BR112013013354A2

BR112013013354A2 - molécula de ligação ao antígeno capaz de se ligar a uma pluralidade de moléculas de antígeno repetidamente

Info

Publication number: BR112013013354A2
Application number: BR112013013354-6A
Authority: BR
Inventors: Tomoyuki Igawa; Shinya Ishii; Miho Funaki; Naoka Hironiwa; Atsuhiko Maeda; Junichi Nezu; Yoshinao Ruike; Takeshi Baba; Shun Shimizu
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 2010-11-30
Filing date: 2011-11-30
Publication date: 2020-10-06
Also published as: TW201730217A; EP4231014A2; RU2642318C2; TWI812066B; TW202043266A; JP2020189850A; HK1258068A1; JP7096863B2; JP6431506B2; JP6030452B2; SG190727A1; AU2011337704B2; US20140234340A1; TWI654203B; TWI761912B; HK1251592A1; KR20220045258A; EP2647706A4; MX365235B; RU2658504C9

Abstract

MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO, MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DA REFERIDA MOLÉCULA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO DE SELEÇÃO DE UMA MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO E USO MESMA. A presente invenção refere-se a um método para promover a absorção de um antígeno pelas células por uma molécula de ligação ao antígeno; um método para aumentar a frequência de ligação a um antígeno por uma molécula de ligação ao antígeno; um método para promover a redução da concentração plasmática de antígeno pela administração de uma molécula de ligação ao antígeno; um método para aperfeiçoar a retenção de uma molécula de ligação ao antígeno no plasma; uma molécula de ligação ao antígeno que promove a absorção de um antígeno pelas células; uma molécula de ligação ao antígeno tal que a frequência com que a molécula se liga a um antígeno esteja aumentada; uma molécula de ligação ao antígeno capaz de promover, pela sua administração, uma redução na concentração plasmática do antígeno; uma molécula de ligação ao antígeno que tenha retenção aperfeiçoada no plasma; composições farmacêuticas que compreendam tais moléculas de ligação ao antígeno; e métodos para produção da referida molécula, em que estes problemas podem ser solucionados pelo uso de uma molécula de ligação ao antígeno que possui uma reação antígeno-anticorpo dependente de cálcio.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO, MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DA REFE- RIDA MOLÉCULA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO DE SELE- ÇÃO DE UMA MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO E USO MESMA". 5 Antecedentes da invenção Os anticorpos têm chamado a atenção como agentes farmacêuti- cos uma vez que são altamente estáveis no plasma e possuem poucos efeitos colaterais.

Atualmente, um número de agentes farmacêuticos de anticorpos do tipo IgG está disponível no mercado e muitos agentes farmacêuticos de anticorpos estão atualmente em desenvolvimento (documentos não patente 1 e 2). Enquanto isso, várias tecnologias aplicáveis a agentes farmacêuticos de anticorpos de segunda geração foram relatadas, incluindo aquelas que melho- ram a função efetora, a capacidade de ligação ao antígeno, a farmacocinética e a estabilidade e aquelas que reduzem o risco de imunogenicidade (Docu- mento de não patente 3). Em geral, a dose necessária de um agente farma- cêutico de anticorpo é muito alta. . Isto, por sua vez, levou a problemas, tal como o alto custo de produção, bem como a dificuldade de produzir formula- ções subcutâneas.

Em teoria, a dose de um agente farmacêutico de anticorpo pode ser reduzida através do aprimoramento da farmacocinética do anticorpo ou do aprimoramento da afinidade entre anticorpos e antígenos.

A literatura relatou métodos para aprimorar a farmacocinética do anticorpo utilizando a substituição artificial de aminoácidos em regiões cons- tantes (documentos não patente 4 e 5). Similarmente, a maturação da afini- dade foi relatada como uma tecnologia para o aprimoramento da capacidade de ligação ao antígeno ou da atividade de neutralização dos antígenos (Do- cumento de não patente 6). Esta tecnologia possibilita o aprimoramento da atividade de ligação ao antígeno através da introdução de mutações de ami- noácidos dentro da região de CDR de uma região variável ou tal.

O aprimo- ramento da capacidade de ligação ao antígeno possibilita o aprimoramento da atividade biológica in vitro ou a redução de dosagem e possibilita ainda o aprimoramento da eficácia in vivo (Documento de não patente 7). Entretanto, a capacidade de neutralização de antígenos de uma única molécula de anticorpo depende de sua afinidade.

Através do aumento da afinidade, um antígeno pode ser neutralizado por uma quantidade menor de um anticorpo.

Vários métodos podem ser utilizados para aprimorar a afi- nidade do anticorpo (Documento de não patente 6). Além disso, se a afini- 5 dade puder se tornada infinita através da ligação de forma covalente do anti- corpo ao antígeno, uma única molécula de anticorpo poderia neutralizar uma molécula de antígeno (um anticorpo divalente pode neutralizar duas molécu- las de antígeno). Entretanto, a neutralização estequiométrica de um anticor- po contra um antígeno (um anticorpo divalente contra dois antígenos) é o limite de rnétodos pré-existentes e assim era impossível neutralizar comple- tamente o antigeno com uma quantidade de anticorpo menor que a quanti- dade de antígeno.

Em outras palavras, o efeito de aumento de afinidade possui um limite (Documento de não patente 9). Para prolongar o efeito de neutralização de um anticorpo neutralizante durante certo periodo, o anticor- po tem que ser administrado em uma dose maior que a quantidade de antí- geno produzida no corpo durante o mesmo periodo.

Portanto, apenas com o aprimoramento acima mencionado da farmacocinética do anticorpo ou da tecnologia de maturação da afinidade, houve limitações com relação à redu- ção da dose de anticorpo necessária.

Consequentemente, com a finalidade de manter o efeito de neutralização de antigeno do anticorpo durante um perlodo alvo com uma quantidade de anticorpo menor que a quantidade de antígeno, um único anticorpo tem que neutralizar vários antigenos.

Um anticorpo que se liga a um antígeno de uma maneira depen- dente do pH foi recentemente relatado como um novo método para atingir o objetivo anterior (documento de patente 1). Os anticorpos com ligação ao antígeno dependente do pH, que se ligam fortemente a um antígeno sob as condições neutras no plasma e se dissociam do antigeno sob condições áci- das no endossomo, podem se dissociar do antígeno no endossomo.

Quando um anticorpo com ligação ao antigeno dependente do pH se dissocia do an- tígeno é reciclado para o plasma por FcRn, este pode se ligar a um outro antígeno novamente.

Assim, um único anticorpo pode se ligar repetidamente a inúmeros antígenos.

Além disso, a retenção no plasma do antígeno é muito curta quando comparada com os anticorpos reciciados através da ligação de FcRn. Quando um anticorpo com retenção longa no plasma se liga a tal antigeno com retenção curta no plasma, o tempo de retenção no plasma do complexo 5 antígeno-anticorpo é prolongado até o mesmo que aquele do anticorpo. As- sim, a retenção no plasma do antigeno é prolongada através da ligação ao anticorpo e assim a concentração de antigenos no plasma é aumentada, Nestes casos, mesmo que a afinidade ao antigeno do anticorpo seja melhorada, a eliminação do antigeno do pIasma não pode ser aumen- lO tada. Os anticorpos descritos acima com ligação ao antígeno dependente do pH foram relatados como sendo mais eficazes como um método para apri- " morar a eliminação de antígenos do plasma em comparação aos anticorpos comuns (documento de patente 1). Assim, um único anticorpo com ligação ao antigeno dependente 15 do pH se iiga a inúmeros antígenos e é capaz de facilitar a eiiminação dos antígenos do plasma quando comparado com anticorpos típicos. Conse- quentemente, os anticorpos com Iigação ao antigeno dependente do pH possuem efeitos não conseguidos por anticorpos comuns. Entretanto, o úni- co método conhecido para se obter o efeito de Iigação repetida de um anti- 20 corpo com ligação ao antigeno dependente do pH ao antigeno e o efeito de promover a eliminação do antígeno do plasma foi conferir dependência do pH à reação antigeno-anticorpo usando a diferença de pH entre o plasma e o endossomo.

Os documentos da técnica anterior relacionados com a presente 25 invenção são mostrados abaixo: Documentos da técnica anterior Documentos de patente Documento de patente 1 WO 2009/125825, ANTIGEN-BINDING MOLECULE CAPABLE OF BINDING TO TWO OR MORE ANTIGEN MO- 30 LECULES REPEATEDLY Documentos de não patente Documento de não patente 1 Monoclonal antibody successes in the cIinic, janice M Reichert, Clark J Rosensweig, Laura B Faden & Matthew C Dewitz, Nature Biotechnology 23, 1073 - 1078 (2005) Documento de não patente 2 Pavlou AK, Belsey MJ., The thera- peutic antibodies market to 2008., Eur J Pharm Biopharm. 2005 Abr; 59(3): 5 389-96 Documento de não patente 3 Kim SJ, Park Y, Hong HJ., Anti- body engineering for the development of therapeutic antibodies., Mol Cells. 2005 Ago 31; 20(1): 17-29. Revisão Documento de não patente 4 Hinton PR, Xiong JM, johlfs MG, 10 Tang MT, Keller S, Tsurushita N., An engineered human lgGl antibody with longer serum half-life., J lmmunol. 2006 Jan 1; 176(1): 346-56

. Documento de não patente 5 Ghetie V, Popov S, Borvak J, Radu C, Matesoi D, Medesan C, Ober RJ, Ward ES., lncreasing the serum persis- . tence of an lgG fragment by random mutagenesis., Nat Biotechnol. 1997 Jul; 15 15(7): 637-40 Documento de não patente 6 Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Jun 14; 102(24): 8466-71. Epub 2005 Jun 6. A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using combinatorial libraries.

Rajpal a, Beyaz N, Haber L, Cappuccilli G, Yee H, Bhatt RR, Takeuchi T, Lerner RA, 20 Crea R Documerito de rião patente 7 Wu H, Pfarr DS, Johnson S, Bre- wah YA, Woods RM, Patel NK, White Wl, Young JF, Kiener PA.

Develop- ment of Motavizumab, an Ultra-potent Antibody for the Prevention of Respira- tory Syncytial Virus lnfection in the Upper and Lower Respiratory Tract.

J MOI 25 Biol. (2007) 368: 652-665 Documento de não patente 8 Hanson CV, Nishiyama Y, Paul S.

Catalytic antibodies and their applications- Curr Opin Biotechnol. 2005 Dez; 16(6): 631-6 Documento de não patente 9 Rathanaswami P, Roalstad S, 30 Roskos L, Su QJ, Lackie S, Babcook J.

Demonstration of an in vivo genera- ted sub-picomolar affinity fully human monoclonal antibody to interleukin-8. Biochem Biophys Res Commun. 2005 Sep 9: 334(4): 1004-13

Sumário da lnvenção Problemas a serem solucionados pela invenção A presente invenção foi alcançada em vista das circunstâncias acima.

Um objetivo da presente invenção é fornecer métodos para promover 5 a absorção de antígenos pelas células através da utilização de moléculas de ligação ao antígeno, métodos para aumentar o número de vezes de ligaçáo ao antigeno por uma molécula de ligação ao antigeno, métodos para promo- ver a redução da concentraçâo de antígenos no plasma através da adminis- tração de moléculas de ligação ao antigeno, métodos para aprimorar a re- lO tenção plasrnática de moléculas de ligação ao antígeno, moléculas de liga- ção ao antígeno que facilitam a absorção de antígenos pelas células, molé- culas de ligação ao antígeno que possuem um número maior de vezes de ligação ao antígeno, moléculas de ligação ao antígeno capazes de promover . a redução da concentração de antigenos no plasma através de administra- 15 ção, moléculas de ligação ao antígeno com retenção plasmática aprimorada, composições farmacêuticas que compreendem as moléculas de ligação ao antígeno e métodos para a produção do que foi descrito anteriormente. .Meios para solucionar os problemas Os presentes inventores realizaram estudos dedicados sobre os 20 métodos para promover a absorção de antígenos pelas células por molécu- las de ligação ao antígeno (moléculas, tais como polipeptídeos, que possu- em atividade de ligação ao antigeno), métodos para aumentar o número de vezes de ligação ao antígeno por uma molécula de ligação ao antígeno, mé- todos para promover a redução da concentração de antígenos no plasma 25 através da administração de moiéculas de ligação ao antígeno e métodos para aprimorar a retenção no pIasma de uma molécula de ligação ao antíge- no.

Como um resultado, os presentes inventores se concentraram na dife- rença na concentração de cálcio entre o plasma e o endossomo precoce, e então descobriram: a absorção de um antígeno nas células por moléculas de 30 ligação ao antígeno poderia ser promovida pelo ljSO de moléculas de ligação ao antígeno que possuem reatividade de ligação ao antigeno de uma forma dependente de cálcio; o numero de vezes de ligação ao antígeno por uma

> molécula de ligação ao antigeno poderia ser aumentado pela ligação repeti- tiva ao antigeno de uma molécula de ligação ao antígeno; a redução da con- centração do antígeno no plasma poderia ser promovida pela administração de moléculas de ligação ao antigeno e que a retenção no plasma de uma 5 molécula de ligação ao antigeno poderia ser aprimorada. Especificamente, a presente invenção se refere a métodos para promover a captura de antigenos nas células pelo uso de moléculas de Iiga- ção ao antígeno que possuem reatividade antígeno-anticorpo de uma forma dependente de cálcio, métodos para aumentar o número de vezes de liga- lO ção ao antigeno por uma molécula de ligação ao antigeno, rnétodos para promover a redução da concentração de antígenos no plasma pela adminis- tração de moléculas de ligação ao antígeno, e métodos para melhorar a re- tenção plasmática de moléculas de ligação ao antigeno, assim como molé- . culas de ligação ao antigeno que permitem captura de antígeno intensificada 15 nas células, moléculas de iigação ao antigeno com um número aumentado de vezes de ligação ao antígeno, moléculas de ligação ao antígeno que po- dem promover a redução da concentração de antígenos no plasma quando administradas, moléculas de ligaçâo ao antigeno com retenção plasmática aprimorada, composições farmacêuticas que compreendem as moléculas de 20 ligação ao antígeno acima, e métodos para produzir as mesmas- Mais espe- cificamente, a presente invenção se refere ao seguinte:

[1] uma molécula de ligação ao antigeno que compreende um domínio de ligação ao antígeno e um domínio de ligação ao FcRn humano, cuja atividade de ligação ao antigeno é diferente sob duas condições de 25 concentração de cálcio diferentes e é menor sob uma condição de baixa concentração de cálcio do que sob uma condição de alta concentração de cálcio, e que tem atividade de ligação ao FcRn humano sob uma condição de pH neutro;

[2] rnolécula de ligação ao antígeno de [1], em que a concentra- 30 ção baixa de cálcio é uma concentração de cálcio ionizado de 0,1 a 30 µM;

[3] molécula de Iigação ao antígeno de [1], em que a concentra- ção alta de cálcio é uma concentração de cálcio ionizado de 100 µM a 10 mM;

[4] molécula de ligação ao antígeno de [1] ou [2], em que a con- centração baixa de cálcio é uma concentração intra-endossômica de cálcio ionizado; 5 [5] molécula de ligação ao antígeno de [1] ou [3], em que a con- centração alta de cálcio é uma concentração plasmática de cálcio ionizado;

[6] molécula de ligação ao antígeno de qualquer um de [1] a j5], em que o dominio de Iigação a FcRn é uma região Fc; {7] molécula de ligação ao antlgeno de qualquer um de [1] a [6j, 10 em que a atividade de iigação ao antígeno ainda é menor sob uma condição de pH ácido do que sob uma condiçâo de pH neutro;

[8] molécula de Iigação ao antigeno de [7], em que pelo menos um aminoácido é substituído por histidina ou pelo menos uma histidina é T' inserida na molécula de ligação ao antigeno; 15 [9] molécula de ligação ao antígeno de qualquer um de [1] a [8], que se liga a um antígeno de membrana ou antígeno solúvel;

[10] molécula de ligação ao antigeno de qualquer um de [1] a [9], em que o antígeno é um antígeno selecionado do grupo que consiste em IL- 6R, IL-6, lgA, glipicana 3 humana e lgE; 20 [11] uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio de ligação ao antígeno e um domínio de iigação a FcRn humano, cuja atividade de ligação ao antígeno é diferente sob duas condições de concentração de cálcio diferentes e é menor sob uma condição de concen- tração baixa de cálcio do que sob uma condição de concentração alta de 25 cálcio e em que uma cadeia leve ou uma cadeia pesada do domínio de liga- ção compreende um motivo de iigação ao cálcio derivado de um anticorpo humano;

[12] molécula de ligação ao antigeno de [11], que o motivo de li- gação ao cálcio está compreendido na CDRI, CDR2 e/ou CDR3 de cadeia 30 leve do dominio de Iigação ao antigeno; (13] molécula de ligação ao antígeno de [12], em que o motivo de ligação ao cálcio está compreendido nas posições 30, 31 e/ou 32 de a-

cordo com a numeração de Kabat na CDRI da cadeia leve;

[14] molécula de ligação ao antígeno de [12] ou [13], em que o motivo de ligação ao cálcio está compreendido na posição 50 de acordo com a numeração de Kabat na CDR2 da cadeia leve; 5 [15] molécula de ligação ao antígeno de qualquer um de [12] a {14], em que o motivo de ligação ao cálcio está compreendido na posição 92 de acordo com a numeração de Kabat na CDR3 da cadeia leve;

[16] molécula de ligação ao antigeno de qualquer um de f12] a

[15], que é lgA ou glipicana 3 humana; 10 [17] molécula de ligação ao antigeno de [11], em que o motivo de ligação ao cálcio está compreendido na CDRI, CDR2 e/ou CDR3 da ca- deia pesada do domínio de ligação ao antígeno; {18] molécula de ligação ao antigeno de [16], em que o motivo

V de ligação ao cálcio está compreendido nas posições 95, 96, lOOa e/ou 101 15 de acordo com a numeração de Kabat na CDR3 da cadeia pesada: j19] molécula de ligação ao antígeno de j17] ou [18], que é IL-6R ou IL-6; (20] molécula de ligação ao antigeno de qualquer um de [11] a

[19], que compreende um domínio de ligação a FcRn que tem atividade de 20 FcRn na faixa de pH neutro;

[21] molécula de ligação ao antigeno de [20], em que o domínio de ligação a FcRn é uma região Fc;

[22] molécula de (igação ao antigeno de qualquer um de [1] a

[10], [20], ou [21], em que um ou mais aminoácidos nas posições 248, 250, 25 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 286, 289, 297, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434, e 436 (numeração EU) na sequência de aminoáci- dos da região Fc são diferentes daqueles da região Fc natural;

[23] molécula de ligação ao antígeno de [22], que compreende 30 qualquer um ou uma combinação de: Met na posição de aminoácido 237; lle na posição de aminoácido 248;

Ala, Phe, lle, Met, Gln, Ser, Val, Trp, ou Tyr na posição de ami- noácido 250; Phe, Trp, ou Tyr na posição de aminoácido 252; Thr na posição de aminoácido 254; Glu na posição de aminoácido 255: Asp, Glu, ou Gln na posição de aminoácido 256; Ala, Gly, lle, Leu, Met, Asn, Ser, Thr, ou Val na posição de ami- noácido 257; His na posição de aminoácido 258; Ala na posição de aminoácido 265; Ala ou Glu na posição de aminoácido 286; His na posição de aminoácido 289; Ala na posição de aminoácido 297; Ala na posição de aminoácido 303; Ala na posição de aminoácido 305: Ala, Asp, Phe, Gly, His, lle, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp, ou Tyr na posição de aminoácido 307; Ala, Phe, lle, Leu, Met, Pro, Gln, ou Thr na posição de aminoáci- do 308; Ala, Asp, GIu, Pro, ou Arg na posição de aminoácido 309; Ala, His, ou lle na posição de aminoácido 311; Ala ou His na posição de aminoácido 312; Lys ou Arg na posição de aminoácido 314; Ala, Asp, ou His na posição de aminoácido 315: Ala na posição de aminoácido 317: Val na posição de aminoácido 332: Leu na posição de aminoácido 334; His na posição de aminoácido 360: Ala na posição de aminoácido 376; Ala na posição de aminoácido 380: Ala na posição de aminoácido 382: Ala na posição de aminoácido 384:

Asp ou His na posição de aminoácido 385; Pro na posição de aminoácido 386; GIu na posição de aminoácido 387; Ala ou Ser na posição de aminoácido 389; 5 Ala na posição de aminoácido 424: Ala, Asp, Phe, Gly, His, lle, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp, ou Tyr na posição de aminoácido 428; Lys na posição de aminoácido 433; Ala, Phe, His, Ser, Trp, ou Tyr na posição de aminoácido 434: ou 10 His, lle, Leu, ou Val na posição de aminoácido 436; de acordo com a numeração EU na região Fc;

[24] molécula de ligação ao antígeno de quaiquer um de [1] a

[23], em que a molécula de ligação ao antigeno é um anticorpo; . [25] método para a produção de uma molécula de ligação ao an- 15 tígeno que possui pelo menos uma função selecionada dentre: (j) função de promover a absorção de um antigeno pelas célu- las, (ii) função de se ligar a um antígeno CJLlâS ou mais vezes, (iii) função de promover a redução da concentração plasmática 20 de antígeno e (iv) função de destaque na retenção plasmática, em que o método compreende as etapas de (a) a (e) abaixo: (a) determinar a atividade de ligação ao antígeno de uma molé- cula de ligação ao antígeno sob uma condição de baixa concentração de 25 cálcio; (b) determinar a atividade de ligação ao antígeno de uma molé- cula de ligação ao antígeno sob uma condição de alta concentração de cál- cio; (c) selecionar a molécula de ligação ao antigeno que tenha me- 30 nor atividade de íigação ao antígeno sob uma condição de baixa concentra- ção de cálcio do que sob uma condição de alta concentração de cálcio; (d) obter um gene que codifique a molécula selecionada na eta-

pa (C); e (e) produzir a molécula de ligação ao antigeno usando o gene obtido na etapa (d):

[26] método de produção de uma molécula de ligação ao antige- 5 no que possui pelo menos uma função selecionada entre: (i) função de promover a absorção de um antígeno pelas célu- las, (ii) função de se ligar a um antígeno duas ou mais vezes, (iii) função de promover a redução da concentração pIasmática de antigeno e (iv) função de destaque na retenção plasmática, em que o método compreende as etapas de (a) a (e) abaixo: (a) colocar um antígeno em contato com uma molécula de liga- ção ao antígeno ou uma biblioteca de moléculas de ligaçào ao antigeno sob uma condição de alta concentração de cálcio; (b) colocar a molécula de ligação ao antígeno na etapa (a) sob uma condição de baixa concentração de cálcio; (c) obter uma molécula de ligação ao antígeno que se dissocia na etapa (b); (d) obter um gene que codifica a molécula de ligação ao antíge- no obtido na etapa (c); e (e) produzir a molécula de Iigação ao antígeno usando o gene obtido na etapa (d);

[27] método para a produção de uma molécula de ligação ao an- tigeno que possui pelo menos uma função selecionada dentre: (i) função de promover a absorção de um antígeno pelas célu- las, (ii) função de se ligar a um antígeno duas Olj mais vezes, (iii) função de promover a redução da concentração plasmática de antígeno e (iv) função de destaque na retenção plasmática, em que o método compreende as etapas de (a) a (f) abaixo:

(a) coIocar um antígeno em contato com uma molécula de liga- cão ao antígeno ou uma biblioteca de moléculas de ligação ao antígeno sob > uma condição de baixa concentração de cálcio; (b) selecionar uma molécula de Iigação ao antigeno que não se 5 ligue ao antigeno da etapa (a); (c) permitir que a molécula de ligação ao antigeno selecionado na etapa (b) se ligue ao antigeno sob uma condição de alta concentração de cálcio: (d) obter uma molécula de ligação ao antígeno que se ligue ao 10 antígeno na etapa (c); (e) obter um gene que codifica a molécula de ligação ao antíge- no obtido na etapa (d); e (f) produzir a molécula de ligação ao antlgeno usando o gene . obtido na etapa (e); 15 [28] método de produção de qualquer um de [25] a [27], que compreende adicionalmente a etapa de conferir ou aumentar a atividade de ligação a FcRn sob uma condição de pH neutro pela modificação de um a- minoácido na molécula de ligação ao antígeno;

[29] método de produção de qualquer um de [25] a [27], que 20 compreende adicionalmente a etapa de reduzir a atividade de ligação ao antigeno sob uma condição de pH ácido para ser menor do que sob uma condição de pH neutro pela modificação de um aminoácido na molécula de ligação ao antigeno;

[30] método de produção de qualquer um de [25] a [27], em que 25 a concentração baixa de cálcio é uma concentração de cálcio ionizado de O,1a30µM;

[31] método de produção de qualquer um de [25] a [27], em que a concentração alta de cálcio é uma concentração de cálcio ionizado de 100 µM a 10 mM; 30 [32] método de produção de qualquer um de [25] a [27], em que a concentração baixa de cálcio é uma concentração intra-endossômica de cálcio ionizado;

[33] método de produção de qualquer um de [25] a [27], em que a concentração alta de cálcio é uma concentração pIasmática de cálcio ioni- zado; {34] método de produção de [29], em que a modificação de ami- 5 noácido na molécula de ligação ao antígeno é uma modificação pela substi- tuição de pelo menos um aminoácido por histidina ou inserção de pelo me- nos uma histidina na molécula de ligação ao antígeno;

[35] método de produção de qualquer um de [25] a [34], em que o antígeno ligado pela moiécula de Iigação ao antigeno é um antigeno sele- lO cionado do grupo que consiste em IL-6R, IL-6, lgA, glipicana 3 humana e lgE;

[36] método de produção de qualquer um de {25] a {35], em que a molécula de ligação ao antígeno é um anticorpo: . [37] composição farmacêutica que compreende: 15 a molécula de ligação ao antígeno de qualquer um de [1] a [24] ou uma molécula de ligação ao antígeno produzida pelo método de produ- ção de qualquer urn de [25] a [36], e um veículo farmaceuticamente aceitá- vel;

[38] composição farmacêutica de [37] para uso na promoção da 20 internalização do antígeno nas células;

[39] composição farmacêutica de [37] para uso na promoção da redução da concentração de antígeno no plasma;

[40] composição farmacêutica para uso na promoção de absor- ção do antígeno nas células ou redução da concentração de antigeno no 25 plasma, que compreende uma molécula de ligação ao antígeno que com- preende um dominio de ligação ao antígeno e um domínio de ligação a FcRn humano, cuja atividade de ligação ao antigeno é diferente sob duas condi- ções de concentração de cálcio diferentes e é menor sob uma condição de concentração baixa de cálcio do que sob uma condição de concentração alta 30 de cálcio;

[41] composição farmacêutica de [40], em que a concentração baixa de cálcio é uma concentração de cálcio ionizado de 0,1 a 30 µM;

[42] composição farmacêutica de [40], em que a concentração alta de cálcio é uma concentração de cálcio ionizado de 100 µM a 10 mM;

[43] composição farmacêutica de [40] ou [41], em que a concen- tração baixa de cálcio é uma concentração intra-endossômica de cálcio ioni- 5 zado;

[44] composição farmacêutica de [40] ou [42], em que a concen- tração alta de cálcio é uma concentração plasmática de cálcio ionizado;

[45] composição farmacêutica de qualquer um de [40] a [44], em que o domínio de ligação a FcRn compreendido na molécula de ligação ao antígeno é uma região Fc;

[46] composição farmacêutica de qualquer um de [40] a [45], em que a atividade de ligação ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno é menor sob uma condição de pH ácido do que sob uma condição de pH neu- tro;

[47] Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação

[46], em que a modificação de aminoácido na molécula de ligação ao antí- geno é uma modificação pela substituição de pelo menos um aminoácido por histidina ou inserção de pelo menos uma histidina na molécula de ligação ao antígeno;

[48] composição farmacêutica de qualquer um de [40] a [47], em que o antígeno ao qual a molécula de ligação ao antígeno se liga é um antí- geno selecionado do grupo que consiste em IL-6R, IL-6, IgA, glipicana 3 hu- mana e IgE;

[49] método de seleção de uma molécula de ligação ao antígeno que tem pelo menos uma função selecionada entre: (i) função de promover a absorção de um antígeno pelas células, (ii) função de se ligar a um antígeno duas ou mais vezes, (iii) função de promover a redução da concentração plasmá- tica de antígeno e (iv) função de destaque na retenção plasmática, em que o método compreende as etapas de (a) a (c) abaixo:

[42] composíção farmacêutica de [40], em que a concentração alta de cálcio é uma concentração de cálcio ionizado de 100 µM a 10 mM;

[43] composição farmacêutica de [40] ou j41], em que a concen- tração baixa de cálcio é uma concentração intra-endossômica de cálcio ioni- 5 zado;

[45] composição farmacêutica de qualquer um de [40] a [44], em que o dominio de ligação a FcRn compreendido na molécula de ligaçào ao 10 antígeno é uma região Fc;

[46] composição farmacêutica de qualquer um de [40] a [45], em que a atividade de ligação ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno é ¶ menor sob uma condição de pH ácido do que sob uma condição de pH neu- - tro; 15 [47] Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 46, em que a modificação de aminoácido na molécula de ligação ao antige- no é uma modificação pela substituição de pelo menos um aminoácido por histidina ou inserção de peb menos uma histidina na molécula de ligação ao antígeno; 20 [48] composição farmacêutica de qualquer um de [40] a [47], em que o antígeno ao qual a molécula de ligação ao antlgeno se liga é um anti- geno selecionado do grupo que consiste em IL-6R, IL-6, lgA, glipicana 3 hu- mana e lgE;

[49] método de seleção de uma molécula de ligação ao antígeno 25 que tem pelo menos uma função selecionada entre: (i) função de promover a absorção de um antigeno pelas célu- las, (ii) função de se ligar a um antígeno duas ou mais vezes, (iii) função de promover a redução da concentração plasmática 30 de antígeno e (iv) função de destaque na retenção plasmática, em que o método compreende as etapas de (a) a (c) abaixo:

(a) determinar a atividade de ligação ao antígeno de uma molé- cula de ligação ao antigeno sob uma condição de baixa concentração de cálcio; (b) determinar a atividade de ligação ao antígeno da molécula 5 de ligação ao antígeno sob uma condição de alta concentração de cálcio; e (C) selecionar a molécula de ligação ao antigeno cuja atividade de ligação ao antígeno seja menor sob uma condição de baixa concentração de cálcio do que sob uma condição de alta concentração de cálcio;

[50] método de seleção de uma molécula de ligação ao antígeno que compreende pelo menos uma função selecionada entre: (i) função de promover a absorção de um antigeno pelas célu- las, (ii) função de se Iigar a um antígeno duas ou mais vezes, (iii) função de promover a redução da concentração plasmática de antígeno e {iv) função de destaque na retenção plasmática, em que o método compreende as etapas de (a) a (c) abaixo: (a) colocar um antigeno em contato com uma molécula de liga- ção ao antígeno ou uma biblioteca de moléculas de Iigação ao antígeno sob uma condição de alta concentração de cálcio; (b) coiocar a molécula de ligação ao antígeno na etapa (a) sob uma condição de baixa concentração de cálcio; e (C) obter uma molécula de ligação ao antígeno que se dissocia na etapa (b):

[51] método de seleção de uma molécula de ligação ao antígeno que compreende pelo menos uma função selecionada entre: (i) função de promover a absorção de um antígeno pelas célu- las, (ii) função de se ligar a um antigeno duas ou mais vezes, (iii) função de promover a redução da concentração plasmática de antígeno e (iv) função de destaque na retenção plasmática,

em que o método compreende as etapas de (a) a (d) abaixo: (a) colocar um antígeno em contato com uma molécula de liga- ção ao antígeno ou uma biblioteca de moléculas de ligação ao antígeno sob uma condição de baixa concentração de cálcio; 5 (b) selecionar uma molécula de ligação ao antigeno que não se ligue ao antigeno da etapa (a); (C) permitir que a molécula de ligação ao antígeno selecionado na etapa (b) se ligue ao antígeno sob uma condição de alta concentração de cálcio; e 10 (d) obter uma molécula de ligação ao antigeno que se ligue ao antígeno na etapa (C);

[52] método de seleção de qualquer um de [49] a [51],em que a concentração baixa de cálcio é uma concentração de cálcio ionizado de 0,1 » a30µM; 15 [53] método de seleção de qualquer um de [49] a [51], em que a concentração alta de cálcio é uma concentração de cálcio ionizado de 100 µM a 10 mM;

[54] método de seleção de qualquer um de [49] a [52], em que a concentração baixa de cálcio é uma concentração intra-endossômica de cál- 20 cio ionizado;

[55] método de seleção de qualquer um de [49] a [51], ou [53], em que a concentração alta de cálcio é uma concentração plasmática de cálcio ionizado;

[56] método de seleção de qualquer um de [49] a [55], em que o 25 antigeno ao qual a molécula de ligação ao antígeno se liga é um antigeno selecionado do grupo que consiste em IL-6R, IL-6, lgA, glipicana 3 humana e lgE;

[57] método de seleção de qualquer um de [49] a [56], em que a molécula de ligação ao antígeno é um anticorpo; 30 [58] método para promoçào da absorção do antigeno em uma célula pela molécula de ligação ao antigeno pela administração da molécula de ligação ao antígeno de qualquer um de [1] a [24] ou uma molécula de li-

gação ao antígeno produzida pelo método de produção de qualquer um de

[25] a [36]:

[59] método para promoção da redução de concentração de an- tígeno no plasma pela administração da moiécula de ligação ao antígeno de 5 qualquer um de [1] a [24] ou uma molécula de Iigação ao antígeno produzida pelo método de produção de qualquer um de [25] a [36];

[60] método para aumentar o número de vezes de ligação ao an- tígeno por uma molécula de ligação ao antigeno pelo uso da molécula de ligação ao antigeno de qualquer um de [1] a j24] ou uma molécula de ligação ao antígeno produzida pelo método de produção de qualquer um de [25] a

[36];

[61] método para aperfeiçoar a retenção plasmática de uma mo- lécula de Iigação ao antígeno pelo uso da molécula de iigação ao antigeno de qualquer um de [1] a [24] ou uma molécula de ligação ao antigeno produ- zida pelo método de produção de qualquer um de [25] a [36];

[62] método para promoção da absorção do antígeno em uma célula pela molécula de ligação ao antigeno pela administração de uma mo- Iécula de ligação ao antigeno que compreende um domínio de ligação ao antígeno e um domínio de ligação a FcRn humano, cuja atividade de ligação ao antígeno é diferente sob duas condições de concentração de cálcio dife- rentes e é menor sob uma condição de concentração baixa de cálcio do que sob uma condição de concentração alta de cálcio;

[63] método para promoção da redução de concentração de an- tígeno no plasma pela administração de uma molécula de ligação ao antíge- no que compreende um dominio de ligação ao antígeno e um dominio de ligaçào a FcRn humano, cuja atividade de ligação ao antígeno é diferente sob duas condições de concentração de cálcio diferentes e é menor sob uma condição de concentração baixa de cálcio do que sob uma condição de concentração alta de cálcio;

[64] método para aumentar o número de vezes de ligação ao an- tígeno por uma molécula de ligação ao antígeno pelo uso de uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio de ligação ao antígeno e um domínio de ligação a FcRn humano, cuja atividade de ligação ao anti- geno é diferente sob duas condições de concentração de cálcio diferentes e é menor sob uma condição de concentração baixa de cálcio do que sob uma condição de concentração alta de cálcio; 5 [65] método para aperfeiçoar a retenção pIasmática de uma mo- lécula de ligação ao antígeno pelo uso de uma molécula de Iigação ao antí- geno que compreende um domínio de ligação ao antígeno e um domínio de ligação a FcRn humano, cuja atividade de ligação ao antígeno é diferente sob duas condições de concentração de cálcio diferentes e é menor sob 10 uma condição de concentração baixa de cálcio do que sob uma condição de concentração alta de cálcio;

[66] método de qualquer um de [62] a [65], em que a concentra- ção baixa de cálcio é uma concentração de cálcio ionizado de 0,1 a 30 µM; e

[67] método de qualquer um de [62] a [66], em que a concentra- 15 ção alta de cálcio é uma concentração de cálcio ionizado de 100 µM a 10 mM;

[68] método de quaíquer um de [62] a [67], em que a concentra- çâo baixa de cálcio é uma concentração intraendossômica de cálcio ioniza- do; 20 [69] método de qualquer um de [62] a (68], em que a concentra- ção alta de cálcio é uma concentração plasmática de cálcio ionizado;

[70] método de quaíquer um de j62] a [69], em que o domínio de figação a FcRn da molécula de ligação ao antígeno é uma região Fc;

[71] método de qualquer um de [62] a [70], em que a atividade 25 de ligação ao antígeno é adicionalmente menor sob uma condição de pH ácido do que sob uma condição de pH neutro;

[72] método de acordo com a reivindicação [71], em que a modi- ficação de aminoácido na molécula de ligação ao antigeno é uma modifica- ção pela substituição de pelo menos um aminoácido por histidina ou inser- 30 ção de pelo menos uma histidina na molécula de ligação ao antigeno;

[73] método de qualquer um de [62] a [72], em que o antígeno ao qual a molécula de ligação ao antigeno está ligada é um antígeno seleciona-

do do grupo que consiste em IL-6R, IL-6, lgA, glipicana 3 humana e lgE; e

[74] método de qualquer um de [62] a [73], em que a molécula de ligação ao antigeno é um anticorpo. Além disso, a presente invenção se refere a kits para uso nos 5 métodos da presente invenção, que compreendem uma molécula de ligação ao antigeno da presente invenção ou uma molécula de ligação ao antigeno produzida pelos métodos de produção da presente invenção. A presente in- venção também se refere a agentes para promover a absorção de antígenos nas células por uma molécula de ligação ao antígeno, agentes para promo- lO ver a redução da concentração de antigenos no plasma, agentes para au- mentar o número de vezes de ligação ao antigeno por uma molécula de liga- ção ao antigeno, e agentes para melhorar a retenção plasmática de uma molécula de ligação ao antígeno, todos os quais compreendem como um » ingrediente ativo uma molécula de ligação ao antígeno da presente invenção 15 ou uma molécula de ligação ao antlgeno produzida pelo método de produ- ção da presente invenção. Além disso, a presente invenção se refere ao uso de uma molécula de ligação ao antigeno da presente invenção ou uma mo- lécula de Iigação ao antigeno pelos métodos de produção da presente in- venção na produção de agentes para promover a absorção de antigeno nas 20 células por uma molécula de ligação ao antigeno, agentes para promover a redução da concentração de antígenos no plasma, agentes para aumentar o número de vezes de ligação ao antigeno por uma molécula de ligação ao antígeno, ou agentes para melhorar a retenção plasmática de uma molécula de ligação ao antígeno. A presente invenção também se refere a moléculas 25 de ligação ao antigeno da presente invenção ou moléculas de ligação ao antígeno produzidas pelos métodos de produção da presente invenção para uso nos métodos da presente invenção. Efeitos da invenção A presente invenção fornece métodos para promover a absorção 30 de antígeno nas células por moléculas de ligação ao antígeno, métodos para aumentar o número de vezes de ligação ao antígeno por uma molécula de ligação ao antígeno, métodos para promover a redução da concentração de antígenos no plasrna pela administração de moléculas de ligação ao antige- no, e métodos para meihorar a retenção plasmática de uma molécula de ii- gação ao antigeno.

A promoção de absorção de antigeno nas células por moléculas de ligação ao antígeno permite que se promova a redução da 5 concentração de antígenos no plasma pela administração das moléculas de Iigação ao antígeno e também se promova a retenção plasmática de uma molécula de ligação ao aritígeno. lsto pode aumentar o número de vezes de Iigação ao antigeno por uma molécula de ligação ao antígeno.

Desta forma, tais moléculas de ligação ao antigeno podem produzir mais efeitos in vivo 10 superiores em comparaçáo às moléculas de ligação ao antigeno típicas.

Breve descrição dos desenhos A figura 1 é um diagrama mostrando que um anticorpo com liga- ção dependente do pH se liga repetidamente a antigenos solúveis. (i) um y anticorpo se liga a antígenos solúveis; (ii) o anticorpo é internalizado não- 15 especificamente em uma célula através de pinocitose; (iii) o anticorpo se liga a FcRn dentro do endossomo, e, então, os antígenos solúveis se dissociam do anticorpo; (iv) os antígenos solúveis são transferidos para o lisossomo e degradados; (V) após a dissociação dos antígenos solúveis, o anticorpo é reciclado para o pIasma através de FcRn; (vi) o anticorpo reciclado pode se 20 ligar aos antígenos soÍúveis novamente.

A figura 2 é um diagrarna mostrando que um anticorpo com iiga- ção dependente do pH se Iiga repetidamente a antígenos de membrana- (i) um anticorpo se liga a antigenos de membrana; (ii) o anticorpo é internaliza- do em uma célula em um complexo com os antígenos de membrana: (iii) o 25 anticorpo se dissocia dos antlgenos de membrana dentro do endossomo; (iv) os antígenos de membrana são transferidos para o lisossomo e são degra- dados; (V) após a dissociação dos antlgenos de membrana, o anticorpo é reciclado para o plasma; (vi) o reciclado pode se ligar novamente aos antí- genos de membrana. 30 A figura 3 é um diagrama que mostra os modos de interação no plasma (pH 7,4) e no endossomo (pH 6,0) entre um antígeno e um anticorpo com ligação dependente do pH.

A figura 4 é um diagrama que mostra os modos de interação no plasma (Ca2" 2 mM) e endossomo (Ca2" 3 µM) entre um antigeno e um anti- corpo com (igação dependente de cálcio. A figura 5 é uma diagrama que mostra os modos de interação no 5 plasma (pH 7,4, Ca'" 2 mM) e endossomo (pH 6,0, Ca2" 3 µM) entre um an- tígeno e um anticorpo com ligação dependente do pH e de cálcio. A figura 6 apresenta sensorgramas Biacore mostrando a intera- ção entre os anticorpos antirreceptor de IL-6 humana com o receptor de IL-6 humana solúvel sob as condições de (Ca2"2 mM) e (Ca2" 3 µM).

10 A figura 7 apresenta um sensorgrama Biacore mostrando a inte- ração entre H54/L28-lgG1 e o receptor de IL-6 humana solúvel sob as con- dições de (Ca'" 2 mM) e (Ca'" 3 µM).

A figura 8 apresenta um sensorgrama Biacore mostrando a inte- . ração entre Fl-l4-lgG1 e o receptor de IL-6 humana solúvel sob as condições 15 de (Ca'" 2 mM) e (Ca" 3 µM). A figura 9 apresenta um sensorgrama Biacore mostrando a inte- ração entre 6RL#9-lgG1 e o receptor de IL-6 humana solúvel sob as condi- ções de (Ca2' 2 mM) e (Ca2" 3 µM).

A figura 10 descreve um curso de tempo da concentração plas- 20 mática do anticorpo em camundongos normais administrados com H54/L28- lgG1, FH4-lgG1, ou 6Rl_#9-lgG1. A figura 11 descreve um curso de tempo do níve! plasmático do receptor de IL-6 humana solúvel (hslL-6R) em camundongos normais admi- nistrados com H54/L28-lgG1, FH4-lgG1, ou 6RL#9-lgG1. 25 A figura 12 descreve um curso de tempo da concentração plas- mática do anticorpo em camundongos normais administrados com H54/L28- N434W, FH4-N434W, ou 6RL#9-N434W. A figura 13 descreve um curso de tempo do nível pIasmático do receptor de IL-6 humana solúvel (hsIL-6R) em camundongos normais admi- 30 nistrados com H54/L28-N434W, FH4-N434W, ou 6RL#9-N434W. A figura 14 mostra a estrutura da CDR3 de cadeia pesada de um fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 determinado por cristalografia de raios X.

A figura 15 apresenta sensorgramas Biacore mostrando a intera- ção entre os anticorpos anti-lL-6 humana com IL-6 humana sob as condi- ções de (Ca'" 1,2 mM) e (Ca'" 3 µM)-

A figura 16 mostra cromatogramas de troca iônica para um anti- 5 corpo que tem a sequência Vk5-2 humana e um anticorpo que tem a se- quência h Vk5-2 _ L65 que tem uma sequência de glicosilação modificada na sequência Vk5-2 humana.

A linha continua indica um cromatograma para um anticorpo que tem a sequência Vk5-2 humana (cadeia pesada: CIM _ H, SEQ ID NO: 48; cadeia leve: hVk5-2, molécula de fusão entre as SEQ ID NOs: 41 10 e 28); a linha tracejada indica um cromatograma para um anticorpo que tem a sequência hVk5-2_ L65 (cadeia pesada: CIM _ H (SEQ ID NO: 48); cadeia leve: hVk5-2 _ L65 (SEQ ID NO: 47)). A figura 17 mostra cromatogramas de troca iônica para um anti- . corpo que tem a sequência LNKI _ Ca (cadeia pesada: GC_ H, SEQ ID NO: 15 102: cadeia leve: LNKI _Ca, SEQ ID NO: 61) e um anticorpo que tem uma sequência na qual Asp (D) na sequência LNKI _Ca é substituído por Ala (A) após amiazenamento a 5°C (linha contínua) ou 50°C (linha pontilhada)- A- pós armazenamento a 5°C, o pico mais elevado no cromatograma para cada anticorpo é definido como um pico principal, e o eixo y de cada cromatogra- 20 ma de troca iônica foi normalizado ao pico principal.

A figura 18 mostra cromatogramas de troca iônica para um anti- corpo que tem a sequência LfVkl _ Ca (cadeia pesada: GC H, SEQ ID NO: 102; cadeia leve: LNKI _ Ca, SEQ ID NO: 61) e um anticorpo que tem a se- quência LfVkl _ Ca6 (cadeia pesada: GC _ H, SEQ ID NO: 102: cadeia leve: 25 LfVkl _ Ca6, SEQ ID NO: 75) no qual Asp (D) na posição 30 (sistema de nu- meração de Kabat) na sequência de LfVkl _ Ca é substituido por Ser (S) a- pós armazenamento a 5°C (linha contínua) ou 50"C (Iinha pontilhada). Após armazenamento a 5°C, o pico mais elevado no cromatograma para cada anticorpo é definido como um pico principal, e o eixo y de cada crornatogra- 30 ma de troca iônica foi normalizado ao pico principal.

A figura 19 apresenta sensorgramas Biacore mostrando a intera- ção entre os anticorpos anti-CD4 humano e o CD4 humano solúvel sob as

O condições de (Ca'" 1,2 mM) and (Ca'" 3 µM)- A figura 20 descreve um curso de tempo da concentração plas- mática de anticorpos anti-CO4 humano em camundongos normais.

A figura 21 descreve um curso de tempo da concentração plas- 5 mática de CD4 humano soIúve! o grupo administrado com CD4 humano so- lúvel sozinho, o grupo administrado com o anticorpo TNX355-lgG1, o grupo administrado com o anticorpo Q425, e o grupo administrado com o anticorpo Q425L9 de camundongos normais.

A figura 22 apresenta sensorgramas Biacore mostrando a intera- IO ção entre os anticorpos anti-lgA humana com lgA humana sob as condições de (Ca'" 1,2 mM) e (Ca'" 3 µM). A figura 23 descreve um curso de tempo das concentrações plasmáticas do anticorpo em camundongos normais para o grupo adminis- . trado com o anticorpo GAl-lgGl, o grupo administrado com o anticorpo 15 GA2-lgG1, o grupo administrado com o anticorpo GA3-lgG1 e o grupo admi- nistrado com o anticorpo GA2-N434W.

A figura 24 descreve um curso de tempo da concentração pIas- mática de lgA humana em camundongos normais para o grupo administrado apenas com IgA humana, o grupo administrado com o anticorpo GAl-lgGl, 20 o grupo administrado com o anticorpo GA2-lgG1, o grupo administrado com o anticorpo GA3-lgG1 e o grupo administrado com o anticorpo GA2-N434W.

A figura 25 descreve um curso de tempo da concentração plas- mática da lgA humana não ligada em camundongos normais para o grupo administrado com o anticorpo GAl-lgGl, o grupo administrado com o anti- 25 corpo GA2-lgG1, o grupo administrado com o anticorpo GA3-lgG1e o grupo administrado com o anticorpo GA2-N434W.

A figura 26 é um diagrama ilustrativo mostrando a eficiência da eliminação de antígeno por molécula de anticorpo para um anticorpo geral que forma um grande complexo imune com um antígeno muitimérico. 30 A figura 27 é um diagrama ilustrativo mostrando a eficiência da eliminação de antigeno por molécula de anticorpo para um anticorpo depen- dente de pH/Ca que tem a região constante da lgGl natural que forma um grande complexo imune com um antígeno multimérico. A figura 28 é um diagrama ilustrativo mostrando a eficiência da eliminação de antigeno por molécula de v para um anticorpo multiespecifico dependente de pH/Ca que reconhece dois ou mais epítopos em um aritígeno 5 monomérico e é adequado para a formação de um grande complexo imune. A figura 29 descreve a interação entre anticorpos anti-glipicana 3 humana com glipicana 3 humana recombinante sob as condições de (Ca2' 1,2 mM) e (Ca" 3 µM) por ELISA.

A figura 30 descreve a interação entre os anticorpos anti-lgE 10 humana com lgE humana recombinante sob as condições de (Ca2" 2 mM) e (Ca'" 3 µM) por ELISA.

. A figura 31 descreve um curso de tempo das concentrações plasmáticas do anticorpo em camundongos transgênicos para FcRn humano. m A figura 32 descreve um curso de tempo da concentração plas- 15 mática do receptor de IL-6 humana solúvel em camundongos transgênicos para FcRn humano. A figura 33 descreve um curso de tempo das concentrações plasmáticas do anticorpo em camundongos normais. A figura 34 descreve um curso de tempo da concentração plas- 20 mática do receptor de IL-6 humana solúvel em camundongos normais. A figura 35 descreve um curso de tempo da concentração plas- mática do receptor de IL-6 humana solúvel não ligado em camundongos normais. A figura 36 descreve um curso de tempo da concentração plas- 25 mática do receptor de IL-6 humana solúvel em camundongos transgênicos para FcRn humano. A figura 37 descreve um curso de tempo da concentração pIas- mática de receptor de IL-6 humana solúvel após a administração de Fv4- lgG1-F14 em uma dose menor (0,01 mg/kg) ou 1 mg/kg. 30 A figura 38 descreve um curso de tempo das concentrações plasmáticas do anticorpo após administração de Fv4-lgG1-F14 em uma dose menor (0,01 mg/kg) ou 1 mg/kg.

e A figura 39 descreve um curso de tempo da concentração plas- mática do receptor de IL-6 humana solúvel após administração de anticorpos antirreceptor de IL-6 humana a camundongos normais nos quais a concen- tração plasmática do receptor de IL-6 humana soIúvel é constante. 5 A figura 40 descreve um curso de tempo da concentração plas- mática do anticorpo após coadministração de hslL-6R e um anticorpo antir- receptor de IL-6 humana a camundongos transgênicos para FcRn humano (Linhagem 276). A figura 41 descreve um curso de tempo da concentração plas- lO mática do receptor de IL-6 humana soIúvel após coadministração de hslL-6R e um anticorpo antirreceptor de IL-6 humana a camundongos transgênicos " para FcRn humano (Linhagem 276)- A figura 42 descreve a relação entre a afinidade de ligação de

W variantes Fc ao FcRn humano em pH 7,0 e a concentração plasmática de 15 hslL-6R um dia após a coadministração de hslL-6R e um anticorpo antirre- ceptor de IL-6 humana a camundongos transgênicos para FcRn humano (Linhagem 276). A figura 43 descreve a relação entre a afinidade de Iigação de variantes Fc ao FcRn humano em pH 7,0 e a concentração plasmática do 20 anticorpo um dia após a coadministração de hslL-6R e um anticorpo antirre- ceptor de 1L-6 humana a camundongos transgênicos para FcRn humano (Linhagem 276). A figura 44 descreve um curso de tempo da razão molar antige- no/anticorpo (valor C) após a coadministração de hslL-6R e um anticorpo 25 antirreceptor de IL-6 humana a camundongos transgênicos para FcRn hu- mano (Linhagem 276). A figura 45 descreve a relação entre a afinidade de ligação de variantes Fc ao FcRn humano em pH 7,0 e a razão molar antígeno/anticorpo (valor C) no dia 1 após a coadministração de hslL-6R e um anticorpo antirre- 30 ceptor de IL-6 humana a camundongos transgênicos para FcRn humano (Linhagem 276). A figura 46 descreve um curso de tempo da concentração plas-

mática de hslL-6R após a administração de Fv4-lgG1-F14 em doses mais baixas (0,01 ou 0,2 mg/kg) ou 1 mg/kg a camundongos transgênicos para FcRn humano (Linhagem 276) nos quais a concentração plasmática de hslL- 6R é constante (modelo de infusão em estado estacionário). 5 A figura 47 descreve um curso de tempo da concentração pIas- mática de hslL-6R em camundongo transgênico para FcRn humano da li- nhagem 276 e linhagem 32 após a coadrninistração de hslL-6R e um anti- corpo antirreceptor de IL-6 humana a camundongos transgênicos para FcRn humano (Linhagens 276 e 32). 10 A figura 48 descreve um curso de tempo da concentração plas- mática do anticorpo em camundongo transgênico para FcRn humano da li- nhagem 276 e linhagem 32 após a coadministração de hslL-6R e um anti- corpo antirreceptor de IL-6 humana a camundongos transgênicos para FcRn . humano (Linhagens 276 e 32). 15 A figura 49 descreve um curso de tempo da concentração plas- mática de hslL-6R após a administração de anticorpo antirreceptor de IL-6 humana a camundongos transgênicos para FcRn humano nos quais a con- centração plasmática de hslL-6R é constante (Linhagem 32) (modelo de in- fusão em estado estacionário). 20 A figura 50 descreve um curso de tempo da concentração plas- mática do anticorpo após a administração de anticorpo antirreceptor de IL-6 humana a camundongos transgênicos para FcRn humano nos quais a con- centração plasmática de hslL-6R é constante (Linhagem 32) (modelo de in- fusão em estado estacionário). 25 A figura 51 descreve cursos de tempo da razão molar antíge- no/anticorpo (valor C) após a administração de anticorpo antirreceptor de IL- 6 humana a camundongos transgênicos para FcRn humano nos quais a concentração plasmática de hslL-6R é constante (Linhagem 32) (modelo de infusão em estado estacionário). 30 A figura 52 descreve a relação entre a afinidade de ligação de variantes Fc e FcRn humano em pH 7,0 e a razão molar antigeno/anticorpo (valor C) no dia 1 após a administração do anticorpo antirreceptor de IL-6 humana a camundongos transgênicos para FcRn humano (Linhagem 32) nos quais a concentração plasmática de hslL-6R é constante (modelo de infusão em estado estacionário).

A figura 53 mostra em um gráfico um curso de tempo da concen- 5 tração plasmática do anticorpo após a administração de anticorpos antirre- ceptor de IL-6 humana que têm uma variante Fc de F11, F39, F48, e F264 a camundongos transgênicos para FcRn humano nos quais a concentração plasmática de hslL-6R é constante (Linhagem 32) (modelo de infusão em estado estacionário).

10 A figura 54 mostra em um gráfico um curso de tempo da concen- tração pIasmática de hslL-6R após a administração de anticorpos antirrecep- tor de IL-6 humana que têm uma variante Fc de F11, F39, F48, e F264 a camundongos transgênicos para FcRn humano nos quais a concentração

W plasmática de hslL-6R é constante (Linhagem 32) (modelo de infusão em 15 estado estacionário). A figura 55 descreve um curso de tempo da concentração plas- mática do anticorpo após a administração de anticorpos antirreceptor de IL- 6 humana que têm uma variante Fc de F157, F196, e F262 a camundongos transgênicos para FcRn humano nos quais a concentração plasmática de 20 hslL-6R é constante (Linhagem 32) (modelo de infusão em estado estacio- nário). A figura 56 descreve um curso de tempo da concentração plas- mática de hslL-6R após a administração de anticorpos antirreceptor de IL-6 humana que têm uma variante Fc de F157, F196, e F262 a camundongos 25 transgênicos para FcRn humano nos quais a concentração piasmática de hslL-6R é constante (Linhagem 32) (modelo de infusão em estado estacio- nário)- Modo para executar a invenção A presente invenção fornece métodos para promover a absorção 30 de antlgeno nas células por moléculas de ligação ao antigeno, métodos para aumentar o número de vezes de ligação ao antígeno por uma molécula de ligação ao antigeno, métodos para promover a redução da concentração de antígenos no plasma pela administração de moléculas de ligação ao antíge- no, e métodos para melhorar a retenção plasmática de uma molécula de li- gação ao antlgeno.

Especificamente, a presente invenção fornece métodos para promover a absorção de antigenos em células por moléculas de ligação 5 ao antigeno, métodos para aumentar o número de vezes de Iigação ao antí- geno por uma molécula de iigação ao antígeno, métodos para promover a redução da concentração de antígenos no pIasma pela administração de moléculas de ligação ao antigeno, e métodos para melhorar a retenção plasmática das moléculas de ligação ao antigeno, todas as quais usam uma 10 molécula de ligação ao antígeno que tem uma atividade de ligação ao antí- geno menor (na presente invenção, algumas vezes chamada de "atividade de ligação") sob uma condição de baixa concentração de cáicio do que uma condição de alta concentração de cálcio. * Aminoácidos 15 Na presente invenção, os aminoácidos são descritos ern códigos de uma ou três letras ou ambos, por exemplo, Ala/A, Leu/L, Arg/R, Lys/k, Asn/N, Met/M, Asp/D, Phe/F, Cys/C, Pro/P, Gln/Q, Ser/S, Glu/E, Thr/T, GIy/G, Trp/W, H1S/H, TyrfV, Ile/l, ou Val/V.

AntÍçjenos 20 Na presente invenção, os "antígenos" não são particularmente limitados na sua estrutura, contanto que eles compreendam epítopos aos quais os dominios de ligação ao antígeno se ligam.

Em outras palavras, os antígenos podem ser substâncias inorgânicas ou orgânicas; e alternativa- mente, os antígenos podem ser substâncias estranhas ou endógenas aos 25 organismos submetidos à administração da presente invenção.

Exemplos de antigenos ligados pelos domínios de ligação ao antigeno das molécuias de ligação ao antígeno cuja farmacocinética é aprimorada pelos métodos da presente invenção incluem. de preferência, antigenos de membrana como proteinas receptoras (receptores ligados à membrana e receptores solúveis) 30 e marcadores de superfície celular; antigenos solúveis como citocinas; e an- tígenos com epítopos presentes apenas em organismos estranhos.

Tais an- tígenos incluem, por exemplo, as seguintes moléculas: 17AA, 4-1 BB, 4Dc,

6-ceto-PGF1a, 8-1so-PGF2a, 8-oxo-dG, Receptor de Adenosina Al, A33, ACE, ACE-2, Activina, Activina A, Activina AB, Activina B, Activina C, Activi- na RIA, Activina RIA ALK-2, Activina RIB ALK-4, Activina RIIA, Activina RIIB, ADAM, ADAMIO, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAM8, ADAM9, 5 ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, Adressinas, adiponectina, ADP ribos j| ci- clase-l, aFGF.

AGE, ALCAM, ALK, ALK-I, ALK-7, alérgeno, al- antiquimiotripsina, al-antitripsina, a-sinucleína, antagonista a-Vl j3-1, amini- na, amilina, amiloide j3, região variável da cadeia pesada de imunoglobulina amiloide, região variável da cadeia leve de imunoglobulina amiloide, Andró- lO geno, ANG, angiotensinogênio, ligante-2 de Angiopoietina, anti-ld, antitrom- bina |||, Antrax, APAF-I, APE, APJ, apo Al, amilóide A do soro apo, Apo- SAA, APP, ABRIL, AR, ARC, ART, Artemina, ASPARTIC, Fator natriurético atrial, Peptideo natriurético atrial, Peptideos natriuréticos atria is A, Peptideos m natriuréticos atriais B, Peptídeos natriuréticos atriais C, av/b3 integrina, Axl, 15 B7-1, B7-2, B7-H, BACE, BACE-I, antígeno protetor de Baci//us anthracis, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-l, BAK, Bax.

BCA-I, BCAM, Bcl, BCMA, BDNF, b- ECGF, [3-2-microglobulina, |3-lactamase, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, Estimulador de linfócitos B (BlyS), BMP, BMP-2 (8MP-2a), BMP-3 (Os- teogenina), BMP-4 (8MP-2b), BMP-5, BMP-6 Ngr-1), BMP-7 (OP-l), BMP-8 20 (8MP-8a), BMPR, BMPR-IA (ALK-3), BMPR-IB (ALK-6), BMPR-II (BRK-3), BMPs, BOK, Bombesina, Fator neurotrófico derivado do osso, hormônio de crescimento bovino, BPDE, BPDE-DNA, BRK-2, BTC, molécula de adesão de células de linfócitos B, ClO, Cl-inibidor, Clq, C3, C3a, C4, C5, C5a(complemento 5a), CA125, CAD-8, Caderina-3, Calcitonina, cAMP, Ani- 25 drase carbônica-lX, antígeno carcioembrionário (CEA), antígeno associado a carcinoma, Cardiotrofina-l, Catepsina A, Catepsina B, Catepsina C/DPPl, Catepsina D, Catepsina E, Catepsina H, Catepsina L, Catepsina O, Catepsi- na S, Catepsina V, Catepsina X/Z/P, CBL, CCl, CCK2, CCL, CCL1/l-309, CCL11/Eotaxina, CCL12/MCP-5, CCL13/MCP-4, CCL14/HCC-1, C- 30 CL15/HCC-2, CCL16/HCC-4, CCL17/TARC, CCL18/PARC, CCL19/ELC, CCL2/MCP-1, CCL20MlP-3-a, CCL21/SLC, CCL22/MDC, CCL23/MPIF-1, CCL24/Eotaxina-2, CCL25/TECK, CCL26/Eotaxina-3, CCL27/CTACK, C-

CL28/MEC, CCL3/M1P-1- a, ccL3L!/LD-78-j3, CCL4/M|P-|-Í3, C-

CL5/RANTES, CCL6/C1O, CCL7/MCP-3, CCL8/MCP-2, CCL9/10/MTP-1-y,

CCR, CCRl, CCRlO, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8,

CCR9, CDl, CDlO, CD105, CD11a, CD11b, CD11C, CD123, CD13, CD137,

5 CD138, CD14, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD15, CD152, CD16,

CD164, CD18, CD19, CD2, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD26, CD27L,

CD28, CD29, CD3, CD30, CD30L, CD32, CD33 (proteínas p67), CD34,

CD37, CD38, CD3E, CD4, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a,

CD49b, CD5, CD51, CD52, CD54, CD55, CD56, CD6, CD61, CD64, CD66e,

10 CD7, CD70, CD74, CD8, CD80 (B7-1), CD89, CD95, CD105, CD158a, CEA,

CEACAM5, CFTR, CGMP, receptor de CGRP, CINC, CKb8-1, Claudina18,

CLC, toxina de Clostn'dium botu/inum, toxina de C/ostn'dium dihici/e, toxina de Clostridium perfringens, c-Met, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-I, fator do * complemento 3 (C3), fator do complemento D, globulina de ligação a corti-

15 coesteróide, Receptor do fator estimulador de colônias 1, COX, C-Ret, CRG-

2, CRTH2, CT-l, CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1/Fractalcina, CX3CR1,

CXCL, CXCLl/Gro-a, CXCLlO, CXCL11/I-TAC, cxcL12/sDF4-a/j3, CX-

CL13/BCA-1, CXCL14/BRAK, CXCL15/Lungcina.

CXCL16, cxcl16, cx-

cL2/gro-j3 CXCL3/Gro-Y, cxcl3, cxcl4/pf4, cxcl5/ena-78, cx-

20 cl6/gcp-2, cxcl7/nap-2, cxcl8/il-8, CXCL9/Mig, CXCLlO/lP-1O, cxcr,

CXCRl, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, cistatina C, antígeno associado a tumor de citoqueratina, DAN, DCC, DCR3, DC-SIGN, Fator ace-

lerador de deterioração, Ligante 4 da proteina similar a delta, des(1-3)-lGF-l

(IGF-I cerebral), Dhh, DHICA oxidase, Dickkopf-l, digoxina, Dipeptidil pepti-

25 dase lV, DKI, DNAM-I, Dnase, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-

Al, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR (Erb8-1), Proteína 7 que contém domínio similar a EGF, Elastase, elastina, EMA, EMMPRIN, ENA, ENA-78, Endosia-

lina, receptor de endotelina, endotoxina, Encefalinase, eNOS, Eot, Eotaxina,

Eotaxina-2, eotaxina, EpCAM, Efrina 82/Eph84, receptor de tirosina quinase

30 Epha2, receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), receptor de

Erb82, receptor de tirosina quinase Erb83, ERCC, eritropoietina (EPO), re-

ceptor de Eritropoietina, E-selectina, ET-I, Exodus-2, proteína F de RSV,

FlO, F11, F12, F13, F5, F9, Fator la, Fator lX, Fator Xa, Fator Vll, fator Vlll, Fator Vlllc, Fas, FcaR, FCER|, FcY||b, FcyRl, FcyRlla, FcyRl(la, FcYR|l[b, FcRn, FEN-I, Ferritina, FGF, FGF-19, FGF.-2, receptor de FGF-2, FGF-3, FGF-8, FGF-ácido, FGF-básico, FGFR, FGFR-3, Fibrina, proteina de ativa- 5 ção de fibroblasto (FAP), fator de crescimento de fibroblasto, fator de cres- cimento de fibrob)asto-1O, fibronectina, FL, FLIP, Flt-3, ligante de FLT3, re- ceptor de Folato, hormônio estimulador de folículos (FSH), Fractalcina (CX3C), cadeia pesada livre, cadeia ieve livre, FZDI, FZDIO, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, G250, Gas 6, GCP-2, GCSF, G- lO CSF, receptor de G-CSF, GD2, GD3, GDF, GDF-I, GDF-15 (MIC-I), GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14/CDMP-1), GDF-6 (BMP-13/CDMP-2), GDF-7 (BMP- 12/CDMP-3), GDF-8 (Miostatina), GDF-9, GDNF, Gelsolina, GFAP, GF-CSF, GFR-a1, GFR-a2, GFR-cÜ, GF-|31, glicoproteína de envelope gH.

GITR, 0

Glucagon, receptor de Glucagon, receptor de peptideo similar ao Glucagon 1, 15 Glut 4, Glutamato carboxipeptidase il, receptores de hormônio de glicoprote- Ína, glicoproteína Hb/llla (GP llb/Hla), Glypican-3, GM-CSF, receptor de GM- CSF, gp130, gp140, gp72, granulócito-CSF (G-CSF), GRO/MGSA, Fator de liberação de hormônio do crescimento, GRO-f3, GRO-y, H. pylori, Hapteno (NP-cap ou NlP-cap), HB-EGF, HCC, HCC 1, glicoproteina de envelope g8 20 de HCMV, HCMV UL, Fator de crescimento hematopoiético (HGF), Hep B gp120, heparanase, cofator de heparina ll, fator de crescimento hepático, antigeno protetor de Bacillus anthracis, glicoproteína E2 do vírus da Hepatite C, Hepatite E, Hepcidina, Herl, Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (Erb8-4), vírus herpes simplex (HSV) glicoproteína g8, HGF, HGFA, Antige- 25 no associado a melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA), envelope proteinas de HlV tais como GP120, HlV MIB gp 120 V3 loop, HLA, HLA-DR, HM1,24, HMFG PEM, HMGB-I, HRG, Hrk, HSP47, Hsp90, glicoproteina gD de HSV, miosina cardíaca humana, citomegalovírus humano (HCMV), hor- mônio de crescimento humano (hGH), albumina do soro humano, ativador 30 de plasminogênio do tipo tecido humano (t-PA), Huntingtin, HVEM, IAP, l- CAM, ICAM-I, ICAM-3, ICE, lCOS, lFN-a, lFN-j3, IFN-y, lgA, receptor de lgA, lgE, IGF, proteínas de ligação de IGF, IGF-I, IGF-1 R, IGF-2, ÍGFBP, IGFR,

IL, IL-1, ÍL-1O, receptores de IL-IO, IL-11, receptores de IL-11, IL-12, recep- tores de IL-12, IL-13, receptores de IL-1 3, IL-15, receptores de IL-15, IL-16, receptores de IL-16, IL-17, receptores de IL-17, IL-1 8 (IGIF), receptores de (L-18, 1L-1a, lL-1j3, receptores de IL-1, IL-2, receptores de IL-2, IL-20, recep- 5 tores de IL-20, IL-21, receptores de IL-21, !L-23, receptores de IL-23, recep- tores de IL-2, IL-3, receptores de IL-3, IL-31, receptores de IL-31, receptores de ÍL-3, ÍL-4, receptores de !L-4, IL-5, receptores de 1L-5, ÍL-6, receptores de IL-6, IL-7, receptores de IL-7, IL-8, receptores de IL-8, IL-9, receptores de IL- 9, complexo imune de imunoglobulina, imunoglobulinas, lNF-a, receptores 10 de INF-a, lNF-j3, receptores de lNF-j3, lNF-y, receptores de [NF-y, IFN tipo-l , receptor de IFN tipo-l, influenza, inibina, Inibina a, Inibina j3, 1NOS, insulina, cadeia A da lnsulina, cadeia B da lnsulina, fator de crescimento similar à ln- sulina 1, fator de crescimento similar à lnsulina 2, proteinas de ligação ao 7 fator de crescimento similar à lnsulina, integrina, integrina a2, integrina a3, 15 integrina a4, integrina a4/{31, integrina a-v/j3-3, integrina a-v/j3-6, integrina a4/f37, integrina a5/j31, integrina a5/j33, integrina a5/j36, integrina a-delta (aV), integrina a-teta, integrina j31, integrina [32, integrina l33(GP||b-|||a), |P-1O, l- TAC, JE, calicreína, calicreína 11, calicreína 12, calicreína 14, calicreína 15, calicreína 2, calicreína 5, calicreína 6, calicreína Ll, calicreina L2, calicreína 20 L3, calicreína L4, calistatina, KC, KDR, Fator de Crescimento de Queratinóci- to (KGF), Fator de Crescimento de Queratinócito-2 (KGF-2), KGF, receptor similar à imunoglobulina killer, ligante kit (KL), Kit tirosina quinase, laminina 5, LAMP, LAPP (Amilina, polipeptídeo de ilhota amilóide), LAP (TGF- 1), peptí- deo associado à latência, TGF-I Latente, TGF-I bpl Latente, LBP, LDGF, 25 LDL, receptor de LDL, LECT2, Lefty, Leptina, hormônio luteinizante (LH), antígeno de Lewis-V, antígeno relacionado a Lewis-Y, LFA-I, LFA-3, recep- tores de LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, lipoproteínas, LlX, LKN, Lptn, L-Selectina, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-I, Tensoativo pulmonar, Hormônio luteinizante, Lin- fotactina, Receptor de Linfotoxina B, receptor de Lisoesfingolipldeo, Mac-l, 30 macrófago-CSF (M-CSF), MAdCAM, MAG, MAP2, MARC, maspina, MCAM, MCK-2, MCP, MCP-l, MCP-2, MCP-3, MCPA, MCP-l (MCAF), M-CSF, MDC, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), megsina, Mer, família de receptor de

MET tirosina quinase, METALOPROTEASES, Glicoproteína de membrana OX2, Mesotelina, receptor de MGDF, MGMT, MHC (HLA-DR), protelna mi- crobiana, MIF, MIG, MlP, MlP-l a, MlP-l B, MlP-3 a, MlP-3 B, MlP-4, MK, MMACI, MMP, MMP-I, MMP-IO, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, 5 MMP-15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, proteína de atração de monócito, fator inibidor de colônia de monócito, peptídeo associ- ado à gonadotropina de camundongo, MPIF, Mpo, MSK, MSP, MUC-16, MUC18, mucina (ML[d), substância de inibição Muelleriana, Mug, MuSk, Gli- coproteina associada à mielina, fator inibidor progenitor mielóide 1 (MPIF-I), 10 NAIP, Nanocorpo, NAP, NAP-2, NCA 90, NCAD, N-Caderina, NCAM, Nepri- lisina, Molécula de adesão de célula neural, neroserpina, Fator de cresci- mento neuronal (NGF), Neurotrofina-3, Neurotrofina-4, Neurotrofina-6, Neu- ropiíina 1, Neurturina, NgF-j3, NGFR, NKG20, hormônio de crescimento hu- . mano N-metionil, nNOS, NO, Nogo-A, receptor de Nogo, proteina não estru- 15 tural tipo 3 (NS3) do vírus da Hepatite C, NOS, Npn, NRG-3, NT, NT-3, NT-4, NTN, OB, OGGl, Oncostatina M, OP-2, OPG, OPN, OSM, receptores de OSM, fatores osteoindutores, osteopontina, OX40L, OX40R, LDL oxidada, p150, p95, PAOPr, hormônio paratireóide, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, P-Caderina, PCNA, PCSK9, PDGF, receptor de PDGF, PDGF-AA, PDGF-AB, 20 PDGF-BB, PDGF-D, PDK-I, PECAM, PEDF, PEM, PF-4, PGE, PGF, PGl2, PGJ2, PIGF, PIN, PLA2, Fator de crescimento de placenta, fosfatase alcali- na placentária (PLAP), lactogênio placentário, inibidor de ativador de plasmi- nogênio 1, fator de crescimento de plaquetas, plgR, PLP, cadeias de poIi glicol de tamanho diferente (por exemplo, PEG-20, PEG-30, PEG40), PP14, 25 precalicreína, proteína prion, procalcitonina, Proteína de morte celular pro- gramada 1. proinsulina, prolactina, Proproteína convertase PC9, prorelaxina, antigeno de membrana específico para a próstata (PSMA), Proteina A, Pro- teína C, Proteina D, Proteína S, Proteína Z, PS, PSA, PSCA, PsmAr, PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, P-selectina ligante de glicoproteina 1, R51, RAGE, RANK, 30 RANKL, RANTES, relaxina, cadeia A de relaxina, cadeia B de relaxina, reni- na, vÍrus sincicial respiratório (RSV) F, Ret, reticulona 4, Fatores reumatói- des, RLI P76, RPA2, RPK-I, RSK, RSV Fgp, SlOO, RON-8, SCF/KL, SCGF,

esclerostina, SDF-I, SDFI a, SDFI j3, SERINA, Amilóide P do Soro, Albu- mina do soro, sFRP-3, Shh, toxina ll similar a Shiga, SIGIRR, SK-l, SLAM, SLPl, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, receptor 1 de esfingosina l- fosfato, ácido lipoteicoico de Staphylococcus, Stat, STEAP, STEAP-II, fator 5 de célula-tronco (SCF), estreptoquinase, superóxido dismutase, sindecan-l, TACE, TACI, TAG-72 (glicoproteina associada a tumor 72), TARC, TB, TCA- 3, receptor a/j3 de células T, TdT, TECK, TEMI, TEM5, TEM7, TEM8, Te- nascina, TERT, fosfatase alcalina simiiar a PLAP testicular, TfR, TGF, TGF-a, TgF-j3, TgF-j3 Pan Específico, TGF-|3 Rll, TGF-f3 Rllb, TgF-j3 Rlll, TGF-f3 Rl (ALK-5), TGF-Í31, TGF-{32, TGF-|33, TGF-|34, TgF-j35, TGF-I, Trombina, trombopoietina (TPO), Receptor de linfoproteina de estroma timico, Ck-l do Timo, hormônio estimulador da tireóide (TSH), tiroxina, globulina de ligação à tiroxina, Tie, T(MP, TIQ, Fator de Tecido, inibidor de protease de fator de tecido, proteina de fator de tecido, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, receptor I de TNF, receptor ll de TNF, TNF-a, TNF-j3, TNF-j32, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSFIOA (TRAIL Rl Apo-2/DR4), TNFRSFIOB (TRAIL R2 DR5/KlLLER/TRlCK-2A/TRlCK-B), TNFRSFIOC (TRAIL R3 DcR1/LIT/TRID), TNFRSFIOD (TRAIL R4 DCR2/TRUNDD), TNFRSFIIA (RANK ODF R/TRANCE R), TNFRSFIIB (OPG OCIF/TRI), TNFRSF12 (TWEAK R FN14), TNFRSF12A, TNFRSF13B (TACI), TNFRSF13C (BAFF R), TN- FRSF14 (HVEM ATAR/HveA/LIGHT R/TR2), TNFRSF16 (NGFR p75NTR), TNFRSF17 (BCMA), TNFRSF18 (GITR AITR), TNFRSF19 (TROY TAJ/TRADE), TNFRSF19L (RELT), TNFRSFIA (TNF Rl CD120a/p55-60), TNFRSFIB (TNF Rll CD120b/p75-80), TNFRSF21 (DR6), TNFRSF22 (Dc- TRAIL R2 TNFRH2), TNFRSF25 (DR3 ApoA/LARD/TR-3/TRAMP/WSL-1), TNFRSF26 (TNFRH3), TNFRSF3 (LTbR TNF RHI/TNFC R), TNFRSF4 (OX40 ACT35/TXGP1 R), TNFRSF5 (CD40 p50), TNFRSF6 (Fas Apo- 1/APT1/CD95), TNFRSF6B (DCR3 M681TR6), TNFRSF7 (CD27), TNFRSF8 (CD30), TNFRSF9 (4-1 BB CD137/ILA), TNFRST23 (DCTRAIL Rl TNFRHI), TNFSFIO (TRAIL Apo-2 Ligante/TL2), TNFSF11 (TRANCE/RANK Ligante ODF/OPG Ligante), TNFSF12 (TWEAK Apo-3 Ligante/DR3 Ligante), TNFSF13 (ABRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS/TALL1/QUEK/TNFSF20),

TNFSF14 (LIGHT HVEM Ligante/LTg), TNFSF15 (TLIANEGI), TNFSF18 (GITR Ligante AITR Ligante/TL6), TNFSFIA (TNF-a Conectina/DIF/TNFSF2), TNFSFIB (TNF-b LTMTNFSFI), TNFSF3 (LTb TNFC/p33), TNFSF4 (OX40 Ligante gp34kXGP1), TNFSF5 (CD40 Ligante 5 CD154/gp39/HlGM1/lMD3/TRAP), TNFSF6 (Fas Ligante Apo-l Ligan- te/APT1 Ligante), TNFSF7 (CD27 Ligante CD70), TNFSF8 (CD30 Ligante CD153). TNFSF9 (4-1 BB Ligante CD137 Ligante), TNF-cx, TNF-j3, TNIL-I, metabólito tóxico, TP-l, t-PA, Tpo, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-RI, TRAIL-R2, TRANCE, receptor de transferrina, fatores de crescimento de transformação (TGF) tais como TGF-a e TgF-j3, Glicoproteína transmembrana NMB, Trans- tiretina, TRF, Trk, TROP-2, Glicoproteína de trofoblasto, TSG, TSLP, Fator de Necrose de Tumor (TNF), antigeno CA 125 associado a tumor, antígeno associado a tumor que expressa carboidrato relacionado com Lewis Y, TWEAK, TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1, Uroquinase, VAP-l, fator de cresci- mento endotelial vascular (VEGF), vaspin, VCAM, VCAM-I, VECAD, VE- Caderina, VE-Caderina-2, VEFGR-I (flt-l), VEFGR-2, receptor de VEGF (VEGFR), VEGFR-3 (flt-4), VEGl, VIM, Antígenos virais, receptor de Vit812, Receptor de vitronectina, VLA, VLA-I, VLA-4, VNR integrina, Fator de von Willebrand (VWF), WIF-I, WNTI, WNTIOA, WNTI OB, WNT11, WNT16, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9B, XCLl, xcL2/scM-I-j3.

