JP2009545322A - 規定された抗原特異性の可溶性モノクロナール可変性リンパ球受容体に関連する方法および組成物 - Google Patents

Abstract

開示されるのは、可変性リンパ球受容体（ＶＬＲ）に関連する組成物および方法である。より詳細には、開示されるのは、可溶性、モノクロナール、多価形態を含む、各種抗原特異的ポリペプチド、並びに、該ポリペプチドの使用法、該抗原特異的ポリペプチドに結合する抗体、および、該ポリペプチドをコードする核酸、ベクター、および発現システムである。炭疽菌などの病原体、血液型決定基などの炭水化物に選択的に結合する、抗原特異的ポリペプチドが、具体的に開示される。

Description

関連出願への相互参照
本願は、２００６年８月２日に出願された米国特許出願第６０／８３５，０３３号に対する優先権を主張する。米国特許出願第６０／８３５，０３３号は、本明細書中に参考として援用される。

発明の背景
最近、無顎脊椎動物が、可変性リンパ球受容体（ＶＬＲ）と呼ばれる、抗原特異的受容体を有することが明らかにされた。これらのＶＬＲは、適応性免疫に関与するが、有顎脊椎動物に見られる免疫グロブリン型抗原受容体とははっきり異なる。ＶＬＲは、クローン的に多様であり、ロイシンリッチな反復（ＬＲＲ）モジュールを含む。ＶＬＲは、以前に、ヤツメウナギまたはヌタウナギから単離され、ＧＰＩアンカーを有し、膜結合型であることが知られる。しかしながら、上記の特徴のために、大規模なＶＬＲ生産のために利用が可能な細胞系統は無かった。

発明の要旨
本明細書において具体的に例示し、広範囲に記載するように、本出願は、抗原特異的ポリペプチド、およびそれに関連する方法および組成物に関する。本出願はさらに、可溶性、モノクロナールＶＬＲを作製する方法に関する。これらの方法は、ＶＬＲの大規模生産のために商業的に有用である。さらに、本出願において提供されるものは、これらの方法によって作製されるＶＬＲであって、例えば、ただし、例示のためであって、限定のためではないが、炭疽菌、ＨＩＶ、およびインフルエンザなどの病原体に対して特異的なＶＬＲ、および、血液型決定因子などの炭水化物に対して特異的なＶＬＲなどである。さらに提供されるものは、ＶＬＲに対する抗体、および、ＶＬＲをコードする核酸である。ＶＬＲの使用法、ＶＬＲをコードする核酸、およびＶＬＲに対する抗体も開示される。

前述の一般的記述、および下記の詳細な説明はいずれも、単に例示および説明のためのものであって、特許請求の範囲を限定するものではないことを理解しなければならない。

本明細書に組み込まれ、その一部を構成する付属の図面は、いくつかの実施態様を例示し、その説明と相俟って、ＶＬＲ、およびそれに関連する方法および組成物の原理を説明するのに役立つ。

