PL233352B1

PL233352B1 - Przeciwnowotworowe białko fuzyjne

Info

Publication number: PL233352B1
Application number: PL418713A
Authority: PL
Inventors: Sebastian Dominik Pawlak
Original assignee: Adamed Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia
Priority date: 2016-09-15
Filing date: 2016-09-15
Publication date: 2019-10-31
Also published as: EP3512562B1; EP3512562A1; WO2018050808A1; PL418713A1

Abstract

Zgłoszenie dotyczy dziedziny terapeutycznych rekombinowanych białek fuzyjnych. Konkretnie, zgłoszenie dotyczy białek fuzyjnych egzotoksyny A Pseudomonas w połączeniu z fragmentem ludzkiej onkostatyny M (OSM) lub mutantem fragmentu onkostatyny M, mutanta fragmentu onkostatyny M oraz ich zastosowania w terapii przeciwnowotworowej.

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy dziedziny terapeutycznych rekombinowanych białek fuzyjnych. Konkretnie, wynalazek dotyczy białek fuzyjnych egzotoksyny A Pseudomonas w połączeniu z fragmentem ludzkiej onkostatyny M (OSM) lub mutantem fragmentu onkostatyny M, mutanta fragmentu onkostatyny M oraz ich zastosowania w terapii przeciwnowotworowej.

Egzotoksyna A Pseudomonas aeruginosa to polipeptyd, który składa się z trzech funkcjonalnych domen, z których pierwsza odpowiada za rozpoznanie i związanie jej na powierzchni komórki, druga za translokację z endosomu do cytoplazmy, a trzecia ma toksyczną aktywność enzymatyczną. Po związaniu się z komórką jest transportowana do wnętrza komórki jako protoksyna a następnie w środowisku endosomów aktywowana proteolitycznie poprzez enzym proteolityczny furynę, która rozcina łańcuch polipeptydowy tworząc 28 kDa N-terminalny fragment oraz 37 kDa toksyczny polipeptyd. W cytoplazmie rozpoznaje on czynnik elongacyjny 2 (EF-2) i inaktywuje go przeprowadzając jego ADP-rybozylację. Wyczerpanie się komórkowego EF-2 powoduje zahamowanie syntezy białka w komórce i jej śmierć.

Cytotoksyczność egzotoksyny A Pseudomonas względem wielu rodzajów komórek nowotworowych została szczegółowo opisana. Znane są także podejścia, w których stosowano egzotoksynę A Pseudomonas w postaci fuzji z innymi białkami. Dla przezwyciężenia tej cytotoksyczności ogólnoustrojowej zaprojektowano różne terapie celowane mające na celu kierowanie toksyn Pseudomonas do określonych rodzajów komórek i tkanek. Celowany transport toksyn bakteryjnych, włączając egzotoksynę Pseudomonas, jest znany i opisany, przykładowo przez W. Dębiński i wsp. J Biol Chem. 1995 Jul 14;270(28):16775-80. A novel chimeric protein composed of IL13 and Pseudomonas exotoxin is highly toxic to human carcinoma cells expressing receptors to IL13 and IL4. Także fuzje egzotoksyny Pseudomonas z IL-13 są w trakcie badań klinicznych w schorzeniach przerzutowych: Liu-Chittenden Y, Cancer Med. 2015 Jul; 4(7):1060-8. doi: 10.1002/cam4.449. Epub 2015 Mar 13.Phase I trial of systemic intravenous infusion of interleukin-13-Pseudomonas exotoxin in patients with metastatic adrenocortical carcinoma.

Badano także aktywność fuzji mutanta toksyny Pseudomonas z interleukiną 6 względem komórek AML pobranych od pacjentów pediatrycznych. Boayue KB I wsp. Leukemia. 1998 Feb; 12(2):182-91. Pediatric acute myelogenous leukemia cells express IL-6 receptors and are sensitive to a recombinant IL6-Pseudomonas exotoxin.

Opisano także białko fuzyjne składające się z interleukiny 6 i mutanta egzotoksyny Pseudomonas (IL6-PE40) zaopatrzone w domeną kierująca KDEL. Fuzja ta została opisana jako cytotoksyczna względem komórek szpiczaka mnogiego (Cui JW i wsp. 2004 Dec;12(6):825-8. Biochemical and physical properties for a recombinant IL6 Pseudomonas exotoxin fusion protein IL6D24PE40KDEL.

Jednakże w powyższych podejściach wykazano możliwość kierowania toksyny Pseudomonas jedynie do komórek nowotworowych eksprymujących receptory dla wskazanych inter leukin, podczas gdy komórki pozbawione takich receptorów nie mogą być celem terapeutycznym. Ponadto interleukiny stosowane jako nośniki dla toksyn Pseudomonas na niektórych typach komórek indukują proliferację skutkując wzrostem nowotworów lub toksycznością.

Dlatego problem techniczny stanowi brak efektywnego systemu kierowania toksyny Pseudomonas do różnych typów komórek nowotworowych, czyli systemu o znacznie szerszej specyficzności wiązania uzyskanej przez oddziaływanie z więcej niż jednym typem receptorów nadeksprymowanych na komórkach nowotworowych. Ponadto problem techniczny stanowi brak efektywnego systemu kierowania toksyny Pseudomonas do komórek nowotworowych, które nie wykazują nadekspresji receptora dla nośnika toksyny, albo komórek nowotworowych, na które nośnik toksyny działa stymulująco lub toksycznie.

W związku z tym celem niniejszego wynalazku jest opracowanie skutecznego celowanego transportu egzotoksyny A Pseudomonas, który będzie skutkował szeroką specyficznością wiązania się z komórkami nowotworowymi, a w konsekwencji kierowaniem toksyny Pseudomonas do różnych typów docelowych komórek nowotworowych, i przy czym ten celowany transport zapewnia znaczące lub zupełne ograniczenie aktywności względem komórek prawidłowych oraz umożliwia kierowanie toksyny Pseudomonas do komórek nowotworowych, które nie wykazują nadekspresji receptora dla nośnika toksyny, albo komórek nowotworowych, na które nośnik toksyny działa stymulująco lub toksycznie. Problem ten rozwiązuje niniejszy wynalazek przez zastosowa nie ludzkiej

PL 233 352 B1 cytokiny Onkostatyny M (OSM) i mutantów onkostatyny M jako nowotworowo-specyficznego nośników cząsteczek lub domen o znanej aktywności cytotoksycznej, w szczególności egzotoksyny A Pseudomonas.

W szczególności problem ten został rozwiązany przez dostarczenie białek fuzyjnych według wynalazku: OSMPE1.0 o Sekw. Nr 1, OSMPE1.1 o Sekw. Nr 2, OSMPE1.2 o Sekw. Nr 3, OSMPE1.3 o Sekw. Nr 4, OSMPE2.0 o Sekw. Nr 5, które szczegółowo opisano, odpowiednio, w Przykładach wykonania od 1 do 5.

Do tej pory sama onkostatyna M była rozważana jako potencjalny czynnik antyproliferacyjny w przypadku nowotworów piersi, płuc, nerwiaków czy niektórych czerniaków (Zarling JM i wsp.Oncostatin M: a growth regulator produced by differentiated histiocytic lymphoma cells. Proc Natl Acad Sci USA. 1986 Dec;83(24):9739-43, Horn i wsp. 1990). Jednak ze względu na wiele innych funkcji tej cytokiny mających związek z aktywnością prozapalną czy wręcz stymulującą kancerogenezę (David E i wsp. Oncostatin M is a growth factor for Ewing sarcoma. Am J Pathol. 2012 Nov;181(5):1782-95), jej wykorzystanie nie rokowało istotnej możliwości przewagi nad innymi potencjalnymi terapeutykami, a wręcz generowało dodatkowe zagrożenia związane z bezpieczeństwem terapii.

OSM należy do rodziny IL6 i celuje w receptor gp130 nadeksprymowany na komórkach nowotworowych.

Aktywność onkostatyny ma ścisły związek z obecnością receptorów OSMR (Lacreusette i wsp. 2007). Receptor OSMR jest obecny na wielu typach komórek prawidłowych (Tamura S i wsp. Developmental expression pattern of oncostatin M receptor beta in mice. Mech Dev. 2002 Jul; 115(1-2):127-31), jednak jego nadekspresja związana jest wyłącznie ze stanami patologicznymi. Wykazano, ze poziomy OSMR są istotnie podniesione na wielu typach komórek nowotworowych, między innymi piersi i prostaty (Tanaka M i wsp. a multifunctional cytokine. Rev Physiol Biochem Pharmacol. 2003;149:39-52), czy szyjki macicy (Caffarel MM i wsp. Oncostatin M receptor is a novel therapeutic target in cervical squamous cell carcinoma. J Pathol. 2014 Mar; 232(4):386-90).

Receptory OSM dzielą jedno miejsce odziaływania w strukturze OSM z receptorami LIFR.

Obydwa te receptory pełnią funkcje regulujące.

Onkostatyna M wiąże także glikoproteinowy receptor błonowy gp130. Jest to receptor wspólny dla ligandów z rodziny IL-6, zaangażowany w aktywację wielu ścieżek sygnałowych między innymi MAPK, JAK/STAT3, PI3'K odgrywających istotne role w odpowiedzi immunologicznej, stanach zapalnych, proliferacji, różnicowaniu komórek i kancerogenezie. Taki układ generuje dwa typy kompleksów onkostatyny z receptorami: gp130/LIFR lub gp130/OSMR.

Tryb tworzenia kompleksów z receptorami przebiega następująco: OSM wiąże indywidualnie receptor gp130 i taki kompleks nie posiada aktywności biologicznej do czasu związania trzeciej składowej czyli receptorów LIFR lub OSMR (Liu J i wsp. Interactions between oncostatin M and the IL-6 signal transducer, gp130. Cytokine. 1994 May; 6(3):272-8).

Ze względu na wiązanie się z kilkoma receptorami onkostatyna M posiada szeroką specyficzność wiązania się z komórkami nowotworowymi. Wskutek zdolności do tworzenia aktywnych kompleksów z dwoma typami receptorów, OSM wykazuje aktywność plejotropową i wielokierunkowość działania.