XCLl/Linfotactina, XCRl, XEDAR, XIAP, XPD, HMGBI, lgA, Aj3, CD81, CD97, CD98, DDRI, DKKI, EREG, Hsp90, ÍL-17/IL-17R, IL-20/1L-20R, LDL oxidado, PCSK9, precalicreína, RON, TMEM16F, SODl, cromogranina A, cromogranina B, tau, VAPI, cininogênio de alto peso molecular, IL-31, IL- 31R, Nav1.1, Nav1.2, Nav1.3, Nav1.4, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8, Nav1.9, EPCR, Cl, Clq, Clr, Cls, C2, C2a, C2b, C3, C3a, C3b, C4, C4a, C4b, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9, fator B, fator D, fator H, properdina, es- clerostina, fibrinogênio, fibrina, protrombina, trombina, fator tecidual, fator V, fator Va, fa'tor Vll, fator Vlla, fator Vlll, fator Vllla, fator lX, fator lXa, fator X, fator Xa, fator Xl, fator XIa, fator Xll, fator Xlla, fator Xlll, fator Xllla, TFPI, antitrombina lll, EPCR, trombomodulina, TAPI, tPA, plasminogênio, plasmina,

PAl-l, PAl-2, GPC3, Sindecano-l, Sindecano-2, Sindecano-3, Sindecano-4, LPA, e SlP e moléculas receptoras solúveis para um hormônio ou fator de crescimento, que não são ancoradas às células no fluido corpóreo dos orga- nismos. 5 "Epítopo" significa um determinante antigênico em um antígeno, e se refere a um sÍtio antigênico ao qual o dominio de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno aqui apresentada se liga. Desta forma, por exemplo, o epítopo pode ser definido de acordo com sua estrutura. Ater- nativamente, o epítopo pode ser definido de acordo com a atividade de liga- lO ção ao antigeno de uma molécula de ligação ao antígeno que reconhece o epítopo. Quando o antigeno é um peptídeo ou polipeptídeo, o epítopo pode ser especificado pelos resíduos de aminoácido que formam o epitopo. Alter- nativamente, quando o epítopo é uma cadeia de açúcar, o epítopo pode ser

Q especificado por sua estrutura de cadeia de açúcar especifica. 15 Um epltopo linear é um epítopo que contém um epitopo cuja se- quência de aminoácidos primária é reconhecida. Tal epítopo linear contém, tipicamente, pelo menos três e o mais comumente pelo menos cinco, por exemplo, cerca de 8 a 10 ou 6 a 20 aminoácidos na sua sequência específi- ca- 20 Ao contrário do epítopo linear, o "epítopo conformacional" é um epítopo no qual a sequência de aminoácidos primária contendo o epítopo não é o único determinante do epítopo reconhecido (por exemplo, a sequên- cia de aminoácidos primária de um epitopo conformacional não é necessari- amente reconhecida por um anticorpo que define o epítopo)- Os epítopos 25 conformacionais podem conter um número maior de aminoácidos em com- paração aos epítopos lineares, Um anticorpo que reconhece um epítopo conformacional reconhece a estrutura tridimensional de um peptideo ou pro- teína. Por exemplo, quando uma molécula de proteina se dobra e forma uma estrutura tridimensional, as cadeias principais do aminoácido e/ou polipeptí- 30 deo que formam um epítopo conformacional ficam alinhados e o epítopo é tornado passivel de reconhecimento pelo anticorpo. Os métodos para de- terminar as conformações do epítopo incluem, por exemplo, cristalografia de raios X, ressonância magnética nuclear bidimensional, marcação spin de sítio-especifica, e ressonância paramagnética de elétrons, mas não são limi- tados a estes.

Vide, por exemplo Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology (1996), Vol. 66, Morris (ed.). 5 Atividade de liqação Exemplos de um método para avaliar a ligação do epítopo por uma molécula de ligação ao antígeno de teste contendo um domínio de liga- ção ao antigeno de IL-6R são descritos a seguir.

De acordo com os exem- plos abaixo, os métodos para avaliar a ligação do epítopo por uma molécula 10 de ligação ao antigeno de teste contendo um domínlo de ligaçào ao antigeno para um antígeno diferente de ÍL-6R, também podem ser conduzidos apro- . priadamente.

Por exemplo, pode-se confirmar se uma molécula de ligação ao t antigeno de teste contendo um domínio de ligação ao antígeno de IL-6R re- 15 conhece um epítopo linear na molécula de IL-6R, por exemplo, como men- cionado abaixo.

Um peptídeo linear que compreende urna sequência de a- minoácidos que forma o domínio extracelular de ÍL-6R é sintetizada para o propósito acima.

O peptideo pode ser sintetizado quimicamente, ou pode ser obtido por técnicas de engenharia genética usando uma região que codifica 20 a sequência de aminoácidos que corresponde ao dominio extracelular em um cDNA de IL-6R- Então, uma molécula de ligação ao antígeno de teste contendo um dominio de Iigação ao antigeno de IL-6R é avaliada para sua atividade de ligação a um peptídeo linear que compreende a sequência de aminoácidos que forma o domínio extracelular.

Por exemplo, um peptldeo 25 linear imobilizado pode ser usado como um antígeno por ELISA para avaliar a atividade de ligação da molécula de Iigação ao antígeno ao peptideo.

Al- ternativamente, a atividade de ligação a um peptideo linear pode ser avalia- da com base no nível com que o peptídeo linear inibe a ligação da molécula de iigação ao antígeno a células que expressam IL-6R- Estes testes podem 30 demonstram a atividade de ligação da molécula de ligação ao antígeno ao peptídeo linear.

Pode-se avaliar se uma molécula de ligação ao antígeno de tes-

te contendo um domínio de ligação ao antígeno de IL-6R reconhece um epítopo conformacional quando ela se liga fortemente às células que expressam IL-6R mediante contato, mas não se liga substancialmente a um peptídeo linear imobilizado que compreende uma sequência de 5 aminoácidos que forma o domínio extracelular de IL-6R.

Na presente invenção, "não se liga substancialmente" significa que a atividade de ligação é 80% ou menos, geralmente, 50% ou menos, de preferência 30% ou menos, e particularmente, de preferência, 15% ou menos em comparação à atividade de ligação às células que expressam IL-6R humano.

Os métodos para avaliar a atividade de ligação de uma molécula de ligação ao antígeno de teste contendo um domínio de ligação ao antígeno de IL-6R a células que expressam IL-6R incluem, por exemplo, os métodos descritos em Antibodies: A Laboratory Manual (Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 359-420). Especificamente, a avaliação pode ser feita com base no princípio do ELISA ou classificação celular ativa- da por fluorescência (FACS) usando células que expressam IL-6R como an- tígeno.

No formato ELISA, a atividade de ligação de uma molécula de ligação ao antígeno de teste contendo um domínio de ligação ao antígeno de IL-6R às células que expressam IL-6R pode ser avaliada quantitativamente por comparar os níveis de sinal gerado por reação enzimática.

Especificamente, uma molécula de ligação ao antígeno de teste é adicionada a uma placa de ELISA sobre a qual as células que expressam IL-6R são imobilizadas.

Então, a molécula de ligação ao antígeno de teste ligada às células é detectada usando um anticorpo marcado com enzima que reconhece a molécula de ligação ao antígeno de teste.

Alternativamente, quando FACS é usado, uma série de dilui- ções de uma molécula de ligação ao antígeno de teste é preparada, e o título de ligação do anticorpo para células que expressam IL-6R pode ser determinado para comparar a atividade de ligação da molécula de ligação ao antígeno de teste às células que expressam IL-6R. A ligação de uma molécula de ligação ao antígeno de teste a um antígeno expresso sobre a superfície de células suspensas em tampão ou similares, pode ser detectada usando um citômetro de fluxo. Os citômetros 5 de fluxo conhecido incluem, por exemplo, os seguintes dispositivos: FACSCanto"" || FACSAria'" FACSArray'" FACSVantage'" SE 10 FACSCa|iburTM (todos são nomes comerciais da BD Bioscien- ces) EPlCS ALTRA HyPerSort

U Cytomics FC 500 EPlCS XL-MCL ADC EPlCS XL ADC 15 Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC (todos são nomes comer- ciais da Beckman Coulter). Os métodos preferenciais para avaliar a atividade de ligação de uma molécula de ligação ao antígeno de teste contendo um domínio de liga- ção ao antígeno de IL-6R a um antígeno incluem, por exemplo, o seguinte 20 método. Primeiro, células que expressam IL-6R são reagidas com uma mo- lécula de ligação ao antígeno de teste, e, então, elas são coradas com um anticorpo secundário marcado com FITC que reconhece a molécula de liga- ção ao antígeno. A molécula de ligação ao antígeno de teste é diluída apro- priadamente um tampâo adequado para preparar a molécula em uma con- 25 centração desejada. Por exemplo, a molécula pode ser usada em uma con- centração dentro da faixa de 10 µg/ml a 10 ng/ml. Então, a intensidade de fluorescência e a contagem de células são determinadas usando FACSCali- bur (BD). A intensidade de fluorescência é obtida por análise usando pro- grama CELL QUEST (BD), isto é, o valor geométrico médio reflete a quanti- 30 dade de anticorpo ligado às células. Ou seja, a atividade de ligação de uma molécula de ligação ao antígeno de teste, que é representada pela quanti- dade da molécula de ligação ao antígeno de teste ligada, pode ser determi-

nada mediante a medição do valor geométrico médio.

Pode-se avaliar se uma molécula de ligação ao antígeno de tes- te contendo um dominio de ligação ao antígeno de IL-6R compartilha um epítopo comum com outra molécula de ligação ao antígeno com base na 5 competição entre as duas moléculas pelo mesmo epitopo.

A competição en- tre as moléculas de ligação ao antigeno pode ser detectada por um ensaio de bloqueio cruzado ou similares.

Por exemplo, o ensaio ELISA competitivo é um ensaio de bloqueio cruzado de preferência.

Especificamente, no ensaio de bloqueio cruzado, a proteina IL- lO 6R imobilizada aos poços de uma placa de microtitulação é pré-incubada na presença ou ausência de uma moiécula de ligação ao antígeno competidora candidata e, então, uma molécula de ligação ao antigeno de teste é adicio- nada a isso.

A quantidade da molécula de Iigação ao antígeno de teste liga- . da à proteina IL-6R nos poços está correlacionada indiretamente com a ca- 15 pacidade de ligação de uma molécula de ligação ao antígeno competidora candidata que compete pela ligação ao mesmo epítopo.

Ou seja, quanto maior a afinidade da molécula de ligação ao antígeno competidora pelo mesmo epítopo, menor será a atividade de ligação da molécula de ligação ao antígeno de teste aos poços revestidos com a proteína IL-6R. 20 A quantidade da molécula de Iigação ao antígeno de teste ligada aos poços através da proteína IL-6R pode ser facilmente determinada atra- vés de marcação da molécula de ligação ao antigeno antecipadamente- Por exemplo, uma molécula de ligação ao antlgeno marcada com biotina é me- dida usando um conjugado de avidinalperoxidase e um substrato adequado. 25 Em particular, o ensaio de bloqueio cruzado que usa marcadores de enzima como peroxidase é chamado "ensaio ELISA competitivo". A molécula de li- gação ao antígeno também pode ser marcada com outras substâncias de marcação que permitem a detecção ou medição.

Especificamente, radio- marcadores, marcadores fluorescentes, e similares, são conhecidos. 30 Quando a molécula de ligação ao antígeno competidora candi- data pode bloquear a ligação por uma molécula de ligação ao antigeno de teste contendo um domínio de ligação ao antígeno de IL-6R em pelo menos

2O°/j, de preferência ao menos 20 a 50%, e com mais preferência pelo me- nos 50% em comparação à atividade de ligação em um experimento de con- trole conduzido na ausência da molécula de ligação ao antígeno competido- ra, é determinado que a molécula de ligação ao antígeno de teste se liga 5 substancialmente ao mesmo epítopo ligado pela molécula de ligação ao an- tígeno competidora, ou compete pela ligação ao mesmo epítopo. Quando a estrutura de um epitopo Iigado por uma molécula de Iigação ao antigeno de teste contendo um domínio de ligação ao antígeno de ÍL-6R já tiver sido identificada, pode-se avaliar se as moléculas de ligaçào ao 10 antígeno de teste e controle compartilham um epítopo comum através da comparação das atividades de ligação das duas moléculas de ligação ao antígeno a um peptídeo preparado pela introdução de mutações de aminoá- cido no peptídeo que forma o epítopo.

F Para medir as atividades de ligação acima, por exemplo, as ati- 15 vidades de ligação das moléculas de ligação ao antígeno de teste e de con- trole a um peptídeo linear no qual uma mutação é introduzida são compara- das no formato ELISA acima. Além dos métodos ELISA, a atividade de liga- ção ao peptídeo mutante ligado a uma coluna pode ser determinada por fa- zer as moléculas de ligação ao antígeno de teste e de controle fluirem na 20 coluna, e, então, quantificar a molécula de ligação ao antígeno eluída na so- lução de eluição. Os métodos para adsorver um peptídeo mutante a uma coluna, por exemplo, sob a forma de um peptideo de fusão de GST, são co- nhecidos. Alternativamente, quando o epítopo identificado é um epítopo 25 conformacional, pode-se avaliar se as moléculas de ligação ao antigeno de teste e de controle compartilham um epítopo comum por meio do seguinte método. Primeiro, células que expressam IL-6R e células que expressam IL- 6R com uma mutação introduzida no epítopo são preparadas. As moléculas de ligação ao antígeno de teste e de controle são adicionadas a uma sus- 30 pensão de células preparada por suspender estas células em um tampão adequado, como PBS. A seguir, as suspensões de células são lavadas a- propriadamente com um tampão, e um anticorpo marcado com FITC que reconhece as moléculas de ligação ao antígeno de teste e de controle é adi- cionado a elas.

A intensidade de fluorescência e o número de células mar- cadas com o anticorpo marcado são determinados usando FACSCalibur (BD). As moléculas de ligação ao antígeno de teste e de controle são diluí- 5 das apropriadamente usando um tampão adequado, e são usadas nas con- centrações desejadas.

Por exemplo, elas podem ser usadas a uma concen- tração dentro da faixa de 10 µg/ml a 10 ng/ml.

A intensidade de fluorescên- cia é determinada por análise usando programa CELL QUEST (BD), isto é, o valor geométrico médio reflete a quantidade de anticorpo marcado ligado às células.

Ou seja, as atividades de ligação das moléculas de ligação ao antí- geno de teste e de controle, que são representadas pela quantidade de anti- corpo marcado ligado, podem ser determinadas mediante a medição do va- lor geométrico médio.

No método acima, pode-se avaliar se uma molécula de ligação ao antígeno "não se liga substancialmente às células que expressam IL-6R mutante", por exemplo, por meio do seguinte método.

Primeiro, as moléculas de ligação ao antígeno de teste e de controle ligadas às células que expres- sam IL-6R mutante são marcadas com um anticorpo marcado.

Então, a in- tensidade de fluorescência das células é determinada.

Quando FACSCalibur é usado para a detecção da fluorescência por citometria de fluxo, a intensi- dade de fluorescência determinada pode ser analisada usando o programa CELL QUEST.

A partir dos valores médios geométricos na presença e na ausência molécula de ligação ao antígeno, o valor de comparação (∆média- Geo) pode ser calculado de acordo com a seguinte fórmula para determinar a proporção de aumento na intensidade de fluorescência como resultado da ligação pela molécula de ligação ao antígeno. ∆média-Geo= média-Geo (na presença da molécula de ligação ao antígeno)/média-Geo (na ausência da molécula de ligação ao antígeno) O valor de comparação da média geométrica (valor da ∆média- Geo para a molécula de IL-6R mutante) determinado pela análise acima, que reflete a quantidade de uma molécula de ligação ao antígeno de teste ligada às células que expressam IL-6R mutante, é comparado com o valor de com-

paração da Amédia-Geo que reflete a quantidade da molécula de ligação ao antígerio de teste ligada às células que expressam IL-6R. Nesse caso, as concentrações da molécula de ligação ao antigeno de teste usadas para de- terminar os valores de comparação da Amédia-Geo para células que ex- 5 pressam 1L-6R e células que expressam IL-6R mutante são particularmente ajustadas, de preferência, para serem iguais ou substancialmente iguais. Uma molécula de ligação ao antigeno que foi confirmada como reconhecen- do um epitopo em IL-6R é usada como uma molécula de ligação ao antigeno de controle. 10 Se o valor de comparação da Amédia-Geo de uma molécula de ligação ao antigeno de teste para células que expressam o IL-6R mutante for

W menor que o valor de comparação da Ljmédia-Geo da molécula de ligação ao antigeno de teste para células que expressam IL-6R em pelo menos 80°6, * de preferência 5Õ°/o, com mais preferência, 3Õ°/o, e particularmente, de prefe- 15 rência, 15% então, a molécula de ligação ao antigeno de teste "não se liga substancialmente às células que expressam IL-6R mutante". A fórmula para determinar o valor da média-Geo (média geométrica) está descrita no guia do usuário do programa CELL QUEST (BD biosciences). Quando a compa- ração mostra que os valores de comparação são substancialmente equiva- 20 lentes, pode-se determinar que o epitopo para as moléculas de ligação ao antigeno de teste e de controle é o mesmo Domínio de ligação ao antíqeno Na presente invenção, um "domínio de ligação ao antígeno" po- de ter qualquer estrutura contanto que ele se ligue a um antigeno de interes- 25 se. Tais domínios incluem, de preferência, por exemplo: regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve do anticorpo; um módulo de cerca de 35 aminoácidos chamado dominio A que está contido na proteína de membrana celular in v/'vo Avimero (WO 2004/044011, WO 2005/040229); 30 Adnectina contendo o domínio 1OFn3 que se liga à porção de proteína da fibronectina, uma glicoprotelna expressa sobre a membrana ce- lular (WO 2002/032925):

Um aficorpo que é composto por um feixe de três hélices com 58 aminoácidos com base na estrutura do dominio de ligação à lgG da proteina A (WO 1995/001937); Proteínas de repetição de anquirina projetadas (DARPins) que 5 são uma região exposta na superficie molecular das repetições de anquirina (AR) que têm uma estrutura na qual uma subunidade que consiste em uma volta compreendendo 33 resíduos de aminoácido, duas hélices anti- paralelas, e um laço é repetidamente empilhada (WO 2002/020565); Anticalinas e similares, que são dominios que consistem em 10 quatro laços que suportam um Iado de uma estrutura de cilindro composta por oito fitas antiparalelas dispostas circularmente que são altamente con- servadas entre as moléculas de lipocalina como lipocalina associada à gela-

b tinase de neutrófilo (NGAL) (WO 2003/029462): e A região côncava formada pela estrutura de folha paralela dentro 15 da estrutura com formato de ferradura constituida por repetições empilhadas do módulo de repetições ricas em Ieucina (LRR) do receptor de linfócito vari- ável (VLR) que não tem a estrutura da imunoglobulina e é usada no sistema de imunidade adquirida em vertebrados sem mandíbulas como o peixe lam- pery and congro (WO 2008/016854). Os dominios de ligação ao antigeno 20 preferenciais da presente invenção incluem, por exemplo, aqueles tendo re- giões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve do anticorpo.

Os exem- plos preferenciais de domínios de ligação ao antigeno incluem "Fv de cadeia única (scFv)", "anticorpo de cadeia única", "Fv", "Fv 2 de cadeia única (SCFV2)", "Fab", e "F(ab')2". 25 Os domínios de ligação ao antígeno das moléculas de ligação ao antigeno da presente invenção podem se Iigar a um epitopo idêntico.

Tal epitopo pode estar apresentar, por exemplo, em uma proteina que compre- ende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15. Alternativamente, o epitopo pode estar presente na proteína que compreende os aminoácidos 30 nas posições 20 a 365 na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15. Alternativamente, cada um dos domínios de ligação ao antígeno das molécu- las de ligação ao antígeno da presente invenção pode se ligar a um epítopo diferente.

Na presente invenção, o epitopo diferente pode estar presente, por exemplo, em uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15. Alternativamente, o epítopo pode estar presente na proteina que compreende os aminoácidos nas posições 20 a 365 na sequência de 5 aminoácidos da SEQ ID NO: 15. Motivo de liqação ao cálcio O dominio de Iigação ao antigeno de uma molécula de ligação ao antígeno da presente invenção compreende um motivo de ligação ao cál- cio.

O motivo de ligação ao cálcio pode estar situado em qualquer local den- lO tro do domínio de ligação ao antígeno contanto que a atividade de ligação ao antigeno seja menor sob uma condiçào de baixa concentração de cálcio do - que sob uma condição de alta concentração de cálcio.

Quando o domínio de ligação ao antigeno é uma região variável do anticorpo, o motivo de Iigação e ao cálcio pode estar contido na região variável da cadeia pesada ou na regi- 15 ão variável da cadeia leve.

Alternativamente, o motivo de Iigação ao cálcio pode estar contido em ambas as cadeias pesadas e cadeias leves.

Em uma outra modalidade não-limitadora, o motivo de Íigação ao cálcio podem estar contido na sequência estrutural ou de CDR da região variável.

Alternativa- mente, o motivo de ligação ao cálcio pode estar contido em ambas as se- 20 quências estrutural e de CDR.

Em uma rnodalidade não-limitadora da presente invenção, o mo- tivo de ligação ao cálcio compreende um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno depen- dendo da condição da concentração iônica do cálcio.

Tais resíduos de ami- 25 noácido incluem, de preferência, por exemplo, aminoácidos que têm uma atividade quelante de metal.

Os aminoácidos que têm uma atividade quelan- te de metal incluem, de preferência, por exemplo, serina (Ser (S)), treonina (Thr (T)), asparagina (Asn (N)), glutamina (Gln (Q)), ácido aspártico (Asp (D)), ácido glutâmico (GIu (E)), histidina (His (H)), e tirosina (Tyr (Y)). Os mo- 30 tivos de ligação ao cálcio nos dominios de ligação ao antigeno existentes que possuem uma menor atividade de ligação ao antigeno sob uma condi- ção de baixa concentração de cálcio do que sob uma condição de alta con-

centraçâo de cálcio podem ser usados como um motivo de ligaçào ao cálcio adequado da presente invenção. Como exemplos de tais domínios de liga- ção ao antígeno existentes, motivos de ligação ao cálcio nas regiões variá- veis dos anticorpos que têm uma atividade de ligação ao antígeno menor 5 sob uma condição de baixa concentração de cálcio do que sob uma condi- ção de alta concentração de cálcio podem, de preferência, ser usados; mas não são limitados a estes. Tais anticorpos incluem, mas não se limitam a, por exemplo, anticorpos para o receptor de IL-6 que compreendem as SEQ ID NOS: 1 e 2 e anticorpos para 1L-6 que compreendem as SEQ ID NOS: 25 e 10 26. Além disso, troponina C, calmodulina, parvalbumina, cadeia Ieve de mio- sina, e siniilares, que têm vários sÍtios de ligação ao Íon de cálcio e acredita- se que sejam derivadas de uma origem comum na sua evolução molecular,

Y são conhecidas. Seus motivos de ligação também podem ser usados como um motivo de ligação ao cálcio da presente invenção. 15 Quando um domínio de Iigação ao antígeno da presente inven- ção é uma região variável do anticorpo, o motivo de ligação ao cálcio pode estar contido na sua região variável da cadeia pesada ou na região variável da cadeia leve. Alternativamente, o motivo de ligação ao cálcio pode estar contido em ambas as cadeias pesadas e cadeias leves. Em uma outra mo- 20 dalidade nãojimitadora, o motivo de ligação ao cálcio podem estar contido na sequência estrutural ou de CDR da região variávei Alternativamente, o motivo de ligação ao cálcio pode estar contido em ambas as sequências es- trutural e de CDR. As CDRI, CDR2 e/ou CDR3 de cadeia pesada ou de ca- deia leve podem ser projetadas de modo a compreenderem tais motivos de 25 ligação ao cálcio. Por exemplo, em uma modalidade não-limitadora da pre- sente invenção, a região variável da cadeia leve de uma molécula de ligação ao antigeno da presente invenção pode ser projetada de modo a conter o motivo de ligação ao cálcio da região variável da cadeia leve do anticorpo humano da SEQ ID NO: 41, 63, ou 64. Tais motivos de ligação ao cálcio in- 30 cluem aqueles nos quais qualquer um ou mais dos aminoácidos nas posi- ções 30, 31, 32, 50, e/ou 92 de acordo com a numeração de Kabat têm uma atividade quelante de metal. Em uma modalidade não-limitadora, tais moti-

vos de ligação ao cálcio incluem, de preferência, aqueles nos quais aminoá- cidos iguais a um a quatro aminoácidos selecionados a partir dos cinco ami- noácidos nas posições 30, 31, 32, 50, elou 92, de acordo com o sistema de numeração de Kabat, da região variável da cadeia leve do anticorpo humano 5 da SEQ ID NO: 41, 63, ou 64 estão contidos nas posições de aminoácido correspondentes de acordo com o sistema de numeração de Kabat.

Nesse caso, é preferencial que os aminoácidos que têm uma atividade quelante de meta! estejam contidos na região variáve) da cadeia leve do anticorpo huma- no da SEQ ID NO: 41, 63, ou 64 nas posições de aminoácido onde os ami- lO noácidos nas posições de aminoácido correspondentes das cinco posições de aminoácido 30, 31, 32, 50, e/ou 92 de acordo com sistema de numeração de Kabat na região variável da cadeia leve não são idênticos aos aminoáci- dos nestas posições.

Em uma outra modalidade não-limitadora da presente * invenção, a região variável da cadeia pesada de uma molécula de ligação ao 15 antigeno da presente invenção pode ser projetada para ter, por exemplo, o motivo de ligação ao cálcio da região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 1. Tais motivos de ligação ao cálcio incluem aqueles nos quais os ami- noácidos nas posições 95, 96, e/ou lOOa de acordo com o sistema de nume- ração de Kabat têm uma atividade quelante de metal.

Em uma outra modali- 20 dade não-limitadora da presente invenção, a região variável da cadeia pesa- da de uma molécula de ligação ao antígeno da presente invenção pode ser projetada para ter, por exemplo, o motivo de ligação ao cálcio da região vari- ável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 25. Tais motivos de ligação ao cálcio incluem aqueles nos quais os aminoácidos nas posições 95 e/ou 101 de a- 25 cordo com o sistema de numeração de Kabat têm uma atividade quelante de metal- Os aminoácidos que têm uma atividade quelante de metal incluem, por exemplo, serina (Ser (S)), treonina (Thr (T)), asparagina (Asn (N)), glu- tamina (Gln (Q)), ácido aspártico (Asp (D)), ácido glutâmico (Glu (E)), histidi- na (His (H)), e tirosina (Tyr (Y)). Além disso, os grupos carbonila da cadeia 30 principal dos aminoácidos nas posições descritas acima podem participar na ligação ao ion de cálcio.

Surpreendentemente, conforme descrito nos exem- pIos abaixo, a atividade de ligação ao Íon de cálcio pode ser conferida a um domínio de iigação ao antígeno de interesse por enxertar aminoácidos de um motivo de ligação ao cálcio ao domínio de ligação ao antígeno.

Também é possivel usar apropriadamente uma mão EF, que está contida no domínio de caderina e calmodulina; domínio C2, que está contido na protelna quina- 5 se C: dominio Gla, que está contido na proteína de coagulação sanguinea fator lX; Iectina de tipo C, que está contida no receptor de aciaroglicoproteí- na e receptor de ligação à manose; dominio A, que está contido no receptor de LDL; anexina, domínio 3 tipo trombospondina, e domínio similar a EGF.

Especificidade 10 "Específico" significa que uma molécula não mostra qualquer li- gação significativa a moléculas que não uma única ou inúmeras moléculas parceiras de ligação.

Além disso, "especifico" também é usado quando um domínio de ligação ao antígeno é específico para um epítopo particular den- . tre múltiplos epítopos em um antígeno.

Quando um epítopo ligado por um 15 domínio de ligação ao antigeno está contido em múltiplos antígenos diferen- tes, as moléculas de ligação ao antígeno contendo o domínio de ligação ao antígeno podem se ligar a vários antigenos que possuem o epítopo.

Anticorpo Na presente invenção, "anticorpo" se refere a uma imunoglobuli- 20 na natural ou uma imunoglobulina produzida por sÍntese parcial ou completa.

Os anticorpos podem ser isolados de fontes naturais como plasma e soro de ocorrência natural, ou sobrenadantes de cultura de hibridomas produtores de anticorpo- Alternativamente, os anticorpos podem ser sintetizados parcial ou completamente usando técnicas como recombinação genética.

Os anticor- 25 pos preferenciais incluem, por exemplo, anticorpos de um isotipo ou sub- classe de imunoglobulina que pertence a isso.

As imunoglobulinas humanas conhecidas incluem anticorpos das nove classes a seguir (isotipos): lgGl, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1, IgA2, lgD, lgE, e lgM.

Destes isotipos, os anticorpos da presente invenção incluem lgGl, lgG2, lgG3, e lgG4. 30 Os métodos para produzir um anticorpo com a atividade de liga- ção desejada são conhecidos pelos versados na técnica.

Abaixo está um exemplo que descreve um método para produzir um anticorpo que se liga ao

IL-6R (anticorpo anti-lL-6R). Anticorpos que se ligam a antígeno diferente de ' IL-6R também podem ser produzidos de acordo com o exemplo descrito a seguir.

Os anticorpos anti-lL-6R podem ser obtidos como anticorpos po- 5 liclonais ou monoclonais usando métodos conhecidos.

Os anticorpos anti-lL- 6R produzidos são, de preferência, anticorpos monoclonais derivados de mamíferos.

Tais anticorpos monoclonais derivados de mamifero incluem an- ticorpos produzidos por hibridomas ou células hospedeiras transformadas com um vetor de expressão que transporta um gene do anticorpo por técni- lO cas de engenharia genética. "Anticorpos humanizados" ou "anticorpos qui- méricos" estão incluidos nos anticorpos monoclonais da presente invenção.

Os hibridomas produtores de anticorpo monoclonal podem ser produzidos usando técnicas conhecidas, por exemplo, conforme descrito abaixo.

Especificamente, mamíferos são imunizados por métodos de imuni- zação convencionais usando uma proteina IL-6R como um antígeno de sen- sibilização.

As células imunes resultantes são fundidas com células paren- tais conhecidas por métodos de fusão celular convencionais.

Então, os hibri- domas que produzem um anticorpo anti-lL-6R podem ser selecionados por triagem das células produtoras de anticorpo monoclonal usando métodos de triagem convencionais.

Especificamente, os anticorpos monoclonais são preparados conforme mencionado abaixo.

Primeiro, o gene de il-6r cuja sequência de nucleotideos é revelada na SEQ ID NO: 16 pode ser expresso para produzir uma proteína IL-6R mostrada na SEQ ID NO: 15, que será usada como um antígeno de sensibilização para a preparação do anticorpo.

Ou seja, uma sequência gênica que codifica IL-6R é inserida em um vetor de expressão de conhecido, e as células hospedeiras adequadas são transformadas com este vetor.

A proteína IL-6R humana desejada é purificada a partir das células hospedeiras ou seus sobrenadantes de cultura por métodos conhecidos.

De modo a obter IL-6R solúvel a partir dos sobrenadantes de cultura, por exem- plo, uma proteína que consiste nos aminoácidos nas posições 1 a 357 na sequência de polipeptídeos de IL-6R da SEQ ID NO: 15, tal como descrito em Mullberg et al- (J. lmmunol. (1994) 152 (10), 4958-4968), é expressa co- mo um ÍL-6R solúvel, ao invés da proteína IL-6R da SEQ ID NO: 15. A prote- Ína IL-6R natural purificada também pode ser usada como um antigeno de sensib j] ização- 5 A proteína IL-6R purificada pode ser usada como um antigeno de sensibilização para imunização de mamíferos. Um peptideo de IL-6R par- cial pode, também, ser usada como um antígeno de sensibiiização. Nesse caso, um peptídeo parcial pode ser preparado por síntese química com base na sequência de amjnoácIdos do IL-6R humano, ou por inserir um gene IL- lO 6R parcial em um vetor de expressão para expressão. Alternativamente, um peptídeo parciai pode ser produzido por degradar uma proteina IL-6R com uma protease. O comprimento e a região do peptídeo de IL-6R parcial não se limitam a modalidades específicas. Uma região preferencial pode ser se- . lecionada arbitrariamente a partir da sequência de aminoácidos nas posi- 15 ções de aminoácido 20 a 357 na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:

15. O número de aminoácidos que formam um peptídeo a ser usado como um antígeno de sensibilização é, de preferência, pelo menos cinco ou mais, seis ou mais, ou sete ou mais- Mais especificamente, um peptídeo com 8 a 50 resíduos, com mais preferência, 10 a 30 resíduos pode ser usado como 20 um antígeno de sensibilização.

Para o antígeno de sensibilização, alternativamente, é possível usar uma proteina de fusão preparada por fundir um polipeptideo ou pepti- deo parcial desejado da proteína IL-6R com um polipeptídeo diferente. Por exemplo, fragmentos Fc do anticorpo e marcadores de peptídeo são usados, 25 de preferência, para produzir proteínas de fusão a serem usadas como antí- genos de sensibilização. Os vetores para expressão de tais proteínas de fusão podem ser construídos por fundir na estrutura genes que codificam dois ou mais fragmentos do polipeptídeo desejado e inserir o gene de fusão em um vetor de expressão, conforme descrito acima. Métodos para produzir 30 proteinas de fusão são descritos em Molecular CIoning 2" ed- (Sambrook, J et al., Molecular Cloning 2" ed., 9.47-9.58 (1989) Cold Spring Harbor Lab.

Press)- Os métodos para preparar IL-6R para ser usada como um antígeno de sensibilização, e métodos de imunização usando IL-6R são descritos es- pecificamente nos WO 2003/000883, WO 2004/022754, WO 2006/006693, e similares.

Não há limitação especifica aos mamíferos a serem imunizados 5 com o antigeno de sensibilização.

Entretanto, é preferencial selecionar os mamíferos por considerar sua compatibiiidade com as células progenitoras a serem usadas para a fusão celular.

Em geral, roedores como camundongos, ratos, e hamsters, coelhos, e macacos são preferencialmente usados.

Os animais acima são imunizados com um antígeno de sensibili- lO zação por métodos conhecidos.

Em geral, os métodos de imunização feitos incluem, por exemplo, a administração intraperitoneal ou subcutânea de um antígeno de sensibilização nos mamíferos.

Especificamente, um antigeno de sensibilização é dilu ido apropriadamente com PBS (solução salina tampona- . da com fosfato), solução salina fisiológica, ou similares.

Se for desejado, um 15 adjuvante convencionai como adjuvante completo de Freund é misturado com o antigeno, e a mistura é emulsionada.

A seguir, o antigeno de sensibi- lização é administrado a um mamífero várias vezes em intervalos de 4 a 21 dias.

Veículos adequados podem ser usados na imunização com o antígeno de sensibilização.

Em particular, quando um peptideo parcial de baixo peso 20 molecular é usado como o antigeno de sensibilização, é algumas vezes de- sejável acoplar o peptídeo do antígeno de sensibilização a uma proteina car- readora como albumina ou hemocianina do molusco keyhole limpet para a imunização.

Altemativamente, hibridomas que produzem um anticorpo dese- 25 jado podem ser preparados usando imunização com DNA, como menciona- do abaixo.

A imunização com DNA é um método de imunização que confere estimulação imunológica mediante expressão de um antígeno de sensibiliza- ção em um animal imunizado como um resultado da administração de um vetor de DNA construído para permitir a expressão de um gene que codifica 30 a proteína do antígeno no animal.

Em comparação aos métodos de imuniza- ção convencionais rios quais um antígeno proteico é administrado aos arii- mais a serem imunizados, espera-se que a imunização com dna seja supe-

rior em que: - estimulação imunológica pode ser fornecida enquanto se man- tém a estrutura de uma proteina membrânica como IL-6R; e - não há necessidade de purificar o antigeno para imunizaçãob 5 De modo a preparar um anticorpo monoclonal da presente in- venção usando imunização com DNA, primeiro, um DNA que expressa uma proteina IL-6R é administrado a um animal a ser imunizado. O DNA que co- difica IL-6R pode ser sintetizado por métodos conhecidos como PCR. O DNA obtido é inserido em um vetor de expressão adequado, e, então, ele é 10 administrado a um animal a ser imunizado. De preferência, os vetores de expressão usados incluem, por exemplo, vetores de expressão disponiveis comercialmente como pcDNA3.1. Os vetores podem ser administrados a um

F organismo usando métodos convencionais. Por exemplo, a imunização com DNA é feita pelo uso de um arma de genes para introduzir as partículas de 15 ouro revestidas com vetor de expressão em células no corpo de um animal a ser imunizado. Os anticorpos que reconheceram IL-6R também podem ser produzidos pelos métodos descritos no WO 2003/104453. Após imunizar um mamífero, conforme descrito acima, o aumen- to no título de um anticorpo de ligaçâo a IL-6R é confirmado no soro- A se- 20 guir, as células imunes são coletadas do mamifero, e, então, submetidas à fusão celular. Em particular, esplenócitos são usados, de preferência, como células imunes. Uma célula de mieloma de mamifero é usada como uma célula a ser fundida com as células imunes acima mencionadas. As células de mie- 25 loma compreendem, de preferência, um marcador de seleção adequado pa·- ra triagem. Um marcador de seleção confere caracteristicas às células para sua sobrevivência (ou morte) sob uma condição de cultura específica. Defi- ciência em hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (deste ponto em dian- te no presente documento abreviada como deficiência de HGPRT) e defici- 30 ência em timidina quinase (deste ponto em diante no presente documento abreviada como deficiência de TK) são conhecidos como marcadores de seleção. Células com deficiência de HGPRT ou TK têm sensibilidade à hipo-

xantina-aminopterina-timidina (deste ponto em diante no presente documen- to abreviada como sensibiiidade à HAT). As células senslveis à HAT não sin- tetizam o DNA em um meio de seleção com HAT e são então mortas.

Entre- tanto, quando as células são fundidas com células normais, elas podem con- 5 tinuar a sÍntese de DNA usando a via de salvamento das células normais e, portanto, elas podem crescer mesmo no meio de seleção de HAT.

As células deficientes em HGPRT e deficientes em TK podem ser selecionadas em um meio contendo 6-tioguanina, B-azaguanina (deste ponto em diante no presente documento abreviada como 8AG), ou 5'- 10 bromodeoxiuridina, respectivamente.

As células normais são mortas porque elas incorporam estes análogos de pirimidina no seu DNA.

Entretanto, célu- las que são deficientes nestas enzimas podem sobreviver no meio de sele-

r ção, uma vez que elas não podem incorporar estes análogos de pirimidina.

Além disso, um marcador de seleção chamado de resistência à G418 forne- 15 cido pelo gene de resistência à neomicina confere resistência aos antibióti- cos de 2-desoxiestreptamina (análogos de gentamicina). Diversos tipos de células de mieloma que são adequadas para fusão celular são conhecidos.

Por exemplo, células de mieloma que incluem as seguintes céiu- las pode ser preferencialmente usadas: 20 P3(P3x63Ag8.653) (Jb lmmunol. (1979) 123 (4), 1548-1550); P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and lmmunology (1978)81, 1-7); NS-l (C.

Eur.

J. lmmunol. (1976)6 (7), 511-519); MPC-11 (Cell (1976) 8 (3), 405-415); 25 SP2/0 (Nature (1978) 276 (5685), 269-270); FO (J. lmmunol.

Methods (1980) 35 (1-2), 1-21); S194/5.XXO.BU.1 (J.

Exp.

Med. (1978) 148 (1), 313-323); R210 (Nature (1979) 277 (5692), 131-133), etc.

Fusões celulares entre os imunócitos e células de mieloma são 30 essencialmente executadas usando métodos conhecidos, por exemplo, um método por Kohler e Milstein et al. (Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46). Mais especificamente, a fusão celular pode ser executada, por

S

?

*

exemplo, em um meio de cuítura convencional na presença de um agente promotor de fusào celular.

Os agentes promotores de fusão incluem, por e- xemplo, polietileno glicol (PEG) e vírus Sendai (HVJ). Se necessário, uma substância auxiliar como sulfóxido de dimetila também é adicionada para 5 aprimorar a eficiência da fusão.

A razão entre as células imunes e as células de mieloma pode ser determinada como desejado, de preferência, por exemplo, uma célula de mleloma para cada um a dez imunócitos.

Os meios de cultura a serem usa- dos para as fusões celulares incluem, por exemplo, meios que são adequa- lO dos para o cultivo de linhagens celulares de mieloma, como meio RPMI1640 e meio MEM, e outro meio de cultura convencional usado para este tipo de cultura celular.

Além disso, suplemento de soro como soro fetal de bovino (FSB) pode ser adicionado, de preferência, ao meio de cultura. . Para a fusão celular, quantidades predeterminadas das células 15 imunes acima e células de mieloma são bem misturadas no meio de cultura acima.

A seguir, uma solução de PEG (por exemplo, o peso molecular médio é cerca de 1.000 a 6.000) pré-aquecida para cerca de 37°C é adicionada a isto a uma concentração de geralmente 30% a 60% (p/v). lsto é suavemente misturado para produzir as células de fusão desejadas (hibridomas). A se- 20 guir, um meio de cultura adequado acima mencionado é adicionado gradu- almente às células, e ele é centrifugado repetidamente para remover o so- brenadante.

Desta forma, agentes de fusão celular e similares que são des- favoráveis para o crescimento do hibridoma podem ser removidos.

Os hibridomas assim obtidos podem ser selecionados por cultu- 25 ra usando um meio seletivo convencional, por exemplo, meio HAT (um meio de cultura contendo hipoxantina, aminopterina, e timidina). Células diferentes dos hibridomas desejados (células não-fundidas) podem ser mortas por cul- tura continua no meio HAT acima por um período de tempo suficiente.

Tipi- camente, o período é vários dias a várias semanas.

A seguir, os hibridomas 30 que produzem o anticorpo desejado são selecionados e clonados de modo único por métodos de diluição limitante convencionais.

Os hibridomas assim obtidos podem ser selecionados usando

M

W um meio de seleção com base no marcador de seleção possuido pelo mie- loma usado para a fusão celular. Por exemplo, células deficientes em HG- PRT ou TK podem ser selecionadas por cultura usando o meio HAT (um meio de cultura contendo hipoxantina, aminopterina, e tiniidina). Especifica- 5 mente, quando as células de mieloma sensiveis a HAT são usadas para a fusão celular, as células fundidas de forma bem-sucedida com as células normais podem proliferar seletivamente no meio HAT. Células diferentes dos hibridomas desejados (células não-fundidas) podem ser mortas por cultura continua no meio HAT acima por um período de tempo suficiente. Especifi- lO camente, os hibridomas desejados podem ser selecionados por cultura ge- ralmente por vários dias até várias semanas. A seguir, os hibridomas que produzeni o anticorpo desejado são selecionados e clonados de modo único por métodos de diluição limitante convencionais. Os anticorpos desejados podem ser, de preferência, seleciona- 15 dos e clonados isoladamente por métodos de triagem com base na reação antigeno/anticorpo conhecida. Por exemplo, um anticorpo monoclonal liga·- ção a (L-6R pode se ligar à IL-6R expressa sobre a superficie celular. Tal anticorpo monoclonal pode ser selecionado por seleção de célula ativada por fluorescência (FACS). O FACS é um sistema que avalia a ligação de um an- 20 ticorpo a uma superfície celular pela análise das células colocadas em con- tato com um anticorpo fluorescente usando um feixe de laser, e medindo a fluorescência emítida pelas células individuais. Para selecionar hibridomas que produzem um anticorpo mono- clonal da presente invenção por FACS, células que expressam IL-6R são 25 primeiro preparadas. As células preferencialmente usadas para a seleção são células de mamifero nas quais a IL-6R é expressa de forma forçada. Como controle, a atividade de um anticorpo de se iigar a IL-6R da superficie celular pode ser detectada seletivamente usando células de mamífero não- transformadas como células hospedeiras. Especificamente, hibridomas que 30 produzem um anticorpo monoclonal anti-lL-6R podem ser isolados pela se- leção de hibridomas que produzem um anticorpo que se liga às células for- çadas a expressar IL-6R, mas não às células hospedeiras.

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-

Alternativamente, a atividade de um anticorpo de se ligar às cé- lulas que expressam IL-6R imobilizadas pode ser avaliada com base no princípio do ELISA.

Por exemplo, células que expressam IL-6R são imobili- zadas aos poços de uma pIaca de ELISA.

Os sobrenadantes de cultura dos 5 hibridomas são colocados em contato com as célu)as jmobj]jzadas nos po- ços, e os anticorpos que se ligam às céiulas imobilizadas são detectados.

Quando os anticorpos monoclonais são derivados de camundongo, anticor- pos ligados às células podem ser detectados usando um anticorpo de imu- noglobulina anticamundongo.

Os hibridomas que produzem um anticorpo 10 desejado que possui a capacidade de ligação ao antígeno são selecionados pela triagem acima, e eles podem ser clonados por um método de diluição limitante ou similares.

Os hibridomas produtores de anticorpo monoclonal assim prepa- . rados podem ser subcultivados em um meio de cultura convencional, e ar- 15 mazenados em nitrogênio líquido durante um longo período.

Os hibridomas acima são cultivados por um método convencio- nal, e os anticorpos monoclonais desejados podem ser preparados a partir dos sobrenadantes de cultura.

Alternativamente, os hibridomas são adminis- trados e cultivados em mamíferos compatíveis, e os anticorpos rnonoclonais 20 são preparados a partir da ascite.

O método anterior é adequado para prepa- rar anticorpos com alta pureza.

Anticorpos codificados por genes de anticorpo que são clonados a partir de células que produzem anticorpos como os hibridomas acima tam- bém podem ser preferencialniente usados- Um gene de anticorpo cIonado é 25 inserido em um vetor adequado, e ele é introduzido em um hospedeiro para expressar o anticorpo codificado pelo gene.

Os métodos para isolar genes de anticorpo, inserir os genes em vetores, e transformar células hospedeiras já foram estabelecidos, por exemplo, por Vandamme et al. (Eur.

J.

Biochem. (1990) 192(3), 767-775). Métodos para produzir anticorpos recombinantes 30 também são conhecidos, conforme descrito abaixo.

Por exemplo, um cDNA que codifica a região variável (região V) de um anticorpo anti-IL-6R é preparado a partir de células de hibridoma que

A expressam o anticorpo anti-lL-6R.

Para este propósito, o RNA total é primei- ro extraído dos hibridomas.

Os métodos usados para a extração de mRNAs das células incluem, por exemplo: - o método de ultracentrifugação de guanidina (Biochemistry 5 (1979) 18(24), 5294-5299), e - o método de AGPC (Anal Biochem. (1987) 162(1), 156-159) Os mRNAs extraídos podem ser purificados usando o kit de puri- ficação de mRNA (GE Healthcare Bioscience) ou similares.

Alternativamente, kits para extrair mRNA total diretamente das células, como o kit de purifica- lO ção de mRNA QuickPrep (GE Healthcare Bioscience) também são comerci- almente disponíveis.

Os mRNAs podem ser preparados a partir de hibrido- . mas que usam tais kits.

Os cDNAS que codificam a região V do anticorpo podem ser sintetizados a partir dos mRNAs preparados usando uma trans- . criptase reversa.

Os cDNAS podem ser sintetizados usando o kit de sÍntese 15 de CDNA primeira fita de transcriptase reversa AMV (Seikagaku Co.) ou simi- Íares.

Além disso, o kit de amplificação de cDNA SMART RACE (Clontech) e o método 5'-RACE baseado em PCR (Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA (1988) 85(23), 8998-9002; Nucleic Acids Res. (1989) 17(8), 2919-2932) podem ser apropriadamente usados para sintetizar e amplificar CDNAS.

Em tal processo 20 de sintese de cDNA, os sÍtios de enzima de restrição adequados descritos a seguir podem ser introduzidos em ambas as extremidades de um cDNA- O fragmento de cDNA de interesse é purificado a partir do pro- duto de PCR resultante, e, então, ele é ligado a um DNA vetor.

O vetor re- combinante é então construido, e introduzido em E. coli ou simiiares.

Após 25 seleção de colônia, o vetor recombinante desejado pode ser preparado a partir da E.

Co/i formadora de colônia.

A seguir, testa-se se o vetor recombi- nante tem a sequência de nucleotideos de cDNA de interesse por um méto- do conhecido como o método de terminação de cadeia com nucleotídeo di- desóxi. 30 O método 5'-RACE que usa iniciadores para amplificar o gene da região variável é usado convenientemente para isolar o gene que codifica a região variável.

Primeiro, uma biblioteca de CDNA 5'-RACE é construida por sintese de CDNA usando RNAs extraídos de células de hibridoma como um molde.

Um kit disponível para comercialização como o kit de amplifica- ção de CDNA SMART RACE é usado apropriadamente para sintetizar a bi- blioteca de CDNA 5'-RACE. 5 O gene do anticorpo é amplificado por PCR usando a biblioteca de cDNA 5'-RACE preparada como um molde. lniciadores para amplificar o gene de anticorpo de camundongo podem ser projetados com base em se- quências do gene do anticorpo conhecidas.

As sequências de nucleotideos dos iniciadores variam dependendo da subclasse de imunoglobulina.

Portan- lO to, é preferencia! que a subclasse seja determinada com antecedência u- sando um kit disponível para comercialização como o kit para isotipagem de anticorpo monoclona! de camundongo lso Strip (Roche Diagnostics). Especificamente, por exemplo, iniciadores que permitem a am- . plificação de genes que codificam as cadeias pesadas y1, Y2a, y2b, e Y3 e 15 as cadeias leves k e y são usados para isolar genes que codificam lgG de camundongo.

Em geral, urn iniciador que anela a um sitio da região constan- Íe próximo da região variável é usado como um iniciador do lado 3' para am- plificar um gene da região variável de lgG.

Entretanto, um iniciador ligado a um kit de construção da biblioteca de CDNA 5' RACE é usado como um ini- 20 ciador do lado 5'. Os produtos de PCR assim amplificados são usados para refor- mar as imunoglobulinas compostas de uma combinação de cadeias pesadas e leves.

Um anticorpo desejado pode ser seiecionado usando a atividade de ligação de IL-6R de uma imunoglobulina reformada como um indicador.

Por 25 exemplo, quando o objetivo é isolar um anticorpo contra IL-6R, é mais prefe- rencial que a ligação do anticorpo a il-6r seja específica.

Um anticorpo liga- ção a IL-6R pode ser selecionado, por exemplo, por uma das seguintes eta-

pas: (1) colocar uma célula que expressa IL-6R em contato com um 30 anticorpo que compreende a região V codificada por um CDNA isolado de um hibridoma; (2) detectar a ligação do anticorpo à célula que expressa IL-6R;

e (3) selecionar um anticorpo que se Iiga à célula que expressa IL- 6R. Métodos para detectar a Iigação de um anticorpo a células que 5 expressam IL-6R são conhecidos. Especificamente, a ligação de um anticor- po a células que expressam IL-6R pode ser detectada pelas técnicas descri- tas acima como FACS. As amostras imobilizadas de células que expressam IL-6R são usadas apropriadamente para avaliar a atividade de ligação de um anticorpo. 10 Os métodos de triagem de anticorpos preferenciais que usam a atividade de ligação como um indicador incluem, também, métodos de pan- ning usando vetores de fago. Os métodos de triagem usando vetores de fa-

V go são vantajosos quando os genes de anticorpo são isolados a partir de bibliotecas das subclasses de cadeia pesada e cadeia leve de uma popula- 15 ção de células que expressa um anticorpo pohclonal. Os genes que codifi- cam as regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve podem ser ligados por uma sequência ligante adequada para formar um Fv de cadeia única (scFv). Os fagos que apresentam scFv na sua superfície podem ser produzi- dos por inserir um gene que codifica scFv em um vetor de fago. Os fagos 20 são coIocados em contato com um antígeno de interesse. Então, um codifi- cação de DNA scFv que tem a atividade de ligação de interesse pode ser isolado por coletar os fagos ligados ao antígeno. Este processo pode ser repetido conforme necessário para enriquecer o scFV que tem a atividade de ligação de interesse. 25 Após o isolamento do cDNA que codifica a região V do anticorpo anti-lL-6R de interesse, o CDNA é digerido com enzimas de restrição que reconhecem os sÍtios de restrição introduzidos em ambas as extremidades do cDNA. As enzimas de restrição preferenciais reconhecem e clivam uma sequência de nucleotídeos que ocorre na sequência de nucleotideos do ge- 30 ne do anticorpo em uma baixa frequência. Além disso, um sítio de restrição para uma enzima que produz uma extremidade adesiva é introduzido, de preferência, em um vetor para inserir um fragmento digerido de cópia única na orientação correta. O CDNA que codifica a região V do anticorpo anti-lL- 6R é digerido conforme descrito acima, e ele é inserido em um vetor de ex- pressão adequado para construir um vetor de expressão do anticorpo. Nes- se caso, se um gene que codifica a região constante do anticorpo (região C) 5 e um gene que codifica a região V acima forem fundidos na estrutura na es- trutura, um anticorpo quimérico é obtido. Na presente invenção, "anticorpo quimérico" significa que a origem da região constante é diferente daquela da região variável. Desta forma, em adição aos anticorpos heteroquiméricos de camundongo/humanos, anticorpos aloquiméricos humano/humano estão 10 incluídos nos anticorpos quiméricos da presente invenção. Um vetor de ex- pressão de anticorpo quimérico pode ser construído por inserir o gene da região V acima em um vetor de expressão que já tem a região constante.

b Especificamente, por exemplo, uma sequência de reconhecimento para uma enzima de restrição que corta o gene da região V acima pode ser apropria- 15 damente colocada no lado 5' de um vetor de expressão que transporta um DNA que codifica uma região constante (região C) desejada do anticorpo - Um vetor de expressão de anticorpo quimérico é construído por fundir na estrutura os dois genes digeridos com a mesma combinação de enzimas de restrição. 20 Para produzir um anticorpo monoclonal anti-lL-6R, os genes do anticorpo são inseridos em um vetor de expressão para que os genes sejam expressos sob o controle de uma região reguladora da expressão- A região reguladora da expressão para expressão do anticorpo inclui, por exemplo, intensificadores e promotores. Além disso, uma sequência de sinal adequa- 25 da pode ser ligada à terminação amino para que o anticorpo expresso seja secretado para o lado de fora das células. Por exemplo, um peptídeo que tem a sequência de aminoácidos MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID NO: 113) pode ser usado como uma sequência de sinal. Entretanto, outras se- quências de sinal adequadas podem ser ligadas. O polipeptídeo expresso é 30 clivado na terminação carboxila da sequência acima, e o polipeptídeo resul- tante é secretado para o lado de fora das células como um poIipeptídeo ma- duro. Então, as células hospedeiras adequadas são transformadas com o vetor de expressão, e células recombinantes que expressam o DNA que co- difica o anticorpo anti-lL-6R são obtidas.

Os DNAS que codificam a cadeia pesada do anticorpo (cadeia H) e a cadeia Íeve (cadeia L) são inseridos separadamente em diferentes veto- 5 res de expressão para expressar o gene do anticorpo.

Uma molécula de an- ticorpo que tem as cadeias H e L pode ser expressa por co-transfectar a mesma célula hospedeira com vetores nos quais os genes da cadeia H e da cadeia L são inseridos, respectivamente.

Alternativamente, as células hos- pedeiras podem ser transformadas com um único vetor de expressão no 10 qual os DNAs que codificam as cadeias H e L são inseridos (consulte WO 1994011523). 0

Há várias combinações de célula hospedeira/vetor de expressão conhecidas para a preparação de anticorpos por introduzir genes de anticor- . pos isolados em hospedeiros adequados.

Todos estes sistemas de expres- 15 são são aplicáveis ao isolamento dos dominios de ligação ao antígeno da presente invenção.

As células eucarióticas adequadas usadas como células hospedeiras incluem céluias animais, céluias vegetais, e células fúngicas.

Especificamente, as células animais incluem, por exemplo, as seguintes cé- lulas. 20 (1) células de mamifero: CHO, COS, mieloma, rim de hamster jovem (bhk), HeLa, Vero, ou similares; (2) células de anfibio: oócitos de Xenopus, ou similares; e (3) células de inseto: sf9, sf21, Tn5, ou similares.

Além disso, como uma célula vegetal, um sistema de expressão 25 gênica de anticorpo que usa células derivadas do gênero Nicotiana, como Nicotiana tabacum, é conhecido.

Células cultivadas do calo podem ser usa- das apropriadamente para transformar células vegetais.

Além disso, as seguintes células podem ser usadas como célu- las fúngicas: 30 - leveduras: o gênero Saccharomyces, como Saccharomyces serevisiae, e o gênero Pichia, como Pichia pastoris; e

- fungos filamentosos: o gênero Aspergi//us, como Aspergi/lus vetor de expressão, e células recombinantes que expressam o DNA que co- difica o anticorpo anti-IL-6R são obtidas.

Os DNAs que codificam a cadeia pesada do anticorpo (cadeia H) e a cadeia leve (cadeia L) são inseridos separadamente em diferentes veto- 5 res de expressão para expressar o gene do anticorpo.

Alternativamente, as células hos- pedeiras podem ser transformadas com um único vetor de expressão no qual os DNAs que codificam as cadeias H e L são inseridos (consulte WO 1994011523). Há várias combinações de célula hospedeira/vetor de expressão conhecidas para a preparação de anticorpos por introduzir genes de anticor- pos isolados em hospedeiros adequados.

Todos estes sistemas de expres- são são aplicáveis ao isolamento dos domínios de ligação ao antígeno da presente invenção.

As células eucarióticas adequadas usadas como células hospedeiras incluem células animais, células vegetais, e células fúngicas.

Especificamente, as células animais incluem, por exemplo, as seguintes cé- lulas. (1) células de mamífero: CHO, COS, mieloma, rim de hamster jovem (BHK), HeLa, Vero, ou similares; (2) células de anfíbio: oócitos de Xenopus, ou similares; e (3) células de inseto: sf9, sf21, Tn5, ou similares.

Além disso, como uma célula vegetal, um sistema de expressão gênica de anticorpo que usa células derivadas do gênero Nicotiana, como Nicotiana tabacum, é conhecido.

Além disso, as seguintes células podem ser usadas como célu- las fúngicas: - leveduras: o gênero Saccharomyces, como Saccharomyces ce- revisiae, e o gênero Pichia, como Pichia pastoris; e - fungos filamentosos: o gênero Aspergillus, como Aspergillus niger. Além disso, os sistemas de expressão de genes de anticorpo que utilizam células procarióticas também são conhecidos. Por exemplo, quando se usa células bacterianas, células de E. coli, células de Baci/lus 5 subti/is, e similares, podem ser adequadamente utilizadas na presente in- venção. Vetores de expressão transportando os genes de anticorpo de inte- resse são introduzidos nestas células por transfecção. As células transfecta- das são cultivadas in vitro, e o anticorpo desejado pode ser preparado a par- tir da cultura de células transformadas. 10 Além das células hospedeiras descritas acima, anirnais transgê- nicos também podem ser usados para produzir um anticorpo recombinante. 0 Ou seja, o anticorpo pode ser obtido a partir de um animal no qual o gene

S que codifica o anticorpo de interesse é introduzido. Por exemplo, o gene de anticorpo pode ser construido como um gene de fusão por inserção na estru- 15 tura em um gene que codifica uma proteína produzida especificamente no leite. j3-caseína de cabra ou similares pode ser usada, por exemplo, como a proteína secretada no leite. Os fragmentos de DNA contendo o gene fundido inserido com o gene do anticorpo são injetados em um embrião de cabra, e, então, este embrião é introduzido em uma cabra fêmea. Os anticorpos dese- 20 jados podem ser obtidos como uma proteína fundida com a proteína do leite a partir do leite produzido pela cabra transgênica nascida da cabra receptora do embrião (ou sua progênie). Além disso, para aumentar o volume de leite contendo o anticorpo desejado produzido pela cabra transgênica, hormônios podem ser administrados à cabra transgênica, como necessário (Ebert, K. M. 25 et al., Bio/Technology (1994) 12 (7), 699-702). Quando uma molécula de ligação ao antígeno aqui descrita é administrada a um ser humano, um domínio de Íigação ao antigeno derivado de um anticorpo geneticamente recombinante que foi modificado artificial- mente para reduzir a antigenicidade heteróloga contra um ser humano e si- 30 milares, pode ser usada apropriadamente como o domínio de ligação ao an- tígeno do complexo. Tais anticorpos geneticamente recombinantes incluem, por exemplo, anticorpos humanizados. Estes anticorpos modificados são produzidos apropriadamente por métodos conhecidos.

Uma região variável do anticorpo usada para produzir o domínio de ligação ao antlgeno de uma molécula de ligação ao antígeno aqui descri- ta é formada geralmente por três regiões determinantes de complementari- 5 dade (CDRS) que são separadas por quatro regiões estruturais (FRs). A CDR é uma região que determina substancialmente a especificidade de liga- ção de um anticorpo.

As sequências de aminoácidos das CDRs são altamen- te diversas.

Por outro lado, as sequências de aminoácidos formadoras de FR têm frequentemente alta identidade mesmo entre anticorpos com diferentes 10 especificidades de ligação.

Portanto, geralmente, a especificidade de ligação de um determinado anticorpo pode ser introduzida em outro anticorpo por enxertia de CDR.

Um anticorpo humanizado também ê chamado de anticorpo hu- , mano reformado.

Especificamente, os anticorpos humanizados preparados 15 por enxertia da CDR de um anticorpo animal não humano, como um anticor- po de camundongo a um anticorpo humano e similares, são conhecidos.

Técnicas de engenharia genética comuns para se obter anticorpos humani- zados também são conhecidas.

Especificamente, por exemplo, PCR por ex- tensão de sobreposição é conhecida como um método para enxertar uma 20 CDR de anticorpo de camundongo em uma FR humana.

Na PCR por exten- são de sobreposição, uma sequência de nucleotídeos que codifica uma CDR de anticorpo de camundongo a ser enxertada é adicionada a iniciadores pa- ra sintetizar uma FR de anticorpo humano.

Os iniciadores são preparados para cada uma das quatro FRS- Geralmente se considera que quando se 25 enxerta uma CDR de camundongo em uma FR humana, selecionar uma FR humana que tem alta identidade a uma FR de camundongo é vantajoso para manter a função da CDR.

Ou seja, é geralmente preferencial usar uma FR humana que compreende uma sequência de aminoácidos que tem alta iden- tidade à sequência de aminoácidos da FR adjacente à CDR de camundongo 30 a ser enxertada.

As sequências de nucleotideos a serem ligadas são projetadas de modo a estarem conectadas umas às outras na estrutura.

As FRs huma-

nas são sintetizadas individualmente usando os respectivos iniciadores. Co- mo resultado, são obtidos produtos nos quais o DNA que codifica a CDR de camundongo é ligado aos DNAS que codificam a FR individual. Sequências de nucleotídeos que codificam a CDR de camundongo de cada produto são 5 projetadas para que elas se sobreponham umas com as outras. A seguir, uma reação de sÍntese de fita complementar é conduzida para anelar as re- giões CDR sobrepostas dos produtos sintetizados usando um gene de anti- corpo humano como molde. As FRs humanas são ligadas através das se- quências de CDR de camundongo por esta reação- lO O gene da região V de extensão completa, no qual três CDRS e quatro FRs são essencialmente ligadas, é amplificado usando iniciadores que anelam com a sua extremidade 5' ou 3', que são adicionados com se-

T quências de reconhecimento de enzimas de restrição adequadas. Um vetor de expressão para um anticorpo humanizado pode ser produzido por inserir 15 o DNA obtido conforme descrito acima e um DNA que codifica uma região C de anticorpo humano em um vetor de expressão para que eles se liguem na estrutura. Após o vetor recombinante ser transfectado para um hospedeiro para estabelecer as células recombinantes, as células recombinantes são cultivadas, e o DNA que codifica o anticorpo humanizado é expresso para 20 produzir o anticorpo humanizado na cultura celular (consulte, publicação de patente europeia N" EP 239400 e Publicação de Patente internacional n° WO 1996/002576). Por medir qualitativamente ou quantitativamente e avaliar a ativi- dade de ligação ao antígeno do anticorpo humanizado produzido conforme 25 descrito acima, pode-se sejecionar adequadamente FRS de anticorpo huma- no que permitem que as CDRS formem um sítio de ligação ao antígeno favo- rável quando ligados através das CDRs. Os resíduos de aminoácido nas FRS podem ser substituídos como necessário, para que as CDRs de um an- ticorpo humano reformado formem um sÍtio de ligação ao antígeno adequa- 30 do. Por exemplo, mutações na sequência de aminoácidos podem ser intro- duzidas nas FRS por aplicar o método de PCR usado para enxertar uma CDR de camundongo em uma FR humana. Mais especificamente, mutações parciais na sequência de nucleotideos podem ser introduzidas em iniciado- res que anelam à FR.

Mutações na sequência de nucleotídeos são introdu- zidas nas FRs sintetizadas pelo uso de tais iniciadores.

As sequências de FR mutantes que possuem as características desejadas podem ser seleciona- 5 das mediante a medição e avaliação da atividade do anticorpo mutante com aminoácido substituído para se ligar ao antigeno pelo método acima men- cionado (Cancer Res. (1993) 53: 851-856). Alternativamente, os anticorpos humanos desejados podem ser óbtidos pela imunização de animais transgênicos que possuem todo o reper- IO tório de genes de anticorpos humanos (consulte WO 1993/012227; WO 1992/003918; WO 1994/002602; WO 1994/025585; WO 1996/034096; WO 1996/033735) por imunização com DNA.

Além disso, técnicas para preparar anticorpos humanos por . panning usando bibliotecas de anticorpos humanos também são conhecidas. 15 Por exemplo, a região V de um anticorpo humano é expressa como um anti- corpo de cadeia única (ScFv) na superfície do fago pelo método de apresen- tação em fago.

Os fagos que expressam um scFv que se liga ao antigeno podem ser selecionados.

A sequência de DNA que codifica a região V do anticorpo humano que se liga ao antigeno pode ser determinada através da 20 análise dos genes dos fagos selecionados.

A sequência de DNA do scFv que se liga ao antígeno é determinada.

Um vetor de expressão é preparado por fundir a sequência da região V na estrutura com a sequência da região C de um anticorpo humano desejado, e inserir isto em um vetor de expressão adequado.

O vetor de expressão é introduzido em células adequadas para 25 expressão, como aquelas descritas acima.

O anticorpo humano pode ser produzido por expressão do gene que codifica o anticorpo humano nas célu- las- Estes métodos já são conhecidos (consulte WO 1992/001047; WO 1992/020791: WO 1993/006213: WO 1993/011236: WO 1993/019172; WO 1995/001438: WO 1995/015388). 30 Em adição às técnicas descritas acima, técnicas de clonagem de células B (identificação de cada sequência codificante do anticorpo, clona- gem e seu isolamento; uso na construção do vetor de expressão de modo a preparar cada anticorpo (lgGl, IgG2, lgG3, ou lgG4, em particuiar); e simila- res) tal como descrito em Bernasconi et al. (Science (2002) 298: 2199-2202) ou no WO 2008/081008 podem ser apropriadamente usadas para isolar os genes de anticorpo. 5 Sistema de numeração EU De acordo com os métodos usados na presente invenção, as posições de aminoácido atribuidas à CDR e à FR do anticorpo são especifi- cadas de acordo com a numeração de Kabat (Sequences of Proteins of lm- munologicai lnterest (Nationa! lnstitute of Health, Bethesda, Md-, 1987 e 10 1991)). Na presente invenção, quando uma molécula de ligação ao antigeno é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno, os aminoácidos da re- . gião variável são indicados de acordo com o sistema de numeração de Ka-

Y bat, enquanto os aminoácidos da região constante são indicados de acordo com o sistema de numeração EU com base nas posições de aminoácido de 15 Kabat. Absorção de antígenos nas células ou promoção da absorção de antíqenos pelas céiulas Na presente invenção, "absorção de antígeno pelas células" mediada por moléculas de Iigação ao antígeno significa que os antígenos 20 são incorporados nas células por endocitose- Na presente invenção, "pro- mover a absorção de antigenos pelas células" significa aumentar a taxa de absorção celular de uma molécula de ligação ao antígeno que se ligou a um antigeno no plasma e/ou reduzir a quantidade de antigeno reciclado para o plasma após absorção. Na presente invenção, a taxa de absorção pelas cé- 25 lulas pode ser intensificada em comparação a da molécula de Íigação ao antígeno antes de reduzir sua atividade de ligação ao antígeno sob uma condição de baixa concentração de cálcio para ser menor que sob uma con- dição de alta concentração de cálcio. Desta forma, na presente invenção, pode-se avaliar se a absorção de antigeno pelas células é facilitada por uma 30 molécula de Iigação ao antigeno com base em um aumento na taxa de ab- sorção de antígeno pelas células. A taxa de absorção de antigeno pelas cé- lulas pode ser calculada, por exemplo, por monitoramento ao longo do tem-

po da redução na concentração do antígeno no meio de cultura contendo células que expressam FcRn humano após a adição do antígeno e da molé- cula de ligação ao antígeno ao meio, ou monitoramento ao longo do tempo da quantidade de absorção de antlgeno pelas células que expressam FcRn 5 humano.

O uso dos métodos da presente invençâo para facilitar a taxa de absorção de antigeno mediada pela molécula de ligação ao antígeno pelas células, por exemplo, a taxa de eliminação de antígeno do plasma pode ser intensificada pela administraçáo de moléculas de Iigação ao antigeno.

Desta forma, pode-se avaliar se a absorção de antigeno mediada pela molécula de ligação ao antígeno pelas células é facilitada, por exemplo, por testar se a taxa de eliminação do antígeno do plasma é acelerada ou se a concentração de antigenos no plasma é reduzida pela administração de uma molécula de ligação ao antigeno.

Especificamente, a redução da concentração de anti- genos no plasma também pode ser promovida pela administração das molé- culas de Iigação ao antigeno da presente invenção.

O número de vezes de liqaçâo ao antígeno por uma molécula de |iAação ao antigeno.

Na presente invenção, "o número de vezes de ligação ao antí- geno por uma molécula de ligação ao antigeno" significa o número de vezes de ligação ao antigeno que pode ser alcançado por uma n1o|écu|a de ligação ao antigeno até ela ser eliminada por degradação.

Na presente invenção, "aumentar o número de vezes de ligação ao antígeno por uma molécula de ligação ao antígeno" significa aumentar o número de ciclos que podem ser alcançados por uma molécula de ligação ao antigeno até ela ser eliminada por degradação quando se define como "um ciclo" o processo no qual a mo- lécula de ligação ao antígeno se liga a um antigeno no plasma, e a molécula de ligação ao antigeno ligada ao antígeno é absorvida pelas células, e se dissocia do antígeno em um endossomo, e, então, a molécula de ligação ao antígeno retorna para o plasma.

Na presente invenção, o número de ciclos pode ser aumentado em comparação ao de uma molécula de ligação ao an- tígeno cuja atividade de ligação ao antígeno sob uma condição de baixa

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concentração de cálcio não é menor que aquela sob uma condição de alta concentração de cálcio, ou aquela da molécula de ligação ao antígeno antes de reduzir sua atividade de ligação ao antígeno sob uma condição de baixa concentração de cálcio para ser menor que aquela sob uma condição de alta 5 concentração de cálcio.

Desta forma, pode-se avaliar se o número de ciclos está aumentado por testar se "a absorção nas células é promovida" confor- me descrito acima ou se a "retenção plasmática é aprimorada" conforme descrito abaixo.

Aprimoramento da retenção plasmática Na presente invenção, "aprimoramento da retenção plasmática" é intercambiável com "intensificação da farmacocinética", "aprimoramento da farmacocinética", "farmacocinética superior", "intensificaçáo da retenção plasmática", "excelência na retenção plasmática", ou "prolongamento da re- tenção plasmática". As expressões são sinônimas.

Aqui, "o aprimoramento da retenção plasmática" significa não somente o prolongamento do período até a eliminação do plasma (por e- xemplo, até a molécula de ligação ao antígeno ser degradada de forma in- tracelular ou similar e não poder voltar para o pIasma) após a administração da molécula de ligação ao antigeno a animais como seres humanos, ca- mundongos, ratos, macacos, coelhos e cachorros, mas também o prolonga- mento da retenção plasmática da molécula de ligação ao antígeno sob uma forma que permite a ligação ao antigeno (por exemplo, em uma forma livre de antigeno da molécula de ligação ao antígeno) durante o período de admi- nistração até a eliminação devido à degradação- Especificamente, "o apri- moramento da retenção plasmática" inclui ainda o prolongamento do período até a eliminação devido à degradação da molécula de ligação ao antígeno não ligada aos antígenos (a forma livre de antigenos da molécula de ligação ao antígeno). A molécula de ligação ao antígeno no plasma não pode se Iigar a um novo antigeno se a molécula de ligação ao antígeno já estiver ligada a um antígeno.

Assim, quanto mais longo for o período em que a molécula de ligação ao antígeno não está ligada a um antigeno, mais longo é o período que esta pode se ligar a um novo antigeno (maior a chance de ligação a um outro antígeno). lsto possibilita a reducão do período de tempo que um antí- . geno fica livre da molécula de ligação ao antigeno in vivo e o prolongamento do período que um antigeno fica ligado à molécula de ligação ao antígeno.

A 5 concentração plasmática da forma livre de antígeno de molécula de ligação ao antígeno pode ser aumentada e o período que o antígeno fica Íigado à molécula de ligação ao antígeno pode ser prolongado através da aceleração da eliminação dos antigenos do plasma através da administração da molé- cula de ligação ao antigeno.

Especificamente, para uso na presente inven- lO ção, "o aprimoramento da retenção plasmática de uma molécula de iigação ao antigeno" inclui o aprimoramento de um parâmetro farmacocinético (tal como prolongamento da meia-vida no plasma, prolongamento do tempo de

4 retenção médio no plasma ou redução da depuração no plasma) de uma molécula de ligação ao antígeno livre do antígeno da presente invenção, pro- 15 longamento do periodo que o antígeno fica ligado à molécula de Iigação ao antígeno após a administração da molécula de ligação ao antígeno, e inten- sificação da eliminação do antígeno do plasma pela molécula de ligação ao antígeno, em comparação a uma molécula de ligação ao antígeno livre do antígeno cuja atividade de Iigação ao antigeno sob uma condição de baixa 20 concentração de cálcio não for menor que sob uma condição de alta concen- tração de cálcio, ou uma molécula de ligação ao antígeno livre do antígeno antes de reduzir sua atividade de ligação ao antígeno sob uma condição de baixa concentração de cálcio para ser menor que sob uma condição de alta concentração de cálcio. 25 Pode-se avaliar se os parâmetros farmacocinéticos são aprimo- rados pela determinação de qualquer um dos parâmetros, meia-vida no plasma, tempo médio de retenção pfasmática, e depuração do pIasma para a molécula de ligação ao antígeno ou a sua forma livre do antigeno ("Phar- macokinetics: Enshu-niyoru Rikai (Understanding through practice)" Nan- 30 zando). Por exemplo, a concentração plasmática da molécula de ligação ao antígeno ou da sua forma livre de antígeno é determinada após a adminis- tração da molécula de ligação ao antigeno a camundongos, ratos, macacos,

coelhos, cachorros ou seres humanos- Então, cada parâmetro é determina- do. Quando a meia-vida no plasma ou o tempo médio de retenção no plas- ma é prolongado, pode ser julgado que a retenção plasmática da molécula de ligação ao antigeno foi aprimorada. Os parâmetros podem ser determina- 5 dos através de métodos conhecido pelos versados na técnica. Os parâme- tros podem ser apropriadamente avaliados, por exemplo, através de análise não-compartimental utilizando o programa de análise farmacocinética Win- Nonlin (Pharsight) de acordo com o manual de instruções em anexo. A con- centração plasmática de moíécula de ligação ao antígeno livre de antígeno 10 pode ser determinada através de métodos conhecidos pelos versados na técnica, por exemplo, utilizando o método de ensaio descrito em Clin Phar- macol. 2008 Abr; 48(4): 406-17.

