JP5430090B2 - 抗体断片のスクリーニング方法及びアッセイシステム - Google Patents
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Description
項1. 抗体断片を酵母表層に提示し、該酵母に標識抗原を作用させ、標識抗原が抗体断片に結合した複合体を検出し、標識検出装置により検出された抗体断片表層提示酵母を前記検出装置と連動したマニピュレータにより自動的に回収し、回収された酵母から前記標識抗原に結合した抗体断片の配列を決定することを特徴とする、標的抗原に結合する抗体断片のスクリーニング方法。
項2. 抗体断片がscFv、Fab、F(ab)2またはFvである、項1に記載の抗体断片のスクリーニング方法。
項3. 抗体断片をAga2に融合し、表層提示したことを特徴とする項1または2に記載の抗体断片のスクリーニング方法。
項4. 抗体断片を酵母表層に提示し、該酵母に標識抗原を作用させて標識抗原が抗体断片に結合した複合体を検出し、標識検出装置により検出された抗体断片表層提示酵母を前記検出装置と連動したマニピュレータにより自動的に回収し、回収された酵母から前記標識抗原に結合した抗体断片の配列を決定することを特徴とする、標的抗原に結合する抗体断片のアッセイシステム。
項5. 抗体断片がscFv、Fab、F(ab)2またはFvである、項4に記載の抗体断片のアッセイシステム。
項6. 抗体断片をAga2に融合し、表層提示したことを特徴とする項4または5に記載の抗体断片のアッセイシステム。
スライドグラスサイズ(25mm×75mmまたは1インチ×3インチ)のチャンバー表面に、細胞のサイズに合わせたウェルサイズで、数十〜数百のウェルが形成されている。細胞懸濁液をマイクロピペットでアプライすることで、各ウェルに細胞が1個(条件によっては、2個、あるいは3個ないし数個)入るように設計されている(図B)。超音波や遠心法を用いることで、各ウェルに導入される酵母の個数の精度をさらに高めることが可能である
蛍光顕微鏡をベースとした検出機構が、チップ表面の自動フォーカス後、マイクロチャンバー(ウェルに入っている酵母細胞)の蛍光画像を取得する(図C)。酵母は光学的に検出することができるので、容易に検出できる。
各ウェル座標の蛍光値を解析し、解析結果をヒストグラム(縦軸:細胞数、横軸:蛍光値)として表示する。
所望の蛍光値を持つ酵母を、解析部のヒストグラムから範囲指定すると、自動的にマニピュレーターによって吸引され、マイクロプレートへ吐出・回収される。酵母の吸引・吐出にはキャピラリが好ましく使用され、酵母をマニピュレータ内に残さないように吐出できることが実験により確認されている。
実施例1
1.Aga2のN末端側にscFvを融合する酵母表層提示用ベクターpYD12の作成
a型酵母とα型酵母の接合に必要なagglutinin receptorはGPI anchorを介して膜に結合し、酵母表層に提示されていることから、この系を用いた酵母表層提示方法が多く報告されている。膜結合型のAga1 subtype(725アミノ酸)とジスルフィド結合を形成するAga2 subtype(69 aa)に目的遺伝子を融合するa-agglutinin system(図1)はref.1(Feldhaus MJ, Siegel RW, Opresko LK, Coleman JR, Feldhaus JM, Yeung YA, Cochran JR, Heinzelman P, Colby D, Swers J, Graff C, Wiley HS, Wittrup KD. (2003) Nat. Biotechno. 21, 163.)に報告されており、表層提示用ベクターpYD1がInvitrogenより発売されている。しかし、このベクターではAga2のC末端側に外来蛋白質を融合するため、外来蛋白質は立体構造的な制約を受けることが予想され(ref.2)、実際に、これを用いて、マウスハイブリドーマ由来の配列をscFvとして、酵母表層に提示させようとするとほとんど提示されなかった。scFvをAga2のN末端側に融合し、その構造的制約をはずすことによって、提示効率をあげることができたので、scFvをAga2のN末端側に融合できるplasmid pYD12をpYD1より作成した。
Nhe-HA-Nco-Not-FLAG-Mlu-U(配列番号1)
5’-
CT AGC TAC CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC GCT TCC ATG GGT GGT GAG CTC GCG GCC GCA GAT TAC AAG GAT GAC GAC GAT AAG AAG CTT A-3’
Nhe-HA-Nco-Not-FLAG-Mlu-L(配列番号2)
5’-CG CGT AAG CTT CTT ATC GTC GTC ATC CTT GTA ATC TGC GGC CGC GAG CTC ACC ACC CAT GGA AGC GTA ATC TGG AAC ATC GTA TGG GTA G
-3’
Tomlinson I and J libraryとしてMRC HGMP Resource Centerから配布されているhuman combinatorial antibody phage display librariesよりPlant (+)RNA virusのRNA-dependent RNA polymeraseに結合するscFvとして単離、報告されている配列(AJ634527)(ref.3)をもとに、ref.4に従って、de novo合成を行った。2本鎖DNAは各々が40-50塩基overlapする形で、以下の17本のオリグヌクレオチドに分割して合成し、アクリルアミドゲル電気泳動で精製した後、T4 polynucleotide kinaseにより5’リン酸化し、アニーリングの後、T4 DNAリガーゼで結合した。さらに、以下に示す、cNCO-U、 cNOT-L プライマーによるPCRでscFv コーディング領域を増幅し、NcoI、NotIで切断した断片をpYD12のNcoI, NotI部位にクローニングし、pYD12-repとした。
