KR102302714B1

KR102302714B1 - 신호전달 막단백질의 경막 부위를 이용한 목적단백질의 인간세포 막 표면 발현 방법

Info

Publication number: KR102302714B1
Application number: KR1020170053302A
Authority: KR
Inventors: 한규범; 김천형; 하종천
Original assignee: 주식회사 파이안바이오테크놀로지
Priority date: 2017-04-26
Filing date: 2017-04-26
Publication date: 2021-09-17
Also published as: KR20180119761A

Abstract

본 발명은 신호전달 막단백질의 경막 부위를 이용하여 목적단백질을 인간세포 막 표면에 발현시키는 방법에 대한 것으로, 더욱 상세하게는 신호전달 막단백질의 경막 부위를 목적단백질의 C-말단에 결합시키고 시그널 펩타이드를 목적 단배질 N-말단에 결합시켜 융합된 목적단백질이 막을 통과 시 시그널 펩타이드는 자연 절단되고 막단백질의 경막 도메인은 막에 부착되어 목적단백질이 인간세포 막 표면에 도출되게 발현시키는 방법에 대한 것이다. 본 발명은 상기 융합단백질의 mRNA를 제조하여 인간세포에 삽입함으로써 융합단백질의 발현이 일시적으로 일어나게 하는 특징을 가지고 있어 변형된 인간세포의 임상 적용 시 안전하며, 목적단백질이 세포 막 표면에 발현된 인간세포는 목적단백질과 상호작용을 할 수 있는 단백질을 세포 표면에 발현한 다른 인간세포와의 상호 작용을 증대시켜 수 있다.

Description

신호전달 막단백질의 경막 부위를 이용한 목적단백질의 인간세포 막 표면 발현 방법 {Method of expressing a target protein on the surface of human cell membrane using the transmembrane anchored domain of signal transduction membrane protein}

인간 면역 세포들 중 자연살해세포 (NK 세포)는 암 면역요법을 위한 주요한 세포이다. 자가 NK세포를 증식하여 암을 치료하는 요법은 안전성이 입증되어 일본에서는 암환자 치료에 널리 사용되고 있다. NK 세포는 암 공격력은 뛰어나나 비 특이적으로 암세포를 공격한다. 만일 NK세포가 세포 표면에 말현된 특정암 마커를 타겟팅할 수 있으면 NK세포의 항종양 활성은 더욱 증가할 것이다.

최근 CD19-양성 악성종양 환자에게 CAR-변형 T세포의 적용은 암 면역요법의 새로운 장을 열었고 (Porter et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.N Engl J Med. 2011; 365(8):725-33, Kalos et al. T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia, Sci Transl Med. 2011; 3(95): 95ra73, Grupp et al. Chimeric Antigen ReceptorModified T Cells for Acute Lymphoid Leukemia. N Engl J Med 2013; 368:1509-1518), 다양한 상이한 종양 항원을 표적화하는 CAR T 세포를 이용해 활발한 임상 개발이 진행 중이다. 그러나, 변형된 CAR T 세포는 너무 강력해서 임상 중 암환자가 부작용으로 인하여 사망하는 사례가 보고되었다. 따라서 좀더 마일드하게 면역세포를 활성화시켜 항암치료에 사용할 필요가 있다.

T 세포에 비해 NK 세포의 CAR-매개 재표적화는 지금까지 덜 빈번하게 시도되고 있다. NK 또는 NKT 세포에 의해 사용되는 신호전달도메인은 NKp30 및 DAP12, NKG2D, NKp44, NKp46, DAP10, CD3z의 신호전달 도메인들을 포함한다. 추가로, 세포 내 신호전달 도메인은 또한 면역수용체 티로신 기발 활성화 모티프(Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif, ITAM)를 함유하는 인간 면역글로불린 수용체의 신호전달 도메인들, 예를 들어 Fc 감마 RI, FC 감마 RIIA, FC 감마 RIIC, FC 감마 RIIIA, FcRL5도 포함된다.