W Aqui, "o aprimoramento da retenção plasmática" inclui ainda o prolongamento do período que um antígeno fica ligado a uma molécula de 15 Iigação ao antígeno após a administração da molécula de ligação ao antíge- no. Pode-se avaliar se o período que um antígeno fica ligado à molécula de ligação ao antigeno após a administração da molécula de ligação ao antíge- no com base no tempo até o aumento na concentração (razão) mediante a medição da concentração plasmática do antígeno não ligado à molécula de 20 ligação ao antígeno (antigeno livre), ou a razão entre a concentração do an- tigeno não ligado à molécula de ligação ao antigeno (concentração do antí- geno livre) e a concentração total do antigeno. Na presente invenção, a "concentração de antígeno no plasma" pode ser determinada mediante a medição da concentração plasmática de 25 um antigeno livre da molécula de ligação ao antigeno, ou da razão entre a concentração do antigeno livre da molécula de ligação ao antigeno e a con- centração total de antígeno, usando métodos conhecidos pelos versados na técnica, por exemplo, métodos de medição descrifos em Pharm Res. 2006 Jan; 23(1): 95-103. 30 Alternativamente, quando um antígeno mostra uma função parti- cular in vivo, pode-se avaliar se o antigeno está ligado a uma molécula de ligação ao antígeno que netraliza a função do antigeno (molécula antagonis-

ta) por testar se a função do antígeno é neutralizada.

Pode-se avaliar se a função do antígeno é neutralizada por testar um marcador in vivo que reflete a função do antígeno.

Pode-se avaliar se o antígeno está Iigado a uma mo- lécula de ligação ao antígeno que ativa a função do antigeno (molécula ago- 5 nista) por testar um marcador in vivo que reflete a função do antigeno.

A determinação da concentração plasmática do antígeno livre da molécula de ligação ao antlgeno e da razão entre a concentração do antíge- no livre da molécula de iigação ao antigeno e a concentração total do anti- geno, ensaio com marcador in vivo, e medições similares não são particu- lO larmente limitadas; entretanto, os ensaios são executados, de preferência, após um determinado período de tempo ter passado após a administração da molécula de ligação ao antígeno.

Na presente invenção, o período após a administração da molécula de ligação ao antígeno não é particularmente limitado; os versados na técnica podem determinar o periodo adequado de- pendendo das propriedades e similares da molécula de ligação ao antígeno administrada.

Tais períodos incluern, por exemplo, um dia após a adminis- tração da molécula de Iigação ao antigeno, três dias após a administração da molécula de ligação ao antígeno, sete dias após a administração da mo- lécula de iigação ao antígeno, 14 dias após a administração da molécula de ligação ao antígeno, e 28 dias após a administração da molécula de ligação ao antígeno.

Na presente invenção, o aprimoramento da retenção plasmática em seres humanos é preferencial Quando a retenção plasmática em um ser humano é difícil de determinar, ela pode ser prevista com base na retenção plasmática em camundongos (por exemplo, camundongos normais, camun- dongos transgênicos que expressam antígeno humano, camundongos transgênicos que expressam FcRn humano) ou macacos (por exemplo, ma- cacos cynomolgus)- Dissociação de um antíçjeno dentro de unía célula a partir de uma molécula de liqação ao antígeno liqada de forma extracelular A presente invenção também é aplicável como um método para promover a dissociação de um antigeno dentro de uma célula a partir de uma molécula de ligação ao antígeno Iigada de forma extracelular.

Na pre- sente invenção, o antígeno pode se dissociar da molécula de ligação ao an- tígeno em qualquer Iocal em uma célula; entretanto, é preferencial que o an- tígeno se dissocie dentro de LIm endossomo precoce.

Na presente invenção, 5 "um antigeno se dissocia dentro de uma célula a partir de uma molécula de ligação ao antígeno ligada de forma extracelular" não significa necessaria- mente que todo antígeno que foi absorvido pela célula por ligação extracelu- lar à molécula de ligação ao antlgeno se dissocia da molécula de ligação ao antígeno no interior da célula.

É aceitável que a proporção do antígeno que se dissocia da molécula de ligação ao antigeno dentro de uma célula seja maior em comparação a uma molécula de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação ao antígeno sob uma condição de baixa concentração de cálcio não é menor que sob uma condição de alta concentração de cálcio, ou a molécula de Iigação ao antígeno antes de reduzir a atividade de ligação ao antigeno sob uma condição de baixa concentração de cálcio para ser menor que aquela sob uma condição de alta concentração de cálcio.

O método pa- ra promover a dissociação de um antígeno dentro de uma célula a partir de uma molécula de ligação ao antígeno ligada de forma extracelular também pode ser chamado de um método para conferir a uma molécula de ligação ao antígeno uma propriedade que facilita a promoção da absorção intracelu- Iar da molécula de ligação ao antígeno ligada a um antigeno, e a promoção da dissociação intracelular do antígeno da molécula de ligação ao antígeno.

Liberação extracelular sob uma forma livre do antigeno de uma molécula de ligação ao antíqeno que foi absorvida por uma célula sob uma forma liqada ao antíqeno A presente invenção também se aplica como um método para acentuar a liberação extracelular sob uma forma livre do antígeno de uma molécula de ligação ao antigeno que foi absorvida por uma célula sob uma forma ligada ao antigeno.

Na presente invenção, "Iiberação extracelular sob uma forma livre do antigeno de uma rnolécula de iigação ao antigeno que foi absorvida por uma célula sob uma forma Iigada ao antígeno" não significa necessariamente que toda molécula de ligação ao antigeno que foi ligada a um antigeno e absorvida por uma célula é Iiberada sob uma forma livre do antígeno para o lado de fora de uma célula- É aceitável que a proporção mo-

lécula de ligação ao antígeno que é liberada sob uma forma livre do antigeno para o lado de fora das células seja maior em comparação a uma molécula 5 de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação ao antigeno sob uma condi- ção de baixa concentração de cálcio não é menor que sob uma condição de alta concentração de cálcio, ou a molécula de Iigação ao antigeno antes de reduzir sua atividade de ligação ao antígeno sob uma condição de baixa concentração de cálcio para ser menor que aquela sob uma condição de alta concentração de cálcio.

É preferencial que a molécula de ligação ao antíge- no liberada para o lado de fora de uma célula guarde a atividade de ligação ao antígeno.

O método para promover a liberação extracelular sob uma for- ma livre do antigeno de uma molécula de ligação ao antlgeno que foi absor- vida por uma célula sob uma forma ligada ao antígeno também pode ser chamada de um método para conferir a uma molécula de ligação ao antíge- no uma propriedade que facilita a promoção da absorção intracelular da mo- lécula de ligação ao antígeno ligada a um antigeno, e a promoção da Iibera- ção extracelular da molécula de ligação ao antigeno sob uma forma livre do antigeno.

Condição da concentração de cálcio Na presente invenção, a condição de baixa concentração de cál- cio significa tipicamente que a concentração de cálcio ionizado é 0,1 µM a 30 µM, de preferência, 0,5 µM a 10 µM, e particularmente, de preferência, 1 µM a 5 µM, o que é comparável com a concentração de cálcio ionizado no endossomo precoce in vivo.

Entretanto, na presente invenção, a condição de alta concentração de cálcio significa tipicamente que a concentração de cál- cio ionizado é 100 µM a 10 mM, de preferência, 200 µM a 5 mM, e particu- larmente, de preferência, 0,5 mM a 2,5 mM, o que é comparável à concen- tração de cálcio ionizado no plasma (sangue) in vivo.

Desta forma, na presente invenção, "a atividade de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antigeno é menor sob uma condi- ção de baixa concentração de cálcio do que sob uma condiçào de alta con-

centração de cálcio" significa que a atividade de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antigeno é menor em uma concentração de cálcio ionizado de 0,1 µM a 30 µM do que em uma concentração de cálcio ionizado de 100 µM a 10 mM- lsto significa, de preferência, que a atividade de ligação 5 ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno é menor em uma con- centração de cálcio ionizado de 0,5 µM a 10 µM do que em uma concentra- ção de cálcio ionizado de 200 µM a 5 mM.

Particularmente, de preferência, isto significa que a atividade de ligação ao antígeno é menor na concentra- ção de cálcio ionizado no endossomo precoce in vivo do que na concentra- lO ção de cálcio ionizado no plasma in vivo; especificamente, isto significa que a atividade de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antigeno 4 é menor em uma concentração de cálcio ionizado de 1 µM a 5 µM do que a uma concentração de cálcio ionizado de 0,5 mM a 2,5 mM.

Entretanto, como usado aqui, a expressão "a atividade de liga- 15 ção ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno é menor sob uma condição de baixa concentração de cálcio do que sob uma condição de alta concentração de cálcio" é intercambiável com a expressão "a atividade de ligação ao antigeno de uma molécula de Iigação ao antigeno é mais alta sob uma condição de alta concentração de cálcio do que sob uma condição de 20 baixa concentração de cálcio". A expressão "a atividade de ligação ao anti- geno de uma molécula de ligação ao antigeno é menor sob uma condição de baixa concentraçào de cálcio do que sob uma condição de alta concentração de cálcio" também significa que a atividade de ligação ao antigeno de uma molécula de ligação ao antígeno sob uma condição de baixa concentração 25 de cálcio é reduzida para ser menor que sob uma condição de alta concen- tração de cálcio ou a atividade de ligação ao antigeno de uma molécula de ligação ao antigeno sob uma condição de alta concentração de cálcio é au- mentada para ser maior que sob uma condição de baixa concentração de cálcio, pela modificação de uma sequência de aminoácidos na molécula de 30 ligação ao antígeno, etc- Ou seja, na presente invenção, a razão entre a ati- vidade de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno sob uma condição de baixa concentração de cálcio e aquela sob uma condição de alta concentração de cálcio pode ser aumentada- Por exemplo, em uma modalidade, a razão de KD (Ca 3 µM)/KD (Ca 2 mM) pode ser aumentada, conforme descrito abaixo.

A razão entre a atividade de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno sob uma condição de baixa con- 5 centração de cálcio e aquela sob uma condição de alta concentração de cál- cio pode ser aumentada, por exemplo, por reduzir a atividade de ligação ao antígeno sob uma condição de baixa concentração de cálcio através da se- leção de uma molécula de ligação ao antigeno com baixa atividade de liga- ção ao antigeno sob uma condição de baixa concentração de cálcio, ou a- lO través da modificação de uma sequência de aminoácidos na molécula de ligação ao antígeno; ou mediante o aumento da atividade de ligação ao antí- . geno sob uma condição de alta concentração de cálcio através da seleção r de uma molécula de ligação ao antígeno com alta atividade de ligação ao antigeno sob uma condição de alta concentração de cálcio, ou através da 15 modificação de uma sequência de aminoácidos na molécula de ligação ao antigeno; ou ambos.

Na presente invenção, a expressão "a capacidade de ligação ao antígeno é mais fraca sob uma condição de baixa concentração de cálcio do que sob uma condição de alta concentração de cálcio", é usada algumas 20 vezes ao invés da expressáo "a atividade de Iigação ao antígeno é menor sob uma condição de baixa concentração de cálcio do que sob uma condi- ção de alta concentração de cálcio"- Além disso, a expressão, "enfraqueci- mento da capacidade de ligação ao antigeno sob uma condiçào de baixa concentração de cálcio para ser menor que aquela sob uma condição de alta 25 concentração de cálcio", é algumas vezes usada ao invés da expressão "re- duzir a atividade de ligação ao antígeno sob uma condição de baixa concen- tração de cálcio para ser menor que aquela sob uma condição de alta con- centração de cálcio". FcRn 30 Ao contrário do receptor Fcy que pertence à superfamilia da i- munoglobulina, FcRn, particularmente, FcRn humano, é estruturalmente si- milar aos polipeptídeos do complexo de histocompatibilidade principa! (MHC)

classe I, que exibem 22°6 a 29% de identidade de sequência às moléculas de MHC classe l (Ghetie el al., lmmunol. Today (1997) 18 (12): 592-598). O FcRn é expresso como um heterodímero que consiste em cadeia |3 solúvel ou leve (j32 microglobulina) complexada com uma cadeia a transmembrana 5 ou pesada. Como MHC, a cadeia a de FcRn compreende três domlnios ex- tracelulares (al, a2, e a3) e seu dominio citoplasmático curto ancora a prote- Ína sobre a superficie celular. Os dominios a1 e a2 interagem com o domínio de ligação ao FcRn da região Fc do anticorpo (Raghavan et al., lmmunity (1994) 1: 303-315). 10 O FcRn é expresso na placenta materna a no saco vitelino de mamiferos, e está envolvido na transferência de lgG materno-fetal. Além dis- so, no intestino delgado neonatal de Roedores, quando FcRn é expresso, o

R FcRn está envolvido na transferência de lgG materna através do epitélio da borda em escova a partir de coIostro ou leite ingerido. O FcRn é expresso 15 em uma variedade outros tecidos e sistemas de células endoteliais de várias espécies. O FcRn também é expresso no endotélio humano adulto, vasos sanguineos musculares, e capiíares sinusoides hepáticos. Acredita-se que o FcRn desempenhe um papel na manutenção da concentração plasmática de lgG por mediar a reciclagem da lgG para o soro mediante ligação à lgG. Ti- 20 picamente, a iigação de FcRn às moléculas de lgG é estritamente depen- dente do pH. A ligação ótima é observada em uma faixa de pH ácido abaixo de 7,0. O FcRn humano cujo precursor é um polipeptideo que tem a se- quência de sina! da SEQ ID NO: 17 (o polipeptideo com a sequência de sina) 25 é mostrado na SEQ ID NO: 18) forma um complexo com a l32-microglobu|in humana in vivo. O FcRn humano solúvel cornplexado com a j32- microglobulin é produzido pelo uso de técnicas de expressào recombinante convencionais. Os domínios de ligação ao FcRn da presente invenção po- dem ser avaliados para sua atividade de ligação a tal FcRn humano solúvel 30 complexado com Í32-microg|obu|in- Na presente invenção, exceto onde es- pecificado em contrário, o FcRn humano se refere a uma forma capaz de se ligar a um dominio de ligação ao FcRn da presente invenção. Exemplos in-

cluem um complexo entre FcRn humano e |32-microglobulin humana.

Dominio de ligação de FcRn As moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção têm um dornínio de ligação ao antígeno e um domínio de ligação ao FcRn huma-

5 no.

O domlnio de ligação ao FcRn humano não é particularmente limitado, contanto que as moléculas de ligação ao antígeno mostrem a atividade de ligação ao FcRn humano em pH ácido e/ou pH neutro- Alternativamente, o domínio pode ter uma atividade de Iigação ao FcRn humano direta ou indire- ta.

Tais domínios incluem, por exemplo, a região Fc da imunoglobulina do 10 tipo lgG, albumina, dominio 3 de albumina, anticorpos anti-FcRn humano, peptídeos anti-FcRn humano, e moléculas de arcabouço anti-FcRn humano, todos os quais têm a atividade de se ligar diretamente ao FcRn humano; e

7 moléculas que se ligam à lgG ou albumina, que têm a atividade de se Iigar indiretamente ao FcRn humano.

Tais dominios preferenciais da presente 15 invenção têm atividade de ligação ao FcRn humano nas intervalos de pH ácido e neutro.

É possível usar os dominios sem qualquer alteração contanto que eles já tenham atividade de ligação ao FcRn humano nas faixas de pH ácido e neutro.

Quando os domínios têm apenas atividade de ligação FcRn humano fraca ou ausente nas faixas de pH ácido e/ou neutro, a atividade de 20 ligação ao FcRn humano pode ser conferida por alterar os aminoácidos nas moléculas de ligação ao antigeno.

Entretanto, é preferencial que a atividade de ligação ao FcRn humano nas faixas de pH ácido e/ou neutro seja conferi- da por alterar os aminoácidos no domínio de ligação ao FcRn humano.

Al- ternativamente, os aminoácidos nos dominios que já tèm atividade de liga- 25 ção ao FcRn humano nas faixas de pH ácido e/ou neutro podem ser altera- dos para aumentar a atividade de ligação ao FcRn humano.

As alterações de aminoácido desejadas no domínio de ligação ao FcRn humano podem ser selecionadas por comparar a atividade de ligação ao FcRn humano nas faixas de pH ácido e/ou neutro antes e depois da alteração do aminoácido. 30 O domínio de ligação ao FcRn humano preferencial é uma regi- ão que se liga diretamente ao FcRn humano.

Tais regiões de ligação ao F- cRn humano preferenciais incluem, por exemplo, regiões Fc do anticorpo

Entretanto, as regiões capazes de se ligar a um polipeptídeo como albumina ou lgG, que tem atividade de ligação ao FcRn humano, podem se ligar indi- retamente ao FcRn humano através da albumina, IgG, ou similares. Desta forma, tal região de ligação ao FcRn humano da presente invenção pode ser 5 uma região que se liga a um polipeptídeo que tem uma atividade de ligação à albumina ou lgG. Em particular, um dominio de ligação ao FcRn humano com uma atividade de ligação ao FcRn humano maior em pH neutro é prefe- rencial. Um domínio de ligação ao FcRn humano com uma atividade de liga- ção ao FcRn humano maior em pH neutro pode ser selecionado com ante- lO cedência. Alternativamente, a atividade de ligação ao FcRn humano em pH neutro pode ser conferida ou aumentada pela modificação de um aminoáci- . do em uma molécula de Iigação ao antígeno.

V Condições adequadas diferentes do pH, no qual a atividade de ligação ao FcRn humano é determinada, podem ser selecionadas pelos ver- 15 sados na técnica. As condições não são particularmente limitadas. Por e- xemplo, as medições podem ser conduzidas a 37"C usando tampão MES, conforme descrito no WO 2009/125825. Entretanto, a atividade de ligação ao FcRn humano de uma molécula de Iigação ao antígeno pode ser determina- da por métodos conhecidos pelos versados na técnica, por exemplo, pelo 20 uso de Biacore (GE Healthcare) ou similares. A atividade de ligação entre uma molécula de ligação ao antigeno e o FcRn humano pode ser avaliada por carregar FcRn humano ou a molécuia de ligação ao antígeno como um analito em um chip sobre o qual a molécula de ligação ao antígeno ou FcRn humano é imobilizado, respectivamente. 25 Na presente invenção, a atividade de ligação ao FcRn humano em pH ácido significa a atividade de Iigação ao FcRn humano em pH 4,0 a 6,5, de preferência, a atividade de ligação ao FcRn humano em pH 5,5 a 6,5, e particularrnente, de preferência, a atividade de ligação ao FcRn humano em PH 5,8 a 6,0, que é comparável ao pH no endossomo precoce in vivo. 30 Entretanto, a atividade de ligação ao FcRn humano em pH neutro significa a atividade de ligação ao FcRn humano em pH 6,7 a 10,0, de pre'ferência, a atividade de ligação ao FcRn humano em pH 7,0 a pH 8,0, e particularmente,

de preferência, a atividade de ligação ao FcRn humano em pH 7,4, que é comparável ao pH no plasma in vivo.

A atividade de ligação ao FcRn humano em pH neutro pode ser conferida por ou aumentada em uma molécula de ligação ao antígeno pela 5 modificação de um aminoácido na molécula.

Por exemplo, quando a região Fc de uma imunoglobulina do tipo lgG é usada como o dominio de Iigação ao FcRn humano, a atividade de ligação ao FcRn humano em pH neutro po- de ser conferida por ou aumentada em uma molécula de ligação ao antígeno pela modificação de um aminoácido no dominio de ligação ao FcRn humano.

A região Fc preferencial da imunoglobulina do tipo lgG a ser alterada inclui, por exemplo, a região Fc de uma IgG humana natural (lgGl, lgG2, lgG3 ou lgG4). Os aminoácidos em quaisquer sÍtios podem ser alterados para outros aminoácidos contanto que a atividade de ligação ao FcRn humano seja con- ferida ou aumentada em pH neutro.

Quando a molécula de ligação ao anti- geno tiver uma região Fc de IgGl humana quando o domínio de ligação ao FcRn humano, é preferencial que a molécula tenha alterações que potenci- am a ligação ao FcRn humano em pH neutro em comparação ao da lgGl natural humana.

Aminoácidos onde tal alteração podem ser alcançados in- cluem, por exemplo, aminoácidos nas posições 221 a 225, 227, 228, 230, 232, 233 a 241, 243 a 252, 254 a 260, 262 a 272, 274, 276, 278 a 289, 291 a 312, 315 a 320, 324, 325, 327 a 339, 341, 343, 345, 360, 362, 370, 375 a 378, 380, 382, 385 a 387, 389, 396, 414, 416, 423, 424, 426 a 438, 440, e 442 (numeração EU). Mais especificamente, tais alterações de aminoácido incluem, por exemplo, aquelas mencionadas na tabela 1- A ligação ao FcRn humano da região Fc de uma imunoglobulina do tipo lgG em pH neutro pode ser intensificada (potenciada) pelo uso das alterações descritas acima.

Além disso, as alterações que podem potencializar a ligação ao FcRn humano na faixa de pH ácido em comparação à IgGl natural humana são mostradas como um exemplo na tabela 2. Quando as alterações adequadas que tam- bém podem potencializar a ligaçâo ao FcRn humano na faixa de pH neutro são selecionadas a partir das alterações descritas acima, elas são aplicáveis à presente invenção.

"Alteração de aminoácidos" ou "alteração no aminoácido" de um dominio de ligação ao FcRn compreende a alteração de uma sequência de aminoácidos em um domínio de hgação ao FcRn original a sequências de aminoácidos diferentes.

Qualquer domínio de ligação ao FcRn pode ser u- 5 sado como um domínio de ligação ao FcRn original, contanto que as varian- tes preparadas pela modificação do domínio de ligaçâo ao FcRn original possam se ligar ao FcRn hurnano na faixa de pH neutro.

Além disso, um domlnio de ligação ao FcRn modificado a partir de um domínio de ligação ao FcRn original que já foi modificado também pode ser usado, de preferência, como um domínio de ligação ao FcRn da presente invenção.

O "domínio de Íigação ao FcRn original" pode se referir ao polipeptideo em si, uma compo- sição que compreende o dominio de ligação ao FcRn original, ou uma se- quência de polinucleotídeos que codifica o domínio de ligação ao FcRn ori- ginal.

Os domínios de ligação ao FcRn originais podem compreender uma região Fc conhecida produzida através de recombinação descrita resumida- mente na seção "anticorpos". A origem dos domínios de ligação ao FcRn originais - não é limitada, e eles podem ser obtidos a partir de organismos humanos ou qualquer não-humano.

Tais organismos incluem, de preferência, camundongos, ratos, cobaias, hamsters, gerbils, gatos, coelhos, cachorros, cabras, ovelhas, bovinos, cavalos, camelos e organismos selecionados a partir de primatas não-humanos.

Em outra modalidade, os domínios de liga- ção ao FcRn originais também podem ser obtidos a partir de macacos cy- nomolgus, micos, macacos rhesus, chimpanzés, ou seres humanos.

Os do- minios de ligação ao FcRn originais podem ser obtidos, de preferência, a partir de lgGl humana; entretanto, eles não se limitam a nenhuma classe lgG particular. lsto significa uma região Fc de lgGl, lgG2, lgG3, ou lgG4 humana pode ser usada apropriadamente como um domínio de ligação ao FcRn original, e na presente invenção também significa que uma região Fc de uma classe ou subclasse de lgG arbitrária derivada de quaisquer orga- nismos descritos acima pode ser usada, de preferência, como um domínio de ligação ao FcRn original.

Exemplos de mutantes de lgG de ocorrência natural ou formas modificadas são descritos nos documentos publicados

(Curr.

Opin.

Biotechnol. (2009) 20 (6): 685-91; Curr.

Opin. lmmunol. (2008) 20 (4), 460-470; Protein Eng.

Des.

Sel. (2010) 23 (4): 195-202; WO 2009/086320; WO 2008/092117; WO 2007/041635; e WO 2006/105338); entretanto, eles não se lirnitam aos exemplos. 5 Exemplos de alterações incluem aquelas com uma ou mais mu- tações, por exemplo, mutações por substituição de diferentes resíduos de aminoácido por aminoácidos dos domínios de ligação ao FcRn originais, por inserção de um ou mais resíduos de aminoácidos em domínios de ligação ao FcRn originais, ou por deleção de um ou mais aminoácidos dos domínios de 10 ligação ao FcRn originais.

De preferência, as sequências de aminoácidos dos domínios de ligação ao FcRn alterados compreendem ao menos uma

· parte da sequência de aminoácidos de um dominio de ligação ao FcRn não- natural.

Tais variantes têm necessariamente de identidade ou similaridade de ¶

sequência menor que 1OO'/o ao seu domínio de ligação ao FcRn original.

Em 15 uma modalidade preferencial, as variantes têm identidade ou similaridade de sequências de aminoácido de cerca de 75% a menos de 100%, com mais preferência, cerca de 80% a menos de 1OO°/o, com mais preferência ainda cerca de 85°/o a menos de 1OO°/o, com mais preferência ainda cerca de 9O°/j a menos de 10O°/o, e, com mais preferência ainda, cerca de 95% a menos de 20 100% à sequência de aminoácidos do seu dominio de ligaçào ao FcRn origi- nal.

Em uma modalidade não-limitadora da presente invenção, pelo menos um aminoácido é diferente entre um dominio de ligação ao FcRn modificado da presente invenção e seu domínio de Iigação ao FcRn original.

A diferença de aminoácidos entre um domínio de ligação ao FcRn modificado da presen- 25 te invenção e seu domínio de Iigação ao FcRn original também pode ser es- pecificada, de preferência, com base nas diferenças de aminoácido nas po- sições de aminoácido específicas descritas acima de acordo com o sistema de numeração EU.

Além disso, alterações que podem potencializar a ligação ao 30 FcRn humano na faixa de pH ácido em comparação à lgG humana original são mostradas como um exempjo na tabela 2. Quando as alterações ade- quadas que também podem potencializar a ligação ao FcRn humano na fai-

m= xa de pH neutro sào selecionadas a partir das alterações descritas acima, elas são aplicáveis à presente invenção Entretanto, combinações de altera- ções que podem potencializar a Iigação de Fv4-!gG1 ao FcRn humano sob condições ácidas são mostradas nas tabelas 6-1 e 6-2. Os aminoácidos par- 5 ticularmente preferenciais para serem alterados na região Fc da lgG humana original incluem, por exemplo, aminoácidos nas posições 237, 238, 239, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 270, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 325, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434, e 436 (numeração EU). As alterações particularmente preferenciais incluem, por exern- plo, uma substituição de aminoácido de Met por Gly na posição 237; uma substituição de aminoácido de Ala por Pro na posição 238; uma substituição de aminoácido de Lys por Ser na posição 239: uma substituição de aminoácido de lle por Lys na posição 248: uma substituição de aminoácido de Ala, Phe, lle, Met, Gln, Ser, Val, Trp, ou Tyr por Thr na posição 250; uma substituição de aminoácido de Phe, Trp, ou Tyr por Met na posição 252;

uma substituição de aminoácido de Thr por Ser na posição 254; uma substituição de aminoácido de Glu por Arg na posição 255; uma substituição de aminoácido de Asp, Glu, ou GIn por Thr na posição 256; uma substituição de aminoácido de Ala, Gly, lle, Leu, Met, Asn, Ser, Thr, ou Val por Pro na posição 257; uma substituição de aminoácido de His por Glu na posição 258; uma substituição de aminoácido de Ala por Asp na posição 265; uma substituição de aminoácido de Phe por Asp na posição 270; uma substituição de aminoácido de Ala, ou Glu por Asn na posi- ção 286: uma substituição de aminoácido de His por Thr na posição 289; uma substituição de aminoácido de Aia por Asn na posição 297:

uma substituição de aminoácido de Gly por Ser na posição 298; uma substituição de aminoácido de Ala por Val na posição 303; uma substituição de aminoácido de Ala por Val na posição 305; uma substituição de aminoácido de Ala, Asp, Phe, Gly, His, lle, 5 Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp, ou Tyr por Thr na posição 307; uma substituição de aminoácido de Ala, Phe, lle, Leu, Met, Pro, Gln, ou Thr por Val na posição 308; uma substituição de aminoácido de Ala, Asp, Glu, Pro, ou Arg 10 por Leu ou Val na posição 309; uma substituição de aminoácido de Ala, His, ou lle por Gln na h posição 311; y uma substituição de aminoácido de Ala, ou His por Asp na posi- ção 312; 15 uma substituição de aminoácido de Lys, ou Arg por Leu na posi- ção 314: uma substituição de aminoácido de Ala, ou His por Asn na posi- ção 315; uma substituição de aminoácido de Ala por Lys na posição 317; 20 uma substituição de aminoácido de Gly por Asn na posição 325; uma substituição de aminoácido de Val por lle na posição 332; uma substituição de aminoácido de Leu por Lys na posição 334; uma substituição de aminoácido de His por Lys na posição 360: uma substituição de aminoácido de Ala porAsp na posição 376: 25 uma substituição de aminoácido de Ala por Glu na posição 380; uma substituição de aminoácido de Ala por Glu na posição 382; uma substituição de aminoácido de Ala por Asn ou Ser na posi- ção 384; uma substituição de aminoácido de Asp, ou His por Gly na posi- 30 ção 385: uma substituição de aminoácido de Pro por Gln na posição 386; uma substituição de aminoácido de Glu por Pro na posição 387;

uma substituição de aminoácido de Ala, ou Ser por Asn na posi- ção 389; uma substituição de aminoácido de Ala por Ser na posição 424; uma substituição de aminoácido de Ala, Asp, Phe, Gly, His, lle, 5 Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp, ou Tyr por Met na posição 428; uma substituição de aminoácido de Lys por His na posiçào 433; uma substituição de aminoácido de Ala, Phe, His, Ser, Trp, ou Tyr por Asn na posição 434; e uma substituição de aminoácido de His por Tyr ou Phe na po- lO sição 436 (numeração EU) na região Fc da lgG original.

o número de aminoácidos que será alterado não é particular- " mente limitado; e é possível alterar os aminoácidos apenas em um único sitio ou em dois ou mais sitios. As combinações de duas ou mais aiterações 0 de aminoácidos incluem, por exemplo, aquelas mostradas na Tabela 3. as 15 combinações de alterações que podem potencializar a ligação ao FcRn hu- mano na faixa de pH ácido em comparação com a lgG humana original são mostradas nas Tabelas 4-1 até 4-5. Quando as combinações de alterações adequadas que também podem potencializar a ligação ao FcRn humano na faixa de pH neutro são selecionadas a partir das alterações descritas acima, 20 elas são aplicáveis à presente invenção Além disso, as combinações de alte- rações que podem potencializar a ligaçâo de Fv4-lgG1 ao FcRn humano sob condições neutras são mostradas nas Tabelas 5-1 e 5-2.

A atividade de ligação ao FcRn humano de uma molécula de li- gaçâo ao antigeno na faixa de pH neutro pode ser aumentada mediante a 25 substituição de pelo menos um aminoácido selecionado a partir dos aminoá- cidos com um aminoácido diferente.

Tabela 1 POSIÇÃO ALTERAÇÃO DE AMINOÁCIDO ) 256 P 280 K 339 T 385 H 428 L 434 W, Y, F, A. H

U 318 319 320 324 325 326 327 328 329 330 331 I 251 )t,d 332 ! 252 ,y \n,q 333 I 254 µ 334 ! 255 Ie, y h 335 L_?56 Ia 336 337 A 338 ,A lO 339 N, W 341 P 343 E. H, K. Q, R T, Y 360 H, A 362 A 375 R 376 )iiiljj 377 378 380 382 385 386 I 274 |m.f.g,e.1,t.n 387 H, Q I 276 |d.f.h,r, lv,w,a 414 A I 278 |r.s,v,m.n,i,ld 423 N 279 |a, d, g, h. m. n, q. r, s, t, w, y, g. i 424 A 281 |d, y 426 H, L V. R 282 !g.ke.y 427 283 284 jA.D. f,g. h,lk. l n.p, q, r,s,t.w, y |t.l. q,e 428 429 : _

Q _] 285 |n, y. w, q. k. e. d. y 430 A, F, G. H. [, K. L, M, N, Q, R, S, T, ',', Y j 286 !f, Ly.e,p.d,k,a 431 H. K 287 |s.h 432 H 288 jN,p.Y,H.D,L v. c,e,g.l q,r 433 P 289 |h 434 G. T. M, S. 291 iq. h 435 K 292 Íy, e, d 436 [, L T_ _4 293 |v 437 H 294 [. k, g 438 K, L T, W 295 v, t 440 K 296 e, i, l 442 K I 298 f, e, t, h

Tabela 3 C:C)MB|NAÇÃO DA t'.LTERAcÃo DE AM!i·joÁclDo"

J M252Y,'S254T/T256E M25"2Y,'s'254T/T256Ei'H433K/N434F/Y436H H433K,'N434F.'Y436H |T307A/E380A T307A/E380A/N434H T307A/E380A,/N434A N434H,'N315H N434H/T289H N434H/T370A,'E380A T250Q,/M428L 'T250Q/N434A M252W/N434A M252Y/N434A T256A/N434A T256D/N434A T256E/N434A T256S/N434A P257I/Q3111 T307A/N434A T307E/N434A T307Q.'N434A V308P/N434A L309G/N434A Q311H1N434A Q311R/N434A N315D/N434A A378V/N434A E380S/N434A E382V.'N434A S424E/N434A M428L,'N434A N434A/Y436I T437Q/N434A T437R/N434A

[Tabela 4 11 C'(")MB|NA(:ÃC} DA ALTFRAÇÃO DE AMINOÁCIDO L234I1L235D G236A/V308F,1332E G236R,'L32ER G236A.'1332E,'N434S s239E./'v'2g4[/'A:330Y,'I3jk?E S239E/V2641,'1332E S239E/'V264I,/ S298AJA330Y.·1332E S239D/"D265H,'N297D,']332E S239D/E272Y,'1332E S239D/E272S/I332E S239D/E272J/I332E S239D/N297D/I332E S239D/K326T./1332E S239Q/1332Q S239Q/I332N S239D,'1332D S239D,'I332E S239Q/I332E S239E/1332E F241W/F24-'W F241Y/F243Y/V262T,'V264T F241'NK243W,'V262A,'V264A F241L/V2621 F243L/V2621/V264W F243L/'K288D/R292P/Y300L./V305I./P396L/H435K F243L/K288D/R292P,/Y300L,'H435K F 243L/R292P/Y30DL,'V305I/P396L/H435K P245G/V308F T250L'V259Í/V308F T250l 'V308F

T250lí'V308F.'N434S _ ) T250Q,·'V308F ,'M428i- T250Q/M428L L2511,"N434S L251N./N434S ! L251F1N43.4S L251V/'N434S L251M."|\I434S T252Lµ"r254.ç.'T25eÍF M252Y/S254T/T256E/N434M L7J M252Y/S254T,'T256E,'M428L./N434St M252Y/S254T/T256E M252Y/S254T/T256E/V308F M252Y/S254T/T256E/N434S

M252Y/S254T/T256E/N434A " ) M252Y,'S254T,'T256E,'M428L M252Y/S254T/T256E/T307Q M252F/T256D M252Y/T256Q M252Y/P257L M252Y/P257N M252Y/V259J M252Y/V279Q M252Y/V308P/N434Y M252Q/V308F M252Y/V308F

A tabela 4-2 é uma continuação da tabela 4-1.

[Tabela 4-2] M252Q,'V308F/'N434S M252Y/V308F/M428L M252Y,'V308F/N434M M252Y/V308F/N434S M252Y,'Y3191 M252Q.'M428L/N434S M252Y./M428L M252Y.'N434M M252Y,'N434S M252Y/N434A M252Y/N434Y S254T/V308F R255H.'N434A R255Q/N434S R25"H/N434S T256V/V308F T256P/Q3111 T256P/1332E A T756P/1337F/S440Y ) T256P/E430Q

W T256P/N434H T256E/N434Y T256P/S440Y P257Y/V279Q P257L/V279E P257N/V279Q P257N,'V279E P257N/V279Y P257L/V279Q j P257N/"281S P257L,'^281S P257N/V284E P257N/L306Y P257L/V308Y P257UV308F P257N/V308Y P257I/Q311I/N434H P257L,'Q31IV P257L/G385N P25 7L/M428L P25 71,'E430Q P2571.'N434H P257L/N434Y E258H/N434A E258H,'N434H V259I,'T3O7Q,/V308F V2591/V308F V2591.'V308F/Y319L V259UV308F/Y3191 V259A,'V308F V259Í,'V308F/N434M V259L'V308F/N434S V2591/V3Q8F/M428Lt'N434S V2591.'V308F/M428L V2591,·'Y319I V259!.'Y319I/N434S V259I,'M428L V259I/M428L/N434S V259I/N434S _ _J

A tabela 4-3 é uma continuação da tabela 4-2-

P281s/n434y ) |e283f,'v284e

|v308f/g385h -1 |v308f/m428l./n434m |v308um428l —

A tabela 4-4 é uma continuação da tabela 4-3.

jTabela 4-4] |Q311Y,/N434S |Q311F,'N434S ir |Y3191/N434S |L328H/I332F |L328N/1332E |L328E,'J332E |L328VI332E L328Q/1332E L328D/I332E L328RiM428LiN434S A330L/1332E A330Y/1332E 1332E/D376V 1332Ei'N434S P343FUE345D ¶ D376V/E430Q D376V,'E430R D376V/N434H E380A/N434A G385R,'Q386T!P38J G385D,"Q386P,'N389S N414F/Y416H M428L,'N434M -! M428L,'N434S M428L/N434A M428L/N434Y |l429N/'N434S E43OD/N434S E430T,.'N434S E430si'N434s E430A/N434S E430F/N434S E430Q/N434S E430L.'N434S E430I/N434S A431T/N434S

: Eb '"

A tabela 4-5 é uma continuação da tabela 4-4,

. [Tabela 5-1] ,Jo1te da variantE KD (M) 'alteração ck amirIÜácjdcl " ' IgGl ND ;none IgGl-vl 3.2E-06 iM252Y,'S254T1T256E lgG1-v2 8.1E-07 'n434w lgGi-F3 2.5E-06 n434y lqG1-F4 5.8E-Q6 In434s " " ' ]gG1-F5 6-ÕE-06 |n434a IgG1-F7 5.ÊÊ'Õ6" m252y !gGi-F8 4.2E-Ú6 m252\n !gG1-F9 1.4E-07 m252y/s254t/t256e,."n434y lgG1-F1O 6.9E-08 m252y/s254t,'"t256e1n434w Kgj-f11 3.1E-07 m252y/n434y ""ÍgG1-Fi2 1.7E-07 M252YjN434w _kg1-F13 3.2E-07 m252w,·'n434y [qG1-F14 "1"ÃÈ-Õ7 m252w,'n434w IgG1-F19 4,6E-07 p257l,'n434y ' Kgpf20 4.6E-07 v308f,'n434y [gG1-F21 3.OE-08 m252y,'v308p,'n434y" "" Kgpf22 2-OE-06 m428l/n434s IgG1-F25 9JZÊ'® m252y/'s254t/t256e./'v308p./"n434w I,qG1-F26 1.OE-06 l332V lgG1-F27 7.4E-06 g237m µgpf29 1.4E 06 'i332v/n434y _ !g,G.1±3.1 _ 2-8E-06 G237Ms"V308F _JgGi-F32 8-OE-07 s254t/n434w IgG1-F33 2.3E-06 s254t/n434y ^;g1-f34 2-8E-07 t256e/n434w lgG1-F35 8.4E-07 t256e.'n434y >g1-f36 3,6E-07 s254t/t256e/n434w lgG1-F37 1.1E-06 s254t/t256ein434y lgGi-F38 1.OE-07 M252Y./'S254T./N434Vd lgG1-F39 3-OE-07 m252y/s254t/n434y IgG1-F40 8-2E-08 m252y/'t256e/n434w irg1-f41 1.5E-07 m252y.'t256e/n434y lgG1-F42 1.OE-06 M252Y.e"S254T/'T256E/'N434A I,jg1-F43 1.7E—06 M252YíN434A lgG1-F44 1.1E-06 m252w,'n434a _JgG1-F47 2.4E-07 m252y/"t256q,"n434w Kg1-f48 3.2E-07 M252Yi'T256Q,'N434Y "IqG1-F49 5,1E-07 m252f,'t256din434w "ÍgG1-F50 1.2E-06 m252f/t256d/n434y igG1-F51 8.1E-06 n434f..'y436h JgG1-F52 3.1E-06 h433k.."n434f ·'y436h lgGi-F53 1.OE-06 1332v,"n434w igG1-F54 8.4E-08 v308p,'n434w IgG1-F56 9.4E-07 l332V,."M428L,r' n434y

A tabela 5-2 é uma continuação da tabela 5-1. [Tabela 5-2] IgG1-F57 J_1je±5. G385D/Q386P/N389S ]gG1-F58 E-07 G385D/Q386P/N389S/N434W IgG1-F59 I 2-4E-06 G385D/Q386P/N389S/N434Y lgG1-F60' I 1.1E-05 G385H ]gG1-F61 I 9.7E-07 G385H/N434W IgG1-F62 I 1-9E-06 G385H/N434Y IgG1-F63 N434F IgG1-F64 IgG1-F65 IgG1-F66 'à|i!! I 4.3E-07 N434H M252Y/S254T/T256E/N434F M252Y/S254T/T256E/N434H IgG1-F67 I 6.3E-07 M252Y/N434F IgG1-F68 M252Y/N434H

)Í))) IgG1-F69 M428L/N434W IgG1-F70 M428L/N434Y lgG1-F71 M252Y/S254T/T256E/M428L/N434W IgG1-F72 M252Y/S254T/T256E/M428L/N434Y IgG1-F73 M252Y/M428L/N434W IgG1--F74 M252Y/M428L/N434Y IgG1-F75 M252Y/M428L/N434A IgG1-F76 I 1.OE-06 M252Y/S254T/T256E/M428L/N434A |gG1-F77 I 9.9E-07 T256E/M428L/N434Y lgG1-F78 I 7.8E-07 S254T/M428L/N434W !gG1-F79 S254T/T256E/N434A

JÍ!)! IgG1-F80 M252Y/T256Q/N434A IgG1-F81 M252Y/T256E,'N434A I@1-F82 T256Q/N434W WG1-F83 T256Q/N434Y lgG1-F84 I 2.8E-07 M252W/'T256Q/N434W IgG1-F85 I 5.5E-07 M252W,'T256Q/N434Y IgG1-F86 ! 1.5E-06 S254T/T256Q/N434W IgG1-F87 S254T/T256Q/N434Y

))))) IgG1-F88 M252Y/S254T/T256Q/N434W lgG1-F89 M252Y/S254T/T256Q/N434Y IgG1-F90 M252Y"/T256E/V308P/N434W IgG1-F91 M252Y/V308P/M428L/N434Y IgG1-F92 M252Y/S254T/T256E/V308P/M428L/N434W lgG1-F93 M252W/M428L/N434W IgG1-F94 P257L/M428L/N434Y IgG1-F95 M252Y/S254T/T256E/M428L/N434F kG1-F99 M252Y/T256E/N434H

[Tabela 6-1] oíte aa vanante Kl) ?·¶) di=ão de amnnácidcl

EEÍ

ND 3-2E-06 ='S254T.'T256E

8.IE-07 2-5E-06 íI)j:.e,,,,,,/,,,,,..N,,,Y lf!

5.8E-06

6.8E-D6

5.6E 06

4.2E-06 ÍAE-07 I tgG1-FIO 69E-08 AA52Yí"s254T.'T256Es N434\N Lk[Q1-F]I 3.1F-07 AM252yi'n434y

1.7E-07 _JM252Y."N434W !!))

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4.6E-07 ÍV308F,'N434Y

3.UE-08 |M252YN308P.' N434Y =::: 2.OE-06

9.2E-D9 jM428L/N434s |M252YI's254T-'T256Ej'v3n8p.- Y434W ílj) 1 OE-06 |J332V

7.4£-06 |G237M 1 4Ê-Õ6 A!332vt"N434Y

2.8E-06 |G237M·"V308F "" . ". " ""

8.0E"Üí |S254T 1N434'N """"" '"'" ! lgG1-F33 " 2 3E-06 |S254T:'N434Y l lgG1-F34 2.8E-07 lT256E/Ns34w 1 lgG1-f35 8 4E-07 Jj256E-'N434't Lkg1-F36 3 6E-07 ~j_S254T: T2E6E ^""""" """""" — -1.ÍE.-05 — js254Tn256E.'h434Y " jj "' 1'.QÈZQ"7 _JM252Yp S254ÜN434W

3.OE-07 |M252\Ü S254T.·"N434Y

8.2E·-·08 |M252Yi'"T256E."N434W 1 5E-07 !M252YiT256E.'"N434Y 1,ÓE-06 AM25zYt S254T.'T256E-· N434A F lgG1-·-F43 1.7E-D6 _lM252YiN434A i ixg1-f44 1-1È--D6 |M252W.'N434A ! IgG1-F47 2.4E-07 lM252Y/T256Q "N434W LÀgG1-F48 3-2E-07 =252YíT256Q N434Y LJqC'1-F49 5 IE"07 =252F>'T256D.·'?l434rY >g1-f50 1-2E-D6 AM252FjT256D -'A434Y " """"""""" ""

8.1E-06 jN434F/Y436H Êi'àiàí \È± 1 0E-06 "8.4E-08 H©3K.·' N¢34F, W36H '1332VÍN434W V308P 'N434\Y " " " " "" j))-

9.4E-07 I332V.·'M428L-'N434Y , . " l 1E:05' G385D.' G386d N389S 7 7E-07 g385Dí Q386P t"N389s! N434W

2.4E-OÔ G385DiQ386PtT\'389St'N434Y " 1.IÊ-05 ,C385H

9.7E"6i' |g385H;N434r/ '" " R,-,6, 1.9E-06 jg385H:"N4'4Y m1-F63 2.5E-hG JN434f " " l !cK1-F64 5-3E-06 lN434'H

A tabela 6-2 é uma continuação da tabela 6-1. [Tabela 6-2] IgG1-F65 M252Y./S254T/'T256E/N434F IgG1-F66 M252Y/S254T/T256E/N434H

) IgG1-F67 M252Y/N434F igG1-F68 M252Y/N434H IgG1-F69 M428L/N434W lgG1-F70 M428L/N434Y IgG1-F71 M252Y,'S254T/T256E,'M428L/N434W jgG1-F72 M252Y/S254TIT256E/M428L/N434Y igG1-F73 M252Y,'M428L/N434W IgG1-F74 M252Y/M428L/N434Y IgG1-F75 M252Y/M428L/N434A ÍgGl-F76 M252Y/S254T,'T256E/M428L/N434A IgG1-F77 T256E./M428L,'N434Y IgG1-F78 S254T/M428L/N434W IgG1-F79 IgG1-F80 IgG1-F81 IgG1-F82 j73íi S254T/T256E/N434A M252Y/T256Q.'N434A M252Y/'T256E,"N434A T256Q/N434W

))))) IgG1-F83 T2"6Q,"N434Y M252W,/'T25GQ,"N434Vd IgG1-F84 IgG1-F85 M252W/T256Q 'N434Y IgG1-F86 S254T,"T256Q,·"N434W IgGl F87 s254r,.'T2b6Q/'N434Y IgG1-F88 M252Y/"S254T/'T256Q,/"N434W [gG1-F89 M252'}","S254T,/'T256Q,/"N434Y IgG1-F90 M252Y/T256E/V308P/'N434W IgG1-F91 M252Y/V308P/M428L/N434Y IgG1-F92 M252Y,'S254T/T256E,/V308P/M428L/N434W IgG1-F93 M252W/M428L/N434W ÍgG1-F94 P257L/M428L/N434Y IgG1-F95 M252Y/S254T,'T256E/M428L/N434F ktgi-F99 M252Y/'T256E/'N434H

Tais alterações de aminoácidos podem ser apropriadamente in- troduzidas utilizando métodos conhecidos.

Por exemplo, as alterações no domínio Fc da lgGl humana natural são descritas em Drug Metab Dispos. 2007 Jan. 35(1): 86-94; Int Immunol. 2006 Dez. 18, (12): 1759-69; J Biol Chem. 2001 Mar. 2, 276(9): 6591-604; J Biol Chem. (2007) 282(3): 1709-17; J lmmunol. (2002) 169(9): 5171-80; J lmmunol. (2009) 182(12): 7663-71; Molecular Cell, Vol. 7, 867-877, abril, 2001: Nat Biotechnol. 1997 Jul. 15, (7): 637-40: Nat Biotechnol. 2005 Oct. 23, (10): 1283-8; Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Dez. 5, 103(49): 18709-14; EP 2154157; US 20070141052; WO 2000/042072: WO 2002/060919; WO 2006/020114: WO 2006/031370; WO 2010/033279: WO 2006/053301; e WO 2009/086320.

De acordo com o Journal of lmmunology (2009) 182: 7663-7671, a atividade de ligação ao FcRn humano de lgGl humana natural na faixa de pH ácido (pH 6,0) é KD 1,7 µM, e a atividade é quase indetectável na faixa de pH neutro.

Assim, em uma rnodalidade preferencial, a molécula de liga- 5 ção ao antígeno que será utilizada nos métodos da presente invenção inclui moléculas de ligação ao antigeno cuja atividade de ligação ao FcRn humano na faixa de pH ácido é KD 20 µM ou mais forte e é idêntica ou mais forte que aquela da lgGl natural humana na faixa de pH neutro- Em uma modalidade mais preferencial, a molécula de ligação ao antígeno inclui moléculas de li- lO gação ao antigeno cuja atividade de ligação ao FcRn humano é KD 2,0 µM oumaisfortenafaixadepHácidoekD40µMoumaisfortenafaixadepH neutro.

Em uma modalidade mais preferencial, a molécula de ligação ao an- tigeno inclui moléculas de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação ao . FcRn humanoé KD 0,5 µM ou maisforte nafaixa de pH ácido e KD 15 µM 15 ou mais forte na faixa de pH neutro.

Especificamente, é preferencial que a atividade de ligação ao antigeno seja menor sob uma condição de pH ácido do que sob uma condição de pH neutro.

Os valores de Kd acima são deter- minados pelo método descrito no Journal of lmmunology (2009) 182: 7663- 7671 (por imobilizar a molécula de ligação ao antígeno sobre um chip e car- 20 regar o FcRn humano como um analito). A constante de dissociação (KD) pode ser utilizada como um va- Ior da atividade de ligação ao FcRn humano.

Entretanto, a lgGl humana na- tural possui pouca atividade de ligação ao FcRn hLlmano na faixa de pH neu- tro (pH 7,4) e, portanto, é difícil calcular a atividade na forma de KD.

Méto- 25 dos para avaliar se a atividade de ligação ao FcRn humano é maior do que aquela da lgGl humana natural em pH 7,4 incluem métodos de avaliação através da comparação das intensidades de resposta de Biacore após o car- regamento de analitos na mesma concentração.

Especificamente, quando a resposta após o carregamento de um chip com FcRn humano imobilizado 30 com uma molécula de ligação ao antígeno em pH 7,4 é mais forte que a res- posta após o carregamento do FcRn humano sobre um chip com lgGl hu- mana natural imobilizada em pH 7,4, a atividade de ligação ao FcRn humano da molécula de ligação ao antígeno é julgada como sendo maior do que a- quela da lgGl humana intacta em pH 7,4. O pH 7,0 também pode ser utilizado como uma faixa de pH neu- tro.

A utilização de pH 7,0 como um pH neutro pode facilitar a fraca interação 5 entre o FcRn humano e o dominio de ligação ao FcRn.

Como uma tempera- tura empregada na condição de ensaio, a afinidade de ligação pode ser ava- liada a qualquer temperatura desde 1O°C até 50°C.

De preferência, uma temperatura desde 15°C até 40°C é empregada com a finalidade de deter- minar a afinidade de ligação entre o domínio de ligação ao FcRn humano e o 10 FcRn humano.

Com mais preferência, qualquer temperatura desde 20°C até 35°C, como qualquer uma de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 e 35 °C é também empregada com a finalidade de determinar a afiriidade de ligação entre o domínio de ligação ao FcRn humano e o FcRn ¶

humano.

Uma temperatura a 25°C descrita no Exemplo 5 é uma de exemplo 15 para a modalidade desta invenção.

Em uma modalidade preferencial, uma interação entre o FcRn humano e o domínio de ligação ao FcRn pode ser medida em pH 7,0 e a 25°C como descrito no Exemplo 5. A afinidade de Ii- gação de molécula de ligação ao antígeno ao FcRn humano pode se.r medi- da por Biacore como descrito no Exemplo 3. 20 Em uma modalidade mais preferencial, as moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção possuem atividade de ligação ao FcRn humano em pH 7,0 e a 25"C que é mais forte que aquela da lgG humana natural.

Em uma modalidade mais preferencial, a atividade de Iigação ao FcRn humano em pH 7,0 e a 25°C é 28 vezes mais forte que a IgG humana 25 natural ou mais forte que KD 3,2 µM.

Em uma modalidade mais preferencial, a atividade de ligação ao FcRn humano em pH 7,0 e a 25°C é 38 vezes mais forte que aquela da lgG humana natural ou mais forte que KD 2,3 µM.

Uma lgGl, lgG2, lgG3 ou lgG4 humana natural é preferencial- mente utilizada como a lgG humana intacta com uma finalidade de uma lgG 30 humana intacta de referência ser comparada com as moléculas de ligação ao antígeno em relação a sua atividade de ligação ao FcRn humano ou ati- vidade in vivo.

De preferência, uma molécula de ligação ao antígeno de refe-

rência que compreende o mesmo domínio de ligação ao antigeno que uma molécula de ligação ao antígeno de interesse e a região Fc da lgG humana natural como um domínio de ligação ao FcRn humano podem ser apropria- damente utilizadas, Com mais preferência, uma lgGl hutnana natural é utili- 5 zada com a finalidade de uma lgG humana natural de referência ser compa- rada com as moléculas de ligação ao antígeno em relação a sua atividade de ligação ao FcRn humano ou atividade in vivo.

Mais especificamente, as moléculas de ligação ao antigeno com efeito em longo prazo sobre a atividade para eliminação de antigeno no 10 plasma descritas na presente invenção possuem atividade de ligação ao FcRn humano em pH 7,0 e a 25"C dentro de uma faixa de 28 vezes até 440 vezes mais forte que a IgGl humana natural ou KD dentro de uma faixa de 3,0 µM até 0,2 µM.

Uma concentração de antigenos no plasma em longo . prazo é determinada mediante a medição da concentração de antlgenos to- 15 tais ou livres no plasma e da razão molar de antÍgeno/molécula de ligação ao antigeno 2, 4, 7, 14, 28, 56 ou 84 dias após a administração de uma mo- lécula de ligação ao antígeno de modo a avaliar o efeito em longo prazo da molécula de ligação ao antigeno da presente invenção sobre a atividade pa- ra eliminação de antígeno no plasma.

Pode-se determinar se a redução da 20 concentração de antígenos no plasma ou da razão molar de antíge- no/molécula de ligação ao antígeno é conseguida pela molécula de ligação ao antígeno descrita na presente invenção através da avaliação da redução em qualquer um ou mais dos pontos de tempo descritos acima.

Ainda mais especificamente, as moléculas de ligação ao antige- 25 no com efeito em curto prazo sobre a atividade para eliminação de antígeno no plasma descritas na presente invenção possuem atividade de Iigação ao FcRn humano em pH 7,0 e a 25°C 440 vezes mais forte que a lgG humana natural ou KD mais forte que 0,2 µM.

Uma concentração de antígenos no plasma em curto prazo é determinada mediante a medição da concentração 30 de antígenos totais ou livres no plasma e da razão molar de antige- noknolécula de ligação ao antígeno 15 min, 1, 2, 4, 8, 12 ou 24 horas após a administração de uma molécula de Iigação ao antígeno de modo a avaliar o efeito em curto prazo da molécula de ligação ao antígeno da presente inven- ção sobre a atividade para eliminação de antígeno no plasma.

Os métodos da presente invenção são aplicáveis a quaisquer moléculas de ligação ao antígeno independentemente do tipo de antígeno 5 alvo.

Por exemplo, quando a molécula de ligação ao antigeno for um anticorpo que se liga a um antigeno de membrana, o anticorpo administrado no corpo se liga ao antígeno e então é capturado através da internalização dentro dos endossomos nas céluias junto com o antígeno enquanto o anti- lO corpo é mantido ligado ao antígeno- Então, o anticorpo é translocado para os lisossomos enquanto o anticorpo é mantido ligado ao antígeno e o anticorpo é degradado pelo Íisossomo junto com o antigeno.

A eliminação do plasma mediada pela internalização é chamada de eliminação dependente de antí- . geno e tal elim"inação foi relatada com várias moléculas de anticorpo (Drug 15 Discov Today- 2006 Jan; 11(1-2): 81-8)- Quando uma única molécula de an- ticorpo IgG se liga aos antigenos de uma maneira divalente, a única molécu- la de anticorpo é internalizada enquanto o anticorpo é mantido ligado às du- as moléculas de antígeno e degradado no lisossomo.

Consequentemente, no caso de anticorpos comuns, uma molécula de anticorpo lgG não pode se 20 Iigar a três ou mais moléculas de antlgeno.

Por exemplo, uma única molécu- la de anticorpo lgG que possui uma atividade de neutralização não pode neutralizar três ou mais moléculas de antígeno.

A retenção relativamente prolongada (eliminação lenta) de molé- culas de lgG no plasma é devida à função do FcRn humano que é conhecido 25 como um receptor de recuperação de molécuias de lgG.

Quando capturadas pelos endossomos através de pinocitose, as moléculas de lgG se ligam ao FcRn humano expresso nos endossomos sob a condição ácida nos endos- somos.

Enquanto as molécuias de ÍgG que não se ligam ao FcRn humano são transferidas para os lisossomos onde são degradadas, as moléculas de 30 lgG que estão ligadas ao FcRn humano são translocadas para a superfície celular e voltam novamente para o plasma através da dissociação do FcRn humano sob a condição neutra no plasma.

Alternativamente, quando a molécula de ligação ao antígeno for um anticorpo que se liga a um antígeno solúvel, o anticorpo administrado no corpo se liga ao antígeno e então é capturado pelas células enquanto o anti- corpo é mantido ligado ao antígeno.

Muitos anticorpos capturados pelas cé- 5 lulas são liberados para fora da célula através de FcRn.

Entretanto, uma vez que os anticorpos são Iiberados para fora da célula, com os anticorpos man- tidos ligados aos antígenos, os anticorpos não podem se ligar aos antígenos novamente- Assim, similar aos anticorpos que se ligam aos antígenos de membrana, no caso de anticorpos comuns, uma molécula de anticorpo lgG 10 não pode se ligar a três ou mais moléculas de antigeno.

Os anticorpos de ligação ao antígeno dependente da concentra- ção de eálcio que se ligam fortemente a um antígeno sob condições de alta concentração de cálcio, mas se dissociam do antígeno sob condições de . baixa concentração de cálcio podem se dissociar do antígeno no endossomo. 15 Tais anticorpos de ligação ao antigeno dependente da concentração de cál- cio podem se ligar aos antígenos novamente quando estes são reciclados para o plasma pelo FcRn após a dissociação do antígeno; assim, cada anti- corpo pode se ligar repetidamente a inúmeros antígenos.

Além disso, o antí- geno ligado à molécula de ligação ao antígeno é dissociado no endossomo e 20 não é reciclado para o plasma. lsto facilita a captura pelas células de antíge- nos mediada por moléculas de ligação ao antigeno.

Assim, a administração de uma molécula de ligação ao antigeno pode aumentar a eliminaçâo dos antígenos e assim reduzir a concentração de antigenos no plasma- Moléculas de liqação ao antígeno 25 A presente invenção fornece moiéculas de Iigação ao antigeno que têm um domínio de ligação ao antígeno e um domínio de ligação ao F- cRn humano, sendo que a atividade de ligação ao antígeno das moléculas de ligação ao antígeno é diferente sob duas condições de concentração de cálcio diferentes e é menor sob uma condição de baixa concentração de cál- 30 cio do que sob uma condição de alta concentração de cálcio.

As moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção não são particularmente limitadas, contanto que eias incluam um domínio de li-

gação ao antígeno que tem uma atividade de ligação específica para um antígeno alvo. Tais domínios de ligação ao antigeno preferenciais compre- endem, por exemplo, domlnios que têm urna região de ligação ao antigeno de um anticorpo. A região de iigação ao antígeno de um anticorpo compre- 5 ende, por exemplo, CDRS e regiões variáveis. Quando a região de ligação ao antígeno de um anticorpo é CDR, ela pode conter todas as seis CDRs do anticorpo inteiro, ou uma, duas, ou mais CDRs. Quando as CDRS estão con- tidas como uma região de ligação de anticorpo, elas podem compreender deleções, substituições, adições e/ou inserções de aminoácidos ou podem 10 ser uma parte de CDR. Por outro lado, as moléculas de ligação ao antígeno que serão utilizadas nos métodos da presente invenção incluem moléculas de ligação ao antígeno que possuem uma atividade antagonista (moléculas de ligação

V ao antígeno antagonistas), moléculas de Iigação ao antígeno que possuem 15 uma atividade agonista (molécula de Iigação ao antígeno agonista) e molé- culas que possuem citotoxicidade. Em uma modalidade preferencial, as mo- léculas de ligação ao antigeno compreendem moléculas de ligação ao anti- geno antagonistas, em particular, moléculas de ligação ao antígeno antago- nistas que reconhecem um antígeno tal como um receptor ou uma citocina. 20 Na presente invenção, a molécula de ligaçáo ao antígeno cle in- teresse não é particularmente limitada e pode ser qualquer molécula de liga- ção ao antígeno. A molécula de ligação ao antígeno da presente invenção tem, de preferència, tanto atividade de Iigação ao antígeno (domínio de liga- ção ao antígeno) quanto um domínio de ligação ao FcRn humano. Em parti- 25 cular, a molécula de ligação ao antigeno preferencial da presente invenção compreende um domínio de ligação ao FcRn humano. A molécula de ligação ao antigeno que compreende tanto o do- mínio de ligação ao antigeno quanto o domínio de ligação ao FcRn humano inclui, por exemplo, anticorpos. No contexto da presente invenção, um e- 30 xemplo preferencial de anticorpo inclui anticorpos lgG. Quando o anticorpo que será utilizado for um anticorpo IgG, o tipo de lgG não é limitado: a lgG que pertence a qualquer isotipo (subclasse) tal como lgGl, lgG2, lgG3 ou lgG4 pode ser utilizada.

Além disso, as moléculas de ligação ao antigeno da presente invenção podem compreender uma região constante do anticorpo e mutações de aminoácidos podem ser introduzidas na região constante.

As mutações de aminoácidos que serão introduzidas incluem, por exemplo, a- 5 quelas que potencializam ou prejudicam a ligação ao receptor Fc y (Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Mar 14; 103(11): 4005-10),), mas não estão limi- tadas a estes exemplos.

Alternativamente, também é possÍvel alterar a liga- ção dependente de pH através da seleção de uma região constante apropri- ada tal como de lgG2. Quando a molécula de ligação ao antígeno de interesse na pre- sente invenção for um anticorpo, este pode ser um anticorpo derivado de qualquer animal, tal como um anticorpo de camundongo, um anticorpo hu- mano, um anticorpo de rato, um anticorpo de coelho, um anticorpo de cabra ou um anticorpo de cameio.

Além disso, o anticorpo pode ser um anticorpo alterado, por exemplo, um anticorpo quimérico e em particular, um anticorpo alterado que inclui substituições de aminoácidos na sequência de um anti- corpo humanizado etc.

Os anticorpos incluem ainda anticorpos biespecíficos, produtos de modificação de anticorpo ligados a várias moléculas e polipeptí- deos que compreendem fragmentos de anticorpo. "Anticorpos quiméricos" são anticorpos preparados através da combinação de sequências derivadas de animais diferentes.

Especificamen- te, o anticorpo quimérico inclui, por exemplo, anticorpos que possuem regi- ões variáveis N) de cadeia pesada e leve de um anticorpo de camundongo e regiões constantes (C) de cadeia pesada e leve de um anticorpo humano. "Anticorpos humanizados", também chamados de anticorpos humanos reformados, são anticorpos nos quais as regiões de determinação de complementaridade (CDRs) de um anticorpo derivado de um mamífero nào humano, por exemplo, um camundongo, são transplantadas para dentro das CDRs de um anticorpo humano.

Os métodos para a identificação de CDRS são conhecidos (Kabat et al., Sequence of Proteins of lmmunological lnterest (1987), National lnstitute of Health, Bethesda, Md.; Chothia et al., Nature (1989) 342: 877). As tecnologias de recombinação genética gerais adequadas para esta finalidade também são conhecidas (ver o pedido de patente europeu EP 125023; e WO 96/02576). Um anticorpo biespecifico se refere a um anticorpo que possui, na mesma molécula de anticorpo, regiões variáveis que reconhecem epito- 5 pos diferentes.

Um anticorpo biespecífico pode ser um anticorpo que reco- nhece dois ou mais antigenos diferentes ou um anticorpo que reconhece dois ou mais epítopos diferentes em um mesmo antígeno.

Além disso, os polipeptídeos que compreendem fragmentos de anticorpo incluem, por exemplo, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, SCFvs 10 (Nat Biotechnol. 2005 Set; 23(9): 1126-36), anticorpos de domínios (dAbs) (WO 2004/058821, WO 2003/002609), SCFV-FC (WO 2005/037989), dAb-Fc e proteinas de fusão Fc.

A região Fc de uma molécula que compreende uma região Fc pode ser usada como um dominio de ligação ao FcRn humano. . Alternativamente, um domínio de ligação ao FcRn pode ser fundido a estas 15 molécuias.

Adicionalmente, as moléculas de ligação ao antígeno que são aplicáveis à presente invenção podem ser moléculas similares a um anticor- po.

Uma molécula similar a anticorpo (molécula estrutural, molécula peptídi- ca) é uma molécula que pode exibir funções através da ligação com uma 20 molécula alvo (Current Opinion in Biotechnology (2006) 17: 653-658; Current Opinion in Biotechnology (2007) 18: 1-10; Current Opinion in Structural Bio- logy (1997) 7: 463-469; Protein Science (2006) 15: 14-27) e inclui, por e- xemplo, DARPins (WO 2002/020565), Aficorpo (WO 1995/001937), Avímero (WO 2004/044011; WO 2005/040229) e Adnectina (WO 2002/032925). . Es- 25 tas moléculas semelhantes a um anticorpo podem se ligar a moléculas alvo de uma forma dependente da concentração de cálcio, facilitam a absorção de antígeno nas células por moléculas de ligação ao antigeno, facilitam a redução da concentração de antigenos no plasrna pela administração de moléculas de ligação ao antígeno, e melhoram a retenção plasmática de mo- 30 léculas de ligação ao antígeno, e aumentam o número de vezes de ligação ao antígeno por uma única molécula de ligação ao antígeno.

Além disso, a molécula de ligação ao antigeno pode ser uma proteína resultante da fusão entre um dominio de ligação ao FcRn humano e uma proteína receptora que se iiga a um alvo e inclui, por exemplo, proteí- nas de fuSão TNFR-FC, proteínas de fusão ILIR-FC, proteinas de fusão VEGFR-FC e proteínas de fusão CTLA4-FC (Nat Med. 2003, Jan; 9(1): 47-52; 5 BioOrugs. (2006) 20(3): 151-60)- Se estas proteínas de fusão do receptor e do dominio de ligação ao FcRn humano se ligarem a uma molécula alvo em uma forma dependente da concentração de cálcio, é possível facilitar a ab- sorção de antígeno nas células por moléculas de ligação ao antígeno, facili- tar a redução da concentração de antígenos no plasrna pela administração 10 das moléculas de Iigação ao antígeno, e melhorar a retenção plasmática das moléculas de Iigação ao antígeno, e aumentar o número de vezes de ligação ao antígeno por uma única molécula de ligação ao antígeno.

Além disso, a molécula de ligação ao antígeno pode ser uma . proteina de fusão entre uma proteina ligante artificial que se Iiga a um alvo e 15 tem um efeito neutralizante e um domínio de ligação ao FcRn humano; e uma proteina ligante artificial inclui, por exemplo, IL-6 mutante (EMBO J. 1994 Dez 15: 13(24): 5863-70). Se tais proteinas de fusão ao ligante artifici- ais puderem se Iigar às moléculas alvo de uma forma dependente da con- centração de cálcio, é possível facilitar a absorção de antigeno nas células 20 pelas rnoléculas de ligação ao antigeno, facilitar a redução da concentração de antlgenos no plasma pela administração de moléculas de ligação ao antí- geno, melhorar a retenção plasmática das moléculas de ligação ao antigeno, e aumentar o número de vezes de ligação ao antígeno por uma única molé- cula de ligação ao antígeno. 25 Além disso, cadeias de açúcar podem ser modificadas nos anti- corpos da presente invenção.

Os anticorpos com cadeias de açúcar altera-- das incluem, por exemplo, anticorpos com glicosilação modificada (WO 99/54342 e similares), anticorpos que são deficientes na fucose ligada à ca- deia de açúcar (WO 00/61739; WO 02/31140; WO 2006/067847; WO 30 2006/067913), e anticorpos que têm cadeias de açúcar com GICNAc bifurca- do (WO 02/79255). Além da concentração de cálcio ionizado, as condições usadas para medir a atividade de ligação ao antígeno podem ser adequadamente seiecionadas pelos versados na técnica, e elas não são particularmente limi- tadas.

Por exemplo, as condições de uso de tampão HEPES a 37°C podem ser usadas para a determinação da atividade.

Por exemplo, Biacore (GE 5 Healthcare) ou similares pode ser usado para determinar a atividade.

Quan- do o antlgeno é um antígeno solúvel, a atividade de uma molécula de liga- ção ao antígeno de se ligar ao antígeno solúvel pode ser determinada atra- vés do carregamento do antigeno como um analito sobre um chip com a mo- lécula de ligação ao antígeno imobilizada.

Alternativamente, quando o antí- lO geno for um antígeno do tipo membrana, a atividade da molécula de ligação ao antígeno de se Iigar ao antígeno do tipo membrana pode ser determinada através do carregamento da molécula de ligação ao antigeno como um ana- lito sobre um chip com antigeno imobilizado.

Nas moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção, a razão entre a atividade de ligação ao antígeno sob uma condição de baixa concentração de cálcio e aquela sob uma condição de alta concentração de cálcio não é particularmente limitada contanto que a atividade de ligaçâo ao antígeno seja menor sob a condição de baixa concentração de cálcio do que sob a condição de alta concentração de cálcio.

Entretanto, o valor de KD (Ca 3 µM)/KD (Ca 2 mM), que é um razão entre a constante de dissociação (KD) contra um antígeno sob uma condição de baixa concentração de cálcio e aquela sob uma condição de alta concentração de cálcio, é, de preferência, 2 ou mais, com mais preferência, 10 ou mais, e com mais preferência ainda 40 ou mais.

O limite superior do valor de KD (Ca 3 µM)/KD (Ca 2 mM) não é particularmente limitado e pode ser qualquer valor, por exemplo, 400, 1.000 ou 10.000, contanto que a produção seja possÍvel utilizando as tecnologias dos versados na técnica.

Quando o antígeno for um antígeno solúvel, o valor da atividade de ligação ao antigeno pode ser apresentado em termos da constante de dissociação (KD)- Por outro lado, quando o antígeno for um antígeno do tipo membrana, a atividade pode ser apresentada em termos da constante de dissociação aparente (KD aparente)- A constante de dissociação (KD) e a ção na diferença na atividade de ligação ao antígeno desde que a atividade de ligação ao antígeno seja menor sob uma condição de baixa concentração de cálcio do que sob uma condição de alta concentração de cálcio. É ainda aceitável que a atividade de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação 5 ao antígeno seja apenas ligeiramente menor sob uma condição de baixa concentração de cálcio. Em uma modalidade preferencial, para uma molécula de ligação ao antígeno da presente invenção que tem uma atividade de ligação ao antí- geno menor sob uma condição de baixa concentração de cálcio do que sob uma condição de alta concentração de cálcio, o valor de KD (baixo Ca)/KD (alto Ca), que é a razão de KD entre as condições com baixa e alta concen- tração de cálcio, é 2 ou mais, de preferência, o valor de KD (baixo Ca)/KD (alto Ca) é 10 ou mais, e com mais preferência, o valor de KD (baixo Ca)/KD (alto Ca) é 40 ou mais. O limite superior do valor de KD (baixo Ca)/KD (alto Ca) não é particularmente limitado, e pode ser qualquer valor, tal como 400,

1.000, e 10.000 desde que ele possa ser produzido por técnicas conhecidas pelos versados na técnica. Em uma outra modalidade preferencial, para uma molécula de li- gação ao antígeno da presente invenção que tem uma atividade de ligação ao antígeno menor sob uma condição de baixa concentração de cálcio do que sob uma condição de alta concentração de cálcio, o valor de kd (baixo Ca)/kd (alto Ca), que é a razão entre os valores de kd para um antígeno em uma condição de baixa concentração de cálcio e uma condição de alta concentração de cál- cio, é 2 ou mais, de preferência, o valor de kd (baixo Ca)/kd (alto Ca) é 5 ou mais, com mais preferência, o valor de kd (baixo Ca)/kd (alto Ca) é 10 ou mais, e com mais preferência ainda, o valor de kd (baixo Ca)/kd (alto Ca) é 30 ou mais. O limite superior do valor de kd (baixo Ca)/kd (alto Ca) não é particularmente limitado, e pode ser qualquer valor, tal como 50, 100, e 200 desde que ele pos- sa ser produzido por técnicas conhecidas pelos versados na técnica. Uma molécula de ligação ao antígeno da presente invenção po- de ter ainda a atividade de ligação ao FcRn humano acima mencionada sob uma condição de pH neutro. Pelo uso da atividade de ligação ao FcRn hu-

mano sob Llma condição de pH neutro em combinação com uma atividade de ligação ao antígeno dependente da concentração de cálcio, é possivel melhorar a função de promover a absorção de antígenos pelas células, a função de aumentar o número de vezes de ligação ao antígeno por uma mo-

5 lécula de ligação ao antígeno, função de promover a redução da concentra- ção de antígenos no plasma pela administração de uma molécula de ligação ao antígeno, ou a função de melhorar a retenção plasmática de uma molécu- la de ligação ao antigeno.

Uma molécula de ligação ao antigeno da presente invenção po- lO de ter ainda a atividade de ligação ao antígeno dependente de pH acima mencionada, isto é, uma menor atividade de ligação ao antígeno sob uma condição de pH ácido do que sob uma condição de pH neutro.

Pelo uso da atividade de ligação ao antigeno dependente de pH em combinação corn . uma atividade de ligação ao antígeno dependente da concentração de cálcio, 15 é possivel melhorar a função de promover a absorção de antígenos pelas células, a função de aumentar o número de vezes de ligação ao antígeno por uma molécula de ligação ao antígeno, função de promover a redução da concentração de antígenos no plasma pela administração de uma molécula de ligação ao antigeno, ou a função de melhorar a retenção plasmática de 20 uma n7o|écu|a de ligação ao antígeno.

Além disso, uma molécula de ligação ao antígeno da presente invenção pode ter qualquer outra propriedade, desde que ela tenha uma ati- vidade de ligação ao antigeno menor sob uma condição de baixa concentra- ção de cálcio do que sob uma condição de alta concentração de cálcio.

Por 25 exemplo, a molécula de ligação ao antígeno pode ser uma molécula de liga- ção ao antígeno agonista ou molécula de ligação ao antigeno antagonista.

As moiéculas de ligação ao antígeno preferenciais da presente invenção in- cluem, por exemplo, moléculas de ligação ao antígeno antagonistas.

Tal mo- lécula de ligação ao antígeno antagonista é tipicamente uma molécula de 30 ligação ao antigeno que inibe a transdução de sinal intracelular mediada pe- lo receptor por inibir a ligação entre um ligante (agonista) and its receptor.

Além disso, uma molécula de ligação ao antigeno à qual a ativi-

dade de ligação ao aritigeno dependente de pH é conferida pode ter uma substituição de histidina por pelo menos um aminoácido, ou uma inserção de ao menos uma histidina.

Entretanto, não há limitação específica ao antígeno ao qual uma 5 molécula de ligação ao antígeno da presente invenção se liga, e a molécula de ligação ao antígeno pode se ligar a qualquer antígeno.

Tais antígenos incluem, por exemplo, antigenos de membrana como proteínas receptoras (receptores do tipo membrana e receptores solúveis) e marcadores de su- perfície celular, e antígenos solúveis como citocinas.

Exemplos especificos 10 de outros antígenos são descritos acima.

Métodos de seleção A presente invenção fornece métodos de seleção de uma molé- cula de ligação ao antígeno que tem uma atividade de ligação ao antígeno 0 menor sob uma condição de baixa concentração de cálcio do que sob uma 15 condição de alta concentração de cálcio.