図１Ａは、ヤツメウナギ血清から単離されたＶＬＲ、および培養媒体から単離されたＶＬＲのウェスタンブロットである。血液は、ヤツメウナギ幼生から、抗凝固剤としてのＥＤＴＡの存在下に収集した。血液細胞は、１，０００ｇ５分の遠心によってペレット状とし、次いで、血漿上清を取り出した。この血漿を、還元剤、２−メルカプト−エタノール（２−ＭＥ）によって処理するか、または未処理のままとし、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷した（左パネル）。図１Ａの右パネルでは、クローンされたＶＬＲ ｃＤＮＡをＨＥＫ−２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、トランスフェクト細胞から培養媒体を収集し、２−ＭＥ前処置をして、またはせずに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに負荷した。ＶＬＲ発現を、抗ＶＬＲ ｍＡｂ（４Ｃ４）によるウェスタンブロットによって検出した。図１Ｂは、多価ＶＬＲのモデルである。 抗原特異的ＶＬＲ作製法の模式図である。 トランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞から分泌された多価ＶＬＲのウェスタンブロットである。図３Ａは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル負荷前に、２−メルカプトエタノールで処理した、トランスフェクトＨＥＫ−２９３細胞から調製した、界面活性剤可溶分解物使用の結果を示す。図３Ｂは、トランスフェクションの４８時間後、直接ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷した、ＶＬＲ形質転換細胞採取上清のウェスタンブロットである。ＶＬＲ発現は、抗ＶＬＲ ｍＡｂ（４Ｃ４）によるウェスタンブロッティングによって検出した。図３Ｃは、トランスフェクションの４８時間後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷前に、２−メルカプトエタノールで処理した、ＶＬＲ形質転換細胞採取上清のウェスタンブロットである。ＶＬＲ発現は、抗ＶＬＲ ｍＡｂ（４Ｃ４）によるウェスタンブロッティングによって検出した。 いくつかのＶＬＲの結合特異性を特定する棒グラフである。ＶＬＲトランスフェクトＨＥＫ−２９３細胞からの培養上清を、表示の抗原をコートした９６ウェルプレートにおいてインキュベートした。ＶＬＲ結合は、抗ＶＬＲ ｍＡｂ（４Ｃ４）、次いで、ＡＰ接合ヤギ抗マウスＩｇ二次抗体によって検出した。 Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓのＢｃｌＡ−ＣＴＤ（配列番号１）およびＢ．ｃｅｒｅｕｓのＢｃｌＡ−ＣＴＤ（配列番号２）の整列。非保存的残基を、白色で強調する。 ＢｃｌＡに結合する、ＶＬＲ４可変域（配列番号３）、および、ＢｃｌＡに結合しない、ＶＬＲ５可変域（配列番号４）の比較を示す配列整列。白は、アミノ酸差を示し、（＊）は、積極的に選択されること、およびＶＬＲソレノイド構造の内面へ配されることが予測される残基を示す。 ヤツメウナギＶＬＲが、ヒトの血液型炭水化物抗原を認識することを実証するＦＡＣＳヒストグラムを示す。結果は、ヒト赤血球によって免疫化されたヤツメウナギの血漿のみが、Ｈ抗原を生成するように酵素によってトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を染色することを示す。 種々のＬＲＲドメインを表示する、完全長ＶＬＲ−４（配列番号５）および完全長ＶＬＲ−５（配列番号６）の配列整列である。 抗原特異的モノクロナールＶＬＲ−Ｂ抗体の生産法を示す模式図である。４から８週間、抗原の腹腔内（Ｉ．Ｐ．）注入によってヤツメウナギが免疫化されるところが示される。免疫化後、抹消血からバッフィーコートリンパ球を単離し、全体ＲＮＡを調製した。５’および３’定常域に対し特異的なプライマーによるＰＣＲによってＶＬＲ−Ｂ ｃＤＮＡを単離し、これを、哺乳動物発現ベクターにクローンしてライブラリーを構築した。ＶＬＲ−Ｂ ｃＤＮＡを、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に一過性にトランスフェクトし、トランスフェクト細胞の上清を用いて、ＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリーによって、抗原結合に関してスクリーニングした。 抗原特異的モノクロナールＶＬＲ−Ｂ抗体の生産法を示す模式図である。は、マウスモノクロナール抗体（ｍＡｂ）生産・対・ヤツメウナギモノクロナールＶＬＲ−Ｂ（ｍＶＬＲ−Ｂ）抗体生産に必要とされる時間投資を示す。 図９Ａは、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓのＢｃｌＡに対して特異的な、モノクロナールＶＬＲ−Ｂ抗体の生産を示す。プレートに、組み換えＢｃｌＡ−ＣＴＤ−ＧＳＴ、またはＧＳＴタンパク質を塗布し、次いで、ＶＬＲ−ＢトランスフェクトＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の上清と共にインキュベートした。ＶＬＲ−Ｂ結合は、抗ＶＬＲ−Ｂ ｍＡｂ（４Ｃ４）、および、ＡＰ−接合ヤギ抗マウスポリクロナールＡｂによって検出した。図９Ｂは、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓのＢｃｌＡに対して特異的な、モノクロナールＶＬＲ−Ｂ抗体の生産を示す。胞子を、ポリ−Ｌ−リシン処理プレートに吸着させ、次いで、ＶＬＲ−Ｂトランスフェクト細胞上清と共にインキュベートした。ＶＬＲ−Ｂ結合は、図１０Ａに記載するように、ＥＬＩＳＡによって検出した。 図９Ｃは、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓのＢｃｌＡに対して特異的な、モノクロナールＶＬＲ−Ｂ抗体の生産を示す。胞子を、ＶＬＲ−Ｂトランスフェクト細胞上清と共にインキュベートし、次いで、抗ＶＬＲ−Ｂ ｍＡｂ（４Ｃ４）、およびＦＩＴＣ−接合ヤギ抗マウスポリクロナールＡｂで染色した。ＶＬＲ−Ｂ染色を、フローサイトメトリーによって分析した（ＢＤ ＦＡＣＳｃａｎ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ））。図９Ｄは、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ由来のＢｃｌＡ−ＣＴＤ（配列番号１）、およびＢ．ｃｅｒｅｕｓＴのＢｃｌＡ−ＣＴＤ（配列番号２）の配列整列を示す。溶媒暴露アミノ酸差には、黒陰影を、埋没アミノ酸差には、灰色陰影を施す。図９Ｅは、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓのＢｃｌＡ−ＣＴＤ三次構造の表面画像を示す。Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓおよびＢ．ｃｅｒｅｕｓの間に見られるアミノ酸配列の差には、黒陰影を施す。 組み換えＶＬＲ−Ｂを集結させて、ジスルフィド結合マルチマー複合体としたことを示す。図１０Ａは、ＶＬＲ４トランスフェクトＨＥＫ−２９３Ｔ細胞からの上清を、ＢｃｌＡ−ＣＴＤ接合セファロースビーズと共にインキュベートし、次いで洗浄し、指示の条件による溶出について調べた（ＴＥＡ＝トリエチルアミン、ＥｔＧｌｙｃｏｌ＝エチレングリコール）。ＶＬＲ４溶出は、抗ＶＬＲ−Ｂ ｍＡｂ（４Ｃ４）によるウェスタンブロッティングによって検出した。図１０Ｂは、大規模精製のために、安定なトランスフェクト細胞上清から、ＢｃｌＡ−ＣＴＤアフィニティー精製によってＶＬＲ４を精製し、トリエチルアミンｐＨ１１．５によって溶出した。精製ＶＬＲ４を、非還元性８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、Ｇｅｌｃｏｄｅ ｂｌｕｅ染色によって検出した。図１０Ｃは、５、６、７、８、１０、および１２％の未加工ポリアクリルアミドゲルにおける、精製組み換えＶＬＲ４、および高分子量タンパク質標準（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の相対的移動度を測定し、これを用いてＦｅｒｇｕｓｏｎプロットを構築し、マルチマーＶＬＲ４の分子量を推定した。図１０Ｄは、部分的還元条件下で、ＶＬＲ−４含有上清をウェスタンブロットすることによって、モノマー、ダイマー、およびオリゴマーを検出した。 図１１は、オリゴマー集結のためには、ＶＬＲ−ＢのシステインリッチＣ末端が必要であることを示す。図１１Ａは、ＶＬＲ４野生型（ＷＴ）およびＧＰＩ−ｓｔｏｐトランスフェクトＨＥＫ−２９３Ｔ細胞からの上清を、非還元性１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、抗ＶＬＲ ｍＡｂ（４Ｃ４）、次いで、ＨＲＰ接合ヤギ抗マウスポリクロナール抗体によってウェスタンブロットした。図１１Ｂは、ＶＬＲ４を、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞上清から精製し、還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、Ｇｅｌｃｏｄｅ ｂｌｕｅ染色し、メスを用いて切り出した。切り出したＶＬＲ４バンドは、イオドアセタミドによってアルキル化し、トリプシンで消化した。このトリプシン処理ペプチドを、ＲＰ−ＨＰＬＣによって分離し、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。質量スペクトラムにはＹ−イオンが示される。 図１１は、オリゴマー集結のためには、ＶＬＲ−ＢのシステインリッチＣ末端が必要であることを示す。図１１Ｃは、ＶＬＲ４ ＷＴおよびＧＰＩ−ｓｔｏｐ構築体の模式図である。ＭＳ／ＭＳによって特定された典型的ペプチドが、配列上の黒線によって示される（配列番号４０）。図１１Ｄは、オリゴマー集結のためには、ＶＬＲ−ＢのシステインリッチＣ末端が必要であることを示す。ＢｃｌＡ−１−ｉｓｌａｎｄ塗布プレートに対する、ＶＬＲ４ ＷＴおよびＧＰＩ−ｓｔｏｐの結合のＥＩＩＳＡ結果を示すグラフである。 図１２は、陥凹面における超可変アミノ酸の部位指向性突然変異誘発によるＶＬＲ５アビディティーの修飾を示す。図１２Ａは、高アビディティー抗ＢｃｌＡ−ＣＴＤ ＶＬＲ−Ｂ抗体（ｖＢＡ４１（配列番号４１）、ｖＢＡ１９１（配列番号４２）、およびＶＬＲ４（配列番号４３））、および、低アビディティー抗ＢｃｌＡ−ＣＴＤ ＶＬＲ−Ｂ抗体（ＶＬＲ５（配列番号４４））の複数配列整列である。超可変位置はボックスで囲まれ、高アビディティーＶＬＲ−Ｂ抗体によって利用される共通残基と異なる、ＶＬＲ５のアミノ酸は、陰影で示されるが、それらのアミノ酸が超可変位置に存在する場合、あるパターンを示す。超可変位置以外での配列差は、グレイの陰影で示される。 図１２は、陥凹面における超可変アミノ酸の部位指向性突然変異誘発によるＶＬＲ５アビディティーの修飾を示す。図１２Ｂは、ＶＬＲ５の陥凹面のモデルである。ＶＬＲ５によって利用されるアミノ酸・対・高アビディティー抗ＢｃｌＡ−ＣＴＤ ＶＬＲ−Ｂ抗体の共通配列における不一致は、陰影で示され、Ａと同じパターンを描く。例えば、図１２Ａの位置１３におけるＨ周辺のパターンは、図１２Ｂにおいて同じパターンで陰影で示される円に一致する。図１２Ａの位置３４におけるＹ周辺のパターンは、図１２Ｂにおいて同じパターンで陰影で示される円に一致する。図１２Ａの位置３７におけるＴ周辺のパターンは、図１２Ｂにおいて同じパターンで陰影で示される円に一致する。図１２Ａの位置８０におけるＱ周辺のパターンは、図１２Ｂにおいて同じパターンで陰影で示される円に一致する。図１２Ａの位置８２におけるＳ周辺のパターンは、図１２Ｂにおいて同じパターンで陰影で示される円に一致する。図１２Ａの位置１０６におけるＷ周辺のパターンは、図１２Ｂにおいて同じパターンで陰影で示される円に一致する。 図１２は、陥凹面における超可変アミノ酸の部位指向性突然変異誘発によるＶＬＲ５アビディティーの修飾を示す。図１２Ｃは、ＶＬＲ−Ｂ抗体の相対的アビディティーを、表面プラズモン共鳴（ＢｉａＣｏｒｅ ３０００）によって測定した。ＢｃｌＡ−１−ｉｓｌａｎｄを、Ｂｉａｃｏｒｅ ＣＭ５チップに共有的に接合し、次いで、タンパク質発現に関して正規化した、ＶＬＲトランスフェクト細胞上清をチップの上に流した。チップは、各結合サイクル後にトリエチルアミンｐＨ１１．５によって再生した。 抗Ｈ抗原モノクロナールＶＬＲ−Ｂ（ｖＲＢＣ−３６（配列番号２０））抗原結合部位のモデルである。このｖＲＢＣ−３６モデルは、ヌタウナギＶＬＲ−Ｂ（ＰＤＢ特定番号：２Ｏ６Ｒ）の結晶構造データに対し、ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬ（ｈｔｔｐ：／／ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／）を用いて相同性に基づくモデル作製によって構築した。超可変アミノ酸位置は、濃いグレイで強調した。矢印は、他の炭水化物成分からＨ抗原を識別する、フコース糖の接触面であると考えられる、陥凹面上の凹部を示す。 図１４は、ヒトのＯ血液型赤血球による免疫化後生産されるＶＬＲ−Ｂ抗体の分析を示す。図１４Ａは、漸増する、ヒトのＯ型赤血球によって免疫化される動物の血球凝集反応を示す。血液サンプルは、免疫化前、および免疫化の２８日後に取得した。免疫化は、１および１４日目に行った。 図１４は、ヒトのＯ血液型赤血球による免疫化後生産されるＶＬＲ−Ｂ抗体の分析を示す。図１４Ｂは、抗ＶＬＲ−Ｂモノクロナール抗体、またはコントロールモノクロナール抗体を塗布したビーズによる血漿吸着前、または後の、血球凝集反応力価を示す。誤差バーは、平均の標準誤差を示す。 図１４は、ヒトのＯ血液型赤血球による免疫化後生産されるＶＬＲ−Ｂ抗体の分析を示す。図１４Ｃは、免疫化ヤツメウナギ血漿対マウス抗Ｈモノクロナール抗体のＨ抗原活性を比較するフローサイトメトリー分析を示す。