Onkostatyna M i jej receptory ze względu na swoje różnorodne funkcje odgrywają istotną rolę w fizjologii komórek nowotworowych. Pierwotnie OSM została opisana jako czynnik hamujący in vitro wzrost komórek czerniaka (Zarling JM i wsp.Oncostatin M: a growth regulator produced by differentiated histiocytic lymphoma cells. Proc Natl Acad Sci USA. 1986 Dec; 83(24):9739-43). Wykazano efektywne hamowanie proliferacji przez OSM na wielu typach komórek nowotworowych np. panelu komórek nowotworowych płuc (Horn D i wsp. Regulation of cell growth by recombinant oncostatin M. Growth Factors. 1990; 2(2-3):157-65), piersi (Li C i wsp. Induction of S100A9 gene expression by cytokine oncostatin M in breast cancer cells through the STAT3 signaling cascade. Breast Cancer Res Treat. 2004 Sep; 87(2):123-34), nerwiaków (Zarling JM i wsp.Oncostatin M: a growth regulator produced by differentiated histiocytic lymphoma cells. Proc Natl Acad Sci USA. 1986 Dec; 83(24):9739-43) i kości (David E i wsp.Direct anti-cancer effect of oncostatin M on chondrosarcoma. Int J Cancer. 2011 Apr 15; 128(8): 1822-35). Jednakże aktywność OSM nie jest jednokierunkowa i w przypadku innych niż wskazane powyżej typów linii nowotworowych OSM często wykazywała efekt odwrotny, tzn. stymulację proliferacji. Taki efekt opisano w przypadku nowotworów prostaty (Godoy-Tundidor S, i wsp. Z. lnterleukin-6 and oncostatin M stimulation of proliferation of prostate cancer 22Rv1 cells through the signaling pathways of p38 mitogen-activated protein kinase and phosphatidylinositol 3-kinase. Prostate. 2005 Jul 1; 64(2):209-16), jajnika (Li Q. i wsp.

PL 233 352 B1

Oncostatin M promotes proliferation of ovarian cancer cells through signal transducer and activator of transcription 3. Int J Mol Med. 2011 Jul; 28(1):101-8) i mięska Ewinga (David E i wsp.Oncostatin M is a growth factor for Ewing sarcoma. Am J Pathol. 2012 Nov; 181(5):1782-95).

Mimo, że OSM i jej mutanty jako takie nie okazały się wystarczająco atrakcyjne jako czynnik przeciwnowotworowy, to ze względu na powinowactwo do więcej niż jednego efektora nadeksprymowanego mogą służyć jako efektywny nośnik kierujący cząsteczki toksyczne do komórek nowotworowych.

Onkostatyna M może służyć jako nośnik kierujący dla dowolnej białkowej cząsteczki wykazującej działanie cytotoksyczne. W szczególności może służyć jako nośnik toksyn y Pseudomonas, w szczególności fragmentu toksyny Pseudomonas obejmujący tylko część enzymatyczną (domena III) i fragment domeny translokacyjnej. Taki fragment toksyny Pseudomonas nie jest w stanie specyficznie związać się z komórką, dlatego jego działanie powinno się ujawnić dopiero po endocytozie, w której pośredniczy onkostatyna M związana na komórce z przynajmniej jednym specyficznym receptorem.

Szczegółowy opis wynalazku

Istotą wynalazku jest wykorzystanie ludzkiej Onkostatyny M (OSM) i mutantów onkotoksyny M jako nośników i wspomagających efektorów dla domen cytotoksycznych w terapii przeciwnowotworowej. Wynalazek polega na połączeniu dwóch domen białkowych. Ludzkiej cytokiny onkostatyna M lub mutanta ludzkiej onkostatyny M oraz domeny efektorowe j o działaniu cytotoksycznym, takiej jak egzotoksyna A Pseudomonas.

W tym układzie według wynalazku onkostatyna M lub mutant onkotoksyny M jest nośnikiem nakierowującym cząsteczkę toksyny na komórkę nowotworową poprzez rozpoznanie i związanie receptorów specyficznych dla onkotoksyny M. Natomiast domena toksyny Pseudomonas jest cytotoksycznym efektorem uśmiercającym docelową komórkę po internalizacji całego konstruktu w procesie endocytozy receptora/ów.

Przedmiotem wynalazku jest białko fuzyjne, zawierające:

- domenę (a), którą jest fragment sekwencji aminokwasowej onkostatyny M lub mutanta onkostatyny M wybrany z grupy składającej się z Sekw. Nr 6, Sekw. Nr 7, Sekw. Nr 8, Sekw. Nr 9 i Sekw. Nr 10, oraz

- domenę (b) którą jest sekwencja egzotoksyny A Pseudomonas o Sekw. Nr 11.

Korzystnie białko fuzyjne, zawiera:

- domenę (a), którą jest fragment sekwencji aminokwasowej onkostatyny M o Sekw. Nr 6 oraz

- domenę (b) którą jest sekwencja egzotoksyny A Pseudomonas o Sekw. Nr 11.

Również korzystnie białko fuzyjne, zawiera:

- domenę (a), którą jest fragment sekwencji aminokwasowej mutanta onkostatyny M o sekwencji wybranej z grupy składającej się z Sekw. Nr 7, Sekw. Nr 8 i Sekw. Nr 9 oraz

- domenę (b) którą jest sekwencja egzotoksyny A Pseudomonas o Sekw. Nr 11.

Podobnie korzystnie białko fuzyjne, zawiera:

- domenę (a), którą jest fragment sekwencji aminokwasowej mutanta onkostatyny M o sekwencji Sekw. Nr 10 oraz

- domenę (b) którą jest sekwencja egzotoksyny A Pseudomonas o Sekw. Nr 11.

Przedmiotem wynalazku jest także sekwencja aminokwasowa nieopisanego do tej pory mutanta onkostatyny M wyrażona Sekw. Nr 9

W białku fuzyjnym według wynalazku domeny (a) i (b) mogą być połączone za pomocą elastycznego linkera, takiego jak przykładowo linker o sekwencji GGGGSASGG o Sekw. Nr 12 lub dowolny inny znany specjaliście w dziedzinie linker steryczny np. linker glicynowo-serynowy lub glicynowo-serynowo-alaninowy. Dodatkowo białka fuzyjne według wynalazku mogą być zaopatrzone w motyw kierujący do retikulum KDEL o Sekw. Nr 13 lub dowolny inny motyw kierujący do retikulum znany specjaliście w dziedzinie.

Sekwencja Nr 11 mutanta egzotoksyny Pseudomonas to sekwencja obejmująca aminokwasy 276-633 z delecją 390-405, sekwencji przedstawionej w NCBI Reference Sequence: WP_058170169.1.

Onkostatyna M obecna w konstrukcie zwiąże przynajmniej jeden z rozpoznawanych przez siebie receptorów (gp130, OSMP, LIFR), które są często nadreprezentowane na komórkach nowotworowych.

PL 233 352 B1

W jednym wykonaniu białka fuzyjnego według wynalazku sekwencja onkostatyny M domeny (a) jest przedstawiona jako Sekw. Nr 6.

Sekw. Nr 6. to dzika wersji onkostatyny M, a konkretnie sekwencja obejmująca aminokwasowy 26-221 sekwencji zdeponowanej pod numerem GenBank: AAH11589.1.

Taki wariant jest korzystny w przypadku komórek wrażliwych na onkostatynę. Zastosowanie onkostatyny M o Sekw. Nr 6 jako nośnika efektorów wzmacnia efekt cytotoksyczny białka fuzyjnego, ze względu na to, że onkostatyna M wykazuje dodatkowy efekt cytostatyczny. Taki wariant białka fuzyjnego wykazuje synergistyczny efekt cytotok syczny pochodzący od działania dzikiej onkostatyny M oraz od egzotoksyny Pseudomonas.

Nadreprezentacja receptorów OSM na komórkach nowotworowych ma podwójne znaczenie dla niniejszego wynalazku. W przypadku gdy obserwowany efekt cytotoksyczny obserwowany na linii komórkowej jest zbyt silny, co mogłoby skutkować działaniami niepożądanymi, według wynalazku stosuje się w białku fuzyjnym mutanty onkostatyny M o obniżonym powinowactwie do jednego z jej receptorów.

W takim wykonaniu sekwencja aminokwasowa mutantów onkostatyny M domeny (a) o obniżonym powinowactwie do jednego z jej receptorów jest przedstawiona jako Sekw. Nr 7 lub Sekw. Nr 8.

Sekw. Nr 7 to sekwencja onkostatyny M z mutacją Q20A o obniżonym powinowactwie do receptora gp130.

Sekw. Nr 8 to sekwencja onkostatyny M z mutacją K163A o obniżonym powinowactwie do receptora OSMR/LIFR.

Deller MC i wsp. Crystal structure and functional dissection of the cytostatic cytokine oncostatin M. Structure. 2000 Aug 15; 8(8):863-74)

W przypadku nowotworów na które onkostatyna M nie działa, lub działa wręcz stymulująco, bądź w przypadku pojawienia się w warunkach in vivo toksyczności, eliminacja jej aktywności biologicznej poprzez zastosowanie w białkach fuzyjnych według wynalazku mutantów onkostatyny M o ograniczonym powinowactwie do jednego z jej receptorów podnosi bezpieczeństwo terapii bez istotnego ograniczania efektywności.

Białko fuzyjne według wynalazku zawierające jako domenę (a) sekwencje mutanta onkostatyny M o obniżonym powinowactwie do obu receptorów gp130 i OSMR/LIFR stanowi kontrolę negatywną.

W tym wykonaniu sekwencja mutanta onkostatyny M o obniżonym powinowactwie do obu receptorów gp130 i OSMR/LIFR jest przedstawiona jako Sekw. Nr 9.

W innym wykonaniu białka fuzyjnego według wynalazku sekwencja mutanta onkostatyny M domeny (a) jest przedstawiona jako Sekw. Nr 10.

Sekw. Nr 10 to wariant delecyjny onkostatyny M, w którym ze struktury usunięta została pętla (między helisami B i C) obecna w pobliżu miejsca wiązania receptorów OSMR i LIFR. W wariancie tym, określanym w literaturze jako M2 (Chollangi S i wsp.A unique loop structure in oncostatin M determines binding affinity toward oncostatin M receptor and leukemia inhibitory factor receptor. J Biol Chem. 2012 Sep 21; 287(39):32848-59), modyfikacja obejmuje usunięcie aminokwasów 93-103 i zastąpienie ich krótkim łącznikiem złożonym z trzech glicyn (GGG). Wariant taki wykazuje silniejsze wiązanie z receptorem i intensywniej indukuje zahamowanie proliferacji komórek.