A presente invenção fomece, adi- cionalmente métodos de seleção de uma molécula de ligação ao antígeno que tem pelo menos uma função selecionada a partir de: (i) função de promover a absorção de um antigeno pelas célu- las; 20 (ii) função de se ligar a um antígeno duas ou mais vezes; (iii) função de promover a redução da concentração plasmática de antlgeno; e (iv) função de destaque na retenção plasmática- Especificamente, a presente invenção fornece métodos para se- 25 lecionar uma molécula de iigação ao antigeno, que compreende as etapas de (a) a (C) abaixo: (a) determinar a atividade de ligação ao antigeno de uma molé- cula de ligação ao antígeno sob uma condiçào de baixa concentração de cálcio; 30 (b) determinar a atividade de ligação ao antigeno da molécula de ligação ao antigeno sob uma condição de alta concentração de cálcio; e (c) selecionar a molécula de ligação ao antígeno que tenha me-

nor atividade de ligação ao antigeno sob uma condição de baixa concentra- ção de cálcio do que sob uma condição de alta concentração de cálcio; A presente invenção fornece, adicionalmente, métodos para se- lecionar uma molécula de ligação ao antígeno, que compreende as etapas 5 de (a) a (c) abaixo: (a) colocar um antígeno em contato com uma molécula de liga- ção ao antígeno ou uma biblioteca de moiéculas de ligação ao antígeno sob uma condição de alta concentração de cálcio; (b) colocar a molécula de ligação ao antígeno na etapa (a) sob uma condição de baixa concentração de cálcio; e (C) obter uma molécula de ligação ao antigeno que se dissocia na etapa (b)- A presente invenção fornece, adicionalmente, métodos para se- lecionar uma molécula de ligação ao antígeno, que compreende as etapas de (a) a (d) abaixo: (a) colocar um antígeno em contato com uma molécula de liga- ção ao antígeno ou uma biblioteca de moléculas de ligação ao antígeno sob uma condição de baixa concentração de cálcio; (b) selecionar uma molécula de ligação ao antígeno que não se ligue ao antigeno da etapa (a); (C) permitir que a molécula de ligação ao antígeno selecionado na etapa (b) se ligue ao antígeno sob uma condição de alta concentração de cálcio; e (d) obter uma molécula de ligação ao antígeno que se liga ao antigeno na etapa (c). A presente invenção fornece, adicionalmente, métodos para se- Iecionar uma molécula de ligação ao antígeno, que compreende as etapas de (a) a (C) abaixo: (a) colocar uma molécula de ligação ao antigeno ou uma biblio- teca moléculas de ligação ao antigeno em contato com uma coluna com an- tígeno imobilizado sob uma condiçâo de alta concentração de cálcio; (b) eluir uma molécula de ligação ao antigeno que se Iiga à coIu-

na na etapa (a) da coluna sob uma condição de baixa concentração de cál- cio; e (c) obter a molécula de ligação ao antígeno eluída na etapa (b). A presente invenção fornece, adicionalmente, métodos para se- 5 lecionar uma molécula de ligação ao antígeno, que compreende as etapas de (a) a (d) abaixo: (a) permitir que uma molécula de ligação ao antígeno ou uma bi- blioteca de moléculas de ligação ao antígeno passe através de uma coluna com antígeno imobilizado sob uma condição de baixa concentração de cál- cio; (b) coletar uma molécula de ligação ao antígeno eluída sem se ligar à coluna na etapa (a); (c) permitir que a molécula de ligação ao antígeno coletada na etapa (b) se ligue ao antígeno sob uma condição de alta concentração de cálcio; e (d) obter uma molécula de ligação ao antígeno que se liga ao antígeno na etapa (c). A presente invenção fornece, adicionalmente, métodos para se- lecionar uma molécula de ligação ao antígeno, que compreende as etapas de (a) a (d) abaixo: (a) colocar um antígeno em contato com uma molécula de ligação ao antígeno ou uma biblioteca de moléculas de ligação ao antígeno sob uma condição de alta concentração de cálcio; (b) obter uma molécula de ligação ao antígeno que se liga ao antígeno na etapa (a); (c) colocar a molécula de ligação ao antígeno obtida na etapa (b) sob uma condição de baixa concentração de cálcio; e (d) obter uma molécula de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação ao antígeno na etapa (c) é menor que a atividade de ligação ao antí- geno selecionado na etapa (b). As etapas acima podem ser repetidas duas ou mais vezes.

Des- ta forma, a presente invenção fornece métodos de seleção que compreen-

dem adicionalmente a etapa de repetir as etapas (a) a (C), ou (a) a (d) duas ou mais vezes nos métodos de seleção acima mencionados.

O número de vezes que as etapas (a) a (C) ou (a) a (d) são repetidas não é particularmen- te limitado, e é geralmente dez ou menos. 5 Nos métodos de seleção da presente invenção, a atividade de li- gação ao antígeno de uma molécula de Iigação ao antígeno sob uma condi- ção de baixa concentração de cálcio não é particularmente limitada, desde que ela seja uma atividade de Iigação ao antígeno em uma concentração de cálcio ionizado de 0,1 µM a 30 µM.

De preferência, a atividade de ligação ao antígeno inclui atividades de (igação ao antígeno em uma concentração de cálcio ionizado de 0,5 µM a 10 µM.

As concentrações de cálcio ionizado mais preferenciais incluem concentrações de cálcio ionizado no endossomo precoce in v/'vo.

Especificamente, a atividade de ligação ao antígeno inclui atividades a 1 µM a 5 µM.

Entretanto, a atividade de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno sob uma condição de alta concentra- ção de cálcio não é particularmente limitada, desde que ela seja uma ativi- dade de ligação ao antigeno em uma concentração de cálcio ionizado de 100 µM a 10 mM.

De preferência, a atividade de Iigação ao antígeno inclui atividades de iigação ao antígeno em uma concentração de cálcio ionizado de 200 µM a 5 mM.

As concentrações de cálcio ionizado mais preferenciais incluem concentrações de cálcio ionizado no plasma in vivo.

Especificamen- te, a atividade de ligação ao antígeno inclui atividades a 0,5 mM a 2,5 mM.

A atividade de Iigação ao antigeno de uma molécula de ligação ao antígeno pode ser determinada por rnétodos conhecidos pelos versados na técnica.

As condições adequadas além da concentração de cálcio ioniza- do podem ser selecionadas pelos versados na técnica.

A atividade de liga- ção ao antígeno de uma molécula de Íigação ao antígeno pode ser avaliada pelo uso de KD (constante de dissociação), KD aparente (constante de dis- sociação aparente), taxa de dissociação kd (taxa de dissociação), kd aparen- te (dissociação aparente: taxa de dissociação aparente), ou similares.

Elas podem ser determinadas por métodos conhecidos pelos versados na técnica, por exemplo, usando Biacore (GE Healthcare), Scatchard plot, FACS, ou similares, Na presente invenção, a etapa de selecionar uma molécula de ligação ao antígeno que tem uma atividade de ligação ao antígeno maior sob uma condição de alta concentração de cálcio do que sob uma baixa concen- 5 tração de cálcio é sinônimo da etapa de selecionar uma molécula de ligação ao antigeno que tem uma atividade de ligação ao antígeno menor sob uma condição de baixa concentração de cálcio do que sob uma condição de alta concentração de cálcio.

A diferença entre a atividade de Iigação ao antígeno sob uma condição de alta concentração de cálcio e aquela sob uma condição de bai- xa concentração de cálcio não é particularmente limitada, desde que a ativi- dade de ligação ao antígeno seja maior sob uma condição de alta concen- tração de cálcio do que sob uma condição de baixa concentração de cálcio.

Entretanto, a atividade de ligação ao antígeno sob uma condição de alta concentração de cálcio é, de preferência, duas vezes ou mais, com mais preferência, 10 vezes ou mais, e com mais preferência ainda 40 vezes ou mais a atividade de Iigação ao antigeno sob uma condição de baixa concen- tração de cálcio.

As moléculas de ligação ao antígeno a serem selecionadas pelo método de seleção da presente invenção podem ser quaisquer moléculas de ligação ao antigeno.

Por exemplo, as moléculas de ligação ao antigeno des- critas acima podem ser selecionadas.

Por exemplo, é possivel selecionar moléculas de ligação ao antígeno que possuem uma sequência natural ou molêculas de ligação ao antigeno que têm uma sequência de aminoácidos com uma substituição.

As rnoléculas de ligação ao antígeno que serão selecionadas pe- lo método de seleção da presente invenção podem ser preparadas por quaisquer métodos.

É possível usar, por exemplo, anticorpos pré-existentes, bibliotecas pré-existentes (bibliotecas de fagos, e similares), e anticorpos e bibliotecas preparadas a partir de células B de animais imunizados ou hibri- domas preparados pela imunização de animais, anticorpos ou bibliotecas obtidas pela introdução de aminoácidos capazes de quelar cálcio (por exem-

plo, ácido aspártico ou ácido glutâmico) ou mutações de aminoácidos não- naturais em tais anticorpos ou bibliotecas (bibliotecas com alto teor de ami- noácidos não-naturais ou aminoácidos capazes de quelar cálcio (por exem- plo, ácido aspártico ou ácido giutâmico), bibliotecas introduzidas com muta- 5 ções de aminoácidos não-naturais ou mutações com aminoácidos capazes de quelar cálcio (por exemplo, ácido aspártico ou ácido glutâmico) em sitios específicos, ou similares), ou similares. Uma molécula de Iigação ao antigeno que tem pelo menos uma função selecionada a partir de: (i) função de promover a absorção de antígeno pelas células, (ii) função de se ligar a um antígeno duas ou mais vezes, (iii) função de promover a redução da concentração plasmática de antígeno e (iv) função de destaque na retenção plasmática, pode ser obtida pelos métodos de seleção da presente invenção quando administrada a animais como seres humanos, camundongos, e ma- cacos. Desta forma, os métodos de seleção da presente invenção podem ser usados como um método de seleção para se obter uma molécula de li- gação ao antígeno que tem ao menos uma das funções descritas acima. Além disso, espera-se que tais moléculas de ligação ao antigeno obtidas pelos métodos de seleção da presente invenção sejam especialmen- te superiores como fármacos, pelo fato de a dose e a frequência de adminis- traçâo nos pacientes poder ser reduzida, e como resultado, a dosagem total pode ser reduzida. Desta forma, os métodos de seleção da presente inven- ção podem ser usados como métodos de seieção para moléculas de ligação ao antígeno para uso como composições farmacêuticas.

Métodos para produzir moléculas de ligação ao antiqeno A presente invenção fornece métodos de produção de uma mo- lécula de ligação ao antígeno que tem uma atividade de ligação ao antígeno menor sob uma condição de baixa concentração de cálcio do que sob uma condição de alta concentração de cálcio. A presente invenção fornece, adi- cionalmente métodos de produção de uma molécula de Iigação ao antigeno que tem pelo menos uma função selecionada a partir de: (i) função de promover a absorção de antígeno pelas células, (ii) função de se ligar a um antígeno duas ou mais vezes, (iii) função de promover a reducão da concentração plasmática .y

5 de antigeno e (iv) função de destaque na retenção piasmática.

Especificamente, a presente invenção fornece métodos para produzir uma molécula de ligação ao antígeno, que compreende as etapas de (a) a (e) abaixo: (a) determinar a atividade de ligação ao antígeno de uma molé- cula de ligação ao antígeno sob uma condição de baixa concentração de cálcio; (b) determinar a atividade de ligação ao antigeno de uma molé- cula de ligação ao antigeno sob uma condição de alta concentração de cál- cio; (C) selecionar a molécula de ligação ao antigeno que tenha me- nor atividade de ligação ao antígeno sob uma condição de baixa concentra- ção de cálcio do que sob uma condição de alta concentração de cálcio; (d) obter um gene que codifique a molécula selecionada na eta- pa (c): e (e) produzir a molécula de ligação ao antigeno usando o gene obtido na etapa (d). A presente invenção fornece, adicionalmente, métodos para produzir uma molécula de ligação ao antigeno, que compreende as etapas de (a) a (e) abaixo: (a) colocar um antigeno em contato com uma molécula de liga- ção ao antígeno ou uma biblioteca de moléculas de Iigação ao antígeno sob uma condição de alta concentração de cálcio; (b) colocar a molécula de ligação ao antigeno ligada ao antigeno na etapa (a) sob uma condição de baixa concentração de cálcio; (C) obter uma molécula de ligação ao antigeno que se dissocia na etapa (b):

(d) obter um gene que codifica a molécula de Iigação ao antíge- no obtido na etapa (c); e (e) produzir a molécula de ligação ao antígeno usando o gene isolado na etapa (d)- 5 As etapas (a) a (d) podem ser repetidas duas ou mais vezes.

Desta forma, a presente invenção fornece métodos que compreendem adi- cionalmente a etapa de repetir as etapas (a) a (d) duas ou mais vezes nos métodos descritos acima.

O número de vezes que as etapas (a) a (d) são repetidas não é particularmente limitado, e é geralmente dez ou menos. 10 Além disso, a presente invenção fornece métodos para produzir uma molécula de ligação ao antígeno, que compreende as etapas de (a) a (f) abaixo: (a) colocar um antígeno em contato com uma molécula de liga- . ção ao antigeno ou uma biblioteca de moléculas de Iigação ao antígeno sob 15 uma condição de baixa concentração de cálcio; (b) selecionar uma molécula de ligação ao antígeno que não se ligue ao antígeno da etapa (a); (c) colocar o antígeno em contato com a molécula de ligação ao antígeno selecionada na etapa (b) sob uma condição de alta concentração 20 de cálcio; (d) obter uma molécula de ligação ao antígeno que se liga ao antigeno na etapa (c); (e) obter um gene que codifica a molécula de ligação ao antíge- no obtido na etapa (d): e 25 (f) produzir a molécula de Iigação ao antígeno usando o gene obtido na etapa (e)- As etapas (a) a (e) podem ser repetidas duas ou mais vezes.

Desta forma, a presente invenção fornece métodos que compreendem adi- cionalmente a etapa de repetir as etapas (a) a (e) duas ou mais vezes nos 30 métodos descritos acima.

O número de vezes que as etapas (a) a (e) são repetidas não é particularmente limitado, e é geralmente dez ou menos.

A presente invenção fornece, adicionalmente, métodos para produzir uma molécula de ligação ao antígeno, que compreende as etapas de (a) a (e) abaixo: (a) colocar uma molécula de ligação ao antigeno ou uma biblio- teca moléculas de ligação ao antígeno em contato com uma coluna com an-- 5 tígeno imobilizado sob uma condição de alta concentração de cálcio; (b) eluir uma molécula de ligação ao antígeno ligada à coIuna na etapa (a) da coluna sob uma condição de baixa concentração de cálcio; (c) obter a molécula de ligação ao antígerio eluída na etapa (b); (d) obter um gene que codifica a molécula de ligação ao antíge- lO no obtido na etapa (C); e (e) produzir a molécula de ligação ao antígeno usando o gene obtido na etapa (e)- As etapas (a) a (d) podem ser repetidas duas ou mais vezes.

O número de vezes que as etapas (a) a (d) são repetidas não é particularmente limitado, e é geralmente dez ou menos, A presente invenção fornece, adicionalmente, métodos para produzir uma molécula de ligação ao antigeno, que compreende as etapas de (a) a (f) abaixo: (a) permitir que uma molécula de ligação ao antlgeno ou uma biblioteca de moléculas de ligação ao antígeno passe através de uma coluna com antígeno imobilizado sob uma condição de baixa concentração de cál- cio; (b) coletar uma molécula de Iigação ao antígerio eluida sem se ligar à coluna na etapa (a); (C) permitir que a molécula de ligação ao antlgeno coletada em (b) se ligue ao antígeno sob uma condição de alta concentração de cálcio; (d) obter uma molécula de ligação ao antigeno que se liga ao antigeno na etapa (C); (e) obter um gene que codifica a molécula de ligação ao antíge- no obtido na etapa (d): e

(f) produzir uma molécula de ligação ao antígeno usando o gene obtido na etapa (e). As etapas (a) a (e) podem ser repetidas duas ou mais vezes.

Desta forma, a presente invenção fornece métodos que compreendem adi- 5 cionalmente a etapa de repetir as etapas (a) a (e) duas ou mais vezes nos métodos descritos acima.

A presente invenção fornece, adicionalmente, métodos para produzir uma molécula de ligação ao antígeno, que compreende as etapas de (a) a (f) abaixo: (a) colocar um antígeno em contato com uma molécula de ligação ao antígeno ou uma biblioteca de moléculas de ligação ao antígeno sob uma condição de alta concentração de cálcio; (b) obter uma molécula de ligação ao antígeno que se liga ao antígeno na etapa (a); (c) colocar a molécula de ligação ao antígeno obtida na e- tapa (b) sob uma condição de baixa concentração de cálcio; (d) obter uma molécula de ligação ao antígeno que tem atividade de ligação ao antígeno na etapa (c) menor que a atividade de ligação ao an- tígeno selecionado na etapa (b); (e) obter um gene que codifica a molécula de ligação ao an- tígeno obtido na etapa (d); e (f) produzir a molécula de ligação ao antígeno usando o gene obtido na etapa (e). As etapas (a) a (e) podem ser repetidas duas ou mais vezes.

Desta forma, a presente invenção fornece métodos que compreendem adi- cionalmente a etapa de repetir as etapas (a) a (e) duas ou mais vezes nos métodos descritos acima.

As moléculas de ligação ao antígeno usadas nos métodos de produção da presente invenção podem ser preparadas por qualquer método, e incluem, por exemplo, anticorpos e bibliotecas existentes (bibliotecas de fagos, etc.), anticorpos e bibliotecas que são preparadas a partir de hibrido- mas obtidos peia imunização de animais ou a partir de células B de animais imunizados, anticorpos e bibliotecas preparadas pela introdução de aminoá- cidos capazes de quelar cálcio (por exempio, ácido aspártico e ácido giutâ- 5 mico) ou mutações de aminoácidos não-naturais em bibliotecas (bibliotecas com teor aumentado de aminoácidos capazes de quelar cálcio (por exemplo, ácido aspártico e ácido glutâmico) ou aminoácidos não-naturais, bibliotecas introduzidas com aminoácidos capazes de quelar cálcio (por exemplo, ácido aspártico e ácido glutâmico) ou mutações de aminoácidos não-naturais em sitios específicos, ou similares). Nos métodos de produção descritos acima, a atividade de liga- ção ao antígeno de uma molécula de ligação ao antigeno sob uma condição de baixa concentração de cálcio não é particularmente limitada, contanto que ela seja uma atividade de ligação ao antígeno em uma concentração de cálcio ionizado de 0,1 µM a 30 µM- De preferência, a atividade de ligação ao antígeno inclui uma atividade de ligação ao antigeno em uma concentração de cálcio ionizado de 0,5 µM a 10 µM.

As concentrações de cálcio ionizado mais preferenciais incluem a concentraçâo de cálcio ionizado no endossomo precoce in vivo.

Especificamente, a atividade de ligação ao antígeno inclui atividades de ligação ao antígeno a 1 µM a 5 µM.

Entretanto, a atividade de ligação ao antigeno de uma molécula de ligação ao antígeno sob uma con- dição de alta concentração de cálcio não é particularmente iimitada, desde que ela seja uma atividade de ligação ao antigeno em uma concentração de cálcio ionizado de 100 µM a 10 mM.

De preferência, a atividade de ligação ao antígeno inclui atividades de Iigação ao antígeno em uma concentração de cálcio ionizado de 200 µM a 5 mM- As concentrações de cálcio ionizado mais preferenciais incluem a concentração de cálcio ionizado no plasma in vivo.

Especificamente, a atividade de ligação ao antígeno inclui atividades de ligação ao antigeno a 0,5 mM a 2,5 mM.

A atividade de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno pode ser determinada por métodos conhecidos pelos versados na técnica.

Condições adequadas que não a concentração de cálcio ioniza-

do podem ser determinadas pelos versados na técnica. A etapa de selecionar uma molécula de ligação ao antígeno que tem uma atividade de ligação ao antígeno maior sob uma condição de alta concentração de cálcio do que sob uma condição de baixa concentração de 5 cáicio é sinônimo da etapa de selecionar uma molécula de ligação ao antí- geno que tem atividade de ligação ao antígeno maior sob uma condição de baixa concentração de cálcio do que sob uma condição de alta concentração de cálcio. A diferença entre a atividade de ligação ao antigeno sob uma 10 condição de alta concentração de cáicio e aquela sob uma condição de bai- xa concentração de cálcio não é particularmente limitada, desde que a ativi- dade de ligação ao antígeno seja maior sob uma condição de alta concen- tração de cálcio do que sob uma condição de baixa concentração de cálcio.

W A atividade de ligação ao antígeno sob uma condição de alta concentração 15 de cálcio é, de preferência, duas vezes ou mais, com mais preferência, 10 vezes ou mais, e com mais preferência ainda 40 vezes ou mais a atividade de ligação ao antígeno sob uma condição de baixa concentração de cálcio. Nos métodos de produção descritos acima, a ligação de um an- tigeno e de uma molécula de ligação ao antigeno pode ser executada em 20 qualquer estado, e o estado não é particularmente limitado. Por exemplo, a ligação de um antígeno e urna molécula de ligação ao antígeno pode ser executada por colocar um antigeno em contato com uma molécula de liga- ção ao antigeno imobilizada, ou por colocar uma molécula de Iigação ao an- tigeno em contato com um antigeno imobilizado. Alternativamente, a ligação 25 pode ser executada por colocar um antígeno em contato com uma molécula de ligação ao antígeno em uma solução. Além disso, método de produção da presente invenção pode ser usado para uma molécula de ligação ao antígeno descrita acima que tem a atividade de ligação ao FcRn humano em pH neutro, ou pode ser combinado 30 com um método para conferir ou aumentar a atividade de iigação ao FcRn humano em pH neutro. Quando o produção método da presente invenção for combinado com um método para conferir ou aumentar a atividade de Iigação ao FcRn humano em pH neutro, o método pode compreender, adicionalmen- te, a etapa de alterar os aminoácidos na molécula de ligação ao antígeno para conferir ou aumentar a atividade de ligação ao FcRn humano sob urna condição de pH neutro.

Entretanto, o dominio de ligação ao FcRn humano

5 preferencial de uma molécula de ligação ao antigeno que tem a atividade de ligação ao FcRn humano em pH neutro inclui, por exemplo, os domínios de ligação de FcRn humano descritos acima que possuem a atividade de liga- ção ao FcRn humano em pH neutro.

Desta forma, os métodos de produção da presente invenção podem, adicionalmente, compreender a etapa de seie- lO cionar com antecedência uma molécula de ligação ao antígeno que tem um domlnio de ligação ao FcRn humano com maior atividade de ligação ao F- cRn humano em pH neutro e/ou alterar os aminoácidos em uma moiécula de ligação ao antígeno para conferir ou aumentar a atividade de ligação ao F- . cRn humano em pH neutro. 15 Além disso, método de produção da presente invenção pode ser usado para uma molécula de ligação ao antigeno que tem a atividade de ligação ao antígeno dependente de pH descrita acima, ou pode ser combi- nado com um método para conferir atividade de ligação ao antígeno depen- dente de pH (WO 2009/125825). Quando o método de produção da presente 20 invenção for combinado com um método para conferir atividade de ligação ao antígeno dependente de pH, o método pode compreender, adicionalmen- te, a etapa de selecionar com antecedência uma molécula de ligação ao an- tígeno que tem uma atividade de ligação ao antígeno menor sob uma condi- ção de pH ácido do que sob uma condição de pH neutro, e/ou alterar os a- 25 minoácidos em uma molécula de ligação ao antígeno para reduzir a ativida- de de ligação ao antígeno sob uma condição de pH ácido para ser menor que sob uma condição de pH neutro.

As moléculas de ligação ao antígeno preferenciais que tem uma atividade de ligação ao antígeno dependente de pH incluem, por exemplo, 30 moléculas de ligação ao antigeno nas quais pelo menos um aminoácido de uma molécula de ligação ao antigeno é substituído por histidina ou ao me- nos uma histidina é inserida em uma molécula de ligação ao antigeno.

Desta forma, o método de produçâo da presente invenção pode, adicionalmente, compreender a etapa de usar uma molécula de ligação ao antígeno na qual pelo menos um aminoácido é substituido por histidina ou ao menos uma his- tidina é inserida como uma molécula de ligação ao antigeno, ou a etapa de 5 substituir histidina por pelo menos um aminoácido ou inserir pelo menos uma histidina em uma molécula de ligação ao antígeno.

No método de produçáo da presente invenção, aminoácidos não-naturais podem ser usados ao invés de histidina.

Desta forma, A pre- sente invenção pode ser compreendida com aminoácidos não-naturais no 10 lugar da histidina descrita acima- Os métodos de produção da presente invenção podem produzir moléculas de Iigação ao antígeno que têm pelo menos uma função selecio- nada a partir de: ¥

(i) função de promover a absorção de antigeno pelas células, 15 (ii) função de se ligar a um antigeno duas ou mais vezes, (iii) função de promover a redução da concentração plasmática de antigeno e (iv) função de destaque na retenção plasmática, quando administrada a animais como seres humanos, camun- 20 dongos, e macacos.

Desta forma, método de produção da presente invenção pode ser usado como um método para produzir uma molécula de ligação ao antigeno que tem ao menos uma das funções descritas acima.

Além disso, espera-se que tais moléculas de Iigação ao antígeno sejam especialmente superiores como fármacos, porque a dose e a frequên- 25 cia de administração nos pacientes podem ser reduzidas e como resultado, a dosagem total pode ser reduzida.

Desta forma, os métodos de produção da presente invenção podem ser usados como métodos para produzir molé- culas de ligação ao antígeno para uso como composições farmacêuticas.

Os genes obtidos através dos métodos de produção da presente 30 invenção são tipicamente carregados por (inseridos em) vetores apropriados e então introduzidos nas células hospedeiras.

Os vetores não são particu- larmente limitados contanto que mantenham de forma estável os ácidos nu-

cléicos inseridos. Por exemplo, quando a E. co/i é utilizada como o hospedei- ro, os vetores de clonagem preferidos incluem o vetor pBluescript (Stratage- ne); entretanto, vários vetores disponíveis comercialmente podem ser utili- zados. Quando são utilizados vetores para produzir as moléculas de ligação 5 ao antigeno da presente invenção, os vetores de expressão são particular- mente úteis- Os vetores de expressão não são particularmente limitados contanto que os vetores expressem as moléculas de ligação ao antigeno in vitro, em E. CO/i, em células de cultura ou no corpo de um organismo. Por exemplo, o vetor pBEST (Promega) é preferido para expressão in vitro o ve- lO tor pET (lnvitrogen) é preferido para E. coli; o vetor pME18S-FL3 (No. de Acesso do Gen8ank ABO09864) é preferido para células de cultura; e o vetor pME18S (Mol Cell Biol. (1988) 8: 466-472) é preferido para corpos de orga- nismos. Os DNAs da presente invenção podem ser inseridos nos vetores - através de métodos convencionais, por exemplo, através de ligação utilizan- 15 do sÍtios de enzimas de restrição (Current protocols in Molecular Biology, edit. Ausubel e outros, (1987) Publish. John Wiley & Sons, Seção 11.4- 11-11).

As células hospedeiras anteriores não são particularmente limi- tadas e várias células hospedeiras podem ser utilizadas dependendo da fina- 20 lidade. Os exemplos de células para a expressão das moléculas de ligação ao antigeno incluem células bacterianas (tais como aquelas de Streptococ- cus, Staphylococcus, E. coli, Streptomyces, e Bacil/us subtilis), células euca- rióticas (tais como aquelas de levedura e Aspergillus), células de insetos (tais como Drosophila S2 e Spodoptera SF9), células de animais (tais como 25 células CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK293 e melanoma de Bowes) e células vegetais. Os vetores podern ser introduzidos em uma célula hos- pedeira através de métodos conhecidos, por exemplo, métodos de precipita- ção com fosfato de cálcio, métodos de eletroporação (Current protocols in Molecular Biology edit- Ausubel e outros (1987) Publish. John Wiley & Sons, 30 Seção 9.1-9.9), métodos de lipofecção e métodos de microinjeção. As células hospedeiras podem ser cultivadas através de méto- dos conhecidos. Por exemplo, quando forem utilizadas células de animais como um hospedeiro, DMEM, MEM, RPMI1640 ou IMDM pode ser utilizado como o meio de cultura.

Estas podem ser utilizadas com suplementos de soro tal como FBS ou soro fetal bovino (SFB). As células podem ser cultiva- das em culturas isentas de soro.

O pH preferido é de aproximadamente 6 até 5 8 durante o curso de cultura.

A incubação é realizada tipicamente a cerca de 30 até 40°C durante aproximadamente 15 até 200 horas.

O meio é trocado, aerado ou agitado, quando necessário.

Sinais de secreção apropriados podem ser incorporados aos po- lipeptídeos de interesse de forma que as moléculas de ligação ao antígeno 10 expressas na célula hospedeira sejam secretadas no lúmen do retículo en- doplasmático, no espaço periplasmático ou no ambiente extracelular.

Estes sinais podem ser endógenos às moléculas de ligação ao antigeno de inte- resse ou pode ser sinais heterólogos. e

Por outro lado, por exemplo, os sistemas de produção utilizando 15 animais ou plantas podem ser utilizados como sistemas para a produção de polipeptideos in v/'vo.

Um polinucleotideo de interesse é introduzido em um animal ou uma planta e o polipeptideo é produzido no corpo do animal ou na planta e então coletado- Os "hospedeiros" da presente invenção inciuem tais animais e pIantas. 20 O sistema de produção utilizando animais inclui aqueles que uti- lizam mamíferos ou insetos.

É possivel utilizar mamíferos tais como caprinos, suinos, ovinos, camundongos e bovinos (Vicki Glaser SPECTRUM Biotech- nology Applications (1993))- Os mamiferos podem ser animais transgênicos.

Por exemplo, um polinucleotídeo que codifica uma molécula de 25 ligação ao antígeno da presente invenção é preparado na forma de um gene de fusão com um gene que codifica um polipeptídeo especificamente produ- zido no leite, tais como a |3 caseína de caprinos.

A seguir, os embriões de caprinos recebem injeção de fragmentos de polinucleotideo contendo o gene de fusão e são então transplantados nas fêmeas de caprinos.

As moléculas 30 de ligação ao antigeno desejadas podem ser obtidas partindo do leite produ- zido pelos caprinos transgênicos, que nascem dos caprinos que receberam os embriões ou de sua prole.

Hormônios podem ser administrados quando apropriado para aumentar o voIume do leite que contém a molécula de liga- ção ao antigeno obtida pelos caprinos transgênicos (Ebert e outros, Bi- o/Technology (1994) 12: 699-702). lnsetos tais como bichos-da-seda podem ser utilizados para pro- 5 duzir as moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção.

Quando os bichos-da-seda são utilizados, baculovírus que carregam um polinucleotídeo que codifica uma molécula de ligação ao antígeno de interesse podem ser utilizados para infectar os bichos-da-seda e a molécula de ligação ao antige- no de interesse pode ser obtida partindo de seus fluidos corporais. 10 Além disso, quando plantas são utilizadas para produzir as mo- léculas de ligação ao antígeno da presente invenção, por exemplo, pode ser utilizado o tabaco.

Quando o tabaco é utiiizado, um polinucleotídeo que codi- fica uma molécula de ligação ao antígeno de interesse é inserido em um ve- - tor de expressão de planta, por exemplo, pMON 530 e então o vetor é intro- 15 duzido em bactérias, tais como Agrobacterium tumefaciens.

É então permiti- do que as bactérias infectem o tabaco tal como Nicotiana tabaeum, e as mo- léculas de ligação ao antígeno desejadas podem ser coletadas de suas fo- lhas (Ma e outros, Eur.

J. lmmunol. (1994) 24: 131-138). Alternativamente, é possÍvel infectar a lentilha d'água (Lemna minor)com bactérias similares. 20 Após a clonagem, as moléculas de ligação ao antígeno desejadas podem ser obtidas partindo das células de lentilha d'água (Cox KM e outros, Nat.

Biotechnol. 2006 Dez; 24(12): 1591-1597)- As moléculas de ligação ao antígeno obtidas dessa maneira po- dem ser isoladas do interior ou do exterior (tais como o meio e o leite) das 25 células hospedeiras e purificadas na forma de moléculas de ligação ao antí- geno substancialmente puras e homogêneas.

Os métodos para isolamento e purificação das moléculas de ligação ao antígeno não são particularmente limitados e os métodos de isolamento e purificação geralmente utilizados para a purificação de polipeptídeos podem ser utilizados.

As moléculas de 30 ligação ao antígeno podem ser isoladas e purificadas, através da seleção e da combinação de forma apropriada de, por exemplo, colunas cromatográfi- cas, filtração, ultrafiítração, coagulação, precipitação com solvente, extração com soIvente, destilação, imunoprecipitação, eletroforese em gel de SDS- poliacrilamida, focalização isoelétrica, diálise e recristalização- A cromatografia inclui, por exemplo, cromatografia por afinidade, cromatografia de troca iônica, cromatografia hidrofóbica, filtração em gel, 5 cromatografia em fase inversa e cromatografia por adsorção (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual.

Ed Daniel R.

Marshak e outros, (1996) Cold Spring Harbor Laboratory Press). Tais métodos cromatográficos podem ser realizados utilizando cromatografia em fase llquida tal como HPLC e FPLC.

As colunas utilizadas para cromato- lO grafia por afinidade incluem, colunas de proteina A e colunas de proteína G.

As colunas que utilizam proteina A incluem, por exemplo, Hyper D, POROS e Sepharose F.

F. (Pharmacia). Se necessário, uma molécula de ligação ao antigeno pode ser ¶

modificada arbitrariamente e os peptídeos podem ser parcialmente deleta- 15 dos permitindo que uma enzima de modificação de proteína apropriada atu- em antes ou após a purificação da molécula de ligação ao antigeno.

Tais enzimas de modificação de proteina incluem, por exemplo, tripsina, quimio- tripsina, lisil endopeptidases, proteínas quinases e glicosidases.

Composições farmacêuticas 20 A presente invenção refere-se ainda a composições farmacêuti- cas que incluem moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção, moléculas de ligação ao antígeno isoladas através dos métodos de verifica- ção da presente invenção ou moléculas de ligação ao antigeno produzidas através dos métodos de producão da presente invenção.

As moléculas de >

25 ligação ao antígeno da presente invenção, as moléculas de Iigação ao antí- geno isoladas pelo método de seleção da presente invenção ou as molécu- las de ligação ao antígeno produzidas pelo método de produção da presente invenção são moléculas de ligação ao antígeno que têm pelo menos uma função selecionada a partir de: 30 (i) funçào de promover a absorção de antígeno pelas células, (ii) função de se ligar a um antigeno duas ou mais vezes, (iii) função de promover a redução da concentração plasmática imK*:

de antígeno e (iv) função de destaque na retenção plasmática, são úteis como composições farmacêuticas, porque espera-se que a frequência de administração possa ser reduzida.

Além disso, compo- 5 sição farmacêutica da presente invenção pode compreender um veículo far- maceuticamente aceitável.

Na presente invenção, as composições farmacêuticas referem- se geralmente a agentes para o tratamento ou para a prevenção ou para o teste e para o diagnóstico de doenças.

As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser formuladas através de métodos conhecidos pelos versados na técnica.

Por exemplo, podem ser utilizadas de forma parenteral, na forma de injeções de soluções ou suspensões esterilizadas que incluem água ou outro líquido farmaceuticamente aceitávei.

Por exemplo, tais composições podem ser formuladas através da mistura na forma de dose unitária requerida na prática de fabricação de medicamento geralmente aprovada através da combinação, de forma apropriada, com veícuíos ou meios farmacoíogicamente aceitáveis, especificamente com água esterilizada, solução salina fisiológica, óleo vege- tal, emulsificante, suspensão, tensoativo, estabilizante, agente aromatizante, excipiente, veiculo, conseNante, aglutinante ou similar.

Em tais formulações, a quantidade de ingrediente ativo é ajustada para a obtenção de uma quan- tidade apropriada em uma faixa predeterminada.

As composições estêreis para injeção podem ser formuladas uti- lizando veículos tais como água destilada para injeção, de acordo com a prá- tica de formulação padronizada.

As soluções aquosas para injeção incluem, por exemplo, solu- ção salina fisiológica e soIuções isotônicas contendo dextrose ou outros ad- juvantes (por exemplo, D-sorbitol, D-manose, D-manitol e cloreto de sódio). É também possível utilizar em combinação solubilizantes apropriados, por exemplo, álcoois (etanol e similares), polialcoóis (propileno glicol, polietileno glicol e similares), tensoativos não iônicos (polissorbato 80(TM), HCO-50 e similares).

Os óleos incluem óleo de gergelim e óleos de soja.

O benzoato de benzila e/ou o álcool benzilico pode ser utilizado em combinação como solubilizantes.

É também possÍvel combinar tampões (por exemplo, tampão fosfato e tampão acetato de sódio), agentes suavizantes (por exemplo, clori- 5 drato de procaina), estabilizantes (por exemplo, álcool benzílico e fenol) e/ou antioxidantes.

Ampolas apropriadas são preenchidas com as injeções prepa- radas.

As composições farmacêuticas da presente invenção são prefe- rencialmente administradas de forma parenteral.

Por exemplo, as composi-- 10 ções podem estar na forma de dosagem para injeções, administração trans- nasal, administração transpulmonar ou administração transdérmica- Por e- xemplo, estas podem ser administradas de forma sistêmica ou Iocal através de injeção intravenosa, injeção intramuscular, in jeção intraperitoneal, in jeção . subcutânea ou similar. 15 Os métodos de administração podem ser apropriadamente sele- cionados considerando a idade e os sintomas do paciente.

Uma dose de uma composição farmacêutica contendo uma molécula de ligação ao antí- geno pode ser, por exemplo, de 0,0001 até 1.000 mg/kg para cada adminis- tração.

Alternativamente, a dose pode ser, por exemplo, de 0,001 até 20 100,000 mg por paciente.

Entretanto, a presente invenção nâo é limitada pelos valores numéricos descritos anteriormente.

As doses e os métodos de administração variam dependendo do peso, da idade, dos sintomas do paci- ente e similares.

Os versados na técnica podem ajustar doses e métodos de administração apropriados considerando os fatores descritos anteriormente. 25 Além disso, composição farmacêutica da presente invenção po- de ser uma composição farmacêutica usada para promover a absorção do antígeno nas células ou a redução da concentração do antígeno no plasma.

A presente invenção também se refere a métodos de promover a absorção de antigeno em células por uma molécula de ligação ao antigeno e 30 métodos para promover a redução da concentração do antígeno no plasma pela administração da molécula de ligação ao antígeno da presente inven- ção ou da molécula de ligação ao antígeno produzida pelo método de prodú-

ção da presente invenção.

A molécula de ligação ao antígeno pode ser ad- ministrada in vivo ou in vitro- O indivlduo a ser administrado inclui, por e- xemplo, animais não-humanos (camundongos, macacos, etc.) e seres hu-

manos. 5 A presente invenção também se refere a métodos para aumen- tar o número de vezes de (igação ao antígeno por uma molécula de ligação ao antlgeno e métodos para melhorar a retenção plasmática de uma molécu- la de Iigação ao antígeno pelo uso de uma molécula de ligação ao antígeno da presente invenção ou uma molécula de ligação ao antigeno produzida 10 pelo método de produção da presente invenção.

Os aminoácidos contidos nas sequências de aminoácidos da presente invenção podem ser modificados após a traduçâo.

Por exemplo, a modificaçâo de uma glutamina N-terminal em um ácido piroglutâmico através 0 da piroglutamilação é bem conhecida pelos versados na técnica.

Natural- 15 mente, tais aminoácidos modificados após a tradução são incluidos nas se- quências de aminoácidos na presente invenção.

Além disso, a presente invenção fornece kits para uso nos méto- dos da presente invenção, que compreendem pelo menos uma molécula de ligação ao antigeno da presente invenção.

Além do exposto acima, veículos 20 farmaceuticamente aceitáveis, meios, manuais de instrução descrevendo o método de uso e similares podem ser embalados nos kits.

A presente inverição também se refere a agentes para promover a absorção de antigeno nas células por moléculas de ligação ao antígeno, agentes para promover a redução da concentração de antigenos no plasma, 25 agentes para aumentar o número de vezes de Iigação ao antígeno por uma molécula de ligação ao antígeno, e agentes para melhorar a retenção plas- mática de moléculas de ligação ao antígeno, todos os quais compreendem como um ingrediente ativo uma molécula de ligação ao antigeno da presente invenção ou uma molécula de ligação ao antigeno produzida pelos métodos 30 de produção da presente invenção.

A presente invenção também se refere ao uso das moléculas de ligação ao antigeno da presente invenção ou moléculas de iigação ao antí-

geno produzidas pelos métodos de produção da presente invenção na pro- dução de agentes para promover a absorção de antígeno nas células pelas moléculas de ligação ao antígeno, agentes para promover a reduçáo da concentração de antígenos no plasma, agentes para aumentar o número de 5 vezes de ligação ao antígeno por uma molécula de ligação ao antigeno, ou agentes para melhorar a retenção plasmática das moléculas de ligação ao antígeno. A presente invenção também se refere às moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção ou moléculas de ligação ao antígeno pro- lO duzidas pelos métodos de produção da presente invenção para uso em mé- todos para promover a absorção de antigeno nas células pelas moléculas de ' ligação ao antígeno, agentes para promover a redução da concentração de antígenos no plasma, métodos para aumentar o número de vezes de ligação ao antígeno por uma molécula de ligação ao antígeno, e métodos para me- 15 lhorar a retenção plasmática das moléculas de ligação ao antigeno. Todos os documentos da técnica anterior citados no relatório descritivo estão aqui incorporadas a titulo de referência.

EXEMPLOS Aqui abaixo, a presente invenção será especificamente descrita 20 com referência aos Exemplos, mas não deve ser interpretada como sendo limitada aos mesmos. Exemplo 1 O conceito do efeito de aceleração da eliminação de antígenos dos antic-orpos de ligação ao antigeno dependente de cálcio (1-1) Efeito dos anticorpos de licjação ao antígeno dependente de pH para 25 acelerar a eliminação do antíqeno H54/L28-lgG1 descrito na WO 2009/125825 é um anticorpo an- tirreceptor de IL-6 humanizado. Fv4-lgG1 é um anticorpo antirreceptor de IL-6 humanizado que resulta de conferir ao H54/L28-(gG1 a propriedade de se ligar ao receptor de IL-6 humana solúvel de uma maneira dependente do 30 pH (que se liga sob condição neutra, mas é dissociado sob condição ácida). O teste in vivo descrito em WO 2009/125825 utilizando camundongos de- monstrou que a eliminação de receptor de IL-6 humana solúvel poderia ser muito acelerada em um grupo que recebeu administração de uma mistura de Fv4-lgG1 e receptor solúvel de IL-6 humana como o antigeno quando com- parado com um grupo que recebeu administração de uma mistura de H54/L28-IgG1 e receptor soIúvel de IL-6 humana como o antígeno. 5 O receptor de IL-6 humana solúvel ligado a um anticorpo comum que se liga ao receptor de IL-6 humana solúvel é reciclado para o plasma junto com o anticorpo através do FcRn.

Entretanto, um anticorpo que se liga ao receptor solúvel de IL-6 humana de uma maneira dependente do pH se dissocia do receptor soIúvel de IL-6 humana que foi ligado com o anticorpo 10 sob condições ácidas no endossomo.

O receptor solúvel de IL-6 humana dissociado é degradado no lisossomo. lsto pode acelerar enormemente a

" eliminação do receptor solúvel de IL-6 humana.

Então, o anticorpo que se liga ao receptor solúvel de IL-6 humana de uma maneira dependente do pH é reciclado para o plasma através do FcRn.

O anticorpo reciclado pode se 15 ligar a outro receptor solúvel de IL-6 humana novamente.

Através da repeti- ção deste ciclo, uma única molécula de anticorpo pode se Iigar repetidamen- te aos receptores solúveis de IL-6 humana várias vezes (figura 1). Entretanto, como descrito no WO 2009/125825, depois da liga- ção ao receptor de IL-6 humano do tipo de membrana, um anticorpo antirre- 20 ceptor de IL-6 humanizado comum é internalizado em um complexo de anti- corpo antirreceptor de IL-6 humanizado e receptor de IL-6 humanizado do tipo de membrana e depois degradado no lisossoma.

Em contrapartida, um anticorpo antirreceptor de IL-6 humanizado que se liga ao receptor de IL-6 de uma maneira dependente do pH, é reciclado para o plasma através da 25 dissociação do receptor de IL-6 humano do tipo de membrana sob condição ácida no endossoma depois da internalização em um complexo com o re- ceptor de IL-6 humano do tipo de membrana.

O anticorpo reciclado pode se ligar novamente ao receptor de IL-6 humana do tipo de membrana.

Pela re- petição desse ciclo, uma única molécula de anticorpo pode se ligar repeti- 30 damente ao receptor de IL-6 humana do tipo de membrana múltiplas vezes (Fig- 2). (1-2) Concentrações de pH e cálcio no plasma e endossoma

No mecanismo de ligação de um anticorpo dependente do pH mostrado nas figuras 1 e 2, é importante que o anticorpo se ligue fortemente a um antígeno no plasma e dissocie do antígeno no endossoma com base na diferença ambiental entre o plasma e o endossoma, isto é, diferença de 5 pH (pH 7,4 no plasma; pH 6,0 no endossoma). O grau de diferença ambien- tai entre o plasma e o endossoma é importante para diferenciar a habilidade de ligação ao antígeno de um anticorpo que se Iiga dependendo do pH no plasma e no endossoma.

Uma diferença de pH é devido a uma diferença de na concentração do íon hidrogênio.

Especificamente, a concentração de íon hidrogênio no plasma (pH 7,4) é cerca de 40 nM, enquanto que a concentra- ção no endossoma (pH 6,0) é cerca de 1.000 nM- O fator concentração (íon hidrogênio) difere em cerca de 25 vezes entre o plasma e o endossoma.

Os presentes inventores entendem que, a fim de obter o meca- nismo ilustrado nas figuras 1 e 2 facilmente ou para intensificar o mecanismo, poderá ser benéfico usar um anticorpo que dependa de um fator que tenha uma diferença de concentração maior entre o pIasma e o endossoma do que a diferença de concentração de Íon hidrogênio entre os dois.

Portanto, os inventores procuraram um fator cuja concentração fosse consideravelmente diferente entre o plasma e o endossoma.

Como resultado, foi identificado o cálcio.

A concentração de cálcio ionizado é de cerca de 1,1 a 1,3 mM no plasma e de cerca de 3 µM no endossoma.

A concentração do fator (cálcio) difere em cerca de 400 vezes entre os dois.

Portanto, a proporção foi encon- trada ser maior do que a diferença na concentração do ion hidrogênio (25 vezes). Especificamente, o mecanismo ilustrado nas Figuras 1 e 2 foi espe- rado ser obtido ou intensificado mais prontamente pelo uso de um anticorpo com ligação dependente da concentração de cálcio ionizado, que se liga a um antigeno sob uma condição de alta concentração de cálcio (1,1 a 1,3 mM), mas que se dissocia do antígeno sob uma condição de baixa concen- tração de cálcio (3 µM). Adicionalmente, no WO 2009/125825, anticorpos com ligação dependente do pH, cujas propriedades mudam entre pH 7,4 e 6,0, foram produzidos pela introdução de histidina.

A histidina é eletricamente neutra sob a condição neutra no plasma, mas positivamente carregada sob a con- dição ácida no endossoma.

A dependência do pH pode ser conferida à inte- ração antígeno-anticorpo pela utilização da alteração na carga elétrica da histidina.

Entretanto, como mostrado na figura 3, quando a histidina é usada, 5 a fim de ligar a um antigeno no piasma e se dissociar do antigeno no endos- soma, os reslduos de histidina do anticorpo precisam interagir com aminoá- cidos positivamente carregados do antigeno ou aminoácidos que sirvam po- tencialmente como doador de ligação com o hidrogênio.

Portanto, um epíto- po do antigeno, ao qual o anticorpo com ligação dependente do pH se liga para exercer seu efeito-alvo, tem que conter aminoácidos positivamente car- regados do antigeno ou aminoácidos que sirvam potencialmente como doa- dor de ligação com o hidrogênio.

Por outro lado, como mostrado na figura 4, um anticorpo com li- gação dependente do cálcio é presumido se ligar a um antígeno através de um íon de cálcio.

Nesse caso, o epitopo do antigeno contém aminoácidos negativamente carregados ou aminoácidos que potencialmente servem co- mo aceptor de ligação de hidrogênio, que sejam capazes de quelar o Íon de cálcio.

Portanto, tais anticorpos podem atingir epítopos que não são atingi- dos pelos anticorpos com ligação dependente do pH produzidos pela intro- dução de histidina.

Adicionalmente, como mostrado na figura 5, espera-se que os epítopos que possuam uma grande variedade de propriedades pos- sam ser atingidos pelo uso de anticorpos com dependência de cálcio e de- pendência de pH- Exemplo 2 lsolamento de anticorpos com ligação dependente de Ca de uma biblioteca de anticorpos humanos usando a técnica de apresen- tação em fago (2-1) Preparação da biblioteca de apresentação em façjo de anticorpos hu- manos naives Várias bibliotecas de apresentação em fago de anticorpo huma- no que apresentam domínios Fab que compreendem uma sequência de an- ticorpo humano foram construidas usando como um modelo poI1A-RNA pre- parado a partir de PBMC humanas, poI1A-RNA humano disponivel no mer-

cado ou semelhantes, de acordo com Methods MOI Bio). 2002, 178: 87-100. (2-2) lsolamento de fragmentos de anticorpo com liqação dependente de Ca das bibliotecas pela técnica de "bead panninq" A pri.meira seleção a partir das bibliotecas de apresentação em 5 fago de anticorpo humano foi obtida pelo enriquecimento de fragmentos de anticorpo que possuem habilidade de ligação ao anticorpo ou pelo enrique- cimento usando a habilidade de ligação dependente de Ca como um indica- dor.

Os fragmentos de anticorpo com habilidade de ligação dependente de Ca foram enriquecidos pela eluição de fagos através da quelação do íon Ca 10 com EDTA depois que os fragmentos de anticorpo foram ligados a um antí- geno na presença de ion de Ca.

O receptor de IL-6 humano biotinilado foi

- usado como o antígeno.

Os fagos foram produzidos com E. co/i que carregam fagomí- deos que apresentam fago construídos da maneira descrita acima.

O meio 15 de cultura resultante foi precipitado usando NaCl 2,5 M/PEG 1O°/j.

Depois o precipitado foi diluído com TBS para preparar a soIução de bibiioteca de fago.

BSA e CaC|2 foram adicionados à soIução de biblioteca de fago tal que as concentrações finais de BSA e cálcio ionizado eram de 4°/0 e 1,2 mM, res- pectivamente.

O "panning" foi realizado de acordo com um método de pan- 20 ning convencional usando esferas magnéticas imobilizadas com antígeno (J lmmunol Methods. 2008 Mar 20, 332(1-2): 2-9; J lmmunol Methods. 2001 Jan 1, 247(1-2): 191-203; Biotechnol Prog. 2002 Mar-Abr, 18(2): 212-20; Mol Cell Proteomics. 2003 Fev, 2(2): 61 9)- As esferas magnéticas usadas eram esferas revestidas com NeutrAvidin (Sera-Mag Speed8eads NeutrAvidin- 25 coated) e esferas revestidas com Streptavidin (Dynabeads M-280 Streptavi- din). Especificamente, 250 pmol do antígeno biotinilado foram adicio- nados à solução de biblioteca de fago preparada e contados com o antígeno em temperatura ambiente por 60 minutos- Esferas magnéticas bloqueadas 30 com BSA foram adicionadas e incubadas para a ligação em temperatura ambiente por 15 minutos.

As esferas foram lavadas uma vez com 1 mL de 1,2 mM CaCl2/TBS (TBS contendo 1,2 mM de CaC|2). Depois, os fagos fo-

ram coletados pela eluição usando um método padronizado que enriquece os fragmentos de anticorpo que possuem atividade de ligação ou pela sus- pensão das esferas em EDTA 2 mM /TBS (TBS contendo 2% de EDTA) para enriquecer os fragmentos de anticorpo que possuem habilidade de Iigação 5 dependente de Ca.

E. co/i foi infectada peía adição de 10 mL da cepa TGl de E. coli durante a fase de crescimento logaritmico (OD600 0,4-0,5) para a suspensão de fago preparada e cultivada a 37°C por uma hora com agitação cuidadosa.

A E. co/i infectada foi plaqueada sobre placas (225 mm x 225 mm). Novamente a cultura foi iniciada com essa E. co/i para cultivar os fagos.

No segundo e subsequente panning, o enriquecimento foi obtido usando a habilidade de Iigação dependente de Ca como um indicador.

Es- pecificamente, 40 pmol do antígeno biotinilado foram adicionados à soIução de biblioteca de fago preparada.

Os fagos foram colocados em contato com o antigeno em temperatura ambiente por 60 minutos.

Esferas magnéticas bloqueadas com BSA foram adicionadas à suspensão e incubadas para a ligação em temperatura ambiente por 15 minutos.

As esferas foram lavadas uma vez com 1 mL de CaCl2 1,2 mM ITBST (TBS contendo 1,2 mM de CaC|2 e 0,1% de Tween-20) e CaCI2 1,2 mM /TBS.

Depois, 0,1 mL de EDTA 2 mM /TBS (TBS contendo EDTA 2%) foi adicionado as esferas em temperatura ambiente e imediatamente depois da suspensão, as esferas foram removi- das usando Magnet Stand para coletar a suspensão de fago.

A suspensão de fago resultante foi adicionada a 10 mL da cepa TGl de E. co/i durante a fase de crescimento logaritmico (OD600 0,4-0,5) para infectar a E- co/i que foi então cultivada a 37°C por uma hora com agitação cuidadosa.

A E. co/i infectada foi plaqueada sobre placas (225 mm x 225 mm). Novamente a cul- tura foi iniciada com essa E. co/i e os fagos foram cultivados da maneira co- mo descrita acima.

O panning foi repetido duas vezes. (2-3) Avaliação por ELISA de façjo A partir de colônias isoladas de E- co/i obtidas pelo método des- crito acima, sobrenadantes de cultura contendo fago foram preparados de acordo com Methods MoI Biol. 2002, 178: 133-145. BSA e CaC|2 foram adicionados aos sobrenadantes de cultura contendo os fagos tal que as concentrações finais de BSA e cálcio eram de 4°/0 e 1,2 mM, respectivamente.

Os sobrenadantes foram submetidos ao E- LISA.

Placas de microtitulação StreptaWell 96 (Roche) foram revestidas u- sando 100 µL de PBS contendo o antígeno biotinilado.

Depois de lavar com 5 PBST (PBS contendo Tween 20 0,1%) para remover o antígeno, as pIacas foram bloqueadas com 250 |jL de BSA 4°/)/TBS por uma hora ou mais.

BSA 4%/TBS foi removido e depois os sobrenadantes de cultura preparados fo- ram adicionados às placas.

As placas foram deixadas descansar a 37°C por uma hora para obter a ligação do anticorpo que apresenta o fago.

Depois de lavar com 1,2 mM CaC|2/TBST (TBS contendo 1,2 mM de CaCl2 e 0,1% de Tween20), 1,2 mM CaC(,jTBS ou 1 mM EDTA/TBS foram adicionados as placas.

As placas foram deixadas descansar a 37°C com 30 minutos de in- cubação.

Depois de lavar com 1,2 mM CaC!2/TBST, as placas foram incuba- das com um anticorpo anti-M13 conjugado com HRP (Amersham Pharmacia Biotech) diluído com TBS contendo BSA 4% e 1,2 mM de cálcio ionizado.

Depois de lavar com 1,2 mM CaC|2/TBST, a detecção foi realizada com uma solução só de TMB (ZYMED). A absorbância a 450 nm foi determinada de- pois que a reação foi terminada pela adição de ácido suifúrico.

Os fragmen- tos de anticorpo considerados ter uma habilidade de ligação dependente de Ca foranj analisados quanto as suas sequências de nucleotídeo usando ini- ciadores especificos- (2-4) Expressão e purificação de anticorpo Clones julgadDs ter a habilidade de ligação dependente de Ca pelo ELISA de fago foram introduzidos em plasmideos de expressão em cé- lula animal.

Os anticorpos foram expressos usando o seguinte método.

As células da linhagem FreeStyle 293-F (invitrogen) derivada de rim fetal huma- no e aliquotas de 3 ml foram plaqueadas em cada poço de placas de 6 po- ços em uma densidade de 1,33 x 106 celulas/mL.

Os plasmideos preparados foram introduzidos nas células por um método de Iipofecção.

As células fo- ram cultivadas em uma incubadora com CO2 (37°C, 8% CÕ2, 90 rpm) por 4 dias.

A partir dos sobrenadantes de cultura obtidos, os anticorpos foram puri- ficados em rProtein A SepharoseTM Fast Flow (Amersham Biosciences) por um método conhecido por aqueles versados na técnica.

As concentrações de anticorpos foram determinadas pela medição da absorbância a 280 nm usando um espectrofotômetro.

As concentrações de anticorpo foram calcu- ladas a partir de valores determinados com base no coeficiente de extinção 5 determinado pelo método PACE (Protein Science 1995: 4: 2411-2423)- Exemplo 3 Avaliação dos anticorpos preparados quanto a sua a- tividade de Iigação dependente de Ca ao receptor de IL-6 humano Anticorpos 6RL#9-lgG1 (cadeia pesada SEQ ID NO: 1: cadeia Íeve SEQ ID NO: 2), 6Rk#12-lgG1 (cadeia pesada SEQ ID NO: 66: cadeia leve SEQ (D NO: 67), e FH4-(gG1 (cadeia pesada SEQ ID NO: 3: cadeia Ieve SEQ ID NO: 4) preparados no Exemplo 2 foram avaliados quanto a sua atividade de ligação ao receptor de interleucina 6 humano (hlL6R) em pH 7,4 usando Biacore TlOO (GE Healthcare). O ensaio foi realizado usando um tampão de corrida 0,05% de tensoativo P20, ACES 10 mmoll, NaCl 150 mmol/l (pH 7,4 ou 6,0) contendo 3 µM ou 2 mM de CaCl,. Depois de imobilizar uma quantidade adequada de Proteína A recombinante (Thermo Scientific) sobre Sensor chip CM4 (GE Healthcare) por um método de acoplamento, os anticorpos foram deixados se ligar sobre o chip sensor.

Depois, 10 mmol/l de glicina-HCl (pH 1,5) foram injetados para regenerar o chip sensor.

As medidas foram realizadas a 37°. Os sensorgra- mas obtidos pelas medidas são mostradas na Fig. 6. O resultado demons- trou que todos os anticorpos 6RL#9-lgG1, 6Rk#12-lgG1, e FH4-lgG1 ligados a hlL6R mais fracamente sob a condição de concentração de 3 µM de Ca2" do que sob a concentração de 2 mM de Ca'" Desses anticorpos, como anticorpos que exibem dependência do Ca, 6RL#9-lgG1 (cadeia pesada SEQ ID NO: 1; cadeia leve SEQ ID NO: 2) e FH4-!gG1 (cadeia pesada SEQ ID NO: 3: cadeia leve SEQ ID NO: 4) foram analisados cineticamente mais tarde.

H54/L28-lgG1 (cadeia pesada SEQ ID NO: 5: cadeia leve SEQ ÍD NO: 6) descrito no WO 2009/125825 foi usado como um anticorpo que não exibe dependência ao C.

As condições de alta e baixa concentração de íon de cálcio usadas foram 2 mM e 3 µM, respectivamente.

O receptor de IL-6 humano (ÍL-6R) foi usado como urn an-

tígeno.

Uma quantidade apropriada de proteína A (lnvitrogen) foi imobilizada sobre o Sensor chip CM4 (GE Healthcare) pelo método de acoplamento de amina e os anticorpos de interesse foram capturados sobre o chip.

Os dois tipos de tampões de corrida usados foram: [10 mmol/L de ACES, 150 5 mmoI/L de NaCl, 0,05% (p/v) de Tween20, 2 mmol/L de CaCl2 (pH 7,4)) ou [10 mmol/L de ACES, 150 mmol/L de NaCl, 0,05°/o (p/v) de Tween20, 3 µmol/l- de CaC|2 (pH 7,4)]. Todas as medidas foram realizadas a 37"C.

Cada tampão também foi usado para diluir IL-6R.

H54L28-lgG1 foi ensaiado pela injeção de cada tampão de corri- lO da como um branco e a solução diluida de IL-6R em uma taxa de fluxo de 20 µl/min por três minutos.

Depois, IL-6R foi deixado interagir com o anticorpo capturado sobre o chip sensor.

Depois, o tampão de corrida foi injetado em uma taxa de fluxo de 20 µl/min por dez minutos para observar a dissociação de IL-6R- Depois, 10 mmol/L de glicina-HCI (pH 1,5) foi injetada em uma ta- xa de fluxo de 30 µl/min por 30 segundos para regenerar o chip sensor.

A constante da taxa de associação KA (I/Ms) e a constante da taxa de dissoci- ação (l/s), que são parâmetros cinéticos, foram calculadas a partir do sen- sorgrama obtido pela medida.

Com base nos valores, a constante de disso- ciação Kd (M) entre cada anticorpo e o receptor de IL-6 humano foi calculada.

Cada parâmetro foi calculado usando o Biacore TlOO Evaluation Software (GE Healthcare). FH4-lgG1 e 6RL#9-lgG1 foram ensaiados pela injeção de cada tampão de corrida corno um branco e a solução diluída de ]L-6R em uma taxa de fluxo de 5 µl/min por 15 minutos.

Depois, 10 mmol/l de glicina- HCl (pH 1,5) foram injetados em uma taxa de fluxo de 30 µl/min por 30 se- gundos para regenerar o chip sensor.

Com base no modelo de afinidade do estado estacionário, a constante de dissociação Kd (M) foi calculada a partir do sensorgrama obtido pela medida.

Cada parâmetro foi calculado usando Biacore TlOO Evaluation Software (GE Healthcare)- As constantes de dissociação Kd entre IL-6R e cada anticorpo na presença de CaC|2 2 mM, que foram determinadas pelos métodos descri-

ímm tos acima, sâo mostradas na Tabela 7. H54/L28-lgG1 não mostrou qualquer diferença no nivel de ligação a IL-6R devido a diferença de concentraçâo de Ca. Enquanto isso, FH4-(gG1 e 6RL#9-lgG1 exibiram uma deficiência signi- ficativa de ligação na condição de baixa concentração de Ca (figuras 7, 8 e 5 9).

Tabela 7 j" lG jüij _ ) _ _ H54/L28-|gG1 9e-9_ _ ! 5.9e 7 Tii4-lgG1 _ " )" 2. 6E 7 6RL#9"KG1_ ") _ No caso de H54/L28-lgG1, K[j em uma concentração de Ca de 3 µM pode ser calculada pelos métodos simiíares usados para determinar Kd em uma concentração de Ca de 2 mM. No caso de FH4-lgG1 e 6RL#9-lgG1, por outro lado, é dificil calcular Kd em uma concentração de Ca de 3 µM pe- los métodos similares descritos acima, por que a ligação a IL-6R era quase indetectável na concentração de 3 µM de Ca. Entretanto, a Kd pode ser pre- dita pelo uso da fórmula 1 mostrada abaixo (Biacore TlOO Software Hand- book, BR-1006-48, AE 01/2007).

Fórmula 1 R,,=C"R,,,/ (Kd"C) +Rl Cada simbolo na fórmula 1 mostrada acima é definido abaixo.

Req (RU): niveis de ligação no estado estacionário Rmax (RU): capacidade de ligação do analito da superfície Rl (RU): contribuição em massa do índice de refração na amostra C (M): concentração do analito Kd (M): constante de dissociação do equilibrio A constante de dissociação Kç) entre IL-6R e cada anticorpo em uma concentração de Ca de 3 µmol/L, que pode ser predita pelo uso da fór- mula 1 acima, é mostrada como uma estimativa aproximada na Tabela 8.

Tabela 8 H54L28-lgG1 ! FH4-|gG1 6RL#9-|gG1 r,, (ru) _ ) 5 10 r,,, (ru) '" _À 39 72 Ri (ru) " ," ' 0 0 c (m) CI 5e-06 5E-06 "R, (m) ) 2. 2e- I 3. 4e-05 3-1E-D5 nas curvas de desnaturação obtidas por DSC, a temperatura do ponto médio da desnaturação térmica (valor de Tm) foi calculada para cada domínio Fab de cada anticorpo.

Os valores são mostrados na Tabela 10. Tabela 10 CONCENTRAÇÃO- SEQUÊNCIADA· DE-ÍON-CÁLCIO¶ ATni[°C] REGIÃO-VARIÁVEL ! M 2nM ! 2rd - 3µfÁ H54/L28 i 92-87 92,87 ) O.DO FH4 | 74,71 78,97 ) 4,26 6RLI19 ! 77.77 78,98 i 1,21 5 O resultado mostrado na Tabela 10 demonstra que para FH4 e 6RL#9, que exibem habilidade de ligação dependente de cálcio, os valores . de Tm de seus Fab variam dependendo da concentração de cálcio, enquan- to que o valor de Tm não muda em H54/L28, que não exibe habilidade de ligação dependente de cálcio.

As alterações observadas nos valores de Tm 10 de Fab em FH4 e 6RL#9 sugerem que os dominios Fab dos anticorpos esta- vam estabilizados pela ligação do íon de cálcio aos anticorpos. lsso implica em que o ion de cálcio se liga a FH4 e 6RL#9, enquanto que o íon de cálcio não se liga a H54/L28. Exemplo 5 Avaliação de anticorpos com Iigação dependente de 15 Ca quanto aos seus efeitos sobre a retenção do antígeno no plasma usando camundongos norrnais (5-1) Teste in vivo usando camundonqos normais Camundongos normais (camundongo 57BL/6J: Charles River japão) foram tratados com hslL-6R (receptor de IL-6 solúvel humano: prepa- 20 rado como descrito no EXEMPLO DE REFERENCIA 1) sozinho ou em com- binação com um anticorpo antirreceptor de IL-6 humana e depois avaliados quanto a dinâmica in vivo de hslL-6R e do anticorpo antirreceptor de IL-6 humana.

Uma solução de hslL-6R (5 µg/ml) ou uma solução mista de hslL- 6R e um anticorpo antirreceptor de IL-6 humana foi administrada a 10 ml/kg 25 uma vez na veia caudal.

Os anticorpos antirreceptor de IL-6 humana usados foram H54/L28-lgG1, 6RL#9-IgG1, e FH4-lgG1 descritos acima.

A concentração de hslL-6R era de 5 µg/ml em todas as soluções mistas.

Enquanto isso, a concentração de anticorpo antirreceptor de IL-6 humana difere com cada anticorpo.

A concentração de H54/L28-lgG1 era de 5 0,1 mg/mL, enquanto que aquelas de 6RL#9-lgG1 e FH4-lgG1 eram de 10 mg/mL.

O anticorpo antirreceptor de IL-6 humana está presente em excesso sobre hsiL-6R e portanto quase todo hslL-6R é presumido estar ligado ao anticorpo.

O sangue foi coletado com 15 minutos, 7 horas, 1 dia, 2 dias, 4 dias, 7 dias, 14 dias, 21 dias e 28 dias depois da administração.

O sangue coletado foi irnediatamente centrifugado a 4°C e 12.000 rpm por 15 minutos para separar o plasma, O plasma separado foi armazenado em um freezer a -20°C ou abaixo até a avaliação. (5-2) Determinação por ELISA da concentração do anticorpo antirreceptor de IL-6 humana no plasma de camundonqos normais A concentração do anticorpo antirreceptor de IL-6 humana no plasma do camundongo foi determinada por ELISA.

Primeiro, o Fragmento de Anticorpo F(ab')2 Anti-lgG Humana (específico para a cadeia ' ) (SIGMA) foi dispensado sobre placas Nunc-lmmuno, MaxiSorp (Nalge nunc lnternati- onal) e deixado descansar por uma noite a 4°C para preparar as placas com Anti-lgG humana imobilizada.

Amostras da curva de calibração que possuem concentrações plasmáticas de 0,64, 0,32, 0,16, 0,08, 0,04, 0,02, e 0,01 µg/mL e amostras de ensaio de plasma de camundongo diluídas 100 vezes ou mais foram preparadas e aliquotadas nas placas com Anti-lgG humana imobilizada.

As placas foram incubadas a 25°C por uma hora, seguida pela incubação com anticorpo anti-IL-6R humano biotinilado (R&D) a 25"C por uma hora.

Depois, Streptavidin-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Tech- nologies) foi reagido a 25°C por 0,5 horas.

O desenvolvimento de cor foi rea- lizado usando o substrato para micropoços TMB One Component HRP Mi- crowell Substrate (B1OFX Laboratories) como substrato.

Depois de parar a reação com ácido sulfúrico 1N (Showa Chemical), a absorbância a 450 nm foi medida com um leitor de microplaca.

As concentrações plasmáticas nos camundongos foram calculadas a partir da absorbância da curva de caiibra-

ção usando o programa analitico SOFTmax PRO (Molecular Devices). Os tempos decorridos para as concentrações plasmáticas dos anticorpos H54/L28-lgG1, 6RL#9-lgG1, e Fl-14-lgG1 em camundongos normais depois da administração intravenosa determinada por esse método são mostrados 5 na Fig. 10. (5-3) Medida da concentração plasmática de hslL-6R pelo método da eletro- quimioluminescência A concentração de hslL-6R no plasma do camundongo foi medi- da pelo método da eletroquimioluminescência- A curva de calibração das amostras de hslL-6R ajustadas para concentrações de 2,000, 1,000, 500, 250, 125, 62,5, ou 31,25 pg/mL e amostras de ensaio de plasma de camun- dongo diluidas 50 vezes ou mais foram preparadas. As amostras foram mis- turadas com uma solução de anticorpo monoclonal anti-lL-6R humano (R&D) marcado com rutênio com SULFO-TAG NHS Ester (Meso Scale Discovery), Anticorpo Anti-lL-6R Humano Biotinilado (R&D), e tocilizumab (cadeia pesa- da SEQ ID NO: 13: cadeia leve SEQ ID NO: 14), e depois deixadas reagir por uma noite a 4"C. O tampão de ensaio usado para a reação contém ED- TA 10 mM com o propósito de reduzir z concentração de Ca livre nas amos- tras, tal que quase todo hslL-6R esteja dissociado de 6RL#9-lgG1 ou FH4- lgGl nas amostras e ligado ao tocilizumab adicionado. Depois, as misturas foram aliquotadas na MA400 PR Streptavidin Plate (Meso Scale Discovery). Depois de outra hora de reação a 25°C, a placa foi lavada. lmediatamente depois, tampão de leitura (Read Buffer) T(X4) (Meso Scale Discovery) foi aliquotado na pIaca, a medição foi realizada usando o leitor SECTOR PR 400 (Meso Scale Discoveiy). A concentração de hSlL-6R foi calculada com base na resposta na curva de calibração usando o programa analítico, SOFTmax PRO (Molecular Devices). Os tempos decorridos da concentração plasmática de hslL-6R em camundongos normais depois da administração intravenosa determinada pelo método acima descrito são mostrados na Fig.

11. Os achados descritos acima demostram que hslL-6R adminis- trado sozinho foi eliminado muito rapidamente. Enquanto isso, a eliminação de hslL-6R era consideravelmente retardada quando hslL-6R era simultane- amente administrado com um anticorpo comum H54/L28-lgG1, que não exi- be a ligação a hslL-6R dependente de Ca.

Entretanto, a eliminação de hslL- 6R era significativamente acelerada quando hslL-6R era administrado simul- 5 taneamente com 6RL#9-(gG1 ou FH4-lgG1, que possui ligação 100 vezes ou mais a hslL-6R em uma maneira dependente de Ca.

Quando hslL-6R foi administrado em combinação com 6RL#9-lgG1 ou FH4-lgG1, a concentra- ção plasmática de hslL-6R no Dia 1, pode ser reduzida em 39 vezes ou duas vezes, respectivamente, em comparação a quando hslL-6R era administrado em combinaçâo com H54/L28-lgG1. lsso demonstra que os anticorpos com ligação dependente de cálcio podem acelerar a eliminação de um antígeno do plasma.

Exemplo 6 Testes para aperfeiçoar o efeito de aceleração da e- Iiminação de anticorpo com ligação ao antígeno dependente de Ca (prepara- ção de anticorpos) (6-1) Avaliação da liqação de anticorpo lqG a FcRn Anticorpos IgG possuem tempo de retenção plasmática mais longo como resultado da ligação a FcRn.

A ligação entre lgG e FcRn é ob- servada apenas sob condição ácida (pH 6,0). Ao contrário, a ligação é quase indetectável sob uma condição neutra (pH 7,4). Um anticorpo lgG é absorvi- do pelas células de uma maneira não específica.

O anticorpo retorna a su- perficie celular pela ligação a FcRn endossômico sob a condição ácida en- dossômica e depois se dissocia de FcRn sob a condição neutra do plasma.

Quando a ligação a FcRn sob condição ácida é perdida pela introdução de mutações no domínio Fc de lgG, o tempo de retenção do anticorpo é acen- tuadamente prejudicado, por que o anticorpo não é mais reciclado para o plasma a partir do endossorna.

Um método relatado para aperfeiçoar a retenção plasmática de um anticorpo IgG, é intensificar a ligação a FcRn sob condições ácidas.

Mu- tações de aminoácidos são introduzidas no domínio Fc de um anticorpo lgG para aperfeiçoar sua ligação a FcRn sob condições ácidas. lsso aumenta a eficiência da reciclagem para o plasma a partir do endossoma, resultando no aperfeiçoamento da retenção plasmática- Um requisito importante na substi- tuição de aminoácidos é não aumentar a Iigação a FcRn sob condições neu- tras.

Se um anticorpo lgG se liga a FcRn sob condições neutras, o anticorpo não se dissocia de FcRn sob a condição neutra do plasma mesmo que ele 5 retorne para a superfície celular pela ligação a FcRn sob a condição ácida do endossoma.

Nesse caso, a retenção plasmática é quase perdida por que o anticorpo IgG não é reciclado para o plasma.

Por exemplo, como descrito no J lmmunoi. (2002) 169(9): 5171- 80, um anticorpo lgGl modificado pela introdução de substituições de ami- lO noácidos, taí que o anticorpo resultante seja capaz de se ligar a FcRn de camundongo sob uma condição neutra (pH 7,4) foi relatado exibir retenção plasmática muito pobre quando administrado a camundongos.

Adicionalmen- te, como descrito em J lmmunol- (2009) 182(12): 7663-71; J Biol Chem. 2007 Jan. 19, 282(3): 1709-17: e J lmmunol. 2002 Nov. 1, 169(9): 5171-80, um anticorpo lgGl que tenha sido modificado pela introdução de substitui- ções de aminoácidos tal que o anticorpo resultante exiba ligação aperfeiçoa- da a FcRn humano sob condições ácidas (pH 6,0) e ao mesmo tempo se torne capaz de se ligar ao FcRn humano sob condições neutras (pH 7,4). O anticorpo resultante não foi relatado mostrar nenhum aperfeiçoamento nem alteração na retenção plasmática quando administrado a macacos cynomol- gus.

Portanto, a tecnologia de manipulação de anticorpo para o aperfeiçoa- mento das funções do anticorpo focalizou apenas o aperfeiçoamento da re- tenção plasmática do anticorpo pela intensificação da ligação a FcRn huma- no sob condições ácidas sem intensificá-la sob condições neutras (pH 7,4). Até agora, não há relato descrevendo a vantagem de aperfeiçoar a Iigação a FcRn humano sob uma condição neutra (pH 7,4) pela introdução de substitu- ições de aminoácidos no domínio Fc de um anticorpo lgGl.

Anticorpos que se ligam a um antígeno de uma maneira depen- dente do pH aceleram a eliminação do antígeno solúvel.

Os anticorpos pro- duzem o efeito pela ligação repetida a antígenos solúveis múltiplas vezes.

Portanto, tais anticorpos são muito úteis.

Um método para aumentar a liga- ção a FcRn sob condições neutras (pH 7,4) foi testada para intensificar o efeito que facilita a eliminação do antígeno. (6-2) Preparação de anticorpos que se liqam ao receptor de IL-6 dependen- tes de Ca que possuem atividade de liqação a FcRn sob condições neutras As mutações de aminoácidos para intensificar a ligação a FcRn 5 sob uma condição neutra (pH 7,4) foram introduzidas em FH4-!gG1 e 6RL#9-lgG1 que possuem uma habilidade de se ligar ao antigeno depen- dendo do cálcio.

As mutações de aminoácidos foram introduzidas por um método de PCR conhecido por aqueles versados na técnica.

Especificamen- te, FH4-N434W (cadeia pesada SEQ ID NO: 7; cadeia leve SEQ ÍD NO: 8), 6RL#9-N434W (cadeia pesada SEQ ID NO: 9; cadeia leve SEQ ID NO: 10), e H54/L28-N434W (cadeia pesada SEQ ID NO: 11; cadeia leve SEQ ID NO: 12) foram construidos pela substituição de Trp por Asn na posição 434 no sistema de numeração EU na região constante da cadeia pesada de lgGl.

O método para substituição de um aminoácido é como se segue.

Os mutantes são preparados usando o QuikChange Site-Oirected Mutagenesis Kit (Stra- tagene) pelo método descrito no manual de instrução em anexo.

Os frag- mentos de plasmídeo resultantes foram inseridos em vetores de expressão em célula animal para construir os vetores de expressão desejados.

A ex- press.ão e a purificação do anticorpo e a determinação de suas concentra- ções foram realizadas pelos métodos descritos no Exemplo 2. Exemplo 7 Avaliação do efeito de aceleração da eliminação de anticorpos com ligação dependente de Ca usando camundongos normais (7-1) Teste in vivo usando camundongos normais

Camundongos normais (camundongo C57BL/6j; Charles River japão) foram tratados com hslL-6R (receptor de IL-6 soIúvel humano: prepa-

rado como descrito no EXEMPLO DE REFERENCIA 1) sozinho ou em com- binação com um anticorpo antirreceptor de IL-6 humana e depois avaliados quanto a dinâmica in vivo de hslL-6R e do anticorpo antirreceptor de IL-6 humana.

