KR20140005864A - 미오스타틴에 결합하는 항체, 조성물 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 선택성 미오스타틴 길항제(항체를 포함하는), 그들을 인코딩하는 핵산, 및 그들을 사용하고 만드는 방법이 개시되어 있다. 위치 21 내지 31 및 위치 50 내지 60 근처의 입체형태적(conformational) 에피톱을 인식하는 중화 항체(neutralizing antibody).

Description

미오스타틴에 결합하는 항체, 조성물 및 방법{ANTIBODIES THAT BIND MYOSTATIN, COMPOSITIONS AND METHODS}
본 출원은 2010년 8월 16일 출원된, 미국 가특허출원 61/374,095호의 35 U.S.C. 119항에 따른 이익을 주장하며, 이는 본 명세서에 참조로 포함되어있다.
본 발명은 전반적으로 미오스타틴(myostatin) 및 그에 결합하는 프로틴에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 미오스타틴 억제제 및 그들의 사용에 관한 것이다.
미오스타틴으로도 지칭되는 성장/분화 인자 8(GDF-8)는, 발달 중인 그리고 성인의 골격근 조직(adult skeletal muscle tissue) 및 세포에서 대부분 발현되는 TGF-β 패밀리 멤버(family member)이다. 미오스타틴은 골격근 성장을 음성적으로 조절하는 것에서 본질적인 역할을 하는 것으로 보인다(McPherron 등. Nature (London) 387, 83-90 (1997)). 미오스타틴 유전자에서의 돌연변이는 소(cattle), 돼지(pig), 개(dog) 및 인간(human)을 포함하는 다양한 종에서 증명되어왔으며, 증가된 근조직(musculature)을 야기해왔다(Kocamis and Killefer, Domestic Animal Endocrinology 23:447; 2002). 게다가, 미오스타틴을 길항시키는(antagonizing)것은 동물에서 순근육량(lean muscle mass)을 증가시키는 것으로 보여져왔다(McFerron 등, supra, Zimmers 등, Science 296:1486 (2002)).
미오스타틴 길항제(antagonist)는 인간 임상실험에서 평가되어져왔다. MYO-29로 지칭되는 인간 항체는 다양한 형태의 근디스트로피(muscular dystrophy)를 갖는 환자들에게서 평가되었다. 이 미오스타틴 길항제의 초기 임상결과는 좋은 안전성 및 내성(tolerability)을 증명했으며, 근력(muscle strength) 또는 근기능(muscle function)에서 뛰어난 향상을 보이지 않았고(그러나, 그 연구는 효능을 증명하는것에 이르지 않았다); 증가된 근육 크기(size)에 대한 경향은 대상의 제한된 숫자에서 확인되었다(Wagner 등. Ann. Neurol. 63:561; 2008). 그 다음의 연구보고에서, 치료된 환자들에게서 종합적인 정량 근력측정은 향상되지 않았고, 그러나 몇몇 환자들은 단일 근육 섬유 수축특성에서 향상을 보였다(Krivickas 등. Muscle Nerv. 39:3; 2009).
미오스타틴 경로(pathway)의 조절(regulation)은 잠재적(latent) 미오스타틴 복합체를 성숙한 미오스타틴으로 가공하는 것을 필요로 한다고 여겨진다. 잠재적 복합체는 성숙한 C-말단 이합체(dimer)와 비공유결합으로 관련되고 생물학적으로 비활성인 절단된 프로펩티드 도메인으로 구성된다. 조직-특이 인자(Tissue-specific factor)는 비활성 복합체를 생물학적으로 활성인 형태로 변환하는데 책임이 있는 것으로 생각된다. 미오스타틴은 또한 폴리스타틴-관련 유전자(follistatin-related gene)(FLRG) 및 성장 및 분화-연관 인자-연관 혈청 프로틴-1(growth and differentiation-associated factor-associated serum protein-1)(GASP-1)와 복합체를 형성하며, 두 복합체 모두 혈청에서 확인되어 왔다.
성숙한 미오스타틴은 액티빈 타입(activin type) IIB 수용체(ActRIIB)와 높은 친화력으로 결합하고, 액티빈 수용체(ActRIIA)와 더 낮은 친화력으로 결합한다. 세포 내 신호전달(Intracellular signalling)은 이합체의 미오스타틴이 ActRIIB에 결합하는 것에 뒤이은 액티빈-유사(activin-like) 키나아제 4 (ALK4)나 액티빈-유사 키나아제 5 (ALK5) 중 하나인 낮은-친화력 타입 I 수용체의 보충에 의해 개시된다. 타입 I 수용체의 인산화는 미오스타틴의 생물학적 효과에 책임이 있는 세포 내 신호전달 경로의 개시를 야기한다.
생체 내(in vivo)에서 미오스타틴 길항제의 효용은 미오스타틴 경로의 신호전달(signalling) 및 조절의 특성에 의한 것뿐만 아니라 활성 도메인의 아미노산 수준(level)에서 미오스타틴과 90% 동일한, 성장 및 분화 인자 11(GDF-11; 또한 뼈형성프로틴(bone morphogenetic protein) 11 또는 BMP-11로 알려져있다)에 대한 미오스타틴의 높은 유사도와 관련되어 왔다. 신호전달 메커니즘(mechanism)에서 높은 서열 일치도(degree of sequence identity) 및 유사도가 미오스타틴과 GDF-11이 특정한 기능을 공유한다는 것을 제시하는 반면, 이러한 두 TGF-베타 패밀리 멤버들의 표적화된 유전자 파괴(gene disruption)는 매우 다른 결과를 보인다. 미오스타틴 넉아웃 마우스들은(knockout mice) 근섬유(myofiber)의 과형성(hyperplasia) 및 비대(hypertrophy)를 보이고, GDF-11 넉아웃 마우스들은 다수의 기형(numerous abnormality)을 가지고 태어난 뒤 직후에 죽는다; 이중 넉아웃 동물들은 단일 넉아웃 마우스들에서 보이지 않은 추가적인 기형들을 보인다(McPherron 등., BMC Dev Biol. 9: 24; 2009).
따라서, 당해 기술분야에 미오스타틴과 결합하여 그 활성을 길항시키면서 관련된 경로 및 이를 억제하는 것의 부작용(adverse effect)을 제거하거나 최소화하는 제제(agent)에 대한 추가적인 요구가 존재한다.
본 발명은 100 pM보다 적은 Kd 로 미오스타틴에 결합하는 분리된 미오스타틴-특이적 항체를 제공한다. 일 실시예에서, 본 발명은 10nM보다 큰 Kd로 GDF-11에 결합하고 100 pM보다 작은 Kd로 미오스타틴에 결합하는 분리된 미오스타틴-특이적 항체를 제공한다. 다른 실시예에서, 본 발명은 GDF-11에 대한 그것의 친화력 보다 적어도 5000배 이상 큰 친화력으로 미오스타틴에 결합하는 분리된 미오스타틴-특이적 항체를 제공한다. 또 다른 실시예에서, 본 발명은 GDF-11보다 적어도 5000배 이상 큰 미오스타틴에 대한 선택성을 보이는 분리된 미오스타틴-특이적 항체를 제공한다.
본 발명의 한 양상에서, 미오스타틴에 결합하여 ALK4와 미오스타틴의 상호작용을 차단하는 분리된 미오스타틴-특이적 항체가 제공된다. 다른 양상에서, 미오스타틴에 결합하여 ALK4와 미오스타틴의 상호작용을 차단하지만 미오스타틴/ ActRIIA 복합체 및/또는 미오스타틴/ ActRIIB 복합체와는 공동-결합(co-bind)하는 분리된 미오스타틴-특이적 항체가 제공된다.
본 발명의 다른 양상에서, 미오스타틴에 결합하는 분리된 미오스타틴-특이적 항체가 제공되는데, 미오스타틴-특이적 길항제에 대한 미오스타틴의 결합에 필요한 상기 미오스타틴의 두 부위는 성숙한 미오스타틴(SEQ ID NO:25)의 위치 50 내지 60 및 위치 21 내지 31 근처 서열에 위치한다. 또한 제공되는 것은 이러한 부위들 안에서 펩티드 결합의 키모트립신 절단(chymotrypsin cleavage)를 막기 위하여, 성숙한 미오스타틴의 위치 50 내지 60 및 위치 21 내지 31 근처 서열에 위치된, 미오스타틴의 두 부위와 상호작용하는 분리된 미오스타틴-특이적 항체이다.
본 발명의 일 실시예에서, 미오스타틴-특이적 길항제는 하나 이상의 라이트 체인(light chain)과 하나 이상의 헤비 체인(heavy chain)을 포함하는 항체이며, 상기 라이트 체인은 3개의 상보성결정부위들(complementarity determining regions)(CDR)을 포함하는 가변부(variable region) 및 불변부(constant region)를 포함하는 것이며, 헤비 체인은 3개의 상보성결정부위들(complementarity determining regions)(CDR)를 포함하는 가변부(variable region) 및 불변부(constant region)를 포함하는 것이다. 이 실시예는 이전에 설명된 하나 이상의 발명의 양상 및/또는 실시예를 포함할 수도 있다. 특정한 실시예에서, 헤비 및 라이트 체인 CDR들의 서열은 본원에 개시되어있다. 일 실시예에서, 라이트 체인 CDR들은 SEQ ID NO:10에 개시된 것들이고, 헤비 체인 CDR들은 SEQ ID NO:20에 개시된 것들이다. 다른 실시예에서, 라이트 체인 CDR들은 SEQ ID NO:1에 개시된 라이트 체인 CDR들; SEQ ID NO:2에 개시된 라이트 체인 CDR들; SEQ ID NO:3에 개시된 라이트 체인 CDR들; SEQ ID NO:4에 개시된 라이트 체인 CDR들; SEQ ID NO:5에 개시된 라이트 체인 CDR들; SEQ ID NO:6에 개시된 라이트 체인 CDR들; SEQ ID NO:7에 개시된 라이트 체인 CDR들; SEQ ID NO:8에 개시된 라이트 체인 CDR들; SEQ ID NO:9에 개시된 라이트 체인 CDR들로 구성된 군으로부터 선택된 것이며; 헤비 체인 CDR들은: SEQ ID NO:11에 개시된 헤비 체인 CDR들; SEQ ID NO:12에 개시된 헤비 체인 CDR들; SEQ ID NO:13에 개시된 헤비 체인 CDR들; SEQ ID NO:14에 개시된 헤비 체인 CDR들; SEQ ID NO:15에 개시된 헤비 체인 CDR들; SEQ ID NO:16에 개시된 헤비 체인 CDR들; SEQ ID NO:17에 개시된 헤비 체인 CDR들; SEQ ID NO:18에 개시된 헤비 체인 CDR들; SEQ ID NO:19에 개시된 헤비 체인 CDR들로 구성된 군으로부터 선택된 것이다.
특정한 실시예에서, 헤비 및 라이트 체인의 가변부의 서열은 본원에 개시되어 있다. 일 실시예에서, 라이트 체인 가변부는 SEQ ID NO:10에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 헤비 체인 가변부는 SEQ ID NO:20에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시예에서 라이트 체인 가변부는 SEQ ID NO:1에 개시된 라이트 체인 가변부; SEQ ID NO:2에 개시된 라이트 체인 가변부; SEQ ID NO:3에 개시된 라이트 체인 가변부; SEQ ID NO:4에 개시된 라이트 체인 가변부; SEQ ID NO:5에 개시된 라이트 체인 가변부; SEQ ID NO:6에 개시된 라이트 체인 가변부; SEQ ID NO:7에 개시된 라이트 체인 가변부; SEQ ID NO:8에 개시된 라이트 체인 가변부; SEQ ID NO:9에 개시된 라이트 체인 가변부로 구성된 군으로부터 선택된 것이며; 헤비 체인 가변부는: SEQ ID NO:11에 개시된 헤비 체인 가변부; SEQ ID NO:12에 개시된 헤비 체인 가변부; SEQ ID NO:13에 개시된 헤비 체인 가변부; SEQ ID NO:14에 개시된 헤비 체인 가변부; SEQ ID NO:15에 개시된 헤비 체인 가변부; SEQ ID NO:16에 개시된 헤비 체인 가변부; SEQ ID NO:17에 개시된 헤비 체인 가변부; SEQ ID NO:18에 개시된 헤비 체인 가변부; SEQ ID NO:19에 개시된 헤비 체인 가변부로 구성된 군으로부터 선택된 것이다.
앞서 언급한 항체들의 변종들 또한 제공된다. 일 실시예에서 변종 항체는 예를 들어,항체 12A5-5와 같은 항체들중 하나와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%로 일치한다. 다른 실시예에서, 변종 항체는 앞서 언급한 항체들과(예를 들어 12A5-5) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 잔기가(아미노산의 결실 또는 치환에 의한) 다르다. 또 다른 실시예에서, 하나 (또는 그 이상)의 아미노산은 번역 후에(post-translationally) 변형된다(예를 들어, 다른 아미노산으로 전환 또는 고리화에 의해; 및/또는 탈아미드화(deamidation), 이성화(isomerization), 무효소당화(glycation) 및/또는 산화(oxidation)에 의해).
발명의 다른 양상에서, 항체의 라이트 체인 불변부는 카파(kappa) 및 람다(lambda) 라이트 체인로 구성된 군으로부터 선택되는 것이며, 헤비 체인의 불변부는 뮤(mu), 델타(delta), 감마(gamma), 알파(alpha) 및 엡실론(epsilon) 불변부로 구성된 군으로부터 선택된 것이다. 다른 실시예에서는 lgG1, lgG2, lgG3 및 lgG4로 구성된 군으로부터 선택된 서브클래스(subclass)에 속하는 항체를 제공한다. 이러한 발명의 양상은 이전에 설명된 양상 및 실시예에 동일하게 적용될 수 있다는 것은 이해될 수 있다.
또한 본 발명은 앞서 언급한 임의의 미오스타틴-특이적 길항제를 인코딩(encoding)하는 분리된 핵산뿐만 아니라, 그러한 핵산을 포함하는 벡터, 그러한 벡터로 형질전환 되거나 트랜스펙션된 분리된 숙주 세포, 및 발현을 촉진하는 조건에서 그러한 숙주세포를 배양하고 배양 배지에서 미오스타틴-특이적 길항제를 회수하는 것을 포함하는 미오스타틴-특이적 길항제의 제조를 위한 방법을 제공한다. 생리학적으로 허용되는 희석제, 부형제 또는 담체 및 이전에 설명된 것과 같은 미오스타틴-특이적 길항제를 포함하는 조성물이 제공 될 수 있고, 마찬가지로 하나 이상의 미오스타틴 활성 억제의 방법으로서, 하나 이상의 미오스타틴 활성이 부분적으로 또는 완전히 억제되도록 그러한 조성물을 개체에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공 될 수도 있다.
발명의 실시예에 덧붙여, 상기 개체는: 생식샘저하증(hypogonadism)(안드로겐 결핍 치료가 원인인 생식샘저하증 및 생식선 기능에서의 연령-관련 감소가 원인인 생식샘저하증을 포함하는); 악액질(cachexia); 심장 악액질(cardiac cachexia), 신장성 악액질(renal cachexia), 심장 위축(cardiac atrophy); 심장 발육부전(cardiac hypotrophy); 심장 부전(heart failure); 근육감소증(sarcopenia); 외상성 골절(traumatic bone fracture); 골다공성 골절(osteoporotic fracture); 뼈 손실(bone loss)(예를들어, 골다공증(osteoporosis) 또는 골감소증(osteopenia)); 애디슨병(Addison's disease); 근육위축가쪽경화증(amyotrophic lateral sclerosis) 또는 운동신경세포병(motor neuron disease)(ALS; MND; 루게릭병); 벨 마비(Bell's palsy, 및 또는 안면 신경 문제); 보툴리눔독소증(botulism); 뇌성마비(cerebral palsy); 샤르코-마리-투스병(Charcot-Marie-Tooth disease) 및 다른 말초신경증(other peripheral neuropathies); 쿠싱증후군(Cushing's syndrome); 당뇨신경병증(diabetic neuropathy); 궐레인 바레 증후군(Guillan-Barre syndrome); 다발경화증(multiple sclerosis); 근위축(muscular atrophy, 진행성 및 척추근위축을 포함하는); 근디스트로피(muscular dystrophy)(이에는 베커 근디스트로피(Becker's muscular dystrophy), 선천적 근디스트로피(cogenital muscular dystrophy), 듀켄씨근디스트로피(Duchenne muscular dystrophy), 원위 근디스트로피(distal muscular dystrophy), 에머리-드레이푸스 근디스트로피(Emery-Dreifuss muscular dystrophy), 얼굴어깨위팔근육디스트로피(facioscapulohumeral muscular dystrophy), 팔다리이음근디스트로피(limb-girdle muscular dystrophy), 근긴장성(myotonic muscular dystrophy), 눈인두근디스트로피(oculopharyngeal muscular dystrophy), 척추근위축증(spinal muscular atrophy), 브라운-비알레토-반 라에레 증후군(Brown-Vialetto-Van Laere syndrome, BWL), 파지오-론데 증후군(Fazio-Londe syndrome), 및 진행성골근육약화(progressive weakness), 근프로틴결핍(defects in muscle protein), 및 근세포 및 근조직 사멸에 의해 특징지어진 다른 증후군을 포함하는 다양한 형태가 있다); 중증근무력증(myasthenia gravis); 회색질척수염(poliomyelitis); 다발근육염(polymyositis); 근육, 힘줄 및 또는 인대의 접질림 및 염좌(sprains and strains); 뇌졸중(stroke)(및 장기적 무기력(prolonged inactivity) 또는 장기요양(bed-rest), 사지고정(immobilization of limbs)(예를 들어 석고붕대고정 및 부목고정에 의한), 및 우주비행과 같은 근소모를 야기하는 다른 질환); 및 성장호르몬, 인슐린 성장 인자-1(IGF-1), 성장 호르몬 분비촉진제, 및 성장 호르몬- IGF-1 액시스(axis)와 관련된 다른 제제(agent)에 의해 치료 가능한 질환으로 구성된 군으로부터 선택된 질환에 의해 고통을 받았다.
도 1은 실시예 4에서 설명된 대로, 대조군(PBS; 흰 동그라미)과 비교하여 미오스타틴 억제제가 투여된 마우스들의 총 체중의 증가량(항-미오스타틴 항체 12A5-5, 검은 마름모)를 설명한 것이다.
도 2은 핵자기공명(NMR)에 의해 측정된 4주차의 지방제외체중(lean body mass)의 변화를 나타낸 것이다.
도 3은 지정된 분자 내 및 분자 간 이황화 결합을 가진 성숙한 형태(mature form)의 인간 미오스타틴의 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 이황화 결합 Cys15-Cys74, Cys43-Cys106, 및 Cys47-Cys108은 시스테인 매듭구조(cystine knot structure)를 형성한다.
도 4은 Cys73에서 두 개의 55-78 서열에 함께 연결된 다른 이황화 결합 및 시스테인 매듭을 형성하기 위해 네개의 LysC 펩티드와 함께 연결된 이황화 결합을 보이는 펩티드 G의 일차구조(primary structure)를 설명한 것이다. 펩티드 G는 항체에 결합하는 것을 보인다.
도 5은 Cys73에서 두 개의 63-82 서열을 연결하는 이황화 결합 및 시스테인 매듭을 형성하기 위해 네개의 카이모트롭신분해(chymotryptic) 펩티드를 함께 연결하는 이황화 결합을 보이는 펩티드 N의 일차구조를 설명한 것이다. 펩티드 N은 항체에 결합하지 않는다.
도 6은 비-환원된 및 TCEP-환원된 펩티드 샘플을 위한 BIAcore® 경쟁 분석(competition assay)의 결과를 나타낸 것이다. 펩티드 A, C, E, G, O 및 P는 모두 항체 12A5-5에 결합할 수 있으며 그렇게 함으로써 성숙한 미오스타틴에 결합하는 것으로부터 12A5-5를 예방한다. 항체와 결합하는 것을 보이는 시스테인 매듭 카이모트롭신 분해 펩티드, 펩티드 N 및 펩티드 G의 TCEP 환원으로부터 얻어진 것을 포함한 다른 펩티드들은 시험되지 않았다.
도 7은 미오스타틴과 함께 펩티드 A, C, E, G에 대한 BIAcore® 경쟁 분석의 결과를 설명한 것이다.
도 8은 미오스타틴/폴리스타틴 복합체의 공동-크리스탈(co-crystal) 구조에서 유도된 미오스타틴 이합체 및 단량체의 구조를 나타낸 것이다. 이황화 결합에 관여된 Cys 잔기는 표시되어있고, 이는 12A5-5의 결합에 중요하다고 여겨지는 부위에 있는 추가적인 아미노산 잔기이다(장사방형으로 가려진 부분으로 표시된다).
본 발명은 미오스타틴(항-미오스타틴 항체, 항체 단편, 및 항체 유도체와 같은)에 결합하여 적어도 미오스타틴의 생물학적 활성을 억제하는 분자와 관련된 조성물, 키트 및 방법을 제공한다. 본원에서 사용된 "미오스타틴 길항제"는 "미오스타틴 억제제"와 교환적으로 쓰인다. 본 발명에 따른 미오스타틴 길항제는 하나 이상의 미오스타틴 활성을 억제하거나 차단하며, 또는 그 대신에, 미오스타틴 또는 그 수용체의 발현을 차단한다. 미오스타틴 활성의 억제 또는 차단은, 예를 들어, 미오스타틴과 그 수용체의 결합을 방해하는 및/또는 미오스타틴과 그 수용체의 결합으로 야기되는 신호전달을 차단하는 하나 이상의 억제제를 사용하여 달성될 수 있다. 길항제는 미오스타틴 그 자신에 결합하는 제제, 또는 미오스타틴 수용체에 결합하는 제제를 포함한다. 예를 들어, 미오스타틴 길항제는 폴리스타틴, 미오스타틴 프로도메인, 성장 및 분화 인자 11(GDF-11) 프로도메인, 프로도메인 융합 프로틴, 미오스타틴에 결합하는 길항적 항체, 액티빈 타입 IIB 수용체에 결합하는 길항적 항체 또는 항체 단편, 가용성 액티빈 타입 IIB 수용체, 가용성 액티빈 타입 IIB 수용체 융합 프로틴, 가용성 미오스타틴 유사체(analogs)(가용성 리간드), 올리고뉴클레오티드, 소분자, 펩티도미메틱스(peptidomimetics), 및 미오스타틴 결합제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이들은 아래에 더 자세히 설명된다.