이중, DAP12 단백질은 12 KDa의 막단백질이며 하나의 ITAM을 포함하는 자연살해세포에서 중요한 역할을 하는 신호전달도메인으로 알려져 있다 (Campbell et al. DAP12: a key accessory protein for relaying signals by natural killer cell receptors.Int J Biochem Cell Biol.1999; 31(6), 631-636, Topfer et al. DAP12-based Activating Chimeric Antigen Receptor for NK Cell Tumor Immunotherapy. J Immunol. 2015; 194 (7), 3201-3212).

본 발명은 NK 세포의 신호전달 막단백질인 DAP12에서 ITAM 부위를 제거하고 경막 부위만을 이용하여 목적 단백질을 인간세포 막 표면에 발현시키는 방법에 대한 것으로, 목적단백질이 세포 막 표면에 발현된 인간세포는 목적단백질과 상호작용을 할 수 있는 단백질을 세포 표면에 발현한 다른 인간세포와의 상호 작용을 증대시켜 수 있어 임상적으로 유용한 다양한 세포치료제들을 개발 할 수 있다. 본 발명은 또한 세포 형질전환에 통상적으로 사용한 바이러스 벡터 시스템을 사용하지 않고 상기 융합단백질의 mRNA를 제조하여 인간세포에 삽입함으로써 융합 단백질의 발현이 일시적으로 일어나게 하는 특징을 가지고 있어 변형된 인간세포의 임상 적용 시 상대적으로 매우 안전하다.

본 발명은 인간 세포 유전자를 조작하여 임상에 사용 시 발생하는 안전에 관한 문제를 해결하기 위하여 유전자 조작에 통상적으로 사용하는 바이러스 벡터 없이 목적단백질을 일시적으로 발현시킬 수 있는 방법과 인간 세포의 활성을 증대시키기 위하여 목적단백질을 인간 세포 막 표면에 발현시키는 방법을 동시에 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 형질이 변형된 인간 세포의 임상적용에서 안전성을 높이기 위해 목적단백질을 바이러스 벡터 없이 일시적으로 인간 세포에 발현시킬 수 있는 방법으로 mRNA 세포주입 방법을 사용하는 것이 특징이다. 또한 목적단백질의 세포 막 발현을 위해 신호전달 막단백질의 경막 부위를 목적단백질의 C-말단에 결합시키고 시그널 펩타이드를 목적 단배질 N-말단에 결합시켜 융합된 목적단백질이 세포 막을 통과 시 시그널 펩타이드는 자연 절단되나 막단백질의 경막 도메인은 막에 부착되어 목적단백질이 인간세포 막 표면에서 빠져나가지 못하고 걸리도록 발현시키는 것이 특징이다.

본 발명을 통해 막단백질의 경막 부위가 목적단백질과 융합된 mRNA를 제조하고 이를 세포에 주입함으로서 목적단백질이 세포 막 표면에 일시적으로 발현된 인간 세포를 제조할 수 있어 임상적으로 안전하고 유용한 다양한 세포치료제를 개발 할 수 있다.

도 1은 본 발명에 사용된 신호전달 막단백질의 경막부위가 결합된 융합단백질 도식 구조이다.
도 2는 dsRED mRNA를 주입하여 발현된 단백질을 관찰한 형광현미경 사진이다.
도 3은 dsRED(GSSG)₅DAP12 mRNA를 주입하여 발현된 단백질을 관찰한 형광현미경 사진이다.
도 4는 tPA-dsRED(GSSG)₅DAP12 mRNA를 주입하여 발현된 단백질을 관찰한 형광현미경 사진이다.

