ES2848478T3 - Receptores quiméricos para antígenos y usos de estos - Google Patents

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Abstract

Un receptor quimérico para antígeno que incluye: un dominio de reconocimiento de antígeno que reconoce un receptor P2X7 disfuncional; un dominio transmembrana; y un dominio de señalización que incluye una porción de señalización intracelular de un receptor de activación y/o una porción de señalización intracelular de un receptor coestimulador.

Description

DESCRIPCIÓN
Receptores quiméricos para antígenos y usos de estos
Campo de la invención
La presente invención se refiere a receptores quiméricos para antígenos, linfocitos T que expresan receptores quiméricos para antígenos y receptores quiméricos para antígenos para su uso en la prevención y/o el tratamiento del cáncer, según el conjunto de reivindicaciones adjuntas.
Antecedentes de la invención
El sistema inmunitario cuenta con mecanismos muy evolucionados y específicos que nos protegen de diversas patologías. Entre estas patologías se encuentra la detección y eliminación de patógenos no deseados como infecciones bacterianas, células infectadas por virus y, lo que es más importante, células mutadas que pueden causar neoplasias malignas (cáncer). La capacidad del sistema inmunitario para prevenir la formación y el crecimiento de cánceres depende de la capacidad de las células del sistema inmunitario para distinguir entre una célula "sana" y una célula "enferma" (p. ej., neoplásica o preneoplásica). Esto se logra mediante el reconocimiento de marcadores celulares (antígenos) que son indicativos de la transición en una célula de un estado sano a un estado enfermo.
Ha habido muchos intentos de desarrollar enfoques inmunoterapéuticos para tratar el cáncer al manipular o dirigir el sistema inmunitario a células diana que expresan antígenos de células cancerosas. Los enfoques inmunoterapéuticos se han centrado en gran medida en explotar el sistema inmunitario humoral mediante la utilización de anticuerpos aislados o diseñados o, más recientemente, la rama celular del sistema inmunitario.
Los primeros intentos de utilizar inmunoterapia celular para el tratamiento del cáncer utilizaron linfocitos T aislados de tumores y expandidos ex vivo. Si bien este enfoque ha proporcionado alguna promesa inicial en las primeras investigaciones, existen muchos desafíos técnicos asociados con este enfoque. La capacidad de aislar y expandir poblaciones de linfocitos T a cantidades clínicamente relevantes es técnicamente desafiante y la naturaleza mal controlada de la expansión da como resultado una población final de linfocitos T que es claramente heterogénea y puede contener solo una pequeña cantidad de linfocitos T específicos para el antígeno canceroso. Como resultado, la eficacia de este método es impredecible y variable.
Con el fin de abordar algunas de las deficiencias relacionadas con el uso de linfocitos T expandidos ex vivo aislados de tumores, los receptores quiméricos para antígenos (CAR o receptores de linfocitos T artificiales) comenzaron a desarrollarse a fines de la década de 1980. Los receptores quiméricos para antígenos se crean al enlazar una región extracelular que es específica para un antígeno deseado a una región de señalización, lo que da como resultado un receptor específico para antígeno que puede inducir la función de los linfocitos T.
La transformación de linfocitos T aislados con CAR da como resultado una población de linfocitos T que son específicos para un antígeno dado. Como resultado, se pueden generar grandes poblaciones de linfocitos T específicos para antígeno y utilizarlas para inmunoterapia.
Los ensayos clínicos iniciales de linfocitos T transformados con CAR específicos para antígenos asociados a tumores fueron prometedores. Sin embargo, la eficacia de los linfocitos T transformados con CAR condujo a una hipercitocinemia significativa y, en última instancia, a la muerte de algunos pacientes. Se cree en gran medida que estos efectos adversos son inducidos por la actividad específica para la diana, pero inespecífica para el tumor, de los linfocitos T transformados con CAR inducida como resultado de la expresión endógena del antígeno afín para el CAR en poblaciones de células sanas, no cancerosas.
La publicación internacional WO 2012/079000 A1 describe la generación de linfocitos T modificados genéticamente que expresan un CAR que comprende un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana y múltiples regiones de señalización.
La publicación internacional WO 2014/055657 A1 describe la generación de linfocitos T genéticamente modificados que contienen un primer y un segundo CAR, en donde cada uno contiene distintas regiones de señalización.
La publicación internacional WO 2011/075789 A1 describe el uso de anticuerpos dirigidos contra receptores P2X7 no funcionales para la terapia del cáncer.
La publicación internacional WO 2011/020155 A1 describe anticuerpos específicos contra receptores P2X7 no funcionales y la generación de proteínas de fusión para dirigir un polipéptido heterólogo o un agente citotóxico conjugado a una célula cancerosa.
BARDEN, J.A. et al., revelan una visión general de la expresión del receptor P2X7 no funcional en diferentes líneas celulares y proponen nfP2X7 como una diana terapéutica para la terapia del cáncer.
Por lo tanto, es evidente que existe la necesidad de desarrollar un CAR que se dirija a un antígeno asociado a un tumor que es expresado selectivamente por células cancerosas, pero no expresado endógenamente en células no cancerosas.
La descripción de documentos, acciones, materiales, dispositivos, artículos y similares se incluye en esta memoria descriptiva únicamente con el propósito de proporcionar un contexto para la presente invención. No se sugiere ni se representa que alguno o todos estos asuntos formen parte de la base de la técnica anterior o fueran de conocimiento general común en el campo relevante para la presente invención tal como existía antes de la fecha de prioridad de cada reivindicación de esta solicitud.
Compendio de la invención
La presente invención se basa en parte en el reconocimiento de que debido a la actividad significativa “específica para la diana” pero “inespecífica para el tumor” de las células inmunitarias que expresan CAR, existe la necesidad de desarrollar un CAR y una célula modificada genéticamente que lo expresa, que se dirija a un marcador asociado específicamente con una variedad de células neoplásicas (cancerosas) o preneoplásicas (precancerosas). Los inventores han reconocido que un receptor P2X7 disfuncional es un marcador adecuado para dirigirse con un CAR.
Por consiguiente, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un receptor quimérico para antígeno que incluye un dominio de reconocimiento de antígeno que reconoce un receptor P2X7 disfuncional; un dominio transmembrana; y un dominio de señalización que incluye una porción de señalización intracelular de un receptor de activación y/o una porción de señalización intracelular de un receptor coestimulador.
En algunas realizaciones, el dominio de reconocimiento de antígeno reconoce un epítopo asociado con un sitio de unión a trifosfato de adenosina (ATP) del receptor P2X7 disfuncional. En algunas realizaciones, el receptor P2X7 disfuncional tiene una capacidad reducida para unirse a ATP en el sitio de unión a ATP en comparación con la capacidad de unión a a Tp de un receptor P2X7 natural (funcional). En algunas realizaciones, el receptor P2X7 disfuncional no puede unirse a ATP en el sitio de unión a ATP.
En algunas realizaciones, el receptor P2X7 disfuncional tiene un cambio conformacional que hace que el receptor sea disfuncional. En algunas realizaciones, el cambio conformacional es un cambio de un aminoácido de la conformación trans a la conformación cis. En algunas realizaciones, el aminoácido que ha cambiado de una conformación trans a una conformación cis es prolina en la posición aminoacídica 210 del receptor P2X7 disfuncional.
En algunas realizaciones, el dominio de reconocimiento de antígeno reconoce un epítopo que incluye la prolina en la posición aminoacídica 210 del Receptor P2X7 disfuncional. En algunas realizaciones, el dominio de reconocimiento de antígeno reconoce un epítopo que incluye uno o más residuos aminoacídicos que van desde la glicina en la posición aminoacídica 200 hasta la cisteína en la posición aminoacídica 216, inclusive, del receptor P2X7 disfuncional.
El dominio de reconocimiento de antígeno del CAR puede ser cualquier molécula adecuada que pueda interactuar y reconocer específicamente un receptor P2X7 disfuncional. Sin embargo, en algunas realizaciones, el dominio de reconocimiento de antígeno incluye homología de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo, o un fragmento de este, que se une al receptor P2X7 disfuncional. En algunas realizaciones, el dominio de reconocimiento de antígeno incluye homología de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de una porción de unión a antígeno de fragmento (Fab) de un anticuerpo que se une a un receptor P2X7 disfuncional. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.
En algunas realizaciones, el dominio de reconocimiento de antígeno incluye la homología de la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de un fragmento variable de cadena sencilla (scFv) o un scFv multivalente que se une a un receptor P2X7 disfuncional. En algunas realizaciones, el scFv multivalente es un scFv divalente o trivalente.
En algunas realizaciones, el dominio de reconocimiento de antígeno incluye homología de secuencia de aminoácidos con un dominio de anticuerpo único (sdAb, por sus siglas en inglés) que se une a un receptor P2X7 disfuncional.
En algunas realizaciones, el dominio de reconocimiento de antígeno incluye un péptido de unión que incluye homología de secuencia de aminoácidos con una o más regiones CDR de un anticuerpo que se une a un receptor P2X7 disfuncional. En algunas realizaciones, el péptido vinculante incluye homología de secuencia de aminoácidos con los dominios CDR1,2 y 3 de la cadena Vh y/o Vl de un anticuerpo que se une a un receptor P2X7 disfuncional. En algunas realizaciones, el dominio de reconocimiento de antígeno incluye una o más secuencias de aminoácidos que son al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 94 % idénticas a una cualquiera de las regiones que abarcan las posiciones 30 a 35, 50 a 67 o 98 a 108 de las secuencias establecidas en las SEQ ID NOS: 10, 32, 33 o 34. En algunas realizaciones, el dominio de reconocimiento de antígeno incluye una o más de las secuencias que abarcan las posiciones 30 a 35, 50 a 67 o 98 a 108 de las secuencias establecidas en las SEQ ID NOS: 10, 32, 33 o 34. En algunas realizaciones, el dominio de reconocimiento de antígeno incluye una o más de las secuencias establecidas en las SEQ ID NOS: 10, 32, 33 o 34.
En algunas realizaciones, el dominio de señalización incluye una porción derivada de un receptor de activación. En algunas realizaciones, el receptor de activación es un miembro del complejo de correceptor de CD3 o es un receptor Fc. En algunas realizaciones, la porción derivada del complejo correceptor de CD3 es CD3-Z. En algunas realizaciones, la porción derivada del receptor Fc es FcsRI o FcyRI.
En algunas realizaciones, el dominio de señalización incluye una porción derivada de un receptor coestimulador. En algunas realizaciones, el dominio de señalización incluye una porción derivada de un receptor de activación y una porción derivada de un receptor coestimulador. En algunas realizaciones, el receptor coestimulador se selecciona del grupo que consiste en CD27, CD28, CD30, CD40, DAP10, OX40, 4-1BB (CD137) e ICOS.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica el receptor quimérico para antígeno según el primer aspecto de la invención.
En un tercer aspecto, la presente invención proporciona una construcción de ácido nucleico que incluye una molécula de ácido nucleico según el segundo aspecto de la invención. En algunas realizaciones, la expresión de la molécula de ácido nucleico está bajo el control de una secuencia de control de la transcripción. En algunas realizaciones, la secuencia de control de la transcripción puede ser un promotor constitutivo o un promotor inducible.
En algunas realizaciones del tercer aspecto de la invención, la construcción de ácido nucleico incluye además un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES, por sus siglas en inglés) que permite el inicio de la traducción dentro del ARNm una vez expresado a partir de la construcción de ácido nucleico.
En algunas realizaciones del tercer aspecto de la invención, la construcción de ácido nucleico es un vector tal como un vector viral, que puede usarse para transformar un linfocito T para inducir la expresión del CAR.
En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona una célula modificada genéticamente que incluye un CAR según el primer aspecto de la invención. En algunas realizaciones, la célula incluye dos o más CAR diferentes.
En un quinto aspecto, la presente invención proporciona una célula genéticamente modificada que incluye una molécula de ácido nucleico según el segundo aspecto de la invención, o una construcción de ácido nucleico según el tercer aspecto de la invención, o una forma genómicamente integrada de la construcción. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico o la construcción de ácido nucleico codifica dos o más CAR diferentes.
En algunas realizaciones de los aspectos cuarto y quinto de la invención, los dos o más CAR diferentes tienen dominios de señalización diferentes.
En algunas realizaciones de los aspectos cuarto y quinto de la invención, la célula incluye un primer CAR con un dominio de señalización que incluye una porción derivada de un receptor de activación y un segundo CAR con un dominio de señalización que incluye una porción derivada de un receptor coestimulador. En algunas realizaciones, el receptor de activación es un miembro del complejo de correceptor de CD3 o es un receptor Fc. En algunas realizaciones, el receptor coestimulador se selecciona del grupo que consiste en CD27, CD28, CD30, CD40, DAP10, OX40, 4-1 BB (CD137) e ICOS.
En algunas realizaciones de los aspectos cuarto y quinto de la invención, la célula se modifica adicionalmente para expresar constitutivamente receptores coestimuladores. En algunas realizaciones, la célula se modifica adicionalmente para expresar ligandos para los receptores coestimuladores, facilitando así la autoestimulación de la célula.
En algunas realizaciones de los aspectos cuarto y quinto de la invención, la célula se modifica adicionalmente para secretar citocinas. En algunas realizaciones, las citocinas se seleccionan del grupo que consiste en IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-17 e IL-21, o una combinación de estas.
En algunas realizaciones de los aspectos cuarto y quinto de la invención, la célula es un leucocito. En algunas realizaciones, la célula es una célula mononuclear de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés), un linfocito, un linfocito T (que incluye un linfocito T CD4+ o un linfocito T CD8+), una célula citolítica natural o un linfocito T citolítico natural.
En un sexto o séptimo aspecto, la presente invención proporciona una célula genéticamente modificada según la invención para su uso en un método para destruir una célula que expresa un P2X7 disfuncional, el método que incluye exponer la célula que expresa un receptor P2X7 disfuncional a una célula genéticamente modificada según los aspectos cuarto o quinto de la invención.
En algunas realizaciones de los aspectos sexto y séptimo de la invención, la célula que expresa un receptor P2X7 disfuncional se expone a la célula genéticamente modificada junto con una citocina exógena. En algunas realizaciones, la célula modificada genéticamente es una célula modificada genéticamente, autóloga de la célula que expresa un receptor P2X7 disfuncional.
En algunas realizaciones de los aspectos sexto y séptimo de la invención, la célula que expresa un receptor P2X7 disfuncional es una célula cancerosa. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en; cáncer de cerebro, cáncer de esófago, cáncer de boca, cáncer de lengua, cáncer de tiroides, cáncer de pulmón, cáncer de estómago, cáncer de páncreas, cáncer de riñón, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de cuello uterino, cánceres de células epiteliales, cáncer de piel, leucemia , linfoma, mieloma, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de endometrio y cáncer de testículo. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en; cáncer de pulmón, cáncer de esófago, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de cuello uterino, cánceres de vagina, cánceres de células epiteliales, cáncer de piel, cánceres relacionados con la sangre, cáncer de mama, cáncer de endometrio, cáncer de útero y cáncer de testículo.
En algunas realizaciones de los aspectos sexto y séptimo de la invención, el cáncer es metastásico. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer en etapa III o es cáncer en etapa IV.
En un octavo aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que incluye una célula modificada genéticamente según el cuarto o quinto aspecto de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica incluye adyuvantes adecuados que pueden consistir en citocinas. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica también puede incluir un intermediario como se describe en la presente memoria.
Breve descripción de las figuras
Para una mayor comprensión de los aspectos y ventajas de la presente invención, debe hacerse referencia a la siguiente descripción detallada, tomada junto con los dibujos adjuntos.
Figura 1 - un esquema que muestra la disposición de un receptor quimérico para antígeno (CAR) anti-receptor P2X7 disfuncional (nf) según una realización de la presente invención.
Figura 2 - un esquema que muestra el plásmido BLIV utilizado para la expresión del CAR anti-receptor P2X7 nf en la Figura 1.
Figura 3 - un gel de electroforesis que muestra fragmentos de restricción de ADN restringido por BamHI aislado de clones de E. co litransformados con el plásmido BLIV.
Figura 4 - un gel de electroforesis que muestra fragmentos de restricción de ADN restringido por EcoRI, BamHI y Psti aislado de clones de E. coli seleccionados transformados con el plásmido BLIV.
Figura 5 - muestra imágenes de microscopía de células 293T transfectadas con plásmidos necesarios para la construcción de vectores lentivirales que contienen la construcción BLIV-CAR-bisagra corta y células 293T transducidas con sobrenadante que contiene los vectores lentivirales.
Figura 6 - muestra imágenes de microscopía de células 293T transfectadas con plásmidos necesarios para la construcción de vectores lentivirales que contienen la construcción BLIV-CAR-bisagra larga y células 293T transducidas con sobrenadante que contiene los vectores lentivirales.
Figura 7 - Análisis FACS de la pureza celular de los linfocitos T purificados con el kit de enriquecimiento de linfocitos T CD8+ humanos RosetteSep.