5’-ATGGCCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGGTTCACCTTTAGCAGCT-3’
U2(101-190) (配列番号8)
6’-ATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAATGCTACTGGTTATACTACAAGTTACGCAG-3’
U3(191-280) (配列番号9)
5’-ACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGG-3’
U4(281-370) (配列番号10)
5’-CCGTATATTACTGTGCGAAATATGATTCTAGTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGGTGGAGGCGGTTCAG-3’
U5(371-460) (配列番号11)
5’-GCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCA-3’
U6(461-550) (配列番号12)
5’-CCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATG-3’
U7(551-640) (配列番号13)
5’-GTGCATCCTATATGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTT-3’
U8(641-735) (配列番号14)
5’-GCAACTTACTACTGTCAACAGACTGCTGATGCTCCTAATACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGGCGGCCGCA-3’
L1(59-1) (配列番号15)
5’-AGGGACCCCCCAGGCTGTACCAAGCCTCCCCCAGACTCCAACAGCTGCACCTCGGCCAT-3’
L2(153-60) (配列番号16)
5’-TGAGACCCACTCCAGCCCCTTCCCTGGAGCCTGGCGGACCCAGCTCATGGCATAGCTGCTAAAGGTGAACCCAGAGGCTGCACAGGAGAGTCTC-3’
L3(240-154) (配列番号17)
5’-CGTGTTCTTGGAATTGTCTCTGGAGATGGTGAACCGGCCCTTCACGGAGTCTGCGTAACTTGTAGTATAACCAGTAGCATTAATACC-3’
L4(330-241) (配列番号18)
5’-CTGGCCCCAGTAGTCAAAACTAGAATCATATTTCGCACAGTAATATACGGCCGTGTCCTCGGCTCTCAGGCTGTTCATTTGCAGATACAG-3’
L5(420-331) (配列番号19)
5’-CTGGGTCATCTGGATGTCCGTCGACCCGCCACCGCCGCTGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCGCTCGAGACGGTGACCAGGGTTCC-3’
L6(510-421) (配列番号20)
5’-ATACCAATTTAAATAGCTGCTAATGCTCTGACTTGCCCGGCAAGTGATGGTGACTCTGTCTCCTACAGATGCAGACAGGGAGGATGGAGA-3’
L7(600-511) (配列番号21)
5’-TCCACTGCCACTGAACCTTGATGGGACCCCACTTTGCATATAGGATGCACCATAGATCAGGAGCTTAGGGGCTTTCCCTGGTTTCTGCTG-3’
L8(689-601) (配列番号22)
5’-ATTAGGAGCATCAGCAGTCTGTTGACAGTAGTAAGTTGCAAATCTTCAGGTTGCAGACTGCTGATGGTGAGAGTGAAATCTGTCCCAGA-3’
L9(735-690) (配列番号23)
5’-TGCGGCCGCCCGTTTGATTTCCACCTTGGTCCCTTGGCCGAACGT-3’
5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’
scFv-U1(配列番号27)
5’-AATTAAGATGCAGTTACTTCGCTG-3’
scFv-L2(配列番号28)
5’-GCATATAGTTGTCAGTTCCTGGC-3’
pYD1-1115L(配列番号29)
5’-GTCGATTTTGTTACATCTACAC-3’
CDRH2-Dir-L(配列番号30)
5’-CCTTCACGGAGTCTGCGTAABHTGTABHABHACCABHABHABHAATABHTGAGACCCACTCCAGCCCC-3’
CDRH2-U(配列番号31)
5’-ATACGCAGACTCCGTGAAGG-3’
CDRH3-Dir-L(配列番号32)
5’-CCTGGCCCCAGTAGTCAAAABHABHABHABHTTTCGCACAGTAATATACG-3’
CDRH3-U(配列番号33)
5’-TTTGACTACTGGGGCCAGG-3’
CDRL2-Dir-L(配列番号34)
5’-ATGGGACCCCACTTTGCATABHGGATGCABHATAGATCAGGAGCTTAGGG-3’
CDRL2-U(配列番号35)
5’-ATGCAAAGTGGGGTCCCAT-3’
CDRL3-Dir-L(配列番号36)