W szczególności przedmiotem wynalazku są białka fuzyjne: OSMPE1.0 o Sekw. Nr 1, OSMPE1.1 o Sekw. Nr 2, OSMPE1.2 o Sekw. Nr 3, OSMPE1.3 o Sekw. Nr 4, OSMPE2.0 o Sekw. Nr 5, które szczegółowo opisano, odpowiednio, w Przykładach wykonania od 1 do 5.

P r z y k ł a d y w y k o n a n i a:

P r z y k ł a d 1. Białko fuzyjne OSMPE1.0 o Sekw. Nr 1

Białko fuzyjne składa się z dzikiej wersji onkostatyny M o Sekw. Nr 6 (OSM: GenBank: AAH11589.1 aminokwasy 26-221) z domeną aktywną endotoksyny Pseudomonas 276-633 (del 390-405) o Sekw. Nr 11 z mutacjami punktowymi w celu zmniejszenia immunogenności oraz motywu KDEL o Sekw. Nr 13 dla efektywnego transportu do retikulum cytoplazmatycznego. Domeny onkostatyny i toksyny Pseudomonas połączono za pomocą elastycznego linkera GGGGSASGG o Sekw. Nr 12

PL 233 352 Β1

Sekw. Nr 1:

AAIGSCSKEY RVLLGQLQKQ TDLMO.DTSRL LDPYIRIOGL DVPKLREHCR

ERPGAFPSEE TLRGLGRRGF LOTLNATLGC VLHRLADLEQ RLPKAODLER

101 SGLNIEDLEK LQMARPNILG LRNNIYCMAO LLDNSDTAEP TKAGRGASOP

151 PTPTPASDAF QRKLEGCRFL HGYHRFMH$V GRVFSKWGES PNRSRRGGGG

201 SASGGPEGGS LAALTAHOAC HLPLETFTRH RQPRGWEOLE QCGYPVQRLV

251 ALYLAARLSW NQVDQVIANA LASPGSGGDL GEAIRESPEO ARLALTLAAA

301 ESERFVRQGT GN DEAGAANG PADSGDALLE RNYPTGAEFL GDGGDVSFST

351 RGTQNWTVER LLQAHRQLEE AGYVFVGYHG TFLEAAQSIV FGGVRARSQD

401 LDAIWAGFYI AGDPALAYGY AQDQEPDAAG RIRNGALLRV YVPRSSLPGF

451 YATSLTLAAP EAAGEVERLI GHPLPLRLDA ITGPEESGGR LETILGWPLA

501 ERTWIPSAI PTDPRNYGGD LDPSSIPDSE OAISALPDYA SOPGKPPKDE

551 L

Sekwencja OSM: aminokwasy 1-196

Sekwencja toksyny Pseudomonas: aminokwasy 206-547 sekwencje elastycznego linkera i motywu KDEL podkreślono mutacje w sekwencji OSM wytłuszczono

Przykład 2. Białko fuzyjne OSMPE1.1 o Sekw. Nr 2

Białko fuzyjne składa się z onkostatyny M z mutacją Q20A o Sekw. Nr 7 mającej obniżone powinowactwo do receptora gpl30 z domeną aktywną endotoksyny Pseudomonas 276-633 (del 390-405) o Sekw. Nr 11 z mutacjami punktowymi w celu zmniejszenia immunogenności oraz motywu KDEL o Sekw. Nr 13 dla efektywnego transportu do retikulum cytoplazmatycznego. Domeny onkostatyny i toksyny Pseudomonas połączono za pomocą elastycznego linkera GGGGSASGG o Sekw. Nr 12.

Sekw. Nr 2:

AAIGSCSKEY RVLLGQLQKA TDLMQDTSRL LDPYIRIOGL DVPKLREHCR

ERPGAFPSEE TLRGLGRRGF LOTLNATLGC VLHRLADLEQ RLPKAODLER

101 SGLNIEDLEK LOMARPNILG LRNNIYCMAO LLDNSDTAEP TKAGRGASOP

151 PTPTPASDAF QRKLEGCRFL HGYHRFMHSV GRVFSKWGES PNRSRRGGGG

201 SASGGPEGGS LAALTAHOAC HLPLETFTRH RQPRGWEQLE QCGYPVQRLV

251 ALYLAARLSW NQVDQVIANA LASPGSGGDL GEAIRESPEO. ARLALTLAAA

301 ESERFVRQGT GNDEAGAANG PADSGDALLE RNYPTGAEFL GDGGDYSFST

351 RGTQNWTVER LLQAHRQLEE AGYVFVGYHG TFLEAAQSIV FGGVRARSQD

401 LDAIWAGFYI AGDPALAYGY AQDQEPDAAG RIRNGALLRY YVPRSSLPGF

451 YATSLTLAAP EAAGEVERLI GHPLPLRLDA ITGPEESGGR LETILGWPLA

501 ERTWIPSAI PTDPRNVGGD LDPSSIPDSE OAISALPDYA SOPGKPPKDE

551 L

PL 233 352 Β1

Sekwencja OSM: aminokwasy 1-196

Przykład 3. Białko fuzyjne OSMPE1.2 o Sekw. Nr 3

Białko fuzyjne składa się z onkostatyny M z mutacją K163A o Sekw. Nr 8 mającej obniżone powinowactwo do receptora OSMR/LIFR z domeną aktywną endotoksyny Pseudomonas 276-633 (del 390-405) o Sekw. Nr 11 z mutacjami punktowymi w celu zmniejszenia immunogenności oraz motywu KDEL o Sekw. Nr 13 dla efektywnego transportu do retikulum cytoplazmatycznego. Domeny onkostatyny i toksyny Pseudomonas połączono za pomocą elastycznego linkera GGGGSASGG o Sekw. Nr 12 Sekw. Nr 3

AAIGSCSKEY RVLLGQLQKQTDLMGDTSRL LDPYIRIQGL DYPKLREHCR

ERPGAFPSEE TLRGLGRRGF LQTLNATLGC VLHRLADLEQ RLPKAQDLER

101 SGLNIEDLEK LQMARPNILG LRNNIYCMAQ LLDNSDTAEP TKAGRGASO.P

151 PTPTPASDAF QRALEGCRFL HGYHRFMHSV GRYFSKWGES PNRSRRGGGG

201 SASGGPEGGS LAALTAHO.AC HLPLETFTRH RQPRGWEQLE QCGYPVQRLV

251 ALYLAARLSW NQVDQVIANA LASPGSGGDL GEAIRESPEO, ARLALTLAAA

301 ESERFVRQGTGNDEAGAANG PADSGDALLE RNYPTGAEFL GDGGDYSFST

351 RGTQN WTYER LLQAHRQLEE AGYYFYGYHG TFLEAAQSIV FGGVRARSQD

401 LDAIWAGFYI AGDPALAYGY AQDQEPDAAG RIRNGALLRY YYPRSSLPGF

451 YATSLTLAAP EAAGEYERLI GHPLPLRLDA ITGPEESGGR LETILGWPLA

501 ERTWIPSAI PTDPRNYGGD LDPSSIPDSE OAISALPDYA SO.PGKPPKDE

551 L

Sekwencja OSM: aminokwasy 1-196

Przykład 4. Białko fuzyjne OSMPE1.3 o Sekw. Nr 4

Białko fuzyjne składa się z onkostatyny M z mutacjami O20A/K163A o Sekw. Nr 9 mającej obniżone powinowactwo do receptorów gp 130 i OSMR/LIFR z domeną aktywną endotoksyny Pseudomonas 276-633 (del 390-405) o Sekw. Nr 11 z mutacjami punktowymi w celu zmniejszenia immunogenności oraz motywu KDEL o Sekw. Nr 13 dla efektywnego transportu do retikulum cytoplazmatycznego. Domeny onkostatyny i toksyny Pseudomonas połączono za pomocą elastycznego linkera GGGGSASGG o Sekw. Nr 12 Białko stanowi kontrolę zawierającą modyfikacje nie pozwalające efektywnie oddziaływać domenie kierującej z żadnym receptorem.

Sekw. Nr 4:

AAIGSCSKEY RVLLGQLQKA TDLMQDTSRL LDPYIRIQGL DYPKLREHCR

ERPGAFPSEE TLRGLGRRGF LOTLNATLGC VLHRLADLEQ RLPKAQDLER

101 SGLNIEDLEK LDMARPNILG LRNNIYCMAQ LLDNSDTAEP TKAGRGASQP

151 PTPTPASDAF QRALEGCRFL HGYHRFMHSY GRYFSKWGES PNRSRRGGGG

201 SASGGPEGGS LAALTAHOAC HLPLETFTRH RQPRGWEQLE QCGYPVQRLV

251 ALYLAARLSW NQYDQVIANA LASPGSGGDL GEAIRESPEQ ARLALTLAAA

PL 233 352 Β1

301 ESERFVRQGT GNDEAGAANG PADSGDALLE RNYPTGAEFL GDGGDVSFST

351 RGTQNWTVER LLQAHRQLEE AGYVFVGYHG TFLEAAQSIV FGGVRARSQD

401 LDAIWAGFYI AGDPALAYGY AQDQEPDAAG RIRNGALLRV WPRSSLPGF

451 YATSLTLAAP EAAGEYERLI GHPLPLRLDA ITGPEESGGR LETILGWPLA

501 ERTWIPSAI PTDPRNVGGD LDPSSIPDSE OAISALPDYA SQPGKPPKDE

551 L

Sekwencja OSM: aminokwasy 1-196

Przykład 5. Białko fuzyjne OSMPE2.0 o Sekw. Nr5

Przykład w którym wykorzystano onkostatynę M w postaci wariantu określanego w literaturze jako M2, posiadającego delecję aminokwasów 93-103 i w ich miejsce insercję krótkiego łącznika z trzech glicyn. Wariant powinien intensywniej wiązać się z receptorem OSMR i indukować zahamowanie proliferacji. Do tego wariantu OSM dołączono domenę aktywną endotoksyny Pseudomonas 276-633 (del 390-405) z mutacjami punktowymi w celu zmniejszenia immunogenności i motyw KDEL o Sekw. Nr 13 dla efektywnego transportu do retikulum cytoplazmatycznego połączona za pomocą elastycznego linkera GGGGSASGG o Sekw. Nr 12

Białko fuzyjne składa się z onkostatyny M w postaci tzw. wariantu M2 posiadającego delecję aminokwasów 93-103 i w ich miejsce insercję krótkiego łącznika z trzech glicyn, o Sekw. Nr 10, który intensywniej wiąże się z receptorem OSMR i indukuje zahamowanie proliferacji oraz domeny aktywnej endotoksyny Pseudomonas 276-633 (del 390-405) o Sekw. Nr 11 z mutacjami punktowymi w celu zmniejszenia immunogenności, a także motywu KDEL o Sekw. Nr 13 dla efektywnego transportu do retikulum cytoplazmatycznego. Domeny onkostatyny i toksyny Pseudomonas połączono za pomocą elastycznego linkera GGGGSASGG o Sekw. Nr 12.

