MX2013006109A - Molecula de union a antigeno capaz de unir repetidamente a la pluralidad de moleculas de antigeno. - Google Patents

Molecula de union a antigeno capaz de unir repetidamente a la pluralidad de moleculas de antigeno.

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Shinya Ishii
Atsuhiko Maeda
Miho Funaki
Naoka Hironiwa
Junichi Nezu
Yoshinao Ruike
Takeshi Baba
Shun Shimizu
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Abstract

La presente invención aborda el problema de proporcionar lo siguiente: un método para promover la absorción de un antígeno en una célula mediante una molécula de unión a antígeno; un método para aumentar la frecuencia de unión a un antígeno en una molécula de unión a antígeno; un método para promover una reducción de la concentración de antígeno en plasma mediante la administración de una molécula de unión a antígeno; un método para mejorar la retención de una molécula de unión a antígeno en el plasma; una molécula de unión a antígeno que promueve la absorción de un antígeno en una célula; una molécula de unión a antígeno de tal manera que se aumente la frecuencia con la cual la molécula une a un antígeno; una molécula de unión a antígeno capaz de promover, mediante su administración, una reducción de la concentración del antígeno en el plasma; una molécula de unión a antígeno que tiene una retención mejorada en el plasma; las composiciones farmacéuticas que comprenden tales moléculas de unión a antígeno; y los métodos para producir lo anterior. Los inventores descubrieron que el problema se puede solucionar al usar una molécula de unión a antígeno que tiene una reacción de antígeno-anticuerpo dependiente del calcio.

Description

MOLÉCULA DE UNIÓN A ANTÍGENO CAPAZ DE UNIR REPETIDAMENTE A LA PLURALIDAD DE MOLÉCULAS DE ANTÍGENO Antecedentes de la Invención Los anticuerpos están llamando la atención como productos farmacéuticos puesto que son altamente estables en plasma y tienen pocos efectos secundarios. Actualmente, un número de productos farmacéuticos del anticuerpo tipo IgG están comercialmente disponibles y muchos productos farmacéuticos de anticuerpo están actualmente en desarrollo (Documentos no relacionados con patente 1 y 2). Mientras tanto, varias tecnologías aplicables a productos farmacéuticos de anticuerpo de segunda generación se han reportado, incluyendo los que mejoran la función efectora, capacidad de unión al antígeno, farmacinéticos, y estabilidad, y los que reducen el riesgo de inmunogenicidad (Documento no relacionado con patente 3). En general, la dosis requerida de un farmacéutico de anticuerpo es muy alta. Esto, a su vez, ha llevado a problemas, tal como alto costo de producción, así como la dificultad en producir formulaciones subcutáneas. En teoría, la dosis de un anticuerpo farmacéutico puede reducirse mejorando los farmacinéticos de anticuerpo o mejorando la afinidad entre anticuerpos y antígenos.
La literatura ha reportado métodos para mejorar los farmacinéticos de anticuerpo usando la sustitución artificial de aminoácidos en regiones constantes (Documentos no relacionados con patente 4 y 5). Similarmente, la maduración de afinidad se ha reportado como una tecnología para mejorar la capacidad de unión al antígeno o actividad neutralizante del anttgeno (Documento no relacionado con patente 6). Esta tecnología permite mejorar la actividad de unión al antígeno mediante la introducción de mutaciones del aminoácido en la región CDR de una región variable o similar. La mejora de la capacidad de unión al antígeno permite la mejora de la actividad biológica ¡n vitro o reducción de dosificación, y además permite la mejora de la eficacia in vivo (Documento no relacionado con patente 7).
La capacidad neutralizante del antígeno de una sola molécula de anticuerpo depende de su afinidad. Incrementando la afinidad, un antígeno puede neutralizarse mediante una cantidad pequeña de un anticuerpo. Varios métodos pueden usarse para mejorar la afinidad del anticuerpo (Documento no relacionado con patente 6). Además, si la afinidad pude hacerse infinita uniendo covalentemente el anticuerpo al antígeno, una sola molécula del anticuerpo podrá neutralizar una molécula del antígeno (un anticuerpo bivalente puede neutralizar dos moléculas del antígeno). Sin embargo, la neutralización estequiométrica de un anticuerpo contra un antígeno (un anticuerpo bivalente contra dos antígenos) es el límite de métodos preexistentes, y así es imposible neutralizar totalmente el antígeno con la cantidad pequeña de anticuerpo que la cantidad de antígeno. Es decir, la afinidad que mejora el efecto tiene un límite (Documento no relacionado con patente 9). Para prolongar el efecto neutralizante de un anticuerpo neutralizante durante cierto período, el anticuerpo debe administrarse en una dosis mayor que la cantidad de antígeno producida en el cuerpo durante el mismo período. Con la mejora de los farmacinéticos de anticuerpo o tecnología de maduración de afinidad sola descrita anteriormente, hay así una limitación en la reducción de la dosis de anticuerpo requerida. Por consiguiente, para mantener el efecto neutralizante de antígeno del anticuerpo durante un período objetivo con una cantidad más pequeña del anticuerpo que la cantidad de antígeno, un solo anticuerpo debe neutralizar los antígenos múltiples.
Un anticuerpo que une a un antígeno de una manera dependiente de pH se ha reportado recientemente como un nuevo método para alcanzar el objetivo anterior (Documento de Patente 1). Los anticuerpos de unión al antígeno dependientes de pH, que unen fuertemente a un antígeno bajo condiciones neutrales en plasma y disocian del antígeno bajo condiciones ácidas en el endosoma, pueden disociarse del antígeno en el endosoma. Cuando un anticuerpo de unión al antígeno dependiente de pH se disocia del antígeno es reciclado al plasma mediante FcRn, puede unirse nuevamente a otro antígeno. Así, un solo anticuerpo de unión al antígeno dependiente de pH puede unirse a un número de antígenos repetidamente.
Además, la retención en plasma de un antígeno es muy corta con respecto a los anticuerpos reciclados a través de la unión al FcRn. Cuando un anticuerpo con tal retención en plasma larga uñe al antígeno, el tiempo de retención en plasma del complejo de antígeno-anticuerpo se prolonga al igual que el del anticuerpo. Así, la retención en plasma del antígeno es prolongada uniendo al anticuerpo, y así la concentración del antígeno en plasma se incrementa. En tales casos, incluso si se mejora la afinidad al antígeno del anticuerpo, la eliminación del antígeno del plasma no puede ser mejorada. Los anticuerpos descritos anteriormente con unión al antígeno dependiente de pH se han reportado como más efectivos que un método para mejorar la eliminación del antígeno en plasma en con respecto a los anticuerpos comunes (Documento de Patente 1).
Así, un solo anticuerpo de unión al antígeno dependiente de pH une a un número de antígenos y es capaz de facilitar la eliminación del antígeno desde el plasma con respecto a los anticuerpos comunes. Por consiguiente, los anticuerpos de unión al antígeno dependiente de pH tienen efectos no alcanzados por los anticuerpos comunes. Sin embargo, él único método conocido para lograr el efecto de la unión repetida de un anticuerpo con la unión al antígeno dependiente de pH al antígeno, y el efecto de promover la eliminación del antígeno del plasma, se confirió la dependencia de pH en la reacción antígeno-anticuerpo usando la diferencia de pH entre el plasma y endosoma.
Documentos de la Técnica Anterior Documentos de Patente [Documento de Patente 1] WO 2009/125825, MOLECULA DE UNION AL ANTIGEN CAPAZ DE UNIR A DOS O MAS MOLECULAS DE ANTIGENO REPETIDAMENTE.
[Documentos no relacionados con patente] [Documento no relacionado con patente 1] Monoclonal antibody successes in the clinic, Janice M Reichert, Clark J Rosensweig, Laura B Faden & Matthew C Dewitz, Nature Biotechnology 23, 1073 - 1078 (2005); [Documento no relacionado con patente 2] Pavlou AK, Belsey MJ., The therapeutic antibodies market to 2008., Eur J Pharm Biopharm. Abril 2005; 59(3): 389-96; [Documento no relacionado con patente 3] Kim SJ, Park Y, Hong HJ., Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies., Mol Cells. 31 de agosto de 2005; 20(1): 17-29. Review; [Documento no relacionado con patente 4] Hinton PR, Xiong JM, Johlfs MG, Tang MT, Keller S, Tsurushita N., An engineered human I g G 1 antibody with longer serum half-life., J Immunol. 1 de enero de 2006; 176(1): 346-56; [Documento no relacionado con patente 5] Ghetie V, Popov S, Borvak J, Radu C, Matesoi D, Medesan C, Ober RJ, Ward ES., Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis., Nat Biotechnol. Julio de 1997; 15(7): 637-40; [Documento no relacionado con patente 6] Proc Nati Acad Sci U S A. 14 de junio de 2005; 102(24): 8466-71. Epub6 de junio de 2005. A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using combinatorial libraries. Rajpal A, Beyaz N, Haber L, Cappuccilli G, Yee H, Bhatt RR, Takeuchi T, Lerner RA, Crea R; [Documento no relacionado con patente 7] Wu H, Pfarr DS, Johnson S, Brewah YA, Woods RM, Patel NK, White Wl, Young JF, Kiener PA. Development of Motavizumab, an Ultra-potent Antibody for the Prevention of Respiratory Syncytial Virus Infection in the Upper and Lower Respiratory Tract. J Mol Biol. (2007) 368: 652-665; [Documento no relacionado con patente 8] Hanson CV, Nishiyama Y, Paul S. Catalytic antibodies and their applications. Curr Opin Biotechnol. 2005 Dec; 16(6): 631-6; [Documento no relacionado con patente 9] Rathanaswami P, Roalstad S, Roskos L, Su QJ, Lackie S, Babcook J. Demonstration of an in vivo generated sub-picomolar affinity fu 11 y human monoclonal antibody to interleukin-8. Biochem Biophys Res Commun. 9 de septiembre de 2005; 334(4): 1004-13.
Breve Descripción de la Invención Problemas que se Resolverán Mediante la Invención La presente invención se logró debido a las circunstancias anteriores. Un objetivo de la presente invención es proporcionar métodos para promover la absorción del antígeno en células usando moléculas de unión al antígeno, métodos para incrementar el número de veces de unión al antígeno mediante una sola molécula de unión al antígeno, métodos para promover la reducción de la concentración del antígeno en plasma administrando las moléculas de unión al antígeno, métodos para mejorar la retención en plasma de moléculas de unión al antígeno, moléculas de unión al antígeno que facilitan la absorción del antígeno en células, moléculas de unión al antígeno que tienen un número de veces incrementado de unión al antígeno, moléculas de unión al antígeno capaces de promover la reducción de la concentración del antígeno en plasma administrando, moléculas de unión al antígeno con retención en plasma mejorada, composiciones farmacéuticas que comprenden las moléculas de unión al antígeno, y métodos para producir los descritos antes.
Medios que Resolverán los Problemas Los presentes inventores condujeron estudios dedicados sobre los métodos para promover la absorción del antígeno en células a través de moléculas de unión al antígeno (moléculas, como polipéptidos, que tienen actividad de unión al antígeno), métodos para aumentar el número de veces de la unión al antígeno mediante la molécula de unión al antígeno, métodos para promover la reducción de la concentración del antígeno en plasma administrando moléculas de unión al antígeno, y métodos para mejorar la retención en plasma de una molécula de unión al antígeno. Como resultado, los presentes inventores se concentraron que las moléculas de unión al antígeno que tienen capacidad de unión al FcRn humano en el pH endosomal temprano y actividad de unión al FcRn humano mayor que la de la inmunoglobulina tipo IgG humano intacta en el pH del plasma podrá facilitar la absorción del antígeno en células. Como resultado, los presentes inventores se centraron en la diferencia en la concentración de calcio entre el plasma y el endosoma temprano y, a continuación, descubrieron que: la absorción del antígeno en las células mediante las moléculas de unión al antígeno podrá ser promovida usando de moléculas de unión al antígeno que tienen reactividad antígeno-anticuerpo en una forma dependiente de calcio; el número de veces la unión al antígeno mediante una molécula de unión al antígeno, se podrá aumentar mediante la unión al antígeno repetitiva de una molécula de unión al antígeno; la reducción de la concentración de antígeno en el plasma podrá ser promovida administrando las moléculas de unión al antígeno; y que la retención de plasma de la molécula de unión al antígeno podrá mejorarse.
Específicamente, la presente invención se relaciona con métodos para promover la absorción del antígeno en células usando moléculas de unión al antígeno que tienen reactividad antígeno-anticuerpo en una manera dependiente de calcio, métodos para aumentar el número de veces de la unión al antígeno mediante una molécula de unión al antígenos, métodos para promover la reducción de la concentración de antígeno en plasma al administrar moléculas de unión al antígeno, y métodos para mejorar la retención de plasma de moléculas de unión al antígeno, así como moléculas de unión al antígeno que permiten la absorción de antígenos mejorados en las células, moléculas de unión al antígeno con un mayor número de veces de unión al antígeno, moléculas de unión al antígeno que pueden promover la reducción de la concentración del antígeno en plasma cuando se administran, moléculas de unión al antígeno con retención de plasma mejorada, composiciones farmacéuticas que comprenden las moléculas de unión al antígeno anteriores, y métodos para producirlas. Más específicamente, la presente invención se refiere a lo siguiente: [1] una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión al antígeno y un dominio de unión al FcRn humano, cuya actividad de unión al antígeno es diferente bajo dos diferentes condiciones de concentración de calcio y es menor bajo una baja condición de concentración de calcio que bajo una alta condición de concentración de calcio, y que tiene actividad de unión al FcRn humano bajo una condición de pH neutral; [2] la molécula de unión al antígeno de [1], donde la baja concentración de calcio es una concentración de calcio ionizado de 0.1 a 30 µ?; [3] la molécula de unión al antígeno de [1], donde la alta concentración de calcio es una concentración de calcio ionizado de 100 µ? a 10 mM; [4] la molécula de unión al antígeno de [1] o [2], donde la baja concentración de calcio es una concentración intraendosomal de calcio ionizado; [5] la molécula de unión al antígeno de [1] o [3], donde la alta concentración de calcio es una concentración en plasma de calcio ionizado; [6] la molécula de unión al antígeno de cualquiera de [1] a [5], donde el dominio de unión a FcRn es una región Fe; [7] la molécula de unión al antígeno de cualquiera de [1] a [6], donde además la actividad de unión al antígeno es menor bajo una condición de pH ácido que bajo una condición de pH neutro; [8] la molécula de unión al antígeno de [7], donde al menos un aminoácido está sustituido por histidina, o al menos una histidina se inserta en la molécula de unión al antígeno; [9] la molécula de unión al antígeno de cualquiera de [1] a [8], que se une a un antígeno de membrana o antígeno soluble; [10] la molécula de unión al antígeno de cualquiera de [1] a [9], donde el antígeno es un antígeno seleccionado del grupo que consiste de IL-6R, IL-6, IgA, glipicano 3 humano, e IgE; [11] una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión al antígeno y un dominio de unión al FcRn humano, cuya actividad de unión al antígeno es diferente entre las dos condiciones de concentración de calcio diferentes y es menor bajo una baja condición de concentración de calcio que bajo una alta condición de concentración de calcio, y donde una cadena ligera o cadena pesada del dominio de unión al antígeno comprende una porción de unión a calcio derivada de un anticuerpo humano; [12] la molécula de unión al antígeno de [11], donde la porción de unión a calcio está comprendida en la cadena ligera CDR1, CDR2 y/o CDR3 del dominio de unión al antígeno; [13] la molécula de unión al antígeno de [12], donde la porción de unión a calcio está comprendida en las posiciones 30, 31 , y/o 32 de acuerdo con la numeración de Kabat en la cadena ligera CDR1 ; [14] la molécula de unión al antígeno de [12] o [13], donde el porción de unión a calcio está comprendida en la posición 50 de acuerdo con la numeración de Kabat de la cadena ligera CDR2; [15] la molécula de unión al antígeno de cualquiera de [12] a [14], donde la porción de unión a calcio está comprendida en la posición 92 de acuerdo con la numeración de Kabat de la cadena ligera CDR3; [16] la molécula de unión al antígeno de cualquiera de [12] a [15], que es ya sea IgA o glipicano 3 humano; [17] la molécula de unión al antígeno de [11], donde la porción de unión al calcio está comprendida en la cadena pesada CDR1, CDR2 y/o CDR3 del dominio de unión al antígeno; [18] la molécula de unión al antígeno de [16], donde la porción de unión al calcio está comprendida en las posiciones 95, 96, 100a, y/o 101 de acuerdo con la numeración de Kabat en la cadena pesada CDR3; [19] la molécula de unión al antígeno de [17] o [18], que es cualquiera de IL-6R o IL-6; [20] la molécula de unión al antígeno de cualquiera de [11] a [19], que comprende un dominio de unión al FcRn que tiene actividad de unión al FcRn en el intervalo de pH neutro; [21] la molécula de unión al antígeno de [20], donde el dominio de unión al FcRn humano es una región de Fe; [22] la molécula de unión al antígeno de cualquiera de [1] a [10], [20], o [21], donde uno o más aminoácidos en las posiciones 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 286, 289, 297, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434, y 436 (numeración de EU) en la secuencia de aminoácido de la región de Fe son diferentes de las de la región de Fe natural; [23] la molécula de unión a antígeno de [22], que comprende cualquiera o una combinación de: Met en la posición del aminoácido 237; He en la posición del aminoácido 248; Ala, Phe, Me, Met, Gln, Ser, Val, Trp, o Tyr en la posición del aminoácido 250; Phe, Trp, o Tyr en la posición del aminoácido 252; Thr en la posición del aminoácido 254; Glu en la posición del aminoácido 255; Asp, Glu, o Gln en la posición del aminoácido 256; Ala, Gly, He, Leu, Met, Asn, Ser, Thr, o Val en la posición del aminoácido 257; His en la posición del aminoácido 258; Ala en la posición del aminoácido 265; Ala o Glu en la posición del aminoácido 286; His en la posición del aminoácido 289; Ala en la posición del aminoácido 297; Ala en la posición del aminoácido 303; Ala en la posición del aminoácido 305; Ala, Asp, Phe, Gly, His, Me, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp, o Tyr en la posición del aminoácido 307; Ala, Phe, lie, Leu, Met, Pro, Gln, o Thr en la posición del aminoácido 308; Ala, Asp, Glu, Pro, o Arg en la posición del aminoácido 309; Ala, His, o lie en la posición del aminoácido 311; Ala o His en la posición del aminoácido 312; Lys o Arg en la posición del aminoácido 314; Ala, Asp, o His en la posición del aminoácido 315; Ala en la posición del aminoácido 317; Val en la posición del aminoácido 332; Leu en la posición del aminoácido 334; His en la posición del aminoácido 360; Ala en la posición del aminoácido 376; Ala en la posición del aminoácido 380; Ala en la posición del aminoácido 382; Ala en la posición del aminoácido 384; Asp o His en la posición del aminoácido 385; Pro en la posición del aminoácido 386; Glu en la posición del aminoácido 387; Ala o Ser en la posición del aminoácido 389; Ala en la posición del aminoácido 424; Ala, Asp, Phe, Gly, His, lie, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp, o Tyr en la posición del aminoácido 428; Lys en la posición del aminoácido 433; Ala, Phe, His, Ser, Trp, o Tyr en la posición del aminoácido 434; o His, Me, Leu, o Val en la posición del aminoácido 436; de acuerdo con la numeración de EU en la región de Fe; [24] la molécula de unión al antígeno de cualquiera de [1] a [23], donde la molécula de unión al antígeno es un anticuerpo: [24] la molécula de unión al antígeno de [1] a [23], que une a un antígeno de membrana o antígeno soluble; [25] un método para producir una molécula de unión al antígeno que tiene por lo menos una función seleccionada de: (i) función de promover la absorción de un antígeno en las células, (i¡) función de unir a un antígeno dos o más veces, (¡ii) función de promover la reducción de la concentración del antígeno en plasma, y (iv) función de excelencia en la retención de plasma, donde el método comprende las etapas (a) a (e) a continuación: (a) determinar la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio; (b) determinar la actividad de unión al antígeno de la molécula de unión al antígeno bajo una alta condición de concentración de calcio; (c) seleccionar una molécula de unión al antígeno que tiene una baja actividad de unión al antígeno bajo la baja condición de concentración de calcio que bajo la alta condición de concentración de calcio; (d) obtener un gen que codifica la molécula de unión al antígeno seleccionada en la etapa (c); y (e) producir la molécula de unión al antígeno usando el gen obtenido en la etapa (d); [26] un método para producir una molécula de unión al antígeno que tiene por lo menos una función seleccionada de: (i) función de promover la absorción de un antígeno en las células, (ii) función de unir a un antígeno dos o más veces, (iii) función de promover la reducción de la concentración del antígeno de plasma, y (iv) función de excelencia en la retención de plasma, donde el método comprende las etapas (a) a (e) a continuación: (a) poner en contacto un antígeno con una molécula de unión al antígeno o una biblioteca de moléculas de unión al antígeno bajo una alta condición de concentración de calcio; (b) colocar una molécula de unión al antígeno que une al antígeno en la etapa (a) bajo una baja condición de concentración de calcio; (c) obtener una molécula de unión al antígeno que disocia en la etapa (b); (d) obtener un gen que codifica la molécula de unión al antígeno obtenida en la etapa (c); y (e) producir la molécula de unión al antígeno usando el gen obtenido en la etapa (d); [27] un método para producir una molécula de unión al antígeno que tiene por lo menos una función seleccionada de: (i) función de promover la absorción de un antígeno en las células, (¡i) función de unir a un antígeno dos o más veces, (¡ii) función de promover la reducción de la concentración del antígeno de plasma, y (¡v) función de excelencia en la retención de plasma, donde el método comprende las etapas (a) a (f) a continuación: (a) poner en contacto un antígeno con una molécula de unión al antígeno o una biblioteca de moléculas de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio; (b) seleccionar una molécula de unión al antígeno que no une al antígeno en la etapa (a); (c) permitir que la molécula de unión al antígeno seleccionada en la etapa (b) para unir al antígeno bajo alta condición de concentración de calcio; (d) obtener una molécula de unión al antígeno que une al antígeno en la etapa (c); (e) obtener un gen que codifica la molécula de unión al antígeno obtenida en la etapa (d); y (f) producir la molécula de unión al antígeno usando el gen obtenido en la etapa (e); [28] el método de producción de cualquiera de [25] a [27], que adicionalmente comprende la etapa de conferir o de aumentar la actividad de unión al FcRn humano bajo una condición del pH neutral al modificar un aminoácido en la molécula de unión al antígeno; [29] el método de producción de cualquiera de [25] a [27], que adicionalmente comprende la etapa de reducir la actividad de unión al antígeno bajo una condición del pH ácido para ser bajo que el de bajo una condición del pH neutral al modificar un aminoácido en la molécula de unión al antígeno; [30] el método de producción de cualquiera de [25] a [27], donde la baja concentración de calcio es una concentración de calcio ionizado de 0.1 a 30 µ?; [31] el método de producción de cualesquiera de [25] a [27], donde la alta concentración de calcio es una concentración de calcio ionizado 100 de 10 µ a 10 mM; [32] el método de producción de cualquiera de [25] a [27], donde la baja concentración de calcio es una concentración intraendosomal de calcio ionizado; [33] el método de producción de cualquiera de [25] a [27], donde la alta concentración de calcio es una concentración en plasma de calcio ionizado; [34] el método de producción de [29], donde la modificación del aminoácido en la molécula de unión al antígeno es la modificación al sustituir por lo menos un aminoácido con histidina, o al insertar por lo menos de una histidina en la molécula de unión al antígeno; [35] el método de producción de cualquiera de [25] a [34], donde un antígeno unido por la molécula de unión al antígeno es un antígeno seleccionado del grupo que consiste de IL-6R, IL-6, IgA, glipicano 3 humano, e IgE; [36] el método de producción de cualquiera de [25] a [35], donde la molécula de unión al antígeno es un anticuerpo; [37] una composición farmacéutica que comprende: la molécula de unión al antígeno de cualquiera de [1] a [24] o una molécula de unión al antígeno producida por el método de producción de cualquiera de [25] a [36], y un portador farmacéuticamente aceptable; [38] la composición farmacéutica de [37] para el uso en promover la internalización del antígeno en las células; [39] la composición farmacéutica de [37] para el uso en promover la reducción de la concentración del antígeno en plasma; [40] una composición farmacéutica para el uso en promover la absorción del antígeno en las células o la reducción de la concentración del antígeno de plasma, que comprende una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión al antígeno y un dominio de unión al FcRn humano, cuya actividad de unión al antígeno es diferente entre dos diferentes concentraciones de calcio y baja bajo una baja condición de concentración de calcio que bajo una alta condición de concentración de calcio; [41] la composición farmacéutica de [40], donde la baja concentración de calcio es una concentración de calcio ionizado de 0.1 a 30 µ?; [42] la composición farmacéutica de [40], donde la alta concentración de calcio es una concentración de calcio ionizado de 100 µ? a 10 mM; [43] la composición farmacéutica de [40] o [41], donde la baja concentración de calcio es una concentración ¡ntraendosomal de calcio ionizado; [44] la composición farmacéutica de [40] o [42], donde la alta concentración de calcio es una concentración en plasma de calcio ionizado; [45] la composición farmacéutica de cualquiera de [40] a [44], donde el dominio de unión al FcRn comprendido en la molécula de unión al antígeno es una región de Fe; [46] la composición farmacéutica de cualquiera de [40] a [45], donde la actividad de unión al antígeno de la molécula de unión al antígeno es baja bajo una condición del pH ácido que bajo una condición del pH neutral; [47] la composición farmacéutica de la reivindicación 46, donde la modificación del aminoácido en la molécula de unión al antígeno es la modificación al sustituir por lo menos un aminoácido con histidina, o al insertar por lo menos de una histidina en la molécula de unión al antígeno; [48] la composición farmacéutica de cualquiera de [40] a [47], donde el antígeno al cual se une la molécula de unión al antígeno es un antígeno seleccionado del grupo que consiste de IL-6R, IL-6, IgA, glipicano 3 humano, e IgE; [49] un método de evaluación para una molécula de unión al antígeno que tiene por lo menos una función seleccionada de: (i) función de promover la absorción de un antígeno en las células, (¡i) función de unir a un antígeno dos o más veces, (¡ü) función de promover la reducción de la concentración del antígeno de plasma, y (¡v) función de excelencia en la retención de plasma, donde el método comprende las etapas (a) a (c) a continuación: (a) determinar la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio; (b) determinar la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno bajo una alta condición de concentración de calcio; y (c) seleccionar una molécula de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno es baja bajo una baja condición de concentración de calcio que bajo una alta condición de concentración de calcio; [50] un método de evaluación para una molécula de unión al antígeno que comprende por lo menos una función seleccionada de: (i) función de promover la absorción de un antígeno en las células, (ii) función de unir a un antígeno dos o más veces, (iii) función de promover la reducción de la concentración del antígeno de plasma, y (¡v) función de excelencia en la retención de plasma, donde el método comprende las etapas (a) a (c) a continuación: (a) poner en contacto un antígeno con una molécula de unión al antígeno o una biblioteca de moléculas de unión al antígeno bajo una alta condición de concentración de calcio; (b) colocar una molécula de unión al antígeno que une al antígeno en la etapa (a) bajo una baja condición de concentración de calcio; y (c) obtener una molécula de unión al antígeno que disocia en la etapa (b); [51] un método de evaluación para una molécula de unión al antígeno que comprende por lo menos una función seleccionada de: (i) función de promover la absorción de un antígeno en las células, (¡i) función de unir a un antígeno dos o más veces, (¡ii) función de promover la reducción de la concentración del antígeno de plasma, y (¡v) función de excelencia en la retención de plasma, donde el método comprende las etapas (a) a (d) a continuación: (a) poner en contacto un antígeno con una molécula de unión al antígeno o una biblioteca de moléculas de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio; (b) seleccionar una molécula de unión al antígeno que no une al antígeno en la etapa (a); (c) permitir que la molécula de unión al antígeno seleccionada en la etapa (b) una al antígeno bajo una alta condición de concentración de calcio; y (d) obtener una molécula de unión al antígeno una al antígeno en la etapa (c); [52] el método para evaluar cualquiera de [49] a [51], donde la baja concentración de calcio es una concentración de calcio ionizado de 0.1 a 30 µ ; [53] el método para evaluar cualquiera de [49] a [51], donde la alta concentración de calcio es una concentración de calcio ionizado de 100 µ? a 10 mM; [54] el método para evaluar cualquiera de [49] a [52], donde la baja concentración de calcio es una concentración intraendosomal de calcio ionizado; [55] el método para evaluar cualquiera de [49] a [51], o [53], donde la alta concentración de calcio es una concentración del plasma de calcio ionizado; [56] el método para evaluar cualquiera de [49] a [55], donde el antígeno al cual se une la molécula de unión al antígeno es un antígeno seleccionado del grupo que consiste de IL-6R, IL-6, IgA, glipicano 3 humano, e IgE; [57] el método para evaluar cualquiera de [49] a [56], donde la molécula de unión al antígeno es un anticuerpo; [58] un método para promover la absorción del antígeno en una célula mediante una molécula de unión al antígeno al administrar la molécula de unión al antígeno de cualquiera de [1] a [24] o una molécula de unión al antígeno producida por el método de producción de cualquiera de [25] a [36]; [59] un método para promover la reducción de la concentración del antígeno de plasma al administrar la molécula de unión al antígeno de cualquiera de [1] a [24] o una molécula de unión al antígeno producida por el método de producción de cualquiera de [25] a [36]; [60] un método para aumentar el número de veces de la unión al antígeno mediante una molécula de unión al antígeno al usar la molécula de unión al antígeno de cualquiera de [1] a [24] o una molécula de unión al antígeno producida por el método de producción de cualquiera de [25] a [36]; [61] un método para mejorar la retención de plasma de una molécula de unión al antígeno al usar la molécula de unión al antígeno de cualquiera de [1] a [24] o una molécula de unión al antígeno producida por el método de producción de cualquiera de [25] a [36]; [62] un método para promover la absorción del antígeno en una célula mediante una molécula de unión al antígeno al administrar una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión al antígeno y un dominio de unión al FcRn humano, cuya actividad de unión al antígeno es diferente entre dos diferentes concentraciones de calcio y es baja bajo una baja condición de concentración de calcio que bajo una alta condición de concentración de calcio; [63] un método para promover la reducción de la concentración del antígeno de plasma al administrar una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión al antígeno y un dominio de unión al FcRn humano, cuya actividad de unión al antígeno es diferente entre dos diferentes concentraciones de calcio y es baja bajo una baja condición de concentración de calcio que bajo una alta condición de concentración de calcio; [64] un método para aumentar el número de veces de la unión al antígeno mediante una molécula de unión al antígeno al usar una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión al antígeno y un dominio de unión al FcRn humano, cuya actividad de unión al antígeno es diferente entre dos diferentes concentraciones de calcio y es baja bajo una baja condición de concentración de calcio que bajo una alta condición de concentración de calcio; [65] un método para mejorar la retención de plasma de una molécula de unión al antígeno al usar una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión al antígeno y un dominio de unión al FcRn humano, cuya actividad de unión al antígeno es diferente entre dos diferentes concentraciones de calcio y es baja bajo una baja condición de concentración de calcio que bajo una alta condición de concentración de calcio; [66] el método de cualquiera de [62] a [65], donde la baja concentración de calcio es una concentración de calcio ionizado de 0.1 a 30 µ?; [67] el método de cualquiera de [62] a [66], donde la alta concentración de calcio es una concentración de calcio ionizado de 100 µ? a 10 mM; [68] el método de cualquiera de [62] a [67], donde la baja concentración de calcio es una concentración ¡ntraendosomal de calcio ionizado; [69] el método de cualquiera de [62] a [68], donde la alta concentración de calcio es una concentración en plasma de calcio ionizado; [70] el método de cualquiera de [62] a [69], donde un dominio de unión al FcRn de la molécula de unión al antígeno es una región de Fe; [71] el método de cualquiera de [62] a [70], donde adicionalmente la actividad de unión al antígeno de la molécula de unión al antígeno es baja bajo una condición del pH ácido que bajo una condición del pH neutral; [72] el método de [71], donde la modificación del aminoácido en la molécula de unión al antígeno es la modificación al sustituir por lo menos un aminoácido con histidina, o al insertar por lo menos una histidina en la molécula de unión al antígeno; [73] el método de cualquiera de [62] a [72], donde el antígeno al cual se une la molécula de unión al antígeno es un antígeno seleccionado del grupo que consiste de IL-6R, IL-6, IgA, glipicano 3 humano, e IgE; y [74] el método de cualquiera de [62] a [73], donde la molécula de unión al antígeno es un anticuerpo.
Además, la actual invención se relaciona con kits para el uso en los métodos de la presente invención, que comprenden una molécula de unión al antígeno de la presente invención o una molécula de unión al antígeno producida por métodos de producción de la presente invención. La presente invención también se relaciona con agentes para promover la absorción del antígeno en las células mediante una molécula de unión al antígeno, agentes para promover la reducción de la concentración del antígeno de plasma, agentes para aumentar el número de veces de la unión al antígeno mediante una molécula de unión al antígeno, y agentes para mejorar la retención en plasma de una molécula de unión al antígeno, todos los cuales comprenden como un ingrediente activo una molécula de unión al antígeno de la presente invención o una molécula de unión al antígeno producida por el método de producción de la presente invención. Además, la presente invención se relaciona con el uso de una molécula de unión al antígeno de la presente invención o una molécula de unión al antígeno producida por los métodos de producción de la presente invención en la producción de agentes para promover la absorción del antígeno en las células mediante una molécula de unión al antígeno, de agentes para promover la reducción de la concentración del antígeno de plasma, de agentes para aumentar el número de veces de la unión al antígeno en una molécula de unión al antígeno, o de agentes para mejorar la retención de plasma de una molécula de unión al antígeno. La presente invención también se relaciona con las moléculas de unión al antígeno de la presente invención o moléculas de unión al antígeno producidas mediante métodos de producción de la presente invención para el uso en los métodos de la presente invención.
Efectos de la Invención La presente invención proporciona métodos para promocionar la absorción del antígeno en células mediante molécula de unión al antígeno; métodos para aumentar el número de veces del antígeno de unión mediante una sola molécula de unión al antígeno; métodos para promover la reducción de la concentración del antígeno de plasma al administrar las moléculas de unión al antígeno, y métodos para mejorar la retención de plasma de una molécula dé unión al antígeno. La promoción de la absorción del antígeno en las células mediante las moléculas de unión al antígeno permite a una promover la reducción de la concentración del antígeno de plasma al administrar las moléculas de unión al antígeno y también al promover la retención de plasma de una molécula de unión al antígeno. Esto puede aumentar el número de veces de la unión al antígeno mediante una molécula de unión al antígeno. Así, tales moléculas de unión al antígeno pueden producir efectos in vivo más superiores con respecto a las moléculas de unión al antígeno comunes.
Breve Descripción de los Dibujos La Fig. 1 es un diagrama que muestra que un anticuerpo con unión dependiente del pH repetidamente une a los antígenos solubles, (i) un anticuerpo une a los antígenos solubles; (ii) el anticuerpo se internaliza no específicamente en una célula a través de la pinocitosis; (iii) el anticuerpo une a FcRn dentro del endosoma, y después los antígenos solubles disocian del anticuerpo; (iv) los antígenos solubles se transfieren en el lisosoma y se degradan; (v) después de la disociación de los antígenos solubles, el anticuerpo es reciclado al plasma a través de FcRn; (vi) el anticuerpo reciclado puede unir de nuevo a los antígenos solubles.
La Fig. 2 es un diagrama que muestra que un anticuerpo con la unión dependiente del pH une repetidamente a los antígenos de membrana, (i) un anticuerpo une a los antígenos de membrana; (ii) el anticuerpo se internaliza en una célula en un complejo con los antígenos de membrana; (iii) el anticuerpo disocia de los antígenos de membrana dentro del endosoma; (iv) los antígenos de membrana se transfieren en el lisosoma y se degradan; (v) después de la disociación de los antígenos de membrana, el anticuerpo se recicla al plasma; (vi) el reciclado puede unir de nuevo a los antígenos de membrana.
La Fig. 3 es un diagrama que muestra los modos de interacción en el plasma (pH 7.4) y el endosoma (pH 6.0) entre un antígeno y un anticuerpo con la unión dependiente de pH.
La Fig. 4 es un diagrama que muestra los modos de interacción en el plasma (Ca2+ de 2 mM) y el endosoma (Ca2+ de 3 µ?) entre un antígeno y un anticuerpo con la unión dependiente de calcio.
La Fig. 5 es un diagrama que muestra los modos de interacción en el plasma (pH 7.4, Ca2+ de 2 mM) y el endosoma (pH 6.0, Ca2+ de 3 µ?) entre un antígeno y un anticuerpo con la unión dependiente de pH y calcio.
La Fig. 6 presenta los sensogramas Biacore que muestran la interacción de los anticuerpos del receptor anti-humano IL-6 con el receptor IL-6 humano soluble bajo condiciones de (Ca2+ de 2 mM) y (Ca2+ de 3 µ?).
La Fig. 7 presenta un sensograma Biacore que muestra la interacción de H54/L28-lgG1 con el receptor IL-6 humano soluble bajo condiciones de (Ca2+ de 2 mM) y (Ca2+ de 3 µ?).
La Fig. 8 presenta un sensograma Biacore que muestra la interacción de FH4-lgG1 con el receptor IL-6 humano soluble bajo condiciones de (Ca2+ de 2 mM) y (Ca + de 3 µ?).
La Fig. 9 presenta un sensograma Biacore que muestra la interacción de 6RL#9-lgG1 con el receptor IL-6 humano soluble bajo condiciones de (Ca2+ de 2 mM) y (Ca + de 3 µ?).
La Fig. 10 describe un periodo de tiempo de la concentración del anticuerpo en plasma en ratones normales administrado con H54/L28-lgG1 , FH4-lgG1, o 6RL#9-lgG1.
La Fig. 11 describe un periodo de tiempo del nivel del plasma del receptor IL-6 humano soluble (hslL-6R) en ratones normales administrado con H54/L28-lgG 1 , FH4-lgG1, o 6RL#9-lgG1.
La Fig. 12 describe un periodo de tiempo de la concentración del anticuerpo en plasma en ratones normales administrado con H54/L28-N434W, FH4-N434W, o 6RL#9-N434W.
La Fig. 13 describe un periodo de tiempo del nivel del plasma del receptor IL-6 humano soluble (hslL-6R) en ratones normales administrado con H54/L28-N434W, FH4-N434W, o 6RL#9-N434W.
La Fig. 14 muestra la estructura de la cadena pesada CDR3 de un fragmento Fab del anticuerpo 6RL#9 determinado mediante la cristalografía de rayos X.
La Fig. 15 presenta los sensogramas de Biacore que muestran la interacción de los anticuerpos IL-6 anti-humano con IL-6 humano bajo las condiciones de (Ca2+ de 1.2 mM) y (Ca2+ de 3 µ?).
La Fig. 16 muestra los cromatogramas de intercambio iónico para un anticuerpo que tiene la secuencia Vk5-2 humana y un anticuerpo que tiene secuencia h Vk5-2_L65 que tiene una secuencia de glicosilación modificada en la secuencia Vk5-2 humana. La línea continua indica un cromatograma para un anticuerpo que tiene secuencia Vk5-2 humana (cadena pesada: CIM_H, NO. SEC ID NO: 48; cadena ligera: hVk5-2, molécula de fusión entre las SEC ID NOs.: 41 y 28); la línea discontinua indica un cromatograma para un anticuerpo que tiene la secuencia hVk5-2_L65 (cadena pesada: CIM_H (SEC ID NO: 48); cadena ligera: hVk5-2_L65 (SEC ID NO: 47)).
La Fig. 17 muestra los cromatpgramas de intercambio iónico para un anticuerpo que tiene la secuencia LfVk1_Ca (cadena pesada: GC_H, SEC ID NO: 102; cadena ligera: LfVk1_Ca, SEC ID NO: 61) y un anticuerpo que tiene una secuencia en la cual ASP (d) en la secuencia LfVk1_Ca se sustituye con Ala (A) después del almacenamiento a 5°C (línea continua) o 50°C (línea punteada). Después del almacenamiento a 5°C, el pico máximo en el cromatograma para cada anticuerpo se define como un máximo principal, y el eje y de cada cromatograma de intercambio iónico se normalizó al máximo principal.
La Fig. 18 muestra los cromatogramas de intercambio iónico para un anticuerpo que tiene la secuencia LfVk1_Ca (cadena pesada: GC_H, SEC ID NO: 102; cadena ligera: LfVk1_Ca, SEC ID NO: 61) y un anticuerpo que tiene la secuencia LfVk1_Ca6 (cadena pesada: GC_H, SEC ID NO: 102; cadena ligera: LfVk1_Ca6, SEC ID NO: 75) en los cuales Asp (D) en la posición 30 (sistema de numeración de Kabat) en la secuencia LfVk1_Ca se sustituye con Ser (S) después del almacenamiento a 5°C (línea continua) o 50°C (línea punteada). Después del almacenamiento a 5°C, el pico máximo del cromatograma para cada anticuerpo se define como máximo principal, y el eje y de cada cromatograma de intercambio iónico se normalizó al máximo principal.
La Fig. 19 presenta los sensogramas de Biacore que muestran la interacción de los anticuerpos CD4 anti-humano con el CD4 humano soluble bajo condiciones de (Ca2+ de 1.2 mM) y (Ca2+ de 3 µ?).
La Fig. 20 describe un periodo de tiempo de la concentración en plasma de los anticuerpos CD4 anti-humano de ratones normales.
La Fig. 21 describe un periodo de tiempo de la concentración en plasma del CD4 humano soluble en el grupo administrado con el CD4 humano soluble solamente, el grupo administrado con el anticuerpo TNX355-lgG1, el grupo administrado con anticuerpo Q425, y el grupo administrado con anticuerpo Q425L9 de ratón normal.
La Fig. 22 presenta los sensogramas de Biacore que muestran la interacción de los anticuerpos IgA anti-humano con IgA humano bajo las condiciones de (Ca2 + de 1.2 mM) y (Ca2+ de 3 µ?).
La Fig. 23 describe un periodo de tiempo de las concentraciones del anticuerpo en plasma en ratones normales para el grupo administrado con anticuerpo GA1-lgG1, el grupo administrado con anticuerpo GA2-lgG1, el grupo administrado con anticuerpo GA3-lgG1, y el grupo administrado con anticuerpo GA2-N434W.
La Fig. 24 describe un periodo de tiempo de la concentración de IgA humano en plasma en ratones normales para el grupo administrado con IgA humano solamente, el grupo administrado con anticuerpo GA1-lgG1, el grupo administrado con anticuerpo GA2-lgG1, el grupo administrado con anticuerpo GA3-I g G 1 , y el grupo administrado con anticuerpo GA2-N434W.
La Fig. 25 describe un periodo de tiempo de la concentración en plasma de IgA humano no unido en ratones normales para el grupo administrado con anticuerpo GA1-lgG1, el grupo administrado con anticuerpo GA2-lgG1, el grupo administrado con anticuerpo GA3-lgG1, y el grupo administrado con anticuerpo GA2-N434W.
La Fig. 26 es un diagrama ilustrativo que muestra la eficacia de la eliminación del antígeno por la molécula de anticuerpo para un anticuerpo general que forma un complejo inmune grande con un antígeno multimérico.
La Fig. 27 es un diagrama ilustrativo que muestra la eficacia de la eliminación del antígeno por la molécula de anticuerpo para un anticuerpo dependiente de pH/Ca que tiene la región constante de lgG1 natural que forma un complejo inmune grande con un antígeno multimérico.
La Fig. 28 es un diagrama ilustrativo que muestra la eficacia de la eliminación del antígeno por la molécula de anticuerpo para un anticuerpo multiespecífico dependiente de pH/Ca que reconoce dos o más epítopos en un antígeno monomérico y es adecuado para la formación de un complejo inmune grande.
La Fig. 29 describe la interacción de los anticuerpos glipicano 3 anti-humano con glipicano 3 humanos recombinante bajo las condiciones de (Ca2+ de 1.2 mM) y (Ca2 + de 3 µ ) mediante ELISA.
La Fig. 30 describe la interacción de los anticuerpos IgE anti-humano con IgE humano recombinante bajo las condiciones de (Ca2+ de 2 mM) y (Ca2+ de 3 µ?) mediante ELISA.
La Fig. 31 describe un periodo de tiempo de las concentraciones del anticuerpo en plasma en ratones transgénicos con FcRn humano.
. La Fig. 32 describe un periodo de tiempo de la concentración del plasma de receptor IL-6 humano soluble en ratones transgénicos con FcRn humano.
La Fig. 33 describe un periodo de tiempo de las concentraciones del anticuerpo en plasma en ratones normales.
La Fig. 34 describe un periodo de tiempo de la concentración del plasma de receptor IL-6 humano soluble en ratones normales.
La Fig. 35 describe un periodo de tiempo de la concentración del plasma de receptor IL-6 humano soluble no unido en ratones normales.
La Fig. 36 describe un periodo de tiempo de la concentración del plasma de receptor IL-6 humano soluble en ratones transgénicos con FcRn humano.
La Fig. 37 describe un periodo de tiempo de la concentración del plasma de receptor IL-6 humano soluble después de la administración de Fv4-lgG1-F14 en una dosis baja (0.01 mg/kg) o 1 mg/kg.
La Fig. 38 describe un periodo de tiempo de las concentraciones del anticuerpo en plasma después de la administración de Fv4-lgG1-F14 en una dosis baja (0.01 mg/kg) o 1 mg/kg.
La Fig. 39 describe un periodo de tiempo de la concentración del plasma de receptor IL-6 humano soluble después de la administración de los anticuerpos del receptor IL-6 anti-humano a ratones normales en que es constante la concentración en plasma del receptor IL-6 humano soluble.
La Fig. 40 describe un periodo de tiempo de la concentración del anticuerpo en plasma después de la coadministración de hslL-6R y de un anticuerpo del receptor IL-6 anti-humano a ratones transgénicos con FcRn humano (línea 276).
La Fig. 41 describe un periodo de tiempo de la concentración en plasma del receptor IL-6 humano soluble después de la coadministración de hslL-6R y de un anticuerpo del receptor IL-6 anti-humano a ratones transgénicos con FcRn humano (línea 276).
La Fig. 42 describe la relación entre la afinidad de unión de las variantes de Fe a FcRn humano en pH 7.0 y la concentración de hslL-6R en plasma un día después de la coadministración de hslL-6R y de un anticuerpo del receptor IL-6 anti-humano a ratones transgénicos con FcRn humano (línea 276).
La Fig. 43 describe la relación entre la afinidad de unión de las variantes de Fe a FcRn humano en pH 7.0 y la concentración del anticuerpo en plasma un día después de la coadministración de hslL-6R y de un anticuerpo del receptor IL-6 anti-humano a ratones transgénicos con FcRn humano (línea 276).
La Fig. 44 describe un periodo de tiempo de la relación antígeno/anticuerpo molar (valor C) después de la coadministración de hslL-6R y un anticuerpo del receptor IL-6 anti-humano a ratones transgénicos con FcRn humano (línea 276).
La Fig. 45 describe la relación entre la afinidad de unión de las variantes de Fe a FcRn humano en pH 7.0 y la relación antígeno/anticuerpo molar (valor C) en el día 1 después de la coadministración de hslL-6R y un anticuerpo del receptor IL-6 anti-humano a ratones transgénicos con FcRn humano (línea 276).
La Fig. 46 describe un periodo de tiempo de la concentración en plasma de hslL-6R después de la administración de Fv4-lgG1-F14 a dosis bajas (0.01 o 0.2 mg/kg) o 1 mg/kg a ratones transgénicos con FcRn humano (línea 276) en que es constante la concentración en plasma de hslL-6R (modelo de infusión en estado estable).
La Fig. 47 describe un periodo de tiempo de la concentración de hslL-6R en plasma en la línea 276 y línea 32 de ratones transgénicos con FcRn humano después de la coadministración de hslL-6R y el anticuerpo del receptor anti-IL-6 humano a ratones transgénicos con FcRn humano (línea 276 y 32).
La Fig. 48 describe un periodo de tiempo de la concentración del anticuerpo en plasma en la línea 276 y línea 32 de ratones transgénicos con FcRn humano después de la coadministración de hslL-6R y el anticuerpo del receptor anti-IL-6 humano a ratones transgénicos con FcRn humano (línea 276 y 32).
La Fig. 49 describe un periodo de tiempo de la concentración en plasma de hslL-6R después de la administración del anticuerpo del receptor anti-IL-6 humano a ratones transgénicos con FcRn humano en que es constante la concentración en plasma de hslL-6R (línea 32) (modelo de infusión en estado estable).
La Fig. 50 describe de un periodo de tiempo de la concentración de anticuerpo en plasma después de la administración del anticuerpo del receptor anti-IL-6 humano a ratones transgénicos con FcRn humano en que es constante la concentración en plasma de hslL-6R (línea 32) (modelo de infusión en estado estable).
La Fig. 51 describe los períodos de tiempo de la relación antígeno/anticuerpo molar (valor C) después de la administración del anticuerpo del receptor anti-IL-6 humano a ratones transgénicos con FcRn humano en que es constante la concentración en plasma de hslL-6R (línea 32) (modelo de infusión en estado estable).
La Fig. 52 describe la relación entre la afinidad de unión de las variantes de Fe a FcRn humano en pH7.0 y la relación antígeno/anticuerpo molar (valor C) en el día 1 después de la administración del anticuerpo del receptor anti-IL-6 humano a ratones transgénicos con FcRn humano (línea 32) en que es constante la concentración en plasma de hslL-6R (modelo de infusión en estado estable).
La Fig. 53 muestra una gráfica de un periodo de tiempo de la concentración del anticuerpo en plasma después de la administración de anticuerpos del receptor anti-IL-6 humano que tienen la variante de Fe de F11, F39, F48, y F264 a ratones transgénicos con FcRn humano en que es constante la concentración en plasma de hslL-6R (línea 32) (modelo de infusión en estado estable).
La Fig. 54 muestra una gráfica de un periodo de tiempo de la concentración en plasma de hslL-6R después de la administración de anticuerpos del receptor anti-IL-6 humano que tienen la variante de Fe de F 11 , F39, F48, y F264 a ratones transgénicos con FcRn humano en que es constante la concentración en plasma de hslL-6R (línea 32) (modelo de infusión en estado estable).
La Fig. 55 describe un periodo de tiempo de la concentración del anticuerpo en plasma después de la administración de anticuerpos del receptor anti-IL-6 humano que tienen la variante de Fe de F157, F196, y F262 a ratones transgénicos con FcRn humano en que es constante la concentración en plasma de hslL-6R (línea 32) (modelo de infusión en estado estable).
La Fig. 56 describe un periodo de tiempo de la concentración en plasma de hslL-6R después de la administración de anticuerpos del receptor anti-IL-6 humano que tienen la variante de Fe de F157, F196, y F262 a ratones transgénicos con FcRn humano en que es constante la concentración en plasma de hslL-6R (línea 32) (modelo de infusión en estado estable).
Descripción Detallada de ta Invención Específicamente, la presente invención proporciona los métodos para promover la absorción del antígeno en las células mediante las moléculas de unión al antígeno, los métodos para aumentar el número de veces de la unión al antígeno mediante una molécula de unión al antígeno, los métodos para promover la reducción de la concentración del antígeno en plasma al administrar las moléculas de unión al antígeno, y los métodos para mejorar la retención de plasma de las moléculas de unión al antígeno, todas las cuales usan una molécula de unión al antígeno que tienen una baja actividad de unión al antígeno (en la presente, referido a veces como "actividad de unión") bajo una baja condición de concentración de calcio que bajo una alta condición de concentración de calcio.
Aminoácidos En la presente, los aminoácidos se describen en uno o tres códigos de letras o ambos, por ejemplo, Ala/A, Leu/L, Arg/R, Lys/K, Asn/N, Met/M, Asp/D, Phe/F, Cys/C, Pro/P, Gln/Q, Ser/S, Glu/E, Thr/T, Gly/G, Trp/W, His/H, Tyr/Y, II e/1 , o Val/V.
Antígenos En la presente, los "antígenos" no se unen particularmente en su estructura, siempre que comprendan los epítopos a los que los dominios de unión al antígeno se unan. Es decir, los antígenos pueden ser sustancias inorgánicas u orgánicas; y alternativamente, los antígenos pueden ser sustancias extranjeras o endógenas a los organismos sometidos a la administración de la presente invención. Los ejemplos de antígenos unidos mediante los dominios de unión al antígenos de las moléculas unidas al antígeno cuyas farmacocinéticas son mejoradas mediante los métodos de la presente invención preferiblemente incluyen los antígenos de membrana como proteínas de receptor (receptores unidos a membrana y los receptores solubles) y marcadores superficiales de célula; antígenos solubles como citocinas; y los antígenos con epítopos presentan solamente en organismos extranjeros. Tales antígenos incluyen, por ejemplo, las siguientes moléculas: 17-IA, 4-1 BB, 4Dc, 6-keto-IPGF1 a, 8-iso-PGF2a, 8-oxo-dG, receptor de la adenosina A1, A33, ACE, ACE-2, Activina, Activina A, Activina AB, Activina B, Activina C, Activina RIA, Activina RIA ALK-2, Activina RIB ALK-4, Activina RIIA, Activina RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM 17/TACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, Adresinas, adiponectina, ADP-ribosil ciclasa-1, aFGF, aFGF, AGE, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, alérgeno, a1 -anticimotripsina, a1 -antitripsina, a-sinucleína, antagonista a-?ß-1, aminipa, amilina, amiloide ß, región variable de cadena pesada de amiloide inmunoglobulina, región variable de cadena ligera de amiloide inmunoglobulina, Andrógeno, ANG, angiotensinógeno, ligando-2 de Angiopoietina, anti-ld, antitrombina III, Ántrax, APAF-1, APE, APJ, apo A1, amiloide A sérico apo, Apo-SAA, APP, APRIL, AR, ARC, ART, Artemina, ASPÁRTICO, Factor natriurético atrial, Péptido natriurético atrial, Péptidos A natriuréticos atriales, Péptidos B natriuréticos atriales, péptidos C natriuréticos atriales, integrina av/b3, Axl, B7-1, B7-2, B7-H, BACE, BACE-1, Antígeno protector de Bacillus anthracis, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Bax, BCA-1, BCAM, Bel, BCMA, BDNF, b-ECGF, ß-2-microglobulina, ß lactamasa, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, Estimulador del linfocito B (BlyS), BMP, BMP-2 (BMP-2a), BMP-3 (Osteogenina), BMP-4 (BMP-2b), BMP-5, BMP-6 (Vgr-1), BMP-7 (OP-1), BMP-8 (BMP-8a), BMPR, BMPR-IA (ALK-3), BMPR-IB (ALK-6), BMPR-II (BRK-3), BMPs, BOK, Bombesina, Factor neurotrófico derivado de hueso, Hormona de crecimiento bovina, BPDE, BPDE-DNA, BRK-2, BTC, molécula de adhesión celular del linfocito B, C10, inhibidor C1, C1q, C3, C3a, C4, C5, C5a (complemento 5a), CA125, CAD-8, Cadherina-3, Calcitonina, cAMP, anhidrasa carbónica-IX, antígeno carcinoembrionario (CEA, por sus siglas en inglés), antígeno asociado con carcinoma, Cardiotrofina-1 , Catepsina A, Catepsina B, Catepsina C/DPPI, Catepsina D, Catepsina E, Catepsina H, Catepsina L, Catepsina O, Catepsina S, catepsina V, catepsina X/Z/P, CBL, CCI, CCK2, CCL, CCL1/I-309, CCL11 /Eotaxina, CCL12/MCP-5, CCL13/MCP-4, CCL14/HCC-1 , CCL15/HCC-2, CCL16/HCC-4, CCL17/TARC, CCL18/PARC, CCL19/ELC, CCL2/MCP-1, CCL20/MIP-3-a, CCL21/SLC, CCL22/MDC, CCL23/MPIF-1 , CCL24^Eotaxina-2, CCL25/TECK, CCL26/Eotaxina-3, CCL27/CTACK, CCL28/MEC, CCL3/M 1 P-1 -a, CCL3LI/LD-78- , CCL4/MIP-1-P, CCL5/RANTES, CCL6/C10, CCL7/MCP-3, CCL8/MCP-2, CCL9/10/MTP-1-Y, CCR, CCR1, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCIR8, CCR9, CD1, CD10, CD105, CD11a, CD11b, CD11c, CD123, CD13, CD137, CD138, CD14, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD15, CD152, CD16, CD164, CD18, CD19, CD2, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD26, CD27L, CD28, CD29, CD3, CD30, CD30L, CD32, CD33 (proteínas p67), CD34, CD37, CD38, CD3E, CD4, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD49b, CD5, CD51, CD52, CD54, CD55, CD56, CD6, CD61 , CD64, CD66e, CD7, CD70, CD74, CD8, CD80 (B7-1), CD89, CD95, CD105, CD158a, CEA, CEACAM5, CFTR, cGMP, receptor CGRP, CINC, CKb8-1, Claudin 18, CLC, Toxina clostridium botulinum, Toxina clostridium difficile, Toxina clostridium perfringens, c-Met, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, Factor de complemento 3 (C3), Factor de complemento D, globulina de unión al corticosteroide, Receptor de factor-1 estimulante de colonia, COX, C-Ret, CRG-2, CRTH2, CT- , CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1 /Fractalcina, CX3CR1, CXCL, CXCL1/Gro-a, CXCL10, CXCL11 /l-TAC, CXCL12/SDF-l-a/p, CXCL13/BCA-1 , CXCL14/BRAK, CXCL15/Lungcina, CXCL16, CXCL16, CXCL2/Gro- CXCL3/Gro-Y, CXCL3, CXCL4/PF4, CXCL5/ENA-78, CXCL6/GCP-2, CXCL7/NAP-2, CXCL8/IL-8, CXCL9/M¡g, CXCLIO/I P-10, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, cistatina C, antígeno asociado a tumor de citoqueratina, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, Factor acelerador de decaimiento, Ligando 4 de proteína similar a Delta, des(1-3)-IGF-I (IGF-1 de cerebro), Dhh, DHICA oxidasa, Dickkopf-1, digoxina, Dipeptidil peptidasa IV, DKI, DNAM-1, Dnasa, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1 , EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR (ErbB-1), proteína 7 que contiene el dominio similar a EGF, Elastasa, elastina, AME, EMMPRIN, ENA, ENA-78, Endosialina, receptor del endotelina, endotoxina, Encefalinasa, eNOS, Eot, Eotaxina, Eotaxina-2, eotaxinla, EpCAM, Efrina B2/EphB4, receptor de la tirosina cinasa Epha2, receptor del factor de crecimiento epidérmico, receptor ErbB2, receptor de la tirosina cinasa ErbB3, ERCC, eritropoyetina (EPO, por sus siglas en inglés), receptor de la eritropoyetina, selectina E, ET-1, Exodus-2, proteína F de RSV, F10, F11, F12, F13, F5, F9, Factor la, Factor IX, Factor XA, Factor VII, Factor VIII, Factor Vlllc, Fas, FcaR, FcepsilonRI, FoyUb, FcyRI, FcyRIIa, FcYRIIIa, FcYRIIIb, FcRn, FEN-1, Ferritina, FGF, FGF-19, FGF-2, Receptor FGF-2, FGF-3, FGF-8, FGF-ácido, FGF-básico, FGFR, FGFR-3, Fibrina, Proteína de activación del fibroblasto (FAB, por sus siglas en inglés), factor de crecimiento del fibroblasto, factor-10 de crecimiento del fibroblasto, fibronectina, FL, FLIP, Flt-3, ligando FLT3, Receptor de folato, hormona estimuladora de folículo (FSH, por sus siglas en inglés), Fractalcina (CX3C), cadena pesada libre, cadena ligera libre, FZD1, FZD10, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, G250, Gas 6, GCP-2, GCSF, G-CSF, receptor G-CSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-15 (MIC-1), GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14/CDMP-1 ), GDF-6 (BMP-13/CDMP-2), GDF-7 (BMP-12/CDMP-3), GDF-8 (Miostatina), GDF-9, GDNF, Gelsolina, GFAP, GF-CSF, GFR-cM, GFR-a2, GFR-a3, GF-a1, glucoproteína de envoltura gH, GITR, Glucagón, Receptor de glucagón, Receptor del péptido 1 similar al glucagón, Glut 4, Glutamato carboxipeptidasa II, receptores de hormonas de glicoproteína, glicoproteína llb/llla (GP llb/llla), Glipicano-3, GM-CSF, receptor GM-CSF, gp130, gp140, gp72, granulocitos CSF (G-CSF, por sus siglas en inglés), GRO/MGSA, Factor de liberación de hormona del crecimiento, GRO-ß, GRO-?, H. pylori, Hapteno (NP-cap o NIP-cap), HB-EGF, HCC, HCC 1, glicoproteína de envoltura HCMV gB, HCMV UL, Factor de crecimiento hematopoyético (HGF, por sus siglas en inglés), Hep B gp120, heparanasa, cofactor II de heparina, factor de crecimiento hepático, antígeno protector de Bacillus anthracis, glicoproteína del virus E2 de hepatitis C, Hepatitis E, Hepcidina, Herí, Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), glicoproteína gB del virus de herpes simple (HSV, por sus siglas en inglés), HGF, HGFA, antígeno asociado a melanoma de alto peso molecular (H MW-M AA, por sus siglas en inglés), proteínas de envoltura VIH, como GP120, bucle VIH MIB gp 120 V3, H LA, HLA-DR, HM1.24, HMFG PEM, HMGB-1, HRG, Hrk, HSP47, Hsp90, glicoproteína HSV gD, miosina cardiaca humana, citomegalovirus humano (HCMV, por sus siglas en inglés), hormona de crecimiento humana (hGH, por sus siglas en inglés), albúmina de suero humana, activador del plasminógeno tipo tejido humano (t-PA, por sus siglas en inglés), Huntingtina, HVEM, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS , IFN-a, IFN-ß, IFN-?, IgA, receptor IgA, IgE, IGF, proteínas de unión a IGF, IGF-1, IGF-1 R, IGF-2, IGFBP, IGFR, IL, IL-1, IL-10, receptores de IL-10, IL-11, receptores de IL-11, IL-12, receptores de IL-12, IL-13, receptores de IL-13, IL-15, receptores de IL-15, IL-16, receptores de IL-16, IL-17, receptores de IL-17, IL-18 (IGIF), receptores de IL-18, de IL-1a, I L- 1 ß, receptores de IL-1, IL-2, receptores de IL-2, IL-20, receptores de IL-20, IL-21, receptores de IL-21, IL-23, receptores de IL-23, receptores de IL-2, IL-3, receptores de IL-3, IL-31, receptores de IL-31, receptores de IL-3, IL-4, receptores de IL-4, IL-5, receptores de IL-5, IL-6, receptores de IL-6, IL-7, receptores de IL-7, IL-8, receptores de IL-8, IL-9, receptores de IL-9, complejo inmune de inmunoglobulina, inmunoglobulinas, INF-a, receptores de INF-a, INF-ß, receptores de INF-ß, INF-?, receptores de INF-?, IFN tipo I, receptor IFN tipo I, influenza, inhibina, inhibina a, inhibina ß, ¡NOS, insulina, cadena de insulina A, insulina de cadena B, factor 1 de crecimiento similar a la insulina, factor 2 de crecimiento similar a la insulina, proteínas de unión del factor de crecimiento similar a la insulina, integrina, integrina a2, integrina a3, integrina a4, integrina a4/ß1, integrina a-?/ß-3, integrina a-V/ß-ß, integrina a4/ß7, integrina a5/ß1, integrina a5/ß3, integrina a5/ß6, integrina a-d (aV), integrina a-?, integrina ß1, integrina ß2, integrina ß3(<3?? lb-l lia), IP-10, l-TAC, JE, Calicleína, Calicleína 11, Calicleína 12, Calicleína 14, Calicleína 15, Calicreína 2, Calicleína 5, Calicreína 6, Calicleína L1, Calicleína L2, Calicleína L3, Calicleína L4, Calistatína, KC, KDR, Factor de Crecimiento de Queratinocitos (KGF, por sus siglas en inglés), Factor-2 de Crecimiento de queratinocitos (KGF-2, por sus siglas en inglés), KGF, receptor similar a inmunoglobulina asesina, ligando de kit (KL, por sus siglas en inglés), kit de la tirosina cinasa, laminina 5, LAMP, LAPP (Amilina, polipéptido amiloide en islotes), LAP (TGF-1), péptido asociado a latencia, TGF-1 latente, TGF BP1-1 latente, LBP, LDGF, LDL, receptor de LDL, LECT2, Lefty, Leptina, Hormona luteinizante (LH, por sus siglas en inglés), antígeno de Lewis-Y, antígeno relacionado con Lewis-Y, LFA-1, LFA-3, receptores de LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, lipoproteínas, LIX, LKN, Lptn, L-Selectina, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, tensioactivo pulmonar, Hormona luteinizante, Linfotactina, receptor de linfotoxina ß, Receptor de lisosfingolípido, Mac-1, CSF de macrófagos (M-CSF, por sus siglas en inglés), MAdCAM , MAG, MAP2, MARC, maspins, MCAM, MCK-2, MCP, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-I (MCAF) , M-CSF, MDC, MDC (67 a. a.), MDC (69 a. a.), megsina, Mer, familia del receptor de la tirosina cinasa MET, METALOPROTEASAS, glicoproteína 0X2 de membrana, Mesotelina, receptor de MGDF, MGMT, MHC (HLA-DR), proteína microbiana, MI F, MIG, MIP, ???-1a, ???-1ß, ???-3a, ???-3ß, MIP-4, MK, M MAC 1 , MMP, MMP-1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, proteína atrayente de monocitos, factor inhibidor de colonias de monocitos, péptido asociado a gonadotropina de ratón, MPIF, Mpo, MSK, MSP, MUC-16, MUC18, mucina (Mud), sustancia inhibidora de Muellerian, Mug, MuSK, Glicoproteína asociada a mielina, factor-1 inhibidor de progenitor mieloide (MPIF-1, por sus siglas en inglés), NAIP, Nanocuerpo, PNA, NAP-2, NCA 90, NCAD, N-cadherina, NCAM, Neprilisina, Molécula de adhesión celular neural, neroserpina, Factor de crecimiento neuronal (NGF, por sus siglas en inglés), Neurotrofina-3, Neurotrofina-4, Neurotrofina-6, Neuropilina 1, Neurturina, NGF-ß, NGFR, NKG20, Hormona de crecimiento humano de N-metionilo, nNOS, NO, Nogo-A, receptor Nogo, Proteína tipo 3 no estructural (NS3, por sus siglas en inglés) del virus de la hepatitis C, Nos, Npn, NRG-3, NT, NT-3, NT-4, NTN, OB, OGG1, Oncostatina M, OP-2, OPG, OPN, OSM, receptores de OSM, factores osteoinductores, osteopontina, OX40L, OX40R, LDL oxidado, p150, p95, PADPr, hormona paratiroidea , PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, P-cadherina, PCNA, PCSK9, PDGF, receptor de PDGF, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-D, PDK-1, PECAM, PEDF, PEM, PF-4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIGF, PIN, PLA2, Factor de crecimiento placentario, fosfatasa alcalina placentaria (PLAP, por sus siglas en inglés), lactógeno placentario, inhibidor-1 activador de plasminógeno, factor de crecimiento de plaquetas, plgR, PLP, cadenas de poliglicol de diferente tamaño (por ejemplo, PEG-20, PEG-30, PEG40), PP14, precalicreína, proteína priónica, procalcitonina, proteína 1 de muerte celular programada, proinsulina, prolactina, Proproteína convertasa PC9, prorelaxina, antígeno prostético específico de membrana (PSMA, por sus siglas en inglés), Proteína A, Proteína C, Proteína D, proteína S, proteína Z, PS, PSA, PSCA, PsmAr, PTEN, PTHrp, Ptk, PTN , ligando-1 de la P-selectina glicoproteína, R51, RAGE, RANK, RANKL, RANTES, relaxina, cadena de relaxina A, cadena de relaxina B, renina, proteína F del virus sincitial respiratorio (RSV, por sus siglas en inglés), Ret, reticulon 4, Factores reumatoides, RLI P76, RPA2, RPK-1, RSK, RSV Fgp, S100, RON-8, SCF/KL, SCGF, Esclerostina, SDF-1, SDF1 a, SDF1 ß, SERINA, amiloide P sérico, Albúmina sérica, sFRP-3, Shh, Shiga como toxina II, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, receptor 1 de la esfingosina-1 -fosfato, Ácido lipoteicoico de estafilocócico, Estat, STEAP, STEAP-II, Factor de células madre (SCF, por sus siglas en inglés), estreptocinasa, superóxido dismutasa, sindecano-1, TACE, TACI, TAG-72 (glicoproteína-72 asociada a tumor), TARC, TB, TCA-3, receptor a/ß de células T, TdT, TECK, TEM1, TEM5, TEM7, TEM8, Tenascina, TERT, Alcalina fosfatasa similar a PLAP testicular, TtR, TGF, TGF-a, TGF-ß. TGF-ß Pan específico, TGF-ß Rll, TGF-ß Rllb, TGF-ß RUI, TGF-ß Rl (ALK-5), TGF-ß?, TGF^2, TGF^3, TGF-ß?, TGF-ßd, TGF-I, Trombina, trombopoyetina (TPO, por sus siglas en inglés), Receptor de linfoproteína del estroma tímico, Timo Ck-1, hormona estimulante de la tiroides (TSH, por sus siglas en inglés), tiroxina, globulina de unión a tiroxina, Tie, TIMP, TIQ, Factor de Tejido, Inhibidor de proteasa del factor de tejido, proteína de factor de tejido, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, receptor I de TNF, receptor II de TNF, TNF-a, TNF-ß, ???-ß2, TNFc, TNF-RI, TNF-Rll, TNFRSF10A (TRAIL R1 Apo-2/DR4), TNFRSF10B (TRAIL R2 DR5/KILLER/TRICK-2A/TRICK-B), TNFRSF10C (TRAIL R3 DcR1 /LIT/TRID), TNFRSF10D (TRAIL R4 DcR2/TRUNDD), TNFRSF11 A (RANK ODF R/TRANCE R), TNFRSF11 B (OPG OCIF/TR1), TNFRSF12 (TWEAK R FN14), TNFRSF12A, TNFRSF13B (TACI), TNFRSF13C (BAFF R), TNFRSF14 (HVEM ATAR/HveA/LIGHT R/TR2), TNFRSF16 (NGFR p75NTR), TNFRSF17 (BCMA), TNFRSF18 (GITR AITR), TNFRSF19 (TROY TAJ/TRADE), TNFRSF19L (RELT) , TNFRSF1A (TNF Rl CD120a/p55-60), TNFRSF1 B (TNF Rll CD120b/p75-80), TNFRSF21 (DR6), TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRSF25 (DR3 Apo-3/LARD/TR-3/TRAMP/WSL-1), TNFRSF26 (TNFRH3), TNFRSF3 (LTbR TNF RIII/TNFC R), TNFRSF4 (OX40 ACT35/TXGP1 R), TNFRSF5 (CD40 p50), TNFRSF6 (Fas Apo-1/APT1/CD95), TNFRSF6B (DcR3 M68/TR6), TNFRSF7 (CD27), TNFRSF8 (CD30), TNFRSF9 (4-1 BB CD137/ILA), TNFRST23 (DcTRAIL R1 TNFRH 1 ), TNFSF10 (Ligando TRAIL Apo-2/TL2), TNFSF11 (TRANCE/ODF del Ligando: RANK/Ligando OPG), TNFSF12 (Ligando TWEAK ???-3/Ligando DR3), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS/TALL1 /THANK/TNFSF20), TNFSF14 (Ligando LIGHT HVEM/LTg), TNFSF15 (TL1A/VEGI), TNFSF18 (Ligando AITR del Ligando GITR/TL6), TNFSF1A (Conectina de TNF-a/DIF/TNFSF2), TNFSF1B (TNF-b LTa/TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC/p33), TNFSF4 (gp34 del Ligando OX40/TXGP1), TNFSF5 (CD154 del Ligando CD40/gp39/HIGM1/IMD3/TRAP), TNFSF6 (Ligando Apo-1 del Ligando Fas/Ligando APT1), TNFSF7 (CD70 del Ligando CD27), TNFSF8 (CD153 del Ligando CD30), TNFSF9 (Ligando CD137 del Ligando 4-1 BB), TNFa, TNF-ß, TNIL-I, metabolito tóxico, TP-1, t-PA, Tpo, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, receptor de la transferrina, factores de crecimiento de transformación (TGF, por sus siglas en inglés) como TGF-a y TGF-ß, glicoproteína NMB de transmembrana, Transtiretina, TRF, Trk, TROP-2, Glicoproteína en trofoblasto, TSG, TSLP, Factor de Necrosis Tumoral (TNF, por sus siglas en inglés), antígeno CA 125 asociado a tumor, Carbohidrato relacionado a Lewis Y que expresa el antígeno asociado a tumor, TWEAK, TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1, Urocinasa, VAP-1, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, por sus siglas en inglés), vaspina, VCAM, VCAM-1, VECAD, VE-Cadherina, VE-Cadherina-2 , VEFGR-1 (flt-1), VEFGR-2, receptor de VEGF (VEGFR, por sus siglas en inglés), VEGFR-3 (flt-4), VEGI, VIM, Antígenos virales, receptor de VitB12, receptor de Vitronectina, VLA, VLA-1, VLA-4, integrina de VNR, Factor de von Willebrand (vWF, por sus siglas en inglés), WIF-1, WNT1, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9B, XCL1, XCL2/SCM-1-3, XCLI/Linfotactina, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD, HMGB1, IgA, ?ß, CD81, CD97, CD98, DDR1, DKK1, EREG, Hsp90, IL-17/IL-17R, I L-20/I L-20R , LDL oxidado, PCSK9, precalicleína, RON, TMEM16F, SOD1, Cromogranina A, Cromogranina B, tau, VAP1, cininógeno de alto peso molecular, IL-31, IL-31R, Nav1.1, Nav1.2, Nav1.3, Nav1.4, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8, Nav1.9, EPCR, C1, C1q, C1r, C1s, C2, C2a, C2b, C3, C3a, C3b, C4, C4a, C4b, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9, factor B, factor D, factor H, properdina, esclerostina, fibrinógeno, fibrina, protrombina, trombina, factor de tejido, factor V, factor Va, factor VII, factor Vlla, factor VIII, factor Villa, factor IX, factor IXa, factor X, factor XA, factor XI, factor Xla, factor XII, factor XI la, factor XIII, factor XI I la, TFPI, antitrombina III, EPCR, trombomodulina, TAPI, tPA, plasminógeno, plasmina, PAI-1, PAI-2, GPC3, Sindecano-1, Sindecano-2, Sindecano-3, Sindecano-4, LPA, y S1P y moléculas del receptor soluble para una hormona o factor de crecimiento, que no se anclan a las células en el fluido corporal de los organismos.