본 발명을 구체적으로 확인하기 위해 목적단백질 모델로 적형광단백질을 이용하였다. 먼저 대조군으로 사용하기 위해 순수 적형광단백질 mRNA를 준비하였고, 신호전달 막단백질 중 DAP12에서 세포내부 신호 전달 부위를 제거하고 경막 부위만 적형광단백질의 C-말단에 결합하여 두 종류의 융합단백질 mRNA를 제조하였다. 두 종류의 융합단백질은 적형광단백질의 C-말단에는 DAP12 경막 부위가 공동으로 결합되어 있으나 하나는 적형광단백질 N-말단에 티피에이 (tPA) 시그널 펩타이드가 결합된 것과 아닌 것 두개이며 티피에이 (tPA) 시그널 펩타이드가 결합된 도식 구조는 도 1에 나타내었다. 이와 같이 제조된 3 종류의 mRNA들은 Lipofectamine을 이용하여 인간 세포에 주입하고 적형광단백질의 발현을 형광현미경으로 비교 관찰함으로써 막단백질 경막부위가 결합된 적형광단백질들이 세포막 주변에 모이는 지를 관찰하여 본 발명 방법의 유용성을 확인하였다 (도 2, 3, 4).

적형광단백질과 신호전달 막단백질 경막부위는 글리신-세린중합체인 (GSSG)₅힌지(hinge)로 연결하였다. 힌지 영역은 글리신 중합체, 글리신-세린 중합체 및 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체, 그리고 당 분야에서 공지된 다른 유연한 링커들을 포함할 수 있다.

본 발명을 인체에 응용하기 위해서 여러 세포들 중 인간 섬유아세포 (human primary fibroblast)를 적형광단백질 발현 확인에 사용으로써 본 발명의 목적을 달성할 수 있었다. 즉, 본 발명에 따라 암, 바람직하게는 암세포 표적항원을 발현하는 암 치료에서 인간 면역세포를 사용하기 위한 막단백질 경막 부위가 결합된 암 항원 수용체의 면역세포 막 발현을 확인하는 대신 적형광단백질의 발현을 인간 섬유아세포에서 확인함으로써도 본 발명의 목적을 확인 할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어는 단지 특정 실시양태를 기술하는 목적을 위한 것이고 첨부된 특허청구범위에 의해서만 제한된 본 발명의 범주를 제한하도록 의도되지 않는다는 것을 이해하여야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본 발명에서 사용된 모든 기술 과학 용어는 관련 분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미이다.

NK세포 신호전달 도메인 DAP12 경막 부위를 이용한 적형광단백질의 세포 막 발현

적형광단백질을 세포에 주입한 것과 같이 일시적 발현 효과를 확인하기 위하여 DAP12 경막부위가 결합되지 않거나 결합된 여러 형태의 적형광단백질 mRNA (dsRED mRNA, dsRED(GSSG)₅DAP12 mRNA, tPA-dsRED(GSSG)₅DAP12 mRNA)를 제조하여 세포내 주입 실험을 실시하였으며, 여러 형태의 mRNA의 발현 양상과 발현 위치를 확인하고자 하였다. DAP12의 경막부위 mRNA를 얻기 위하여 인비트로젠사 (Invitrogen)의 plasmid pcDNA3.1(+)에 mRNA 합성에 필요한 5’UTR(ATCAAGCTTGGTACCCTCACTTCCTACTCAGGCTTTATTCAAAGACCAAGAGGTACAGGTGCAAGGGAGAGAAGAAGGGCATGGCCAGAAGGCAAGCCCCGCAGAAGGCAGCGGCCGCGTTAA),

3’UTR(AATTCGTTAACGCGGCCGCTGCCTTCTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATGCCCTTCTTCTCTCCCTTGCACCTGTACCTCTTGGTCTTTGAATAAAGCCTGAGTAGGAAGTGAGGGTACCAAGCTTGAT),

120A(CTAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGG) oligo(IDT, Coralville, IA)를 T7 promoter 뒤에 삽입하여 plasmid pcDNAR을 만들었으며, 유전자 dsRED, dsRED(GssG)₅DAP12,그리고 tPA- dsRED(GSSG)₅DAP12는 5’UTR과 3’UTR사이에 삽입하여 제작하였다. Plasmid pcDNAR에 삽입된 각각의 유전자들을 제한 효소 EcoRV를 처리하여 선형으로 제조한 뒤 In Vitro Transcription Kit인 MEGAscript T7 kit (Ambion, Austin, TX)을 사용하여 mRNA로 합성하였으며, 한번 반응에 DNA template 3 ug과 총 volume 60 ul를 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 후, DNase를 37℃에서 15분간 반응시키고. ammonium acetate(2.5M)로 침전시켜 정제한 후, mRNA의 5`capping을 위해 ScriptCap m7G Capping System과 2`-O-Methyltransferase (Epicentr, currently available from CELLSCRIPT)를 사용하였다. 그 후, poly A tail를 추가하기 위해 Poly(A) Polymerase (Epicentr, currently available from CELLSCRIPT)를 사용한 뒤, 만들어진 mRNA는 다시 ammonium acetate 침전으로 정제되었고, 정제된 mRNA는 RNA 저장용액 (Ambion)에 녹인 후, -80℃ 초저온 냉동고에 저장하였다.