Sekw. Nr 5:

AAIGSCSKEY RVLLGQ.LQKQ TDLMQDTSRL LDPYI R!QGL DVPKLREHCR

ERPGAFPSEE TLRGLGRRGF LO.TLNATLGC VLHRLADLEQ RLGGGNIEDL

101 EKLQMARPNI LGLRNNIYCM AQLLDNSDTA EPTKAGRGAS QPPTPTPASD

151 AFQRKLEGCR FLHGYHRFMH SVGRVFSKWG ESPNRSRRGG GGSASGGPEG

201 GSLAALTAHO. ACHLPLETFT RHRQPRGWEQ LEQCGYPVQR LYALYLAARL

251 SWNQVDQVIA NALASPGSGG DLGEA1RESP EOARLALTLA AAESERFVRQ

301 GTGNDEAGAA NGPADSGDAL LERNYPTGAE FLGDGGDVSF STRGTQNWTV

351 ERLLQAHRQL EEAGYVFVGY HGTFLEAACLS IVFGGVRARS QDLDA1WAGF

401 YIAGDPALAY GYAQ.DQ.EPDA AGRIRNGALL RVYVPRSSLP GFYATSLTLA

451 APEAAGEVER LIGHPLPLRL DAITGPEESG GRLETILGWP LAERTWIPS

501 AIPTDPRIWG GDLDPSSIPD SEOAISALPD YASQPGKPPK DEL

Sekwencja OSM: aminokwasy 1-188

Sekwencja toksyny Pseudomonas: aminokwasy 198-539 sekwencje elastycznego linkera i motywu KDEL podkreślono mutacje w sekwencji OSM wytłuszczono.

PL 233 352 B1

P r z y k ł a d 6. Przygotowanie preparatów białek fuzyjnych

Sekwencje aminokwasowe opisanych powyżej w Przykładach od 1 do 5 białek fuzyjnych (tj. sekwencje Sekw. Nr 1, Sekw. Nr 2, Sekw. Nr 3, Sekw. Nr 4, Sekw. Nr 5) posłużyły jako matryce do wygenerowania kodujących je sekwencji DNA zawierających kodony optymalne dla wyrażania w E.coli przy wykorzystaniu reverse translation tools dostępnych on-line z portalu expassy przy zastosowaniu domyślnych ustawień programu dla uzyskania optymalnych kodonów do wyrażania w E.coli, z preferencją kodonów ludzkich.

Otrzymane sekwencje nukleotydowe zostały następnie automatycznie zsyntetyzowane z dodatkowo dołączonymi do nich miejscami dla enzymów restrykcyjnych Ndel (na końcu 5' nici wiodącej) i Xhol (na końcu 3' nici wiodącej). Sekwencje te posłużyły do klonowania genu odpowiedniego białka fuzyjnego do wektora pochodzącego z pET28a (Novagen). Białka z takiego konstruktu posiadały na końcu N znacznik polihistydynowy (10 histydyn) poprzedzony sekwencją poliglicynową i miejscem rozpoznawanym przez trombinę, który posłużył następnie do ich oczyszczania za pomocą chromatografii powinowactwa. Poprawność uzyskanych konstruktów potwierdzono przez automatyczne sekwencjonowanie całej ramki odczytu. Uzyskane plazmidy posłużyły d o nadprodukcji białek w szczepie E. coli BL21 DE3 RIL Codon-Plus (Startagen). Powyższy szczep był nimi transformowany, a uzyskane na podłożu selekcjonującym (LB agar, kanamycyna, chloramfenikol, 1% glukoza) kolonie posłużyły do założenia nocnej kultury w podłożu płynnym LB uzupełnionym kanamycyną, chloramfenikolem i glukozą. Pre-kultury posłużyły do zaszczepienia właściwej hodowli. Prowadzono je w pożywce TB uzupełnionej kanamycyną i chloramfenikolem w temperaturze 37 °C, Przy OD 0,15-0,5 hodowlę indukowano 1 mM IPTG i obniżono temperaturę do 25°C. Ekspresję prowadzono przez 18 h. Osad bakteryjny zbierano przez wirowanie hodowli przy 7000 g i analizowano elektroforetycznie za pomocą SDS-PAGE.

Komórki po nadprodukcji były dezintegrowane w buforze o następującym składzie 100 mM Tris-HCI, 300 mM NaCI, 10 mM Imidazol, pH 8. Otrzymany ekstrakt był klarowany przez wirowanie 50 min przy 8000 g. Supernatant nanoszono na kolumnę His NI-NTA. W celu wymycia frakcji zawierających białka niewiążące się do złoża, kolumnę płukano: 3 objętościami kolumny buforu o składzie jak wyżej. W celu odmycia białek związanych specyficznie, złoże płukano 10 objętościami liniowego gradientu 0-100% buforu o składzie jak wyżej zawierającego dodatkowo 500 mM imidazol. Zebrane frakcje analizowano za pomocą SDS-PAGE.

Frakcje wykazujące obecność białek o oczekiwanej masie połączono i trawiono trombiną (w stosunku 1U trombiny na 4 mg białka przez 8 h w 16°C) w celu usunięcia metki polihistydynowej, a następnie dializowano do buforu formulacyjnego: PBS (10 mM NasPO4, 137 mM NaCI, 2.7 mM KCI) + 2mM zredukowany glutation.

P r z y k ł a d 7. Analiza preparatów białkowych białek fuzyjnych

Dla uzyskanych preparatów białek fuzyjnych oznaczono stężenie, czystość oraz strukturę drugorzędową (CD-dichroizm kołowy). Następnie oczyszczone preparaty białek fuzyjnych zostały przebadane pod względem specyficzności oddziaływania z receptorami onkostaty ny M z wykorzystaniem powierzchniowego rezonansu plazmonowego (urządzenie BIACORE T200). Receptory gp130 i OSMR (preparaty rekombinowane, uzyskane standardowymi metodami) immobilizowano na sensorze CM5 za pomocą wiązań aminowych do poziomu około 2000 RU (reflection units). Badane preparaty białek fuzyjnych według wynalazku i referencyjne nastrzykiwano we wzrastających stężeniach, a związana frakcja była oddysocjowywana w czasie jednolitym. Uzyskane sygnały analizowano przy pomocy oprogramowania T200 BiaEval uation. Do obliczeń dobrano standardowy model Langmuira 1:1. Pozwoliło to na wyznaczenie stałych asocjacji i dysocjacji Kon i Kof oraz dużej stałej dysocjacji wyznaczającej siłę kompleksu KD. Im wartość KD jest niższa tym silniejsze jest wyznaczone wiązanie.

Celem weryfikacji powinowactwa wybranych białek fuzyjnych według wynalazku do receptorów onkostatyny M zmierzono dla nich parametry kinetyki oddziaływania. Wyniki przedstawiono w Tabeli 2. Obliczono wartości stałych dla dzikiej formy onkostatyny M (niep oddanej koniugacji) względem każdego receptora OSM, a także dla cząsteczki fuzyjnej OSMPE1.1 według Przykładu 2, która została zmutowana celem uzyskania obniżonego powinowactwa do receptora gp 130. Uzyskana wartość KD dla receptora gp130 jest o ponad dwa rzędy wielkości wyższa od wartości uzyskanej dla dzikiej OSM, co znaczy o ponad dwa rzędy wolniejszą kinetykę odziaływania z tym receptorem w porównaniu do wariantu dzikiej onkostatyny M. Wyznaczone wartości kinetyczne potwierdzają,

PL 233 352 Β1 że białko fuzyjne OSMPE1.1 według Przykładu 2 pozwala na obniżenie powinowactwa do receptorów dla OSM. W związku z tym można przewidywać, że na modelu komórkowym i zwierzęcym uzyskana zostanie sumarycznie obniżona aktywność cytotoksyczna (w porównaniu z zastosowaniem jako nośnika toksyny dzikiej OSM). A zatem stosowanie jako nośnika mutanta OSM o obniżonym powinowactwie do receptorów OSM pozwala na modulowanie odpowiedzi cytotoksycznej.

Tabela 2. Przykładowe wyniki badania parametrów kinetycznych odziaływania białka fuzyjnego OSMPE1.1 według Przykładu 2 i referencyjnego preparatu dzikiej OSM z receptorami gp130 i OSMR. Badania wykonano metodą powierzchniowego rezonansu plazmonowego na urządzeniu BIACORE T200.

Białko fuzyjne/receptor	Ka (1/Ms)	Kd (1/s)	KD (M)
OSM/gpl30	2,13E+04	1,95E-O3	9,13E-O8
OSM/OSMR	6,27E+04	3,92E-O3	6,25E-O7
OSMPEl.l/gpl30	3,75E+3	9,88E-O3	2,63 E-5
OSMPE1.1/OSMR	8,39E+04	2,O7E-O3	2,46E-O8

Oznaczenia:

- OSM - referencja samej dzikiej Onkostatyny M (białko rekombinowane),

- OSMPE1.1 - białko fuzyjne według Przykładu 2 (o obniżonym powinowactwie do receptora gp130)

Przykład 9. Analiza cytotoksyczności

W następnej kolejności białka fuzyjne według wynalazku z Przykładów od 1 do 5 posłużyły do badań cytotoksyczności na panelu 10 ludzkich linii komórkowych (9 linii nowotworowych: A549, SK-MES-1, A431, A375, SKOV3, HCT116, HepG2, Pand, MiaPaCa2 z różnych narządów i jedna nietransformowana nowotworowo linia ludzkich fibroblastów CCD11Lu, służąca jako referencja aktywności względem komórek prawidłowych i określenia potencjalnego ryzyka toksyczności ogólnej.