Uma solução de hslL-6R (5 µg/ml) ou uma solução mista de hslL- 6R e um anticorpo antirreceptor de IL-6 humana foi administrada a 10 ml/kg uma vez na veia caudal.

Os anticorpos antirreceptor de IL-6 humana usados foram H54/L28-N434W, 6RL#9-N434W, e FH4-N434W descritos acima.

A concentração de hslL-6R era de 5 µg/mi em todas as soluções mistas.

As concentrações de H54/L28-N434W, 6RL#9-N434W, e FH4-N434\N eram de 0,042, 0,55, e 1 mg/ml, respectiva- 5 mente.

Nesse caso, anticorpo antirreceptor de IL-6 humana está presente em excesso sobre hslL-6R e portanto quase todo hslL-6R é presumido estar ligado ao anticorpo.

O sangue coletado foi imediatamente centrifugado a 4°C e 12.000 rpm por 15 minutos para separar o plasma.

O plasma separado foi armazenado em um freezer a -20°C ou abaixo antes do ensaio. (7-2) Medição por ELISA da concentração de anticorpo antirreceptor de IL-6 humano no plasma de camundongos normais A concentração do anticorpo antirreceptor de ÍL-6 humano no plasma de camundongo foi medida por ELISA da mesma maneira como descrita no EXEMPLO 6. Os tempos decorridos das concentrações plasmá- ticas dos anticorpos H54/L28-N434W, 6RL#9-N434W, e FH4-N434W em camundongos normais depois da administração intravenosa determinados por esse método são mostrados na Fig. 12- (7-3) Medida da concentração plasmática de hslL-6R pelo ensaio de eletro- quimioluminescência Medida da concentração plasmática de hslL-6R pelo método da eletroquimi- oluminescência A concentração de hslL-6R no plasma do camundongo foi medi- da pelo método da eletroquimioluminescência.

A curva de calibração das amostras de hslL-6R ajustadas para concentrações de 2,000, 1,000, 500, 250, 125, 62,5, ou 31,25 pg/mL e amostras de ensaio de plasma de camun- dongo diluldas 50 vezes ou mais foram preparadas.

As amostras foram mis- turadas com uma solução de anticorpo monoclonal anti-lL-6R humano (R&D) marcado com rutênio com SULFO-TAG NHS Ester (Meso Scale Discovery), Anticorpo Anti-(L-6R Humano Biotinilado (R&D) e depois deixadas reagir por uma noite a 4°C.

O tampão de ensaio usado para a reação contém EDTA 10 mM com o propósito de reduzir a concentração de Ca livre nas amostras, tal que quase todo hslL-6R esteja dissociado de 6RL#9-N434W ou FH4-N434W nas amostras e exista em forma livre.

Depois, as misturas foram aliquotadas na MA400 PR Streptavidin Plate (Meso Scale Discovery). Depois de outra 5 hora de reação a 25°C, a placa foi lavada. lmediatamente depois, Read Buf- fer T(X4) (Meso Scale Discovery) foi aliquotado na placa, a medição foi reali- zada usando o leitor SECTOR PR 400 (Meso Scale Discovery). As concen- trações de hSlL-6R foram calculadas com base na resposta na curva de ca- libração usando o programa analítico, SOFTmax PRO (Molecular Devices). Os tempos decorridos da concentração plasmática de hslL-6R em camun- dongos normais depois da administração intravenosa determinada pelo mé- todo acima descrito são mostrados na Fig. 13. Os achados descritos acima demostram que a ligação de FcRN em pH 7,4 foi intensificada, mas quando hsIL-6R foi administrado simultane- amente com um anticorpo comum administrado sozinho foi eliminado muito rapidamente.

Enquanto isso, a eliminação de hsIL-6R era consideravelmente retardada quando hslL-6R era simultaneamente administrado com um anti- corpo comum H54/L28-N434\N, que não exibe a ligação a hslL-6R depen- dente de Ca, a eliminação de hslL-6R foi consideravelmente retardada quando comparada a quando hslL-6R era administrado sozinho- Entretanto, quando hslL-6R era administrado simultaneamente com 6RL#9-N434W ou FH4-N434W que são anticorpos que possuem ligação com FcRn em pH 7,4 e ligaçáo de hslL-6R dependente de Ca 100 vezes ou mais, a eliminação de hslL-6R foi significativamente acelerada quando comparada a quando hslL- 6R era administrado sozinho.

Quando hslL-6R era administrado simultane- amente com 6RL#9-N434\N e FH4-N434W, a concentração plasmática de hslL-6R no Dia 1 podia estar reduzida em 3 e 8 vezes, respectivamente, quando comparada a quando hslL-6R era administrado sozinho. lsso de- monstra que a eliminação de um antígeno do plasma pode ser acelerada pela intensificação da habilidade de iigação a FcRn de um anticorpo com ligação dependente de cálcio em pH 7,4. Em comparação com o anticorpo comum H54/L28-lgG1 que não exibe Íigação a hslL-6R dependente de Ca, o anticorpo 6RL#9JgG1 ou FH4- lgG1 que tinha ligação a hslL-6R dependente de Ca 100 vezes ou mais fo- ram confirmados ter o efeito de intensificar a eliminação de hslL-6R.

Adicio- nalmente, em comparação a quando hs)L-6R sozinho e administrado, hslL- 5 6R e o anticorpo 6RL#9-N434W ou FH4-N434W que exibe ligação a FcRn em pH 7,4 e tem ligação 100 vezes ou mais a hslL-6R dependendo de Ca foram confirmados serem capazes de acelerar a eiiminação de hslL-6R.

Os dados descritos acima sugerem que similar a um anticorpo que se liga a um antígeno de uma maneira dependente de pH, um anticorpo que se liga a um antigeno de uma maneira dependente de Ca se dissocia do antigeno no en- dossoma, como ilustrado na Fig. 1. Como descrito no Exemplo 1, existem tipos limitados de epítopo atingidos pelos anticorpos com ligação ao antíge- no dependente do pH (Fig. 3). Entretanto, pelo uso dos anticorpos com Iiga- ção ao antigeno dependente de Ca como revelado na presente invenção, é considerado que pode-se expandir a variedade de epitopos para serem atin- gidos peios anticorpos capazes de dissociação do antlgeno dependente do endossoma (Figuras 2A e 2B). Exemplo 8 ldentificação do sitio de ligação ao iori de Ca no anti- corpo 6RL#9 pela cristalografia com raios X (8-1) Cristalografia com raios X Como descrito no Exemplo 4, as medidas da temperatura de desnaturação térmica Tm sugeriram que o anticorpo 6RL#9 se liga ao íon de cálcio- Entretanto, não foi predita qual porção do anticorpo 6RL#9 se liga ao Íon de cálcio.

Então, pelo uso da técnica da cristalografia com raios X, os resíduos de anticorpo 6RL#9 que interagem com o Íon de cálcio foram identi- ficados. (8-2) Expressão e purificação do anticorpo 6RL#9 O anticorpo 6RL#9 foi expresso e purificado por cristalografia com raios X.

Especificamente, plasmídeos de expressão em animal que fo- ram construídos para serem capazes de expressar a cadeia pesada (SEQ ID NO: 1) e a cadeia leve (SEQ ID NO: 2) do anticorpo 6RL#9 foram introduzi- dos transitoriamente em células de animais.

Os plasmideos construídos fo-

ram introduzidos pelo método da lipofecção em células FreeStyle 293-F (ln- vitrogen) derivadas de célula de rim fetal humano, suspensas em 800 ml do Meio de Expressão FreeStyle 293 (lnvitrogen) (densidade celular final: 1 x 106 células/mL). As células com o plasmídeo introduzido foram cultivadas em

5 uma incubadora com CÕ2 (37°C, 8°/o de CO2, 90 rpm) por cinco dias.

A partir do sobrenadante de cultura obtido como descrito acima, os anticorpos foram purificados por um método conhecido por aqueles versados na técnica u- sando rProtein A SepharoseTM Fast Flow (Amersham Biosciences). A absor- bância a 280 nm dos anticorpos purificados foi medida usando um espectro- lO fotômetro.

As concentrações de anticorpo foram calculadas a partir dos valo- res rnedidos usando um coeficiente de extinção calculado pelo método PA- CE (Protein Science (1995) 4, 2411-2423). (8-3) Purificação do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 " O anticorpo 6RL#9 foi concentrado para 21 mg/ml usando um ul- 15 trafiltro com um ponto de corte de peso molecular de 10,000 MWCO.

Uma amostra de 5 mg/mL de anticorpo (2,5 mL) foi preparada pela diluição da solução de anticorpo usando L-cisteina 4 mM / EDTA 5 mM / tampão fosfato de sódio 20 rnM (pH 6.5). 0,125 mg de papaina (Roche Applied Science) fo- ram adicionados a amostra.

Depois de agitar, a amostra foi incubada a 35°C 20 por duas horas.

Depois da incubação, um comprimido de Protease lnhibitor Cocktail Mini, sem EDTA (Roche Applied Science) foi dissolvido em 10 ml de tampão MES 25 mM (pH 6) e adicionados a amostra.

A amostra foi incubada sobre gelo para parar a reação proteolítica da papaína.

Depois a amostra foi carregada sobre uma coluna de troca de cátion de 1 ml HiTrap SP HP (GE 25 Healthcare) equilibrada com tampão MES 25 mM (pH 6), a jusante da qual uma coluna HiTrap MabSelect Sure Protein A de 1 ml (GE Healthcare) foi conectada em tandem.

Uma fração purificada do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 foi obtida pela realização da eluição com um gradiente de concentra- ção linear de NaCl até 300 mM no tampão descrito acima.

Depois, a fração 30 purificada resultante foi concentrada para cerca de 0,8 ml usando um ultrafil- tro 5000 MWCO.

O concentrado foi carregado sobre uma coluna de filtração em gel Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare) equilibrada com tampão ímm:

HEPES 100 mM HEPES (pH 8) contendo NaCl 50 mM.

O fragmento Fab purificado do anticorpo 6RL#9 pela cristalização foi eluído da coluna usando o mesmo tampão.

Todos os tratamentos de coluna descritos foram realiza- dos em baixa temperatura de 6 a 7,5°C. 5 (8-4) Cristalização do fraqmento Fab do anticorpo 6RL#9 na presença de Ca Sementes de cristal do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 foram preparadas a seguir sob condições gerais.

Depois, o fragmento Fab purifica- do do anticorpo 6RL#9 em CaCl2 5 mM foi concentrado para 12 mg/ml com um ultrafiltro 5000 MWCO.

Depois, a amostra concentrada como descrito acima foi cristalizada pelo método da difusão de vapor em gota pendente usando tampão HEPES 100 mM (pH 7,5) contendo 20% a 29% de PEG4000 como um resevatório de solução.

As sementes de cristal acima mencionadas foram trituradas em tampão HEPES 100 mM (pH 7,5) contendo 29°6 de PEG4000 e CaCl2 5 mM e diluída seriadamente para 100 a 10.000 vezes.

Depois, 0,2 µL das soluções diluídas foram combinados com uma mistura de 0,8 µ1 da solução de reservatório e 0,8 µ1 da amostra concentrada para pre- parar gotas de cristalização sobre uma iamínula de vidro.

As gotas de cristal foram deixadas descansar a 20°C por dois a três dias para preparar cristais semelhantes a placas finas.

Os dados de difração por raios X foram coleta- dos usando os cristais. (8-5) Cristalização do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 na ausência de Ca O fragmento Fab purificado do anticorpo 6RL#9 foi concentrado para 15 mg/ml usando um ultrafiltro 5000 MWCO.

Depois, a amostra con- centrada como descrito acima foi cristalizada pelo método da difusão de va- por em gota pendente usando tampão HEPES 100 mM (pH 7,5) conten- do18% a 25% de PEG4000 como um resevatório de solução- Cristais do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 obtidas na presença de Ca foram tritura- das em tampão HEPES 100 mM (pH 7,5) contendo 25% de PEG4000 e dilu- Ída seriadamente para 100 a 10.000 vezes.

Depois, 0,2 µL das soluções di- luídas foram cornbinados com uma mistura de 0,8 µ1 da solução de reserva- tório e 0,8 µ1 da amostra concentrada para preparar gotas de cristalização sobre uma laminula de vidro.

As gotas de cristal foram deixadas descansar a

20°C por dois a três dias para preparar cristais semelhantes a pIacas finas.

Os dados de difração por raios X foram coletados usando os cristais. (8-6) Medida cristaloqráfica com raios X do cristal de fragmento de Fab do anticorpo 6RL#9 na presença de Ca 5 Cristais do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9, preparados na presença de Ca, foram imersos em solução de tampão HEPES 100 mM (pH 7,5) contendo PEG4000 35% e CaCÍ2 5 mM.

Pela remoção da solução exte- rior da superficie de um único cristal com uma microalça de nylon, o cristal isolado foi congelado em nitrogênio liquido.

Os dados de difração de raios X do cristal congelado foram coletados do feixe linear BL-17A da Photon Fac- tory no High Energy Accelerator Research Organization.

O cristal congelado foi mantido no estado congelado durante a medição pela sua colocação constante em um fluxo de gás nitrogênio a -178°C.

Um total de 180 imagens de difração foi coletado usando o detector de CCD Quantum315r (ADSC) acoplado ao feixe linear, enquanto se girava o cristal em intervaios de 1°, A determinaçào constante da estrutura, indexação do ponto de difração e a análise dos dados de difração foram realizadas usando os programas Xia2 (CCP4 Software Suite), XDS Package (Walfgang Kabsch), e Scala (CCP4 Software Suite). Finalmente, os dados de intensidade da difração até a reso- lução de 22 Angstrons foram obtidos.

O cristal pertence ao grupo espacial P212121 com estrutura constante a = 45,47 Angstrons, b = 79,86 Angstrons, c = 116,25 Angstrons, a = 90°, |3 = 90°, y = 90°. (8-7) Medida cristaloçjráfica com raios X do cristal de fraqmento de Fab do anticorpo 6RL#9 na ausência de Ca Cristais do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9, preparados na ausência de Ca, foram imersos em solução de tampão HEPES 100 mM (pH 7,5) contendo PEG4000 35%. Pela remoção da solução exterior da superfí- cie de um único cristal com uma microalça de nylon, o cristal isolado foi con- gelado em nitrogênio líquido.

Os dados de difração de raios X do cristal con- gelado foram coletados do feixe linear BL-17A da Photon Factory no High Energy Accelerator Research Organization.

Um total de 180 imagens de difração foi coletado usando o detector de CCD Quantum315r (ADSC) acoplado ao feixe linear, enquanto se girava o cristal em intervalos de 1°. A determinação cons- tante da estrutura, indexação do ponto de difração e a análise dos dados de 5 difração foram realizadas usando os programas Xia2 (CCP4 Software Suite), XDS Package (Walfgang Kabsch), e Scala (CCP4 Software Suite). Finalmen- te, os dados de intensidade da difração até a resolução de 2,3 Angstrons foram obtidos.

O cristal pertence ao grupo espacial P212121 com estrutura constante a = 45,40 Angstrons, b = 79,63 Angstrons, c = 116,07 Angstrons, a = 90°, j3 = 90°, y = 90°, e portanto é estruturalmente idêntico ao cristal prepa- rado na presença de Ca. (8-8) Medida crista|oÁráfica com raios X do cristal de fraqmento de Fab do anticorpo 6RL#9 na presença de Ca ' A estrutura cristalina do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 na presença de Ca foi determinada por um método de substituição molecular usando o programa Phaser (CCP4 Software Suite). O número de moléculas em uma unidade assimétrica foi avaliado ser um a partir do tamanho da es- trutura do cristal e o peso molecular do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9. Com base na homologia de sequência primária, uma porção das posições de aminoácidos 112 a 220 da cadeia A e uma porção das posições de ami- noácidos 116 a 218 da cadeia B na coordenada conformacional de PDB có- digo 1ZA6 foram usadas como moléculas de modelo para anaiisar as regi- ões CL e CHl.

Depois, uma porção das posições de aminoácidos 1 a 115 da cadeia B na coordenada conformacional de PDB código 1ZA6 foi usada co- mo molécula de modelo para analisar a região VH.

Finalmente, uma porção

' das posições de aminoácidos 3 a 147 da cadeia leve na coordenada con- formacional de PDB código 2A9M foi usada como molécula de modelo para analisar a região VL.

Com base nessa ordem, um modelo estrutural inicial para o fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 foi obtida pela determinação das funções de translação e rotação das posições e orientações das moléculas de modelo para análise na estrutura cristafina.

O fator de confiabilidade cris- talográfico para os dados de reflexão na resolução de 25 a 0,3 Angstrons foi de 46,9% e Free R foi de 48,6% depois do refinamento do corpo rigido, os dominios de VH, VL, CHl, e CL foram cada um deixados se desviar do mo- delo estrutural inicial.

Depois, o refinamento do modelo foi obtido pela repeti- ção do refinamento estrutural usando o programa Refmac5 (CCP4 Software 5 Suite) seguido pela revisão do modeb realizada usando o programa Coot (Paul Emsley) com referencia aos mapas de densidade de eletron Fo-Fc e 2FO-F onde os coeficientes Fo-Fc e 2FO-FC forarn calculados usando o Fator Fo estrutural determinado experimentalmente, Fator Fc estrutural calculado com base no modeío e as fases.

O refinamento final foi realizado usando o 10 programa Refmac5 (CCP4 Software Suite) com referencia aos mapas de densidade de eletron FO-FC e 2Fo-F pela adição de uma molécula de água e um Íon de Ca no modelo.

Com dados de deflexão de 21,020 na resolução de 25 a 2,2 Angstrons, eventualmente o fator R de confiabilidade cristalográfica . tornou-se 20,0% e R livre tornou-se 27,9% para o modelo que consiste em 15 3440 átomos. (8-9) Medida cristaloqráfica com raios X do cristal de fraqmento de Fab do anticorpo 6RL#9 na ausência de Ca A estrutura cristalina do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 na ausência de Ca foi determinada com base na estrutura do cristal preparado 20 na presença de Ca.

Moiéculas de água e ion de Ca foram omitidas da coor- denada conformacional do cristal do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 pre- parado na presença de Ca- O fator de confiabilidade cristalográfica R para os dados de reflexão em uma resolução de 25 a 3,0 Angstrons foi de 30,3% e Free R era de 31,7% depois do refinamento do corpo rigido, onde os do- 25 minios de VH, VL, CHl, e CL foram cada um deixados se desviar do modelo estrutural inicial.

Depois, o refinamento do modelo foi obtido pela repetição do refinamento estrutural usando o programa Refmac5 (CCP4 Software Sui- te) seguido pela revisão do modelo realizada usando o programa Coot (Paul Emsiey) com referencia aos mapas de densidade de eletron FO-FC e 2Fo-F 30 onde os coeficientes Fo-Fc e 2Fo-Fc foram calculados usando o Fator Fo estmtural determinado experimentalmente, Fator Fc estrutural calculado com base no modelo e as fases.

O refinamento final foi realizado usando o pro-

grama Refmac5 (CCP4 Software Suite) com referencia aos mapas de densi- dade de eletron Fo-Fc e 2FO-F pela adição de uma molécula de água e um íon de Ca no modelo- Com dados de deflexão de 18,357 em uma resolução de 25 a 2,3 Angstrons, eventualmente o fator R de confiabilidade cristaíográ- 5 fica tornou-se 20.9% e R livre tornou-se 27,7% for para o modelo que consis- te em 3351 átomos. (8-10) Comparação dos dados de difração cristaloqráfica com raios X dos fraqmentos Fab do anticorpo 6RL#9 na presença e na ausência de Ca Quando os fragmentos Fab do anticorpo 6RL#9 são comparados 10 na presença e na ausência de Ca, são vistas alterações significativas na CDR3 da cadeia pesada.

A estrutura da CDR3 da cadeia pesada do frag- mento Fab do anticorpo 6RL#9 determinada pela cristalografia por raios X é mostrada na Fig. 14. Especificamente, um Íon de cálcio residia no centro da . região de alça da CDR3 da cadeia pesada do fragmento Fab do anticorpo 15 6RL#9 preparado na presença de Ca.

O Íon de cálcio foi presumido interagir com as posições 95, 96 e 199 (numeração de Kabat) da CDR3 da cadeia pesada.

Foi considerado que a alça de CDR3 da cadeia pesada que é im- portante para a ligação ao antigeno foi estabilizada pelo ligação ao cálcio na presença de Ca e tornou-se uma estrutura ótima para a ligação ao antigeno. 20 Não há relato que demonstre que o cálcio se ligue a CDR3 da cadeia pesa- da do anticorpo.

Portanto, a estrutura de ligação ao cálcio de CDR3 da ca- deia pesada do anticorpo é uma estrutura nova.

A CDR3 da cadeia pesada é conhecida por ser a mais importante na ligação ao antigeno.

O motivo pelo qual o lon de cálcio é necessário para a manutenção da estrutura da CDR3 25 da cadeia pesada, revelado como descrito no presente Exemplo, implica em que o Íon de cálcio desempenha um importante papel na ligação ao antígeno.

Especificamente, é ajtamente p)ausíve1 que os anticorpos com esse motivo se ligam a um antigeno de uma maneira dependente de cálcio.

Por exemplo, quando uma biblioteca sintética que possui esse motivo é preparada, pode-se 30 isolar eficientemente anticorpos com ligação dependente de cálcio da biblioteca.

Exemplo 9 Preparação de anticorpos que se ligam a ÍL-6 de uma maneira dependente de Ca de uma biblioteca de anticorpo humano usando técnicas de apresentação em fago (9-1) Construção de uma biblioteca de apresentação em fa,qo de anticorpos humanos naives Uma biblioteca de apresentação em fago humana contendo múl- 5 tiplos fagos que apresentam várias sequências de domínio Fab de anticorpo humano foi construída por um método conhecido por aqueles versados na técnica usando, como modelo, poI1RNA preparado a partir de PBMC humana, poli RNA comercialmente disponívei e etc. (9-2) Preparação de fragmentos de anticorpo que se Iigam ao antiqeno de uma 10 maneira dependente de Ca a partir de uma biblioteca por "bead panninq" A seleção primária da biblioteca de apresentação em fago cons- truída de anticorpos humanos naives foi realizada pelo enriquecimento de fragmentos de anticorpo que possuem atividade de ligação ao antigeno (IL- . 6). O antigeno usado foi IL-6 marcado com biotina. 15 Os fagos foram produzidos a partir de E- coli que carrega o fa- gomídeo construído para a apresentação em fago.

Para precipitar os fagos produzidos por E. coh', NaCl 2.5 M / PEG 1O°/o foi adicionado ao meio de cul- tura de E. co/i.

A fração de fago foi diluida com TBS para preparar uma solu- ção de biblioteca de fago.

Depois, BSA e CaC|2 foram adicionados à solução 20 de biblioteca de fago em concentrações finais de 4°/0 e 1,2 mM de concen- tração de íon de cálcio, respectivamente.

O método de panning usado foi um método de panning convencional que usa esferas magnéticas com antígeno imobilizado (J. lmmunol. methods- (2008) 332(1-2): 2-9; J- lmmunol. methods. (2001) 247(1-2): 191-203; Biotechnol.

Prog. (2002) 18(2): 212-20; Mol.

Cell 25 Proteomics (2003) 2(2): 61-9)- As esferas magnéticas usadas eram esferas revestidas NeutrAvidin (Sera-Mag Speed8eads NeutrAvidin-coated) e esfera revestidas com Estreptavidina (Dynabeads M-280 Streptavidin). Especificamente, 250 pmol do antigeno marcado com biotina fo- ram adicionados à solução de bibfioteca de fago preparada.

Então, a solução 30 foi contatada com o antigeno em temperatura ambiente por 60 minutos.

As esferas magnéticas bloqueadas com BSA foram adicionadas e o complexo antígeno-fago foi delxado se ligar às esferas magnéticas em temperatura ambiente por 15 minutos.

As esferas foram lavadas três vezes com CaCl2 1,2 mM ITBST (TBST contendo CaC|2 1,2 mM), e depois duas vezes com 1 ml de CaCl, 1,2 mM ITBST (TBST contendo CaCl, 1,2 mM). Depois, 0,5 ml de 1 mg/ml de tripsina foi adicionado as esferas.

Depois de 15 minutos de disper- 5 são em temperatura ambiente, as esferas foram imediatamente separadas usando um suporte magnético para coletar uma suspensão de fago.

A sus- pensão de fago preparada foi adicionada a 10 ml de E. coli da cepa TGl na fase de crescimento logarÍtmico (OD600 = 0,4 a 0,5). A E. co/i foi incubada com agitação cuidadosa a 37°C por uma hora para infectar os fagos.

A E. 10 co/i infectada foi semeada em uma placa (225 mm x 225 mm). Depois os fagos foram coletados do meio de cultura da E. co/i semeada para preparar uma solução de biblioteca de fago.

Na segunda rodada e panning subsequente, os fagos foram en- . riquecidos usando a atividade de ligação dependente de Ca como um indi- 15 cador.

Especificamente, 40 pmol do antigeno marcado com biotina foram adicionados para preparar a solução de biblioteca de fago.

Então, a bibliote- ca de fago foi colocada em contato com o antígeno em temperatura ambien- te por 60 minutos.

As esferas magnéticas bloqueadas com BSA foram adi- cionadas e o complexo antigeno-fago foi deixado se ligar às esferas magné- 20 ticas em temperatura ambiente por 15 minutos.

As esferas foram lavadas com 1 ml de CaCl, 1,2 mM ITBST e CaCi, 1,2 mM ITBS.

Depois, 0,1 ml de EDTA 2mM/TBS foi adicionado as esferas.

Depois da dispersão em tempera- tura ambiente, as esferas foram imediatamente separadas usando um supor- te magnético para coletar uma suspensão de fago.

A proteínã plll (proteína 25 pll derivada de fago auxiliar) foi clivada dos fagos que não apresentavam Fab pela adição de 5 µ1 de tripsina 100 mg/ml à suspensão de fago coletada para eliminar a habilidade dos fagos de não apresentar Fab para infectar a E. coli.

Os fagos coletados do concentrado de liquido de fago tripsinizado foram adicionados a 10 ml de células de E. co/i da cepa TGl na fase de crescimen- 30 to |ogarítn1ico (OD600 = 0,4 a 0,7). A E. coh" foi incubada com agitação cui- dadosa a 37°C por uma hora para infectar o fago.

A E. co//" infectada foi se- meada em uma placa (225 mm x 225 mm). Depois os fagos foram coletados do meio de cultura da E. cO/i semeada para preparar um concentrado líquido de biblioteca de fago.

O panning foi realizado três vezes usando a atividade de ligação dependente de Ca como um indicador. (9-3) Avaliação por ELISA de faqo 5 Sobrenadantes de cultura contendo fago foram coletados a partir de colônias isoladas de E. coli obtidas pelo método descrito acima de acordo com um método convencional (Methods MOL Biol. (2002) 178, 133-145). BSA e CaCl2 foram adicionados tal que as concentrações finais de BSA e cálcio eram de 4°/0 e 1,2 mM, respectivamente aos sobrenadantes de cultura 10 de fago.

Os sobrenadantes foram submetidos ao ELISA pelo seguinte pro- cedimento.

Uma placa de microtitulação StreptaWell 96 (Roche) foi revestida por uma noite com 100 µL de PBS contendo o antígeno biotinilado.

O antí- geno foi removido pela lavagem de cada poço da placa com PBST.

Depois, , os poços foram bloqueados com 250 µ1 de BSA 4%-TBS por uma hora ou 15 mais.

Depois da remoção de BSA 4%-TBS, os sobrenadantes de cultura preparados foram adicionados a cada poço.

A placa foi incubada a 37°C por uma hora tal que os fagos que apresentam anticorpo foram deixados se ligar ao antigeno em cada poço.

Depois cada poço foi lavado com 1,2 mM Ca- C|2/TBST, 1,2 mM CaC|2/TBS ou 1 mM EDTA/TBS foi adicionado.

A placa foi 20 deixada incubar a 37°C por 30 minutos.

Depois de lavar com 1,2 mM Ca- Ci2/TBST, um anticorpo anti-M13 conjugado com HRP (Amersham Pharma- cia Biotech) diluído com TBS contendo BSA e Íon de cálcio em concentra- ções finais de of 4% e 1,2 mM de ion de cálcio foi adicionado a cada poço e a placa foi incubada por uma hora.

Depois de lavar com 1,2 mM de Ca- 25 C|2/TBST, uma solução única de TMB (ZYMED) foi adicionada a cada poço- A reação cromogênica na soIução de cada poço foi paralisada pela adição de ácido sulfúrico Depois, a cor desenvolvida foi avaliada pela medição da absorbância a 450 nm.

A partir dos 96 clones isolados, os anticorpos 6KC4-1#85, 6LC4- 30 1#15, e 6LC4-2#16 que possuem atividade de ligação a IL-6 dependente de Ca, foram obtidos por ELISA de fago.

Usando os fragmentos de anticorpo que foram preditos ter uma atividade de Iigação ao antígeno dependente de

Ca com base no resultado do ELISA de fago descrito acima como modelo, genes foram amplificados com iniciadores especificos e suas sequências foram analisadas.

As sequências da região variável de cadeia pesada e de cadeia leve do anticorpo 6KC4-1#85 são mostradas nas SEQ ÍD NOS: 25 e 5 26, respectivamente.

O polinucleotídeo que codifica a região variável da ca- deia pesada do anticorpo 6KC4-1#85 (SEQ ID NO: 25) foi ligado a um poli- nucleotídeo que codifica uma sequência derivada de lgGl (SEQ ID NO: 65) pelo método da PCR.

O fragmento de DNA resultante foi inserido em um vetor de expressão em célula animal para construir um vetor de expressão para a cadeia pesada de SEQ ID NO: 27. O polinucleotídeo que codifica a região variável da cadeia Ieve do anticorpo 6KC4-1#85 (SEQ ID NO: 26) foi ligado a um polinucleotídeo que codifica a região constante da cadeia Kappa natural (SEQ ID NO: 28) por PCR.

O fragmento de DNA que codifica a se- quência ligada mostrado na SEQ ID NO: 29 foi inserido em um vetor de ex- pressão em céluia animal.

Usando o mesmo método, o anticorpo 6LC4-1#15 (cadeia pesada SEQ ID NO: 68; cadeia leve SEQ ID NO: 69) e o anticorpo 6LC4-2#16 (cadeia pesada SEQ ID NO: 70; cadeia leve SEQ ID NO 71) também foram inseridos em vetores de expressão celular.

As sequências das variantes construídas foram confirmadas por um método conhecido por aqueles versados na técnica. (9-4) Expressão e purificação de anticorpos CIones que foram preditos ter uma atividade de ligação ao anti- geno dependente de Ca com base no resultado de ELISA de fago foram in- seridOs em plasmídeos de expressão em célula animal.

A expressão do anti- corpo foi realizada pelo seguinte método.

Células FreeStyle 293-F (lnvitro- gen) derivadas de rim fetal humano foram suspensas no Meio de Expressão FreeStyle 293 (lnvitrogen) e plaqueadas em uma densidade celular de 1,33 x 106 célulashnl (3 ml) em cada poço de uma placa de 6 poços.

Os plasmí-

deos preparados foram introduzidos nas células pelo método da lipofecção.

As células foram cultivadas por quatro dias em uma incubadora com CO2 (37°C, 8% CO2, 90 rpm). Dos sobrenadantes da cultura, os anticorpos foram purificados usando rProtein A SepharoseTM Fast FIOw (Amersham Bioscien-

ces) pelo método conhecido por aqueles versados na técnica.

A absorbância a 280 nm das soluções de anticorpo purificado foi medida usando um espec- trofotômetro.

As concentrações de anticorpo foram caiculadas a partir dos valores determinados usando um coeficiente de extinçâo calculado pelo mé- 5 todo PACE (Protein Science (1995) 4: 2411-2423). (9-5) Ensaio de liqação de anticorpos anti-lL-6 dependentes de Ca Usando Biacore TIOO (GE Healthcare), os anticorpos prepara- dos foram avaliados quanto a sua atividade de ligação (constante de disso- ciação K[) (M)) a interleucina 6 humana (hlL6) em pH 7,4. A medida foi reali- lO zada usando como um tampão de corrida Tween20 0,05%, ACES 10 mmol/l, NaCl150 mmol/l (pH 7,4) contendo CaC|23 µM ou 1,2 mM.

Depois que uma quantidade adequada Protein NG recombinan- te (Thermo Scientific) foi imobilizada sobre um chip Sensor CM5 (GE Heaith- . care) por um método de acoplamento de aminoácido, os anticorpos foram 15 deixados se ligar a ele.

Uma concentração apropriada de hlL6 (interleucina 6 humana; Kamakura Techno-Science, lnc.) foi injetada como um analito para interagir com os anticorpos sobre o chip sensor.

Depois, o chip sensor foi regenerado pela injeção de 10 mmol/l de glicina-HCl (pH 1,5). A medição foi realizada a 37°C.

O sensorgrama resultante da medição é mostrado na 20 Fig.15. O resultado demonstra que os anticorpos 6LC4-1#15-lgG1, 6LC4- 2#16-lgG1, e 6KC4-1#85-lgG1 tinham uma ligação mais fraca a hlL6 sob a condição de 3 µM de Ca'" do que com 1,2 mM- O achado descrito acima sugere que esse método é apiicável a outros antígenos já que a propriedade de ligação ao antígeno dependente de cálcio foi provada para IL-6 assim 25 como para IL-6R demonstrada no Exemplo 3. Exemplo 10 Avaliação do anticorpo 6KC4-1#85 quanto a ligação ao Íon de cálcio (10-1) Avaliação do anticorpo 6KC4-1#85 quanto a liqação ao íon de cálcio O anticorpo 6KC4-1#85 que se liga ao antigeno na dependência " 30 de cálcio, que foi isolado de uma biblioteca de anticorpo humano, foi avalia- do para sua Iigação ao cálcio.

Avaliou-se se o valor da Tm medida varia de- pendendo da condição da concentração de cálcio ionizado pelo método des-

crito no Exemplo 4.

Os valores de Tm para o dominio Fab do anticorpo 6KC4-1#85 são mostrados na Tabela 11. Como mostrado na Tabela 11, o valor de Tm do dominio Fab do anticorpo 6KC4-1#85 variou dependendo da concentração 5 de cálcio. lsso demonstra que o anticorpo 6KC4-1#85 se liga ao cálcio.

Tabela 11 anticorpo¶ CONCENTRAçÃOOE-ÍON-CÁLClO¶ A Tm ( °C ) 3µM 2 mM i2mM-3µMi |6KC4-I#B5 71.49 75.39 |3-9 (10-2) ldentificação do sitio de |içlação ao íon de cálcio no anticorpo 6KC4- 1#85 Como demonstrado em (10-1) do Exemplo 10, o anticorpo 10 6KC4-1#85 se liga ao ion de cálcio. Entretanto, 6KC4-1#85m não possui um . motivo de ligação ao cálcio tal como a sequência de hVk5-2 descrita abaixo. Portanto, para identificar resíduos responsáveis pela ligação ao íon de cálcio do anticorpo 6KC4-1#85, cadeias pesadas alterdas (6_ H1-11 (SEQ ID NO: 30), 6_H1-12 (SEQ ID NO: 31), 6_ H1-13 (SEQ ID NO: 32), 6_ H1-14 (SEQ ID 15 NO: 33), 6_ H1-15 (SEQ ID NO: 34)) e cadeia leves alteradas (6_ L1-5 (SEQ ID NO: 35) e 6 _ L1-6 (SEQ ID NO: 36)) foram construídas pela substituição de um resíduo de Asp (D) na CDR do anticorpo 6KC4-1#85 por um resíduo de Ala (A) que não participa da ligação ou da quelação do íon de cálcio. Pelo método descrito no Exemplo 2, os anticorpos alterados foram purificados a 20 partir de sobrenadantes de cultura de células animais introduzidas com veto- res de expressão que carregan os genes alterados do anticorpo. Os anticor- pos alterados purificados foram avaliados quanto a sua ligação ao cálcio pe- lo método descrito no Exemplo 4. O resultado da medição é mostrado na Tabela 12.

25 Tabela 12 I Cadeia Pe- Cadeia Leve Residuo Altera- ji7ú sada do KC4-1#85 ' Tipo Selvagem 6H1-11 ' 6KC4-1#85 Cadeia H Posi- ção 61 (Nume- ração de Kabat)

Cadeia Pe- Cadeia Leve Resíduo Altera- Concentração de A Tm (°C) sada do ion de cálcio 3µM ) 2mM 2 mM-3 µM 6H1-12 ) 6KC4-1#85 Cadeia H Posi- 72,9 73,43 0,53 ção 95 (Nume- ração de Kabat) 6H1Ã3 l 6KC4-1#85 Cadeia H Posi- 70,94 76,25 5,31 ção lOOa (Nu- meração de L_ Kabat) 6H1-14 : 6KC4-1#85 ! Cadeia H Posi- 73,95 75,14 1,19 I ção1OOg(Nu- meração de Kabat) 6H1-15 uR":4-1#85 ' Cadeia H Posi- 65,37 66,25 0,87 ção 101 (Nume- ração de Kabat) 6KC4-1#85 I 6L1-5 Cadeia L Posi- 71,92 76,80 4,16 ção 50 (Nume- ração de Kabat) 6KC4-1#85 I 6L1-6 Cadeia í: Posi- 72,13 78,74 ção 92 (Nume- m racão de Kabat)

Como mostrado na Tabela 12, a substituição de um resíduo de Ala na posição 95 ou 101 (numeração de Kabat) na CDR3 da cadeia pesada do anticorpo 6KC4-1#85 resultou na perda da atividade de ligação ao cálcio do anticorpo 6KC4-1#85. lsso sugere que esses resíduos são responsáveis 5 pela ligação ao cálcio.

Foi demonstrado que o motivo de ligação ao cálcio em volta da base da alça da CDR3 da cadeia pesada CDR3 no anticorpo 6KC4-1#85, que foi identificado com base na atividade de Iigação ao cálcio dos anticorpos alterados a partir do anticorpo 6KC4-1#85, poderia ser usado também como um motivo de ligação ao cálcio no dominio de ligação ao antí- lO geno de uma molécula que se liga ao antígeno da presente invenção.

Como o motivo revelado como descrito no Exemplo 8, esse motivo de ligação ao cáicio está localizado na CDR3 da cadeia pesada.

Portanto, igualmente, por exemplo, quando uma biblioteca sintética que possui esse motivo é constru- Ída, os anticorpos com ligação dependente do cálcio podem ser eficiente- mente isolados da biblioteca.

Exemplo 11 Pesquisa por sequências da linhagem germinativa humana que se liguem ao íon de cálcio

(11-1) lsolamento de sequências da linhaçjem qerminativa humana Anticorpos que se ligam ao Íon de cálcio contendo sequências da linhagem germinativa humana amda não foram descritos.

Portanto, as sequências da linhagem germinativa de anticorpos que possuam sequências 5 da linhagem germinativa humana foram clonadas usando como modelo um cDNA preparado a partir de Human Fetal Spleen Poly RNA (Clontech) para avaliar se os anticorpos que possuem sequências da linhagem germinativa humana se ligam ao Íon de cálcio.

Os fragmentos de DNA cIonados foram inseridos em vetores de expressão em célula animal.

As sequências de nu- lO cleotideos dos vetores de expressâo construídos foram determinadas pelo método conhecido por aqueles versados na técnica.

As SEQ IDs são mos- ' tradas na Tabela 13. Por PCR, os polinucleotideos que codificam a SEQ ID NO: 37 (Vkl), SEQ ID NO: 38 (Vk2), SEQ ID NO: 39 (Vk3), SEQ ID NO: 40 (Vk4), e SEQ ID NO: 41 (Vk5) foram ligados a um polinucleotídeo que codifi- ca a região constante da cadeia Kappa natural (SEQ ID NO: 28). Os frag- mentos de DNA ligados foram inseridos em vetores de expressão em célula an.imal.

Adicionalmente, os polinucleotÍdeos que codificam as SEQ ID NO: 42 (Vkl), SEQ ID NO: 43 (Vk2), SEQ ID NO: 44 (Vk3), SEQ ID NO: 45 (Vk4), e SEQ ID NO: 46 (Vk5) foram ligados por PCR a um polinucleotÍdeo que co- difica um poIipeptídeo (SEQ ID NO: 65) que possui uma deleção de dois a- minoácidos na terminação C de IgGl- Os fragmentos de DNA resultantes foram inseridos em vetores de expressão em célula animal.

As sequências das variantes construídas foram confirmadas por um método conhecido por aqueles versados na técnica.

Tabela 13 SeqUêncla da Linhagem Ger- SEQ ID NO da Região Vanavel I SEQ ID NO da Região Variavel I mínaúva da Cadeia Leve da Cadeia Pesada l da Cadeia Leve

Vkl 42 37 nã a 38 Ã5 a 59 G1Á ÃF Ãis ns a 41 (11-2) Expressão e purificação de anticorpos Os vetores de expressão em célula animal construídos inseridos com os fragmentos de DNA que possuem cinco tipos de sequências da li- nhagem germinativa humana, foram introduzidos em células de animais.

A expressão de anticorpo foi realizada pelo seguinte método.

Células FreeSt- yle 293-F (lnvitrogen) derivadas de células de rim fetal humano foram sus- 5 pensas no Meio de Expressão FreeStyle 293 (lnvitrogen) e plaqueadas em uma densidade celular de 1,33 x 106 células/ml (3 ml) em cada poço de uma placa de 6 poços.

Os plasmideos preparados foram introduzidos nas células pelo método da lipofecção.

As céILllas foram cultivadas por quatro dias em uma incubadora com CÕ2 (37°C, 8°/0 CO2, 90 rpm). Dos sobrenadantes da 10 cultura, os anticorpos foram purificados usando rProtein A SepharoseTM Fast Flow (Amersham Biosciences) pelo método conhecido por aqueles versados na técnica.

A absorbância a 280 nm das soluções de anticorpo purificado foi " medida usando um espectrofotômetro.

As concentrações de anticorpo fo- . ram calculadas a partir dos valores determinados usando um coeficiente 15 de extinção calculado pelo rnétodo PACE (Protein Science (1995) 4: 2411- 2423). (11-3) Avaliação de anticorpos que possuem sequências da linhacjem germi- nativa humana quanto a sua atividade de liqação ao Íon de cálcio Os anticorpos purificados foram avaliados quanto a sua ativida- 20 de de ligação ao íon de cálcio- Os anticorpos purificados foram dialisados (EasySEP, TOMY) contra uma solução contendo Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM, e CaCl,2 mM (pH 7,4), ou Tris HCl 20 mM, NaCl 150 mM, e CaCl, 3 µM (pH 7,4). As soluções de anticorpo como uma substancia de teste foram ajustadas para 0,1 mg/ml usando a mesma solução usada para a diálise e a 25 medição por DSC foi realizada em uma taxa de temperatura de 240°C/h de 20 a 115°C.

Com base nas curvas de desnaturação por DSC obtidas, a tem- peratura do ponto médio da desnaturação térrnica (valor de Tm) foi calculada para o domínio Fab de cada anticorpo.

Os valores de TM são mostrados na Tabela 14. 30 Tabela 14

SEQUGNCIA da | CONCENTRAçÃO de ION CÁLC1O i 'JTm (C) LINHAGEM germi- , , ' NATIVA '^'"^ 3µM l 2 mM )2mM-3uM i

LEVE i Vkl _ _+ 80.32 ) 80.78 _:_0,g6 _ _ , ! Vk2 i 80.67 ' 80.61 : 0.06 l

I q Vk3 i 81.64 | 81.36 i -0.28 : ) 70.74 J 70.74 !0 i Vk4

Á Vk5 : 71.52 | 74.17 I 2.65

Í O resultado mostrou que os valores de Tm dos domínios Fab dos anticorpos que possuem a sequência hVkl, hVk2, hVk3, ou hVk4 não variaram dependendo da concentração de Íon de cálcio nas soIuções que continham o domínio Fab. Entretanto, o valor de Tm para o domínio Fab do . 5 anticorpo que possuía a sequência hVk5 variou na dependência da concen- ' tração de Íon de cálcio nas soluções que continham o dominio Fab. lsso demonstra que a sequência hVk5 se liga ao Íon de cálcio. Exemplo 12 Avaliação da sequencia Vk5 (hVk5) humana (12-1) Sequencia hVk5 10 A única sequência hVk5 registrada no banco de dados de Kabat é a sequência hVk5-2. Daqui por diante, hVk5 e hVk5-2 são usadas como sinônimas- (12-2) Construção, expressão e purificação de uma forma não glicosilada da sequência hVk5-2 15 A sequência hVk5-2 tem uma sequência para N glicosilação na posição de aminoácido 20 (numeração de Kabat)- Cadeias de açúcar aco- pIadas a proteínas exibem heterogenicidade. Portanto, é desejável perder a glicosilação do ponto de vista da homogeneidade da substancia. Nesse con- texto, a variante hVk5-2 _L65 (SEQ ID NO: 47), na qual o resíduo Asn (N) na 20 posição 20 (numeração de Kabat) é substituído por Thr (T) foi construida. A substituição de aminoácido foi realizada por um método conhecido por aque- les versados na técnica usando o QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)- Um DNA que codifica a variante hVk5-2 _ L65 foi inserido em um vetor de expressão em célula animal. O vetor de expressão em animal 25 inserido com o DNAS construído que codifica a variante hVk5-2 _ L65, em combinação com um vetor de expressão em célula animal que possui um inserto para expressar CIM _ H (SEQ ID NO: 48) como a cadeia pesada, foi introduzido nas células de animal pelo método descrito no Exemplo 2. O an- ticorpo compreendendo hVk5-2_ L65 e CIM_ H, que foi expresso em células 5 de animais introduzidas com vetores, foi purificado pelo método descrito no Exemplo 2.

(12-3) Avaliação do anticorpo que possui a seguência hVk5-2 não glicosilada quanto a propriedades físicas O anticorpo isolado que possui a sequência hVk5-2 _ L65 modifi- lO cada foi analisado pela cromatografia de troca de ion para testar se ele é menos heterogêneo do que o anticorpo que possui a sequência hVk5-2 ori- ginal antes da modificação. O procedimento da troca de íon é mostrado na Tabela 15. O resultado da análise mostrou que hVk5-2 _ L65 modificada no 4 sitio da glicosilação era menos heterogênea do que a sequência hVk5-2 ori- 15 ginal, como mostrada na Fig. 16.

Tabela 15 Uond|ção _ ©luna " TOSOH TSkgel DEAE-NPR ! FASE MÓVEL A; Tris-HCl1O mM, CaCh 3 µM (pH 8,0) B; Tris-HCl 10 mM, NaCl 500 mM, CaC|2 3µÁÃj (pH 8,0) l GRADIENTE %B = 0-(5 min.)-0-2%/1 min. ki:A'ERATURA DA CO- 40°C I DETECÇÃ.O _ _ 280 nm _ ) VOLUM_E_DE INJEÇÃO _ J 100 µL (5 µg) A seguir, foi avaliado pelo método descrito no Exemplo 4 se o anticorpo que compreende a sequência hVk5-2 _ L65 menos heterogêne se liga ao ion de cálcio. O resultado mostrou que o valor de Tm para o domínio 20 Fab do anticorpo que possui hVk5-2 _ L65 com o sítio de glicosilação alterado também variou dependendo das concentrações do Íon de cálcio nas solu- ções de anticorpo, como mostrado na Tabela 16. Especificamente, foi de- monstrado que o dominio Fab do anticorpo que possui hVk5-2 _ L65 com o sÍtio de glicosilação alterado se liga ao Íon de cálcio.

Tabela 16

CADEIALEVE ) SEQJÉ'QCLA g:-tco- CONCENTRAÇÃO DE ION CÃLCIO l ATm("C) g j3ttM 2 rnM I 2 mM-3µM hVk5-2 SIM 71.52 74.17 2.65 hVk5-2_ L65 Í NÃO l 71.51 l 73.66 I 2.15

Exemplo 13 Avaliação da atividade de ligação ao ion de cálcio de moléculas de anticorpo que possuem a sequência de CDR da sequência hVk5-2 5 (13-1) Construção, expressão e purificação de anticorpos modificados que possuem uma sequência de CDR a partir da sequência hVk5-2 A sequência hVk5-2 _ L65 é uma sequência com aminoácidos al- terados em um sÍtio de glicosilação na estrutura da sequência Vk5-2 humana.

Como descrito no Exemplo 12, foi demonstrado que o Íon de cálcio se liga mesmo depois da alteração do sÍtio de glicosilação.

Entretanto, do ponto de vista da imunogenicidade, é geralmente desejável que a sequência estrutural seja uma sequência da linhagem germinativa.

Portanto, os presentes inven- tores avaliaram se uma sequência estrutural de anticorpo poderia ser substi- tuida por uma sequência estrutural de uma sequência da linhagem germina- tiva não glicosilada, enquanto mantém a atividade de ligação ao ion de cál- cio do anticorpo.

Polinucleotideos que codificam sequências quimicamente sinte- tizadas que compreendem uma sequência estrutural alterada da sequência hVk5-2 sequência, hVkl, hVk2, hVk3, ou hVk4 (CaVkl (SEQ ID NO: 49), CaVk2 (SEQ ID NO: 50), CaVk3 (SEQ ID NO: 51), ou CaVk4 (SEQ ID NO: 52), respectivamente) foram ligados por PCR a um polinucleotideo que codi- fica a região coristante (SEQ ID NO: 28) da cadeia Kappa natural.

Os frag- mentos de DNA ligados foram inseridos em vetores de expressão em célula animal.

Sequências das variantes constmídas foram confirmadas por um método conhecido por aquele versado na técnica.

Cada plasmídeo construí- do como descrito acima foi introduzido em células de animal em combinação com um plasmídeo inserido com um polinucleotídeo que codifica CIM_ H (SEQ ID NO: 48) pelo método descrito no Exemplo 2. As moléculas de anti-

corpo de interesse expressas foram purificadas do meio de cultura das célu- Ias animais com os plasmideos introduzidos. (13-2) Avaliação dos anticorpos alterados que possuem a sequência de CDR da sequência de hVk5-2 quanto a sua atividade de ligação ao Íon de cálcio 5 Se o ion de cálcio se liga a anticorpos alterados que possuem a sequência de CDR da sequência hVk5-2 sequência e as sequências estrutu- rais das sequências da linhagem germinativa diferentes de hVk5-2 (hVkl, hVk2, hVk3, and hVk4) foi avaliado pelo método descrito no Exemplo 4. O resultado da avaliação é mostrado na Tabela 17. O valor de Tm do domínio 10 Fab de cada anticorpo alterado foi revelado variar dependendo da concen- tração de Íon de cálcio nas soluções de anticorpo. lsso demonstra que os ' anticorpos que possuem a sequência estrutural diferente das sequências estruturais da sequencia hVk5-2 também se ligam ao ion de cálcio. Especifi- . camente, foi demonstrado que o motivo na sequência de CDR da sequência 15 hVk5-2 é responsável pela ligação ao cálcio, enquanto que e estrutural pode ser qualquer sequência estrutural. Tabela 17 LINHAGEM GER- CONCENTRAÇÃO DE 1ON CÁLCIO JTm (Ç.) :

Ã MNATIVA(SE- QUÉNCIA ESTRU- 3u M i 2 mM 2 niM-3/IM '

TURAL DA CADEIA

LEVE hVkl 77.51 | 79.79 2.28 : hVk2 78.46 80.37 1.91 hVk3 77.27 79.54 2.27 hVk4 80.35 81.38 1-03 [ hVk5-2 71.52 l 74.17 \ 2.65 A temperatura de desnaturação térmica (valor de Tm), como um indicador da estabilidade térmica, do domínio Fab de cada anticorpo alterado 20 para ter a sequência de CDR da sequência hVk5-2 e a sequência estrutura) de uma sequência da Íinhagem germinativa diferente da sequência hVk5-2 (hVkl, hVk2, hVk3, ou hVk4) foi demonstrada ser maior que aquela do do- minio Fab do anticorpo original que possui a sequência hVk5-2. Esse resul-

tado mostra que os anticorpos que possuem a sequência de CDR da se- quência de hVk5-2 e a sequência estrutural da sequência hVkl, hVk2, hVk3, ou hVk4 não apenas possuem atividade de ligação ao cálcio, mas também são moléculas excelentes do ponto de vista da estabilidade térmica. 5 Exemplo 14 ldentificação do sítio de ligação ao íon de cálcio na sequência hVk5-2 da iinhagem germinativa humana (14-1) Desenho do sitio de mutação na sequência de CDR da sequência hVk5-2 Como descrito no Exemplo 13, os anticorpos que possuem a ca- lO deia leve que resulta da introdução do domínio de CDR da sequência de hVk5-2 na sequência da sequência estrutural de uma sequência da linhagem germinativa diferente também foram demonstrados se ligar ao íon de cálcio. Esse resultado sugere que em hVk5-2 um sítio de ligação ao Íon de cálcio

V está localizado dentro de sua CDR. Aminoácidos que se iigam ao íon de cál- 15 cio, isto é, que quelam o Íon de cálcio, incluem aminoácidos negativamente carregados e aminoácidos que podem ser aceptores de ligação de hidrogê- nio. Então, foi testado se os anticorpos que possuem uma sequência mutan- te de hVk5-2 com uma substituição de um resíduo de Ala (A) por um resíduo de Asp (D) ou Glu (E) na sequência de CDR da sequência de hVk5-2 se li- 20 gam ao íon de cálcio. (14-2) Construção de sequências variantes de hVk5-2 com substituição de Ala e expressão e purificação de anticorpos As moléculas de anticorpo foram preparadas para compreender uma cadeia leve com uma substituição de um resíduo de Ala (A) por um re- 25 sÍduo de Asp (D) ou Glu (E) na sequência de CDR da sequência de hVk5-2. Como descrito no Exemplo 12, a variante não glicosilada hVk5-2 _ L65 exibiu ligação ao ion de cálcio e foi presumido ser equivalente à sequência de hVk5-2 em termos de ligação ao ion de cálcio. Nesse Exemplo, as substitui- ções de aminoácidos foram introduzidas em hVk5-2 _ L65 como uma sequên- 30 cia de modelo. As variantes construidas são mostradas na Tabela 18. As substituições de aminoácidos foram realizadas pelos métodos conhecidos por aqueles versados na técnica tais como usando o QuikChange Site-

Directed Mutagenesis Kit (Stratagene), PCR, ou o ln fusion Advantage PCR Cloning Kit (TAKARA) para construir vetores de expressão para cadeia leves alteradas que possuam uma substituição de aminoácido. Tabela 18 ) POSIÇÂO ALTERADA l NOME DA CADEIA ) (NUMERAÇÃO DE Kabat) { SEQ ID NO

LEVE VARIANTE

Ê ) TlPO sELvÃâEM"" " j" hVk5-2 _L65 hVk5-2 JJ66 ) 30 ) 5_3 _ T__ hVk5-2 _L67 ) 31 ' µj'i _ """I hVk5-2_ L68 ) 32 ) 5 "l hVk5-2_ L69 j 50 )56 iNk5-2 _l70 j 30, 32 l57 _—----| ' 30, 50 !58 hVk5-2 _L71 hVk5-2 _L72 ) 30, 32, 50 i59 hVk5-2 L73 i 92 i60 5 As sequências de nucleotídeos dos vefores de expressão cons- truídos foram confirmadas por um método conhecido por aqueles versados na técnica. Os vetores de expressão construidos para as cadeias leves aite- radas foram introduzidos transitoriamente em combinação com um vetor de expressão para a cadeia pesada CIM _ H (SEQ ID NO: 48), em células da linhagem HEK293H (lnvitrogen) ou FreeStyle293 (lnvitrogen) derivadas de célula de rim fetal humano para expressar os anticorpos. Dos sobrenadantes de cultura obtidos, anticorpos foram purificados usando rProtein A Sepharo- seTM Fast Flow (GE Healthcare) por um método conhecido por aqueles ver- sados na técnica. A absorbância a 280 nm das soluções de anticorpo purifi- cado foi medida usando um espectrofotômetro. As concentrações de anti- corpo foram calculadas a partir dos valores determinados usando um coefi- ciente de extinção pelo método PACE (Protein Science (1995) 4: 2411-2423). (14-3) Avaliação da atividade de liqação ao Íon de cálcio de anticorpos que possuem uma substituição de Ala na sequência de hVk5-2 Se os anticorpos purificados obtidos se ligam ao Íon de cálcio foi testado. Especificamente, os anticorpos purificados foram dialisados (Easy-

SEP, TOMY) contra uma solução de Tris-HCl 20 mM / NaCl 150 mM / CaC|2 2 mM (pH 7,5) ou uma solução de Tris-HCl 20 mM / NaCl 150 mM (pH 7,5) (na Tabela 19, indicada como concentração de ion de cálcio de 0 µM)- A me- dição de DSC foi realizada em um aumento da taxa de temperatura de 5 240°C/h de 20 para 115°C usando soluções de anticorpo preparadas na mesma concentração de 0,1 mg/mL pela mesma soIução usada para a diáli- se.

Com base nas curvas de desnaturação de DSC obtidas, a temperatura intermediária de desnaturação térmica (valor de Tm) foi calculada para o dominio Fab de cada anticorpo como mostrado na Tabela 19. Alguns anti- lO corpos que possuem uma substituição de um residuo de Asp ou Glu na se- quência de CDR da sequência de hVk5-2 por um residuo de Ala que pode não estar envolvido na ligação ao Íon de cálcio ou quelação, foram revelados ter um dominio Fab cuja Tm não varia pela concentração de ion de cálcio y nas soluções de anticorpo.

Os sitios de substituição, cuja substituição de Ala 15 não altera a Tm (posições 32 e 92) (numeração de Kabat) foram demonstra- dos ser altamente importantes para a ligação ion de cálcio-anticorpo.

Tabela19 COnceNTRAçÃO de Íon CÁLCIO ATm(°C) NOME DA CADEIA POSIC.ÃO ALTERADA (NUtviÈRAcÃo DE LEVE VARIANTE Kabd) " OµM ) 2 mM l 2mM-OµM

I hVk5-2 _L65 TlPO SELVAGEM 71.71 73,69 1.98 L!!Vk5-2_L66 30 71.65 72.83 1.18 k!vk5-2_L67 31 71-52 73.30 1.78 I hVk5-2_ L68 73.25 74.03 0.78 32 l hVk5-2_ L69 72.00 73,97 1.97 50 hVk5-2_ L70 30, 32 73.42 73.60 ) 0-18 ! hVk5-2_ L71 71.84 72.57 0.73 30, 50 j hVk5-2 _L72 30, 32, 50 75-04 75.17 ) 0.13 I hVk5-2 L73 . . 92 75.23 i 75.04 , --0.19

Exemplo 15 Avaliação da atividade de ligação ao íon de cálcio de anticorpos que possuem a sequência hVkl com motivo de ligação ao íon 20 de cálcio (15-1) Construção de uma sequência hVkl sequência com motivo de liqação ao íon de cálcio e expressão e purificação de anticorpos

O resultado descrito no Exemplo 14 sobre a atividade de ligação ao Íon de Ca da Ala substituta demonstra que os residuos de Asp ou Glu na sequência de CDR da sequência hVk5-2 eram importantes para a ligação ao cálcio.

Então, os presentes inventores avaliaram se um anticorpo pode se 5 ligar ao íon de cálcio quando os residuos nas posições 30, 31, 32, 50, e 92 (numeração de Kabat) sozinhos eram introduzidos em uma sequência dife- rente da região variável.

Especificamente, variante LfVkl _ Ca (SEQ ID NO: 61) foi construída pela substituição dos resíduos nas posições 30, 31, 32, 50, e 92 (numeração de Kabat) na sequência hVk5-2 para os residuos nas posi- lO ções 30, 31, 32, 50, e 92 (numeração de Kabat) na sequencia hVkl sequên- cia (uma sequência da iinhagem germinativa humana)- Especificamente, foi testado se os anticorpos que possuem uma sequência hVkl introduzida com apenas 5 residuos da sequencia hVk5-2 podem se ligar ao cálcio.

As varian- tes foram produzidas pelo mesmo método como descrito no Exemplo 2. A variante de cadeia leve resultante LfVkl _ Ca e LfVkl que possui a sequência de cadeia leve hVkl (SEQ ID NO: 62) foi co-expressa com a cadeia pesada CIM _ H (SEQ ID NO: 48). Os anticorpos foram expressos e purificados pelo mesmo método como descrito no Exemplo 14. {15-2) Avaliação da atividade de liqação ao ion de cálcio de anticorpos que possuem uma sequência hVkl humana com motivo de ligação ao ion de cálcio Se o anticorpo purificado preparado como descrito acima se Iiga ao ion de cálcio foi avaliado pelo método descrito no Exemplo 4- O resultado é mostrado na Tabela 20. O valor de Tm do domínio Fab do anticorpo que possui LfVkl com uma sequência hVkl não variou na dependência da con- centração de cálcio nas soIuções de anticorpo.

Entretanto, a Tm do anticor- po que possui a sequência LfVkl _ Ca foi alterada em 1°C ou mais depois da alteração na concentração de cálcio nas soluções de anticorpo.

Portanto, foi mostrado que o anticorpo que possui LfVkl _ Ca se liga ao cálcio.

O resultado descrito acima demonstra que a sequência de CDR inteira de hVk5-2 não é necessária, já que os residuos introduzidos para a construção da sequência LfVkl _ Ca sozinhos já são suficientes para a ligação ao Íon de cálcio.

Tabela 20 CADEIA LEVE | CONCENTRAÇÃO DE ION CÁLCIO ATm(°C)

VARIANTE I 3 µ-M I 2 mM 2 mM-3µM LNKI 83.18 83.81 0.63 LfVkl _Ca l 79.83 I 82.24 2.41 (15-3) Construção, expressão e purificação da sequência LfVkl Ca resisten- te a degradação Como descrito em (15-2) do Exemplo 15, a variante LNKI _ Ca 5 (SEQ ID NO: 61) foi construida para ter a substituição dos resíduos nas po- sições 30, 31, 32, 50, e 92 (numeração de Kabat) na sequência hVk5-2 para os resíduos nas posições 30, 31, 32, 50, e 92 (numeração de Kabat) na se- quência hVkl (uma sequência da linhagem germinativa humana). A variante foi demonstrada se ligar ao íon de cálcio. Portanto, pode-se considerar anti- - 10 corpos dependentes de Ca (anticorpos que se ligam ao Ca) que possuem a sequência LfVkl _ Ca. Entretanto, como a sequência LfVkl _ Ca é uma se- quência nova, sua estabilidade no armazenamento como farmacêutico não está clara. Portanto, a aplicabilidade da sequência LNKI _ Ca como farma- cêutico permanece por ser esclarecida. Nesse contexto, a estabilidade de 15 LNKI _ Ca foi avaliada pelo teste de aceleração térmica. Um anticorpo que possua LfVkl _ Ca como uma cadeia L foi dialisada contra uma solução de histidina-HCl 20 mM / NaCl 150 mM (pH 6,0) por uma noite a 4°C- A concen- tração de anticorpo dialisado foi ajustada para 0,5 mg/ml, e armazenado a 5"C ou 50°C por três dias. Depois do armazenamento, cada anticorpo foi 20 submetido à cromatografia por troca de Íon pelo método descrito no Exemplo

12. O resultado demonstrou que LfVkl _ Ca estava significativamente degra- dado durante três dias de armazenamento a 50"C, como mostrado na Fig. 17, A sequência LfVkl _ Ca tem Asp nas posições 30, 31, e 32 (numeração de Kabat) e portanto sua sequência de CDRI contém uma sequência Asp- 25 Asp que tem sido descrita ser degradada sob condições ácidas (J. Pharm. Biomed. (2008) 47(1): 23-30). lsso sugere que os aminoácidos nas posições 30, 31 e 32 (numeração de Kabat) são um sitio de degradação possivel. Por- tanto, para evitar a degradaçào de LfVkl _ Ca, as variantes LNKI _ Cal (SEQ

ID NO: 72), LfVkl _ Ca2 (SEQ ID NO: 73), e LfVkl _ Ca3 (SEQ ID NO: 74) fo- ram construidas para ter uma substituição de resíduos de Ala (A) para os três resíduos de Asp (D) que são possivelmente sensiveis a degradação.

A substituição de aminoácido foi realizada por um método conhecido por aque- 5 les versados na técnica usando o QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit {Stratagene). DNAS que codificam as variantes foram inseridos em vetores de expressão em célula animai.

Em combinação com um vetor de expressão em célula animal que possui um inserto para expressar GC H (SEQ ID NO: 102) como a cadeia pesada, os vetores de expressão em célula animal 10 construídos que carregam insertos de DNA para as variantes, foram introdu- zidos em células animais pelo método descrito no Exempb 14. Os anticor-

" pos expressos nas células de animais introduzidos com os vetores foram purificados pelo método como descrito no Exemplo 14. (15-4) Avaliação da estabiiidade de anticorpos que possuem a sequência 15 LfVkl Caresistente a degradação Se os anticorpos preparados como descrito em (15-3) do Exem- plo 15 eram mais resistentes a degradação em soluções em pH 6,0 do que os anticorpos originais que possuem a sequência LfVkl _ Ca fornecida pela modificaçâo, foi avaliado pela comparação da heterogenicidade entre os 20 respectivos anticorpos depois da aceleração térmica.

Da mesma maneira como descrito acima, os anticorpos foram armazenados a 5°C ou 50°C pot três dias.

Cada anticorpo depois do armazenamento foi submetido à croma- tografia por troca de ion usando o método descrito no Exemplo 12- Como mostrado na Fig. 17, o resultado da análise demonstra que LNKI _ Cal com

25 uma alteração na posição 30 (numeração de Kabat) era menos heterogêneo e muito mais resistente à degradação da aceleração térmica do que a se-

quência LfVkl _ Ca original.

Especificamente, foi demonstrado que a degra-

dação ocorreu no residuo de Asp (D) da posição 30 na sequência LfVkl _ Ca,

mas ela poderia ser evitada pela alteração do aminoácido,

30 (15-5) Construção de uma sequência de cadeia leve LfVkl Ca resistente a deqradação no resíduo de Asp na posição 30 e expressão e purificação de anticorpos

O resultado descrito em (15-4) do Exemplo 15 sobre a resistên- cia a degradação da forma substituída com Ala demonstra que sob condi- ções ácidas, a sequencia LfVkl _ Ca foi degradada no resíduo Asp (D) na posição 30 (numeração de Kabat) em sua sequência de CDR e a degrada- 5 ção poderia ser evitada no caso de substituição em um aminoácido diferente (em (15-4), pela substituição de um resíduo de Ala (A)) pelo resíduo Asp (D) na posição 30 (numeração de Kabat). Depois, os presentes inventores testa- ram se até uma sequência com uma substituição de Ser (S), um resíduo ca- paz de quelar o íon de cálcio, pelo resíduo na posição 30 (numeração de Kabat) (referido como LfVkl _ Ca6; SEQ ID NO: 75) era resistente a degrada- ção, enquanto mantinha a atividade de ligação ao cálcio.

As variantes foram preparadas pelo mesmo método como descrito no Exemplo 14. As sequên- cias das cadeias Ieves alteradas LfVkl _ Ca6 e LfVkl _ Ca foram expressas em combinação com a cadeia pesada GC _ H (SEQ ID NO: 102). Anticorpos foram expressos e purificados pelo mesmo método como descrito no Exem- plo 14. (15-6) Avaliação de uma sequência de cadeia leve LfVkl Ca resistente a deqradação no resíduo Asp na posição 30 Anticorpos purificados preparados como descrito acima foram avaliados quanto a sua estabilidade ao armazenamento sob condições áci- das pelo método descrito em (15-4) do Exemplo 15- O resultado demonstra que os anticorpos que possuem a sequência LfVkl _ Ca6 são mais resisten- tes à degradação do que aqueles que possuem a sequência LfVkl Ca origi- nal, como mostrado na Fig. 18. Então, se os anticorpos que possuem a sequência LNKI _ Ca e os anticorpos que possuem a sequência LfVkl _ Ca6 sequência se ligam ao íon de cálcio foi testado pelo método descrito no Exemplo 15- O resultado é mostrado na Tabela 21. Os valores de Tm dos domínios Fab de anticorpos que possuem a sequência LNKI _ Ca e os anticorpos que possuem a se- quencia LfVkl _ Ca6 resistente a degradação estavam alterados em rc ou mais depois da alteração na concentraçáo de cálcio de soluções de anticor-

po.

Tabela 21 CADEIA LEVE CONCENTRAÇÃO DE KJN CÁLCIO : ATni (°c) l variante µu ! 2 ml/l j2mld-3µM , t JfVk1_Ca : 78. 45 i 80.06 µ- 61 l LfVk1_Ca6 ! 78. 44 È 79- 74 i 1. 30 Levando a estabilidade em consideração, o resultado descrito acima demonstra que ela é importante para a ligação ao íon de cálcio de anticorpos em que o aminoácido na posição 30 era um aminoácido capaz de 5 interagir com o íon de cáicio (Asn, Glu, Gln, Ser, Thr, His, Tyr, etc.) diferente de Asp, e todos ou alguns aminoácidos nas posições 31, 32, 50, e 92 (nume- ração de Kabat) na sequência eram os mesmos de hVk5-2 ou aminoácidos capazes de interagir com cálcio (Asp, Asn, Glu, Gln, Ser, Thr, His, Tyr, etc.). - Por exemplo, quando uma biblioteca sintética é construída para ter tal motivo, " 10 os anticorpos com ligação dependente de cálcio podem ser eficientemente isolados da biblioteca.

Exempio 16 Avaliação por RMN da atividade de ligação ao íon de cálcio de anticorpos que possuem a sequência hVkl humana com um motivo de ligação ao cálcio 15 (16-1) Expressão e purificação de anticorpos Um anticorpo que tem LfVkl _Ca e um anticorpo que tem LNKI foram expressos e purificados para avaliações por RMN. Especificamente, plasmídeos de expressão em animal para um anticorpo que possui LfVkl _ Ca foram construidos para serem capazes de expressar sua cadeia 20 pesada (SEQ ID NO: 13) e a cadeia leve (SEQ ID NO: 61), e eles foram in- troduzidos transitoriamente em céiulas de animais. Adicionalmente, plasmí- deos de expressão em animal para um anticorpo que possui LfVkl foram construidos para serem capazes de expressar sua cadeia pesada (SEQ ID NO: 13) e cadeia Ieve (SEQ ID NO: 62), e eles foram introduzidos transitori- 25 amente em células de animais. Aminoácidos marcados foram adicionados a 100 ml de suspensões celulares preparadas pela suspensão de células Fre- eStyie 293-F (lnvitrogen) derivadas de célula de rim fetal humano em uma densidade celular de 1 x 106 células/ml no Meio de Expressão FreeStyle 293 (lnvitrogen). Especificamente, uma solução de ácido L-aspártico-'3C,,1'N (10 mg), ácido L-glutâmico-"C,,"N (2.5 mg), L-g{utamina-'3C,,"N, (60 mg), L- asparagina-"C ,,""N2·H2O (2,5 mg), e l3-cIoro-L-a|anina (6 mg) em 10 ml de água foi filtrada através de um filtro de 0.22-µm e adicionada para preparar anticorpos marcados com Asp/G|u/G|n/Asn- Enquanto isso, uma solução de 5 L-leucina-'5N (30 mg) e |3-cloro-L-alanina (6 mg) em 10 ml de água foi filtra- da através de um filtro de 0,22-µm e adicionada para preparar anticorpos marcados com Leu.

Os plasmideos construídos foram introduzidos nas célu- Ías pelo método da lipofecção.

As células introduzidas com os plasmideos foram cult'ivadas por cinco dias em uma incubadora com CO2 (37°C, 8% CO2, 10 90 rpm). A partir dos sobrenadantes de cultura preparados como descrito acima, os anticorpos foram purificados usando rProtein A SepharoseTM Fast

" Flow (Amersham Biosciences) por um método conhecido por aqueles versa- dos na técnica.

A absorbância a 280 nm das soluções de anticorpo purifi- cado foi medida usando um espectrofotômetro.

As concentrações de anti- 15 corpo foram calculadas a partir dos valores determinados usando um coe- ficiente de extinção pelo método PACE (Protein Science (1995) 4: 2411- 2423). (16-2) Preparação de fraqmento Fab Cada anticorpo foi concentrado para 8,2 a 11,8 mg/ml usando 20 um ultrafiltro com um ponto de corte de peso molecular de 30.000 MWCO.

Os anticorpos foram diluídos para 8 mg/ml usando ácido acético 50 mM/tarnpão Tris 125 mM (pH 6,8) contendo L-cisteina 1 mM e EDTA 2 mM para preparar as arnostras- Uma quantidade 1/240 de papaína (Roche Appli-

ed Science) foi adicionada a cada anticorpo- Depois de agitar, as amostras

25 foram incubadas a 37°C por uma hora- Depois da incubação, cada amostra foi carregada sobre uma HiTrap HP ativado com NHS 1 ml (GE Healthcare)

imobilizada com peptídeo Gly-Gly-Tyr-Arg (Sigma) e equilibrada com ácido acético 50 mM/tampão Tris 125 mM (pH 6,8), a jusante da qual uma coluna

HiTrap MabSelect Sure Protein A 1 ml (GE Healthcare) foi conectada em

30 tandem As frações de fragmento Fab purificado foram obtidas pela remoção do fragmento Fc e anticorpos não digeridos pela coÍuna de Proteína A a ju-

sante, enquanto a papaina ativada era removida a montante pelo peptideo

Gly-Gly-Tyr-Arg. O inibidor de Cisteina protease E64 (Sigma) foi adicionado a 10 µM nas frações de Fab para prevenir a ativação da papaina inativa nas frações Fab. Todas as operações com coluna descritas acima foram realiza- das em temperatura ambiente de 20 a 25°C. 5 (16-3) Preparação de fraqmentos Fab de anticorpos LfVkl Ca e LfVkl como amostras de RMN Soluções de anticorpos concentradas para 0,5 ml por centrifuga- ção usando o dispositivo de ultrafiltração Vivaspin (Sartorius) com MWCO

5.000. Depois um recipiente de diafiltração foi colocado no dispositivo de ultrafiltração descrito acima e o tampão foi trocado por tampão de RMN: d- 81sTris 5 mM/NaCl 20 mM/NaN3 O,OO1%(p/v) / 'H,O 5°/o(v/v) (pH 7,0) (o pH foi ajustado com NaOH e HCl) (através de três ciclos de: adição de 5 ml do tampão acima descrito ao recipiente de diafiltração, seguido pela concentra- ção para 0,5 rnl pela centrifugação). As soluções de anticorpo foram concen- tradas finaimente para 0,25 ml. Finalmente, o dispositivo de ultrafiltração foi lavado com tampão de RMN e o tampão foi combinado com o concentrado. lsso forneceu 420 µ1 e 270 µ1 de soluções de anticorpo para o anticorpo LfVkl _ Ca e o anticorpo LfVkl, respectivamente. Nesse estágio, o pH das soIuções foi confirmado de novo e o pH foi ajustado para 7,0 usando NaOH e HCl, se necessário. A absorbância a 280 nm das soluções de anticorpo purificado foi medida usando um espectrofotômetro UV Nanodrop (Thermo Fisher Scientific) e as concentrações dos fragmentos de Fab foram determi- nadas com o coeficiente de extinção molar a 280 nm = 70 000 M 'cm '. As concentrações de anticorpos marcados com Leu LfVkl _ Ca e LfVkl eram 0,12 mM, enquanto que as concentrações de anticorpos marcados com Asp, Glu, Asn, e Gln LfVkl _Ca r LfVkl eram de 0,24 mM. Das amostras acima descritas, o anticorpo LfVkl _ Ca foi colocado em um tubo de amostra de RMN com 5 rnm de diâmetro (shigemi) e o anticorpo LfVkl foi colocado em um tubo de micro amostra simétrico de 5 mm (shigemi) para a solução a- quosa usando uma pipeta Pasteur. Nos experimentos de titulação de Ca'" para o anticorpo o LfVkl _ Ca, soluções de CaCl2 foram adicionadas a solu- ções de anticorpo em sucessão tal que Ca2" era de 1, 2, 5, 10, ou 20 equiva-

lentes molares para o anticorpo. As soluções de CaC|2 adicionadas foram preparadas a 10, 20, 50, e 100 mM de CaCl, usando tampão de RMN. Os volumes requeridos de soIuções de CaC|2 foram adicionados diretamente à soluções de anticorpo nos tubos de amostra de RMN usando uma microsse- 5 ringa (ITO), que foi adaptada pela extensão da porção de seringa de um produto já pronto, tal que o volume de carregamento varia de 3 a 10 µ1. De- pois de agitar com um misturador, os tubos de amostra foram centrifugados usando uma centrifuga manual (Shimadzu). (16-4) Medição de RMN para observar sinais de qrupo amida dos fraqmen- lO tos Fab dos anticorpos LfVkl Ca e LfVkl Ca As medições de RMN foram executadas usando o espectrôme- tro de RMN DRX750 (Bruker Biospin) instalado com TCl CryoProbe. A tem- peratura foi ajustada a 307K (GasFlow 535 L/h). 1H~"N HSQC foi usado pa- ra observar os sinais do grupo amida nas medições de RMN. O método de medição foi conduzido por desacoplamento de 13ç simultâneo dos carbonos a e da carbonila e subtração dos sinais de água e solvente durante o perio- do de evolução de "N usando 'H-"N FHSQC com um trem de puiso 3-9-19.