또한 제공된 것은 미오스타틴에 결합하는 폴리펩티드의 부분 또는 전체를 인코딩하는 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 핵산, 및 유도체 및 그들의 단편이며, 예를 들어, 항-미오스타틴 항체, 항체 단편, 또는 항체 유도체의 부분 또는 전체를 인코딩하는 핵산; 이 핵산을 포함하는 플라스미드 및 벡터, 및 이 핵산 및/또는 벡터 및 플라스미드를 포함하는 세포 또는 세포주이다. 제공된 방법은 예를 들어, 항-미오스타틴 항체와 같은 미오스타틴에 결합하는 분자를 제조하고, 식별하고, 또는 분리하는 방법, 분자가 미오스타틴에 결합했는지 결정하는 방법, 어떤 분자가 미오스타틴을 길항시키는지 결정하는 방법, 미오스타틴에 결합하는 분자를 포함하는 약제학적 조성물과 같은 조성물을 제조하는 방법, 미오스타틴에 결합하는 분자를 대상에 투여하는 방법, 예들 들어 생체 내 또는 시험관 내에서 미오스타틴의 생물학적 활성을 길항시키기 위한(또는 억제하기 위한) 방법 및 미오스타틴에 의해 매개되는 질환을 치료하기 위한 방법을 포함한다. 미오스타틴의 이런 한 생물학적 활성은 미오스타틴 수용체에 결합하는 것이며; 다른 활성은 골격근 성장의 음성적 조절이다.
폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열은 일반적인 원- 또는 쓰리-레터 약어(one- or three-letter abbreviation)로 나타내진다. 다르게 나타내지 않는 한, 각 폴리펩티드 서열은 왼쪽에 아미노 말단들을 갖고 오른쪽에 카르복시 말단을 갖는다; 각 단일-가닥 핵산 서열, 및 각 이중-가닥 핵산 서열의 위의 가닥은 왼쪽에 5' 말단 그리고 오른쪽에 3' 말단을 갖는다. 특정 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 또한 참조 서열과 어떻게 다른지 설명하는 것에 의해 기술될 수 있다.
본원에서 다르게 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용된 과학적 및 기술적 용어들은 당해 기술분야의 통상의 지식에 의해 흔히 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥에서 필요로 하지 않는 한, 단수 형태는 다수를 포함할 것이며, 복수 형태는 단수를 포함할 것이다. 일반적으로, 본원에서 기술된 세포 및 조직 배양, 분자생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 프로틴 및 핵산 화학 및 이종교배(hybridization) 및 이들의 기술과 관련하여 사용된 명명법(nomenclature)은 당해 기술분야에서 잘 알려지고 흔히 쓰이는 것이다.
본 발명의 기술 및 방법은 당해 기술분야에서 잘 알려지고 다르게 나타내지 않는 한 본 명세서에 걸쳐 인용되고 논해진 다양한 일반적 및 더 구체적인 참조문헌에 기술된 통장적인 방법에 따라서 수행된다. 예를 들어, 본원에 참조문헌으로 포함된 Sambrook 등. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) and Ausubel 등., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), and Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)을 인용한다. 효소적 반응 및 정제 기술은 본원에서 기술되거나 당해 기술분야에서 흔히 달성되는 것과 같은 제조자의 명세서에 따라 수행된다. 본원에서 기술된 분석 화학, 합성 유기 화학(synthetic organic chemistry), 및 의약 화학 및 약제학적 화학, 및 이들의 실험 과정 및 기술 와 관련하여 사용된 용어는 당해 기술분야에서 잘 알려지고 흔히 쓰이는 것이다. 일반적인 기술은 화학적 합성, 화학적 분석, 약제학적 제제(preparation), 제형(formulation), 및 담체, 및 환자 치료제로 사용될 수 있다.
다르게 나타내지 않는 한, 하기의 용어들은 하기의 뜻을 갖는 것으로 이해 될 것이다:
"분리된 분자"(예를 들어, 분자는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 항체이다)라는 용어는 그것의 기원 또는 어원의 소스에 의해서 (1) 그것의 원형 상태에서 그것과 동반하는 자연적으로 관련된 성분과는 관련되지 않고, (2) 같은 종으로부터 얻은 다른 분자가 실질적으로 없고 (3) 다른 종으로부터 얻은 세포에 의해 발현되거나, 또는 (4) 인간 간섭 없이는 사실상 일어나지 않는 분자이다. 따라서, 화학적으로 합성 되거나 또는 자연적으로 비롯된 것에서 온 세포와는 다른 세포성 시스템 안에서 합성된 분자는 그것의 자연적으로 관련된 성분에서 온 "분리된" 일 것이다. 또한 분자는 당해 기술분야에서 잘 알려진 정제 기술을 사용하여 분리함으로써 자연적으로 관련된 성분이 실질적으로 없게 될 수 도 있다. 분자 순도(Molecule purity) 또는 동종성(homogeneity)은 당해 기술분야에서 잘 알려진 다수의 방법에 의해서 검정될 수 도 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 샘플의 순도는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법을 사용하고 당해 기술분야에서 잘 알려진 기술을 사용해 폴리펩티드를 시각화하기 위한 겔을 염색하여 검정될 수 있다. 특정 목적을 위해, HPLC 또는 당해 기술분야에서 잘 알려진 정제를 위한 다른 방법을 사용하는 것에 의해 고해상도가 제공 될 수도 있다.
"미오스타틴 억제제" 및 "미오스타틴 길항제"라는 용어는 교환적으로 쓰였다. 그 각각은 하나 이상의 미오스타틴 기능을 탐지 가능하게 억제시키는 분자이다. 반대로, "미오스타틴 작용제(agonist)"는 미오스타틴의 하나 이상의 기능을 탐지 가능하게 증가시키는 분자이다. 미오스타틴 억제제에 의해 유발된 억제는 예를 들어 검정법을 사용하는 것에 의해 그것이 탐지 가능하기만 하면 완벽할 필요는 없다. 미오스타틴의 기능의 임의의 검정법이 사용될 수 있고, 예들은 본원에 제공되어있다. 미오스타틴 억제제에 의해 억제될 수 있는(또는 미오스타틴 작용제에 의해 증가 될 수 있는) 미오스타틴의 기능의 예들은 미오스타틴 수용체(또는 이 수용체를 발현시키는 세포들)에 결합 및 골격근 성장의 음성조절을 포함한다. 미오스타틴 억제제 및 미오스타틴 작용제 유형의 예들은 항원 결합 프로틴(예를 들어, 미오스타틴 항원 결합 프로틴), 항체, 항체 단편, 및 항체 유도체와 같은 미오스타틴 결합 폴리펩디드를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
"펩티드", "폴리펩티드" 및 "프로틴"이라는 용어는 각각 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 둘 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 나타낸다. 이러한 용어들은, 예를 들어 프로틴 서열의 폴리펩티드 유사체(뮤테인, 변종, 및 융합 프로틴과 같은), 프로틴 단편 및 천연 및 인공적 프로틴 뿐만 아니라 후-번역적, 또는 그렇지 않으면 공유결합 또는 비-공유결합으로, 변형된 프로틴을 포함한다. 펩티드, 폴리펩티드, 또는 프로틴은 단량체 또는 다량체 일 수도 있다.
본원에서 사용된 "폴리펩티드 단편"이라는 용어는 상응하는 전장 프로틴과 비교하였을 때 아미노-말단 및/또는 카르복시-말단의 결실(deletion)을 갖는 폴리펩티드를 나타낸다. 예를 들어, 단편은 길이에 있어서 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 50, 70, 80, 90, 100, 150 또는 200개 이상의 아미노산일 수 있다. 또한 단편은 예를 들어, 길이에서 1,000, 750, 500, 250, 200, 175, 150, 125, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 14, 13, 12, 11, 또는 10개 이하의 아미노산 일 수 있다. 단편은, 그 끝의 어느 하나 또는 둘 다에서, 하나 이상의 추가적인 아미노산, 예를 들어, 다른 자연적으로-발생된 프로틴에서 온 아미노산의 서열(예를 들어, Fc 또는 류신 지퍼 도메인) 또는 인공적 아미노산 서열(예를 들어, 인공적 링커 서열 또는 태그 프로틴)을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 어떤 방법으로 및 어떤 이유로 인해서 변형되어온 폴리펩티드를 포함한다, 예를 들어: (1) 단백질 가수분해에 대한 민감성을 감소하는, (2) 산화에 대한 민감성을 감소하는, (3) 프로틴 복합체를 생성하기 위한 결합 친화도를 바꾸는, (4) 결합 친화도를 바꾸는, 및 (5) 다른 물리화학적 또는 기능적 성질들을 부여 또는 변형하는 것이다. 유사체들은 폴리펩티드의 뮤테인(mutein)을 포함한다. 예를 들어, 단일 또는 다중 아미노산 치환(예를 들어, 보존적 아미노산 치환)은 자연적으로 발생된 서열(예를 들어, 분자간 접촉을 형성하는 도메인(들) 밖 폴리펩티드의 부분에서)에서 만들어 질 수도 있다. 공통 서열은 치환을 위한 아미노산 잔기의 선택에 사용될 수 있고; 당업자들은 추가적 아미노산 잔기가 또한 치환될 수도 있음을 인정한다.
"보존적 아미노산 치환"은 부모 서열(parent sequence)의 구조적 특징이 실질적으로 변화하지 않는(예를 들어, 아미노산의 대체는 부모 서열에서 발생하는 헬릭스를 파괴하거나 또는 부모 서열의 특징이 되거나 그 기능성에 필수적인 이차 구조의 다른 유형을 파괴하는 경향을 띄지 않아야 한다) 것이다. 기술-인정된(art-recognized) 폴리펩티드 2차 및 3차 구조의 예들은, 각각 본원에서 참조로 포함된 Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); 및 Thornton et at. Nature 354:105 (1991)에 기술되어 있다.
본 발명은 또한 미오스타틴 결합 폴리펩티드의 비-펩티드 유사체를 제공한다. 비-펩티드 유사체는 흔히 약제학적 산업에서 그러한 주형 펩티드(template peptide)와 유사한 성질을 갖는 약물로 사용된다. 이러한 유형의 비-펩티드 화합물은 "펩티드 미메틱스" 또는 "펩티도미메틱스"로 일컬어지며, 예를 들어, 본원에서 참조문헌으로 포함된 Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber and Freidinger TINS p.392 (1985); and Evans 등. J. Med. Chem. 30:1229 (1987)를 인용한다. 치료적으로 유용한 펩티드들과 구조적으로 유사한 펩티드 미메틱스는 동등한 치료 또는 예방 효과를 생산하는데 쓰일 수도 있다. 일반적으로, 펩티도미메틱스는 인간 항체와 같은 패러다임 폴리펩티드와 구조적으로 유사하다(즉, 바람직한 생화학적 성질 또는 약리학적 활성을 갖는 폴리펩티드), 그러나 당해 기술분야에서 잘 알려진 방법에 의해, --CH2NH--, --CH2S--, --CH2 --CH2 --, --CH=CH-(시스 및 트랜 스), --COCH2--, --CH(OH)CH2--, 및 --CH2SO-로 구성된 그룹에서 선택된 결합으로 선택적으로 대체된 하나 이상의 펩티드 결합을 갖는다. 공통서열에서 하나 이상의 아미노산이 같은 유형의 D-아미노산(예를 들어, L-라이신 대신에 D-라이신)으로의 체계적인 치환은 또한 더 안정한 펩티드를 생성하는데 쓰일 수도 있다. 게다가, 공통서열 또는 실질적으로 동일한 공통서열 변이를 포함하는 강요된 펩티드(constrained peptide)들은 당해 기술분야에서 알려진 방법(Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992), incorporated herein by reference), 예를 들어, 펩티드를 고리화 하는 분자 내 디설파이드 브릿지(disulfide bridge)를 생성할 수 있는 내부 시스테인 잔기를 첨가하는 것에 의하는 방법에 의해서 생성될 수도 있다.
폴리펩티드의 "변종"은 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 폴리펩티드 서열에 비해 아미노산 서열에 삽입, 결실 및/또는 치환된 아미노산 서열을 포함하는 것이다. 본 발명의 변종은 융합 프로틴을 포함한다.
폴리펩티드의 "유도체"는 예를 들어, 다른 화학적 모이에티(moiety)(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 또는 인간 혈청 알부민과 같은 알부민)에 접합, 인산화, 및/또는 당화(glycosylation)를 통해서 화학적으로 변형됐던 폴리펩티드(예를 들어, 항체)이다. 다르게 나타내지 않는 한, "항체"라는 용어는, 두개의 전체-길이 헤비 체인 및 두개의 전체-길이 라이트 체인을 포함하는 항체뿐 아니라, 유도체, 변종, 단편, 및 그들의 뮤테인을 포함하며, 그 예들은 아래에 기술되어있다.
"항원 결합 프로틴"은 항원, 및 선택적으로 스캐폴드(scaffold) 또는 항원 결합 부분이 항원에 항원 결합 프로틴의 결합을 촉진시키는 형태를 채택하는 것을 가능하게 하는 골격 부분(framework portion)에 결합하는 부분을 포함하는 프로틴이다. 항원 결합 프로틴의 예들은 항체들, 항체 단편(예를 들어, 항체의 항원 결합 부분), 항체 유도체, 및 항체 유사체를 포함한다. 항원 결합 프로틴은 예를 들어, 그라프트된(grafted) CDR들 또는 CDR 유도체를 갖는 인공적 스캐폴드 또는 대체적 프로틴 스캐폴드를 포함한다. 이러한 스캐폴드들은 예를 들어, 생체 적합한 폴리머를 포함하는 완전 합성 스캐폴드 뿐만 아니라 예를 들어, 항원 결합 프로틴의 3차원적 구조를 안정화하기 위해 도입된 돌연변이를 포함하는 항체-유래된 스캐폴드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, Korndorfer 등., 2003, Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, Volume 53, Issue 1:121-129; Roque 등., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654을 인용한다. 게다가, 펩티드 항체 미메틱스("PAMs")는 피브로넥션(fibronetction) 성분을 스캐폴드로 사용하는 항체 미메틱스에 근거한 스캐폴드로도 사용될 수 있다.
항원 결합 프로틴은, 예를 들어, 자연적으로 발생한 면역글로불린의 구조를 가질 수 있다. "면역글로불린"은 사합체(tetrameric) 분자이다. 자연적으로 발생한 면역글로불린에서, 각 사합체는 각 쌍이 한 개의 "라이트"(약 25 kDa) 및 한 개의 "헤비" 체인(약 50-70 kDa)을 갖는 폴리펩티드 사슬들의 두 개의 동일한 쌍으로 이루어진다. 각 사슬의 아미노-말단 부분은 항원 인식에 주된 원인인 약 100 내지 110 또는 그 이상의 아미노산의 가변부를 포함한다. 각 사슬의 카르복시-말단 부분은 작동 기능(effector function)에 주된 원인인 불변부를 정의한다. 인간 라이트 체인은 캅파 또는 람다 라이트 체인로 분류된다. 헤비 체인은 뮤, 델타, 감마, 알파, 또는 엡실론으로 분류되며, 각각 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE인 항체의 이소타입으로 정의된다; lgG 항체들은 인간에서 4개의 서브클래스로 더 나눠 질 수 있다(IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4). 라이트 및 헤비 체인 내에서, 가변부 및 불변부는 또한 약 10 이상의 아미노산의 "D"부위를 포함하는 헤비 체인과, 약 12 이상의 아미노산의 "J"부위에 의해서 연결된다. Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)) (모든 목적을 위해 그 전체가 참고 문헌으로 포함된)를 일반적으로 인용한다. 각 라이트/헤비 체인 쌍의 가변부는 온전한 면역글로불린이 두 개의 결합 부위를 갖도록 항체 결합 부위를 형성한다.
자연적으로 발생한 면역글로불린 사슬의 가변부는 3개의 고변이부위에 의해 연결되고 또한 상보성 결정 부위 또는 CDR들이라 불리는 상대적으로 보존된 골격부(framework region, FR)의 일반적인 구조와 같은 구조를 보인다. N-말단에서 C-말단까지, 라이트 및 헤비 체인 둘 다는 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각 도메인으로 아미노산의 지정(assignment)은 Kabat 등. in Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242, 1991의 정의에 따른다. 면역글로불린 사슬에서 아미노산을 위한 다른 숫자 체계(numbering system)는 IMGT®를 포함한다(세계적 면역유전학(ImMunoGeneTics) 정보 시스템; Lefranc 등, Dev. Comp. Immunol. 29:185-203; 2005) and AHo (Honegger and Pluckthun, J. Mol. Biol. 309(3):657-670; 2001).
항체들은 다양한 항원 특이성을 갖는 면역글로불린을 함유하는 혈청 또는 혈장(plasma)과 같은 소스로부터 얻어질 수 있다. 만약 이런 항체들이 친화성 정제에 적용되면, 그들은 특정한 항원 특이성을 위해 강화될 수 있다. 이러한 항체들의 강화된 제제는 대게 특정한 항원에 대해 특이적 결합 활성을 갖는 약 10% 미만의 항체로 제조된다. 이러한 제제를 친화성 정제의 몇몇 라운드들에 적용하는 것은 항원에 대해 특이적 결합 활성을 갖는 항체의 비율을 증가시킬 수 있다. 이 방법으로 제조된 항체들은 흔히 "단일특이성(monospecific)"이라 지칭된다. 단일특이적 항체 제조는 특정 항원에 대해 특이적 결합 활성을 갖는 약 10 %, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 99.9%의 항체로 이루어 질 수 있다.
"항체"는 따로 명기되지 않는 한 온전한 면역글로불린 또는 특이적 결합에 대한 온전한 항체와 경쟁하는 그들의 항원 결합 부분을 지칭한다. 항원 결합 부분은 재조합 DNA 기술에 의해서 또는 온전한 항체들의 효소적 또는 화학적 분리에 의해서 생성될 수도 있다. 항원 결합 부분은, 그 중에서도, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 도메인 항체들(dAbs), 및 상보성 결정 부위들(CDR) 단편, 가변부 단편, 단일-사슬 항체(scFv), 키메라 항체(chimeric antibody), 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), 및 적어도 특이적 항원 결합을 폴리펩티드에 부여하기에 충분한 면역글로불린의 부분을 함유하는 폴리펩티드를 포함한다.
Fab 단편은 VL, VH, CL and CH1 도메인을 갖는 1가 단편이며; F(ab')2 단편은 경첩 영역(hinge region)에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 두 개의 Fab 단편을 갖는 2가 단편이며; Fd 단편은 VH 및 CH1 도메인을 가지며; Fv 단편은 항체의 단일 팔(single arm)의 VL 및 VH 도메인을 가지며; 그리고 dAb 단편은 VH 도메인, VL 도메인, 또는 VH or VL 도메인의 항원-결합 단편을 가진다(US Pat. No. 6,846,634, 6,696,245, US App. Pub. No. 05/0202512, 04/0202995, 04/0038291, 04/0009507, 03/0039958, Ward 등., Nature 341:544-546, 1989).
단일-사슬 항체(scFv)는 계속적인 프로틴 사슬을 형성하기 위한 링커(예를 들어, 아미노산 잔기의 합성 서열)를 통해 연결된 VL 및 VH부위인 항체이며 상기 링커는 프로틴 사슬이 그 자신으로 되접어 꺾이게 하고 1가 항원 결합 부위를 형성하기에 충분히 길다(예를 들어, Bird 등., 1988, Science 242:423-26 and Huston 등., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83를 인용한다). 디아바디는 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 2가 항체이며, 상기 각 폴리펩티드 사슬은 같은 사슬에서 두 개의 도메인 사이에 쌍을 짓게 하기엔 너무 짧은 링커에 의해 연결된 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 따라서 각 도메인이 다른 폴리펩티드 사슬에서 상보적 도메인과 짝을 이루게 한다(예를 들어, Holliger 등., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48, and Poljak 등., 1994, Structure 2:1121-23을 인용한다). 만약 디아바디의 두 개의 폴리펩티드 사슬이 동일하다면, 그들의 쌍짓기가 원인인 디아바디는 두 개의 동일한 항원 결합 부위를 가질 것이다. 서로 다른 서열을 갖는 폴리펩티드 사슬은 두 개의 서로 다른 항원 결합 부위와 함께 디아바디를 만드는데 사용될 수 있다. 비슷하게, 트리아바디 및 테트라바디들은 각각, 세 개 및 네 개의 폴리펩티드 사슬을 포함하고 각각, 같거나 또는 서로 다를 수 있는 세 개 및 네 개의 항원 결합 부위를 형성하는 항체들이다.
일정 항체의 상보성 결정 부위들(CDR) 및 골격부(FR)는 Kabat 등. supra; Lefranc 등., supra 및/또는 Honegger 및 Pluckthun, supra에 의해 기술된 시스템을 사용하여 식별 될 수도 있다. 하나 이상의 CDR들은 이를 항원 결합 프로틴으로 만들기 위해 공유결합으로 또는 비공유결합으로 중 어느 하나로 분자에 포함될 수도 있다. 항원 결합 프로틴은 더 큰 폴리펩티드 사슬의 부분으로 CDR들에 포함될 수도 있고, CDR들을 다른 폴리펩티드 사슬에 공유결합으로 연결 할 수도 있고, 또는 CDR들을 비공유결합으로 포함할 수도 있다. CDR들은 항원 결합 프로틴이 특정한 관심 항원에 특이적으로 결합하는 것을 허용한다.