Linie komórkowe pozyskano z ATCC, a następnie namnożono i zdeponowano w Banku Linii Komórkowych Laboratorium Biologicznego ADAMED. Hodowle prowadzono w standardowych warunkach: 37°C, 5% CO2, 95% wilgotności i hodowane były w optymalnych dla nich pożywkach zgodnie z zaleceniami ATCC dla poszczególnych linii. Hodowlę komórkową rozcieńczano pożywką do określonej gęstości (ok. 3 x 10⁵ - komórek na 1 ml). Następnie 150 μΙ odpowiednio rozcieńczonej zawiesiny komórkowej nanoszono na płytkę 96-dołkową w trzech powtórzeniach. Tak przygotowane komórki inkubowano przez 24 h w 37°C w 5% CO2, 95% wilgotności, po czym do komórek zawieszonych w 150 μΙ odpowiedniej dla nich pożywki, dodawano kolejne 50 μΙ odpowiedniej pożywki zawierającej różne stężenia odpowiedniego testowanego białka fuzyjnego według wynalazku otrzymanymi według wyżej opisanej procedury lub kontroli. Komórki inkubowano z preparatami białek przez kolejne 72 h, po czym do pożywki z testowymi preparatami dodawano 20 μΙ standardowego, dostępnego komercyjnie roztworu roboczego MTT (5 mg/ml) i inkubowano przez 3 h w 37°C w 5% CO2. Następnie pożywkę z roztworem MTT usuwano, a kryształy formazanu rozpuszczano, dodając 100 μΙ DMSO. Po wymieszaniu mierzono absorbancję przy długości fali 570 nm (filtr referencyjny 690 nm), a wyniki przekładano na żywotność hodowli względem kontroli nietraktowanej i na tej podstawie wyznaczano wartość IC50 (stężenie hamujące żywotność komórek w 50%).

PL 233 352 Β1

Wyniki uzyskane z badań cytotoksyczności zebrano w Tabeli 1.

Tabela 1. Wyniki badania cytotoksyczności na liniach komórkowych (wyniki uśrednione IC50 z trzech niezależnych pomiarów).

Oznaczenia w tabeli:

Białko	Płuca	Skóra	Jajnik	j. grube	Wątroba	Trzustka	Fibroblasty
A549	SK- MES-1	A431	A375	SK0V3	HCT116	HepG2	Panel	Mia Pa Ca 2	CCDllLu
OSMPEl.O Prz. 1	30,09	21,14	531,53	>9000	2678,00	2476,00	16,30	7,75	4,41	7345,50
OSMPE1.1 Prz, 2	127,13	114,88	863,50	9259,67	1767,33	1569,00	31,37	39,18	60,39	9627,33
OSMPE1.2 Prz. 3	211,00	222,87	2214,00	>17500	2963,00	2154,00	90,30	224,43	100,81	6467,00
OSMPE1.3 Prz. 4	573,57	1392,00	2042,00	>12500	8197,00	3367,00	247,20	253,27	278,27	>12500
OSMPE2.0 Prz. 5	10,52	6,51	305,77	1432,50	313,93	313,83	2,02	5,58	2,92	4446,67
OSM dzika	1744,33	3188,00	2211,00	>17500	10397,33	8641,00	16222,50	4222,67	759,67	>17500
PE2.0	>20000	>20000	>20000	6136,50	>20000	>20000	>20000	592,97	>20000	545,10

W wierszu nr 1 podano pochodzenie nowotworowych linii komórkowych, a w wierszu 2 ich oznaczenia kodowe wg ATCC.

Linia Ludzkich Fibroblastów stanowi referencję komórek nietransformowanych nowotworowo (prawidłowych).

OSM - referencja: dzikiej onkostatyny M,

PE2.0 - referencja: sama domena egzotoksyny A z Pseudomonas identyczna z użytą w białkach fuzyjnych według wynalazku (Sekw. Nr 11)

OSMPE1.0 - wg Przykładu 1 (dzika wersja OSM z toksyną PE), OSMPE1.1 - wg Przykładu 2 (obniżone powinowactwo do receptora gp130), OSMPE1.2 - wg Przykładu 3 (obniżone powinowactwo do receptora OSMR/LIFR), OSMPE1.3 - wg Przykładu 4 (obniżone powinowactwo do obu receptorówkontrola negatywna), OSMPE2.0 - wg Przykładu 5 (delecja w OSM 93-103, podnosząca powinowactwo do receptora OSMR).

Wartości IC50 podano w ng/ml. Istotne jest porównanie zmiany uzyskanych wartości IC50 w odniesieniu osobno do każdej stosowanej linii komórkowej, które różnią się poziomem ekspresji receptorów, w które celują białka fuzyjne według wynalazku.

Badania na liniach komórkowych z zastosowaniem rekombinowanego białka dzikiej onkostatyny M jak i egzotoksyny A Pseudomonas stosowanych pojedynczo wykazały, że wykazują one niezadawalającą cytotoksyczność (wysokie wartości IC50), a na modelu zwierzęcym nie obserwuje się zahamowania wzrostu guzów nowotworowych, a dodatkowo w przypadku egzotoksyny wysoką toksyczność ogólnou kładową.

Wyniki zebrane w Tabeli 1 wyraźnie wskazują, że składowe białka fuzyjnego stosowane osobno nie wywołują efektu cytotoksycznego (mierzonego wartością IC50), gdyż wysokie wartości IC50 obliczono jedynie ekstrapolując krzywą dla niższych, akceptowalnych poziomów stężeń dla tego typu doświadczeń.

PL 233 352 B1

Cząsteczki fuzyjne według wynalazku wykazują w większości przypadków (w zależności od mutanta onkostatyny M) znacznie niższe wartości IC50 niż ich składowe, a zatem białka fuzyjne według wynalazku wygenerowały efekt synergistyczny.

Fuzja wariantu dzikiego OSM wg Prz. 1 wykazuje wyższe aktywności (niższe IC50) niż mutanty zmniejszonych powinowactwach do konkretnych receptorów (fuzje wg Prz. 2, 3 i 4), przy czym najsłabszy jest wariant z podwójnie obniżonym powinowactwem zarówno do gp130 jak OSMR (OSMPE1.3Przykład 4).

Wariant OSMPE2.0 - Przykład 5, który w genie OSM posiada delecję zwiększającą powinowactwo do receptora OSMR wykazuje najwyższe aktywności (najniższe IC50). Wszystkie testowane białka fuzyjne według wynalazku wykazują wysokie wartości IC50 wobec ludzkich fibroblastów (od kilku do kilkuset razy wyższe niż na komórkach nowotworowych) co potwierdza niską specyficzność a co za tym idzie toksyczność cząsteczek wobec komórek prawidłowych.

Można wskazać linie nowotworowe szczególnie wrażliwe na białka fuzyjne według wynalazku pochodzące z płuc i trzustki, co pośrednio koreluje z literaturowo opisanymi przypadkami wrażliwości na onkostatynę. Wrażliwość ta najprawdopodobniej koreluje z poziomem eksprymowanych receptorów dla OSM - ale brak jest szczegółowych danych literaturowych określających poziomy ekspresji receptorów OSM dla poszczególnych rodzajów nowotworów.

Stosowanie cząsteczek fuzyjnych onkostatyny M lub jej mutantów o ograniczonym powinowactwie wg wynalazku, lecz wciąż wiążących przynajmniej jeden receptor OSM, z niespecyficzną domeną cytotoksyczną egzotoksyny Pseudomonas pozwala na modulowanie poziomu aktywności toksyny, a poprzez to ogranicza ryzyko dodatkowych efektów toksycznych w przypadku nowotworów wykazujących szczególną wrażliwość na OSM. Stosowanie białek fuzyjnych według wynalazku istotnie podnosi efektywność przeciwnowotworową w porównaniu do składowych białek fuzyjnych stosowanych osobno. Badania na panelu komórkowym wskazują na pojawienie się przykładów specyficznego efektu cytotoksycznego wywieranego na komórki nowotworowe przez cząsteczki fuzyjne w porównaniu do samej onkostatyny M, przy braku aktywności na komórkach nietransformowanych.

W przypadku obniżonego powinowactwa białek fuzyjnych według wynalazku do określonych typów nowotworów lub linii nowotworowych, na których OSM może indukować proliferację, zastosowanie silnego efektora jak toksyna Pseudomonas jest wystarczające do wywołania na tych komórkach wybiórczej cytotoksyczności nad sygnałem wzrostu nowotworu. Jeżeli działanie cytostatycznego efektora jest dla danego rodzaju nowotworu niewystarczające dla zahamowania pro-onkogennej aktywności OSM wykorzystanie wariantów o obniżonym powinowactwie do jednego z receptorów (np. gp130) blokuje tę aktywność (inhibicja formowania aktywnego biologicznie kompleksu) i pozwala na działanie samego nakierowanego na nowotwór efektora toksyny. Ponadto taka forma białka będzie antagonistą fizjologicznie wydzielanej onkostatyny M.

Stosowanie białek fuzyjnych wg wynalazku o podwyższonym powinowactwie do receptorów OSM (OSMPE2.0 - wg Przykładu 5) zapewnia uzyskanie efektu cytotoksycznego w przypadku komórek które nie będą odpowiadały na OSM lub charakteryzowały się obniżonym poziomem prezentowanych receptorów dla OSM.

Białka fuzyjne według wynalazku zawierające onkostatynę M i jej mutantów o zmodyfikowanym powinowactwie do receptorów i niespecyficznej domeny cytotoksycznej egzotoksyny Pseudomonas ograniczają ryzyko efektów ogólnoustrojowych oraz podnoszą istotnie efektywność samej cząsteczki toksyny. Badania na panelu komórkowym wskazują na pojawienie się przykładów specyficznego efektu cytotoksycznego wywieranego na komórki nowotworowe przez białka fuzyjne według wynalazku w porównaniu do samej onkostatyny M i do samej toksyny Pseudomonas, przy braku aktywności na komórkach nietransformowanych.

P r z y k ł a d 10. Efektywność przeciwnowotworową białek fuzyjnych in vivo na ksenoprzeszczepach

Aktywność przeciwnowotworowa preparatów białkowych badano na mysim modelu ludzkiego nowotworu płuc A549.

Komórki ludzkiego nowotworu płuc A549 utrzymywano w pożywce RPMI1640 (HyClone, Logan, UT, USA) suplementowanej 10% cielęcej surowicy płodowej oraz 2 mM glutaminy. W dniu zaszczepienia myszy, komórki odklejono od podłoża poprzez przemycie trypsyną (Invitrogen), a następnie zwirowano przy 1300 rpm, 4°C, 8 minut i zawieszono w buforze HBSS (Hanks medium).