Um programa padrão fornecido pelo fabricante (Bruker Biospin) foi usado como um esquema de controle de pulso. As condições da medição de RMN foram as seguintes. Largura espectral: 12019Hz (f2), 1976 Hz (fl): o número de pontos de dados: 2048 (f2), 128 (fl). Os dados foram processados usan- do Topspin 3.0 (Bruker Biospin) do seguinte modo. Uma função de janela de seno quadrado deslocado (QSINE) em f2 e fl, e preenchimento zero para dobrar o tamanho dos dados foram aplicados antes da transformação de Fourier. Os deslocamentos quimicos dos sinais foram calculados usando um programa de anáiise por RMN Sparky (UCSF). (16-5) Atribuição do sinal de RMN dos çjrupos amida da cadeia principal 80% dos sinais RMN dos grupos amida da cadeia principal do fragmento Fab de tocilizumabe (cadeia pesada SEQ ID NO: 13: cadeia leve SEQ ID NO: 14) foram atribuídos anteriormente (dados não revelados). A sequência de aminoácidos do fragmento Fab do anticorpo LNKI _ Ca é igual a do fragmento Fab de tocilizumabe, exceto por algumas porções da CDRI,

CDR2, CDR3 de cadeia leve e os residuos de aminoácido nas posições 73 e 83 na cadeia leve.

As sequências de aminoácidos compartilhadas pelos du- as anticorpos dão sinais de RMN que mostram deslocamentos químicos i- guais ou similares.

Por causa disto, as informações de atribuição sobre o 5 tocilizumabe foram aplicáveis em tais sequências de aminoácidos.

Para a- mostras marcadas com Leu, as atribuições revelaram ser aplicável incluir: 11, (33), (46), (47), (54), (78), 125, 135, 136, 154, 175, 179, 181, e 201 na ca- deia leve, e 18, 46, 64, 71, 81, 83, 114, 144, 147, 165, 176, 181, 184, e 195 na cadeia pesada.

No exposto acima, números sem parênteses representam 10 números de resíduo nos quais as atribuições são aplicáveis porque os des- locamentos quimicos são compartilhados pelo tocilizumabe; os números en-

- tre parênteses representam números de residuos nos quais as atribuições são aplicáveis porque os deslocamentos químicos são similares aos do toci- . lizumabe e não há outros sinais dando deslocamentos quimicos similares. 15 Entretanto, para as amostras marcadas com Asp, Glu, Asn, Gln, quatro si- nais foram recentemente observados em LfVkl _ Ca quando os espectros foram comparados entre os anticorpos LfVkl _ Ca e LfVkl.

Presume-se que estes foram atribuiveis a quatro dos cinco resíduos, Asp30, Asp31, Asp32, Asp92, e Glu50, entre os resíduos Asp, Glu, Asn, e Gln na cadeia leve onde 20 a sequência introduzida como um motivo de ligação ao Ca2" é diferente en- tre os dois anticorpos. (16-6) ldentificaçâo do sÍtio de liqação ao Ca'" no anticorpo LfVkl Ca Sinais com deslocamento quimico diferente foram extraídos pela comparação dos espectros de 'H-""N HSQC do fragmento Fab do anticorpo 25 LfVkl _Ca entre na presença e na ausência de 20 equivalentes molares de Ca2". O resultado nas amostras marcadas com Leu mostrou que apenas Leu33, mas nenhum outro resíduo de Leu, na cadeia leve está envolvido na ligaçào.

Além disso, com as amostras marcadas com Asp, Glu, Asn, Gln , foi mostrado que quatro dos cinco residuos, Asp30, Asp31, Asp32, Asp92, e 30 Glu50, na cadeia leve foram estão envolvidos na ligação, e todos menos um dos outros resíduos Asp, Glu, Asn, e Gln não eram responsáveis pela liga- ção.

O achado descrito acima demonstra que na sequência de aminoácidos introduzida como o motivo de Iigação ao Ca2", alguns aminoácidos pelo me nos da CDRI de cadeia leve e ambas ou qualquer uma das CDR2 e CDR3 de cadeia leve estavam envolvidos na ligação ao Ca2'", Jsto é compativel com o achado descrito no Exemplo 15 de que é importante para a ligação do 5 Íon de cálcio que os aminoácidos nas quatro posições entre as posições 30, 31, 32, 50, e 92 (numeração de Kabat) sejam idênticos aos na sequência de hVk5-2. (16 7) Cálculo da constante de dissociação de Ca'" por um experimento de titulação 10 Com base nos espectros de 'H_"N HSQC em concentrações de Ca2" de 0, 1, 2, 5, 10, ou 20 equivalentes moiares ao fragmento Fab do anti- corpo LfVkl _ Ca, um gráfico foi plotado com o equivalente molar de Ca2" no eixo horizontal e com os deslocamentos químicos de 1H ou 15N do sinal para m a Leu33 de cadeia leve identificada como o sítio de ligação no eixo vertical. 15 Usando a função representada pela fórmula 2 mostrada abaixo, o ajuste dos dados foi feito com o programa Gnuplot.

Fórmula 2 f(x)=s*[1-0,5/a*{(a*x+a+Kd)-((a*x+a+Kd)2—4*x*a2)0°5}+t* [0,5/a*{(a*x+a+Kd)-((a*x+a+Kd)2-4*x*a2)0v3

20 Na função representada pela fórmula 2, "s" e "t" representam o deslocamento quírnico [ppm] para o estado não ligado ao Ca2" e um deslo- camento quimico estimado [ppm] para o estado saturado ligado ao Ca2", respectivamente; "a" representa a concentração do fragmento Fab do anti- corpo [M]; "Kd" representa a constante de dissociação; e "x" representa os 25 equivalentes molares de Ca2" adicionados ao fragmento Fab do anticorpo.

No ajuste dos dados, s, t, e Kd foram parâmetros de ajuste.

Como resul- tado,, com base nos deslocamentos químicos de 1H e 15N , a Kd foi esti- mada da seguinte forma: Kd = 7,1 x 10"' [M] e Kd = 5,9 x 10"' [M], respec-

tivamente. 30 Exemplo 17 Avaliação da sequência variante hVk5-2 para liga- ção ao cálcio A variante 1 de Vk5-2 (SEQ ID NO: 63) e a variante 2 de Vk5-2

(SEQ ID NO: 64) foram obtidas em adição à Vk5-2 (SEQ ID NO: 41), todas os quais são classificadas como Vk5-2. Estas variantes foram avaliadas por sua ligação ao cálcio.

Os fragmentos de DNA para Vk5-2, variante 1 de Vk5- 2, e variante 2 de Vk5-2 foram inseridos, cada um, em vetores de expressão 5 em célula animal.

As sequências de nucleotídeos dos vetores de expressão construídos foram determinadas por um método conhecido pelos versados na técnica.

Pelo método descrito no Exemplo 13, os vetores de expressão em célula animal nos quais se inseriu os fragmentos de DNA para Vk5-2, variante 1 de Vk5-2, e variante 2 de Vk5-2 foram introduzidos, em combina- lO ção com o vetor de expressão em um animal transportando um inserto para expressar CIM_ H (SEQ ID NO: 48) como uma cadeia pesada, em células animais e os anticorpos foram purificados.

Os anticorpos purificados foram avaliados quanto a sua atividade de figação ao Íon de cálcio.

Os anticorpos . purificados foram dialisados (EasySEP, TOMY) contra Tris-HCl 20 mM /NaCl 15 150 mM (pH 7,5) (na tabela 22, indicado como concentração de Íon de cálcio de 0 mM) ou Tris-HCl 20 mM /NaCl 150 mM lCaCl, 2 mM (pH 7,5). A medi- ção com calorímetro de varredura diferencial (DSC) foi executada a uma ta- xa de aumento de temperatura de 240°C/h de 20 a 115"C usando soIuções de anticorpo preparadas a uma concentração de 0,1 mg/mL pela mesma 20 solução usada para a diálise.

Com base nas curvas de desnaturação de DSC obtidas, a temperatura intermediária da desnaturação térmica (valor de Tm) foi calculada para o domínio Fab de cada anticorpo.

Os valores da Tm são mostrados na tabela 22-

25 Tabela 22 Cadeia leve Concentração de ion de cálcio A Tm ("C)

0 mM 2mM 1 mM - 0 mM Vk5-2 71,65 74,38 2,73 Variante 1 de Vk5-2 65,75 72,24 6,49 Variante 2 de Vk5-2 66,46 72,24 5,,78

O resultado mostrou que o valor da Tm para os domínios Fab dos anticorpos com a sequência de Vk5-2, variante 1 de Vk5-2, ou variante 2 de Vk5-2 variou dependendo da concentração de íon de cálcio nas soluções contendo anticorpos tendo os dominios Fab. lsto demonstra que os anticor- pos com uma sequência classificada como Vk5-2 se ligam ao íon de cálcio.

Exemplo 18 Anticorpos que se ligam ao CD4 humano de uma 5 maneira dependente de cálcio (18-1) Preparação de CD4 humano soiúvel O CD4 humano solúvel foi preparado da seguinte forma.

Uma sequência de DNA que codifica uma sequência (SEQ ID NO: 76) na qual um sinalizador Myc é ligado à sequência de aminoácidos do CD4 humano que 10 não possui a região transmembranar foi inserida em um vetor de expressão de célula animal.

A sequência do CD4 humano recombinante construido foi confirmada por um método conhecido pelos versados na técnica. (18-2) Expressão e purificação de anticorpos que se iiqam ao CD4 humano m solúvel 15 TNX355-lgG1 (cadeia pesada SEQ ÍD NO: 77; cadeia leve SEQ ID NO: 78) e Q425 (cadeia pesada SEQ ID NO: 79; cadeia leve SEQ ID NO: 80) são anticorpos anti-CD4 humano.

Além disso, Q425L9 (cadeia pesada SEQ ID NO: 81; cadeia leve SEQ ID NO: 82) é uma variante de cadeia L de Q425. As sequências de DNA que codificam os aminoácidos de TNX355- 20 lgGl (cadeia pesada SEQ ID NO: 77; cadeia leve SEQ ID NO: 78), Q425 (cadeia pesada SEQ ID NO: 79: cadeia leve SEQ ID NO: 80), e Q425L9 (ca- deia pesada SEQ ID NO: 81; cadeia leve SEQ ID NO: 82) foram inseridos em pIasmideos de expressão de célula animal.

Os anticorpos foram expres- sos por meio do seguinte método.

Células de FreeStyle 293-F derivada de 25 célula de rim fetal humano (lnvitrogen) foram suspensas em meio de expres- são FreeStyle 293 (Invitrogen) e piaqueadas a uma densidade celular de 1,33 x 106 células/ml (3 ml) em cada poço de uma pIaca de 6 poços.

Os plasmídeos preparados foram introduzidos nas células por um método de lipofecção.

As células foram cultivadas durante quatro dias em uma incuba- 30 dora de CO2 (37"C, 8% CO2, 90 rpm). A partir dos sobrenadantes de cultura preparados conforme descrito acima, anticorpos foram purificados usando rProtein A Sepharose"M Fast Flow (Amersham Biosciences) por um método conhecido peíos versados na técnica.

A absorbância a 280 nm das soluções de anticorpo purificadas foi medida usando um espectrofotômetro, As con- centrações de anticorpo foram calculadas a partir dos valores determinados usando um coeficiente de extinção calculado pelo método PACE (Protein 5 Science (1995) 4: 2411-2423). (18-3) Avaliação dos anticorpos preparados para atividade de Iiqação de- pendente de cálcio ao CD4 humano Os anticorpos preparados foram avaliados para sua atividade de ligação dependente de cálcio ao CD4 humano soÍúvel usando Biacore TlOO (GE Healthcare). A concentração alta de íon de cálcio usada foi 1,2 mM, en- quanto que a concentração baixa de Íon de cálcio foi 3 µM.

O CD4 humano solúvel (preparado conforme descrito em 18-1) foi usado como antigeno.

Uma quantidade adequada de proteína G (lnvitrogen) foi imobilizada no chip sensor CM4 (GE Healthcare) pelo método de acoplamento de amina e, en- tão, os anticorpos de interesse foram deixados em captura.

ACES 10 mmol/l, NaCl 150 mmol/l, Tween20 0,05% (p/v), CaC|2 1,2 mmol/l (pH 7,4 ou pH 6,0) contendo 1,2 mmol/l ou 3 µrnol/l de CaC|2 foi usado como um tampão de cor- rida.

Todas as medições foram executadas a 37°C.

O CD4 humano foi diluí- do usando os respectivos tampões.

Os sensorgramas do anticorpo são mos- trados na Figura 19. Conforme mostrado na figura 19, o formato do sensor- grama do anticorpo TNX355-lgG1 não se alterou mesmo quando a condição do tampão de corrida foi mudada. lsto demonstra que TNX355-lgG1 é um anticorpo comum que não mostra atividade de ligaçâo dependente de cálcio ao CD4 humano.

Entretanto, para ambos os anticorpos Q425 e Q425L9, a quantidade de ligação ao antígeno foi menor em uma concentração de íon de cálcio 3 µM (concentração de íon de cálcio baixa) do que em 1,2 mM (concentração de Íon de cálcio alta), e esta forma, eles mostraram atividade de ligação dependente Ca.

Em particular, nenhuma fase de ligação foi ob- servada para o anticorpo Q425L9 em uma concentração de íon de cálcio de 3 µM mesmo a uma concentração de analito (CD4 humano solúvel) de 200 nM.

Especificamente, foi demostrado que Q425 e Q425L9 são anticorpos de ligação dependente de cálcio que se ligam ao CD4 humano em uma maneira dependente de cálcio.

Exemplo 19 Avaliação dos anticorpos de Iigação dependente de Ca por seu efeito sobre a retenção do antígeno no plasma usando camun- dongos normais 5 (19-1) Ensaio in vivo usando camundonqos normais Q425 e Q425L9 preparados conforme descrito no exemplo 18 são anticorpos que se ligam ao CD4 humano solúvel de uma maneira de- pendente de cálcio.

Como já descrito nos exemplos 5 e 6, com relação ao IL6R, foi demonstrado que quando administrado em combinação com um antigeno, um anticorpo que tem a propriedade de se ligar a um antígeno de uma maneira dependente de cálcio tem a propriedade de acelerar a elimina- ção do antigeno em comparação a quando um anticorpo que se liga a um antigeno de uma maneira independente de cálcio é administrado em combi- nação com um antigeno.

Entretanto, ainda não foi esclarecido se os anticor- pos contra outros antigenos também têm a propriedade de acelerar a elimi- nação do antígeno.

A seguir, o CD4 humano solúvel (preparado conforme descrito no Exemplo 18) foi administrado sozinho ou em combinação com um anti- corpo anti-CD4 humano a camundongos normais (camundongo C57BL/6j; Charles River Japão). Os camundongos foram testados para a cinética in vivo do CD4 humano solúvel e do anticorpo anti-CD4 humano após a admi- nistração.

Uma solução de CD4 humano solúvel (50 µg/ml) ou uma solução mista de CD4 humano solúvel e um anticorpo anti CD4 hurnano foi adminis- trada uma vez a 10 ml/kg à veia caudal.

Os anticorpos anti-CD4 humano usados foram TNX355-!gG1, Q425-lgG1, e Q425L9-lgG1 descritos acima.

A concentração do CD4 humano solúvel na solução mista foi 50 µg/ml.

Entretanto, as concentrações dos anticorpos anti-CD4 humano varia- ram dependendo do anticorpo: 0,264 mg/ml para TNX355-lgG1: 0,197 mg/ml para Q425-lgG1; e 2,594 mg/ml para Q425L9-lgG1. Nesse caso, os anticor- pos anti-CD4 humano estavam presentes em uma quantidade em excesso em comparação ao CD4 humano solúvel, e presume-se que CD4 humano solúvel se ligue predominantemente aos anticorpos.

No grupo administrado itgw«

com CD4 humano solúvel sozinha, sangue foi coletado 2 minutos, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, uma hora, e duas horas após a administração.

No grupo administrado com CD4 humano solúvel em combinação com TNX355- lgG1 sem atividade de ligação ao antigeno dependente de cálcio, sangue foi 5 coletado 5 minutos, 2 horas, 7 horas, 1 dia, 3 dias, 7 dias, 14 dias, e 28 dias após a administração.

No grupo administrado com CD4 humano solúvel em combinação com Q425-lgG1 ou Q425L9-lgG1 tendo atividade de ligação ao antigeno dependente de cálcio, sangue foi coletado 5 minutos, 30 minutos, 2 horas, 7 horas, 1 dia, 3 dias, 8 dias, 14 dias, e 28 dias após a administração. lmediatamente após a coleta, o sangue foi centrifugado a 4°C e 12.000 rpm durante 15 minutos para isolar o plasma.

O plasma isolado foi armazenado em um congelador a -20°C ou menos antes das medições. (19-2) Determinação da concentração plasmática do anticorpo anti-CD4 hu- mano em camundonÁos normais por ELISA As concentrações do anticorpo anti-CO4 humano no plasma de camundongo foram determinadas por ELISA.

Primeiro, um fragmento F(ab')2 anti-lgG humana (específico para cadeia Y) do anticorpo (SIGMA) foi aliquo- tado em uma pIaca Nunc-lmmuno Plate, MaxiSorp (Nalge nunc lnternational). A placa foi deixada em repouso de um dia para outro a 4°C para preparar uma placa com anticorpo anti-lgG humana imobilizado.

Amostras-padrão foram preparadas em concentrações de 0,64, 0,32, 0,16, 0,08, 0,04, 0,02, e 0,01 µg/ml no plasma.

Amostras de teste do plasma de camundongo foram preparadas por diluir 100 vezes ou mais- As amostras foram aliquotadas na placa com anticorpo anti-lgG humana imobilizado.

A pIaca foi incubada a 25°C durante uma hora.

Após a incubação, as amostras foram reagidas com anticorpo anti-lL-6R humano biotinilado (R&D) a 25°C durante uma hora, e, então, com estreptavidina-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologi- es) a 25°C durante 0,5 hora.

A reação cromogênica foi executada usando substrato para micropoço TMB One Component HRP (B1OFX Laboratories) como um substrato.

Após a reação ter sido interrompida corn ácido sulfúrico 1N (Showa Chemical), a absorbância a 450 nm foi medida usando um leitor de microplacas.

Usando um programa de análise SOFJ"max PRO (Molecular

Devices), as concentrações no plasma do camundongo foram calculadas com base na absorbância da curva-padrão.

Um curso de tempo das concentrações plasmáticas dos anticor- pos TNX355-lgG1, Q425-!gG1, e Q425L9-lgG1 determinado pelo método 5 descrito acima após administração intravenosa a camundongos normais é mostrado na Figura 20. (19-3) Determinação das concentrações plasmáticas de CD4 humano solú- vel por um método de Iuminescência eletroquímica As concentrações de CD4 humano solúvel no plasma de ca- lO mundongo foram determinadas por ELISA.

Para o grupo administrado com sCD4 sozinho e o grupo admi- nistrado em combinação com Q425 ou Q425 _ L9, TNX foi aliquotada em uma placa Nunc-lmmuno, MaxiSorp (Nalge nunc lnternational). A placa foi deixa- da de u[n dia para o outro a 4°C para preparar uma placa com TNX imobili- zado.

Amostras-padrão foram preparadas em concentrações de plasma de 10, 5, 2,5, 1.25, 0.625, 0.3125, e 0.156 µg/ml no plasma.

Amostras de teste do plasma de camundongo foram preparadas por diluir 100 vezes ou mais.

As amostras foram preparadas usando um tampão contendo EDTA 10 mM, e aliquotadas na placa com TNX imobilizado.

Após três horas de incubação a 25°C, as amostras foram reagidas com anti-c-myc-HRP (Miltenyi Biotech) a 25°C durante uma hora.

A reação cromogênica foi executada usando subs- trato para micropoço TMB One Component HRP (B1OFX Laboratories) como um substrato- Após a reação ter sido interrompida com ácido sulfúrico 1N (Showa Chemical), a absorbância a 450 nm foi medida usando um leitor de microplacas.

Usando o programa de análise SOFTmax PRO (Molecular De- vices), as concentrações no plasma do camundongo foram calculadas com base na absorbância da curva-padrão.

No grupo administrado em combinação com TNX, Q425 foi ali- quotada em uma placa Nunc-lmmuno, MaxiSorp (Nalge nunc international). A placa foi deixada de um dia para o outro a 4°C para preparar uma placa com Q425 imobilizado.

Amostras-padrão foram preparadas em concentra- ções de plasma de 20, 10, 5, 2,5, 1,25, 0,625, e 0,3125 µg/ml no plasma.

Amostras de teste do piasma de camundongo foram preparadas por diluir 100 vezes ou mais.

As amostras foram preparadas usando um tampão contendo Ca2" 2 mM, e aliquotadas na placa com TNX imobilizado.

Após três horas de incubação a 25°C, as amostras foram reagidas com anti-c- 5 myc-HRP (Miltenyi Biotech) a 25°C durante uma hora.

A reação cromogê- nica foi executada usando substrato para micropoço TMB One Compo- nent HRP (B1OFX Laboratories) como um substrato.

Após a reação ter si- do interrompida com ácido sulfúrico 1N (Sbowa Chemical), a absorbância a 450 nm foi medida usando um leitor de microplacas.

Usando o progra- lO ma de análise SOFTmax PRO (Molecular Devices), as concentrações no plasma do camundongo foram calculadas com base na absorbância da curva-padrão.

Um curso de tempo das concentrações plasmáticas de CD4 hu- mano solúvel determinado pelo método descrito acima após administração intravenosa a camundongos normais é mostrado na Figura 21. O resultado mostrou que o CD4 humano solúvel foi eliminado muito rapidamente quando administrado sozinho- Entretanto, a eliminação do CD4 humano solúvel foi muito retardada quando ele foi administrado em combinação com TNX355-lgG1, um anticorpo comum sem atividade de liga- ção dependente de Ca ao CD4 humano solúvel.

Em contrapartida, a eiimi- nação do CD4 humano solúvel foi significativamente acelerada quando ele foi administrado em combinação com Q425-1gG1 ou Q425L9-lgG1 que pos- suem atividade de ligação dependente de Ca ao CD4 humano solúvel.

A eli minação do CD4 humano solúvel poderia ser acelerada quando administra- do em combinação com Q425-lgG1 ou Q425L9-lgG1 em comparação a quando administrado em combinação com TNX355-lgG1. Este achado de- monstra que não apenas para IL-6R, mas também para CD4 humano, a eli- minação do antígeno do plasma pode ser obtida com um anticorpo com liga- ção dependente de cálcio.

Exemplo 20 Anticorpos que se ligam à lgA humana de uma ma- neira dependente de cálcio (20-1) Preparação da IçjA humana (hlqA)

Um antígeno, IgA humana recombinante (deste ponto em diante no presente documento abreviada como hlgA), foi preparado da seguinte forma.

A hlgA compreendendo H(\NT)-lgA1 (SEQ ID NO: 83) e L(\NT) (SEQ ID NO: 14) foi expressa, e purificada por cromatografia de troca iônica e 5 cromatografia de filtração em gel usando um método conhecido pelos versa- dos na técnica. (20-2) Expressão e purificação de anticorpos que se ligam à lqA humana GA1-lgG1 (cadeia pesada SEQ ID NO: 84; cadeia leve SEQ ID NO: 85), GA2-lgG1 (cadeia pesada SEQ ID NO: 86; cadeia leve SEQ ID NO: 10 87), GA3-lgG1 (cadeia pesada SEQ ID NO: 88: cadeia leve SEQ ID NO: 89), e GA4-lgG1 (cadeia pesada SEQ ID NO: 90: cadeia leve SEQ ID NO: 91) são anticorpos que se ligam à lgA humana.

Então, com o propósito de acen- tuar ainda mais a eliminação do antígeno (hlgA) do plasma, de uma forma k similar àquela descrita nos exemplos 6 e 7, GA2-N434W (cadeia pesada 15 SEQ ID NO: 92; cadeia leve SEQ ÍD NO: 87) foi construído por introduzir uma substituição de aminoácido N434W em GA2-lgG1 para fortalecer a liga- ção ao FcRn de camundongo em pH 7,4, As sequências de DNA que codifi- cam GAl-lgGl (cadeia pesada SEQ ID NO: 84; cadeia leve SEQ ID NO: 85), GA2-lgG1 (cadeia pesada SEQ ID NO: 86; cadeia leve SEQ ID NO: 87), 20 GA3-lgG1 (cadeia pesada SEQ ID NO: 88; cadeia leve SEQ ID NO: 89), GA4-lgG1 (cadeia pesada SEQ ID NO: 90; cadeia Ieve SEQ ID NO: 91), e GA2-N434W (cadeia pesada SEQ ID NO: 92; cadeia leve SEQ ID NO: 87) foram inseridas em plasmideos de expressão em animais por um método conhecido pelos versados na técnica.

Os anticorpos foram expressos por 25 meio do seguinte método.

Células de FreeStyle 293-F derivada de célula de rim fetal humano (lnvitrogen) foram suspensas no meio de expressão Fre- eStyle 293 (lnvitrogen) e plaqueadas a uma densidade celular de 1,33 x 10' células/ml (3 ml) em cada poço de uma placa de 6 poços.

Os plasmídeos construídos foram introduzidos nas células por um método de lipofecção.

As 30 células foram cultivadas durante quatro dias em uma incubadora de CO2 (37°C, 8°/0 CO2, 90 rpm). A partir dos sobrenadantes de cultura preparados, anticorpos foram purificados usando rProtein A SepharoseTM Fast Flow (A-

mersham Biosciences) por um método conhecido pelos versados na técnica.

As concentrações os anticorpos purificados foram determinadas mediante a medição da absorbância a 280 nm usando um espectrofotômetro.

As con- centrações de anticorpo foram calculadas a partir dos valores determinados 5 usando um coeficiente de extinção calculado pelo método PACE (Protein Science (1995) 4: 2411-2423). (20-3) Avaliação dos anticorpos preparados para a atividade de ligação à lgA humana dependente de Ca Usando Biacore T200 (GE Healthcare), os anticorpos obtidos fo- lO ram avaliados para sua atividade de ligação à lgA humana (constante de dissociação Kd (M)). A medição foi executada usando como um tampão de corrida 0,05% de Tween20, ACES 20 mmol/l, NaCl 150 mmol/l (pH 7,4 ou pH 5,8) contendo 3 µM ou 1,2 mM de CaC|2, ou 0,05°6 de Tween20, A- CES 20 mmol/l, NaCl 150 mmol/l (pH 8,0) contendo 0,1 µM ou 10 mM de CaCl,. Após uma quantidade adequada de proteina NG recombinante (Thermo Scientific) ser imobilizada sobre o chip sensor CM5 (GE Healthcare) por um método de acoplamento de amino, foi deixado que os anticorpos se ligassem ao chip sensor.

Uma concentração adequada de hlgA (descrita em (20-1)) foi injetada como um analito para interagir com os anticorpos no chip sensor.

A seguir, o chip sensor foi regenerado por injetar 10 mmol/l de glici- na-HCl, pH 1,5. A medição foi executada a 37°C.

A partir do resultado do en- saio, a constante de dissociaçâo Kd (M) foi calculada com base na análise de ajuste de curva e análise de constante de equilibrio usando o programa de avaliaçáo Biacore T200 (GE Healthcare). O resultado é mostrada na tabe- la 23. O sensorgrama obtido é mostrado na Figura 22- Foi demostrado que GA2-lgG1, GA3-lgG1, e GA4-lgG1 se ligam à lgA humana fortemente a uma concentração de Ca2" de 1,2 mM e fracamente a uma concentração de Ca2"

de 3 µM.

Tabela 23

19'4269 Nome do" condição Ajuste anticorpo | ka kd KD : pH8-0, 10 rdd Ca jmodelo de ligação 1:1 1. 1OE+06 2.40E-O1 L 2- 20£197, l pÁ8, 0." 0."1" µ'ÍCa jmodelo de ligação 1:1 " 1."20È+"0G 1 20e-01:L 1-09E_97. " "t " " " " " " " " " " " " " " " " 5_ 70E+05 8 40E-02 L 1.59ÊT9i GA1-lgG1 j_pH7. 4, 1. 2 ,2 S!! J modelo de ligação 1:1 6-40E+Õ5 "1 20E 0i"L i. 90E-07 l pH7. 4. 3 µ,M Ca )modelo de ligação 1:1 | r±l5, 8 1. 2 dlil C2 _) modeb de ligação 1:1 ~

6. 80E+05 9 9(È"0íL i "40Ê47 I À5- á: 3 µ"M Ca !modelo de ligação 1:1 " ÜOÊ+05 1 1Qê:0i |1-"50ui | pH7. 4, 1. 2 mNl Ca jmodelo de ligação 1:1 4- OOE+05 1. 60E-02 L 3. 90E-08 "- i 6. 70E-06 GA2-lgG1 i _ pH7- 4, 3 µ M Ca |annidade em estado éstacicmáng l pH5. 8, 1. 2 mld Ca I afinidaje em esiado estacionário - L 4- OOE-06 I pH5. 8, 3 µ Áil Ca I ahntda1e em es'ado-esEacionàno - - - - - - - I 5. OÕE-06 ! pH7. 4, 1. 2 MÀ Ca ! modelo de ligação 1:1 4. 30E+05 3. 30E-02 L 7. 90E-08 GA3-lgG1 i _ pH7- 4. 3 Li ld Ca, J aM%ade em estado estacion&o — 3 50E-0Tt 8- 1OÉ-08 4ÀOE®5 I pH5. 8 "1- i À Ca ! "|:1"bl;d"iág" :àã "" I pH5. 8, 3 u Id Ca l ahn|daje em. estaao estac,onário - - - - - - - I 1.1OE-06 I pH7.4, 1.2mM Ca afintdade em estado esíacíonário - L 4- 20E-07 L 8. 90E-07 GA4-1 gGl : _ M7. 4. 3 Ll j|| Ca_ aÍÍnidacle em estado e2í"'?'_2'_ l pH5.8. 1.2mill Ca afinidade em estado estacionárN - L 1- 1OE-06 I " " " " " " " " - - ———- - - - - - - —- - - - - - " " l pH5.8, 3 µMCa afínidaje em estado estauonáno - I 1. 50E-06 Exemplo 21 Avaliação do efeito dos anticorpos de ligação à lgA humana dependente de Ca sobre a retenção do antígeno no plasma usando camundongos normais (21-1) Ensaio in vivo usando camundonqos normais lgA humana (lgA humana: preparada conforme descrito no e- xemplo 20) foi administrada sozinha ou em combinação com um anticorpo anti-lgA humana a camundongos normais (camundongo C57BL/6j; Charles River Japão). Os camundongos forarn testados para a cinética in vivo da lgA humana e do anticorpo anti-lgA humana após a administração. Uma solução de lgA humana (80 µg/ml) ou uma solução mista de lgA humana e anticorpo anti-lgA humana foi administrado quando uma vez a 10 ml/kg à veia caudal. Os anticorpos anti-lgA humana usados foram GAljgGl, GA2-lgG1, GA3- lgG1, e GA2-N434\N descritos acima. A concentração de lgA humana na solução mista foi 80 µg/ml. Entretanto, as concentrações dos anticorpos anti-lgA humana variam depen- dendo da afinidade por hlgA: 100 mg/ml para GAl-lgGl: 28,9 mg/ml para GA2-lgG1: 53,8 mg/ml para GA3-lgG1; e 1 mg/ml para GA2-N434W. Nesse caso, os anticorpos anti-lgA humana estavam presentes em uma quantidade em excesso em comparação à lgA humana, e presume-se que a lgA huma-

U0' na se ligue predominantemente aos anticorpos. O sangue foi coletado 5 mi- nutos, 7 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, e 7 dias após a administração. lmedia- tamente após a coleta, o sangue foi centrifugado a 4°C e 12.000 rpm durante 15 minutos para isolar o plasma. O plasma isolado foi armazenado em um 5 congelador a -20°C ou rnenos antes das medições. (21-2) Determinação da concentração plasmática do anticorpo anti-lçjA hu- mana em camundonqos normais por ELISA As concentrações do anticorpo antijgA humana no plasma de camundongo foram determinadas por ELISA. Primeiro, um fragmento F(ab')2 10 anti-lgG humana (especifico para cadeia y) do anticorpo (SIGMA) foi aliquo- tado em urna placa Nunc-lmmuno Plate, MaxiSorp (Nalge nunc lnternational). A placa foi deixada de um dia para outro a 4°C para preparar uma placa com anticorpo anti-lgG humana imobilizado. Amostras-padrão foram preparadas

Y em concentrações de plasma de 0,5, 0,25, 0,125, 0,0625, 0,03125, 0,01563, 15 e 0,07813 µg/ml no plasma. Amostras de teste do plasma de camundongo foram preparadas por diluir 100 vezes ou mais. As amostras foram aliquota- das na placa com anticorpo anti-lgG humana imobilizado. Após uma hora de incubação a 25°C, as amostras foram reagidas com conjugado de anticorpo de cabra anti-lgG humana (especifico para cadeia y) biotina (BIOT) (Sou- 20 thern Biotechnology Associats lnc-) a 25°C durante uma hora. A seguir, as amostras foram reagidas com estreptavidina-PoliHRP80 (Stereospecific De- tection Technologies) a 25"C durante uma hora- A reação cromogênica foi executada usando substrato para micropoço TMB One Component HRP (Bi- OFX Laboratories) como um substrato. Após a reação ter sido interrompida 25 com ácido sulfúrico 1N (Showa Chemical), a absorbância a 450 nm foi medi- da usando um leitor de microplacas. Usando o programa de análise SOFT- max PRO (Molecular Devices), as concentrações no plasma do camundongo foram calculadas com base na absorbância da curva-padrão. Um curso de tempo das concentrações plasmáticas dos anticorpos GAl-lgGl, GA2-lgG1, 30 GA3-lgG1, e GA2-N434W deterrninado pelo método descrito acima após administração intravenosa a camundongos normais é mostrado na Figura 23. (21-3) Determinação da concentração plasmática de lqA humana por ELISA

As concentrações de lgA humana no plasma de camundongo fo- ram determinadas por ELISA.

Primeiro, o anticorpo de cabra anti-lgA huma- na (BETHYL) foi aliquotado em uma pIaca Nunc-lmmuno, MaxiSorp (Nalge nunc lnternational). A placa foi deixada a 4°C de um dia para o outro para 5 preparar uma placa com anticorpo anti-lgG humana imobilizado.

Amostras- padrão de lgA humana foram preparadas em concentrações de plasma de 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,0125, e 0,00625 µg/ml no plasma.

Amostras de teste do plasma de camundongo foram preparadas por diluir 100 vezes ou mais. 200 µ1 de hslL-6R 500 ng/ml foram adicionados a 100 µ1 das Amostras- lO padrào e de plasrna.

As misturas resultantes foram deixadas em repouso à temperatura ambiente durante uma hora, e, então, aliquotadas na placa com

· anticorpo anti-lgA humana imobilizado e incubadas à temperatura ambiente durante uma hora.

Após a incubação, as misturas foram reagidas com anti- . corpo anti-lL-6R humano biotinilado (R&D) à temperatura ambiente durante 15 uma hora, e, então, com estreptavidina-PoliHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) à temperatura ambiente durante uma hora.

A reação cromo- gênica foi executada usando substrato para micropoço TMB One Compo- nent HRP (B1oFX Laboratories) como um substrato.

Após a reação ter sido interrompida com ácido sulfúrico 1N (Showa Chemical), a absorbância a 450 20 nm foi medida usando um leitor de microplacas.

Usando um programa de análise SOFTmax PRO (Molecular Devices), as concentrações no plasma do camundongo foram calculadas com base na absorbância da curva-padrão.

Um curso de tempo das concentrações plasmáticas de lgA humana determi- nado pelo método descrito acima após administração intravenosa a camun- 25 dongos normais é mostrado na Figura 24. O resultado mostrou que quando a lgA humana foi administrada em combinação com GA1-lgG1, um anticorpo cuja dependência de Ca na ligação à lgA humana é fraca (o grau de dependência é baixo), a eliminação da lgA humana foi retardada em comparação a quando administrada sozinha. 30 Entretanto, a eliminação da lgA humana foi significativamente acelerada quando administrada em combinação com GA2-lgG1, que mostralOO vezes ou mais atividade de ligação à lgA humana dependente de Ca- A concentra-

ção plasmática da IgA humana não ligada foi determinada a partir da con- centração plasmática do anticorpo mostrada na figura 23, da concentração plasmática da lgA humana mostrada na figura 24, e do valor de KD de cada anticorpo mostrado na tabela 23. O resultado é mostrado na figura 25- Con- 5 forme mostrado na figura 25, a concentração de antígeno não ligado (lgA humana) no grupo administrado com GA2-lgG1 ou GA3-lgG1 foi menor em comparação à concentração de antigeno não Iigado (lgA humana) no grupo ao qual GA1-lgG1 foi administrado. lsto demonstra que o antígeno não liga- do (lgA humana) pode ser reduzido por aceleração da eliminaçào do antíge- lO no usando anticorpos de ligação dependente de cálcio.

Além disso, GA2- N434W que mostrou ligação ao FcRn intensificada em pH 7,4 acelerou a eliminação do antígeno mais que GA2-!gG1. O antígeno foi reduzido para um nivel abaixo do limite de detecção 7 horas após a administração. -e

O achado descrito acima demonstra que os anticorpos com liga- 15 ção dependente de cálcio podem acelerar a eliminação do antígeno do plasma em comparação a anticorpos comuns que se ligam a um antígeno de uma forma independente de pH ou de cálcio.

Foi revelado que isto se aplica não apenas ao IL6R humano descrito no Exemplo 5 ou CD4 humano descri- to no Exemplo 19, mas também à lgA humana.

Além disso, em adição ao 20 IL6R humano descrito nos exemplos 6 e 7, foi demonstrado para lgA huma- na que a eliminação do antígeno pode ser ainda acelerada pela intensifica- ção da ligação ao FcRn dos anticorpos com ligação dependente de cálcio em pH 7,4. Conforme mostrado no Exemplo de referência 31, Fv4-lgG1, que 25 se liga ao receptor de IL-6 humana de uma forma dependente de pH, pode acelerar a eliminação do receptor de IL-6 humana em comparação a H54/L28-lgG1 que se liga ao receptor de IL-6 humana de uma forma inde- pendente do pH; entretanto, Fv4jgG1 não pode acelerar a eliminação em comparação à administração do receptor de IL-6 humana sozinho.

Fv4-lgG1- 30 vl ou Fv4-lgG1-v2 com atívidade de ligação ao FcRn intensificada na faixa neutra deveria ser usado para acelerar a eliminação em comparação à ad- ministração do receptor de IL-6 humana sozinho.

Entretanto, surpreendentemente, foi revelado ' que GA2-lgG1, que se liga à lgA humana de uma forma dependente do Ca, acelera a elimi- nação da lgA humana em comparação à administração de IgA humana sozi- nha, embora ela tenha a região constante da lgGl natural, cuja Iigação ao 5 FcRn na intervalo neutra não é intensificada.

O acredita-se que o seguinte mecanismo seja responsável pelo que ocorreu em GA2-lgG1. No caso de antigenos monoméricos como, receptor de IL-6 hu- mana, dois antigenos se ligam a um anticorpo divalente- lsto resulta na for- mação de um complexo antígeno/anticorpo que consiste em três moléculas 10 de antigeno e anticorpo.

Por outro lado, já que a lgA humana é um antigeno dimérico e um anticorpo é divalente, o complexo antigeno/anticorpo entre

· eles provavelmente formará um complexo antígeno/anticorpo (complexo i- mune) que consiste em quatro ou mais moléculas de antígeno e anticorpo. ?

Quando um anticorpo comum do tipo lgGl natural contra um an- 15 tígeno multimérico forma um complexo imune volumoso, o complexo imune pode se Iigar à FcgR, FcRn, receptor do complemento, e similares com avi- dez de uma forma multivaiente através do domínio Fc.

Desta forma, o com- plexo imune é internalizado em células que expressam tais receptores.

En- tretanto, um anticorpo independente de pH/Ca comum contra um antígeno 20 monomérico tem afinidade insuficiente pelo receptor do tipo lgGl natural, e desta forma, o complexo imune resultante é internalizado nas células com baixa eficiência.

O FcRn tem originalmente um papel de reciclagem de anti- corpos internalizados de forma intracelular do endossomo para o pIasma.

Entretanto, é sabido que os complexos imunes volumosos capazes de fazer 25 ligação ao FcRn de uma forma multivalente são transferidos do endossomo pelo FcRn e degradados no lisossomo.

Especificamente, conforme mostrado na figura 26, um anticorpo comum contra um antigeno multimérico, que for- ma um complexo imune volumoso, pode acelerar a eliminação do antigeno; entretanto, o antígeno não se dissocia do anticorpo no endossomo, e o anti- 30 corpo também é eliminado simultaneamente junto com o antígeno.

Portanto, a eficiência de eliminação do antigeno por molécula de anticorpo é baixa.

Em outras palavras, um anticorpo independente de pH/Ca comum contra um antigeno monomérico pode acelerar a eliminação do antígeno; entretanto, presume-se que a eficiência seja baixa.

Por outro lado, quando um anticorpo dependente de pH/Ca que tem uma região constante do tipo lgGl natural contra um antigeno multimé- 5 rico forma um complexo imune volumoso, o complexo imune se liga ao FcgR, FcRn, receptor de complemento, e similares com avidez através da região Fc multivalente, conforme mostrado na figura 27, e é absorvido pelas células que expressam os receptores.

O complexo imune se dissolve por dissocia- ção do antígeno do anticorpo dependente de pH/Ca no endossomo.

O antí- lO geno não pode se ligar ao FcRn e é transferido para o lisossomo para de- gradação.

Entretanto, o anticorpo é reciclado para o plasma pelo FcRn por- que ele não forma um complexo imune.

Especificamente, quando um anticorpo dependente de pH/Ca > que tem uma região constante do tipo lgGl natural contra um antígeno mul- 15 timérico pode se ligar ao FcgR, FcRn, receptor do complemento, e similares com avidez pela formação de um complexo imune volumoso, apenas a eli- minação do antigeno pode ser seletivamente e amplamente acelerada.

A- credita-se que o fenômeno descrito acima também ocorra com GA2-lgG1 contra lgA humana- Espera-se que isto seja útil como um método para acele- 20 rar significativamente a eliminação do antigeno multimérico sem usar o mé- todo de substituição de aminoácido para acentuar a Iigação ao FcRn da lgGl natural na faixa neutra, como mostrado no Exemplo de referência 31. De modo a se obter o efeito descrito acima, um antigeno e um anticorpo formam um complexo imune voiumoso e devem se ligar fortemente 25 ao FcgR/FcRn com avidez, mesmo se o anticorpo for uma lgGl.

Quando o antigeno é um antigeno dimérico ou polimérico de ordem superior, pela sele- ção de anticorpos dependentes de pH/Ca que formam um complexo imune volumoso e se ligam ao receptor descrito acima, a eliminação do antígeno pode ser acelerada de forma eficaz pelo uso da região constante de lgGl 30 natural sem fazer qualquer substituição de aminoácido.

Em geral, considera- se que os antígenos têm que ser multiméricos (por exemplo, imunoglobuli- nas como lgA e lgE, e a superfamília de TNF como TNF e CD154) para os anticorpos e os antígenos formarem complexos imunes vcdumosos.

Mesmo quando um antigeno é monomérico, um complexo imune volunioso pode ser formado pelo uso de uma mistura de dois ou mais tipos de anticorpos de- pendentes do pH/Ca adequados que reconhecem dois ou mais epitopos em 5 um antigeno monomérico.

Alternativamente, um complexo imune volumoso pode ser formado pelo uso de um anticorpo dependente de pH/Ca multies- pecífico adequado que reconhece dois ou mais epítopos em um antígeno monomérico (por exemplo, um anticorpo biespecifico que tem uma região constante de lgG natural com os braços direito e esquerdo reconhecendo os epitopos A e B, respectivamente, como mostrado na figura 28). Especifica- mente, se anticorpos dependentes de pH/Ca adequados contra antígenos monoméricos puderem ser selecionados, a eliminação do antígeno pode ser acelerada de forma eficaz pelo uso de uma mistura de anticorpos que tem uma região constante de lgGl natural ou um anticorpo multiespecífico que tem uma região constante de lgGl natural, sem usar a lgGl mutante que tem uma substituição de aminoácido.

Exemplo 22 Anticorpos que se Iigam à glipicana 3 humana de uma maneira dependente de cálcio (22-1) Preparação da qlipicana 3 humana (GPC3) A glipicana 3 humana recombinante (deste ponto em diante no presente documento abreviada como GPC3) que é usada como um antigeno, foi preparada mediante o seguinte procedimento.

Células CHO nas quais se introduziu constitutivamente um plasmídio que expressa uma sequência na qual seis resíduos de histidina são (igados à sequência de aminoácidos da glipicana 3 humana sem ter o dominio transmembranar (SEQ ID NO: 93) foram cultivadas.

Então, a partir do sobrenadante da cultura coletado, a GPC3 foi purificada por cromatografia de troca iônica, seguido de afinidade com base em marcador de His e cromatografia de filtração em gel. (22-2) Expressão e purificação de anticorpos que se liqam à GPC3 humana Os anticorpos anti-glipicana 3 humana CSCM-Ol _ 005 (sequên- cia da cadeia pesada: 94; sequência da cadeia leve: 95), CSCM-Ol _ 009 (sequência da cadeia pesada: 96; sequência da cadeia leve: 97), CSCM-

01 _015 (sequência da cadeia pesada: 98, sequência da cadeia leve: 99), CSCM-Ol _ 023 (sequência da cadeia pesada: 100; sequência da cadeia le- ve: 101), e GC-lgGl (sequência da cadeia pesada: 102; sequência da ca- deia leve: 103) foram inseridos, cada um, em plasmídeos de expressão em 5 animais.

Os anticorpos foram expressos mediante o seguinte procedimento- Células de FreeStyle 293-F derivada de célula de rim fetal humano (Invitro- gen) foram suspensas no meio de expressão FreeStyle 293 (lnvitrogen) e plaqueadas a uma densidade celular de 1,33 x 106 câulas/ml (3 ml) em cada poço de uma placa de 6 poços.

Os plasmídeos preparados foram introduzi- lO dos nas células por um método de lipofecção.

As células foram cultivadas durante quatro dias em uma incubadora de CÕ2 (37°C, 8°/j CO2, 90 rpm). A partir dos sobrenadantes de cultura preparados, anticorpos foram purificados usando rProtein A Sepharose'" Fast Flow (Amersham Biosciences) por um 0 método conhecido pelos versados na técnica.

As concentrações os anticor- 15 pos purificados foram determinadas mediante a mediçâo da absorbância a 280 nm usando um espectrofotômetro.

As concentrações de anticorpo foram calculadas a partir dos valores determinados usando um coeficiente de ex- tinção calculado pelo método PACE (Protein Science (1995) 4: 2411-2423). Além disso, o anticorpo GC-lgGl foi purificado dos sobrenadantes de cultura 20 de células CHO expressando constitutivamente o anticorpo GC-lgGl e sua concentração foi determinada pelo mesmo método que descrito acima. (22-3) Avaliação dos anticorpos isolados para a atividade de |iÁação à GPC3 humana dependente de Ca Os anticorpos isolados foram submetidos a um ensaio ELISA uti- 25 Iizando-se o seguinte procedimento- Uma placa de microtitulação de 96 po- ços StreptaWel! (Roche) foi revestida de um dia para o outro com 100 µ1 of PBS contendo um antigeno marcado com biotina.

Após o antígeno ter sido removido por lavagem de cada poço da placa usando tampão ACES (ACES 10 mM, NaCl 150 mM, CaC|2 100 mM, 0,05% de Tween20, pH 7,4), os po- 30 ços foram bloqueados por uma hora ou mais com 250 µ1 de um tampão A- CES contendo 2% de BSA.

Após remover o tampão ACES contendo 2% de BSA de cada poço, uma lgG purificada diluida seriadamente a uma razão de diluição de 4 começando com 10 µg/ml foi preparada com antecedência e foi aliquotada a 100 µ1 na placa.

A placa foi deixada repousar durante uma hora para permitir a ligação da lgG ao antígeno em cada poço.

Após lavagem com o tampão ACES, "ACES 10 mM, NaCl 150 mM, CaCl, 1,2 mM, pH 7,4", 5 "ACES 10 mM, NaCl 150 mM, CaC!, 3µM, pH 7,4", "ACES 10 mM, NaCl 150 mM, CaCl, 1,2 rnM, pH 5,8", ou "ACES 10 mM, NaCl150 mM, CaC|2 3 µM , pH 5,8" foi adicionado a cada poço.

A placa foi incubada a 37°C durante 30 minutos.

Após a lavagem com o tampão ACES, um anticorpo anti-lgG huma- na conjugado a HRP (BIOSOURCE) diluido com um tampão ACES contendo 2°/q de BSA foi adicionado a cada poço.

A placa foi incubada durante uma hora.

Após lavagem com tampão ACES, a solução única de TMB (ZYMED) foi adicionada a cada poço.

A reação cromogênica na solução de cada poço foi interrompida peia adição de ácido sulfúrico.

A seguir, a cor desenvolvida foi avaliada mediante a medição da absorbância a 450 nm.

O resultado da medição é mostrado na Figura 29. No caso de GC-lgGl, a absorbância de GC-lgGl não mudou de acordo com a concen- tração de íon de cálcio.

Em contrapartida, com relação a CSCM-OI _ 005, CSCM-Ol _009, CSCM-Ol _ 015, e CSCM-O1._023, a absorbância foi conside- ravelmente menor a uma concentração de íon de cálcio de 3 µM (baixa con- centração de Íon de cálcio) do que a 1,2 mM (alta concentração de íon de cálcio)- O resultado descrito acirna demonstra que CSCM-Ol _ 005, CSCM- Ol _009, CSCM-Ol _015, e CSCM-Ol _023 têm a propriedade de que sua li- gação ao antigeno varia de acordo com a concentração do ion de cálcio. lsto demonstra que anticorpos dependentes de cálcio contra a glipicana 3 huma- na também podem ser obtidos.

Em comparação aos anticorpos anti- glipicana 3 humana típicos, considera-se que os anticorpos anti-glipicana 3 humana dependentes de cáicio podem acelerar a eliminação de glipicana 3 humana, de maneira similar ao caso com IL-6R humano, CD4 humana, ou lgA humana descrito nos exemplos acima.

Além disso, considera-se que a eliminação de glipicana 3 humana pode ser ainda acelerada peia intensifica- ção da ligação de FcRn aos anticorpos anti-glipicana 3 humana dependentes de cálcio em pH 7,4.

Exemplo 23 Anticorpos que se ligam à lgE de uma maneira de- pendente de cálcio (23-1) Preparação de lçjE humana biotinilada IgE humana foi preparada como um antígeno mediante o seguin- 5 te procedimento.

Um vetor de expressão de célula animal inserido com uma sequência de DNA que codifica lgE-H (SEQ ID NO: 104, uma sequência pa- ra biotinilaçâo é Iigada na terminação C) e L(\NT) (SEQ ID NO: 14) foi prepa- rado.

Usando o vetor de expressão e FreeStyle293 (lnvitrogen), a proteína lgE humana de extensão completa, à qual uma sequência para b.iotinilação é 10 ligada à terminação C, foi expressa no sobrenadante da cultura.

A partir do sobrenadante da cultura isolado, uma lgE humana biotinilada foi preparada

- por fazer cromatografia de troca iônica, purificação por afinidade de avidina e purificação por cromatografia de filtração em gel. (23-2) Expressão e purificação de anticorpos que se Iigam à lqE humana 15 GE80100 (cadeia pesada, SEQ ID NO: 105; cadeia leve, SEQ ID NO: 106), GEB0220 (cadeia pesada, SEQ ID NO: 107; cadeia leve, SEQ ID NO: 108), GEB0230 (cadeia pesada, SEQ ID NO: 109; cadeia leve, SEQ ID NO: 110), e Xolair (cadeia pesada, SEQ ID NO: 111: cadeia leve, SEQ ID NO: 112) eram anticorpos que se ligam à lgE humana.

GE80100 (cadeia 20 pesada, SEQ ID NO: 105; cadeia leve, SEQ ID NO: 106), GEB0220 (cadeia pesada, SEQ ID NO: 107; cadeia leve, SEQ ID NO: 108), GEB0230 (cadeia pesada, SEQ ID NO: 109: cadeia Ieve, SEQ ID NO: 110), e Xolair (nome ge- nérico: Omalizumabe) (cadeia pesada, SEQ ID NO: 111; cadeia leve, SEQ ID NO: 112) foram inseridos cada em plasmideos de expressão animais por 25 um método conhecido pelos versados na técnica.

Os anticorpos foram ex- pressos mediante o seguinte procedimento.

Os plasmídeos construidos fo- ram introduzidos nas células de FreeStyle 293-F derivada de célula de rim fetal humano (lnvitrogen) por um método de lipofecção.

As células foram cul- tivadas durante quatro a sete dias em uma incubadora de CO2 (37°C, 8°/0 30 CO2, 90 rpm). A partir dos sobrenadantes de cultura preparados, anticorpos foram purificados usando rProtein A SepharoseTM Fast Flow (Amersham Bi-

osciences) por um método conhecido pelos versados na técnica.

As concentrações de anticorpo foram calculadas a partir dos valores deter- minados usando um coeficiente de extinção calculado pelo método PACE 5 (Protein Science (1995) 4: 2411-2423). (23-3) Avaliação dos anticorpos isolados para a atividade de liqação à lgE humana dependente de Ca Os anticorpos isolados foram avaliados para sua atividade de li- gação dependente de Ca à lgE humana por ELISA.

Especificamente, 40 µ1 10 de anticorpo policlonal Fc cabra anti-lgG de coelho a 1 µg/ml (Bethyl labora- tory; A120-111A) ou anticorpo poIiclonal Fc de cabra anti-lgG humana a 1 µg/ml (ICN biomedicals; 55071) foram adicionados à placa de 384 poços " NUNC lmmuno 384-we!l Plate MaxiSorp (Thermo fisher scientific; 464718). Após uma hora de incubação à temperatura ambiente, a solução foi removi- 15 da e 50 µ1 de reagente de bloqueio um (Blocking One Reagent) (Nacalai Tesque; 03953-95) diluida para 20% foram adicionados.

Após uma hora de incubação à temperatura ambiente, a soIução foi removida e 40 µ1 de anti- corpos purificados diluidos com tampão Tris contendo 1,2 mM de cloreto de cálcio foram adicionados.

Após incubação de um dia para outro a 4°C, a pla- 20 ca foi Iavada três vezes com 80 µ1 de tampão Tris contendo 1,2 mM de cIore- to de cálcio e 0,05%(p/v) de Tween-20, e 40 µ1 da lgE humana biotinilada (preparada conforme descrito em (23-1)) diluída para 500 ng/ml com um tampâo Tris contendo 1,2 mM de cIoreto de cálcio foram adicionados- Após uma hora de incubaçâo à temperatura ambiente, a placa foi lavada três ve- 25 zes com 80 µ1 de um tampão Tris contendo 1,2 mM de cloreto de cálcio e 0,05%(p/v) de Tween-20- 80 µ1 de um tampão ACES (pH 7,4) contendo 2 mM ou 3 µM de cloreto de cálcio forarn adicionados e, então, imediatamente removidos.

Novamente, 80 µ1 de um tampão ACES (pH 7,4) contendo 2 mM ou 3 µM de cloreto de cálcio foram adicionados à placa.

Após uma hora de 30 incubação a 37°C, a placa foi lavada três vezes com 80 µ1 de um tampão Tris contendo 1,2 mM de cloreto de cálcio e 0,05%(p/v) de Tween-20, e 40 µ1 de estreptavidina marcada com HRP (Thermo fisher scientific; 21132) diluída para 25 ng/ml com um tampão Tris contendo 1,2 mM de cloreto de cálcio foram adicionados.

Após uma hora de incubação à temperatura ambiente, a placa foi lavada três vezes com 80 µ1 de um tampão Tris contendo 1,2 mM de cloreto de cálcio e 0,05%(p/v) de Tween-20. A seguir, 40 µ1 de um subs- 5 trato cromogênico (KPL; 50-66-06: componente 1 do sistema de substrato de peroxidase ABTS) são adicionados.

Após 15 a 30 minutos de incubação à temperatura ambiente, a absorbância a 405 nm foi medida (Molecular devi- ces; SpectraMax Plus384). O resultado da medição é mostrado na Figura 30. No caso de 10 Xolair, a absorbância não mudou de acordo com a concentração de íon de cálcio.

Em contrapartida, com relação a GE80100, GEB0220, e GEB0230, a

· absorbância foi consideravelmente menor a uma concentração de ion de " cálcio de 3 µM (baixa concentração de íon de cálcio) do que a 1,2 mM (alta concentração de Íon de cáício). O resuítado descrito acima demonstra que 15 GE80100, GEB0220, e GEB0230 têm a propriedade de que sua ligação ao antigeno varia de acordo com a concentração do ion de cálcio. lsto indica que anticorpos dependentes de cálcio contra a ÍgE humana também podem ser obtidos.

Cm comparação aos anticorpos anti-lgE humana típicos, como Xolair, considera-se que os anticorpos anti-lgE humana dependentes de cál- 20 cio podem acelerar a eliminação de lgE humana, de maneira similar ao caso com IL-6R humano, CD4 humana, ou IgA humana descrito nos exemplos acima.

Além disso, considera-se que a eliminação de lgE humana pode ser ainda acelerada pela intensificação da ligação de FcRn aos anticorpos anti- lgE humana dependentes de cálcio em pH 7,4. 25 Exemplo de referência 1 Preparação do receptor de IL-6 humana solúvel (hslL-6R) O receptor de IL-6 humana recombinante como um antígeno foi preparado da seguinte forma.

Uma linhagem celular CHO que expressa constitutivamente o receptor de IL-6 humana solúvel (mais adiante neste 30 documento chamado de hslL-6R) e que tem a sequência de aminoácidos das posições 1 a 357 a partir da terminação N, como relatado em J. lmmunol. 152: 4958-4968 (1994) foi estabelecida por um método conhecido pelos ver-

sados na técnica.

As células foram cultivadas para expressar hslL-6R.

O hslL-6R foi purificado a partir do sobrenadante da cultura por duas etapas: cromatografia em coIuna Blue Sepharose 6 FF e cromatografia em coluna por filtração em gel.

Uma fração que eluiu como o pico principal no estágio 5 final foi preparada como o produto de purificação final.

Exemplo de referência 2 Preparação do FcRn humano O FcRn é um complexo de FcRn e l32-microg|obu|ina. lniciado- res oligo-DNA foram preparados com base na sequência de genes publicada do FcRn humano (J Exp Med. 1994 Dez 1; 180(6): 2377-81)- Um fragmento 10 de DNA que codifica o gene cornpleto foi preparado por PCR usando o cD- NA humano (Human Placenta Marathon-Ready CDNA, Clontech) como um e molde e os iniciadores preparados.

Usando o fragmento de DNA obtido co- mo um molde, um fragmento de DNA que codifica o dornínio extracelular contendo a região de sinal (Met1-Leu290) foi amplificado por PCR, e inserido 15 em um vetor de expressão celular de mamífero.

De modo semelhante, inici- adores oligo-DNA foram preparados com base na sequência do gene de j32- microglobulina humana publicada (Proc.

Natl.

Acad.

Sci- U.S.A. 99 (26): 16899-16903 (2002))- Um fragmento de DNA que codifica o gene completo foi preparado por PCR usando o cDNA humano (Human PIacenta Marathon- 20 Ready cDNA, Clontech) como um molde e os iniciadores preparados.

Usan- do o fragmento de DNA obtido como um molde, um fragmento de DNA que codifica a proteína completa contendo uma região de sinal (Met1-Met119) foi amplificado por PCR e inserido em um vetor de expressão celular de mamí- fero. 25 O FcRn humano solúvel foi expresso mediante o seguinte pro- cedimento.

Os plasmideos construídos para expressar o FcRn humano (SEQ ID NO: 17) e Í32-microgjobu|ina (SEQ ID NO: 18) foram introduzidos nas células da linhagem celular derivada de câncer renal embrionário huma- no HEK293H (lnvitrogen) pelo método de Iipofecção usando PE! (Po!yscien- 30 ce). O sobrenadante da cultura resultante foi coletado, e o FcRn foi purifica- do usando lgG Sepharose 6 Fast Flow (Amersham Biosciences), seguido de purificação adicional usando HiTrap Q HP (GE Healthcare) (J lmmunol. 2002

Nov 1: 169(9): 5171-80). Exemplo de referência 3 Estudos para melhorar o efeito de ace- leração da eliminação de antígenos dos anticorpos ligação ao antígeno de- pendente de pH (teste in vivo) 5 (3-1) Preparação de anticorpos de (iqação ao receptor de IL-6 humana de- pendente de pH que se li,qam ao FcRn sob condição neutra Mutações foram introduzidas em Fv4-lgG1 compreendendo VH3-lgG1 (SEQ ID NO: 19) e VL3-CK (SEQ ID NO: 20) para aumentar a ligação ao FcRn sob uma condição neutra (pH 7,4). Especificamente, VH3- 10 lgG1-v1 (SEQ ID NO: 21) foi preparado a partir da região constante da ca- deia pesada de lgGl mediante a substituição Tyr por Met na posição 252,

· Thr por Ser na posição 254, e Glu por Thr na posição 256 na numeração EU, " enquanto VH3-lgG1-v2 (SEQ ID NO: 22) foi construído a partir da região ?

constante da cadeia pesada de [gGl mediante a substituição de Trp por Asn 15 na posição 434 na numeração EU.

Os mutantes foram construídos por subs- tituição de aminoácido usando o kit de mutagênese sitio-dirigida QuikChan- ge (Stratagene) ou o kit de clonagem ln-Fusion HD (Clontech) de acordo com o método descrito no manual fornecido.

Os fragmentos de plasmídio preparados foram inseridos em vetores de expressão de célula animal para 20 construir vetores de expressão para a cadeia H e cadeia L de interesse.

As sequências de nucleotídeos dos vetores de expressão construídos foram determinadas por um método conhecido pelos versados na técnica- H54/L28-lgG1 que compreende H54 (SEQ ID NO: 5) e L28 (SEQ ID NO: 6), Fv4-lgG1 que compreende VH3-lgG1 (SEQ ID NO: 19) e VL3-CK 25 (SEQ ID NO: 20), Fv4-lgG1-v1 que compreende VH3-lgG1-v1 (SEQ ID NO: 21) e VL3-CK (SEQ ID NO: 20), e Fv4-lgG1-v2 que compreende VH3JgG1- V2 (SEQ ID NO: 22) e VL3-CK (SEQ ID NO: 20) foram expressos e purifica- dos pelo rnétodo descrito a seguir.

Os anticorpos foram expressos por Fre- estyleHEK293 (lnvitrogen), conforme descrito pelo protocolo fornecido pelo 30 fabricante, ou linhagem celular HEK293H (lnvitrogen). A linhagem celular HEK293H derivada de câncer de rim embrionário humano (lnvitrogen) foi suspensa em DMEM (lnvitrogen) suplementado com 10°/o de soro fetal bovi-

no (Invitrogen). As células foram plaqueadas a 10 ml por placa em pIacas para células aderentes (10 cm de diâmetro; CORNING) a uma clensidade celular de 5 a 6 x 105 células/ml e cultivadas em uma incubadora de CO2 (37°C, 5°/0 de CO2) por um dia e noite inteiros- A seguir, o meio foi removido 5 por aspiração, e 6,9 ml de meio CHO-S-SFM-II (lnvitrogen) foram adiciona- dos, O plasmídio preparado foi introduzido nas células pelo método de lipo- fecção.

Os sobrenadantes de cultura resultantes foram coletados, centrifu- gados (aproximadamente 2.000 x g, 5 min, temperatura ambiente) para re- mover as células, e esterilizados por filtração através de um filtro de 0,22 µm 10 MILLEX (marca registrada)-GV (Millipore) para obter os sobrenadantes.

Os anticorpos foram purificados a partir dos sobrenadantes de cultura obtidos

· por um método conhecido pelos versados na técnica usando rProtein A Se- pharoseT" Fast Flow (Amersham Biosciences). Para determinar a concen- . tração do anticorpo purificado, a absorbância foi medida a 280 nm usando 15 um espectrofotômetro.

As concentrações do anticorpo foram calculadas a partir dos valores determinados usando um coeficiente de absorbância cal- culado pelo método descrito em Protein Science (1995) 4: 2411-2423. (3-2) Teste ln vivo utilizando camundonqos transgênicos para FcRn humano e camundonçjos normais 20 A cinética in vivo de hslL-6R {receptor solúvel de IL-6 humana: preparado como descrito no Exemplo de Referência 1) e do anticorpo antir- receptor de IL 6 humana foi avaliada após a administração de hs(L-6R sozi nho ou hslL-6R e anticorpo antirreceptor de IL-6 humana em combinação aos camundongos transgènicos para FcRn humano (B6.mFcRn-/--.hFcRn Tg 25 linhagem 276 +/+ camundongo, Jackson Laboratories; Methods MOI Biol. (2010) 602: 93-104) e camundongos normais (camundongo C57BL/6j; Char- les River Japão). Uma solução de hslL-6R (5 µg/mL) ou uma solução de mistura contendo hslL-6R e anticorpo antirreceptor de IL-6 humana (5 µg/mL e 0,1 mg/mL, respectivamente) foi administrada uma vez em uma do- 30 se de 10 ml/kg dentro da veia caudal.

Neste caso, o anticorpo antirreceptor de IL-6 humana está presente em excesso em relação ao hslL-6R e, portan- to, é assumido que quase todo o hslL-6R está ligado ao anticorpo.

O sangue foi coletado 15 minutos, sete horas, um dia, dois dias, três dias, quatro dias, sete dias, 14 dias, 21 dias e 28 dias após a administração.

O sangue coleta- do foi imediatamente centrifugado a 15.000 rpm e 4 °C durante 15 minutos para separar o plasma.

O plasma separado foi armazenado em um refrige- 5 rador a ou abaixo de -20 °C antes do ensaio.

Os anticorpos antirreceptor de IL-6 humana utilizados são: H54/L28-lgG1, Fv4-lgG1 e Fv4-lgG1-v2 descri- tos anteriormente para camundongos transgênicos para FcRn humano e H54/L28-lgG1, Fv4-lgG1, Fv4-lgG1-v1 e Fv4-lgG1-v2 descritos anteriormen- te para camundongos normais. 10 (3-3) Medição da concentração de anticorpo antirreceptor de ÍL-6 humana

. no plasma por ELISA A concentração de anticorpo antirreceptor de IL-6 humana no plasma de camundongo foi medida por ELISA.

O fragmento F(ab')2 de anti- corpo anti-lgG humana (especifico para a cadeia y) (Sigma) foi fornecido a 15 uma Nunc-lmunoPlate MaxiSorp (Nalge Nunc lnternational) e foi permitido que ficasse em repouso durante a noite a 4 °C para preparar placas com anti-lgG humana imobilizado.

As amostras da curva de calibração que pos- suem concentrações no plasma de 0,8, 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025 e 0,0125 µg/mL e as amostras de plasma de camundongo diluídas 100 vezes ou mais 20 foram preparadas. 200 µL de 20 ng/mL de hslL-6R foram adicionados em 100 µL das amostras da curva de calibração e das amostras do plasma e então foi permitido que as amostras ficassem em repouso durante uma hora à temperatura ambiente.

Subsequentemente, as amostras foram distribuídas dentro das placas com anti-lgG humana imobilizado e foi permitido que fi- 25 cassem em repouso durante uma hora à temperatura ambiente.

Então, o anticorpo Anti-lL-6 Humana Biotinilado (R&D) foi adicionado para reagir du- rante uma hora à temperatura ambiente.

Subsequentemente, estreptavidina- PoI1HRP80 (Stereospecific Detection Technologies) foi adicionado para rea- gir durante uma hora à temperatura ambiente e a reaçáo cromogênica foi 30 realizada utilizando TMP One Component HRP Microwell Substrate (B1oFX Laboratories) como um substrato.

Após interromper a reação com ácido sul- fúrico a 1N (Showa Chemical), a absorbância em 450 nm foi medida por uma leitora de microplacas.

A concentração no plasma de camundongo foi calcu- lada partindo da absorbáncia da curva de calibração utilizando o software analítico SOFTmax PRO (Molecular Devices). O curso de tempo da concen- tração no plasma após a administração intravenosa que é medido através 5 deste método é mostrado na Fig. 31 para camundongos transgênicos para FcRn humano e na Fig. 33 para camundongos normais. (3-4) Medição da concentração de hslL-6R no plasma através do ensaio de eletroquimiduminescência A concentração de hslL-6R no pIasma de camundongo foi medi- lO da através de eletroquimioluminescência.

As amostras da curva de calibra-

. ção de hslL-6R ajustadas em concentrações de 2-000, 1.000, 500, 250, 125, 62,5 e 31,25 pg/mL e as amostras de plasma de camundongo diluídas 50 vezes ou mais foram preparadas.

As amostras foram misturadas com uma solução de Anticorpo Monoclonal Anti-lL-6 Humana (R&D) marcado com 15 rutênio com Sulfo-Tag NHS Ester (Meso Scale Discovery), Anticorpo Anti-lL- 6 Humana Biotinilado (R&D), e WT·-lgG1 e foi permitido que reagissem du- rante a noite a 37°C.

A concentração final de WT-lgGl como um anticorpo antirreceptor de IL-6 humana, que compreende H (WT) (SEQ ID NO: 13) e L (WT) (SEQ ID NO: 14), era de 333 µg/mL, que está em excesso da concen- 20 tração de anticorpo antirreceptor de IL-6 humana contido nas amostras, pa- ra a finalidade de ligação quase todas as moléculas de hslL-6R nas amos- tras para WT-lgGl.

Subsequentemente, as amostras foram distribuídas den- tro de uma MA400 PR Streptavidin Plate (Meso Scale Discovery) e foi permi- tido que reagissem durante uma hora à temperatura ambiente e a lavagem 25 foi realizada. lmediatamente após o Tampão de leitura (Read Buffer) T (x4) (Meso Scale Discovery) ser fornecido, a medição foi realizada por Sector PR 400 Reader (Meso Scale Discovery). A concentração de hslL-6R foi calcula- da com base na resposta da curva de calibração utilizando o software anali- tico SOFTmax PRO (Molecular Devices). O curso de tempo de concentração 30 de hslL-6R no plasma após a administração intravenosa que é medido atra- vés deste método é mostrado na Fig. 32 para camundongos transgênicos para FcRn humano e na Fig. 34 para camundongos normais.

(3-5) Determinaçâo da concentração de hslL-6R livre no plasma através do ensaio de eletroquimioluminescência Para avaliar o grau de neutralização de receptor solúvel de IL-6 humana no plasma, a concentração de receptor solúve! de IL-6 humana livre 5 de (não neutralizado por) anticorpo antirreceptor de IL-6 humana (concen- tração de hslL-6R livre) no plasma de camundongo foi determinada através do ensaio de eletroquimioluminescência. Todos os anticorpos do tipo lgG (lgG de camundongo, anticorpo antirreceptor de IL-6 humana e complexo de anticorpo antirreceptor de IL-6 humana-receptor solúvel de IL-6 humana) 10 no plasma foram adsorvidos na proteína A através da adição de 12 µL cada , de amostras padronizadas de hslL-6R preparadas a 10.000, 5.000, 2.500,

1.250, 625, 312,5 ou 156,25 pg/mL e amostras de plasma de camundongo sobre uma quantidade apropriada de resina rProtein A Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) seca sobre copo de filtro de 0,22 µm (Millipore). Então, a 15 solução em um copo foi centrifugada utilizando uma centrifuga de alta velo- cidade para coletar a solução que passava através. A solução que passava através não contém complexo de anticorpo antirreceptor de IL-6 humana- receptor solúvel de IL-6 humana ligado à Proteína A. Assim, a concentração de hslL-6R livre no plasma pode ser determinada através da medida da con- 20 centração de hslL-6R na soIução que passou. Então, a solução que passou foi misturada com um anticorpo monoclonal anti-lL-6 humana (R&D) marca- do com rutênio com SULFO-TAG NHS Ester (Meso Scaie Discovery) e um anticorpo anti IL 6R humana biotinilado (R&D)- A mistura resultante foi incu- bada à temperatura ambiente durante uma hora e então aliquotada em MA400 PR Streptavidin Plate (Meso Scale Discovery)- Após outra hora de incubação à temperatura ambiente, a placa foi Iavada e o Read Buffer T (X4) (Meso Scale Discovery) foi aliquotado dentro da mesma. lmediatamente, a placa foi medida no leitor SECTOR PR 400 (Meso Scale Discovery). A con- centração de hslL-6R foi calculada com base na resposta na curva-padrão 30 utilizando o software de análise SOFTmax PRO (Molecular Devices). Um curso de tempo de concentração de hslL-6R Iivre no pIasma de camundon- gos normais após a administração intravenosa determinado através do mé-

todo descrito anteriormente é mostrado na Fig. 35. (3-6) Efeito da liqação dependente de pH ao receptor de 1L-6 humana H54/L28-lgG1 e Fv4-lgG1 que se ligam ao receptor de IL-6 hu- mana de uma maneira dependente do pH foram testados in vivo, e os resul- 5 tados foram comparados entre os mesmos.

Como mostrado nas Figuras 31 e 33, a retenção de anticorpo no plasma era comparável.

Enquanto isso, como mostrado nas Figuras 32 e 34, foi observado que o hslL-6R simultane- amente administrado com Fv4-lgG1 que se liga ao receptor de IL-6 humana de uma maneira dependente do pH acelerava a eliminação de hslL-6R 10 quando comparado com hslL-6R simultaneamente administrado com

. H54/L28-lgG1. A tendência acima foi observada tanto em camundongos transgênicos para FcRn humano quanto normais; assim, isto demonstrou que conferindo uma capacidade de ligação ao receptor de IL-6 humana de- pendente de pH, a concentração de hslL-6R no plasma quatro dias após a 15 administração poderia ser diminulda em aproximadamente 17 e 34 vezes, respectivamente. (3-7) Efeito da liqação ao FcRn sob condição neutra (pH 7,4) Foi relatado que a (gGl humana natural se (iga dificilmente ao (possui afinidade extremamente baixa por) FcRn humano sob uma condição 20 neutra (pH 7,4). Foi relatado que a ligação ao FcRn humano sob uma condi- ção neutra (pH 7,4) era aumentada através da substituição de Trp por Asn na posição 434 (numeração EU) na lgGl humana natural (J lmmunol. (2009) 182 (12): 7663-71)- FV4 lgG1-v2 que resulta da introdução da substituição de aminoácidos em Fv4-lgG1 anterior foi testado através de um teste in vivo utilizando camundongos transgênicos para FcRn humano.

O resultado do teste foi comparado com aquele de Fv4-lgG1. Como mostrado na Fig. 31, a retenção do anticorpo no plasma era comparável entre os dois.

Enquanto isso, como mostrado na Fig. 32, foi observado que o hslL-6R simultanea- mente administrado com Fv4-lgG1-v2 que exibe maior ligação ao FcRn hu- 30 mano sob uma condiçáo neutra (pH 7,4) era eliminado mais rápido quando comparado com o hslL-6R simultaneamente administrado com Fv4-lgG1. Assim, foi demonstrado que conferindo a capacidade de se ligar ao FcRn humano sob uma condição neutra (pH 7,4), a concentração no plasma de hslL-6R quatro dias após a administração poderia ser reduzida em aproxi- madamente quatro vezes.

Com base na homologia entre o FcRn humano e o FcRn de ca- 5 mundongo, é assumida a substituição de Trp por Asn na posição 434 na numeração EU para aumentar a ligação ao FcRn de camundongo sob uma condição neutra (pH 7,4). Enquanto isso, foi relatado que a ligação ao FcRn de camundongo sob uma condição neutra (pH 7,4) era aumentada através da substituição de Tyr por Met na posição 252, Thr por Ser na posição 254 e 10 Glu por Thr na posição 256 na numeração EU (J lmmunol. (2002) 169(9):

. 5171-80). Fv4-lgG1-v1 e Fv4-lgG1-v2 que resultam da introdução das subs- tituições de aminoácidos descritas anteriormente no Fv4-lgG1 foram testa- dos in vivo utilizando camundongos normais.

Os resultados do teste foram comparados com aquele de Fv4-lgG1. Como mostrado na Fig. 33, os tem- 15 pos de retenção no plasma de Fv4-lgG1-v1 e Fv4-lgG1-v2 que também fo- ram aprimorados para aumentar a ligação ao FcRn de camundongo sob uma condição neutra (pH 7,4) foram ligeiramente reduzidos (as concentrações de anticorpo neutralizante no plasma um dia após a administração foram redu- zidas em aproximadamente 1,5 e 1,9 vezes, respectivamente) quando com- 20 parados com o de Fv4-lgG1. Como mostrado na Fig. 34, foi demonstrado que o hslL-6R si- multaneamente administrado com Fv4-lgG1-v1 ou Fv4-lgG1-v2 que foi apri- morado para aumentar a ligação ao FcRn de camundongo sob uma condi- ção neutra (pH 7,4) era notavelmente eliminado mais rápido quando compa- 25 rado com o hslL-6R simultaneamente administrado com Fv4-lgG1. Fv4- lgG1-v1 e Fv4-lgG1-v2 reduziam as concentrações de hslL-6R no plasma um dia após a administração em aproximadamente 32 e 80 vezes, respecti- vamente.

Assim, foi revelado que a concentração no plasma poderia ser re- duzida conferindo a capacidade de ligação ao FcRn de camundongo sob 30 uma condição neutra (pH 7,4). Como descrito anteriormente, conferindo a capacidade de ligação ao FcRn de camundongo sob uma condição neutra (pH 7,4), a concentração de anticorpo no plasma foi ligeiramente reduzida;

entretanto, o efeito de redução da concentração de hsIL-6R no plasma, que excedia enormemente a diminuição na concentração de anticorpo, foi produ- zido.

Além disso, foi observado que o hsIL-6R simultaneamente administra- do com Fv4-lgG1-v1 ou Fv4-lgG1-v2 era eliminado mais rápido ainda quan- 5 do comparado com o grupo que recebeu administração de hslL-6R sozir)ho.