항원 결합 프로틴은 하나 이상의 결합 부위를 가질 수도 있다. 만약 한 개의 결합 부위보다 많은 것이 있다면, 결합 부위들은 다른 하나와 동일할 수도 있고 또는 다를 수도 있다. 예를 들어, 자연적으로 발생한 인간 면역글로불린은 전형적으로 두 개의 결합 부위를 가지며, 반면 "이중특이적(bispecific)" 또는 "양기능성(bifunctional)" 항체는 서로 다른 두 개의 결합 부위를 갖는다.
"인간 항체"라는 용어는 인간 면역글로불린 서열에 의해 유래된 하나 이상의 가변 및 불변부를 갖는 모든 항체들을 포함한다. 일 실시예에서, 모든 가변 및 불변 도메인들은 인간 면역글로불린 서열들(완전한 인간 항체)로부터 유래된다. 이러한 항체들은 다양한 방법들로 제조 될 수도 있으며, 인간 헤비 및/또는 라이트 체인-인코딩 유전자들에서 유래된 항체들을 발현시키기 위해 유전적으로 변형된 마우스의 관심 항원으로의 면역화(immunization)를 통하는 것을 포함하는 그 예들은 하기에 기술되어있다.
인간화 항체(humanized antibody)는 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 및/또는 추가에 의해 비-인간 종들에서 유래된 항체의 서열과는 다른 서열을 가지며, 그러한 경우 인간화 항체는 인간 대상에 투여되었을 때 면역 반응을 유도할 가능성이 더 적으며, 및/또는 비-인간 종들의 항체와 비교해서 덜 심각한 면역 반응을 유도한다. 일 실시예에서, 비-인간 종 항체의 헤비 및/또는 라이트 체인의 골격 및 불변부에서 특정 아미노산은 인간화 항체를 생성하기 위해 돌연변이가 된다. 다른 실시예에서, 인간 항체로부터 온 불변 도메인(들)은 비-인간 종들의 가변 도메인(들)과 융합된다. 다른 실시예에서, 비-인간 항체의 하나 이상의 CDR 서열에 있는 하나 이상의 아미노산 잔기는 비-인간 항체가 인간 대상에 투여되었을 때 그것의 그럴듯한 면역원성을 감소시키기 위해 변화되며, 상기 변화된 아미노산 잔기들은 그 항원에 대한 항체의 면역특이적 결합에 중요하지 않거나, 또는 만들어진 아미노산 서열로의 위 변화는 보존적 변화이며, 그러한 경우 항원에 대한 인간화 항체의 결합은 항원에 대한 비-인간 항체의 결합 보다 상당히 나쁘지 않다. 인간화 항체들을 어떻게 만드는지에 대한 예들은 U.S. Pat. Nos. 6,054,297, 5,886,152 및 5,877,293에서 찾을 수도 있다.
"키메라 항체"는 하나 이상의 다른 항체들로부터 온 하나 이상의 부위(region)들 및 하나의 항체로부터 온 하나 이상의 부위들을 포함하는 항체를 지칭한다. 일 실시예에서, 하나 이상의 CDR들은 인간 항-미오스타틴 항체로부터 유래된다. 일 실시예에서, 모든 CDR들은 인간 항-미오스타틴 항체로부터 유래된다. 다른 실시예에서, 하나 이상의 인간 항-미오스타틴 항체들로부터 온 CDR들은 키메라 항체와 믹스되고(mixed) 매치된다(matched). 예를 들어, 키메라 항체는 1차 인간 항-미오스타틴 항체의 라이트 체인로부터 온 CDR1, 2차 인간 항-미오스타틴 항체의 라이트 체인로부터 온 CDR2 및 CDR3, 및 3차 항-미오스타틴 항체로부터 온 헤비 체인로부터 얻은 CDR들을 포함할 수도 있다. 다른 조합물도 가능하며 이는 본 발명의 실시에 내에서 포함된다.
또한, 골격부는 같은 항-미오스타틴 항체들 중의 하나로부터, 인간 항체와 같은 하나 이상의 서로 다른 항체들로부터, 또는 인간화 항체로부터 유래될 수도 있다. 키메라 항체의 일 실시예에서, 헤비 및/또는 라이트 체인의 부분은 특정한 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 또는 특정한 종으로부터 온 항체와 동일하고, 상응하고, 또는 그것으로부터 유래되나, 반면 사슬의 나머지(들)은 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 또는 다른 종들로부터 온 항체(들)와 동일하고, 상응하고, 또는 그것으로부터 유래된다. 또한 포함된 것은 바람직한 생물학적 활성을 보이는 이러한 항체들의 단편이다. 예를 들어, U.S. Patent No. 4,816,567 및 Morrison, 1985, Science 229:1202-07을 인용한다.
"중화 항체(neutralizing antibody)" 또는 "억제적 항체(inhibitory antibody)"는 과다한 항-미오스타틴이 항체 본원의 실시예에서 기술된 것들과 같은 검정법을 사용하여 상호작용의 양을 적어도 20%까지 감소시킬 때 미오스타틴과 미오스타틴 수용체의 상호작용을 억제하는 항체이다. 다양한 실시예에서, 항원 결합 프로틴은 미오스타틴과 미오스타틴 수용체의 상호작용을 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 및 99.9%까지 감소시킨다.
항체들의 단편 또는 유사체는 하기 본 명세서의 교시에 따르는 당해 기술분야의 통상의 지식인 것들 및 당해 기술분야에서 잘 알려진 기술을 사용하는 것에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 단편 또는 유사체의 아미노- 및 카르복시-말단은 기능성 도메인(functional domain)의 경계 근처에서 발생한다. 구조적 및 기능성 도메인들은 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열 데이터를 공공 또는 사유 서열 데이터베이스와의 비교에 의해서 식별 될 수 있다. 컴퓨터화된 비교 방법은 다른 프로틴의 알려진 구조 및/또는 기능에서 발생하는 서열 모티프 또는 예측된 프로틴 형태 도메인을 식별하는데 사용될 수 있다. 알려진 3차원적 구조를 접어서(fold) 만드는 프로틴 서열을 식별하는 방법은 알려져 있다. 예를 들어, Bowie 등., 1991, Science 253:164 을 인용한다.
"CDR 그라프트된 항체"는 같은 또는 서로 다른 종들 또는 이소타입의 다른 항체의 골격 및 이소타입 또는 특정한 종들의 항체로부터 유래된 하나 이상의 CDR들을 포함하는 항체이다.
"다중-특이적 항체(multi-specific antibody)"는 하나 이상의 항원에 있는 하나 초과의 에피톱을 인식하는 항체이다. 이 타입의 항체의 서브클래스는 같은 또는 다른 항원에 있는 두 개의 구별되는 에피톱을 인식하는 "이중-특이적 항체"이다.
만약 그것이 항원에 1 나노몰 또는 그 이하의 해리상수(dissociation constant, Kd)로 결합한다면 항원 결합 프로틴은 항원(예를 들어, 인간 미오스타틴)에 "특별히 결합"한다. 또한 항원 결합 프로틴은 1차 항원에 대한 해리상수가 2차 항원에 대한 해리상수 보다 현저히 낮을 때 2차 항원과 비교하여 하나의 항원에 "선택적으로" 또는 "우선적으로" 결합한다. "선택적으로"는 항원 결합 프로틴이 예를 들어, 매우 관련된 항원과 같은 2차 항원에 결합하는 정도와 비교하여 특정 항원에 결합하는 정도를 지칭한다. 예들 들어, "미오스타틴-특이적 길항제"는 1 나노몰 또는 그 이하의 Kd로 미오스타틴에 결합하는 것 및 10 nM 또는 그 이상의 Kd로 GDF-11에 결합하는 것이다. 따라서, 미오스타틴 대(versus) GDF-11에 대한 미오스타틴 길항제의 선택성은 10배 또는 그 이상일 수도 있다.
"항원 결합 도메인", "항원 결합부", 또는 "항원 결합 부위"는 항원에 대한 친화력 및항원 결합 프로틴의 특이성에 기여하고 항원과 상호작용 하는 아미노산 잔기(또는 다른 모이에티들)을 함유하는 항원 결합 프로틴의 부분이다. 그것의 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 위해, 이는 적어도 하나 이상의 그 CDR 도메인들의 부분을 포함한다.
"에피톱"은 항원 결합 프로틴(예를 들어, 항체)과 결합되는(또는 그와 상호작용하는) 분자의 부분이다. 에피톱은 분자의 비-인접 부분(non-contiguous portion)을 포함할 수 있다(예를 들어, 폴리펩티드에서, 폴리펩티드의 3차 및 4차 구조와 관련해서는 그렇지 않으나 폴리펩티드의 일차 서열과 인접하지 않는 아미노산 잔기는 항원 결합 프로틴과 결합하거나 또는 상호작용 하기에 서로 충분히 가깝다).
두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 두 개의 폴리펩티드 서열의 "퍼센트 식별"은 그 디폴트 파라미터를 사용한 GAP 컴퓨터 프로그램(GCG Wisconsin Package, version 10.3 (Accelrys, San Diego, CA)의 일부)을 사용해 서열을 비교하는 것에 의해 측정된다.
"폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드" 및 "핵산"이라는 용어는 전체에 걸쳐 교환적으로 사용되며 DNA 분자(예를 들어, cDNA 또는 게노믹 DNA), RNA 분자(예들 들어, mRNA), 뉴클레오티드 유사체를 사용해 생성된 DNA 또는 RNA의 유사체(예를 들어, 펩티드 핵산 및 비-자연적으로 발생한 뉴클레오티드 유사체), 및 그들의 하이브리드를 포함한다. 핵산 분자는 단일-가닥 또는 이중-가닥 일 수 있다. 일 실시예에서, 본 발명의 핵산 분자는 본 발명의 항체, 또는 단편, 유도체, 뮤테인, 또는 그들의 변종을 인코딩하는 인접한 해독틀(contiguous open reading frame)을 포함한다.
두 개의 단일-가닥 폴리뉴클레오티드는 서로의 "보체(complement)"이다 만약 그들의 서열이 역-병렬 방향으로 배열될 수 있고 그러한 경우 갭(gap)의 도입 없이 및 서열의 5' 또는 3' 말단 중 어느 하나에서 쌍이 없는(unpaired) 뉴클레오티드 없이, 하나의 폴리뉴클레오티드에 있는 모든 뉴클레오티드가 다른 폴리뉴클레오티드에 있는 그것의 상보뉴클레오티드(complementary nucleotide)와 마주본다. 폴리뉴클레오티드는 두 개의 폴리뉴클레오티드가 보통의 엄격한 조건에서 다른 하나와 이종교배 될 수 있다면 다른 폴리뉴클레오티드와 "상보적"이다.
"벡터"는 세포안에서 그것으로 연결하는 다른 핵산을 도입하는데 사용될 수 있는 핵산이다. 벡터의 한 유형은 "플라스미드"이다, 이는 추가적인 핵산 조각들(segments)이 결착(ligated)될 수 있는 선형 또는 고리형의 이중 나선 DNA 분자를 지칭한다. 벡터의 다른 유형은 바이러스성 벡터이며(예를 들어, 복제 결손 레트로바이러스(replication defective retroviruses), 아데노바이러스(adenoviruses), 및 아데노-관련 바이러스들), 상기 추가적인 DNA 조각은 바이러스성 게놈으로 도입될 수 있다. 특정 벡터들은 그들이 도입된 숙주세포에서 자동복제(autonomous replication)를 할 수 있다(예를 들어, 박테리아 복제 기점(origin of replication)을 포함하는 박테리아 벡터 및 에피솜(episomal) 포유류 벡터). 다른 벡터는(예를 들어, 비-에피솜 포유류 벡터) 숙주 세포로의 도입에서 숙주 세포의 게놈으로 통합되며, 그렇게 함으로써 숙주 게놈과 함께 복제된다. "발현 벡터"는 선택된 폴리뉴클레오티드의 발현으로 향할 수 있는 유형의 벡터이다.
뉴클레오티드 서열은 조절 서열이 뉴클레오티드 서열의 발현(예를 들어, 발현의 위치, 또는 시기, 정도)에 영향을 주면 조절 서열(regulatory sequence)로 "작동 가능하게 연결(operably linked)"된다. "조절 서열"은 작동 가능하게 연결된 핵산의 발현(예를 들어, 발현의 위치, 또는 시기, 정도)에 영향을 주는 핵산이다. 조절 서열은, 예를 들어, 하나 이상의 다른 분자들(예를 들어, 조절 서열 및/또는 핵산에 결합하는 폴리펩티드)의 작용을 통해 또는 그것의 효과를 조절된 핵산에 직접적으로 가할 수 있다. 조절 서열의 예들은 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 조절 부분(element, 예를 들어 아데닐중합반응 신호)을 포함한다. 조절 서열의 다른 예들은, 예를 들어, Goeddel, 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA and Baron 등., 1995, Nucleic Acids Res. 23:3605-06 에 기술된다.
"숙주 세포"는 예를 들어, 본 발명의 핵산과 같은 핵산을 발현시키는데 사용 될 수 있는 세포이다. 숙주세포는, 예를 들어, E. coli 와 같은 원핵생물일 수 있고, 또는 예를 들어, 단일-세포의 진핵생물(single-celled eukaryote, 예를 들어 효모 또는 다른 균류)과 같은 진핵생물, 식물세포(예를 들어, 담배 또는 토마토 식물 세포), 동물 세포(예를 들어, 인간 세포, 몽키(monkey) 세포, 햄스터 세포, 래트 세포, 마우스 세포, 또는 곤충 세포) 또는 하이브리도마 일 수 있다. 숙주 세포의 예들은 몽키 신장 세포(ATCC CRL 1651, Gluzman 등., 1981, Cell 23:175을 인용한다)의 COS-7 주(COS-7 line), L 세포, C127 세포, 3T3 세포(ATCC CCL 163), 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 Veggie CHO와 같은 그들의 유도체 및 무혈청배지(serum-free media)에서 자란 관련된 세포주(Rasmussen 등., 1998, Cytotechnology 28:31을 인용) 또는 DHFR 결핍인 CHO 스트레인 DX-B11 (Urlaub 등., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-20을 인용), HeLa 세포, BHK (ATCC CRL 10) 세포주, 아프리카 초록 몽키 신장 세포주 CV1 (ATCC CCL 70)로부터 유래된 CV1/EBNA 세포주 (McMahan 등., 1991, EMBO J. 10:2821을 인용), 293, 293 EBNA 또는 MSR 293과 같은 인간 배아의 신장 세포, 인간 상피 A431 세포, 인간 Colo205 세포, 다른 형질전환된 영장류 세포, 정상 2배체세포, 시험관 내에서 1차 조직의 배양으로부터 유래된 세포 스트레인, 1차 조직 절편(primary explants), HL-60, U937, HaK 또는 Jurkat 세포를 포함한다. 전형적으로, 숙주 세포는 폴리펩티드-인코딩 핵산으로 형질전환 또는 트랜스펙션될 수 있고 그 뒤에 숙주세포에서 발현 될 수 있는 배양세포이다. "재조합 숙주 세포"라는 어구는 발현되기 위해 핵산으로 형질전환 또는 트랜스펙션 됐던 숙주세포를 나타내는데 사용 될 수 있다. 또한 숙주 세포는 핵산을 포함하나 조절 서열이 숙주세포로 도입되지 않는 한 바람직한 수준에서 이를 발현하지는 않는 세포일 수 있으며 그러한 경우 이는 핵산과 작동적으로 연결되어진다. 숙주 세포라는 용어는 특정한 대상 세포뿐 아니라 그러한 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 지칭하는 것으로 이해된다. 특정한 변형이 예를 들어, 돌연변이 또는 환경적 영향 때문에 뒤에 이어지는 세대에서 발생할 수도 있기 때문에, 이러한 자손들은, 사실, 부모 세포와 동일하지 않을 수도 있으나, 본원에서 쓰인 용어의 범주 내에 여전히 포함된다.
항원 결합 프로틴
일 양상에서, 본 발명은 인간 미오스타틴과 같은 미오스타틴에 결합하는 항원 결합 프로틴(예를 들어, 항체, 항체 단편, 항체 유도체, 항체 뮤테인, 및 항체 변종)을 제공한다.
본 발명에 따른 항원 결합 단백질은 미오스타틴의 생물학적 활성을 억제하는 항원 결합 단백질을 포함한다. 이러한 생물학적 활성의 예들은 미오스타틴 수용체에 대한 미오스타틴의 결합, 및 이러한 미오스타틴 수용체를 발현시키는 세포에 결합하는 것을 포함한다. 다른 생물학적 활성은 골격근 성장의 음성 조절과 같은, 생체 내에서 미오스타틴에 의해 매개되는 것들을 포함한다.
서로 다른 항원 결합 단백질은 미오스타틴의 서로 다른 에피톱 또는 도메인에 결합할 수도 있고 또는 작용의 서로 다른 메커니즘에 의해 작용 할 수도 있다. 실시예들은 미오스타틴 수용체 또는 그들의 서브유닛에 대한 미오스타틴의 능력을 방해하는 항원 결합 프로틴을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 항원 결합 프로틴은 본 발명에서의 용도를 찾기 위해 미오스타틴 유도 활성을 완전히 억제할 필요는 없다; 대신에, 미오스타틴의 특정한 활성을 감소시키는 항원 결합 프로틴은 또한 사용에 대해 고려될 수 있다. (본원에서 특정 질병을 치료하는데 있어서 미오스타틴-결합 항원 결합 프로틴에 대한 작용의 특정 메커니즘의 논의는 오직 설명에 도움이 되며, 본원에서 제시된 방법들은 그것에 한정되지 않는다.)
본 발명의 범주 내에서 항-미오스타틴 항체의 다른 유도체는, 항-미오스타틴 항체 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단과 융합된 이형(heterologous) 폴리펩티드를 포함하는 재조합 융합 프로틴의 발현에 의하는 것과 같은, 미오스타틴 항체 또는 그들의 단편의 다른 프로틴 또는 폴리펩티드와의 공유적 또는 집합적 접합체(aggregative conjugate)를 포함한다. 예를 들어, 접합된 펩티드는 이형 신호(또는 선도) 폴리펩티드, 예를 들어, 효모 알파-인자 선도, 또는 에피톱 태그와 같은 펩티드 일 수도 있다. 항원 결합 프로틴-함유 융합 프로틴은 항원 결합 프로틴의 식별 또는 정제를 용이하게 하기 위해 첨가된 펩티드들(예를 들어, poly-His와 같은 태그 프로틴)을 포함할 수 있다. 항원 결합 프로틴은 또한 Hopp 등., Bio / Technology 6:1204, 1988, and U.S. Patent 5,011,912에 기술된 대로 FLAG® 펩티드에 연결 될 수 있다. FLAG® 펩티드는 매우 항원성이며 발현된 재조합 프로틴의 손쉬운 정제 및 빠른 검정을 가능하게 하는 특이적 단일클론 항체(mAb)에 의해 가역적으로 결합된 에피톱을 제공한다. FLAG® 펩티드가 일정 폴리펩티드와 융합되어 있는 융합 프로틴을 제조하는데 유용한 시약이 상업적으로 이용 가능하다(Sigma-Aldrich, St. Louis MO).
하나 이상의 항원 결합 프로틴을 함유하는 올리고머(oligomer)는 미오스타틴 길항제로 사용될 수도 있다. 올리고머는 공유결합으로-연결된 또는 비-공유결합으로-연결된 이합체, 삼합체(trimer), 또는 고등 올리고머(higher oligomer)의 형태 일 수도 있다. 둘 이상의 항원 결합 프로틴을 포함하는 올리고머가 사용에 고려되는데 그 예시로써 동종이합체(homodimer)를 들 수 있다. 다른 올리고머는 이질이합체(heterodimer), 동종삼합체(homotrimer), 이질삼합체(heterotrimer), 동종사합체(homotetramer), 이질사합체(heterotetramer) 등을 포함한다.
일 실시예는 항원 결합 프로틴에 융합된 펩티드 모이에티 사이에서 공유결합 또는 비-공유결합 상호작용을 통해 연결된 다중 항원 결합 프로틴을 포함하는 올리고머에 관한 것이다. 이러한 펩티드는 펩티드 링커(스페이서), 또는 올리고머화(oligomerization)를 촉진하는 성질을 갖는 펩티드일 수도 있다. 류신 지퍼(Leucine zipper) 및 항체로부터 유래된 특정 폴리펩티드들은, 하기에 더 자세히 기술된 대로, 그것에 부착되는 항원 결합 프로틴의 올리고머화를 촉진할 수 있는 펩티드들에 속한다.
특정 실시예에서, 올리고머는 두 개 내지 네 개의 항원 결합 프로틴을 포함한다. 올리고머의 항원 결합 프로틴은, 예를 들어 변종 또는 단편과 같이 상기에 기술된 임의의 형태와 같은 임의의 형태 일 수도 있다. 바람직하게는, 올리고머는 미오스타틴 결합 활성을 갖는 항원 결합 프로틴을 포함한다.
일 실시예에서, 올리고머는 면역글로불린으로부터 유래된 폴리펩티드를 사용하여 제조된다. 항체-유래된 폴리펩티드(Fc 도메인을 포함하는)의 다양한 부분에 융합된 특정한 이종 폴리펩티드를 포함하는 융합 프로틴의 제조는 예를 들어, Ashkenazi 등., 1991, PNAS USA 88:10535; Byrn 등., 1990, Nature 344:677; 및 Hollenbaugh 등., 1992 "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", in Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, pages 10.19.1 - 10.19.11에서 기술 되어 있다.