PL 233 352 B1

Badanie aktywności przeciwnowotworowej białek prowadzono na 4-5 tygodniowych samicach myszy szczepu Crl:SHO-Prkd^cscidHr^hr otrzymanych z hodowli Charles River Germany. Myszy utrzymywano w warunkach wolnych od specyficznych patogenów, z wolnym dostępem do karmy oraz demineralizowanej wody (adlibitum). Wszystkie eksperymenty na zwierzętach prowadzone były zgodnie z wytycznymi: Interdisciplinary Principles and Guidelines for the Use of Animals in Research, Marketing and Education wydanym przez New York Academy of Sciences' Ad Hoc Committee on Animal Research, oraz zostały zaakceptowane przez IV Lokalną Komisję Etyczną do Spraw Doświadczeń na Zwierzętach w Warszawie.

Wielkość guza mierzono przy pomocy suwmiarki elektronicznej, objętość guza liczono według wzoru: (a² x b)/2, gdzie a = krótsza przekątna guza (mm) oraz b = dłuższa przekątna guza (mm). Zahamowanie wzrostu guza obliczano przy pomocy wzoru:

TGI (%) (tumour growth inhibition) = (WT/WC) x 100-100%, gdzie WT oznacza średnią objętość guza w grupie traktowanej, WC oznacza średnią objętość guza w grupie kontrolnej.

Wyniki eksperymentów przedstawiono jako wielkość średnią ± +/- SD (SD). Wszystkie obliczenia oraz wykresy przygotowane zostały przy pomocy programu GraphPad Prism 5.0. Model nowotworu płuc: W dniu 0 myszy zostały zaszczepione przy pomocy strzykawki z igłą 0,5 x 25 mm (Bogmark) podskórnie (s.c.) w prawy bok komórkami w ilości 5x106 komórek ludzkiego nowotworu płuc A549 zawieszonych w 0,1 ml mieszaniny buforu HBSS i Matrigelu (4:1). W 20 dniu eksperymentu myszy poddano randomizacji tak, aby średnia wielkość guzów w grupie wyniosła 175 mm³ i przypisano po trzy zwierzęta do grupy. W grupach podawano preparaty białka fuzyjnego według wynalazku z Prz. 5 (0,1 mg/kg) oraz porównawczo ludzką rekombinowaną Onkostatynę M (0,1 mg/kg) i rekombinowaną domenę aktywną egzotoksyny A z Pseudomonas aeruginosa wobec roztworu soli fizjologicznej jako kontroli. Preparaty podawano drogą dożylną (i.v.) w następującym schemacie: podanie codzienne przez 10 dni. W 32 dniu eksperymentu myszy uśpiono poprzez przerwanie rdzenia kręgowego.

Wyniki eksperymentu przedstawiono na Fig. 1 i Fig. 2, które pokazują zmiany objętości guza nowotworowego względem kontroli (Fig. 1) oraz zahamowanie wzrostu guza (%TGI) jako odsetek kontroli (Fig. 2) u myszy.

Jak pokazują wyniki eksperymentów, przez podawanie białka fuzyjnego według wynalazku z Prz. 5 uzyskano zahamowanie wzrostu guza ludzkieg o nowotworu płuc A549, z wartością TGI 39,5% względem kontroli w 23 dniu, utrzymujące się na podobnym poziomie przez resztę eksperymentu. Dla użytych jako preparaty referencyjne Onkostatyny M i domeny aktywnej egzotoksyny A z Pseudomonas aeruginosa uzyskano punktowe maksymalne wartości TGI na poziomie odpowiednio 15,9% i 11,7%. Zatem białko fuzyjne według wynalazku wykazuje silniejsze działanie w porównaniu ze swoimi składowymi stosowanymi oddzielnie, a zatem dla białka fuzyjnego według wynalazku z Prz. 5 uzyskano efekt synergii.

Zróżnicowanie celów komórkowych onkostatyny skutkuje tym, że OSM może być wykorzystana w celowanej terapii komórkowej jako nośnik o plejotropowej aktywności wiązania się z komórkami nowotworowymi. Ponadto zaangażowanie OSM w różne mechanizmy komórkowe skutkuje uzyskaniem efektów synergistycznych. Efekty te wyrażają się uzyskaniem dla białek fuzyjnych według wynalazku efektu cytotoksycznego wobec komórek linii nowotworowych i uzyskaniem % zahamowania rozwoju guza na modelu zwierzęcym wyższych niż sumaryczne efekty uzyskane w wyniku zastosowania pojedynczych składowych, a także wyższych niż w przypadku zastosowania mieszaniny tych składowych.

PL 233 352 Β1

LISTA SEKWENCJI <110> Adamed sp. z o.o.

Pawlak, Sebastian Dominik <12O> Przeciwnowotworowe białko ftizyjne <13O> Biol/KM/ONCOSTATM <160> 13 <170> Patentln version 3,5 <21O> 1 <211> 551 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> fusion protein <400> 1

Ala Ala Ile Gly Ser Cys Ser Lys Glu Tyr Arg Val Leu Leu Gly Gin 15 1015

Leu Gin Lys Gin Thr Asp Leu Met Gin Asp Thr Ser Arg Leu Leu Asp

2530

Pro Tyr Ile Arg Ile Gin Gly Leu Asp Val Pro Lys Leu Arg Glu His 35 4045

Cys Arg Glu Arg Pro Gly Ala Phe Pro Ser Glu Glu Thr Leu Arg Gly 50 5560

Leu Gly Arg Arg Gly Phe Leu Gin Thr Leu Asn Ala Thr Leu Gly Cys 65 70 7580

Val Leu His Arg Leu Ala Asp Leu Glu Gin Arg Leu Pro Lys Ala Gin

9095

PL 233 352 Β1

Asp Leu Glu Arg Ser Gly Leu Asn He Glu Asp Leu Glu Lys Leu Gin

100 105110

Met Ala Arg Pro Asn Ile Leu Gly Leu Arg Asn Asn Ile Tyr Cys Met 115 120125

Ala Gin Leu Leu Asp Asn Ser Asp Thr Ala Glu Pro Thr Lys Ala Gly 130 135140

Arg Gly Ala Ser Gin Pro Pro Thr Pro Thr Pro Ala Ser Asp Ala Phe 145 150 155160

Gin Arg Lys Leu Glu Gly Cys Arg Phe Leu His Gly Tyr His Arg Phe

165 170175

Met His Ser Val Gly Arg Val Phe Ser Lys Trp Gly Glu Ser Pro Asn

180 185190

Arg Ser Arg Arg Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Gly Gly Pro Glu Gly

195 200205

Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gin Ala Cys His Leu Pro Leu 210 215220

Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gin Pro Arg Gly Trp Glu Gin Leu Glu 225 230 235240

Gin Cys Gly Tyr Pro Val Gin Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala Ala

245 250255

Arg Leu Ser Trp Asn Gin Val Asp Gin Val Ile Ala Asn Ala Leu Ala

260 265270

PL 233 352 Β1

Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Ser Pro 275 280285

Glu Gin Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg 290 295300

Phe Val Arg Gin Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn Gly

305 310 315320

Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr Gly

325 330335

Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly

340 345350

Thr Gin Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gin Ala His Arg Gin Leu

355 360365

Glu Glu Ala Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu 370 375380

Ala Ala Gin Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gin Asp 385 390 395400

Leu Asp Ala Ile Trp Ala Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu

405 410415

Ala Tyr Gly Tyr Ala Gin Asp Gin Glu Pro Asp Ala Ala Gly Arg Ile 420 425430

Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro 435 440445

PL 233 352 Β1

Gly Phe Tyr Ala Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly 450 455460

Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala 465 470 475480

Ile Thr Gly Pro Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly

485 490495

Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr 500 505510

Asp Pro Arg Asn VaI Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp 515 520525

Ser Glu Gin Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gin Pro Gly 530 535540

Lys Pro Pro Lys Asp Glu Leu

545550 <210> 2 <211> 551 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> białko fuzyjne <400> 2

Ala Ala Ile Gly Ser Cys Ser Lys Glu Tyr Arg Val Leu Leu Gly Gin 15 10 15

Leu Gin Lys Ala Thr Asp Leu Met Gin Asp Thr Ser Arg Leu Leu Asp 20 25 30

PL 233 352 Β1

Pro Tyr Ile Arg lie Gin Gly Leu Asp Val Pro Lys Leu Arg Glu His 35 4045

Cys Arg Glu Arg Pro Gly Ala Phe Pro Ser Glu Glu Thr Leu Arg Gly 50 5560

Leu Gly Arg Arg Gly Phe Leu Gin Thr Leu Asn Ala Thr Leu Gly Cys 65 70 7580

Val Leu His Arg Leu Ala Asp Leu Glu Gin Arg Leu Pro Lys Ala Gin

9095

Asp Leu Glu Arg Ser Gly Leu Asn Ile Glu Asp Leu Glu Lys Leu Gin

100 105110

Met Ala Arg Pro Asn He Leu Gly Leu Arg Asn Asn Ile Tyr Cys Met

115 120125

Ala Gin Leu Leu Asp Asn Ser Asp Thr Ala Glu Pro Thr Lys Ala Gly 130 135140

Arg Gly Ala Ser Gin Pro Pro Thr Pro Thr Pro Ala Ser Asp Ala Phe

145 150 155160

Gin Arg Lys Leu Glu Gly Cys Arg Phe Leu His Gly Tyr His Arg Phe

165 170175

Met His Ser Val Gly Arg Val Phe Ser Lys Trp Gly Glu Ser Pro Asn 180 185190

Arg Ser Arg Arg Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Gly Gly Pro Glu Gly

195 200205

PL 233 352 Β1

Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gin Ala Cys His Leu Pro Leu 210 215220

Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gin Pro Arg Gly Trp Glu Gin Leu Glu 225 230 235240

Gin Cys Gly Tyr Pro VaI Gin Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala Ala

245 250255

Arg Leu Ser Trp Asn Gin Val Asp Gin Val Ile Ala Asn Ala Leu Ala

260 265270

Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Ser Pro 275 280285

Glu Gin Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg 290 295300

Phe Val Arg Gin Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn Gly

305 310 315320

Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr Gly

325 330335

Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly

340 345350

Thr Gin Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gin Ala His Arg Gin Leu

355 360365

Glu Glu Ala Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu

370 375380

Ala Ala Gin Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gin Asp

385 390 395400

PL 233 352 Β1

Leu Asp Ala Ile Trp Ala Gly Phe Tyr ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu

405 410415

Ala Tyr Gly Tyr Ala Gin Asp Gin Glu Pro Asp Ala Ala Gly Arg Ile 420 425430

Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr VaI Pro Arg Ser Ser Leu Pro