Figura 8 - Análisis FACS de ensayos de destrucción que comprenden el cocultivo de linfocitos T CD8+ y células BT549.
Figura 9 - Gráfico que ilustra el porcentaje de células diana marcadas con tinte eliminadas después de 48 horas de cocultivo con linfocitos T CD8+ transducidos con vectores lentivirales que contienen los plásmidos BLIV-CAR-bisagra corta y BLIV-CAR-bisagra larga en comparación con linfocitos T CD8+ no transducidos y linfocitos T CD8+ transducidos con plásmidos BLIV vacíos.
Figura 10 - Alineación de los péptidos de unión PEP2-2-1-1, PEP2-472-2 y PEP2-2-12 con anticuerpos dirigidos contra el receptor P2X7 nf.
Figura 11 - Un esquema que muestra la disposición de un CAR anti-receptor P2X7 nf según una realización adicional de la presente invención.
Figura 12 - Un esquema que muestra el plásmido pCDH utilizado para la expresión de un CAR anti-receptor P2X7 nf de la Figura 11.
Figura 13 - Un gel de electroforesis que muestra fragmentos de restricción de ADN restringido por EcoRI y Not I aislado de clones de Sure 2 seleccionados, transformados con el plásmido pCDH.
Figura 14 - Análisis FACS de la eficacia de transfección de células HEK293T.
Figura 15 - Histogramas representativos del análisis FACS de la eficacia de la transducción lentiviral.
Figura 16 - Análisis FACS del porcentaje de células CD8 transducidas que expresan GFP.
Figura 17 - Ilustración de la cadena principal de la proteína de fusión para la generación de receptores P2X7 disfuncionales y funcionales.
Figura 18 - Un gel de electroforesis que muestra fragmentos de restricción de ADN restringido por Bam H Iy Pmel aislado de clones de E.cloni ®10G seleccionados transformados con EXD2_K193A o EXD2_WT que contienen vectores pDONR-107.
Figura 19 - Un gel de electroforesis que muestra fragmentos de restricción de ADN restringido por Bam HI aislado de clones de E.cloni ®10G seleccionados transformados con EXD2_K193A o EXD2_WT que contienen vectores pLV-416.
Figura 20 - Análisis FACS de transducción de empaquetamiento lentiviral de células HEK293 con pLV-416-EXD2_K193A y pLV-416-EXD2_WT.
Figura 21 - Análisis FACS de la transducción de HEK293 con lentivirus que contienen construcciones pLV-416-EXD2_K193A o pLV-416-EXD2_WT.
Figura 22 - Gráfico que ilustra la destrucción de células diana HEK que expresan P2X7 nf y células de cáncer de mama 231 mediante linfocitos T que expresan los CAR PEP2-2-1-1, PEP2-472-2
Descripción detallada de la invención
Las secuencias de nucleótidos y polipéptidos a las que se hace referencia en la presente memoria están representadas por un número de identificación de secuencia (SEQ ID NO:). En la Tabla 1 se proporciona un resumen de los identificadores de secuencia. También se proporciona una lista de secuencias al final de la memoria descriptiva. Tabla 1
Resumen de identificadores de secuencia
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Los inventores han reconocido que debido a la actividad significativa "específica para la diana” pero “inespecífica para el tumor” de las células inmunitarias que expresan el receptor quimérico para antígeno (CAR), existe la necesidad de desarrollar un CAR, y una célula genéticamente modificada que lo exprese, que se dirija a un marcador asociado específicamente con células neoplásicas (cancerosas) o preneoplásicas (precancerosas). Los inventores han reconocido que un receptor P2X7 disfuncional es un marcador adecuado para dirigirse a una célula inmunitaria que expresa CAR, en una variedad de cánceres.
Por consiguiente, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un receptor quimérico para antígeno (CAR) que incluye un dominio de reconocimiento de antígeno que reconoce un receptor P2X7 disfuncional; un dominio transmembrana; y un dominio de señalización que incluye una porción de señalización intracelular de un receptor de activación y/o una porción de señalización intracelular de un receptor coestimulador.
Los receptores quiméricos para antígenos son proteínas construidas artificialmente que tras la expresión en la superficie de una célula pueden inducir una respuesta celular específica para el antígeno. Un CAR incluye al menos dos dominios; el primer dominio es un dominio de reconocimiento de antígeno que reconoce específicamente un antígeno, o más específicamente una porción o porciones de epítopo de un antígeno; y el segundo dominio es un dominio de señalización que es capaz de inducir, o participar en la inducción, de una vía de señalización intracelular.
La combinación de estos dos dominios determina la especificidad antigénica del CAR y la capacidad del CAR para inducir una respuesta celular deseada, la última de las cuales también depende de la célula hospedante del CAR. Por ejemplo, la activación de un CAR expresado en un linfocito T colaborador y que tiene un dominio de señalización que comprende un dominio de activación de CD3, puede, una vez activado al encontrar su antígeno afín, inducir a que el linfocito T colaborador CD4+ secrete una variedad de citocinas. En otro ejemplo, el mismo CAR cuando se expresa en un linfocito T citotóxico CD8+, una vez activado por una célula que expresa el antígeno afín, puede inducir la liberación de citotoxinas que finalmente conducen a la inducción de la apoptosis de la célula que expresa el antígeno.
Además del dominio de reconocimiento de antígeno y el dominio de señalización, un CAR puede incluir además componentes o porciones adicionales. Por ejemplo, el CAR incluye un dominio transmembrana que puede comprender una porción del dominio de señalización del CAR o puede estar asociado con él. El dominio transmembrana es típicamente una o más hélices hidrófobas, que se extiende por la bicapa lipídica de una célula e incrusta el CAR dentro de la membrana celular. El dominio transmembrana del CAR puede ser un determinante en el patrón de expresión del CAR cuando se asocia con una célula. Por ejemplo, el uso de un dominio transmembrana asociado con un correceptor de CD3 puede permitir la expresión del CAR en linfocitos T indiferenciados, mientras que el uso de un dominio transmembrana de un correceptor de CD4 puede dirigir la expresión de un CAR en linfocitos T colaboradores, pero no linfocitos T citotóxicos.
Otro componente o porción de un CAR puede ser un dominio enlazador. El dominio enlazador (también conocido como espaciador o dominio bisagra) puede extenderse desde el lado extracelular del dominio transmembrana hasta el dominio de reconocimiento de antígeno, uniendo así el dominio de reconocimiento de antígeno al dominio transmembrana. Aunque en algunos casos no se requiere un dominio enlazador para un CAR funcional (es decir, el dominio de reconocimiento de antígeno se puede conectar directamente al dominio transmembrana), en algunas circunstancias el uso de un dominio enlazador permite una mayor eficacia del CAR. El dominio enlazador puede tener una variedad de funciones que incluyen permitir la flexibilidad del CAR para permitir la orientación necesaria del dominio de reconocimiento de antígeno del CAR para unirse a un antígeno. En consecuencia, el dominio enlazador puede ser cualquier secuencia de aminoácidos que realice esta función. Un ejemplo no limitante de un dominio enlazador es un dominio que tiene homología de secuencia de aminoácidos con la región bisagra de un anticuerpo IgG, tal como la región bisagra de IgG1. Los ejemplos alternativos incluyen secuencias de aminoácidos que tienen homología de secuencia con la región CH2CH3 de un anticuerpo o porciones del complejo correceptor de CD3, el correceptor de CD4 o el correceptor de CD8.
El receptor P2X7 (receptor purinérgico P2X, canal iónico controlado por ligando, 7) es un canal iónico controlado por ATP que se expresa en varias especies, incluidos los seres humanos. El receptor está codificado por un gen, cuyo símbolo oficial está representado por P2RX7. El gen también se ha denominado purinoceptor 7 de P2X, receptor de ATP, receptor de P2Z, receptor de P2X7 y variante A del receptor de P2X7 purinérgico. Para los fines de la presente divulgación, el gen y el receptor codificado se denominarán en el presente documento P2X7 y P2X7 , respectivamente.
Las secuencias de ARNm, codificante (ADNc) y de aminoácidos del gen P2X7 humano se establecen en las SEQ ID NO: 1 a 3, respectivamente. Las secuencias de ARNm y de aminoácidos del gen P2X7 humano también están representadas por los números de acceso de GenBank NM_002562.5 y NP_002553.3, respectivamente. El gen P2X7 se conserva en chimpancés, mono Rhesus, perro, vaca, ratón, rata, cerdo, pollo, pez cebra y rana. Se puede acceder a más detalles del gen P2X7 humano y de otras especies desde la base de datos GenBank en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI, por sus siglas en inglés) (www.ncbi.nlm.nih.gov). Por ejemplo, el número de identificación del gen para P2X7 humano es 5027, para el de chimpancé es 452318, para el de mono es 699455, para el de perro es 448778, para el de vaca es 286814, para el de ratón es 18439, para el de pez cebra es 387298 y para el de rana es 398286. Además, al menos 73 organismos tienen ortólogos con el gen P2X7 humano.
También se pueden encontrar más detalles sobre el gen P2X7 humano y de otras especies en el portal UniGene del NCBI (por ejemplo, ver UniGene Hs. 729169 para P2X7 humano7-hftp: //www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/clust.cgi?UGID=4540770&TAXID=9606&SEARCH). Alternativamente, se puede acceder a los detalles de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos para el gen P2X7 desde la base de datos UniProt (www.uniprot.org) donde el ID de UniProt para el gen P2X7 humano es Q99572. El contenido de los registros de GenBank y UniProt se incorpora en la presente memoria como referencia.
El receptor P2X7 se forma a partir de tres subunidades proteicas (monómeros), en donde en el receptor natural en humanos al menos uno de los monómeros tiene una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 3. Debe entenderse que un "receptor P2X7" como se menciona en la presente memoria también incluye variaciones de origen natural del receptor, incluidas variantes de empalme, formas truncadas de origen natural y variantes alélicas del receptor. Un receptor P2X7 también puede incluir subunidades que tienen una secuencia de aminoácidos modificada, por ejemplo, aquellas que incluyen truncamientos, eliminaciones de aminoácidos o modificaciones del aminoácido establecido en la SEQ ID NO: 3.
Una "variante" del gen P2X7 o la proteína codificada pueden presentar una secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos, respectivamente, que sea al menos 80 % idéntica, al menos 90 % idéntica, al menos 95 % idéntica, al menos 98 % idéntica, al menos 99 % idéntica, o al menos 99,9 % idéntica a un receptor P2X7 natural, por ejemplo.
El receptor P2X7 se activa mediante la unión de ATP al sitio de unión a ATP del receptor. Esto conduce a la apertura rápida (en milisegundos) de un canal que permite selectivamente el movimiento de pequeños cationes a través de la membrana. Después de un corto período de tiempo (en segundos) se forma un gran poro en la membrana de una célula que permite la penetración de moléculas de hasta 900 Da de tamaño por la membrana celular. Esta formación de poros conduce finalmente a la despolarización de la célula y en muchos casos a la citotoxicidad y muerte celular. Este papel conduce a la creencia de que el receptor P2X7 está involucrado en la apoptosis en una variedad de tipos de células.
Al igual que otras moléculas involucradas en la apoptosis, como Bcl2 y Bax, una disminución o pérdida en la función del receptor P2X7 puede conducir a una célula que es comparativamente resistente a la apoptosis inducida. En muchos casos, esta resistencia a la apoptosis es fundamental en la transición de una célula "sana" normal a una célula precancerosa o cancerosa mutada. En consecuencia, la capacidad de apuntar a las células que tienen una función disminuida, o una pérdida de función, del receptor P2X7 proporciona una diana prometedora para la terapia del cáncer.
En consecuencia, en el primer aspecto de la invención, el CAR reconoce un receptor P2X7 disfuncional. Tal como se utiliza en toda la memoria descriptiva, el término "disfuncional" con referencia al receptor P2X7 incluye una disminución en la función del receptor con respecto a su función comparativa en una célula normal no tumoral. En algunas realizaciones, la función del receptor P2X7 se puede reducir en al menos 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más del 99 %. En algunas realizaciones, el término "disfuncional" puede incluir un receptor P2X7 que no es funcional. Es decir que el receptor P2X7 no puede inducirse para permitir la permeabilidad de cationes y otras moléculas a través de la membrana celular.
Cualquier cambio en la forma natural o nativa del receptor P2X7 que conduce a un receptor disfuncional se incluye en la presente memoria. Por ejemplo, el receptor disfuncional puede ser el resultado de una mutación o alteración en uno o más aminoácidos del receptor que están asociados con la unión de ATP al receptor. En efecto, el receptor P2X7 es disfuncional ya que tiene una capacidad reducida o no puede unirse a ATP en el sitio de unión a ATP. En este caso, el dominio de reconocimiento de antígeno del receptor quimérico para antígeno reconocerá un epítopo del receptor P2X7 disfuncional asociado con el sitio de unión a ATP. En consecuencia, en algunas realizaciones del primer aspecto de la invención, el dominio de reconocimiento de antígeno del receptor quimérico para antígeno reconoce un epítopo del receptor P2X7 disfuncional asociado con el sitio de unión a ATP. En algunas realizaciones, el receptor P2X7 disfuncional tiene una capacidad reducida para unirse a ATP en comparación con la capacidad de unión a ATP de un receptor P2X7 natural (funcional). En algunas realizaciones, el receptor P2X7 disfuncional no puede unirse a ATP.
Una alteración en uno o más aminoácidos del receptor P2X7 puede incluir un cambio conformacional en uno o más aminoácidos del receptor. Por lo tanto, en algunas realizaciones del primer aspecto de la invención, el receptor quimérico para antígeno se une a un receptor P2X7 disfuncional que tiene un cambio conformacional que hace que el receptor sea disfuncional. Específicamente, este cambio conformacional puede ser un cambio en uno o más aminoácidos del receptor P2X7 de una conformación trans a una conformación cis. En algunas realizaciones, una prolina en la posición 210 del receptor P2X7 cambia de una conformación trans a una conformación cis. En este caso, el dominio de reconocimiento de antígenos del CAR puede reconocer un epítopo que incluye prolina en la posición aminoacídica 210 del receptor P2X7. En algunas realizaciones del primer aspecto de la presente invención, el dominio de reconocimiento de antígeno reconoce un epítopo que incluye uno o más aminoácidos que van desde la glicina en la posición aminoacídica 200 hasta la cisteína en la posición aminoacídica 216 (inclusive) del receptor P2X7 disfuncional. En algunas realizaciones del primer aspecto de la presente invención, el dominio de reconocimiento de antígenos reconoce un epítopo que incluye la prolina en la posición 210 del receptor P2X7 disfuncional, y uno o más de los residuos de aminoácidos que van desde la glicina en la posición aminoacídica 200 hasta la cisteína en la posición aminoacídica 216 (inclusive) del receptor P2X7 disfuncional.
Sin querer estar limitado por la teoría, como resultado del cambio conformacional de la prolina en la posición 210 del receptor P2X7 , la estructura tridimensional del receptor puede alterarse. Esta alteración en la estructura tridimensional puede permitir que el dominio de reconocimiento de antígenos del CAR se una a los aminoácidos o epítopos, previamente inaccesibles en la estructura tridimensional natural del receptor P2X7. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el CAR reconoce uno o más epítopos de receptor P2X7 expuestos al dominio de reconocimiento de antígeno como resultado de un cambio conformacional trans a cis de la prolina en la posición 210 de la SEQ ID NO: 3. Estos epítopos pueden incluir uno o más de los aminoácidos en la posición 200 a 210, o posiciones 297 a 306, inclusive, del receptor P2X7. Por consiguiente, en algunas realizaciones del primer aspecto de la presente invención, el dominio de reconocimiento de antígeno reconoce un epítopo que incluye uno o más de los aminoácidos en las posiciones 200 a 210 y/o 297 a 306 del receptor P2X7.
Tal como se utiliza en toda la memoria descriptiva, el término "reconoce" se refiere a la capacidad del dominio de reconocimiento de antígeno para asociarse con un receptor P2X7 disfuncional, una porción de este, o un epítopo de este. En algunas realizaciones, el dominio de reconocimiento de antígeno puede unirse directamente al receptor P2X7 disfuncional, o un epítopo de este. En otras realizaciones, el dominio de reconocimiento de antígeno puede unirse a una forma procesada del receptor P2X7 disfuncional. Tal como se utiliza en este contexto, el término "forma procesada" se refiere a las formas del receptor P2X7 que se ha truncado o digerido como resultado del procesamiento intracelular. En consecuencia, el reconocimiento de la "forma procesada" del receptor P2X7 disfuncional puede ser el resultado de presentarse en asociación con un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC, por sus siglas en inglés).