"Epítopo" se entiende un antigénico determinante en un antígeno, y se refiere a un sitio de antígeno al cual se une el dominio de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno descrita en la presente. Así, por ejemplo, el epítopo se puede definir de acuerdo con su estructura. Alternativamente, el epítopo se puede definir de acuerdo con la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno que reconozca el epítopo. Cuando el antígeno es un péptido o un polipéptido, el epítopo se puede especificar mediante los residuos de aminoácidos que forman el epítopo. Alternativamente, cuando el epítopo es una cadena de azúcar, el epítopo se puede especificar por su estructura específica de cadena de azúcar.
Un epítopo lineal es un epítopo que contiene un epítopo cuya secuencia de aminoácido primaria se reconozca. Tal epítopo lineal contiene comúnmente por lo menos tres y más comúnmente por lo menos cinco, por ejemplo, aproximadamente 8 a 10 o 6 a 20 aminoácidos en su secuencia específica.
En contraste con el epítopo lineal, el "epítopo conformacional" es un epítopo en el cual la secuencia de aminoácido primaria que contiene el epítopo no es el único factor determinante del epítopo reconocido (por ejemplo, la secuencia de aminoácido primaria de un epítopo conformacional no es reconocida necesariamente por un anticuerpo que define el epítopo). Los epítopos conformacionales pueden contener un mayor número de aminoácidos comparados a los epítopos lineales. Un anticuerpo que reconoce el epítopo conformacional reconocerá la estructura tridimensional de un péptido o de una proteína. Por ejemplo, cuando una molécula de proteína dobla y forma una estructura tridimensional, se alinean los aminoácidos y/o las cadenas principales del polipéptido que forman un epítopo conformacional, y el epítopo es hecho reconocible por el anticuerpo. Los métodos para determinar las conformaciones de epítopo incluyen, por ejemplo, la cristalografía de rayos X, la resonancia magnética nuclear bidimensional, etiquetado de giro específico al sitio, y la resonancia paramagnética de electrón, pero no se limitan a las mismas. Ver, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology (1996), Vol. 66, Morris (ed.) Actividad de Unión Los ejemplos de un método para evaluar la unión al epítopo mediante una molécula de unión al antígeno de prueba que contiene un dominio de unión al antígeno de IL-6R se describen más adelante. De acuerdo con los ejemplos más adelante, los métodos para determinar la unión la epítopo mediante una molécula de unión al antígeno de prueba que contiene un dominio de unión al antígeno para un antígeno con excepción de IL-6R, pueden también ser conducidos apropiadamente.
Por ejemplo, si una molécula de unión al antígeno de prueba que contiene un dominio de unión al antígeno de IL-6R reconoce un epítopo lineal en la molécula de IL-6R se puede confirmar, por ejemplo, de acuerdo como se menciona más adelante. Un péptido lineal que comprende una secuencia de aminoácido que forma el dominio extracelular de IL-6R se sintetiza para el propósito anterior. El péptido se puede sintetizar químicamente, u obtener mediante técnicas de ingeniería genética usando una región que codifica la secuencia de aminoácido que corresponde al dominio extracelular en un cADN de IL-6R. Entonces, una molécula de unión al antígeno de prueba que contiene un dominio de unión al antígeno de IL-6R se determina para su actividad de unión hacia un péptido lineal que comprende la secuencia de aminoácido que forma el dominio extracelular. Por ejemplo, un péptido lineal inmovilizado se puede usar como un antígeno mediante ELISA para evaluar la actividad de unión de la molécula de unión al antígeno hacia el péptido. Alternativamente, la actividad de unión hacia un péptido lineal se puede determinar basada en el nivel que el péptido lineal inhibe la unión de la molécula de unión al antígeno a las células de expresión de IL-6R. Estas pruebas pueden demostrar la actividad de unión de la molécula de unión al antígeno hacia el péptido lineal.
Si una molécula de unión al antígeno de prueba que contiene un dominio de unión al antígeno de IL-6R reconoce un epítopo conformacional se puede determinar cómo sigue. Las células de expresión de IL-6R se preparan para el propósito anterior. Una molécula de unión al antígeno de prueba que contiene un dominio de unión al antígeno de IL-6R se puede determinar para reconocer un epítopo conformacional cuando se une fuerte a las células de expresión de IL-6R al entrar en contacto, pero no une sustancialmente a un péptido lineal inmovilizado que comprende una secuencia de aminoácido que forma el dominio extracelular de IL-6R. En la presente, "no unido sustancialmente" se entiende que la actividad de unión es del 80% o menos, generalmente del 50% o menos, preferiblemente del 30% o menos, y particularmente preferiblemente del 15% o menos comparado con la actividad de unión hacia las células de expresión de IL-6R humana.
Los métodos para ensayar la actividad de unión de una molécula de unión al antígeno de prueba que contiene un dominio de unión al antígeno de IL-6R hacia las células de expresión de IL-6R incluyen, por ejemplo, los métodos descritos en Antibodies: A Laboratory Manual (Ed Harlow, David Lañe, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 359-420). Específicamente, la valoración se puede realizar basada en el principio de ELISA o clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés) usando las células de expresión de IL-6R como antígeno.
En el formato de ELISA, la actividad de unión de una molécula de unión al antígeno de prueba que contiene un dominio de unión al antígeno de IL-6R hacia las células de expresión de IL-6R puede ser determinada cuantitativamente comparando los niveles de Las señales generadas mediante la reacción enzimática. Específicamente, se agregó un complejo del polipéptido de prueba a una placa de ELISA sobre la cual se inmovilizaron las células de expresión de IL-6R. Después, la molécula de unión al antígeno de prueba unida a las células se detecta usando un anticuerpo etiquetado con enzima que reconoce la molécula de unión al antígeno de prueba. Alternativamente, cuando se usa FACS, se preparó una serie de diluciones de una molécula de unión al antígeno de prueba, y el título de unión al anticuerpo para las células de expresión de IL-6R se puede determinar para comparar la actividad de unión de la molécula de unión al antígeno de prueba hacia las células de expresión de IL-6R.
La unión de una molécula de unión al antígeno de prueba hacia un antígeno expresado en la superficie de las células suspendidas en amortiguador o similares se puede detectar usando un citómetro de flujo. Los citómetros de flujo conocidos incluyen, por ejemplo, los siguientes dispositivos: FACSCanto™ II FACSAria™ FACSArray™ FACSVantage™ SE FACSCalibur™ (todos son nombres comerciales de BD Biosciences) EPICS ALTRA HyPerSort Cytomics FC 500 EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC (todos son nombres comerciales de Beckman Coulter).
Los métodos preferibles para ensayar la actividad de unión de una molécula de unión al antígeno de prueba que contiene un dominio de unión al antígeno de IL-6R hacia un antígeno incluyen, por ejemplo, el siguiente método. Primero, las células de expresión de IL-6R se reaccionan con una molécula de unión al antígeno de prueba, y después esta se mancha con un anticuerpo secundario etiquetado de FITC que reconoce la molécula de unión al antígeno. Se diluyó la molécula de unión al antígeno de prueba apropiadamente con un amortiguador adecuado para preparar la molécula en una concentración deseada. Por ejemplo, se puede usar la molécula en una concentración dentro del intervalo de 10 pg/ml a 10 ng/ml. Entonces, la intensidad de fluorescencia y el conteo de células son determinados usando FACSCalibur (BD). La intensidad de fluorescencia obtenida mediante el análisis usando el Software CELL QUEST (BD), es decir, el Valor Media Geométrica, refleja la cantidad del anticuerpo unido a las células. Es decir, la actividad de unión de una molécula de unión al antígeno de prueba, que es representada por la cantidad de la molécula de unión al antígeno de prueba unida, puede ser determinada midiendo el Valor Media Geométrica .
Si una molécula de unión al antígeno de prueba que contiene un dominio de unión al antígeno de IL-6R comparte un epítopo común con otra molécula de unión al antígeno se puede determinar basado en la competición entre las dos moléculas para el mismo epítopo. La competición entre las moléculas de unión al antígeno se puede detectar mediante el ensayo de bloqueo cruzado o similar. Por ejemplo, el ensayo competitivo de ELISA es un ensayo de bloqueo cruzado preferido.
Específicamente, en el ensayo de bloqueo cruzado, la proteína de IL-6R inmovilizada en los pozos de una placa de microtítulo se previamente incuba en presencia o ausencia de una molécula de unión al antígeno competidora candidata, y después se agregó una molécula de unión al antígeno de prueba a la misma. La cantidad de la molécula de unión al antígeno de prueba unida a la proteína de IL-6R en los pozos se correlaciona indirectamente con la capacidad de unión de una molécula de unión al antígeno competidora candidata que compite para la unión al mismo epitopo. Es decir, cuanto mayor es la afinidad de la molécula de unión al antígeno competidora para el mismo epitopo, menor es la actividad de unión de la molécula de unión al antígeno de prueba hacia los pozos recubiertos con proteína de IL-6R.
La cantidad de la molécula de unión al antígeno de prueba unida a los pozos a través de la proteína de IL-6R puede ser determinada fácilmente etiquetando la molécula de unión al antígeno de antemano. Por ejemplo, se midió una molécula de unión al antígeno etiquetada con biotina usando un conjugado de avidina/peroxidasa y un sustrato apropiado. En particular, el ensayo de bloqueo cruzado que usa etiquetas de enzima como peroxidasa es llamado "ensayo competitivo de ELISA". La molécula de unión al antígeno se puede también etiquetar con otras sustancias de etiquetado que permiten la detección o la medición. Específicamente, se conocen radioetiquetas, etiquetas fluorescentes, y similares.
Cuando la molécula de unión al antígeno competidora candidata puede bloquear el unión mediante una molécula de unión al antígeno de prueba que contiene un dominio de unión al antígeno de IL-6R por lo menos del 20%, preferiblemente por lo menos del 20 al 50%, y más preferiblemente por lo menos del 50% comparado a la actividad de unión en un experimento de control conducido en ausencia de la molécula de unión al antígeno competidora, la molécula de unión al antígeno de prueba es determinada para unir sustancialmente al mismo epítopo unido por la molécula de unión al antígeno competidor, o competir para la unión al mismo epítopo.
Cuando la estructura de un epítopo unido por una molécula de unión al antígeno de prueba que contiene un dominio de unión al antígeno de IL-6R ya se ha identificado, si las moléculas de unión al antígeno de prueba y de control comparten un epítopo común puede ser determinado comparar las actividades de unión de las dos moléculas de unión al antígeno hacia un péptido preparado introduciendo mutaciones de aminoácido en el péptido que forma el epítopo.
Para medir las actividades de unión anteriores, por ejemplo, las actividades de unión de la prueba y las moléculas de unión al antígeno de control hacia un péptido lineal en el cual es introducida una mutación se compararon en el formato de ELISA anterior. Además de los métodos de ELISA, la actividad de unión hacia el péptido mutante unido a una columna se puede determinar mediante la prueba de fluidez y las moléculas de unión al antígeno de control en la columna, y después de cuantificar la molécula de unión al antígeno eluído en la solución de elución. Se conocen los métodos para adsorber un péptido mutante a una columna, por ejemplo, en la forma de un péptido de fusión de GST.
Alternativamente, cuando el epítopo identificado es un epítopo conformacional, si las moléculas de unión al antígeno de prueba y el control comparten un epítopo común se puede determinar por el siguiente método. Primero, se prepararon las células de expresión de IL-6R y las células de expresión de IL-6R con una mutación introducida en el epítopo. Se agregaron las moléculas de unión al antígeno de prueba y de control a una suspensión de células preparada suspendiendo estas células en un amortiguador apropiado como PBS. Entonces, las suspensiones de células se lavan apropiadamente con un amortiguador, y se agregó un anticuerpo etiquetado con FITC que reconoce las moléculas de unión al antígeno de prueba y de control al mismo. La intensidad de fluorescencia y el número de células manchadas con el anticuerpo etiquetado son determinados usando FACSCalibur (BD). Se diluyeron las moléculas de unión al antígeno de prueba y de control apropiadamente usando un amortiguador adecuado, y se usaron en las concentraciones deseadas. Por ejemplo, pueden ser usadas en una concentración dentro del intervalo de 10 pg/ml a 10 ng/ml. La intensidad de fluorescencia determinada mediante el análisis usando el Software CELL QUEST (BD), es decir, el Valor Media Geométrica, refleja la cantidad de anticuerpo etiquetado unido a las células. Es decir, las actividades de unión de las moléculas de unión al antígeno de prueba y de control, que son representadas por la cantidad de anticuerpo etiquetado unido, pueden ser determinadas midiendo el Valor Media Geométrica.
En el método anterior, se puede determinar si una molécula de unión al antígeno "no une sustancialmente a las células de expresión de IL-6R mutante", por ejemplo, mediante el siguiente método. Primero, las moléculas de unión al antígeno de prueba y de control unidas a las células que expresan el mutante IL-6R se manchan con un anticuerpo etiquetado. Entonces, es determinada la intensidad de fluorescencia de las células. Cuando se usa FACSCalibur para la detección de fluorescencia mediante la citometría de flujo, la intensidad de fluorescencia determinada se puede analizar usando el Software CELL QUEST. A partir de los Valores Media Geométricas en presencia y ausencia del complejo de polipéptido, el valor de comparación (Media Geométrica ?) se puede calcular de acuerdo con la siguiente fórmula para determinar la relación del aumento en la intensidad de fluorescencia como un resultado de la unión por la molécula de unión al antígeno.
Media Geométrica ? = Media Geométrica (en presencia del complejo de polipéptido)/Media Geométrica (en ausencia del complejo de polipéptido) El valor de la comparación del Media Geométrica (valor de Media Geométrica ? para la molécula de IL-6R mutante) determinado por el análisis anterior, que refleja la cantidad de una molécula de unión al antígeno de prueba unido a las células de expresión de IL-6R mutante, se compara al valor de comparación de Media Geométrica ? que refleja la cantidad de la molécula de unión al antígeno de prueba unida a las células de expresión de IL-6R. En este caso, las concentraciones de la molécula de unión al antígeno de prueba usadas para determinar los valores de comparación de Media Geométrica ? para las células de expresión de IL-6R y las células de expresión de IL-6R mutante se ajustan particularmente preferiblemente para ser iguales o sustancialmente iguales. Una molécula de unión al antígeno que se ha confirmado para reconocer un epítopo en IL-GR se usa como una molécula de unión al antígeno de control.
Si el valor de comparación de Media Geométrica ? de una molécula de unión al antígeno de prueba para las células de expresión de IL-6R mutante es más pequeño que el valor de comparación de Media Geométrica ? de la molécula de unión al antígeno de prueba para las células de expresión de IL-6R por lo menos del 80%, preferiblemente del 50%, más preferiblemente del 30%, y particularmente preferiblemente del 15%, después la molécula de unión al antígeno de prueba "no une sustancialmente a las células de expresión de IL-6R mutante". La fórmula para determinar el valor de Media Geométrica ? (Media Geométrica) se describe en la Guía de Usuario del Software CELL QUEST (BD biosciences). Cuando la comparación muestra que los valores de comparación son sustancialmente equivalentes, el epítopo para las moléculas de unión al antígeno de prueba y de control se puede determinar para ser igual.
Dominio de Unión al Antígeno En la presente, un "dominio de unión al antígeno" puede ser de cualquier estructura siempre y cuando se una a un antígeno de interés. Tales dominios incluyen preferiblemente, por ejemplo: regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera del anticuerpo; un módulo de aproximadamente 35 aminoácidos llamado dominio A que está contenido en el Avímero de proteína de membrana celular in vivo (documentos WO 2004/044011, WO 2005/040229); La adnectina que contiene el dominio 10Fn3 que une a la parte de proteína de fibronectina, una glicoproteína expresada en la membrana celular (WO 2002/032925); El aficuerpo que se compone de una estructura de tres hélices de 58 aminoácidos basado en el andamio del dominio de unión al IgG de la Proteína A (documento WO 1995/001937); Las proteínas de Repetición de Anquirina Diseñadas (DARPins, por sus siglas en inglés) que son una región expuesta en la superficie molecular de las repeticiones de anquirina (AR, por sus siglas en inglés) que tienen una estructura en la cual una subunidad que consiste de una vuelta que comprende 33 residuos de aminoácidos, dos hélices antiparalelas, y un bucle se apila repetidamente (documento WO 2002/020565); Las anticalinas y tales, que son dominios que consisten de cuatro bucles que soportan un lado de una estructura de barril integrada por ocho filamentos antiparalelos circularmente colocados que se conservan altamente entre las moléculas de lipocalina como la lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (documento WO 2003/029462); y la región cóncava formada por la estructura de hoja paralela dentro de la estructura en forma de herradura constituida por repeticiones apiladas del módulo repetido rico en leucina (LRR, por sus siglas en inglés) del receptor de linfocito variable (VLR, por sus siglas en inglés) que no tiene la estructura de inmunoglobulina y se usa en el sistema de inmunidad adquirida en vertebrados sin mandíbula como lamprea y mixino (documento WO 2008/016854). Los dominios de unión al antígeno preferidos de la presente invención incluyen, por ejemplo, los que tienen regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera del anticuerpo. Los ejemplos preferidos de dominios de unión al antígeno incluyen "Fv cadena sencilla (scFv, por sus siglas en inglés)", "cadena sencilla del anticuerpo", "Fv", "Fv2 de cadena sencilla (scFv2, por sus siglas en inglés)", "Fab", y "F(ab')2".
Los dominios de unión al antígeno de moléculas de unión al antígeno de la presente invención pueden unir a un epítopo idéntico. Tal epítopo puede estar presente, por ejemplo, en una proteína que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 15. Alternativamente, el epítopo puede estar presente en la proteína que comprende los aminoácidos en las posiciones 20 a 365 en la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 15. Alternativamente, cada uno de los dominios de unión al antígeno de moléculas de unión al antígeno de la presente invención puede unir a un diferente epítopo. En la presente, el diferente epítopo puede estar presente en, por ejemplo, una proteína que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 15. Alternativamente, el epítopo puede estar presente en la proteína que comprende los aminoácidos en las posiciones 20 a 365 en la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 15.
Motivo de Unión al Calcio El dominio de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno de la presente invención comprende una porción de unión al calcio. La porción de unión al calcio se puede localizar dondequiera dentro del dominio de unión al antígeno, siempre y cuando la actividad de unión al antígeno sea menor bajo una baja condición de concentración de calcio que bajo una alta condición de concentración de calcio. Cuando el dominio de unión al antígeno es una región variable del anticuerpo, el motivo de unión al calcio se puede contener en la región variable de cadena pesada o la región de variable de cadena ligera. Alternativamente, el motivo de unión al calcio se puede contener en las cadenas pesadas y las cadenas ligeras. En otra modalidad no limitante, el motivo de unión al calcio se puede contener en el marco o la secuencia de CDR de la región variable.
Alternativamente, el motivo de unión al calcio se puede contener en el marco y las secuencias de CDR.
En una modalidad no limitante de la presente invención, el motivo de unión al calcio comprende un residuo(s) de aminoácido que altera la actividad molécula de unión al antígeno de la molécula de unión al antígeno dependiendo de la condición de concentración de calcio-ión. Tales residuos de aminoácidos incluyen preferiblemente, por ejemplo, los aminoácidos que tienen una actividad quelante al metal. Los aminoácidos que tienen una actividad quelante al metal incluyen preferiblemente, por ejemplo, serina (Ser (S)), treonina (Thr (T)), asparagina (Asn (N)), glutamina (Gln (Q)), ácido aspártico (Asp (D)), ácido glutámico (Glu (E)), histidina (His (H)), y tirosina (Tyr (Y)). Los motivos de unión al calcio en los dominios de unión al antígenos existentes que tienen una baja actividad de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio que bajo una alta condición de concentración de calcio se pueden usar como un motivo de unión al calcio adecuado de la presente invención. Como ejemplos de tales dominios de unión al antígeno existentes, los motivos de unión al calcio en las regiones variables de los anticuerpos que tienen una baja actividad de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio que bajo una alta condición de concentración de calcio pueden ser usadas preferiblemente; pero no se limitan a los mismos. Tales anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, los anticuerpos del receptor de IL-6 que comprenden las SEC ID NOs: y los anticuerpos IL-6 1 y 2 que comprenden las SEC ID NOs: 25 y 26. Además, se conocen la troponina C, la calmodulina, la parvalbumina, la cadena ligera de miosina, y tales, que tienen varios sitios de unión al ion de Calcio y se asumen para ser derivadas de un origen común en su evolución molecular. Sus motivos de unión se pueden también usar como un motivo de unión al calcio de la presente invención.
Cuando un dominio de unión al antígeno de la presente invención es una región variable del anticuerpo, el motivo de unión al calcio se puede contener en su región variable de cadena pesada o la región variable de cadena ligera. Alternativamente, el motivo de unión al calcio se puede contener en las cadenas pesadas y las cadenas ligeras. En otra modalidad no limitante, el motivo de unión al calcio se puede contener en el marco o la secuencia de CDR de la región variable. Alternativamente, el motivo de unión al calcio se puede contener en el marco y las secuencias de CDR. La cadena pesada o la cadena ligera CDR1, CDR2, y/o CDR3 pueden ser diseñadas de modo que comprenda tales motivos de unión al calcio. Por ejemplo, en una modalidad no limitante de la presente invención, la región variable de cadena ligera de una molécula de unión al antígeno de la presente invención puede ser diseñada para contener el motivo de unión al calcio de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo humano de la SEC ID NO: 41, 63, o 64. Tales motivos de unión al calcio incluyen aquellos en los cuales cualquiera uno o más de los aminoácidos en las posiciones 30, 31, 32, 50, y/o 92 de acuerdo con la numeración de Kabat tienen una actividad quelante al metal. En una modalidad no limitante, tales motivos de unión al calcio incluyen preferiblemente aquellos en los cuales los mismos aminoácidos como uno a cuatro aminoácidos seleccionados de cinco aminoácidos en las posiciones 30, 31, 32, 50, y/o 92 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat en la región variable de cadena ligera del anticuerpo humano de la SEC ID NO: 41, 63, o 64 está contenido en las posiciones del aminoácido correspondientes de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat. En este caso, es preferible que los aminoácidos que tienen una actividad quelante al metal estén contenidos en la región variable de cadena ligera del anticuerpo humano de la SEC ID NO: 41, 63, o 64 en la posición del aminoácidos donde no son idénticos los aminoácidos en las posiciones del aminoácido correspondientes de las cinco posiciones del aminoácido 30, 31, 32, 50, y/o 92 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat en la región variable de cadena ligera a los aminoácidos en estas posiciones. En otra modalidad no limitante de la presente invención, la región variable de cadena pesada de una molécula de unión al antígeno de la presente invención se puede diseñar para tener, por ejemplo, el motivo de unión al calcio de la región variable de cadena pesada de la SEC ID NO: 1. Tales motivos de unión al calcio incluidos aquellos en los cuales los aminoácidos en las posiciones 95, 96, y/o 100a de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat tienen una actividad quelante al metal. En otra modalidad no limitante de la presente invención, la región variable de cadena pesada de una molécula de unión al antígeno de la presente invención se puede diseñar para tener, por ejemplo, el motivo de unión al calcio de la región variable de cadena pesada .de la SEC ID NO: 25. Tales motivos de unión al calcio incluyen aquellos en los cuales los aminoácidos en las posiciones 95 y/o 101 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat tienen una actividad quelante al metal. Los aminoácidos que tienen una actividad quelante al metal incluyen, por ejemplo, serina (Ser (S)), treonina (Thr (T)), asparagina (Asn (N)), glutamina (Gln (Q)), ácido aspártico (Asp (D)), ácido glutámico (Glu (E)), histidina (His (H)), y tirosina (Tyr (Y)). Además, los grupos carbonilo de cadena principal de los aminoácidos en las posiciones descritas antes pueden participar en la unión al ion de Calcio. Sorpresivamente, como se describe en los Ejemplos a continuación, la actividad de unión al ion de Calcio se puede conferir a un dominio de unión al antígeno de interés injertando los aminoácidos desde un motivo de unión al calcio al dominio de unión al antígeno. Es también posible usar apropiadamente una mano EF, que está contenido en el dominio de cadherina y calmodulina; Dominio C2, que está contenido en la proteína cinasa C; Dominio Gla, que está contenido en el Factor IX de la proteína de coagulación de sangre; lectina tipo C, que está contenida en el receptor de asialoglicoproteína y el receptor de unión a mañosa; dominio A, que está contenido en el receptor de LDL; Anexina, dominio tipo-3 di trombospondina, y dominio similar a EGF.
Especificidad "Específico" se entiende que una molécula no muestra cualquier unión significante a las moléculas con excepción de una sola o un número de moléculas del miembro de unión. Además, "específico" también se usa cuando un dominio de unión al antígeno es específico a un epítopo particular entre múltiples epítopos en un antígeno. Cuando un epítopo unido por un dominio de unión al antígeno está contenido en múltiples diferentes antígenos, las moléculas de unión al antígeno que contienen el dominio de unión al antígeno pueden unir a varios antígenos que tienen el epítopo.
Anticuerpo En la presente, "anticuerpo" se refiere a una inmunoglobulina natural o a una inrnunoglobulina producida mediante síntesis parcial o completa. Los anticuerpos se pueden aislar de fuentes naturales como plasma y suero que ocurre naturalmente, o sobrenadantes de cultivo de hibridomas que producen el anticuerpo. Alternativamente, los anticuerpos se pueden sintetizar parcialmente o totalmente usando técnicas como recombinación genética. Los anticuerpos preferidos incluyen, por ejemplo, los anticuerpos de un isotipo de inmunoglobulina o una subclase que pertenece a los mismos. Las inmunoglobulinas humanas conocidas incluyen los anticuerpos de las siguientes nueve clases (isotipos): lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, I g A 1 , lgA2, IgD, IgE, e IgM. De estos isotipos, los anticuerpos de la presente invención incluyen IgG 1 , lgG2, lgG3, e lgG4.
Los métodos para producir un anticuerpo con actividad de unión deseada se conocen por los expertos en la técnica. Más adelante está un ejemplo que describe un método para producir un anticuerpo que une a IL-6R (anticuerpo anti-IL-6R). Los anticuerpos que unen a un antígeno con excepción de IL-6R se pueden también producir de acuerdo con el ejemplo descrito más adelante.
Los anticuerpos anti-IL-6R se pueden obtener como anticuerpos policlonales o monoclonales usando métodos conocidos. Los anticuerpos anti-IL-6R producidos preferiblemente son anticuerpos monoclonales derivados de mamíferos. Tales anticuerpos monoclonales derivados de mamífero incluyen los anticuerpos producidos mediante hibridomas o células hospedadoras transformadas con un vector de expresión que lleva un gen de anticuerpo mediante técnicas de ingeniería genética. Los "anticuerpos humanizados" o los "anticuerpos quiméricos" se incluyen en los anticuerpos monoclonales de la presente invención.
Los hibridomas que producen el anticuerpo monoclonal se pueden producir usando técnicas conocidas, por ejemplo, como se describe más adelante. Específicamente, los mamíferos son inmunizados mediante métodos de inmunización convencionales usando una proteína de IL-6R como un antígeno sensibilizante. Las células inmunes resultantes son fusionadas con las células parentales conocidas mediante métodos de fusión celular convencionales. Entonces, los hibridomas que producen un anticuerpo anti-IL-6R pueden ser seleccionados mediante evaluación para las células que producen el anticuerpo monoclonal usando métodos de evaluación convencionales.
Específicamente, los anticuerpos monoclonales se prepararon como se menciona más adelante. Primero, el gen de IL-6R cuya secuencia de nucleótido se describe en la SEC ID NO: 16 se puede expresar para producir una proteína de IL-6R mostrada en la SEC ID NO: 15, que será usada como un antígeno sensibilizante para la preparación del anticuerpo. Es decir, una secuencia de gen que codifica IL-6R se inserta en un vector de expresión conocido, y las células hospedadoras apropiadas se transforman con este vector. La proteína IL-6R humana deseada es purificada de las células hospedadoras o de sus sobrenadantes de cultivo mediante métodos conocidos. Para obtener la IL-6R soluble de sobrenadantes de cultivo, por ejemplo, una proteína que consiste de los aminoácidos en las posiciones 1 a 357 en la secuencia del polipéptido de IL-6R de la SEC ID NO: 15, como describe en Mullberg et al. (J. Immunol. (1994) 152 (10), 4958-4968), es expresada como una IL-6R soluble, en vez de la proteína de IL-6R de la SEC ID NO: 15. La proteína IL-6R natural purificada se puede también usar como un antígeno sensibilizante.
La proteína IL-6R purificada se puede usar como un antígeno sensibilizante para la inmunización de mamíferos. Un péptido IL-6R parcial se puede también usar como un antígeno sensibilizante. En este caso, un péptido parcial se puede preparar mediante la síntesis química basada en la secuencia de aminoácido de la IL-6R humana, o insertando un gen IL-6R parcial en un vector de la expresión para expresión. Alternativamente, un péptido parcial puede ser producido degradando una proteína de IL-6R con una proteasa. La longitud y la región del péptido IL-6R parcial no se limitan a las modalidades particulares. Una región preferida se puede seleccionar arbitrariamente de la secuencia de aminoácido en las posiciones de aminoácidos 20 a 357 en la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 15. El número de aminoácidos que forma un péptido que se usará como antígeno sensibilizante es preferiblemente por lo menos cinco o más, seises o más, o siete o más. Más específicamente, un péptido de 8 a 50 residuos, más preferiblemente 10 a 30 residuos se puede usar como antígeno sensibilizante.
Para el antígeno sensibilizante, alternativamente es posible usar una proteína de fusión preparada fusionando un polipéptido o un péptido parcial deseado de la proteína de IL-6R con un diferente polipéptido. Por ejemplo, los fragmentos Fe del anticuerpo y las etiquetas de péptido se usaron preferiblemente para producir las proteínas de fusión que se usarán como antígenos sensibilizante. Los vectores para la expresión de tales proteínas de fusión pueden ser construidos por la fusión en los genes de marco que codifican dos o más fragmentos de polipéptido deseados y la inserción del gen de fusión en un vector de expresión como se describe anteriormente. Los métodos para producir las proteínas de fusión se describen en Molecular Cloning 2a ed. (Sambrook, J et al., Molecular Cloning 2a ed., 9.47-9.58 (1989) Cold Spring Harbor Lab. Press). Los métodos para preparar IL-6R para ser usada como un antígeno sensibilizante, y los métodos de inmunización usando IL-6R se describen específicamente en los documentos WO 2003/000883, WO 2004/022754, WO 2006/006693, y similares.
No hay limitación particular en los mamíferos que se inmunizaron con el antígeno sensibilizante. Sin embargo, es preferible seleccionar los mamíferos considerando su compatibilidad con las células madre que se usarán para la fusión celular. En general, los roedores como ratones, ratas, y hámsteres, conejos, y monos son usados preferiblemente.
Los animales anteriores son inmunizados con un antígeno sensibilizante mediante métodos conocidos. Los métodos de inmunización generalmente realizados incluyen, por ejemplo, administración intraperitoneal o subcutánea de un antígeno sensibilizante en mamíferos. Específicamente, un antígeno sensibilizante se diluyó apropiadamente con PBS (Solución salina Amortiguada con Fosfato), solución salina fisiológica, o similares. Si se desea, un adyuvante convencional como el adyuvante completo de Freund se mezcla con el antígeno, y se emulsiona la mezcla. Entonces, el antígeno sensibilizante se administra a un mamífero varias veces de 4 a 21 intervalos al día. Los portadores apropiados se pueden usar en la inmunización con el antígeno sensibilizante. En particular, cuando un péptido parcial de bajo peso molecular se usa como el antígeno sensibilizante, es a veces deseable combinar el péptido del antígeno sensibilizante a una proteína de portador como albúmina o hemocianina de lapa californiana para la inmunización.
Alternativamente, los hibridomas que producen un anticuerpo deseado se pueden preparar usando la inmunización del ADN como se menciona más adelante. La inmunización del ADN es un método de inmunización que confiere la inmunoestimulación que expresa un antígeno sensibilizante en un animal inmunizado como un resultado de administrar un ADN del vector construido para permitir la expresión de un gen codificador de proteína del antígeno en el animal. Con respecto a los métodos de inmunización convencionales en los cuales un antígeno de proteína se administra a los animales que serán inmunizados, se espera que la inmunización del ADN sea superior en que: - la ¡nmunoestimulación puede ser proporcionada, siempre y cuando conserve la estructura de una proteína de membrana como IL-6R; y - no hay necesidad de purificar el antígeno para la inmunización.
Para preparar un anticuerpo monoclonal de la presente invención usando la inmunización del ADN, primero, un ADN que expresa una proteína de IL-6R se administra a un animal que será inmunizado. El ADN que codifica la IL-6R se puede sintetizar mediante métodos conocidos como PCR. El ADN obtenido es insertado en un vector de expresión apropiado, y entonces este se administra a un animal que será inmunizado. Los vectores de expresión preferiblemente usados incluyen, por ejemplo, vectores de expresión comercialmente disponibles como pcADN3.1. Los vectores se pueden administrar a un organismo usando métodos convencionales. Por ejemplo, la inmunización del ADN es realizada usando una pistola de genes para introducir las partículas de oro recubiertas con vector de expresión en las células en el cuerpo de un animal que será inmunizado. Los anticuerpos que reconocieron la IL-6R se pueden también producir mediante los métodos descritos en el documento WO 2003/104453.
Después de inmunizar un mamífero como se describe anteriormente, un aumento en el título de un anticuerpo de unión a la IL-6R se confirmó en el suero. Entonces, las células inmunes se recolectaron del mamífero, y después se sometieron a fusión celular. En particular, los esplenocitos se usaron preferiblemente como células inmunes.
Una célula de mieloma mamífera se usa como una célula que se fusionará con las células inmunes anteriormente mencionadas. Las células de mieloma preferiblemente comprenden un marcador de selección adecuado para la evaluación. Un marcador de selección confiere las características a las células para su supervivencia (o muerte) bajo una condición de cultivo específica. La deficiencia de la hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (más adelante abreviada como deficiencia de HGPRT) y la deficiencia de la timidina cinasa (más adelante abreviada como deficiencia de TK) se conocen como marcadores de selección. Las células con deficiencia de HGPRT o de TK tienen sensibilidad a hipoxantina-aminopterina-timidina (más adelante abreviada como sensibilidad a HAT). Las células sensibles a HAT no pueden sintetizar el ADN en un medio de selección de HAT, y por lo cual son eliminadas. Sin embargo, cuando las células son fusionadas con las células normales, pueden continuar la síntesis del ADN usando la trayectoria de recuperación de las células normales, y por lo tanto pueden crecer incluso en el medio de selección de HAT.
Las células deficientes de HGPRT y deficientes de TK se pueden seleccionar en un medio que contiene 6-azaguanina, 8-tioguanina, (más adelante abreviado como 8AG), o 5'- bromodeoxiuridina, respectivamente. Son asesinadas las células normales debido a que incorporan estos análogos de pirimidina en su ADN. Siempre y cuando, las células que son deficientes en estas enzimas pueden sobrevivir en el medio de selección, puesto que no pueden incorporar estos análogos de pirimidina. Además, un marcador de selección referido como resistencia a G418 proporcionado por el gen resistente a neomicina confiere resistencia a antibióticos de 2-desoxiestreptamina (análogos de gentamicina) . Se conocen varios tipos de células de mieloma que son adecuados para la fusión celular.
Por ejemplo, las células de mieloma incluyendo las siguientes células pueden ser usadas preferiblemente: P3(P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123 (4), 1548-1550); - P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978)81, 1-7); NS-1 (C. Eur. J. Immunol. (1976)6 (7), 511-519); MPC-11 (Cell (1976) 8 (3), 405-415); SP2/0 (Nature (1978) 276 (5685), 269-270); FO (J. Immunol. Methods (1980) 35 (1-2), 1-21); S194/5.XX0.BU.1 (J. Exp. Med. (1978) 148 (1), 313-323); R210 (Nature (1979) 277 (5692), 131-133), etc.
Las fusiones de células entre los inmunocitos y las células de mieloma esencialmente son realizadas usando los métodos conocidos, por ejemplo, un método por Kohler and Milstein ef al. (Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46).
Más específicamente, la fusión celular se puede realizar, por ejemplo, en un medio de cultivo convencional en presencia de un agente promotor de fusión celular. Los agentes promotores de fusión incluyen, por ejemplo, polietilenglicol (PEG, por sus siglas en inglés) y el virus de Sendai (HVJ, por sus siglas en inglés). Si es necesario, una sustancia auxiliar como sulfóxido de dimetilo también se agregó para mejorar la eficacia de fusión.
La relación de células inmunes a células de mieloma puede ser determinada a propia discreción, preferiblemente, por ejemplo, una célula de mieloma para cada uno de los diez inmunocitos. Los medios de cultivo que se usarán para las fusiones de células incluyen, por ejemplo, los medios que son adecuados para el crecimiento de las líneas celulares de mieloma, como el medio RPMI1640 y el medio MEM, y el otro medio de cultivo convencional usado para este tipo de cultivo celular. Además, los suplementos de suero como suero de becerro fetal se pueden agregar preferiblemente al medio de cultivo.
Para la fusión celular, las cantidades predeterminadas de células inmunes anteriores y de células de mieloma se mezclan bien en el medio de cultivo anterior. Entonces, se agregó una solución de PEG (por ejemplo, el peso molecular promedio es de aproximadamente 1,000 a 6,000) previamente entibiada a aproximadamente 37°C a la misma en una concentración de generalmente 30% a 60% (p/v). Esto se mezcla suavemente para producir las células de fusión deseadas (hibridomas). Entonces, un medio de cultivo apropiado mencionado anteriormente se agregó gradualmente a las células, y éste se centrifugó repetidamente para eliminar el sobrenadante. Así, los agentes de fusión celular y tales que son desfavorables al crecimiento del hibridoma pueden ser eliminados.
Los hibridomas así obtenidos se pueden seleccionar mediante el cultivo usando un medio selectivo convencional, por ejemplo, el medio de HAT (un medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina, y timidina). Las células con excepción de los hibridomas deseados (células no fusionadas) pueden ser asesinadas al continuar el cultivo en el medio de HAT anterior por un periodo de tiempo suficiente. Comúnmente, el período es varios días a varias semanas. Entonces, los hibridomas que producen el anticuerpo deseado son evaluados e individualmente clonados mediante métodos de dilución limitantes convencionales.
Los hibridomas así obtenidos se pueden seleccionar usando un medio de selección basado en el marcador de selección poseído por el mieloma usado para la fusión celular. Por ejemplo, células deficientes de HGPRT o de TK se pueden seleccionar mediante el cultivo usando el medio de HAT (un medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina, y timidina). Específicamente, cuando las células de mieloma sensibles a HAT se usaron para la fusión celular, las células exitosamente fusionadas con células normales pueden proliferar selectivamente en el medio de HAT. Las células con excepción de los hibridomas deseados (células no fusionadas) pueden ser asesinadas al continuar el cultivo en el medio de HAT anterior por un periodo de tiempo suficiente. Específicamente, los hibridomas deseados se pueden seleccionar mediante el cultivo por generalmente varios días a varias semanas. Entonces, los hibridomas que producen el anticuerpo deseado son evaluados e individualmente clonados mediante métodos de dilución limitantes convencionales.
Los anticuerpos deseados se pueden seleccionar preferiblemente e individualmente clonar mediante métodos de evaluación basados en la reacción de antígeno/anticuerpo conocida. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal de unión a IL-6R puede unir a IL-6R expresada en la superficie celular. Tal anticuerpo monoclonal se puede evaluación mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés). La FACS es un sistema que determina la unión de un anticuerpo a la superficie celular analizando las células puestas en contacto con un anticuerpo fluorescente usando un haz de láser, y midiendo la fluorescencia emitida desde las células individuales.
Para evaluar los hibridomas que producen un anticuerpo monoclonal de la presente invención mediante la FACS, las células de expresión de IL-6R primero se prepararon. Las células preferiblemente usadas para la evaluación son las células mamíferas en las cuales IL-6R es forzosamente expresada. Como control, la actividad de un anticuerpo para unir la IL-6R de superficie celular se puede selectivamente detectar usando las células mamíferas no transformadas como las células hospedadoras. Específicamente, los hibridomas que producen un anticuerpo monoclonal anti-IL-6R se pueden aislar al seleccionar los hibridomas que producen un anticuerpo que une a las células forzadas para expresar IL-6R, pero no a las células hospedadoras.
Alternativamente, la actividad de un anticuerpo para unir células que expresan IL-6R inmovilizadas se puede determinar basada en el principio de ELISA. Por ejemplo, las células que expresan IL-6R se inmovilizan a los pozos de una placa de ELISA. Los sobrenadantes de cultivo de hibridomas se ponen en contacto con las células inmovilizadas en los pozos, y se detectan los anticuerpos que unen a las células inmovilizadas. Cuando los anticuerpos monoclonales se derivan de ratón, los anticuerpos unidos a las células se pueden detectar usando un anticuerpo de inmunoglobulina anti-ratón. Los hibridomas que producen un anticuerpo deseado que tiene la capacidad de unión al antígeno son seleccionados por la evaluación anterior, y pueden ser clonados mediante un método de dilución limitante o similar.
Los hibridomas que producen el anticuerpo monoclonal así preparados se pueden pasar en un medio de cultivo convencional, y almacenar en nitrógeno líquido durante un largo periodo.
Los hibridomas anteriores son cultivados mediante un método convencional, y los anticuerpos monoclonales deseados se pueden preparar de los sobrenadantes de cultivo. Alternativamente, los hibridomas se administran a y se hacen crecer en mamíferos compatibles, y los anticuerpos monoclonales se prepararon a partir de las ascitis. El método anterior es adecuado para preparar los anticuerpos con alta pureza.
Los anticuerpos codificados mediante genes de anticuerpo que son clonados a partir de células que producen el anticuerpo como los hibridomas anteriores pueden también ser usados preferiblemente. Un gen de anticuerpo clonado se inserta en un vector apropiado, y éste se introduce en un huésped para expresar el anticuerpo codificado por el gen. Los métodos para aislar genes de anticuerpo, al insertar genes en los vectores, y transformar las células hospedadoras ya han sido establecidos, por ejemplo, por Vandamme et al. (Eur. J. Biochem. (1990) 192(3), 767-775). Los métodos para producir los anticuerpos recombinantes también se conocen como se describe más adelante.
Por ejemplo, se preparó un cADN que codifica la región variable (región de V) de un anticuerpo anti-IL-6R a partir de células de hibridoma que expresan el anticuerpo anti-IL-6R. Para este propósito, el ARN total primero se extrae de los hibridomas. Los métodos usados para extraer los mARN a partir de células incluyen, por ejemplo: el método de ultracentrifugación de guanidina (Biochemistry (1979) 18 (24), 5294-5299), y - el método de AGPC (Anal. Biochem. (1987) 162(1), 156- 159) Los mARN extraídos se pueden purificar usando el Kit de Purificación de mARN (GE Healthcare Bioscience) o similares. Alternativamente, los kits para la extracción del mARN total directamente de las células, como el Kit de Purificación de mARN QuickPrep (GE Healthcare Bioscience), están también comercialmente disponibles. Los mARN se pueden preparar a partir de los hibridomas usando tales kits. Los cADN que codifican la región V del anticuerpo se pueden sintetizar a partir de los mARN preparados usando una transcriptasa inversa. Los cADN se pueden sintetizar usando el Kit de Síntesis de cADN de Primer-Filamento de la Transcriptasa Inversa de AMV (Seikagaku Co.) o similares. Además, el kit de amplificación de cADN SMART RACE (Clontech) y el método 5'-RACE basado en PCR (Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1988) 85(23), 8998-9002; Nucleic Acids Res. (1989) 17(8), 2919-2932) se pueden usar apropiadamente para sintetizar y para amplificar los cADN. En tal proceso de síntesis de cADN, los sitios de la enzima de restricción apropiados descritos más adelante se pueden introducir en ambos extremos de un cADN.
Se purificó el fragmento de cADN de interés a partir del producto de PCR resultante, y entonces este se liga a un ADN del vector. Un vector recombinante así se construyó, y se introdujo en E. Coli o similares. Después de la selección de la colonia, el vector recombinante deseado se puede preparar a partir de la £. Coli formadora de colonias. Entonces, si el vector recombinante tiene la secuencia de nucleótido de cADN de interés es probada mediante un método conocido como el método de terminación de cadena de didesoxinucleótido.
El método 5'-RACE que usa los cebadores para amplificar el gen de región variable convenientemente se usa para aislar el gen que codifica la región variable. Primero, una biblioteca de cADN 5'-RACE es construida mediante la síntesis del cADN usando los RNA extraídos a partir de células de hibridoma como un molde. Un kit comercialmente disponible como el kit de amplificación de cADN SMART RACE apropiadamente se usa para sintetizar la biblioteca de cADN 5'-RACE.
El gen del anticuerpo es amplificado mediante la PCR usando la biblioteca de cADN 5'-RACE preparada como un molde. Los cebadores para amplificar el gen de anticuerpo de ratón pueden ser diseñados basados en las secuencias del gen de anticuerpo conocidas. Las secuencias de nucleótido de los cebadores varían dependiendo de la subclase de inmunoglobulina. Por lo tanto, es preferible que la subclase esté determinada de antemano usando un kit comercialmente disponible como el kit de isotipificación de anticuerpo monoclonal de ratón Iso Strip (Roche Diagnostics).
Específicamente, por ejemplo, los cebadores que permiten la amplificación de los genes que codifican las cadenas pesadas ?1, y2a, y2b, y ?3 y las cadenas ligeras ? y ? se usaron para aislar los genes codificadores de IgG de ratón. En general, un cebador que hibridiza a un sitio de región constante cerca de la región variable se usa como un cebador del lado 3' para amplificar un gen de región variable de IgG. Siempre y cuando, un cebador unido a un kit de construcción de biblioteca de cADN 5'RACE se usa como un cebador del lado 5'.
Los productos de PCR así amplificados se usaron para reformar las inmunoglobulinas compuestas de una combinación de cadenas pesadas y ligeras. Un anticuerpo deseado se puede seleccionar usando la actividad de unión a L-6R de una inmunoglobulina reformada como un indicador. Por ejemplo, cuando el objetivo es aislar un anticuerpo contra IL-6R, es más preferido que la unión del anticuerpo a IL-6R es específica. Un anticuerpo de unión a IL-6R se puede evaluación, por ejemplo, mediante las siguientes etapas: (1) poner en contacto una célula que expresan IL-6R con un anticuerpo que comprende la región V codificada por un cADN aislado de un hibridoma; (2) detectar la unión del anticuerpo a la célula que expresa IL-6R; y (3) seleccionar un anticuerpo que une a la célula de expresión de IL-6R.
Se conocen los métodos para detectar la unión de un anticuerpo a las células de expresión de IL-6R. Específicamente, la unión de un anticuerpo a las células de expresión de IL-6R se puede detectar mediante las técnicas descritas antes como FACS. Las muestras inmovilizadas de células de expresión de IL-6R se usaron apropiadamente para determinar la actividad de unión de un anticuerpo.
Los métodos de evaluación del anticuerpo preferidos que usan la actividad de unión como un indicador también incluyen los métodos de selección usando los vectores bacteriófagos. Los métodos de evaluación usando los vectores bacteriófagos son ventajosos cuando los genes del anticuerpo se aislan a partir de bibliotecas de subclase de cadena pesada y de cadena ligera a partir de una población de células de expresión del anticuerpo policlonal. Los genes que codifican las regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera se pueden ligar mediante una secuencia enlazadora apropiada para formar un Fv de cadena sencilla (scFv, por sus siglas en inglés). Los fagos que presentan el scFv en su superficie pueden ser producidos al insertar un gen que codifica el scFv en un vector de fago. Los fagos se ponen en contacto con un antígeno de interés. Entonces, un ADN que codifica el scFv que tiene la actividad de unión de interés puede ser aislado mediante la recolección de los fagos unidos al antígeno. Este proceso se puede repetir como sea necesario para enriquecer el scFv que tiene la actividad de unión de interés.
Después del aislamiento del cADN que codifica la región V del anticuerpo anti-IL-6R de interés, el cADN se digiere con enzimas de restricción que reconocen los sitios de restricción introducidos en ambos extremos del cADN. Las enzimas de restricción preferidas reconocen y dividen una secuencia de nucleótido que ocurre en la secuencia de nucleótido del gen de anticuerpo en una baja frecuencia. Además, un sitio de restricción para una enzima que produce un extremo pegajoso preferiblemente se introduce en un vector o se inserta un fragmento digerido de una copia sencilla en la orientación correcta. El cADN que codifica la región V del anticuerpo anti-IL-6R se digiere como se describe anteriormente, y éste se inserta en un vector de expresión apropiado para construir un vector de expresión del anticuerpo. En este caso, si un gen que codifica la región constante del anticuerpo (región C) y un gen que codifica la región V anterior están en estructura fusionada, se obtiene un anticuerpo quimérico. En la presente, el "anticuerpo quimérico" se entiende que el origen de la región constante es diferente del de la región variable. Así, además de los anticuerpos heteroquiméricos ratón/humano, los anticuerpos haloquiméricos humano/humano, se incluyen en los anticuerpos quiméricos de la presente invención. Un vector de expresión del anticuerpo quimérico puede ser construido al insertar el gen región V anterior en un vector de expresión que ya tiene la región constante. Específicamente, por ejemplo, una secuencia de reconocimiento para una enzima de restricción que suprime el gen de región V anterior se puede colocar apropiadamente en el lado 5' de un vector de expresión que lleva un ADN que codifica una región constante del anticuerpo deseada (región C). Un vector de expresión del anticuerpo quimérico es construido al fusionar en el marco los dos genes digeridos con la misma combinación de enzimas de restricción.
Para producir un anticuerpo monoclonal anti-IL-6R, los genes del anticuerpo se insertan en un vector de expresión de manera que se expresan los genes bajo el control de una región reguladora de expresión. La región reguladora de expresión para la expresión del anticuerpo incluye, por ejemplo, los mejoradores y los promotores. Además, una secuencia de señal apropiada se puede unir al amino terminal de manera que es secretado el anticuerpo expresado al exterior de las células. Por ejemplo, un péptido que tiene la secuencia de aminoácido MGWSCI ILFLVATATGVHS (SEC ID NO: 113) se pueden usar como una secuencia de señal. Siempre y cuando, otras secuencias de señal apropiadas puedan ser unidas. El polipéptido expresado es dividido en el carboxilo terminal de la secuencia anterior, y el polipéptido resultante es secretado al exterior de las células como un polipéptido maduro. Entonces, las células hospedadoras apropiadas se transforman con el vector de expresión, y se obtienen las células recombinantes que expresan el ADN de codificación del anticuerpo anti-IL-6R.
Los ADN que codifica la cadena pesada del anticuerpo (cadena H) y la cadena ligera (cadena L) se inserta por separado en diferentes vectores de expresión para expresar el gen del anticuerpo. Una molécula de anticuerpo que tiene las cadenas H y L se puede expresar mediante cotransfectar la misma célula hospedadora con los vectores en los cuales los genes de cadena H y de cadena L se insertan respectivamente. Alternativamente, las células hospedadoras se pueden transformar con un solo vector de expresión en el cual se insertan los ADN que codifican las cadenas H y L (ver el documento WO 1994011523).
Hay varias combinaciones de célula hospedadora/vector de expresión conocidas para la preparación del anticuerpo al introducir genes aislados del anticuerpo en huéspedes apropiados. Todos estos sistemas de expresión son aplicables para el aislamiento de los dominios de unión al antígeno de la presente invención. Las células eucarióticas apropiadas usadas como células hospedadoras incluyen células animales, células de plantas, y células fungicidas. Específicamente, las células animales incluyen, por ejemplo, las siguientes células. (1) células mamíferas: CHO, COS, mieloma, riñón de hámster bebé (BHK, por sus siglas en inglés), HeLa, Vero, o similares; (2) células de anfibio: oocitos de Xenopus, o similares; y (3) células de insecto: sf9, sf21, Tn5, o similares.
Además, como célula de planta, se conoce un sistema de expresión de gen del anticuerpo usando células derivadas a partir del género de Nicotiana como Nicotiana tabacum. Las células cultivadas en callosidad apropiadamente se pueden usar para transformar las células de plantas.
Además, las siguientes células se pueden usar como células fungicidas: - levaduras: el género Saccharomyces como Saccharomyces serevisiae, y el género Pichia como Pichia pastoris; y - hongos filamentosos: el género Aspergillus como Aspergillus niger.
Además, los sistemas de expresión de gen del anticuerpo que usaron las células procarióticas también se conocen. Por ejemplo, cuando se usan las células bacterianas, las células E. Coli, las células Bacillus subtilis, y similares se pueden usar adecuadamente en la presente invención. Los vectores de expresión que llevan los genes del anticuerpo de interés son introducidos en estás células mediante la transfección. Las células transfectadas se cultivan in vitro, y el anticuerpo deseado se puede preparar a partir del cultivo de células transformadas.
Además de las células hospedadoras descritas antes, los animales transgénicos pueden también ser usados para producir un anticuerpo recombinante. Es decir, el anticuerpo se puede obtener a partir de un animal en el cual se introduce el gen que codifica el anticuerpo de interés. Por ejemplo, el gen del anticuerpo se puede construir como un gen de fusión por la inserción en marco en un gen que codifique una proteína producida específicamente en leche. Se puede usar la ß-caseína de cabra o similares, por ejemplo, como la proteína secretada en leche. Los fragmentos de ADN que contienen el gen fusionado insertado con el gen del anticuerpo se inyectan en un embrión de cabra, y después este embrión se introduce en una cabra hembra. Se pueden obtener los anticuerpos deseados como una proteína fusionada con la proteína de leche a partir de la leche producida por la cabra transgénica llevada a partir de la cabra receptora de embrión (o de progenie de la misma). Además, para aumentar el volumen de leche que contienen el anticuerpo deseado producido por la cabra transgénica, las hormonas se pueden administrar a la cabra transgénica cuanto sea necesario (Ebert, K. M. et al., Bio/Technology (1994) 12 (7), 699-702).
Cuando una molécula de unión al antígeno descrita en la presente se administra a un humano, un dominio de unión al antígeno derivado de un anticuerpo genéticamente recombinante que se ha modificado artificialmente para reducir la antigenicidad heteróloga contra el humano y similares, apropiadamente se puede usar como el dominio de unión al antígeno del complejo. Tales anticuerpos genéticamente recombinantes incluyen, por ejemplo, anticuerpos humanizados. Estos anticuerpos modificados son apropiadamente producidos mediante los métodos conocidos.