染色は、Ｈ抗原を発現する、α１，２−フコシルトランスフェラーゼＣＨＯ形質転換細胞において示される。非トランスフェクトＣＨＯ細胞では反応性は観察されなかった。 図１４は、ヒトのＯ血液型赤血球による免疫化後生産されるＶＬＲ−Ｂ抗体の分析を示す。図１４Ｄは、Ｈ抗原担持ＣＨＯ細胞による吸着によって、Ｈ抗原特異的ＶＬＲ抗体を枯渇すると、血漿から血球凝集反応が除去されることを示す。Ｈ抗原反応性ＶＬＲの枯渇は、ＶＬＲの血漿レベルにはほとんど影響を及ぼさない。 図１５は、Ｈ抗原に対する、組み換えＶＬＲ抗体の特異性を示す。図１５Ａは、Ｈ抗原を生産するようにα１，２−フコシルトランスフェラーゼによって、またはベクターのみによってトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を、抗−Ｈ ｍＡｂによって、または、Ｈ抗原に対して特異的なＶＬＲ−ＢによってトランスフェクトしたＨＥＫ ２９３Ｔ細胞から得られた上清によって染色した。灰色は、未染色細胞を表し、中が空虚な黒色は、ｍＡｂまたはＶＬＲ抗体によって染色される細胞を表す。図１５Ｂは、ジスルフィド結合を還元するための２−メルカプトエタノールによる処理前、または処理後の、ヤツメウナギ血漿のウェスタンブロットを示す。 図１６は、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ ｅｘｏｓｐｏｒｉｕｍによる免疫化に対するＶＬＲ抗体の反応を示す。免疫化ヤツメウナギ（黒色バー）および非免疫化ヤツメウナギ（白色バー）の血漿サンプルを、ＥＬＩＳＡによってアッセイした。図１６Ａは、抗原用量要求の評価を示す。１（◆）、０．１（■）、または０．０１（▲）μｇのＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ ｅｘｏｓｐｏｒｉｕｍによる、２回の腹腔内免疫化の前（ｘ）、および後における、ＢｃｌＡに対する、ＶＬＲ抗体の反応。ブースター免疫化は２週間後に与え、４週時に血漿サンプルを得た。図１６Ｂは、ＶＬＲ抗体反応が、胞子コートタンパク質ＢｃｌＡのＣ末端ドメイン（ＢｃｌＡ−ＣＴＤ）を指向することを示す。図１６Ｃは、ａｎｔｈｒａｃｉｓ ｅｘｏｓｐｏｒｉｕｍ（１μｇ）による２回の免疫化後の、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ胞子コートタンパク質ＢｃｌＡに対する、ＶＬＲ抗体の特異性を示す。誤差バーは、平均の標準誤差を示す。 図１７は、ＶＬＲ−Ｂ^＋リンパ球の組織分布を示す。図１７Ａは、種々の器官におけるＶＬＲ−Ｂ^＋リンパ球の免疫組織化学的分析を示す。パラフィン切片を、ヘマトキシリンエオジン（上段）、または、発色源としてＤＡＢを用いて抗ＶＬＲ ｍＡｂ（下段）で染色した。 図１７は、ＶＬＲ−Ｂ^＋リンパ球の組織分布を示す。図１７Ｂは、鰓領域の大血管（Ａの上段左パネルの鰓底部の大血管に対応）内のＶＬＲ−Ｂ^＋リンパ球の、免疫組織化学的特定を示す。 図１７は、ＶＬＲ−Ｂ^＋リンパ球の組織分布を示す。図１７Ｃは、血液、腎臓、および盲腸由来のリンパ球によるＶＬＲ発現の免疫蛍光分析を示す。ヒストグラムは、種々の組織から単離された「リンパ球ゲート」における細胞の分析を示す。 図１７は、ＶＬＲ−Ｂ^＋リンパ球の組織分布を示す。図１７Ｄは、血液サンプルの「リンパ球ゲート」から選別されたＶＬＲ−Ｂ^＋およびＶＬＲ−Ｂ⁻細胞の、透過型電子顕微鏡（ＥＭ）撮影：安静ＶＬＲ−Ｂ^＋リンパ球（上段）および、特徴的な核裂溝を有する血小板（下段）の顕微鏡写真を示す。 ＶＬＲ−Ｂ^＋およびＶＬＲ−Ｂ⁻リンパ球集団の遺伝子発現プロフィールを示す。「リンパ球ゲート」における細胞について、蛍光活性化細胞ソーティングによって単離したＶＬＲ−Ｂ^＋およびＶＬＲ−Ｂ⁻細胞の定量的ＰＣＲ分析。 図１９は、ａｎｔｈｒａｘ ｅｘｏｓｐｏｒｉｕｍによって超免疫化されたヤツメウナギにおける、ＶＬＲ−Ｂ^＋リンパ球のリンパ芽球様反応を示す。図１９Ａは、ゲート選択されない血液白血球・対・ＶＬＲ−Ｂ^＋細胞の、前方および側方光散乱特性のフローサイトメトリー分析を示す。超免疫原用量のＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ ｅｘｏｓｐｏｒｉｕｍ（＞２５μｇ）のブースター注入１４日後に、動物から血液サンプルを得た。図１９Ｂは、ＶＬＲ−Ｂの細胞表面発現を示す。ａｎｔｈｒａｘ ｅｘｏｓｐｏｒｉｕｍによる超免疫化後、ＶＬＲ−Ｂ発現レベルに低下が認められた。 図２０は、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ ｅｘｏｓｐｏｒｉｕｍによる免疫化の前後における、ＶＬＲ−Ｂ^＋細胞の頻度分析を示す。図２０Ａは、未処置および免疫化動物から得られた血液サンプルにおけるＶＬＲ−Ｂ^＋細胞であって、４Ｃ４抗ＶＬＲモノクロナール抗体および蛍光標識胞子によって共染色された細胞のフローサイトメトリー分析を示す。図２０Ｂは、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ ｅｘｏｓｐｏｒｉｕｍによる免疫化（２８日）前後における、炭疽菌胞子結合細胞のパーセントを示す。 図２１は、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ ｅｘｏｓｐｏｒｉｕｍによる免疫化によって誘発される、ＶＬＲ−Ｂ分泌細胞の特徴を示す。１μｇのｅｘｏｓｐｏｒｉｕｍによるブースター免疫の１４日後、１３ｃｍのヤツメウナギ幼生６匹から得た、プール細胞をソートした。図２１Ａは、異なる光散乱特性を持つ、ＶＬＲ−Ｂ^＋およびＶＬＲ−Ｂ⁻細胞集団における、ＶＬＲ−Ｂ抗体分泌細胞のＥＬＩＳＰＯＴアッセイを示す。ＢｃｌＡ ａｎｔｈｒａｘコートタンパク質に対して特異的なＶＬＲ−Ｂ抗体を分泌する細胞は、比較的大型のＶＬＲ−Ｂ担持細胞のサブ集団に認められた。図２１Ｂは、大型の、ＶＬＲ−Ｂ^＋生産細胞のＥＭ分析は、それらが、拡張型粗面小胞体を持つ、プラズマ細胞様形態を有することを示す。 非マイトジェン用量のａｎｔｈｒａｘ ｅｘｏｓｐｏｒｉｕｍによる注入後の、未処置および免疫化ヤツメウナギの比較。免疫化ヤツメウナギには、１μｇのａｎｔｈｒａｘ ｅｘｏｓｐｏｒｉｕｍを２度注入した。この用量の炭疽菌は、リンパ芽球様形質転換は誘発しないが、ＢｃｌＡ−ＣＴＤに対する特異的免疫反応は生成する。 インフルエンザウイルスによって免疫化されたヤツメウナギが、免疫原に対して特異的なＶＬＲを生産することを示す。１：５０希釈のヤツメウナギ血漿についてＥＬＩＳＡを実行した。 ＨＩＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ＨＩＶエンベロープタンパク質ｇｐ１２０サブユニットに対して特異的なＶＬＲ−Ｂ抗体を生産する。ＥＬＩＳＡプレートを、精製組み換えＨＩＶ ｇｐ１２０でコートし、一晩インキュベートし、次に、未処置ヤツメウナギ血漿、またはＨＩＶ ＶＬＰ免疫化ヤツメウナギ血漿とインキュベートした。Ｇｐ１２０結合ＶＬＲ−Ｂ抗体は、抗ＶＬＲ−Ｂ ｍＡｂ（４Ｃ４）、および、アルカリフォスファターゼ接合ヤギ抗マウスＩｇＧポリクロナール抗体によって検出した。