El dominio de reconocimiento de antígeno puede ser cualquier dominio adecuado que pueda reconocer un receptor P2X7 disfuncional, o epítopo de este. Como se usa en toda la memoria descriptiva, el término "dominio de reconocimiento de antígeno" se refiere a la parte del CAR que proporciona la especificidad del CAR para el receptor P2X7 disfuncional. El dominio de reconocimiento de antígeno puede ser todo o simplemente parte de la región extracelular del CAR. Los dominios de reconocimiento de antígeno adecuados incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos que tienen homología de secuencia con el sitio de unión al antígeno de un anticuerpo, o fragmento de este, que se unen a un receptor P2X7 disfuncional. Por lo tanto, en algunas realizaciones del primer aspecto de la invención, el dominio de reconocimiento de antígeno incluye una secuencia de aminoácidos que tiene homología con un anticuerpo, o un fragmento de este, que se une a un receptor P2X7 disfuncional. En algunas realizaciones, una porción del dominio de reconocimiento de antígenos incluye una secuencia de aminoácidos que tiene homología con un anticuerpo, o un fragmento de este, que se une al Receptor P2X7 disfuncional. La secuencia del anticuerpo homólogo de origen puede ser cualquier secuencia adecuada de un anticuerpo que tenga afinidad por el receptor P2X7. Por ejemplo, la secuencia puede compartir homología de secuencia con un anticuerpo que se origina en una o más de las siguientes especies; primate humano, no humano, ratón, rata, conejo, oveja, cabra, hurón, canino, pollo, felino, conejillo de indias, hámster, caballo, vaca o cerdo. El dominio de reconocimiento de antígenos puede compartir homología de secuencia con la secuencia de un anticuerpo monoclonal producido a partir de una línea celular de hibridoma. Cuando la especie de origen de la secuencia de anticuerpo homóloga no es humana, el anticuerpo es preferiblemente un anticuerpo humanizado. La secuencia del anticuerpo homólogo también puede ser de una especie animal distinta de mamífero, como un pez cartilaginoso (p. ej., anticuerpos IgNAR de tiburón - ver la publicación internacional WO2012/073048). Alternativamente, el dominio de unión al antígeno puede incluir andamios proteicos modificados que proporcionan una funcionalidad similar a la de los anticuerpos de tiburón, como los cuerpos i que tienen restos de unión basados en anticuerpos IgNAR de tiburón (ver la publicación internacional WO2005/118629). Además, el dominio de reconocimiento de antígeno podría ser, derivarse de, o podría compartir homología de secuencia con cualquier otra molécula de unión o péptido adecuado que pueda interactuar selectivamente con un receptor P2X7 disfuncional con una afinidad suficiente para activar el dominio de señalización del CAR. Se conocen en la técnica métodos para la identificación de proteínas de unión a antígenos tales como, inter alia, barrido de bibliotecas de presentación de fagos, cromatografía de afinidad de proteínas, coinmunoprecipitación y sistemas de dos híbridos de levadura (ver Srinivasa Rao, V. et al. Proteomics Int J, 2014; Id. de artículo 147648).
En algunas realizaciones, el dominio de reconocimiento de antígeno del CAR incluye una homología de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de una porción de unión a antígeno en fragmento (Fab) de un anticuerpo que se une a un receptor P2X7 disfuncional. Como se entenderá en la técnica, una porción Fab de un anticuerpo está compuesta por una región constante y una región variable de cada una de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo. El Fab es la región determinante de antígeno del anticuerpo y se puede generar escindiendo enzimáticamente la región Fc de un anticuerpo.
En algunas realizaciones del primer aspecto de la invención, el dominio de reconocimiento de antígenos incluye la homología de la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de un fragmento variable de cadena sencilla (scFv) que se une a un receptor P2X7 disfuncional. Como se entenderá en la técnica, un scFv es una proteína de fusión que comprende dos porciones que pueden compartir homología con, o pueden ser idénticas a, las cadenas variable-pesada (VH) y variable-ligera (VL) de un anticuerpo, con las dos porciones conectadas entre sí con un péptido enlazador. Por ejemplo, el scFv puede incluir secuencias de aminoácidos VH y VL que se derivan de un anticuerpo que reconoce un receptor P2X7 disfuncional. En este contexto, se apreciará que el término "derivado de" no es una referencia a la fuente de los polipéptidos per se, sino que más bien se refiere a la derivación de la secuencia de aminoácidos que constituye una porción de la región de unión al antígeno. En consecuencia, el término "derivado de" incluye polipéptidos creados sintéticamente, artificialmente o que de otro modo comparten la identidad de secuencia con un anticuerpo que se une al receptor P2X7 disfuncional.
En algunas realizaciones del primer aspecto de la invención, el dominio de reconocimiento de antígeno incluye la homología de la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de un scFv multivalente que se une a un receptor P2X7 disfuncional. En algunas realizaciones, el scFv multivalente es un scFv divalente o trivalente.
En algunas realizaciones del primer aspecto de la invención, el dominio de reconocimiento de antígeno tiene la secuencia de aminoácidos de un dominio de anticuerpo único (sdAb) que se une a un receptor P2X7 disfuncional.
En algunas realizaciones, el dominio de reconocimiento de antígeno incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 o SEQ ID NO: 34 o una variante funcional de esta.
En algunas realizaciones, el dominio de reconocimiento de antígeno incluye un péptido de unión que incluye homología de secuencia de aminoácidos con una o más regiones CDR de un anticuerpo que se une a un receptor P2X7 disfuncional. En algunas realizaciones, el péptido de unión incluye una o más regiones que tienen homología de secuencia con los dominios CDR1, 2 y 3 de la cadena Vh y / o Vl de un anticuerpo que se une a un receptor P2X7 disfuncional. En algunas realizaciones, el dominio de reconocimiento de antígeno incluye una o más secuencias que son al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 94 % idénticas a cualquiera de las regiones CDR que abarcan las posiciones 30 a 35, 50 a 67 o 98 a 108 de las secuencias establecidas en SEQ ID NOS: 10, 32, 33 o 34. En algunas realizaciones, el dominio de reconocimiento de antígeno incluye una o más de las secuencias que abarcan las posiciones 30 a 35, 50 a 67 o 98 a 108 de las secuencias establecidas en SEQ ID NOS: 10, 32, 33 o 34. Las secuencias que intercalan las regiones CDR de los péptidos de unión al antígeno indicadas en SEQ ID NOS: 10, 32, 33 o 34 pueden ser cualquier secuencia adecuada que permite la formación y conformación apropiadas de las regiones CDR. En algunas realizaciones, el dominio de reconocimiento de antígeno incluye una secuencia 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %, 95 % o 99 % idéntica a una de las secuencias establecidas en SEQ ID NOS: 10, 32, 33 o 34.
Anticuerpos dirigidos contra receptores P2X7 disfuncionales, de los cuales se pueden derivar secuencias de aminoácidos adecuadas, y métodos para producir tales anticuerpos, se han descrito en la técnica (por ejemplo, las publicaciones
internacionales WO2001/020155, WO2003/020762, WO2008/043145, WO2008/043146, WO2009/033233, WO2011/ 020155 y WO2011/075789). Un experto en la técnica conocerá métodos para generar anticuerpos policlonales y monoclonales para epítopos específicos (tales como los establecidos anteriormente). A modo de resumen, un epítopo deseado (como un segmento del receptor P2X7 disfuncional que incluye la prolina en la posición 210) se inyecta en un animal huésped adecuado en presencia de una proteína portadora inmunógena apropiada y un adyuvante. A continuación, se recoge el suero del animal inmunizado y el anticuerpo puede aislarse basándose en su clase de anticuerpo o su especificidad de antígeno. Después de la evaluación de la idoneidad y especificidad del anticuerpo purificado, el anticuerpo puede procesarse adicionalmente para aislar fragmentos de unión al antígeno o secuenciarse para identificar los dominios VH y VL relevantes. Se conocen epítopos adecuados para la producción de anticuerpos dirigidos contra el receptor P2X7 disfuncional en la técnica (ver las publicaciones internacionales WO2008/043146, WO2010/000041 y WO2009/033233 como ejemplos).
El dominio de señalización del CAR puede ser cualquier dominio adecuado que sea capaz de inducir o participar en la inducción de una cascada de señalización intracelular tras la activación del CAR como resultado del reconocimiento de un antígeno por el dominio de reconocimiento de antígeno del CAR. El dominio de señalización de un CAR se elegirá específicamente dependiendo del resultado celular deseado después de la activación del CAR.
Como se usa en toda la memoria descriptiva, el término "porción", cuando se usa con respecto a un receptor de activación o receptor coestimulador, se refiere a cualquier segmento del receptor que incluye una secuencia responsable de, o involucrada en, la iniciación/inducción de una cascada de señalización intracelular después de la interacción del receptor con su ligando o antígeno afín. A continuación, se describe un ejemplo de la iniciación/inducción de una cascada de señalización intracelular para el receptor de linfocitos T (TCR, por sus siglas en inglés) a través de CD3.
Sin desear estar ligado a ninguna teoría, la porción extracelular del TCR comprende en gran parte heterodímeros de las cadenas clonotípicas TCRa y TCRp (el receptor TCRa/p) o las cadenas TCRy y TCR5 (el receptor TCRyó). Estos heterodímeros de TCR generalmente carecen de capacidades de transducción de señalización inherentes y, por lo tanto, están asociados de forma no covalente con múltiples subunidades de transducción de señales de CD3 (principalmente CD3-zeta, -gamma, -delta y -épsilon). Cada una de las cadenas gamma, delta y épsilon de CD3 tiene una porción intracelular (citoplásmica) que incluye un único motivo de activación basado en tirosina de inmunorreceptores (ITAM, por sus siglas en inglés), mientras que la cadena CD3-zeta incluye tres ITAM en tándem. Tras el acoplamiento del TCR con su antígeno afín en presencia de MHC, y la asociación de un correceptor requerido como CD4 o CD8, se inicia la señalización que da como resultado una tirosina cinasa (a saber, Lck) que fosforila los dos residuos de tirosina dentro de ITAM(s) intracelular(es) de las cadenas CD3. Posteriormente, se recluta una segunda tirosina cinasa (ZAP-70, activada a su vez por la fosforilación de Lck) para bifosforilar los ITAM. Como resultado, se activan varias proteínas diana posteriores, lo que eventualmente conduce a cambios conformacionales intracelulares, movilización de calcio y reordenación del citoesqueleto de actina que, cuando se combinan, finalmente conducen a la activación de factores de transcripción y la inducción de una respuesta inmunitaria de linfocitos T.
Tal como se utiliza en toda la memoria descriptiva, el término "receptor de activación" se refiere a receptores, o correceptores que forman un componente de, o están implicados en la formación del complejo del receptor de linfocitos T (TCR), o receptores implicados en la activación específica de células inmunitarias como resultado del reconocimiento de un estímulo antigénico u otro inmunógeno.
Los ejemplos no limitantes de tales receptores de activación incluyen componentes del complejo receptor de linfocitos T-CD3 (CD3-zeta, -gamma, -delta y -épsilon), el correceptor de CD4, el correceptor de CD8, los receptores de FC o receptores de activación asociados a células citolíticas (NK) tales como LY-49 (KLRA1), receptores de citotoxicidad naturales (NCR, preferiblemente NKp46, NKp44, NKp30 o NKG2 o el heterodímero CD94 / NKG2). En consecuencia, en algunas realizaciones del primer aspecto de la presente invención, el dominio de señalización incluye una porción derivada de uno cualquiera o más de un miembro del complejo de correceptor de CD3 (preferiblemente la cadena CD3-Z o una porción de esta), el correceptor de CD4, el correceptor de CD8, un receptor de Fc (FcR) (preferiblemente el FcsRI o FcyRI) o receptores asociados a NK tales como LY-49.
La porción de transducción de señales intracelulares específica de cada una de las cadenas CD3 se conoce en la técnica. A modo de ejemplo, la región citoplásmica intracelular de la cadena CD3Z abarca desde el aminoácido 52 hasta el aminoácido 164 de la secuencia establecida en SEQ ID NO: 4, con las tres regiones ITAM que abarcan los aminoácidos 61 a 89, 100 a 128 y 131 a 159 de SEQ ID NO: 4. Además, la porción intracelular de la cadena CD3s abarca los aminoácidos 153 a 207 de la secuencia establecida en SEQ ID NO: 5, con la única región ITAM que abarca los aminoácidos 178 a 205 de SEQ ID NO: 5. La porción intracelular de la cadena CD3y abarca los aminoácidos 138 a 182 de la secuencia establecida en SEQ ID NO: 6 con la región ITAM única que abarca los aminoácidos 149 a 177 de SEQ ID NO: 6. La porción intracelular de CD35 abarca los aminoácidos 127 a 171 de la secuencia establecida en SEQ ID NO: 7 con la región ITAM única que abarca los aminoácidos 138 a 166 de SEQ ID NO: 7.
En algunas realizaciones del primer aspecto de la presente invención, el dominio de señalización incluye una porción derivada de cualquiera de CD3 (preferiblemente la cadena CD3-Z o una porción de esta) o un receptor de FC (preferiblemente el FcsRI o FcyRI). En algunas realizaciones, la porción del complejo de correceptor de CD3-Z incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 22, o una variante funcional de esta.
Las porciones intracelulares de los receptores de FC son conocidas en la técnica. Por ejemplo, las porciones intracelulares de FcsR1 abarcan los aminoácidos 1 a 59, 118 a 130 y 201 a 244 de la secuencia establecida en SEQ ID NO: 8. Además, la porción intracelular de FcyRI abarca los aminoácidos 314 a 374 de la secuencia establecida en SEQ ID NO: 9.
Se pueden utilizar varias combinaciones de porciones de receptores de activación para formar las porciones transmembrana (TM) e intracelular (IC) del CAR, por ejemplo, CD3Z TM y CD3Z IC (Landmeier S. et al. Cancer Res.
2007; 67: 8335-43; Rd invitado. et al., J Immunother. 2005, 28: 203-11; Hombach Aa . et al. J Immunol. 2007; 178: 4650-7), el CD4 TM y CD3Z IC (James SE. et al. J Immunol. 2008; 180: 7028-38), el CD8 TM y CD3Z IC (Patel SD. et al. Gene Ther. 1999; 6: 412-9), y el FcsRIy TM y el FcsRIy IC (Haynes NM. et al. J Immunol. 2001; 166: 182­ 7; Annenkov AE. et al. J Immunol. 1998; 161: 6604-13).
Tal como se utiliza en toda la memoria descriptiva, el término "receptor coestimulador" se refiere a receptores o correceptores que ayudan en la activación de una célula inmunitaria tras la inducción específica de antígeno de un receptor de activación. Como se entenderá, los receptores coestimuladores no requieren la presencia de antígeno y no son específicos de antígeno, pero son típicamente una de dos señales, siendo la otra una señal de activación, que se requiere para la inducción de una respuesta celular inmunitaria. En el contexto de una respuesta inmunitaria, un receptor de coestimulación se activa típicamente por la presencia de su ligando expresado en la superficie de una célula presentadora de antígeno (APC, por sus siglas en inglés), como una célula dendrítica o macrófago. Con respecto específicamente a los linfocitos T, la coestimulación es necesaria para conducir a la activación, proliferación, diferenciación y supervivencia celular (todas las cuales se denominan generalmente bajo el paraguas de activación de linfocitos T), mientras que la presentación de un antígeno a un linfocito T en la ausencia de coestimulación puede conducir a anergia, eliminación clonal y/o al desarrollo de tolerancia antigénica específica. Es importante destacar que las moléculas coestimuladoras pueden informar la respuesta de los linfocitos T a un antígeno encontrado simultáneamente. Generalmente, un antígeno encontrado en el contexto de una molécula coestimuladora "positiva" conducirá a la activación del linfocito T y una respuesta inmunitaria celular dirigida a eliminar las células que expresan ese antígeno. Mientras que un antígeno encontrado en el contexto de un correceptor "negativo" conducirá a un estado inducido de tolerancia al antígeno coencontrado.
Los ejemplos no limitantes de receptores coestimuladores de linfocitos T incluyen CD27, CD28, CD30, CD40, DAP10, OX40, 4-1BB (CD137), ICOS. Específicamente, CD27, CD28, CD30, CD40, DAP10, OX40, 4-1BB (CD137) e ICOS representan moléculas coestimuladoras "positivas" que mejoran la activación de una respuesta de linfocitos T. Por consiguiente, en algunas realizaciones del primer aspecto de la presente invención, el dominio de señalización incluye una porción derivada de uno cualquiera o más de c D27, CD28, CD30, CD40, DAP10, OX40, 4-1 BB (CD137) e ICOS.
En algunas realizaciones del primer aspecto de la presente invención, el dominio de señalización incluye una porción derivada de los receptores coestimuladores CD28, OX40 o 4-1BB. En algunas realizaciones, el dominio de señalización incluye una parte del receptor coestimulador CD28. En algunas realizaciones, el dominio de señalización incluye una porción del receptor coestimulador OX40. En algunas realizaciones, la porción del receptor coestimulador OX40 incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 20, o una variante funcional de esta.