본 발명의 일 실시예는 항체의 Fc부위에 항-미오스타틴 항체의 미오스타틴 결합 단편을 융합하는 것에 의해 형성되는 두 개의 융합 프로틴을 포함하는 이합체에 관한 것이다. 이합체는, 예를 들어, 융합 프로틴을 인코딩하는 유전자 융합(gene fusion)을 적절한 발현 벡터에 삽입하는 것, 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 있는 유전자 융합을 발현시키는 것, 및 발현된 융합 프로틴이 항체 분자와 매우 비슷하게 조립되도록 허용하는 것에 의해 제조될 수 있으며, 그 결과로 체인 간(interchain) 디설파이드 결합은 Fc 모이에티들 사이에 형성되어 이합체를 생산한다.
본원에서 사용된 "Fc 폴리펩티드"라는 용어는 항체의 Fc부위로부터 유래된 폴리펩티드의 원형 및 뮤테인 형태를 포함한다. 이합체화를 촉진하는 경첩부를 함유하는 이러한 폴리펩티드의 각추형태(Truncated form)도 또한 포함된다. Fc 모이에티(및 그것으로부터 형성된 올리고머)를 포함하는 융합 프로틴은 프로틴 A 또는 프로틴 G 컬럼을 넘는 친화성 크로마토그래피에 의한 손쉬운 정제의 장점을 제안한다.
PCT 출원 WO 93/10151 (이로써 참고문헌에 의해 포함된)에 기술된 하나의 적합한 Fc 폴리펩티드는, 인간 lgG1 항체의 Fc부위의 N-말단 경첩부에서부터 원형 C-말단까지 연장하는 단일 사슬 폴리펩티드이다. 다른 유용한 Fc 폴리펩티드는 U.S. Patent 5,457,035 및Baum 등., 1994, EMBO J. 13:3992-4001에 기술된 Fc 뮤테인이다. 이 뮤테인의 아미노산 서열은 아미노산 19가 Leu에서 Ala로 변환됐던, 아미노산 20이 Leu 에서 Glu로 변환됐던 및 아미노산 22가 Gly 에서 Ala로 변환됐던 것을 제외한 WO 93/10151에 제시된 원형 Fc 서열의 그것과 동일하다. 뮤테인은 Fc 수용체에 대해 감소된 친화력을 나타낸다.
다른 실시예에서, 항-미오스타틴 항체의 헤비 및/또는 라이트 체인의 가변부는 항체 헤비 및/또는 라이트 체인의 가변부로 치환 될 수도 있다.
대신에, 올리고머는 펩티드 링커들(스페이서 펩티드)이 있거나 없는, 다중 항원 결합 프로틴을 포함하는 융합 프로틴이다. 적합한 펩티드 링커들 중 이러한 것들은 U.S. Patents 4,751,180 and 4,935,233 에 기술되어 있다.
올리고머의 항원 결합 프로틴을 제조하기 위한 다른 방법은 류신 지퍼의 사용을 포함한다. 류신 지퍼 도메인은 프로틴들이 발견되는 곳에서 프로틴의 올리고머화를 촉진하는 펩티드이다. 류신 지퍼는 원래 몇몇 DNA-결합 프로틴들에서 식별되었고(Landschulz 등., 1988, Science 240:1759), 그 이후 다양한 서로 다른 프로틴에서 발견됐다. 알려진 류신 지퍼들 중에는 자연적으로 발생한 펩티드들 및 이합화 또는 삼합화 하는 그들의 유도체가 있다. 가용성 올리고머 프로틴의 생성에 적합한 류신 지퍼 도메인의 예는 PCT 출원 WO 94/10308에 기술되어있고, 폐 계면활성제 프로틴 D(SPD)로부터 유래된 류신 지퍼는 Hoppe 등., 1994, FEBS Letters 344:191에 기술되었고, 이로써 참조 문헌에 포함된다. 그것과 융합되는 이형 프로틴의 안정한 삼합체화를 허용하는 변형된 류신 지퍼의 사용은 Fanslow 등., 1994, Semin. Immunol. 6:267-78에 기술되어 있다. 한 시도에서, 류신 지퍼 펩티드와 융합된 항-미오스타틴 항체 단편 또는 유도체를 포함하는 재조합 융합 프로틴은 적절한 숙주세포 내에서 발현되고, 가용성 올리고머 항-미오스타틴 항체 단편 또는 그 형태의 유도체는 배양 상층액으로부터 회수된다.
일 양상에서, 본 발명은 미오스타틴 수용체 또는 그들의 서브유닛에 대한 미오스타틴의 결합을 방해하는 항원 결합 프로틴을 제공한다. 예를 들어, 항원 결합 프로틴은 ALK4와 미오스타틴의 상호작용을 차단할 수도 있으나, ActRIIB를 갖는 미오스타틴 복합체 및/또는 ActRIIA를 갖는 미오스타틴 복합체와 공동-결합(co-bind) 할 수도 있다. 이러한 항원 결합 프로틴은 미오스타틴, 또는 단편, 변종 또는 그들의 유도체에 대항하여 만들어 질 수 있고, 미오스타틴 수용체를 방해하는 능력에 대한 종래의 검정법에서 스크린(screened)될 수 있다. 적절한 검정법의 예들은, 미오스타틴 수용체를 발현하는 세포에 대한 미오스타틴의 결합을 방해하는 능력이 있는지 항원 결합 프로틴을 검사하는 검정법, 또는 이러한 수용체(들) 및 미오스타틴의 상호작용이 원인인 생물학적 또는 세포성 반응을 감소시키는 능력이 있는지 항원 결합 프로틴을 검사하는 검정법(즉, 본원의 실시예들에서 기술된 것들과 같은 세포-기반 검정법, 및 시험관내 결합 검정법)이다. 항원 결합 프로틴을 검사하는 추가적인 검정법은 미오스타틴 폴리펩티드에 대한 항원 결합 프로틴의 결합과 미오스타틴 폴리펩티드에 대한 알려진 항원 결합 프로틴의 결합을 정성적으로 또는 정량적으로 비교하는 것들을 포함하며, 이것의 몇몇 예들은 본원에 개시되어 있다.
다른 양상에서, 본 발명은 종 선택성을 증명하는 항원 결합 프로틴을 제공한다. 일 실시예에서, 항원 결합 프로틴은 하나 이상의 포유류 미오스타틴, 예를 들어, 인간 미오스타틴 및 하나 이상의 마우스, 래트, 기니 피그, 햄스터, 게르빌(gerbil), 고양이, 토끼, 개, 염소, 양, 소, 말, 낙타, 및 비-인간 영장류 미오스타틴에 결합한다. 다른 실시예에서, 항원 결합 프로틴은 하나 이상의 영장류 미오스타틴, 예를 들어, 인간 미오스타틴 및 하나 이상의 사이노몰로거스(cynomologous), 마모셋(marmoset), 레수스(rhesus), 타마린(tamarin), 및 침팬지 미오스타틴에 결합한다. 다른 실시예에서, 항원 결합 프로틴은 특히 인간, 사이노몰로거스, 마모셋, 레수스, 타마린 또는 침팬지 미오스타틴에 결합한다. 다른 실시예에서, 항원 결합 프로틴은 하나 이상의 마우스, 래트, 기니 피그, 햄스터, 게르빌, 고양이, 토끼, 개, 염소, 양, 소, 말, 낙타, 및 비-인간 영장류 미오스타틴에 결합하지 않는다. 다른 실시예에서, 항원 결합 프로틴은 마모셋과 같은 뉴 월드 몽키(New World monkey) 종에는 결합하지 않는다.
다른 실시예에서, 항원 결합 프로틴은 미오스타틴외에 임의의 자연적으로 발생한 프로틴에 대한 특이적 결합을 보이지 않는다. 다른 실시예에서, 항원 결합 프로틴은 포유류 미오스타틴외에 임의의 자연적으로 발생한 프로틴에 대한 특이적 결합을 보이지 않는다. 다른 실시예에서, 항원 결합 프로틴은 영장류 미오스타틴외에 임의의 자연적으로 발생한 프로틴에 대한 특이적 결합을 보이지 않는다. 다른 실시예에서, 항원 결합 프로틴은 인간 미오스타틴외에 임의의 자연적으로 발생한 프로틴에 대한 특이적 결합을 보이지 않는다. 다른 실시예에서, 항원 결합 프로틴은 하나 이상의 비-인간 영장류, 예를 들어, 사이노몰로거스 몽키(cynomologous monkey)로부터 온 미오스타틴 및 인간 미오스타틴에 특이적으로 결합한다. 다른 실시예에서, 항원 결합 프로틴은 비슷한 결합 친화성을 갖는 비-인간 영장류, 사이노몰로거스 몽키, 및 인간 미오스타틴에 특이적으로 결합한다. 다른 실시예에서, 항원 결합 프로틴은 비-인간 영장류, 사이노몰로거스 몽키, 및 인간 미오스타틴의 활성을 차단한다. 다른 실시예에서, 항원 결합 프로틴은 본원에서 기술된 검정법에서 비-인간 영장류, 사이노몰로거스 몽키, 및 인간 미오스타틴에 대해 비슷한 IC50 또는 EC50을 갖는다.
미오스타틴에 대한 항원 결합 프로틴의 선택성을 당해 기술분야에서 잘 알려진 방법 및 하기 명세서의 교시를 사용하여 측정할 수도 있다. 예를 들어, 하나는 Western blot, FACS, ELISA, RIA를 사용하거나, 또는 결합 상수의 측정을 허용하는 임의의 적절한 방법, 예를 들어, Biacore® (표면 플라즈몬 공명을 사용하는) 또는 KinexA®, 키네틱 익스클루젼 검정법(kinetic exclusion assay)(예를들어, Ohmura 등., Anal. Chem. 73: 3392-3399, 2001을 인용)에 의해 선택성을 측정 할 수도 있다.
다른 양상에서, 본 발명은 하기의 특성 중 하나 이상을 갖는 미오스타틴 결합 항원 결합 프로틴(예를 들어, 항-미오스타틴 항체)을 제공한다: 인간 및 비-인간 영장류 미오스타틴 둘 다에 결합한다, 미오스타틴 수용체에 대한 미오스타틴의 결합을 억제한다, ALK4에 대한 미오스타틴의 결합을 억제한다, myostatin/ActRIIB과 공동-결합한다, myostatin/ActRIIA와 공동-결합한다, 음성적으로 근육량을 조절하는 미오스타틴의 능력을 억제한다.
본 발명의 항원 결합 프로틴의 항원-결합 단편은 통상적인 기술에 의해 생성될 수도 있다. 이러한 단편의 예들은 Fab 및 F(ab')2 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 유전 공학 기술(genetic engineering technique)에 의해 생성된 항체 단편 및 유도체들이 또한 고려된다.
추가적인 실시예는 키메라 항체들, 예를 들어, 비-인간(예를 들어, 쥐과의(murine)) 단일클론 항체들의 인간화 버전을 포함한다. 이러한 인간화 항체는 알려진 기술에 의해 제조될 수도 있고, 항체가 인간에게 투여될 때 감소된 면역원성의 장점을 제안한다. 일 실시예에서, 인간화된 단일클론 항체는 쥐과의 항체(또는 그들의 모든 또는 일부의 항원 결합 부위)의 가변 도메인(variable domain) 및 인간 항체로부터 유래된 불변 도메인(constant domain)을 포함한다. 그 대신에, 인간화된 항체 단편은 쥐과의 단일클론 항체의 항원 결합 부위 및 인간 항체로부터 유래된 가변 도메인 단편(항원-결합 부위가 없는)을 포함할 수도 있다. 키메라 및 더 조작된(engineered) 단일클론 항체들의 제조를 위한 방법들은 Riechmann 등., 1988, Nature 332:323, Liu 등., 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84:3439, Larrick 등., 1989, Bio/Technology 7:934, 및 Winter 등., 1993, TIPS 14:139에 기술된 것들을 포함한다. 일 실시예에서, 키메라 항체는 CDR 그라프트된 항체이다. 항체를 인간화하는 기술들은 예를 들어, U.S. Pat. App. No. 10/194,975 (2003, 2월 27 출간), U.S. Pat. No.s 5,869,619, 5,225,539, 5,821,337, 5,859,205, Padlan 등., 1995, FASEB J. 9:133-39, 및 Tamura 등., 2000, J. Immunol. 164:1432-41에 논의되어있다.
방법들은 비-인간 동물들에서 인간 또는 부분적 인간 항체들을 생성하기 위해 개발되어왔다. 예를 들어, 하나 이상의 내인 면역글로불린 유전자가 다양한 방법에 의해 비활성화된 마우스들(mice)이 제조돼 왔다. 인간 면역글로불린 유전자는 비활성화된 마우스 유전자를 대체하기 위해 마우스들에게 도입되어왔다. 동물 안에서 생성된 항체들은 동물 안으로 도입된 인간 유전 물질에 의해 인코딩된 인간 면역글로불린 펩티드 체인을 포함한다. 일 실시예에서, 트랜스제닉(transgenic) 마우스 와 같은, 비-인간 동물은 미오스타틴 폴리펩티드로 면역되고, 그러한 경우 미오스타틴 폴리펩티드에 대항하는 항체들이 동물 안에서 생성된다. 적절한 면역원의 한 예는 인간 미오스타틴의 단백분해 절단 부위(proteolytic cleavage site)와 같은 가용성 인간 미오스타틴, 또는 다른 면역원성 단편 미오스타틴이다. 적절한 면역원의 다른 예는 높은 수준의 미오스타틴을 발현하는 세포, 또는 그것으로부터 얻어진 세포막 조제물이다.
인간 또는 부분적 인간 항체를 생산하기 위한 트랜스제닉 동물의 사용 및 생산을 위한 기술의 예는 U.S. Patents 5,814,318, 5,569,825, 및 5,545,806, Davis 등., 2003, Production of human antibodies from transgenic mice in Lo, ed. Antibody Engineering: Methods and Protocols, Humana Press, NJ:191-200, Kellermann 등., 2002, Curr Opin Biotechnol. 13:593-97, Russel 등., 2000, Infect Immun. 68:1820-26, Gallo 등., 2000, Eur J Immun. 30:534-40, Davis 등., 1999, Cancer Metastasis Rev. 18:421-25, Green, 1999, J Immunol Methods. 231:11-23, Jakobovits, 1998, Adv Drug Deliv Rev 31:33-42, Green 등., 1998, J Exp Med. 188:483-95, Jakobovits A, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs. 7:607-14, Tsuda 등., 1997, Genomics 42:413-21, Mendez 등., 1997, Nat Genet. 15:146-56, Jakobovits, 1994, Curr Biol. 4:761-63, Arbones 등., 1994, Immunity. 1:247-60, Green 등., 1994, Nat Genet. 7:13-21, Jakobovits 등., 1993, Nature 362:255-58, Jakobovits 등., 1993, Proc Natl Acad Sci U S A. 90:2551-55. Chen, J. 등., 1993, lnt Immunol 5: 647-656, Choi 등., 1993, Nature Genetics 4: 117-23, Fishwild 등., 1996, Nat Biotechnol 14: 845-51, Harding 등., 1995, Ann NY Acad Sci, Lonberg 등., 1994, Nature 368: 856-59, Lonberg, 1994, Transgenic Approaches to Human Monoclonal Antibodies in Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101, Lonberg 등., 1995, Int Rev Immunol 13: 65-93, Neuberger, 1996, Nat Biotechnol 14: 826, Taylor 등., 1992, Nucleic Acids Research 20: 6287-95, Taylor 등., 1994, Int Immunol 6: 579-91, Tomizuka 등., 1997, Nat Gen 16: 133-43, Tomizuka 등., 2000, Proc Natl Acad Sci U S A. 97: 722-27, Tuaillon 등., 1993, Proc Natl Acad Sci U S A. 90: 3720-24, and Tuaillon 등., 1994, J Immunol 152: 2912-20 에 기술되어 있다. 이러한 및 다른 예들은 또한 2007년,5월 3일에 출판된 U.S. 특허 출원 공보 2007-0098715에 논의되어있다.
다른 양상에서, 본 발명은 미오스타틴에 결합하는 단일클론 항체들을 제공한다. 단일클론 항체는, 예를 들어, 면역화 스케줄의 완료 후에 트랜스제닉 동물로부터 채취한 췌장세포를 불멸화하는 기술과 같은 당해 기술분야에서 잘 알려진 임의의 기술을 사용하여 생산될 수도 있다. 췌장 세포는, 예를 들어, 하이브리도마를 생산하기 위해 그것을 골수 세포와 융합하는 기술과 같은 당해 기술분야에서 알려진 임의의 기술을 사용하여 불멸화 될 수 있다. 하이브리도마-생산 융합 방법에 사용되기 위한 골수세포는 바람직하게는 미-항체-생산 이며, 높은 융합 효율 및 오직 원하는 융합 세포(하이브리도마)만의 성장을 지원하는 특정한 선택 배지에서 그들을 성장 하지 못하게 만드는 효소 결핍을 갖는다. 마우스 융합의 사용을 위한 적절한 세포주의 예들은 Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 및 S194/5XX0 Bul을 포함하며; 래트 융합에 사용되는 세포주의 예들은 R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F 및 4B210이다.
일 실시예에서, 하이브리도마 세포주는 동물(예를 들어, 인간 면역글로불린 서열을 갖는 트랜스제닉 동물)을 미오스타틴 면역원으로 면역화 하고; 면역화된 동물로부터 췌장 세포를 채취하고; 채취한 췌장 세포를 골수 세포주에 융합하고, 그리하여 하이브리도마 세포를 생성하고; 하이브리도마 세포들로부터 하이브리도마 세포주를 수립하고, 미오스타틴 폴리펩티드에 결합하는 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주를 식별하는것에 의해 생산된다. 그들에 의해 생산된 이러한 하이브리도마 세포주, 및 항-미오스타틴 단일크론 항체는 본 발명에 의해 포함된다.
하이브리도마 세포주에 의해 분비된 단일클론 항체는 당해 기술분야에서 알려진 임의의 기술을 사용하여 정제될 수 있다. 하이브리도마 또는 mAbs는 미오스타틴 유도 활성을 차단하는 능력과 같은 특정한 성질을 갖는 mAbs를 식별하기 위해 더 스크린될 수도 있다. 이러한 스크린의 예들은 하기의 실시예에서 제공된다.
단일클론 항체는 또한 유전적 면역화(genetic immunization)라 지칭되는 과정을 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 관심 항원을 인코딩하는 핵산은 바이러스성 벡터(아데노바이러스성 벡터와 같은)에 포함될 수 있다. 그런 뒤 상기 결과 벡터(resulting vector)는 적절한 숙주 동물(예를 들어, 비-비만성 당뇨병, 또는 NOD, 마우스)에서 관심 항원에 대항하는 면역 반응을 일으키는데 사용된다. 이 기술은 실질적으로 Ritter 등., Biodrugs16(1): 3 - 10 (2002)에 기술되었고, 그것의 개요는 본원에 참조문헌으로 포함된다.
항체 결합 부위의 중심에 있는 상보성결정부위들(CDR)의 분자 진화는 또한 Schier 등., 1996, J. Mol. Biol. 263:551에 기술된 것 처럼, 예를 들어, c-erbB-2에 대해 증가된 친화성을 갖는 항체와 같은 증가된 친화성을 갖는 항체를 분리하는데 사용돼 왔다. 그래서 이러한 기술은 미오스타틴에 대한 항체를 제조하는데 유용하다.
미오스타틴을 향하는 항원 결합 프로틴이, 예를 들어, 시험관 내 또는 생체 내 중 어느 하나에서 미오스타틴 폴리펩티드 또는 미오스타틴 발현 세포의 존재를 검출하는 검정법에서 사용 될 수 있다. 항원 결합 프로틴은 또한 면역 친화성 크로마토그래피에 의해 미오스타틴 프로틴을 정제하는데 사용될 수도 있다. 미오스타틴 및 미오스타틴 수용체(또는 그들의 서브유닛)의 상호작용을 추가적으로 차단 할 수 있는 이러한 항원 결합 프로틴은 이러한 상호작용의 원인인 생물학적 활성을 억제하는데 사용될 수도 있다. 항원 결합 프로틴을 차단하는 것은 본 발명의 방법에서 사용 될 수 있다. 미오스타틴 길항제로서 기능하는 이러한 항원 결합 프로틴은 근육감소증(sarcopenia), 악액질(cachexia) 및 근육-소모성 질환(muscle-wasting condition)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 미오스타틴-유도 질환을 치료하는데 사용될 수도 있다. 일 실시예에서, 트랜스제닉 마우스들의 면역화를 포함하는 방법에 의해 생성된 인간 항-미오스타틴 단일클론 항체는 이러한 질환을 치료하는 것에 사용된다. 다른 실시예에서, 인간화된 항-미오스타틴 단일클론 항체는 이러한 질환을 치료하는 것에 사용된다.
항원 결합 프로틴은 시험관 내 방법에 사용될 수 있고, 또는 미오스타틴-유도 생물학적 활성을 억제하기 위해 생체 내에 투여될 수도 있다. 그 예들이 본원에 제공되어 있는, 미오스타틴에 의해 발생되거나 악화된(직접적 또는 간접적으로) 질병도 이처럼 치료될 수도 있다. 일 실시예에서, 본 발명은 미오스타틴-유도 생물학적 활성을 감소시키는데 유효한 양의 미오스타틴을 필요로 하는 포유동물에 대한 항원 결합 프로틴을 차단하는 미오스타틴의 생체 내 투여를 포함하는 치료법을 제공한다.