詳細な説明
無顎脊椎動物の適応免疫系は、クローン的に多様なリンパ球によって構成される。それらは、有顎脊椎動物によって利用される免疫グロブリンＶ、Ｄ、およびＪ遺伝子サブユニットではなく、ロイシンリッチ反復（ＬＲＲ）遺伝子セグメントの集合体から得られる可変性リンパ球受容体（ＶＬＲ）を発現するので、従来Ｖリンパ球と呼ばれている。無顎脊椎動物（ａｇｎａｔｈａｎｓ）の、既存の二つの代表種であるヤツメウナギおよびヌタウナギにおいて、二つのＶＬＲ遺伝子、ＶＬＲ−ＡおよびＶＬＲ−Ｂが特定されている。生殖系列ＶＬＲ遺伝子は、介在配列によって隔てられる、不変のＮ末端およびＣ末端配列に対するコード領域のみしか持たず、カノニカルスプライス部位を欠如するという点で不完全である。リンパ球系統細胞の発達の際、側接するＬＲＲモジュラーユニットが、この不完全ＶＬＲ遺伝子の中に継時的に挿入され、同時に、遺伝子変換機構を介して介在配列が削除されて、成熟ＶＬＲ遺伝子を生成する。この遺伝子変換過程は、最近特定された、活性誘発デアミナーゼ／アポリポタンパク質Ｂ編集触媒タンパク質（ＡＩＤ−ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーのメンバーで、リンパ球限定発現メンバーによって触媒される可能性がある。