Se pueden utilizar varias combinaciones de porciones de receptores coestimuladores para formar las porciones transmembrana (TM) e intracelular (IC) del CAR. Por ejemplo, c D8 TM y DAP10 IC o CD8 TM y 4-1 BB IC (Marin V. et al. Exp Hematol. 2007; 35: 1388-97), el CD28 TM y el CD28 IC (Wilkie S. et al. J Immunol. 2008; 180: 4901 -9; Maher J. et al. Nat Biotechnol. 2002; 20: 70-5) y el CD8 TM y el CD28 IC (Marin V. et al. Exp Hematol. 2007; 35: 1388-97).
La información de la secuencia para los receptores coestimuladores y de activación mencionados anteriormente es fácilmente accesible en una variedad de bases de datos. Por ejemplo, en la Tabla 2 se proporcionan realizaciones de secuencias de aminoácidos, genes y ARNm humanos para estos receptores.
Tabla 2
Resumen de la información de la secuencia del receptor de activación y coestimulación
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Aunque la Tabla 2 se proporciona con referencia alos receptores de activación y coestimuladores humanos, una persona experta en la técnica entenderá que las versiones homólogas y ortólogas de cada receptor están presentes en la mayoría de las especies de mamíferos y vertebrados. Por lo tanto, las secuencias mencionadas anteriormente solo se proporcionan como ejemplos no limitantes de secuencias de receptores que pueden incluirse en un CAR del primer aspecto de la presente invención y las secuencias homólogas y ortólogas de cualquier especie deseada pueden usarse para generar un CAR que es adecuado para la especie dada.
En algunas realizaciones del primer aspecto de la invención, el dominio de señalización incluye una porción derivada de un receptor de activación y una porción derivada de un receptor coestimulador. Sin desear estar ligado a ninguna teoría, en este contexto el reconocimiento de un antígeno por el dominio de reconocimiento de antígeno del CAR inducirá simultáneamente tanto una señal de activación intracelular como una señal coestimuladora intracelular. En consecuencia, esto simulará la presentación de un antígeno por un ligando coestimulador que expresa APC. Alternativamente, el CAR podría tener un dominio de señalización que incluye una porción derivada de un receptor de activación o un receptor coestimulador. En esta forma alternativa, el CAR solo inducirá una cascada de señalización intracelular activante o una cascada de señalización intracelular coestimuladora.
En algunas realizaciones del primer aspecto de la invención, el CAR tendrá un dominio de señalización que incluye una porción derivada de un único receptor de activación y porciones derivadas de múltiples receptores coestimuladores. En algunas realizaciones, el CAR tendrá un dominio de señalización que incluye porciones derivadas de múltiples receptores de activación y una porción derivada de un único receptor coestimulador. En algunas realizaciones, el CAR tendrá un dominio de señalización que incluye porciones derivadas de múltiples receptores de activación y porciones derivadas de múltiples receptores coestimuladores. En algunas realizaciones, el CAR tendrá un dominio de señalización que incluye una porción derivada de un único receptor de activación y porciones derivadas de dos receptores coestimuladores. En algunas realizaciones, el CAR tendrá un dominio de señalización que incluye una porción derivada de un único receptor de activación y porciones derivadas de tres receptores coestimuladores. En algunas realizaciones, el CAR tendrá un dominio de señalización que incluye porciones derivadas de dos receptores de activación y una porción derivada de un receptor coestimulador. En algunas realizaciones, el CAR tendrá un dominio de señalización que incluye porciones derivadas de dos receptores de activación y porciones derivadas de dos receptores coestimuladores. Como se entenderá, existen variaciones adicionales del número de receptores de activación y receptores coestimuladores de los que se puede derivar el dominio de señalización, y no se considera que los ejemplos anteriores limiten las posibles combinaciones incluidas en la presente memoria.
En algunas realizaciones del primer aspecto de la invención, el receptor quimérico para antígeno incluye la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ iD NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 52, SeQ ID NO: 53 o s Eq ID NO. : 54, o una variante funcional de SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 54. En algunas realizaciones, la variante funcional incluye una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 54.
Como se indicó anteriormente, la presente invención incluye una variante funcional de cualquiera de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 , SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 54. En el contexto de la presente invención, una "variante funcional" puede incluir cualquier secuencia de aminoácidos siempre que mantenga la función de cualquiera de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 , SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 54.
Como tal, la variante funcional puede, por ejemplo, tener una o más inserciones, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos con respecto a una de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 54; una forma mutante o variante alélica de una de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 32 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 54; un ortólogo de uno de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO : 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 54; un homeólogo de uno de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO : 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 54; un análogo de uno de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO : 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 54; y similares, siempre que la variante funcional mantenga la función de cualquiera de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 , SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 54.
Por ejemplo, con respecto a SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 54, la función de un receptor quimérico para antígeno que comprende SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 54 es reconocer un receptor P2X7 disfuncional sin reconocimiento significativo del receptor P2X7 funcional, e inducir una señal intracelular que da como resultado la activación de un linfocito T que expresa el CAR. Como comprenderá un experto en la técnica, la variación de porciones de la secuencia de aminoácidos del receptor quimérico para antígeno establecida en SEQ ID NO: 26, s Eq ID NO: 27, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 54 pueden realizarse sin una alteración significativa del reconocimiento del receptor P2X7 disfuncional y/o activación de un linfocito T que expresa el CAR. Tales variaciones pueden incluir, pero no se limitan a, variaciones en la región de bisagra del receptor quimérico para antígeno, variaciones en el dominio transmembrana y variaciones en las porciones de los receptores de activación y/o receptores coestimuladores que comprenden el dominio intracelular del receptor quimérico para antígeno.
Como se indicó anteriormente, la variante funcional puede comprender sustituciones, eliminaciones o inserciones de aminoácidos individuales con respecto a una de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26 , SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 54. Por ejemplo, un experto en la técnica reconocerá que cualquier aminoácido puede sustituirse con un aminoácido químicamente (funcionalmente) similar y conservar la función del polipéptido. Tales sustituciones conservadoras de aminoácidos son bien conocidas en la técnica. Los siguientes grupos en la Tabla 3 contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservadoras entre sí.
Tabla 3
Sustituciones conservadoras de aminoácidos ilustrativas
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Además, si se desea, se pueden introducir aminoácidos no naturales o análogos de aminoácidos químicos como una sustitución o adición en un polipéptido incluido en la presente memoria. Dichos aminoácidos incluyen, pero no se limitan a, los isómeros D de los aminoácidos comunes, ácido 2,4-diaminobutírico, ácido a-amino isobutírico, ácido 4-aminobutírico, ácido 2-aminobutírico, ácido 6-amino hexanoico, ácido 2-amino isobutírico, ácido 3-amino propiónico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, homocitrulina, ácido cisteico, t-butilglicina, tbutilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina, p-alanina, fluoro-alanina, aminoácidos de diseño tales como p-metilaminoácidos, Ca-metil-aminoácidos, N-metil-aminoácidos y análogos de aminoácidos en general.
Como se estableció anteriormente, una variante funcional de cualquiera de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 54 puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 % idéntica a cualquiera de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 54. En otras realizaciones, una variante funcional puede comprender al menos 85 % de identidad de secuencia de aminoácidos, al menos 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos, al menos 91 % de identidad de secuencia de aminoácidos, al menos 92 % de identidad de secuencia de aminoácidos, al menos 93 % de identidad de secuencia de aminoácidos, al menos 94 % de identidad de secuencia de aminoácidos, al menos 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos, al menos 96 % de aminoácido identidad de secuencia, al menos 97 % de identidad de secuencia de aminoácidos, al menos 98 % de identidad de secuencia de aminoácidos, al menos 99 % de identidad de secuencia de ácido o al menos 99,1 %, 99,2 %, 99,3 %, 99,4 %, 99,5 %, 99,6 %, 99,7 %, 99,8 % o 99,9 % de identidad de secuencia de aminoácidos con cualquiera de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO : 52, SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 54.
Cuando se comparan secuencias de aminoácidos, las secuencias deben compararse en una ventana de comparación que está determinada por la longitud del polipéptido. Por ejemplo, se contempla una ventana de comparación de al menos 20 residuos de aminoácidos, al menos 50 residuos de aminoácidos, al menos 75 residuos de aminoácidos, al menos 100 residuos de aminoácidos, al menos 200 residuos de aminoácidos, al menos 300 residuos de aminoácidos, al menos al menos 400 residuos de aminoácidos, al menos 500 residuos de aminoácidos, al menos 600 residuos de aminoácidos, o en toda la longitud de cualquiera de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 54. La ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, huecos) de aproximadamente el 20 % o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o eliminaciones) para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. La alineación óptima de secuencias para alinear una ventana de comparación se puede realizar mediante implementaciones computarizadas de algoritmos tales como la familia de programas BLAST como, por ejemplo, divulgado por Altschul et al., 1997, Nucl. Acids Res. 25: 3389­ 3402. También se pueden utilizar programas de alineación global para alinear secuencias similares de aproximadamente el mismo tamaño. Ejemplos de programas de alineación global incluyen NEEDLE (disponible en www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/) que es parte del paquete EMBOSS (Rice P et al., 2000, Trends Genet., 16: 276-277.) y el programa GGSEa Rc H (disponible en fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_www.cgi?rm=compare&pgm=gnw) que forma parte del paquete FASTA (Varita de Pearson Lipman D, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU., 85: 2444-2448). Ambos programas se basan en el algoritmo Needleman-Wunsch que se utiliza para encontrar la alineación óptima (incluidos los espacios) de dos secuencias a lo largo de toda su longitud. También se puede encontrar una descripción detallada del análisis de secuencia en la Unidad 19.3 de Ausubel et al ("Current Protocols in Molecular Biology" John Wiley & Sons Inc, 1994­ 1998, capítulo 15, 1998).
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica el receptor quimérico para antígeno según el primer aspecto de la invención. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico de origen no natural.
En algunas realizaciones del segundo aspecto de la invención, la molécula de ácido nucleico incluye una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 54, o codifica una variante funcional de SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 54. En algunas realizaciones, la variante funcional incluye una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80 % idéntica a SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 54.
La molécula de ácido nucleico puede comprender cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN no modificado o modificado. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico puede incluir ADN monocatenario y/o bicatenario, ADN que es una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias, ARN monocatenario y bicatenario y ARN que es una mezcla de monocatenarios y bicatenarios. Regiones bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser monocatenarios o, más típicamente, bicatenarios o una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias. Además, la molécula de ácido nucleico puede comprender regiones de cadena triple que comprenden ARN o ADN o tanto ARN como ADN. La molécula de ácido nucleico también puede comprender una o más bases modificadas o cadenas principales de ADN o ARN modificadas para estabilidad o por otras razones. Se pueden realizar diversas modificaciones en el ADN y el ARN; por tanto, el término "molécula de ácido nucleico" abarca formas modificadas química, enzimática o metabólicamente.
En algunas realizaciones del segundo aspecto de la invención, la molécula de ácido nucleico incluye la secuencia de nucleótidos establecida en SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 o SEQ ID NO: 37.
Una persona experta en la técnica entenderá que cualquier secuencia de nucleótidos que codifique un receptor quimérico para antígeno que tenga la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO : 36 o SEQ ID NO: 37, o una variante funcional de SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 o SEQ ID NO: 37, está contemplada por la presente invención . Por ejemplo, se contemplan variantes de SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 o SEQ ID NO: 37 que comprenden uno o más ácidos nucleicos diferentes a SEQ ID NO: 28 , SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 o SEQ ID NO: 37 pero que todavía codifican secuencias de aminoácidos idénticas. Debido a la degeneración del código genético, una gran cantidad de ácidos nucleicos puede codificar cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todos el aminoácido alanina. Por lo tanto, en cada posición en SeQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 o SEQ ID NO: 37 donde una alanina está especificada por un codón, el codón se puede alterar para cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Por consiguiente, cada secuencia de nucleótidos en la presente memoria que codifica un receptor quimérico para antígeno que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 o SEQ ID NO: 37, o una variante funcional de SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 o SEQ ID NO: 37 también describe cada posible variación silenciosa de la secuencia de nucleótidos. Un experto reconocerá que cada codón de un ácido nucleico (excepto AUG, que normalmente es el único codón de metionina, y TGG, que normalmente es el único codón de triptófano) puede modificarse para producir una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación silenciosa de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita.
En un tercer aspecto, la presente invención proporciona una construcción de ácido nucleico que incluye una molécula de ácido nucleico según el segundo aspecto de la invención. La construcción de ácido nucleico puede comprender además uno o más de: un origen de replicación para uno o más hospedantes; un gen marcador seleccionable que está activo en uno o más hospedantes; y/o una o más secuencias de control de la transcripción.
Como se usa en la presente memoria, el término "gen marcador seleccionable'' incluye cualquier gen que confiera un fenotipo a una célula en la que se expresa, para facilitar la identificación y/o selección de células que se transfectan o transforman con la construcción.
Los "genes marcadores seleccionables" incluyen cualquier secuencia de nucleótidos que, cuando se expresa por una célula transformada con la construcción, confieren un fenotipo a la célula que facilita la identificación y/o selección de estas células transformadas. Se conocen en la técnica una variedad de secuencias de nucleótidos que codifican marcadores seleccionables adecuados (por ejemplo, Mortesen, RM. y Kingston RE. Curr Protoc. Mol Biol, 2009; Unidad 9.5). Las secuencias de nucleótidos ejemplares que codifican marcadores seleccionables incluyen: gen de la adenosina desaminasa (ADA); Gen de la citosina desaminasa (CDA); Gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR); Gen de la histidinol deshidrogenasa (hisD); Gen de puromicina-N-acetil transferasa (PAC); Gen de la timidina cinasa (TK); Gen de xantina-guanina fosforribosiltransferasa (XGPRT) o genes de resistencia a antibióticos tales como genes de resistencia a ampicilina, genes de resistencia a puromicina, genes de resistencia a bleomicina, genes de resistencia a higromicina, genes de resistencia a kanamicina y gen de resistencia a ampicilina; genes informadores fluorescentes tales como los genes que codifican proteínas fluorescentes verde, rojo, amarillo o azul; y genes indicadores basados en luminiscencia, como el gen de la luciferasa, entre otros, que permiten la selección óptica de células utilizando técnicas como la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).
Además, debe tenerse en cuenta que el gen marcador seleccionable puede ser un marco de lectura abierto distinto en la construcción o puede expresarse como una proteína de fusión con otro polipéptido (p. ej., el CAR).
Como se estableció anteriormente, la construcción de ácido nucleico también puede comprender una o más secuencias de control de la transcripción. Debe entenderse que el término "secuencia de control de la transcripción" incluye cualquier secuencia de ácido nucleico que efectúe la transcripción de un ácido nucleico conectado operativamente. Una secuencia de control de la transcripción puede incluir, por ejemplo, un líder, una secuencia de poliadenilación, un promotor, un potenciador o una secuencia de activación cadena arriba y un terminador de la transcripción. Típicamente, una secuencia de control de la transcripción incluye al menos un promotor. El término "promotor" como se usa en la presente memoria, describe cualquier ácido nucleico que confiere, activa o mejora la expresión de un ácido nucleico en una célula.
En algunas realizaciones, al menos una secuencia de control de la transcripción está operativamente conectada a la molécula de ácido nucleico del segundo aspecto de la invención. Para los propósitos de la presente memoria descriptiva, una secuencia de control de la transcripción se considera "operativamente conectada" a una molécula de ácido nucleico dada cuando la secuencia de control de la transcripción es capaz de promover, inhibir o modular de otro modo la transcripción de la molécula de ácido nucleico. Por tanto, en algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico está bajo el control de una secuencia de control de la transcripción, como un promotor constitutivo o un promotor inducible.
La "construcción de ácido nucleico" puede estar en cualquier forma adecuada, tal como en forma de plásmido, fago, transposón, cósmido, cromosoma, vector, etc., que es capaz de replicarse cuando se asocia con los elementos de control adecuados y que puede transferir secuencias de genes, contenidas dentro de la construcción, entre células. Por tanto, el término incluye vehículos de clonación y expresión, así como vectores virales. En algunas realizaciones, la construcción de ácido nucleico es un vector. En algunas realizaciones, el vector es un vector viral.
Un promotor puede regular la expresión de una molécula de ácido nucleico conectada operativamente de forma constitutiva o diferencial con respecto a la célula, tejido u órgano en el que se produce la expresión. Como tal, el promotor puede incluir, por ejemplo, un promotor constitutivo o un promotor inducible. Un "promotor constitutivo" es un promotor que está activo en la mayoría de las condiciones ambientales y fisiológicas. Un "promotor inducible" es un promotor que es activo en condiciones ambientales o fisiológicas específicas. La presente invención contempla el uso de cualquier promotor que sea activo en una célula de interés. Como tal, un experto en la técnica podría determinar fácilmente una amplia gama de promotores.
Los promotores constitutivos de mamíferos pueden incluir, entre otros, virus del simio 40 (SV40), citomegalovirus (CMV), P-actina, ubiquitina C (UBC), factor de elongación 1 alfa (EF1A), fosfoglicerato cinasa (PGK) y potenciador temprano de CMV/actina p de pollo (CAGG).