본 발명의 항원 결합 프로틴은 미오스타틴의 생물학적 활성을 억제하는 부분적 인간 및 완전 인간 단일클론 항체들을 포함한다. 일 실시예는 미오스타틴 수용체(또는 그들의 서브유닛)과 인간 미오스타틴의 상호작용을 적어도 부분적으로 차단하는 단일클론 항체에 관한 것이다. 일 실시예에서, 항체는 미오스타틴 면역원으로 트랜스제닉 마우스를 면역화하는 것에 의해 생성된다. 다른 실시예에서, 면역원은 인간 미오스타틴 폴리펩티드(예를 들어, 미오스타틴을 발현하기 위해 형질전환 또는 트랜스펙션된 세포, 또는 미오스타틴을 자연적으로 발현하는 세포)이다. 이러한 면역화된 마우스들로부터 유래된 하이브리도마 세포주는 또한 본원에서 제공되며, 상기 하이브리도마는 미오스타틴을 결합하는 단일클론 항체를 분비한다.
비록 인간, 부분적 인간, 또는 인간화 항체가 많은 용도, 특히 인간 대상에 대한 항체의 투여를 포함하는 것들에 적합할 것이라도, 항원 결합 프로틴의 다른 유형은 특정한 용도에 적합할 것이다. 본 발명의 비-인간 항체는, 예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 염소, 당나귀, 또는 비-인간 영장류(몽키(예를 들어, 사이노몰로거스 또는 레수스 몽키) 또는 에이프(ape)(예를 들어, 침팬지)와 같은)와 같은 임의의 항체-생산 동물로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 비-인간 항체들은, 예를 들어, 시험관 및 세포-배양에 기반을 둔 용도 또는 본 발명의 항체에 대한 면역 반응이 일어나지 않거나, 현저하지 않거나, 예방 할 수 있거나, 우려가 아니거나, 또는 원하는 것인 임의의 다른 용도로 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 본 발명의 비-인간 항체는 비-인간 대상로 투여된다. 다른 실시예에서, 비-인간 항체는 비-인간 대상 내에서 면역 반응을 끌어내지 않는다. 다른 실시에에서, 비-인간 항체는 비-인간 대상와 같은 종들로부터 온 것이며, 예를 들어, 본 발명의 마우스 항체는 마우스에 투여된다. 특정 종들로부터 온 항체는, 예를 들어, 그 종들의 동물을 원하는 면역원(예를 들어, 미오스타틴을 발현하는 세포, 또는 가용성 미오스타틴 폴리펩티드)으로 면역화하는 것 또는 그 종들의 항체를 생성하기 위한 인공적 시스템(예를 들어, 특정 종들의 항체를 생성하기 위한 박테리아성 또는 파지 디스플레이-기반 시스템)을 사용하는 것, 예를 들어, 항체의 불변부를 다른 종들로부터 온 불변부로 대체하는 것에 의해 한 종으로부터 온 항체를 다른 종으로부터 온 항체로 변환하는 것, 또는 다른 종들로부터 온 항체의 서열과 더 가까이 닮도록 항체의 하나 이상의 아미노산 잔기들을 대체하는 것에 의해 만들어 질 수 있다. 일 실시예에서, 항체는 둘 이상의 서로 다른 종들로부터 온 항체에서 유래된 아미노산 서열을 포함하는 키메라 항체이다.
항원 결합 프로틴은 다수의 종래 기술의 임의의 것에 의해서 제조될 수도 있다. 예를 들어, 그들은 그들을 자연적으로 발현하는 세포로부터 정제 될 수도 있고, 또는 당해 기술분야에서 알려진 임의의 기술을 사용하여, 재조합 발현 시스템에서 생산 될 수도 있다. 예들 들어, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet 등. (eds.), Plenum Press, New York (1980); and Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow 및 Land (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988)을 인용한다.
당해 기술분야에 알려진 임의의 발현 시스템은 본 발명의 재조합 폴리펩티드를 만드는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 숙주 세포는 원하는 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된다. 개중에 사용 될 수도 있는 숙주 세포는 원핵 생물, 효모 또는 고등 진핵 세포이다. 원핵 생물은 예들 들어, E. coli 또는 bacilli와 같은 그람 음성 또는 그람 양성 유기체를 포함한다. 고등 진핵 세포는 곤충 세포 및 포유류 기원의 수립된 세포주를 포함한다. 적절한 포유류 숙주 세포주의 예들은 몽키 신장 세포(ATCC CRL 1651)의 COS-7주 (Gluzman 등., 1981, Cell 23:175), L세포, 293세포, C127세포, 3T3세포 (ATCC CCL 163), 중국 햄스터 난소(CHO)세포, HeLa세포, BHK (ATCC CRL 10)세포주, 및 McMahan 등., 1991, EMBO J. 10: 2821에 기술된 것과 같은 아프리카 초록 몽키 신장 세포주 CVI(ATCC CCL 70)로부터 유래된 CVI/EBNA 세포주를 포함한다. 박테리아, 균류, 효모, 및 포유류 세포성 숙주용 적절한 클로닝(cloning) 및 발현 벡터는 Pouwels 등.(Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985)에 기술되어 있다.
형질전환 세포는 폴리펩티드의 발현을 촉진하는 조건에서 배양 될 수 있고, 폴리펩티드는 통장적인 프로틴 정제 방법에 의해서 회수되었다. 이러한 정제 방법은, 예를 들어, 그것에 결합하는 미오스타틴의 전체 또는 부분을 갖는 매트릭스를 넘는, 친화성 크로마토그래피의 사용을 포함한다. 본원의 사용을 위해 고려된 폴리펩티드는 실질적으로 오염성 내인 물질(endogenous material)이 없는 실질적으로 동종의 재조합 포유류 항-미오스타틴 항체 폴리펩티드를 포함한다.
항원 결합 프로틴은 다수의 알려진 기술의 임의의 것에 의해서, 원하는 성질들을 위해 스크린되거나 제조될 수 있다. 기술들 중 어떤 것은 관심 항원 결합 프로틴(예를 들어, 항-미오스타틴 항체)의 폴리펩티드 사슬(또는 그들의 부분)을 인코딩하는 핵산을 분리하는 것, 재조합 DNA 기술을 통해 핵산을 조작하는 것을 포함한다. 핵산은 다른 관심 핵산과 융합 될 수도 있고, 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 잔기를 더하고, 결실하고, 또는 치환하여 변화될 수도 있다(예를 들어, 돌연변이 유발 또는 다른 통상적인 기술).
일 양상에서, 본 발명은 본 발명의 항-미오스타틴 항체의 항원-결합 단편을 제공한다. 이러한 단편은 전적으로 항체-유래 서열로 구성 될 수 있고 또는 추가적 서열을 포함할 수 있다. 항원-결합 단편의 예들은 Fab, F(ab')2, 단일 사슬 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 및 도메인 항체를 포함한다. 다른 예들은 Lunde 등., 2002, Biochem. Soc. Trans. 30:500-06에서 제공된다.
단일 사슬 항체는 아미노산 브릿지(짧은 펩티드 링커)를 통한 헤비 및 라이트 체인 가변 도메인(Fv부위)을 연결하는 것에 의해 형성될 수도 있고, 그 결과로 단일 펩티드 사슬을 낳는다. 이러한 단일-사슬 Fv들(scFvs)은 두 가변 도메인 폴리펩티드 (VL 및 VH)를 인코딩하는 DNAs 사이의 폴리펩티드 링커를 인코딩하는 DNA를 융합하는 것에 의해 제조되어 왔다. 결과 폴리펩티드는 항원-결합 단량체를 형성하기 위해 그들 스스로 되접어 질 수 있고, 또는 두 가변 도메인 사이의 유연한 링커의 길이에 따라 다량체(예를 들어, 이합체, 삼합체, 또는 사합체)를 형성할 수도 있다 (Kortt 등., 1997, Prot. Eng. 10:423; Kortt 등., 2001, Biomol. Eng. 18:95-108). 단일 사슬 항체의 생산을 위해 개발된 기술들은 U.S. Patent No. 4,946,778; Bird, 1988, Science 242:423; Huston 등., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879; Ward 등., 1989, Nature 334:544, de Graaf 등., 2002, Methods Mol Biol. 178:379-87에 기술된 것들을 포함한다.
본 발명의 항원 결합 프로틴(에를 들어, 항체, 항체 단편, 및 항체 유도체)은 당해 기술분야에서 알려진 임의의 불변부를 포함한다. 라이트 체인 불변부는, 예를 들어, 캅파- 또는 람다-타입 라이트 체인 불변부, 예를 들어, 인간 카파- 또는 람파-타입 라이트 체인 불변부 일 수 있다. 헤비 체인 불변부는, 예를 들어, 알파-, 엘타-, 엡실론-, 감마-, 또는 뮤-타입 헤비 체인 불변부, 예를 들어, 인간 알파-, 델타-, 엠실론-, 감마-, 또는 뮤-타입 헤비 체인 불변부 일 수도 있다. 일 실시예에서, 라이트 또는 헤비 체인 불변부는 자연적으로 발생한 불변부의 단편, 유도체, 변종, 또는 뮤테인이다.
기술은 관심 항체로부터 온 서로 다른 서브클래스 또는 이소타입의 항체를 유도하는 것, 즉 서브클래스 전환으로 알려져 있다. 따라서, lgG 항체는 lgM 항체로부터 유래될 수도 있고, 예를 들어, 그 반대도 마찬가지이다. 이러한 기술은 주어진 항체(부모 항체)의 항원-결합 성질을 갖는 새로운 항체의 제조를 허용하며, 그러나 또한 부모 항체의 성질과는 다른 항체 이소타입 또는 서브클래스와 관련된 생물학적 성질을 보인다. 조합 DNA 기술이 사용될 수도 있다. 예를 들어, 원하는 이소타입의 항체의 불변 도메인을 인코딩하는 DNA와 같은 특정한 항체 폴리펩티드를 인코딩하는 클로닝된(cloned) DNA는 이러한 방법에서 사용될 수도 있다. 또한 Lantto 등., 2002, Methods Mol. Biol.178:303-16.를 인용한다. 게다가, lgG4를 원한다면, 그것은 Bloom 등., 1997, Protein Science 6:407, 본원에 참조문헌으로 포함된)에 기술된 것과 같이 경첩부에서 점 돌연변이(CPSCP -> CPPCP)를 도입함으로써, lgG4 항체들에서 이질성을 이끌 수 있는 인트라-H 사슬(intra-H chain) 디설파이드 결합을 형성하는 경향을 완화하는 것이 바람직 할 수도 있다.
게다가, 서로 다른 성질들(예를 들어, 그들이 결합한 항원에 대한 친화성이 바뀌는 성질)을 갖는 항원 결합 프로틴을 유도하기 위한 기술들 또한 알려져 있다. 사슬 셔플링(chain shuffling)이라 칭해지는 이러한 기술은, 흔히 파지 디스플레이라 지칭되는, 섬질 박테리오파지(filamentous bacteriophage)의 표면 위에있는 면역글로불린 가변 도메인 유전자 레파토리들을 디스플레이 하는 것을 포함한다. 사슬 셔플링은 Marks 등., 1992, BioTechnology, 10:779 에 기술된 바와 같이, 합텐 2-페닐옥사졸-5-원에 대한 높은 친화성 항체들을 제조하기 위해 사용돼 왔다.
다른 실시예에서, 본 발명은 미오스타틴으로부터 낮은 해리상수를 갖는 항원 결합 프로틴을 제공한다. 일 실시예에서, 항원 결합 프로틴은 200pM 이하의 Kd, 또는 100pM 이하의 Kd를 갖는다. 다른 실시예에서, Kd는 10pM 이하이고; 다른 실시예에서, 5pM 이하이며, 또는 4pM 이하, 3pM 이하 또는 2pM 이하이다. 다른 실시예에서, Kd는 본원의 실시예에서 기술된 항체와 실질적으로 같다. 다른 실시에에서, 항원 결합 프로틴은 본원의 실시예에서 기술된 항체와 실질적으로 같은 Kd로 미오스타틴에 결합한다.
다른 실시예에서, 본 발명은 GDF-11에 대한 그것의 해리상수 보다 실질적으로 낮은 미오스타틴에 대한 해리상수(Kd)를 갖는 항원 결합 프로틴을 제공한다. 다른 실시예에서, 미오스타틴에 대한 해리상수는 GDF-11에 대한 것보다 1000-배 낮으며, 또는 GDF-11보다 미오스타틴에 대한 것이 2,500, 5,000, 7,500, 8,000, 9,000, 9,500, 9,700, 9,800, 9,900 또는 10,000-배 낮다. 다른 실시예에서, GDF-11을 넘는 미오스타틴에 대한 결합의 선택성은 1,000, 2,500, 5,000, 7,500, 8,000, 9,000, 9,500, 9,700, 9,800, 9,900 또는 10,000-배이다. 다른 실시예에서, GDF-11에 대한 Kd는 10nM 또는 그보다 높고; 다른 실시예에서, 이는 25 nM 이상, 또는 50 nM 이상, 100 nM 이상, 150 nM 이상, 175 nM 이상 또는 180 nM 이상이다. 다른 실시예에서, GDF-11을 넘는 미오스타틴에 대한 결합의 선택성은 1,000, 2,500, 5,000, 7,500, 8,000, 9,000, 9,500, 9,700, 9,800, 9,900 또는 10,000-배이다.
다른 실시예에서, 본 발명은 GDF-11에 대한 그 결합 친화성 보다 실질적으로 높은 미오스타틴에 대한 결합 친화성을 갖는 항원 결합 프로틴을 제공한다. 일 실시예에서, 미오스타틴에 대한 항원 결합 프로틴의 친화성은 GDF-11에 대한 것보다 500배 높다. 다른 실시예에서, 미오스타틴에 대한 친화성은 GDF-11에 대한 것보다 1000-배 보다 컸으며, 또는 이는 GDF-11보다 미오스타틴에 대해서 2,500, 5,000, 7,500, 8,000, 9,000, 9,500, 9,700, 9,800, 9,900 또는 10,000-배 높았다.
다른 양상에서, 본 발명은 예를 들어, 미오스타틴 수용체(또는 그들의 서브유닛)에 결합하는, 또는 미오스타틴 수용체를 발현하는 세포에 결합하는, 또는 ALK4에 대한 미오스타틴의 결합과 같은 미오스타틴의 활성을 억제하는 항원 결합 프로틴을 제공한다. 일 실시예에서, 항원 결합 프로틴은 1000pM 또는 그보다 낮은 IC50을 갖는다. 다른 실시예에서, IC50은 500pM 또는 그 이하이며; 다른 실시예에서, IC50은 300pM 또는 그 이하이며, 또는 200pM 또는 그 이하, 또는 100pM 또는 그 이하이다. 다른 실시예에서, IC50은 본원의 실시예에서 기술된 항체의 그것과 실질적으로 같다. 다른 실시예에서, 항원 결합 프로틴은 본원의 실시예에서 기술된 항체와 실질적으로 같은 IC50을 갖는 미오스타틴의 활성을 억제한다.
일 실시예에서, 본 발명의 항원 결합 프로틴은 미오스타틴(또는 미오스타틴을 발현하는 세포)에 대한 1000 pM 또는 그 이하의 분명한 친화성을 갖는다. 다른 실시에에서, 항원 결합 프로틴은 500 pM 또는 그 이하의, 300 pM 또는 그 이하의, 200 pM 또는 그 이하의, 100 pM 또는 그 이하의, 또는 80 pM 또는 그 이하의 분명한 친화성을 보인다. 다른 실시예에서, 항원 결합 프로틴은 본원의 실시에에서 기술된 항체의 것과 실질적으로 동일한 분명한 친화성을 보인다. 다른 실시예에서, 항원 결합 프로틴은 본원의 실시예에서 기술된 항체의 것과 실질적으로 동일한 분명한 친화성을 갖는다.
다른 실시예에서, 본 발명은 본원에 개시된 항체를 갖는 미오스타틴에 대한 결합을 위해 경쟁하는 항원 결합 프로틴을 제공한다. 이러한 경쟁적 능력은 예를 들어, 형광활성화세포분취(fluorescence activate cells sorting, FACS) 기술 또는 다른, 비슷한 검정법을 사용하여 관찰된 미오스타틴-발현 세포에 대한 결합에서의 경쟁, BIACore® 또는inExA® 검정법과 같은 검정법에서의 경쟁, 또는 본원에 기술된 다른 검정법에서의 경쟁에 의하는 것과 같은 당해 기술분야에서 잘-알려진 방법들에 의해 측정될 수 있다. 일 양상에서, 본원에 개시된 항체를 갖는 미오스타틴에 대한 결합을 위해 경쟁하는 항원 결합 프로틴은 항체처럼 같은 에피톱 또는 중복되는(또는 인접한) 에피톱에 결합한다. 다른 양상에서, 본원에 개시된 항체를 갖는 미오스타틴에 대한 결합을 위해 경쟁하는 항원 결합 프로틴은 미오스타틴의 활성을 억제한다.
다른 양상에서, 본 발명은 실험관 또는 생체 내에서 적어도 하루의 반감기를 갖는 항원 결합 프로틴을 제공한다(예를 들어, 인간 대상에 투여되었을 때). 일 실시예에서, 항원 결합 프로틴은 적어도 3일의 반감기를 갖는다. 다른 실시예에서, 항원 결합 프로틴은 4일 또는 그보다 긴 반감기를 갖는다. 다른 실시예에서, 항원 결합 프로틴은 8일 또는 그보다 긴 반감기를 갖는다. 다른 실시예에서, 항원 결합 프로틴은 유도되거나 변화되며, 그러한 경우 이는 유도되지 않거나 변형되지 않은 항원 결합 프로틴과 비교하여 더 긴 반감기를 갖는다. 다른 실시예에서, 항원 결합 프로틴은 혈청 반감기를 증가시키는 하나 이상의 점 돌연변이를 함유하며, 예를 들어 2000년,2월.24에 출간된 WO 00/09560에 기술되었고, 참조문헌으로 포함되었다.
본 발명은, 예를 들어, 2중특이성 항원 결합 프로틴, 예를 들어, 서로 다른 두 항원 결합 부위 또는 결합부를 통해서 미오스타틴의 서로 다른 두 에피톱, 또는 미오스타틴의 에피톱 및 다른 분자의 에피톱에 결합하는 항원 결합 프로틴과 같은 다중-특이적 항원 결합 프로틴을 더 제공한다. 게다가, 본원에 개시된 것과 같은 이중특이적 항원 결합 프로틴은 다른 공보에 대해 참조문헌에 의해 본원에 기술된 것들을 포함하는, 본원에-기술된 항체들 중 하나로부터 온 미오스타틴 결합 부위 및 본원에-기술된 항체들 중 다른 하나로부터 온 2차 미오스타틴 결합부를 포함할 수 있다. 그 대신에, 이중특이적 항원 결합 프로틴은 본원에 기술된 항체들 중 하나로부터 온 항원 결합 부위 및 본원에 기술된 방법 또는 알려진 방법에 의해 제조된 항체 또는 당해 기술분야에서 알려진 다른 미오스타틴 항체로부터 온 2차 항원 결합 부위를 포함할 수도 있다.
이중특이적 항체 제조의 많은 방법들은 당해 기술분야에 알려져 있고, 2001, 4월 20에 출원된, US 특허 출원 09/839,632(본원에 참조문헌으로 포함된)에 논의되어 있다. 이러한 방법은 Milstein 등., 1983, Nature 305:537에 기술된 것과 같은 하이브리드-하이브리도마의 사용, 및 다른 것들(U.S. 특허 4,474,893, U.S. 특허 6,106,833), 및 항체 단편의 화학적 커플링(Brennan 등.,1985, Science 229:81; Glennie 등.,1987, J. Immunol. 139:2367; U.S. 특허 6,010,902)을 포함한다. 게다가, 이중특이적 항체는 예를 들어 류신 지퍼 모에티를 사용하는 것에 의해(즉, Fos 및 Jun 프로틴으로부터 온, 이형이합체를 우선적으로 형성하는 것, Kostelny 등., 1992, J. Immnol. 148:1547) 또는 U.S. 특허 5,582,996에 기술된 것과 같은 다른 열쇠와 열쇠구멍 상호작용적 도메인 구조에 의하는 것과 같은 재조합 방법을 통해 생산될 수 있다. 추가적인 유용한 기술은 Kortt 등., 1997, supra; U.S. 특허 5,959,083; 및 U.S. 특허 5,807,706에 기술된 것들을 포함한다.
다른 양상에서, 본 발명의 항원 결합 프로틴은 항체의 유도체를 포함한다. 유도된 항체는 특정 사용에서 증가된 반감기와 같은, 항체에 원하는 성질을 주는 임의의 분자 또는 물질을 포함 할 수 있다. 유도된 항체는, 예를 들어, 탐지 가능한(또는 라벨링) 모이에티(예를 들어, 방사성, 비색적(colorimetric), 항원적 또는 효소적 분자, 탐지 가능한 비드(자석 또는 전자밀도(예를들어, 금) 비드), 또는 다른 분자(예를 들어, 비오틴 또는 스트렙타비딘)에 결합하는 분자), 치료적 또는 진단적 모이에티(예를 들어, 방사성, 세포독성, 또는 약제학적으로 활성 모이에티), 또는 특정 사용에 대한 항체의 적합도를 증가시키는 분자(예를 들어, 인간 대상와 같은, 대상에 대한 투여, 또는 다른 시험관 또는 생체내의 사용)를 포함할 수 있다. 항체를 유도체합성(derivatize) 하는데 사용될 수 있는 분자의 예들은 알부민(예를 들어, 인간 혈청 알부민) 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)를 포함한다. 항체들의 알부민-연결된 및 PEG화된(PEGylated) 유도체들은 당해 기술분야에서 잘 알려진 기술을 사용해 제조될 수 있다. 일 실시예에서, 항체는 트란스타이레틴(transthyretin, TTR) 또는 TTR 변종에 접합되거나 또는 그렇지 않으면 연결된다. TTR 또는 TTR 변종은, 예를 들어, 덱스트란, 폴리(n-비닐 피롤리돈), 폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌(propropylene) 글리콜 호모폴리머, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 코-폴리머(co-polymer), 폴리옥시에틸레이티드(polyoxyethylated) 폴리올 및 폴리비닐 알콜로 구성된 군으로부터 선택된 화학물질로 화학적으로 변화할 수 있다. US Pat. App. No. 20030195154.