Como mostrado na Fig. 34, foi demonstrado que o hslL-6R simultaneamente administrado com Fv4-lgG1-v1 ou Fv4-lgG1-v2 poderia reduzir a concentra- ção de hslL-6R no plasma um dia após a administração em aproximadamen- te 4 ou 11 vezes, respectivamente, quando comparado com o hslL-6R sozi- lO nho.

Especificamente, isto significa que a eliminação de receptor de IL-6 so-

. lúvel poderia ser acelerada através da administração do anticorpo que se liga a receptor de IL-6 solúvel de uma maneira dependente do pH e que é conferida com capacidade de ligação ao FcRn de camundongo sob uma condição neutra (pH 7,4). Especificamente, a concentração de antígenos no 15 plasma pode ser reduzida in vivo através da administração de tal anticorpo ao corpo.

Como mostrado na Fig. 35, o hslL-6R livre estava em uma faixa de concentração detectável durante sete dias após a administração de H54/L28-lgG1, enquanto o hsIL-6R livre era indetectável depois de um dia 20 após a administração de Fv4-lgG1. Por outro lado, o hslL-6R livre não era detectável após sete horas após a administração de Fv4-lgG1-v1 ou Fv4- lgG1-v2. Especificamente, a concentração de hslL-6R livre era menor na presença de Fv4-lgG1 que se liga ao hslL-6R de uma maneira dependente do pH quando comparado com H54/L28-lgG1, sugerindo que um forte efeito 25 de neutralização de hslL-6R foi produzido conferindo a capacidade de liga- ção ao hslL-6R dependente de pH.

Aiém disso, a concentração de hslL-6R livre era muito menor na presença de Fv4-lgG1-v1 ou Fv4-lgG1-v2, dos quais ambos foram modificados partindo de Fv4-lgG1 para aumentar a ca- pacidade de ligação ao FcRn em pH 7,4. lsto demonstra que um efeito de 30 neutralização de hslL-6R mais forte pode ser produzido através do aumento da capacidade de ligação ao FcRn em pH 7,4. Quando administrado, um anticorpo neutralizante comum tal como H54/L28-lgG1 reduz a eliminação de um antígeno de ligação, resul- tando na retenção de antígeno prolongada no píasma- Não é preferido que anticorpos administrados prolonguem a retenção no plasma de um antígeno cuja ação é pretendida que seja neutralizada pelos anticorpos.

A retenção de 5 antigeno no pIasma pode ser diminuída conferindo a dependência do pH à ligação ao antigeno (o anticorpo se liga sob condições neutras, mas é disso- ' ciado sob condições ácidas). Na presente invenção, o tempo de retenção de antígeno no plasma poderia ser adicionalmente diminuido conferindo adicio- nalmente capacidade de ligação ao FcRn humano sob uma condição neutra 10 (pH 7,4). Além disso, foi demonstrado que quando comparada com a elimi-

. nação de antigeno sozinho, a eliminação de antigeno poderia ser aumenta- da através da administração de um anticorpo que se liga a um antígeno de uma maneira dependente do pH e que é conferida com a capacidade de Ii- gação ao FcRn sob uma condição neutra (pH 7,4). Até agora não há um mé- 15 todo disponível para aumentar a eliminação de antigeno através da adminis- tração de anticorpo em relação à eliminação de antígeno sozinho.

Assim, os métodos estabelecidos que são descritos neste EXEMPLO sâo muito úteis como um método para eliminação de antígenos do plasma através da admi- nistração de anticorpos.

Além disso, os presentes inventores descobriram 20 pela primeira vez a vantagem de aumentar a capacidade de iigação ao FcRn sob uma condição neutra (pH 7,4). Além disso, tanto v4-lgG1-v1 quanto FV4- lgG1-v2 que possuem substituições de aminoácidos diferentes que aumen- tam a capacidade de ligação ao FcRn sob uma condição neutra (pH 7,4) produziam efeitos comparáveis. lsto sugere que independentemente do tipo 25 de substituição de aminoácidos, cada substituição de aminoácidos que au- menta a capacidade de ligação ao FcRn humano sob uma condição neutra (pH 7,4) possui poten"cialmente um efeito de aceleração da eliminação dos antigenos.

Especificamente, as moléculas de anticorpo que eliminam anti- genos do plasma quando administradas podem ser produzidas utilizando as 30 substituições de aminoácidos a seguir sozinhas ou em combinação: uma substituição de aminoácidos de ile por Pro na posição 257 e uma substituição de aminoácidos de lle por GIn na posição 311 na nume-

ração EU, das quais ambas foram relatadas no J Biol Chem. 2007, 282(3): 1709-17; uma substituição de aminoácidos de Ala, Tyr ou Trp por Asn na posição 434, uma substituição de aminoácidos de Tyr por Met na posição 252, uma substituição de aminoácidos de Gln por Thr na posição 307, uma 5 substituição de aminoácidos de Pro por Val na posição 308, uma substitui- ção de aminoácidos de Gln por Thr na posição 250, uma substituição de a- minoácidos de Leu por Met na posição 428, uma substituição de aminoáci- dos de Ala por Glu na posição 380, uma substituição de aminoácidos de Val por Ala na posição 378, uma substituição de aminoácidos de Ile por Tyr na posição 436 na numeração EU, das quais todas foram relatadas no J Immu- nol. (2009) 182(12): 7663-71; uma substituição de aminoácidos de Tyr por Met na posição 252, uma substituição de aminoácidos de Thr por Ser na po- sição 254, uma substituição de aminoácidos de Glu por Thr na posição 256 na numeração EU, das quais todas foram relatadas no J Biol Chem. 2006 Ago. 18, 281(33): 23514-24; uma substituição de aminoácidos de Lys por His na posição 433, uma substituição de aminoácidos de Phe por Asn na posi- ção 434 e uma substituição de aminoácidos de His por Tyr na posição 436 na numeração EU, das quais todas foram relatadas no Nat Biotechnol. 2005 Out. 23(10): 1283-8; e similares.

Exemplo de referência 4 Avaliação da atividade de ligação ao FcRn humano Para o sistema de ensaio baseado em Biacore para testar a inte- ração entre anticorpo e FcRn, um sistema que imobiliza anticorpo sobre um chip sensor e utiliza FcRn humano como um analito é relatado no J Immunol. (2009) 182(12): 7663-71. Para esta finalidade, o FcRn humano foi preparado como descrito no Exemplo de Referência 2. Fv4-IgG1, Fv4-IgG1-v1 e Fv4- IgG1-v2 foram avaliados em relação à atividade de ligação ao FcRn humano (constante de dissociação (KD)) em pH 6,0 e pH 7,4 através da utilização do sistema descrito anteriormente.

Os anticorpos foram testados como uma substância de teste após a imobilização direta sobre o Series S Sensor Chip CM5. Utilizando um kit de acoplamento de amino de acordo com o manual do fornecedor, os anticorpos foram imobilizados sobre o Sensor Chip de forma a garantir uma quantidade de imobilização de 500 RU. O tampão de corrida utilizado era 50 mmoles/L de Na-fosfato/150 mmoles/L de NaCl con- tendo 0,05% (V/V°/j) de Tensoativo P20 (pH 6,0)- Com os chips sensores preparados, o ensaio foi realizado utili- 5 zando como um tampão de corrida, 50 mmoles/L de Na-fosfato/150 mmo- les/L de NaCl contendo 0,05% de Tensoativo P20 (pH 6,0) ou 50 mmoles/L de Na-fosfato/150 mmoles/L de NaCl contendo 0,05% de Tensoativo P20 (pH 7,4). Os ensaios foram realizados exclusivamente a 25 °C. As soluções de FcRn humano diluídas e o tampão de corrida como uma soiução de refe- lO rência foram injetados a uma vazão de 5 µL/min durante dez minutos para W permitir que o FcRn humano interagisse com o anticorpo sobre o chip. A se- guir, o tarnpão de corrida foi injetado a uma vazão de 5 µL/min durante uma minuto para monitorar a dissociação de FcRn. Então, o chip sensor foi rege- nerado em duas rodadas de injeção de 20 mmoles/L de Tris-HCl/150 mmo- les/L de NaCl (pH 8,1) a uma vazão de 30 µljmin durante 15 segundos.

Os resultados do ensaio foram analisados utilizando Biacore TlOO Evaluation Software (Ver. 2.0.1). Através de um método de afinidade em estado estacionário, a constante de dissociação (KD) foi calculada par- tindo dos resultados do ensaio em seis concentrações de FcRn diferentes.

Os resultados sobre as atividades de ligação ao FcRn humano (constantes de dissociaçâo (KD)) de Fv4-lgG1, Fv4-lgG1-v1 e Fv4-lgG1-v2 em pH 6,0 e pH 7,4 são mostrados na Tabela 24 abaixo.

Tabela 24 KO(µM) pH6.0 pH7.4 Fv4-[gG1 1.99 NA Fv4-IgG1-v1 0.32 36.55 Fv4-IgG1-v2 0.11 11.03 Em pH 7,4, a ligação do FcRn humano ao Fv4-lgG1 era muito fraca para determinar o valor de KD (NA). Enquanto isso, foi observado que Fv4-lgG1-v1 e Fv4-lgG1-v2 se ligam ao FcRn humano em pH 7,4 e os valo- res de KD foram determinados como sendo 36,55 e 11,03 µM, respectiva- mente. Os valores de KD para FcRn humano em pH 6,0 foram determinados como sendo 1,99, 0,32 e 0,11 µM.

Como mostrado na Fig. 31, quando com- parado com Fv4-lgG1, Fv4-lgG1-v2 acelerava a eliminação de hslL-6R em camundongos transgênicos para FcRn humano.

Assim, a eliminação dos antígenos pode ser prevista como sendo acelerada através do aumento da 5 ligação ao FcRn humano em pH 7,4 pelo menos para ser mais forte que 11,03 µM através da alteração da lgGl humana.

Enquanto isso, como des- crito no J lmmunol. (2002) 169(9): 5171-80, a lgGl humana se liga aproxi- madamente dez vezes mais fortemente ao FcRn de camundongo que ao FcRn humano.

Por esta razão, é também previsto que Fv4-lgG1-v1 e Fv4- 10 lgG1-v2 se liguem aproximadamente dez vezes mais fortemente ao FcRn de

¥ camundongo que ao FcRn humano em pH 7,4. A aceleração da eliminação de hslL-6R por Fv4-lgG1-v1 Olj Fv4jgG1-v2 em camundongos normais mos- trada na Fig. 34 é mais significativa que a aceleração da eliminação por Fv4- lgG1-v2 em camundongos transgênicos para FcRn humano mostrada na Fig. 15 32. lsto sugere que o grau de aceleração de eliminação de hslL-6R é au- mentado de acordo com a força de ligação ao FcRn em pH 7,4. Exemplo de referência 5 Preparação de anticorpos de ligação ao receptor de IL-6 humana dependente do pH com maior ligação ao FcRn hu- mano sob condição neutra 20 (5-1) Preparação de mutantes da região constante da cadeia pesada de FV4- lgG1 Várias alterações para aumentar a ligação ao FcRn humano sob uma condição neutra foram introduzidas no Fv4-lgG1 para aumentar adicio- nalmente o efeito de eliminação dos antigenos do anticorpo de ligação ao 25 receptor de IL-6 humana dependente do pH em camundongos transgênicos para FcRn humano.

Especificamente, as alterações de aminoácidos mostra- das nas Tabelas 25-1 e 25-2 foram introduzidas dentro da região constante de cadeia pesada de Fv4-lgG1 para produzir vários mutantes (os números de aminoácidos dos sÍtios de mutação são apresentados de acordo com a 30 numeração EU). As substituições de aminoácidos foram introduzidas através de métodos conhecidos pelos versados na técnica como descrito no Exem- plo de Referência 3.

[Tabela 25-1] &F 'Y: ±ejT-2 G '*aEa:r "E Âlteracão de aminoáádo &

ND NWE ÍE

3.2E-O6 M252Y.0'S254T.'TZ56E

8.1È-07 N434W Z5E"06 N434Y

5.8E-06 N434S

6.8E-06 N434A 5,6E-06 =V IÊi?,

4.2E-Q6 M252W

1.4E~07 M252Y/'S254Tt'T256E/N434Y

6.9E-08 M252Y,t'S254T.f'T256Ef'N434W I IgG1-Fl1 3 1E-07 M252Y,'N434Y Lkg1-F12 1-7E-07 M252Y.'N434'N i !gGi-F13 3.2E--07 M252W.'N434Y I [gG)-F14 1.8E_07 M252W.·"N434W I igGi-F19 4.6E-07 p257L.í'N434Y I lEG1-F20 4.6E-07 V308F,t'N434Y ] lRG1-F21 3.OE-08 M252VN308P,'N4MY l_kg1-F22 2.OE-06 M428L'N434S | Kgpf25 9.2E-09 M252Y,'S254Tp'T25GE."V308P,'N434W >g1"-f26 I.QE-06 I332V I Kgj±27 7.4E-06 G23/M Lkg1-F29 1.4E-06 1332V/N434Y i [rg]-f3j 2 8E-06 G237M.'V3(J8F | IgG1-F32 8-OE-07 S254T!'N434W Llgg1-F33 2.3E-06 S254T./NG34Y I [gG1-F34 2-8E-07 T256E/N434W ! lgGl-F35 8-4E-07 T2566'N434Y I tRGi-F36 3-6E-07 S254T."T256E/'N434W | Kgj-f37 1.1E-06 S254T,.·'T256E.'N434Y I iRG]-F38 I.OÊ-07 M252Yís254T.'N434w I lKG]-F39 3.QÈ-07 M252Y,r"S254T,"N434Y i Kgj-f4o 8.2E-08 M252Y.'T256E .'N434W I irg1-f¢1 1.5Ê-07 M252Y1T256E/N434Y I [eg1·-F42 1.OE-06 M252Y.·'S254T..'T256E.·' N434A ) íkg1-f43 1.7É 06 M252YÍN434A | [kg1 f44 1.1E'-06 M252W,"N434A Rkg1-F¢7 2.4E-07 M252Y·'T25ÕQ,"N434W | Igg1-Fa 3.2E-07 M252'(,""T256Q.."N434Y" I IgGI-F49 5.1E-07 M252FiT256Dí'l¥34'N " | [qG1-F50 1-2E-06 M252F /" r258D r'l\'434Y | l€G1-F5l 8.1E-06 N434't'Y436H | [gGí-F52 3-1E-06 H433K.'N434F..· Y436H I tgGí--F53 1.OE-06 I332VrN434W L_kg1-F5" 8.4Ê-08 V308P.'·'N434W I ikg1 f56 9.4E-07 1332V."td428 L .-'N434Y |JgG1_F57 1.1E-05 G385D./'Q386Pt'N389S I IgG1-F58 7.7E-Ô7 G385D.'Q386P.·"N389S."N434W I lEGl'-F59 2.4E-06 G385D.·"Q38FP 'N38gs."N434"T "' ' l [gGi-F60 1.1E-Q5 G385H i IgGi-F61 9.7E-Q7 G38.5H·'N434W Í.9E-06 G385H '"N434Y ! IgGl-F62 I [gGi-F63 2-5E-06 N434" 5-3È-06 N434H l kG1-F64

A Tabela 25-2 é a continÍjação da Tabela 25-1. Tabela 25-.2 kg1-F65 M252Y,'S254T,'T256E,'N434F KGFF66 M252Y,.'"S254T/'T256E/"N434H

))))) KGPF67 M252Y."N434F IgG1-F68 M252Y,'N434H IgG1-F69 M428L.'N434W IgG1-F70 M428L,"N434Y IgG1-F71 M252Y,'S254T'T256E,'"M428L/N434W IgG1-F72 M252Y,r"S254T/'T25RE,.'M428L,/N434Y IgGl-F73 M252Y.'M428L,"N434W IqG1-F74 M252Y'M428L/N434Y igG1-F75 M252Y,'M428L,'N434A IgG1-F76 M252Y/S254"T,/"T2"6E/"M428L/N434A IgG1-F77 T2"6E."M428L,'N434Y IgG1-F78 S254T."M428L:'N434W IqG1-F79 S254T7T256E..'N434A IgG1-F80 M252Y/'T256Q/N434A !gG1-F81 M252Y/T256E/N434A !gG1-F82 T256Q,'N434W

))))) IgG1-F83 T256Q/N434Y IgG1-F84 M252W,'T256Q/N434W lgG1-F85 M252W/T256Q/N434Y [RGl-F86 S254T/T256Q/N434W IgG1-F87 S254T,'T256Q/N434Y IgG1-F88 M252Y/S254T/T256Q,'N434W I,gG1-F89 M252Y,'S254T/T256Q/N434Y Kgpf90 M252Y/T256E/V308P,'N434W !£G1-F91 M252Y,'V308P/M428L/N434Y igG1-F92 M252Y/S254T/T256E/V308P/M428L,'N434W IgG1-F93 M252W/M428L/N434W L;çí1-F94 P257L,'M428L./N434Y IgG1-F95 M252Y,'S254T.'T256E,'M428L,'N434F kG1-F99 M252Y/T256E/N434H

Os variantes que compreendem cada um uma cadeia pesada preparada e L (WT) (SEQ ID NO: 14) foram expressos e purificados através de métodos conhecidos pelos versados na técnica como descrito no Exem- plo de Referência 3. (5-2) Avaliação de ligação ao FcRn humano A ligação entre o anticorpo e o FcRn humano foi analisada cine-

ticamente utilizando Biacore TlOO (GE Healthcare). Para esta finalidade, o

FcRn humano foi preparado como descrito no Exemplo de Referência 2. Uma quantidade apropriada de proteína L (ACTIGEN) foi imobilizada sobre o

Sensor chip CM4 (GE Healthcare) através do método de acoplamento de amino e foi permitido que o chip capturasse um anticorpo de interesse.

En- tão, as soluções de FcRn diluídas e o tampão de corrida (na forma de uma solução de referência) foram injetados para permitir que o FcRn humano interagisse com o anticorpo capturado sobre o chip sensor.

O tampão de 5 corrida utilizado compreendia 50 mmoles/L de fosfato de sódio, 150 mmo- les/L de NaCl e 0,05% (p/v) de Tween20 (pH 7,0). O FcRn foi diluido utili- zando cada tampão.

O chip foi regenerado utilizando 10 mmoles/L de glici- na-HCl (pH 1,5). Os ensaios foram realizados exclusivamente a 25 °C- A constante da taxa de associação ka (I/MS) e a constante da taxa de dissoci- lO ação kd (l/s), das quais ambas são parâmetros cinéticos, foram calculadas com base nos sensorgramas obtidos nos ensaios e a KD (M) de cada anti- corpo para o FcRn humano foi determinada partindo destes valores.

Cada parâmetro foi calculado utilizando o Biacore TlOO Evaluation Software (GE Healthcare). O resultado de avaliação sobre a ligação ao FcRn humano sob uma condição neutra (pH 7,0) por Biacore é mostrado nas Tabelas 6-1 e 6-2. A KD da lgGl natural não podia ser calculada porque exibia apenas ligação muito fraca.

Assim, a KD é indicada como ND na Tabela 6-1. Exemplo de referência 6 Teste in vivo de anticorpos de iigação ao receptor de IL-6 humana dependente do pH com maior ligação ao FcRn humano sob a condição neutra Os anticorpos de ligação ao receptor de IL-6 humana dependen- te do pH que possuem capacidade de ligação ao FcRn humano sob uma condição neutra foram produzidos utilizando as cadeias pesadas preparadas como descrito no Exemplo de referência 4 para ter capacidade de ligação ao FcRn humano sob uma condição neutra.

Os anticorpos foram avaliados em relação ao seu efeito de eliminação dos antigenos in vivo Especificamente, os anticorpos Iistados abaixo foram expressos e purificados através de mé- todos conhecidos pelos versados na técnica como descrito no Exemplo de Referência 3: Fv4-lgG1 que compreende VH3-lgG1 e VL3-CK; Fv4jgG1-v2 que compreende VH3-lgG1-v2 e VL3-CK;

Fv4-(gG1-F14 que compreende VH3-lgG1-F14 e VL3-CK; Fv4-lgG1-F20 que compreende VH3-lgG1-F20 e VL3-CK; Fv4-lgG1-F21 que compreende VH3-lgG1-F21 e VL3-CK; Fv4-lgG1-F25 que compreende VH3-lgG1-F25 e VL3-CK; 5 Fv4-lgG1-F29 que compreende VH3-lgG1-F29 e VL3-CK; Fv4-lgG1-F35 que compreende VH3-lgG1-F35 e VL3-CK; Fv4-igG1-F48 que compreende VH3JgG1-F48 e VL3-CK; Fv4-lgG1-F93 que compreende VH3-lgG1-F93 e VL3-CK; e Fv4-lgG1-F94 que compreende VH3-lgG1-F94 e VL3-CK.

Através dos mesmos métodos descritos no Exemplo de referên- cia 3, os anticorpos de iigação ao receptor de IL-6 humana dependente do pH preparados foram testados in vivo utilizando camundongos transgênicos para FcRn humano (B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg linhagem 276 +/+ camundongo, Jackson Laboratories; Methods MoI Biol. (2010) 602: 93-104). Um curso de tempo de concentração no plasma de receptor so- lúvel de IL-6 humana após a administração intravenosa um camundongos transgênicos para FcRn humano é mostrado na Fig. 36. O resultado do teste mostrou que a concentração no plasma de receptor solúvel de IL-6 humana permanecia baixo ao longo do tempo na presença de qualquer um dos anti- corpos de ligação ao receptor de IL-6 humana dependente do pH com maior ligação ao FcRn humano sob condição neutra, quando comparada com a- quela na presença de Fv4-lgG1 que quase não possui capacidade de liga- ção ao FcRn humano sob condição neutra- Entre outros, os anticorpos que produziam o efeito notável incluem, por exemplo, Fv4-lgG1-F14. Foi de- monstrado que a concentração no plasma de receptor solúvel de IL-6 huma- na simultaneamente administrado com Fv4-lgG1-F14 era reduzida em apro- ximadamente 54 vezes um dia após a administração quando comparada com aquela de receptor solúvel de IL-6 humana simultaneamente adminis- trado com Fv4-lgG1. Além disso, foi demonstrado que a concentração no plasma de receptor solúvel de IL-6 humana simultaneamente administrado com Fv4jçjG1-F21 era reduzida em aproximadamente 24 vezes sete horas após a administração quando comparada com aquela de receptor soIúvel de

IL-6 humana simultaneamente administrado com Fv4-lgG1. Em adição, a concentração no plasma de receptor solúvel de IL-6 humana simultanea- mente administrado com Fv4-lgG1-F25 sete horas após a administração es- tava abaixo do Iimite de detecção (1,56 ng/mL)- Assim, era esperado que o 5 Fv4-lgG1-F25 possibilitasse uma redução notável de 200 ou mais vezes na concentração de receptor soIúvel de IL-6 humana em relação à concentra- ção de receptor solúvel de IL-6 humana simultaneamente administrado com Fv4-lgG1. As descobertas descritas anteriormente demonstram que o au- mento da ligação ao FcRn humano de anticorpos que se ligam ao antígeno 10 dependente do pH sob uma condição neutra é altamente eficiente para o

. aprimoramento do efeito de eliminação dos antígenos.

Enquanto isso, o tipo de alteração de aminoácidos para aumentar a ligação ao FcRn humano sob condição neutra, que é introduzida para aumentar o efeito de eliminação dos antigenos, não é particularmente limitado: e tais alterações incluem aquelas 15 mostradas nas Tabelas 6-1 e 6-2. Pode ser previsto que o efeito de elimina- ção dos antígenos é aumentado in vivo através de qualquer alteração intro- duzida.

Além disso, a concentração no plasma de receptor soIúvel de IL- 6 humana simultaneamente administrado com um dos quatro tipos de anti- 20 corpos de ligação ao receptor de IL-6 humana dependente do pH, Fv4-lgG1- F14, Fv4-lgG1-F21, Fv4-lgG1-F25 e Fv4-lgG1-F48, permanecia menor ao longo do tempo que aquela de receptor solúvel de IL-6 humana administrado sozinho.

Tal anticorpo de Iigação ao receptor de IL-6 humana dependente do pH pode ser administrado ao corpo em que a concentração no plasma de 25 receptor solúvel de IL-6 humana é mantida constante (estado estacionário) para manter a concentração no piasma de receptor solúvel de IL-6 humana menor que a concentração no plasma no estado estacionário.

Especifica- mente, a concentração in vivo de antígenos no plasma pode ser reduzida através da administração de tal anticorpo ao corpo. 30 Exemplo de referência 7 Avaliação em relação à eficiência de Fv4-lgG1-F14 em dose baixa (0,01 mg/kg) O Fv4-lgG1-F14 preparado como descrito no Exemplo de refe-

rência 6 foi testado em uma dose baixa (0,01 mg/kg) através do mesmo mé- todo de teste in vivo que é descrito no Exemplo de referência 6. O resultado (mostrado nas Figuras 37 e 38) foi comparado com aquele descrito no E- xemplo de referência 6, que foi obtido através da administração de Fv4-lgG1 5 e Fv4-!gG1-F14a 1 mg/kg.

O resultado mostrou que embora a concentração de anticorpo no plasma no grupo que recebeu administração de Fv4-lgG1-F14 a 0,01 mg/kg fosse aproximadamente 100 vezes menor quando comparada com aquela do grupo administrado a 1 mg/kg (Fig. 38), os cursos de tempo de concentração no plasma de receptor solúvel de IL-6 humana eram compará- veis um com os outros (Fig. 37). Em adição, foi demonstrado que a concen- tração no plasma de receptor solúvel de IL-6 humana sete horas após a ad- ministração no grupo que recebeu administração de Fv4-lgG1-F14 a 0,01 mg/kg foi reduzida em aproximadamente três vezes quando comparada com aquela no grupo que recebeu administração de Fv4-lgG1 a 1 mg/kg- Além disso, na presença de Fv4-lgG1-F14, a concentração no pIasma de receptor soIúvel de IL-6 humana era menor ao longo do tempo em ambos os grupos administrados em doses diferentes quando comparada com aquela do grupo que recebeu administração de receptor solúvei de IL-6 humana sozinho (Fig. 37). A descoberta demonstra que ainda quando administrado em uma dose que é um centésimo daquela de Fv4-lgG1, o Fv4-lgG1-F14 que resulta da modificaçâo de Fv4-lgG1 para aumentar a ligação ao FcRn hu mano sob uma condição neutra reduz eficientemente a concentração no plasma de receptor solúvel de IL-6 humana.

Especificamente, é previsto que os antígenos podem ser eficientemente eliminados em uma dose ainda me- nor quando um anticorpo que se liga ao antígeno dependente do pH é modi- ficado para aumentar sua capacidade de ligação ao FcRn sob condição neu- tra.

Exemplo de referência 8 Teste in vivo com base no modelo de estado estacionário utilizando camundongos normais (8-1) Avaliação da liqação ao FcRn de camundonqo sob condição neutra

VH3/L (WT)-lgG1 que compreende VH3-lgG1 (SEQ ID NO: 19) e L (WT) (SEQ ID NO: 14), VH3/L (WT)-lgG1-v2 que compreende VH3-lgG1- v2 (SEQ ID NO: 22) e L (WT) (SEQ ID NO: 14) e VH3/L (WT)-lgG1-F20 que compreende VH3-lgG1-F20 (SEQ ID NO: 23) e L (WT) (SEQ ID NO: 14), dos 5 quais todos foram preparados como descrito no Exemplo de referência 5, foram avaliados em relação à ligação ao FcRn de camundongo sob uma condição neutra (pH 7,4) através do método descrito abaixo.

A ligação entre o anticorpo e o FcRn de camundongo foi anali- sada cineticamente utilizando Biacore TlOO (GE Healthcare). Uma quantida- lO de apropriada de proteína L (ACTIGEN) foi imobilizada sobre o Sensor Chip

. CM4 (GE Healthcare) através do método de acoplamento de amino e foi permitido que o chip capturasse um anticorpo de interesse.

Então, as solu- ções de FcRn diluidas e o tampão de corrida (como uma soIução de referên- cia) foram injetados para permitir que o FcRn de camundongo interagisse 15 com o anticorpo capturado sobre o chip sensor.

O tampão de corrida utiliza- do contém 50 mmoles/L de fosfato de sódio, 150 mmoles/L de NaCl e 0,05% (p/v) de Tween20 {pH 7,4)- O FcRn foi diluido utilizando cada tampão.

O chip foi regenerado utilizando 10 mmoles/L de glicina-HCl (pH 1,5). Os ensaios foram realizados exclusivamente a 25 °C.

A constante da taxa de associa- 20 ção ka (I/MS) e a constante da taxa de dissociação kd (l/s), ambas sendo parâmetros cinéticos, foram calculadas com base nos sensorgramas obtidos nos ensaios e a KD (M) de cada anticorpo para FcRn de camundongo foi determinada partindo destes valores.

Cada parâmetro foi calculado utilizan- do o Biacore TlOO Evaluation Software (GE Healthcare). 25 O resultado é mostrado na Tabela 26 (afinidade por FcRn de camundongo em pH 7,4). VH3/L (VVT)-lgG1 (lgGl na Tabela 26) cuja região constante é da lgGl natural exibia apenas ligação muito fraca ao FcRn de camundongo.

Assim, a KD não podia ser calculada e é indicada como ND na Tabela 26. O resultado do ensaio mostrou que os anticorpos alterados com 30 maior ligação ao FcRn humano sob condição neutra também exibiam maior ligação ao FcRn de camundongo sob a condição neutra.

Tabela 26

KD (M) lgGl ND lgG1-v2 1.04E-06 lag1-F20 íír:ü (8-2) Teste in vivo utilizando camundonqos normais com uma concentração constante no plasma de receptor solúvel de IL-6 humana Utiiizando H54/L28-lgG1, Fv4-lgG1, Fv4-lgG1-v2 e Fv4-lgG1- F20 preparados como descrito no exemplos 3 e no exemplo de referência 5, 5 um teste in vivo foi realizado através do método descrito abaixo.

Uma bomba de infusão (MINPOSMOTlC PUMP MODEL 2004: alzet) contendo receptor solúvel de IL-6 humana foi implantada sob a pele nas costas de camundongos normais (camundongo C57Blj6js; Charles Ri- ver Japão) para preparar animais de modelo em que a concentração no plasma de receptor solúvel de IL-6 humana foi mantida constante.

Os anti- corpos antirreceptor de IL-6 humana foram administrados aos animais de modelo para avaliar a cinética in vivo após a administração de receptor solú- vel de IL-6 humana.

O anticorpo monoclonal anti-CD4 de camundongo (R&D) foi administrado a 20 mg/kg uma vez dentro da veia caudal para su- primir a produção de anticorpo neutralizante contra o receptor solúvel de IL-6 humana.

Então, uma bomba de infusão contendo 92,8 µg/mL de receptor solúvel de IL-6 humana foi implantada sob a pele rias costas dos camundon- gos.

Três dias após impiantar a bomba de infusão, os anticorpos antirrecep- tor de (L-6 humana foram administrados a 1 mg/kg uma vez dentro da veia caudal.

O sangue foi coletado 15 minutos, sete horas, um dia, dois dias, três dias, quatro dias, sete dias, 14 dias, 21 dias e 28 dias após a administração do anticorpo antirreceptor de IL-6 humana.

O sangue coletado foi imediata- mente centrifugado a 15.000 rpm e 4 "C durante 15 minutos para separar o plasma.

O plasma separado foi armazenado em um refrigerador a ou abaixo de -20"C antes do ensaio. (8-3) Determinação da concentração no pIasma de anticorpos antirreceptor de IL-6 humana por ELISA O método utilizado era o mesmo que o descrito no Exemplo de referência 3. (8-4) Determinação da concentração de hsÍL-6R no plasma através do en- saio de eletroquimioluminescência O método utilizado foi o mesmo descrito no Exemplo 5. 5 Como mostrado na Fig. 39, a concentração no plasma de recep- tor solúvel de IL-6 humana foi eíevada até 650 ng/mL (15 vezes antes da administração) quando H54/L28-lgG1, um anticorpo neutralizante contra re- ceptor solúvel de )L-6 humana, foi administrado a camundongos normais (grupo hslL-6R) em que a concentração no plasma de receptor solúvel de IL- lO 6 humana foi mantida constante a aproximadamente 40 ng/mL.

Por outro

. lado, a concentração no plasma de receptor solúvel de IL-6 humana foi man- tida a aproximadamente 70 ng/mL no grupo que recebeu administração de Fv4-lgG1 que resulta de conferir ao H54/L28-lgG1 uma capacidade de liga- ção ao antígeno dependente do pH. lsto sugere que o aumento na concen- 15 tração no plasma de receptor solúvel de IL-6 humana causado através da administração de H54/L28-fgG1, um anticorpo neutralizante comum, pode ser suprimido até aproximadamente um décimo conferindo a capacidade de ligação dependente do pH.

Além disso, foi demonstrado que a concentração no plasma de 20 receptor solúvel de IL-6 humana era mantida a ou abaixo um décimo da concentração no estado estacionário através da administração de Fv-lgG1- v2 ou Fv-lgG1-F20, dos quais ambos resultaram da introdução de uma alte- ração dentro de um anticorpo de ligação ao receptor de IL-6 humana depen- dente do pH para aumentar a ligação ao FcRn sob condição neutra.

Quando 25 o Fv-lgG1-v2 foi administrado, a concentração no plasma de receptor solúvel de IL-6 humana 14 dias após a administração era de aproximadamente 2 ng/mL.

Assim, o Fv-lgG1-v2 poderia reduzir a concentração até 1/20 do nível antes da administração.

Enquanto isso, quando o Fv-lgG1-F20 foi adminis- trado, as concentrações no plasma de receptor soIúvel de IL-6 humana sete 30 horas, um dia, dois dias e quatro dias após a administração estavam abaixo do (imite de detecção (1 ,56 ng/mL). lsto sugere que o Fv-lgG1-F20 reduzia a concentração até ou abaixo 1/25 do nível antes da administração.

As descobertas descritas anteriormente demonstram que a con- centração de antigenos no plasma pode ser significativamente reduzida a- través do aumento da taxa de eliminação dos antígenos no plasma, através da administração de um anticorpo que possui tanto capacidade de ligação 5 ao antígeno dependente do pH quanto capacidade de ligação ao FcRn sob a condição neutra a animais de modelo em que a concentração de antígenos no plasma é mantida constante.

Os anticorpos comuns, tal como H54/L28-lgG1, podem apenas neutralizar a ação de um antlgeno alvo através da ligação com o antígeno alvo e, ainda pior, podem aumentar a concentração de antigenos no plasma.

Em contraste, foi observado que os anticorpos que possuem tanto capacida- de de ligação ao antígeno dependente do pH quanto capacidade de ligação ao FcRn sob condição neutra eram capazes não apenas de neutralizar o antígeno alvo, mas também reduzir a concentração no plasma do antígeno alvo.

Pode ser esperado que o efeito de remoção do antígeno do plasma seja mais benéfico que a neutralização.

Em adição, a remoção do antígeno também pode funcionar para antigeno ajvos que são insuficientemente efici- entes através apenas da neutraíização.

Exemplo de referência 9 ldentificação da faixa mínima da afini- dade de Iigação ao FcRn humano em pH neutro necessário para aumentar a eliminação dos antígenos e a relação entre a eliminação dos antígenos e a afinidade de ligação ao FcRn humano em pH neutro (9-1)Preparação de anticorpo para estudo in vivo Os variantes de Fc de Fv4-lgG1 que compreende VH3-lgG1 (SEQ ID NO: 19) e VL3-CK (SEQ ID NO: 20) com maior ligação ao FcRn sob o pH neutro foram gerados.

Especificamente, VH3-M73 (SEQ ID NO: 24) e VH3-lgG1-v1 (SEQ ID NO: 21) foram preparados.

As substituições de ami- noácidos foram introduzidas através de métodos conhecidos pelos versados na técnica como descrito no Exemplo de Referência 3- H54/L28-lgG1 que compreende H54 (SEQ ID NO: 5) e L28 (SEQ ID NO: 6), Fv4-lgG1 que compreende VH3-lgG1 (SEQ ID NO: 19) e VL3-CK (SEQ ID NO: 20), Fv4-M73 que compreende VH3-M73 (SEQ ID NO: 24) e

VL3-CK (SEQ ID NO: 20), Fv4-lgG1-v1 que compreende VH3-lgG1-v1 (SEQ ID NO: 21) e VL3-CK (SEQ ID NO: 20) e Fv4-lgG1-v2 que compreende VH3- lgG1-v2 (SEQ ID NO: 22) e VL3-CK (SEQ ID NO: 20), foram expressos e purificados através do método conhecido pelos versados na técnica descrito 5 no Exemplo de Referência 3. {9-2) Avaliação da afinidade de ligação de anticorpos ao FcRn humano sob condição de pH neutro VH3/L (VVT)-lgG1 que compreende VH3-lgG1 (SEQ ID NO: 19) e L (WT) (SEQ ID NO 14), VH3/L (WT)-M73 que compreende VH3-M73 (SEQ 10 ID NO: 24) e L (WT) (SEQ ID NO: 14), VH3/L (WT)-lgG1-v1 que compreende

_ VH3-lgG1-v1 (SEQ ID NO: 21) e L (WT) (SEQ ID NO: 14) e VH3/L (WT)- lgG1-v2 que compreende VH3-lgG1-v2 (SEQ ID NO: 22) e L (WT) (SEQ ID NO: 14), dos quais todos foram preparados como descrito no Exemplo de referência 3, foram avaiiados for ligação ao FcRn humano sob um pH neutro 15 (pH 7,0). A atividade de ligação de VH3/L (VVT)-lgG1-v1 e VH3/L (WT)- IgG1-v2 ao FcRn humano foi medida utilizando o método descrito no Exem- plo de referência 5. Devido à baixa afinidade de ligaçáo de VH3/L (WT)-lgG1 e VH3/L (\NT)-M73 ao FcRn humano, a atividade de ligação ao FcRn huma- 20 no não podia ser medida utilizando o método descrito no Exemplo 5, portan- to, estes anticorpos foram avaliados através do método descrito abaixo.

A ligação entre o anticorpo e o FcRn humano foi analisada cineticamente utili- zando Biacore TlOO (GE Healthcare)- Uma quantidade apropriada de proteí- na L (ACTIGEN) foi imobilizada sobre o Sensor Chip CM4 (GE Healthcare) 25 através do método de acoplamento de amina e foi permitido que o chip cap- turasse um anticorpo de interesse.

Então, as soluções de FcRn diluidas e o tampão de corrida como uma solução de referência foram injetados para permitir que o FcRn humano interagisse com o anticorpo capturado sobre o chip sensor.

O tampão de corrida utilizado compreendia 50 mmoles/L de fos- 30 fato de sódio, 150 mmoles/L de NaCl e 0,05% (p/v) de Tween20 (pH 7,0). O FcRn foi diluido utilizando cada tampão.

O chip foi regenerado utilizando 10 mmoles/L de glicina-HCl (pH 1,5). Os ensaios foram realizados a 25°C.

A KD (M) de cada anticorpo era derivada dos dados de sensor- grama utilizando o Biacore TlOO Evaluation Software (GE Heaithcare), que ajusta simultaneamente as fases de associação e dissociação dos sensor- gramas e ajusta globalmente todas as curvas no ambiente de trabalho.

Os 5 sensorgramas foram ajustados no modelo de ligação 1:1, o modelo de "liga- ção de Langmuir", fornecido pelo Biacore TlOO Evaluation Software.

Para algumas das interações de ligação, a KD era derivada da análise de regres- são não linear das representações gráficas de R,q, da resposta de ligação em equilíbrio, versus o log da concentração de analito utilizando uma abor- lO dagem baseada no equilibrio.

O resultado sobre a ligação ao FcRn humano sob a condição neutra (pH 7,0) por Biacore é mostrado na Tabela 27. Tabela 27 KD(M) ÍgGl 8.8E-05 M73 1.4E-05 IgG1-v1 3.2E-06 kG1-v2 8.1E-07 (9-3) Estudos in vivo do efeito de anticorpos sobre a eliminação dos antiqe- nos no modelo de coadministração utilizando a linhaqem de camundongo transqênica para FcRn humano 276 O estudo in vivo dos anticorpos utilizando o modelo de coadmi- nistração foi realizado como descrito no Exemplo de referência 3. Os anti- corpos antirreceptor de IL-6 humana utilizados neste estudo são os H54/L28-lgG1, Fv4-lgG1, FV4-M73, Fv4-lgG1-v1 e Fv4-lgG1-v2 descritos anteriormente.

Os camundongos utilizados neste estudo são camundongos transgênicos para FcRn humano (B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg linhagem 276 +/+ camundongo, Jackson Laboratories; Methods Mol Biol. (2010) 602: 93-104). Como mostrado na Fig. 40, as farmacocinéticas de H54/L28- lgGl, Fv4-lgG1, FV4-M73, Fv4-lgG1-v1 e Fv4-lgG1-v2 eram comparáveis e estes anticorpos mantinham concentração similar no plasma durante o estu- do.

O curso de tempo da concentração de hslL-6R no plasma foi mostrado na Fig. 41. Comparado com o hslL-6R administrado com Fv4-lgG1, o hsll-6R administrado com Fv4-lgG1-v2 exibia maior eliminação, enquanto que o hsll-6R administrado com FV4-M73 e Fv4-lgG1-v1 exibia eliminação 5 reduzida.

Embora todos os variantes de Fc, M73, vl e v2 tivessem maior afinidade de ligação ao FcRn humano em pH neutro condição (pH 7,0), foi demonstrado que apenas Fv4-lgG1-v2, mas não Fv4-M73 e Fv4-lgG1-v1, exibia eliminação aprimorada de hslL-6R, lsto indica que com a finalidade de aumentar a eliminação de antígeno, a afinidade de ligação de anticorpo ao FcRn humano em pH 7,0 precisa ser pelo menos mais forte do que aquela de IgGl-vl, cuja afinidade de ligação ao FcRn humano em pH 7,0 é KD 3,2 µM ou 28 vezes mais forte do que aquela da lgGl humana intacta (a afini- dade de ligação ao FcRn humano é KD 88 µM). A Fig. 42 descreve a relação entre a afinidade de ligação de va- riantes Fc ao FcRn humano em pH7,0 e a concentração de hslL-6R no pIasma no dia 1 após a coadministração de hslL-6R e variantes Fc.

Os vari- antes Fc descritos neste Exemplo e no Exemplo de referência 6 (Fv4-lgG1, FV4-M73, Fv4-lgG1-v1, Fv4-lgG1-v2, Fv4-lgG1-F14, Fv4-lgG1-F20, FV4- lgG1-F21, Fv4-lgG1-F25, Fv4-lgG1-F29, Fv4-lgG1-F35, Fv4-lgG1-F48, FV4- lgG1-F93 e Fv4-lgG1-F94) são representados graficamente.

Através do au- mento da afinidade de ligação de anticorpo ao FcRn humano em pH 7,0, a concentração no plasma de hslL-6R, que reflete a eliminação de antígeno, aumentava no iriício, mas então diminuia rapidamente, lsto demonstra que com a finalidade de aprimorar a eliminação de antigeno comparada com a IgGl humana intacta, a afinidade de Iigação de anticorpo ao FcRn humano em pH 7,0 precisa ser preferencialmente mais forte que KD 2,3 µM (valor obtida partindo de ajuste da curva da Fig. 42). A afinidade de ligação de an- ticorpo ao FcRn humano entre KD 88 µM e KD 2,3 µM reduziria bastante a eliminação de antigeno (maior concentração de hslL-6R ). Em outras pala- vras, a afinidade de ligação de anticorpo ao FcRn humano em pH 7,0 preci- sa ser preferencialmente 38 vezes mais forte do que aquela da IgGl huma- na natural para aumentar a eliminação dos antigenos ou de outra maneira reduzir a eliminação de antígeno.

A Fig. 43 descreve a relação entre a afinidade de ligação de va- riantes Fc ao FcRn humano em pH 7,0 e a concentração de anticorpo no plasma no dia 1 após a coadministração de hslL-6R e variantes Fc.

Os vari- 5 antes Fc descritos neste Exemplo e no Exemplo de referência 6 (Fv4-lgG1, FV4-M73, Fv4-lgG1-v1, Fv4-lgG1-v2, Fv4-lgG1-F14, Fv4-lgG1-F20, FV4- lgG1-F21, Fv4-lgG1-F25, Fv4-lgG1-F29, Fv4-lgG1-F35, Fv4-lgG1-F48, Fv4- lgG1-F93 e Fv4-lgG1-F94) são representados graficamente.

Através do au- mento da afinidade de ligação de anticorpo ao FcRn humano em pH 7,0, a concentração no plasma de anticorpo. que reflete a farmacocinética do anti- corpo (eliminação), é mantida primeiramente, mas é então diminuida rapi- damente. lsto demonstra que com a finalidade de manter a farmacocinética de anticorpo similar àquela da lgGl humana natural (a afinidade de ligação ao FcRn humano é KD 88 µM), a afinidade de anticorpo ao FcRn humano em pH 7,0 precisa ser mais fraca que KD 0,2 µM (valor obtido partindo do ajuste da curva da Fig. 43). A afinidade de ligação de anticorpo ao FcRn humano mais forte que KD 0,2 µM aumentava a eliminação do anticorpo (is- to é, eliminação mais rápida do anticorpo do plasma). Em outras palavras, a afinidade de ligaçâo de anticorpo ao FcRn humano em pH 7,0 precisa ser dentro de 440 vezes mais forte do que aquela da lgGl humana natural para exibir farmacocinética do anticorpo similar àquela da lgGl humana natural ou de outra maneira resultar na eliminação rápida do anticorpo do plasma.

Considerando ambas as Figuras 42 e 43, com a finalidade de melhorar a eliminação de antígeno (isto é, reduzir a concentração de antíge- nos no plasma) comparada com aquela da ]gG1, enquanto a farmacocinética do anticorpo for mantida similar àquela da lgGl humana natural, a afinidade de ligação de anticorpo ao FcRn humano em pH 7,0 precisa ser entre 2,3 µM e 0,2 µM ou em outras palavras, a afinidade de ligação de anticorpo ao FcRn humano em pH 7,0 precisa ser dentro de uma faixa de 38 vezes até 440 vezes mais forte do que aquela da lgGl humana intacta.

Tal anticorpo com farmacocinética similar àquela da lgGl com atividade de eliminação de antígeno em longo prazo seria benéfico para anticorpo terapêutico que re-

quer intervalo de dosagem mais longo tal como doença crônica por causa de sua propriedade de ação longa.

Por outro lado, aumentando a afinidade de Iigação de anticorpo ao FcRn humano em pH 7,0 mais forte que KD 0,2 µM ou em outras pala- 5 vras, aumentando a afinidade de Iigação de anticorpo ao FcRn humano em pH 7,0 mais que 440 vezes quando comparada com aquela da lgGl humana natural, aumentaria a eliminação de antigeno até uma grande extensão den- tro de um curto periodo de tempo, embora o anticorpo seja eliminado do plasma mais rápido que aquela da lgGl humana natural.

Tal anticorpo com capacidade de induzir a redução rápida e forte da concentração de antige- nos seria benêfico para anticorpo terapêutico tal como doença aguda em que o antígeno relacionado à doença precisa ser removido do plasma por causa de sua propriedade de ação rápida.

A quantidade de antígeno eliminada do plasma por anticorpo é o fator importante para avaliar a eficiência de eliminação dos antígenos atra- vés da administração dos variantes Fc do anticorpo que possuem maior afi- nidade de ligação ao FcRn humano em pH 7,0. Para avaliar a eficiência de eliminação dos antígenos por anticorpo, o cálculo a seguir foi realizado em cada ponto de tempo de estudo in vivo descrito neste Exemplo e no Exemplo de referência 6. valor A: Concentração molar de antigeno em cada ponto de tempo valor B: Concentração molar de anticorpo em cada ponto de tempo valor de C: Concentração molar de antígeno por concentração molar de anticorpo (proporção de antígeno/anticorpo) em cada ponto de tempo C = NB Os cursos de tempo de valor de C (proporção de antíge- no/anticorpo) para cada anticorpo foram descritos na Fig. 44. O valor de C menor indica maior eficiência de eliminação dos antígenos por anticorpo, enquanto que o valor de C maior indica menor eficiência de eliminação dos

J S!

antígenos por anticorpo.

O valor de C menor quando comparado com a lgGl indica que uma maior eficiência de eliminação dos antígenos foi atingida pe- los variantes Fc, enquanto que o valor de C maior quando comparado com a lgGl indica que os variantes Fc possuem efeito negativo sobre a eficiência 5 de eliminação dos antígenos.

Todos os variantes Fc exceto Fv4-M73 e Fv4- lgG1-v1 demonstravam eficiência de eliminação dos antígenos aprimorada quando comparados com Fv4-lgG1. Fv4-M73 e Fv4-lgG1-v1 demonstravam impacto negativo sobre a eficiência de eliminação dos antígenos, que era coerente com a Fig. 42. 10 A Fig. 45 descreve a relação entre a afinidade de ligação de va- riantes Fc ao FcRn humano em pH 7,0 e o valor de C (proporção de antíge- no/anticorpo) no dia 1 após a coadministração de hslL-6R e variantes Fc.

Os variantes Fc descritos neste Exemplo e no Exemplo de referência 6 (FV4- lgG1, Fv4-M73, Fv4-lgG1-v1, Fv4-lgG1-v2, Fv4-lgG1-F14, Fv4-lgG1-F20, 15 Fv4-lgG1-F21, Fv4-lgG1-F25, Fv4-lgG1-F29, Fv4-lgG1-F35, Fv4-lgG1-F48, Fv4-lgG1-F93 e Fv4-lgG1-F94) são representados graficamente- lsto de- monstra que com a finalidade de atingir maior eficiência de eliminação dos antígenos quando comparada com aquela da lgGl humana natural, a afini- dade de anticorpo ao FcRn humano em pH 7,0 precisa ser mais forte que 20 KD 3,0 µM (valor obtido partindo do ajuste da curva da Fig. 45). Em outras palavras, a afinidade de Iigação de anticorpo ao FcRn humano em pH 7,0 precisa ser pelo menos 29 vezes mais forte do que aquela da lgGl humana natural para atingir maior eficiência de eliminação dos antígenos quando comparada com aquela da lgGl humana natural. 25 Em conclusão, o grupo de variantes de anticorpo que possui afi- nidade de ligação ao FcRn em pH 7,0 entre KD 3,0 µM e 0,2 µM ou em ou- tras palavras, o grupo de variantes de anticorpo que possui afinidade de li- gação ao FcRn em pH 7,0 dentro de uma faixa de 29 vezes até 440 vezes mais forte do que aquela da IgGl humana natural, possui farmacocinética do 30 anticorpo similar àquela da lgGl, mas possui maior capacidade de eliminar o anticorpo do plasma, Portanto, tal anticorpo exibe eficiência de eliminação dos antígenos aprimorada quando comparada com aquela da lgGl.

A far-

macocinética similar àquela da lgGl possibilitaria uma eliminação em Iongo prazo de antígeno do plasma (eliminação de ação longa dos antígenos) e, portanto, intervalos de dosagem longos que seriam preferíveis para anticor- pos terapêuticos para doença crônica.

O grupo de variantes de anticorpo 5 que possui afinidade de ligação ao FcRn em pH 7,0 mais forte que KD 0,2 µM ou em outras palavras, o grupo de variantes de anticorpo que possui afi- nidade de ligação ao FcRn em pH 7,0 440 vezes mais forte do que aquela da [gGl humana natural, possui rápida eliminação de anticorpo (eliminação em curto prazo de anticorpo). Todavia, uma vez que tal anticorpo possibilita 10 eliminação de antígeno ainda mais rápida (eliminação de ação rápida dos

. antígenos), portanto, tal anticorpo também exibe eficiência de eliminação dos antígenos aprimorada quando comparada com aquela da lgGl.

Como mostrado no Exemplo de referência 8, Fv4-lgG1-F20 em camundongo nor- mal induziria alta eliminação significativa do antígeno do plasma em um pe- 15 ríodo de tempo muito curto, mas o efeito de eliminação dos antígenos não é durável.

Tal perfil seria preferível para doença agudas em que é necessário que o antígeno relacionado à doença seja eliminado do plasma rapidamente e significativamente em um período de tempo muito curto.

Exemplo de referência 10 Estudo ln vivo de Fv4-lgGl-F14 atra- 20 vés do modelo de infusão no estado estacionário utilizando linhagem de ca- mundongo transgênica para FcRn humano 276 O estudo ln vivo de Fv4-lgG1-F14 através do modelo de infusão no estado estacionário utilizando Iinhagem de camundongo transgênica para FcRn humano 276 foi realizado como descrito abaixo.

O grupo de estudo 25 consiste de grupo de controle (sem anticorpo), Fv4-lgG1 em uma dose de 1 mg/kg e Fv4-lgG1-F14 em uma dose de 1 mg/kg, 0,2 mg/kg e 0,01 mg/kg.

Uma bomba de infusão (MlNl-OSMOTIC PUMP MODELO 2004; alzet) contendo receptor de IL-6 humana solúvel foi implantado sob a pele das costas de camundongos transgênicos para FcRn humano 276 30 (B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg linhagem 276 +/+ camundongo (B6.mFcRn-/- hF- CRN Tg276 B6.Cg-Fcgrt <tm1Dcr" Tg(FCGRT) 276Dcr (Jackson n° 4919)), Jackson Laboratories; Methods Mol Biol. (2010) 602: 93-104) para preparar animais modelo nos qLlais a concentração plasmática de receptor de IL-6 humana foi mantida constante.

Os anticorpos antirreceptor de IL-6 humana foram administrados aos animais modelo para avaliar a dinâmica in vivo in vivo após administração do receptor de IL-6 humana solúvel.

O anticorpo 5 monoclonal anti-CD4 de mouse (R&D) foi administrado a 20 mg/kg antes do implante da bomba de infusão e 14 dias após a administração do anticorpo na veia caudal para suprimir a produção de anticorpo neutralizante contra o receptor de IL-6 humana solúvel.

A seguir, uma bomba de infusão contendo 92,8 g/ml de receptor de IL-6 humana solúvel foi implantada sob a pele das ' 10 costas dos camundongos.

Três dias após o implante de uma bomba de infu-

são, os anticorpos antirreceptor de IL-6 humana (H54/L28-lgG1 e H54/L28- lgG1-F14) foram administrados a 1 mg/kg uma vez na veia caudal.

O sangue foi colhido 15 minutos, sete horas, um dia, dois dias, três dias, quatro dias, cinco dias, sete dias, 14 dias, 21 dias e 28 dias após a administração do an- 15 ticorpo antirreceptor de IL-6 humana.

O sangue coletado foi centrifugado imediatamente a 15.000 rpm e 4°C durante 15 minutos para separar o plas- ma.

O plasma separado foi armazenado em um refrigerador a -20°C ou me- nos, antes do teste.

A concentração de hsIL-6R no plasma do camundongo foi medi- 20 da por eletroquimioluminescência.

Amostras da curva de calibração de hslL- 6R ajustadas para as concentrações de 2.000, 1.000, 500, 250, 125, 62,5, e 31,25 pg/ml, e amostras do plasma do camundongo diluídas 50 vezes ou mais foram 'preparadas.

As amostras foram misturadas com uma solução de Anticorpo Monoclonal Anti-lL-6 Humana (R&D) marcado com rutênio com 25 Sulfo-Tag NHS Ester (Meso Scale Discovery), Anticorpo Anti-lL-6 Humana Biotinilado (R&D), e WT-lgGl e foi permitido que reagissem durante a noite a 37°C.

A concentração fina! de WT-lgGl como um anticorpo antirreceptor de IL-6 humana compreendendo tocilizumabe (cadeia pesada SEQ ID NO: 13; cadeia leve SEQ ID NO: 14) era 333 µg/ml, o que está a mais do que a 30 concentração do anticorpo antirreceptor de IL-6 humana contido nas amos- tras, com o propósito de ligar quase todas as moléculas de hslL-6R nas a- mostras a VVT-lgGl.

Subsequentemente, as amostras foram distribuidas dentro de uma MA400 PR Streptavidin Plate (Meso Scale Discovery) e foi permitido que reagissem durante uma hora à temperatura ambiente e a Ia- vagem foi realizada. lmediatamente após o Tampão de leitura (Read Buffer) T (x4) (Meso Scale Discovery) ser fornecido, a medição foi realizada por 5 Sector PR 400 Reader (Meso Scale Discovery). A concentração de hslL-6R foi calculada com base na resposta da curva de calibração utilizando o soft- ware analítico SOFTmax PRO (Molecular Devices). A Fig. 46 descreve o perfil de tempo de concentração de hslL-6R no plasma após a administração do anticorpo.

Comparada com o nive) da linha de base de hslL-6R sem anticorpo, a administração de 1 mg/kg de Fv4- lgG1 resultou em aumentos de várias vezes na concentração de hslL-6R no plasma.

Por outro lado, a administração de 1 mg/kg de Fv4-lgG1-F14 resul- tou na redução significativa na concentração no plasma em comparação com o grupo Fv4-lgG1 e o grupo de linha de base.

No dia 2, a concentração de hslL-6R no plasma não foi detectada (o limite de quantificação da con- centração de hslL-6R no plasma é de 1,56 ng/mL neste sistema de medida) e isto durou até o dia 14. H54/L28-lgG1-F14 mostrou redução de concentração de hslL- 6R no plasma quando comparado com H54/L28-lgG1, mas a extensão da redução foi pequena.

A extensão da redução foi muito maior para a região variável de FV4 que possui propriedade de ligação dependente de pH ao hslL-6R. lsto demonstra que embora o aumento da afinidade de ligação ao FcRn humano em pH 7,0 seja eficiente para a redução da concentração de antígenos no plasma, a combinação de ligação ao antigeno dependente do pH e a maior afinidade de ligação ao FcRn humano em pH neutro aumenta significativamente a eliminação dos antígenos.

O estudo utilizando menor dose de Fv4-)gG1-F14 mostrava ain·- da que a 0,01 mg/kg, 1/100 de 1 mg/kg, reduzia a concentração de antíge- nos no plasma abaixo da linha de base demonstrando a eficiência significati- va da molécula de eliminar o antígeno do plasma.

Exemplo de referência 11 Comparação da linhagem de camun- dongo transgênica para FcRn humano 276 e a linhagem 32 no modelo de coadministração Estudos anteriores in vivo foram realizados utilizando a linhagem de camundongo transgênica para FcRn humano 276 (Jackson Laboratories). Com a finalidade de comparar a diferença entre a linhagem de camundongo 5 transgênica para FcRn humano 276 e uma linhagem transgênica diferente, linhagem 32, foi realizado um estudo de coadministração de H54/L28-lgG1, Fv4-lgG1 e Fv4-lgG1-v2 utilizando a linhagem de camundongo transgênica para FcRn humano 32 (B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg linhagem 32 +/+ camundon- go (B6.mFcRn-/- hFCRN Tg32; B6.Cg-Fcgrt<trn1 Dcr" Tg(FCGRT)32Dcr) (Jackson #4915)), Jackson Laboratories; Methods Mol Biol. (2010) 602: 93- 104). O método de estudo era o mesmo que aquele do Exemplo de referên- cia 3, mas a linhagem de camundongo transgênica para FcRn humano 32 foi utilizada ao invés da linhagem de camundongo transgênica para FcRn hu- mano 276. A Fig. 47 descreve o curso de tempo de concentração de hslL- 6R no plasma tanto na linhagem de camundongo transgênica para FcRn humano 276 quanto na linhagem 32. H54/l-28-lgG1, Fv4-lgG1 e Fv4-lgG1-v2 exibiam perfil de tempo de concentração similar de hslL-6R no plasma.

Em ambos os camundongos, o aumento da afinidade de ligação ao FcRn huma- no em pH 7,0 aumentava a eliminação dos antígenos do plasma (comparan- do Fv4-lgG1 e Fv4-lgG1-v2) até uma mesma extensão.

A Fig. 48 descreve o curso de tempo de concentração de anti- corpo no plasma tanto ria linhagem de camundongo transgênica para FcRn humano 276 quanto na linhagem 32. 1454/L28JgG1, Fv4-lgG1 e Fv4-lgG1-v2 exibiam perfil de tempo similar de concentração de anticorpo no plasma.

Em conclusão, nenhuma diferença significativa era observada entre a Íinhagem 276 e a linhagem 32, demonstrando que o variante Fc au- mentava a afinidade de ligação ao FcRn humano em pH 7,0 de forma efici- ente nas duas linhagens de camundongo transgênicas diferentes que ex- pressam FcRn humano para o aprimoramento de eliminação de concentra- ção de antígenos no plasma.

Exemplo de referência 12 Geração de várias variantes Fc de an-

ticorpo que possuem maior afinidade de ligação ao FcRn humano em pH neutro (12-1) Geração de variantes Fc Várias mutações para aumentar a afinidade de Iigação ao FcRn 5 humano sob pH neutro foram introduzidas no Fv4-lgG1 para aprimorar adi- cionalmente o perfil de eliminação dos antígenos.

Especificamente, as muta- ções de aminoácidos mostradas na Tabela 15, foram introduzidas dentro da região constante de cadeia pesada de Fv4-lgG1 para gerar variantes Fc (os números de aminoácidos dos sitios de mutação são descritos de acordo com 10 a numeração EU)- As substituições de aminoácidos foram introduzidas atra-

, vés do método conhecido pelos versados na técnica descrito no Exemplo de Referência 3. As variantes adicionais (IgG1-F1OO até IgG1-F1052) cada uma compreendendo uma cadeia pesada preparada e L (WT) (SEQ ID NO: 14) 15 foram expressos e purificados através de métodos conhecidos pelos versa- dos na técnica como descrito no Exemplo de Referência 3. (12-2) Avaliação de ligação ao FcRn humano A iigação entre o anticorpo e o FcRn humano foi analisada cine- ticamente como descrito no exemplo de referência 5 para lgG1-v1, lgG1-v2 e lgG1-F2 a lgG1-F1052 ou no exemplo de referência 9 para lgGl e M73- O resultado sobre a ligação ao FcRn humano sob uma condição neutra (pH 7,0) por Biacore é mostrado nas Tabelas 28-1 a 28-21.

Tabela 28-1 Vzmi"- 'O :M: Posição do aminoácido alterack .- = Fl l 8. ICE-Q? =s254TjT256E F2 3 20E-06 'F3 t 2 5ÕEJ6 Í N43àY " ' 1 F4 l 5. 80E-ci6 N434S F5 I 6. 8GE-06 ,N434A 5 60E-06 jhl252v F7 ' 4 20t"-06 ÍK?5:M" " _3 F2 F9 i I 40E-Q7 M252Y '$254T 7256E. N434Y —E FlO 6_ 90£-'í9 l M25ZY- S2547 '1256L..'N&?4A" —— ~ Fi! 3 !0E-Cl7 l e57"-'M34)' 7k F · " l [?ijÊ%7 |R52Y,?l434*' " __j .

::: ,,, l )- 3, 2(E^07 1 8Cy:-Q7 ! K252N-'?1434Y ! K!52H'. 434h" Fl9 i 4-KE-07 l P257L."N434Y

F F20 i 4. 6ÜEm' Ly308F N434Y t " I N252Y·"v"333P N43Á'í F2l 3.OCE-08

J | W'28LM34S 1 F22 l 2- (XÈ-06 ' R52Y, R541 T256E ·v3¥íp 'N43&' "" "i 9, 2QE-Q9 F?S i F26 i 1- OCE-06 F27 7 4|OE-0€ tâí~- ---—4 ' F29 , 1 40E-0Ê : 1332\/ M434Y i =7y.-'"y3.28F" ! F3i ! Z 80E-Q6 ] F32 l êl 0OÉ-OJ I $254T. H4yK l 2 3C€46 ' S254LN434Y ! F33 2 8CE 07 , T256E'N434K — i ::: Eitz i ! a 40E 07 3 6CE 07 i TzaEtN434Y I $?54T,-T256ErN434N ' ] i

F i $254T,-"T256EjN434Y : F37 i 1 1OE-J6 f38 i 1 OCE-Ü7 i H2S2Y,·S254T,'N43ÀW I ~

3.0OE-Q7 i M252Y-'S254T,'N434Y l ::: mi F 8. K'"-Ó8 1, 5QE-07 l m52YíT256E'N434w l N252Y,'T256EÍN434Y

I li F-Q ! L¢OE-Q'6 j M252Y.-'SZ54M256E.·N434A : l K52Y,'N434Á Fà3 \ 1 7C-E-O€ í 1OE-06 i R5M,.N434A F44 2 4gt-07 i u252Y,: T256CÍ "N434W '47 j i kl252Y,T256QFM34Y — m£ 3 20E-07 Fdg l 5 WE-Q7 l H252Fs"T256D 'N434N " "" ""! "F50 i 1 2CE-06 N=jr' t2"'6wn434y """ "i

8. 1QE--OE jN434F.!Y436H _ ' { F51 i !

A tabela 28-2 é a continuação da Tabela 28-1. Tabela 28-2

3. 1OE-06 H433K,/'N434F/'Y436H F52

1. OOE-06 1332V/N434N F53 8-40E-08 V308P/N434# F54

9. 40E-07 l332V/'M428L,/'N434Y F56

1.1OE-05 G385D/Q386P/N389S F57

7. 70E-07 G385D/'Q386P/N389S/'N434W F58

2. 40E-06 G385D/'Q386P/N389S/N434Y F59

1.1OE-05 G38"H F60 Ki 9. 70E-07 G385H,"N434W

1. 90E-06 G385H/N434Y F62 F63 2- 50E-06 N434F

5. 30E-06 N434H F64 F65 2- 90E-07 M252Y/'S254T/T256E,.'N434F

4.30E-07 M252Y/S254T/T256E/N434H F66

6. 30E-07 NI252Y/N434F F67

9. 30E-07 IÀ252Y/N434H F68 5-1OE-07 M428L/N434W F69

1. 50E-06 M428L,·'N434Y F70

8.30E-08 M252Y/S254T/T256E/M428L/N434W F71 Êii 2. OOE-07 M252Y/S254T/T256E/M428L/N434Y M252Y/M428L/N434H F73 1. 70E-07 m 4- 60F-07

1. 40E-06 i M252Y,/M428L,'N434Y M252Y,M428L/N434A F75

1. OOE-06 M252Y/S254T/T256E,'M428L/N434A F76 9- 90E-07 T256EM428L/N434Y F77

7.80E-07 S254T/M428L,/N434Y/ F78

5. 90E-06 S254T/T256E/N434A F79 R6 2. 70E-06 M252Y/T256Q/N434A

1. 60E-06 M252Y/T256E/N434A F81

1. 1OE-06 T256Q/N434W F82

2. 60E-06 T256Q./N434Y F83

2. 80E-07 M252W/T256Q/N434H F84

5. 50E-07 M252W/T256Q,'N434Y F85 1- 50E-06 S254T,/T256Q/N434W F86 4- 3(JE-06 S254T./T256Q/N434Y F87 1- 90E-07 M252Y,/S254T,'T256Q/N434W F88

3. 60E-07 M252Y,/"S254T./T256Q/'N434Y F89

1. 90E-08 M252Y,/T256E/V308P,'N434W F90

4. 80E-08 M252Y/'V308P,lN428L,"N4:34Y F91 M252Y,.'S2E}4T,'T256E,/"V308P,.'ld42àL,/ N434Y/ F92 1- 1OE-08

7. 40E-07 M252W,'IÁ428L,"N434¶ F93

3. 70E-07 P257L,'M428L,'N434Y F94

A tabela 28-3 é a continuação da tabela 28-2. Tabela 28-3 F95 2. 60E-07 M252Y/S254T/T256E/M428L,'N434F

F99 6 20E-07 IÀ252Y/T256E/N434H

F1O1 1. 1OE-07 M252N/T256Q,'P257L/N434Y

F103 4- 40E-08 P238A,'M252Y,'V308P,'N434Y

F104 3 70E-08 M252Y/D265A,'V308P/N434Y

F105 7. 50E-08 M252Y/T307A/V308P/N434Y

F106 3. 70E-08 M252Y/V303A/V308P/N434Y

F107 3- 40E-08 M252Y/V308P/D376A./N434Y

F108 4. 1OE-08 M252Y/V305A,'V308P/N434Y

NS 3. 20E-08 M252Y/V308P/Q311A/N434Y

F111 3. 20E-08 M252Y/V308P/K317A/N434Y

F112 6.40E-08 M252Y/V308P/E380A/N434Y

F113 3. 20E-08 M252Y/V308P,'E382A/N434Y

F114 3. 80E-08 M252Y/V308P,'S424A,/N434Y

F115 6. 60E-06 T307A/N434A

F116 8. 70E-06 I E380A/N434A F118 1- 40E-05 M428L

F119 5. 40E-06 T250Q,'I\1428L

F120 6- 30E-08 P257L/V308P,'H428L/'N434Y

F121 1. 50E-08 M252Y/T256E/"V308P,'M428L/'N434W

F122 1. 20E-07 R52Y/T256E,'H428L/N434W

F123 3.0OE 08 I M252Y/T256E/V308P/N434Y F124 Z 90E-07 M252Y/T256E,N428L/N434Y

F125 Z 40E-08 M252Y,'S254T,'T256E,'V308P/'M428!-,/'N434Y

F128 1. 70E-07 P257L,'M428L,'N434\V

F129 2. 20E-07 P257A/IÀ428L,'N434Y "Fl"31 3. OOE-06 P257G/IÁ428L,'N434Y

Fl32 2. 1OE-07 P257I/IÁ428L,'N434Y

F133 4. 1OE-07 P257M/IÁ428L,.'N434Y

F134 2. 70E-07 P257N/M428L/N434Y

F135 7. 50E-07 P257S,'M428L,"N434Y

Êni6 3. 80E-07 P257T/M428L,/N434Y

F137 4. 60E-07 P257V,'M428L.,'N434Y

F139 1. 50E-08 M252W/V308P/N434W

F140 3. 60E-08 S239K,'M252Y,'V308P/N434Y

F141 3- 50E-08 M252Y/S298G,'V308P,"N434Y

F142 3. 70E·-08 M252Y/D270F,'V308P/N434Y

F143 2. OOE-07 M252Y,'V308A/N434Y

F145 5. 30E-08 IÀ252Y,'V308F/N434Y

F147 2 40E-07 M252Y/V3081,"N434Y

Fi49 1. 90E-07 IÁ252Y/V308L/N434Y

F150 2. OOE-07 M252Y/V308NI/N434Y

A tabela 28-4 é a continuação da tabela 28-3.

[Tabela 28-4] F152 2. 70E-07 M252Y,'V308Q, N434Y F154 1. 80E-07 M252Y,'V30QT,f"N434Y F157 1. 50E-07 P257A,·'V308P,M428L, N434r F158 5. 90E-08 P257T,"V?)D8P,/"M428] ,/N434Y F159 4- 40E-08 P257V,/'V308P,r'M428L,/'N434Y F160 8. 50E-07 |d252N,'M4"28[,/"N434Y " F162 1. 60E-07 |\k252!|\t'h|428Y,'N434Y F163 4. 20E-07 M252W,'M428F/N434Y F164 3.70E-07 P238A/N252H/N434Y F165 2. 90E-07 M252W/D265A/N434Y F166 1. 50E-07 M252WT307Q/N434Y F167 2- 90E-07 M252WV303A/N434Y F168 3. 20E-07 M252W/'D376A/N434Y F169 2. 90E-07 M252N/V305A/N434Y F170 1. 70E-07 ld252W,'Q311A,/'N434Y F171 1. 90E-07 M252W/D312A/N434Y F172 2. 20E-07 M252W,'K317A,'N434Y F173 7.70E-07 %252W/E380A/N434Y F174 3. 40E-07 M252N/E382A,ÍN434Y F175 2. 70E-07 M252W/S424A,.'N434Y F176 2. 90E-07 S239K/M252W/N434Y F177 2. 80E-07 I M252W/S298G/N434Y F178 2. 70E-07 M252W/D270F/N434Y F179 3.1OE-07 M252W,'N325G/N434Y Fi82 6. 60E-08 P257A/N428L,/N434¶ FÚ13 2. 20E-07 P257T,'N428L/N434W F184 2. 70E-07 P257V/M428L/N434W = 2- 60E-07 M252W/1332V,"N434Y F188 3. OOE-06 P257I/Q311I F189 1. 90E-07 M252Y,'T307A/N434Y F190 1- 1OE-07 M252Y/T307Q/N434Y "F191 1. 60E-07 P257L/T307A/M428L/N434Y F192 1-1OE-07 P257A/T307A,'M428L/N434Y F193 8. 50E-08 P257T/T307A/M428L/N434Y F194 1- 20E-07 P257V,'T307A/M428L,/N434Y F195 5- 60E-08 P257L/T3D7Q/M428L,'N434Y F196 3. 50E-08 P257A/T307Q/'M428L/N434Y F197 3- 30E-08 P257T/T307Q/M428L,'N434Y n9ã 4- 80E-08 P257V/T307Q/M428L/N434Y F201 2. 1OE-07 M252Y/T307D/N434Y F203 2- 40E-07 M252Y/T307F/N434Y F204 2.1OE-07 M252Y/T307G,/N434Y

A tabela 28-5 é a continuação da tabela 28-4.

[Tabela 28-5] F205 2. OOE-07 R252Y/T307H/N434Y F206 2. 30E-07 M252Y/T30JI/N434Y F207 9. 40E-07 M252Y/T307K,'N434Y F208 3. 90E-07 M252Y/T307L,'N434Y F209 1. 30E-07 M252Y/T307N,'N434Y F210 2. 90E-07 M252Y/T307N,'N434Y F211 2. 40E-07 M252Y/T307P,'N434Y F212 6. 80E-07 M252Y/T307R,'N434Y F213 2- 30E-07 M252Y/T307S,'N434Y F214 1. 70E-07 M252Y/T307V,'N434Y F215 9. 60E-08 M252Y/T307W/N434Y F216 2. 30E-07 M252Y/T307Y,/N434Y F217 2. 30E-07 M252Y/K334L,'N434Y F218 2. 60E-07 N252Y/G385H,'N434Y F219 2. 50E-07 M252Y/T289H/N434Y F220 2. 50E-07 M252Y/Q311H,"N434Y F221 3. 1OE-07 M252Y/D312H,'N434Y F222 3. 40E-07 M252Y/N315H/N434Y nzi 2- 70E-07

1. 50E-06 M252Y/K360H,'N434Y N252Y/L314R/N434Y F225 F226 5. 40E-07 R52Y,'L314K/N434Y F227 1 20E-07 | M252Y/N286F/N434Y F228 2. 30E-07 M252Y/L309E,'N434Y F229 5. 1OE-07 M252Y/R255E,'N434Y F230 2. 50E-07 R52Y/P387E/N434Y F236 8. 90E-07 K248I,'M428L,'N434Y F237 2. 30E-07 M252Y/M428A/N434Y F238 7.40E-07 M252Y/N428D,'N434Y F240 7. 20E-07 W52Y/M428F/N434Y F241 1. 50E-06 M252Y/M428G/N434Y F242 8. 50E-07 M252Y/M428H,'N434Y F243 1. 80E-07 M252Y/M428I/N434Y F244 1-30E-06 1&252Y/M428K/N434Y F245 4-70E-07 M252Y/M428N/N434Y F246 1. 1OE-06 R52Y/M428P,'N434Y F247 4. 40E-07 M252Y/M4280,'N434Y ÊAS 6. 40E-07 M252Y/M428S/N434Y ns 2. 90E-07

1. 90E-07 M252Y/M428T,'N434Y M252Y,N428V,'N434Y F251 F252 1. OOE-06 K252Y/M428W,'N4.34Y F253 7-1OE-07 N252ÜM4'28Y,,'N434Y F254 '7- 50E-08 M252Yí,/'T30"}Q,.r'M428y,/'N434't A tabela 28-6 é a continuação da tabeia 28-5. »

[Tabela 28-6] f255 1. 1OE-07 M252w,,/'Q311A,,,p'|Â4?8y/'N434j' f256 5. 40E-08 M252W,'T307Q/Q311A,,'M428Y,'"N434Y f257 5. OOE-07 M252Y/T307A,"M428Y,/N434Y f258 3. 20E-07 M252\',/"T307Q,/fÁ428Y,/'N434'[' f259 2. 80E-07 M252Y,"D270F,'N434Y i'ã6 1.30E-07 M252Y,"T307A,'Q31 1 A/N434Y f261 8. 40E-08 M252Y,"Tã"07Q,/'Q31 1A/N434Y f262 1. 90E-07 M252Y/T307A/Q311H/N434Y f263 ]. 1OE-07 M252Y,/T307Q/'Q311H./N434Y f264 2. 80E-07 M252Y/E382A/N434Y f265 6- 80E-07 M252Y/E382A,¶428Y/N434Y f266 4 70E-07 M252Y/T307A/E382A/M428Y/N434Y R67 3.20E-07 M252Y/T307Q,'E382A/M428Y,"N434Y f268 6 30E-07 P238A/M252Y,'M428F/N434Y f269 5. 20E-07 M252Y/V305A,'M428F/N434Y "F2ÍO 6. 60E-07 M252Y/N325G,'M428F,'N434Y f271 6. 90E-07 M252Y,'D376A,'M428F/N434Y f272 6.80E-07 M252Y/E380A/M428F/N434Y f273 6.50E-07 M252Y,,'E382A/M428F/N434Y f274 7. 60E-07 M252Y/E380A/E382A/M428F,'N434Y f275 4. 20E-08 S239K,'M252Y/V308P/E382A/N434Y f2/6 4 IOE 08 M252Y/D270F/V308P/E382A/N434Y f277 1.30E-07 S239K/M252Y/V308P/M428Y,"N434Y f278 3. OOE-08 M252y/T307Q/y308p,/E382A,"N434y f279 6. 1OE-08 M252Y/V308P,'Q311H/E382A/N434Y f280 4. 1OE-08 S239K/M252Y/D270F/V308P/N434Y f2b1 9. 20E-08 M252Y/v308p/E382A/M428r,/N434Y f282 2.90E-08 M252Y,'V308P/E382A/M428L/N434Y nsí 1. OOE-07

1. OOE-07 M252Y,'V308P/E382A/M428Y/N434Y M252Y,/V308P,'M428Y/N434Y f284 f285 9. 90E-08 M252Y/V308P/M428F/N434Y f2Íi6 1. 20E-07 S239K/M252Y/V308P/E382A/M428Y/N434Y f287 1.OOE-07 M252Y/V308P/E380A/E382A/M428F/N434Y f288 1. 90E-07 M252Y/T256E/E382A/N434Y f2b9 4. 80E-D) M252Y/'T256E/.M428y,/'N434y f290 4. 60E-07 M252Y,'T256E/E382A/M428Y/N434Y f292 2. 30E-08 S239K/M252Y/V308P,'E382A/M428I/N434Y f293 5. 30E-08 M252Y/V308P,'E380A/E382A,'M428I/N434Y f294 1- 1OE-07 S239K/M252Y/V308P/M428F/N434Y f295 6 80E-07 S239K/M252Y,'E380A/E382A/M428F/N434Y f296 4 90E-07 M252Y/Q311A/ld428Y/N434Y f297 5. 1OE-07 X252Y,/D312A/M428Y/N434Y A tabela 28-7 é a continuação da tabela 28-6.