ＶＬＲ−Ｂ＋リンパ球（ＶＢ細胞）は、ヤツメウナギ適応免疫系体液部門の主要成分を構成する。本明細書において記載するように、特定の抗原、例えば、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ ｅｘｏｓｐｏｒｉｕｍ、またはヒト赤血球によってヤツメウナギを免疫化すると、プラズマ細胞様細胞の分化、および、それらによる、抗原特異的ＶＬＲ−Ｂ抗体の分泌が誘発される。ストーク領域のほとんどを欠く、ヌタウナギＶＬＲ−Ｂの構造分析によって、超可変アミノ酸は、受容体の陥凹表面に集中し、ここに恐らく抗原結合部位を形成するのであろうとする、従来のモデル予想が確認された。分泌されるＶＬＲ−Ｂ抗体は、有顎脊椎動物の抗体と同様に機能し、そのため、抗原刺激は、エフェクター分子としてのＶＬＲ−Ｂの分泌を招き、これが抗原に結合し、恐らくは、中和、オプソニン作用、およびその他の機構によって、感染の排除を推進する。

モノクロナール抗体は、有顎脊椎動物の適応免疫系が持つ、いかなるものであれ、ほとんど全ての外来分子を認識可能とする、驚くべき能力を利用する、貴重な研究および治療ツールである。本明細書において記載するように、モノクロナール抗体と同様の特性を有する、既知の特異性の、可溶性ＶＬＲ−Ｂクローンを生成するために、無顎類適応免疫系の膨大な多様性レパートリーの利用が可能である。本明細書に記載されるのは、規定された抗原特異性の、可溶性、組み換えモノクロナールＶＬＲ−Ｂ抗体の生産法である。