본 발명의 추가 양상은 본원에 기술된 항체들의 변종을 포함한다. 변종들 중 어떤 것은, 예를 들어, SEQ ID NOs:10 및 20에서와 같은 본원에서 제시된 공통 서열에 의해 포함된다. 추가적 변종들은 예를 들어, 개시된 항체 서열의 것들과는 다른 변종 항체의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 아미노산들과 같은 하나 이상의 아미노산(들)에 의해 본원에서 개시된 항체들과는 다른 항체들을 포함한다. 다른 실시예에서, 변종은 개시된 항체 중 하나와 아미노산 서열에서 90% 로 일치한다. 다른 실시예에서, 변종 항체 서열은 본원에 개시된 항체들 중 하나의 그것과 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 로 일치한다. 변종은 또한 하나 이상의 아미노산이 결실되어 왔던 것으로부터 온 항체 서열을 포함하며, 예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산이 항체 폴리펩티드의 말단 어느 쪽에서 결실 될 수도 있고 또는 이러한 결실은 내부적으로 만들어 질 수도 있다.
추가적 실시예는 "변종" 이라는 용어에 의해 포함된다. 예를 들어, 아미노산 잔기는 번역 후 수식(post-translational modification)을 겪을 수도 있고, 글루타민(특히, N-말단에서 글루타민)은 피로글루탐산(pyroglutamic acid)으로 변환되거나 또는 고리화 될 수도 있으며; 추가적으로 또는 그 대신에, 아미노산은 탈아미드화(deamidation), 이성질체화, 무효소당화(glycation) 및/또는 산화를 겪을 수도 있음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 폴리펩티드는 예를 들어, N-연결된 또는 O-연결된 글리코실화와 같은 글리코실화를 포함하는 추가적 번역 후 수식을 당해 기술분야에서 잘-알려진 부위에서 겪을 수도 있다. 따라서, 변화(change)들은 이러한 변화(alteration)를 못하게 하거나 최소화 하는, 또는 이러한 가공이 이익인 환경에서 그들을 가능하게 하는 폴리펩티드의 아미노산 서열에서 만들어 질 수도 있다.
다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 항원 결합 프로틴을 사용하는 미오스타틴에 결합하는 분자에 대한 스크린 방법을 제공한다. 임의의 적합한 스크린 기술이 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 본 발명의 항원 결합 프로틴이 결합하는 미오스타틴 분자 또는 그들의 단편은 본 발명의 항원 결합 프로틴 및 다른 분자와 접촉되며, 상기 다른 분자는 미오스타틴에 대한 항원 결합 프로틴의 결합을 감소시키면 미오스타틴에 결합한다. 항원 결합 프로틴의 결합은 예를 들어, ELISA와 같은 임의의 적절한 방법을 사용하여 검출 될 수 있다. 항원 결합 프로틴의 미오스타틴에 대한 결합의 검출은, 위에 논의된 것처럼, 항원 결합 프로틴을 검출 가능하게 라벨링 하는 것에 의해 단순화 될 수 있다. 다른 실시예에서, 미오스타틴-결합 분자는 그것이 미오스타틴 활성화(activation) 및/또는 신호전달을 억제하는지를 측정하기 위해 더 분석 될 수 있다.
또한 본 발명에 의해 이해되는 것은 미오스타틴 치료에 유용한 약제학적으로 허용되는 희석제, 보존제, 용해제, 유화제, 보조제 및 또는 담체와 함께 본 발명의 폴리펩티드 산물(product)을 유효한 양으로 포함하는 약제학적 조성물이다. 이러한 조성물은 다양한 완충제 내용물의 희석제(예를 들어, Tris-HCl, 아세트산염, 인산염), pH 및 이온 강도; 세제 및 가용화제(예를 들어, Tween 80, Polysorbate 80)과 같은 보조제, 항-산화제(예를 들어, 아스코르브산, 메타중아황산 나트륨(sodium metabisulfite)) 및 벌킹 물질(bulking substance, 예를 들어 락토오즈, 만니톨); 프로틴(위에 논의된 것과 같으며, 또한, 예를 들어 U.S. 특허 4,179,337을 인용하며 이로써 참조문헌에 포함된다)에 대한 폴리머(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 또는 다른 모이에티들)와 같은, 모이에티들의 공유 부착; 폴리락틱산(polylactic acid), 폴리글리콜릭산(polyglycolic acid) 등과 같은 폴리머 화합물의 미립자 제조 또는 리포좀안으로 물질의 포함(incorporation)을 포함한다. 이러한 조성물은 물리적 상태, 안정성, 생체 내 방출 속도, 및 생테 내 미오스타틴 처분 속도에 영향을 줄 것이다. 예를 들어, 본원에 참조문헌으로 포함된 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) pages 1435-1712을 인용한다.
일반적으로, 본 미오스타틴-억제적 폴리펩티드의 유효한 양은 나이(age), 무게 및 상태 또는 수용자의 질병 심각성에 의해서 측정될 것이다. 본원에 참조문헌으로 포함된, Remingtons Pharmaceutical Sciences, supra, at pages 697-773을 인용한다. 전형적으로, 약 0.001g/kg 체중 내지 약 1g/kg 체중의 투여량이 사용될 수도 있으나, 숙련된 전문가가 인정하는 것과 같이 그 보다 많거나 적은 양이 사용될 수도 있다. 국소 도포(topical application)와 같은 국소(즉, 비-전신성(nonsystemic)) 적용(local application)을 위해, 투여하는 것(dosing)는 약0.001g/cm2 내지 약 1g/cm2 일 수도 있다. 투여하는 것은 매일 한번 이상, 또는 덜 자주될 수도 있고, 본원에 설명된 것과 같은 다른 조성물들과 함께 될 수도 있다. 본 발명은 본원에 인용된 투여량에 제한되지 않는다는 것이 확인되어야 한다.
본 발명은 미오스타틴 결합제(또는 항체를 포함하는, 미오스타틴 결합 폴리펩티드)를 포함하는 미오스타틴 길항제를 사용하여 다양한 질병을 치료하는 방법 및 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 그들을 필요로 하는 대상에 생식샘저하증(hypogonadism)의 효과를 치료하는 방법으로서, 대상에 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합물로 하나 이상의 미오스타틴 길항제를 치료적으로 유효한 양으로 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일 실시예에서, 생식샘저하증은 안드로겐 결핍 치료가 원인이다. 두 번째 실시예에서, 생식샘저하증은 생식샘 기능(gonadal functioning)의 연령-관련 감소(age-related decrease)가 원인이다.
본 발명은 또한 이러한 질환으로 고통받는 대상에서 악액증을 치료하는 방법을 제공하며, 이는 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합물로 하나 이상의 미오스타틴 길항제를 대상에 치료적으로 유효한 양으로 투여하는 것을 포함한다. 질환은 1차 악액질(primary cachexia) 또는 2차 악액질(secondary cachexia)일 수도 있다. 일 실시예에서, 대상는 류머티즘성 악액질, 또는 다른 자가면역 또는 염증성 질환(만성폐쇄폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 또는 COPD를 포함하는)의 합병증 또는 결과로 발생하는 악액질로 고통받고 있다. 본 발명은 또한 이를 필요로 하는 대상에서 화상으로 인한 악액질을 치료하는 방법을 제공하며 이는 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합물로 하나 이상의 미오스타틴 길항제를 대상에 치료적으로 유효한 양으로 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 과도한 TNF-알파가 특징인 염증성 질환으로 고통받는 대상에서 종양괴사인자(TNF)-알파를 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 이러한 치료가 필요한 대상에 화학요법제(chemotherapeutic agent)와 같은 화학적 제제(chemical agent)의 치료로 인한 악액질을 치료하는 방법을 제공하며 이는 이는 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합물로 하나 이상의 미오스타틴 길항제를 대상에 치료적으로 유효한 양으로 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 악액질이 암 또는 종양 질환으로 인한 것일 때, 암 또는 종양 질환에 대한 임의의 치료에 의한 것일 때, 또는 치료와 질환의 병용효과일 때 각각 암 또는 종양(neoplastic) 질환으로 고통받는 악액질을 치료하는 벙법이다.
본 발명은 또한 이러한 치료가 필요한 대상에 당뇨병으로 인한 악액질을 치료하는 방법을 제공하며 이는 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합물로 하나 이상의 미오스타틴 길항제를 대상에 치료적으로 유효한 양으로 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 이러한 질환으로 고통받는 대상에서 당뇨콩팥병(diabetic nephropathy)을 치료하는 방법을 제공하며 이는 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합물로 하나 이상의 미오스타틴 길항제를 대상에 치료적으로 유효한 양으로 투여하는 것을 포함한다.
또한 본 발명에서 제공된 것은 심장 악액질 및/또는 신장성 악액질을 치료하는 방법이며, 이는 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합물로 하나 이상의 미오스타틴 길항제를 대상에 치료적으로 유효한 양으로 투여하는 것을 포함한다. 악액질은 동화/이화 경로(pathway)의 불균형 및 TNF-알파와 같은 염증성 사이토카인의 증가된 혈장 수준과 관련된 만성심장부전(chronic heart failure, CHF)의 흔한 합병증이다. 만성신부전(chronic renal failure, CRF) 및/또는 말기신장질환(end-stage renal disease, ESRD)으로 고통받는 대상은 또한 전-염증성 제제(pro-inflammatory agent)의 증가된 수준에 또한 기여할 수 있는 악액질에 의해 흔히 고통받는다.
본원에서 더 제공되는 것은 심장 위축증(cardiac atrophy), 및/또는 심장 발육부전(cardiac atrophy)을 치료하는 방법이다. 심장 위축증은 암으로 고통받는 각각에서 발생할 수 있고, 또한 장기간 침상-안정(prolonged bed-rest), 또는 자발적 근육 위축증을 야기하는 다른 상황 또는 질환에 있는 각각에서 발생할 수 있다. 게다가, 본 선택적 미오스타틴 길항제는 또한 예를 들어, 심장 부전(예를 들어, 울혈심장부전(congestive heart failure))과 같은 심장 근육이 유효하게 감소하는 다른 질환을 치료하는데 쓰일 수도 있다. 본 발명은 또한 식사 장애(eating disorder) 또는 기아에서 발병하는 심장 이상(cardiac abnormality)을 치료하는데 유용할 수도 있다.
본 발명은 또한 이전에 성장호르몬, 인슐린 성장 인자-1(IGF-1), 성장 호르몬 분비촉진제, 및 성장 호르몬- IGF-1 액시스(axis)와 관련된 다른 제제로 치료된 질병 또는 질환을 치료하는 대안적 방법을 제공한다. 미오스타틴 길항제는 이러한 제제의 잠재적으로 위험한 부작용 없이 이러한 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 미오스타틴 길항제는 또한 성장 호르몬 내성(growth hormone resistance, 노화에서 알려진 문제)을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 일 실시에에서, 본 발명은 이러한 질환으로 고통받는 대상에 프라더-윌리 증후군(Prader-Willi syndrome)의 효과를 치료하는 방법을 제공하며 이는 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합물로 하나 이상의 미오스타틴 길항제를 대상에 치료적으로 유효한 양으로 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 노인들의 근육감소증, 및 다른 근육 질병 또는 질환을 포함하는 근육감소증을 치료하는 방법을 제공하며, 이는 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합물로 하나 이상의 미오스타틴 길항제를 대상에 치료적으로 유효한 양으로 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 재활 요법(rehabilitative therapy)에서의 사용, 근력 및/또는 밸런스 훈련과 함께 사용, 게다가 넘어지는 것의 예방 또는 감소에서의 사용을 포함하는 노인들의 노쇠함을 치료하는 방법을 더 제공한다.
또한 본 발명에서 제공된 것은 외상성 골절의 치료 및 골다공증 골절의 회복(repair), 게다가 일반적인 뼈 손실(예를 들어, 골다공증 및/또는 골감소증)의 치료 및 부수되는 장기적 무기력 또는 장기요양, 및/또는 사지 고정의 결과로서의 뼈 손실의 치료를 가능하게 하는 방법이다.
미오스타틴 길항제의 투여가 이롭다는 것이 증명된 다른 질환은 애디슨병(Addison's disease); 근육위축가쪽경화증(amyotrophic lateral sclerosis) 또는 운동신경세포병(motor neuron disease)(ALS; MND; 루게릭병); 벨 마비(Bell's palsy, 및 또는 안면 신경 문제); 보툴리눔독소증(botulism); 뇌성마비(cerebral palsy); 샤르코-마리-투스병(Charcot-Marie-Tooth disease) 및 다른 말초신경증(other peripheral neuropathies); 쿠싱증후군(Cushing's syndrome); 당뇨신경병증(diabetic neuropathy); 궐레인 바레 증후군(Guillan-Barre syndrome); 다발경화증(multiple sclerosis); 근위축(muscular atrophy, 진행성 및 척추근위축을 포함하는); 근디스트로피(muscular dystrophy, 이에는 많은 형태가 있으며, 근긴장성디스트로피를 포함한다); 중증근무력증(myasthenia gravis), 회색질척수염(poliomyelitis), 다발근육염(polymyositis), 근육, 힘줄 및 또는 인대의 접질림 및 염좌(sprains and strains), 뇌졸중(stroke, 및 장기적 무기력(prolonged inactivity) 또는 장기요양(bed-rest), 사지고정(immobilization of limbs, 예를 들어 석고붕대고정 및 부목고정에 의한), 및 우주비행과 같이 근소모를 야기하는 다른 질환을 포함한다.
본 발명의 미오스타틴 결합 프로틴은 또한 진단법(diagnostic method)에서의 사용을 발견할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 항원 결합 프로틴은 검출에서 유용한 시약를 제공하는 검출가능한 마커(marker) 물질(예를 들어, 125I로 방사성표지된 또는 다른 검출가능한 모이에티와 결합된)과의 관련(association) 및 혈액 또는 소변과 같은 액체 샘플 및 고체 조직에서 미오스타틴의 수량화(quantification)에 의해 "라벨된(labeled)" 것일 수도 있다. 본원에서 고려된 것은 이러한 라벨된 물질을 포함하는 키트이다.
하기의 실시예들은 본 발명의 특정 실시예 또는 특징을 설명하는 목적을 위해서 제공되었으며 그것의 범주에 제한되지 않는다.
항- 미오스타틴 항체
몇몇 변종 항-미오스타틴 항체를 제조하였고, 활성을 시험하였다; 그들의 서열은 하기의 표 1 및 2에 나타나있다.
[표 1]
항-미오스타틴 항체 헤비 체인 서열
Figure pct00001
[표 2]
항-미오스타틴 항체 라이트 체인 서열
Figure pct00002
시험관 내 검정법
항-미오스타틴 항체의 활성(들)을 몇몇 검정법으로 평가하였다.
C2C12 세포 기반 미오스타틴 활성 검정법
이 검정법은 그 수용체에 대한 미오스타틴의 결합을 억제하는 정도를 측정하는 것에 의해 시험되는 것으로 억제제의 미오스타틴 중화 능력을 증명한다.
미오스타틴-응답성 리포터 세포주(reporter cell line)가 C2C12 근육모세포(ATCC No: CRL-1772)의 pMARE-luc 구조체로 트랜스펙션에 의해서 생성됐다. pMARE-luc 구조체는 TATA 박스의 윗쪽(upstream)에서 pLuc-MCS 리포터 벡터(Stratagene cat # 219087)내로 미오스타틴/액티빈 반응 요소(response element, Dennler 등. EMBO 17: 3091-3100 (1998))들을 나타내는 CAGA 서열의 12회 반복체를 클로닝함으로써 만들어졌다. 근육모세포 C2C12 세포는 세포 표면에서 미오스타틴/액티빈 수용체를 자연적으로 발현한다. 세포 수용체에 미오스타틴이 결합할 때, Smad 경로가 활성화되고, 인산화된 Smad는 반응 요소(Macias-Silva 등. Cell 87:1215 (1996))에 결합하고, 루시퍼레이스(luciferase) 유전자의 발현을 야기한다. 그런 뒤 루시퍼레이스 활성은 제조자의 프로토콜에 따라 시판되는 루시퍼레이스 리포터 검정 키트 (cat # E4550, Promega, Madison, WI)를 사용하여 측정된다. pMARE-luc(C2C12/pMARE clone #44)로 트랜스펙션돼 왔었던 C2C12 세포의 안정주(stable line)가 하기의 방법에 따른 미오스타틴 활성을 측정하기 위해 사용되었다.
리포터 세포(C2C12/pMARE clone #44)의 동일한 숫자를 96 웰 배양(well culture)에 도말(plated)한다. 재조합 성숙 미오스타틴을 시험되기 위한 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 전-배양(pre-incubated)한다. 리포터 셀 배양을 항체와 함께 또는 그것 없이 6시간 동안 미오스타틴으로 처리한다. 처리된 배양에서 미오스타틴 활성을 루시퍼레이스 활성을 측정하는 것에 의해 측정한다. 이 검벙법은 미오스타틴 신호전달 활성을 억제하는 항체를 처음에 식별하는데 사용될 수 있으며; 적정 곡선은 미오스타틴의 농도가 정해진 상태에서 변화된 항체의 농도를 사용하여 생성될 수 있다. 이러한 적정 곡선은 하기 표 3에 나타난 것처럼, 많은 수의 항체들에 대한 IC50 값을 측정하는데 사용된다.
[표 3]
다양한 항-미오스타틴 항체 변종의 IC50
Figure pct00003
단일클론 항체 12A5-5를 추가 분석을 위해 선택하였다.
KinExA ™ 용액 평형화 검정법에서 미오스타틴의 결합
KinExA®기술(Sapidyne Instruments, Inc.)을 사용하는 용액-기반 평형화-결합 검정법은 항체 분자에 대해 결합하는 미오스타틴의 해리 평형(dissociation equilibrium, Kd)을 측정하기 위해 사용된다. 이 용액-기반 검정법은 몇몇 예에서 BIAcore® 검정법 보다 민감하다고 고려된다. Reacti-Gel 6X(고반응도, 아민-함유 리간드의 고정화를 위해 6% 아가로스에 교차-연결된; Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL)을 약 50 마이크로G/ml의 미오스타틴으로 하룻밤 동안 전-코팅(pre-coated)하고, 그런 뒤 보바인 혈청 알부민(BSA; 1 mg/ml)으로 차단한다. 항체 샘플(10pM, 및 30pM)을 미오스타틴-코팅된 비드를 통해 수행하기 전에 0.1 mg.ml의 BSA를 함유하는 샘플 완충제에서 미오스타틴의 다양한 농도(0.5 pM to 5 nM )로 8시간 동안 실온상태로 배양한다. 비드-결합 항체의 양을 SuperBlock®에서 1 mg/ml(과잉 결합 부위를 차단하기 위한 최적화된 프로틴-기반 용액; Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL)에 형광(Cy5) 라벨된 염소 항-인간-Fc 항체에 의해 정량화한다. 결합 신호는 주어진 미오스타틴 농도에 평형상태에서 자유 항체의 농도에 비례한다. Kd는 KinExA™소프트웨어(Sapidyne Instruments, Inc.)에서 제공된 이중-곡선 단일-부위 동종의 결합 모델을 사용하는 경쟁 곡선의 비선형 회귀로부터 얻어진다. 항체 12A5-5는 본 검정법에서 대략 2 pM의 Kd를 나타낸다.
Biacore ™ 을 사용한 선택성 검정법
결합 특이성 분석은 실시간(in real time) 생체분자 상호작용을 연구하는 것에 대한 라벨-자유 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR)에 기반한 기술인, Biacore™을 사용하여 12A5-5에 대해 수행하였다(GE Healthcare, Chalfont St. Giles, UK). 12A5-5, 및 ActRIIB/Fc는 내부적으로(in house) 만들어졌고, TGF베타RII/Fc 및 BMPR-1A/Fc는 R & D 시스템즈(미니애폴리스, MN)으로부터 왔다. Mab 12A5-5 및 수용체 둘 모두를 제조자의 제시된 프로토콜에 따른 연구 등급 센서 칩(research grade sensor chip)에 공유결합으로 커플링하였다. 10 나노몰(nanomolar)의 각 리간드가 고정화된 높은 밀도 항체 및 수용체 표면 위를 지나쳐가게 했다. 그들의 상응하는 수용체에 대한 미오스타틴, GDF11, GDF3, 액티빈 A, 액티빈 AB, 액티빈 AC, TGF-베타1, BMP4, BMP9, 및 BMP10의 결합을 12A5-5 및 다른 수용체에 결합하는 리간드의 신호를 정상화하는 대조군으로 사용하였고, 시험하였다. 데이터는 Mab 12A5-5가 GDF3, 액티빈 A, 액티빈 AB, 액티빈 AC, TGF-베타1, BMP4, BMP9, 또는 BMP10에 결합하지 않는다는 것을 명백히 나타낸다. 항체 12A5-5는 별도의 실험에서 180 nM로 측정되는 친화성(Kd)으로 GDF11에 대한 약한 결합을 보였다. 결과는 항체 12A5-5가 미오스타틴에 특이적이라는 것을 나타냈고, 미오스타틴에 대해 GDF11를 넘는 거의 10,000-배의 선택성을 보였다.