5’-TGGTCCCTTGGCCGAACGTABHAGGABHABHABHABHCTGTTGACAGTAGTAAGTT-3’
CDRL3-U(配列番号37)
5’- ACGTTCGGCCAAGGGACCA-3’
pYD12 10μgをNcoI, NotI 各60Uで37℃5時間切断後、1% Seakem GTG agarose電気泳動で分離、QIAquik Gel Extraction kitで精製し、8.9 μgを得た。 insert scFvはscFv-U1、 scFv-L2を用い、ExTaq PCRで20 cylces増幅後、同様にNcoI, NotI切断、agarose電気泳動で精製し、4.6 μgを得た。これらを、総360 μl(ligation high 120μl)で16℃16時間ligase反応を行い、QIAGEN PCR purification kitで精製した。ligase反応の一部をchemical competent DH5α細胞に形質転換し、1μg DNAあたり4.6 x 104の形質転換効率を得た。ref.5に従って調製したelectro competent XLI-Blue cellを用い、6回のelectroporationを行って、2.3 x 107 clonesのlibraryを作成した。 直径15 cm のLB plate 36枚上でcolony を形成させた後、400 mlのterrific broth中で37℃2時間培養、QIAGEN Maxi prepで3.6mg (1.1 x 10 12 clones) のDNAを取得した。 insert含有率はelectroporation後が100% (図5 insert check A)、plate上でamplifyした後が80%であった (図5 insert check B)。
Libraryのglycerol stockをSDCAA medium (ref.7)で30℃数時間から一晩培養し、OD600 = 0.5となるように、SG/RCAA mediumに希釈し、20℃で48時間発現誘導した。0.8 OD600相当の酵母細胞を100 μl super blocking buffer中100nM biotinylated ubiquitinと室温で1時間、さらに氷中で10分間結合させたのち、PBS 800μlで洗浄し、1/200量のPE-streptavidin (Molecular Probes S866)を含む100 μl super blocking buffer中氷中で30分間反応させ、PBS 800μlで2回洗浄した。
単離した結合性クローンは、抗原結合能力の強いものから弱いものまで、多岐にわたり、得られているクローンの全アミノ酸配列を図8に示した。3クローンが同一である以外は全て配列が異なっていて、Tomlinson I libraryからantibody array screeningによってユビキチンに結合するものとして報告されている配列(ref.8)とはいずれも一致していなかった。この中で、R22-A19-2が最も抗原親和性が高く、ref.9に従って、FACS測定により求めたKD値は149.5 nMであった(図9)。
1., Fedhaus MJ, Siegel RW, Opresko LK, Coleman JR, Feldhaus JM, Yeung YA, Cochran JR, Heinzelman P, Colby D, Swers J, Graff C, Wiley HS, Wittrup KD. (2003) Nat. Biotechno. 21, 163.
2. Wang Z, Mathias A, Stavrou S, Neville DM Jr. (2005) Protein Eng Des Sel. 18, 337.
3. Fomitcheva VW, Schubert J, Saalbach I, Habekuss A, Kumlehn J, Conrad,U (2005)
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4. Tanaka T, Chung GT, Forster A, Lobato MN, Rabbitts TH. (2003)
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9, Feldhaus M, Siegel R.(2004) Methods Mol Biol. 263, 311.
Claims (4)
- 抗体断片を酵母表層に提示し、該酵母に標識抗原を作用させ、標識抗原が抗体断片に結合した複合体を検出し、標識検出装置により検出された抗体断片表層提示酵母を前記検出装置と連動したマニピュレータにより自動的に回収し、回収された酵母から前記標識抗原に結合した抗体断片の配列を決定することを特徴とし、且つ該抗体断片をAga2のN末端側に融合し、表層提示したことを特徴とする、標的抗原に結合する抗体断片のスクリーニング方法。
- 抗体断片がscFv、Fab、F(ab)2またはFvである、請求項1に記載の抗体断片のスクリーニング方法。
- 抗体断片を酵母表層に提示し、該酵母に標識抗原を作用させて標識抗原が抗体断片に結合した複合体を検出し、標識検出装置により検出された抗体断片表層提示酵母を前記検出装置と連動したマニピュレータにより自動的に回収し、回収された酵母から前記標識抗原に結合した抗体断片の配列を決定することを特徴とし、且つ該抗体断片をAga2のN末端側に融合し、表層提示したことを特徴とする、標的抗原に結合する抗体断片のアッセイシステム。
- 抗体断片がscFv、Fab、F(ab)2またはFvである、請求項3に記載の抗体断片のアッセイシステム。
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