本明細書において提供されるのは、抗原特異的ポリペプチドの、規模調節可能な作製法、より具体的には、可溶の、モノクロナールな、抗原特異的ポリペプチド、例えば、ＶＬＲの作製法である。さらに提供されるのは、特異的ＶＬＲ、多価ＶＬＲ、およびＶＬＲに対する抗体を含む組成物、および、該組成物を使用する方法である。

可溶性モノクロナール抗原特異的ポリペプチドの作製法は：（１）抗原特異的ポリペプチドであって、Ｎ末端ロイシンリッチリピート（ＬＲＲＮＴ）、一つ以上のロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）、Ｃ末端ロイシンリッチリピート（ＬＲＣＣＴ）、および、アルファヘリックスを含む連結ペプチドを含む、抗原特異的ポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを単離する工程；（２）培養媒体において該ｃＤＮＡクローンによって細胞をトランスフェクトする工程；および、（３）該培養媒体から該抗原特異的ポリペプチドを単離する工程、を含む。さらに具体的には、抗原特異的タンパク質の作製法は：（１）ヤツメウナギまたはヌタウナギに、標的抗原（例えば、標的炭水化物、標的タンパク質、標的病原体、標的糖タンパク質、標的脂質、標的糖脂質など）を投与すること；（２）該ヤツメウナギまたはヌタウナギのリンパ球から、抗原特異的タンパク質をコードするＲＮＡを単離すること；（３）該単離ＲＮＡから、抗原特異的タンパク質をコードするｃＤＮＡを増幅すること；（４）該ｃＤＮＡを発現ベクターにおいてクローンすること；（５）該発現ベクターによって形質転換された細菌において該発現ベクターを発現させること；（６）ｃＤＮＡクローンを単離すること；（７）該単離ｃＤＮＡクローンによって培養細胞をトランスフェクトすること；（８）標的抗原に結合する能力に関して培養上清をスクリーニングすること；および（９）該標的抗原に結合する上清から抗原特異的タンパク質を単離すること、を含む。抗原は、抗原特異的ＶＬＲを生産するのに十分な量として投与することが可能である。例えば、０．０１、０．１、１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、または１００μｇの抗原、または、０．０１と１００μｇ以上の間の任意の量の抗原を、ヤツメウナギまたはヌタウナギに投与することが可能である。