Una región variable del anticuerpo usada para producir el dominio de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno descrita en la presente generalmente es formada por tres regiones de determinación complementaria (CDRs, por sus siglas en inglés) que están separadas por cuatro regiones de marco (FRs, por sus siglas en inglés). La CDR es una región que sustancialmente determina la especificidad de unión de un anticuerpo. Las secuencias de aminoácidos de CDR son altamente diversas. Por una parte, las secuencias de aminoácidos formadoras de FR tienen a menudo alta identidad incluso entre los anticuerpos con diferentes especificidades de unión. Por lo tanto, generalmente, la especificidad de unión de cierto anticuerpo se puede introducir a otro anticuerpo mediante la inserción de CDR.
Un anticuerpo humanizado también se llama un anticuerpo humano reformado. Específicamente, se conocen los anticuerpos humanizados preparados mediante la inserción de CDR de un anticuerpo animal no humano como un anticuerpo de ratón a un anticuerpo humano y similar. Las técnicas de ingeniería genética comunes para obtener los anticuerpos humanizados también se conocen. Específicamente, por ejemplo, se conoce la PCR de extensión de traslape como un método para injertar una CDR del anticuerpo de ratón a una FR humana. En la PCR de extensión de traslape, se agregó una secuencia de nucleótido que codifica una CDR del anticuerpo de ratón que se injertará a los cebadores para sintetizar a una FR del anticuerpo humano. Se prepararon los cebadores para cada una de las cuatro FR. Generalmente se considera cuando se injerta una CDR de ratón a una FR humana, seleccionando una FR humana que tiene alta identidad a una FR de ratón es ventajoso para mantener la función de la CDR. Es decir, generalmente es preferible usar una FR humana que comprende una secuencia de aminoácido que tiene alta identidad a la secuencia de aminoácido de la FR adyacente a la CDR de ratón que se injertará.
Las secuencias de nucleótidos que se ligarán se diseñan de modo que serán conectadas entre sí en el marco. Las FR humanas individualmente se sintetizaron usando los cebadores respectivos. Como un resultado, se obtuvieron los productos en los cuales el ADN que codifica la CDR de ratón se une a los ADN que codifican la FR individual. Las secuencias de nucleótido que codifican a las CDR de ratón de cada producto se diseñan de modo que se traslapan entre sí. Entonces, se conduce la reacción de síntesis de hebra complementaria para recocer las regiones de CDR traslapadas de los productos sintetizados usando un gen del anticuerpo humano como molde. Las FR humanas se ligan a través de las secuencias de CDR de ratón por esta reacción.
El gen de región V de longitud completa, en el cual tres CDR y cuatro FR se ligan últimamente, se amplifica usando los cebadores que hibridizan a sus extremos 5' o 3', que se agregaron con secuencias de reconocimiento de enzima de restricción adecuadas. Un vector de expresión para el anticuerpo humanizado puede ser producido al insertar el ADN obtenido como se describe anteriormente y un ADN que codifique una región C del anticuerpo humano en un vector de expresión de modo que se ligarán en la estructura. Después el vector recombinante es transfectado en un huésped para establecer las células recombinantes, se cultivaron las células recombinantes, y se expresó el ADN que codifica el anticuerpo humanizado para producir el anticuerpo humanizado en el cultivo celular (ver, No. de Publicación de Patente Europea EP 239400 y el No. de Publicación de Patente Internacional WO 1996/002576).
Mediante medición cualitativa o cuantitativa y evaluando la actividad de unión al antígeno del anticuerpo humanizado producido como se describe anteriormente, uno puede adecuadamente seleccionar las FR del anticuerpo humano que permite que las CDR formen un sitio de unión al antígeno favorable cuando se ligó a través de las CDR. Se pueden sustituir los residuos de aminoácidos en las FR cuanto sea necesario, de modo que las CDR de un anticuerpo humano reformado formen un sitio de unión al antígeno apropiado. Por ejemplo, las mutaciones de la secuencia de aminoácido se pueden introducir en las FR al aplicar el método de PCR usado para injertar una CDR de ratón en una FR humana. Más específicamente, las mutaciones de la secuencia de nucleótido parciales se pueden introducir en los cebadores que hibridizan a la FR. Las mutaciones de la secuencia de nucleótido se introducen en las FR sintetizadas usando tales cebadores. Las secuencias de FR mutante que tienen las características deseadas pueden ser seleccionadas midiendo y evaluando la actividad del anticuerpo mutante sustituido con aminoácido para unir al antígeno mediante el método anterior (Cáncer Res. (1993) 53: 851-856).
Alternativamente, los anticuerpos humanos deseados pueden ser obtenidos inmunizando los animales transgénicos que tienen el repertorio entero de los genes del anticuerpo humano (ver los documentos WO 1993/012227; WO 1992/003918; WO 1994/002602; WO 1994/025585; WO 1996/034096; WO 1996/033735) por la inmunización del ADN.
Además, las técnicas para la preparación de anticuerpos humanos mediante selección usando bibliotecas del anticuerpo humano también se conocen. Por ejemplo, la región V de un anticuerpo humano es expresada, como un anticuerpo de cadena sencilla (scFv, por sus siglas en inglés) en superficie de fago mediante el método de exhibición de fago. Los fagos que expresan un scFv que une al antígeno pueden ser seleccionados. La secuencia del ADN que codifica la región V del anticuerpo humano que une al antígeno puede ser determinada al analizar los genes de los fagos seleccionados. Es determinada la secuencia de ADN del scFv que une al antígeno. Un vector de expresión es preparado mediante la fusión de la secuencia de región V en el marco con la secuencia de región C de un anticuerpo humano deseado, e insertándolo en un vector de expresión apropiado. El vector de expresión se introduce en las células apropiadas para la expresión como los descritos antes. El anticuerpo humano puede ser producido al expresar el gen de codificación del anticuerpo humano en las células. Estos métodos ya se conocen (ver los documentos WO 1992/001047; WO 1992/020791; WO 1993/006213; WO 1993/011236; WO 1993/019172; WO 1995/001438; WO 19957015388).
Además de las técnicas descritas antes, las técnicas de clonación de la célula B (identificación de cada secuencia codificante del anticuerpo, de clonación y su aislamiento; usada en construir el vector de expresión para preparar cada anticuerpo (lgG1, lgG2, lgG3, o lgG4 en particular); y similares) como se describe en Bernasconi et al. (Science (2002) 298: 2199-2202) o en el documento WO 2008/081008 se pueden usar apropiadamente para aislar los genes del anticuerpo.
Sistema de numeración de EU De acuerdo con los métodos usados en la presente invención, las posiciones del aminoácido asignadas a la CDR y FR del anticuerpo se especifican de acuerdo con la numeración de Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, d., 1987 and 1991)). En la presente, cuando una molécula de unión al antígeno es un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno, los aminoácidos de región variable se indican de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat, siempre y mientras que los aminoácidos de región constante se indican de acuerdo con el sistema de numeración EU basado en las posiciones del aminoácido de Kabat.
Absorción del antígeno en células o que promueven la absorción del antígeno en células En la presente, la "absorción del antígeno en células" mediada por las moléculas de unión al antígeno se entiende que los antígenos se incorporan en las células a través de la endocitosis. En la presente, la "que promueve la absorción del antígeno en células" se entiende que aumenta la velocidad de absorción celular de una molécula de unión al antígeno que ha unido a un antígeno en plasma y/o que disminuye la cantidad de antígeno reciclada al plasma después de la absorción. En la presente invención, la velocidad de absorción en células se puede mejorar comparada a la de la molécula de unión al antígeno antes de reducir su actividad de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio para ser menor bajo que bajo una alta condición de concentración de calcio. Así, en la presente invención, si la absorción del antígeno en las células es facilitada por una molécula de unión al antígeno puede ser determinada basada en un aumento en la velocidad de absorción del antígeno en las células. Se puede calcular la velocidad de absorción del antígeno en las células, por ejemplo, mediante supervisar durante el transcurso del tiempo la reducción en' la concentración del antígeno en el medio de cultivo que contiene las células de expresión de FcRn humano después de agregar el antígeno y la molécula de unión al antígeno al medio, o mediante supervisar durante el transcurso del tiempo la cantidad de absorción del antígeno en las células de expresión de FcRn humano.
Usando los métodos de la presente invención para facilitar la velocidad de absorción del antígeno mediada por la molécula de unión al antígeno en las células, por ejemplo, la velocidad de la eliminación del antígeno del plasma puede ser mejorada al administrar las moléculas de unión al antígeno. Así, si la absorción del antígeno mediada por la molécula de unión al antígeno en las células es facilitada puede también ser determinada, por ejemplo, probando si la velocidad de eliminación del antígeno del plasma es acelerada o si la concentración del antígeno en plasma es reducida al administrar una molécula de unión al antígeno. Específicamente, la reducción de la concentración del antígeno en plasma puede también ser promovida al administrar las moléculas de unión al antígeno de la presente invención.
El número de veces de la unión al antígeno mediante una molécula de unión al antíqeno En la presente, "el número de veces de la unión al antígeno por una molécula de unión al antígeno" se entiende el número de veces de la unión al antígeno que se pueden alcanzar por una molécula de unión al antígeno hasta que sea eliminado debido a la degradación. En la presente, "aumentar el número de veces del unión al antígeno por una molécula de unión al antígeno" se entiende el aumento del número de ciclos que se pueden alcanzar por una molécula de unión al antígeno hasta que sea eliminado debido a la degradación cuando se define como "un ciclo" el proceso en el cual la molécula de unión al antígeno une a un antígeno en plasma, y la molécula de unión al antígeno unida al antígeno se toma en las células, y se disocia del antígeno en el endosoma, y entonces la molécula de unión al antígeno regresa al plasma. En la presente invención, el número de ciclos se puede aumentar comparado al de una molécula de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio no sea menor que bajo una alta condición de concentración de calcio, o a la de la molécula de unión al antígeno antes de reducir su actividad de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio para ser menor que bajo una alta condición de concentración de calcio. Así, si el número de ciclos es aumentado puede ser determinado probando si "la absorción en las células está promovida" como se describe anteriormente o si "la retención de plasma es mejorada" como describe más adelante.
Mejora de la retención de plasma En la presente, la "mejora de la retención de plasma" es intercambiable con el "mejoramiento de los farmacinéticos", la "mejora de los farmacinéticos", los "superiores farmacinéticos", "mejoramiento de la retención de plasma", la "excelencia en la retención de plasma", o la "prolongación de la retención de plasma". Estas frases son sinónimas.
En la presente, la "mejora de la retención de plasma" se entiende no sólo la prolongación del período hasta la eliminación del plasma (por ejemplo, hasta que la molécula de unión al antígeno se degrade intracelularmente o similares y no pueda regresar al plasma) después de la administración de la molécula de unión al antígeno a animales como humanos, ratones, ratas, monos, conejos, y perros, pero también la prolongación de la retención de plasma de la molécula de unión al antígeno en una forma que permita la unión al antígeno (por ejemplo, en una forma libre de antígeno de la molécula de unión al antígeno) durante el período de administración a la eliminación debido a la degradación. Específicamente, la "mejora de la retención de plasma" también incluye la prolongación del período hasta que la eliminación debido a la degradación de la molécula de unión al antígeno no unida a los antígenos (la forma libre de antígeno de molécula de unión al antígeno).
La molécula de unión al antígeno en plasma no puede unir a un nuevo antígeno si la molécula de unión al antígeno ha unido ya a un antígeno. Así, cuanto más largo es el período que la molécula de unión al antígeno no está unido a un antígeno, más largo es el período que él puede unir a un nuevo antígeno (más alta es la oportunidad de unir a otro antígeno). Esto permite la reducción del periodo de tiempo que un antígeno esté libre de la molécula de unión al antígeno in vivo y de la prolongación del período que un antígeno está unido a la molécula de unión al antígeno. La concentración en plasma de la forma libre de antígeno de la molécula de unión al antígeno puede ser aumentada y el período que el antígeno está unido a la molécula de unión al antígeno puede ser prolongado al acelerar la eliminación del antígeno del plasma mediante la administración de la molécula de unión al antígeno. Específicamente, como se usa en la presente, la "mejora de la retención de plasma de una molécula de unión al antígeno" incluye la mejora de cualquier parámetro farmacocinético (como la prolongación de la vida media en plasma, la prolongación del tiempo de retención de plasma promedio, o la reducción de la separación en plasma) de una molécula de unión al antígeno libre de antígeno de la presente invención, la prolongación del período donde un antígeno está unido a la molécula de unión al antígeno después de la administración de la molécula de unión al antígeno, y el mejoramiento de la eliminación del antígeno del plasma por la molécula de unión al antígeno, con respecto a una molécula de unión al antígeno libre de antígeno cuya actividad de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio no sea menor que bajo una alta condición de concentración de calcio, o a una molécula de unión al antígeno libre de antígeno antes de reducir su actividad de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio a ser menor que bajo una alta condición de concentración de calcio.
Si los parámetros farmacinéticos son mejorados puede ser determinado por la determinación de cualquiera de los parámetros, la vida media en plasma, el tiempo de retención de plasma promedio, y la separación de plasma para la molécula de unión al antígeno o la forma libre de antígeno de los mismos ("Farmacinéticos: Enshu-niyoru Rikai (Entendidos a través de la práctica)" Nanzando). Por ejemplo, la concentración en plasma de la molécula de unión al antígeno o la forma libre de antígeno de la misa es determinada después de la administración de la molécula de unión al antígeno a ratones, ratas, monos, conejos, perros, o humanos. Entonces, es determinado cada parámetro. Cuando se prolonga el tiempo de vida media de plasma o retención de plasma promedio, la retención de plasma de la molécula de unión al antígeno se puede juzgar para ser mejorado. Los parámetros se pueden determinar mediante los métodos conocidos por los expertos en la técnica. Los parámetros se pueden determinar apropiadamente, por ejemplo, mediante análisis no compartimental usando el software de análisis de farmacinéticos WinNonlin (Pharsight) de acuerdo con el manual de instrucción anexo. La concentración en plasma de la forma libre de antígeno de la molécula de unión al antígeno se puede determinar mediante los métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, usando el método de ensayo descrito en Clin Pharmacol. abril de 2008; 48(4): 406-17.
En la presente, la "mejora de la retención de plasma" también incluye la prolongación del período donde un antígeno está unido a una molécula de unión al antígeno después de la administración de la molécula de unión al antígeno. Si el período es prolongado donde un antígeno está unido a una molécula de unión al antígeno después de la administración de la molécula de unión al antígeno puede ser determinado basado en el tiempo hasta el aumento en la concentración (relación) midiendo la concentración en plasma del antígeno no unido a la molécula de unión al antígeno (antígeno libre), o la relación de la concentración del antígeno no unido a la molécula de unión al antígeno (concentración del antígeno libre) a la concentración del antígeno total.
En la presente invención, la "concentración del antígeno en plasma" se puede determinar midiendo la concentración en plasma de un antígeno libre de la molécula de unión al antígeno, o la relación de la concentración del antígeno libre de la molécula de unión al antígeno a la concentración del antígeno total, usando los métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, los métodos de medida descritos a pHarm Res. enero de 2006; 23(1): 95-103.
Alternativamente, cuando un antígeno exhibe una función particular in vivo, si el antígeno está unido a una molécula de unión al antígeno que neutraliza la función del antígeno (molécula antagónica) puede ser determinado probando si la función del antígeno está neutralizada. Si la función del antígeno está neutralizada puede ser determinada al ensayar un marcador in vivo que refleje la función del antígeno. Si el antígeno está unido a una molécula de unión al antígeno que active la función del antígeno (molécula agonística) puede ser determinado al ensayar un marcador in vivo que refleje la función del antígeno.
La determinación de la concentración en plasma del antígeno libre de la molécula de unión al antígeno y la relación de la concentración del antígeno libre de la molécula de unión al antígeno a la concentración del antígeno total, al ensayo del marcador in vivo, y tales medidas no están particularmente limitadas; sin embargo, los ensayos se realizan preferiblemente después de que un cierto periodo de tiempo haya pasado después de la administración de la molécula de unión al antígeno. En la presente invención, el período después de la administración de la molécula de unión al antígeno no está particularmente limitado; los expertos en la técnica pueden determinar el período apropiado dependiendo de las propiedades y similares de la molécula de unión al antígeno administrada. Tales períodos incluyen, por ejemplo, un día después de la administración de la molécula de unión al antígeno, tres días después de la administración de la molécula de unión al antígeno, siete días después de la administración de la molécula de unión al antígeno, 14 días después de la administración de la molécula de unión al antígeno, y 28 días después de la administración de la molécula de unión al antígeno.
En la presente invención, es preferida la mejora de la retención de plasma en humanos. Cuando la retención de plasma en humanos es difícil de determinar, se puede predecir basada en la retención de plasma en ratones (por ejemplo, ratones normales, ratones transgénicos que expresan el antígeno humano, ratones transgénicos que expresan el FcRn humano) o monos (por ejemplo, monos cinomolgos).
Disociación de un antígeno dentro de una célula a partir de una molécula de unión al antígeno extracelularmente unida La presente invención es también aplicable como un método para promover la disociación de un antígeno dentro de una célula desde una molécula de unión al antígeno extracelularmente unida. En la presente invención, el antígeno puede disociar desde la molécula de unión al antígeno dondequiera en una célula; sin embargo, es preferido que el antígeno disocie dentro de un endosoma temprano. En la presente invención, "un antígeno disocia dentro de una célula desde una molécula de unión al antígeno extracelularmente unida" no se entiende necesariamente que cada antígeno que ha sido tomado en una célula mediante la extracelularmente unir a la molécula de unión al antígeno disocia de la molécula de unión al antígeno dentro de la célula. Es aceptable que la proporción del antígeno que disocia de la molécula de unión al antígeno dentro de una célula es mayor comparada a una molécula de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio no sea menor que bajo una alta condición de concentración de calcio, o la molécula de unión al antígeno antes de reducir la actividad de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio para ser menor que bajo una alta condición de concentración de calcio. El método para promover la disociación de un antígeno dentro de una célula desde la molécula de unión al antígeno extracelularmente unida se puede también referir como un método para conferir a una molécula de unión al antígeno una propiedad que facilite la promoción de la absorción intracelular de la molécula de unión al antígeno unida a un antígeno, y la promoción de la disociación intracelular del antígeno desde la molécula de unión al antígeno.
Liberación extracelular en una forma libre de antígeno de una molécula de unión al antígeno que se ha tomado en una célula en una forma unida al antígeno La presente invención es también aplicable como un método para mejorar la liberación extracelular en una forma libre de antígeno de una molécula de unión al antígeno que se ha tomado en una célula en la forma unida al antígeno. En la presente invención, la "liberación extracelular en una forma libre de antígeno de una molécula de unión al antígeno que se ha tomado en una célula en una forma unida al antígeno" no se entiende necesariamente que cada molécula de unión al antígeno que ha estado unida a un antígeno y tomada en una célula es liberada en una forma libre del antígeno al exterior de una célula. Es aceptable que la proporción de la molécula de unión al antígeno que se libera en una forma libre de antígeno al exterior de células es mayor comparada a una molécula de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio no sea menor que bajo una alta condición de concentración de calcio, o la molécula de unión al antígeno antes de reducir su actividad de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio para ser menor que bajo una alta condición de concentración de calcio. Es preferido que la molécula de unión al antígeno liberada al exterior de una célula conserve la actividad de unión al antígeno. El método para promover la liberación extracelular en una forma libre de antígeno de una molécula de unión al antígeno que se ha tomado en una célula en forma unida al antígeno se puede también referir como un método para conferir a una molécula de unión al antígeno una propiedad que facilite la promoción de la absorción intracelular de la molécula de unión al antígeno unida a un antígeno, y la promoción de la liberación extracelular de la molécula de unión al antígeno en una forma libre del antígeno.
Condición de la concentración de calcio En la presente, la baja condición de concentración de calcio se entiende comúnmente que la concentración de calcio ionizado es 0.1 µ? a 30 µ?, preferiblemente 0.5 µ? a 10 µ?, y particularmente preferiblemente 1 µ? a 5 µ?, que es comparable a la concentración de calcio ionizado en el endosoma temprano in vivo. Siempre y cuando, en la presente, la alta condición de concentración de calcio se entiende comúnmente que la concentración de calcio ionizado es 100 µ? a 10 mM, preferiblemente 200 µ? a 5 mM, y particularmente preferiblemente 0.5 mM a 2.5 mM, que es comparable a la concentración de calcio ionizado en el plasma (sangre) in vivo.
Así, en la presente, "la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno es menor bajo una baja condición de concentración de calcio que bajo una alta condición de concentración de calcio" se entiende que la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno es menor en una concentración de calcio ionizado de 0.1 µ? a 30 µ? que en una concentración de calcio ionizado de 100 µ? a 10 mM. Preferiblemente se entiende que la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno es menor en una concentración de calcio ionizado de 0.5 µ? a 10 µ? que en una concentración de calcio ionizado de 200 µ? a 5 mM. Particularmente preferiblemente, se entiende que la actividad de unión al antígeno es menor en la concentración de calcio ionizado en el endosoma temprano in vivo que en la concentración de calcio ionizado en plasma in vivo; específicamente, se entiende que la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno es menor en una concentración de calcio ionizado de 1 µ? a 5 µ? que en una concentración de calcio ionizado de 0.5 mM a 2.5 mM.
Mientras tanto, como se usa en la presente, la frase "la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno es menor bajo una baja condición de concentración de calcio que bajo una alta condición de concentración de calcio" es intercambiable con la frase "la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno es más alta bajo una alta condición de concentración de calcio que bajo una baja condición de concentración de calcio". La frase "la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno es menor bajo una baja condición de concentración de calcio que bajo una alta condición de concentración de calcio" también se entiende que la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio está reducida para ser menor que bajo una alta condición de concentración de calcio o la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno bajo una alta condición de concentración de calcio es aumentada para ser más alta que bajo una baja condición de concentración de calcio, al modificar una secuencia de aminoácido en la molécula de unión al antígeno, etc. Es decir, en la presente invención, la relación entre la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio y que bajo una alta condición de concentración de calcio puede ser aumentada. Por ejemplo, de una modalidad, la relación de KD (Ca de 3 µ?)/?? (Ca de 2 mM) se puede aumentar como de describe más adelante. La relación entre la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio y que bajo una alta condición de concentración de calcio se puede aumentar, por ejemplo, bajando la actividad de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio a trasvés de la selección de una molécula de unión al antígeno con baja actividad de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio, o a través de la modificación de una secuencia de aminoácido en la molécula de unión al antígeno; o al aumentar la actividad de unión al antígeno bajo una alta condición de concentración de calcio a través de la selección de una molécula de unión al antígeno con alta actividad de unión al antígeno bajo una alta condición de concentración de calcio, o a través de la modificación de una secuencia de aminoácido en la molécula de unión al antígeno; o por ambas de las mimas.
En la presente, la expresión "la capacidad de unión al antígeno es más débil bajo una baja condición de concentración de calcio que bajo una alta condición de concentración de calcio", se usa a veces en vez de la frase "la actividad de unión al antígeno es menor bajo una baja condición de concentración de calcio que bajo una alta condición de concentración de calcio". Además, la expresión, "que debilita la capacidad de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio de ser menor que bajo una alta condición de concentración de calcio", se usa a veces en vez de la frase "que reduce la actividad de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio para ser menor que bajo una alta condición de concentración de calcio".
FcRn Diferente al receptor Fcy que pertenece a la superfamilia de la inmunoglobulina, FcRn, particularmente FcRn humano, es estructuralmente similar a los polipéptidos del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC, por sus siglas en inglés) de clase I, que exhibe del 22% al 29% de identidad de secuencia a las moléculas de MHC de clase I (Ghetie el al., Immunol. Today (1997) 18 (12): 592-598). El FcRn es expresado como el heterodímero que consiste de la cadena ß o ligera soluble (microglobulina ß2) en complejo con la transmembrana a o la cadena pesada. Como los MHC, la cadena de FcRn a comprende tres dominios extracelulares (a1, a2, y a3) y su dominio citoplásmico corto ancla la proteína sobre la superficie celular. Los dominios a1 y a2 interactúan con el dominio de unión al FcRn de la región de Fe del anticuerpo (Raghavan et al., Immunity (1994) 1 : 303-315).
El FcRn es expresado en la placenta maternal y el saco de York de mamíferos, y está implicado en la transferencia de IgG madre-a-feto. Además, en el intestino delgado neonatal de los roedores, donde se expresa FcRn, FcRn está implicado en la transferencia de IgG maternal a través del epitelio de borde en cepillo del calostro injerido o la leche. El FcRn es expresado en una variedad de otros tejidos y sistemas de células endoteliales de varias especies. El FcRn también es expresado en el endotelio humano adulto, vasos sanguíneos musculares, y capilares sinusoidales hepáticos. El FcRn se cree que desempeña un papel en mantener la concentración de IgG en plasma por la medición del reciclaje de IgG al suero para la unión a IgG. Comúnmente, la unión al FcRn a las moléculas de IgG es estrictamente dependiente del pH. La unión óptima se observa en un intervalo de pH ácido debajo de 7.0.
El FcRn humano cuyo precursor es un polipéptido que tiene la secuencia de señal de la SEC ID NO: 17 (el polipéptido con la secuencia de señal se muestra en la SEC ID NO: 18) forma un complejo con la p2-microglobulina humana in vivo. El FcRn humano soluble en complejo con la p2-microglobulins es producido usando las técnicas de expresión recombinantes convencionales. Los dominios de unión al FcRns de la presente invención se pueden determinar para su actividad de unión a un FcRn humano tan soluble en complejo con 2-microglobulina. En la presente, a menos que se especifique lo contrario, el FcRn humano se refiere a una forma capaz de unir a un dominio de unión al FcRn de la presente invención. Los ejemplos incluyen un complejo entre FcRn humano y p2-microglobulina humana.
Dominio de unión al FcRn Las moléculas de unión al antígeno de la presente invención tienen un dominio de unión al antígeno y un dominio de unión al FcRn humano. El dominio de unión al FcRn humano no es está particularmente limitado, siempre y cuando las moléculas de unión al antígeno exhiban la actividad de unión al FcRn humano en el pH ácido y/o el pH neutral. Alternativamente, el dominio puede tener una actividad de unión al FcRn humano directa o indirecta. Tales dominios incluyen, por ejemplo, la región de Fe de la inmunoglobulina tipo I g G , albúmina, dominio 3 de la albúmina, anticuerpos de FcRn anti-humano, péptidos de FcRn anti-humano, y moléculas de andamio de FcRn anti-humano, todas la cuales tienen la actividad a unir directamente a FcRn humano; y las moléculas que unen a IgG o a la albúmina, que tienen la actividad para indirectamente unir al FcRn humano. Tales dominios preferidos de la presente invención tienen actividad de unión al FcRn humano en los intervalos del pH ácido y neutral. Es posible usar los dominios sin ninguna alteración, siempre y cuando tengan ya actividad de unión al FcRn humano en los intervalos del pH ácido y neutral. Cuando los dominios tienen solamente actividad de unión al FcRn humano débil o ninguna en los intervalos del pH ácido y/o neutral, la actividad de unión al FcRn humano puede ser conferida al alterar los aminoácidos en las moléculas de unión al antígeno. Sin embargo, es preferido que la actividad de unión al FcRn humano en los intervalos del pH ácido y/o neutral sea conferida al alterar los aminoácidos en el dominio de unión al FcRn humano. Alternativamente, los aminoácidos en los dominios que ya tienen actividad de unión al FcRn humano en los intervalos del pH ácido y/o neutral se pueden alterar para aumentar la actividad de unión al FcRn humano. Las alteraciones del aminoácido deseadas en el dominio de unión al FcRn humano pueden ser seleccionadas al comparar la actividad de unión al FcRn humano en los intervalos del pH ácido y/o neutral antes y después de la alteración del aminoácido.
El dominio de unión al FcRn humano preferido es una región que directamente une a FcRn humano. Tales regiones de unión al FcRn humano preferidas incluyen, por ejemplo, las regiones de Fe del anticuerpo. Siempre y cuando, las regiones capaces de unir a un polipéptido como albúmina o IgG, que tienen actividad de unión al FcRn humano, pueden indirectamente unir a FcRn humano a través de la albúmina, IgG, o similares. Así, tal región de unión al FcRn humano de la presente invención puede ser una región que une a un polipéptido que tiene una actividad de unir a la albúmina o el IgG. En particular, es preferido un dominio de unión al FcRn humano con una mayor actividad de unión al FcRn humano en el pH neutral. Un dominio de unión al FcRn humano con una mayor actividad de unión al FcRn humano en el pH neutral se puede seleccionar de antemano. Alternativamente, la actividad de unión al FcRn humano en el pH neutral puede ser conferida o ser aumentada al modificar un aminoácido en una molécula de unión al antígeno.
Las condiciones apropiadas, con excepción del pH en el cual la actividad de unión al FcRn humano es determinada, se pueden seleccionar por los expertos en la técnica. Las condiciones no están particularmente limitadas. Por ejemplo, las medidas se pueden conducir a 37°C usando el amortiguador de MES, como se describe en el documento WO 2009/125825. Siempre y cuando, la actividad de unión al FcRn humano de una molécula de unión al antígeno se puede determinar mediante los métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, usando Biacore (GE Healthcare) o similares. La actividad de unión entre una molécula de unión al antígeno y un FcRn humano puede ser determinada al cargar el FcRn humano o la molécula de unión al antígeno, como un analito a una matriz sobre la cual se inmoviliza la molécula de unión al antígeno o el FcRn humano, respectivamente.
En la presente, la actividad de unión al FcRn humano a pH ácido se entiende la actividad de unión al FcRn humano a pH 4.0 a 6.5, preferiblemente la actividad de unión al FcRn humano a pH 5.5 a 6.5, y particularmente preferiblemente la actividad de unión al FcRn humano a pH 5.8 a 6.0, que es comparable al pH en el endosoma temprano in vivo. Siempre y cuando, la actividad de unión al FcRn humano a pH neutral se entiende la actividad de unión al FcRn humano de pH 6.7 a 10.0, preferiblemente la actividad de unión al FcRn humano de pH 7.0 a pH 8.0, y particularmente preferiblemente la actividad de unión al FcRn humano a pH 7.4, que es comparable al pH en plasma in vivo.
La actividad de unión al FcRn humano a pH neutral se puede conferir a o aumentar en una molécula de unión al antígeno al modificar un aminoácido en la molécula. Por ejemplo, cuando la región de Fe de una inmunoglobulina tipo IgG se usa como el dominio de unión al FcRn humano, la actividad de unión al FcRn humano a pH neutral se puede conferir a o aumentar de una molécula de unión al antígeno al modificar un aminoácido en el dominio de unión al FcRn humano. La región de Fe preferida de la inmunoglobulina tipo IgG que se alterará incluye, por ejemplo, la región de Fe de un IgG natural humano (lgG1, lgG2, lgG3, o lgG4). Los aminoácidos en cualquier sitio se pueden alterar a otros aminoácidos, siempre y cuando la actividad de unión al FcRn humano se confiera o se aumente a pH neutral. Cuando la molécula de unión al antígeno tiene una región de Fe de la IgG 1 humana como el dominio de unión al FcRn humano, es preferido que la molécula tenga alteraciones que refuercen la unión a FcRn humano a pH neutral con respecto al de la I g G 1 natural humana. Los aminoácidos donde tal alteración puede ser alcanzada incluyen, por ejemplo, los aminoácidos en las posiciones 221 a 225, 227, 228, 230, 232, 233 a 241, 243 a 252, 254 a 260, 262 a 272, 274, 276, 278 a 289, 291 a 312, 315 a 320, 324, 325, 327 a 339, 341, 343, 345, 360, 362, 370, 375 a 378, 380, 382, 385 a 387, 389, 396, 414, 416, 423, 424, 426 a 438, 440, y 442 (numeración de EU). Más específicamente, tales alteraciones del aminoácido incluyen, por ejemplo, los enumerados en la Tabla 1. La unión al FcRn humano de la región de Fe de una inmunoglobulina tipo IgG a pH neutral puede ser mejorada (reforzada) usando las alteraciones descritas antes. Además, las alteraciones que pueden reforzar la unión a FcRn humano en del intervalo del pH ácido con respecto a la lgG1 natural humana se muestran como ejemplo en la Tabla 2. Cuando las alteraciones apropiadas que también pueden reforzar la unión al FcRn humano en el intervalo del pH neutral se seleccionan de las alteraciones descritas antes, son aplicables a la presente invención.
La "alteración de aminoácidos" o la "alteración del aminoácido" de un dominio de unión al FcRn comprende la alteración de una secuencia de aminoácido en un dominio de unión al FcRn madre a diferentes secuencias de aminoácidos. Cualquier dominio de unión al FcRn se puede usar como dominio de unión al FcRn madre, siempre y cuando las variantes preparadas al modificar el dominio de unión al FcRn madre puedan unir al FcRn humano en el intervalo del pH neutral. Además, un dominio de unión al FcRn modificado desde un dominio de unión al FcRn madre que ya se ha modificado se puede también usar preferiblemente como un dominio de unión al FcRn de la presente invención. El "dominio de unión al FcRn madre" puede referir al polipéptido por sí mismo, una composición que comprende el dominio de unión al FcRn madre, o una secuencia del polinucleótido que codifica el dominio de unión al FcRn madre. Los dominios de unión al FcRns madre pueden comprender una región de Fe conocida producida a través de la recombinación descrita brevemente en la sección de "anticuerpos". El origen de los dominios de unión al FcRns madre no está limitado, y pueden ser obtenidos de humano o de cualquier organismo no humano. Tales organismos incluyen preferiblemente ratones, ratas, cobayos, hámsteres, gerbils, gatos, conejos, perros, cabras, ovejas, bovinos, caballos, camellos y organismos seleccionados de primates no humanos. En otra modalidad, los dominios de unión al FcRns madre se pueden también obtener de monos cinomolgos, titíes, macacos de la India, chimpancés, o humanos. Los dominios de unión al FcRns madre se pueden obtener preferiblemente de la IgG 1 humana; sin embargo, no se limitan a ninguna clase particular de IgG. Esto se entiende que una región de Fe de la lgG1, lgG2, lgG3, o lgG4 humana se puede usar apropiadamente como un dominio de unión al FcRn madre, y en la presente también se entiende que una región de Fe de una clase o una subclase de IgG arbitraria derivada de cualquier organismo descrito antes se puede usar preferiblemente como un dominio de unión al FcRn madre. Los ejemplos de mutantes IgG que ocurren naturalmente o de formas modificadas se describen en los documentos publicados (Curr. Opin. Biotechnol. (2009) 20 (6): 685-91; Curr. Opin. Immunol. (2008) 20 (4), 460-470; Protein Eng. Des. Sel. (2010) 23 (4): 195-202; WO 2009/086320; WO 2008/092117; WO 2007/041635; and WO 2006/105338); sin embargo, no se limitan a los ejemplos.
Los ejemplos de alteraciones incluyen aquellas con una o más mutaciones, por ejemplo, mutaciones mediante la sustitución de diferentes residuos de aminoácidos por los aminoácidos de los dominios de unión al FcRns madre, mediante la inserción de uno o más residuos de aminoácidos en dominios de unión al FcRns madre, o mediante la supresión de uno o más aminoácidos a partir de los dominios de unión al FcRns madre. Preferiblemente, las secuencias de aminoácidos de los dominios de unión al FcRns alterados comprenden por lo menos una parte de la secuencia de aminoácido de un dominio de unión al FcRn no natural. Tales variantes necesariamente tienen la identidad o similitud de la secuencia menos del 100% de su dominio de unión al FcRn madre. En una modalidad preferida, las variantes tienen identidad o similitud de la secuencia de aminoácido de aproximadamente 75% a menos de 100%, más preferiblemente de aproximadamente 80% a menos de 100%, aún más preferiblemente de aproximadamente 85% o menos de 100%, aún más preferiblemente de aproximadamente 90% a menos de 100%, y aún más preferiblemente de aproximadamente 95% menos de 100% a la secuencia de aminoácido de su dominio de unión al FcRn madre. En una modalidad no limitante de la presente invención, por lo menos un aminoácido es diferente entre un dominio de unión al FcRn modificado de la presente invención y su dominio de unión al FcRn madre. La diferencia del aminoácido entre un dominio de unión al FcRn modificado de la presente invención y su dominio de unión al FcRn madre también se puede preferiblemente especificar basado en las diferencias de aminoácidos en las posiciones del aminoácido particulares descritas antes de acuerdo con el sistema de numeración de EU.
Además, las alteraciones que pueden reforzar la unión a FcRn humano en del intervalo del pH ácido con respecto al IgG humano madre se muestran como un ejemplo en la Tabla 2. Cuando las alteraciones apropiadas que pueden también reforzar la unión a FcRn humano en del intervalo del pH neutral se seleccionan de las alteraciones descritas antes, son aplicables a la presente invención. Siempre y cuando, las combinaciones de alteraciones que pueden reforzar la unión de Fv4-lgG1 a FcRn humano bajo condiciones ácidas se muestran en las Tablas 6-1 y 6-2. Los aminoácidos particularmente preferidos que se alterarán en la región humana de Fe de IgG madre incluyen, por ejemplo, los aminoácidos en las posiciones 237, 238, 239, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 270, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 325, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434, y 436 (Numeración de EU).
Las alteraciones particularmente preferidas incluyen, por ejemplo, una sustitución del aminoácido de Met por Gly en la posición 237; una sustitución del aminoácido de Ala por Pro en la posición 238; una sustitución del aminoácido de Lys por Ser en la posición 239; una sustitución del aminoácido de Me por Lys en la posición 248; una sustitución del aminoácido de Ala, Phe, He, Met, Gln, Ser, Val, Trp, o Tyr por Thr en la posición 250; una sustitución del aminoácido de Phe, Trp, o Tyr por Met en la posición 252; una sustitución del aminoácido de Thr por Ser en la posición 254; una sustitución del aminoácido de Glu por Arg en la posición 255; una sustitución del aminoácido de Asp, Glu, o Gln por Thr en la posición 256; una sustitución del aminoácido de Ala, Gly, Me, Leu, Met, Asn, Ser, Thr, o Val por Pro en la posición 257; una sustitución del aminoácido de His por Glu en la posición 258; una sustitución del aminoácido de Ala por Asp en la posición 265; una sustitución del aminoácido de Phe por Asp en la posición 270; una sustitución del aminoácido de Ala, o Glu por Asn en la posición 286; una sustitución del aminoácido de His por Thr en la posición 289; una sustitución del aminoácido de Ala por Asn en la posición 297; una sustitución del aminoácido de Gly por Ser en la posición 298; una sustitución del aminoácido de Ala por Val en la posición 303; una sustitución del aminoácido de Ala por Val en la posición 305; una sustitución del aminoácido de Ala, Asp, Phe, Gly, His, He, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp, o Tyr por Thr en la posición 307; una sustitución del aminoácido de Ala, Phe, lie, Leu, Met, Pro, Gln, o Thr por Val en la posición 308; una sustitución del aminoácido de Ala, Asp, Glu, Pro, o Arg por Leu o Val en la posición 309; una sustitución del aminoácido de Ala, His, o lie por Gln en la posición 311; una sustitución del aminoácido de Ala, o His por Asp en la posición 312; una sustitución del aminoácido de Lys, o Arg por Leu en la posición 314; una sustitución del aminoácido de Ala, o His por Asn en la posición 315; una sustitución del aminoácido de Ala por Lys en la posición 317; una sustitución del aminoácido de Gly por Asn en la posición 325; una sustitución del aminoácido de Val por lie en la posición 332; una sustitución del aminoácido de Leu por Lys en la posición 334; una sustitución del aminoácido de His por Lys en la posición 360; una sustitución del aminoácido de Ala por Asp en la posición 376; una sustitución del aminoácido de Ala por Glu en la posición 380; una sustitución del aminoácido de Ala por Glu en la posición 382; una sustitución del aminoácido de Ala por Asn o Ser en la posición 384; una sustitución del aminoácido de Asp, o His por Gly en la posición 385; una sustitución del aminoácido de Pro por GIn en la posición 386; una sustitución del aminoácido de Glu por Pro en la posición 387; una sustitución del aminoácido de Ala, o Ser por Asn en la posición 389; una sustitución del aminoácido de Ala por Ser en la posición 424; una sustitución del aminoácido de Ala, Asp, Phe, Gly, His, He, Lys, Leu, Asn, Pro, GIn, Ser, Thr, Val, Trp, o Tyr por Met en la posición 428; una sustitución del aminoácido de Lys por His en la posición 433; una sustitución del aminoácido de Ala, Phe, His, Ser, Trp, o Tyr por Asn en la posición 434; y una sustitución del aminoácido de His por Tyr o Phe en la posición 436 (numeración de EU) en la región del Fe de IgG madre.
Mientras tanto, el número de aminoácidos que se alterarán no está particularmente limitado; y es posible alterar los aminoácidos en solamente un solo sitio o en dos o más sitios.
Las combinaciones de dos o más alteraciones de aminoácidos incluyen, por ejemplo, las mostradas eni, la Tabla 3. Siempre y cuando, las combinaciones de alteraciones que puedan reforzar la unión a FcRn humano en del intervalo del pH ácido con respecto al IgG humano madre se muestran en las Tablas 4-1 a 4-5. Cuando las combinaciones apropiadas de alteraciones que pueden también reforzar la unión a FcRn humano en el intervalo del pH neutral, se seleccionan de las alteraciones descritas antes, son aplicables a la presente invención. Además, las combinaciones de alteraciones que pueden reforzar la unión de Fv4-lgG1 a FcRn humano bajo las condiciones neutrales se muestran en las Tablas 5-1 y 5-2.
La actividad de unión al FcRn humano de una molécula de unión al antígeno en del intervalo del pH neutral puede ser aumentada al sustituir por lo menos un aminoácido seleccionado de estos aminoácidos con un diferente aminoácido.
Tabla 1 Tabla 2 Tabla 3 Tabla 4-1 La Tabla 4-2 es una continuación de la Tabla 4-1. Tabla 4-2 La Tabla 4-3 es una continuación de la Tabla 4-2.
Tabla 4-3 La Tabla 4-4 es una continuación de la Tabla 4-3.
Tabla 4-4 La Tabla 4-5 es una continuación de la Tabla 4-4. [Tabla 4-5] Tabla 5-1 La Tabla 5-2 es una continuación de la Tabla 5-1. Tabla 5-2 Tabla 6-1 La Tabla 6-2 es una continuación de la Tabla 6-1.
Tabla 6-2 Tales alteraciones del aminoácido se pueden introducir apropiadamente usando los métodos conocidos. Por ejemplo, las alteraciones en el dominio de Fe del I gG 1 natural humana se describen en Drug Metab Dispos. enero de 2007. 35(1): 86-94; Int Immunol. 18 de diciembre de 2006, (12): 1759-69; J Biol Chem. 2 de marzo de 2001, 276(9): 6591-604; J Biol Chem. (2007) 282(3): 1709-17; J Immunol. (2002) 169(9): 5171-80; J Immunol. (2009) 182(12): 7663-71; Molecular Cell, Vol. 7, 867-877, abril, 2001; Nat Biotechnol. 15 de julio de 1997, (7): 637-40; Nat Biotechnol. 23 de octubre de 2005, (10): 1283-8; Proc Nati Acad Sci U S A. 5 de diciembre de 2006, 103(49): 18709-14; EP 2154157; US 20070141052; WO 2000/042072; WO 2002/060919; WO 2006/020114; WO 2006/031370; WO 2010/033279; WO 2006/053301; y WO 2009/086320.
De acuerdo con el Diario de Inmunología (2009) 182:7663-7671, la actividad de unión al FcRn humano de la lgG1 natural humana en el intervalo del pH ácido (pH 6.0) es KD de 1.7 µ?, y la actividad es casi indetectable en el intervalo del pH neutral. Así, en una modalidad preferida, la molécula de unión al antígeno que se usará en los métodos de la presente invención incluye las moléculas de unión al antígeno cuya actividad de unión al FcRn humano en del intervalo del pH ácido es KD de 20 µ? o más fuerte, y es idéntica o más fuerte que a la lgG1 natural humana en del intervalo del pH neutral. En una modalidad más preferida, la molécula de unión al antígeno incluye lias moléculas de unión al antígeno cuya actividad de unión al FcRn humano es KD de 2.0 µ? o más fuerte en el intervalo del pH ácido y KD de 40 µ? o más fuerte en el intervalo del pH neutral. En una modalidad aún más preferida, la molécula de unión al antígeno incluye las moléculas de unión al antígeno cuya actividad de unión al FcRn humano es KD de 0.5 µ? o más fuerte en el intervalo del pH ácido y de KD de 15 µ? o más fuerte en el intervalo del pH neutral.
Específicamente, es preferido que la actividad de unión al antígeno es menor bajo una condición del pH ácido que bajo una condición del pH neutral. Los valores de la KD anterior son determinados mediante el método descrito en el Diario de inmunología (2009) 182:7663-7671 (mediante la inmovilización de la molécula de unión al antígeno sobre una matriz y al cargar FcRn humano como el analito).
La constante de disociación (KD, por sus siglas en inglés) se puede usar como un valor de la actividad de unión al FcRn humano. Sin embargo, la IgG 1 natural humana tiene poca actividad de unión al FcRn humano en el intervalo del pH neutral (pH 7.4), y por lo tanto es difícil calcular la actividad como la KD. Los métodos para determinar si la actividad de unión al FcRn humano es más alta que la de la lgG1 natural humana a pH 7.4 incluyen los métodos de valoración al comparar las intensidades de la respuesta de Biacore después de cargar el analitos en la misma concentración. Específicamente, cuando la respuesta después de cargar una matriz de FcRn humano inmovilizada con una molécula de unión al antígeno a pH 7.4 es más fuerte que la respuesta después de la carga del FcRn humano sobre una matriz inmovilizada con Ig G 1 natural humana a pH 7.4, la actividad de unión al FcRn humano de la molécula de unión al antígeno se juzga para ser más alta que la I gG 1 natural humana a pH 7.4.
El pH 7.0 se puede también usar como intervalo del pH neutral. Usando el pH 7.0 como un pH neutral puede facilitar la interacción débil entre el FcRn humano y el dominio de unión al FcRn. Como una temperatura empleada en la condición de ensayo, una afinidad de unión se puede determinar a cualquier temperatura de 10°C a 50°C. Preferiblemente, una temperatura de 15°C a 40°C se emplea para determinar la afinidad de unión entre el dominio de unión al FcRn humano y el FcRn humano. Más preferiblemente, cualquier temperatura desde 20°C a 35°C, como cualquiera de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, y 35°C también se emplea para determinar la afinidad de unión entre el dominio de unión al FcRn humano y el FcRn humano. Una temperatura a 25°C descrita en el Ejemplo 5 es una del ejemplo para la modalidad de esta invención. En una modalidad preferida, una interacción entre el FcRn humano y el dominio de unión al FcRn se puede medir a pH 7.0 y a 25°C como de describe en el Ejemplo 5. La afinidad de unión de la molécula de unión al antígeno al FcRn humano puede ser medir mediante Biacore como de describe en el Ejemplo 3.
En una modalidad más preferida, las moléculas de unión al antígeno de la presente invención tienen actividad de unión al FcRn humano a pH 7.0 y a 25°C que son más fuertes que la IgG humana natural. En una modalidad más preferida, la actividad de unión al FcRn humano a pH 7.0 y a 25°C es 28 veces más fuerte que la IgG humana natural o más fuerte que la KD de 3.2 µ?. En una modalidad más preferida, la actividad de unión al FcRn humano a pH 7.0 y a 25°C es 38 veces más fuerte que IgG humana natural o más fuerte que la KD de 2.3 µ?.
Se usó una lgG1, lgG2, lgG3 o lgG4 humana natural preferiblemente como la IgG humana intacta para un propósito de una referencia de la IgG humana intacta de ser comparada con las moléculas de unión al antígeno para su actividad de unión al FcRn humano o la actividad de unión in vivo. Preferiblemente, una molécula de unión al antígeno de referencia que comprende el mismo dominio de unión al antígeno como una molécula de unión al antígeno de interés y la región de Fe de IgG humana natural de como un dominio de unión al FcRn humano puede ser usada apropiadamente. Más preferiblemente, se usó la I g G 1 humana natural para un propósito de una IgG humana natural de referencia a ser comparada con las moléculas de unión al antígeno para su actividad de unión al FcRn humano o la actividad de unión in vivo.
Más específicamente, las moléculas de unión al antígeno con efecto de largo plazo sobre la actividad para eliminar el antígeno en el plasma descrita en la presente invención tienen actividad de unión al FcRn humano a pH 7.0 y a 25°C dentro de un intervalo de 28 veces a 440 veces más fuerte que la I g G 1 o KD humana natural dentro de un intervalo de 3.0 µ? a 0.2 µ?. Una concentración del antígeno en plasma a largo plazo es determinada por la medición total o la concentración libre de antígeno en plasma y la relación antígeno molar/molécula de unión al antígeno en 2, 4, 7, 14, 28, 56, o 84 días después de la administración de una molécula de unión al antígeno para evaluar el efecto a largo plazo de la molécula de unión al antígeno de la presente invención en actividad para eliminar el antígeno en plasma. Si la reducción de la concentración del antígeno en plasma o la relación del antígeno molar/molécula de unión al antígeno es alcanzada por la molécula de unión al antígeno descrita en la presente invención se puede determinar por la evaluación de la reducción de cualquiera o más de los puntos de tiempo descritos antes.
Aún más específicamente, las moléculas de unión al antígeno con efecto a corto plazo sobre la actividad para eliminar el antígeno en plasma descrita en la presente invención tienen actividad de unión al FcRn humano a pH 7.0 y a 25°C 440 veces más fuerte que la IgG o KD humana natural o más fuerte de 0.2 µ?. Una concentración del antígeno en plasma a corto plazo es determinada por la medición total o la concentración libre del antígeno en plasma y la relación antígeno molar/molécula de unión al antígeno en 15 minutos, 1, 2, 4, 8, 12, o 24 horas después de la administración de una molécula de unión al antígeno para evaluar el efecto a corto plazo de la molécula de unión al antígeno de la presente invención en la actividad para eliminar el antígeno en plasma.
Los métodos de la presente invención son aplicables a cualquier molécula de unión al antígeno sin importar el tipo de antígeno objetivo.
Por ejemplo, cuando la molécula de unión al antígeno es un anticuerpo que une a un antígeno de membrana, el anticuerpo administrado en el cuerpo une al antígeno y entonces se toma a través de la internalización en endosomas en las células junto con el antígeno, siempre y cuando el anticuerpo se mantenga unido al antígeno. Entonces, el anticuerpo desplaza a los lisosomas, siempre y cuando el anticuerpo se mantenga unido al antígeno, y el anticuerpo es degradado por el lisosoma junto con el antígeno. La eliminación de internalización mediada del plasma se llama eliminación dependiente del antígeno y tal eliminación se ha reportado con numerosas moléculas del anticuerpo (Drug Discov Today, enero de 2006; 11(1-2): 81-8). Cuando una sola molécula de anticuerpo de IgG une a los antígenos de una manera bivalente, se internaliza la única molécula de anticuerpo, siempre y cuando el anticuerpo se mantenga unido a las dos moléculas del antígeno, y se degrade en el lisosoma. Por consiguiente, en el caso de los anticuerpos comunes, una molécula del anticuerpo de IgG no puede unir a tres o más moléculas de antígeno. Por ejemplo, una sola molécula del anticuerpo de IgG que tiene una actividad neutralizante no puede neutralizar tres o más moléculas del antígeno.
La retención relativamente prolongada (eliminación lenta) de las moléculas de IgG en el plasma es debido a la función del FcRn humano que se conoce como un receptor de recuperación de las moléculas de IgG. Cuando se toma en endosomas a través de la pinocitosis, las moléculas de IgG unen al FcRn humano expresado en los endosomas bajo una condición ácida en los endosomas. Siempre y cuando las moléculas de IgG que no unen al FcRn humano transfieran a los lisosomas donde se degradan, las moléculas de IgG que están unidas al FcRn humano desplazan a la superficie celular y regresan de nuevo en el plasma mediante la disociación del FcRn humano bajo la condición neutral en el plasma.
Alternativamente, cuando la molécula de unión al antígeno es un anticuerpo que une a un antígeno soluble, el anticuerpo administrado en el cuerpo une al antígeno y entonces se toma en las células, siempre y cuando el anticuerpo se mantenga unido al antígeno. Muchos anticuerpos tomados en las células se liberan al exterior de la célula a través de FcRn. Sin embargo, puesto que los anticuerpos se liberan al exterior de la célula, con los anticuerpos tomados unidos a los antígenos, los anticuerpos no puede unir a los antígenos de nuevo. Así, similar a los anticuerpos que unen a los antígenos de membrana, en el caso de anticuerpos comunes, una molécula del anticuerpo de IgG no pueden unir a tres o más moléculas de antígeno.
Los anticuerpos de unión al antígenos dependientes de la concentración de calcio que fuertemente unen a un antígeno bajo alta condiciones de concentración de calcio en plasma pero disocian del antígeno bajo una bajas condiciones de concentración de calcio en el endosoma pueden disociar del antígeno en el endosoma. Tales anticuerpos de unión al antígenos dependientes de la concentración de calcio pueden unir a los antígenos de muevo cuando son reciclados al plasma mediante el FcRn después de la disociación del antígeno; así, cada anticuerpo puede repetidamente unir a un número de antígenos. Además, el antígeno unido a la molécula de unión al antígeno se disocia en el endosoma y no se recicla al plasma. Esto facilita la absorción del antígeno mediado con la molécula de unión al antígeno en las células. Así, la administración de una molécula de unión al antígeno puede mejorar la eliminación del antígeno y de tal modo reduce la concentración del antígeno en plasma.
Moléculas de unión al antígeno La presente invención proporciona las moléculas de unión al antígeno que tienen un dominio de unión al antígeno y un dominio de unión al FcRn humano, donde la actividad de unión al antígeno de las moléculas de unión al antígeno es diferente bajo dos diferentes condiciones de concentración de calcio y es menor bajo una baja condición de concentración de calcio que bajo una alta condición de concentración de calcio.
Las moléculas de unión al antígeno de la presente invención no están particularmente limitadas, siempre y cuando incluyan un dominio de unión al antígeno que tenga mayor actividad de unión específica a un antígeno objetivo. Tales dominios de unión al antígeno preferidos comprenden, por ejemplo, los dominios que tienen una región de unión al antígeno de un anticuerpo. La región de unión al antígeno de un anticuerpo comprende, por ejemplo, las CDR y las regiones variables. Cuando la región de unión al antígeno de un anticuerpo es CDR, puede contener todas las seis CDR del anticuerpo entero, o una, dos, o más CDR. Cuando las CDR están contenidas como una región de unión en un anticuerpo, pueden comprender las supresiones, sustituciones, adiciones, y/o inserciones del aminoácido, o pueden ser una porción de una CDR.
Por una parte, las moléculas de unión al antígeno que se usarán en los métodos de la presente invención incluyen las moléculas de unión al antígeno que tienen una actividad antagónica (moléculas de unión al antígeno antagónicas), moléculas de unión al antígeno que tienen una actividad agonística (molécula de unión al antígeno agonística), y las moléculas que tienen citotoxicidad. En una modalidad preferida, las moléculas de unión al antígeno comprenden las moléculas de unión al antígeno antagónicas, en particular, las moléculas de unión al antígeno antagónicas que reconocen un antígeno como un receptor o una citocina.
En la presente invención, la molécula de unión al antígeno del interés no está particularmente Ilimitada, y puede ser cualquiera de las moléculas de unión al antígeno. La molécula de unión al antígeno de la presente invención preferiblemente tiene tanto una actividad de unión al antígeno (dominio de unión al antígeno) y un dominio de unión al FcRn humano. En particular, una molécula de unión al antígeno preferida de la presente invención comprende un dominio de unión al FcRn humano.
La molécula de unión al antígeno que comprende tanto un dominio de unión al antígeno y un dominio de unión al FcRn humano incluye, por ejemplo, los anticuerpos. En el contexto de la presente invención, un ejemplo preferido del anticuerpo incluye los anticuerpos de IgG. Cuando el anticuerpo que se usará es un anticuerpo de IgG, el tipo de IgG no está limitado; y un IgG que pertenece a cualquier isotipo (subclase) como IgG 1 , lgG2, lgG3, o lgG4 puede ser usado. Además, las moléculas de unión al antígeno de la presente invención pueden comprender una región constante del anticuerpo, y las mutaciones del aminoácido se pueden introducir en la región constante. Las mutaciones del aminoácido que se introducirán incluyen, por ejemplo, las que refuerzan o deterioran la unión al receptor Fcy (Proc Nati Acad Sci U S A. 14 de marzo 2006; 103(11): 4005-10), pero no se limitan a estos ejemplos. Alternativamente, es también posible alterar la unión dependiente del pH al seleccionar una región constante apropiada como el de lgG2.
Cuando la molécula de unión al antígeno del interés en la presente invención es un anticuerpo, puede ser un anticuerpo derivado de cualquier animal, como un anticuerpo de ratón, anticuerpo humano, anticuerpo de rata, anticuerpo de conejo, anticuerpo de cabra, o anticuerpo de camello. Además, el anticuerpo puede ser un anticuerpo alterado, por ejemplo, un anticuerpo quimérico, y en particular, un anticuerpo alterado incluyendo sustituciones del aminoácido en la secuencia de un anticuerpo humanizado, y similares. Los anticuerpos también incluyen los anticuerpos biespecíficos, los productos de modificación del anticuerpo ligados con varias moléculas, y los polipéptidos que comprenden los fragmentos de anticuerpos.
Los "anticuerpos quiméricos" son anticuerpos preparados al combinar las secuencias derivadas de diferentes animales. Específicamente, el anticuerpo quimérico incluye, por ejemplo, los anticuerpos que tienen regiones variables (V) de cadena pesada y ligera de un anticuerpo de ratón y regiones constante (C) de cadena pesada y ligera de un anticuerpo humano.
Los "anticuerpos humanizados", también referidos como los anticuerpos humanos reformados, son los anticuerpos en los cuales las regiones determinantes de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) de un anticuerpo derivado de un mamífero no humano, por ejemplo, un ratón, se trasplantan en las CDR de un anticuerpo humano. Los métodos para identificar los CDR se conocen (Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health, Bethesda, Md.; Chothia et al., Nature (1989) 342: 877)). Las tecnologías de recombinación genética generales adecuadas para este propósito también se conocen (ver Solicitud de Patente Europea EP 125023; y WO 96/02576).
Un anticuerpo biespecífico se refiere a un anticuerpo que tiene las regiones variables en la misma molécula de anticuerpo que reconocen diferentes epítopos. Un anticuerpo biespecífico puede ser un anticuerpo que reconoce dos o más diferentes antígenos, o un anticuerpo que reconoce dos o más diferentes epítopos en un mismo antígeno.
Además, los polipéptidos que comprenden los fragmentos de anticuerpos incluyen, por ejemplo, fragmentos de Fab, fragmentos F(ab')2, scFvs (Nat Biotechnol. septiembre de 2005; 23(9): 1126-36), anticuerpos de dominio (dAbs) (documentos WO 2004/058821; WO 2003/002609), scFv-Fc (documento WO 2005/037989), dAb-Fc, y proteínas de fusión de Fe. La región de Fe de una molécula que comprende la región de Fe se puede usar como dominio de unión al FcRn humano. Alternativamente, un dominio de unión al FcRn se puede fusionar a estas moléculas.
Además, las moléculas de unión al antígeno que son aplicables a la presente invención pueden ser moléculas similares al anticuerpo. Una molécula similar al anticuerpo (molécula de andamio, molécula de péptido) es una molécula que puede exhibir las funciones al unir a una molécula objetivo (Current Opinión in Biotechnology (2006) 17: 653-658; Current Opinión in Biotechnology (2007) 18: 1-10; Current Opinión in Structural Biology (1997) 7: 463-469; Protein Science (2006) 15: 14-27), e incluyen, por ejemplo, DARPinas (WO 2002/020565), Aficuerpo (WO 1995/001937), Avimer (WO 2004/044011; WO 2005/040229), y Adnectina (WO 2002/032925). Éstos moléculas similares al anticuerpo pueden unir a las moléculas objetivo de una manera dependiente de la concentración de calcio, facilitar la absorción del antígeno en las células mediante las moléculas de unión al antígeno, facilitar la reducción de la concentración del antígeno en plasma al administrar las moléculas de unión al antígeno, y para mejorar la retención de plasma de las moléculas de unión al antígeno, y aumentar el número de veces de la unión al antígeno mediante una sola molécula de unión al antígeno.
Además, la molécula de unión al antígeno puede ser una proteína que resulta de la fusión entre un dominio de unión al FcRn humano y una proteína de receptor que une a un objetivo, e incluye, por ejemplo, las proteínas de fusión de TNFR-Fc, las proteínas de fusión de IL1R-Fc, las proteínas de fusión de VEGFR-Fc, y las proteínas de fusión de CTLA4-Fc (Nat ed. 2003, enero; 9(1): 47-52; BioDrugs. (2006) 20(3): 151-60). Si estas proteínas de fusión del receptor y el dominio de unión al FcRn humano unen a una molécula objetivo de una manera dependiente de la concentración de calcio, es posible facilitar la absorción del antígeno en las células mediante las moléculas de unión al antígeno, facilitar la reducción de la concentración del antígeno en plasma al administrar las moléculas de unión al antígeno, y mejorar la retención de plasma de las moléculas de unión al antígeno, y aumentar el número de veces de la unión al antígeno mediante una sola molécula de unión al antígeno.
Por otra parte, la molécula de unión al antígeno puede ser una proteína de fusión entre una proteína de ligando artificial que une a un objetivo y tiene un efecto neutralizante y un dominio de unión al FcRn humano; y una proteína de ligando artificial incluye, por ejemplo, el IL-6 muíante (EMBO J. 15 de diciembre de 1994; 13(24): 5863-70). Si tales proteínas de fusión del ligando artificial pueden unir a las moléculas objetivo de una manera dependiente de la concentración de calcio, es posible para facilitar la absorción del antígeno en las células mediante las moléculas de unión al antígeno, facilitar la reducción de la concentración del antígeno en plasma al administrar las moléculas de unión al antígeno, mejorar la retención de plasma de moléculas de unión al antígeno, y aumentar el número de veces de la unión al antígeno en una sola molécula de unión al antígeno.
Además, las cadenas de azúcar se pueden modificar en los anticuerpos de la presente invención. Los anticuerpos con las cadenas de azúcar alteradas incluyen, por ejemplo, los anticuerpos con la glicosilación modificada (WO 99/54342 y similares), los anticuerpos que son deficientes en fucosa unida a la cadena de azúcar (WO 00/61739; WO 02/31140; WO 2006/067847; WO 2006/067913), y anticuerpos que tienen cadenas de azúcar con la bisección de GIcNAc (WO 02/79255).
Además de la concentración de calcio ionizado, las condiciones usadas para medir la actividad de unión al antígeno se pueden seleccionar apropiadamente por los expertos en la técnica, y no están particularmente limitadas. Por ejemplo, las condiciones de usar el amortiguador de HEPES a 37°C se pueden usar para determinar la actividad. Por ejemplo, Biacore (GE Healthcare) o similares se puede usar para determinar la actividad. Cuando el antígeno es un antígeno soluble, la actividad de una molécula de unión al antígeno para unir al antígeno soluble puede ser determinada al cargar el antígeno como un analito sobre una matriz inmovilizada con la molécula de unión al antígeno. Alternativamente, cuando el antígeno es un antígeno tipo membrana, la actividad de la molécula de unión al antígeno para unir al antígeno tipo membrana puede ser determinada al cargar la molécula de unión al antígeno como un analito sobre una matriz con antígeno inmovilizado.
En las moléculas de unión al antígeno de la presente invención, la relación de la actividad de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio a la de bajo una alta condición de concentración de calcio no está particularmente limitada, siempre y cuando la actividad de unión al antígeno sea menor bajo una baja condición de concentración de calcio que bajo una alta condición de concentración de calcio. Sin embargo, el valor de KD (Ca de 3 pM)/KD (Ca de 2 mM), que es una relación de la constante de disociación (KD, por sus siglas en inglés) contra un antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio a la de bajo una alta condición de concentración de calcio, es preferiblemente 2 o mayor, más preferiblemente 10 o mayor, y aún más preferiblemente 40 o mayor. El límite superior del valor de KD (Ca de 3 )/KD (Ca de 2 mM) no está particularmente limitado, y puede ser cualquier valor, por ejemplo, 400, 1,000, o 10,000, siempre y cuando la producción sea posible usando las tecnologías de los expertos en la técnica.