Los promotores inducibles pueden incluir, pero no se limitan a, promotores químicamente inducibles y promotores físicamente inducibles. Los promotores químicamente inducibles incluyen promotores que tienen actividad regulada por compuestos químicos tales como alcoholes, antibióticos, esteroides, iones metálicos u otros compuestos. Ejemplos de promotores químicamente inducibles incluyen: promotores regulados por tetraciclina (p. ej., ver la patente estadounidense 5.851.796 y la patente estadounidense 5.464.758); promotores sensibles a los esteroides como los promotores del receptor de glucocorticoides (por ejemplo, ver la patente estadounidense 5.512.483), promotores del receptor de ecdisona (por ejemplo, ver la patente estadounidense 6.379.945) y similares; y promotores sensibles a metales tales como promotores de metalotioneína (por ejemplo, ver la patente estadounidense 4.940.661, la patente estadounidense 4.579.821 y US 4.601.978) entre otros.
Como se mencionó anteriormente, las secuencias de control también pueden incluir un terminador. El término "terminador" se refiere a una secuencia de ADN al final de una unidad transcripcional que señala la terminación de la transcripción. Los terminadores son secuencias de ADN no traducidas en 3' que generalmente contienen una señal de poliadenilación, que facilitan la adición de secuencias de poliadenilato al extremo 3' de un transcrito primario. Al igual que con las secuencias promotoras, el terminador puede ser cualquier secuencia terminadora que sea operable en las células, tejidos u órganos en los que se pretende usar. Un experto en la técnica conocerá los terminadores adecuados.
Como se entenderá, la construcción de ácido nucleico del tercer aspecto de la invención puede incluir además secuencias adicionales, por ejemplo, secuencias que permitan una expresión, transporte citoplásmico o de membrana y señales de localización mejorados. Los ejemplos específicos no limitantes incluyen un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES, por sus siglas en inglés).
La presente invención se extiende a todas las construcciones genéticas esencialmente como se describe en la presente memoria. Estas construcciones pueden incluir además secuencias de nucleótidos destinadas al mantenimiento y/o replicación de la construcción genética en eucariotas y/o la integración de la construcción genética o una parte de esta en el genoma de una célula eucariota.
Se conocen en la técnica métodos para la introducción deliberada (transfección/transducción) de material genético exógeno, tal como la construcción de ácido nucleico del tercer aspecto de la presente invención, en células eucariotas. Como se entenderá, el método más adecuado para introducir la construcción de ácido nucleico en la célula hospedante deseada depende de muchos factores, como el tamaño de la construcción de ácido nucleico, el tipo de célula hospedante y la tasa deseada de eficiencia de la transfección/transducción y la viabilidad final deseada, o requerida, de las células transfectadas/transducidas. Los ejemplos no limitantes de tales métodos incluyen; transfección química con productos químicos como polímeros catiónicos, fosfato de calcio o estructuras como liposomas y dendrímeros; métodos no químicos como electroporación, sonoporaciones, choque térmico o transfección óptica; métodos basados en partículas como el suministro por "pistola de genes", magnetofección o impalefección o transducción viral.
La construcción de ácido nucleico se seleccionará dependiendo del método de transfección/transducción deseado. En algunas realizaciones del tercer aspecto de la invención, la construcción de ácido nucleico es un vector viral y el método para introducir la construcción de ácido nucleico en una célula hospedante es la transducción viral. Se conocen en la técnica métodos para utilizar la transducción viral para provocar la expresión de un CAR en una PBMC (Parker, LL. et al. Hum Gene Ther. 2000; 11: 2377-87) y más generalmente utilizando sistemas retrovirales para la transducción de células de mamíferos (Cepko, C. y Pear, W. Curr Protoc Mol Biol. 2001, unidad 9.9). En otras realizaciones, la construcción de ácido nucleico es un plásmido, un cósmido, un cromosoma artificial o similar, y se puede transfectar en la célula mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica.
En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona una célula modificada genéticamente que incluye el receptor quimérico para antígeno según el primer aspecto de la invención.
En algunas realizaciones del cuarto aspecto de la invención, la célula modificada genéticamente incluye dos o más CAR diferentes.
En un quinto aspecto, la invención proporciona una célula modificada genéticamente que incluye la molécula de ácido nucleico según el segundo aspecto de la invención, o incluye la construcción de ácido nucleico según el tercer aspecto de la invención, o una forma genómica integrada de la construcción de ácido nucleico.
En algunas realizaciones del quinto aspecto de la invención, la célula modificada genéticamente incluye una molécula de ácido nucleico, o una construcción de ácido nucleico, que codifica dos o más CAR diferentes. En algunas realizaciones del quinto aspecto de la invención, la célula modificada genéticamente incluye dos o más moléculas de ácido nucleico, o dos o más construcciones de ácido nucleico, cada una de las cuales codifica un CAR diferente.
Como se menciona en la presente memoria, una "célula modificada genéticamente" incluye cualquier célula que comprenda una molécula de ácido nucleico o una construcción de ácido nucleico introducida y/o de origen no natural abarcada por la presente invención. La molécula de ácido nucleico introducida o la construcción de ácido nucleico se puede mantener en la célula como una molécula de ADN discreta, o se puede integrar en el ADN genómico de la célula.
El ADN genómico de una célula debe entenderse en su contexto más amplio para incluir todo el ADN endógeno que constituye el complemento genético de una célula. Como tal, debe entenderse que el ADN genómico de una célula incluye cromosomas, ADN mitocondrial y similares. Como tal, el término "integrado genómicamente" contempla la integración cromosómica, la integración del ADN mitocondrial y similares. La "forma genómicamente integrada" de la construcción puede ser todo o parte de la construcción. Sin embargo, en algunas realizaciones, la forma genómicamente integrada de la construcción incluye al menos la molécula de ácido nucleico del segundo aspecto de la invención.
Como se usa en la presente memoria, el término "CAR diferentes" o "receptores quiméricos para antígenos diferentes" se refiere a dos o más CAR que tienen dominios de reconocimiento de antígeno y/o de señalización no idénticos. En un ejemplo, "diferentes CAR" incluye dos CAR con los mismos dominios de reconocimiento de antígenos (p. ej., ambos CAR pueden reconocer un receptor P2X7 disfuncional), pero tienen diferentes dominios de señalización, como un CAR que tiene un dominio de señalización con una parte de un receptor de activación y el otro CAR que tiene un dominio de señalización con una parte de un receptor coestimulador. Como se entenderá, al menos uno de los dos o más CAR dentro de esta realización tendrá un dominio de reconocimiento de antígeno que reconoce el receptor P2X7 disfuncional y los otros CAR(s) pueden tomar cualquier forma adecuada y pueden dirigirse contra cualquier antígeno adecuado.
Por consiguiente, en algunas realizaciones de los aspectos cuarto y quinto de la invención, los dos o más CAR diferentes tienen dominios de señalización diferentes y pueden tener dominios de reconocimiento de antígenos idénticos o diferentes. Específicamente, la célula modificada genéticamente según el cuarto o quinto aspecto de la invención puede incluir un primer receptor quimérico para antígeno con un dominio de señalización que incluye una porción derivada de un receptor de activación y un segundo receptor quimérico para antígeno con un dominio de señalización que incluye una porción derivada de un receptor coestimulador.
En algunas realizaciones del cuarto o quinto aspecto de la invención, el receptor de activación (del que se deriva una porción del dominio de señalización) es el complejo correceptor CD3 o es un receptor Fc.
En algunas realizaciones del cuarto o quinto aspecto de la invención, el receptor coestimulador (del cual se deriva una porción del dominio de señalización) se selecciona del grupo que consiste en CD27, CD28, CD-30, CD40, DAP10, OX40, 4-1BB (CD137) e ICOS.
En algunas realizaciones del cuarto o quinto aspecto de la invención, el receptor coestimulador (del que se deriva una porción del dominio de señalización) se selecciona del grupo que consiste en CD28, OX40 o 4-1 BB.
En algunas realizaciones de los aspectos cuarto y quinto de la invención, la célula modificada genéticamente se modifica adicionalmente para expresar constitutivamente receptores coestimuladores.
Como se describió anteriormente, una respuesta inmunitaria celular típicamente solo se induce cuando se experimentan simultáneamente una señal de activación (típicamente en respuesta a un antígeno) y una señal de coestimulación. Por lo tanto, al tener una célula genéticamente modificada según algunas de las realizaciones anteriores, que incluye dos o más CAR que en combinación proporcionan tanto una señal de activación intracelular como una señal de coestimulación intracelular, se asegura que se pueda inducir una respuesta inmunitaria suficiente en respuesta al reconocimiento por el(los) CAR(s) de su antígeno afín. Alternativamente, la célula genéticamente modificada puede incluir solo un CAR, que tiene un dominio de reconocimiento de antígeno que reconoce un receptor P2X7 disfuncional, y pueden expresar constitutivamente receptores coestimuladores, aumentando así la probabilidad de que se proporcione coestimulación simultáneamente cuando se activa el CAR. Alternativamente, la célula modificada genéticamente puede modificarse adicionalmente para expresar constitutivamente tanto el receptor o receptores coestimuladores como su ligando o sus ligandos. De esta manera, la célula experimenta continuamente coestimulación y solo necesita la activación de un CAR, con un dominio de señalización que incluye una parte de un receptor de activación, para la activación inmunitaria de la célula.
Por lo tanto, en algunas realizaciones del cuarto o quinto aspecto de la invención, la célula modificada genéticamente se modifica adicionalmente para expresar constitutivamente receptores coestimuladores. En realizaciones adicionales, la célula genéticamente modificada se modifica adicionalmente para expresar ligandos para los receptores coestimuladores, facilitando así la autoestimulación de la célula. Se conocen en la técnica ejemplos de linfocitos T que expresan CAR que también expresan tanto receptores coestimuladores como sus ligandos afines (para inducir la autoestimulación) e incluyen, interalia, los divulgados en Stephen MT. et al. Nat Med, 2007; 13: 1440-9.
La potencia de una célula modificada genéticamente que incluye un CAR se puede mejorar modificando adicionalmente la célula para que secrete citocinas, preferiblemente citocinas proinflamatorias o proproliferativas. Esta secreción de citocinas proporciona tanto apoyo autocrino para la célula que expresa el CAR como altera el entorno local que rodea a la célula que expresa el CAR de modo que se reclutan y activan otras células del sistema inmunitario. En consecuencia, en algunas realizaciones del cuarto o quinto aspecto de la invención, la célula modificada genéticamente se modifica adicionalmente para secretar citocinas. Esta secreción puede ser constitutiva o puede ser inducible tras el reconocimiento de un CAR de su antígeno afín de ligando.
Si bien se pueden seleccionar una o más citocinas dependiendo de la respuesta inmunitaria deseada, las citocinas preferidas incluyen IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-17 e IL-21, o una combinación de estas.
La célula modificada genéticamente del cuarto o quinto aspecto de la invención puede ser cualquier célula inmunitaria adecuada, o puede ser una población celular homogénea o heterogénea. En algunas realizaciones, la célula es un leucocito, una célula mononuclear de sangre periférica (PBMC), un linfocito, un linfocito T, un linfocito T CD4+, un linfocito T CD8+, una célula citolítica natural o un linfocito T citolítico natural.
En un sexto aspecto, la presente invención proporciona una célula modificada genéticamente según la invención para su uso en un método para destruir una célula que expresa un receptor P2X7 disfuncional, el método que incluye exponer la célula que expresa un receptor P2X7 disfuncional a la célula genéticamente modificada.
Por tanto, según el sexto aspecto de la invención, el CAR reconoce directamente el receptor P2X7 disfuncional.
Como se usa en la presente memoria, el término "reconoce directamente" incluye la unión directa del dominio de reconocimiento de antígeno del CAR al receptor P2X7 disfuncional, o un epítopo de este, cuando el receptor está presente en su forma natural. En otro ejemplo no limitante, el dominio de reconocimiento de antígenos puede unirse directamente a una forma procesada del receptor P2X7 disfuncional, que puede ser presentado por moléculas presentadoras de antígeno como el complejo principal de histocompatibilidad (MHC).
En algunas realizaciones del sexto aspecto de la invención, la célula que tiene un receptor P2X7 disfuncional está dentro del cuerpo de un sujeto. En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano. En algunas realizaciones, el método incluye además exponer la célula que expresa un receptor P2X7 disfuncional a uno genéticamente modificado junto con una citocina exógena.
En algunas realizaciones del sexto aspecto de la invención, la célula genéticamente modificada es una célula genéticamente modificada autóloga de la célula que expresa un receptor P2X7 disfuncional del sujeto.
En algunas realizaciones del sexto aspecto de la invención, la célula que expresa un receptor P2X7 disfuncional está dentro del cuerpo de un sujeto. En algunas realizaciones del sexto aspecto de la invención, la célula que expresa un receptor P2X7 disfuncional es una célula cancerosa.
En algunas realizaciones del sexto aspecto, la presente invención proporciona una célula modificada genéticamente para su uso en un método de tratamiento o prevención del cáncer en un sujeto, el método incluye proporcionar a un sujeto una célula modificada genéticamente que tiene un receptor quimérico para antígeno, en donde el receptor quimérico para antígeno está dirigido contra una célula diana que tiene un receptor P2X7 disfuncional.
Debe entenderse que los términos "tratar", "tratar" o "tratamiento", como se usan en la presente memoria, incluyen dentro de su alcance uno o más de los siguientes resultados: (i) inhibir hasta cierto punto el crecimiento de un tumor primario en un sujeto , incluida la desaceleración y la detención completa del crecimiento, y la reducción del crecimiento del tumor primario después de la resección; (ii) inhibir hasta cierto punto el crecimiento y la formación de uno o más tumores secundarios en un sujeto; (iii) reducir el número de células tumorales en un sujeto; (iv) reducir el tamaño de un tumor en el sujeto; (v) inhibir (es decir, reducir, ralentizar o detener por completo) la infiltración de células tumorales en órganos periféricos; (vi) inhibir (es decir, reducción, ralentización o detención completa) de la metástasis; (vii) mejorar la esperanza de vida de un sujeto en comparación con el estado no tratado; (viii) mejorar la calidad de vida de un sujeto en comparación con el estado no tratado; (ix) aliviar, atenuar o mejorar al menos un síntoma de cáncer en un sujeto; (x) provocar la regresión o remisión del cáncer en un sujeto; (xi) aliviar una afección en un sujeto causada por cáncer; y (xii) detener los síntomas en un sujeto que están asociados con el cáncer.
Los términos "prevenir" o "prevenir" como se usan en la presente memoria deben entenderse que incluyen dentro de su alcance inhibir la formación de un tumor primario en un sujeto, inhibir la formación de uno o más tumores secundarios en un sujeto, o reducir o eliminar la recurrencia del cáncer en un sujeto en remisión.
El término "inhibir", como se usa en la presente memoria, significa una disminución o reducción en el crecimiento de un cáncer, una célula cancerosa o un tumor cuando se compara con el crecimiento en un testigo, tal como una célula o un sujeto no tratado. En algunas realizaciones, el crecimiento puede disminuirse o reducirse en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 %, en relación con un testigo no tratado.
La inhibición del crecimiento de un cáncer, un tumor o una célula cancerosa se puede evaluar mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, para una célula cancerosa in vitro, el crecimiento de la célula puede determinarse mediante un ensayo de proliferación adecuado o mediante un método que evalúe el grado de incorporación de timidina tritiada en el ADN celular durante un período de tiempo determinado. Para un tumor o una célula cancerosa presente en vivo, el crecimiento del tumor o la célula puede determinarse, por ejemplo, mediante un método de formación de imágenes adecuado conocido en la técnica.
El término "sujeto", como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier animal capaz de padecer cáncer. Los temas particulares de interés son los seres humanos y las especies científicamente relevantes como ratones, ratas, hurones, cobayas, hámsteres, primates no humanos, perros, cerdos y ovejas, o animales económicamente relevantes como caballos, perros, gatos y ganado. En una realización preferida del sexto aspecto de la invención, el sujeto es un ser humano.
Una referencia a "proporcionar a un sujeto" se refiere a administrar al sujeto la célula modificada genéticamente. Alternativamente, la célula modificada genéticamente se puede generar dentro del sujeto. Por ejemplo, la célula genéticamente modificada puede generarse en vivo de manera que el sujeto tenga una población endógena de células modificadas genéticamente. Medios adecuados para tal generación in vivo son conocidos en la técnica e incluyen la terapia génica de un sujeto.
Como se usa en toda la memoria descriptiva, una referencia a un CAR que se "dirige" contra una célula diana que tiene un receptor P2X7 disfuncional contempla la orientación selectiva de una respuesta inmunitaria hacia una célula basada en la célula que tiene un receptor P2X7 disfuncional. Es importante destacar que dicho direccionamiento no se limita al reconocimiento directo del receptor P2X7 disfuncional por un CAR. Es decir, el CAR en sí mismo no tiene que reconocer ni unirse directamente al receptor P2X7 disfuncional, sino que simplemente tiene que ser capaz de reconocer selectivamente y ser activado por una célula que expresa una receptor P2X7 disfuncional.