추가적 시험관 내 검정법
미오스타틴의 억제 대 GDF -11의 억제를 비교하는 세포-기반 검정법
미오스타틴 결합 억제의 IC50과 GDF-11의 그것을 비교하는 것으로서, 이전에 설명된 것과 같은 세포-기반 검정법을 실질적으로 수행한다. 결과는 하기 표 4에 나타나있다.
[표 4]
미오스타틴 또는 GDF-11 활성의 억제
Figure pct00004
이 결과는 본 검정법에서, 12A5-5가 미오스타틴의 활성을 억제 한다는 것을 나타낸다, 그러나 대조군 폴리펩티드도 마찬가지였다(US 특허 7,511,012에 설명된), 반면에 대조군 펩티드는 또한 GDF-11의 활성도 억제했다, 항체 12A5-5는 그러하지 않았다.
ALK4 , ActRIIA , and ActRIIB / Fc 표면에서 결합 검정법
미오스타틴 결합 검정법을 실질적으로 미오스타틴에 대해 이전에 설명된 것처럼, 고정화된 ALK4/Fc, ActRIIA/Fc, 및 ActRIIB/Fc (R&D 시스템즈, 미니애폴리스, MN) 표면에 대해 Biacore™시스템을 사용하여 수행하였다. 고정화된 수용체에 대한 미오스타틴의 결합 신호를 용액에서 항체의 존재 또는 부재의 상태로 측정하였고, 100%로 할당되었던(대조군), 항체의 존재 상태로 미오스타틴의 결합 신호를 비교하였다. 감소된 결합 반응은 미오스타틴에 결합하는 항체가 수용체 서브유닛에 대한 미오스타틴의 결합을 차단했다는 것을 나타냈고, 반면 증가된 결합 반응은 미오스타틴/수용체 복합체에 대한 항체의 공동-결합(co-binding)을 나타냈다. 결과는 하기 표 5에 나타나있다.
[표 5]
미오스타틴 수용체 서브유닛에 대한 미오스타틴의 결합에 대한 12A5-5의 영향
Figure pct00005
이러한 결과는 12A5-5 및 대조군 폴리펩티드(이전에 설명된)가 미오스타틴/ALK4 상호작용을 차단했으나, 미오스타틴/ ActRIIB 및 미오스타틴/ ActRIIA 와는 공동-결합했다는 것을 나타낸다.
KinExA ™ 용액 평형 검정법에서 프로미오스타틴의 결합
이전에 설명된 것과 비슷한 KinExA™ 검정법을 성숙 미오스타틴 대신 프로미오스타틴(promyostatin)을 사용하여 수행했다. Reacti-Gel 6X을 약 50 microG/ml의 프로미오스타틴으로 하룻밤 동안 전-코팅(pre-coated)하고, 그런 뒤 BSA로 차단한다(blocked). 10 pM의 항체 샘플을 프로미오스타틴-코팅된 비드를 통해 수행하기 전에 프로미오스타틴의 다양한 농도(0.5 pM to 5 nM )로 샘플 완충제에서 8시간 동안 실온상태로 배양한다. 비드-결합 항체의 양을 이전에 설명된 것과 같이 실질적으로 정량화한다. Kd를 설명된 것과 같은 비선형 회귀(nonlinear regression)로부터 얻었으며; 항체 12A5-5는 ~2 pM의 Kd로 프로미오스타틴에 결합했다.
생체 내 항체의 동화작용( Anabolic ) 활성
C57BL6 마우스 모델(Charles River Laboratories, Massachusetts)을 본 발명의 미오스타틴 억제제의 생체 내 효능을 측정하기 위해 사용한다. 이 모델은 본 발명의 억제제와 급격한 동화작용 반응으로 반응하였고 그 반응은 증가된 건조 근육량(dry muscle mass) 및 근원섬유단백질(myofibrillar protein)의 증가과 관련되었으나, 체수분함량(body water content)에서 축적과는 관련되지 않았다.
일 실시예에서, 생체 내 12A5-5의 효능을 하기의 실험에 의해 증명하였다. 8주령 C57BL6 마우스들의 그룹을 10 mg/kg의 투여량(피하주사)으로 1주일에 한번 처리하였다. 8주령 C57BL6 마우스들의 대조군은 매주 운반체(vehicle, PBS)의 주사를 받았다. 동물들을 매주 마다 계량하였고, 지방제외체중(lean body mass)을 0주 및 4주차에 측정하였다. 그 결과는 도 1 및 2에 나타난다. 도 1은 항체의 투여에 대한 4주차가 지난 마우스들의 총 체중의 증가량을 대조군과 비교하여 나타낸다. 도면에서, 항-미오스타틴 항체 12A5-5는 검은 마름모(solid diamond)로 표시되고, 대조군은 흰 동그라미(open circle)로 표시된다; 다양한 데이터 점들에 대한 P 값은 하기와 같다: * = p<0.05; ** = P<0.01; and *** = p<0.001. 도 2는 핵자기공명(nuclear magnetic resonance, NMR)영상(imaging)(EchoMRI 2003, Echo Medical Systems, Houston, TX)에 의해 측정된 4주차 지방제외체중의 변화를 나타낸다. P 값은 이전에 설명한 것과 같다.
따라서, 미오스타틴 길항제 12A5-5는 마우스들에서 증가된 체중 및 지방제외체중의 증가를 야기했고; 비슷한 결과가 사이노몰로거스 몽키 연구에서 증명되었다.
항- 미오스타틴 중화 단일클론 항체 12A5-5에 대한 에피톱(들)의 식별
인간 미오스타틴의 성숙한 형태는 분자에서 분자내 및 분자간 디설파이드 결합(도 3에 나타남)을 형성하는 9개의 시스테인을 갖는 109 아미노산 프로틴이다. 8-멤버 고리 구조(eight-member ring structure)는 Cys43-Cys106 및 Cys47-Cys108 디설파이드 결합을 통해서 형성된다. Cys15-Cys74 디설파이드 결합은 다른 디설파이드 결합에 의해 생성된 고리 구조를 통해 관통하며(penetrate) 시스테인 매듭 구조(cystine-knot structure)를 생성한다. Cys6 및 Cys16은 시스테인 매듭의 부분이 아닌 N-말단 부위에서 디설파이드 결합을 형성한다. 1차 미오스타틴 단량체의 Cys73과 2차 미오스타틴 단량체의 Cys73 간의 분자간 디설파이드 연결은 공유결합 연결된 이합체인 원형 미오스타틴을 만들기 위해 형성된다. 두 미오스타틴 단량체는 원형 상태에서 역-병렬 구조(anti-parallel structure)로 3차원 적으로 접힌다(Cash 등., EMBO J (2009) 28, 2662-2676).
12A5-5의 결합에 중요한 에피톱(들)을 특징화하기 위한 일반적인 시도는 인간 미오스타틴을 서로 다른 단백질분해효소(protease) 및/또는 화학적 제제를 써서 펩티드로 단편화하는 것, 다양한 인간 미오스타틴 펩티드의 서열을 측정하는 것, 이러한 펩티드를 분리하는 것, 및 그들 각각을 BIAcore® 기반 경쟁 검정법을 사용해 12A5-5에 결합하는 그들의 능력이 있는지 시험하는 것을 포함했다. 유사한 단백질 가수분해 소화를 사용하는 추가적인 연구들은 결합부(펩티드 맵핑에 의해 검출된) 근처에서 단백질 가수분해 부위의 보호를 야기하는 12A5-5와 함께 전-배양돼 왔었던 인간 미오스타틴을 가지고 수행되었다. 인간 미오스타틴의 단백질 가수분해에 대한 항체 보호는 HPLC(고-성능 액체 크로마토그래피, high-performance liquid chromatography) 펩티드 맵핑으로부터 분리하는 것 후에 항체에 결합하는 펩티드(들)의 생산 및 항체에 의한 단백질 가수분해로부터 보호되는 이러한 펩티드들에 대한 감소된 신호를 야기한다. 따라서 결과 데이터는 측정되는 미오스타틴에 대한 12A5-5의 고-친화성 결합(high-affinity binding)에 중요한 부위(들)을 허용한다.
펩티드 분리 및 식별
펩티드 소화(Peptide digest)를 HPLC 펩티드 맵핑을 거치게 했고; 각각의 피크들을 수거했으며; 펩티드들을 전자분무 이온화(electrospray ionization, ESI) LC-MS/MS (액체 크로마토그래피 -질량 분광계/질량 분광계) 펩티드 맵핑 분석, 기질 보조 레이저 탈착 질량 분광계(matrix assisted laser desorption mass spectrometry, MALDI-MS) 및/또는 N-말단 염기서열결정(sequencing)에 의해 식별했고 맵핑했다. 이러한 연구에 대한 모든 HPLC 분석은 역상(reverse-phase) C18 컬럼(0.5 mm i.d. x 25 cm length; Zorbax® 300SB; 5 micron; Agilent Technologies, Santa Clara, CA)을 사용하여 수행하였다. HPLC 펩티드 맵핑 분석은 0.1 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, 이동상 B)에서 0.1% 트리플루오로아세트산(이동상 A) 부터 90% 아세토니트릴까지 다단계 선형 구배(multi-step linear gradient)로 전개(developed)되었다. 컬럼은 98% 이동상 A/2% 이동상 B에서 평형화되었고, 하기에 설명된 대로 15 마이크로리터/분 의 유속에서 100분이 넘게 프로그램된 구배 용리를 전개하였다: 2% 이동상 B에서 5분동안 등용매 용리(isocratic elution) 뒤에 90분 동안 2% 내지 50%의 이동상 B 및 5분 동안 50% 내지 100%의 이동상 B인 두 선형 구배 용리가 따른다.
CNBr , 엔도프로테이나제 ( endoproteinase ) LysC 및 키모트립신 소화( chymotrypsin digestion ):
성숙한 인간 미오스타틴을 Met 후에 펩티드 결합을 화학적으로 절단하는 CNBr로 소화시키고; 라이신 후에 펩티드 결합을 절단하는 엔도프로테이나제 LysC로 소화시키고; 또는 Phe, Tyr, Trp, Leu, 및 His 후에 절단하는 키모트립신으로 소화시켰다. 화학적 절단을 위한, 약 20-35 마이크로그람의 인간 미오스타틴 (0.5 mg/ml)을 약 0.5 mg 의 CNBr을 함유한 70%의 포름산에서 16시간 동안 실온으로 암중에서 배양하였다. 단백질분해효소 소화를 위해, 0.5mg/ml 에서 약 20-35 마이크로그람의 인간 미오스타틴을 10 mM의 아세트산 암모늄(pH 6.5)에서 20시간 동안 37℃로 20:1의 미오스타틴-대-단백질분해효소를 사용하는 LysC 또는 키모트립신 중 어느 하나와 함께 배양하였다. 1-3 마이크로그람 양(quantity)에서 CNBr 절단 및 단백질 가수분해 소화 실험으로부터 온 샘플은 LC-MS/MS 펩티드 맵핑 분석을 거친다. ESI-MS 검출로부터 온 유사한 펩티드 맵핑 분석 오프-라인을 또한 결합 분석 및 MALDI-MS 분석에 대한 각각의 펩티드 분획을 모으기 위해 수행하였다.
항-미오스타틴 항체 보호 실험에서, 미오스타틴(20 마이크로그람; 0.5 mg/ml)을 항체와 함께 두 개의 다른 양(30 및 120 마이크로그람; 각각 약 미오스타틴 이합체/Ab 몰 비율 = 4:1 및 1:1)으로 0.1M 아세트산 암모늄, pH 6.5 에서 1시간 동안 실온으로 전-배양하였다. 그런 뒤 샘플들을 위에서 설명된 것과 같이 LysC 및 키모트립신으로 소화하였다. 동일한 농도에서 항체 단독은 작은 양의 항체가 또한 소화될 수도 있는 것 처럼 또한 대조군으로 쓰이고 소화되었다.
TCEP [트리스 (2-카르복시에틸)-포스핀] 환원:
LysC 소화 샘플 및 CNBr 절단으로부터 온 HPLC-분리된 시스테인 매듭 펩티드 및 원형 미오스타틴의 디설파이드 결합은 4시간 동안 37℃의 0.05% 트리플루오로 아세트산에서 100 mM TCEP에 의해 완전히 환원되었다. TCEP-환원된 샘플들을 그런 뒤 LC-MS/MS 펩티드 맵핑과 동일한 조건을 사용하는 LC-MS/MS 분석에 의해 분석하였다. 환원된 펩티드를 ESI-MS 검출로부터 온 펩티드 맵핑 분석 오프-라인에 의해 수거했다.
CNBr 절단:
인간 미오스타틴의 CNBr 절단의 HPLC 크로마토그래피는 각각 58 및 80분의 체류시간을 갖는 두 개의 주된 피크를 생성했다. HPLC 피크에서 펩티드의 아이덴티티(identity)를 펩티드 B 및 C(표 6)로 지정된 샘플 식별에 의해 측정하였다. 펩티드 B는 Met84 및 Met101의 절단으로부터 생성된 작은 단편이다. 펩티드 C를 펩티드 A보다 대략 5분 먼저 용리하였고, 비-절단된 미오스타틴을 원형 미오스타틴의 HPLC 분석으로부터 회수하였다. N-말단 염기서열결정에 의해, MALDI-MS 및 LC-MS/MS 분석, 펩티드 C를 1-80 (분자량 9022 달튼) 및 102-109 (분자량 836 달튼)으로부터 온 서열을 함유하는 시스테인 매듭 단편으로 식별하였다. 펩티드 C의 측정된 분자량은 대략 19.7 kD이며, 이는 그것이 이합체 형태로 된 것임을 지칭한다. CNBr 절단 샘플의 TCEP 환원 뒤에 따르는 HPLC 펩티드 맵핑 후에, 표 6에 표시된 대로 펩티드 D 및 E를 수거했다. 체류시간 58분에서 용리된 펩티드 D를 펩티드 B와 같은 서열을 갖는지 식별하였고, 80분에서 용리된 펩티드 E를 1-80 서열을 함유하는지 식별하였고, 이는 완전히 환원돼 왔었던 분자간 디설파이드 결합뿐 아니라 서열 위치 102-109에서 펩티드에 연결된 디설파이드 결합을 나타낸다.
LysC 소화:
LysC 소화의 HPLC 크로마토그래피는 오직 4개의 피크만을 내었다. 체류시간 8 및 38분에서 펩티드 피크를 각각, 위치 37-39, 및 91-97에서 할당된(assigned) 서열로 펩티드인지 식별하였다. 이러한 두 펩티드 피크는 결합 검정법을 위해 수거됐던 것이 아니다. 61분에서 수거된 펩티드 F는 79-90에 할당된 서열을 가졌다(표 2). N-말단 염기서열결정 및 MALDI-MS에 의해 확인된 것처럼, 76분에서 수거된 펩티드 G는 디설파이드 결합으로 연결되고 서열 위치 1-36, 40-54, 55-78 및 98-109에서 할당된 4개의 서열을 포함하며, 이는 시스테인 매듭 구조가 온전하다는 것을 표시한다. 이 펩티드 피크가 이합체 형태의 존재를 확인하는, 19.5 kD의 분자량을 갖는지 측정하였다. 4개의 펩티드 중에 디설파이드 연결을 갖는 펩티드 G의 일차구조는 도 4에 나타나있다.
LysC 소화의 TCEP 환원 뒤에 따르는 LC-MS/MS 펩티드 맵핑 후에, 6개의 펩티드를 그런 뒤 수거하였고 추가적으로 분석하였다(표 6). 위에 설명된 것과 같은 비-시스테인-함유 펩티드인, 38분에서 펩티드 H는 서열 91-97을 포함한다. 체류시간 43, 49, 60, 및 79분에서 수거된 펩티드 I, J, K, 및 M은 각각 하기의 서열 위치에 할당되었다, 55-78, 98-109, 40-54, 및 1-36. 이러한 펩티드는 펩티드 G의 TCEP 환원으로부터 명백히 유도된다. 73분에서 펩티드 L은 서열 할당이 없는 혼합 서열을 포함한다.
항체 보호 실험(두 개의 다른 항체 농도에서 항체와 함께 미오스타틴을 전-배양한 것으로서 LysC로 단백질가수분해 한 것)에서, 이 실험에 의해 얻어진 펩티드 맵(map)은 미오스타틴 단독의 소화로부터 얻어진 것들과 동일하였다. 78분에서 주요한 피크의 구조는 설명된 것과 같은 LysC 시스테인-매듭 펩티드, 펩티드 G와 완벽하게 동일하다. 데이터는 12A5-5가 미오스타틴 단백질가수분해에 대해 보호 효과를 가지지 않았다는 것을 표시했고, 즉, 항체는 LysC 소화 도중에 단백질가수분해 보호를 제공하지 않는다.
키모트립신 소화:
키모트립신 소화의 HPLC 크로마토그래피는 많은 피크들을 내었다. HPLC로부터 회수된 펩티드 피크에 서열 분석을 수행하였다. 또한 펩티드 소화의 온-라인 ESI LC-MS 분석을 HPLC에 의해 분리되었던 펩티드의 정확한 질량을 측정하기 위해 수행하였다. 키모트립신적 절단(Chymotryptic cleavage)은 체류시간 27.1 분 (서열위치 53-57 및 53-59), 29 분(서열위치 30-31), 32.3 분(서열위치 52-57), 41분 (서열위치 53-60), 44분 (서열위치 52-60), 50 분(서열위치 87-95), 53 분(서열위치 30-38), 57 분(서열위치 28-31) 및 58분 (서열위치 21-27)에서 검출된 짧은 디- 내지 헵타-펩티드를 포함하는 많은 펩티드 피크를 생성한다. 67-73분 주변에서(펩티드 N으로 지정된) 큰 분자량 및 넓은 펩티드 피크는 N-말단 염기서열결정에 의해 확인된 것으로서 네 개의 펩티드(서열 위치 1-20, 25-38, 39-82, 및 96-109)로 이루어진 시스테인 매듭 구조를 함유하는지 식별되었다. 펩티드 N이 표시된 MALDI-MS 분석은 이합체의 존재를 확인하는 14.4 kD의 분자량을 가졌으나 반면 펩티드 피크가 확인된 디설파이드 결합의 MALDI-인-소스 부분 단편화(MALDI-in-source partial fragmentation)는 표 5에 나타난 것과 같은 서열 위치에 상응하는 예상된 분자량을 갖는 4개의 펩티드를 함유한다.
항체 보호 실험(미오스타틴을 12A5-5와 함께 전-배양한 것으로서 키모트립신으로 단백질가수분해되었고, LC-MS/MS 펩티드 맵핑으로 분석되었던 것)에서, 낮은 항체 몰 비율에서, 서열 위치 30-31 및 28-31 및 32-38에서 펩티드에 상응하는 펩티드 피크는 펩티드 맵핑 동안 그들 각각의 UV 흡광도 검출 신호의 감소를 나타내며, 키모트립신 소화로부터 항체에 의해 쉽게 보호됐던 위치 28 내지 38의 서열을 갖는 펩티드(들)을 표시한다. 높은 항체-대-미오스타틴 몰 비율(1:1에 가까운)에서, 단백질가수분해 부위의 많은 부분이 보호되었다. 펩티드 피크의 현저한 감소가 서열위치 21-27, 30-31, 28-31, 32-38, 및 52-60에서의 펩티드에서 관찰되었고, 펩티드 87-95에서 약간의 감소가 관찰되었다. 결과적으로 75분에서 높은 UV 흡광도를 갖는 새로운 피크(표 6의 폴리펩티드 P)가 관찰되었다. 이러한 데이터는, 위치 21 내지 31 및 위치 50 내지 60 근처 서열에 위치한, 미오스타틴의 두 부위를 나타내며, 그 부위는 위에서-언급된 펩티드에서 펩티드 결합의 키모트립신 절단을 방지하기 위해 항체와 밀접환 상호작용 관계에 있으며 따라서 미오스타틴에 대한 12A5-5의 결합에 필수적이다.
[표 6]
CNBr, 엔도프로테이나제 LysC 및 키모트립신 소화로부터의 HPLC 펩티드 맵핑 분석으로부터 분리된 미오스타틴 펩티드의 요약(digest)
Figure pct00006
BIAcore ® 결합 검정법:
항-미오스타틴 중화 단일클론 항체에 의해 결합된 에피톱을 특징화하는 전략은 다양한 CNBr-, LysC- 및 키모트립신-생성 인간 미오스타틴 펩티드를 사용하는 것 및 항체에 의해 결합 될 수 있는 펩티드를 측정하는 것이었다. 일 양상에서, 이는 BIAcore® 칩(chip)에 고정화된 인간 미오스타틴에 대한 12A5-5의 결합이 각 분리된 HPLC 펩티드 분획의 존재 또는 부재에서 측정된 상황에서 BIAcore® 경쟁 결합 검정법으로 시험되었다. 임의의 경쟁 펩티드의 부재에서, 12A5-5는 칩에 있는 인간 미오스타틴에 결합 할 수 있고, RU(공명 단위) 반응을 생성할 수 있다. 용액에서 온전한 인간 미오스타틴과 함께 12A5-5의 전-배양, 그 뒤를 이은 칩에 대한 결합을 시험하는 것은 용액에서 인간 미오스타틴에 대한 항체의 결합이 칩에서 인간 미오스타틴에 대한 항체의 결합을 방해했다는 것을 증명했고, 따라서 경쟁 검정법의 일반적인 원칙을 입증한다. 이 일반적 방법은 각 펩티드에 대해서 개별적으로 반복되었다. 로버스트(robust) RU 반응은 시험되고 있는 특정 펩티드가 용액에서 12A5-5에 결합 할 수 없다는 것(이런 이유로 12A5-5는 칩에 고정화돼 왔었던 인간 미오스타틴에 결합될 수 있었다)을 표시하기 위해 채택되었다. 반대로, 로버스트 RU 반응의 부재는 12A5-5가 용액에서 미오스타틴 펩티드에 결합 할 수 있다는 것(및 따라서 고정화된 미오스타틴에 결합할 수 없다는 것)을 나타냈다. 다양한 미오스타틴 펩티드의 알려진 아이덴티티와 더불어 이러한 결합 패턴은 미오스타틴의 어떤 부위가 항체 12A5-5의 결합에 중요했는지(또는 필요했는지)를 측정하기 위해 사용되었다.