Cuando el antígeno es un antígeno soluble, el valor de la actividad de unión al antígeno se puede presentar en términos de la constante de disociación (KD, por sus siglas en inglés). Por una parte, cuando el antígeno es un antígeno tipo membrana, la actividad se puede presentar en términos de la constante de disociación aparente (KD aparente). La constante de disociación (KD, por sus siglas en inglés) y la constante de disociación aparente (KD aparente) se pueden determinar mediante los métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, usando Biacore (GE Healthcare), gráfica de Scatchard, citómetro de flujo, o similares.
En las moléculas de unión al antígeno de la presente invención, otros parámetros que son representativos de la relación entre las actividades de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio y una alta condición de concentración de calcio incluyen, por ejemplo, la kd constante de velocidad de disociación. Cuando la constante de velocidad de disociación (kd, por sus siglas en inglés) se usa en vez de la constante de disociación (KD, por sus siglas en inglés) como un parámetro representativo de la relación de actividad de unión, el valor de kd (bajo una baja condición de concentración de calcio)/kd (bajo una alta condición de concentración de calcio), que es un relación entre los valores de kd (constante de velocidad de disociación) contra un antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio y una alta condición de concentración de calcio, es preferiblemente 2 o mayor, más preferiblemente 5 o mayor, aún más preferiblemente 10 o mayor, y aún más preferiblemente 30 o mayor. El límite superior del valor de kd (bajo la condición de baja concentración de calcio)/kd (bajo la condición de alto grado de calcio) no está particularmente limitado, y puede ser cualquier valor, por ejemplo, 50, 100, o 200, siempre y cuando la producción sea posible usando las tecnologías de los expertos en la técnica.
Cuando el antígeno es un antígeno soluble, el valor de la actividad de unión al antígeno se puede presentar usando la constante de velocidad de disociación (kd, por sus siglas en inglés). Alternativamente, cuando el antígeno es un antígeno tipo membrana, el valor se puede presentar en términos de kd aparente (constante de velocidad de disociación aparente). La constante de velocidad de disociación (kd, por sus siglas en inglés) y la constante de velocidad de disociación aparente (kd aparente) se pueden determinar mediante los métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, usando Biacore (GE Healthcare), citómetro de flujo, o similares.
En la presente invención, cuando se mide la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno en una diferente concentración de calcio, es preferible usar las mismas condiciones a excepción de la concentración de calcio.
No hay una limitación particular en el método para reducir (debilitar) la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio para ser menor que bajo una alta condición de concentración de calcio (método para conferir una actividad de unión al antígeno dependiente de la concentración de calcio) para obtener una molécula de unión al antígeno que tenga mayor baja actividad de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio que bajo una alta condición de concentración de calcio. Las moléculas de unión al antígeno que tienen una actividad de unión al antígeno (más débil) menor bajo una baja condición de concentración de calcio que bajo una alta condición de concentración de calcio (las moléculas de unión al antígeno que muestran la unión dependiente de la concentración de calcio) se pueden obtener directamente, por ejemplo, al evaluar una biblioteca del anticuerpo exhibida in vitro usando la unión dependiente de la concentración de calcio anterior a un antígeno como un indicador.
Otros métodos incluyen métodos para directamente aislar una molécula de unión al antígeno que tiene la propiedad mencionada anteriormente. Por ejemplo, es posible obtener directamente un anticuerpo que tiene una propiedad de interés al inmunizar los animales (ratones, ratas, hámsteres, conejos, ratones transgénicos de inmunoglobulina humana, ratas transgénicas de inmunoglobulina humana, conejos transgénicas de inmunoglobulina humana, llamas, camellos, etc.) con un antígeno, y evaluar los anticuerpos obtenidos usando la unión del antígeno dependiente de la concentración de calcio como un indicador. Alternativamente, se pueden introducir las mutaciones aleatorias en la secuencia de aminoácido de una molécula de unión al antígeno, y la actividad de unión al antígeno de la molécula de unión al antígeno en diferentes condiciones de concentración de calcio es medida mediante el método mencionado anteriormente para seleccionar una molécula de unión al antígeno que tenga mayor baja actividad de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio que bajo una alta condición de concentración de calcio con respecto a la molécula de unión al antígeno antes de la modificación.
Cuando la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio se reduce (debilita) para ser menor que bajo una alta condición de concentración de calcio (el valor de KD (bajo una baja condición de concentración de calcio)/KD (bajo una alta condición de concentración de calcio) se aumenta) mediante el método mencionado anteriormente o similares, el valor de KD (bajo una baja condición de concentración de calcio)/KD (bajo una alta condición de concentración de calcio) es, sin limitación particular, comúnmente dos veces o más, preferiblemente cinco veces o más, y más preferiblemente diez veces o más en comparación con el anticuerpo original.
Además, usando un método para conferir la actividad de unión al antígeno dependiente de la concentración de calcio de la presente invención, en combinación con un método usando una molécula de unión al antígeno que tiene actividad de unión al FcRn humano en el pH neutral o un método de conferir o de aumentar la actividad de unión al FcRn humano en el pH neutral, es posible mejorar la función de promover la absorción del antígeno en las células, la función de aumentar el número de veces de la unión al antígeno mediante una molécula de unión al antígeno, la función de promover la reducción de la concentración del antígeno en plasma al administrar una molécula de unión al antígeno, o la función de mejorar la retención de plasma de una molécula de unión al antígeno. Los métodos de conferir o de aumentar la actividad de unión al FcRn humano en el pH neutral incluyen, por ejemplo, los métodos descritos antes para modificar los aminoácidos en el dominio de unión al FcRn humano. En la presente, la "actividad de unión al FcRn humano en el pH neutral" se entiende la actividad para unir al FcRn humano a pH 6.7 a 10.0. Una actividad de unión al FcRn humano preferible es, por ejemplo, la actividad de unión al FcRn humano de pH 7.0 a 8.0; y una actividad de unión al FcRn humano más preferible es, por ejemplo, la actividad de unión al FcRn humano a pH 7.4.
Además, usando un método para conferir la actividad de unión al antígeno dependiente de la concentración de calcio de la presente invención, en combinación con un método usando una molécula de unión al antígeno que tiene actividad de unión al antígeno dependiente del pH o un método de conferir una actividad de unión al antígeno dependiente del pH, es posible mejorar la función de promover la absorción del antígeno en las células, la función de aumentar el número de veces de la unión al antígeno mediante una molécula de unión al antígeno, la función de promover la reducción de la concentración del antígeno en plasma al administrar una molécula de unión al antígeno, o la función de mejorar la retención de plasma de una molécula de unión al antígeno. Los métodos de conferir una actividad de unión al antígeno dependiente del pH incluyen, por ejemplo, los métodos descritos en el documento WO 2009/125825.
Específicamente, por ejemplo, una molécula de unión al antígeno dependiente de la concentración de calcio de la presente invención se puede usar en combinación con un método para reducir (debilitar) la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno en el pH ácido para ser menor que en el pH neural. En la presente, "reducir (debilitar) la actividad de unión al antígeno en el pH ácido para ser menor que la actividad de unión al antígeno en el pH neutral" se entiende que reduce la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno de pH 4.0 a 6.5 a ser más bajo que el de pH 6.7 a 10.0. Se entiende preferiblemente el debilitar la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno de pH 5.5 a 6.5 a ser más bajos que el de pH 7.0 a 8.0, y se entiende particularmente preferiblemente el debilitar la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno a pH 5.8 para ser menor que la de a pH 7.4. En la presente, el "pH ácido" se refiere comúnmente de pH 4.0 a 6.5, preferiblemente de pH 5.5 a 6.5, y particularmente preferiblemente a pH 5.8. Siempre y cuando, en la presente el "pH neutral" se refiere comúnmente de pH 6.7 a 10.0, preferiblemente de pH 7.0 a 8.0, y particularmente preferiblemente a pH 7.4.
Por una parte, la frase "que reduce la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno a pH ácido para ser menor que en el pH neutral" es sinónima con el "aumento de la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno en el pH neutral para ser mayor que en el pH ácido". Específicamente, en la presente invención, uno puede aumentar la diferencia entre las actividades de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno en el pH ácido y el pH neutral (por ejemplo, uno puede aumentar el valor de KD (pH 5.8)/KD (pH7.4) como de describe más adelante). La diferencia entre las actividades de unión al antígeno de una molécula de unión ai antígeno en el pH ácido y el pH neutral se puede aumentar, por ejemplo, al reducir la actividad de unión al antígeno en el pH ácido, o aumentando la actividad de unión al antígeno en el pH neutral, o ambos.
En la presente invención, la diferencia entre las actividades de unión al antígeno en el pH ácido y el pH neutral no está particularmente limitada, siempre y cuando la actividad de unión al antígeno sea menor en el pH ácido que en el pH neutral. Sin embargo,, el valor de KD (pH 5.8)/KD (pH 7.4), que es una relación entre las constantes de disociación (KD, por sus siglas en inglés) contra un antígeno a pH 5.8 y pH 7.4, es preferiblemente 2 o mayor, más preferiblemente 10 o mayor, y aún más preferiblemente 40 o mayor. El límite superior del valor de KD (pH 5.8)/KD (pH 7.4) no está particularmente limitado, y puede ser cualquier valor, por ejemplo, 400, 1,000, o 10,000, siempre y cuando la producción sea posible usando las tecnologías de los expertos en la técnica.
En la presente invención, otros parámetros que son representativos de la relación entre las actividades de unión al antígeno en el pH ácido y el pH neutral incluyen, por ejemplo, la constante de velocidad de disociación kd. Cuando la constante de velocidad de disociación (kd, por sus siglas en inglés) se usa en vez de la constante de disociación (KD, por sus siglas en inglés) como un parámetro representativo de la relación de actividad de unión, el valor de kd (pH 5.8)/kd (pH 7.4), que es un relación entre los valores de kd (constante de velocidad de disociación) contra un antígeno a pH 5.7 y pH 7.4, es preferiblemente 2 o mayor, preferiblemente 5 o mayor, aún más preferiblemente 10 o mayor, y aún más preferiblemente 30 o mayor. El límite superior del valor de kd (pH 5.8)/kd (pH 7.4) no está particularmente limitado, y puede ser cualquier valor, por ejemplo, 50, 100, o 200, siempre y cuando la producción sea posible usando las tecnologías de los expertos en la técnica.
Los métodos para conferir una actividad de unión al antígeno dependiente del pH no están particularmente limitados. Tales métodos incluyen, por ejemplo, los métodos para debilitar la actividad de unión al antígeno a pH 5.8 para ser más bajos que la del pH 7.4 al sustituir por lo menos un aminoácido en una molécula de unión al antígeno con histidina, o insertando por lo menos una histidina en una molécula de unión al antígeno. Ya se conoce que la sustitución de un aminoácido en un anticuerpo con histidina puede conferir una actividad de unión al antígeno dependiente del pH al anticuerpo (FEBS Letter, 309(1): 85-88, (1992)). En la presente invención, los sitios de la mutación de histidina (sustitución) o la inserción en una molécula de unión al antígeno no están particularmente limitada, y cualquier sitio se puede usar, siempre y cuando la actividad de unión al antígeno a pH 5.8 llegue a ser más débil que la de a pH 7.4 (el valor de KD (pH5.8)/KD (pH7.4) llega a ser mayor) con respecto antes de la mutación o la inserción. Por ejemplo, cuando la molécula de unión al antígeno es un anticuerpo, tales sitios incluyen una región variable del anticuerpo. El número de sitios de mutación o de inserción de histidina introducidos (o hechos) se puede determinar apropiadamente por los expertos en la técnica. Solamente un sitio se puede sustituir con histidina, o la histidina se puede insertar en solamente un sitio. Alternativamente, dos o más múltiples sitios se pueden sustituir con histidina, o la histidina se puede insertar en dos o más múltiples sitios. Es también posible introducir una mutación, además de la mutación de histidina (mutación en un aminoácido además de la histidina) al mismo tiempo. Además, la mutación de histidina se puede introducir simultáneamente con la inserción de histidina. Es posible sustituir o insertar la histidina aleatoriamente usando un método como exploración de histidina, que usa histidina en vez de alanina en la exploración de alanina conocida por los expertos en la técnica. Alternativamente, una molécula de unión al antígeno cuya KD (pH 5.8)/KD (pH 7.4) se aumenta comparada antes de que la mutación se pueda seleccionar de una biblioteca de moléculas de unión al antígeno en las cuales se ha introducido una mutación o inserción de histidina aleatoria.
Cuando por lo menos un aminoácido en una molécula de unión al antígeno se sustituye con histidina, o por lo menos una histidina se inserta en los aminoácidos de una molécula de unión al antígeno, mientras que no hay ninguna limitación particular, es preferido que la actividad de unión al antígeno de la molécula de unión al antígeno a pH 7.4 después de la sustitución o la inserción de la histidina es comparable a la de a pH 7.4 antes de la sustitución o la inserción de la histidina. En la presente, la frase "la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno a pH 7.4 después de la sustitución o la inserción de la histidina es comparable a la de a pH 7.4 antes de la sustitución o la inserción de la histidina" se entiende que la molécula de unión al antígeno después de la sustitución o la inserción de la histidina conserva el 10% o más, preferiblemente el 50% o más, más preferiblemente el 80% o más, y aún más preferiblemente el 90% o más de la actividad de unión al antígeno antes de la sustitución o la inserción de la histidina. Cuando la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno es deteriorada por una sustitución o inserción de la histidina, la actividad de unión al antígeno se puede hacer para ser comparable a la de antes de la sustitución o la inserción de la histidina al introducir una o más sustituciones, supresiones, adiciones, y/o inserciones del aminoácido en la molécula de unión al antígeno. La presente invención también incluye las moléculas de unión al antígeno que tienen una actividad de unión comparable hecha por una o más sustituciones, supresiones, adiciones, e inserciones del aminoácido después de la sustitución o la inserción de la histidina.
Los métodos alternativos para debilitar la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno a pH 5.8 para ser más bajo que la de a pH 7.4 incluyen métodos para sustituir un aminoácido en una molécula de unión al antígeno con un aminoácido no natural, o insertar un aminoácido no natural en los aminoácidos de una molécula de unión al antígeno. Se conoce que la pKa puede ser artificialmente controlada usando los aminoácidos no naturales (Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 34; Chem Soc Rev. 10 de septiembre de 2004; 33(7): 422-30; Amino Acids. 1999; 16(3-4): 345-79). Así, en la presente invención, los aminoácidos no naturales se pueden usar en vez de la histidina mencionada anteriormente. La sustitución y/o la inserción de un aminoácido no natural se pueden introducir simultáneamente con la sustitución y/o la inserción de la histidina anteriormente mencionada. Cualquier aminoácido no natural se puede usar en la presente invención. Es posible usar los aminoácidos no naturales o similares conocidos por los expertos en la técnica.
Además, cuando la molécula de unión al antígeno es una sustancia que contiene una región constante del anticuerpo, los métodos alternativos para debilitar la actividad molécula de unión al antígeno de la molécula de unión al antígeno a pH 5.8 para ser menor que la de a pH 7.4 incluyen los métodos para modificar la región constante del anticuerpo contenida en la molécula de unión al antígeno. Los ejemplos para modificar una región constante del anticuerpo incluyen los métodos para sustituir una región constante descrita en el documento WO 2009/125825.
Mientras tanto, los métodos paira alterar una región constante del anticuerpo incluyen, por ejemplo, los métodos para determinar varios isotipos de región constante (lgG1, lgG2, lgG3, e lgG4) y seleccionar los isotipos que reducen la actividad de unión al antígeno a pH 5.8 (aumentar la velocidad de disociación a pH 5.8). Tales métodos también incluyen los métodos para reducir la actividad de unión al antígeno a pH 5.8 (que aumenta la velocidad de disociación a pH 5.8) el introducir las sustituciones del aminoácido en las secuencias de aminoácidos de los isotipos tipo silvestre (secuencias de aminoácidos del tipo silvestre lgG1, lgG2, lgG3, o lgG4). La secuencia de la región de bisagra en la región constante del anticuerpo es considerablemente diferente entre los isotipos (lgG1, lgG2, lgG3, e lgG4), y la diferencia en la secuencia de aminoácido de la región de bisagra tiene un gran impacto en la actividad de unión al antígeno. Así, es posible seleccionar un isotipo apropiado para reducir la actividad de unión al antígeno a pH 5.8 (aumentar la velocidad de disociación a pH 5.8) de acuerdo con el tipo de antígeno o de epítopo. Además, puesto que la diferencia en la secuencia de aminoácido de región de bisagra tiene un gran impacto en la actividad de unión al antígeno, los sitios de sustitución del aminoácido preferidos en las secuencias de aminoácidos de los isotipos tipo silvestre se asumen para estar dentro de la región de bisagra.
Cuando la actividad de unión al antígeno de una sustancia de unión al antígeno a pH 5.8 se debilita para ser menor que la de a pH 7.4 (cuando el valor de KD (pH 5.8)/KD (pH 7.4) se aumenta) por el método descrito antes y similares, es generalmente preferiblemente que el valor de KD (pH 5.8)/KD (pH 7.4) sea dos veces o más, preferiblemente cinco veces o más, y más preferibles diez veces o más con respecto al anticuerpo original, pero no se une particularmente al mismo.
Moléculas de unión al antígeno Además, la presente invención proporciona las moléculas de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno difiere en dos diferentes condiciones de concentración de calcio; es decir, la actividad de unión al antígeno es menor bajo una baja condición de concentración de calcio que bajo una alta condición de concentración de calcio. Preferiblemente, la presente invención proporciona las moléculas de unión al antígeno que tienen una baja actividad de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio (concentración de calcio ionizada de 0.1 µ? a 30 µ?) que bajo una alta condición de concentración de calcio (concentración de calcio ionizado de 100 µ? a 10 µ?). Más específicamente, las moléculas de unión al antígeno incluyen las moléculas de unión al antígeno que tienen una baja actividad de unión al antígeno en la concentración de calcio ionizado en el endosoma temprano in vivo (una baja concentración de calcio como 1 µ? a 5 µ?) que en la concentración de calcio ionizado en plasma in vivo (una alta concentración de calcio como 0.5 mM a 2.5 mM).
Con respecto a la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno de la presente invención que tiene una baja actividad de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio que bajo una alta condición de concentración de calcio, no hay limitación en la diferencia en la actividad de unión al antígeno, siempre y cuando la actividad de unión al antígeno sea menor bajo una baja condición de concentración de calcio que bajo una alta condición de concentración de calcio. Es incluso aceptable que la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno es solamente ligeramente menor bajo una baja condición de concentración de calcio.
En una modalidad preferida, para una molécula de unión al antígeno de la presente invención que tiene una baja actividad de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio que bajo una alta condición de concentración de calcio, el valor de KD (baja Ca)/KD (alta Ca), que es la relación de KD entre las bajas y altas condiciones de concentración de calcio, es 2 o más, preferiblemente el valor de KD (baja Ca)/KD (alta Ca) es 10 o más, y preferiblemente el valor de KD (Ca bajo)/KD (alta Ca) es 40 o más. El límite superior del valor de KD (baja Ca)/KD (alta Ca) no está particularmente limitado, y puede ser cualquier valor como 400, 1,000, y 10,000, siempre y cuando pueda ser producido por las técnicas conocidas por los expertos en la técnica.
En otra modalidad preferida, para una molécula de unión al antígeno de la presente invención que tiene una baja actividad de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio que bajo una alta condición de concentración de calcio, el valor de kd (baja Ca)/kd (alta Ca), que es una relación entre los valores de kd para un antígeno a una baja condición de concentración de calcio y a pH 7.4, es 2 o más, preferiblemente el valor de kd (baja Ca)/kd (alta Ca) es 5 o más, más preferiblemente el valor de kd (baja Ca)/kd (alta Ca) es 10 o más, y aún más preferiblemente el valor de kd (baja Ca)/kd (alta Ca) es 30 o más. El límite superior del valor de kd (baja Ca)/kd (alta Ca) no está particularmente limitado, y puede ser cualquier valor como 50, 100, y 200, siempre y cuando pueda ser producido por las técnicas conocidas por los expertos en la técnica.
Una molécula de unión al antígeno de la presente invención puede adicionalmente tener la actividad de unión al FcRn humano anteriormente mencionada bajo una condición del pH neutral. Usando la actividad de unión al FcRn humano bajo una condición del pH neutral en combinación con una actividad de unión al antígeno dependiente de la concentración de calcio, es posible mejorar la función de promover la absorción del antígeno en las células, la función de aumentar el número de veces de la unión al antígeno en una molécula de unión al antígeno, la función de promover la reducción de la concentración del antígeno en plasma al administrar una molécula de unión al antígeno, o la función de mejorar la retención de plasma de una molécula de unión al antígeno.
Una molécula de unión al antígeno de la presente invención puede adicionalmente tener la actividad de unión al antígeno dependiente del pH anteriormente mencionado, es decir, una baja actividad de unión al antígeno bajo una condición del pH ácido que bajo una condición del pM neutral. Usando la actividad de unión al antígeno dependiente del pH en combinación con una actividad de unión al antígeno dependiente de la concentración de calcio, es posible mejorar la función de promover la absorción del antígeno en las células, la función de aumentar el número de veces de la unión al antígeno en una molécula de unión al antígeno, la función de promover la reducción de la concentración del antígeno en plasma al administrar una molécula de unión al antígeno, o la función de mejorar la retención de plasma de una molécula de unión al antígeno.
Además, una molécula de unión al antígeno de la presente invención puede tener cualquier otra propiedad, siempre y cuando tenga una baja actividad de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio que bajo una alta condición de concentración de calcio. Por ejemplo, la molécula de unión al antígeno puede ser una molécula de unión al antígeno agonística o molécula de unión al antígeno antagónica. Las moléculas de unión al antígeno preferidas de la presente invención incluyen, por ejemplo, las moléculas de unión al antígeno antagónicas. Tal molécula de unión al antígeno antagónica es comúnmente una molécula de unión al antígeno que inhibe la transducción de señal intracelular mediada por el receptor al inhibir la unión entre un ligando (agonista) y su receptor.
Además, se confiere una molécula de unión al antígeno al cual la actividad de unión al antígeno dependiente del pH puede tener una sustitución de la histidina por lo menos un aminoácido, o una inserción de por lo menos una histidina.
Mientras tanto, no hay limitación particular en el antígeno al cual una molécula de unión al antígeno de la presente invención une, y la molécula de unión al antígeno puede unir a cualquier antígeno. Tales antígenos incluyen, por ejemplo, los antígenos de membrana como proteínas receptoras (receptores tipo membrana y receptores solubles) y marcadores de superficie celular, y antígenos solubles como citocinas. Los ejemplos específicos de otros antígenos se describen antes.
Métodos de evaluación La presente invención proporciona métodos de evaluación para una molécula de unión al antígeno que tenga mayor baja actividad de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio que bajo una alta condición de concentración de calcio. La presente invención también proporciona métodos de evaluación para una molécula de unión al antígeno que tiene por lo menos una función seleccionada de: (i) función de promover la absorción de un antígeno en las células; (ü) función de unir a un antígeno dos o más veces; (iii) función de promover la reducción de la concentración del antígeno en plasma; y (iii) función de la excelencia en la retención de plasma.
Específicamente, la presente invención proporciona métodos de evaluación para una molécula de unión al antígeno, que comprenden las etapas de (a) a (c) a continuación: (a) determinar la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio; (b) determinar la actividad molécula de unión al antígeno de la molécula de unión al antígeno bajo una alta condición de concentración de calcio; y (c) seleccionar una molécula de unión al antígeno que tenga mayor baja actividad de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio que bajo una alta condición de concentración de calcio.
La presente invención también proporciona métodos de evaluación para una molécula de unión al antígeno, que comprende las etapas de (a) a (c) a continuación: (a) poner en contacto un antígeno con una molécula de unión al antígeno o una biblioteca de moléculas de unión al antígeno bajo una alta condición de concentración de calcio; (b) colocar una molécula de unión al antígeno que une al antígeno en la etapa (a) bajo una baja condición de concentración de calcio; y (c) obtener una molécula de unión al antígeno que disocia en la etapa (b).
La presente invención también proporciona los métodos de evaluación para una molécula de unión al antígeno, que comprende las etapas de (a) a (d) a continuación: (a) poner en contacto un antígeno con una molécula de unión al antígeno o una biblioteca de moléculas de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio; (b) seleccionar una molécula de unión al antígeno que no une al antígeno en la etapa (a); (c) permitir que la molécula de unión al antígeno seleccionada en la etapa (b) una al antígeno bajo una alta condición de concentración de calcio; y (d) obtener una molécula de unión al antígeno que une al antígeno en la etapa (c).
La presente invención también proporciona los métodos de evaluación para una molécula de unión al antígeno, que comprende las etapas de (a) a (c) a continuación: (a) poner en contacto una molécula de unión al antígeno o una biblioteca de moléculas de unión al antígeno con una columna con antígeno inmovilizado bajo una alta condición de concentración de calcio; (b) eluir una molécula de unión al antígeno que une a la columna en la etapa (a) de la columna bajo una baja condición de concentración de calcio; y (c) obtener la molécula de unión al antígeno eluída en la etapa (b).
La presente invención también proporciona los métodos de evaluación para una molécula de unión al antígeno, que comprende las etapas de (a) a (d) a continuación: (a) permitir que una molécula de unión al antígeno o una biblioteca de moléculas de unión al antígeno pase a través de una columna con antígeno inmovilizado bajo una baja condición de concentración de calcio; (b) recolectar una molécula de unión al antígeno eluída sin unir a la columna en la etapa (a); (c) permitir que la molécula de unión al antígeno recolectada en la etapa (b) una al antígeno bajo una alta condición de concentración de calcio; y (d) obtener una molécula de unión aj antígeno que une al antígeno en la etapa (c).
La presente invención también proporciona los métodos de evaluación para una molécula de unión al antígeno, que comprende las etapas de (a) a (d) a continuación: (a) poner en contacto un antígeno con una molécula de unión al antígeno o una biblioteca de moléculas de unión al antígeno bajo una alta condición de concentración de calcio; (b) obtener una molécula de unión al antígeno que une al antígeno en la. etapa (a); (c) colocar la molécula de unión al antígeno obtenida en la etapa (b) bajo una baja condición de concentración de calcio; y (d) obtener una molécula de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno en la etapa (c) es menor que la estándar seleccionada en la etapa (b).
Las etapas anteriores pueden ser repetidas dos o más veces. Así, la presente invención proporciona los métodos de evaluación que además comprenden la etapa de repetir las etapas de (a) a (c), o (a) a (d) dos o más veces en los métodos de evaluación mencionados anteriormente. El número de veces de las etapas (a) a (c) o (a) a (d) se repite no está particularmente limitado, y es generalmente diez o menos.
En los métodos de evaluación de la presente invención, la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio no está particularmente limitada, siempre y cuando sea una actividad de unión al antígeno en una concentración de calcio ionizado de 0.1 µ? a 30 µ?. Preferiblemente, la actividad de unión al antígeno incluye actividades de unión al antígeno en una concentración de calcio ionizado de 0.5 µ? a 10 µ?. Las concentraciones de calcio ionizadas más preferibles incluyen concentraciones de calcio ionizadas en el endosoma temprano in vivo. Específicamente, la actividad de unión al antígeno incluye las actividades de 1 µ? a 5 µ?. Siempre y cuando, la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno bajo una alta condición de concentración de calcio no está particularmente limitada, siempre y cuando sea una actividad de unión al antígeno en una concentración de calcio ionizado de 100 µ? a 10 mM. Preferiblemente, la actividad de unión al antígeno incluye las actividades de unión al antígeno en una concentración de calcio ionizado de 200 µ? a 5 mM. Las concentraciones de calcio ionizado más preferidas incluyen las concentraciones de calcio ionizado en plasma in vivo. Específicamente, la actividad de unión al antígeno incluye las actividades de 0.5 mM a 2.5 mM.
La actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno se puede determinar mediante los métodos conocidos por los expertos en la técnica. Las condiciones apropiadas, además de la concentración de calcio ionizado se pueden seleccionar por los expertos en la técnica. La actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno puede ser determinada usando KD (constante de disociación), KD aparente (constante de disociación aparente), kd de velocidad de disociación (velocidad de disociación), kd aparente (disociación aparente: velocidad de disociación aparente), o similares. Pueden ser determinadas por los métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, usando Biacore (GE Healthcare), gráfica de Scatchard, FACS, o similares.
En la presente invención, la etapa de seleccionar una molécula de unión al antígeno que tenga mayor actividad de unión al antígeno bajo una alta condición de concentración de calcio que bajo una baja concentración de calcio es sinónima con la etapa de seleccionar una molécula de unión al antígeno que tenga mayor baja actividad de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio que bajo una alta condición de concentración de calcio.
La diferencia entre la actividad de unión al antígeno bajo una alta condición de concentración de calcio y la de bajo una baja condición de concentración de calcio no está particularmente limitada, siempre y cuando la actividad de unión al antígeno sea mayor bajo una alta condición de concentración de calcio que bajo una baja condición de concentración de calcio. Sin embargo, la actividad de unión al antígeno bajo una alta condición de concentración de calcio está preferiblemente dos veces o más, más preferiblemente 10 veces o más, y aún más preferiblemente 40 veces o más de la actividad de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio.
Las moléculas de unión al antígeno que se evaluarán mediante el método de evaluación de la presente invención pueden ser cualquier molécula de unión al antígeno. Por ejemplo, las moléculas de unión al antígeno descritas antes pueden ser evaluadas. Por ejemplo, es posible evaluar para las moléculas de unión al antígeno que tienen una secuencia natural o moléculas de unión al antígeno que tienen una secuencia de aminoácido con una sustitución.
Las moléculas de unión al antígeno que se evaluarán mediante el método de evaluación de la presente invención se pueden preparar mediante cualquier método. Es posible usar, por ejemplo, los anticuerpos preexistentes, las bibliotecas preexistentes (bibliotecas de fago, y similares), y los anticuerpos y las bibliotecas preparados a partir de las células B de animales inmunizados o hibridomas preparadas al inmunizar los animales, los anticuerpos o las bibliotecas obtenidas al introducir los aminoácidos capaces de quelar el calcio (por ejemplo, ácido aspártico o ácido glutámico) o las mutaciones de aminoácido no naturales en tales anticuerpos o bibliotecas (bibliotecas con alto contenido de aminoácidos no naturales o aminoácidos capaces de quelar el calcio (por ejemplo, ácido aspártico o ácido glutámico), bibliotecas introducidas con mutaciones de aminoácido no natural o mutaciones con aminoácidos capaces de quelar el calcio (por ejemplo, ácido aspártico o ácido glutámico) en los sitios específicos, o similares), o similares.
Una molécula de unión al antígeno que tiene por lo menos una función seleccionada de: (i) función de promover la absorción del antígeno en las células, (ii) función de unir a un antígeno dos o más veces, (iii) función a promover la reducción de la concentración del antígeno en plasma, y (iv) función de la excelencia en la retención de plasma, puede ser obtenida mediante los métodos de evaluación de la presente invención cuando se administra a los animales como humanos, ratones, y monos. Así, los métodos de evaluación de la presente invención se pueden usar como un método de evaluación para obtener una molécula de unión al antígeno que tiene por lo menos una de las funciones descritas antes.
Además, se espera que tales moléculas de unión al antígeno obtenidas mediante los métodos de evaluación de la presente invención sean especialmente superiores como productos farmacéuticos, debido a que la dosis y la frecuencia de la administración en pacientes pueden ser reducidas, y como un resultado la dosificación total puede ser reducida. Así, los métodos de evaluación de la presente invención se pueden usar como los métodos de evaluación para las moléculas de unión al antígeno para el uso como composiciones farmacéuticas.
Métodos para producir las moléculas de unión al antígeno La presente invención proporciona métodos de producir una molécula de unión al antígeno que tienen una baja actividad de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio que bajo una alta condición de concentración de calcio. La presente invención también proporciona métodos de producir una molécula de unión al antígeno que tiene por lo menos una función seleccionada de: (i) función de promover la absorción del antígeno en las células, (ii) función de unir a un antígeno dos o más veces, (i¡¡) función de promover la reducción de la concentración del antígeno en plasma, y (iv) función de la excelencia en la retención de plasma.
Específicamente, la presente invención proporciona los métodos para producir una molécula de unión al antígeno, que comprenden las etapas de (a) a (e) a continuación: (a) determinar la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio; (b) determinar la actividad de unión al antígeno de la molécula de unión al antígeno bajo una alta condición de concentración de calcio; (c) seleccionar una molécula de unión al antígeno que tenga mayor baja actividad de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio que bajo una alta condición de concentración de calcio; (d) obtener un gen que codifica la molécula de unión al antígeno seleccionada en la etapa (c); y (e) producir la molécula de unión al antígeno usando el gen obtenido en la etapa (d).
La presente invención también proporciona los métodos para producir una molécula de unión al antígeno, que comprenden las etapas de (a) a (e) a continuación: (a) poner en contacto un antígeno con una molécula de unión al antígeno o una biblioteca de moléculas de unión al antígeno bajo una alta condición de concentración de calcio; (b) colocar la molécula de unión al antígeno unida al antígeno en la etapa (a) bajo una baja condición de concentración de calcio; (c) obtener una molécula de unión al antígeno que disocia en la etapa (b); (d) obtener un gen que codifica la molécula de unión al antígeno obtenida en la etapa (c); y (e) producir la molécula de unión al antígeno usando el gen aislado en la etapa (d).
Las etapas (a) a (d) pueden ser repetidos dos o más veces. Así, la presente invención proporciona los métodos que además comprenden la etapa de repetir las etapas (a) a (d) dos o más veces en los métodos descritos antes. El número de veces que las etapas (a) a (d) se repite no está particularmente limitado, y es generalmente diez o menos.
Además, la presente invención proporciona los métodos para producir una molécula de unión al antígeno, que comprenden las etapas de (a) a (f) a continuación: (a) poner en contacto un antígeno con una molécula de unión al antígeno o una biblioteca de moléculas de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio; (b) seleccionar una molécula de unión al antígeno que no une al antígeno en la etapa (a); (c) poner en contacto el antígeno con la molécula de unión al antígeno seleccionada en la etapa (b) bajo una alta condición de concentración de calcio; (d) obtener una molécula de unión al antígeno que une al antígeno en la etapa (c); (e) obtener un gen que codifica la molécula de unión al antígeno obtenida en la etapa (d); y (f) producir la molécula de unión al antígeno usando el gen obtenido en la etapa (e).
Las etapas (a) a (e) pueden ser repetidas dos o más veces. Así, la presente invención proporciona los métodos que además comprenden la etapa de repetir las etapas (a) a (e) dos o más veces en los métodos descritos antes. El número de veces que las etapas (a) a (e) se repite no está particularmente limitado, y es generalmente diez o menos.
La presente invención también proporciona los métodos para producir una molécula de unión al antígeno, que comprenden las etapas de (a) a (e) a continuación: (a) poner en contacto una molécula de unión al antígeno o una biblioteca de moléculas de unión al antígeno con una columna con antígeno inmovilizado bajo una alta condición de concentración de calcio; (b) eluir una molécula de unión al antígeno unida a la columna en la etapa (a) de la columna bajo una baja condición de concentración de calcio; (c) obtener la molécula de unión al antígeno eluída en la etapa (b); (d) obtener un gen que codifica la molécula de unión al antígeno obtenida en la etapa (c); y (e) producir la molécula de unión al antígeno usando el gen obtenido en la etapa (e).
Las etapas (a) a (d) pueden ser repetidas dos o más veces. Así, la presente invención proporciona los métodos que además comprenden la etapa de repetir las etapas (a) a (d) dos o más veces en los métodos descritos antes. El número de veces que las etapas (a) a (d) se repite no está particularmente limitado, y es generalmente diez o menos.
La presente invención también proporciona los métodos para producir una molécula de unión al antígeno, que comprenden las etapas de (a) a (f) a continuación: (a) permitir que una molécula de unión al antígeno o una biblioteca de moléculas de unión al antígeno pase a través de una columna con antígeno inmovilizado bajo una baja condición de concentración de calcio; (b) recolectar una molécula de unión al antígeno eluída sin unir a la columna en la etapa (a); (c) permitir que la molécula de unión al antígeno recolectada en (b) una al antígeno bajo una alta condición de concentración de calcio; (d) obtener una molécula de unión al antígeno que une al antígeno en la etapa (c); (e) obtener un gen que codifica la molécula de unión al antígeno obtenida en la etapa (d); y (f) producir una molécula de unión al antígeno usando el gen obtenido en la etapa (e).
Las etapas (a) a (e) pueden ser repetidas dos o más veces. Así, la presente invención proporciona los métodos que además comprenden la etapa de repetir las etapas (a) a (e) dos o más veces en los métodos descritos antes. El número de veces que las etapas (a) a (e) se repite no está particularmente limitado, y es generalmente diez o menos.
La presente invención también proporciona los métodos para producir una molécula de unión al antígeno, que comprenden las etapas de (a) a (f) a continuación: (a) poner en contacto un antígeno con una molécula de unión al antígeno o una biblioteca de moléculas de unión al antígeno bajo una alta condición de concentración de calcio; (b) obtener una molécula de unión al antígeno que une al antígeno en la etapa (a); (c) colocar la molécula de unión al antígeno obtenida en la etapa (b) bajo una baja condición de concentración de calcio; (d) obtener una molécula de unión al antígeno que tiene actividad de unión al antígeno menor en la etapa (c) que la estándar seleccionada en la etapa (b); (e) obtener un gen que codifica la molécula de unión al antígeno obtenida en la etapa (d); y (f) producir la molécula de unión al antígeno usando el gen obtenido en la etapa (e).
Las etapas (a) a (e) pueden ser repetidas dos o más veces. Así, la presente invención proporciona los métodos que además comprenden la etapa de repetir las etapas (a) a (e) dos o más veces en los métodos descritos antes. El número de veces que las etapas (a) a (e) se repite no está particularmente limitado, y es generalmente diez o menos.
Las moléculas de unión al antígeno usadas en los métodos de producción de la presente invención pueden ser preparadas por cualquier método, e incluyen, por ejemplo, anticuerpos y bibliotecas existentes (bibliotecas de fago, etc.), anticuerpos y bibliotecas que se prepararon de los hibridomas obtenidos al inmunizar animales o de las células B de los animales inmunizados, anticuerpos y bibliotecas preparadas al introducir los aminoácidos capaces de quelar el calcio (por ejemplo, ácido aspártico y ácido glutámico) o las mutaciones del aminoácido no natural en las bibliotecas (bibliotecas con contenido aumentado de los aminoácidos capaces de quelar el calcio (por ejemplo, ácido aspártico y ácido glutámico) o aminoácidos no naturales, bibliotecas introducidas con los aminoácidos capaces de quelar el calcio (por ejemplo, ácido aspártico y ácido glutámico) o mutaciones del aminoácido no natural en los sitios específicos, o similares).
En los métodos de producción descritos antes, la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio no está particularmente limitada, siempre y cuando sea una actividad de unión al antígeno en una concentración de calcio ionizado de 0.1 µ? a 30 µ?. Preferiblemente, la actividad de unión al antígeno incluye una actividad de unión al antígeno en una concentración de calcio ionizado de 0.5 µ? a 10 µ?. Las concentraciones de calcio ionizado más preferidas incluye la concentración de calcio ionizado en el endosoma temprano in vivo. Específicamente, la actividad de unión al antígeno incluye las actividades de unión al antígeno de 1 µ? a 5 µ?. Siempre y cuando, la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno bajo una alta condición de concentración de calcio no está particularmente limitada, siempre y cuando sea una actividad de unión al antígeno en una concentración de calcio ionizado de 100 µ? a 10 mM. Preferiblemente, la actividad de unión al antígeno incluye las actividades de unión al antígeno en una concentración de calcio ionizado de 200 µ? a 5 mM. Las concentraciones de calcio ionizado más preferidas incluyen la concentración de calcio ionizado en plasma in vivo. Específicamente, la actividad de unión al antígeno incluye las actividades de unión al antígeno de 0.5 mM a 2.5 mM.
La actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno se puede determinar mediante los métodos conocidos por los expertos en la técnica. Las condiciones apropiadas con excepción de la concentración de calcio ionizado se pueden determinar por los expertos en la técnica.
La etapa de seleccionar una molécula de unión al antígeno que tenga mayor actividad de unión al antígeno bajo una alta condición de concentración de calcio que bajo una baja condición de concentración de calcio es sinónimo con la etapa de seleccionar una molécula de unión al antígeno que tenga mayor actividad de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio que bajo una alta condición de concentración de calcio.
La diferencia entre la actividad de unión al antígeno bajo una alta condición de concentración de calcio y la bajo una baja condición de concentración de calcio no está particularmente limitada, siempre y cuando la actividad de unión al antígeno sea mayor bajo una alta condición de concentración de calcio que bajo una baja condición de concentración de calcio. La actividad de unión al antígeno bajo una alta condición de concentración de calcio es preferiblemente dos veces o más, más preferiblemente 10 veces o más, y aún más preferiblemente 40 veces o más de la actividad de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio.
En los métodos de producción descritos antes, la unión de un antígeno y una molécula de unión al antígeno se pueden realizar en cualquier estado, y el estado no está particularmente limitado. Por ejemplo, la unión de un antígeno y de una molécula de unión al antígeno se puede realizar al poner en contacto un antígeno con una molécula de unión al antígeno inmovilizada, o al poner en contacto una molécula de unión al antígeno con un antígeno inmovilizado. Alternativamente, la unión se puede realizar al poner en contacto un antígeno con una molécula de unión al antígeno en una solución.
Además, el método de producción de la presente invención se puede usar para una molécula de unión al antígeno descrita antes que tiene la actividad de unión al FcRn humano en el pH neutral, o se puede combinar con un método para conferir o para aumentar la actividad de unión al FcRn humano en el pH neutral. Cuando el método de producción de la presente invención se combina con un método para conferir o para aumentar la actividad de unión al FcRn humano en el pH neutral, el método puede adicionalmente comprender la etapa de alterar los aminoácidos en la molécula de unión al antígeno para conferir o para aumentar la actividad de unión al FcRn humano bajo una condición del pH neutral. Siempre y cuando, el dominio de unión al FcRn humano preferido de una molécula de unión al antígeno que tiene la actividad de unión al FcRn humano en el pH neutral incluye, por ejemplo, los dominios de unión al FcRn humano descritos antes que tienen la actividad de unión al FcRn humano en el pH neutral. Así, los métodos de producción de la presente invención pueden adicionalmente comprender la etapa de seleccionar de antemano una molécula de unión al antígeno que tiene un dominio de unión al FcRn humano con mayor actividad de unión al FcRn humano en el pH neutral y/o de altera los aminoácidos en una molécula de unión al antígeno para conferir o para aumentar la actividad de unión al FcRn humano en el pH neutral.
Además, el método de producción de la presente invención se puede usar para una molécula de unión al antígeno que tiene la actividad de unión al antígeno dependiente del pH descrita antes, o se puede combinar con un método para conferir la actividad de unión al antígeno dependiente del pH (WO 2009/125825). Cuando el método de producción de la presente invención se combina con un método para conferir la actividad de unión al antígeno dependiente del pH, el método puede adicionalmente comprender la etapa de seleccionar de antemano una molécula de unión al antígeno que tenga una baja actividad de unión al antígeno bajo una condición del pH ácido que bajo una condición del pH neutral, y/o de alterar los aminoácidos en una molécula de unión al antígeno para reducir la actividad de unión al antígeno bajo una condición del pH ácido para ser más bajo que bajo una condición del pH neutral.
Las moléculas de unión al antígeno preferidas que tienen una actividad de unión al antígeno dependiente del pH incluyen, por ejemplo, moléculas unidas al antígeno en las cuales por lo menos un aminoácido de una molécula de unión al antígeno se sustituye con histidina o por lo menos una histidina se inserta en una molécula de unión al antígeno. Así, el método de producción de la presente invención puede adicionalmente comprender la etapa de usar una molécula de unión al antígeno en la cual por lo menos un aminoácido se sustituya con histidina o por lo menos una histidina se inserta como una molécula de unión al antígeno, o la etapa de sustituir la histidina por lo menos un aminoácido o de insertar por lo menos una histidina en una molécula de unión al antígeno.
En el método de producción de la presente invención, los aminoácidos no naturales se pueden usar en vez de la histidina. Así, la presente invención se puede entender con los aminoácidos no naturales en lugar de la histidina descrita antes.
Los métodos de producción de la presente invención pueden producir las moléculas de unión al antígeno que tienen por lo menos una función seleccionada de: (i) función de promover la absorción del antígeno en las células, (ii) función de unir a un antígeno dos o más veces, (iii) función de promover la reducción de la concentración del antígeno en plasma, y (iv) función de la excelencia en la retención de plasma, cuando es administrada a los animales como humanos, ratones, y monos. Así, el método de producción de la presente invención se puede usar como un método de producir una molécula de unión al antígeno que tiene por lo menos una de las funciones descritas antes.
Además, se espera que tales moléculas de unión al antígeno sean especialmente superiores como productos farmacéuticos, debido a que la dosis y la frecuencia de la administración en pacientes pueden ser reducidas y como un resultado de la dosificación total puede ser reducida. Así, los métodos de producción de la presente invención se pueden usar como los métodos para producir las moléculas de unión al antígeno para el uso como las composiciones farmacéuticas.
Los genes obtenidos mediante los métodos de producción de la presente invención son llevados comúnmente por los (insertados en) vectores apropiados, y después introducidos en las células hospedadoras. Los vectores no están particularmente limitados, siempre y cuando conserven estable los ácidos nucleicos insertados. Por ejemplo, cuando la E. Coli se use como el huésped, los vectores de clonación preferidos incluyen el vector pBluescript (Stratagene); sin embargo, varios vectores comercialmente disponibles pueden ser usados. Cuando se usan los vectores para producir las moléculas de unión al antígeno de la presente invención, los vectores de expresión son particularmente útiles. Los vectores de expresión no están particularmente limitados, siempre y cuando los vectores expresen las moléculas de unión al antígeno in vitro, en la E. Coli, en células de cultivo, o en el cuerpo de un organismo. Por ejemplo, el vector pBEST (Promega) es preferido para la expresión in vitro; el vector pET (Invitrogen) es preferido para la £. Coli; el vector pME18S-FL3 (No. de Acceso de GenBank AB009864) es preferido para las células de cultivo; y el vector pME18S (Mol Cell Biol. (1988) 8: 466-472) es preferido para los cuerpos de organismos. Los ADN de la presente invención se puede insertar en los vectores mediante métodos convencionales, por ejemplo, mediante ligadura usando sitios de enzima de restricción (Current protocols in Molecular Biology, edit. Ausubel et al., (1987) Publish. John Wiley & Sons, Sección 11.4-11.11).
Las células hospedadoras anteriormente mencionadas no están particularmente limitadas, y varias células hospedadoras se pueden usar dependiendo del propósito. Los ejemplos de las células para expresar las moléculas de unión al antígeno incluyen las células bacterianas (como las de Streptococcus, Staphylococcus, E. coli, Streptomyces, y Bacillus subtilis), las células eucarióticas (como las de levadura y Aspergillus), las células de insectos (como Drosophila S2 y Spodoptera SF9), las células animales (como CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK293, y las células del melanoma de Bowes), y las células de plantas. Los vectores se pueden introducir en una célula hospedadora mediante los métodos conocidos, por ejemplo, los métodos de precipitación de fosfato de calcio, los métodos de electroporación (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons, Section 9.1-9.9), los métodos de lipofección, y los métodos de microinyección .
Las células hospedadoras se pueden cultivar mediante los métodos conocidos. Por ejemplo, cuando se usan las células animales como un huésped, DMEM, MEM, RPMI1640, o IMDM se pueden usar como el medio de cultivo. Pueden ser usados con suplementos en suero como FBS o suero de becerro fetal (FCS, por sus siglas en inglés). Las células se pueden cultivar en cultivos libres de suero. El pH preferido es de aproximadamente 6 a 8 durante el curso del cultiva. La incubación se realiza comúnmente de aproximadamente 30 a 40°C por aproximadamente 15 a 200 horas. Se intercambia, se airea, o se agita el medio, como sea necesario.
Las señales de secreción apropiadas se pueden incorporar a los polipéptidos de interés para que las moléculas de unión al antígeno expresadas en la célula hospedadora sean secretadas en el lumen del retículo endoplásmico, ell espacio periplásmico, o el ambiente extracelular. Estas señales pueden ser endógenas a las moléculas de unión al antígeno de interés o pueden ser señal heterólogas.
Por una parte, por ejemplo, los sistemas de producción usando animales o plantas se pueden usar como sistemas para producir los polipéptidos in vivo. Un polinucleótido de interés se introduce en un animal o planta y el polipéptido se produce en el cuerpo del animal o la planta, y después se recolecta. El "huéspedes" de la presente invención incluyen tales animales y plantas.
El sistema de producción que usan animales incluye los que usan mamíferos o insectos. Es posible usar mamíferos como cabras, cerdos, ovejas, ratones, y bovinos (Vicki Glaser SPECTRUM Biotechnology Applications (1993). Los mamíferos pueden ser animales transgénicos.
Por ejemplo, un polinucleótido que codifica una molécula de unión al antígeno de la presente invención se preparó como un gen de fusión con un gen que codifica un polipéptido específicamente producido en leche, como la ß caseína de cabra. Después, se inyectaron los embriones de cabra con fragmentos de polinucleótido que contienen el gen de fusión, y después se trasplantaron a las cabras hembras. Las moléculas de unión al antígeno deseadas se pueden obtener de la leche producida por las cabras transgénicas, que nacen de las cabras que recibieron los embriones, o de su descendiente. Las hormonas se pueden administrar como sea apropiado para aumentar el volumen de leche que contiene la molécula de unión al antígeno producida en las cabras transgénicas (Ebert et al., Bio/Technology (1994) 12: 699-702).
Los insectos como gusanos de seda pueden ser usados para producir las moléculas de unión al antígeno de la presente invención. Cuando se usaron los gusanos de seda, los baculovirus que llevan un polinucleótido que codifica una molécula de unión al antígeno de interés se pueden usar para infectar gusanos de seda, y la molécula de unión al antígeno de interés se puede obtener de sus fluidos corporales.
Además, cuando las plantas se usaron para producir las moléculas de unión al antígeno de la presente invención, por ejemplo, se puede usar el tabaco. Cuando se usa el tabaco, se insertó un polingcleótido que codifica una molécula de unión al antígeno de interés en un vector de expresión de la planta, por ejemplo, pMON 530, y después el vector se introdujo en bacterias, como Agrobacterium tumefaciens. Las bacterias entonces se dejan para infectar el tabaco como Nicotiana tabacum, y las moléculas de unión al antígeno deseadas se pueden recolectar de sus hojas (Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24: 131-138). Alternativamente, es posible infectar la lenteja de agua (Lemna minor) con bacterias similares. Después de clonar, las moléculas de unión al antígeno deseadas se pueden obtener de las células de lenteja de agua (Cox KM et al., Nat. Biotechnol. diciembre de 2006; 24(12): 1591-1597).
Las moléculas de unión al antígeno así obtenidas se pueden aislar del interior o del exterior (como el medio y la leche) de las células hospedadoras, y se purificaron como moléculas de unión al antígeno sustancialmente puras y homogéneas. Los métodos para aislar y purificar las moléculas de unión al antígeno no están particularmente limitadas, y los métodos de aislamiento y de purificación usados generalmente para la purificación del polipéptido pueden ser usados. Las moléculas de unión al antígeno pueden ser aisladas y purificadas por la selección y combinación apropiada, por ejemplo, columnas de cromatografía, filtración, ultrafiltración, salificación, precipitación de solvente, extracción de solvente, destilación, inmunoprecipitación, electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida , concentración isoeléctrica, diálisis, y recristalización.
La cromatografía incluye, por ejemplo, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrofóbica, filtración en gel, cromatografía de fase inversa, y cromatografía de adsorción (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., (1996) Cold Spring Harbor Laboratory Press). Tales métodos cromatográficos se pueden conducir usando la cromatografía de fase líquida como CLAR y FPLC. Las columnas usadas para la cromatografía de afinidad incluyen, columnas de proteína A y columnas de proteína G. Las columnas que usan la proteína A incluyen, por ejemplo, Hyper D, POROS, y Sefarosa F.F. (Pharmacia).
Si es necesario, una molécula de unión al antígeno se puede modificar arbitrariamente, y los péptidos pueden ser eliminados parcialmente al permitir que una enzima de modificación de proteína apropiada actúe antes o después de la purificación de la molécula de unión al antígeno. Tales enzimas de modificación de proteína incluyen, por ejemplo, tripsina, quimotripsina, lisil endopeptidasas, proteína cinasas, y glucosidasas.
¦«Composiciones farmacéut¡cas> La presente invención también se relaciona con composiciones farmacéuticas que incluyen moléculas de unión al antígeno de la presente invención, moléculas de unión al antígeno aisladas mediante métodos de evaluación de la presente de la invención, o moléculas de unión al antígeno producidas mediante métodos de producción de la presente invención. Las moléculas de unión al antígeno de la presente invención, moléculas de unión al antigeno aisladas mediante el método de evaluación de la presente invención, o moléculas de unión al antígeno producidas mediante el método de producción de la presente invención son moléculas de unión al antígeno que tienen por lo menos una función seleccionada de: (i) función de promover la absorción del antígeno en las células, (ii) función de unir a un antígeno dos o más veces, (iii) función de promover la reducción de la concentración del antígeno en plasma, y (¡v) función de la excelencia en la retención de plasma, son útiles como composiciones farmacéuticas, debido a que se espera que la frecuencia de administración pueda ser reducida. Además, la composición farmacéutica de la presente invención puede comprender un portador farmacéuticamente aceptable.
En la presente invención, las composiciones farmacéuticas se refieren generalmente a agentes para tratar o prevenir, o probar y diagnosticar enfermedades.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden formularse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, pueden usarse parenteralmente, en la forma de inyecciones de soluciones o suspensiones estériles incluyendo agua u otro líquido farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, tales composiciones pueden formularse mezclándose en la forma de dosis unitaria requerida en la práctica de fabricación de medicina generalmente apropiada, apropiadamente combinando con portadores o medio farmacéuticamente aceptable, específicamente con agua estéril, solución salina fisiológica, aceite vegetal, emulsificante, suspensión, tensioactivo, agente saborizante, excipiente, vehículo, conservador, aglutinante, o similares. En tales formulaciones, la cantidad de ingrediente activo se ajusta para obtener una cantidad apropiada en un intervalo predeterminado.
Las composiciones estériles para la inyección se pueden formular usando los vehículos como agua destilada para la inyección, de acuerdo con la práctica de formulación estándar.
Las soluciones acuosas para inyección incluyen, por ejemplo, soluciones salinas fisiológicas e isotónicas que contienen la dextrosa u otros adyuvantes (por ejemplo, D-sorbitol, D-manosa, D-manitol, y cloruro sódico). Es también posible usar en combinación solubilizantes apropiados, por ejemplo, alcoholes (etanol y similares), polialcoholes (propilenglicol, polietilenglicol, y similares), tensioactivos no iónicos (polisorbato 80(TM), HCO-50, y similares).
Los aceites incluyen aceite de sésamo y aceites de soya. El benzoato bencílico y/o el alcohol bencílico se pueden usar en combinación como solubilizantes. Es también posible combinar los amortiguadores (por ejemplo, amortiguador de fosfato y amortiguador de acetato de sodio), agentes relajantes (por ejemplo, clorhidrato de procaína), estabilizadores (por ejemplo, alcohol bencílico y fenol), y/o antioxidantes. Las ampollas apropiadas se llenan con las inyecciones preparadas.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se administran preferiblemente de manera parenteral. Por ejemplo, las composiciones pueden estar en la forma de dosificación para inyecciones, administración transnasal, administración transpulmonar, o administración transdérmica. Por ejemplo, pueden administrarse sistémica o localmente mediante inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, inyección subcutánea, o similares.
Los métodos de administración pueden seleccionarse apropiadamente en consideración de la edad y síntomas del paciente. La dosis de una composición farmacéutica que contiene una molécula de unión al antígeno puede ser, por ejemplo, de 0.0001 a 1,000 mg/kg para cada administración. Alternativamente, la dosis puede ser, por ejemplo, de 0.001 a 100,000 mg por paciente. Sin embargo, la presente invención no está limitada por los valores numéricos descritos antes. Las dosis y métodos de administración varían dependiendo del peso, edad, síntomas del paciente y similares. Los expertos en la técnica pueden ajustar la dosis y métodos de administración apropiados en consideración de los factores descritos antes.
Además, la composición farmacéutica de la presente invención puede ser una composición farmacéutica usada para promover la absorción del antígeno en las células o la reducción de la concentración del antígeno en plasma.
La presente invención también se relaciona con los métodos para promover la absorción del antígeno en las células mediante una molécula de unión al antígeno y los métodos para promover la reducción de la concentración del antígeno en plasma al administrar la molécula de unión al antígeno de la presente molécula de la invención o la unión al antígeno producida por el método de producción de la presente invención. La molécula de unión al antígeno se puede administrar ¡n vivo o in vitro. El sujeto a ser administrado incluye, por ejemplo, animales no humanos (ratones, monos, etc.) y humanos.
La presente invención también se relaciona con los métodos para aumentar el número de veces de unión al antígeno por una molécula de unión al antígeno y los métodos para mejorar la retención de plasma de una molécula de unión al antígeno usando una molécula de unión al antígeno de la presente invención o una molécula de unión al antígeno producida mediante el método de producción de la presente invención.
Los aminoácidos contenidos en las secuencias de aminoácidos de la presente invención pueden ser modificado post-translacionalmente (por ejemplo, la modificación de una glutamina N-terminal en un ácido piroglutámico mediante piroglutamilación es bien conocido por los expertos en la técnica). Naturalmente, tales aminoácidos modificados post-translacionalmente se incluyen en las secuencias de aminoácidos en la presente invención.
Además, la presente invención proporciona los kits para el uso en los métodos de la presente invención, que comprenden por lo menos una molécula de unión al antígeno de la presente invención. Además de lo anterior, los portadores farmacéuticamente aceptables, los medios, los manuales de instrucción que describen el uso del método, y similares se pueden empaquetar en los kits.
La presente invención también se relaciona con los agentes para promover la absorción del antígeno en las células mediante las moléculas de unión al antígeno, los agentes para promover la reducción de la concentración del antígeno en plasma, los agentes para aumentar el número de veces de la unión al antígeno por una molécula de unión al antígeno, y los agentes para mejorar la retención de plasma de las moléculas de unión al antígeno, todos los cuales comprenden como un ingrediente activo una molécula de unión al antígeno de la presente invención o una molécula de unión al antígeno producida por los métodos de producción de la presente invención.
La presente invención también se relaciona con el uso de moléculas de unión al antígeno de la presente invención o moléculas de unión al antígeno producidas mediante los métodos de producción de la presente invención en producir los agentes para promover la absorción del antígeno en las células mediante las moléculas de unión al antígeno, los agentes para promover la reducción de la concentración del antígeno en plasma, los agentes para aumentar el número de veces de la unión al antígeno en una molécula de unión al antígeno, o los agentes para mejorar la retención de plasma de las moléculas de unión al antígeno.
La presente invención también se relaciona con las moléculas de unión al antígeno de la presente invención o las moléculas de unión al antígeno producidas mediante los métodos de producción de la presente invención para el uso en los métodos para promover la absorción del antígeno en las células mediante las moléculas de unión al antlígeno, los agentes para promover la reducción de la concentración del antígeno en plasma, los métodos para aumentar el número de veces de la unión al antígeno mediante una molécula de unión al antígeno, y los métodos para mejorar la retención de plasma de las moléculas unidas al antígeno.
Todos los documentos de la técnica anterior citados en la especificación se incorporan en la presente por referencia.
Ejemplos En la presente más adelante, la presente invención será descrita específicamente con referencia a los Ejemplos, pero no debe interpretarse como que está limitada a la misma.
Ejemplo 1 El concepto del efecto de eliminación-aceleración del antígeno de los anticuerpos de unión al antígeno dependientes de calcio (1-1) Efecto de los anticuerpos de unión al antígeno dependiente del pH para acelerar la eliminación El H54/L28-lgG1 descrito en el documento WO 2009/125825 es un anticuerpo del receptor anti-IL-6 humanizado. El Fv4-lgG1 es un anticuerpo del receptor anti-IL-6 humanizado que resulta de conferir el H54/L28-lgG1 con la propiedad de unir al receptor de IL-6 humano soluble de una manera dependiente del pH (que se une bajo una condición neutral pero se disocia bajo una condición ácida). La prueba in vivo descrita en el documento WO 2009/125825 usando ratones demostró que la eliminación del receptor de IL-6 humano soluble se podría acelerar en gran medida en un grupo administrado con una mezcla de Fv4-lgG1 y el receptor de IL-6 humano soluble como un antígeno con respecto a un grupo administrado con una mezcla de H54/L28-I g G 1 y el receptor de IL-6 humano soluble como un antígeno.
El receptor de IL-6 humano soluble unido a un anticuerpo general que une al receptor de IL-6 humano soluble se recicla al plasma junto con el anticuerpo a través de FcRn. Siempre y cuando, un anticuerpo que une al receptor de IL-6 humano soluble de una manera dependiente del pH disocia del receptor de IL-6 humano soluble que se ha unido al anticuerpo bajo condiciones ácidas en el endosoma. El receptor de IL-6 humano soluble disociado se degrada en el lisosoma. Esto puede acelerar en gran medida la eliminación del receptor de IL-6 humano soluble. Entonces, el anticuerpo que une al receptor de IL-6 humano soluble de una manera dependiente del pH se recicia al plasma a través de FcRn. El anticuerpo reciclado puede unir a un receptor de IL-6 humano soluble de muevo. Repitiendo este ciclo, una sola molécula de anticuerpo puede unir repetidamente a los receptores IL-6 humanos solubles múltiples veces (Fig. 1).
Mientras tanto, como se describe en el documento WO 2009/125825, después de unir el receptor de IL-6 humano tipo membrana, un anticuerpo del receptor anti-IL-6 humanizado general se internaliza en un complejo dell anticuerpo del receptor anti-IL-6 humanizado y el receptor de IL-6 humano tipo membrana y después se degrada en el lisosoma. En cambio, un anticuerpo del receptor anti-IL-6 humanizado que une al receptor de IL-6 de una manera dependiente del pH se recicia al plasma a través de la disociación desde la receptor de IL-6 humano tipo membrana bajo una condición ácida en el endosoma después de la ¡nternalización en un complejo con el receptor de IL-6 humano tipo membrana. El anticuerpo reciclado puede unir al receptor de IL-6 humano tipo membrana de muevo. Repitiendo este ciclo, una sola molécula de anticuerpo puede unir repetidamente al receptor de IL-6 humano tipo membrana múltiples veces (Fig. 2). (1-2) concentraciones de pH y calcio en plasma y endosoma En el mecanismo de un anticuerpo de unión dependiente del pH mostrado en las Figs. 1 y 2, es importante que el anticuerpo una fuertemente a un antígeno en plasma y disocie el antígeno en el endosoma basado en la diferencia ambiental entre el plasma y el endosoma, es decir, la diferencia del pH (pH 7.4 en plasma; pH 6.0 en endosoma). El grado de diferencia ambiental entre el plasma y el endosoma es importante para distinguir la capacidad de unión al antígeno de un anticuerpo de unión dependiente del pH en el plasma y el endosoma. Una diferencia del pH es debido a una diferencia en la concentración de iones de hidrógeno. Específicamente, la concentración de iones de hidrógeno en el plasma (pH 7.4) es de aproximadamente 40 nM, mientras que la concentración en el endosoma (pH 6.0) es de aproximadamente 1,000 nM. La concentración del factor (iones de hidrógeno) difiere por aproximadamente 25 veces entre el plasma y el endosoma.
Los presentes inventores concibieron que, para alcanzar el mecanismo ilustrado en las Figs. 1 y 2 fácilmente o para mejorar el mecanismo, sería beneficioso usar un anticuerpo que depende de un factor que tenga una mayor diferencia de concentración entre el plasma y el endosoma que la diferencia de la concentración de iones de hidrógeno entre los dos. Así, los inventores buscaron un factor cuya concentración es considerablemente diferente entre el plasma y el endosoma. Como un resultado, se identificó el calcio. La concentración de calcio ionizado es de aproximadamente 1.1 a 1.3 mM en el plasma y de aproximadamente 3 µ? en el endosoma. La concentración del factor (calcio) difiere por aproximadamente 400 veces entre los dos. Así, la relación se encontró para ser mayor que la diferencia en la concentración de iones de hidrógeno (25 veces). Específicamente, el mecanismo ilustrado en las Figs. 1 y 2 se esperaba que fuera alcanzado o mejorado más fácilmente usando un anticuerpo de unión dependiente de la concentración de calcio ionizado, que une a un antígeno bajo una alta condición de concentración de calcio (1.1 a 1.3 mM) pero disocia del antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio (3 µ?).