En un séptimo aspecto, la presente invención proporciona una célula genéticamente modificada para su uso en un método de tratamiento o prevención del cáncer en un sujeto, el método incluye la administración al sujeto de una célula genéticamente modificada según un cuarto o quinto aspecto de la invención.
Aunque la provisión de una célula modificada genéticamente que expresa un CAR dirigida contra una célula diana que tiene un receptor P2X7 disfuncional puede ser suficiente para proporcionar una inmunoterapia eficaz contra células precancerosas o cancerosas, la provisión de adyuvantes junto con las células modificadas genéticamente puede mejorar aún más la inducción de la respuesta inmunitaria y puede aumentar la inmunoterapia. Las citocinas, preferiblemente las citocinas proinflamatorias, son adyuvantes particularmente adecuados para proporcionar a un sujeto junto con células modificadas genéticamente que tienen CAR.
Por tanto, en algunas realizaciones de los aspectos sexto y séptimo de la invención, la célula modificada genéticamente se administra al sujeto junto con una citocina. Debe entenderse que, tal como se utiliza en toda la memoria descriptiva, el término "junto con" incluye la célula modificada genéticamente que se administra simultáneamente con una citocina o se administra en combinación con una citocina. En consecuencia, cuando se administra en combinación con una citocina, se puede considerar que incluye una terapia de combinación mediante la cual la inmunoterapia de un sujeto incluye tanto el tratamiento con una citocina como el tratamiento con una célula modificada genéticamente que tiene un CAR dirigido contra una célula diana que expresa un receptor P2X7 disfuncional. En algunas formas, la citocina se administra en un día diferente (>24 horas) a la administración de las células modificadas genéticamente. En otras formas, la citocina se administra el mismo día (dentro de las 24 horas) que las células modificadas genéticamente. En otras formas, la(s) citocina(s) y la célula genéticamente modificada se administran dentro de las 18 horas, 12 horas, 6 horas, 4 horas, 2 horas, 1 hora, 45 minutos, 30 minutos, 15 minutos, 10 minutos, 5 minutos, 2 minutos o 1 minuto entre sí.
Las citocinas adecuadas para la administración junto con la célula modificada genéticamente incluyen IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-9, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-21. , IL-23, IFNa, IFNp, IFNy, GM-CSF, TGFp y TNFa. Las citocinas preferidas incluyen IL-2 e IFNa. Además, las citocinas pueden administrarse como formas recombinantes, formas naturales o mediante sistemas de administración tales como fusiones con proteínas, administradas como una secuencia de ácido nucleico que se expresa en la célula genéticamente modificada o conjugada con un polímero como polietilenglicol (PEG).
La célula que se va a modificar genéticamente se puede obtener de cualquier fuente adecuada. En algunas realizaciones del sexto o séptimo aspecto de la invención, la célula a modificar genéticamente es una célula autóloga, siendo una célula autóloga de la célula que expresa un receptor P2X7 disfuncional. De manera ventajosa, una célula autóloga no sería reconocida como "no propia" por el sistema inmunitario del sujeto y, por lo tanto, sería tolerada por el sujeto. Sin embargo, en algunas formas de cáncer, las células autólogas adecuadas pueden no estar fácilmente disponibles. Por tanto, en algunas realizaciones de la invención, la célula que se va a modificar genéticamente es una célula alógena o heteróloga.
La disfunción de P2X7 es una alteración molecular común en una variedad de cánceres. En consecuencia, el método del sexto o séptimo aspecto de la invención puede usarse para la prevención y el tratamiento de una variedad de cánceres.
En algunas realizaciones del sexto o séptimo aspecto de la invención, el método se usa para la prevención o el tratamiento de un cáncer seleccionado de uno o más de; cáncer de cerebro, cáncer de esófago, cáncer de boca, cáncer de lengua, cáncer de tiroides, cáncer de pulmón, cáncer de estómago, cáncer de páncreas, cáncer de riñón, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de cuello uterino, cánceres de células epiteliales, cáncer de piel, leucemia, linfoma, mieloma, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de endometrio, cáncer de testículo. Preferiblemente, el cáncer se selecciona entre uno o más de cáncer de pulmón, cáncer de esófago, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de cuello uterino, cánceres de vagina, cánceres de células epiteliales, cáncer de piel, cánceres relacionados con la sangre, cáncer de mama, cáncer de endometrio, cáncer de útero, cáncer de testículo.
En algunas realizaciones del sexto o séptimo aspecto de la invención, el cáncer es un cáncer metastásico, como el cáncer en estadio III o estadio IV.
Tras la creación de una célula modificada genéticamente según el cuarto o quinto aspecto de la invención, puede ser deseable expandir la población celular in vitro para aumentar el número total de células disponibles para su uso en el tratamiento. Esto se puede hacer usando el paso de exponer la célula a un antígeno para el CAR. En consecuencia, en un octavo aspecto, la presente invención proporciona un método de expansión de la célula modificada genéticamente in vitro según el cuarto o quinto aspecto de la invención, el método incluye la etapa de exponer la célula a un antígeno para el CAR. En algunas realizaciones, el método incluye el paso adicional de exponer la célula a una citocina.
También se describe un método de expansión in vitro la célula modificada genéticamente según el cuarto o quinto aspecto de la invención, el método incluye la etapa de exponer la célula a un antígeno para el CAR y simultáneamente exponer la célula a una citocina.
Las citocinas preferidas utilizadas incluyen miembros de la subfamilia IL-2, la subfamilia del interferón, la subfamilia IL-10, la subfamilia IL-1, la subfamilia IL-17 o la subfamilia TGF-p. En algunas realizaciones del octavo o noveno aspectos de la invención, la citocina se selecciona del grupo que consiste en IFN-y, IL-2, IL-5, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, TNF-a, TGF-p 1, TGF-p2, TGF-p3 y GM-CSF, o una combinación de estos.
Se describe además un método de expansión in vitro de la célula modificada genéticamente según el cuarto o quinto aspecto de la invención, el método incluye exponer la célula a anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 inmovilizados. En algunas realizaciones del décimo aspecto de la invención, los anticuerpos se inmovilizan sobre un sustrato con perlas (por ejemplo, Dynabeads™ “activadoras humanas”). Los anticuerpos pueden inmovilizarse en una superficie alternativa, como la superficie de un recipiente de cultivo de tejidos, un matraz de cultivo, una placa o un biorreactor.
Como entendería un experto en la técnica, dependiendo del dominio de señalización del CAR, el reconocimiento por el CAR de su antígeno afín conducirá a una señalización intracelular que finalmente puede conducir a la proliferación celular. En consecuencia, se pueden expandir pequeñas cantidades de células, o incluso células individuales, (o en el caso de una sola célula, expandirse clonalmente) para formar cantidades terapéuticamente significativas. Este proceso se puede mejorar aún más mediante la provisión de citocinas.
El suministro o administración de la célula modificada genéticamente según un cuarto o quinto aspecto de la invención puede ser el suministro o administración de la célula sola, o el suministro o administración de la célula formulada en una composición farmacéutica adecuada. Por consiguiente, en un octavo aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que incluye una célula modificada genéticamente según un cuarto o quinto aspecto de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Se conocen métodos en la técnica para proporcionar células que contienen CAR para inmunoterapia (ver por ejemplo Kershaw, MH. et al. Clin Cancer Res. 2006; 12 (20): 6106-15; Parker LL. et al. Hum Gene Ther 2000; 11: 2337-87). Además, se conocen en la técnica protocolos y métodos para la preparación, expansión y evaluación de células que expresan CAR de mamíferos (ver por ejemplo Cheadle, EJ. et al. Antibody Engineering: Methods and Protocols, segunda edición, Methods in Molecular Biology, tomo 907: 645-66) y se resumen en los ejemplos siguientes.
La composición farmacéutica también puede incluir uno o más aditivos farmacéuticamente aceptables, incluidas sales, aminoácidos, polipéptidos, polímeros, disolventes, tampones, excipientes y agentes de carga farmacéuticamente aceptables, teniendo en cuenta las características físicas y químicas particulares de la célula a administrar. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica incluye una suspensión de células modificadas genéticamente según el cuarto o quinto aspecto de la invención en un medio adecuado, tal como disolución salina isotónica. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica puede incluir adyuvantes adecuados tales como una o más citocinas como se describió anteriormente. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica también puede incluir un intermediario como se describió anteriormente.
La administración de la composición farmacéutica también puede ser por medios parenterales que incluyen inyección intravenosa, intraventricular, intraperitoneal, intramuscular o intracraneal, o inyecciones locales en el sitio de un tumor o masa cancerosa.
A lo largo de esta memoria descriptiva, a menos que el contexto requiera lo contrario, la palabra "comprenden", o variaciones tales como "comprende" o "que comprende", se entenderá que implica la inclusión de un elemento o número entero o grupo de elementos o números enteros establecidos, pero no la exclusión de cualquier otro elemento o número entero o grupo de elementos o números enteros.
Finalmente, se hace referencia a libros de texto estándar de biología molecular que contienen métodos para llevar a cabo técnicas básicas abarcadas por la presente invención. Ver, por ejemplo, Green MR y Sambrook J, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4a edición), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012.
Resultará evidente para el experto en la técnica que, si bien la invención se ha descrito con cierto detalle para fines de claridad y comprensión, se pueden realizar diversas modificaciones y alteraciones a las realizaciones y métodos descritos en la presente memoria sin apartarse del alcance del concepto inventivo descrito en esta memoria descriptiva.
La invención se ilustra adicionalmente en los siguientes ejemplos. Los ejemplos tienen el propósito de describir realizaciones particulares solamente y no pretenden ser limitantes con respecto a la descripción anterior.
Ejemplo 1
Protocolo para el diseño y expresión del receptor quimérico para antígeno (CAR) del péptido de unión a PEP2-2-3
Un protocolo ejemplificado que detalla el proceso de diseño y expresión de un CAR receptor anti-P2X7 disfuncional (nf) según una realización de la presente invención se detalla a continuación.
Diseño de receptor quimérico para antígeno (anti-P2x7 nf) PEP2-2-3
Se diseñó un receptor quimérico para antígeno anti-P2x7 nf (CAR) según el esquema ilustrado en la Figura 1.
Se generó un dominio de reconocimiento de antígeno 1 del CAR que incluía la secuencia de aminoácidos del péptido de unión PEP2-2-3 (secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 10 y secuencia de nucleótidos indicada en SEQ ID NO: 11). Se demostró que la secuencia PEP2-2-3 tiene una afinidad específica por el receptor P2X7 disfuncional expresado en células cancerosas, como las células LNCap de próstata, sin una afinidad significativa por los monocitos o linfocitos.
Un péptido de señalización CD8a 2 (que tiene la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 12 y la secuencia de nucleótidos indicada en SEQ ID NO: 13) se unió al extremo N-terminal del dominio de reconocimiento de antígeno PEP2-2-3 1. El péptido de señalización CD8a 2 incluye una secuencia consenso de Kozak en las posiciones 1 a 13 de SEQ ID NO: 13. El péptido de señalización CD8a 2 , incluida la secuencia de Kozak, actúa para facilitar el reconocimiento del ARN transcrito por el ribosoma y proporciona un sitio de inicio de la traducción, promoviendo así la traducción de la secuencia de ARN transcrito del CAR a una proteína.
El dominio de reconocimiento de antígeno 1 del CAR estaba vinculado a un dominio transmembrana 3 a través de una de las dos regiones de bisagra, denominada bisagra larga 4 y bisagra corta 5. La provisión de una bisagra larga 4 permite la flexibilidad del dominio de reconocimiento de antígeno que puede ser necesario para que el dominio de reconocimiento de antígeno interactúe con su ligando análogo (P2X7 disfuncional). Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de la bisagra larga 4 se establecen en SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de la bisagra corta 5 se establecen en SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17, respectivamente.
El dominio transmembrana 3 , y una porción del dominio intracelular 6 , del CAR es proporcionado por una porción del receptor coestimulador CD287 (secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 18 y secuencia de nucleótidos indicada en SEQ ID NO: 19). El dominio intracelular incluye además una porción del receptor coestimulador OX408 (secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 20 y secuencia de nucleótidos indicada en SEQ ID NO: 21) y una porción del receptor de activación CD3 zeta 9 (secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 22 y secuencia de nucleótidos indicada en SEQ ID NO: 23).
Una secuencia P2A 10 (secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 24 y secuencia de nucleótidos indicada en SEQ ID NO: 25) se añadió al extremo C-terminal del CAR, permitiendo la escisión posterior a la traducción de cualquier secuencia peptídica unida al extremo C del CAR. La secuencia de aminoácidos para el CAR anti-P2X7 nfbisagra larga y el CAR anti-P2X7 nf- bisagra corta se establecen en las SEQ ID NO: 26 y 27, respectivamente.
Diseño y ensamblaje del vector Lentival
Los CAR diseñados se incorporaron al plásmido lentiviral BLIV (System Biosciences, California, EE. UU.) ilustrado en la Figura 2, que incluye las proteínas informadoras de fluorescencia y bioluminiscencia, la proteína de fluorescencia verde (GFP) y la luciferasa de luciérnaga (FLuc). El plásmido BLIV incluye además una secuencia codificante de T2A entre las secuencias codificantes de la proteína indicadora de GFP y FLuc que permite la separación posterior a la traducción de las proteínas FLuc y GFP.
Se agregaron secuencias que tienen homología con las secuencias anteriores y posteriores al sitio de restricción NheI del vector BLIV a los extremos 5' y 3' de los CAR diseñados para dar como resultado las secuencias de nucleótidos finales establecidas en SEQ ID n O 28 (CAR-bisagra larga) y SeQ ID NO: 29 (CAR-bisagra corta). La inclusión de las secuencias 5' y 3' permitió la incorporación del CAR anti-P2X7 nf en el vector BLIV usando clonación de Gibson.
La secuencia de nucleótidos para el CAR anti-P2X7 nf-bisagra larga y CAR anti-P2X7 nf-bisagra corta se construyeron utilizando tecnología de bloques génicos (gBlock™ Gene Fragments - Integrated DNA Technologies, Iowa, EE. UU.) y se ensamblaron con el kit de clonación de ensamblaje Gibson (New England Biolabs inc. Ipswich MA, EE. UU. -núm. de cat. E5510S) según las instrucciones del fabricante.
El plásmido BLIV se restringió en el sitio de clonación NheI y la secuencia codificante del CARanti-P2X7 nf se incorporó usando ensamblaje de Gibson.
Clonación y evaluación del vector BLIV-CAR
Se transformaron células de E. coli competentes 5-alfa de New England Biolabs (provistas en el kit de clonación de ensamblaje Gibson) con los vectores BLIV-CAR generados según las instrucciones del fabricante. Brevemente:
• Un tubo de células de E. coli competentes 5-alfa de NEB se descongeló en hielo durante 10 minutos;
• Se añadieron 1-5 pl que contenían 1 pg - 100 ng de ADN plasmídico BLIV-CAR a la mezcla de células y se mezclaron agitando el tubo de 4 a 5 veces;
• La mezcla de E. coli y plásmido se colocó en hielo durante 30 minutos sin mezclar;
• La mezcla de células y plásmido se sometió a choque térmico a 42 °C durante 30 segundos antes de colocarla en hielo durante 5 minutos sin mezclar;
• Se añadieron 950 pl de SOC a la mezcla antes de calentarla a 37 °C durante 60 minutos y agitar vigorosamente;
• Se prepararon placas de selección y se calentaron hasta 37 °C;
• Se prepararon diluciones seriadas de 10 veces de las células en disolución SOC; y
• Se extendieron 50 a 100 pl de cada dilución en placas de selección seguido de incubación durante la noche a 37 °C.
Tras la incubación de las células transformadas (E. coli), se aislaron 10 colonias de bacterias transformadas con el plásmido BLIV-CAR-bisagra corta y 10 colonias de bacterias transformadas con el plásmido BLIV-CAR-bisagra larga, se purificó el ADN del plásmido y se restringió con una enzima de restricción BamHI. El ADN restringido se analizó mediante electroforesis en gel en busca de fragmentos de restricción de tamaño apropiado. Como se muestra en la Figura 3, las colonias 2 a 9 de los clones bacterianos transformados con el plásmido de BLIV-CAR-bisagra larga contenían los fragmentos de restricción de tamaño apropiado (7,8 kb y 2,8 kb), mientras que solo la colonia 4 de los clones bacterianos transformados con el BLIV-CAR-bisagra corta proporcionó los fragmentos de restricción de tamaño apropiado (7,4 kb y 2,8 kb).
Los clones 2 a 4 de las bacterias que contienen el plásmido BLIV-CAR-bisagra larga (L2 a L4) y el clon 4 de las bacterias que contienen el plásmido BLIV-CAR-bisagra corta (S4) se seleccionaron para una confirmación adicional de la identidad del plásmido usando las enzimas de restricción EcoRI, BamHI y PsfI. Todas las colonias mostraron fragmentos de restricción de la longitud esperada, como se establece en la Tabla 4 y la Figura 4.