도 6은 비-환원 및 TCEP-환원 펩티드 샘플을 위한 결합 검정법을 요약한 것이다. 펩티드 A(HPLC로부터 회수된 미오스타틴 이합체), 펩티드 C(시스테인 매듭 이합체를 함유하는 CNBr 펩티드), 펩티드 E(환원된 CNBr 펩티드, 서열 위치 1-80), 펩티드 O(환원된 온전한 미오스타틴 단량체; 서열 위치 1-109), 펩티드 G(시스테인 매든 이합체를 함유한 LysC 펩티드, 서열 위치 1-36, 54, 55-78 & 98-109), 및 펩티드 P(시스테인 매듭 이합체를 함유하는 항체-보호된 키모트립식분해 펩티드, 서열 위치 1-20, 21-82 & 96-109)는 모두 BIAcore® 경쟁 검정법에 기반한 항체에 결합할 수 있다. 펩티드 N(시스테인 매듭 이합체를 함유하는 키모트립신분해 펩티드, 서열 위치(1-20, 39-51, 63-82 & 96-109)은 항체에 결합 할 수도 없고, 펩티드 G의 TCEP 환원으로부터 얻은 것을 포함하는 시험된 임의의 다른 펩티드도 아니었다. 게다가, 동일한 것은 결합에 관여되고 있는 항체 보호 검정법에서 식별된 서열을 함유하는, 폴리펩티드 M에 대해 진실이며, 이는 아미노산 21 및 31 사이의 부위가 미오스타틴에 대한 12A5-5의 결합에 필요하나 충분하진 않는 것을 나타낸다.
펩티드 A, C, E, 및 G에 결합하는 12A5-5의 능력은 펩티드가 BIAcore® 칩에서 펩티드 표면을 형성하기 위해 공유결합으로 고정화되었던 상황인 직접 결합 분석에서 더 확인된다. 이 실험을 위해, 25 nM의 항체가 2.5분 동안 80 마이크로리터/분 에서 펩티드 표면상에 가해졌으며(flown), 15분 동안 완충제의 흐름(flowing)이 뒤따랐다. 도 7은 분석의 센서그람(sensorgram)을 나타낸다. 고정화된 펩티드와 결합하는 항체에 대한 결합단계(association phase)는 ~200s에서 끝났으며, 이는 표면으로부터 온 항체의 해리단계(dissociation phase)의 시작점이었다. 펩티드 A, C, E 및 미오스타틴의 평평한 해리단계는 항체와 이러한 펩티드들 간에 안정한 복합체 구조를 나타냈고, 반면 펩티드 G 표면에서 해리 단계의 신호 감소는 항체 및 펩티드 G 사이에 형성된 복합체가 덜 안정하다는 것을 나타냈다. 펩티드 C와 펩티드 G를 비교하면, 항체/펩티드 G 복합체 안정성의 감소는 펩티드 G에 있는 K54에서 LysC 절단 때문에 크게 나타나나(도 4), 반면 펩티드 C(M78 및 M101 사이의 단편이 누락된)의 아미노산 50 내지 60 근처 부위에서 CNBr 절단은 없었다.
K54 바로전에 있는 미오스타틴의 서열이 EFVFLQ라는 것은 주목할 만 하다, 반면 GDF11에 상응하는 서열은 EYMFMQ이다. 이전의 실험에서, 미오스타틴에 있는 이 부위의 GDF11에서 온 상응하는 부위로의 대체는 키메라 분자와 항체의 상호작용을 현저하게 감소시켰다. 또한 본 데이터는 미오스타틴에 있는 이 부위 주변을 잘라내는 것은 비록 그것을 완전히 제거하지 못한다 하여도, 12A5-5 항체와 복합체를 형성하는 그것의 능력을 감소시킨다는 것을 나타낸다. 미오스타틴에 대한 12A5-5의 결합 친화성이 GDF11에서 약 180 nM에 대해 대략 2 pM인 것을 고려하면, 이 부위는 미오스타틴에 대한 항체의 특이적 결합이 필요하다는 것을 나타낸다.
상기 데이터를 종합하면, 항-미오스타틴 중화 항체 12A5에 대한 미오스타틴의 결합에 필요한 미오스타틴의 부위는 위치 21 내지 31 및 위치 50 내지 60(도 8에 표현됨) 근처의 서열에 위치한다. 이러한 두 부위는 1차 서열 수준(primary sequence level)에서는 거리가 멀리 떨어진 것으로 보인다. 그러나, 그들은 미오스타틴/폴리스타틴의 공동-크리스탈 구조에 의해 증명된 것과 같은(Cash 등., supra) 이합체 형태의 3차원적 구조에서 합쳐진다. 도 8은 각 미오스타틴 단량체가 전형적인 시스테인 매듭 구조를 형성하는, 3차원적 미오스타틴 이합체 및 단량체 구조를 나타낸다. 두 단량체는 서로 간에 역-병렬이며 두 단량체 사이에 Cys73-Cys73 디설파이드 결합으로 미오스타틴 이합체를 형성한다. 미오스타틴 이합체의 역-병렬 구조는 한 단량체에서 온 L52/L60 주변 부위를 다른 단량체에 있는 F27/W31 주변 부위와 아주 근접하게 만든다. 상기 데이터는 항체 12A5-5가 그 강력한 결합 친화성을 달성하기 위해서는 두 부위 모두를 필요로 한다는 것을 제안한다.
SEQUENCE LISTING <110> AMGEN INC. <120> ANTIBODIES THAT BIND MYOSTATIN, COMPOSITIONS AND METHODS <130> IF13P040US <150> US 61/374,095 <151> 2010-08-16 <160> 25 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 12A5 - 1LC <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Leu Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 12A5 - 3LC <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln 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Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Lys Leu Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 12A5 - 12LC <400> 8 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Trp Leu Gln Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Leu Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 9 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 12A5 - 18LC <400> 9 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser His Leu Gln Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Leu Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 10 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> ConsensusLC <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(52) <223> Xaa can be Lys, Arg or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (53)..(53) <223> Xaa can be Thr, Phe, Trp or His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (93)..(93) <223> Xaa can be Asn or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (94)..(94) <223> Xaa can be Leu or Lys <400> 10 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Xaa Xaa Leu Gln Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Xaa Xaa Leu Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 11 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 12A5 - 1HC <400> 11 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gln Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 12 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 12A5 - 3HC <400> 12 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr 20 25 30 Trp Cys Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gln Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Glu Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 13 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 12A5 - 5HC <220> <221> misc_feature <222> (50)..(50) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 13 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Xaa Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Glu Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 14 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 12A5 - 6HC <400> 14 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gln Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Glu Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 15 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 12A5 - 8HC <400> 15 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr 20 25 30 Trp Cys Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gln Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Glu Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 16 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 12A5 - 9HC <400> 16 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr 20 25 30 Trp Cys Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gln Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Glu Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 17 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 12A5 - 10HC <400> 17 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr 20 25 30 Trp Cys Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gln Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Glu Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 18 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> A12A5 - 12HC <400> 18 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gln Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Glu Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 19 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 12A5 - 18HC <400> 19 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr 20 25 30 Trp Cys Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gln Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Glu Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 20 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> ConsensusHC <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa can be Ser or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa can be Asn or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> Xaa can be Met, Leu or Cys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (99)..(99) <223> Xaa can be Ala or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (100)..(100) <223> Xaa can be Arg or Glu <400> 20 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Xaa Xaa Tyr 20 25 30 Trp Xaa Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gln Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Xaa Xaa Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 21 <211> 352 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Promyostatin (native) <400> 21 Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys 1 5 10 15 Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gln Asn Thr Lys Ser Ser Arg Ile Glu Ala 20 25 30 Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn 35 40 45 Ile Ser Lys Asp Val Ile Arg Gln Leu Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu 50 55 60 Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp 65 70 75 80 Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile 85 90 95 Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu Met Gln Val Asp Gly Lys Pro 100 105 110 Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val 115 120 125 Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu Arg Pro Val Glu Thr Pro Thr 130 135 140 Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly 145 150 155 160 Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly 165 170 175 Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp 180 185 190 Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp 195 200 205 Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp 210 215 220 Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg 225 230 235 240 Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser 245 250 255 Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp 260 265 270 Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly 275 280 285 Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val 290 295 300 His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr 305 310 315 320 Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile 325 330 335 Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 340 345 350 <210> 22 <211> 352 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Promyostatin (#1) <400> 22 Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys 1 5 10 15 Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gln Asn Thr Lys Ser Ser Arg Ile Glu Ala 20 25 30 Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn 35 40 45 Ile Ser Lys Asp Val Ile Arg Gln Leu Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu 50 55 60 Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp 65 70 75 80 Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile 85 90 95 Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu Met Gln Val Asp Gly Lys Pro 100 105 110 Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val 115 120 125 Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu Arg Pro Val Glu Thr Pro Thr 130 135 140 Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly 145 150 155 160 Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly 165 170 175 Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp 180 185 190 Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp 195 200 205 Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp 210 215 220 Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg 225 230 235 240 Ser Arg Arg Asn Leu Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Ser Glu Ser 245 250 255 Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp 260 265 270 Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly 275 280 285 Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val 290 295 300 His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr 305 310 315 320 Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile 325 330 335 Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 340 345 350 <210> 23 <211> 352 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Promyostatin (#2) <400> 23 Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys 1 5 10 15 Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gln Asn Thr Lys Ser Ser Arg Ile Glu Ala 20 25 30 Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn 35 40 45 Ile Ser Lys Asp Val Ile Arg Gln Leu Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu 50 55 60 Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp 65 70 75 80 Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile 85 90 95 Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu Met Gln Val Asp Gly Lys Pro 100 105 110 Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val 115 120 125 Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu Arg Pro Val Glu Thr Pro Thr 130 135 140 Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly 145 150 155 160 Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly 165 170 175 Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp 180 185 190 Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp 195 200 205 Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp 210 215 220 Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg 225 230 235 240 Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser 245 250 255 Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp 260 265 270 Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly 275 280 285 Gln Cys Glu Tyr Met Phe Met Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val 290 295 300 His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr 305 310 315 320 Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile 325 330 335 Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 340 345 350 <210> 24 <211> 352 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Promyostatin (#3) <400> 24 Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys 1 5 10 15 Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gln Asn Thr Lys Ser Ser Arg Ile Glu Ala 20 25 30 Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn 35 40 45 Ile Ser Lys Asp Val Ile Arg Gln Leu Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu 50 55 60 Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp 65 70 75 80 Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile 85 90 95 Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu Met Gln Val Asp Gly Lys Pro 100 105 110 Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val 115 120 125 Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu Arg Pro Val Glu Thr Pro Thr 130 135 140 Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly 145 150 155 160 Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly 165 170 175 Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp 180 185 190 Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp 195 200 205 Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp 210 215 220 Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg 225 230 235 240 Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser 245 250 255 Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp 260 265 270 Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly 275 280 285 Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val 290 295 300 His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr 305 310 315 320 Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Asp Lys Gln Gln Ile 325 330 335 Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Gly Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 340 345 350 <210> 25 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys 1 5 10 15 Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile 20 25 30 Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu 35 40 45 Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala 50 55 60 Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser 65 70 75 80 Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly 85 90 95 Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 100 105

Claims (21)

  1. 하나 이상의 라이트 체인 및 하나 이상의 헤비 체인을 포함하는 분리된 미오스타틴-특이적 항체로서, 상기 라이트 체인은 3개의 상보 결정 부위들(CDR)을 포함하는 가변부 및 불변부를 포함하며, 헤비 체인은 3개의 CDR들을 포함하는 가변부 및 불변부를 포함하며, 상기 라이트 체인 CDR들은 SEQ ID NO:10 에 개시된 것들이고, 헤비 체인 CDR들은 SEQ ID NO:20 에 개시된 것들인 항체.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 라이트 체인 CDR들은:
    a) SEQ ID NO:1에 개시된 라이트 체인 CDR들;
    b) SEQ ID NO:2에 개시된 라이트 체인 CDR들;
    c) SEQ ID NO:3에 개시된 라이트 체인 CDR들;
    d) SEQ ID NO:4에 개시된 라이트 체인 CDR들;
    e) SEQ ID NO:5에 개시된 라이트 체인 CDR들;
    f) SEQ ID NO:6에 개시된 라이트 체인 CDR들;
    g) SEQ ID NO:7에 개시된 라이트 체인 CDR들;
    h) SEQ ID NO:8에 개시된 라이트 체인 CDR들; 및
    i) SEQ ID NO:9에 개시된 라이트 체인 CDR들 로 구성된 군으로부터 선택된 것 이며;상기 헤비 체인 CDR들은:
    a') SEQ ID NO:11에 개시된 헤비 체인 CDR들;
    b') SEQ ID NO:12에 개시된 헤비 체인 CDR들;
    c') SEQ ID NO:13에 개시된 헤비 체인 CDR들;
    d') SEQ ID NO:14에 개시된 헤비 체인 CDR들;
    e') SEQ ID NO:15에 개시된 헤비 체인 CDR들;
    f') SEQ ID NO:16에 개시된 헤비 체인 CDR들;
    g') SEQ ID NO:17에 개시된 헤비 체인 CDR들;
    h') SEQ ID NO:18에 개시된 헤비 체인 CDR들; 및
    i') SEQ ID NO:19에 개시된 헤비 체인 CDR들로 구성된 군으로부터 선택된 것인 항체.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 라이트 체인 가변부는 SEQ ID NO:10에 제시된 아미노산 서열을 포함하며, 헤비 체인 가변부는 SEQ ID NO:20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 항체.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 라이트 체인 가변부는:
    a) SEQ ID NO:1에 개시된 라이트 체인 가변부;
    b) SEQ ID NO:2에 개시된 라이트 체인 가변부;
    c) SEQ ID NO:3에 개시된 라이트 체인 가변부;
    d) SEQ ID NO:4에 개시된 라이트 체인 가변부;
    e) SEQ ID NO:5에 개시된 라이트 체인 가변부;
    f) SEQ ID NO:6에 개시된 라이트 체인 가변부;
    g) SEQ ID NO:7에 개시된 라이트 체인 가변부;
    h) SEQ ID NO:8에 개시된 라이트 체인 가변부; 및
    i) SEQ ID NO:9에 개시된 라이트 체인 가변부로 구성된 군으로부터 선택된 것이며;
    상기 헤비 체인 가변부는:
    a') SEQ ID NO:11에 개시된 헤비 체인 가변부;
    b') SEQ ID NO:12에 개시된 헤비 체인 가변부;
    c') SEQ ID NO:13에 개시된 헤비 체인 가변부;
    d') SEQ ID NO:14에 개시된 헤비 체인 가변부;
    e') SEQ ID NO:15에 개시된 헤비 체인 가변부;
    f') SEQ ID NO:16에 개시된 헤비 체인 가변부;
    g') SEQ ID NO:17에 개시된 헤비 체인 가변부;
    h') SEQ ID NO:18에 개시된 헤비 체인 가변부; 및
    i') SEQ ID NO:19에 개시된 헤비 체인 가변부로 구성된 군으로부터 선택된 것인 항체.
  5. 100 pM 미만의 Kd로 미오스타틴에 결합하는 분리된 미오스타틴-특이적 항체.
  6. 제 5항에 있어서,
    10 nM 초과의 Kd로 GDF-11에 결합하는 분리된 미오스타틴-특이적 항체
  7. GDF-11에 대한 친화성 보다 5000배 이상의 친화성으로 미오스타틴에 결합하는 분리된 미오스타틴-특이적 항체.
  8. GDF-11에 대한 선택성 보다 5000배 이상인 미오스타틴에 대한 선택성을 보이는 분리된 미오스타틴-특이적 항체.
  9. 미오스타틴에 결합하여 미오스타틴과 ALK4의 상호작용을 차단하는 분리된 미오스타틴-특이적 항체.
  10. 제 9항에 있어서,
    미오스타틴에 결합하여 미오스타틴과 ALK4의 상호작용을 차단지만 미오스타틴/ActRIIA 복합체 및/또는 미오스타틴/ActRIIB 복합체와 공동-결합하는 분리된 미오스타틴-특이적 항체.
  11. 미오스타틴에 결합하여 분리된 미오스타틴-특이적 항체로서, 미오스타틴-특이적 항체에 대한 미오스타틴의 결합에 필요한 상기 미오스타틴의 두 부위는 성숙한 미오스타틴(SEQ ID NO:25)의 위치 21 내지 31 및 위치 50 내지 60 근처의 서열에 위치하는 미오스타틴-특이적 항체.
  12. 성숙한 미오스타틴의 위치 21 내지 31 및 위치 50 내지 60 근처의 서열에 위치된 미오스타틴의 두 부위와 상호작용하여 이러한 부위 내에서 펩티드 결합의 키모트립신 절단을 방지하는 분리된 미오스타틴-특이적 항체.
  13. 제 1항 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 라이트 체인 불변부는 카파 및 람다 라이트 체인 불변부로 구성된 군으로부터 선택된 것이고, 헤비 체인 불변부는 뮤, 델타, 감마, 알파, 및 엡실론 불변부로 구성된 군으로부터 선택된 것인 항체.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 구성된 군으로부터 선택된 서브클래스에 속하는 항체.
  15. 제 1항 내지 14항 중 어느 한 항에 따른,
    미오스타틴-특이적 길항제를 인코딩하는 분리된 핵산.
  16. 제 15항의 핵산을 포함하는 벡터.
  17. 제 16항의 벡터로 트랜스펙션되거나 형질전환된 분리된 숙주 세포.
  18. 발현을 촉진하는 조건에서 제 17항의 숙주 세포를 배양하고; 배양 배지에서 미오스타틴-특이적 길항제를 회수하는 것을 포함하는 미오스타틴-특이적 길항제의 생산 방법.
  19. 제 1항 내지 16항 중 어느 한 항의,
    미오스타틴-특이적 항체 또는 미오스타틴-특이적 길항제 및 약제학적으로 허용되는 희석제, 부형제 또는 담체를 포함하는 조성물.
  20. 하나 이상의 미오스타틴 활성을 억제하는 방법으로서,
    하나 이상의 미오스타틴 활성이 부분적으로 또는 완전히 억제되도록 제 19항에 따른 조성물을 개체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  21. 제 20항에 있어서,
    상기 개체는:
    안드로겐 결핍 치료가 원인인 생식샘저하증 및 생식선 기능에서의 연령-관련 감소가 원인인 생식샘저하증을 포함하는 생식샘저하증(hypogonadism), 악액질(cachexia); 심장 악액질(cardiac cachexia); 신장성 악액질(renal cachexia); 심장 위축(cardiac atrophy); 심장 발육부전(cardiac hypotrophy); 심장 부전(heart failure); 근육감소증(sarcopenia); 외상성 골절(traumatic bone fracture); 골다공성 골절(osteoporotic fracture); 예를들어, 골다공증(osteoporosis) 또는 골감소증(osteopenia)과 같은 뼈 손실(bone loss); 애디슨병(Addison's disease); 근육위축가쪽경화증(amyotrophic lateral sclerosis) 또는 운동신경세포병(motor neuron disease)(ALS; MND; 루게릭병); 벨 마비(Bell's palsy)(및 또는 안면 신경 문제); 보툴리눔독소증(botulism); 뇌성마비(cerebral palsy); 샤르코-마리-투스병(Charcot-Marie-Tooth disease) 및 다른 말초신경증(other peripheral neuropathies); 쿠싱증후군(Cushing's syndrome); 당뇨신경병증(diabetic neuropathy); 궐레인 바레 증후군(Guillan-Barre syndrome); 다발경화증(multiple sclerosis); 근위축(muscular atrophy)(진행성 및 척추근위축을 포함하는); 근디스트로피(muscular dystrophy)(이에는 베커 근디스트로피(Becker's muscular dystrophy), 선천적 근디스트로피(cogenital muscular dystrophy), 듀켄씨근디스트로피(Duchenne muscular dystrophy), 원위 근디스트로피(distal muscular dystrophy), 에머리-드레이푸스 근디스트로피(Emery-Dreifuss muscular dystrophy), 얼굴어깨위팔근육디스트로피(facioscapulohumeral muscular dystrophy), 팔다리이음근디스트로피(limb-girdle muscular dystrophy), 근긴장성(myotonic muscular dystrophy), 눈인두근디스트로피(oculopharyngeal muscular dystrophy), 척추근위축증(spinal muscular atrophy), 브라운-비알레토-반 라에레 증후군(Brown-Vialetto-Van Laere syndrome, BVVL), 파지오-론데 증후군(Fazio-Londe syndrome), 및 진행성골근육약화(progressive weakness), 근프로틴결핍(defects in muscle protein), 및 근세포 및 근조직 사멸에 의해 특징지어진 다른 증후군을 포함하는 다양한 형태가 있다); 중증근무력증(myasthenia gravis); 회색질척수염(poliomyelitis); 다발근육염(polymyositis); 근육, 힘줄 및 또는 인대의 접질림 및 염좌(sprains and strains); 뇌졸중(stroke)(및 장기적 무기력(prolonged inactivity) 또는 장기요양(bed-rest), 사지고정(immobilization of limbs)(예를 들어 석고붕대고정 및 부목고정에 의한), 및 우주비행과 같은 근소모를 야기하는 다른 질환); 및 성장호르몬, 인슐린 성장 인자-1(IGF-1), 성장 호르몬 분비촉진제, 및 성장 호르몬- IGF-1 액시스(axis)와 관련된 다른 제제(agent)에 의해 치료 가능한 질환으로 구성된 군으로부터 선택된 질환에 의해 고통받는 개체인 방법.
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