Además, en el documento WO 2009/125825, los anticuerpos de unión dependiente del pH cuyas propiedades cambian entre el pH 7.4 y 6.0 se produjeron al introducir la histidina. La histidina es eléctricamente neutral bajo una condición neutral en plasma pero es positivamente cargada bajo una condición ácida en el endosoma. La dependencia del pH se puede conferir a la interacción del antígeno-anticuerpo usando el cambio en la carga eléctrica de la histidina. Mientras tanto, como se muestra en la Fig. 3, cuando se usa la histidina, para unir a un antígeno en plasma y para disociar del antígeno en el endosoma y residuos de histidina en la necesidad del anticuerpo para interactuar con los aminoácidos positivamente cargados con el antígeno o los aminoácidos que potencialmente sirven como donante para la unión de hidrógeno. Por lo tanto, un epítopo del antígeno, al cual un anticuerpo de unión dependiente del pH une para ejercer un efecto objetivo, tiene que contener los aminoácidos positivamente cargados o los aminoácidos que potencialmente sirven como un donante para la unión de hidrógeno.
Por una parte, como se muestra en la Fig. 4, un anticuerpo de unión dependiente de calcio se asume para unir a un antígeno a través del ion de Calcio. En este caso, el epítopo del antígeno contiene los aminoácidos negativamente cargados o los aminoácidos que potencialmente sirven como un aceptador para la unión de hidrógeno, que son capaces de quelar el ion de Calcio. Así, tales anticuerpos pueden etiquetar los epítopos, que no son etiquetados por los anticuerpos de unión dependiente del pH, son producidos al introducir la histidina. Además, como se muestra en la Fig. 5, se espera que los epítopos que tienen una gran variedad de propiedades pueden ser etiquetados usando los anticuerpos con dependencia de calcio y dependencia del pH.
Ejemplo 2 Aislamiento de anticuerpos de unión dependientes de Ca de la biblioteca del anticuerpo humano usando la técnica de exhibición de fago (2-1) Preparación de la biblioteca de exhibición de fago de anticuerpos humanos sin tratamiento Varias bibliotecas de expresión en fago del anticuerpo humano que presentan los dominios de Fabs que comprenden una secuencia del anticuerpo humano se construyeron usando como un polyA-ARN de molde preparado del PBMC humano, ARN polyA humano disponible en el mercado, o similares, de acuerdo con Methods Mol Biol.2002, 178: 87-100. (2-2) Aislamiento de los fragmentos de anticuerpos de unión con Ca dependiente de bibliotecas mediante la selección de pelotillas La primera selección de las bibliotecas de expresión en fago del anticuerpo humano construido se logró al enriquecer los fragmentos de anticuerpos que tienen capacidad de unión al anticuerpo o al enriquecer usando la capacidad de unión con Ca dependiente como un indicador. Los fragmentos de anticuerpos con una capacidad de unión con Ca dependiente se enriquecieron al eluir los fagos a través de la quelación de EDTA de ion de Ca después de que los fragmentos de anticuerpos se unieron a un antígeno en presencia de ion de Ca. El receptor de IL-6 humano biotinilado se usó como el antígeno.
Los fagos se produjeron con E. Coli que lleva los fagómidos de expresión en fago construidos de la manera descrita antes. El medio de cultivo resultante se precipitó usando 2.5 M de NaCI/10% de PEG. Entonces, se diluyó el precipitado con TBS para preparar una solución de biblioteca en fago. Se agregaron BSA y CaCI2 a la solución de la biblioteca en fago de modo que las concentraciones finales de BSA y de calcio ionizado fueron 4% y 1.2 mM, respectivamente. La selección se realizó de acuerdo con un método de selección convencional usando pelotillas magnéticos del antígeno inmovilizado (J Immunol Methods. 20 de marzo de 2008, 332(1-2): 2-9; J Immunol Methods. 01 de enero de 2001, 247(1-2): 191-203; Biotechnol Prog. marzo-abril de 2002, 18(2): 212-20; Mol Cell Proteomics. febrero de 2003, 2(2): 61-9). Las pelotillas magnéticas usadas fueron pelotillas cubiertas con NeutrAvidin (Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated) y pelotillas recubiertas con Estreptavidina (Dynabeads M-280 Streptavidin).
Específicamente, se agregaron 250 pmol del antígeno biotinilado a la solución de la biblioteca en fago preparada, y se puso en contacto con el antígeno a temperatura ambiente durante 60 minutos. Se agregaron las pelotillas magnéticas bloqueadas con BSA e incubaron para unir a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se lavaron las pelotillas una vez con 1 mi de 1.2 mM CaCI2/TBS (TBS que contiene 1.2 mM de CaCI2). Entonces, los fagos se cosecharon por la elución usando un método estándar cuando se enriquecieron los fragmentos de anticuerpos que tienen la capacidad de unión, o se suspendieron las pelotillas en 2 mM de EDTA/TBS (TBS que contiene 2% de EDTA) para enriquecer los fragmentos de anticuerpos que tienen la capacidad de unión con Ca dependiente. Se infectó E. Coli agregando 10 mi de la cepa E. Coli TG1 durante la fase de crecimiento logarítmica (OD600 0.4-0.5) a la suspensión de fago preparada, y al cultivar a 37°C durante una hora con agitación suave. Se aplicó el E. Coli infectado sobre las placas (225 mM x 225 mM). Una vez más, el cultivo se inició con este E. Coli para cultivar los fagos.
En la segunda y subsecuente selección, el enriquecimiento se logró usando la capacidad de unión con Ca dependiente como un indicador. Específicamente, se agregaron 40 pmol del antígeno biotinilado a la solución de la biblioteca en fago preparada. Se pusieron en contacto los fagos con el antígeno a temperatura ambiente durante 60 minutos. Se agregaron las pelotillas magnéticas bloqueadas con BSA a la suspensión e incubaron para unir a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se lavaron las pelotillas una vez cada una con 1 mi de 1.2 mM de CaCI2/TBST (TBS que contiene 1.2 mM de CaCI2 y 0.1% de Tween-20) y 1.2 mM de CaCI2/TBS. Entonces, se agregaron 0.1 mi de 2 mM de EDTA/TBS (TBS que contiene 2% de EDTA) para suspender las pelotillas a temperatura ambiente, e inmediatamente después de la suspensión, se eliminaron las pelotillas usando un Soporte Magnético para recolectar la suspensión de fago. Se agregó la suspensión de fago resultante a 10 mi de la cepa de E. coli TG1 durante la fase de crecimiento logarítmico (OD600 0.4-0.5) para infectar el E. Coli que entonces se cultivó a 37°C durante una hora con agitación suave. Se aplicó el E. Coli infectado sobre las placas (225 mM x 225 mM). Una vez más, se inició el cultivo con este E. Coli, y se cultivaron los fagos de la manera como se describe anteriormente. La selección se repitió dos veces. (2-3) Valoración mediante ELISA en fago De las colonias sencillas de E. Coli obtenidas mediante el método descrito antes, los sobrenadantes de cultivo que contienen el fago se prepararon de acuerdo con Methods Mol Biol. 2002, 178: 133-145.
Se agregaron BSA y CaCI2 a los sobrenadantes de cultivo que contienen el fago de modo que las concentraciones finales de BSA y de calcio fueron 4% y 1.2 mM, respectivamente. Se sometieron los sobrenadantes a ELISA. Las placas de microtítulo de 96 pozos Strepta (Roche) se recubrieron usando 100 µ? de PBS que contiene el antígeno biotinilado. Después de lavar con PBST (PBS que contiene 0.1% de Tween20) para eliminar el antígeno, se bloquearon las placas con 250 µ? de BSA/TBS al 4% durante una hora o más. Se eliminó el BSA-TBS al 4%, y entonces se agregaron los sobrenadantes de cultivo preparados a las placas. Se dejaron reposar las placas a 37°C durante una hora para alcanzar la unión del anticuerpo de expresión en fago. Después de lavar con 1.2 mM de CaCI2/TBST (TBS que contiene 1.2 mM de CaCI2 y 0.1% de Tween20), se agregó 1.2 mM de CaCI2/TBS o 1 mM de EDTA/TBS a las placas. Las placas se dejaron reposar a 37°C durante 30 minutos de incubación. Después de lavar con 1.2 mM de CaCI2/TBST, se incubaron las placas durante una hora con un anticuerpo anti-M13 con HRP conjugado (Amersham Pharmacia Biotech) diluido con TBS que contiene 4% de BSA y 1.2 mM de calcio ionizado. Después de lavar con 1.2 mM de CaCI2/TBST, se realizó la detección con la solución sencilla de TMB (ZYMED). Se determinó la absorbencia a 450 nM después de que la reacción se terminó agregando el ácido sulfúrico. Se analizaron los fragmentos de anticuerpos que se considera que tiene una capacidad de unión con Ca dependiente para sus secuencias de nucleótido usando los cebadores específicos. (2-4) Expresión y purificación del anticuerpo Se introdujeron los clones que se considera que tienen una capacidad de unión con Ca dependiente por ELISA de fago en los plásmidos de expresión celular animal. Se expresaron los anticuerpos usando el siguiente método. Se suspendieron las células de la línea con riñón fetal humano derivado FreeStyle 293-F (Invitrogen) en el Medio de Expresión FreeStyle 293 (Invitrogen), y se aplicaron 3 mi de partes alícuotas a cada pozo de las placas de 6 pozos en una densidad celular de 1.33 x 106 células/ml. Se introdujeron los plásmidos preparados en las células mediante un método de lipofección. Se cultivaron las células en una incubadora de C02 (37°C, 8% de C02, 90 rpm) durante cuatro días. De los sobrenadantes de cultivo obtenidos, se purificaron los anticuerpos usando un rProtein A Sepharose™ Fast Flow (Amersham Biosciences) mediante un método conocido por los expertos en la técnica. Se determinaron las concentraciones de anticuerpos purificados al medir la absorbencia a 280 nM usando un espectrofotómetro. Se calcularon las concentraciones de anticuerpos de los valores resueltos basados en el coeficiente de extinción determinado mediante el método de PACE (Protein Science 1995; 4: 2411-2423).
Ejemplo 3 Valoración de los anticuerpos preparados para su actividad de unión con Ca dependiente al receptor humano IL-6 Se evaluaron los anticuerpos 6RL#9-lgG1 (cadena pesada de la SEC ID NO: 1; cadena ligera de la SEC ID NO: 2), 6RK#12-I g G 1 (cadena pesada de la SEC ID NO: 66; cadena ligera de la SEC ID NO: 67), y FH4-lgG1 (cadena pesada de la SEC ID NO: 3; cadena ligera de la SEC ID NO: 4) preparados en el Ejemplo 2 para su actividad de unión al receptor de interleucina 6 humano (hlL6R, por sus siglas en inglés) a pH 7.4 usando Biacore T100 (GE Healthcare). Se realizó el ensayo usando como un tensioactivo P20 de 0.05% de amortiguador de análisis, 10 mmol/l de ACES, 150 m.mol/l de NaCI (pH 7.4 o 6.0) que contiene 3 µ? o 2 mM de CaCI2.
Después de inmovilizar una cantidad adecuada de la Proteína A recombinante (Thermo Scientific) sobre la matriz de detección CM4 (GE Healthcare) mediante un método de combinación de amino, los anticuerpos se dejaron unir sobre la matriz de detección. Se inyectó una concentración apropiada de hlL-6R como un analito para interactuar con los anticuerpos en la matriz de detección. Entonces, se inyectaron 10 mmol/l de glicina-HCI (pH 1.5) para regenerar la matriz de detección. Se realizaron las medidas a 37°C. Se muestran los sensogramas obtenidos por las medidas en la Fig. 6. El resultado demostraron que todos los anticuerpos 6RL#9-lgG1, 6RK#12-lgG1, y FH4-lgG1 unen al hll_6R más débilmente bajo la condición de 3 µ? de concentración Ca2+ que bajo la condición de 2 mM de concentración Ca2+.
De estos anticuerpos, como los anticuerpos que exhiben la dependencia de Ca, se analizaron 6RL#9TlgG1 (cadena pesada de la SEC ID NO: 1 ; cadena ligera de la SEC ID NO: 2) y FH4-lgG1 (cadena pesada de la SEC ID NO: 3; cadena ligera de la SEC ID NO: 4) además cinéticamente. Se usó el H54/L28-lgG1 (cadena pesada de la SEC ID NO: 5; cadena ligera de la SEC ID NO: 6) descrito en el documento WO 2009/125825 como un anticuerpo que no exhibía ninguna dependencia de Ca. Las altas y bajas condiciones de concentración de ion de Calcio usadas fueron 2 mM y 3 µ?, respectivamente. El receptor de IL-6 humano (IL-6R, por sus siglas en inglés) se usó como un antígeno. Una cantidad apropiada de la proteína A (Invitrogen) se inmovilizó sobre la matriz de detección CM4 (GE Healthcare) mediante el método de combinación de amina y se capturaron los anticuerpos de interés en la matriz. Los dos tipos de amortiguadores de análisis usados fueron: [10 mmol/l de ACES, 150 mmol/l de NaCI, 0.05% (p/v) de Tween20, 2 mmol/l de CaCI2 (pH 7.4)] o [10 mmol/l de ACES, 150 mmol/l de NaCI, 0.05% (p/v) de Tween20, 3 pmol/l de CaCI2 (pH 7.4)]. Se realizaron todas las medidas a 37°C. Cada amortiguador también se usó para diluir IL-6R.
Se probó H54L28-lgG1 al inyectar cada amortiguador de análisis como una muestra preliminar y la solución diluida de IL-6R a un caudal de 20 µ?/min durante tres minutos. Así, la IL-6R se dejó interactuar con el anticuerpo capturado en la matriz de detección. Entonces, se inyectó el amortiguador de análisis a un caudal de 20 µ?/min durante diez minutos para observar la disociación de IL-6R. Después, se inyectaron 10 mmol/l de glicina-HCI (pH 1.5) a un caudal de 30 µ?/min durante 30 segundos para regenerar la matriz de detección. Se calcularon la ka constante de velocidad de asociación (1/Ms) y la kd constante de velocidad de disociación (1/s), que son los parámetros cinéticos, del sensograma obtenido por La medición. Basada en los valores, se calculó la KD de disociación constante (M) entre cada anticuerpo y el receptor de IL-6 humano. Se calculó cada parámetro usando el Software de Evaluación Biacore T100 (GE Healthcare) .
Se ensayaron FH4-lgG1 y 6RL#9-lgG1 al inyectar cada amortiguador de análisis como una muestra preliminar y la solución diluida de IL-6R a un caudal de 5 µ?/min durante 15 minutos. Así, la IL-6R se dejó interactuar con el anticuerpo capturado en la matriz de detección. Entonces, se inyectaron 10 mmol/l de glicina-HCI (pH 1.5) a un caudal de 30 µ?/min durante 30 segundos para regenerar la matriz de detección. Basada en el modelo de afinidad de estado estacionario, se calculó la KD constante de disociación ( ) del sensograma obtenido por La medición. Se calculó cada parámetro usando el Software de Evaluación Biacore T100 (GE Healthcare).
La KD constante de disociación entre IL-6R y cada anticuerpo en presencia de 2 mM de CaCI2, que se evaluó mediante los métodos descritos antes, se muestran en la Tabla 7. El H54/L28-lgG1 no mostró ninguna diferencia en el nivel de unión de IL-6R debido a la diferencia de concentración de Ca. Mientras tanto, FH4-lgG1 y 6RL#9-lgG1 exhibieron un deterioro significativo de la unión a la baja condición de concentración de Ca (Figs. 7, 8, y 9).
Tabla 7 En el caso de H54/L28-lgG 1 , KD en una concentración de Ca de 3 µ? se puede calcular mediante los métodos similares usados para determinar la KD en una concentración de Ca de 2 mM. En el caso de FH4-lgG1 y 6RL#9-lgG1, por una parte, es difícil calcular la KD en una concentración de Ca de 3 µ? mediante los métodos similares descritos antes, debido a que la unión a IL-6R fue casi indetectable a 3 µ? de concentración de Ca. Sin embargo, la KD se puede predecir usando la fórmula 1 mostrada continuación (Biacore T100 Software Handbook, BR-1006-48, AE 01/2007).
Fórmula 1 R«rC-¾ix ( o+C)+RI Cada símbolo en la fórmula 1 mostrado antes se define a continuación.
Req (RU): niveles de unión en estado estacionario max (RU): capacidad de unión al analito de la superficie Rl (RU): contribución de índice de refracción de volumen en la muestra C (M): concentración del analito KD (M): constante de disociación de equilibrio La KD de disociación constante entre IL-6R y cada anticuerpo en una concentración de Ca de 3 pmol/l, que se pueden predecir usando la fórmula 1 anterior, se muestra como estimación aproximada en la Tabla 8 Tabla 8 En la Tabla 8 mostrada antes, se estimaron los valores de Req, Rmax, Rl, y C basados en el resultado de ensayo.
Basados en los resultados descritos antes, se predijo que la KD entre IL-6R y FH4-lgG1 o 6RL#9-lgG1 se aumentó por aproximadamente 60 o 120 veces (la afinidad se redujo por 60 o 120 veces o más) cuando la concentración de CaCI2 se alteró a partir de 2 mM a 3 µ?. La Tabla 9 resume los valores de KD en las concentraciones de CaCI2 de 2 mM y 3 µ? y la dependencia de Ca para los tres tipos de los anticuerpos H54/L28-lgG1 , FH4-lgG1 , y 6RL#9-lgG1.
Tabla 9 Ejemplo 4 Valoración de los anticuerpos obtenidos para su unión al ion de Calcio Después, se probaron los anticuerpos para su unión al ion de Calcio mediante calorimetría de barrido diferencial (DSC, por sus siglas en inglés) (MicroCal VP-Capillary DSC; MicroCal) para evaluar la temperatura de punto medio de la desnaturalización térmica (valor de Tm). La temperatura de punto medio de la desnaturalización térmica (valor de Tm) sirve como un indicador para la estabilidad. Cuando una proteína es estabilizada por la unión al ion de Calcio, la temperatura de punto medio de la desnaturalización térmica (valor de Tm) es elevada en comparación con la proteína que cuando la proteína no está unida al ion de Calcio (J Bio Chem. 12 de septiembre de 2008; Vol.283; No. 37: pp 25140-25149). Basados en este principio, los anticuerpos se evaluaron para su unión al ion de Calcio. Se dializaron los anticuerpos purificados (EasySEP, TOMY) contra una solución de [20 mM de Tris-HCI, 150 mM de NaCI, 2 mM de CaCI2 (pH 7.4)] o [20 mM de Tris-HCI, 150 mM de NaCI, 3 µ? de CaCI2 (pH 7.4)]. Se ajustaron las soluciones de proteína a 0.1 mg/ml usando el mismo amortiguador de diálisis como se usó en la diálisis de la solución de proteína. Se realizó La medición de. DSC a una velocidad de calentamiento de 240°C/hr desde 20 a 115°C. Basada en las curvas de desnaturalización de DSC obtenidas, se calculó la temperatura de punto medio de la desnaturalización térmica (valor de Tm) para el dominio de Fab de cada anticuerpo. Los valores se muestran en la Tabla 10.
Tabla 10 El resultado mostrado en la Tabla 10 demuestra que para FH4 y 6RL#9, que exhiben capacidad de unión con calcio dependiente, los valores de Tm de su Fab varían dependiendo de la concentración de calcio, mientras que el valor de Tm no cambia en H54/L28, que no exhibe la capacidad de unión con calcio dependiente. Los cambios observados en los valores de Tm de Fab en FH4 y 6RL#9 sugieren que los dominios de Fab de los anticuerpos se estabilizaron por la unión al ion de Calcio a los anticuerpos. Esto implica que el ion de Calcio une a FH4 y a 6RL#9, mientras que el ion de Calcio no une a H54/L28.
Ejemplo 5 Evaluación de los anticuerpos de unión con Ca dependiente para su efecto sobre la retención del antígeno en plasma usando ratones normales (5-1) Prueba in vivo usando ratones normales Se administraron ratones normales (ratón 57BL/6J; Charles River Japón) con hsll_-6R (receptor de IL-6 humano soluble: preparado como se describe en el EJEMPLO DE REFERENCIA 1) solo o en combinación con un anticuerpo del receptor de IL-6 anti-humano, y después de evaluar la dinámica in vivo de hslL-6R y el anticuerpo del receptor de IL-6 anti-humano. Una solución de hslL-6R (5 pg/ml) o una solución mezclada de hslL-6R y se administró un anticuerpo del receptor de IL-6 anti-humano a 10 ml/kg una vez en la vena caudal. Los anticuerpos del receptor de IL-6 anti-humano usados fueron H54/L28-lgG 1 , 6RL#9-lgG1, y FH4-lgG1 descritos antes.
La concentración de hslL-6R fue 5 Mg/ml en todas las soluciones mezcladas. Mientras tanto, la concentración del anticuerpo del receptor de IL-6 anti-humano difiere con cada anticuerpo. La concentración de H54/L28-lgG1 fue 0.1 mg/ml, mientras que la de 6RL#9-lgG1 y FH4-lgG1 fue 10 mg/ml. El anticuerpo del receptor de IL-6 anti-humano está presente en exceso sobre hslL-6R, y por lo tanto casi cada hslL-6R se asume para ser unido por el anticuerpo. Se recolectó la sangre 15 minutos, 7 horas, 1 día, 2 días, 4 días, 7 días, 14 días, 21 días, y 28 días después de la administración. Se centrifugó la sangre recolectada inmediatamente a 4°C y 12,000 rpm durante 15 minutos para separar el plasma. Se almacenó el plasma separado en un congelador a -20°C o abajo hasta La medición. (5-2) Determinación de ELISA de la concentración del anticuerpo del receptor de IL-6 anti-humano en plasma de ratones normales Se determinó la concentración del anticuerpo del receptor de IL-6 anti-humano en plasma de ratón mediante ELISA. Primero, se dispensó el fragmento F(ab')2 de IgG (cadena ? específica) anti-Humano del Anticuerpo (SIGMA) sobre las placas Nunc-lmmuno, MaxiSorp (Nalge nunc International) y se dejaron reposar durante la noche a 4°C para preparar las placas de IgG anti-humano inmovilizado. Las muestras de curva de calibración que tienen las concentraciones de plasma de 0.64, 0.32, 0.16, 0.08, 0.04, 0.02, y 0.01 pg/ml, y las muestras de ensayo en plasma de ratón diluidas 100 veces o se prepararon y se dividieron en alícuotas en las placas de IgG anti-humano inmovilizado. Se incubaron las placas a 25°C durante una hora, seguido por la incubación con el anticuerpo de IL-6R anti-humano biotinilado (R&D) a 25°C durante una hora. Entonces, se hizo reaccionar Streptavidin-Poly H RP80 (Tecnologías de Detección Estereoespecíficas) a 25°C durante 0.5 horas. Se realizó el desarrollo de color usando el Sustrato de Micropozo HRP de Un Componente TMB (BioFX Laboratories) como un sustrato. Después de detener la reacción con ácido sulfúrico 1N (Showa Chemical), se midió la absorbencia a 450 nM en un lector de microplaca. Se calcularon las concentraciones de plasma en ratones de la absorbencia de la curva de calibración usando el software analítico SOFTmax PRO (Molecular Devices). Se determinaron los cursos de tiempo para las concentraciones de plasma de los anticuerpos H54/L28-lgG1 , 6RL#9-lgG1, y FH4-I g G 1 en ratones normales después de la administración intravenosa mediante este método se muestran en la Fig. 10. (5-3) Medida de la concentración de hslL-6R en plasma mediante el método de electroquimioluminiscencia Se midió la concentración de hsll_-6R en plasma de ratón mediante el método de electroquimioluminiscencia. Se prepararon las muestras de la curva de calibración de hslL-6R ajustadas a las concentraciones de 2,000, 1,000, 500, 250, 125, 62.5, o 31.25 pg/ml y las muestras de ensayo en plasma de ratón diluidas 50 veces o más. Se mezclaron las muestras con una solución del anticuerpo de IL-6R anti-humano monoclonal (R&D) rutenio etiquetado con éster NHS ETIQUETADO CON SULFO (Meso Scale Discovery), Anticuerpo de IL-6R Anti-humano Biotinilado (R&D), y tocilizumab (cadena pesada de la SEC ID NO: 13; cadena ligera de la SEC ID NO: 14), y después se dejaron reaccionar durante la noche a 4°C. El amortiguador de ensayo usado para la reacción contiene 10 mM de EDTA con el propósito de reducir la concentración libre de Ca en las muestras de manera que casi todo el hslL-6R es disociado de 6RL#9-lgG1 o FH4-lgG1 en las muestras y unido al tocilizumab agregado.
Entonces, se dividieron en alícuotas las mezclas en la placa de Estreptavid ¡na MA400 PR (Meso Scale Discovery). Después de otra hora de reacción a 25°C, se lavó la placa. Inmediatamente después el Amortiguador T de Read(x4) (Meso Scale Discovery) se dividió en alícuotas en la placa, Se realizó la medición usando el lector SECTOR PR 400 (Meso Scale Discovery). Se calculó la concentración de hSIL-6R basada en la respuesta en la curva de calibración usando el software analítico, SOFTmax PRO (Molecular Devices). Los cursos de tiempo de la concentración de hslL-6R en plasma en ratones normales después de la administración intravenosa determinada por el método descrito antes se muestran en la Fig. 11.
Los resultados descritos anteriormente demostraron que hslL-6R administrado solo se eliminó muy rápidamente. Mientras tanto, la eliminación de hslL-6R fue considerablemente retardada cuando hslL-6R fue simultáneamente administrado con un anticuerpo general H54/L28-lgG1 que no exhibe la unión de hsIL-6R con Ca dependiente. Mientras tanto, la eliminación de hsIL-6R fue significativamente acelerada cuando hslL-6R fue simultáneamente administrado con 6RL#9-lgG1 o FH4-lgG1, que tienen 100 veces o mayor unión de hslL-6R en una manera con Ca dependiente. Cuando se administró hslL-6R en combinación con 6RL#9-lgG1 o FH4-lgG1, la concentración de hslL-6R en plasma el Día 1 se podrá reducir por 39 veces o dos veces, respectivamente, en comparación cuando hslL-6R se administró en combinación con H54/L28-lgG 1. Esto demuestra que los anticuerpos de unión con calcio dependientes pueden acelerar la eliminación de un antígeno desde el plasma.
Ejemplo 6 Ensayos para mejorar el efecto de eliminación-aceleración del antígeno del anticuerpo con unión al antígeno con Ca dependiente (preparación de anticuerpos) (6-1) En relación con la unión del anticuerpo de IgG a FcRn Los anticuerpos de IgG tienen mayor tiempo de retención de plasma como un resultado de la unión al FcRn. La unión entre IgG y FcRn se observó solamente bajo una condición ácida (pH 6.0). Por el contrario, la unión es casi indetectable bajo una condición neutral (pH 7.4). Un anticuerpo de IgG se toma en las células de una manera no específica. El anticuerpo regresa a la superficie celular al unir al FcRn endosomal bajo una condición ácida endosomal, y después disocia del FcRn bajo una condición del neutral de plasma. Cuando el FcRn que une bajo una condición ácida es perdido al introducir las mutaciones en el dominio de Fe de IgG, el tiempo de retención del anticuerpo en plasma es marcadamente deteriorado debido a que el anticuerpo ya no se recicla al plasma desde el endosoma.
Un método reportado para mejorar la retención de plasma de un anticuerpo de IgG es para mejorar la unión al FcRn bajo condiciones ácidas. Las mutaciones del aminoácido se introducen en su dominio de Fe de un anticuerpo de IgG para mejorar su unión al FcRn bajo condiciones ácidas. Esto aumenta la eficacia del reciclaje para el plasma desde el endosoma, dando por resultado una mejora de la retención de plasma. Un requerimiento importante en la sustitución del aminoácido no es aumentar la unión al FcRn bajo condiciones neutrales. Si un anticuerpo de IgG que une a FcRn bajo condiciones neutrales, el anticuerpo no disocia del FcRn bajo una condición neutral de plasma incluso si regresa a la superficie celular al unir a FcRn bajo una condición ácida endosomal. En este caso, la retención de plasma se perdió un poco debido a que el anticuerpo de IgG no se recicló al plasma.
Por ejemplo, como se describe en J Immunol. (2002) 169(9): 5171-80, un anticuerpo lgG1 modificado por la introducción de subestaciones de aminoácidos de modo que el anticuerpo resultante es capaz de unir al FcRn de ratón bajo una condición neutral (pH 7.4) se reportó para exhibir la retención de plasma muy pobre cuando se administró a los ratones. Además, como se describe en J Immunol. (2009) 182(12): 7663-71; J Biol Chem. 19 de enero de 2007, 282(3): 1709-17; y J Immunol. 01 de noviembre de 2002, 169(9): 5171-80, un anticuerpo de lgG1 se ha modificado mediante la introducción de sustituciones de aminoácido de modo que el anticuerpo resultante exhibe la unión al FcRn humano mejorado bajo una condición ácida (pH 6.0) y al mismo tiempo llega a ser capaz de unir al FcRn humano bajo una condición neutral (pH 7.4). El anticuerpo resultante se reportó como que no muestra ni mejora ni altera la retención de plasma cuando se administró a los monos cinomolgos. Así, la tecnología de la ingeniería del anticuerpo para mejorar las funciones del anticuerpo se ha centrado solamente en la mejora de la retención de plasma del anticuerpo mediante la mejora de la unión al FcRn humano bajo condiciones ácidas sin la mejora en una condición neutral (pH 7.4). Hasta la fecha, no hay un reporte que describa la ventaja de mejorar la unión al FcRn humano bajo una condición neutral (pH 7.4) al introducir las sustituciones del aminoácido en el dominio de Fe de un anticuerpo de IgG.
Los anticuerpos que se unen a los antígenos de una manera dependiente del pH aceleran la eliminación del antígeno soluble. Los anticuerpos producen el efecto repetidamente al unir a los antígenos solubles múltiples veces. Así, tales anticuerpos son muy útiles. Un método para aumentar la unión al FcRn bajo una condición neutral (pH 7.4) se probó para además mejorar el efecto de facilitar la eliminación del antígeno. (6-2) Preparación de los anticuerpos de unión del receptor de IL-6 humano con Ca dependiente que tiene actividad de unión al FcRn bajo condiciones neutrales Las mutaciones del aminoácido para mejorar la unión al FcRn bajo una condición neutral (pH 7.4) se introdujeron en FH4-IgG 1 y 6RL#9-lgG1 que tienen una capacidad de unión al antígeno con calcio dependiente, y H54/L28-lgG1 como un control que no tiene la capacidad de unión al antígeno con calcio dependiente. Las mutaciones del aminoácido se introdujeron mediante un método de PCR conocido por los expertos en la técnica. Específicamente, FH4-N434W (cadena pesada de la SEC ID NO: 7; cadena ligera de la SEC ID NO: 8), 6RL#9-N434W (cadena pesada de la SEC ID NO: 9; cadena ligera de la SEC ID NO: 10), y H54/L28-N434W (cadena pesada de la SEC ID NO: 11; cadena ligera de la SEC ID NO: 12) se construyeron al sustituir Trp por Asn en la posición 434 en el sistema de numeración de EU en la región constante de cadena pesada de lgG1. El método para sustituir un aminoácido es como sigue. Se prepararon los mutantes usando el Kit de Mutagénesis de Sitio Dirigido QuikChange (Stratagene) mediante el método descrito en el manual de instrucción anexo. Se insertaron los fragmentos del plásmido resultante en los vectores de expresión de células animales para construir los vectores de expresión deseados. Se realizaron la expresión y la purificación del anticuerpo, y la determinación de sus concentraciones mediante los métodos descritos en el Ejemplo 2.
Ejemplo 7 Evaluación del efecto para acelerar la eliminación de anticuerpos de unión con Ca dependientes usando ratones normales (7-1) Prueba in vivo usando ratones normales Se administraron ratones normales (ratón C57BL/6J; Charles River Japón) con hslL-6R (receptor de IL-6 humano soluble: preparado como se describe en el EJEMPLO DE REFERENCIA 1) solo o en combinación con un anticuerpo del receptor e IL-6 anti- humano, y después se evaluó para la dinámica in vivo de hslL-6R y el anticuerpo del receptor de IL-6 anti-humano. Se administraron una solución de hslL-6R (5 Mg/ml) o las soluciones mezcladas de hsll_-6R y un anticuerpo del receptor de IL-6 antihumano en 10 ml/kg una vez en la vena caudal. Los anticuerpos del receptor de IL-6 anti-humano usados fueron los H54/L28-N434W, 6RL#9-N434W, y FH4-N434W descritos anteriormente.
La concentración de hslL-6R fue 5 g/ml en todas las soluciones mezcladas. Mientras tanto, la concentración de anticuerpo del receptor de IL-6 anti-humano difiere con cada anticuerpo. Las concentraciones de H54/L28-N434W, 6RL#9-N434W, y FH4-N434W fueron 0.042, 0.55, y 1 mg/ml, respectivamente. En este caso, el anticuerpo del receptor de IL-6 anti-humano está presente en exceso sobre hslL-6R en las soluciones mezcladas, y por lo tanto casi cada hslL-6R se asume para ser unido por el anticuerpo. Se recolectó la sangre 15 minutos, 7 horas, 1 día, 2 días, 4 días, 7 días, 14 días, 21 días, y 28 días después de la administración. Se centrifugó la sangre recolectada inmediatamente a 4°C y 12,000 rpm durante 15 minutos para separar el plasma. Se almacenó el plasma separado en un congelador a -20°C o abajo el ensayo anterior. (7-2) Medida de ELISA de la concentración de anticuerpo del receptor de IL-6 anti-humano en plasma en ratones normales Se midió la concentración de anticuerpo del receptor de IL-6 anti-humano en plasma de ratón mediante ELISA de la misma manera como de describe en el EJEMPLO 6. Los cursos de tiempo de las concentraciones de plasma de los anticuerpos H54/L28-N434W, 6RL#9-N434W, y FH4-N434W en ratones normales después de la administración intravenosa determinada por este método se muestran en la Fig. 12. (7-3) Medida de la concentración de hslL-6R en plasma mediante el ensayo de electroquimioluminiscencia Se midió la concentración de hslL-6R en plasma de ratón mediante el método de electroquimioluminiscencia. Las muestras de la curva de calibración de hslL-6R ajustadas a las concentraciones de 2,000, 1,000, 500, 250, 125, 62.5, y 31.25 pg/ml y se prepararon las muestras de ensayo de plasma de ratón diluidas 50 veces o más. Se mezclaron las muestras con una solución del anticuerpo de IL-6R anti-humano monoclonal (R&D) rutenio etiquetado con éster NHS ETIQETADO CON SULFO (Meso Scale Discovery) y el anticuerpo de IL-6R anti-humano biotinilado (R&D), y después se dejó reaccionar durante la noche a 4°C. El amortiguador de ensayo usado para la reacción contiene 10 mM de EDTA con el propósito de reducir la concentración libre de Ca en las muestras de modo que casi cada hslL-6R disocia de 6RL#9-N434W o de FH4-N434W en las muestras y existe en una forma libre. Entonces, se dividieron en alícuotas las mezclas en la placa de Estreptavidina MA400 PR (Meso Scale Discovery). Después de una hora de reacción a 25°C, se lavó la placa. Inmediatamente después se dividió en alícuotas el amortiguador Read T(x4) (Meso Scale Discovery) en la placa, se realizó La medición usando el lector SECTOR PR 400 (Meso Scale Discovery). Se calcularon las concentraciones de hslL-6R basadas en la respuesta en la curva de calibración usando el software analítico, SOFTmax PRO (Molecular Devices). Los cursos de tiempo de la concentración de hslL-6R en plasma en ratones normales después de la administración intravenosa determinada por el método descrito antes se muestran en la Fig. 13.
Los resultados descritos antes demostraron que la unión al FcRn a pH 7.4 se mejoró pero, cuando hslL-6R simultáneamente se administró con un anticuerpo general H54/L28-N434W, que no exhibe la unión de hslL-6R con Ca dependiente, la eliminación de hslL-6R considerablemente se retrasó en comparación cuando hslL-6R se administró solo. Mientras tanto, cuando hslL-6R simultáneamente se administró con 6RL#9-N434W o FH4-N434W que son los anticuerpos que han mejorado la unión al FcRn a pH 7.4 y 100 veces o mayor unión al hslL-6R dependiendo de Ca, la eliminación de hslL-6R fue significativamente acelerada en comparación cuando hslL-6R se administró solo. Cuando hslL-6R simultáneamente se administró con 6RL#9-N434W y FH4-N434W, la concentración de hslL-6R en plasma en el día 1 se podrá reducir por 3 y 8 veces, respectivamente, en comparación cuando hslL-6R se administró solo. Esto demuestra que la eliminación de un antígeno del plasma puede ser además acelerada al mejorar la capacidad de unión al FcRn de un anticuerpo de unión con calcio dependiente a pH 7.4.
Con respecto a un anticuerpo general H54/L28-lgG1 que no exhibe la unión de hslL-6R con Ca dependiente, el anticuerpo 6RL#9-lgG1 o a FH4-lgG1 que tiene 100 veces o mayor unión de hslL-6R con Ca dependiente se confirmó para tener el efecto para mejorar la eliminación de hslL-6R. Además, en comparación cuando hslL-6R se administró solo, hslL-6R y el anticuerpo 6RL#9-N434W o FH4-N434W que exhiben la unión al FcRn mejorada a pH 7.4 y tienen 100 veces o mayor unión al hslL-6R dependiendo de Ca se confirmó para poder acelerar la eliminación de hsll_-6R. Los datos descritos antes sugieren que similar a un anticuerpo que une a un antígeno de una manera con pH dependiente, un anticuerpo que une a un antigeno de una manera con Ca dependiente disocia del antígeno en el endosoma, como se ilustra en la Fig. 1. Como se describe en el Ejemplo 1, hay tipos unidos de epítopos etiquetados por los anticuerpos con la unión al antígeno dependiente de pH (Fig. 3). Sin embargo, usando los anticuerpos con la unión al antígeno con Ca dependiente como se revela en la presente invención, es considerado que uno puede expandir la variedad de epítopos que se etiquetarán por los anticuerpos capaces de la disociación del antígeno dependiente de endosoma (Figs. 4 y 5).
Ejemplo 8 Identificación del sitio de unión al ion de calcio en el anticuerpo 6RL#9 mediante cristalografía de rayos X (8-1) Cristalografía de rayos X Como se describe en el Ejemplo 4, las medidas de la temperatura de desnaturalización térmica Tm sugirieron que el anticuerpo 6RL#9 une al ion de Calcio. Sin embargo, fue imprevisible que la porción del anticuerpo 6RL#9 una al ion de Calcio. Entonces, usando la técnica de cristalografía de rayos X, se identificaron los residuos del anticuerpo 6RL#9 que interactúan con el ion de Calcio. (8-2) Expresión y purificación del anticuerpo 6RL#9 Se expresó el anticuerpo 6RL#9 y se purificó mediante cristalografía de rayos X. Específicamente, los plásmidos de expresión animales construidos para ser capaces de expresar la cadena pesada (SEC ID NO: 1) y la cadena ligera (SEC ID NO: 2) del anticuerpo 6RL#9 transitoriamente se introdujeron en las células animales. Se introdujeron los plásmidos construidos mediante el método de lipofección en el FreeStyle 293-F derivado de células de riñón fetal humano (Invitrogen) suspendido en 800 mi del Medio de Expresión FreeStyle 293 (Invitrogen) (densidad celular final: 1 x 106 células/ml). Se cultivaron las células introducidas por plásmido en gna incubadora de C02 (37°C, 8% de C02, 90 rpm) durante cinco días. A partir del sobrenadante de cultivo obtenido como se describe anteriormente, se purificaron los anticuerpos mediante un método conocido por los expertos en la técnica usando rProtein A Sepharose™ Fast Flow (Amersham Biosciences) . Se midió la absorbencia a 280 nm de soluciones de anticuerpos purificados usando un espectrofotómetro. Se calcularon las concentraciones de anticuerpos de los valores medidos usando un coeficiente de extinción calculado mediante el método de PACE (Protein Science (1995) 4, 2411-2423). (8-3) Purificación del fragmento Fab del anticuerpo 6RL#9 Se concentró el anticuerpo 6RL#9 a 21 mg/ml usando un ultrafiltro con un límite de peso molecular de 10,000 MWCO. Se preparó una muestra de anticuerpo de 5 mg/ml (2.5 mi) al diluir la solución de anticuerpo usando 4 mM de L-cisteína/5 mM de EDTA/20 mM de amortiguador de fosfato de sodio (pH 6.5). Se agregaron 0.125 mg de papaína (Roche Applied Science) a la muestra. Después de agitar, se incubó la muestra a 35°C durante dos horas. Después de la incubación, se disolvió una tableta de combinación mínima de inhibidor de proteasa libre de EDTA (Roche Applied Science) en 10 mi de 25 mM de amortiguador de MES (pH 6) y se agregó a la muestra. Se incubó la muestra en hielo para detener la reacción proteolítica de papaína. Entonces, se cargó la muestra sobre una columna de intercambio catiónico de 1 mi HiTrap SP HP (GE Healthcare) equilibrada con 25 mM de amortiguador de MES (pH 6), rio debajo de la cual una columna de proteína A de 1 mi HiTrap MabSelect Sure (GE Healthcare) se conectó en tándem. Se obtuvo una fracción purificada del fragmento Fab del anticuerpo 6RL#9 al realizar la elución con un gradiente de concentración de NaCI lineal de hasta 300 mM en el amortiguador descrito antes. Entonces, se concentró la fracción purificada resultante a aproximadamente 0.8 mi usando un ultrafiltro 5000 MWCO. Se cargó el concentrado sobre una columna de filtración en gel Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare) equilibrada con 100 mM de amortiguador HEPES (pH 8) que contiene 50 mM de NaCI. Se eluyó el fragmento Fab purificado del anticuerpo 6RL#9 para la cristalización de la columna usando el mismo amortiguador. Todos los tratamientos de columna descritos antes se realizaron a una baja temperatura de 6 a 7.5°C. (8-4) Cristalización del fragmento Fab del anticuerpo 6RL#9 en presencia de Ca Los gérmenes cristalinos del fragmento Fab 6RL#9 se prepararon de antemano bajo condiciones generales. Entonces, se concentró el fragmento Fab purificado del anticuerpo 6RL#9 en 5 mM de CaCI2 a 12 mg/ml con un ultrafiltro 5000 MWCO. Después, se cristalizó la muestra concentrada como se describe anteriormente mediante el método de difusión de vapor en gota colgante usando 100 mM de amortiguador HEPES (pH 7.5) que contiene del 20% al 29% de PEG4000 como una solución de reserva. Se trituraron los gérmenes cristalinos descritos antes en 100 mM de amortiguador HEPES (pH 7.5) que contiene 29% de PEG4000 y 5 mM de CaCI2, y se diluyeron en serie de 100 a 10,000 veces. Entonces, se combinaron 0.2 µ? de soluciones diluidas con una mezcla de 0.8 µ? de la solución de reserva y 0.8 µ? de la muestra concentrada para preparar las gotas de cristalización en un portaobjetos de cubierta de cristal. Las gotas cristalinas se dejaron reposar a 20°C durante dos a tres días para preparar los cristales similares a una placa fina. Los datos de difracción de rayos X se recolectaron usando los cristales. (8-5) Cristalización del fragmento Fab del anticuerpo 6RL#9 en ausencia de Ca Se concentró el fragmento Fab purificado del anticuerpo 6RL#9 a 15 mg/ml usando un ultrafiltro 5000 MWCO. Entonces, se cristalizó la muestra concentrada como se describe anteriormente mediante el método de difusión de vapor en gota colgante usando 100 mM de amortiguador HEPES (pH 7.5) que contiene del 18% al 25% de PEG4000 como una solución de reserva. Se trituraron los cristales del fragmento Fab del anticuerpo 6RL#9 obtenidos en presencia de Ca en 100 mM de amortiguador HEPES (pH 7.5) que contiene 25% de PEG4000, y se diluyeron en serie de 100 a 10,000 veces. Entonces, se combinaron 0.2 µ? de soluciones diluidas con una mezcla de 0.8 µ? de la solución de reserva y 0.8 µ? de la muestra concentrada para preparar las gotas de cristalización en un portaobjetos de cubierta de cristal. Las gotas cristalinas se dejaron reposar a 20°C durante dos a tres días para preparar cristales similares a placa fina. Los datos de la difracción de rayos X se recolectaron usando los cristales. (8-6) Medida de la cristalográfica de rayos X de cristal del fragmento Fab del anticuerpo 6RL#9 en presencia de Ca Se humedecieron los cristales del fragmento Fab del anticuerpo 6RL#9 preparado en presencia de Ca en 100 mM de solución de amortiguador HEPES (pH 7.5) que contiene el 35% de PEG4000 y 5 mM de CaCI2. Mediante la eliminación de la solución exterior de la superficie de un único cristal con una aguja de microbucle de nylon, el único cristal se congeló en nitrógeno líquido. Se recolectaron los datos de la difracción de rayos X del cristal congelado de la línea de haz BL-17A de la Photon Factory en la High Energy Accelerator Research Organization. Se mantuvo el cristal congelado en estado congelado durante La medición constantemente colocándola en una corriente de gas nitrógeno a -178°C. Se recolectó un total de 180 imágenes de difracción usando el detector CCD Quantum315r (ADSC, por sus siglas en inglés) unido a la línea de haz, mientras giraban el cristal en los intervalos de 1o. La determinación constante de celosía, la indexación del punto de difracción, y el análisis de datos de difracción se realizaron usando los programas Xia2 (CCP4 Software Suite), XDS Package (Walfgang Kabsch), y Scala (CCP4 Software Suite). Finalmente, se obtuvieron los datos de intensidad de difracción hasta 2.2 A de resolución. El cristal pertenece al grupo de espacio P212121 con constante de celosía a = 45.47 Á, b = 79.86 A, c = 116.25 A, a = 90°, ß = 90°, y ? = 90°. (8-7) Medida de cristalográfica de rayos X del cristal del fragmento Fab del anticuerpo 6RL#9 en ausencia de Ca Se humedecieron los cristales del fragmento Fab del anticuerpo 6RL#9 preparado en ausencia de Ca en 100 mM de solución de amortiguador HEPES (pH 7.5) que contiene el 35% de PEG4000. Mediante la eliminación de la solución exterior de la superficie de un único cristal con un perno de micro-nylon-bucle, se congeló el único cristal en nitrógeno líquido. Se recolectaron los datos de la difracción de rayos X del cristal congelado de la línea de haz BL-5A de la Photon Factory en la High Energy Accelerator Research Organizaron. Se mantuvo el cristal congelado en estado congelado durante La medición constantemente al colocarla en una corriente de gas nitrógeno a -178°C. Se recolectó un total de 180 imágenes de difracción usando el detector CCD Quantum210r (ADSC, por sus siglas en inglés) unidas a la línea de haz, mientras se gira el cristal en los intervalos 1o. La determinación constante de celosía, la indexación de punto de difracción, y el análisis de datos de difracción se realizaron usando los programas Xia2 (CCP4 Software Suite), XDS Package (Walfgang Kabsch), y Scala (CCP4 Software Suite). Finalmente, se obtuvieron los datos de intensidad de difracción de hasta 2.3 A de resolución. El cristal pertenece al grupo de espacio P212121 con constante de celosía a = 45.40 A, b = 79.63 A, c = 116.07 A, a = 90°, ß = 90°, y ? = 90°. (8-8) Medida cristalográfica de rayos X del cristal del fragmento Fab del anticuerpo 6RL#9 en presencia de Ca Se determinó la estructura cristalina del fragmento Fab del anticuerpo 6RL#9 en presencia de Ca mediante un método de reemplazo molecular usando el programa Phaser (CCP4 Software Suite). Se estimó el número de moléculas en una unidad asimétrica para ser uno del tamaño de la celosía cristalina y el peso molecular del fragmento Fab del anticuerpo 6RL#9. Basado en la homología de la secuencia primaria, una porción de las posiciones del aminoácido 112 a 220 de la cadena A y una porción de las posiciones del aminoácido 116 a 218 de la cadena B en el coordenada conformacional del código PDB de 1ZA6 se usaron como las moléculas modelo para analizar las regiones CL y CH1. Entonces, una porción de las posiciones de aminoácidos 1 a 115 de la cadena B en la coordenada conformacional de código 1ZA6 de PDB se usó como una molécula modelo para analizar la región VH. Finalmente, se usó una porción de las posiciones de aminoácidos 3 a 147 de la cadena ligera en la coordenada conformacional del código PDB de 2A9M como una molécula modelo para analizar la región VL. Basado en este orden, se obtuvo un modelo de estructura inicial para el fragmento Fab del anticuerpo 6RL#9 mediante la determinación de las funciones de traducción y giro de las posiciones y las orientaciones de las moléculas modelo para el análisis en la celosía cristalina. El factor de confiabilidad R cristalográfico para los datos de reflexión de 25 a 3.0 A de resolución fue 46.9% y R Libre fue 48.6% después del refinamiento del cuerpo rígido donde los dominios VH, VL, CH1, y CL cada uno se dejó desviarse desde el modelo de estructura inicial. Entonces, se logró el refinamiento modelo repitiendo el refinamiento estructural usando el programa Refmac5 (CCP4 Software Suite) seguido por la revisión modelo realizada usando el programa Coot (Paul Emsiey) con referencia a los mapas de densidad de electrón FO-Fc y 2Fo-F donde se calcularon los coeficientes FO-Fc y 2Fo-Fc usando el factor Fo estructural experimental determinado, factor Fe estructural se calculó basado en el modelo, y las fases. Se realizó el refinamiento final usando el programa Refmac5 (CCP4 Software Suite) basado en los mapas de densidad de electrón FO-Fc y 2Fo-F agregando la molécula de agua y el ion de Ca en el modelo. Con 21,020 datos de reflexión de 25 a 2.2 A de resolución, eventualmente el factor de confiabilidad R cristalográfico se convirtió en 20.0% y R libre se convirtió en 27.9% para el modelo que consiste de 3440 átomos. (8-9) Medida de los datos de difracción de rayos X del cristal de del fragmento Fab del anticuerpo 6RL#9 en ausencia de Ca Se determinó la estructura cristalina del fragmento Fab del anticuerpo 6RL#9 en ausencia de Ca basada en la estructura del cristal preparado en presencia de Ca. Se omitieron las moléculas de iones de agua y Ca de la coordenada conformacional del cristal del fragmento Fab del anticuerpo 6RL#9 preparado en presencia de Ca. El factor confiabilidad R cristalográfico para los datos de reflexión de 25 a 3.0 A de resolución fue del 30.3% y R Libre fue 31.7% después del refinamiento del cuerpo rígido donde los dominios de VH, VL, CH1, y CL cada uno se dejaron desviarse. Entonces, el refinamiento modelo se logró repitiendo el refinamiento estructural usando el programa Refmac5 (CCP4 Software Suite) seguido por la revisión modelo realizada usando el programa Coot (Paul Emsiey) con referencia a los mapas de densidad de electrón FO-Fc y 2Fo-Fc donde se calcularon los coeficientes FO-Fc y 2Fo-Fc usando el factor Fe estructural experimentalmente determinado, el factor Fe estructural calculado basado en el modelo, y las fases. Se realizó el refinamiento final usando el programa Refmac5 (CCP4 Software Suite) basado en los mapas de densidad de electrón FO-Fc y 2Fo-F al agregar la molécula de agua y el ion de Ca en el modelo. Con 18,357 datos de reflexión a 25 a 2.3 A de resolución, eventualmente el factor de confiabilidad R cristalográfico se convirtió al 20.9% y R libre se convirtió al 27.7% para el modelo que consiste de 3351 átomos. (8-10) Comparación de datos de difracción cristalográfica de ravos X de los fragmentos Fab del anticuerpo 6RL#9 entre la presencia y la ausencia de Ca Cuando las estructuras cristalográficas de los fragmentos Fab del anticuerpo 6RL#9 se compararon entre la presencia y la ausencia de Ca, los cambios se significantes se ven en la cadena pesada CDR3. La estructura de la cadena pesada CDR3 del fragmento Fab del anticuerpo 6RL#9 determinada por la cristalografía de rayos X se muestra en la Fig. 14. Específicamente, un ion de calcio residió en el centro de la región de bucle de cadena pesada CDR3 del fragmento Fab del anticuerpo 6RL#9 preparado en presencia de Ca. El ion de calcio fue asumido para interactuar con las posiciones 95, 96, y 100a (numeración de Kabat) de la cadena pesada CDR3. Se creyó que el bucle de cadena pesada CDR3 que es importante para la unión al antígeno se estabilizó por la unión al calcio en presencia del Ca, y se convirtió en una estructura óptima para la unión al antígeno. No hay reporte que demuestre que el calcio une a la cadena pesada CDR3 del anticuerpo. Así, la estructura unida al calcio del anticuerpo de cadena pesada CDR3 es una nueva estructura. La cadena pesada CDR3 se conoce para ser la más importante para la unión al antígeno. El motivo para el cual el ion de calcio se requiere para mantener la estructura de la cadena pesada CDR3, revelada como se describe en el presente Ejemplo, implica que el ion de calcio desempeña un papel importante en la unión al antígeno. Específicamente, es altamente plausible que los anticuerpos con este motivo unen a un antígeno de una manera dependiente del ion de calcio. Por ejemplo, cuando una biblioteca sintética que tiene este motivo se preparó, uno puede eficientemente aislar los anticuerpos de unión dependientes de calcio de la biblioteca.
Ejemplo 9 Preparación de anticuerpos que unen a IL-6 de una manera con Ca dependiente de una biblioteca del anticuerpo humano usando técnicas de exhibición de fago (9-1) Construcción de una biblioteca de exhibición de fago de los anticuerpos humanos sin tratamiento Se construyó una biblioteca de exhibición de fago del anticuerpo humano que contiene múltiples fagos que exhiben varias secuencias de dominio Fa del anticuerpo humano mediante un método conocido por los expertos en la técnica que usaron, como un molde, el ARN polyA preparado de PBMC humano, el polyA ARN humano comercialmente disponible, y similares. (9-2) Preparación de los fragmentos de anticuerpos gue unen al antígeno de una manera con Ca dependiente de la biblioteca mediante la selección de pelotillas Se realizó la selección primaria de la biblioteca de exhibición de fago construida de los anticuerpos humanos sin tratamiento mediante el enriquecimiento de fragmentos de anticuerpos que tienen la actividad de unión al antígeno (IL-6). El antígeno usado fue IL-6 etiquetado con biotina.
Se produjeron los fagos de E. Coli que llevaba el fagémido construido para la exhibición da fago. Para precipitar los fagos producidos mediante E. Coli, se agregó 2.5 M de NaCI/10% de PEG al medio de cultivo de E. Coli. Se diluyó la fracción da fago con TBS para preparar una solución de bibliotecas en fago. Entonces, se agregaron BSA y CaCI2 a la solución de biblioteca en fago a concentraciones finales de 4% y 1.2 mM de concentración de ion de calcio, respectivamente. El método de selección usado fue un método de selección convencional que usa pelotillas magnéticas del antígeno inmovilizado (J. Immunol. Methods. (2008) 332(1-2): 2-9; J. Immunol. Methods. (2001) 247(1-2): 191-203; Biotechnol. Prog. (2002) 18(2): 212-20; Mol. Cell Proteomics (2003) 2(2): 61-9). Las pelotillas magnéticas usadas fueron pelotillas recubiertas con NeutrAvidin (Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated) y pelotillas recubiertas con Streptavidin (Dynabeads M-280 Streptavidin) .
Específicamente, se agregaron 250 pmol del antígeno etiquetado con biotina a la solución de biblioteca en fago preparada. Así, la solución se puso en contacto con el antígeno a temperatura ambiente durante 60 minutos. Se agregaron las pelotillas magnéticas bloqueadas con BSA, y el complejo de fago del antígeno se dejó unir a las pelotillas magnéticas a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se lavaron las pelotillas tres veces con 1.2 mM de CaCI2/TBST (TBST que contiene 1.2 mM de CaCI2), y después dos veces con 1 mi de 1.2 mM de CaCI2/TBS (TBS que contiene 1.2 mM de CaCI2). Después de esto, se agregaron 0.5 mi de 1 mg/ml de tripsina a las pelotillas. Después de 15 minutos de dispersión a temperatura ambiente, las pelotillas inmediatamente se separaron usando un soporte magnético para recolectar una suspensión de fago. Se agregó la suspensión de fago preparada a 10 mi de E. Coli de la cepa TG1 en la fase de crecimiento logarítmica (OD600 = 0.4 a 0.5). Se incubó el E. Coli con agitación suave a 37°C durante una hora para infectar los fagos. Se sembró el E. Coli infectado en una placa (225 mM x 225 mM). Entonces, se recolectaron los fagos del medio de cultivo de E. Coli sembrada para preparar una solución de biblioteca en fago.
En la segunda ronda y selección subsecuente, se enriquecieron los fagos usando la actividad de unión con Ca dependiente como un indicador. Específicamente, se agregaron 40 pmol del antígeno etiquetado con biotina a la solución de biblioteca en fago preparada. Así, la biblioteca da fago se puso en contacto con el antígeno a temperatura ambiente durante 60 minutos. Se agregaron las pelotillas magnéticas bloqueadas con BSA, y el complejo de fago del antígeno se dejó unir a las pelotillas magnéticas a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se lavaron las pelotillas con 1 mi de 1.2 mM de CaCI2/TBST y 1.2 mM de CaCI2/TBS. Después, se agregaron 0.1 mi de 2 mM de EDTA/TBS a las pelotillas. Después de la dispersión a temperatura ambiente, las pelotillas se separaron inmediatamente usando un soporte magnético para recolectar una suspensión de fago. Se dividió la proteína plll (proteína plll derivada del fago auxiliar) a partir de fagos que no exhiben Fab mediante la adición de 5 µ? de 100 mg/ml de tripsina a la suspensión de fago recolectada para eliminar la capacidad de los fagos de no exhiben ningún Fab para infectar E. Coli. Se agregaron los fagos recolectaron a partir del material de fago líquido tripsinizado a 10 mi de células E. Coli de la cepa TG1 en la fase de crecimiento logarítmica (OD600 = 0.4 a 0.7). Se incubó el E. Coli, mientras se agita suavemente a 37°C durante una hora al fago infectado. Se sembró el £. Coli infectado en una placa (225 mM x 225 mM). Entonces, se recolectaron los fagos del medio de cultivo del £. Coli sembrado para preparar un material líquido de la biblioteca de expresión en fago. La selección se realizó tres veces usando la actividad de unión con Ca dependiente como un indicador. (9-3) Valoración por ELISA fago Se recolectaron los sobrenadantes de cultivo que contienen fagos de las únicas colonias de E. Coli obtenidas mediante el método descrito antes de acuerdo con un método convencional (Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145). Se agregaron BSA y CaCI2 en las concentraciones finales de 4% y 1.2 mM de concentración de ion de calcio, respectivamente, a los sobrenadantes de cultivo que contienen el fago. Se sometieron los sobrenadantes a ELISA mediante el siguiente procedimiento. Se cubrió una placa de microtítulo de 96 pozos StreptaWell (Roche) durante la noche con 100 µ? de PBS que contiene el antígeno etiquetado con biotina. Se eliminó el antígeno lavando cada pozo de la placa con PBST. Entonces, se bloquearon los pozos con 250 µ? de 4% de BSA-TBS durante una hora o más. Después de la eliminación del 4% de BSA-TBS, se agregaron los sobrenadantes de cultivo preparados a cada pozo. Se incubó la placa a 37°C durante una hora de modo que los fagos de exhibición de anticuerpos se dejarán unir al antígeno en cada pozo. Después de que se lavó cada pozo con 1.2 mM de CaCI2/TBST, se agregaron 1.2 mM de CaCI2/TBS o 1 mM de EDTA/TBS. Se dejó la placa para la incubación a 37°C durante 30 minutos. Después de lavar con 1.2 mM de CaCI2/TBST, se diluido un anticuerpo anti-M13 conjugado con HRP (Amersham Pharmacia Biotech) con TBS que contiene BSA y el ion de calcio en las concentraciones finales de 4% y se agregaron 1.2 mM de concentración de iones de calcio a cada pozo, y se incubó la placa durante una hora. Después de lavar con 1.2 mM de CaCI2/TBST, se agregó la sola solución de TMB (ZYMED) a cada pozo. Se detuvo la solución cromogénica en la solución de cada pozo mediante la adición de ácido sulfúrico. Entonces, se evaluó el color desarrollado al medir la absorbencia a 450 nM.
A partir de los 96 clones aislados, los anticuerpos 6KC4-1#85, 6LC4-1#15, y 6LC4-2#16 que tenían actividad de unión al IL-6 con Ca dependiente se obtuvieron mediante ELISA en fago. Usando los fragmentos de anticuerpos que se predijeron para tener una actividad de unión al antígeno con Ca dependiente basada en el resultado de ELISA en fago descrito antes como un molde, se amplificaron los genes con los cebadores específicos y sus secuencias se analizaron. Las secuencias de región variable de cadena pesada y de cadena ligera del anticuerpo 6KC4-1#85 se muestran en las SEC ID NO: 25 y 26, respectivamente. El polinucleótido que codifica la región variable de cadena pesada del anticuerpo 6KC4-1#85 (SEC ID NO: 25) se ligó a un polinucleótido que codifica una secuencia derivada de I g G 1 (SEC ID NO: 65) mediante el método de PCR. Se insertó el fragmento de ADN resultante en un vector de expresión de célula animal para construir gn vector de expresión para la cadena pesada de la SEC ID NO: 27. Se ligó un polinucleótido que codifica la región variable de cadena ligera del anticuerpo 6KC4-1#85 (SEC ID NO: 26) a un polinucleótido que codificaba la región constante de la cadena de Kappa natural (SEC ID NO: 28) mediante PCR. Se insertó un fragmento de ADN que codifica la secuencia ligada mostrada en la SEC ID NO: 29 en un vector de expresión de célula animal. Usando el mismo método, el anticuerpo 6LC4-1#15 (cadena pesada de la SEC ID NO: 68; cadena ligera de la SEC ID NO: 69) y el anticuerpo 6LC4-2#16 (cadena pesada de la SEC ID NO: 70; cadena ligera de la SEC ID NO: 71) también se insertaron en los vectores de expresión de célula. Las secuencias de las variantes construidas se confirmaron mediante un método conocido por los expertos en la técnica. (9-4) Expresión y purificación de los anticuerpos Se insertaron los clones que se predijeron para tener una actividad de unión al antígeno con Ca dependiente basada en el resultado de ELISA en fago en los plásmidos de expresión de célula animal. Se realizó la expresión de anticuerpo mediante el siguiente método. Se suspendieron las células FreeStyle 293-F derivadas de célula de riñon fetal humano (Invitrogen) en el Medio de Expresión FreeStyle 293-F (Invitrogen), y se aplicaron en una densidad celular de 1.33 x 10 células/ml (3 mi) en cada pozo de una placa de 6 pozos. Se introdujeron los plásmidos preparados en las células mediante un método de lipofección. Se cultivaron las células durante cuatro días en una incubadora de C02 (37°C, 8% de C02, 90 rpm). A partir de los sobrenadantes de cultivo, se purificaron los anticuerpos usando rProtein A Sepharose™ Fast Flow (Amersham Biosciences) mediante un método conocido por los expertos en la técnica. Se midió la absorbencia a 280 nM de las soluciones de anticuerpos purificados usando un espectrofotómetro. Se calcularon las concentraciones de anticuerpos a partir de los valores determinados usando un coeficiente de extinción calculado mediante el método PACE (Protein Science (1995) 4: 2411-2423). (9-5) Análisis de unión de los anticuerpos con calcio dependientes anti-l L6 Usando Biacore T100 (GE Healthcare), se evaluaron los anticuerpos preparados para su actividad de unión (KD de disociación constante (M)) al interleucina 6 humana (hlL6, por sus siglas en inglés) a pH 7.4. Se realizó La medición usando como un amortiguador de análisis 0.05% de Tween20, 10 mmol/l de ACES, 150 mmol/l de NaCI (pH 7.4) que contiene 3 µ? o 1.2 mM de CaCI2.
Después se inmovilizó una cantidad adecuada de proteína recombinante A/G (Thermo Scientific) sobre la matriz de detección CM5 (GE Healthcare) mediante un método de combinación amino, los anticuerpos se dejaron unir a la misma. Se inyectó una concentración apropiada de hlL6 (interleucina 6 humana; Kamakura Techno-Ciencia, Inc.) como un analito para interactuar con los anticuerpos en la matriz de detección. Entonces, se regeneró la matriz de detección mediante la inyección de 10 mmol/l de glicina-HCI (pH 1.5). Se realizó La medición a 37°C. El sensograma que resulta de La medición se muestra en la Fig. 15. El resultado demuestra que los anticuerpos 6LC4-1 #15-lgG 1 , 6LC4-2#16^lgG 1 , y 6KC4-1 #85-lgG 1 tenían unión a la hlL6 más débil bajo una condición de 3 µ? de concentración Ca2+ que a 1.2 mM. El hallazgo descrito anteriormente sugiere que este método es aplicable a otros antígenos ya que la propiedad de unión al antígeno dependiente de calcio se probó para la IL-6 así como para la IL-6R demostrada en el Ejemplo 3.