435 440445

Gly Phe Tyr Ala Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly 450 455460

Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala 465 470 475480

Ile Thr Gly Pro Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly

485 490495

Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr VaI Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr 500 505510

Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp 515 520525

Ser Glu Gin Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gin Pro Gly 530 535540

Lys Pro Pro Lys Asp Glu Leu

545550 <210> 3 <211> 551

PL 233 352 Β1 <212> PRT <213> Artificial Sequence <22O>

<223> białko fuzyjne <400> 3

Ała Ala Ile Gly Ser Cys Ser Lys Glu Tyr Arg Val Leu Leu Gly Gin 15 1015

Leu Gin Lys Gin Thr Asp Leu Met Gin Asp Thr Ser Arg Leu Leu Asp 20 2530

Pro Tyr Ile Arg Ile Gin Gly Leu Asp Val Pro Lys Leu Arg Glu His

4045

Cys Arg Glu Arg Pro Gly Ala Phe Pro Ser Glu Glu Thr Leu Arg Gly 50 5560

Leu Gly Arg Arg Gly Phe Leu Gin Thr Leu Asn Ala Thr Leu Gly Cys 65 70 7580

Val Leu His Arg Leu Ala Asp Leu Glu Gin Arg Leu Pro Lys Ala Gin

9095

Asp Leu Glu Arg Ser Gly Leu Asn Ile Glu Asp Leu Glu Lys Leu Gin

100 105110

Met Ala Arg Pro Asn Ile Leu Gly Leu Arg Asn Asn Ile Tyr Cys Met 115 120125

Ala Gin Leu Leu Asp Asn Ser Asp Thr Ala Glu Pro Thr Lys Ala Gly 130 135140

Arg Gly Ala Ser Gin Pro Pro Thr Pro Thr Pro Ala Ser Asp Ala Phe

145 150 155160

PL 233 352 Β1

Gin Arg Ala Leu Glu Gly Cys Arg Phe Leu His Gly Tyr His Arg Phe

165 170175

Met His Ser Val Gly Arg Val Phe Ser Lys Trp Gly Glu Ser Pro Asn

180 185190

Arg Ser Arg Arg Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Gly Gly Pro Glu Gly

195 200205

Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gin Ala Cys His Leu Pro Leu 210 215220

Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gin Pro Arg Gly Trp Glu Gin Leu Glu 225 230 235240

Gin Cys Gly Tyr Pro Val Gin Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala Ala

245 250255

Arg Leu Ser Trp Asn Gin Val Asp Gin Val Ile Ala Asn Ala Leu Ala

260 265270

Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Ser Pro 275 280285

Glu Gin Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg 290 295300

Phe Val Arg Gin Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn Gly

305 310 315320

Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr Gly

325 330335

PL 233 352 Β1

Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly

340 345350

Thr Gin Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gin Ala His Arg Gin Leu 355 360365

Glu Glu Ala Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu 370 375380

Ala Ala Gin Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gin Asp 385 390 395400

Leu Asp Ala Ile Trp Ala Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu 405 410415

Ala Tyr Gly Tyr Ala Gin Asp Gin Glu Pro Asp Ala Ala Gly Arg Ile

420 425430

Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro 435 440445

Gly Phe Tyr Ala Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly 450 455460

Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala 465 470 475480

Ile Thr Gly Pro Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly

485 490495

Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val ile Pro Ser Ala ile Pro Thr 500 505510

PL 233 352 Β1

Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp 515 520525

Ser Glu Gin Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gin Pro Gly 530 535540

Lys Pro Pro Lys Asp Glu Leu

545550 <210> 4 <211> 551 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> białko fuzyjne <400> 4

Ala Ala Ile Gly Ser Cys Ser Lys Glu Tyr Arg Val Leu Leu Gly Gin 15 1015

Leu Gin Lys Ala Thr Asp Leu Met Gin Asp Thr Ser Arg Leu Leu Asp 20 2530

Pro Tyr Ile Arg He Gin Gly Leu Asp Val Pro Lys Leu Arg Glu His 35 4045

Cys Arg Glu Arg Pro Gly Ala Phe Pro Ser Glu Glu Thr Leu Arg Gly 50 5560

Leu Gly Arg Arg Gly Phe Leu Gin Thr Leu Asn Ala Thr Leu Gly Cys 65 70 7580

Val Leu His Arg Leu Ala Asp Leu Glu Gin Arg Leu Pro Lys Ala Gin

9095

PL 233 352 Β1

Asp Leu Glu Arg Ser Gly Leu Asn Ile Glu Asp Leu Glu Lys Leu Gin

100 105110

Met Ala Arg Pro Asn Ile Leu Gly Leu Arg Asn Asn Ile Tyr Cys Met 115 120125

Ala Gin Leu Leu Asp Asn Ser Asp Thr Ala Glu Pro Thr Lys Ala Gly 130 135140

Arg Gly Ala Ser Gin Pro Pro Thr Pro Thr Pro Ala Ser Asp Ala Phe

145 150 155160

Gin Arg Ala Leu Glu Gly Cys Arg Phe Leu His Gly Tyr His Arg Phe

165 170175

Met His Ser Val Gly Arg Val Phe Ser Lys Trp Gly Glu Ser Pro Asn

180 185190

Arg Ser Arg Arg Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Gly Gly Pro Glu Gly 195 200205

Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gin Ala Cys His Leu Pro Leu 210 215220

Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gin Pro Arg Gly Trp Glu Gin Leu Glu 225 230 235240

Gin Cys Gly Tyr Pro Val Gin Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala Ala

245 250255

Arg Leu Ser Trp Asn Gin Val Asp Gin Val Ile Ala Asn Ala Leu Ala 260 265270

PL 233 352 Β1

Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Ser Pro 275 280285

Glu Gin Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg 290 295300

Phe Val Arg Gin Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn Gly

305 310 315320

Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr Gly

325 330335

Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly 340 345350

Thr Gin Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gin Ala His Arg Gin Leu

355 360365

Glu Glu Ala Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu 370 375380

Ala Ala Gin Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gin Asp 385 390 395400

Leu Asp Ala Ile Trp Ala Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu 405 410415

Ala Tyr Gly Tyr Ala Gin Asp Gin Glu Pro Asp Ala Ala Gly Arg Ile

420 425430

Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro 435 440445

PL 233 352 Β1

Gly Phe Tyr Ala Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly 450 455460

Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala 465 470 475480

Ile Thr Gly Pro Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly

485 490495

Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr 500 505510

Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp

515 520525

Ser Glu Gin Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gin Pro Gly 530 535540

Lys Pro Pro Lys Asp Glu Leu

545550 <210> 5 <211> 543 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> białko fuzyjne <400> 5

Ala Ala Ile Gly Ser Cys Ser Lys Glu Tyr Arg Val Leu Leu Gly Gin 15 10 15

Leu Gin Lys Gin Thr Asp Leu Met Gin Asp Thr Ser Arg Leu Leu Asp

25 30

PL 233 352 Β1

Pro Tyr Ile Arg Ile Gin Gly Leu Asp \/aI Pro Lys Leu Arg Glu His 35 4045

Cys Arg Glu Arg Pro Gly Ala Phe Pro Ser Glu Glu Thr Leu Arg Gly 50 5560

Leu Gly Arg Arg Gly Phe Leu Gin Thr Leu Asn Ala Thr Leu Gly Cys 65 70 7580

Val Leu His Arg Leu Ala Asp Leu Glu Gin Arg Leu Gly Gly Gly Asn

9095

Ile Glu Asp Leu Glu Lys Leu Gin Met Ala Arg Pro Asn Ile Leu Gly

100 105110

Leu Arg Asn Asn Ile Tyr Cys Met Ala Gin Leu Leu Asp Asn Ser Asp

115 120125

Thr Ala Glu Pro Thr Lys Ala Gly Arg Gly Ala Ser Gin Pro Pro Thr

130 135140

Pro Thr Pro Ala Ser Asp Ala Phe Gin Arg Lys Leu Glu Gly Cys Arg 145 150 155160

Phe Leu His Gly Tyr His Arg Phe Met His Ser Val Gly Arg Val Phe

165 170175

Ser Lys Trp Gly Glu Ser Pro Asn Arg Ser Arg Arg Gly Gly Gly Gly 180 185190

Ser Ala Ser Gly Gly Pro Glu Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala 195 200205

PL 233 352 Β1

His Gin Ala Cys His Leu Pro Leu Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gin

210 215220

Pro Arg Gly Trp Glu Gin Leu Glu Gin Cys Gly Tyr Pro Val Gin Arg 225 230 235240

Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gin Val Asp

245 250255

Gin Val Ile Ala Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu

260 265270

Gly Glu Ala Ile Arg Glu Ser Pro Glu Gin Ala Arg Leu Ala Leu Thr 275 280285

Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg Gin Gly Thr Gly Asn 290 295300

Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu 305 310 315320

Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly

325 330335

Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gin Asn Trp Thr Val Glu Arg

340 345350

Leu Leu Gin Ala His Arg Gin Leu Glu Glu Ala Gly Tyr Val Phe Val 355 360365

Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gin Ser Ile Val Phe Gly

370 375380

Gly Val Arg Ala Arg Ser Gin Asp Leu Asp Ala Ile Trp Ala Gly Phe

385 390 395400

PL 233 352 Β1

Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gin Asp Gin

405 410415

Glu Pro Asp Ala Ala Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg VaI

420 425430

Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Ala Thr Ser Leu Thr 435 440445

Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His 450 455460

Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Ser Gly 465 470 475480

Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val

485 490495

Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp 500 505510

Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Ser Glu Gin Ala Ile Ser Ala Leu

515 520525

Pro Asp Tyr Ala Ser Gin Pro Gly Lys Pro Pro Lys Asp Glu Leu

530 535540 <210> 6 <211> 196 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6