Tabla 4
Longitud esperada del fragmento de restricción de los plásmidos BLIV-CAR
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Construcción y verificación de vectores lentivirales
Se usaron células 293T para empaquetar lentivirus a partir de un protocolo de 3 plásmidos según el siguiente método.
Día 1: Se sembraron células 293T en 35 ml de medio DMEM con suero al 10 % en un matraz T-225 de manera que las células fueran 90-95 % confluentes al día siguiente.
Dia 2: Se añadieron 30 ug de uno de los plásmidos BLIV-CAR generados (o un plásmido BLIV sin modificar), 30 ug de plásmido gag-pol delta 8.2 y 15ug de plásmido VSV-G (pMD2.G), a medios OptiMEM hasta un volumen final de 750 ul y se mezclaron. Se añadieron 300 ul de disolución de PEI y se incubaron a temperatura ambiente durante al menos 20 minutos. Después, la mezcla se añadió a las células 293T confluentes antes de la incubación a 37 °C.
Día 3: Se decantó el sobrenadante de las células 293T 24 horas después de la adición de la mezcla de plásmidos y se almacenó a 4 °C. La mezcla decantada se reemplazó con 35 ml de medios frescos antes de una incubación adicional a 37 °C.
Día 4: 48 horas después de la adición de la mezcla de plásmidos, se eliminaron los medios y se combinó con el sobrenadante de la recolección de 24 horas. Los sobrenadantes combinados se centrifugaron durante 15 minutos a 1500 g para eliminar cualquier residuo celular restante. El sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,45 pm y luego se centrifugó a 17.000 rpm en una ultracentrífuga WX durante una hora. Después de la centrifugación, el sobrenadante se decantó a mano, donde quedaron 50-200 ul en el tubo. El tubo de centrífuga se colocó en un tubo con tapón de rosca de 50 ml para evitar la contaminación y la evaporación y se dejó que el virus se resuspendiera a 4°C durante la noche.
Dia 5: El virus se resuspendió del fondo del tubo de centrífuga y se transfirió a un nuevo tubo de 1,5 ml. El virus resuspendido se centrifugó durante 5 minutos en un tubo de microcentrífuga a 5000 rpm para eliminar cualquier residuo restante.
La transfección de células 293T con el vector BLIV-CAR-bisagra corta y BLIV-CAR-bisagra larga se evaluó después de 24 horas de incubación por la presencia de fluorescencia de GFP (ver Figura 5A y Figura 6A). El sobrenadante recogido el día 5 (como se indica anteriormente) que contenía vectores de lentivirus BLIV-CAR de bisagra corta y larga se incubó con células 293T frescas y se visualizó la fluorescencia de GFP para probar la capacidad de transducción (ver Figura 5B y Figura 6B).
Detección de la función de los linfocitos T CAR
Se aislaron 108 linfocitos T CD8 de 50 ml de sangre humana usando el kit de aislamiento de linfocitos T CD8+ humanos RosetteSep ™ (Stemcell Technologies, Vancouver, Canadá) según las instrucciones del fabricante. El análisis de la pureza, como se ilustra en la Figura 7, demostró que el 76,6 % de las células purificadas eran CD8+
Los linfocitos T CD8+ se incubaron a 105 células por pocillo con una proporción de 1: 1 de perlas de expansor de linfocitos T dinámicas (CD3/CD28). A continuación, las células CD8 se incubaron durante la noche junto con preparaciones lentivirales, a una multiplicidad de infección (MOI) de 5 o mayor, que contenían plásmidos BLIV sin modificar, plásmidos BLIV-CAR-bisagra corta o plásmidos BLIV-CAR-bisagra larga. Después de la incubación, los linfocitos T CD8+ se lavaron antes de ser cocultivados con las células diana.
Las células diana que expresan el receptor P2X7 disfuncional fueron proporcionados por la línea celular de cáncer de mama BT549 (ATCc HTB-122). Estas células se marcaron con tinte usando el tinte intercalculante de membrana fluorescente eFluor™ 670 (affymetrix eBioscience) según las instrucciones del fabricante. Brevemente:
• Se prepararon células BT549 como una suspensión unicelular y se lavaron en PBS dos veces para eliminar cualquier suero residual;
• Las células se resuspendieron en PBS a temperatura ambiente;
• Se preparó una disolución 10 pM de tinte de proliferación celular eFluor® 670 en PBS a temperatura ambiente;
• Se añadió un volumen igual de la disolución de tinte 10 pM a las células BT549 preparadas para dar una concentración final de disolución de tinte 5 |uM;
• Las células BT549 en la disolución de tinte se incubaron durante 10 minutos a 37 ° C en la oscuridad, antes de que se detuviera el marcaje al añadir 4 veces el volumen de medio de cultivo frío que contenía suero al 10 % seguido de incubación en hielo durante 5 minutos en la oscuridad;
• Finalmente, las células se lavaron 3 veces en medio de cultivo antes de resuspenderlas en medio de cultivo a la concentración deseada.
Después del marcaje con tinte, las células diana se cocultivaron con los linfocitos T CD8+ preparadas en proporciones de 10: 1,5: 1, 1: 1 y 0: 1 (linfocitos T : dianas).
Después de 24 horas de cocultivo, las células se recogieron y analizaron usando clasificación de células activada por fluorescencia (FACS). Se cuantificó el número de células diana que contenían el tinte intercalculante de membrana para evaluar si los linfocitos T cocultivados conducían a la muerte de las células diana o la detención de la proliferación celular. La estrategia de activación y análisis usada para cuantificar la eficacia de los linfocitos T CD8+ para matar células diana se ilustra en la Figura 8 y se cuantifica en la Figura 9. La Figura 8A ilustra el análisis de histograma y activación de los linfocitos T CD8+ marcados. La Figura 8B ilustra el análisis de histograma y de activación de las células diana BT549 marcadas. La Figura 8C ilustra el análisis de histograma y de activación después de 24 horas de cocultivo de linfocitos T CD8+ testigo y dianas BT549. La Figura 8D ilustra el análisis de histograma y de activación después de 24 horas de cocultivo de linfocitos T CD8+ transducidos con BLIV-CAR-bisagra larga y células diana BT549. La Figura 8E ilustra el análisis de histograma y de activación del cocultivo de 24 horas de linfocitos T CD8+ transducidos con BLIC-CAR-bisagra corta y células diana BT549.
Como puede verse en la Figura 9, hubo un aumento en el número de células diana BT549 eliminadas (muertas) cuando las células diana se cocultivaron con linfocitos T CD8 transducidos con lentivirus que contenían BLIV-CAR-bisagra larga o BLIV-CAR-bisagra corta, en comparación con el cocultivo de las células diana con linfocitos T CD8 no transducidos o transducidos testigo (vector BLIV no modificado).
En vista de los resultados presentados en la Figura 9, es evidente que los linfocitos T CD8+ transducidos con CAR anti-receptores P2X7 nf (que tienen la bisagra corta o larga) demuestran niveles elevados de actividad citotóxica hacia células diana que expresan P2X7 disfuncional, lo que demuestra la capacidad de los linfocitos T CAR para destruir las células cancerosas diana.
Ejemplo 2
Diseño de un receptor quimérico para antígeno anti-P2X7 n alternativo
Otro protocolo ejemplificado que detalla el proceso de diseñar y expresar en un linfocito T, un CAR anti-receptor P2X7 disfuncional (nf), según una realización de la presente invención, se detalla a continuación.
Se diseñaron CAR anti-P2X7 nf utilizando tres péptidos de unión anti-P2X7 disfuncionales. Específicamente, los CAR se diseñaron para incluir dominios de reconocimiento de antígeno con homología de secuencia con los péptidos PEP2-2-1 -1, PEP2-472-2 o PEP2-2-12 (que tienen las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEQ ID NO: 32, 33 y 34, respectivamente). Se ha demostrado que estos péptidos de unión se unen al receptor P2X7 disfuncional (Barden, J.A., Sluyter, R., Gu, B.J. y Wiley, J.S. 2003. Specific detection of non-functional human P2X(7) receptors in HEK293 cells and B-lymphocytes. Fe BS Lett 538, 159-162).
El alineamiento de los péptidos de unión anteriores a las regiones variables de la cadena pesada de los anticuerpos que reconocen receptores P2X7 disfuncionales se muestra en la Figura 10. El alineamiento de las secuencias de la región determinante de complementariedad (CDR 1 a 3) se indica mediante recuadros.
A continuación, se detalla un ejemplo específico de la construcción de un CAR que tiene la secuencia PEP2-2-1 -1. Se usaron la misma estructura y secuencias de CAR para los CAR que tenían secuencias PEP2-472-2 o PEP2-2-12 como péptidos de unión, con los péptidos de unión alternativos sustituidos por PEP2-2-1-1.
Las secuencias de ADN que codifican el péptido de unión a PEP2-2-1-1 se sintetizaron dentro del marco con otras secuencias de ADN para generar un CAR que tiene la configuración que se describe a continuación.
Con referencia a la Figura 11, se preparó un dominio de reconocimiento de antígeno al enlazar una secuencia líder de la variante 1 del transcrito de la molécula CD8a de Homo sapiens (CD8A) (que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEC ID NO: 30 y la secuencia de nucleótidos establecida en la SEC. ID NO: 31) 11 al extremo N del péptido de unión PEP2-2-1-1 12 (que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 32 y la secuencia de nucleótidos establecida en SEQ ID NO: 35).
El dominio de reconocimiento de antígeno se unió luego a un dominio transmembrana a través de una bisagra de IgG4 -CH2-CH4 modificada 13 que tiene la secuencia de la bisagra larga como se indica en el Ejemplo 1 anterior (es decir, la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 14 y la secuencia de nucleótidos establecida en SEQ ID NO: 15).
El dominio extracelular que comprende la secuencia líder de CD811 y el péptido de unión PEP2-2-1 12 se enlazó a un dominio transmembrana 14 proporcionado por una porción de CD28 humano 15 (que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 18 y la secuencia de nucleótidos establecida en SEQ ID NO: 19) que también incluía una parte de los dominios citoplásmicos de CD28 16.
La porción intracelular del CAR 17 fue proporcionada por una porción de la molécula de CD28 humana mencionada anteriormente 14 y el dominio citoplásmico del miembro 4 de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral de Homo sapiens (TNFRSF4/OX40 - que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 20 y la secuencia de nucleótidos establecida en SEQ ID NO: 21) 18 vinculado al dominio citoplasmático de la molécula CD247 de Homo sapiens 19 (cadena zeta de la glicoproteína CD3 de la superficie de linfocitos T, que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 22 y la secuencia de nucleótidos establecida en s Eq ID NO: 23).
Diseño y ensamblaje del vector Lentival
Las secuencias de nucleótidos para los CAR diseñados PEP2-2-1-1, PEP2-472-2 y PEP2-2-12 se construyeron utilizando tecnología de bloques génicos (gBlock™ Gene Fragments - Integrated DNA Technologies, Iowa, EE. UU.) y se ensamblaron utilizando el kit de clonación de ensamblaje Gibson (New England Biolabs inc. Ipswich MA, EE. UU. - núm. de cat. E5510S) según las instrucciones del fabricante. Las secuencias de las construcciones de nucleótidos para los CAR PEP2-2-1-1, PEP2-472-2 o PEP2-2-12 para la integración en vectores de clonación (incluidos los sitios de restricción) se establecen en las SEQ ID NO: 35, 36 y 37, respectivamente.
Las construcciones de nucleótidos CAR se incorporaron en el vector pCDH-CMV-MCS-T2A (pCDH) (System Biosciences, California, EE. UU. núm. de cat. CD524A-1) ilustrado en la Figura 11, que incluye la proteína informadora de fluorescencia, proteína de fluorescencia verde (GFP ). El vector pCDH incluye además una secuencia codificante de T2A entre el sitio de clonación y la GFP que permite la separación posterior a la traducción de las proteínas CAR y GFP clonadas.
Para la integración de las construcciones de nucleótidos CAR PEP2-2-12 y PEP2-472-2 en el vector pCDG, el vector pCDH se restringió con EcoRI y N otly gel purificado (kit de extracción de gel QIAquick, QIAGEN). Las construcciones de gBlock de nucleótidos CAR PEP2-2-12 y PEP2-472-2 también se digirieron con enzimas de digestión EcoRI y Notl. El fragmento de gBlock restringido se purificó luego con un kit de purificación de PCR QIAquick según las instrucciones del fabricante. El vector restringido se ligó con las construcciones CAR restringidas en una relación molar entre inserto y vector de 3:1. Las mezclas de ligación se transformaron en células SURE2 químicamente competentes (Agilent).
La construcción CAR PEP2-2-1-1 contenía un sitio de restricción EcoRI y, por lo tanto, se integró en el vector pCDH de una manera diferente a las construcciones de nucleótidos CAR PEP2-2-12 y PEP2-472-2. El vector pCDH se restringió con EcoRI, y la prolongación hacia 5' resultante se rellenó mediante ADN polimerasa de T4 en presencia de dNTP 100 uM (12 °C durante 15 minutos). Se terminó la reacción (75 °C durante 20 minutos en presencia de EDTA 10 mM) y el vector restringido se purificó en columna (kit de purificación QIAquick PCR, QIAGEN). A continuación, el vector purificado se restringió más con Notl y gel purificado (kit de extracción de gel QIAquick, QIAGEN). El fragmento de construcción CAR PEP2-2-1-1 se restringió primero con Smal seguido por digestión con Notl (ambos a 25 °C). El fragmento de gBlock restringido se purificó con un kit de purificación QIAquick PCR según las instrucciones del fabricante. El vector restringido se ligó con la construcción CAR en una proporción molar entre inserto y vector de 3:1.
Clonación y evaluación del vector pCDH-CAR
Las mezclas de ligación para cada una de las tres construcciones CAR descritas anteriormente se transformaron en células SURE2 químicas competentes (Agilent) según las instrucciones del fabricante. Brevemente:
Las células SURE2 se descongelaron en hielo. Una vez descongeladas, las células se mezclaron suavemente y se colocaron alícuotas de 100 pl de células en tubos de fondo redondo de 14 ml previamente enfriados;
Se añadieron 2 pl de p-mercaptoetanol a cada alícuota de células;
Los tubos se mezclaron y se incubaron en hielo durante 10 minutos, agitando suavemente cada 2 minutos;
Se añadieron 0,1-50 ng de cada uno de los vectores pCDH-CAR a una alícuota de células;
Las alícuotas se mezclaron suavemente, luego se incubaron en hielo durante 30 minutos;
Los tubos se sometieron a pulsos de calor a 42 °C en un baño de agua durante 30 segundos y luego se incubaron en hielo durante 2 minutos;
Se añadieron 0,9 ml de caldo NZY+ precalentado (42 °C) a cada tubo seguido de incubación a 37 °C durante 1 hora con agitación a 225-250 rpm;
Se sembraron hasta 200 pl de la mezcla de transformación en placas de agar LB que contenían antibiótico, seguido de incubación a 37 °C durante la noche;
• Las colonias se recogieron y cultivaron durante la noche;
• El ADN plasmídico se aisló de los clones cultivados con un kit miniprep Quicklyse (QIAGEN) y se digirió con digestión de EcoRI/Not I para identificar clones con los vectores CAR-pCDH de tamaño correcto
Después de la incubación de las células transformadas (SURE2), se aislaron de 5 a 6 colonias de células transformadas con pCDH-CAR para cada uno de los péptidos de unión PEP2-2-1-1, PEP2-472-2 o PEP2-2-12 y posteriormente se incubaron durante la noche. El ADN plasmídico se aisló con un kit miniprep Quicklyse (QIAGEN) a partir de cada una de las colonias cultivadas y se restringió con las enzimas de restricción EcoRI/Not I. El ADN restringido se analizó mediante electroforesis en gel en busca de fragmentos de restricción de tamaño apropiado.
Como se muestra en la Figura 13, la colonia 3 de la construcción PEP2-2-1-1 pCDH-CAR, las colonias 1 y 3 de la construcción PEP2-472-2 pCDH-CAR y las colonias 1,3 y 5 de la construcción PEP2-2-12 pCDH-CAR contenían los fragmentos de restricción de tamaño apropiado.
Cada clon seleccionado se secuenció para confirmar la integración del CAR al usar los cebadores apropiados seleccionados de la Tabla 5.
Tabla 5
Cebadores utilizados para la confirmación de la construcción CAR correcta en colonias seleccionadas
Figure imgf000027_0001
Los datos de secuenciación de cada colonia seleccionada se alinearon con el clon recombinante derivado in silico para cada una de las construcciones CAR de PEP2-2-1-1, PEP2-472-2 o PEP2-2-12 y se verificaron las construcciones apropiadas para al menos una de cada una de las colonias seleccionadas. El aislamiento de plásmido libre de endotoxinas a gran escala de los clones verificados se realizó con un kit NucleoBond® Xtra Midi EF, Macherey-Nagel según las instrucciones del fabricante.