[Ejemplo 10] Evaluación del anticuerpo 6KC4-1#85 para la unión al ion de calcio (10-1) Evaluación del anticuerpo 6KC4-1#85 para la unión al ion de calcio El anticuerpo 6KC4-1#85 de unión al antígeno dependiente de calcio el cual se aisló a partir de una biblioteca de anticuerpo humano se evaluó para su unión al calcio. Si el valor de Tm medido varía dependiendo de la condición de concentración de calcio ionizado se evaluó mediante el método descrito en el Ejemplo 4.
Los valores para el dominio de Fab del anticuerpo 6KC4-1#85 se muestran en la Tabla 11. Como se muestra en la Tabla 11, el valor de Tm del dominio de Fab del anticuerpo 6KC4-1#85 varió dependiendo de la concentración de ion de calcio. Esto demuestra que el anticuerpo 6KC4-1#85 une al calcio.
Tabla 11 ( 10-2) Identificación del sitio de unión al ion de calcio en el anticuerpo 6KC4-1#85 Como se demuestra en (10-1) del Ejemplo 10, el anticuerpo 6KC4-1#85 une al ion de calcio. Sin embargo, 6KC4-1#85m no tiene un motivo de unión al calcio como la secuencia hVk5-2 descrita más adelante. Así, para identificar los residuos responsables para la unión al ion de calcio del anticuerpo 6KC4-1#85, las cadenas pesadas alteradas (6_H1-11 (SEC ID NO: 30), 6_H1-12 (SEC ID NO: 31), 6_H1-13 (SEC ID NO: 32), 6_H1-14 (SEC ID NO: 33), 6_H1-15 (SEC ID NO: 34)) y las cadenas ligeras alteradas (6_L1-5 (SEC ID NO: 35) y 6_L1-6 (SEC ID NO: 36)) se construyeron al sustituir un residuo Asp (D) en la CDR del anticuerpo 6KC4-1#85 con un residuo Ala (A) que no participa en la unión o la quelación del ion de calcio. Mediante el método descrito en el Ejemplo 2, se purificaron los anticuerpos alterados a partir de los sobrenadantes de cultivo de las células animales introducidas con los vectores de expresión que llevaban los genes del anticuerpo alterado. Se evaluaron los anticuerpos alterados purificados para su unión al calcio mediante el método descrito en el Ejemplo 4. El resultado de La medición se muestra en la Tabla 12. Tabla 12 Como se muestra en la Tabla 12, la sustitución de un residuo Ala para el residuo en la posición 95 o 101 (numeración de Kabat) en la cadena pesada CDR3 del anticuerpo 6KC4-1#85 dio lugar a la pérdida de la actividad de unión al calcio del anticuerpo 6KC4-1#85. Esto sugiere que estos residuos son responsables de la unión al calcio. Fue demostró que el motivo de unión al calcio alrededor de la base del bucle de la cadena pesada CDR3 en el anticuerpo 6KC4-1#85, que se identificó basado en la actividad de unión al calcio de los anticuerpos alterados a partir del anticuerpo 6KC4-1#85, se podría también usar como una porción de unión al calcio en el dominio de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno de la presente invención. Como el motivo revelado como se describe en el Ejemplo 8, este motivo de unión al calcio está localizado en la cadena pesada CDR3. Así, del mismo modo, por ejemplo, cuando una biblioteca sintética que tiene este motivo se construye, los anticuerpos de unión dependiente de calcios se pueden eficientemente aislar a partir de la biblioteca.
Ejemplo 11 Búsqueda de secuencias de línea germinal humana que unen al ion de calcio (11-1) Aislamiento de las secuencias de línea germinal humana Los anticuerpos de unión al ion de calcio que contienen las secuencias de línea germinal humana no se han reportado. Así, las secuencias de línea germinal de los anticuerpos que tienen las secuencias de línea germinal humana se clonaron usando como el cADN de molde preparado a partir del Poli-ARN del bazo fetal humano (Clontech) para evaluar si los anticuerpos que tienen las secuencias de línea germinal humana unen al ion de calcio. Se insertaron los fragmentos del ADN clonado en los vectores de expresión de célula animal. Se determinaron las secuencias de nucleótido de los vectores de expresión construidos mediante un método conocido por los expertos en la técnica. Las SEC de ID se muestran en la Tabla 13. Mediante la PCR, polinucleótidos que codifican la SEC ID NO: 37 (Vk1), SEC ID NO: 38 (Vk2), SEC ID NO: 39 (Vk3), SEC ID NO: 40 (Vk4), y SEC ID NO: 41 (Vk5) se ligaron a un polinucleotido que codifica la región constante de cadena kappa natural (SEC ID NO: 28). Se insertaron los fragmentos de ADN ligados en los vectores de expresión de célula animal. Además, los polinucleótidos que codifican la SEC ID NO: 42 (Vk1), SEC ID NO: 43 (Vk2), SEC ID NO: 44 (Vk3), SEC ID NO: 45 (Vk4), y SEC ID NO: 46 (Vk5) se ligaron mediante PCR a un polinucleotido que codifica un polipéptido (SEC ID NO: 65) que tienen una supresión de dos aminoácidos en la C terminal de IgG 1. Se insertaron los fragmentos de ADN resultantes en los vectores de expresión de célula animal. Se confirmaron las secuencias de las variantes construidas mediante un método conocido por los expertos en la técnica.
Tabla 13 (11-2) Expresión y purificación de anticuerpos Se introdujeron los vectores de expresión de célula animal construidos insertados con los fragmentos del ADN que tienen los cinco tipos de secuencias de línea germinal humana en las células animales. La expresión anticuerpo se realizó mediante el siguiente método. Se suspendieron las células FreeStyle 293-F derivadas de células de riñón fetal humano (Invitrogen) en el Medio de Expresión FreeStyle 293 (Invitrogen), y se aplicaron en una densidad celular de 1.33 x 106 células/ml (3 mi) en cada pozo de una placa de 6 pozos. Se introdujeron los plásmidos preparados en las células mediante un método de lipofección. Se cultivaron las células durante cuatro días en una incubadora de C02 (37°C, 8% de C02, 90 rpm). A partir de los sobrenadantes de cultivo preparados como se describe anteriormente, se purificaron los anticuerpos usando el rProtein A SepharoseTM Fast Flow (Amersham Biosciences) mediante un método conocido por los expertos en la técnica. Se midió la absorbencia a 280 nM de las soluciones de anticuerpos purificados usando un espectrofotómetro. Se calcularon las concentraciones de anticuerpos de los valores determinados usando un coeficiente de extinción calculado mediante el método PACE (Protein Science (1995) 4: 2411-2423). (11 -3) Evaluación de anticuerpos que tienen las secuencias de línea germinal humana para su actividad de unión al ion de calcio Se evaluaron los anticuerpos purificados para su actividad de unión al ion de calcio. Se dializaron los anticuerpos purificados (EasySEP, TOMY) contra una solución que contiene 20 mM de Tris-HCI, 150 mM de NaCI, y 2 mM de CaCI2 (pH 7.4), o 20 mM de Tris-HCI, 150 mM de NaCI, y 3 µ? de CaCI2 (pH 7.4). Se ajustaron las soluciones de anticuerpo como una sustancia de prueba a 0.1 mg/ml usando la misma solución usada para la diálisis, y se realizó La medición de DSC a un velocidad de aumento de temperatura de 240°C/hr desde 20 a 115°C. Basado en las curvas de desnaturalización de DSC obtenidas, se calculó la temperatura de punto medio de la desnaturalización térmica (valor Tm) para el dominio de Fab de cada anticuerpo. Los valores de Tm se muestran en la Tabla 14.
Tabla 14 El resultado mostró que los valores de Tm de los dominios de Fab de los anticuerpos que tienen la secuencia hVkl, hVk2, hVk3, o hVk4 no variaron dependiendo de la concentración del ion de calcio en las soluciones que contienen el dominio de Fab. Mientras tanto, el valor de Tm para el dominio de Fab del anticuerpo que tiene la secuencia hVk5 varió dependiendo de la concentración del ion de calcio en la solución que contiene el dominio de Fab. Esto demuestra que la secuencia hVk5 une al ion de calcio.
Ejemplo 12 Evaluación de la secuencia Vk5 humana (hVk5) (12-1) Secuencia hVk5 La única secuencia hVk5 registrada en la base de datos de Kabat es la secuencia hVk5-2. Más adelante, hVk5 y hVk5-2 se usaron sinónimamente. (12-2) Construcción, expresión, y purificación de una forma no glicosilada de la secuencia hVk5-2 La secuencia hVk5-2 tiene una secuencia para la glicosilación N en el aminoácido de posición 20 (numeración de Kabat). Las cadenas de azúcar unidas a las proteínas exhiben heterogeneidad. Así, es deseable perder la glicosilación del punto de vista de la homogeneidad de sustancia. En este contexto, se construyó la variante hVk5-:2_L65 (SEC ID NO: 47) en la cual se sustituye el residuo Asn (N) en la posición 20 (numeración de Kabat) con Thr (T). Se realizó la sustitución del aminoácido mediante un método conocido por los expertos en la técnica usando el Kit de Mutagénesis Dirigida al Sitio QuikChange (Stratagene). Se insertó un ADN que codificaba la variante hVk5-2_L65 en un vector de expresión animal. El vector de expresión animal insertado con el ADN construido que codifica la variante hVk5-2_L65, en combinación con un vector de expresión animal que tiene un inserto para expresar CIM_H (SEC ID NO: 48) como una cadena pesada, se introdujo en las células animales mediante el método descrito en el Ejemplo 2. El anticuerpo que comprende hVk5-2_L65 y CIM_H, que se expresó en las células animales introducido con los vectores, se purificó mediante el método descrito en el Ejemplo 2. ( 12-3) Evaluación del anticuerpo que tiene la secuencia no qlicosilada hVk5-2 para las propiedades físicas Se analizó el anticuerpo aislado que tiene la secuencia hVk5-2_L65 modificada mediante la cromatografía de intercambio iónico para probar si es menos heterogéneo que el anticuerpo que tiene la secuencia hVk5-2 original antes de la modificación. El procedimiento de la cromatografía de intercambio iónico se muestra en la Tabla 15. El resultado del análisis mostró que el hVk5-2_L65 modificado en el sitio de glicosilación fue menos heterogéneo que la secuencia hVk5-2 original, como se muestra en la Fig. 16.
Tabla 15 Después, si el anticuerpo que comprende la secuencia hVk5- 2_L65 menos heterogénea une al ion de calcio se evaluó mediante el método descrito en el ejemplo 4. El resultado mostró que el valor Tm para el dominio de Fab del anticuerpo que tiene hVk5-2_L65 con el sitio de glicosilación alterado también varió dependiendo de la concentración del ion de calcio en las soluciones del anticuerpo, como se muestra en la Tabla 16. Específicamente, se demostró que el dominio de Fab del anticuerpo que tiene hVk5-2_L65 con el sitio de glicosilación alterado une al ion de calcio.
Tabla 16 Ejemplo 13 Evaluación de la actividad de unión al ion de calcio de las moléculas del anticuerpo que tienen la secuencia de CDR de la secuencia hVk5-2 (13-1) Construcción, expresión. y purificación de los anticuerpos modificados que tienen una secuencia de CDR de la secuencia hVk5-2 La secuencia hVk5-2_L65 es una secuencia con aminoácidos alterados en un sitio de glicosilación en el marco de la secuencia Vk5-2 humana. Como se describe en el Ejemplo 12, se demostró que el ion de calcio se unió incluso después la alteración del sitio del glicosilación. Mientras tanto, a partir del punto de vista de la inmunogenicidad, es generalmente deseable que la secuencia de marco sea una secuencia de línea germinal. Así, los presentes inventores evaluaron si una secuencia de marco del anticuerpo se podría sustituir con la secuencia de marco de una secuencia de línea germinal no glicosilada, mientras que mantenía la actividad de unión al ion de calcio del anticuerpo.
Los polinucleótidos que codifican las secuencias químicamente sintetizadas que comprenden una secuencia de marco alterada de la secuencia hVk5-2, hVkl, hVk2, hVk3, o hVk4 (CaVkl (SEC ID NO: 49), CaVk2 (SEC ID NO: 50), CaVk3 (SEC ID NO: 51), o CaVk4 (SEC ID NO: 52), respectivamente) se ligaron mediante la PCR a un polinucleótido que codifica la región constante (SEC ID NO: 28) de la cadena de Kappa natural. Se insertaron los fragmentos del ADN ligado en los vectores de expresión de célula animal. Se confirmaron las secuencias de las variantes construidas mediante un método conocido por los expertos en la técnica. Se introdujo cada plásmido construido como se describe anteriormente en las células animales en combinación con un plásmido insertado con un polinucleótido que codifica CIM_H (SEC ID NO: 48) mediante el método descrito en el Ejemplo 2. Se purificaron las moléculas del anticuerpo expresadas de interés a partir del medio de cultivo de las células animales introducidas con los plásmidos. ( 13-2) Evaluación de los anticuerpos alterados que tienen la secuencia de CDR de la secuencia hVk5-2 para su actividad de unión al ion de calcio Si el ion de calcio une a los anticuerpos alterados que tienen la secuencia de CDR de la secuencia hVk5-2 y las secuencias de marco de la secuencias de línea germinal con excepción de hVk5-2 (hVkl, hVk2, hVk3, y hVk4) se evaluaron mediante el método descrito en el Ejemplo 4. El resultado de evaluación se muestra en la Tabla 17. El valor de Tm del dominio de Fab de cada anticuerpo alterado se reveló para variar dependiendo de la concentración del ion de calcio en las soluciones de anticuerpo. Esto demuestra que los anticuerpos que tienen una secuencia de marco con excepción de las secuencias de marco de la secuencia hVk5-2 también unen al ion de calcio. Específicamente, se demostró que el motivo en la secuencia de CDR de la secuencia hVk5-2 es responsable de la unión al ion de calcio, mientras que el marco puede ser cualquier secuencia de marco.
Tabla 17 La temperatura de desnaturalización térmica (valor de Tm), como un indicador de la estabilidad térmica, del dominio de Fab de cada anticuerpo alterado para tener la secuencia de CDR de la secuencia hVk5-2 y la secuencia de marco de una secuencia de línea germinal con excepción de la secuencia hVk5-2 (hVkl, hVk2, hVk3, o hVk4) se demostró para ser mayor que la del dominio de Fab del anticuerpo original que tiene la secuencia hVk5-2. Este resultado muestra que los anticuerpos que tienen la secuencia de CDR de la secuencia hVk5-2 y la secuencia de marco de hVkl, hVk2, hVk3, o hVk4 no sólo tienen actividad de unión al ion de calcio sino también son las moléculas excelentes del punto de vista de la estabilidad térmica.
Ejemplo 14 Identificación del sitio de unión al ion de calcio en la secuencia hVk5-2 de línea germinal humana (14-1) Diseño de sitio de mutación en la secuencia de CDR de la secuencia hVk5-2 Como se describe en el Ejemplo 13, los anticuerpos que tienen la cadena ligera que resulta de la introducción del dominio de CDR de la secuencia hVk5-2 en la secuencia de marco de una diferente secuencia de línea germinal también se demostraron al unir al ion de calcio. Este resultado sugiere que en hVk5-2 un sitio de unión al ion de calcio está localizado dentro de su CDR. Los aminoácidos que unen al ion de calcio, es decir, el ion de calcio de quelato, incluyen los aminoácidos negativamente cargados y los aminoácidos que pueden ser un aceptador de unión al hidrógeno. Así, se probó si los anticuerpos que tienen una secuencia hVk5-2 muíante con una sustitución de un residuo Ala (A) para un residuo Asp (D) o Glu (E) en la secuencia de CDR de la secuencia hVk5-2 unida al ion de calcio. ( 14-2) Construcción de las secuencias hVk5-2 variantes con sustitución de Ala, y expresión y purificación de anticuerpos Se prepararon las moléculas de anticuerpo para comprender una sustitución de una cadena ligera de un residuo Ala para el residuo Asp y/o Glu en la secuencia de CDR de la secuencia hVk5-2. Como se describe en el Ejemplo 12, el hVk5-2_L65 variante no glicosilado exhibió la unión al ion de calcio y fue asumió para ser equivalente a la secuencia hVk5-2 en términos de la unión al ion de calcio. En este ejemplo, las sustituciones del aminoácido se introdujeron en hVk5-2_L65 como una secuencia de molde. Las variantes construidas se muestran en la Tabla 18. Se realizaron las sustituciones del aminoácido mediante los métodos conocidos por los expertos en la técnica como usando el Kit de Mutagénesis Dirigida al Sitio QuikChange (Stratagene), PCR, o en el In fusión Advantage PCR Cloning Kit (TAKARA) para construir los vectores de expresión para las cadenas ligeras alteradas que tienen una sustitución del aminoácido.
Tabla 18 Las secuencias de nucleótido de los vectores de expresión construidos se confirmaron mediante un método conocido por los expertos en la técnica. Los vectores de expresión construidos para las cadenas ligeras alteradas se introdujeron transitoriamente, en combinación con un vector de expresión para la cadena pesada CIM_H (SEC ID NO: 48), en células de la línea HEK293H derivada de célula de riñón fetal humano (Invitrogen) o FreeStyle293 (Invitrogen) para expresar los anticuerpos. A partir de los sobrenadantes obtenidos de cultivo, se purificaron los anticuerpos usando el rProtein A SepharoseTM Fast Flow (GE Healthcare) mediante un método conocido por los expertos en la técnica. Se midió la absorbencia a 280 nM de las soluciones de anticuerpos purificados usando un espectrofotómetro. Se calcularon las concentraciones de anticuerpos a partir de los valores determinados usando un coeficiente de extinción calculado mediante el método PACE (Protein Science (1995) 4: 2411-2423). ( 4-3) Evaluación de la actividad de unión al ion de calcio de los anticuerpos que tienen una sustitución de Ala en la secuencia hVk5-2 Ya sea que los anticuerpos purificados obtenidos unen al ion de calcio se probó. Específicamente, se dializaron los anticuerpos purificados (EasySEP, TOMY) contra la solución de 20 mM de Tris-HCI/150 mM de NaCI/2 mM de CaCI2 (pH 7.5) o la solución de 20 mM de Tris-HCI/150 mM de NaCI (pH 7.5) (en la Tabla 19, indicada como 0 µ? de concentraciones del ion de calcio). Se realizó La medición de DSC a un velocidad de aumento de temperatura de 240°C/hr desde 20 a 115°C usando las soluciones de anticuerpo preparadas en una concentración de 0.1 mg/ml por la misma solución usada para la diálisis. Basado en las curvas de desnaturalización de DSC obtenidas, se calculó la temperatura intermedia de la desnaturalización térmica (valor de Tm) para el dominio de Fab de cada anticuerpo como se muestra en la Tabla 19. Algunos anticuerpos que tienen la sustitución de un residuo Asp o Glu en la secuencia de CDR de la secuencia hVk5-2 con un residuo Ala que no se puede implicar en la unión o quelación del ion de calcio se revelaron para tener un dominio de Fab cuyo Tm no varió mediante la concentración del ion de calcio en las soluciones de anticuerpo. Los sitios de sustitución en los cuales la sustitución de Ala no alteró el Tm (posiciones 32 y 92 (numeración de Kabat)) se demostraron para ser en gran medida importantes para la unión al ion de calcio-anticuerpo.
Tabla 19 Ejemplo 15 Evaluación de la actividad de unión al ion de calcio de los anticuerpos que tienen la secuencia hVkl con el motivo de unión al ion de calcio (15-1) Construcción de una secuencia hVkl con el motivo de unión al ion de calcio, v expresión y purificación de anticuerpos El resultado descrito en el Ejemplo 14 en la actividad de unión al calcio del sustituyente Ala demuestra que los residuos Asp o Glu en la secuencia de CDR de la secuencia hVk5-2 fueron importantes para la unión al calcio. Así, los presentes inventores evaluaron si un anticuerpo puede unir al ion de calcio cuando los residuos en las posiciones 30, 31, 32, 50, y 92 (numeración de Kabat) solamente se introdujeron en una diferente secuencia de región variable de línea germinal. Específicamente, se construyó la variante LfVk1_Ca (SEC ID NO: 61) al sustituir los residuos en las posiciones 30, 31, 32, 50, y 92 (numeración de Kabat) en la secuencia hVk5-2 para los residuos en las posiciones 30, 31, 32, 50, y 92 (numeración de Kabat) en la secuencia hVkl (una secuencia de línea germinal humana). Específicamente, se probó si los anticuerpos que tienen una secuencia hVkl introducida con solamente 5 residuos de la secuencia hVk5-2 pueden unir al calcio. Las variantes se produjeron mediante el mismo método como se describe en el Ejemplo 2. La variante de cadena ligera resultante LfVk1_Ca y LfVkl que tienen la secuencia hVkl de cadena ligera (SEC ID NO: 62) se coexpresó con la cadena pesada CIM_H (SEC ID NO: 48). Se expresaron los anticuerpos y se purificaron mediante el mismo método como se describe en el Ejemplo 14. (15-2) Evaluación de la actividad de unión al ion de calcio de los anticuerpos que tienen una secuencia hVkl humana con motivo de unión al ion de calcio Si el anticuerpo purificado preparado como se describe anteriormente une al ion de calcio se evaluó mediante el método descrito en el Ejemplo 4. El resultado se muestra en la Tabla 20. El valor de Tm del dominio de Fab del anticuerpo que tiene LfVkl con una secuencia hVkl no varió dependiendo de la concentración de calcio en las soluciones de anticuerpo. Mientras tanto, el Tm del anticuerpo que tiene la secuencia de LfVk1_Ca se desplazó por 1eC o más sobre el cambió en la concentración de calcio en las soluciones de anticuerpo. Así, se mostró que el anticuerpo que tiene LfVk1_Ca une al calcio. El resultado descrito antes demuestra que la secuencia de CDR entera de hVk5-2 no es requerida, mientras que los residuos introducidos para la construcción de la secuencia LfVk1_Ca solamente son suficientes para la unión al ion de calcio.
Tabla 20 (15-3) Construcción, expresión, y purificación de la secuencia LfVkl Ca resistente a deqradación Como se describe en (15-2) del Ejemplo 15, la variante LfVk1_Ca (SEC ID NO: 61) se construyó para tener la sustitución de los residuos en las posiciones 30, 31, 32, 50, y 92 (numeración de Kabat) en la secuencia hVk5-2 para los residuos en las posiciones 30, 31, 32, 50, y 92 (numeración de Kabat) en la secuencia hVkl (una secuencia de línea germinal humana). Se demostró la variante para unir al ion de calcio. Así, uno puede considerar los anticuerpos con Ca dependientes (anticuerpos de unión a Ca) que tienen la secuencia de LfVk1_Ca. Sin embargo, puesto que la secuencia de LfVk1_Ca es una nueva secuencia, su estabilidad de almacenamiento como productos farmacéuticos es confusa. Así, la aplicabilidad de la secuencia LfVk1_Ca como productos farmacéuticos será aclarada. En este contexto, se evaluó la estabilidad de LfVk1_Ca mediante una prueba de aceleración térmica. Un anticuerpo que tiene LfVk1_Ca como una cadena L se d i a I izó contra una solución de 20 mM de histidina-HCI/150 mM de NaCI (pH 6.0) durante la noche a 4°C. Se ajustó la concentración de anticuerpo dializada a 0.5 mg/ml, y se almacenó a 5°C o 50°C durante tres días. Después del almacenamiento, se sometió cada anticuerpo a cromatografía de intercambio iónico mediante el método descrito en el Ejemplo 12. El resultado demostró que LfVk1_Ca se degradó significativamente durante tres días de almacenamiento a 50°C, como se muestra en la Fig. 17. La secuencia LfVk1_Ca tiene Asp en las posiciones 30, 31, y 32 (numeración de Kabat) y su secuencia CDR1 contiene así una secuencia Asp-Asp que se ha reportado para ser degradada bajo condiciones ácidas (J. Pharm. Biomed. Anal. (2008) 47(1): 23-30). Esto sugiere que los aminoácidos en las posiciones 30, 31, y 32 (numeración de Kabat) son un sitio de degradación posible. Entonces, para evitar la degradación de LfVk1_Ca, se construyeron las variantes LfVk1_Ca1 (SEC ID NO: 72), LfVk1_Ca2 (SEC ID NO: 73), y LfVk1_Ca3 (SEC ID NO: 74) para tener la sustitución de los residuos Ala (A) para los tres residuos Asp (D) que son posiblemente sensibles a la degradación. Se realizó la sustitución del aminoácido mediante un método conocido por los expertos en la técnica usando el Kit de Mutagénesis Dirigida al Sitio QuikChange (Stratagene). Se insertaron los ADN que codificaba las variantes en los vectores de expresión animal. En combinación con un vector de expresión animal que tiene un inserto para expresar GC H (SEC ID NO: 102) como la cadena pesada, se introdujeron los vectores de expresión animal construidos que llevaban los insertos del ADN para las variantes en las células animales mediante el método descrito en el Ejemplo 14. Se purificaron los anticuerpos expresados en las células animales introducidas con los vectores mediante el método descrito en el Ejemplo 14. (15-4) Evaluación de estabilidad de los anticuerpos que tienen la secuencia LfVkl Ca resistente a degradación Si los anticuerpos preparados como se describe en (15-3) del Ejemplo 15 fueron más resistentes a la degradación en soluciones a pH 6.0 que los anticuerpos originales que tienen la secuencia LfVk1_Ca proporcionada para la modificación se evaluó al comparar la heterogeneidad entre los anticuerpos respectivos después de la aceleración térmica. De la misma manera como se describe anteriormente, se almacenaron los anticuerpos a 5°C o 50°C durante tres días. Cada anticuerpo después del almacenamiento se sometió a cromatografía de intercambio iónico usando el método descrito en el Ejemplo 12. Como se muestra en la Fig. 17, el resultado del análisis demuestra que LfVk1_Ca1 con una alteración en la posición 30 (numeración de Kabat) fue menos heterogéneo y mucho más resistente a la degradación de la aceleración térmica que la secuencia LfVk1_Ca original. Específicamente, se demostró que la degradación ocurrió en el residuo Asp (D) de la posición 30 en la secuencia de LfVk1_Ca pero podría ser prevenida por la alteración del aminoácido. (15-5) Construcción de una secuencia LfVkl Ca de cadena ligera resistente a la degradación en el residuo Asp de la posición 30. v expresión y purificación de anticuerpos El resultado descrito en (15-4) del Ejemplo 15 en la resistencia a degradación de la forma sustituida con Ala demuestra que bajo las condiciones ácidas la secuencia LfVk1_Ca se degradó en el residuo Asp (D) de la posición 30 (numeración de Kabat) en su secuencia de CDR y la degradación se podría prevenir en el caso de sustitución de un diferente aminoácido (en (15-4), al sustituir un residuo Ala (A)) para el residuo Asp (D) en la posición 30 (numeración de Kabat). Entonces, los presentes inventores probaron si incluso una secuencia con una sustitución de Ser (S), un residuo capaz de quelar el ion de calcio, para el residuo en la posición 30 (numeración de Kabat) (referido LfVk1_Ca6; SEC ID NO: 75) fue resistente a la degradación, mientras que mantenían la actividad de unión al calcio. Se prepararon las variantes mediante el mismo método como se describe en el Ejemplo 14. Las secuencias LfVk1_Ca6 y LfVk1_Ca de cadena ligera alteradas se expresaron en combinación con un GC_H de cadena pesada (SEC ID NO: 102). Se expresaron los anticuerpos y se purificaron mediante el mismo método como se describe en el Ejemplo 14. (15-6) Evaluación de una secuencia LfVkl Ca de cadena ligera resistente a la degradación en el residuo Asp en la posición 30.
Los anticuerpos purificados preparados como se describe anteriormente se evaluaron para su estabilidad de almacenamiento bajo condiciones ácidas mediante el método descrito en (15-4) del Ejemplo 15. El resultado demuestra que los anticuerpos que tienen la secuencia LfVk1_Ca6 son más resistentes a la degradación que los que tienen la secuencia LfVk1_Ca original, como se muestra en la Fig. 18.
Entonces, si los anticuerpos que tienen la secuencia LfVk1_Ca y los anticuerpos que tienen la secuencia LfVk1_Ca6 unen al ion de calcio se probaron mediante el método descrito en el Ejemplo 15. El resultado se muestra en la Tabla 21. Los valores de Tm de los dominios de Fab de los anticuerpos que tienen la secuencia LfVk1_Ca y los anticuerpos que tienen la secuencia LfVk1_Ca6 resistente a degradación se desplazaron por 1°C o más sobre el cambio en la concentración de calcio en soluciones de anticuerpo.
Tabla 21 Tomando la estabilidad en consideración, el resultado descrito antes demuestra que es importante para la unión al ion de calcio de los anticuerpos que el aminoácido en la posición 30 fue un aminoácido capaz de interactuar con el ion de calcio (Asn, Glu, Gln, Ser, Thr, His, Tyr, etc.) con excepción Asp, y todos o algunos aminoácidos en las posiciones 31, 32, 50, y 92 (numeración de Kabat) en la secuencia fueron iguales como hVk5-2 o los aminoácidos capaces de interactuar con el calcio (Asp, Asn, Glu, Gln, Ser, Thr, His, Tyr, etc.). Por ejemplo, cuando se construye una biblioteca sintética para tener tal motivo, los anticuerpos de unión dependiente de calcios se pueden aislar eficientemente de la biblioteca.
Ejemplo 16 evaluación de RMN de la actividad de unión al ion de calcio de los anticuerpos que tienen la secuencia hVkl humana con un motivo de unión al ion de calcio (16-1) Expresión v purificación de anticuerpos Se expresaron un anticuerpo que tiene LfVk1_Ca y un anticuerpo que tiene LfVkl y se purificaron para las medidas de RMN. Específicamente, se construyeron los plásmidos de expresión animal para un anticuerpo que tiene LfVk1_Ca para ser capaces de expresar su cadena pesada, (SEC ID NO: 13) y su cadena ligera (SEC ID NO: 61), y se introdujeron transitoriamente en las células animales. Además, se construyeron los plásmidos de expresión animal para un anticuerpo que tiene LfVkl para ser capaces de expresar su cadena pesada (SEC ID NO: 13) y su cadena ligera (SEC ID NO: 62), y se introdujeron transitoriamente en las células animales. Se agregaron los aminoácidos etiquetados a 100 mi de suspensiones de célula preparadas suspendiendo el FreeStyle 293-F derivado de célula de riñón fetal humano (Invitrogen) a una densidad celular final de 1 x 106 células/ml en el Medio de Expresión FreeStyle 293 (Invitrogen). Específicamente, se filtró una solución de ácido L-aspártico-13C4, 5N (10 mg), ácido L-glutámico-13C5,15N (2.5 mg), L-glutamina-13C5,15N2 (60 mg), L-asparag¡na13C4,15N2 H20 (2.5 mg), y ß-cloro-L-alanina (6 mg) en 10 mi de agua con un filtro de 0.22-µ?? y se agregó para preparar los anticuerpos etiquetados con Asp/Glu/GIn/Asn. Mientras tanto, se filtró una solución de L-leucina-15N (30 mg) y ß-cloro-L-alanina (6 mg) en 10 mi de agua con un filtro de 0.22-µ?? y se agregó para preparar los anticuerpos etiquetados con Leu. Se introdujeron los plásmidos construidos en las células mediante el método de lipofección. Se cultivaron las células introducidas con los plásmidos durante cinco días en una incubadora de C02 (37°C, 8% de C02, 90 rpm). A partir del cultivo se prepararon los sobrenadantes como se describe anteriormente, se purificaron los anticuerpos usando el rProtein A SepharoseTM Fast Flow (Amersham Biosciences) mediante un método conocido por los expertos en la técnica. Se midió la absorbencia a 280 nM de soluciones de anticuerpos purificados usando un espectrofotómetro. Se calcularon las concentraciones de anticuerpos de los valores determinados usando un coeficiente de extinción calculado mediante el método PACE (Protein Science (1995) 4: 2411-2423). (16-2) Preparación del fragmento Fab Se concentró cada anticuerpo de 8.2 a 11.8 mg/ml usando un ultrafiltro con un límite del peso molecular de 30,000 MWCO. Se diluyeron los anticuerpos a 8 mg/ml usando 50 mM de ácido acético/125 mM de amortiguador Tris (pH 6.8) que contiene 1 mM de L-cisteína y 2 mM de EDTA para preparar las muestras. Se agregó una cantidad 1/240 de papaína (Roche Applied Science) a cada anticuerpo. Después de agitar, se incubaron las muestras a 37°C durante una hora. Después de la incubación, se cargó cada muestra sobre un HP activado con NHS HiTrap de 1 mi (GE Healthcare) inmovilizado con el péptido Gly-Gly-Tyr-Arg (Sigma) y se equilibró con 50 mM de ácido acético/125 mM de amortiguador Tris (pH 6.8), corriente abajo de la cual se conectó una columna de proteína A HiTrap MabSelect Sure de 1 mi (GE Healthcare) en tándem. Se obtuvieron las fracciones del fragmento Fab purificadas mediante la eliminación del fragmento de Fe y los anticuerpos no digeridos por la columna de proteína A corriente abajo, mientras se elimina la papaína activada mediante el péptido Gly-Gly-Tyr-Arg corriente arriba. Se agregó el inhibidor de la cisteína proteasa E64 (Sigma) a 10 µ? a las fracciones Fab para prevenir la activación de la papaína inactiva en las fracciones Fab. Todas las operaciones de columna descritas antes se realizaron a temperatura ambiente de 20 a 25°C. (16-3) Preparación de fragmentos Fab de los anticuerpos LfVkl Ca y LfVkl como muestras de R N Se concentraron las soluciones de anticuerpo a 0.5 mi mediante la centrifugación usando el dispositivo de ultrafiltración Vivaspin (Sartorius) con MWCO 5,000. Entonces, se colocó un vaso de diafiltración en el dispositivo de ultrafiltración descrito antes, y el amortiguador se cambió con el amortiguador de RMN: 5 mM de d-BisTris/20 mM de NaCI/0.001 %(p/v) NaN3/5%(v/v) 2H20 (pH 7.0) (se ajustó el pH usando NaOH y HCI) (a través de tres ciclos de: adición de 5 mi del amortiguador descrito antes al vaso de diafiltración, seguido por concentración a 0.5 mi mediante centrifugación). Se concentraron las soluciones de anticuerpo por último a 0.25 mi. Finalmente, se lavó el dispositivo de ultrafiltración con amortiguador de RMN, y se combinó el amortiguador con el concentrado. Esto produjo 420 µ? y 270 µ? de las soluciones de anticuerpo para el anticuerpo LfVk1_Ca y el anticuerpo LfVkl, respectivamente. En esta etapa, se confirmó el pH de las soluciones de muevo, y se ajustó el pH a pH 7.0 usando NaOH y HCI si es necesario. Se midió la absorbencia a 280 nm usando un espectrofotómetro UV Napodrop (Thermo Fisher Scientific) y se determinaron las concentraciones de los fragmentos Fab con coeficiente de extinción molar a 280 nm = 70,000 M"1cm"1. Las concentraciones de los anticuerpos etiquetados con Leu LfVk1_Ca y LfVkl fueron 0.12 mM, mientras que las concentraciones de los anticuerpos etiquetados con Asp, Glu, Asn, y Gln LfVk1_Ca y LfVkl fueron 0.24 mM. De las muestras descritas antes, se rellenó el anticuerpo LfVk1_Ca en un tubo de muestra de RMN de 5 mm de diámetro (shigemi) y se rellenó el anticuerpo LfVkl en un tubo de micro muestra simétrico de 5 mm de diámetro (shigemi) para la solución acuosa usando una pipeta de Pasteur. En los experimentos de titulación de Ca2+ para el anticuerpo LfVk1_Ca, se agregaron las soluciones de CaCI2 a las soluciones de anticuerpo en sucesión de modo que Ca2+ fue 1, 2, 5, 10, o 20 equivalentes molares al anticuerpo. Se prepararon las soluciones de CaCI2 agregadas a 10, 20, 50, y 100 mM de CaCI2 usando amortiguador de RMN. Se agregaron los volúmenes requeridos de soluciones de CaCI2 directamente a las soluciones de anticuerpo en los tubos de muestra de RMN usando una microjeringa (ITO), que se adaptó a las necesidades mediante extender la porción de jeringa de un producto confeccionado, de modo que el volumen de carga oscila de 3 a 10 µ?. Después de agitar con un mezclador de vórtice, los tubos de muestra se centrifugaron usando una centrifugadora manual (Shimadzu). (16-4) Medida de RMN para observar las señala del grupo amida a partir de los fragmentos Fab de los anticuerpos LfVkl Ca v LfVkl Ca Se realizaron las medidas de RMN usando el espectrómetro de RMN DRX750 (Bruker Biospin) instalado con TCI CryoProbe. La temperatura se ajustó a 307K (GasFlow 535 L/h). 1H-15N HSQC se usó para observar Las señales del grupo amida en las medidas de RMN. Se condujo el método de medida mediante el desacoplamiento de 13C simultáneo carbonos a y carbonilo y la sustracción de las señales del agua solvente durante el período de evolución de 15N usando 1H-15N FHSQC con un tren de pulso 3-9-19. Un programa estándar proporcionado por el fabricante (Bruker Biospin) se usó como un esquema de control de pulso. Las condiciones de La medición de MN fueron como sigue. Anchura espectral: 12019Hz (f2), 1976 Hz (f1); el número de puntos de datos: 2048 (f2), 128 (f1). Se procesaron los datos usando Topspin 3.0 (Bruker Biospin) de la siguiente manera. Una función de ventana seno cuadrado desplazado (QSINE, por sus siglas en inglés) en f2 y f 1 , y cero rellenos para duplicar el tamaño de datos se aplicó antes de la transformación de Fourier. Se calcularon los desplazamientos químicos de señal usando un software de análisis de RMN Sparky (UCSF). (16-5) Asignación de señal de RMN de los grupos amida de cadena principal El 80% de las señales de RMN de los grupos amida de cadena principal del fragmento Fab de tocilizumab (cadena pesada de la SEC ID NO: 13; cadena ligera de la SEC ID NO: 14) se asignaron previamente (datos no reportados). La secuencia de aminoácido del fragmento Fab del anticuerpo LfVk1_Ca es igual que la del fragmento Fab de tocilizumab, excepto algunas porciones de la cadena ligera CDR1, CDR2, CDR3 y los residuos de aminoácidos en las posiciones 73 y 83 en la cadena ligera. Las secuencias de aminoácidos compartidas por los dos anticuerpos dan las señales de RMN que exhiben los mismo o similares desplazamientos químicos. Debido a esto, la información de asignación sobre tocilizumab es aplicable en tales secuencias de aminoácidos. Para las muestras etiquetadas con Leu, las asignaciones reveladas para ser aplicables incluyen: 11, (33), (46), (47), (54), (78), 125, 135, 136, 154, 175, 179, 181, y 201 en la cadena ligera, y 18, 46, 64, 71, 81, 83, 114, 144, 147, 165, 176, 181, 184, y 195 en la cadena pesada. En el anterior, los números sin paréntesis representan los números de residuo en los cuales las asignaciones son aplicables debido a que los desplazamientos químicos son compartidos por el tocilizumab; los números entre paréntesis representan los números de residuo en los cuales las asignaciones son aplicables debido a que los desplazamientos químicos son similares a los del tocilizumab y no hay otras señales que dan los desplazamientos químicos similares. Mientras tanto, para las muestras etiquetadas con Asp, Glu, Asn, Gln, recientemente se observaron cuatro señales en LfVk1_Ca cuando los espectros se compararon entre los anticuerpos LfVk1_Ca y LfVkl. Éstos se asumieron para ser asignables a cuatro de los cinco residuos, Asp30, Asp31, Asp32, Asp92, y Glu50, entre residuos Asp, Glu, Asn, y Gln en la cadena ligera donde es diferente la secuencia introducida como un motivo de unión al Ca2+ entre los dos anticuerpos. (16-6) Identificación del sitio de enlace al Ca2+ en el anticuerpo LfVkl Ca Las señales con diferente desplazamiento químico se extrajeron al comparar el espectro de 1H-15N HSQC del fragmento Fab del anticuerpo LfVk1_Ca entre la presencia y la ausencia de 20 equivalentes molares de Ca2+. El resultado en las muestras etiquetadas con Leu mostró que solamente Leu33, pero no otros residuos Leu, en la cadena ligera se involucran en la unión. Además, con las muestras etiquetadas con Asp, Glu, Asn, Gln, cuatro de los cinco residuos, Asp30, Asp31, Asp32, Asp92, y Glu50, en la cadena ligera se revelaron para ser implicado en la unión, y todos, excepto uno, de los otros residuos Asp, Glu, Asn, y Gln no fueron responsable de la unión. El hallazgo descrito antes demuestra que en la secuencia de aminoácido introducida como un motivo de unión al Ca2+, algunos aminoácidos por lo menos la cadena ligera CDR1 y de ambas o cualquiera de la cadena ligera CDR2 y CDR3 estuvieron implicados en la unión de Ca2 + . Esto es constante con el hallazgo descrito en el Ejemplo 15 que es importante para la unión al ion de calcio que los aminoácidos en cuatro posiciones entre las posiciones 30, 31, 32, 50, y 92 (numeración de Kabat) son idénticos a aquellos en la secuencia hVk5-2. (16-7) Cálculo de la constante de disociación de Ca2+ mediante el experimento de titulación Basado en el espectro de 1H-15N HSQC en las concentraciones de Ca2+ de 0, 1, 2, 5, 10, o 20 equivalentes molares al fragmento Fab del anticuerpo LfVk1_Ca, una gráfica se trazó con el equivalente molar de Ca2+ en el eje horizontal y con los desplazamientos químicos 1H o 15N de la señal para la cadena ligera Leu33 identificada como el sitio de unión en el eje vertical. Usando la función representada por la fórmula 2 mostrada a continuación, el desplazamiento de datos se realizó con el software de gráficas Gnuplot.
Fórmula 2 f(x) = s * [1-0.5/a * {(a * x + a + Kd) - ((a * x + a + Kd)2 - 4 * x * a2)0 5} + t * [0.5/a * {(a * x + a + Kd) - ((a * x + a + Kd)2 - 4 * x * a2)0 5} En la función representada por la fórmula 2, "s" y "t" representan el desplazamiento químico [ppm] para el estado no unido a Ca2+ y un desplazamiento químico estimado [ppm] para el estado saturado unido a Ca +, respectivamente; "a" representa la concentración del fragmento Fab del anticuerpo [M]; "Kd" representa la constante de disociación; y "x" representa los equivalentes molares de Ca2+ agregado al fragmento Fab del anticuerpo. En el desplazamiento de datos, s, t, y Kd son los parámetros de desplazamiento. Como un resultado, basado en los desplazamientos químicos 1H y 5N, Kd se estimó como sigue: Kd = 7.1 x 10"s [M] y Kd = 5.9 x 10"5 [M], respectivamente.
Ejemplo 17 Evaluación de la secuencia de variante hVk5-2 para la unión al calcio La variante 1 Vk5-2 (SEC ID NO: 63) y la variante 2 Vk5-2 (SEC ID NO: 64) se obtuvieron además de Vk5-2 (SEC ID NO: 41), todos los cuales se clasificaron como Vk5-2. Estas variantes se evaluaron para su unión al calcio. Los fragmentos de ADN para Vk5-2, la variante 1 Vk5-2, y la variante 2 Vk5-2 fueron cada uno insertados en los vectores de expresión de célula animal. Las secuencias de nucleótido de los vectores de expresión construidos se determinaron mediante un método conocido por los expertos en la técnica. Mediante el método descrito en el Ejemplo 13, se introdujeron los vectores de expresión de célula animal insertados con los fragmentos de ADN para Vk5-2, se purificaron la variante 1Vk5-2, y la variante 2 Vk5-2, en combinación con el vector de expresión animal que llevaba un inserto para expresar CIM_H (SEC ID NO: 48) como una cadena pesada, en las células animales y los anticuerpos. Se evaluaron los anticuerpos purificados para su actividad de unión al ion de calcio. Se dializaron los anticuerpos purificados (EasySEP, TOMY) contra 20 mM de Tris-HCI/150 mM de NaCI (pH 7.5) (en la Tabla 22, indicado como 0 mM de concentración del ion de calcio) o 20 mM de Tris-HCI/150 mM de NaCI/2 mM de CaCI2 (pH 7.5). Se realizó La medición de DSC a un velocidad de aumento de temperatura de 240°C/hr de 20 a 115°C usando las soluciones de anticuerpo preparadas a una concentración de 0.1 mg/ml para la misma solución como se usa para la diálisis. Basado en las curvas de desnaturalización de DSC obtenidas, se calculó la temperatura intermedia de la desnaturalización térmica (valor de Tm) para el dominio de Fab de cada anticuerpo. Los valores de Tm se muestran en la Tabla 22.
Tabla 22 El resultado mostró que el valor Tm para los dominios de Fab de los anticuerpos que tienen la secuencia de Vk5-2, la variante 1 Vk5-2, o la variante 2Vk5-2 variada dependiendo de la concentración del ion de calcio en las soluciones que contienen los anticuerpos que tienen los dominios de Fab. Esto demuestra que los anticuerpos que tienen una secuencia clasificada como Vk5-2 unida al ion de calcio.
Ejemplo 18 Anticuerpos que unen al CD4 humano de una manera dependiente de calcio (18-1) Preparación del CD4 humano soluble Se preparó el CD4 humano soluble como sigue. Se insertó una secuencia de ADN que codifica una secuencia (SEC ID NO: 76) en la cual se une la etiqueta Myc a la secuencia de aminoácido de CD4 humano que carece de la región de transmembrana en un vector de expresión de célula animal. Se confirmó la secuencia del CD4 humano recombinante construido mediante un método conocido por los expertos en la técnica. (18-2) Expresión y purificación de los anticuerpos que unen al CD4 humano soluble TNX355-lgG1 (cadena pesada de la SEC ID NO: 77; cadena ligera de la SEC ID NO: 78) y Q425 (cadena pesada de la SEC ID NO: 79; cadena ligera de la SEC ID NO: 80) son los anticuerpos CD4 anti-humanos. Además, Q425L9 (cadena pesada de la SEC ID NO: 81; cadena ligera de la SEC ID NO: 82) es una variante de cadena L de Q425. Se insertaron las secuencias de ADN que codifican los aminoácidos de TNX355-lgG1 (cadena pesada de la SEC ID NO: 77; cadena ligera de la SEC ID NO: 78), Q425 (cadena pesada de la SEC ID NO: 79; cadena ligera de la SEC ID NO: 80), y Q425L9 (cadena pesada de la SEC ID NO: 81; cadena ligera de la SEC ID NO: 82) en los plásmidos de expresión de célula animal. Se expresaron los anticuerpos por el siguiente método. Se suspendieron las células de FreeStyle 293-F derivado de célula de riñón fetal humano (Invitrogen) en el Medio de Expresión FreeStyle 293 (Invitrogen), y se aplicaron en una célula de densidad de 1.33 x 106 células/ml (3 mi) en cada pozo de una placa de 6 pozos. Se introdujeron los plásmidos preparados en las células mediante un método de lipofección. Se cultivaron las células durante cuatro días en una incubadora de C02 (37°C, 8% de C02, 90 rpm). A partir de los sobrenadantes de cultivo preparados como se describe anteriormente, se purificaron los anticuerpos usando el rProtein A SepharoseTM Fast Flow (Amersham Biosciences) mediante un método conocido por los expertos en la técnica. Se midió la absorbencia a 280 nm de soluciones de anticuerpos purificados usando un espectrofotómetro. Se calcularon las concentraciones de anticuerpos a partir de los valores determinados usando un coeficiente de extinción calculado mediante el método PACE (Protein Science (1995) 4: 2411-2423). (18-3) Evaluación de los anticuerpos preparados para la actividad de unión dependiente de calcio a CD4 humano Se evaluaron los anticuerpos preparados para su actividad de unión dependiente de calcio al CD4 humano soluble usando Biacore T100 (GE Healthcare). La alta concentración de ion de calcio usada fue 1.2 mM, mientras que la baja concentración del ion de calcio fue 3 µ?. Se usó el CD4 humano soluble (preparado como se describe en 18-1) como antígeno. Se inmovilizó una cantidad adecuada de la proteína G (Invitrogen) sobre la matriz de detección CM4 (GE Healthcare) mediante el método de combinación de amina, y después los anticuerpos de interés se dejaron capturar. Se usaron 10 mmol/l de ACES, 150 mmol/l de NaCI, 0.05% (p/v) de Tween20, 1.2 mmol/l de CaCI2 (pH 7.4 o pH 6.0) que contiene 1.2 mmol/l o 3 pmol/l de CaCI2 como un amortiguador de análisis. Se realizaron todas las medidas a 37°C. Se diluyó el CD4 humano usando los amortiguadores respectivos. Los sensogramas del anticuerpo se muestran en la Fig. 19. Como se muestra en la Fig. 19, la forma del sensograma del anticuerpo TNX355-lgG1 no cambió incluso cuando la condición del amortiguador de análisis se cambió. Esto demuestra que TNX355-lgG1 es un anticuerpo común que no muestra actividad de unión dependiente de calcio a CD4 humano. Mientras tanto, para los anticuerpos Q425 y Q425L9, la cantidad de unión al antígeno fue más pequeña en una concentración del ion de calcio de 3 µ? (baja concentración del ion de calcio) que a 1.2 mM (alta concentración del ion de calcio), y así exhibieron actividad de unión con Ca dependiente. En Particular, no se observó ninguna fase de unión para el anticuerpo Q425L9 en una concentración del ion de calcio de 3 µ? incluso en una concentración de analito (CD4 humano soluble) de 200 nM. Específicamente, los Q425 y Q425L9 se demostraron para ser los anticuerpos de unión dependiente de calcios que unen a CD4 humano de una manera dependiente de calcio.
Ejemplo 19 Evaluación de los anticuerpos de unión con Ca dependientes para su efecto sobre la retención del antígeno en plasma usando ratones normales (19-1) Análisis ¡n vivo usando ratones normales Los Q425 y Q425L9 preparados como se describe en el Ejemplo 18 son los anticuerpos que unen al CD4 humano soluble de una manera dependiente de calcio. Como ya se describe en los Ejemplos 5 y 6, con respecto al IL6R, se ha demostrado que cuando se administró en combinación con un antígeno, un anticuerpo que tiene la propiedad de unir a un antígeno en una manera dependiente de calcio tiene una propiedad para acelerar la eliminación del antígeno en comparación cuando un anticuerpo que une a un antígeno de una manera independiente de calcio se administra en combinación con un antígeno. Sin embargo, si los anticuerpos contra otros antígenos también tienen la propiedad de acelerar la eliminación del antígeno aún no se han aclarado.
Entonces, se administró el CD4 humano soluble (preparado como se describe en el Ejemplo 18) solo o en combinación con un anticuerpo CD4 anti-humano a ratones normales (ratón C57BL/6J; Charles River Japón). Se evaluaron los ratones para la cinética in vivo del CD4 humano soluble y del anticuerpo CD4 anti-humano después de la administración. Se administró una solución del CD4 humano soluble (50 pg/ml) o una solución mezclada del CD4 humano soluble y un anticuerpo CD4 anti-humano una vez a 10 ml/kg a la vena caudal. Los anticuerpos CD4 anti-humanos usados fueron TNX355-lgG1, Q425-lgG1, y Q425L9-lgG1 descritos antes.
La concentración del CD4 humano soluble en la solución mezclada fue 50 pg/ml. Mientras tanto, las concentraciones de los anticuerpos CD4 anti-humanos variaron dependiendo del anticuerpo: 0.264 mg/ml para TNX355-|gG1; 0.197 mg/ml para Q425-lgG1; y 2.594 mg/ml para Q425L9-lgG1. En este caso, los anticuerpos CD4 anti-humanos estaban presentes en una cantidad excesiva con respecto al CD4 humano soluble, y se asumió el CD4 humano soluble para unir la mayoría de los anticuerpos. En el grupo administrado con el CD4 humano soluble solo, se recolectó la sangre 2 minutos, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, una hora, y dos horas después de la administración. En el grupo administrado con el CD4 humano soluble en combinación con TNX355-lgG1 sin actividad de unión al antígeno dependiente de calcio, se recolectó la sangre 5 minutos, 2 horas, 7 horas, 1 día, 3 días, 7 días, 14 días, y 28 días después de la administración. En el grupo administrado con el CD4 humano soluble en combinación con Q425-lgG1 o Q425L9-lgG1 que tiene actividad de unión al antígeno dependiente de calcio, se recolectó la sangre 5 minutos, 30 minutos, 2 horas, 7 horas, 1 día, 3 días, 8 días, 14 días, y 28 días después de la administración. Inmediatamente después de la recolección, la sangre se centrifugó a 4°C y 12,000 rpm durante 15 minutos para aislar plasma. Se almacenó el plasma aislado en un congelador a -20°C o menso antes de las mediciones. (19-2) determinar la concentración del anticuerpo CD4 antihumano en plasma en ratones normales mediante ELISA Se determinaron las concentraciones del anticuerpo CD4 anti-humano en plasma de ratón mediante ELISA. Primero, el fragmento F(ab')2 de IgG anti-humano (específico para la cadena ?) del anticuerpo (SIGMA) se dividió en alícuotas en la placa Nunc-lnmuna, MaxiSorp (Nalge nunc International). La placa se dejó reposar durante la noche a 4°C para preparar una placa del anticuerpo IgG anti-humano inmovilizado. Se prepararon las muestras estándar a concentraciones de 0.64, 0.32, 0.16, 0.08, 0.04, 0.02, y 0.01 pg/ml en plasma. Se prepararon las muestras de ensayo en plasma de ratón mediante dilución 100 veces o más.
Se dividieron en alícuotas las muestras en la placa del anticuerpo IgG anti-humano inmovilizado. Se incubó la placa a 25°C durante una hora. Después de la incubación, se hicieron reaccionar las muestras con el anticuerpo IL-6 R anti-humano biotinilado (R&D) a 25°C durante una hora, y después con Streptavidin-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) a 25°C durante 0.5 horas. Se realizó la reacción cromogénica usando el Sustrato de Micropozo HRP de Un Componente TMB (BioFX Laboratories) como un sustrato. Después se terminó la reacción con ácido sulfúrico 1N (Showa Chemical), se midió la absorbencia a 450 nM usando un lector de microplaca. Usando el software de análisis SOFTmax PRO (Molecular Devices), se calcularon las concentraciones en plasma de ratón basadas en la absorbencia a partir de la curva estándar.
Un curso de tiempo de las concentraciones en plasma de los anticuerpos TNX355-lgG1, Q425-lgG1, y Q425L9-lgG1 determinado mediante el método descrito antes después de la administración intravenosa a ratones normales se muestra en la Fig. 20. (19-3) determinar las concentraciones de plasma del CD4 humano soluble mediante un método de luminiscencia electroquímica Se determinaron las concentraciones del CD4 humano soluble en plasma de ratón mediante ELISA.
Para el grupo administrado con CD4 solo y el grupo administrado en combinación con Q425 o Q425_L9, TNX se dividieron en alícuotas en la placa Nunc-lnmuna, MaxíSorp (Nalge nunc International). La placa se dejó durante la noche a 4°C para preparar una placa de TNX inmovilizado. Se prepararon las muestras estándar en concentraciones de plasma de 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125, y 0.156 pg/ml. Se prepararon las muestras de ensayo en plasma de ratón mediante dilución 100 veces o más. Se prepararon las muestras usando un amortiguador que contiene 10 mM de EDTA, y se dividieron en alícuotas en la placa de TNX inmovilizado. Después de tres horas de incubación a 25°C, se hicieron reaccionar las muestras con anti-c-myc-HRP (Miltenyi Biotech) a 25°C durante una hora. Se realizó la reacción cromogénica usando el Sustrato de Micropozo HRP de Un Componente TMB (BioFX Laboratories) como un sustrato. Después de que la reacción se terminó con el ácido sulfúrico 1N (Showa Chemical), se midió la absorbencia a 450 nM usando un lector de microplaca. Usando el software de análisis SOFTmax PRO (Molecular Devices), se calcularon las concentraciones en plasma de ratón basadas en la absorbencia a partir de la curva estándar.
En el grupo administrado en combinación con TNX, Q425 se dividió en alícuotas en la placa Nunc-lnmuna, MaxiSorp (Nalge nunc International). La placa se dejó durante la noche a 4°C para preparar una placa de Q425 inmovilizado. Se prepararon las muestras estándar a concentraciones de plasma de 20, 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, y 0.3125 pg/ml. Se prepararon las muestras de ensayo en plasma de ratón mediante dilución 100 veces o más. Se prepararon las muestras usando un amortiguador que contiene 2 mM de Ca2+, y se dividieron en alícuotas en la placa de TNX inmovilizado. Después de tres horas de incubación a 25°C, las muestras se hicieron reaccionar con Anti-c-myc-H RP ( iltenyi Biotech) a 25°C durante una hora. Se realizó la reacción cromogénica usando el Sustrato de Micropozos de Un Componente HRP de TMB (BioFX Laboratories) como un sustrato. Después de que la reacción se terminó con ácido sulfúrico 1N (Showa Chemical), se midió la absorbencia a 450 nM usando un lector de mlcroplaca. Usando el software de análisis SOFTmax PRO (Molecular Devices), se calcularon las concentraciones en plasma de ratón basadas en la absorbencia a partir de la curva estándar.
Un curso de tiempo de las concentraciones de plasma del CD4 humano soluble determinadas mediante el método descrito antes después de la administración intravenosa a ratones normales se muestra en la Fig. 21.
El resultado mostró que el CD4 humano soluble cuando se administró solo se eliminó muy rápido. Mientras tanto, la eliminación del CD4 humano soluble se retrasó en gran medida cuando se administró en combinación con TNX355-lgG1, un anticuerpo común sin actividad de unión con Ca dependiente al CD4 humano soluble. En cambio, se aceleró la eliminación del CD4 humano soluble significativamente cuando se administró en combinación con Q425-lgG1 o Q425L9-lgG1 que tiene actividad de unión con Ca dependiente al CD4 humano soluble. La eliminación del CD4 humano soluble podrá ser acelerada cuando se administró en combinación con Q425-lgG1 o Q425L9-lgG1 en comparación cuando se administró en combinación con TNX355-IgG 1. Este hallazgo demuestra que no sólo para IL-6R sino también para CD4 humano, la eliminación del antígeno a partir de plasma se puede alcanzar con un anticuerpo de unión dependiente de calcio.
Ejemplo 20 Anticuerpos que unen a IgA humano de una manera dependiente de calcio (20-1 ) Preparación de IgA humano (hlgA) Un antígeno, el IgA humano recombinante (más adelante abreviado como hlgA), se preparó como sigue. Se expresó el hlgA que comprende H(WT)-lgA1 (SEC ID NO: 83) y L(WT) (SEC ID NO: 14), y se purificó mediante cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de filtración en gel usando un método conocido por los expertos en la técnica. (20-2) Expresión y purificación de los anticuerpos que unen a IgA humano GA1-lgG1 (cadena pesada de la SEC ID NO: 84; cadena ligera de la SEC ID NO: 85), GA2-lgG1 (cadena pesada de la SEC ID NO: 86; cadena ligera de la SEC ID NO: 87), GA3-lgG1 (cadena pesada de la SEC ID NO: 88; cadena ligera de la SEC ID NO: 89), y GA4-lgG1 (cadena pesada de la SEC ID NO: 90; cadena ligera de la SEC ID NO: 91) son los anticuerpos que unen a IgA humano. Entonces, con el propósito de mejorar la eliminación del antígeno (hlgA) adicional del plasma, de una manera similar como se describe en los Ejemplos 6 y 7, GA2-N434W (cadena pesada de la SEC ID NO: 92; cadena ligera de la SEC ID NO: 87) se construyó mediante la introducción del aminoácido en sustitución de N434W en GA2-lgG1 para fortalecer la unión al FcRn de ratón a pH 7.4. Se insertó la secuencia de ADN que codifica GA1-lgG1 (cadena pesada de la SEC ID NO: 84; cadena ligera de la SEC ID NO: 85), GA2-lgG1 (cadena pesada de la SEC ID NO: 86; cadena ligera de la SEC ID NO: 87), GA3-lgG1 (cadena pesada de la SEC ID NO: 88; cadena ligera de la SEC ID NO: 89), GA4-lgG1 (cadena pesada de la SEC ID NO: 90; cadena ligera de la SEC ID NO: 91), y GA2-N434W (cadena pesada de la SEC ID NO: 92; cadena ligera de la SEC ID NO: 87) en los plásmidos de expresión animal mediante un método conocido por los expertos en la técnica. Se expresaron los anticuerpos mediante el siguiente método. Se suspendieron las células de FreeStyle 293-F derivado de células de riñon fetal humano (Invitrogen) en el Medio de Expresión de FreeStyle 293 (Invitrogen), y se aplicaron en una densidad celular de 1.33 x 1 O6 células/ml (3 mi) en cada pozo de una placa de 6 pozos. Se introdujeron los plásmidos construidos en las células mediante un método de lipofección. Se cultivaron las células durante cuatro días en una incubadora de C02 (37°C, 8% de C02, 90 rpm). A partir de los sobrenadantes de cultivo preparados, se purificaron los anticuerpos usando el rProtein A SepharoseTM Fast Flow (Amersham Biosciences) mediante un método conocido por los expertos en la técnica. Se determinaron las concentraciones de anticuerpos purificados midiendo la absorbencia a 280 nm usando un espectrofotómetro. Se calcularon las concentraciones de anticuerpos a partir de los valores determinados usando un coeficiente de extinción calculado mediante el método PACE (Protein Science (1995) 4: 2411-2423). (20-3) Evaluación de los anticuerpos preparados para la actividad de unión al IgA humano con Ca dependiente Usando Biacore T200 (GE Healthcare), se evaluaron los anticuerpos obtenidos para su actividad de unión a IgA humano (disociación constante KD (M)). Se realizó la medición usando como un amortiguador de análisis 0.05% de tween20, 20 mmol/l de ACES, 150 mmol/l de NaCI (pH 7.4 o pH 5.8) que contiene 3 µ? o 1.2 mM de CaCI2, o 0.05% de tween20, 20 mmol/l de ACES, 150 mmol/l de NaCI (pH 8.0) que contiene 0.1 µ? o 10 mM de CaCI2.
Después se inmovilizó una cantidad adecuada de la proteína recombinante A/G (Thermo Scientific) sobre la matriz de detección CM5 (GE Healthcare) mediante un método de combinación amino, los anticuerpos se dejaron unir sobre la matriz de detección. Se inyectó una concentración apropiada de h I g A (descrita en (20-1)) como un analito para interactuar con los anticuerpos en la matriz de detección. Entonces, se regeneró la matriz de detección mediante la inyección de 10 mmol/l de glicina-HCI, pH 1.5. Se realizó la medición a 37°C. A partir del resultado de ensayo, se calculó la constante de disociación KD (M) basada en el análisis de ajuste de la curva y el análisis de la constante de equilibrio usando el Software de Evaluación de Biacore T200 (GE Healthcare). El resultado se muestra en la Tabla 23. El sensograma obtenido se muestra en la Fig. 22. GA2-lgG1, GA3-lgG1, y GA4-lgG1 se demostraron para unir a IgA humano fuertemente en una concentración de Ca + de 1.2 mM y débil a una concentración de Ca2+ de 3 µ?.
Tabla 23 IgA humano con Ca dependiente en retención al antígeno en plasma usando ratones normales (21 -1 ) Ensayo in vivo usando ratones normales Se administró IgA humano (IgA humano: preparado como se describe en el Ejemplo 20) solo o en combinación con un anticuerpo IgA anti-humano a ratones normales (ratón C57BL/6J; Charles River Japón). Se evaluaron los ratones para la cinética in vivo del IgA humano y el anticuerpo IgA anti-humano después de la administración. Se administró una solución de IgA humano (80 g/ml) o una solución mezclada de IgA humano y el anticuerpo IgA anti-humano una vez de 10 ml/kg a la vena caudal. Los anticuerpos IgA anti-humanos usados fueron GA1-lgG1, GA2-IgG 1 , GA3-lgG1, y GA2-N434W descritos antes.