PL 233 352 Β1

Ala Ala Ile Gly Ser Cys Ser Lys Glu Tyr Arg Val Leu Leu Gly Gin 15 1015

Leu Gin Lys Gin Thr Asp Leu Met Gin Asp Thr Ser Arg Leu Leu Asp 20 2530

Pro Tyr Ile Arg Ile Gin Gly Leu Asp Val Pro Lys Leu Arg Glu His 35 4045

Cys Arg Glu Arg Pro Gly Ala Phe Pro Ser Glu Glu Thr Leu Arg Gly 50 5560

Leu Gly Arg Arg Gly Phe Leu Gin Thr Leu Asn Ala Thr Leu Gly Cys 65 70 7580

Val Leu His Arg Leu Ala Asp Leu Glu Gin Arg Leu Pro Lys Ala Gin

9095

Asp Leu Glu Arg Ser Gly Leu Asn Ile Glu Asp Leu Glu Lys Leu Gin 100 105110

Met Ala Arg Pro Asn Ile Leu Gly Leu Arg Asn Asn Ile Tyr Cys Met 115 120125

Ala Gin Leu Leu Asp Asn Ser Asp Thr Ala Glu Pro Thr Lys Ala Gly 130 135140

Arg Gly Ala Ser Gin Pro Pro Thr Pro Thr Pro Ala Ser Asp Ala Phe

145 150 155160

Gin Arg Lys Leu Glu Gly Cys Arg Phe Leu His Gly Tyr His Arg Phe

165 170175

PL 233 352 Β1

Met His Ser Val Gly Arg Val Phe Ser Lys Trp Gly Glu Ser Pro Asn

180 185 190

Arg Ser Arg Arg

195 <210> 7 <211> 196 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7

Ala Ala Ile Gly Ser Cys Ser Lys Glu Tyr Arg Val Leu Leu Gly Gin 15 1015

Leu Gin Lys Ala Thr Asp Leu Met Gin Asp Thr Ser Arg Leu Leu Asp 20 2530

Pro Tyr Ile Arg Ile Gin Gly Leu Asp Val Pro Lys Leu Arg Glu His 35 4045

Cys Arg Glu Arg Pro Gly Ala Phe Pro Ser Glu Glu Thr Leu Arg Gly 50 5560

Leu Gly Arg Arg Gly Phe Leu Gin Thr Leu Asn Ala Thr Leu Gly Cys 65 70 7580

Val Leu His Arg Leu Ala Asp Leu Glu Gin Arg Leu Pro Lys Ala Gin

9095

Asp Leu Glu Arg Ser Gly Leu Asn Ile Glu Asp Leu Glu Lys Leu Gin 100 105110

Met Ala Arg Pro Asn Ile Leu Gly Leu Arg Asn Asn Ile Tyr Cys Met

115 120 125

PL 233 352 Β1

Ala Gin Leu Leu Asp Asn Ser Asp Thr Ala Glu Pro Thr Lys Ala Gly 130 135140

Arg Gly Ala Ser Gin Pro Pro Thr Pro Thr Pro Ala Ser Asp Ala Phe 145 150 155160

Gin Arg Lys Leu Glu Gly Cys Arg Phe Leu His Gly Tyr His Arg Phe

165 170175

Met His Ser Val Gly Arg Val Phe Ser Lys Trp Gly Glu Ser Pro Asn

180 185190

Arg Ser Arg Arg

195 <210> 8 <211> 196 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8

Ala Ala Ile Gly Ser Cys Ser Lys Glu Tyr Arg Val Leu Leu Gly Gin 15 1015

Leu Gin Lys Gin Thr Asp Leu Met Gin Asp Thr Ser Arg Leu Leu Asp 20 2530

Pro Tyr Ile Arg Ile Gin Gly Leu Asp Val Pro Lys Leu Arg Glu His 35 4045

Cys Arg Glu Arg Pro Gly Ala Phe Pro Ser Glu Glu Thr Leu Arg Gly 50 5560

PL 233 352 Β1

Leu Gly Arg Arg Gly Phe Leu Gin Thr Leu Asn Ala Thr Leu Gly Cys 65 70 7580

VaI Leu His Arg Leu Ala Asp Leu Glu Gin Arg Leu Pro Lys Ala Gin

9095

Asp Leu Glu Arg Ser Gly Leu Asn Ile Glu Asp Leu Glu Lys Leu Gin 100 105110

Met Ala Arg Pro Asn Ile Leu Gly Leu Arg Asn Asn He Tyr Cys Met 115 120125

Ala Gin Leu Leu Asp Asn Ser Asp Thr Ala Glu Pro Thr Lys Ala Gly 130 135140

Arg Gly Ala Ser Gin Pro Pro Thr Pro Thr Pro Ala Ser Asp Ala Phe

145 150 155160

Gin Arg Ala Leu Glu Gly Cys Arg Phe Leu His Gly Tyr His Arg Phe

165 170175

Met His Ser Val Gly Arg Val Phe Ser Lys Trp Gly Glu Ser Pro Asn 180 185190

Arg Ser Arg Arg

195 <210> 9 <211> 196 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9

Ala Ala Ile Gly Ser Cys Ser Lys Glu Tyr Arg Val Leu Leu Gly Gin

10 15

PL 233 352 Β1

Leu Gin Lys Ala Thr Asp Leu Met Gin Asp Thr Ser Arg Leu Leu Asp

2530

Pro Tyr Ile Arg Ile Gin Gly Leu Asp Val Pro Lys Leu Arg Glu His 35 4045

Cys Arg Glu Arg Pro Gly Ala Phe Pro Ser Glu Glu Thr Leu Arg Gly 50 5560

Leu Gly Arg Arg Gly Phe Leu Gin Thr Leu Asn Ala Thr Leu Gly Cys 65 70 7580

Val Leu His Arg Leu Ala Asp Leu Glu Gin Arg Leu Pro Lys Ala Gin

9095

Asp Leu Glu Arg Ser Gly Leu Asn Ile Glu Asp Leu Glu Lys Leu Gin

100 105110

Met Ala Arg Pro Asn Ile Leu Gly Leu Arg Asn Asn ile Tyr Cys Met 115 120125

Ala Gin Leu Leu Asp Asn Ser Asp Thr Ala Glu Pro Thr Lys Ala Gly 130 135140

Arg Gly Ala Ser Gin Pro Pro Thr Pro Thr Pro Ala Ser Asp Ala Phe

145 150 155160

Gin Arg Ala Leu Glu Gly Cys Arg Phe Leu His Gly Tyr His Arg Phe

165 170175

Met His Ser Val Gly Arg Val Phe Ser Lys Trp Gly Glu Ser Pro Asn 180 185190

PL 233 352 Β1

Arg Ser Arg Arg

195 <210> 10 <211> 188 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10

Ala Ala He Gly Ser Cys Ser Lys Glu Tyr Arg Val Leu Leu Gly Gin

1015

Leu Gin Lys Gin Thr Asp Leu Met Gin Asp Thr Ser Arg Leu Leu Asp 20 2530

Pro Tyr Ile Arg Ile Gin Gly Leu Asp Val Pro Lys Leu Arg Glu His 35 4045

Cys Arg Glu Arg Pro Gly Ala Phe Pro Ser Glu Glu Thr Leu Arg Gly 50 5560

Leu Gly Arg Arg Gly Phe Leu Gin Thr Leu Asn Ala Thr Leu Gly Cys 65 70 7580

Val Leu His Arg Leu Ala Asp Leu Glu Gin Arg Leu Gly Gly Gly Asn

9095

Ile Glu Asp Leu Glu Lys Leu Gin Met Ala Arg Pro Asn Ile Leu Gly

100 105110

Leu Arg Asn Asn Ile Tyr Cys Met Ala Gin Leu Leu Asp Asn Ser Asp

115 120125

Thr Ala Glu Pro Thr Lys Ala Gly Arg Gly Ala Ser Gin Pro Pro Thr

130 135 140

PL 233 352 Β1

Pro Thr Pro Ala Ser Asp Ala Phe Gin Arg Lys Leu Glu Gly Cys Arg

145 150 155160

Phe Leu His Gly Tyr His Arg Phe Met His SerVal Gly Arg Val Phe

165 170175

Ser Lys Trp Gly Glu Ser Pro Asn Arg Ser Arg Arg

180185 <210> 11 <211> 342 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 11

Pro Glu Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gin Ala Cys His 15 1015

Leu Pro Leu Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gin Pro Arg Gly Trp Glu 20 2530

Gin Leu Glu Gin Cys Gly Tyr Pro Val Gin Arg Leu Val Ala Leu Tyr 35 4045

Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gin Val Asp Gin Val Ile Ala Asn 50 5560

Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg 65 70 7580

Glu Ser Pro Glu Gin Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu

9095

PL 233 352 Β1

Ser Glu Arg Phe Val Arg Gin Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala 100 105110

Ala Asn Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr 115 120125

Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser 130 135140

Thr Arg Gly Thr Gin Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gin Ala His

145 150 155160

Arg Gin Leu Glu Glu Ala Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr

165 170175

Phe Leu Glu Ala Ala Gin Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg

180 185190

Ser Gin Asp Leu Asp Ala Ile Trp Ala Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp 195 200205

Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gin Asp Gin Glu Pro Asp Ala Ala 210 215220

Gly Arg tle Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser 225 230 235240

Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Ala Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu

245 250255

Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg

260 265270

PL 233 352 Β1

Leu Asp Ala ile Thr Gly Pro Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Glu Thr 275 280285

Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala

290 295300

Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser 305 310 315320

Ile Pro Asp Ser Glu Gin Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser

325 330335

Gin Pro Gly Lys Pro Pro

340 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> linker steryczny <400> 12

Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Gly Gly

5 <210> 13 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> motyw kierujący do retikulum <400> 13

Lys Asp Glu Leu

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Białko fuzyjne, zawierające:

domenę (a), którą jest fragment sekwencji aminokwasowej onkostatyny M lub mutanta onkostatyny M wybrany z grupy składającej się z Sekw. Nr 6, Sekw. Nr 7, Sekw. Nr 8, Sekw. Nr 9 i Sekw. Nr 10, oraz domenę (b) którą jest sekwencja egzotoksyny A Pseudomonas o Sekw. Nr 11.

2. Białko fuzyjne według zastrz. 1, przy czym domenę (a) stanowi Sekw. Nr 6.

3. Białko fuzyjne według zastrz. 1, przy czym domena (a) jest wybrana spośród Sekw. Nr 7, Sekw. Nr 8 i Sekw. Nr 9.

4. Białko fuzyjne według zastrz. 3, przy czym domena (a) jest wybrana spośród Sekw. Nr 7 i Sekw. Nr 8.

5. Białko fuzyjne według zastrz. 3, przy czym domenę (a) stanowi Sekw. Nr 9.

6. Białko fuzyjne według zastrz. 1, przy czym domenę (a) stanowi Sekw. Nr 10.

7. Białko fuzyjne według zastrz. 1 o sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy składającej się z Sekw. Nr 1, Sekw. Nr 2, Sekw. Nr 3, Sekw. Nr 4 i Sekw. Nr 5.

8. Mutant onkotoksyny M o sekwencji aminokwasowej Sekw. Nr 9.