[Tabela 28-7] f298 4. 80E-07 M252y/Q311A./'D312A,/M428Y/N434y f299 9. 40E-08 S239K/M252Y/V308P,'Q311h"hl428Y/N434Y f300 8. 30E-08 S239K,"M252Y/'V308P,/D312A/M428Y/N434Y nõi 7. 20E-08

1. 90E-07 S239K/M252Y/V308P,'Q31 IA/D312A,'M428Y/N434Y M252Y,'T256E/T307P/N434Y f302 f303 6. 70E-07 M252Y/T307P/M428Y/'N434Y f304 1. 60E-08 M252W,'V308P/M428Y/N434Y f305 2. 70E-08 M252Y,"T256E,'v308p/E382A.í'N434Y f306 3-60E-08 M252W,'V308P/E382A/N434Y f307 3. 60E-08 S239K/M252W/V308P/E382A/N434Y i'ã® 1 90E-08

9. 40E-08 S239K/M252W/V308P/E382A,'M428Y/N434Y S239K,'M252W/V308P/E382A,M428I/N434Y f310 ÊSii 2. 80E-08 S239K/M252W/V308P/'M428F/N434Y f312 4. 50E-07 S239K/M252W,'E380A/E382A,M428F/N434Y f313 6. 50E-07 S239K/M252Y/T307P/M428Y/N434Y f314 3. 20E-07 M252Y/T256E/Q311A,'D312A/M428Y/N434Y f315 6. 80E-07 S239K/M252Y/M428Y/N434Y f316 ). OOE-07 S239K,'M252Y/'D270F,"M428Y/'N434Y f317 1. 1OE-07 S239K,'M252Y,'D27DF/V308P/M428Y/N434Y f318 1. 80E-08 S239K,'M252Y,/V308P/'!Â428I/N434Y 'Ê320 2. OOE-08 S239K/M252Y/V308P/N325G/E382A/M4281,'N434Y f321 3- 20E-08 s239K/M252Y/D270F,'v308pi'N325g/N434Y f322 9- 20E-08 S239K/M252Y/D270F/T307P/V308P/N434Y f323 2. 70E-08 S239K/M252Y/T256E/D270F,'V308P/N434Y f324 2. 80E-08 S239K/M252Y/D270F/T307Q/V308P,'N434Y f325 2. 1OE-08 S239K/M252Y/D270F/T307Q/V308P/Q311A/N4MY f326 7, 50E-08 S239K/M252Y/D270F/T307Q/Q311A/N434Y f327 6. 50E-08 S239K/'M252Y/T256E/D270F,/'T307Q/Q311A/N434Y f328 1. 90E-08 S239K/M252Y/D270F/V308P/M428I/N434Y f329 1. 20E-08 S239K,'M252Y/D270F/N286E,/V308P,'N434Y f330 3. 60E-08 S239K,'M252Y,,'D270F,/V308P,f'L309E/'N434Y f331 3. OOE-08 S239K/M252Y/D270F,/V308P/P387E/N434Y 'ÊiiS 7 40E-08 S239K/lR52Y/D270F/T307QiL309E./Q311A/N434Y f334 1. 90E-08 S239K/M252Y,'D270F/V3Ó8P/N325G,'M4281,'N434Y f335 1. 50E-08 S239K/M252Y,'T256E,'D270F/V308P/M428I/N434Y f336 1. 40E-08 S239K,/M252Y/'D270F/T307Q/V308P/'Q311A/M4281,'N434Y f33j 5. 60E-08 S239K/M252Y/D270F,'T3O7Q/Q311A/M428l,'N434Y f338 7. 70E-09 s239K/'M2.K2Y/'D270F/lq286E/v308p,/'M428[,'N434Y G39 1. 90E-08 S239K/M252Y/D270F/V308P/L309E/K428I/N434Y f343 3. 20E-08 S239K/M252Y/D270F,/'V308P/'M428L/'N434Y f344 3. OOE-08 S239K./M252Y/V308P/M428L/N434Y f349 1. 50E-07 S239K,'M252Y/V308P/L309P/M428L/N434Y A tabela 28-8 é a continuação da tabela 28-7.

[Tabela 28-8] 1'. 70E-07 S239K/M252Y/V308P,'L309R/M428L/N434Y f350 f35Z 6. OOE-07 S239K/M252Y,'L309P/M428L,'N434Y f353 1. 1OE-06 s239K/'M252y,/L309R,Í'M28L,/'N434Y f354 2.80E-08 S239K/M252Y/T307Q/V308P/M428L,'N434Y f356 3.40E-08 S239K/M252Y/D270F/V308P/L309E,'P387E,/N434Y 'i'í9 1. 60E-08 S239K,'M252Y/T256E/D270F/V308P/N325G/M4281/N434Y f358 1. OOE-07 S239K/M252Y/T307Q/N434Y f359 4. 20E-07 P257V,'T307Q/M428I/N434Y f360 1.30E-06 P257V/T307Q,AÀ428V/N434Y f362 5. 4DE-08 P257V,'T307Q/N325G/M428L/N434Y F36ã 4. 1OE-08 P257V/T307Q/Q311A/M28L,'N434Y

3.50E-08 P257V/T307Q/Q311A,'N325G/N428L/N434Y f364

5. 1OE-08 P257V,'V305A/T307Q/M428L/N434Y f365

1. 50E-08 S239K/M252Y,'E258H/'D270F,"T307Q,'V308P/Q311A,'N434Y f367

2. OOE-08 S239K,,'"M252.'/,"D270F,/V308P,"N325G,'E382A/M428I/N434Y f368 f369 7- 50E-08 M252Y,,/'P257V/T3070,/'M428[/'N434Y f372 1. 30E-08 S239K,"M252'W,."V308P,/ld428"Y,'N434Y f373 1. 1OE-08 S239K,l'M252W,."V308P,/'C}3|1A/'M428Y/N434Y f374 1-20E-08 S239K!M252H'T256E,'V308P,,"M428Y/N434Y f375 5.50E-09 S239K,'M252.W,'N286E,"V308P,/'M428Y/'N434Y F3ÍÉ 9. 60E-09 S23gK,'M252Y,/T2'6E,"D270r,r'N286E/V308P/N434Y f377 1- 30E-07 | S239K.'M252W/T307P,'IK428Y,'N434Y f379 9.0OE-09 s239K,'M252w/'T256E/v308p/Q311A,'u28Y/N434Y f380 5. 60E-09 S239K/M252W/T256E/N286E/V308P/M428Y/N434Y f381 1. 1OE-07 P257V/T307A,'Q311A,/'M428L,'N434Y f382 8- 70E-08 P257V,'V305A/T307A./M428L/N434Y f386 3-20E-08 N252Y,'V308P/L309E,.'N434Y f387 1.50E-07 M252Y,'V308P/L309D/N434Y f388 7. OOE-08 M252Y/V308P,'L309A/N434Y f389 1. 70E-08 M252W/V308P/L309E/M428Y,"N434Y f390 6.80E-08 M252W/V308P/L309D/M428Y/N434Y f391 3. 60E-08 N252W/V308P/L309A,'M428Y/N434Y f392 6. 90E-09 s239K,'M252Y,"N286E,/'v308p,'M428i,"N434Y f393 1. 20E-08 S239K,'M252Y/N286E/V308P,'N434Y f394 5. 30E-08 S239K,'M252Y/'T307Q/Q311A,'M428I,'N434Y f395 2- 40E-08 S239K,/M252Y/'T256E/'V308P/'N434Y f396 2. OOE-08 S239K,'M252Y,/'D270F/N286E,'T307Q,"Q311A,'M428],"N434Y f397 4. 50E-08 s239K,'M252Y/'D270F,i'T307Q,'Q311A,"p387E,/M428],'N434Y W8' 4. 40E-09 S239K,'M252Y,/D270F,'N286E,'T307Q/V.308P/Q311A/M428Í/N4 34Y f399 6.50E-09 S239K,'M252Y/D270F/N286E/T307Q,'V308P/M428I/N434Y fÀÕÕ 6- 1OE-09 S239K,'M252Y/D27CF/N286E,'V308P,'Q311A/M428l/N434Y A tabela 28-9 é a continuação da tabela 28-8.

Tabela 28-9 f401 6. 90E-09 S239K/M252Y/D270F/N286E/V308P/P387E/K428I/N434Y f402 2.30E-08 P257V/T307Q,'M428L/N434W i f403 5. 1OE-08 P257V,"T307A/M428L,/N434W

I KN 9. 40E-08 P257A,'T307Q/L309P/M428L,'N434Y

I f405 1.70E-07 P257V/T307Q/L309P/M428L/N434Y

I f406 1. 50E-07 P257A/T307Q/L309R/M428L/N434Y ) f407 1. 60E-07 P257V/T307Q/L309R,'M428L,/N434Y ) f408 2- 50E-07 P25JV/N286E,'M428L/N434Y l f409 2. OOE-07 P257V/P387E,"M428L/N434Y i f410 2. 20E-07 P257V/T307H/M428L/N434Y ! f411 1. 30E-07 I P257V/T307N/IÀ428L,"N434Y f412 8. 80E-08 P257V/T307G/M428L/N434Y

I f413 1 20E-07 P257V/T307P/M428L/N434Y

I f41Ã 1. 1OE-07 P257V,'T307S/M428L/N434Y i f415 5. 60E-08 P257V/N286E/T307A,/M428L/'N434Y

I f416 9.40E-08 P257\',°T307A,/'F387E,/'M428LiN434Y

I

6. 20E-07 S239K/'N252Y/'T307P,'N325G,,/'M,428Y/N434Y : f418 f419 1- 60E-07 M252Y,'T30/A, | Q311H,,/'K360H/'N434Y RÍ20 1 50E-07 M252Y/"T307A,/'Q311H,t"P387E./'N434Y | f421 1. 30E-07 M252)'/"T307A,'Q311F!,í"M428A,f'lq434Y | f422 1. 80E-07 g252Y,m07A,'Q311H/'E382A,/'N434Y

I f423 840E08 |I M252Y/T307W,'Q311F!,'N434Y f424 9.40E-08 : S239K,'P257A,"V308P,'M428LIN434Y f425 8. OOE-08 P257A,'V308P/L309E,N428L/N434Y

I f426 8. 40E-08 P257V,'T307Q/N434Y

I f427 ]- 1OE-07 M252Y,"P257V/T307Q,'M428V/N434Y

I f428 8. OOE-08 M252Y/P257V/T307Q/M428L/N434Y | f429 3. 70E-08 M252Y/P257V/T307Q/N434Y

I f430 8. 1OE-08 M252Y,'P257V,'T307Q,'M428Y,.'N434Y i f431 6. 50E-08 M252Y/P257V/T307Q,N428F/N434Y l Ê4Ü' 9. 20E-07 P257V/T307Q/Q311A/N325G/M428V/N434Y

I f433 6. OOE-08 P257V/T307Q/Q311A/N325G/N434Y | f434 2. OOE-08 p257v,/T307Q/Q311A/N325g/M428y/N434y

I "F4Ü 2. 50E-08 P257V/T307Q,'Q311A/N325G/M428F/N434Y

I f436 Z 50E-07 P257A,/T307Q/M428V/N434Y l f437 5. 70E-08 P257A/T307Q/N434Y

I f438 3. 60E-08 P257A/T307Q/M428Y/N434Y | f439 4. OOE-08 P257A/T307Q,'H428F/N434Y ! f440 1. 50E-08 P257V/N286E/T3Q7Q/Q311A/N325G/M428L/N434Y

I f441 1. 80E-07 P257A/Q311A.N428L/N434Y : f442 2. OOE-07 P257A,'Q311H,'H428L/'N434Y ! f443 5. 50E-08 P257A/'T307Q,"Q31 i 1A/M428L/N434Y A tabela 28-10 é a continuação da tabela 28-9.

[Tabela 28-10]

f444 1- 4DE-07 P257A/T307A,/'0311A/'M428L,'N434Y f445 6. 20E-08 p257A/T307Qi'Q311H/M428L,'N434Y

TÃ 1. 1OE-07 P257A/T307A/Q311H,'M428L/N434Y f447 1. 40E-08 P257A/N286E,/T307Q/'M428L/N434Y f448 5.30E-08 P257A/N286E/T307A,'M428L/N434Y f449 5. 70E-07 S239K/M252Y/D270F/T307P/N325G/M428Y/N434Y f450 5.20E-07 S239K/M252Y/T307P/L309E/N325G,'M428Y/N434Y f451 1. OOE-OJ P257S/'T307A,/M428L/'N434Y f452 1- 40E-07 P257N/T307A,N428L/N434Y

ÍÈÃS 7.80E-08 P257N/T307A/N428L,/N434Y f454 9.60E-08 P257[/T307A,/N428L/'N434Y f455 2 70E-08 P257V/T307Q,N428Y/N434Y f456 3. 40E-08 p257v/T307Q/M428F,i'N434Y f457 4. OOE-08 S239K/'P25/V,/V308P/'M428L/N434Y f458 1-50E-08 P257V/T307Q,/V308P/'N325G/M428L/'N434Y f459 1. 30E-08 P257V/T307Q/V308P/Q311A/N325G/M428L/N434Y f460 4. 70E-08 P257V,'T307A,/V308P/'N325G/M428L/N434Y

ÁEZ 8. 50E-08 P257A/V308P/N325G/M428L,'N434Y f463 1.30E--07 P257A/T307A/V308P/M428L/N434Y f464 5.50E-08 P257A/T307Q,/'V308P/'M428L/N434Y f465 2. 1OE-08 P257V/N286E,/'T307Q/'N325G/M428L,'N434Y f466 3. 50E 07 I T256E/P257V/N434Y f467 5. 70E-07 T256E/P257T/N434Y f468 5- 70E-08 S239K/P257T/V308P/M428L/N434Y

RÕ 5. 60E-08 P257T/V308P/N325G,M428L/N434Y f470 5. 40E-08 T256E/P257T,/V308P/'N325G/M428L/'N434Y A71" 6. 60E-08 P257T/V308P,/N325G/E382A/M428L/N434Y

ÊÃ5Z 5. 40E-08 P257T/V308P/N325G/P387E/M428L/N434Y f473 4. 50E-07 P257T/'V308P,/L309P,/'N325G,/M428L,/N434Y f474 3.50E-07 P257T/V308P,/L309R/'N325G,'M428L/'N434Y f475 4. 30E-08 T256E/P257V/T3070/M428L/N434Y f476 5. 50E-08 p257v/T307Q,/'E382A/'M428L,/N434y

ÊTT 4. 30E-08 p257v/T307Q,/'p387E/'M428L/N434y f480 3. 90E-08 P257L/V308P,/N434Y f481 5. 60E-08 P257T/T307Q/N434Y rin 7- OOE-08 P257V/T307Q/N325G/N434Y

X8Í 5. 70E-08 P257V/T307Q/'Q311A/N434Y f484 6 20E-08 P257V/V305A/'T307Q/N434Y f485 9. 70E-08 P257V/N286E/T307A/N434Y

Á8É 3. 40E-07 P257V/T307Q/L309R/Q311H/M428L/N434Y f488 3- 50E-08 P257V/V308P/N325G/M428L/N434Y f490 7. 50E-08 s239K/p257y,/v3D8p/Q311H/M428L/N434y

A tabela 28-11 é a continuação da tabela 28-10.

[Tabela 28-11]

f492 9 80E-08 P257V./'V305A/T307A/'N325G,/M428L/N434Y

R9ii 4, 90E-07 S239K,/D270F/T307P/N325G,'M428Y/N434Y f497 3 1OE-06 P257T/T307A/M428V/N434Y f498 1. 30E-06 P257A/9428V/N434Y f499 5. 20E-07 P257A/T307A/M428V/N434Y f500 4 30E-08 P257S/T307Q/M428L/N434Y f506 1 90E-07 P257V/N297A/T307Q/M428L,'N434Y f507 5. 1OE-08 P257V/'N286A/T307Q/M428L/N434Y f508 1 1OE-07 P257V/T307Q/N315A/M428L/N434Y f509 5. 80E-08 P257V/T307Q/N384A/M428L/N434Y f510 5 30E-08 P257V/"T307Q/N389A/M428L,'N434Y f511 4. 20E-07 P257V/N434Y 'f512 5 80E-07 P257T/'N434Y f517 3 1OE-07 P257VI'N286E/N434Y f518 4 20E-07 P257T/N286E/N434Y f519 2. 60E-08 p257v/N286E/T307Qi'N434Y f521 1. 1OE-08 P257V/'N286E/T307Q,/'M428Y/N434Y f523 2. 60E-08 P257V/'V305A/'T307Q/'M428Y,'N434Y

TS 1 90E-08 P257T/T307Q/M428Y/N434Y

E2Í 9, 40E-09 P257V/'T307Q/V308P/N325G/M428Y/N434Y f529 2 50E-08 P257T/'T307Q/'M428F/'N434Y f533 1 20E 08 i P257A/'N286E,/T307Q/M428F/N434Y f534 1. 20E-08 P257A 'N286Ê/ T307Q/M428Y,'N434Y

ÊSS 3 90E-08 T250A,/P257V,'T307Q/M428L,"N434Y f538 9. 90E-08 T250F,/"P257V,/'T307Q/'M428L,'"N434Y f541 6, OOE-08 T250I,/P257V,/"T307Q/'M428L,'N434Y f544 3, 1OE-08 T2S0b|,/"P257V,"T307Q/'M428L/'N434Y f549 5 40E-08 T250S,/"P257V,r"T307Q./"M428L,.'N434Y f550 5 90E-08 T250V /'P257'J,|"T307Q,/"M428L,r'N434Y f551 1 20E-07 T250\y,"p257v,/'T307Q,{'M4?8L,'N434Y

ÊSi 1. 1OE-07 T250Y/'P257V,"T307Q/'M428L,'N434Y f553 1 70E-07 M252Y/Q311A/N434Y f554 2. 80E-08 s239K/'µ252Y/'s254T/'v308p/N434y f556 1 50E-06 M252Y/T307Q,/Q311A f559 8, OOE-08 M252Y/S254T,"NZ86E,'N434Y

1"560 2. 80E-08 M252Y,'S254T,'V308P/N434Y f561 1 40E-07 M252Y/S254T,'T307A,'N434Y f562 8, 30E-08 M252Y/'s254T/'T307Q/'N434y f563 1, 30E-07 M252Y,/S254T/Q311A,'N434Y f564 1. 90E-07 M252Y/'S254T/Q311H/N434Y

Ê5g 9 20E-08 M252Y,/S254T/T307A/Q311A/N434Y f566 6- 1OE-08 M252Y/S254T,'T307Q/Q311A/N434Y

A tabela 28-12 é a continuação da tabela 28-11.

[Tabela 28-12] F567 2. 20E-07 M252Y,'S2')4T,"M428!,/"N434Y F568 1. 1OE-07 M252Y/'T256E/'T307A/'Q311H,/'N434Y Êsã 2. OOE-07 M252Y,/"T256(j,/'T3Ü7A,"Q311|q,,'N434Y F570 1. 30E-07 M252Y/S254T,'T307A,"Q311H/N434Y "fSií 8.IOE-08 M252Yl'N286E./'T307A, Q31iH,"N434Y F572 1. OOE-07 M252Y /'T307A/'Q31 1H,'M4281/N434Y F576 1. 60E-06 M252Y, T256E/'T307Q,0"Q311F| Fsii 1. 30E-06 M252Y/N286E,'T307Á/Q311A F578 5. 70E-07 M252Y/N286E/T307Q,'Q311A F580 8. 60E-07 M252Y/N286E/T307Q,'Q311H F581 7. 20E-08 M252Y/T256E,'N286E,'N434Y F582 7. 50E-07 S239K,'°M252Y/V308P F583 7. 80E-07 S239K/M2S2Y,'V308P,'E382A F584 6. 30E-07 S239K,'M252Y/T256E,'V308P F585 2. 90E-07 S239K/'M252Y/N286E/V308P F586 1. 40E-07 S239K/M252Y,'N286E/V308P/M428I F587 1. 90E-07 M252Y,/N286E,/M428L,'N434Y E@" 2. OOE-07 M252Y/s254Tt'E382A,'N434Y F593 3 1OE-08 S239K,"M252Y,/'S254T,/'V308P/M428I/'N434Y F594 1- 60E-08 S239K,/M252Y,/"T256E,'V308P,'M428I,'N434Y F595 1. 80E-07 S239K/M252Y/M4281,'N434Y ÊS9S 4 OOE-07 ! M252Y/D312A,'E382A,'M428Y,'N434Y F597 2. 20E-07 M252Y/E382A/P387E/N434Y F598 1. 40E-07 M252Y,/"D312A/'P387E,'N434Y F599 5. 20E-07 M252Y,,'P387E 'M428Y,"N434Y F600 2 80E-07 M252Y/T256Q/E382A,'N434Y F601 9. 60E-09 M252Y,'N286E/V308P/N434Y F608 G236A/'S239D/'[332E F61i 2. 80E-07 M252Y/V305T/T307P/V308Í/L309A/N434Y F612 3 60E-07 M252Y,"T30)p/v30g] ,/! 309A,'N434Y F613 S239D,/'A330L,'I332E S239D,f'|(326Drr'L328Y F616 7 40E-07 S239K./N434!N F617

6. 40E-07 S239K,"V308F,'N434Y F618

3.1OE-07 S239K"|¶252Y/'N434Y F619

2. 1OE-07 S239KiM2.52Y/"S254T./'N434Y F620

1. 50E-07 S239K,r'M252Y,/'T307A,"Q311'H,/'"N434Y F621 F622 3. 50E-07 S239K,/ M252Y/T256Q,'N434Y F623 1. 80E-07 S239K/M252W/N434W F624 1. 40E-08 S239K/'P257A,/N286E/T307Q,/M428L/N434Y F625 7. 60E-08 s239Kip257A/Tj07Q,'M428L/N434Y F626 1 30E-06 V308P Atabela 28-13 é a continuação da tabela 28-12.

[Tabela 28-13] f629 3. 90E-08 M252Y,/V279L/V308P/N434Y f630 3. 70E-08 S239K,/M252Y/V279L,/V308P/N434Y f633 2. 40E-08 M252Y/V282D/V308P/N434Y f634 3. 20E-D8 S239K/M252Y/V282D/V308P/'N434Y f635 4- 50E-08 M252Y,/V284K/V308P/N434Y F63G 4-80E-08 S239K,/M252Y/V284K,/V308P/N434Y

Ríi 1. 50E-07 M252Y,'K288S/V308P/N434Y f638 1. 40E-07 S239K,'M252Y/K288S/V308P/N434Y f639" 2. 70E-D8 M252Y/V308P/G385R/N434Y f640 3. 60E-D8 S239K/M252Y/V308P/G385R/N434Y i'aí 3. OOE-08 M252Y,/V308P/Q386K/N434Y È642 3. OOE-D8 S239K/M252Y/V308P,/Q386K/N434Y f643 3. 20E--D8 L235G,/G236R/S239K/M252Y/V308P/N434Y f644 3. OOE-08 G236R,/S239K/M252Y/V308P/N434Y f645 3. 30E-08 S239K/M252Y/'V308P/'L328R,/'N434Y f646 3.80E-D8 S239K..'M252Y,/N297A,'V308P,"N434Y f647 2.90E-08 P238D,N252Y,,'V308P,'N434Y f648 P238D f649 1. 2QE-07 S239K,,'M252Y,'N286ÜN434Y f650 1. 70E-07 s239K,/M252Y,t"T256E,'N434Y F65i' 1. 80E-07 S239K/M2"2Y/Q311A/N434Y —

f652 2. 40E-07 ] P238D 'M252Y,"N434Y f654 3- 20E-08 L235K,/S239K/M252Y/V308P/N434Y f655 3. 40E-08 L235R,/S239K,'M252Y/'V308P/'N434Y F5É 3. 30E-08 G237K/S239K/M252Y/V308P/'N434Y f657 3.20E-08 G237R,"S239K,/'M252Y/V308P/'N434Y f658 3. 20E-D8 P238K,'S239K/M252Y/V308P,/N434Y f659 3. OOE-D8 P238R,/'S239K,.'M252Y,/V308P,'N434Y f660 3. 1OE-08 s239K/'M252Y,/'v308p,/p32g|(/N434Y f661 3. 40E-Cl8 S239K,/M252Y/V308P/P329R/N434Y f663 6. 40E-09 S239K/M252Y/'N286E/T307Q/'V308P/Q311A,'N434Y f664 3. 90E-08 M252Y/N286A/V308P/N434Y f665 2. OOE-08 M252Y,/N286D/V308P/N434Y f666 2. 1OE-D8 M252Y,/N286F/V308P,/N434Y f667 3. OOE-D8 M252Y,'N286G/V308P/N434Y f668 4. OOE-D8 !d252Y/N286H/'v308p/N434y f669 3. 50E-D8 M252Y,,'N286I/V308P/N434Y f"6jo 2. 1OE-07 M252Y/N286K,"V308P,'N434Y Ê6j'1' 2. 20E-D8 M252Y/"N286L,/"V308P/'N434Y f672 2 4QE-08 M252Y/'h286|dM08pj5jÁ34Y " "

f673 2. 30E-D8 M252Y/|Y286P/'V308P,/'N434Y — f674 3- 20E-08 M252Y/N286Q,."V308P,'N434Y

A tabela 28-14 é a continuação da tabela 28-13.

[Tabela 28-14]

F675 5. 1OE-08 M252Y/N286R/V308P,'N434Y

F676 3. 20E-08 M252Y,'N286S/V308P/N434Y

F677 4. 70E-08 M252Y/N286T/V308P,'N434Y

F678 3. 30E-08 M252Y/N286V/V308P,'N434Y "

F679 1. 70E-08 M252Y/N286W,/V308P/N434Y

F680 1, 50E-08 M252Y/N286Y/V308P/N434Y

F681 4.90E-08 M252Y/K288A/V308P/N434Y

F682 8. 20E-08 N1252Y/K288D/V308P/N434Y

F683 5. OOE-08 M252Y,/K288E/V308P/N434Y

F684 5.1OE-08 M252Y/K288F/V308P,'N434Y

F685 5. 30E-08 M252Y/K288G/V308P,'N434Y

F686 4 60E-08 M252Y/K288H,/V308P,/N434Y

F687 4 90E-08 M252Y/K2881/V308P/N434Y

F688 2. 80E-08 M252Y/K288L/V308P/N434Y

F689 4. 1OE-08 M252Y/K288M/V308P,'N434Y

F690 1. OOE-07 M252Y/K288N/V308P/N434Y

F691 3.20E-07 M252Y/K288P/V308P,'N434Y

F692 3. 90E-08 M252Y/K288Q/V308P,'N434Y

F693 3. 60E-08 N252Y/K288R/V308P,'N434Y

"m 4.70E-08 4, OOE-08 M252Y/K288V/V308P/N434Y IQ252Y,'K288W/V308P,'N434Y F695 F696 4- 40E-08 I M252Y/K288Y/V308P,'N434Y

F697 3 1OE-08 S239K/M252Y/V308P/N325G/N434Y

F698 2- 20E-08 M252Y/N286E/T307Q,'Q311A,'N434Y

F699 2. 30E-08 S239K/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N434Y

F700 5. 20E-08 M252Y/'V308P/L328E,'N434Y

F705 7. 1OE-09 M252Y/N286E/V308P/M428I/N434Y

F706 1. 80E-08 M252Y/N286E/T307Q,'Q311A/M428I/N434Y

F707 5.90E-09 M252Y/N286E/T307Q,"V308P/Q311A/N434Y

F708 4. 1OE-09 M252Y/N286E/T307Q,'V308P/Q311A/M428I/N434Y

F709 2. OOE-08 S239K/M252Y,'N286E/T307Q/Q311A/M428I/N434Y

F710 1. 50E-08 P238D/M252Y,/N286E,'T307Q/Q311A/M428I/N434Y

F711 6.50E-08 S239K,/M252Y/'T307Q,'Q311A/N434Y

F712 6. OOE-08 P238D/M252Y/T307Q,'Q311A/N434Y

F713 2. OOE-08 P238D/K252Y/N286E,'T307Q/Q311A/N434Y

F714 2.30E-07 P238D/M252Y/N325S/N434Y

F715 2 30E-07 P238D/M252Y/N325M,'N434Y

F716 2 70E-07 P238D/'N252Y/N325L,f'N434Y

F717 2. 60E-07 P238D,/M252Y/N3251/N434Y

F718 2. 80E-07 P238D/M252Y,/Q295M/N434Y

F719 7. 40E-08 P238D/M252Y/N325G/N434Y

F720 2. 40E-08 M252Y,'T307Q/V308P,'Q311A/N434Y

A tabela 28-15 é a continuação da tabela 28-14.

[Tabela 28-15] F721 1-50E-08 M252Y/T307Q/V308P,/Q311A/M4281,/N434Y F722 2.70E-07 P238D/M252Y/A327G/N434Y F723 2.80E-07 P238D/M252Y/L328D,/N434Y F724 2.50E-07 P238D/M252Y/L328E/N434Y F725 4.20E-08 L235K/G237R/S239K/M252Y/V308P/N434Y F726 3. 70E-08 L235K/P238K/S239K/M252Y/V308P/N434Y F729 9.20E-07 T307A/Q311A/N434Y F730 6.0OE-07 T307Q/Q311A/N434Y F731 8.50E-07 T307A/Q311H/N434Y F732 6.80E-07 T307Q/Q311H/N434Y F733 3.20E-07 M252Y/L328E/N434Y F734 3-1OE-07 G236D/M252Y/L328E/N434Y F736 3.1OE-07 M252Y/S267M/L328E/N434Y F737 3. 1OE-07 M252Y/S267IJL328É,/N434Y F738 3.50E-07 P238D/M252Y/T307P/N434Y F739 2.20E-07 R52Y/T307P/Q311A/N434Y F740 2.90E-07 R52Y/T307P,'Q311H,/N434Y F741 3.1OE-07 P238D/T250A/M252Y/N434Y F744 9.90E-07 P238D/T250F/ÍÀ252Y,'N434Y F745 6.60E-07 P238D/T250G/M252Y/N434Y

F746 6. OOE-07 P238D/T250H/M252Y/N434Y F747 2. 80E-07 P238D/T250I/M252Y,/N434Y F749 5. 1OE-07 P238D/T250L/IÀ252Y/N434Y F750 3. OOE-07 P238D/T250M/M252Y/N434Y F751 5- 30E-07 P238D/T250N/M252Y,/N434Y F753 1.80E-07 P238D/T250Q/M252Y/N434Y F755 3.50E-07 P238D/T250S/M252Y/N434Y

F756 3.70E-07 P238D/T250V/M252Y/N434Y

F757 1.20E-06 P238D/T250W/M252Y/N434Y

F758 1.40E-06 P238D/T250Y/M252Y,'N434Y

F759 L235K/S239K

F760 L235R/S239K

F761 1. 1OE-06 P238D,'N434Y

F762 3. 60E-08 L235K/S239K/M252Y,/N286E/T307Q/Q311A/N434Y

F763 3. 50E-08 L235R,'S239K/H252Y/N286E/T307Q,/Q311A/N434Y

F764 6.30E-07 P238D/T307Q/'Q311A,/N434Y '8.T0Ê-0ã 7"ns" 6. OOE-07 P238D,/M252Y/T307Q,/L309E/'Q311A/N434Y T307A/L309E/Q311A/N434Y F766 F767 4. 30E-07 T307Q,'L309E/Q311A/N434Y

F768 6. 40E-07 T30)A/L309E/Q311H/N434Y Fj69 4- 60E-07 T307Q,'L309E/'Q311H,/N434Y

F770 3. OOE-07 M252Y,"T256A/N434Y

A tabela 28-16 é a continuação da tabela 28-15.

[Tabela 28-16] F771 I 4- OOE-07 I M252Y,,/'E272A,i'N434Y F772 3. 80E-07 M252Y,/'K274.A,/'N434Y

F773 3. 90E-07 M252Y,'V282A,"N434Y

F774 4. OOE-07 ld252Y,('N2Q36A,"N434Y

F775 6. 20E-07 M252Y/K338A,.'N434Y

F776 3. 90E-07 M252Y/K340A "N434Y

F777 3.90E-07 M252Y)E345A,'N434Y

F779 3. 90E-07 M252Y/N361A,'N434Y

F780 3 90E-07 M252Y/Q362A,'N434Y

F781 3. 70E-07 H252Y,'S375A,'N434Y

F782 3. 50E-07 M252Y/Y391A/N'434Y

F783 4. OOE-07 M252Y/D413A/N434Y

F784 5. OOE-07 M252Y"/L309A/N434Y

F785 7. 40E-07 M252Y,'L309H,'N434Y

F786 2. 80E-08 M252Y/S254T,'N286E/'T307Q,/Q311A/N434Y

F787 8. 80E-08 M252Y/S254T,'T307Q/"L309E/Q311A/N434Y

F788 4. 1OE-07 M252Y/N315A/N434Y

F789 1. 50E-07 M252Y/N315D,'N434Y

F790 2. 70E-07 M252Y/N315E/N434Y

F791 · 4. 40E-07 M252Y/N315F/N434Y

F792 4. 40E-07 M252Y/N315G,'N434Y

F793 3. 30E-07 H252Y/N315!/N434Y F794 4. 1OE-07 M252Y/N315K/N434Y

F795 3. 1OE-07 M252Y,'N315L,'N434Y F796 3.40E-07 M252Y/N315M,'N434Y

F798 3. 50E-07 K252Y/N315Q,'N434Y F799 4. 1OE-07 M252Y/N315R,'N434Y F800 3. 80E-07 M252Y/N315S,'N434Y F801 4.40E-07 M252Y/N315T,'N434Y F802 3. 30E-07 M252Y/N315V,'N434Y F803 3. 60E-07 M252Y/N315W/N434Y F804 4. OOE-07 M252Y/N315Y,'N434Y F805 3- OOE-07 M252Y,'N325A/N434Y F806 3. 1OE-07 M252Y/N384A/N434Y F807 3. 20E-07 M252Y,'N389A,'N434Y F808 3- 20E-07 M252Y/N389A,'N390A/N434Y F809 2- 20E-07 M252Y/S254T,'T256S/N434Y

F810 2- 20E-07 M252Y/A378V,'N434Y F811 4- 90E-07 M252Y/E380S/N434Y

F812 2 70E-07 M252Y/E382V,'N434Y F813 2 80E-07 M252Y/S424E/N434Y

F814 1.20E-07 M252Y/N434Y/Y4361

A tabela 28-17 é a continuação da tabela 28-16.

[Tabela 28-17] f815 5. 50E-07 M252Y/N434Y/T437R f816 3. 60E-07 P238D/T250VM252Y/T307P/N434Y f817 9. 80E-08 P238D/T250V/M252Y,'T307Q/Q311A/N434Y f819 1. 40E-07 P238D/M252Y/N286E,'N434Y Wá6 3.40E-07 L235K/S239K/M252Y/N434Y f821 3. 1OE-07 L235R/S239K/M252Y/N434Y f822 1. 1OE-06 P238D/T250Y/M252Y,'R13Y/N434Y f823 1. 1OE-06 P238D/T250Y/M252Y/W313F/N434Y f828 2. 50E-06 P238D/T250V,/M252Y/I253V/N434Y f831 1, 60E-06 P238D/T250V/M252Y,'R255A,'N434Y f832 2. 60E-06 P238D/T250V/M252Y/R2'5D/N434Y f833 8, OOE-07 P238D/T250V/M252Y,'R255E,'N434Y f834 8. 1OE-07 P238D/T250V/M252Y,'R255F/N434Y f836 5. OOE-07 P238D/T250V/M252Y/R255H/N434Y f837 5, 60E-07 P238D/T250V/M252Y,'R255I/N434Y f838 4.30E-07 p238D/T250'/i'R52Y,'R255K,'N434Y f839 3. 40E-07 P238D/T250V,/M252Y/R255L,'N434Y f840 4. 20E-07 P238D/'T250V/'M252Y,'R255M,'N434Y f841 1 1OE-06 P238D,,/'T250V,/'M252Y,"R255N/N434Y f843 6. 60E-07 p238D,/'T250y,./'M252Y,'R255Q/N434Y f844 1. 30E-06 P238D/"T250V,/M252Y,'R255S,'N434Y f847 3 40E 07 I P238D/T250V/M252Y,'R255W,'N434Y f848 8. 30E-07 P238D/T250V/M252Y,'R255Y/N434Y R49 3. 30E-07 M252Y/D280A/N434Y f850 2. 90E-07 M252Y/D280E/N434Y f852 3. 30E-07 M252Y/D280G/N434Y f853 3. 20E-07 M252Y/D280H,/N434Y f855 3. 20E-07 M252Y/D280K/N434Y f858 3 20E-07 M252Y/D280N,/N434Y 7í"ã 3 30E-07

3. 20E-07 M252Y/D280Q/N434Y M252Y./D280R/N434Y f861 f862 3 OOE-07 M252Y/'D280S,/N434Y ""Êêà 2- 70E-07 M252Y/D280T/N434Y f867 2. 80E-07 M252Y/N384A/N389A,'N434Y f868 2, OOE-08 G236A/S239D/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N434Y f869 G236A/S239D f870 7. 30E-08 L235K,"S239K/M252Y,'T307Q/Q311A/N434Y " f871 7. 1OE-08 L235R/S239K/M252Y,'T307Q/Q311A/N434Y f872 1.30E-07 L235K/S239K/M252Y,'N286E/N434Y f873 1. 20E-07 L235R/S239K/M252Y,'N286E,'N434Y f875 4. 80E-07 M252Y/N434Y/Y436A f877 8. 30E-07 IÂ252Y,/N434Y/Y436E A tabela 28-18 é a contiriuação da tabela 28-17.

{Tabela 28-18] F878 1. 90E-07 N252Y/N434Y/Y436F F879 9.20E-07 M252Y/N434Y/Y436G F880 3 90E-07 M252Y/N434Y/Y436H F881 3. 1OE--07 R52Y,'N434Y/Y436K F882 1. 30E-07 M252Y/N434Y/Y436L F883 2 1OE-07 M252Y/N434Y/Y436M F884 4. OOE-07 NI252Y/N434Y/Y436N F888 4-80E-07 M252Y/N434Y/Y436S F889 2. 20E-07 M252Y/N434Y/Y436T F890 1. 1OE-07 M252Y/N434Y/Y436V F891 1. 70E-07 M252Y/N434Y/Y436W F892 7. 1OE-08 I\À252Y/S254T/N434Y,'Y436I F893 9. 80E-08 L235K/S239K/M252Y,'N434Y/Y4361 F894 9. 20E-OB L235R/S239K/M252Y,'N434Y/'Y4361 F895 2. 1OE-08 L235K,'S239K/M252Y,'N286E/T307Q/Q311A/N315E/N434Y F896 2. OOE-08 L235R/S239K/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N315E/N434Y F897 9. 70E-08 M252Y/N315D/N384A,'N389A/N434Y F898 1. 70E-07 M252Y/N315E/N384A,'N389A/N434Y F899 1. 1OE-07 M252Y,'N315D/G316A,'N434Y F900 1. 70E-07 M252Y/N315D/G316D,'N434Y F901 1. 30E-07 M252Y,'N315D/G316E,'N434Y F902 2. 20E-07 M252Y/N315D/G316F/N434Y F903 2. 30E-07 M252Y/N315D/G316H,'N434Y F904 1. OOE-07 M252Y/N315D/G316I,'N434Y F905 1. 30E-07 M252Y/N315D/G316K,'N434Y F906 1. 50E-07 N252Y/N315D/G316L,'N434Y F907 1. 30E-07 M252Y,'N315D,'G316M,'N434Y F908 1. 50E-07 !À252Y/N315D/G316N,'N434Y F909 1. 30E-07 M252Y/N315D/G316P,'N434Y F910 1. 40E-07 M252Y/N315D/G316Q/N434Y F911 1. 30E-07 M252Y/N315D/G316R,'N434Y F912 1. 20E-07 M252Y/N31 5D,'G316S,'N434Y F913 1. 1OE-07 M252Y,'N315D/G316T,'N434Y F914 1. 50E-07 M252Y/N315D,'G316V,'N434Y F915 2- 30E-07 M252Y/N315D/G316W,'N434Y F917 2.50E-07 M252Y/N286S/N434Y F'918 2. 80E-07 M252Y/D280E/N384A,'N389A/N434Y F919 3.30E-07 M252Y/D280G,"N384A,'N389A/N434Y F920 2. 50E-07 M252Y/N286S/N384A,'N389A/N434Y F921 1. 20E-07 M252Y/N286E/N384A,'N389A/N434Y F922 5. 90E-08 L235K/S239K/M252Y,'N286E/N434Y/Y436I F923 6. OOE-08 L235R/S239K/M252Y,'N286E/N434Y/Y436I

A tabela 28-19 é a continuação da tabela 28-18. [Tabela 28-19]

a*yKd": F924 3. 40E-08 L235K,'S239K,'M252Y,"T307Q,'Q311A/N434Y/Y436I F925 3. 20E-08 L235R/S239K/'M252Y,'T307Q,'Q311A/N434Y/'Y436l @2G 1. 1OE-07 L235K/'s239K,/M252Y/'s254T/'N434Y/Y436i ' F927 1. OOE-07 L235R,'S239K,i'M252Y,"S254T/N434Y/Y436I Fi2ii 2. 90E-08 M252Y,/'T307Q,/'Q311A/'N434Y,f'"Y436I F929 2. 90E-08 M252Y,'"s254T,/'T307Q,/Q311B,,/'N434Y/Y436i '1. 40E-07 F930 P238D,.'T250V,'M252Y,'N286E,"N434Y F931 1. 20E-07 P238D,·'T250V,"Nl252Y',/'N434Y',/"Y436I F932 3. 20E-07 T250Vild252Y/N434Y F933 3. OOE-07 L234R,('P238D,/'T250V,/'M252Y./'N434Y F934 3. 1OE-07 G236K /'P238D,/T250V,/'M252Y/'N434Y F935 3. 20E-07 G237K,/'P238D,/'T250V/N252Y,"N434Y F936 "3 "z1Eõí g237R,'p238D,/T25(yd/'R52Y /N434Y F937 3. 1OE-07 P238D!S239K,f'T250V,/'M252YlN434Y F938 1. 60E-07 L235K,"S239K,'N2"2Y,"N434Y,.'Y436V F939 1 50F-07 L_235R,/S239K,/M252Y,"N434Y,.'Y436V F940 1. 50E-07 P238D,{'T250V,/'M252Y,"N434Y,/"Y4.36V FNT 1. 20E-08 M252Y/'N286E,/T307Q,/'Q-311A,/'(q434Y/Y436v

4. 20E-08 L235K,/'s239k/N252Y/T307Q,/Q311A/N434Y/y436v F942 F943 4. OOE-08 L235Rp/"s239K,/M252j'iT307Q,/"Q311A/N434Y/Y436v F9Á4 1.70E-07 T250V,'M252'Y/N434Y,"Y436V F945 Í, 70E-08 T250V/'M252Y/'V308P,/'N434Y,,"Y436V F946 4 30E-08 T250v/M252y,t'T307Q,/'Q3|1A AY434Y/Y436V F947 i. 1OE-08 T250V/M252Y/T307Q/V308P,"Q311A,'N434Y/Y436V F954 5. 30E-07 M252Y/N434Y/H435K/Y436V F957 7. 70E-07 M252Y/N434Y/H435N/Y436V F960 8. OOE-07 M252Y/'N434Y,/H435R/Y436V F966 úõÊ"6i M252Y/S254A/N434Y F970 2. 50E-06 M252Y,'S254G/N434Y F971 2. 60E-06 N252Y,'S254H,/N434Y F972 2. 60E-07 M252Y/S254!/N434Y F978 1. 30E-06 M252Y/S254Q/IV434Y F980 1. 80E-07 M252Y/S254V/N434Y F98"7 4'.'OÕE-Ò8 P238D/'T250V,/'M252Y/'T307Q,/Q311A/'N434Y/Y436V F988 6. 90E-08 P238D/T250V,N252Y/N286E/N434Y/Y436V í, 40E-08 F989 L235R/S239K/M252Y/V308P/N434Y,/Y436V F990 9. 40E-09 L235R,'S239K/M252Y/T307Q/V308P/Q311A./N434Y/Y436V F991 1. 30E-08 L235R/S239K/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N434Y/Y436V F992 5. 1OE-08 L235R,'S239K/M252Y/T307Q/Q311A/M428I/N434Y/Y436V F993 3. 80E-08 N252Y/T3070/Q311A/N434Y/Y436V F994 2- 80E-07 M252Y/N325G/N434Y F995 2. 90E-07 L235R/P238D/S239K/M252Y/N434Y A tabela 28-20 é a continuação da tabela 28-19.

Tabela 28-20] '1. 30E-07 L235R,/P238D,0'S239K,/M252Y/N434Y,/Y436V F996

F997 3.80E-07 K248I/T250V/M252Y/N434Y/Y436V F998 8.50E-07 K248Y/T250V/M252Y,/N434Y/Y436V F999 2. 1OE-07 T250V/'M252Y/E258H/N434Y/Y436V F1005 N325G F1008 1. 70E-07 L235R/S239K/T250V/M252Y/N434Y/Y436V F1009 1 20E-08 L235R/'S239K/T250V,N252Y/'T307Q/V308P/Q311A/N434Y/Y4 36V F1O1O 1. 90E-07 L235R/S239K/M252Y/T307A/Q311H/N434Y F'lO11 4. 50E-08 T250V,'M252Y/V308P/N434Y F1012 4. 70E-08 L235R/S239K/T250V,N252Y./V308P,'N434Y F1013 3. OOE-08 T250V/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y Fl014 3.20E-08 L235R/S239K/T250V,/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/'N434Y Èi6iS 2. 20E-08 L235R/S239K/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y F1016 3.80E-09 T250V/M252Y/N286E,/"T307Q/'V308P/Q311A/N434Y/Y436V F1017 4.20E-09 L235R/S239K/T250V!M252Y/N286E/T307Q/V308P/Q311A,'N4 34Y/Y436V F1018 3.20E-09 L235R,'S239K/M252Y/N286E/T307QN308P/Q311A/N434Y/Y4 36V F1019 3-40E-07 P238D/T250V/M252Y/N325G,'°N434Y F1020 8.50E-08 P238D/T250V,"M252Y,'T307Q/Q311A/N325G/N434Y F1021 3.30E-07 P238D/T250V/M252Y,'N325A/N434Y F1022 K326D/L328Y F1023 4.40E-08 S239D/T250V/M252Y,/'T307Q/'Q311A/N434Y,'Y436V F1024 4.0OE-08 T250V/M252Y/T307Q/Q311A/K326D/L328Y/N434Y/Y436V F1025 3- 60E-08 S239D/T250V/M252Y,/T307Q,/Q311A/K326D/L328Y/N434Y/Y4 36V F1026 8. 40E-08 M252Y/T307A/Q311H/N434Y/Y436V F1027 8. 60E-08 L235R/S239K/M252Y/T307A/Q311H/N434Y/Y436V F1028 4 60E-08 ! G236A/S239D/T250V,/M252Y/'T3070/Q311A/N434Y/Y436V ! F1029 5- 1OE-08 T250V/M252Y/T307Q/Q311A/1332E,/N434Y,'Y436V F1030 I332E F1031 5. 30E-08 G236A/S239D/T250V/M252Y/T307Q/Q311A/l332E/N434Y/Y4 36V F1032 4. 30E-08 P238D/T250V/M252Y./T307Q/Q311A/N325G,'N434Y/Y436V F1033 1. OOE-06 P238D/N434W F1034 1.50E-08 L235K/S239K,"M252Y,/'V308P/'N434Y/Y436V F1035 1. OOE-08 L235K/S239K/'M252Y,/T307Q/'V308P,'Q311A/N434Y/Y436V F1036 1.40E-08 L235K,/'S239K/M252Y,/N286E/'T307Q/Q311A/N434Y/Y436V F1037 6.1OE-08 L235K,'S239K/'M252Y,/T307Q/'Q311A/M428I/N434Y,/'Y436V F1038 2. 80E-07 L235K/P238D,'S239K,N252Y/N434Y F1039 1. 30E-O) L235K/P238D/S239K,/M252Y/'N434Y/Y436V

A tabela 28-21 é a continuação da tabela 28-20.

[Tabela 28-21] F1040 2. OOE-07 L235K/S239K/T250V/M252Y/N434Y/Y436V F1041 1. 40E-08 L235K,'S239K,/T250V/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y/Y4 36V F1042 2. OOE-07 L235K,'S239K./M252Y,'T307A/Q311H/N434Y F1043 5. 20E-08 L235K/S239K/T250V/M252Y/V308P/N434Y F1044 3, 50E-08 L235K/S239K/T250V,/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y F1045 2.50E-08 L235K/S239K/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y F1046 4. 50E-09 L235K/S239K/T250V/M252Y/N286E/T307Q/V308P/Q311A/N4 34Y/Y436V F1047 3.40E-09 L235K/S239K/M252Y/N286E/T307Q/V308P/Q311A/N434Y/Y4 36V F1048 9. 90E-08 L235K/S239K/M252Y/T307A/Q311H/N434Y/Y436V F1050 3. 50E-09 T250v/M252Y/N286E/T307Q,/v308p/Q311A/M428l/N434Y,/y4 36V F1051 3.90E-09 L235R/'S239K/T250V/M252Y/N286E/T307Q/V308P/Q311A/M4 281/N434Y/Y436V F1052 3. 20E-09 L235R/S239K/M252Y/N286E/T307Q/V308P/Q311A/M428!/N4 34Y/Y436V " Exemplo de referência 13 Estudo in vivo de vários anticorpos va- riantes Fc através do modelo de infusão no estado estacionário utilizando a linhagem de camundongo transgênica para FcRn humano 32 · 5 Os variantes Fc gerados no Exemplo 12 foram testados em rela- ção a sua capacidade de eliminar antígeno do plasma no modelo de infusão no estado estacionário utilizando a Iinhagem de camundongo transgênica para FcRn humano 32. O estudo in vivo foi realizado como descrito no E- xempio 1, mas a linhagem de camundongo transgênica para FcRn humano 10 32 foi utiíizada ao invés da linhagem 276 e o anticorpo monoclonal anti-CD4 de camundongo foi injetado duas vezes (antes da bomba de infusão ser im- plantada e 14 dias após a injeção de anticorpo) ou três vezes (antes da bomba de infusão ser implantada e 10 e 20 dias após a injeção de anticorpo).

Partindo dos variantes Fc descritos nas Tabelas 28-1 a 28-21, os 15 variantes de anticorpo Fc selecionados listados abaixo foram expressos e purificados através de métodos conhecidos pelos versados na técnica como descrito no Exemplo de Referência 3: Fv4-lgG1 que compreende VH3-lgG1 e VL3-CK; Fv4-lgG1-F11 que compreende VH3-lgG1-F11 e VL3-CK;

Fv4-lgG1-F14 que compreende VH3-lgG1-F14 e VL3-CK; Fv4-lgG1-l"39 que compreende VH3-lgG1-F39 e VL3-CK; Fv4-lgG1-F48 que compreende VH3-lgG1-F48 e VL3-CK; Fv4-lgG1-F140 que compreende VH3-lgG1-F140 e VL3-CK; 5 Fv4-lgG1-F157 que compreende VH3-lgG1-F157 e VL3-CK; Fv4-lgG1-F194 que compreende VH3-lgG1-F194 e VL3-CK; Fv4-lgG1-F196 que compreende VH3-lgG1-F196 e VL3-CK; Fv4-lgG1-F198 que compreende VH3-lgG1-F198 e VL3-CK; Fv4-lgG1-F262 que compreende VH3-lgG1-F262 e VL3-CK; "10 Fv4-lgG1-F264 que compreende VH3-lgG1-F264 e VL3-CK; Fv4-lgG1-F393 que compreende VH3-lgG1-F393 e VL3-CK; Fv4-lgG1-F424 que compreende VH3-lgG1-F434 e VL3-CK; e Fv4-lgG1-F447 que compreende VH3-lgG1-F447 e VL3-CK.

Estes anticorpos foram administrados à linhagem de camundon- go transgênica para FcRn humano 32 em uma dose de 1 mg/kg.

A figura 49 descreve o curso de tempo de concentração de hslL- 6R no plasma no camundongo.

Comparados com Fv4-lgG1, todos os varian- tes Fc que possuem maior afinidade de ligaçâo ao FcRn humano em pH 7,0 exibiam redução de concentração de hslL-6R no pIasma, portanto, elimina- ção aprimorada dos antígenos do plasma.

Embora a extensão e a durabili- dade de redução de concentração de antigenos fossem diferentes entre os variantes Fc, todos os variantes reduziram de forma consistente a concen- tração de hslL-6R no pIasma em comparação com lgGl demonstrando que uma maior afinidade de Iigação ao FcRn humano em pH 7,0 aumentaria uni- versalmente a eliminação dos antígenos do plasma.

A figura 50 descreve o curso de tempo de concentração de anticorpo no plasma no camundongo.

A farmacocinética do anticorpo era diferente entre os variantes Fc.

Como descrito no exemplo de referência 9, a quantidade de an- tígeno eliminada do plasma por anticorpo é o fator importante para avaliar a eficiência de eliminação dos antígenos através da administração dos varian- tes de anticorpo Fc que possuem maior afinidade de ligação ao FcRn huma- no em pH 7,0. Portanto, os cursos de tempo de valor de C (razão molar antí-

geno/anticorpo) para cada anticorpo foram descritos na figura 51. A figura 52 descreve a relação entre a afinidade de ligação de variantes Fc ao FcRn humano em pH 7,0 e o valor de C (razão molar antígeno/anticorpo) no dia 1 após a administração de anticorpos. lsto demonstra que todos os variantes 5 Fc de anticorpo testados neste estudo possuem um valor de C menor quan- do comparados com aquele do Fv4-lgG1. Uma vez que todos os variantes Fc testados neste estudo possuem afinidade de ligação ao FcRn humano em pH 7,0 mais forte que KD 3,0 µM, eles alcançaram maior eficiência de eliminação dos antígenos quando comparado com aquela da lgGl humana 10 natura!. lsto era compatíve! com os resultados obtidos no exemplo de refe-

. rência 9 (figura 42). A figura 53 descreve que entre os variantes Fc testados neste estudo, os anticorpos que possuem variante Fc de F11, F39, F48 e F264 exibiam farmacocinética similar àquela da lgGl.

Uma vez que este estudo é 15 realizado utilizando camundongo transgênico para FcRn humano, é espera- do que estes variantes Fc tenham meia-vida longa similar àquela da lgGl também em seres humanos.

A figura 54 descreve o curso de tempo da con- centração de hslL-6R no plasma em camundongos administrados com anti- . corpos que possuem farmacocinética similar àquela da lgGl humana intacta

- 20 (F11, F39, F48, e F264). Estes variantes reduziram a concentração de hslL- 6R no plasma quando comparados com aquela da lgGl aproximadamente 10 vezes.

Além disso, estes anticorpos reduziram a concentração de hslL- 6R abaixo da concentração de hslL-6R na linha de base (concentração sem anticorpo). Portanto, estes anticorpos possibilitariam uma eliminação em 25 longo prazo de antígeno do plasma e, portanto, intervalos de dosagem lon- gos que seriam preferiveis para anticorpos terapêuticos para doença crônica.

As Figuras 55 e 56 descrevem o curso de tempo de concentra- ção de anticorpo no plasma e a concentração de hslL-6R no plasma para lgGl e variantes Fc F157, F196 e F262, respectivamente.

Surpreendente- 30 mente, embora a farmacocinética de anticorpo de F157 e F262 exibisse uma eliminação significativamente mais rápida do plasma quando comparada com a IgGl humana natural, F157 e F262 exibiram eliminação significativa de hslL-6R do pIasma.

Especificamente, a concentração de hsIL-6R no plasma de F157 estava abaixo do Iimite de detecção (1,56 ng/rnL), dos dias 1 até 28 (exceto no dia 14) e aquela de F262 estava abaixo do limite de de- tecção (1,56 ng/mL) dos dias 14 até 28- Por outro lado, para F196 com eli- 5 minação mais lenta de anticorpo em comparação a F157, a concentração de antígenos começou a aumentar no dia 14 e retornou para a linha de base no dia 28. Entre os variantes Fc testados neste estudo, F157 e F262 foram os únicos variantes Fc que foram capazes de reduzir a concentração de hslL- 6R no pIasma abaixo de 1,56 ng/mL no dia 28. Tal efeito em longo prazo durável de F157 e F262 é inesperado partindo da farmacocinética do anticorpo, uma vez que os anticorpos foram eliminados do plasma muito rapidamente em comparação com a lgGl hu- mana natural.

Em particular, a concentração plasmática do anticorpo de F157 não foi detectada no dia 21. Todavia, a concentração de hslL-6R no plasma continuou a ser reduzida até um nível menor que o limite de detec- ção de 1,56 ng/mL nos dias 21 e 28. A presente invenção não se limita a uma teoria específica, mas este efeito inesperado é considerado como sen- do devido à presença do anticorpo na superficie da célula do endotélio vas- cular na forma ligada ao FcRn.

Embora estes anticorPos tenham mostrado baixa concentração no plasma, estes anticorpos ainda estão presentes no compartimento vascular na forma ligada ao FcRn (que não pode ser medida como uma concentração plasmática do anticorpo). Estes anticorpos ligados ao FcRn podem ainda se ligar ao antígeno no plasma e após a absorção mediada por FcRn do complexo antigeno/anticorpo, o antígeno é liberado dentro do endossomo e degradado pelo lisossomo enquanto o anticorpo é reciclado de volta para a superfície celular na forma ligada ao FcRn.

Assim estes anticorpos ligados ao FcRn contribuem para a eliminação dos antíge- nos. lsto explica a razão pela qua! estes anticorpos mantêm a capacidade de eliminação dos antígenos ainda após a concentração de anticorpo se tornar baixa no plasma.

Aplicação industrial A presente invenção fornece métodos para promover a absorção de antigeno nas células pelo uso de moléculas de ligação ao antigeno, mé- todos para aumentar o número de vezes de ligação ao antígeno por uma molécula de ligação ao antigeno, métodos para promover a redução da con- centração de antígenos no plasma pela administração de moléculas de liga- 5 ção ao antígeno, e métodos para melhorar a retenção plasmática das molé- culas de ligação ao antigeno.

Por promover a absorção do antígeno nas cé- lulas por uma molécula de ligação ao antígeno, se torna possivel não ape- nas promover a redução do antígeno no plasma pela administração da mo- lécula de ligação ao antígeno, mas também melhorar a retenção pIasmática da molécula de ligação ao antígeno e aumentar o número de vezes de liga-

- ção ao antígeno por cada molécula de ligaçào ao antígeno.

Tais moléculas de ligação ao antígeno podem exibir mais efeitos benéficos in vivo do que as moléculas de ligação ao antígeno típicas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Molécula de ligação ao antígeno, caracterizada pelo fato de que compreende um domínio de ligação ao antígeno e um domínio de liga- ção a FcRn humano, cuja atividade de ligação ao antígeno é diferente sob 5 duas condições de concentração de cálcio diferentes e é menor sob uma condição de concentração baixa de cálcio do que sob uma condição de con- centração alta de cálcio e que tem atividade de ligação a FcRn humano sob condição de pH neutro.

2. Molécula de ligação ao antígeno de acordo com a reivindica- ção 1, caracterizada pelo fato de que a concentração baixa de cálcio é uma concentração de cálcio ionizado de 0,1 a 30 µM, e em que a concentração alta de cálcio é uma concentração de cálcio ionizado de 100 µM a 10 mM.

3. Molécula de ligação ao antígeno de acordo com a reivindica- ção 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a concentração baixa de cálcio é uma concentração intra-endossômica de cálcio ionizado, e em que a con- centração alta de cálcio é uma concentração plasmática de cálcio ionizado.

4. Molécula de ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o domínio de ligação a FcRn é uma região Fc.

5. Molécula de ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a atividade de liga- ção ao antígeno ainda é menor sob uma condição de pH ácido do que sob uma condição de pH neutro.

6. Molécula de ligação ao antígeno de acordo com a reivindica- ção 5, caracterizada pelo fato de que pelo menos um aminoácido é substitu- ído por histidina ou pelo menos uma histidina é inserida na molécula de liga- ção ao antígeno.

7. Molécula de ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que se liga a um antíge- no de membrana ou antígeno solúvel.

8. Molécula de ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o antígeno é um antígeno selecionado do grupo que consiste em IL-6R, IL-6, IgA, glipicana 3 humana e IgE.

9. Molécula de ligação ao antígeno, caracterizada pelo fato de que compreende um domínio de ligação ao antígeno e um domínio de liga- 5 ção a FcRn humano, cuja atividade de ligação ao antígeno é diferente sob duas condições de concentração de cálcio diferentes e é menor sob uma condição de concentração baixa de cálcio do que sob uma condição de con- centração alta de cálcio e em que uma cadeia leve ou uma cadeia pesada do domínio de ligação compreende um motivo de ligação ao cálcio derivado de um anticorpo humano.

10. Molécula de ligação ao antígeno de acordo com a reivindica- ção 9, caracterizada pelo fato de que o motivo de ligação ao cálcio está compreendido na CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de cadeia leve do domínio de ligação ao antígeno.

11. Molécula de ligação ao antígeno de acordo com a reivindica- ção 10, caracterizada pelo fato de que o motivo de ligação ao cálcio está compreendido a) nas posições 30, 31 e/ou 32 de acordo com a numeração de Kabat na CDR1 da cadeia leve; e/ou b) na posição 50 de acordo com a numeração de Kabat na C- DR2 da cadeia leve; e/ou c) na posição 92 de acordo com a numeração de Kabat na C- DR3 da cadeia leve.

12. Molécula de ligação ao antígeno de acordo com a reivindica- ção 11, caracterizada pelo fato de que qualquer um ou mais dos aminoácidos nas posições 30, 31, 32, 50, e/ou 92 de acordo com a numeração de Kabat têm uma atividade quelante de metais.

13. Molécula de ligação ao antígeno de acordo com a reivindica- ção 11 ou 12, caracterizada pelo fato de que o motivo de ligação ao cálcio é o motivo de ligação ao cálcio no qual os mesmos aminoácidos como de 1 a 4 aminoácidos selecionados dentre os cinco aminoácidos nas posições 30, 31, 32, 50, e/ou 92 de acordo com o sistema de numeração de Kabat na região variável de anticorpo humano de cadeia leve da SEQ ID NO: 41, 63, ou 64 estão contidos nas posições de aminoácidos correspondentes de acordo com o sistema de numeração de Kabat.

14. Molécula de ligação ao antígeno de acordo com qualquer 5 uma das reivindicações 10 a 13, caracterizada pelo fato de que o antígeno da molécula de ligação ao antígeno é tanto IgA ou glipicana 3.

15. Molécula de ligação ao antígeno de acordo com a reivindica- ção 9, caracterizada pelo fato de que o motivo de ligação ao cálcio está compreendido na CDR1, CDR2 e/ou CDR3 da cadeia pesada do domínio de ligação ao antígeno, e em que o motivo de ligação ao cálcio é a) o motivo de ligação ao cálcio da região variável de cadeia pe- sada da SEQ ID NO: 1, em que no referido motivo de ligação ao cálcio os aminoácidos nas posições 95, 96 e/ou 100a de acordo com o sistema de numeração de Kabat têm uma atividade quelante de metais; ou b) o motivo de ligação ao cálcio da região variável de cadeia pe- sada da SEQ ID NO: 1, em que no referido motivo de ligação ao cálcio os aminoácidos nas posições 95 e/ou 101 têm uma atividade quelante de metais.

16. Molécula de ligação ao antígeno de acordo com a reivindica- ção 15, caracterizada pelo fato de que o antígeno da molécula de ligação ao antígeno é tanto IL-6R ou IL-6.

17. Molécula de ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 16, caracterizada pelo fato de que a baixa concentração de cálcio é uma concentração de cálcio ionizado de 0,1 a 30 µM, e a alta concentração de cálcio é uma concentração de cálcio ionizado de 100 µM a 10 mM.

18. Molécula de ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 17, caracterizada pelo fato de que compreende um domínio de ligação a FcRn que tem atividade de FcRn na faixa de pH neutro.

19. Molécula de ligação ao antígeno de acordo com a reivindica-

ção 18, caracterizada pelo fato de que o domínio de ligação a FcRn é uma região Fc.

20. Molécula de ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, 18 ou 19, caracterizada pelo fato de que um 5 ou mais aminoácidos nas posições 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 286, 289, 297, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434, e 436 (numeração EU) na sequência de aminoácidos da região Fc são diferentes daqueles da região Fc natural.

21. Molécula de ligação ao antígeno de acordo com a reivindica- ção 20, caracterizada pelo fato de que compreende qualquer um ou uma combinação de: Met na posição de aminoácido 237; Ile na posição de aminoácido 248; Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp, ou Tyr na posição de ami- noácido 250; Phe, Trp, ou Tyr na posição de aminoácido 252; Thr na posição de aminoácido 254; Glu na posição de aminoácido 255; Asp, Glu, ou Gln na posição de aminoácido 256; Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr, ou Val na posição de ami- noácido 257; His na posição de aminoácido 258; Ala na posição de aminoácido 265; Ala ou Glu na posição de aminoácido 286; His na posição de aminoácido 289; Ala na posição de aminoácido 297; Ala na posição de aminoácido 303; Ala na posição de aminoácido 305; Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp, ou Tyr na posição de aminoácido 307; Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln, ou Thr na posição de aminoáci-

do 308; Ala, Asp, Glu, Pro, ou Arg na posição de aminoácido 309; Ala, His, ou Ile na posição de aminoácido 311; Ala ou His na posição de aminoácido 312; 5 Lys ou Arg na posição de aminoácido 314; Ala, Asp, ou His na posição de aminoácido 315; Ala na posição de aminoácido 317; Val na posição de aminoácido 332; Leu na posição de aminoácido 334; His na posição de aminoácido 360; Ala na posição de aminoácido 376; Ala na posição de aminoácido 380; Ala na posição de aminoácido 382; Ala na posição de aminoácido 384; Asp ou His na posição de aminoácido 385; Pro na posição de aminoácido 386; Glu na posição de aminoácido 387; Ala or Ser na posição de aminoácido 389; Ala na posição de aminoácido 424; Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp, ou Tyr na posição de aminoácido 428; Lys na posição de aminoácido 433; Ala, Phe, His, Ser, Trp, ou Tyr na posição de aminoácido 434; or His, Ile, Leu, ou Val na posição de aminoácido 436; de acordo com a numeração EU na região Fc.

22. Molécula de ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizada pelo fato de que a molécula de ligação ao antígeno é um anticorpo.

23. Método para a produção de uma molécula de ligação ao an- tígeno que possui pelo menos uma função selecionada dentre: (i) função de promover a absorção de um antígeno pelas células; (ii) função de se ligar a um antígeno duas ou mais vezes;

(iii) função de promover a redução da concentração plasmática de antígeno e (iv) função de excelência na retenção plasmática, o método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas 5 de (a) a (e) abaixo: (a) determinar a atividade de ligação ao antígeno de uma molé- cula de ligação ao antígeno sob uma condição de baixa concentração de cálcio; (b) determinar a atividade de ligação ao antígeno de uma molé- cula de ligação ao antígeno sob uma condição de alta concentração de cál- cio; (c) selecionar a molécula de ligação ao antígeno que tenha me- nor atividade de ligação ao antígeno sob uma condição de baixa concentra- ção de cálcio do que sob uma condição de alta concentração de cálcio; (d) obter um gene que codifique a molécula selecionada na eta- pa (c); e (e) produzir a molécula de ligação ao antígeno usando o gene obtido na etapa (d).

24. Método de produção de uma molécula de ligação ao antíge- no que possui pelo menos uma função selecionada entre: (i) função de promover a absorção de um antígeno pelas células; (ii) função de se ligar a um antígeno duas ou mais vezes; (iii) função de promover a redução da concentração plasmática de antígeno e (iv) função de excelência na retenção plasmática, o método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de (a) a (e) abaixo: (a) colocar um antígeno em contato com uma molécula de liga- ção ao antígeno ou uma biblioteca de moléculas de ligação ao antígeno sob uma condição de alta concentração de cálcio; (b) colocar a molécula de ligação ao antígeno na etapa (a) sob uma condição de baixa concentração de cálcio;

(c) obter uma molécula de ligação ao antígeno que se dissocia na etapa (b); (d) obter um gene que codifica a molécula de ligação ao antíge- no obtido na etapa (c); e 5 (e) produzir a molécula de ligação ao antígeno usando o gene obtido na etapa (d).

25. Método para a produção de uma molécula de ligação ao an- tígeno que possui pelo menos uma função selecionada entre: (i) função de promover a absorção de um antígeno pelas células; (ii) função de se ligar a um antígeno duas ou mais vezes; (iii) função de promover a redução da concentração plasmática de antígeno e (iv) função de excelência na retenção plasmática, o método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de (a) a (f) abaixo: (a) colocar um antígeno em contato com uma molécula de liga- ção ao antígeno ou uma biblioteca de moléculas de ligação ao antígeno sob uma condição de baixa concentração de cálcio; (b) selecionar uma molécula de ligação ao antígeno que não se ligue ao antígeno da etapa (a); (c) permitir que a molécula de ligação ao antígeno selecionado na etapa (b) se ligue ao antígeno sob uma condição de alta concentração de cálcio; (d) obter uma molécula de ligação ao antígeno que se ligue ao antígeno na etapa (c); (e) obter um gene que codifica a molécula de ligação ao antíge- no obtido na etapa (d); e (f) produzir a molécula de ligação ao antígeno usando o gene obtido na etapa (e).

26. Método de produção de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 23 a 25, caracterizado pelo fato de que compreende adicional- mente a etapa de conferir ou aumentar a atividade de ligação a FcRn sob uma condição de pH neutro pela modificação de um aminoácido na molécula de ligação ao antígeno.

27. Método de produção de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 23 a 25, caracterizado pelo fato de que compreende adicional- 5 mente a etapa de reduzir a atividade de ligação ao antígeno sob uma condi- ção de pH ácido para ser menor do que sob uma condição de pH neutro pela modificação de um aminoácido na molécula de ligação ao antígeno.

28. Método de produção de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 23 a 25, caracterizado pelo fato de que a concentração baixa de cálcio é uma concentração de cálcio ionizado de 0,1 a 30 µM, e em que a concentração alta de cálcio é uma concentração de cálcio ionizado de 100 µM a 10 mM.

29. Método de produção de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 23 a 25, caracterizado pelo fato de que a concentração baixa de cálcio é uma concentração intra-endossômica de cálcio ionizado, e em que a concentração alta de cálcio é uma concentração plasmática de cálcio ioniza- do.

30. Método de produção de acordo com a reivindicação 27, ca- racterizado pelo fato de que a modificação de aminoácido na molécula de ligação ao antígeno é uma modificação pela substituição de pelo menos um aminoácido por histidina ou inserção de pelo menos uma histidina na molé- cula de ligação ao antígeno.

31. Método de produção de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 23 a 30, caracterizado pelo fato de que o antígeno ligado pela molécula de ligação ao antígeno é um antígeno selecionado do grupo que consiste em IL-6R, IL-6, IgA, glipicana 3 humana, e IgE.

32. Método de produção de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 23 a 31, caracterizado pelo fato de que a molécula de ligação ao antígeno é um anticorpo.

33. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende: a molécula de ligação ao antígeno como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 22 ou uma molécula de ligação ao antígeno pro- duzida pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 23 a 32, e um veículo farmaceuticamente aceitável. 5

34. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que é para uso na promoção da internalização do antígeno nas células.

35. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que é para uso na promoção da redução da con- centração de antígeno no plasma.

36. Método de seleção de uma molécula de ligação ao antígeno que tem pelo menos uma função selecionada entre: (i) função de promover a absorção de um antígeno pelas células; (ii) função de se ligar a um antígeno duas ou mais vezes; (iii) função de promover a redução da concentração plasmática de antígeno e (iv) função de excelência na retenção plasmática, o método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de (a) a (c) abaixo: (a) determinar a atividade de ligação ao antígeno de uma molé- cula de ligação ao antígeno sob uma condição de baixa concentração de cálcio; (b) determinar a atividade de ligação ao antígeno de uma molé- cula de ligação ao antígeno sob uma condição de alta concentração de cál- cio; e (c) selecionar a molécula de ligação ao antígeno, cuja atividade de ligação ao antígeno é menor sob uma condição de baixa concentração de cálcio do que sob uma condição de alta concentração de cálcio.

37. Método de seleção de uma molécula de ligação ao antígeno que tem pelo menos uma função selecionada entre: (i) função de promover a absorção de um antígeno pelas células; (ii) função de se ligar a um antígeno duas ou mais vezes;

(iii) função de promover a redução da concentração plasmática de antígeno e (iv) função de excelência na retenção plasmática, o método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas 5 de (a) a (c) abaixo: (a) colocar um antígeno em contato com uma molécula de liga- ção ao antígeno ou uma biblioteca de moléculas de ligação ao antígeno sob uma condição de alta concentração de cálcio; (b) colocar uma molécula de ligação ao antígeno na etapa (a) sob uma condição de baixa concentração de cálcio; e (c) obter uma molécula de ligação ao antígeno que se dissocia na etapa (b).

38. Método de seleção de uma molécula de ligação ao antígeno que tem pelo menos uma função selecionada entre: (i) função de promover a absorção de um antígeno pelas células; (ii) função de se ligar a um antígeno duas ou mais vezes; (iii) função de promover a redução da concentração plasmática de antígeno e (iv) função de excelência na retenção plasmática, o método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de (a) a (d) abaixo: colocar um antígeno em contato com uma molécula de ligação ao antígeno ou uma biblioteca de moléculas de ligação ao antígeno sob uma condição de baixa concentração de cálcio; (b) selecionar uma molécula de ligação ao antígeno que não se ligue ao antígeno da etapa (a); (c) permitir que a molécula de ligação ao antígeno selecionado na etapa (b) se ligue ao antígeno sob uma condição de alta concentração de cálcio; e (d) obter uma molécula de ligação ao antígeno que se ligue ao antígeno na etapa (c).

39. Método de seleção de acordo com qualquer uma das reivin-

dicações 36 a 38, caracterizado pelo fato de que a concentração baixa de cálcio é uma concentração de cálcio ionizado de 0,1 a 30 µM, e em que a concentração alta de cálcio é uma concentração de cálcio ionizado de 100 µM a 10 mM. 5 40. Método de seleção de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 36 a 39, caracterizado pelo fato de que a concentração baixa de cálcio é uma concentração intra-endossômica de cálcio ionizado, e em que a concentração alta de cálcio é uma concentração plasmática de cálcio ioniza- do.

41. Método de seleção de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 36 a 40, caracterizado pelo fato de que o antígeno ao qual a molé- cula de ligação ao antígeno se liga é um antígeno selecionado do grupo que consiste em IL-6R, IL-6, IgA, glipicana 3 humana e IgE.

42. Método de seleção de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 36 a 41, caracterizado pelo fato de que a molécula de ligação ao antígeno é um anticorpo.

43. Uso da molécula de ligação ao antígeno como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 22 ou uma molécula de ligação ao an- tígeno produzida pelo método como definido em qualquer uma das reivindi- cações 23 a 32, caracterizado pelo fato de que é para a promoção da absor- ção do antígeno em uma célula pela molécula de ligação ao antígeno.

44. Uso da molécula de ligação ao antígeno como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 22 ou uma molécula de ligação ao an- tígeno produzida pelo método como definido em qualquer uma das reivindi- cações 23 a 32, caracterizado pelo fato de que é para a promoção da redu- ção de concentração de antígeno no plasma.

45. Uso da molécula de ligação ao antígeno como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 22 ou uma molécula de ligação ao an- tígeno produzida pelo método como definido em qualquer uma das reivindi- cações 23 a 32, caracterizado pelo fato de que é para aumentar o número de vezes de ligação ao antígeno por uma molécula de ligação ao antígeno.

46. Uso da molécula de ligação ao antígeno como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 22 ou uma molécula de ligação ao an- tígeno produzida pelo método como definido em qualquer uma das reivindi- cações 23 a 32, caracterizado pelo fato de que é para aperfeiçoar a retenção plasmática de uma molécula de ligação ao antígeno.

47. Invenção, em quaisquer formas de suas concretizações ou em qualquer categoria aplicável de reivindicação, por exemplo, de produto, ou de processo, ou uso, englobadas pela matéria inicialmente descrita, reve- lada, ou ilustrada no pedido de patente.