인간 섬유아세포를 precoating된 24 well plate에 깔아서 항생제가 제외된 증식 배지 (DMEM, 10% FBS, 200 mM L-Glutamine)에서 배양한 후, Lipofectamine 2000 (Transfection reagent, Invitrogen)을 사용하여 합성된 mRNA들을 transfection 시키고 새로운 tube에 Opti-MEM배지와 Lipofectamine 2000을 혼합한 뒤, 만들어 둔 mRNA Mixture를 혼합하여 15분 incubation 뒤에 cell에 첨가하고. 3시간 뒤, 항생제가 추가된 증식 배지로 바꿔주고 24시간 후에 형광 현미경으로 유전자들의 발현을 확인하였다.

도 2에서 보는 바와 같이 dsRED 단독 발현은 세포의 cytosol에 전체에 걸쳐 넓게 분포되며 발현되고 있음을 확인하였으며, dsRED(GSSG)₅DAP12 (도 3) 와 tPA-dsRED(GSSG)₅DAP12 (도 4)의 발현은 막단백질의 기능을 가지는 DAP12의 영향으로 인하여 세포 막주변에 dsRED 단백질이 분포되는 발현양상을 보임을 알 수 있었다.

티피에이 (tPA) 분비 유도 시그널 펩타이드인 tPA 시그널 펩타이드가 존재하는 경우(도 4)는 그렇지 않은 경우(도 3)에 비해 막 주변에서 관찰되는 단백질의 분포가 다름을 확인하였는데, 이는 tPA 시스널 펩타이드에 의해 dsRED(GSSG)₅DAP12단백질은 소포체 (vesicles) 안에 위치하여 quantum dot의 형태로 발현되기 때문으로 보인다.

본 발명의 방법을 상업적으로 용이하고 유용하게 사용할 수 있는 분야로는 자가 NK세포를 이용한 항암 면역치료가 있다. 암항원에 결합하는 목적단백질을 신호전달 DAP12의 경막부위와 결합시키고 그 융합단백질의 mRNA를 자가 NK세포에 주입하여 암에 타겟팅할 수 있는 단백질을 세포 막 표면에 일시적으로 발현한 NK 세포는 안전하고 유효하게 면역 항암치료를 할 수 있다.

Claims

신호전달 막단백질인 DAP12의 경막 부위 및 유용한 목적단백질이 결합된 융합단백질을 코딩하는 mRNA를 세포에 도입하는 단계를 포함하는 인간 세포 막 표면에 목적단백질을 발현시키는 방법.
제1항에 있어서,
상기 목적단백질의 C 말단에 DAP12의 경막 부위가 결합되는 것인, 인간 세포 막 표면에 목적단백질을 발현시키는 방법.
제1항에 있어서,
상기 융합단백질은 힌지를 더 포함하는 것인, 인간 세포 막 표면에 목적단백질을 발현시키는 방법.
제1항에 있어서,
상기 융합단백질은 시그널 펩타이드를 더 포함하는 것인, 인간 세포 막 표면에 목적단백질을 발현시키는 방법.
제1항에 있어서,
상기 세포는 면역세포인 것인, 인간 세포 막 표면에 목적단백질을 발현시키는 방법.
신호전달 막단백질 DAP12의 경막 부위 및 유용한 목적단백질이 결합된 융합단백질.
제6항에 있어서,
상기 융합단백질은 힌지를 더 포함하는 것인, 융합단백질.