La concentración de IgA humano en la solución mezclada fue 80 pg/ml. Mientras tanto, las concentraciones de anticuerpos IgA anti-humanos varían dependiendo de la afinidad para hlgA: 100 mg/ml para GA1-lgG1; 28.9 mg/ml para GA2-lgG1; 53.8 mg/ml para GA3-lgG1; y 1 mg/ml para GA2-N434W. En este caso, los anticuerpos IgA anti-humanos estuvieron presentes en una cantidad excesiva con respecto al IgA humano, y se asumió el IgA humano para unir sobre todo a los anticuerpos. Se recolectó la sangre 5 minutos, 7 horas, 1 día, 2 días, 3 días, y 7 días después de la administración. Inmediatamente después de la recolección, se centrifugó la sangre a 4°C y 12.000 rpm durante 15 minutos para aislar el plasma. Se almacenó el plasma aislado en un congelador a -20°C o menor antes de las mediciones. (21-2) determinar la concentración en plasma del anticuerpo IgA anti-humano en ratones normales mediante ELISA Se determinaron las concentraciones del anticuerpo IgA anti- humano en plasma del ratón mediante ELISA. Primero, el fragmento F(ab')2 de IgG (cadena ? específica) anti-Humano del anticuerpo (SIG A) se dividió en alícuotas en la placa Nunc-Inmuna, MaxiSorp (Nalge nunc International). La placa se dejó durante la noche a 4°C para preparar una placa del anticuerpo IgG anti-humano inmovilizado. Se prepararon las muestras estándar en concentraciones de plasma de 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0.03125, 0.01563, y 0.07813 pg/ml. Se prepararon las muestras de ensayo en plasma de ratón mediante dilución 100 veces o más. Se dividieron en alícuotas las muestras en la placa del anticuerpo IgG anti-humano inmovilizado. Después de una hora de incubación a 25°C, las muestras se hicieron reaccionar con el conjugado de biotina (BIOT) de IgG anti-humano de cabra (cadena ? específica) (Southern Biotechnology Associats Inc.) a 25°C durante una hora. Entonces, se hicieron reaccionar las muestras con Streptavidin-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) a 25°C durante una hora. Se realizó la reacción cromogénica usando el Sustrato de Micropozos de Un Componente HRP de TMB (BioFX Laboratories) como un sustrato. Después de que la reacción se terminó con ácido sulfúrico 1N (Showa Chemical), se midió la absorbencia a 450 nM usando un lector de microplaca. Usando el software de análisis SOFTmax PRO (Molecular Devices), se calcularon las concentraciones en plasma de ratón basadas en la absorbencia de la curva estándar. Un curso de tiempo de las concentraciones de plasma de los anticuerpos GA1-lgG1, GA2-lgG1, GA3-lgG1, y GA2-N434W determinadas mediante el método descrito antes después de la administración intravenosa a ratones normales se muestra en la Fig. 23. (21 -3) determinar la concentración de IgA humano en plasma mediante ELISA Se determinaron las concentraciones de IgA humano en plasma de ratón mediante ELISA. Primero, el anticuerpo IgA antihumano de cabra (BETHYL) se dividió en alícuotas en una placa Nunc-lnmuna, MaxiSorp (Nalge nunc International). La placa se dejó a 4°C durante la noche para preparar una placa del anticuerpo IgG anti-humano inmovilizado. Se prepararon las muestras estándar de IgA humano en concentraciones de plasma de 0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025, 0.0125, y 0.00625 pg/ml. Se prepararon las muestras de ensayo en plasma de ratón mediante dilución 100 veces o más. Se agregaron 200 µ? de 500 ng/ml de hslL-6R a 100 µ? de las muestras estándar y de plasma. Las mezclas resultantes se dejaron reposar a temperatura ambiente durante una hora, y después se dividieron en alícuotas en la placa del anticuerpo IgA anti-humano inmovilizado y se incubaron a temperatura ambiente durante una hora. Después de la incubación, las mezclas se hicieron reaccionar con el anticuerpo IL-6R anti-humano biotinilado (R&D) a temperatura ambiente durante una hora, y después con el Streptavidin-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) a temperatura ambiente durante una hora. Se realizó la reacción cromogénica usando el Sustrato de Micropozos de Un Componente HRP de TMB (BioFX Laboratories) como un sustrato. Después de que la reacción se terminó con ácido sulfúrico 1N (Showa Chemical), se midió la absorbencia en 450 nM usando un lector de microplaca. Usando el software de análisis SOFTmax PRO (Molecular Devices), se calcularon las concentraciones en plasma de ratón basadas en la absorbencia de la curva estándar. Un curso de tiempo de las concentraciones de plasma de IgA humano determinadas mediante el método descrito antes después de la administración intravenosa a ratones normales se muestra en la Fig. 24.
El resultado mostró que cuando se administró IgA humano en combinación con GA1-lgG1, un anticuerpo cuya dependencia de Ca en la unión al IgA humano es débil (el grado de dependencia es bajo), la eliminación de IgA humano fue retardada en comparación cuando se administró solo. Mientras tanto, la eliminación de IgA humano se aceleró significativamente cuando se administró en combinación con GA2-lgG1 que exhibe 100 veces o más la actividad de unión al IgA humano con Ca-dependiente. Se determinó la concentración en plasma del IgA humano no unido de la concentración del anticuerpo en plasma mostrada en la Fig. 23, de la concentración en plasma de IgA humano mostrada en la Fig. 24, y el valor de KD de cada anticuerpo mostrado en la Tabla 23. El resultado se muestra en la Fig. 25. Como se muestra en la Fig. 25, la concentración del antígeno no unido (IgA humano) en el grupo administrado con GA2-lgG1 o GA3-lgG1 fue más bajo con respecto a la concentración del antígeno no unido (IgA humano) en el grupo de GA1 -IgG 1 -administrado. Esto demuestra que el antígeno no unido (IgA humano) puede ser reducido mediante acelerarla la eliminación del antígeno usando los anticuerpos de unión al calcio dependiente. Por otra parte, GA2-N434W que exhibió la unión al FcRn mejorado a pH 7.4 aceleró la eliminación del antígeno más que GA2-lgG1. Se redujo el antígeno a un nivel debajo del límite de detección 7 horas después de la administración.
El hallazgo descrito antes muestra que los anticuerpos de unión al calcio dependiente pueden acelerar la eliminación del antígeno en plasma con respecto a los anticuerpos comunes que unen a un antígeno de una manera de pH o calcio independiente. Se reveló que éste se aplica no solamente al IL6R humano descrito en el Ejemplo 5 o el CD4 humano descrito en el Ejemplo 19 pero también al IgA humano. Por otra parte, además del IL6R humano descrito en los Ejemplos 6 y 7, se demostró para el IgA humano que la eliminación del antígeno puede ser más acelerada mejorando la unión al FcRn de anticuerpos de unión al calcio dependiente a pH 7.4.
Como se muestra en el Ejemplo de Referencia 31, Fv4-lgG1, que une al receptor IL-6 humano de una manera con pH dependiente, puede acelerar la eliminación del receptor IL-6 humano con respecto a H54/L28-lgG1 que une al receptor IL-6 humano de una manera con pH independiente; sin embargo, Fv4-I g G 1 no puede acelerar la eliminación con respecto a la administración del receptor IL-6 humano solo. Fv4-lgG1-v1 o Fv4-lgG1-v2 con la actividad de unión al FcRn mejorada en el intervalo neutral se debe usar para acelerar la eliminación con respecto a la administración del receptor IL-6 humano solo.
Mientras tanto, sorpresivamente, GA2-lgG1, que une al IgA humano de una manera con Ca dependiente, se reveló para acelerar la eliminación de IgA humano con respecto a la administración de IgA humano solo, aunque tiene la región constante de I g G 1 natural cuya unión al FcRn en el intervalo neutral no se mejoró. El siguiente mecanismo se piensa para dar cuenta de lo que sucedió en GA2-lgG1.
En el caso de los antígenos monoméricos como el receptor IL-6 humano, dos antígenos unen a un anticuerpo bivalente. Esto da lugar a la formación de un complejo de antígeno/anticuerpo que consiste de tres moléculas de antígeno y de anticuerpo. Por una parte, puesto que el IgA humano es un antígeno dimérico y un anticuerpo es bivalente, el complejo de antígeno/anticuerpo entre ellos es probable para formar un complejo de antígeno/anticuerpo (complejo inmune) que consiste de cuatro o más moléculas de antígeno y de anticuerpo.
Cuando un anticuerpo común del tipo lgG1 natural contra un antígeno multimérico forma un complejo inmune grande, el complejo inmune puede unir a FcgR, a FcRn, al receptor de complemento, y similares con avidez en una manera polivalente a través del dominio de Fe. Así, el complejo inmune se internaliza en las células que expresan tales receptores. Mientras tanto, un anticuerpo de pH común/Ca independiente contra un antígeno monomérico tiene afinidad insuficiente para el receptor tipo I g G 1 natural, y así el complejo inmune resultante se internaliza en las células con baja eficiencia. El FcRn originalmente tiene un papel de reciclaje de anticuerpos intracelularmente internalizados del endosoma al plasma. Sin embargo, los complejos inmunes grandes capaces de unir al FcRn en una manera polivalente se conocen para ser transferidos desde el endosoma por FcRn y para ser degradados en el lisosoma. Específicamente, como se muestra en la Fig. 26, un anticuerpo común contra un antígeno multimérico, que forma un complejo inmune grande, puede acelerar la eliminación del antígeno; sin embargo, el antígeno no se disocia del anticuerpo en el endosoma, y el anticuerpo también se elimina simultáneamente junto con el antígeno. Por lo tanto, la eficacia de la eliminación del antígeno por la molécula de anticuerpo es baja. En otras palabras, un anticuerpo con pH común/Ca independiente contra un antígeno monomérico puede acelerar la eliminación del antígeno; sin embargo, la eficacia se asume para ser baja.
Por otra parte, cuando un anticuerpo de pH/Ca-dependiente que tiene una región constante de tipo I g G 1 natural contra un antígeno multimérico forma un complejo inmune grande, el complejo inmune une al FcgR, al FcRn, al receptor de complemento, y similares con avidez a través de la región polivalente de Fe como se muestra en la Fig. 27, y es tomado por las células que expresan los receptores. El complejo inmune se disuelve mediante disociación del antígeno a partir del anticuerpo de pH/Ca-dependiente en el endosoma. El antígeno no puede unir a FcRn y se transfiere al lisosoma para la degradación. Mientras tanto, el anticuerpo es reciclado al plasma por FcRn debido a que no forma un complejo inmune.
Específicamente, cuando un anticuerpo de pH/Ca-dependiente que tiene una región constante tipo I g G 1 natural contra un antígeno multimérico puede unir al FcgR, al FcRn, al receptor de complemento, y similares con avidez por la formación de un complejo inmune grande, sólo la eliminación del antígeno puede ser selectivamente y aceleradamente en gran medida. El fenómeno descrito antes se asumido también para ocurrir con GA2-lgG1 contra IgA humano. Se espera que esto sea útil como un método para significativamente acelerar la eliminación del antígeno multimérico sin usar el método de sustitución del aminoácido para mejorar la unión al FcRn de lgG1 natural en el intervalo neutral como se muestra en el Ejemplo de Referencia 31.
Para alcanzar el efecto descrito antes, un antígeno y un anticuerpo forman un complejo inmune grande y deben unir firmemente al FcgR/FcRn con avidez, incluso si el anticuerpo es un I g G 1. Cuando el antígeno es un antígeno dimérico o polimérico de orden superior, por la evaluación de los anticuerpos de pH/Ca-dependiente que forman un complejo inmune grande y unen al receptor descrito antes, la eliminación del antígeno puede ser acelerada eficientemente usando la región constante natural I g G 1 sin la realización de ninguna sustitución del aminoácido. En general, se considera que los antígenos tienen que ser multiméricos (por ejemplo, inmunoglobulinas como IgA e IgE, y la superfamilia de TNF como TNF y CD154) para que los anticuerpos y los antígenos formen complejos inmunes grandes. Incluso cuando un antígeno es monomérico, un complejo inmune grande puede ser formado usando una mezcla de dos o más tipos de anticuerpos de pH/Ca-dependiente apropiados que reconocen dos o más epítopos en un antígeno monomérico. Alternativamente, un complejo inmune grande puede ser formado usando un anticuerpo de pH/Ca-dependiente multiespecífico apropiado que reconoce dos o más epítopos en un antígeno monomérico (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico que tiene una región constante de IgG natural con los brazos derechos e izquierdos que reconocen los epítopos A y B, respectivamente, como se muestra en la Fig. 28).
Específicamente, si los anticuerpos de pH/Ca-dependiente apropiados contra los antígenos monoméricos pueden ser evaluados, la eliminación del antígeno puede ser acelerada eficientemente usando una mezcla de anticuerpos que tienen una región constante de IgG 1 natural o un anticuerpo multiespecifico que tiene una región constante de IgGInatural, sin usar el I g G 1 mutante que tiene una sustitución del aminoácido.
Ejemplo 22 Anticuerpos que unen a glipicano 3 humano de una manera dependiente de calcio (22-1 ) Preparación de glipicano 3 humano (GPC3) Se preparó el glipicano 3 humano recombinante (más adelante abreviado como GPC3) el cual se usa como un antígeno mediante el siguiente procedimiento. Se cultivaron las células CHO constitutivamente introducidas con un plásmido que expresa una secuencia a la cual seis residuos de histidina se liguen a la secuencia de aminoácido del glipicano 3 humano sin tener el dominio de transmembrana (SEC ID NO: 93). Entonces, a partir del sobrenadante de cultivo recolectado, se purificó GPC3 mediante cromatografía de intercambio iónico, seguido por la cromatografía de filtración en gel y afinidad de etiqueta His basada. (22-2) Expresión v purificación de los anticuerpos que unen al GPC3 humano Los anticuerpos de glipicano 3 anti-humano CSCM-01_005 (secuencia de cadena pesada: 94; secuencia de cadena ligera: 95), CSCM-01_009 (secuencia de cadena pesada: 96; secuencia de cadena ligera: 97), CSCM-01_015 (secuencia de cadena pesada: 98, secuencia de cadena ligera: 99), CSCM-01_023 (secuencia de cadena pesada: 100; secuencia de cadena ligera: 101), y GC-lgG1 (secuencia de cadena pesada: 102; secuencia de cadena ligera: 103) fueron cada uno insertados en los plásmidos de expresión animal. Se expresaron los anticuerpos mediante el siguiente procedimiento. Se suspendieron las células de FreeStyle 293-F de células derivadas de riñon fetal humano (Invitrogen) en el Medio de Expresión de FreeStyle 293 (Invitrogen), y se aplicaron a una densidad celular de 1.33 x 106 células/ml (3 mi) en cada pozo de una placa de 6 pozos. Se introdujeron los plásmidos preparados en las células mediante un método de lipofección. Se cultivaron las células durante cuatro días en una incubadora de C02 (37°C, 8% de C02, 90 rpm). A partir de los sobrenadantes de cultivo preparados, se purificaron los anticuerpos usando el rProtein A SepharoseTM Fast Flow (Amersham Biosciences) mediante un método conocido por los expertos en la técnica. Se determinaron las concentraciones de anticuerpos purificados midiendo la absorbencia a 280 nm usando un espectrofotómetro. Se calcularon las concentraciones de anticuerpos de los valores determinados usando un coeficiente de extinción calculado mediante el método PACE (Protein Science (1995) 4: 2411-2423). Además, se purificó el anticuerpo GC-lgG1 de los sobrenadantes de cultivo de las células CHO que expresan constitutivamente el anticuerpo GC-lgG1 y se determinó su concentración mediante el mismo método como se describe anteriormente. (22-3) Evaluación de los anticuerpos aislados para la actividad de unión al GPC3 humano con Ca dependiente Se sometieron los anticuerpos aislados a ELISA usando el siguiente procedimiento. Se cubrió la placa de microtítulo de 96 pozos StreptaWeII (Roche) durante la noche con 100 µ? de PBS que contiene un antígeno etiquetado con biotina. Después de que el antígeno se lavó de cada pozo de la placa usando el amortiguador de ACES (10 mM de ACES, 150 mM de NaCI, 100 mM de CaCI2, 0.05% de Tween20, pH 7.4), se bloquearon los pozos durante una hora o más con 250 µ? de un amortiguador de ACES que contiene 2% de BSA. Después de eliminar el amortiguador ACES que contiene 2% de BSA de cada pozo, un IgG purificado diluido en serie a una relación de dilución de 4 a partir de 10 µg/r\ se preparó de antemano y se dividió en alícuotas a 100 µ? en la placa. Se dejó reposar la placa durante una hora para permitir la unión de IgG al antígeno en cada pozo. Después de lavar con el amortiguador de ACES, se agregaron "10 mM de ACES, 150 mM de NaCI, 1.2 mM de CaCI2, pH 7.4", "10 mM de ACES, 150 mM de NaCI, 3 µ? de CaCI2, pH 7.4", "10 mM de ACES, 150 mM de NaCI, 1.2 mM de CaCI2, pH 5.8", o "10 mM de ACES, 150 mM de NaCI, 3 µ? de CaCI2, pH 5.8" a cada pozo. Se incubó la placa a 37°C durante 30 minutos. Después de lavar con el amortiguador de ACES, se agregó un anticuerpo IgG antihumano con HRP-conjugado (BIOSOURCE) diluido con un amortiguador de ACES que contiene 2% de BSA a cada pozo. Se incubó la placa durante una hora. Después de lavar con amortiguador de ACES, se agregó la solución sencilla de TMB (ZYMED) a cada pozo. La reacción cromogénica en la solución de cada pozo se terminó al agregar el ácido sulfúrico. Después, se evaluó el color desarrollado midiendo la absorbencia a 450 nm.
El resultado de medición se muestra en la Fig. 29. En el caso de GC-lgG1, la absorbencia de GC-lgG1 no cambió de acuerdo con la concentración del ion de calcio. Por el contrario, en cuanto a CSCM-01 _005, CSCM-01_009, CSCM-01_015, y CSCM-01_023, la absorbencia fu considerablemente menor en una concentración del ion de calcio de 3 µ? (baja concentración del ion de calcio) que a 1.2 mM (alta concentración del ion de calcio). El resultado descrito antes demuestra que CSCM-01_005, CSCM-01_009, CSCM-01 _015, y CSCM-01_023 tienen la propiedad que su unión al antígeno varía de acuerdo con la concentración del ion de calcio. Esto demuestra que los anticuerpos dependientes de calcios contra el glipicano 3 humano son también obtenibles. Con respecto a los anticuerpos glipicano 3 anti-humano comunes, se considera que los anticuerpos glipicano 3 anti-humano dependientes de calcio pueden acelerar la eliminación del glipicano 3 humano, se describe similarmente en el caso con IL-6R humano, CD4 humano, o IgA humano en los Ejemplos anteriores. Por otra parte, se considera que la eliminación del glipicano 3 humano puede ser además acelerada mediante la mejora de la unión al FcRn de los anticuerpos de glipicano 3 anti-humano dependiente de calcios a pH 7.4.
Ejemplo 23 Anticuerpos que unen a IgE de una manera dependiente de calcio (23-1) Preparación de IgE humano biotinilado Se preparó el IgE humano como un antígeno mediante el siguiente procedimiento. Un vector de expresión de célula animal insertado con una secuencia de ADN que codifica el IgE-H (SEC ID NO: 104, una secuencia para la biotinilación se liga en la C terminal) y se preparó L(WT) (SEC ID NO: 14). Usando el vector de expresión y FreeStyle293 (Invitrogen), se expresó la proteína IgE humana de longitud completa a la cual una secuencia para la biotinilación se liga a la C terminal en el sobrenadante del cultivo. A partir del sobrenadante de cultivo aislado, se preparó un IgE humano biotinilado mediante la realización de la cromatografía de intercambio iónico, la purificación de afinidad de avidina, y la purificación de la cromatografía de filtración en gel. (23-2) Expresión y purificación de los anticuerpos que unen al IgE humano GEB0100 (cadena pesada, SEC ID NO: 105; cadena ligera, SEC ID NO: 106), GEB0220 (cadena pesada, SEC ID NO: 107; cadena ligera, SEC ID NO: 108), GEB0230 (cadena pesada, SEC ID NO: 109; cadena ligera, SEC ID NO: 110), y Xolair (cadena pesada, SEC ID NO: 111; cadena ligera, SEC ID NO: 112) fueron los anticuerpos que unen al IgE humano. GEB0100 (cadena pesada, SEC ID NO: 105; cadena ligera, SEC ID NO: 106), GEB0220 (cadena pesada, SEC ID NO: 107; cadena ligera, SEC ID NO: 108), GEB0230 (cadena pesada, SEC ID NO: 109; cadena ligera, SEC ID NO: 110), y Xolair (nombre genérico: Omalizumab) (cadena pesada, SEC ID NO: 111; cadena ligera, SEC ID NO: 112) fueron cada uno insertados en los plásmidos de expresión animal mediante un método conocido por los expertos en la técnica. Se expresaron los anticuerpos mediante el siguiente procedimiento. Se introdujeron los plásmidos construidos en células de FreeStyle 293-F derivado de células de riñón fetal humano (Invitrogen) mediante un método de lipofección. Se cultivaron las células durante cuatro a siete días en una incubadora de C02 (37°C, 8% de C02, 90 rpm). A partir de los sobrenadantes de cultivo preparados, se purificaron los anticuerpos usando el rProtein A SepharoseTM Fast Flow (Amersham Biosciences) mediante un método conocido por los expertos en la técnica.
Se determinaron las concentraciones de anticuerpos purificados midiendo la absorbencia en 280 nM usando un espectrofotómetro. Se calcularon las concentraciones de anticuerpos de los valores determinados usando un coeficiente de extinción calculado mediante el método PACE (Protein Science (1995) 4: 2411-2423). (23-3) Evaluación de anticuerpos aislados para la actividad de unión al IgE humano con Ca dependiente Se evaluaron los anticuerpos aislados para su actividad de unión con Ca dependiente a) IgE humano mediante ELISA. Específicamente, se agregaron 40 µ? de 1 pg/ml de anticuerpo policlonal de IgG-Fc anti-conejo de cabra (Bethyl laboratory; A120-111A) o 1 Mg/ml de anticuerpo policlonal de IgG-Fc antihumano de cabra (ICN biomedicals; 55071) a la placa de 384 MaxiSorp de NUNC Immuno (Thermo fisher scientific; 464718). Después de una hora de incubación a temperatura ambiente, se eliminó la solución y se agregaron 50 µ? de Blocking One Reagent (Nacalai Tesque; 03953-95) diluido a 20%. Después de una hora de incubación a temperatura ambiente, se eliminó la solución y se agregaron 40 µ? de anticuerpos purificados diluidos con amortiguador de Tris que contiene 1.2 mM de cloruro de calcio. Después de la incubación durante la noche a 4°C, se lavó la placa tres veces con 80 µ? de amortiguador de Tris que contiene 1.2 mM de cloruro de calcio y 0.05% (p/v) de Tween-20, y se agregaron 40 µ? de IgE humano biotinilado (preparado como se describe en (23-1)) diluido a 500 ng/ml con un amortiguador de Tris que contiene 1.2 mM de cloruro de calcio. Después de una hora de incubación a temperatura ambiente, se lavó la placa tres veces con 80 µ? de un amortiguador de Tris que contiene 1.2 mM de cloruro de calcio y 0.05% (p/v) de Tween-20. Se agregaron 80 µ? de un amortiguador de ACES (pH 7.4) que contiene 2 mM o 3 µ? de cloruro de calcio y después se eliminaron inmediatamente. De nuevo, se agregaron 80 µ? de un amortiguador de ACES (pH 7.4) que contiene 2 mM o 3 µ? de cloruro de calcio a la placa. Después de una hora de incubación a 37°C, se lavó la placa tres veces con 80 µ? de un amortiguador de Tris que contiene 1.2 mM de cloruro de calcio y 0.05% (p/v) de Tween-20, y se agregaron 40 µ? de estreptavidina etiquetada con HRP (Thermo fisher scientific; 21132) diluidos a 25 ng/ml con un amortiguador de Tris que contiene 1.2 mM de cloruro de calcio. Después de una hora de incubación a temperatura ambiente, se lavó la placa tres veces con 80 µ? de un amortiguador de Tris que contiene 1.2 mM de cloruro de calcio y 0.05% (p/v) de Tween-20. Después, se agregaron 40 µ? de un sustrato cromogénico (KPL; 50-66-06: componente del sistema 1 del sustrato de peroxidasa de ABTS). Después de 15 a 30 minutos de incubación a temperatura ambiente, se midió la absorbencia a 405 nM (Molecular Devices; SpectraMax Plus384).
El resultado de la medición se muestra en la Fig. 30. En el caso de Xolair, la absorbencia no cambió de acuerdo con la concentración del ion de calcio. Por el contrario, como para GEB0100, GEB0220, y GEB0230, la absorbencia fue considerablemente menor en una concentración del ion de calcio de 3 µ? (baja concentración del ion de calcio) que en 1.2 mM (alta concentración del ion de calcio). El resultado descrito antes demuestra que GEB0100, GEB0220, y GEB0230 tienen la propiedad que su unión al antígeno varía de acuerdo con la concentración del ion de calcio. Esto indica que los anticuerpos dependientes de calcios contra IgE humano son también obtenibles. Con respecto a los anticuerpos IgE anti-humano comunes como Xolair, se considera que los anticuerpos de IgE anti-humano dependientes de calcios pueden acelerar la eliminación de IgE humano, similarmente en el caso con IL-6R humano, CD4 humano, o IgA humano descritos en los Ejemplos anteriores. Por otra parte, se considera que la eliminación del IgE humano puede ser aún más acelerada mediante la mejora de la unión al FcRn de los anticuerpos anti-humanos dependiente de calcios de IgE a pH 7.4.
Ejemplo de Referencia 1 Preparación del receptor de IL-6 humano soluble (hslL-6R) Se preparó el receptor de IL-6 humano recombinante como un antígeno como sigue. Se estableció una línea celular CHO constitutivamente que expresa el receptor de IL-6 humano soluble (más adelante referido hslL-6R) que tiene la secuencia de aminoácido de las posiciones 1 a 357 de la N terminal como se reportó en J. Immunol. 152:4958-4968 (1994) mediante un método conocido por los expertos en la técnica. Se cultivaron las células para expresar hslL-6R. Se purificó el hslL-6R a partir del sobrenadante de cultivo por dos etapas: cromatografía en columna de Sefarosa azul 6 FF y cromatografía en columna de filtración en gel. Se preparó una fracción eluída como el máximo principal en la etapa final como el producto de purificación final.
Ejemplo de Referencia 2 Preparación de FcRn humano El FcRn es un complejo de FcRn y de p2-microglobulina. Se prepararon los cebadores de Oligo-ADN basados en la secuencia del gen de FcRn humano publicada (J Exp ed. 1994 Dec 1; 180(6): 2377-81). Se preparó un fragmento de ADN que codificaba el gen entero mediante PCR usando el cADN humano (Human Placenta Marathon-Ready cDNA, Clontech) como un molde y los cebadores preparados. Usando el fragmento de ADN obtenido como un molde, se amplificó un fragmento de ADN que codifica el dominio extracelular que contiene la región de señal (Metí -Leu290) mediante PCR, e insertó en un vector de expresión de célula mamífera. Asimismo, se prepararon los cebadores oligo-ADN basados en la secuencia de gen de p2-microglobulina humano publicada (Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 99 (26): 16899-16903 (2002)). Se preparó un fragmento de ADN que codificaba el gen entero mediante PCR usando el cADN humano (Human Placenta Marathon-Ready cDNA, Clontech) como un molde y los cebadores preparadas. Usando el fragmento de ADN obtenido como un molde, se amplificó un fragmento de ADN que codifica la proteína entera que contiene una región de señal (Metí -Metí 19) mediante PCR e insertó en un vector de expresión de célula mamífera.
Se expresó el FcRn humano soluble mediante el siguiente procedimiento. Se introdujeron los plásmidos construidos para expresar el FcRn humano (SEC ID NO: 17) y p2-microglobulina (SEC ID NO: 18) en las células de la línea celular derivada de cáncer de riñón embrionario humano HEK293H (Invitrogen) mediante el método de lipofección usando PEI (Polyscience). Se recolectó el sobrenadante de cultivo resultante, y se purificó el FcRn usando Sepharose 6 Fast Flow de IgG (Amersham Biosciences), seguido por la purificación adicional usando HiTrap Q HP (GE Healthcare) (J Immunol. 1 de noviembre de 2002; 169 (9): 5171-80).
Ejemplo de Referencia 3 Estudios para mejorar el efecto de eliminación-aceleración del antígeno de los anticuerpos de unión al antígeno dependiente de pH (prueba in vivo) (3-1) Preparación de los anticuerpos de unión al receptor IL-6 humano dependiente de pH que unen a FcRn bajo una condición neutral Se introdujeron las mutaciones en Fv4-lgG1 que comprende VH3-lgG1 (SEC ID NO: 19) y VL3-CK (SEC ID NO: 20) para aumentar la unión al FcRn bajo una condición neutral (pH 7.4). Específicamente, se preparó VH3-lgG1-v1 (SEC ID NO: 21) de la región constante de cadena pesada de lgG1 mediante la sustitución de Tyr por Met en la posición 252, Thr por Ser en la posición 254, y Glu por Thr en la posición 256 en la numeración de EU,, mientras se construyó VH3-lgG1-v2 (SEC ID NO: 22) a partir de la región constante de cadena pesada de I g G 1 mediante la sustitución de Trp por Asn en la posición 434 en la numeración de EU. Se construyeron los mutantes por la sustitución del aminoácido usando el Kit de Mutagénesis Dirigida al Sitio QuikChange (Stratagene) o el Kit de Clonación In-Fusion HD (Clontech) de acuerdo con el método descrito en el manual proporcionado. Se insertaron los fragmentos del plásmido preparados en los vectores de expresión de célula animal a los vectores de expresión de constructo para la cadena H y la cadena L de interés. Se determinaron las secuencias de nucleótido de los vectores de expresión construidos mediante un método conocido por los expertos en la técnica.
Se expresaron H54/L28-lgG1 que comprende H54 (SEC ID NO: 5) y L28 (SEC ID NO: 6), Fv4-lgG1 que comprende VH3-lgG1 (SEC ID NO: 19) y VL3-CK (SEC ID NO: 20), Fv4-lgG1-v1 que comprende VH3-lgG1-v1 (SEC ID NO: 21) y VL3-CK (SEC ID NO: 20), y Fv4-lgG1-v2 que comprende VH3-lgG1-v2 (SEC ID NO: 22) y VL3-CK (SEC ID NO: 20) y se purificaron mediante el método descrito más adelante. Se expresaron los anticuerpos por FreestyleHEK293 (Invitrogen) como se describe por el protocolo proporcionado por la fabricación o la línea celular HEK293H (Invitrogen). Se suspendió la línea celular HEK293H derivada de cáncer de riñón embrionario humano (Invitrogen) en D EM (Invitrogen) complementada con 10% de suero vacuno fetal (Invitrogen). Se aplicaron las células en 10 mi por placa en las placas para las células adherentes (10 cm en diámetro; CORNING) en una densidad celular de 5 a 6 x 105 células/ml y cultivadas en una incubadora de C02 (37°C, 5% de C02) durante un día y noche completa. Entonces, se eliminó el medio mediante aspiración, y se agregaron 6.9 mi de medio CHO-S-SFM-II (Invitrogen). Se introdujo el plásmido preparado en las células mediante el método de lipofección. Se recolectaron los sobrenadantes de cultivo resultantes, se centrifugados (aproximadamente 2.000 x g, 5 minuto, temperatura ambiente) para eliminar las células, y se esterilizaron mediante filtración a través de un filtro de 0.22-µ?? MILLEX (marca registrada)-G V (Millipore) para obtener los sobrenadantes. Se purificaron los anticuerpos de los sobrenadantes de cultivo obtenidos mediante un método conocido por los expertos en la técnica que usaron el rProtein A Sepharose™ Fast Flow (Amersham Biosciences). Para determinar la concentración del anticuerpo purificado, se midió la absorbencia en 280 nM usando un espectrofotómetro. Se calcularon las concentraciones de anticuerpos de los valores determinados usando un coeficiente de absorbencia calculado mediante el método descrito en Protein Science (1995) 4: 2411-2423. (3-2) Prueba in vivo usando ratones transgénicos con FcRn humano y ratones normales Se evaluaron la cinética in vivo de hslL-6R (receptor de IL-6 humano soluble: preparado como se describe en el Ejemplo de Referencia 1) y el anticuerpo del receptor de IL-6 anti-humano después de administrar el hslL-6R solo o hslL-6R y el anticuerpo del receptor de IL-6 anti-humano en combinación con ratones transgénicos con FcRn humano (B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg line 276 + /+ mouse, Jackson Laboratories; Methods Mol Biol. (2010) 602: 93-104) and normal mice (C57BL/6J mouse; Charles River Japón). Se administró una solución de hslL-6R (5 g/ml) o una solución de la mezcla que contiene hslL-6R y anticuerpo del receptor de IL-6 anti-humano (5 pg/ml y 0.1 mg/ml, respectivamente) una vez en una dosis de 10 ml/kg en la vena caudal. En este caso, el anticuerpo del receptor de IL-6 anti-humano está presente en exceso sobre hslL-6R, y por lo tanto casi cada hslL-6R se asume para ser unido al anticuerpo. Se recolectó la sangre 15 minutos, siete horas, un día, dos días, tres días, cuatro días, siete días, 14 días, 21 días, y 28 días después de la administración. Se centrifugó la sangre recolectada inmediatamente a 15,000 rpm y 4°C durante 15 minutos para separar el plasma. Se almacenó el plasma separado en un refrigerador a o debajo de -20°C antes del ensayo. Los anticuerpos del receptor de IL-6 anti-humano usados son: H54/L28-lgG1 , Fv4-lgG1, y Fv4-lgG1-v2 descritos antes para ratones transgénicos con FcRn humano, y H54/L28-lgG1 , Fv4-lgG1, Fv4-lgG1-v1, y Fv4-lgG1-v2 descritos antes para ratones normales. (3-3) Medición de la concentración en plasma del anticuerpo del receptor de IL-6 anti-humano mediante ELISA Se midió la concentración de anticuerpo del receptor de IL-6 anti-humano en plasma de ratón mediante ELISA. Se dispensó el fragmento del anticuerpo F(ab')2 de IgG anti-humano (cadena ? específica) (Sigma) sobre en un Nunc-lmmunoPlate MaxiSorp (Nalge Nunc International) y se dejaron reposar durante la noche a 4°C para preparar las placas inmovilizado con IgG anti-humano. Se prepararon las muestras de curva de calibración que tienen concentraciones de plasma de 0.8, 0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025, y 0.0125 Mg/ml, y de muestras de plasma de ratón diluidas cien veces o más. Se agregaron 200 µ? de 20 ng/ml de hslL-6R a 100 µ? de las muestras de curva de calibración y las muestras de plasma, y después las muestras se dejaron reposar durante una hora a temperatura ambiente. Posteriormente, se dispensaron las muestras en las placas inmovilizado con IgG anti-humano, y se dejaron reposar durante una hora a temperatura ambiente. Entonces, se agregó el Anticuerpo de IL-6R Anti-Humano Biotinilado (R&D) para reaccionar durante una hora a temperatura ambiente. Posteriormente, se agregó Streptavidin-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) para reaccionar durante una hora a temperatura ambiente, y se realizó la reacción cromogénica usando el Sustrato de Micropozo HRP de Un Componente TMB (BioFX Laboratories) como un sustrato. Después de detener la reacción con ácido sulfúrico 1N (Showa Chemical), se midió la absorbencia a 450 nM mediante un lector de microplaca. Se calculó la concentración en plasma de ratón de la absorbencia de la curva de calibración usando el software analítico SOFTmax PRO (Molecular Devices). El curso de tiempo de la concentración en plasma después de la administración intravenosa como se midió mediante este método se muestra en la Fig. 31 para ratones transgénicos con FcRn humano y la Fig.33 para ratones normales. (3-4) Medición de la concentración en plasma de hslL-6R mediante ensayo de electroquimioluminiscencia Se midió la concentración de hslL-6R en plasma del ratón por electroquimioluminiscencia. Se diluyeron las muestras de la curva de calibración de hslL-6R ajustadas a las concentraciones de 2,000, 1,000, 500, 250, 125, 62.5, y 31.25 pg/ml, y se prepararon las muestras del plasma de ratón 50 veces o más. Se mezclaron las muestras con una solución del Anticuerpo de IL-6R Anti-humano Monoclonal (R&D) etiquetado con rutenio con éster NHS Etiquetado con Sulfo (Meso Scale Discovery), anticuerpo de IL-6R Anti-humano Biotinilado (R&D), y WT-lgG1, y entonces se dejó reaccionar durante la noche a 37°C. La concentración final de WT-lgG1 como un anticuerpo del receptor de IL-6 anti-humano, que comprende H(WT) (SEC ID NO: 13) y L(WT) (SEC ID NO: 14), fue 333 pg/ml, que está en exceso de la concentración de anticuerpo del receptor de IL-6 anti-humano contenido en las muestras, para el propósito de unir casi todas las moléculas de hslL-6R en las muestras a WT-lgG1. Posteriormente, se dispensaron las muestras en una Placa de Estreptavidina MA400 PR (Meso Scale Discovery), y se dejaron reaccionar durante una hora a temperatura ambiente, y se realizó el lavado. Inmediatamente después se dispensó el amortiguador T de Read (x4) (Meso Scale Discovery), se realizó la medición mediante el Lector Sector PR 400 (Meso Scale Discovery). Se calculó la concentración de hsll_-6R basada en la respuesta de la curva de calibración usando el software analítico SOFTmax PRO (Molecular Devices). El curso de tiempo de la concentración de hslL-6R en plasma después de la administración intravenosa como se midió mediante este método se muestra en la Fig. 32 para ratones transgénicos con FcRn humano y la Fig. 34 para ratones normales. (3-5) determinar la concentración libre de hslL-6 en plasma mediante el análisis de electroquimioluminiscencia Para evaluar el grado de neutralización del receptor de IL-6 humano soluble en plasma, se determinó la concentración de receptor de IL-6 humano soluble libere de (no-neutralizado por) el anticuerpo del receptor de IL-6 anti-humano (concentración libre de hslL-6R) en plasma de ratón mediante el ensayo de electroquimioluminiscencia. Se adsorbieron todo los anticuerpos tipo IgG (IgG de ratón, anticuerpo del receptor de IL-6 antihumano, y complejo del receptor de IL-6 humano soluble en anticuerpo del receptor de IL-6 anti-humano) en plasma sobre la proteína A mediante la adición de 12 µ? cada una de las muestras estándar de hslL-6R preparadas en 10,000, 5,000, 2,500, 1,250, 625, 312.5, o 156.25 pg/ml y se secaron las muestras de plasma de ratón sobre una cantidad apropiada de resina rProtein A Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) en el vaso de filtro de 0.22- µ?? (Millipore). Entonces, la solución en un vaso se hizo girar hacia abajo usando una centrifugadora de alta velocidad para recolectar la solución probada. La solución probada no contiene el complejo del receptor de IL-6 humano soluble en anticuerpo del receptor de IL-6 anti-humano unido a proteína A. Así, la concentración de hslL-6R libre en plasma puede ser determinada midiendo la concentración de hslL-6R en la solución probada. Entonces, se mezcló la solución probada con un anticuerpo de IL-6R anti-humano monoclonal (R&D) etiquetado con rutenio con éster de SULFO-TAG NHS (Meso Scale Discovery) y un anticuerpo de IL-6R anti-humano biotinilado (R&D). Se incubó la mezcla resultante a temperatura ambiente durante una hora, y después se dividió en alícuotas en la Placa de Estreptavidina MA400 PR (Meso Scale Discovery). Después de otra hora de incubación a temperatura ambiente, se lavó la placa y el amortiguador T de Read (x4) (Meso Scale Discovery) se dividió en alícuotas en la misma. Inmediatamente, se midió la placa en el lector SECTOR PR 400 (Meso Scale Discovery). Se calculó la concentración de hslL-6R basada en la respuesta en la curva estándar usando el software de análisis SOFTmax PRO (Molecular Devices). Un curso de tiempo de la concentración libre de hslL-6R en el plasma del ratón normal después de la administración intravenosa determinada mediante el método descrito antes se muestra en la Fig. 35. (3-6) Efecto de la unión dependiente de pH al receptor IL-6 humano Se probaron H54/L28-lgG1 y Fv4-lgG1 que une al receptor IL-6 humano de una manera dependiente de pH in vivo, y se compararon los resultados entre ellos. Como se muestra en las Figs. 31 y 33, la retención del anticuerpo en plasma fue comparable. Mientras tanto, como se muestra en la las figs. 32 y 34, se administró hslL-6R simultáneamente con Fv4-lgG1 que une al receptor de IL-6 humano de una manera dependiente de pH se encontró para acelerar la eliminación de hsll_-6R con respecto a hslL-6R simultáneamente administrado con H54/L28-lgG1. Se observó la tendencia anterior en los ratones transgénicos y normales de FcRn humano; así, se demostró mediante conferir una capacidad de unión al receptor de IL-6 humano dependiente de pH, la concentración de hslL-6R en plasma durante cuatro días después de la administración podría ser disminuida por aproximadamente 17 y 34 veces, respectivamente. (3-7) Efecto de la unión al FcRn bajo una condición neutral (pH 7.4) Se ha reportado el lgG1 humano natural para apenas unir a (tener extremadamente baja afinidad para) el FcRn humano bajo una condición neutral (pH 7.4). Se reportó la unión al FcRn humano bajo una condición neutral (pH 7.4) para ser aumentado mediante la sustitución de Trp por Asn en la posición 434 (Numeración de EU) en el lgG1 humano natural (J Immunol. (2009) 182 (12): 7663-71). Se probó Fv4-lgG1-v2 que resulta de introducir la sustitución del aminoácido anterior en Fv4-lgG1 por una prueba in vivo usando ratones transgénicos con FcRn humano. Se comparó el resultado de la prueba al de Fv4-lgG1. Como se muestra en la Fig. 31, la retención de plasma del anticuerpo fue comparable entre los dos. Mientras tanto, como se muestra en la Fig. 32, el hslL-6R simultáneamente administrado con Fv4-lgG1-v2 que exhibe la unión al FcRn humano mejorado bajo una condición neutral (pH 7.4) se encontró para ser eliminado más rápidamente con respecto a hslL-6R simultáneamente administrado con Fv4-lgG1. Así, se demostró que mediante conferir la capacidad de unir a FcRn humano bajo una condición neutral (pH 7.4), la concentración en plasma de hslL-6R cuatro días después de que la administración podría ser reducida por aproximadamente cuatro veces.
Basado en la homología entre el FcRn humano y el FcRn ratón, la sustitución de Trp por Asn en la posición 434 en la numeración de EU se asume para aumentar la unión al FcRn de ratón bajo una condición neutral (pH 7.4). Mientras tanto, la unión al FcRn de ratón bajo una condición neutral (pH 7.4) se ha reportado para ser aumentado mediante la sustitución de Tyr por Met en la posición 252, Thr por Ser en la posición 254, y Glu por Thr en la posición 256 en la numeración de EU (J Immunol. (2002) 169 (9): 5171-80). Fv4-lgG1-v1 y Fv4-lgG1-v2 que resultan de introducir las sustituciones del aminoácido descritas antes en Fv4-lgG1 se probaron in vivo usando ratones normales. Se compararon los resultados de prueba a los de Fv4-lgG1. Como se muestra en la Fig. 33, los tiempos de retención del plasma de Fv4-lgG1-v1 y Fv4-lgG1-v2 que también habían sido mejorados para aumentar la unión al FcRn de ratón bajo una condición neutral (pH 7.4) se acortados ligeramente (las concentraciones del anticuerpo de neutralización en plasma un día después de que la administración se redujo por aproximadamente 1.5 y 1.9 veces, respectivamente) con respecto a Fv4-lgG1.
Como se muestra en la Fig. 34, se demostró hslL-6R administrado simultáneamente con Fv4-lgG1-v1 o Fv4-lgG1-v2 que habían sido mejorados para aumentar la unión al FcRn de ratón bajo una condición neutral (pH 7.4) para ser eliminado marcadamente más rápido con respecto al hslL-6R simultáneamente administrado con Fv4-lgG1. Fv4-lgG1-v1 y Fv4-lgG1-v2 redujeron las concentraciones de hslL-6R en plasma un día después de la administración por aproximadamente 32 y 80 veces, respectivamente. Así, fue reveló que la concentración en plasma se podría reducir mediante conferir la capacidad de unión al FcRn de ratón bajo una condición neutral (pH 7.4). Como se describe anteriormente, mediante conferir la capacidad de unión al FcRn de ratón bajo una condición neutral (pH 7.4), la concentración del anticuerpo en plasma se redujo ligeramente; sin embargo, el efecto de reducir la concentración de hslL-6R en plasma, que excedió en gran parte la disminución en la concentración del anticuerpo, se produjo. Además, se encontró el hslL-6R administrado simultáneamente con Fv4-lgG1-v1 o Fv4-lgG1-v2 para ser eliminado más rápidamente incluso cuando se comparó al grupo administrado con hslL-6R solo. Como se muestra en la Fig. 34, se demostró que hslL-6R administrado simultáneamente con Fv4-lgG1-v1 o Fv4-lgG1-v2 podría reducir la concentración de hsll_-6R en plasma un día después de la administración por aproximadamente 4 o 11 veces, respectivamente, con respecto a hslL-6R solo. Específicamente, esto se entiende que la eliminación del receptor de IL-6 soluble podría ser acelerada mediante la administración del anticuerpo que une al receptor de IL-6 soluble de una manera dependiente de pH y que se confiere con la capacidad de unión al FcRn de ratón bajo una condición neutral (pH 7.4). Específicamente, la concentración del antígeno en plasma puede ser reducida in vivo al administrar tal anticuerpo al cuerpo.
Como se muestra en la Fig. 35, el hslL-6R libre está en un intervalo de concentración significativa por siete días después de la administración de H54/L28-lgG1 , mientras el hslL-6R libre fue indetectable después de un día después de la administración de Fv4-lgG1. Por una parte, el hslL-6R libre no fue detectable después de siete horas después de la administración de Fv4-lgG1-v1 o de Fv4-lgG1-v2. Específicamente, la concentración de hslL-6R libre fue menor en presencia de Fv4-lgG1 que une a hsIL-6R de una manera dependiente de pH con respecto a H54/L28-I g G 1 , lo que sugiere que un efecto neutralizante de hslL-6R fuerte se produjo que confiere la capacidad de unión al hslL-6R dependiente de pH. Además, la concentración de hslL-6R libre fue mucho menor en presencia de Fv4-lgG1-v1 o de Fv4-lgG1-v2, que fueron modificados a partir de Fv4-lgG1 para aumentar la capacidad de unión al FcRn a pH 7.4. Esto demuestra que un efecto neutralizante de hslL-6R mucho más fuerte puede ser producido al aumentar la capacidad de unión al FcRn a pH 7.4.
Cuando se administró, un anticuerpo neutralizante ordinario como H54/L28-lgG1 reduce la separación de un antígeno de unión, dando por resultado la retención de plasma del antígeno prolongada. No es preferido que los anticuerpos administrados prolonguen la retención de plasma de un antígeno cuya acción se desea para ser neutralizada por los anticuerpos. La retención de plasma del antígeno puede ser acortada al conferir la dependencia del pH a la unión al antígeno (el anticuerpo se une bajo las condiciones neutrales pero se disocia bajo las condiciones ácidas). En la presente invención, el tiempo de retención del antígeno en plasma podría ser más acortado al conferir adicionalmente la capacidad de unión al FcRn humano bajo una condición neutral (pH 7.4). Además, se demostró que con respecto a la separación del antígeno solo, la separación del antígeno podría ser aumentada al administrar un anticuerpo que une a un antígeno de una manera dependiente de pH, y que se confiere con la capacidad de unión al FcRn bajo una condición neutral (pH 7.4). Hasta la fecha, no hay método disponible para aumentar la separación del antígeno mediante la administración del anticuerpo en relación a la separación del antígeno solo. Así, los métodos establecidos como se describe en este EJEMPLO son muy útiles como un método para eliminar los antígenos del plasma al administrar los anticuerpos. Además, los presentes inventores descubrieron por primera vez la ventaja de aumentar la capacidad de unión al FcRn bajo una condición neutral (pH 7.4). Además, v4-lgG1-v1 y Fv4-lgG1-v2 que tienen diferentes sustituciones del aminoácido que aumentan la capacidad de unión al FcRn bajo una condición neutral (pH 7.4) produjeron efectos comparables. Esto sugiere que sin importar el tipo de sustitución del aminoácido, cada sustitución del aminoácido que aumenta la capacidad de unión al FcRn humano bajo una condición neutral (pH 7.4) potencialmente tiene un efecto de acelerar la eliminación del antígeno. Específicamente, las moléculas del anticuerpo que eliminan los antígenos del plasma cuando es administrado se pueden producir usando las siguientes sustituciones del aminoácido solo o en combinación: una sustitución del aminoácido de He por Pro en la posición 257 y una sustitución del aminoácido de He por Gln en la posición 311 en la numeración de EU, que se han reportado en J Biol Chem. 2007, 282(3): 1709-17; una sustitución del aminoácido de Ala, Tyr, o Trp por Asn en la posición 434, una sustitución del aminoácido de Tyr por Met en la posición 252, una sustitución del aminoácido de Gln por Thr en la posición 307, una sustitución del aminoácido de Pro por Val en la posición 308, una sustitución del aminoácido de Gln por Thr en la posición 250, una sustitución del aminoácido de Leu por Met en la posición 428, una sustitución del aminoácido de Ala por Glu en la posición 380, una sustitución del aminoácido de Val por Ala en la posición 378, una sustitución del aminoácido de lie por Tyr en la posición 436 en la numeración de EU, que se han reportado en J Immunol. (2009) 182(12): 7663-71; una sustitución del aminoácido de Tyr poir Met en la posición 252, una sustitución del aminoácido de Thr por Ser en la posición 254, una sustitución del aminoácido de Glu por Thr en la posición 256 en la numeración de EU, que se han reportado en J Biol Chem. 18 de agosto de 2006, 281(33): 23514-24; una sustitución del aminoácido de Lys por His en la posición 433, una sustitución del aminoácido de Phe por Asn en la posición 434, y una sustitución del aminoácido His por Tyr en la posición 436 en la numeración de EU, que se han reportado en Nat Biotechnol. octubre 2005 23(10): 1283-8; y similares.
Ejemplo de Referencia4 Evaluación de la actividad de unión al FcRn humano Para el sistema de ensayo basado en Biacore para probar la interacción entre el anticuerpo y FcRn, un sistema que inmoviliza el anticuerpo en una matriz de detección y usa el FcRn humano como un analito se reportó en J Immunol. (2009) 182(12): 7663-71. Para este propósito, se preparó el FcRn humano como de describe en el Ejemplo de Referencia 4. Se evaluaron Fv4-lgG1, Fv4-lgG1-v1, y Fv4-lgG1-v2 para la actividad de unión al FcRn humano (constante de disociación (KD)) a pH 6.0 y pH 7.4 al usar el sistema descrito antes. Se probaron los anticuerpos como una sustancia de prueba después de la inmovilización directa sobre la Matriz de Detección Serie S CM5. Al usar un kit de combinación de amino de acuerdo con el manual de instrucción del proveedor, se inmovilizaron los anticuerpos sobre la Matriz de Detección para asegurar una cantidad de inmovilización de 500 RU. El amortiguador de análisis usado fue 50 mmol/1 Na-fosfato/150 mmol/l de NaCI que contiene 0.05% (% v/v) de Tensioactivo P20 (pH 6.0).
Con las matrices de detección preparadas, se realizó el ensayo usando como amortiguador de análisis, 50 mmol/1 Na-fosfato/150 mmol/l de NaCI que contiene 0.05% de Tensioactivo P20 (pH 6.0) o 50 mmol/l de Na-fosfato/150 mmol/l de NaCI que contiene 0.05% de Tensioactivo P20 (pH 7.4). Se realizaron los ensayos exclusivamente a 25°C. Las soluciones de FcRn humano diluidas y el amortiguador de análisis como una solución de referencia se inyectaron a un caudal de 5 µ?/min durante diez minutos para dejar que el FcRn humano interactúe con el anticuerpo en la matriz. Después, se inyectó el amortiguador de análisis a un caudal de 5 µ?/min durante un minuto para supervisar la disociación de FcRn. Entonces, se regeneró la matriz de detección durante dos rondas de inyección de 20 mmol/l de Tris-HCI/150 mmol/l de NaCI (pH 8.1) a un caudal de 30 µ?/min durante 15 segundos.
Se analizaron los resultados del ensayo usando el Software de Evaluación Biacore T100 (Ver. 2.0.1). Mediante un método de afinidad de estado estacionario, se calculó la constante de disociación (KD) a partir de los resultados de ensayo en seis diferentes concentraciones de FcRn. Los resultados en las actividades de unión al FcRns humano (constantes de disociación (KD)) de Fv4-lgG1, Fv4-lgG1-v1, y Fv4-lgG1-v2 a pH 6.0 y pH 7.4 se muestran en la Tabla 24 a continuación.
Tabla 24 A pH 7.4, la unión de FcRn humano a Fv4-lgG1 fue demasiado débil para determinar el valor de KD (NA). Mientras tanto, se observaron Fv4-lgG1-v1 y Fv4-lgG1-v2 para unir al FcRn humano a pH 7.4, y se determinaron los valores de KD para ser 36.55 y 11.03 µ?, respectivamente. Se determinaron los valores de KD para FcRn humano a pH 6.0 para ser 1.99, 0.32, y 0.11 µ?. como se muestra en la Fig. 31, cuando son comparados a Fv4-lgG1, Fv4-lgG1-v2 aceleraron la eliminación de hslL-6R en ratones transgénicos con FcRn humano. Así, la eliminación del antígeno se puede predecir para ser acelerado al aumentar la unión al FcRn humano a pH 7.4 por lo menos para ser más fuerte que 11.03 µ? por la alteración de lgG1 humano. Mientras tanto, como se describe en J Immunol. (2002) 169(9): 5171-80, la unión al lgG1 humano aproximadamente diez veces más fuerte al FcRn de ratón que el FcRn humano. Por esta razón, Fv4-lgG1-v1 y Fv4-lgG1-v2 también se predicen para unir aproximadamente diez veces más fuerte al FcRn de ratón que FcR humano a pH 7.4. La aceleración de la eliminación de hslL-6R por Fv4-lgG1-v1 o Fv4-lgG1-v2 en ratones normales mostrada en la Fig. 34 es más significativa que la aceleración de la eliminación por Fv4-lgG1-v2 en ratones transgénicos con FcRn humano mostrada en la Fig. 32. Esto sugiere que el grado de aceleración de la eliminación de hslL-6R es aumentada de acuerdo con la fuerza de la unión la FcRn a pH 7.4.
Ejemplo de Referencia 5 Preparación de los anticuerpos de unión del receptor de IL-6 humano dependiente de pH con unión al FcRn humano mejorado bajo una condición neutral (5-1) Preparación de los mutantes de región constantes de cadena pesada de Fv4-lqG1 Se introdujeron varias alteraciones para aumentar la unión al FcRn humano bajo una condición neutral en Fv4-lgG1 para mejorar además el efecto de eliminación del antígeno del anticuerpo de unión al receptor de IL-6 humano dependiente de pH en ratones transgénicos con FcRn humano. Específicamente, se introdujeron las alteraciones del aminoácido mostradas en las Tablas 25-1 y 25-2 en la región constante de cadena pesada de Fv4-lgG1 para producir varios mutantes (números de aminoácido de los sitios de mutación se presentan de acuerdo con la numeración de EU). Se introdujeron las sustituciones del aminoácido mediante los métodos conocidos por los expertos en la técnica como se describe en el Ejemplo de Referencia 3.
Tabla 25-1 La Tabla 25-2 es la continuación de la Tabla 25-1.
Tabla 25-2 Las variantes cada una que comprende una cadena pesada preparada y un L(WT) (SEC ID NO: 14) se expresaron y se purificaron mediante los métodos conocidos por los expertos en la técnica como se describe en el Ejemplo de Referencia 3. (5-2) Evaluación de unión al FcRn humano La unión entre el anticuerpo y el FcRn humano fue cinéticamente analizada al usar Biacore T100 (GE Healthcare).
Para este propósito, se preparó el FcRn humano como se describe en el Ejemplo de Referencia 2. Se inmovilizó una cantidad apropiada de la proteína L (ACTIGEN) sobre la matriz de detección CM4 (GE Healthcare) mediante el método de combinación de amino, y la matriz se dejó para capturar un anticuerpo de interés. Entonces, se inyectaron las soluciones de FcRn diluido y el amortiguador de análisis (como una solución de referencia) para permitir que el FcRn humano interactúe con el anticuerpo capturado en la matriz de detección. El amortiguador de análisis usado comprendido de 50 mmol/l de fosfato de sodio, 150 mmol/l de NaCI, y 0.05% (p/v) de Tween20 (pH 7.0). Se diluyó el FcRn usando cada amortiguador. Se regeneró la matriz usando 10 mmol/l de glicina-HCI (pH 1.5). Se realizaron los ensayos exclusivamente a 25°C. La constante de velocidad de asociación ka (1/Ms) y la constante de velocidad de disociación kd (1/s), ambas de las cuales son parámetros cinéticos, se calcularon basadas en los sensogramas obtenidos en los ensayos, y se determinó KD (m) de cada anticuerpo para FcRn humano a partir de estos valores. Se calculó cada parámetro al usar el Software de Evaluación Biacore T100 (GE Healthcare).
El resultado de evaluación en la unión al FcRn humano bajo una condición neutral (pH 7.0) mediante Biacore se muestra en las Tablas 6-1 y 6-2. La KD del IgG 1 natural no podría ser calculada debido a que exhibió solamente la unión muy débil. Así, la KD se indica como ND en la Tabla 6-1.
Ejemplo de Referencia 6 Prueba ¡n vivo de los anticuerpos de unión al receptor de IL-6 humano dependiente de pH con unión al FcRn humano mejorada bajo una condición neutral Se produjeron los anticuerpos de unión al receptor de IL-6 humano dependiente de pH que tienen capacidad de unión al FcRn humano bajo una condición neutral usando las cadenas pesadas preparadas como se describe en el Ejemplo de Referencia 4 para tener capacidad de unión al FcRn humano bajo una condición neutral. Se evaluaron los anticuerpos para su efecto de eliminación del antígeno in vivo. Específicamente, se expresaron los anticuerpos enumerados a continuación y se purificaron mediante los métodos conocidos por los expertos en la técnica como se describe en el Ejemplo de Referencia 3: Fv4-¦lgG1 que comprende VH3-lgG1 y VL3-CK; Fv4-•lgG1 -v2 que comprende VH3-lgG1-v2 y VL3-CK; Fv4-¦igGl -F14 que comprende VH3-lgG1 -F14 y VL3-¦CK; Fv4-¦igGi -F20 que comprende VH3-lgG1 -F20 y VL3-¦CK; Fv4-¦igGi -F21 que comprende VH3-lgG1 -F21 y VL3-¦CK; Fv4-¦igGl -F25 que comprende VH3-lgG1 -F25 y VL3- CK; Fv4-¦igGi -F29 que comprende VH3-lgG1 -F29 y VL3-¦CK; Fv4-¦igGi -F35 que comprende VH3-lgG1 -F35 y VL3-¦CK; Fv4-¦igGi -F48 que comprende VH3-lgG1 -F48 y VL3-CK; Fv4-•igGi -F93 que comprende VH3-lgG1 -F93 y VL3- CK; y Fv4-¦igGi -F94 que comprende VH3-lgG1 -F94 y VL3-¦CK.
Mediante los mismos métodos descritos en el Ejemplo de Referencia 3, se probaron los anticuerpos de unión al receptor de IL-6 humano dependiente de pH preparados in vivo al usar ratones transgénicos con FcRn humano (línea 276 de Tg B6.mFcRn-/-.hFcRn +/+ de ratón, Jackson Laboratories; Methods Mol Biol. (2010) 602: 93-104).
Un curso de tiempo de la concentración en plasma del receptor de IL-6 humano soluble después de la administración intravenosa a ratones transgénicos con FcRn humano se muestra en la Fig. 36. El resultado de la prueba mostró que la concentración en plasma del receptor de IL-6 humano soluble sigue siendo baja durante el transcurso del tiempo en presencia de cualquiera de los anticuerpos de unión al receptor de IL-6 humano dependiente de pH con unión al FcRn humano aumentada bajo una condición neutral, con respecto a la presencia de Fv4-I g G 1 el cuál no tiene casi ninguna capacidad de unión al FcRn humano bajo una condición neutral. Entre otros, los anticuerpos que produjeron el efecto notable incluyen, por ejemplo, Fv4-lgG1-F14. Se demostró la concentración en plasma del receptor de IL-6 humano soluble simultáneamente administrada con Fv4-lgG1-F14 para ser reducida por aproximadamente 54 veces un día después de la administración con respecto al receptor de IL-6 humano soluble administrado simultáneamente con Fv4-lgG1. Además, se demostró la concentración en plasma del receptor de IL-6 humano soluble simultáneamente administrada con Fv4-lgG1-F21 para ser reducida por aproximadamente 24 veces siete horas después de la administración con respecto a la del receptor de IL-6 humano soluble administrado simultáneamente con Fv4-lgG1. Además, la concentración en plasma del receptor de IL-6 humano soluble simultáneamente administra con Fv4-lgG1-F25 siete horas después de la administración estaba por debajo del límite de detección (1.56 ng/ml). Así, se esperaba que Fv4-lgG1-F25 permitiera una reducción notable de 200 o más veces en la concentración del receptor de IL-6 humano soluble con respecto a la concentración del receptor de IL-6 humano soluble administrada simultáneamente con Fv4-lgG1. Los resultados descritos antes muestran que el aumento de la unión al FcRn humano de los anticuerpos de unión al antígeno dependiente de pH bajo una condición neutral es altamente efectivo para mejorar el efecto de eliminación del antígeno. Mientras tanto, el tipo de alteración del aminoácido para aumentar la unión al FcRn humano bajo una condición neutral, que se introduce para mejorar el efecto de eliminación del antígeno, no está particularmente limitado; y tales alteraciones incluyen los mostrados en las Tablas 6-1 y 6-2. El efecto de eliminación del antígeno se puede predecir para ser mejorado in vivo por cualquier alteración introducida.
Además, la concentración en plasma del receptor de IL-6 humano soluble simultáneamente administrada con uno de los cuatro tipos de los anticuerpos de unión al receptor de IL-6 humano dependiente de pH, Fv4-lgG1 -F14, Fv4-lgG1 -F21 , Fv4- IgG 1 -F25, y Fv4-lgG1 -F48, siendo más bajos durante el transcurso del tiempo que el receptor de IL-6 humano soluble administró solo. Tal anticuerpo de unión al receptor de IL-6 humano dependiente de pH se puede administrar al cuerpo donde la concentración en plasma del receptor de IL-6 humano soluble se mantiene constante (estado estacionario) para mantener la concentración en plasma del receptor de IL-6 humano soluble menor que la concentración de estado estacionario en plasma. Específicamente, la concentración del antígeno in vivo en plasma puede ser reducida al administrar tal anticuerpo al cuerpo.
Ejemplo de Referencia 7 Evaluación para la eficacia de baja-dosis (0.01 mg/kg) de Fv4-lgG1-F14 Se probó el Fv4-lgG1-F14 preparado como se describe en el Ejemplo de Referencia 6 en una baja dosis (0.01 mg/kg) mediante el mismo método de prueba in vivo como se describe en el Ejemplo de Referencia 6. Se comparó el resultado (mostrado en las Figs. 37 y 38) al descrito en el ejemplo de Referencia 6, que se obtuvo al administrar Fv4-lgG1 y Fv4-lgG1-F14 en 1 mg/kg.
El resultado mostró que aunque la concentración del anticuerpo en plasma en el grupo administrado con Fv4-lgG1-F14 en 0.01 mg/kg fue aproximadamente 100 veces más bajo con respecto al grupo administrado en 1 mg/kg (Fig. 38), los cursos de tiempo de la concentración en plasma del receptor de IL-6 humano soluble fueron comparables entre sí (Fig. 37). Además, se demostró que la concentración en plasma del receptor de IL-6 humano soluble siete horas después de la administración en el grupo administrado con Fv4-lgG1-F14 en 0.01 mg/kg se redujo por aproximadamente tres veces con respecto a aquella en el grupo administrado con Fv4-lgG1 en 1 mg/kg. Además, en presencia de Fv4-lgG1 -F14, la concentración en plasma del receptor de IL-6 humano soluble fue menor durante el transcurso del tiempo en ambos grupos administrados en diferentes dosis cuando se comparó al grupo administrado con el receptor de IL-6 humano soluble solo (Fig. 37).