Construcción y verificación de vectores virales
El empaquetamiento de lentivirus se realizó en células Hek293T transfectadas de forma transitoria utilizando el reactivo Lipofectamine 2000 (Invitrogen) según un protocolo de laboratorio estándar (Brown, C.Y. et al. 2010. Robust, reversible gene knockdown using a single lentiviral short hairpin RNA vector. Hum Gene Ther 21, 1005-1017). Brevemente:
• Se mezclaron 12,5 ug de ADN del vector lentiviral con 3,75 ug de pMD2.g (vector de expresión de la envoltura de VSV-G), 6,25 ug de pRSV-Rev y 7,5 ug de pCMVdelta8.2 por transfección en un matraz T75cm usando 75 ul de Lipofectin según el protocolo del fabricante y se incubaron durante la noche;
• Se cambiaron los medios la mañana siguiente y se recogió el sobrenadante que contenía virus 48 horas después;
• Los sobrenadantes recolectados se centrifugaron a 300 xg durante 5 minutos antes de filtrarlos a través de un filtro de 0,45 gm;
• Las partículas de virus de los sobrenadantes filtrados se concentraron mediante ultracentrifugación (68.000 xg durante 90 minutos y 4 °C, rotor Beckman SW32). Se eliminó el sobrenadante y el sedimento de virus se resuspendió suavemente en DMEM sobre hielo;
• Se almacenaron alícuotas de 100 ul de virus -70 °C hasta que se necesitaron.
Para evaluar la tasa de transfección del virus, se recolectaron células Hek293T transfectadas y se determinó el porcentaje de células positivas para GFP (células que contienen el vector pCDH) mediante citometría de flujo. En la Figura 14 se muestran resultados representativos para Hek293T transfectadas con la mezcla de empaquetamiento LV-PEP2-472-2.
Los títulos virales se calcularon por transducción de un número conocido de células Hek293T con diluciones en serie (1:50 y 1: 100) de disolución madre concentrada de LV. Las transducciones se realizaron durante la noche en presencia de polibreno (bromuro de hexadimetrina) 8 ug/ml. Al día siguiente, los medios que contenían virus y polibreno se reemplazaron con medios frescos, las células se recogieron 24 horas después y se determinó el porcentaje de células positivas para GFP mediante citometría de flujo. Los títulos virales se calcularon utilizando la fórmula: unidades de transducción/ml (TU) = (FxC/V)xD donde F = frecuencia de células GFP+ (% de GFP /100), C = número de células en el momento de la adición del virus, V = volumen de transducción en mL y D = factor de dilución. Los datos de flujo representativos para la transducción de LV-PEP2-472-2 se muestran en la Figura 15. La TU para cada uno de los vectores virales PEP2-2-1 -1, PEP2-12-2 y PEP2-472-2 CAR se proporciona en el Tabla 6 a continuación.
Tabla 6
Unidades de transducción para vectores virales
Figure imgf000028_0001
Detección de función de linfocito T CAR P2X 7 nf
Producción de linfocitos T CD8 que expresan CAR anti-P2X 7 nf
Las células CD8 humanas se purificaron y transdujeron según el siguiente método:
Se purificaron linfocitos T CD8 humanos a partir de células mononucleares (MNC, por sus siglas en inglés) aisladas de capa leucoplaquetaria de donantes anónimos (servicio de sangre de la Cruz Roja de Australia). Las MNC se aislaron usando medios de gradiente de densidad Ficoll-Paque™. Los linfocitos T CD8 se purificaron a partir de MCN con el kit de linfocitos T CD8 humanos Dynabeads® Untouched™ (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. La pureza de las células aisladas, evaluada por citometría de flujo, fue >85 %.
Se preincubaron 2x106 células purificadas con perlas CD3/CD28 (proporción entre perlas y células 3:1) e IL2 (500 U/ml) durante 30 minutos antes de la adición de 1 a 2 unidades de multiplicidad de infección (MOI) de virus que contienen LV- PEP2-2-1-1, LV-PEP2-472-2 o un vector de LV vacío (virus de control de GFP) junto con polibreno 8ug/ml. Las células se incubaron con virus durante 16 horas antes de eliminar los medios que contenían virus. Las células y perlas restantes se incubaron en medios frescos que incluían IL2 durante 40 horas antes de que se analizaran los niveles de fluorescencia de GFP.
Como se ilustra en la Figura 16, entre el 8 % y el 43 % de las células CD8 GFP+ indica una transducción exitosa.
Producción de células diana que expresan receptores P2X 7 nf o P 2X 7 naturales (WT)
Para evaluar la eficacia de las células CD8 que expresan los CAR anti-P2Xz nf, se prepararon células Hek293T que sobreexpresan un receptor P2X7 disfuncional (que tiene una mutación K193A) o un dominio extracelular natural del receptor P2X7 en su superficie celular.
Se solicitaron a Integrated DNA Technologies (IDT) fragmentos de gen gBlock EXD2_K193A (P2X7 nf) y EXD2_WT (P2X7 funcional (SEQ ID NO: 47 y 48, respectivamente). Los dominios EXD2 se diseñaron para expresarse dentro del marco con secuencias de ADN que codifican una proteína de fusión que consiste en IgK-líder-HA-MYC-PDGFR-dominio transmembrana de pDisplay (Invitrogen - Figura 17). Estas proteínas de fusión se diseñaron para la expresión superficial. Los fragmentos de genes EXD2_K193A y EXD2_WT se clonaron entre las etiquetas de epítopo HA y MYC para formar bloques génicos de fusión. Las secuencias de entrada attB1 y attB2 se incluyeron en los extremos 5' y 3' de los bloques génicos de fusión para la clonación en el vector LV-416-IRES-puro (Clontech).
La clonación se realizó utilizando Gateway® (ThermoFisher) y todos los pasos se llevaron a cabo siguiendo el protocolo del fabricante. Brevemente:
• Las primeras reacciones de recombinación de BP se realizaron entre fragmentos de ADN flanqueados por attB (EXD2_K193A, SEQ ID NO: 47 y EXD2_WT, SEQ ID NO: 48) y un vector pDONR-107 que contenía attP para generar un clon de entrada. Las reacciones de recombinación de BP se utilizaron para transformar células E.cloni®10G químicamente competentes (Lucigen®) según el protocolo del fabricante;
• Las células transformadas se sembraron en placas de agar LB que contenían 50 pg/ml de kanamicina (Sigma) y se incubaron a 37 °C durante la noche;
• Se seleccionaron dos clones de cada placa para preparar mini cultivos (2 ml) en caldo LB con kanamicina (SIGMA) (50 ug/ml). Seguido de incubación a 37 °C durante la noche con agitación.
• El ADN plasmídico se extrajo al día siguiente de los mini cultivos utilizando el kit de minipreparación QIAGEN QuickLyse;
• Se realizaron digestiones diagnósticas con Bam H1-HF (NEB) y Pmel (NEB) para identificar clones recombinantes. Se confirmó que tanto los clones EXD2_K193A como EXD2_WT se digirieron correctamente mediante digestión con Bam H1 y Bam H1/Pmel seguida de electroforesis en gel (Figura 18).
Se eligió un clon de cada construcción (EXD2_K193A y EXD2_WT) para la reacción de recombinación LR (como se establece a continuación) para insertar las construcciones EXD2_K193A y EXD2_WT en un vector de destino pLV-416. Después de la selección de los clones, se realizaron reacciones de recombinación LR para transferir cada inserto EXD2 desde el clon de entrada pDONR-107 al vector de destino pLV-416 para crear un vector de expresión. La reacción de recombinación LR final se utilizó para transformar células E.cloni®10G químicamente competentes (Lucigen®) según el protocolo del fabricante. Brevemente:
• Las células transformadas se sembraron en placas de agar LB que contenían 100 pg/ml de ampicilina (SIGMA) y se incubaron a 37 °C durante la noche;
• Se recogieron seis clones de cada placa para preparar mini cultivos (2 mL) en caldo LB con Ampicilina (50 ug/ml), que se incubaron a 37 °C durante la noche con agitación;
• Al día siguiente, se aisló el ADN plasmídico y se realizó la digestión con Bam H1 para identificar clones recombinantes. Los clones recombinantes se identificaron por la presencia de tres bandas del tamaño apropiado (3431, 1056 y 5844 pb - ver Figura 19). Como puede verse en la Figura 19, los seis clones seleccionados de cada placa proporcionaron los fragmentos de restricción de tamaño apropiado;
• Se secuenciaron dos clones transducidos con las construcciones pLV-416 que contenían EXD2_K193A o EXD2_WT con los cebadores indicados en la Tabla 7 para confirmar que las construcciones eran correctas. Tabla 7
Cebadores utilizados para la confirmación de construcciones EXD2_K193A y EXD2_WT correctas en colonias seleccionadas
Figure imgf000029_0001
Producir partículas virales para la transducción de células HEK293 y la generación de una línea celular HEK293 estable, con expresión de un receptor P2X7 funcional o disfuncional, se utilizó el siguiente protocolo:
• Se sembraron en placas células HEK293 (7x106 células por matraz) un día antes de la transfección.
• Se transfectaron células HEK293T con vectores de empaquetamiento lentivíricos y pLV-416-EXD2 y pLV-416-EXD2_WT. Para controlar la eficacia de la transfección, también se incluyó un plásmido de expresión de GFP (1 ug).
• Después de la incubación durante la noche, el medio que contenía los reactivos de transfección se retiró y se reemplazó con 10 ml de medio fresco (DMEM con FCS al 10 %). Se recogieron 10 ml de medios 24 horas después y se almacenaron en alícuotas de 2 ml a -80 °C hasta que se requirieron. Se añadieron otros 10 ml de medio nuevo (DMEM con FCS al 10 %) a los matraces que se recogieron 24 horas más tarde.
• Las partículas virales se aislaron del medio recolectado al centrifugar el medio a 1200 rpm seguido de filtración a través de un filtro de 0,45 pm. Los medios filtrados, con partículas de virus, se utilizaron para la transfección de células HEK293.
Para evaluar la eficacia de la transfección, se recogieron las células tras la eliminación de los segundos 10 ml de medio y se determinó el porcentaje de células positivas para GFP mediante citometría de flujo. La Figura 20 ilustra que las células HEK293 se transfectaron con pLV-416-EXD2_K193A y pLV-416-EXD2_WT con una eficacia del 97 % y el 85 %.
Para generar células HEK293 estables que sobreexpresan el dominio extracelular de P2X7 funcional y disfuncional en su superficie celular. Se utilizó el siguiente protocolo:
• Se sembraron en placas células HEK293 (7x105 por matraz) en matraces T25 un día antes de la transducción.
• Al día siguiente, se retiró el medio de cada matraz y se añadieron medios nuevos que contenían partículas de virus producidas según el protocolo anterior según las relaciones establecidas en la Tabla 8;
• Se añadió polibreno a cada matraz hasta una concentración final de 8 ug/ml.
Tabla 8
Protocolo de transducción
Figure imgf000030_0001
• 24 h después de la transducción, se retiró el medio de cada matraz y se añadió medio fresco (DMEM con FCS al 10 %) suplementado con 1600 ug/ml de G418 a todos los matraces, excepto al matraz que contenía Lentivirus testigo que expresa GFP (LV-411 -GFP).
• Las células HEK293T transducidas con el virus pLV-411-GFP testigo se controlaron para determinar la expresión de GFP 72 horas después de la transducción (ver Figura 21);
• Todas las células no transducidas murieron 4 días después del cultivo con medio complementado con G418. Las líneas celulares transducidas continuaron creciendo normalmente con G418 en el medio.
El dominio extracelular de receptores P2X7 transfectados contiene etiquetas de epítopo HA y MYC. Por lo tanto, estas células pueden teñirse con anticuerpos monoclonales contra HA-y MYC- para confirmar la expresión de superficie del dominio extracelular mediante citometría de flujo.
Detección de la función de linfocitos T CAR
Para evaluar la funcionalidad de los CAR P2X7 nf, las células CD8 transducidas con cada una de las construcciones CAR PEP2-2-1-1 o PEP2-472-2 (como se prepararon anteriormente) se coincubaron durante 4 horas en una placa de cultivo de fondo redondo de 96 pocillos en una proporción de 1:1 con 1X104 células diana que expresan un receptor P2X7 nf (como se preparó anteriormente) y células de cáncer de mama MDA-MB-231, que expresan un receptor P2X7 disfuncional (células 231 P2X7).
El porcentaje de citotoxicidad se determinó mediante un ensayo de citotoxicidad no radiactiva CytoTox 96® (Promega, Madison, Wisconsin, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante. Brevemente:
• 45 minutos antes de 4 horas, se añadieron 10 pl de disolución de lisis (10X) a cada pocillo por cada 100 pl de células diana;
• Después de otros 45 minutos, las placas se centrifugaron a 250 xg durante 4 minutos;
• Se tomaron alícuotas de 50 pl de cada pocillo y se transfirieron a una placa de fondo plano de 96 pocillos;

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un receptor quimérico para antígeno que incluye:
un dominio de reconocimiento de antígeno que reconoce un receptor P2X7 disfuncional;
un dominio transmembrana; y
un dominio de señalización que incluye una porción de señalización intracelular de un receptor de activación y/o una porción de señalización intracelular de un receptor coestimulador.
2. El receptor quimérico para antígeno según la reivindicación 1, en el que el dominio de reconocimiento de antígeno incluye una porción que tiene identidad de secuencia con: un sitio de unión a antígeno de un anticuerpo; o un sitio de unión a antígeno de un fragmento de un anticuerpo.
3. El receptor quimérico para antígeno según la reivindicación 1 o 2, en donde el dominio de reconocimiento de antígeno incluye una porción que tiene identidad de secuencia con al menos la región determinante de complementariedad 1 (CDR1), CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de un anticuerpo o la cadena ligera de un anticuerpo.
4. El receptor quimérico para antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el dominio de reconocimiento de antígeno reconoce un epítopo asociado con un sitio de unión a trifosfato de adenosina (ATP) del receptor P2X7 disfuncional.
5. El receptor quimérico para antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el receptor P2X7 disfuncional tiene una capacidad reducida para unirse a ATP en comparación con la capacidad de unión de ATP de un receptor P2X7 natural (funcional).
6. El receptor quimérico para antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el receptor P2X7 disfuncional tiene un cambio conformacional que hace que el receptor sea disfuncional.
7. El receptor quimérico para antígeno según la reivindicación 6, en donde el cambio conformacional que hace que el receptor sea disfuncional es un cambio de conformación trans a conformación cis de prolina en la posición aminoacídica 210 del receptor P2X7 disfuncional.
8. El receptor quimérico para antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el dominio de reconocimiento de antígeno reconoce un epítopo que incluye prolina en la posición aminoacídica 210 del receptor P2X7 disfuncional.
9. El receptor quimérico para antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el receptor de activación es un miembro del complejo correceptor de CD3 y/o un receptor Fc, y/o en donde el receptor coestimulador se selecciona del grupo que consiste en CD27, CD28, CD30, CD40, DAP10, OX40, 4-1BB (CD137) e ICOS.
10. Una molécula de ácido nucleico que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica el receptor quimérico para antígeno según las reivindicaciones 1 a 9.
11. Un vector viral que incluye un ácido nucleico según la reivindicación 10, para la transducción viral de una célula hospedante.
12. Una célula genéticamente modificada, la célula que incluye el receptor quimérico para antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 11, en donde opcionalmente la célula es un leucocito, una célula mononuclear de sangre periférica (PBMC), un linfocito, un linfocito T, un linfocito T CD4 , un linfocito T CD8+, una célula citolítica natural o un linfocito T citolítico natural.
13. Una célula genéticamente modificada según la reivindicación 12, para su uso en un método para destruir una célula que expresa un Receptor P2X7 disfuncional, el método incluye exponer la célula que expresa un receptor P2X7 disfuncional a la célula genéticamente modificada.
14. La célula genéticamente modificada para su uso según la reivindicación 13, en donde la célula que expresa un receptor P2X7 disfuncional es una célula cancerosa, en donde opcionalmente la célula cancerosa se selecciona de uno o más de; cáncer de cerebro, cáncer de esófago, cáncer de boca, cáncer de lengua, cáncer de tiroides, cáncer de pulmón, cáncer de estómago, cáncer de páncreas, cáncer de riñón, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de cuello uterino, cánceres de células epiteliales, cáncer de piel, leucemia, linfoma, mieloma, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de endometrio y cáncer de testículo, preferiblemente en donde la célula cancerosa se selecciona entre una o más de; cáncer de pulmón, cáncer de esófago, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de cuello uterino, cánceres de vagina, cánceres de células epiteliales, cáncer de piel, cánceres relacionados con la sangre, cáncer de mama, cáncer de endometrio, cáncer de útero y cáncer de testículo.
15. Una composición farmacéutica que incluye una célula genéticamente modificada según la reivindicación 12 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
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