El hallazgo demuestra que incluso cuando se administró en una dosis de una-centésima del de Fv4-lgG1, Fv4-lgG1-F14 que resulta de la modificación de Fv4-lgG1 para aumentar la unión al FcRn humano bajo una condición neutral efectivamente reduce la concentración en plasma del receptor de IL-6 humano soluble. Específicamente, se predice que los antígenos se pueden eliminar eficientemente incluso en una dosis menor cuando un anticuerpo de unión al antígeno dependiente de pH se modifica para aumentar su capacidad de unión al FcRn bajo una condición neutral.
Ejemplo de Referencia8 Prueba in vivo basada en el modelo de estado estacionario usando ratones normales (8-1) Evaluación de la unión al FcRn de ratón bajo una condición neutral VH3/L (WT)-lgG1 que comprende VH3-lgG1 (SEC ID NO: 19) y L (WT) (SEC ID NO: 14), VH3/L (WT)-lgG1-v2 que comprende VH3-lgG1-v2 (SEC ID NO: 22) y L (WT) (SEC ID NO: 14), y VH3/L (WT)-lgG1-F20 que comprende VH3-lgG1-F20 (SEC ID NO: 23) y L (WT) (SEC ID NO: 14), todos los cuales se prepararon como se describe en el Ejemplo de Referencia 5, se evaluaron para la unión al FcRn de ratón bajo una condición neutral (pH 7.4) mediante el método descrito más adelante.
La unión entre el anticuerpo y el FcRn de ratón fue cinéticamente analizada al usar Biacore T100 (GE Healthcare). Se inmovilizó una cantidad apropiada de la proteína L (ACTIGEN) sobre la Matriz de detección CM4 (GE Healthcare) mediante el método de combinación de amino, y la matriz se le permitió capturar un anticuerpo de interés. Entonces, se inyectaron las soluciones diluidas de FcRn y el amortiguador de análisis (como una solución de referencia) para permitir al FcRn de ratón interactúe con el anticuerpo capturado en la matriz de detección. El amortiguador de análisis usado contiene 50 mmol/l de fosfato de sodio, 150 mmol/l de NaCI, y 0.05% (p/v) de Tween20 (pH 7.4). Se diluyó el FcRn usando cada amortiguador. Se regeneró la matriz al usar 10 mmol/l de glicina-HCI (pH 1.5). Se realizaron los ensayos exclusivamente a 25°C. La constante de velocidad de asociación ka (1/Ms) y constante de velocidad de disociación kd (1/s), que son los parámetros cinéticos, se calcularon basados en los sensogramas obtenidos en los ensayos, y se determinó la KD (M) de cada anticuerpo para el FcRn de ratón de estos valores. Se calculó cada parámetro al usar el Software de Evaluación Biacore T100 (GE Healthcare).
El resultado se muestra en la Tabla 26 (afinidad para el FcRn de ratón a pH 7.4). VH3/L (WT)-lgG1 (lgG1 en la Tabla 26) cuya región constante es del lgG1 natural que exhibe solamente la unión muy débil al FcRn de ratón. Así, la KD no se podrá ser calculada y se indica como ND en la Tabla 26. El resultado de ensayo mostró que los anticuerpos alterados con unión al FcRn humano mejorado bajo la condición neutral también exhibido la unión aumentada al FcRn de ratón bajo la condición neutral.
Tabla 26 (8-2) Prueba in vivo al usar ratones normales con una concentración en plasma constante del receptor de IL-6 humano soluble Al usar H54/L28-lgG 1 , Fv4-lgG1, Fv4-lgG1-v2, y Fv4-lgG1-F20 preparados como se describe en el Ejemplo 3 y el Ejemplo de Referencia 5, se condujo una prueba in vivo mediante el método descrito más adelante.
Se implantó una bomba de infusión (BOMBA M I N I -OSMÓTICA MODELO 2004; alzet) que contiene el receptor de IL-6 humano soluble bajo de piel en la parte posterior de los ratones normales (ratones C57BL/6J; Charles River Japón) para preparar los animales modelo donde la concentración en plasma del receptor de IL-6 humano soluble se mantuvo constante. Se administraron los anticuerpos del receptor de IL-6 anti-humano a los animales modelo para evaluar la cinética in vivo después de la administración del receptor de IL-6 humano soluble. Se administró el anticuerpo CD4 anti-ratón monoclonal (R&D) a 20 mg/kg una vez en la vena caudal para suprimir la producción del anticuerpo neutralizante contra el receptor de IL-6 humano soluble. Entonces, se implantó una bomba de infusión que contiene 92.8 Mg/ml de receptor de IL-6 humano soluble bajo la piel en la parte posterior de los ratones. Tres días después de la implantación de una bomba de infusión, se administraron los anticuerpos del receptor de IL-6 anti-humano a 1 mg/kg una vez en la vena caudal. Se recolectó la sangre 15 minutos, siete horas, un día, dos días, tres días, cuatro días, siete días, 14 días, 21 días, y 28 días después de la administración del anticuerpo del receptor de IL-6 anti-humano. Se centrifugó la sangre recolectada inmediatamente a 15.000 rpm y 4°C durante 15 minutos para separar el plasma. Se almacenó el plasma separado en un refrigerador a o debajo de -20°C antes del ensayo. (8-3) determinar la concentración en plasma de anticuerpos del receptor de IL-6 anti-humano mediante ELISA El método usado fue el mismo como se describe en el Ejemplo de Referencia 3. (8-4) determinar la concentración de hslL-6R en plasma mediante el ensayo de electroquimioluminiscencia El método usado fue el mismo como se describe en el Ejemplo 5.
Como se muestra en la Fig. 39, la concentración en plasma del receptor de IL-6 humano soluble se elevó a 650 ng/ml (15 veces antes de la administración) cuando H54/L28-lgG1 , un anticuerpo neutralizante contra el receptor de IL-6 humano soluble, se administró a ratones normales' (grupo hslL-6R) en los cuales la concentración en plasma del receptor de IL-6 humano soluble se mantuvo constantemente a aproximadamente 40 ng/ml. Por una parte, se mantuvo la concentración en plasma del receptor de IL-6 humano soluble a aproximadamente 70 ng/ml en el grupo administrado con Fv4-lgG1 que resulta de conferir H54/L28-lgG1 con una capacidad de unión al antígeno dependiente de pH. Esto sugiere que el aumento en la concentración en plasma del receptor de IL-6 humano soluble causado por la administración de H54/L28-lgG1 , un anticuerpo neutralizante ordinario, se pueda suprimir a aproximadamente un décimo confiriendo la capacidad de unión dependiente de pH.
Además, la concentración en plasma del receptor de IL-6 humano soluble se demostró para ser mantenida en o debajo de un décimo de la concentración de estado estacionario al administrar Fv-lgG1-v2 o Fv-lgG1-F20, ambas de las cuales resultaron de introducir una alteración en un anticuerpo de unión al receptor de IL-6 humano dependiente de pH para aumentar el la unión al FcRn bajo una condición neutral. Cuando se administró Fv-lgG1-v2, la concentración en plasma del receptor de IL-6 humano soluble 14 días después de la administración fue aproximadamente 2 ng/ml. Así, Fv-lgG1-v2 podrá reducir la concentración a 1/20 del nivel ante la administración. Mientras tanto, cuando se administró Fv-lgG1-F20, las concentraciones en plasma de receptor de IL-6 humano soluble siete horas, un día, dos días, y cuatro días después de la administración estuvieron debajo del límite de detección (1.56 ng/ml). Esto sugiere que Fv-lgG1-F20 redujo la concentración a o debajo de 1/25 del nivel ante de la administración.
Los resultados descritos antes demuestran que la concentración del antígeno en plasma puede ser significativamente reducida al aumentar la velocidad de eliminación del antígeno en plasma, al administrar un anticuerpo que tiene tanto la capacidad de unión al antígeno dependiente de pH y la capacidad de unión al FcRn bajo la condición neutral a de animales modelo en los cuales la concentración del antígeno en plasma se mantiene constante.
Los anticuerpos comunes como H54/L28-lgG1 pueden solamente neutralizar la acción de un antígeno objetivo al unir al antígeno objetivo, e incluso peor aumentan la concentración del antígeno en plasma. Por el contrario, los anticuerpos que tienen tanto la capacidad de unión al antígeno dependiente de pH y la capacidad de unión la FcRn bajo una condición neutral se encontraron para poder no solamente neutralizar el antígeno objetivo sino también reducir la concentración en plasma del antígeno objetivo. El efecto de eliminar el antígeno del plasma se puede esperar para ser más beneficioso que la neutralización. Además, el retiro del antígeno puede también trabajar para los antígenos objetivo que son insuficientemente efectivos por la neutralización sola.
Ejemplo de Referencia 9 Identificación del umbral de la afinidad de unión a FcRn humano a pH neutral requerido para mejorar la eliminación y relación del antígeno entre la eliminación del antígeno y la afinidad de unión a FcRn humano a pH neutral (9-1) Preparación del anticuerpo para el estudio in vivo Se generaron las variantes de Fe de Fv4-lgG1 que comprende VH3-lgG1 (SEC ID NO: 19) y VL3-CK (SEC ID NO: 20) con unión al FcRn aumentado bajo el pH neutral. Específicamente, se prepararon VH3- 73 (SEC ID NO: 24) y VH3-lgG1-v1 (SEC ID NO: 21). Se introdujeron las sustituciones del aminoácido mediante los métodos conocidos por los expertos en la técnica como se describe en el Ejemplo de Referencia 3.
Se expresaron H54/L28-lgG1 que comprende H54 (SEC ID NO: 5) y L28 (SEC ID NO: 6), Fv4-lgG1 que comprende VH3-lgG1 (SEC ID NO: 19) y VL3-CK (SEC ID NO: 20), Fv4-M73 que comprende VH3- 73 (SEC ID NO: 24) y VL3-CK (SEC ID NO: 20), Fv4-lgG1-v1 que comprende VH3-lgG1-v1 (SEC ID NO: 21) y VL3- CK (SEC ID NO: 20), y Fv4-lgG1-v2 que comprende VH3-lgG1-v2 (SEC ID NO: 22) y VL3-CK (SEC ID NIO: 20), y se purificaron mediante el método conocido por los expertos en la técnica descritos en el Ejemplo de Referencia 3. (9-2) Evaluación de la afinidad de unión de anticuerpos al FcRn humano bajo una condición de pH neutral Se evaluaron VH3/L (WT)-lgG1 que comprende VH3-lgG1 (SEC ID NO: 19) y L(WT) (SEC ID NO: 14), VH3/L (WT)-M73 que comprende VH3-M73 (SEC ID NO: 24) y L(WT) (SEC ID NO: 14), VH3/L (WT)-lgG1-v1 que comprende VH3-lgG1-v1 (SEC ID NO: 21) y L(WT) (SEC ID NO: 14), y VH3/L (WT)-lgG 1 -v2 que comprende VH3-lgG1-v2 (SEC ID NO: 22) y L(WT) (SEC ID NO: 14), todos los cuales se prepararon como se describe en el Ejemplo de Referencia 3, para la unión al FcRn humano bajo pH neutral (pH 7.0).
Se medió la actividad de unión de VH3/L (WT)-lgG 1 -v1 y de VH3/L (WT)-lgG 1 -v2 al FcRn humano usando el método descrito en el Ejemplo de Referencia 5. Debido a la baja actividad de unión de VH3/L (WT)-lgG1 y de VH3/L (WT)-M73 al FcRn humano, la actividad de unión al FcRn humano no se podrá medir al usar el método descrito en el Ejemplo 5, por lo tanto, se evaluaron estos anticuerpos mediante el método descrito más adelante. La unión entre el anticuerpo y el FcRn humano fue cinéticamente analizada al usar Biacore T100 (GE Healthcare). Se inmovilizó una cantidad apropiada de la proteína L (ACTIGEN) sobre la Matriz de detección CM4 (GE Healthcare) mediante el método de combinación de amina, y la matriz se permitió para capturar un anticuerpo de interés. Entonces, se inyectaron las soluciones de FcRn diluidas y el amortiguador de análisis como una solución de referencia para permitir para que el FcRn humano interactúe con el anticuerpo capturado en la matriz de detección. El amortiguador de análisis usado comprendió 50 mmol/l de fosfato de sodio, 150 mmol/l de NaCI, y 0.05% (p/v) de Tween20 (pH 7.0). Se diluyó el FcRn al usar cada amortiguador. Se regeneró la matriz al usar 10 mmol/l de glicina-HCI (pH 1.5). Se realizaron los ensayos a 25°C.
Se derivó la KD (M) de cada anticuerpo de los datos del sensograma al usar el Software de Evaluación Biacore T100 (GE Healthcare), el cual simultáneamente ajusta las fases de asociación y la disociación de los sensogramas y globalmente ajusta todas las curvas en el conjunto trabajo. Se ajustaron los sensogramas a 1:1 del modelo de unión, el modelo "de unión al Langmuir", suministrado por el Software de Evaluación Biacore T100. Para algunas de las interacciones de unión, se derivó la KD mediante el análisis de regresión no lineal de las gráficas de Req, la respuesta de unión de equilibrio, contra el registro de la concentración de analito al usar un proceso basado en equilibrio.
El resultado en el unión al FcRn humano bajo la condición neutral (pH 7.0) mediante Biacore se muestra en los las Tablas 27.
Tabla 27 (9-3) Estudios in vivo del efecto de anticuerpos en la eliminación del antígeno en el modelo de coadministración al usar la línea 276 de ratón transgénico del FcRn humano Se realizó el estudio in vivo de los anticuerpos al usar el modelo de coadministración como de describe en el Ejemplo de Referencia 3. Los anticuerpos del receptor de IL-6 anti-humano usados en este estudio son los H54/L28-lgG1 , Fv4-lgG1, Fv4-M73, Fv4-lgG1-v1 y Fv4-lgG1-v2 descritos antes. Los ratones usados en este estudio son ratón transgénico de FcRn humano (línea 276 de Tg B6.mFcRn-/-.hFcRn +/+ de ratón, Jackson Laboratories; Methods Mol Biol. (2010) 602: 93-104).
Como se muestra en la Fig. 40, los farmacinéticos de H54/L28-lgG1 , Fv4-lgG1, Fv4-M73, Fv4-lgG1-v1 y Fv4-lgG1-v2 fueron comparables, y estos anticuerpos mantuvieron la concentración en plasma similar durante el estudio.
El curso de tiempo de la concentración de hslL-6R en plasma se mostró en la Fig. 41. Comparado al hslL-6R administrado con Fv4-lgG1, hslL-6R administrado con Fv4-lgG1-v2 exhibió separación mejorada, mientras que el hslL-6R administrado con Fv4-M73 y Fv4-lgG1-v1 exhibió separación reducida. Aunque toda la variante de Fe, M73, v1, y v2 hayan aumentado la afinidad de unión a FcRn humano en la condición del pH neutral (pH 7.0), se demostró que solamente Fv4-lgG1-v2, pero no Fv4-M73 y Fv4-lgG1-v1, exhibieron separación de hsIL-6R mejorada. Esto indica que para mejorar la separación del antígeno, la afinidad de unión del anticuerpo a FcRn humano a pH 7.0 necesita ser por lo menos más fuerte que lgG1-v1, cuya afinidad de unión a FcRn humano a pH 7.0 es la KD de 3.2 µ? o 28 veces más fuerte que el lgG1 humano intacto (la afinidad de unión a FcRn humano es la KD de 88 µ?).
La Fig. 42 describe la relación entre la afinidad de unión de las variantes de Fe a FcRn humano a pH7.0 y la concentración de hslL-6R en plasma en el día 1 después de la coadministración de hslL-6R y las variantes de Fe. Se graficaron las variantes de Fe descritas en este Ejemplo y el Ejemplo de Referencia 6 (Fv4-IgG 1 , Fv4-M73, Fv4-lgG1-v1, Fv4-lgG1-v2, Fv4-lgG1 -F14, Fv4-lgG1-F20, Fv4-lgG1 -F21 , Fv4-lgG1-F25, Fv4-lgG1 -F29, Fv4-lgG1-F35, Fv4-lgG1-F48, Fv4-lgG 1 -F93, y Fv4-lgG 1 -F94) . Al aumentar la afinidad de unión del anticuerpo a FcRn humano a pH 7.0, la concentración en plasma de hslL-6R, que refleja la separación del antígeno, aumentó al principio, pero por otra parte disminuyó rápidamente. Esto demuestra que para mejorar la separación del antígeno comparada al I g G 1 humano intacto, la afinidad de unión del anticuerpo al FcRn humano a pH 7.0 necesita ser preferiblemente más fuerte de la KD de 2.3 µ? (valor obtenido del ajuste de curvas de la Fig. 42). La afinidad de unión del anticuerpo al FcRn humano entre la KD de 88 µ? y la KD de 2.3 µ? reduciría algo la separación del antígeno (concentración de hsll_-6R más alta). En otras palabras, la afinidad de unión del anticuerpo a FcRn humano a pH 7.0 necesita ser preferiblemente 38 veces más fuerte que el IgG 1 humano natural para mejorar la eliminación del antígeno, o de otra manera reducir la separación del antígeno.
La Fig. 43 describe la relación entre la afinidad de unión de las variantes de Fe a FcRn humano a pH 7.0 y la concentración del anticuerpo en plasma en el día 1 después de la coadministración de hslL-6R y las variantes de Fe. Se graficaron las variantes de Fe descritas en este Ejemplo y el Ejemplo de Referencia 6 (Fv4-lgG1, Fv4-M73, Fv4-lgG1-v1, Fv4-lgG1-v2, Fv4-lgG1-F14, Fv4-lgG1 -F20, Fv4-lgG 1 -F21 , Fv4-lgG1 -F25, Fv4-lgG1-F29, Fv4-lgG 1 -F35, Fv4-lgG1 -F48, Fv4-lgG1 -F93, y Fv4-lgG1-F94). Al aumentar la afinidad de unión del anticuerpo a FcRn humano a pH 7.0, la concentración en plasma del anticuerpo, que refleja los farmacinéticos del anticuerpo (separación), es mantenida al principio, pero por otra parte disminuida rápidamente. Esto demuestra que para mantener los farmacinéticos . del anticuerpo similar al I gG 1 humano natural (afinidad de unión a FcRn humano es la KD de 88 µ?), la afinidad del anticuerpo a FcRn humano a pH 7.0 necesita ser más débil que la KD de 0.2 µ? (valor obtenido del ajuste de curvas de la Fig. 43). La afinidad de unión del anticuerpo a FcRn humano más fuerte que la KD de 0.2 µ? aumentó la separación del anticuerpo (es decir, eliminación más rápida del anticuerpo en plasma). En otras palabras, la afinidad de unión del anticuerpo a FcRn humano a pH 7.0 necesita estar dentro de 440 veces más fuerte que el I gG 1 humano natural para exhibir los farmacinéticos del anticuerpo similares como el lgG1 humano natural, o darán lugar de otra manera a la eliminación rápida del anticuerpo en plasma.
Considerando ambas Figs. 42 y 43, para mejorar la separación del antígeno (es decir, reducir la concentración en plasma del antígeno) comparada a IgG 1 , mientras que mantiene los farmacinéticos del anticuerpo similar al I gG 1 humano natural, la afinidad de unión del anticuerpo a FcRn humano a pH 7.0 necesita estar entre 2.3 µ? y 0.2 µ?, o en otras palabras, la afinidad de unión del anticuerpo a FcRn humano a pH 7.0 necesita estar dentro de un intervalo de 38 veces a 440 veces más fuerte que el I g G 1 humano intacto. Tal anticuerpo con los farmacinéticos similares como el lgC1 con actividad de eliminación del antígeno a largo plazo sería beneficioso para el anticuerpo terapéutico que requiere el intervalo de dosificación más largo como la enfermedad crónica debido a su propiedad de activación prolongada.
Por una parte, al aumentar la afinidad de unión del anticuerpo a FcRn humano a pH 7.0 más fuerte que la KD de 0.2 µ?, o en otras palabras, al aumentar la afinidad de unión del anticuerpo a FcRn humano a pH 7.0 más de 440 veces con respecto al I gG 1 humano natural, deberá mejorar la separación del antígeno en gran parte dentro de un corto plazo, aunque el anticuerpo sea eliminado del plasma más rápido que del I g G 1 humano natural. Tal anticuerpo con capacidad de inducir la reducción rápida y fuerte de la concentración del antígeno sería beneficioso para el anticuerpo terapéutico como la enfermedad aguda en la cual la enfermedad relacionada al antígeno necesita ser eliminada del plasma debido a su propiedad de rápida activación .
La cantidad de antígeno eliminada del plasma por el anticuerpo es el factor importante para evaluar la eficacia de la eliminación del antígeno al administrar las variantes de Fe del anticuerpo que tienen afinidad de unión aumentan a FcRn humano a pH 7.0. Para evaluar la eficacia de la eliminación del antígeno por el anticuerpo, el siguiente cálculo se condujo en cada punto de tiempo del estudio in vivo descrito en este Ejemplo y el Ejemplo de Referencia 6. valor A: Concentración de antígeno molar en cada punto de tiempo valor B: Concentración de anticuerpo molar en cada punto de tiempo valor C: Concentración de antígeno molar por concentración de anticuerpo molar (relación de antígeno/anticuerpo molar) en cada punto de tiempo C = A/B Los cursos de tiempo del valor C (relación de antlgeno/anticuerpo molar) para cada anticuerpo se describen en la Fig. 44. Menor valor C indica mayor eficacia de eliminación del antígeno por el anticuerpo, mientras que mayor valor C indica menor eficacia de eliminación del antígeno por el anticuerpo. Menor valor C con respecto a I g G 1 indica que mayor eficacia de eliminación del antígeno se alcanzó por las variantes de Fe, mientras que mayor valor C con respecto a lgG1 indica que las variantes de Fe tienen efecto negativo en eficacia de eliminación del antígeno. Todas las variantes de Fe excepto Fv4-M73 y Fv4-lgG1-v1 demostrados eficacia de eliminación del antígeno mejorada con respecto a Fv4-lgG1. Fv4-M73 y Fv4-lgG1-v1 demostraron impacto negativo en eficacia de eliminación del antígeno, que fue constante con la Fig. 42.
La Fig. 45 describe la relación entre la afinidad de unión de las variantes de Fe a FcRn humano a pH 7.0 y el valor C (relación antígeno/anticuerpo molar) en el día 1 después de la coadministración de hslL-6R y las variantes de Fe. Se graficaron las variantes de Fe descritas en este Ejemplo y el Ejemplo de Referencia 6 (Fv4-lgG1, Fv4-M73, Fv4-lgG1-v1, Fv4-lgG1-v2, Fv4-lgG1-F14, Fv4-lgG 1 -F20, Fv4-lgG 1 -F21 , Fv4-lgG1 -F25, Fv4-lgG1-F29, Fv4-lgG 1 -F35, Fv4-lgG1 -F48, Fv4-lgG 1 -F93, y Fv4-lgG1-F94). Esto muestra que para alcanzar una alta eficacia de eliminación del antígeno con respecto al lgG1 humano natural, la afinidad del anticuerpo a FcRn humano a pH 7.0 necesita ser más fuerte que la KD de 3.0 µ? (valor de obtenido del ajuste de curva de la Fig. 45). En otras palabras, la afinidad de unión del anticuerpo a FcRn humano a pH 7.0 necesita ser por lo menos 29 veces más fuerte que el I g G 1 humano natural para alcanzar mayor eficacia de eliminación del antígeno con respecto al I g G 1 humano natural.
En conclusión, el grupo de variantes del anticuerpo que tienen afinidad de unión a FcRn a pH 7.0 entre la KD de 3.0 µ? y 0.2 µ?, o en otras palabras, el grupo de variantes del anticuerpo que tienen afinidad de unión a FcRn a pH 7.0 dentro de un intervalo de 29 veces a 440 veces más fuerte que el Ig G 1 humano natural, tiene los farmacinéticos del anticuerpo similares a lgG1 pero tiene capacidad mejorado para eliminar el anticuerpo del plasma. Por lo tanto, tal anticuerpo exhibe la eficacia de eliminación del antígeno mejorada con respecto a lgG1. Los farmacinéticos similares como lgG1 permitirían la eliminación a largo plazo del antígeno del plasma (eliminación del antígeno de acción prolongada), y por lo tanto intervalos dosificación prolongada que serían preferibles para los terapéuticos del anticuerpo para la enfermedad crónica. El grupo de variantes del anticuerpo que tienen afinidad de unión a FcRn a pH 7.0 más fuerte que la KD de 0.2 µ?, o en otras palabras, el grupo de variantes del anticuerpo que tienen afinidad de unión a FcRn a pH 7.0 440 veces más fuerte que el lgG1 humano natural, tiene separación del anticuerpo rápida (eliminación del anticuerpo a corto plazo). Sin embargo, puesto que tal anticuerpo permite la separación aún más rápida del antígeno (eliminación del antígeno de acción rápida), por lo tanto, tal anticuerpo también exhibe eficacia de eliminación del antígeno mejorada con respecto a I g G 1. Como se muestra en el Ejemplo de Referencia 8, Fv4-lgG1-F20 en el ratón normal induciría la eliminación significativa del antígeno del plasma en un muy corto plazo, pero el efecto de eliminación del antígeno no es durable. Tal perfil sería preferible para las enfermedades agudas donde el antígeno relacionado con la enfermedad necesita ser agotado del plasma rápidamente y significativamente en un muy a corto plazo.
Ejemplo de Referencia 10 Estudio in vivo de Fv4-lgG1-F14 mediante el modelo de infusión en estado estable al usar la línea 276 de ratón transgénico de FcRn humano Se realizó el estudio in vivo de Fv4-lgG1-F14 mediante el modelo de infusión en estado estable al usar la línea 276 de ratón transgénico de FcRn humano como se describe más adelante. El grupo de estudio consiste del grupo de control (sin anticuerpo), Fv4-lgG1 en una dosis de 1 mg/kg y Fv4-lgG1-F14 en una dosis de 1 mg/kg, 0.2 mg/kg, y 0.01 mg/kg.
Una bomba de infusión (BOMBA MIN l-OSMÓTICA MODELO 2004; alzet) que contiene el receptor de IL-6 humano soluble se implantó bajo la piel en la parte posterior de los ratones transgénicos de FcRn humano 276 (línea 276 de Tg B6.mFcRn-/-.hFcRn +/+ de ratón (B6.mFcRn-/- hFCRN Tg276 B6.Cg-Fcgrt <tm1Dcr> Tg(FCGRT) 276Dcr (Jackson #4919), Jackson Laboratories; Methods Mol Biol. (2010) 602: 93-104) para preparar los animales modelo donde la concentración en plasma del receptor de IL-6 humano soluble se mantuvo constante. Se administraron los anticuerpos del receptor de IL-6 anti-humano a los animales modelo para evaluar los dinámicos in vivo después de la administración del receptor de IL-6 humano soluble. Se administró el anticuerpo CD4 anti-ratón monoclonal (R&D) a 20 mg/kg antes de la implantación de la bomba de infusión y 14 días después de la administración del anticuerpo en la vena caudal para suprimir la producción del anticuerpo neutralizante contra el receptor de IL-6 humano soluble. Entonces, una bomba de infusión que contiene 92.8 pg/ml del receptor de IL-6 humano soluble se implantó bajo la piel en la parte posterior de los ratones. Tres días después de la implantación de una bomba de infusión, se administraron los anticuerpos del receptor de IL-6 anti-humano (H54/L28-lgG 1 y H54/L28-lgG 1 -F14) a 1 mg/kg una vez en la vena caudal. Se recolectó la sangre 15 minutos, siete horas, un día, dos días, tres días, cuatro días, siete días, 14 días, 21 días, y 28 días después de la administración del anticuerpo del receptor de IL-6 anti-humano. Se centrifugó la sangre recolectada inmediatamente a 15,000 rpm y 4°C durante 15 minutos para separar plasma. Se almacenó el plasma separado en un refrigerador a -20°C o menos antes del ensayo.
Se midió la concentración de hslL-6R en plasma de ratón mediante electroquimioluminiscencia. Se ajustaron las muestras de curva de calibración de hslL-6R a las concentraciones de 2,000, 1,000, 500, 250, 125, 62.5, y 31.25 pg/ml, y se prepararon las muestras del plasma de ratón diluidas 50 veces o más. Se mezclaron las muestras con una solución del Anticuerpo de IL-6R Anti-humano Monoclonal (R&D) etiquetado con rutenio con el éster NHS Etiquetado con Sulfo (Meso Scale Discovery), el Anticuerpo de IL-6R Anti-humano Biotinilado (R&D), y WT-lgG1, y después se dejó reaccionar durante la noche a 37°C. La concentración final de WT-lgG1 como un anticuerpo del receptor de IL-6 anti-humano, comprende tocilizumab (cadena pesada de la SEC ID NO: 13; cadena ligera de la SEC ID NO: 14), fue 333 pg/ml, que está en exceso de la concentración de anticuerpo del receptor de IL-6 anti-humano contenido en las muestras, para el propósito de unir casi todas las moléculas de hslL-6R en las muestras a WT-lgG1. Posteriormente, se dispensaron las muestras en una Placa de Estreptavidina MA400 PR (Meso Scale Discovery), y se dejaron reaccionar durante una hora a temperatura ambiente, y se realizó el lavado. Inmediatamente después se dispensó el amortiguador T de Read (x4) (Meso Scale Discovery), se realizó la medición mediante el lector Sector PR 400 (Meso Scale Discovery). Se calculó la concentración de hsIL-6R basada en la respuesta de la curva de calibración al usar el software analítico SOFTmax PRO (Molecular Devices).
La Fig. 46 describe el perfil de tiempo de la concentración en plasma de hslL-6R después de la administración del anticuerpo. Comparado al nivel de hsll_-6R de línea base sin el anticuerpo, la administración de 1 mg/kg de Fv4-lgG1 dio lugar a varias veces el aumento en la concentración de hslL-6R en plasma. Po otra parte, la administración de 1 mg/kg de Fv4-lgG1-F14 dio lugar en una reducción significativa en la concentración en plasma en comparación con el grupo Fv4-lgG1 y el grupo de línea base. En el día 2, la concentración de hslL-6R en plasma no se detectó (límite de cuantificación de la concentración de hslL-6R en plasma es 1.56 ng/ml en este sistema de medición), y ésta duró hasta el día 14.
H54/L28-lgG1 -F1 exhibió la reducción de la concentración de hslL-6R en plasma con respecto a H54/L28-lgG 1 , pero el grado de reducción fue pequeño. El grado de reducción fue mucho mayor para la región variable Fv4 que tiene la propiedad de unión dependiente de pH a hslL-6R. Esto demuestra que aunque el aumento de afinidad de unión a FcRn humano a pH 7.0 sea eficaz para reducir la concentración del antígeno en plasma, la combinación de unión del antígeno dependiente de pH y la afinidad de unión aumentada a FcRn humano a pH neutral significativamente mejora la eliminación del antígeno.
Estudiar el uso de una dosis menor de Fv4-lgG1-F14 exhibió que incluso en 0.01 mg/kg, 1/100 de 1 mg/kg, redujo la concentración en plasma del antígeno debajo de la línea base que demuestra la eficacia significante de la molécula para agotar el antígeno del plasma.
Ejemplo de Referencia 11 Comparación del linaje 276 de ratón transgénico de FcRn humano y el linaje 32 en el modelo de coadministración Anteriores estudios in vivo se han conducido al usar la línea 276 de ratón transgénico de FcRn humano (Jackson Laboratories). Para comparar la diferencia entre el linaje 276 de ratón transgénico de FcRn humano y una diferente línea transgénica, el linaje 32, condujimos el estudio de coadministración de H54/L28-lgG1 , Fv4-lgG1, y Fv4-lgG1-v2 al usar el linaje 32 de ratón transgénico de FcRn humano (linaje 32 de Tg B6.mFcRn-/-.hFcRn +/+ de ratón (B6.mFcRn-/- hFCRN Tg32; B6.Cg-Fcgrt<tm1 Dcr> Tg(FCGRT)32Dcr) (Jackson #4915)), Jackson Laboratories; Methods Mol Biol. (2010) 602: 93-104). El método de estudio fue el miso como el del Ejemplo de Referencia 3 pero el linaje 32 de ratón transgénico de FcRn humano se usó en vez del linaje 276 de ratón transgénico de FcRn humano.
La Fig. 47 describe el curso de tiempo de la concentración de hslL-6R en plasma en el linaje 276 y el linaje 3 de ratón transgénico de FcRn humano 2. H54/L28-lgG 1 , Fv4-lgG1, y Fv4-lgG1-v2 exhibieron similar perfil de tiempo de concentración de hslL-6R en plasma. En ambos ratones, la afinidad de unión aumentada a FcRn humano a pH 7.0 mejoró la eliminación del antígeno en plasma (comparación de Fv4-lgG1 y Fv4-lgG1-v2) a un mismo grado.
La Fig. 48 describe el curso de tiempo de la concentración del anticuerpo en plasma en el linaje 276 y el linaje 32 de ratón transgénico de FcRn humano. H54/L28-lgG1 , Fv4-lgG1, y Fv4-lgG1-v2 exhibieron similar perfil de tiempo de concentración del anticuerpo en plasma.
En conclusión, no se observó ninguna diferencia significante entre el linaje 276 y el linaje 32, que demuestra que la variante de Fe para aumentar la afinidad de unión a FcRn humano a pH 7.0 fue efectiva en dos diferentes líneas de ratón transgénico que expresan el FcRn humano para mejorar la eliminación de la concentración en plasma del antígeno.
Ejemplo de Referencia 12 Generación de varias variantes de Fe del anticuerpo que aumentan la afinidad de unión a FcRn humano a pH neutral (12-1 ) Generación de las variantes de Fe Se introdujeron varias mutaciones para aumentar la afinidad de unión a FcRn humano bajo el pH neutral en Fv4-lgG1 para además mejorar el perfil de la eliminación del antígeno. Específicamente, las mutaciones del aminoácido mostradas en la Tabla 15, se introdujeron en la región constante de cadena pesada de Fv4-lgG1 para generar las variantes de Fe (los números del aminoácido de los sitios de mutación se describen de acuerdo con la numeración de EU). Se introdujeron las sustituciones del aminoácido mediante el método conocido por los expertos en la técnica descritos en el Ejemplo de Referencia 3.
Las variantes adicionales (lgG1-F100 a lgG1-F1052) cada uno que comprende una cadena pesada preparada y L (WT) (SEC ID NO: 14) se expresaron y se purificaron mediante los métodos conocidos por los expertos en la técnica como se describe en el Ejemplo de Referencia 3. (12-2) Evaluación de la unión al FcRn humano La unión entre el anticuerpo y el FcRn humano cinéticamente se analizaron como se describe en el Ejemplo de Referencia 5 para lgG1-v1, lgG1-v2 e lgG1-F2 a lgG1-F1052 o el Ejemplo de Referencia 9 para I g G 1 y M73. El resultado en la unión al FcRn humano bajo una condición neutral (pH 7.0) por Biacore se muestra en las Tablas 28-1 a 28-21.
Tabla 28-1 Tabla 28-2 es la continuación de la Tabla 28-1.
Tabla 28-2 Tabla 28-3 es la continuación de la Tabla 28-2.
Tabla 28-3 Tabla 28-4 es la continuación de la Tabla 28-3.
Tabla 28-4 Tabla 28-5 es la continuación de la Tabla 28-4.
Tabla 28-5 Tabla 28-6 es la continuación de la Tabla 28-5.
Tabla 28-6 Tabla 28-7 es la continuación de la Tabla 28-6.
Tabla 28-7 Tabla 28-8 es la continuación de la Tabla 28-7.
Tabla 28-8 Tabla 28-9 es la continuación de la Tabla 28-8.
Tabla 28-9 La Tabla 28-10 es la continuación de la Tabla 28-9.
Tabla 28-10 corrección La Tabla 28-11 es la continuación de la Tabla 28-10.
Tabla 28-11 La Tabla 28-12 es la continuación de la Tabla 28-11.
Tabla 28-12 La Tabla 28-13 es la continuación de la Tabla 28-12.
Tabla 28-13 La Tabla 28-14 es la continuación de la Tabla 28-13.
Tabla 28-14 La Tabla 28-15 es la continuación de la Tabla 28-14.
Tabla 28-15 La Tabla 28-16 es la continuación de la Tabla 28-15.
Tabla 28-16 La Tabla 28-17 es la continuación de la Tabla 28-16.
Tabla 28-17 La Tabla 28-18 es la continuación de la Tabla 28-17.
Tabla 28-18 La Tabla 28-19 es la continuación de la Tabla 28-18.
Tabla 28-19 La Tabla 28-20 es la continuación de la Tabla 28-19.
Tabla 28-20 La Tabla 28-21 es la continuación de la Tabla 28-20.
Tabla 28-21 Ejemplo de Referencia 13 estudio in vivo de varios anticuerpos de variante de Fe mediante el modelo de infusión en estado estable al usar el linaje 32 de ratón transgénico de FcRn humano Las variantes de Fe generadas en el Ejemplo de Referencia 12 se probaron para su capacidad para eliminar el antlgeno del plasma en el modelo de infusión en estado estable al usar el linaje 32 de ratón transgénico de FcRn humano. Se realizó el estudio in vivo del modelo de infusión en estado estable como se describe en el Ejemplo 1, pero se usó el linaje 32 de ratón transgénico de FcRn humano en vez del linaje 276, y se administró el anticuerpo CD4 anti-ratón monoclonal dos veces (antes de que se implante la bomba de infusión y 14 días después de la administración del anticuerpo) o tres veces (antes de que se implanté la bomba de infusión y 10 y 20 días después de la administración del anticuerpo).
A partir de las variantes de Fe descritas en las Tablas 28-1 a 28-21, seleccionadas de las variantes de Fe del anticuerpo enumeradas más adelante se expresaron y se purificaron mediante los métodos conocidos por los expertos en la técnica como se describe en el Ejemplo de Referencia 3: Fv4-lgG1 que comprende VH3-lgG1 y VL3-CK; Fv4-lgG1-F11 que comprende VH3-lgG1-F11 y VL3-CK; Fv4-lgG1-F14 que comprende VH3-lgG1-F14 y VL3-CK; Fv4-lgG1-F39 que comprende VH3-lgG1-F39 y VL3-CK; Fv4- lgG1 -F48 que comprende VH3-lgG1-l =48 y VL3-CK; Fv4- lgG1 -F140 que comprende VH3-lgG1 -F140 y VL3- CK; Fv4- igGi -F157 que comprende VH3-lgG1 -F157 y VL3- CK; Fv4- igGl -F194 que comprende VH3-lgG1 -F194 y VL3- CK; Fv4- igGl -F196 que comprende VH3-lgG1 -F196 y VL3- CK; Fv4- igd -F198 que comprende VH3-lgG1 -F198 y VL3- CK; Fv4- igGl -F262 que comprende VH3-lgG1 -F262 y VL3- CK; Fv4- igGi -F264 que comprende VH3-lgG1 -F264 y VL3- CK; Fv4- igG -F393 que comprende VH3÷lgG1 -F393 y VL3- CK; Fv4- igGi -F424 que comprende VH3-lgG1 -F434 y VL3- CK; y Fv4- igGi -F447 que comprende VH3-lgG1 -F447 y VL3- CK.
Se administraron estos anticuerpos al linaje 32 de ratón transgénico de FcRn humano en una dosis de 1 mg/kg.
La Fig. 49 describe el curso de tiempo de la concentración de hslL-6R en plasma en el ratón. Comparado a Fv4-lgG1, todas las variantes de Fe que tienen afinidad de unión aumentada a FcRn humano a pH 7.0 exhibieron la reducción de la concentración de hslL-6R en plasma, por lo tanto la eliminación del antígeno mejorada del plasma. Aunque el grado y la durabilidad de la reducción de concentración del antígeno fueron diferentes entre las variantes de Fe, toda la variante constantemente redujo la concentración de hslL-6R en plasma con respecto a lgG1 que demuestra que la afinidad de unión aumentada a FcRn humano a pH 7.0 mejoraría universalmente la eliminación del antígeno del plasma. La Fig. 50 describe el curso de tiempo de la concentración del anticuerpo en plasma en el ratón. Los farmacinéticos del anticuerpo fueron diferentes entre las variantes de Fe.
Como se describe en el Ejemplo de Referencia 9, la cantidad de antígeno eliminada del plasma por el anticuerpo es el factor importante para evaluar la eficacia de la eliminación del antígeno al administrar las variantes de Fe del anticuerpo que aumentan la afinidad de unión a FcRn humano a pH 7.0. Por lo tanto, los cursos del tiempo del valor C (relación molar antígeno/anticuerpo) para cada anticuerpo se describen en la Fig. 51. La Fig. 52 describe la relación entre la afinidad de unión de las variantes de Fe a FcRn humano a pH 7.0 y el valor C (relación molar de antígeno/anticuerpo) en el día 1 después de la administración de los anticuerpos. Esto demuestra que todas las variantes de Fe del anticuerpo probadas en este estudio tienen menor valor C con respecto a Fv4-lgG1. Puesto que todas las variantes de Fe probadas en este estudio tienen afinidad de unión a FcRn humano a pH 7.0 más fuerte que la KD de 3.0 µ?, alcanzaron una mayor eficacia de eliminación del antígeno con respecto al lgG1 humano natural. Esto fue constante con los resultados obtenidos en el Ejemplo de Referencia 9 (Fig.42).
La Fig. 53 describe que entre las variantes de Fe probadas en este estudio, los anticuerpos que tienen la variante de Fe de F11, F39, F48, y F264 exhibió farmacinéticos similares a IgG 1. Puesto que este estudio se conduce al usar el ratón transgénico de FcRn humano, se espera que estas variantes de Fe tengan vida promedio largo similar a I g G 1 también en el humano. La Figura 54 describe el curso de tiempo de la concentración de hslL-6R en plasma en los ratones administrados con los anticuerpos que tienen farmacinéticos similares al I g G 1 humano natural (F11, F39, F48, y F264). Estas variantes redujeron la concentración de hslL-6R en plasma con respecto a I g G 1 aproximadamente diez veces. Por otra parte, estos anticuerpos redujeron la concentración de hslL-6R debajo de la concentración de hslL-6R de línea base (concentración sin el anticuerpo). Por lo tanto, estos anticuerpos permitirían la eliminación a largo plazo del antígeno en plasma, y por lo tanto los intervalos de dosificación largos que serían preferibles para los terapéuticos de anticuerpo para la enfermedad crónica.
La Fig. 55 y 56 describe el curso de tiempo de la concentración del anticuerpo en plasma y la concentración de hsll_-6R en plasma para I g G 1 , y la variante de Fe F157, F196 y F262, respectivamente. Sorpresivamente, aunque los farmacinéticos del anticuerpo de F157 y de F262 mostraron una separación significativamente más rápida del plasma con respecto al lgG1 humano natural, F157 y F262 exhibieron eliminación significativa de hslL-6R del plasma. Específicamente, la concentración de hslL-6R en plasma de F157 fue un bajo límite de detección (1.56 ng/ml), a partir de los días 1 a 28 (excepto en el día 14), y la de F262 fue un bajo límite de detección (1.56 ng/ml) a partir de los días 14 a 28. Por una parte, para F196 con una separación más lenta del anticuerpo comparada a F157, la concentración del antígeno inició para aumentar en el día 14 y regresó a la línea base en el día 28. Entre las variantes de Fe probadas en este estudio, F157 y F262 fueron las únicas variantes de Fe que fueron capaces de reducir la concentración de hslL-6R en plasma debajo de 1.56 ng/ml en el día 28.
Tal efecto de largo plazo durable de F157 y de F262 fue inesperado de los farmacinéticos del anticuerpo, puesto que los anticuerpos se eliminaron del plasma muy rápido con respecto al I g G 1 humano natural. En particular, la concentración del anticuerpo en plasma de F157 no fue detectada en el día 21. Sin embargo, la concentración de hslL-6R en plasma continuó siendo reducida a un nivel más bajo que el límite de detección de 1.56 ng/ml en los días 21 y 28. La presente invención no está limitada a una teoría particular, pero este efecto inesperado se considera ser debido a la presencia del anticuerpo en la superficie de la célula del endotelio vascular como la forma unida a FcRn. Aunque estos anticuerpos mostraron baja concentración en plasma, estos anticuerpos están aún presentes en el compartimiento vascular como la forma unida a FcRn (la cual no se puede medir como una concentración del anticuerpo en plasma). Este anticuerpo unido a FcRn puede aún unir al antígeno en el plasma, y después de la absorción mediada por FcRn del complejo de antígeno/anticuerpo, el antígeno es liberado dentro del endosoma y es degradado por el lisosoma, mientras que el anticuerpo es reciclado de nuevo a la superficie celular como forma unida a FcRn. Así este el anticuerpo unido a FcRn contribuye a la eliminación del antígeno. Esto explica la razón por la que estos anticuerpos mantienen la capacidad de eliminación del antígeno incluso después la concentración del anticuerpo que llega a ser baja en plasma.
Aplicabilidad Industrial La presente invención proporciona los métodos para promover la absorción del antígeno en las células al usar las moléculas de unión al antígeno, los métodos para aumentar el número de veces de la unión al antígeno mediante una molécula de unión al antígeno, los métodos para promover la reducción de la concentración del antígeno en plasma al administrar las moléculas de unión al antígeno, y los métodos para mejorar la retención de plasma de las moléculas de unión al antígeno. Mediante la promoción de la absorción del antígeno en las células mediante una molécula de unión al antígeno, llegará a ser posible no solamente promover la reducción del antígeno en plasma mediante la administración de la molécula de unión al antígeno, sino también mejora la retención de plasma de la molécula de unión al antígeno y aumenta el número de veces de la unión al antígeno en cada una de la molécula de unión al antígeno. Tales moléculas de unión al antígeno pueden exhibir efectos más beneficiosos in vivo que las moléculas de unión al antígeno comunes.

Claims (74)

REIVINDICACIONES
1. Una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión al antígeno y un dominio de unión al FcRn humano, cuya actividad de unión al antígeno es diferente bajo dos diferentes condiciones de concentración de calcio y es menor bajo una baja condición de concentración de calcio que bajo una alta condición de concentración de calcio, y que tiene actividad de unión a FcRn humano bajo una condición del pH neutral.
2. La molécula de unión al antígeno de la reivindicación 1, donde la baja concentración de calcio es una concentración de calcio ionizado de 0.1 30 µ?.
3. La molécula de unión al antígeno de la reivindicación 1, donde la alta concentración de calcio es una concentración de calcio ionizado de 100 µ? a 10 mM.
4. La molécula de unión al antígeno de la reivindicación 1 o 2, donde la baja concentración de calcio es una concentración intraendosomal de calcio ionizado.
5. La molécula de unión al antígeno de la reivindicación 1 o 3, donde la alta concentración de calcio es una concentración en plasma de calcio ionizado.
6. La molécula de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el dominio de unión al FcRn es una región de Fe.
7. La molécula de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, además donde la actividad de unión al antígeno es menor bajo una condición del pH ácido que bajo una condición del pH neutral.
8. La molécula de unión al antígeno de la reivindicación 7, donde por lo menos un aminoácido es sustituido con histidina, o por lo menos una histidina es insertada en la molécula de unión al antígeno.
9. La molécula de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que une a un antígeno de membrana o al antígeno soluble.
10. La molécula de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde el antígeno es un antígeno seleccionado del grupo que consiste de IL-6R, IL-6, IgA, glipicano 3 humano, e IgE.
11. Una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión al antígeno y un dominio de unión al FcRn humano, cuya actividad de unión al antígeno es diferente entre dos diferentes condiciones de concentración de calcio y es menor bajo una baja condición de concentración de calcio que bajo una alta condición de concentración de calcio, y donde una cadena ligera o una cadena pesada del dominio de unión al antígeno comprende un motivo de unión al calcio derivado de un anticuerpo humano.
12. La molécula de unión al antígeno de la reivindicación 11, donde el motivo de unión al calcio se comprende en la cadena ligera CDR1, CDR2, y/o CDR3 del dominio de unión al antígeno.
13. La molécula de unión al antígeno de la reivindicación 12, donde el motivo de unión al calcio se comprende en las posiciones 30, 31, y/o 32 de acuerdo con la numeración de Kabat en la cadena ligera CDR1.
14. La molécula de unión al antígeno de la reivindicación 12 o 13, donde el motivo de unión al calcio se comprende en la posición 50 de acuerdo con la numeración de Kabat en la cadena ligera CDR2.
15. La molécula de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, donde el motivo de unión al calcio se comprende en la posición 92 de acuerdo con la numeración de Kabat en la cadena ligera CDR3.
16. La molécula de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, que es ya sea IgA o glipicano 3 humano.
17. La molécula de unión al antígeno de la reivindicación 11, donde el motivo de unión al calcio se comprende en la cadena pesada CDR1, CDR2, y/o CDR3 del dominio de unión al antígeno.
18. La molécula de unión al antígeno de la reivindicación 16, donde el motivo de unión al calcio se comprende en las posiciones 95, 96, 100a, y/o 101 de acuerdo con la numeración de Kabat en la cadena pesada CDR3.
19. La molécula de unión al antígeno de la reivindicación 17 o 18, que es IL-6R o IL-6.
20. La molécula de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 19, que comprende un dominio de unión al FcRn que tiene actividad de unión al FcRn en del intervalo del pH neutral.
21. La molécula de unión al antígeno de la reivindicación 20, donde el dominio de unión al FcRn es una región de Fe.
22. La molécula de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, 20, o 21, donde uno o más aminoácidos en las posiciones 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 286, 289, 297, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434, y 436 (numeración de EU) en la secuencia de aminoácido de la región de Fe son diferentes de los de la región natural de Fe.
23. La molécula de unión al antígeno de la reivindicación 22, la cual comprende cualquiera o combinación de: Met en la posición del aminoácido 237; lie en la posición del aminoácido 248; Ala, Phe, lie, Met, Gln, Ser, Val, Trp, o Tyr en la posición del aminoácido 250; Phe, Trp, o Tyr en la posición del aminoácido 252; Thr en la posición del aminoácido 254; Glu en la posición del aminoácido 255; Asp, Glu, o Gln en la posición del aminoácido 256; Ala, Gly, Me, Leu, Met, Asn, Ser, Thr, o Val en la posición del aminoácido 257; His en la posición del aminoácido 258; Ala en la posición del aminoácido 265; Ala o Glu en la posición del aminoácido 286; His en la posición del aminoácido 289; Ala en la posición del aminoácido 297; Ala en la posición del aminoácido 303; Ala en la posición del aminoácido 305; Ala, Asp, Phe, Gly, His, Me, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, GIn, Arg, Ser, Val, Trp, o Tyr en la posición del aminoácido 307; Ala, Phe, lie, Leu, Met, Pro, GIn, o Thr en la posición del aminoácido 308; Ala, Asp, Glu, Pro, o Arg en la posición del aminoácido 309; Ala, His, o He en la posición del aminoácido 311; Ala o His en la posición del aminoácido 312; Lys o Arg en la posición del aminoácido 314; Ala, Asp, o His en la posición del aminoácido 315; Ala en la posición del aminoácido 317; Val en la posición del aminoácido 332; Leu en la posición del aminoácido 334; His en la posición del aminoácido 360; Ala en la posición del aminoácido 376; Ala en la posición del aminoácido 380; Ala en la posición del aminoácido 382; Ala en la posición del aminoácido 384; Asp o His en la posición del aminoácido 385; Pro en la posición del aminoácido 386; Glu en la posición del aminoácido 387; Ala o Ser en la posición del aminoácido 389; Ala en la posición del aminoácido 424; Ala, Asp, Phe, Gly, His, Me, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp, o Tyr en la posición del aminoácido 428; Lys en la posición del aminoácido 433; Ala, Phe, His, Ser, Trp, o Tyr en la posición del aminoácido 434; o His, lie, Leu, o Val en la posición del aminoácido 436; de acuerdo con la numeración de EU en la región de Fe.
24. La molécula de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, donde la molécula de unión al antígeno es un anticuerpo.
25. Un método para producir una molécula de unión al antígeno que tiene por lo menos una función seleccionada de: (i) función de promover la absorción de un antígeno en las células, (ii) función de unir a un antígeno dos o más veces, (iii) función de promover la reducción de la concentración del antígeno en plasma, y (iv) función de la excelencia en la retención de plasma, donde el método comprende las etapas (a) a (e) a continuación: (a) determinar la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio; (b) determinar la actividad molécula de unión al antígeno de la molécula de unión al antígeno bajo una alta condición de concentración de calcio; (c) seleccionar una molécula de unión al antígeno que tiene una menor actividad de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio que bajo la alta condición de concentración de calcio; (d) obtener un gen que codifica la molécula de unión al antígeno seleccionado en la etapa (c); y (e) producir la molécula de unión al antígeno al usar el gen obtenido en la etapa (d).
26. Un método para producir una molécula de unión al antígeno que tiene por lo menos una función seleccionada de: (i) función de promover la absorción de un antígeno en las células, (ii) función de unir a un antígeno dos o más veces, (iii) función de promover la reducción de la concentración del antígeno en plasma, y (v) función de la excelencia en la retención de plasma, donde el método comprende las etapas (a) a (e) a continuación: (a) poner en contacto un antígeno con una molécula de unión al antígeno o una biblioteca de moléculas de unión al antígeno bajo una alta condición de concentración de calcio; (b) colocar una molécula de unión al antígeno que une al antígeno en la etapa (a) bajo una baja condición de concentración de calcio; (c) obtener una molécula de unión al antígeno que disocia en la etapa (b); (d) obtener un gen que codifica la molécula de unión al antígeno obtenida en la etapa (c); y (e) producir la molécula de unión al antígeno al usar el gen obtenido en la etapa (d).
27. Un método para producir una molécula de unión al antígeno que tiene por lo menos una función seleccionada de: (i) función de promover la absorción de un antígeno en las células, (ii) función de unir a un antígeno dos o más veces, (iii) función de promover la reducción de la concentración del antígeno en plasma, y (iv) función de la excelencia en la retención de plasma, donde el método comprende las etapas (a) a (f) a continuación: (a) poner en contacto un antígeno con una molécula de unión al antígeno o una biblioteca de moléculas de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio; (b) seleccionar una molécula de unión al antígeno que no une al antígeno en la etapa (a); (c) permitir que la molécula de unión al antígeno seleccionada en la etapa (b) se una al antígeno bajo una alta condición de concentración de calcio; (d) obtener una molécula de unión al antígeno que una al antígeno en la etapa (c); (e) obtener un gen que codifica la molécula de unión al antígeno obtenida en la etapa (d); y (f) producir la molécula de unión al antígeno al usar el gen obtenido en la etapa (e).
28. El método de producción de cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, que adicionalmente comprende la etapa de conferir o de aumentar la actividad de unión al FcRn humano bajo una condición del pH neutral al modificar un aminoácido en la molécula de unión al antígeno.
29. El método de producción de cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, que adicionalmente comprende la etapa de reducir la actividad de unión al antígeno bajo una condición del pH ácido para ser menor que la de bajo una condición del pH neutral al modificar un aminoácido en la molécula de unión al antígeno.
30. El método de producción de cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, donde la baja concentración de calcio es una concentración de calcio ionizado de 0.1 a 30 µ?.
31. El método de producción de cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, donde la alta concentración de calcio es una concentración de calcio ionizado de 100 µ? a 10 mM.
32. El método de producción de cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, donde la baja concentración de calcio es una concentración intraendosomal de calcio ionizado.
33. El método de producción de cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, donde la alta concentración de calcio es una concentración en plasma de calcio ionizado.
34. El método de producción de la reivindicación 29, donde la modificación del aminoácido en la molécula de unión al antígeno es la modificación al sustituir por lo menos un aminoácido con histidina, o al insertar por lo menos de una histidina en la molécula de unión al antígeno.
35. El método de producción de cualquiera de las reivindicaciones 25 a 34, donde un antígeno unido por la molécula de unión al antígeno es un antígeno seleccionado del grupo que consiste de IL-6R, IL-6, IgA, glipicano 3 humano, e IgE.
36. El método de producción de cualquiera de las reivindicaciones 25 a 35, donde la molécula de unión al antígeno es un anticuerpo.
37. Una composición farmacéutica que comprende: la molécula de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, o una molécula de unión al antígeno producida mediante el método de producción de cualquiera de las reivindicaciones 25 a 36, y un portador farmacéuticamente aceptable.
38. La composición farmacéutica de la reivindicación 37, para el uso en promover la internalización del antígeno en las células.
39. La composición farmacéutica de la reivindicación 37, para el uso en promover la reducción de la concentración del antígeno en plasma.
40. Una composición farmacéutica para el uso en promover la absorción del antígeno en las células o la reducción de la concentración del antígeno en plasma, que comprende una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión al antígeno y un dominio de unión al FcRn humano, cuya actividad de unión al antígeno es diferente entre las dos diferentes concentraciones de calcio y es menor bajo una baja condición de concentración de calcio que bajo una alta condición de concentración de calcio.
41. La composición farmacéutica de la reivindicación 40, donde la baja concentración de calcio es una concentración de calcio ionizado de 0.1 a 30 µ?.
42. La composición farmacéutica de la reivindicación 40, donde la alta concentración de calcio es una concentración de calcio ionizado 100 µ? a 10 mM.
43. La composición farmacéutica de la reivindicación 40 o 41, donde la baja concentración de calcio es una concentración intraendosomal de calcio ionizado.
44. La composición farmacéutica de la reivindicación 40 o 42, donde la alta concentración de calcio es una concentración en plasma de calcio ionizado.
45. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 40 a 44, donde el dominio de unión al FcRn comprendido en la molécula de unión al antígeno es una región de Fe.
46. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 40 a 45, donde la actividad molécula de unión al antígeno de la molécula de unión al antígeno es menor bajo una condición del pH ácido que bajo una condición del pH neutral.
47. La composición farmacéutica de la reivindicación 46, donde la modificación del aminoácido en la molécula de unión al antígeno es la modificación al sustituir por lo menos un aminoácido con histidina, o al insertar por lo menos una histidina en la molécula de unión al antígeno.
48. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 40 a 47, donde el antígeno al cual la molécula de unión al antígeno se une es un antígeno seleccionado del grupo que consiste de IL-6R, IL-6, IgA, glipicano 3 humano, e IgE.
49. Un método de evaluación para una molécula de unión al antígeno que tiene por lo menos una función seleccionada de: (i) función de promover la absorción de un antígeno en las células, (¡i) función de unir a un antígeno dos o más veces, (iii) función de promover la reducción de la concentración del antígeno en plasma, y (iv) función de la excelencia en la retención de plasma, donde el método comprende las etapas (a) a (c) a continuación: (a) determinar la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio; (b) determinar la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno bajo una alta condición de concentración de calcio; y (c) seleccionar una molécula de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno es menor bajo una baja condición de concentración de calcio que bajo una alta condición de concentración de calcio.
50. Un método de evaluación para una molécula de unión al antígeno que comprende por lo menos una función seleccionada de: (i) función de promover la absorción de un antígeno en las células, (ii) función de unir a un antígeno dos o más veces, (iii) función de promover la reducción de la concentración del antígeno en plasma, y (iv) función de la excelencia en la retención de plasma, donde el método comprende las etapas (a) a (c) a continuación: (a) poner en contacto un antígeno con una molécula de unión al antígeno o una biblioteca de moléculas de unión al antígeno bajo una alta condición de concentración de calcio; (b) colocar una molécula de unión al antígeno que une al antígeno en la etapa (a) bajo una baja condición de concentración de calcio; y (c) obtener una molécula de unión al antígeno que disocia en la etapa (b).
51. Un método de evaluación para una molécula de unión al antígeno que comprende por lo menos una función seleccionada de: (i) función de promover la absorción de un antígeno en las células, (ii) función de unir a un antígeno dós o más veces, (iii) función de promover la reducción de la concentración del antígeno en plasma, y (iv) función de la excelencia en la retención de plasma, donde el método comprende las etapas (a) a (d) a continuación: (a) poner en contacto un antígeno con una molécula de unión al antígeno o una biblioteca de moléculas de unión al antígeno bajo una baja condición de concentración de calcio; (b) seleccionar una molécula de unión al antígeno que no une al antígeno en la etapa (a); (c) permitir que la molécula de unión al antígeno seleccionada en la etapa (b) una al antígeno bajo una alta condición de concentración de calcio; y (d) obtener una molécula de unión al antígeno unida al antígeno en la etapa (c).
52. El método de evaluación cualquiera de las reivindicaciones 49 a 51, donde la baja concentración de calcio es una concentración de calcio ionizado de 0.1 a 30 µ?.
53. El método de evaluación de cualquiera de las reivindicaciones 49 a 51, donde la alta concentración de calcio es una concentración de calcio ionizado de 100 µ? a 10 mM.
54. El método de evaluación cualquiera de las reivindicaciones 49 a 52, donde la baja concentración de calcio es una concentración intraendosomal de calcio ionizado.
55. El método de evaluación cualquiera de las reivindicaciones 49 a 51, o 53, donde la alta concentración de calcio es una concentración en plasma de calcio ionizado.
56. El método de evaluación cualquiera de las reivindicaciones 49 a 55, donde el antígeno al cual la molécula de unión al antígeno une es un antígeno seleccionado del grupo que consiste de IL-6R, IL-6, IgA, glipicano 3 humano, e IgE.
57. El método de evaluación cualquiera de las reivindicaciones 49 a 56, donde la molécula de unión al antígeno es un anticuerpo.
58. Un método para promover la absorción del antígeno en una célula por una molécula de unión al antígeno al administrar la molécula de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 o una molécula de unión al antígeno produjo mediante el método de producción de cualquiera de las reivindicaciones 25 a 36.
59. Un método para promover la reducción de la concentración del antígeno en plasma al administrar la molécula de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 o una molécula de unión al antígeno producida mediante el método de producción de cualquiera de las reivindicaciones 25 a 36.
60. Un método para aumentar el número de veces de la unión al antígeno en una molécula de unión al antígeno al usar la molécula de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 o una molécula de unión al antígeno producida mediante el método de producción de cualquiera de las reivindicaciones 25 a 36.
61. Un método para mejorar la retención de plasma de una molécula de unión al antígeno al usar la molécula de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 o una molécula de unión al antígeno producida mediante el método de producción de cualquiera de las reivindicaciones 25 a 36.
62. Un método para promover la absorción del antígeno en una célula mediante una molécula de unión al antígeno al administrar una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión al antígeno y un dominio de unión al FcRn humano, cuya actividad de unión al antígeno es diferente entre dos diferentes concentraciones de calcio y es menor bajo una baja condición de concentración de calcio que bajo una alta condición de concentración de calcio.
63. Un método para promover la reducción de la concentración del antígeno en plasma al administrar una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión al antígeno y un dominio de unión al FcRn humano, cuya actividad de unión al antígeno es diferente entre dos diferentes concentraciones de calcio y es menor bajo una baja condición de concentración de calcio que bajo una alta condición de concentración de calcio.
64. Un método para aumentar el número de veces de la unión al antígeno en una molécula de unión al antígeno al usar una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión al antígeno y un dominio de unión al FcRn humano, cuya actividad de unión al antígeno es diferente entre dos diferentes concentraciones de calcio y es menor bajo una baja condición de concentración de calcio que bajo una alta condición de concentración de calcio.
65. Un método para mejorar la retención de plasma de una molécula de unión al antígeno al usar una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión al antígeno y un dominio de unión al FcRn humano, cuya actividad de unión al antígeno es diferente entre dos diferentes concentraciones de calcio y es menor bajo una baja condición de concentración de calcio que bajo una alta condición de concentración de calcio.
66. El método de cualquiera de las reivindicaciones 62 a 65, donde la baja concentración de calcio es una concentración de calcio ionizado de 0.1 a 30 µ .
67. El método de cualquiera de las reivindicaciones 62 a 65, donde la alta concentración de calcio es una concentración de calcio ionizado 100 µ? a 10 mM.
68. El método de cualquiera de las reivindicaciones 62 a 66, donde la baja concentración de calcio es una concentración intraendosomal de calcio ionizado.
69. El método de cualquiera de las reivindicaciones 62 a 65, o 67, donde la alta concentración de calcio es una concentración en plasma de calcio ionizado.
70. El método de cualquiera de las reivindicaciones 62 a 69, donde un dominio de unión al FcRn de la molécula de unión al antígeno es una región de Fe.
71. El método de cualquiera de las reivindicaciones 62 a 70, donde la actividad molécula de unión al antígeno de la molécula de unión al antígeno es además menor bajo una condición del pH ácido que bajo una condición del pH neutral.
72. El método de la reivindicación 71, donde la modificación del aminoácido en la molécula de unión al antígeno es la modificación al sustituir por lo menos un aminoácido con histidina, o al insertar por lo menos una histidina en la molécula de unión al antígeno.
73. El método de cualquiera de las reivindicaciones 62 a 72, donde el antígeno al cual la molécula de unión al antígeno se une es un antígeno seleccionado del grupo que consiste de IL-6R, IL-6, IgA, glipicano 3 humano, e IgE.
74. El método de cualquiera de las reivindicaciones 62 a 73, donde la molécula de unión al antígeno es un anticuerpo.
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