必要に応じて、単離ｃＤＮＡクローンは、可溶性ＶＬＲの形成を妨げる配列をコードしない。ＬＲＲＣＴ領域では、約５０％のＶＬＲクローンは：ＫＮＷＩＶＱＨＡＳＩＶＮ−（Ｐ／Ｌ）−Ｘ−（Ｓ／Ｙ／Ｎ／Ｈ）−ＧＧＶＤＮＶＫ（配列番号７）、またはＫＮＷＩＶＱＨＡＳＩＶＮ−（Ｐ／Ｌ）−ＸＸ−（Ｓ／Ｙ／Ｎ／Ｈ）−ＧＧＶＤＮＶＫ（配列番号８を含む。上記配列式において、（Ｐ／Ｌ）は、その位置に、Ｐか、Ｌのいずれかがあることを意味し、Ｘは、任意のアミノ酸を意味し、（Ｓ／Ｙ／Ｎ／Ｈ）は、その位置に、Ｓ、Ｙ、Ｎ、またはＨのいずれかがあることを意味する。これらの配列によって、分泌されるが、膜結合性であるＶＬＲが得られる。配列番号７または８を持たないＶＬＲは、単に膜結合性であるにすぎない。この配列を含む任意のｃＤＮＡクローンにおいて膜固定を阻止または抑制するために、当該技術分野において通常の錬度を有する当業者に公知の方法を用いて、配列番号７または８に突然変異を起こすことも可能である。さらに提供されるものは、本明細書に記載される方法によって作製される、可溶な、モノクロナールの、抗原特異的ポリペプチドである。したがって、可溶性ＶＬＲは、配列番号７または８を含むか、あるいは、配列番号７または８において、膜固定を抑制または阻止する突然変異を含む。可溶性ＶＬＲは、必要に応じて、膜貫通ドメイン、ＧＰＩアンカー、疎水性尾部、ストーク領域、または、これらの領域の任意の組み合わせを欠如する。

可変性リンパ球受容体、すなわちＶＬＲは、ある構造的特徴および機能を有する、抗原特異的ポリペプチドである。ＶＬＲは、１−１２個のロイシンリッチリピートを含み、適応免疫において機能することが示されている。より詳細には、ＶＬＲは、Ｎ末端ロイシンリッチリピート（ＬＲＲＮＴ）、一つ以上のロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）（本明細書では内部ＬＲＲと呼ぶ）、Ｃ末端ロイシンリッチリピート（ＬＲＲＣＴ）、および、アルファヘリックスを含む連結ペプチドを含む。ＶＬＲの長さは、僅かに約１３０アミノ酸を含むこともあるし、あるいは、約２２５個ものアミノ酸を含むこともある。このポリペプチド、およびコード核酸の一般構造および特定配列の例が、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１７９号；Ｐａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｃｏｏｐｅｒ（２００６）Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２４：４９７−５１８，Ａｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ（２００５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１０：１８９２−９３；Ｐａｎｃｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．１０２（９２２４−２９）に記載される。なお、これらの文書それぞれについて、その中に教示されるＶＬＲ、およびＶＬＲの使用法に関して、その全体を参照することにより本明細書に含める。さらに、各種領域（シグナルペプチド、ＬＲＲＮＴ、ＬＲＲ、ＬＲＲＣＴ、連結ペプチド、ストーク、および疎水性尾部を含む）の数多くの例が、これらの参考文献の中に見出すことが可能であり、これらの参考文献も、ＶＬＲ領域に関する参照によって同様に本明細書に含める。

必要に応じ、ＶＬＲの連結ペプチドは、ＬＲＲＣＴのＮ末端側に、より具体的には、内部ＬＲＲとＬＲＲＣＴとの間に配される。したがって、本明細書において開示されるのは、ＬＲＲＮＴ、一つ以上の内部ＬＲＲ、連結ペプチド、およびＬＲＲＣＴを、この順に含むＶＬＲである。さらに開示されるのは、ＶＬＲであって、ＬＲＲＮＴとＬＲＲＣＴの間の内部ＬＲＲ領域が、１、２、３、４、５、６、７、８、または９個のロイシンリッチリピートを含み、ＬＲＲ１が、ＬＲＲＮＴに隣接、または近接して配されるＶＬＲである。本明細書で用いるＬＲＲ１、２、３、４、５、６、７、８、または９は、ＬＲＲＮＴからＬＬＲＣＴに向かって連続的に連なると考えられる。したがって、本明細書に開示されるのは、ＬＲＲＮＴ、１、１−２、１−３、１−４、１−５、１−６、１−７、１−８、または１−９ＬＲＲ、連結ペプチド、およびＬＲＲＣＴをこの順に含むＶＬＲである。

ロイシンリッチリピート、すなわちＬＲＲは、通常、タンパク質−タンパク質相互作用に与る、複数のロイシン残基を含む、短い配列モチーフである。ＬＲＲは、例えば、位置２、５、７、１２、１６、２１、および２４に、ロイシン、またはその他の脂肪族残基を含む。しかしながら、ロイシンまたは他の脂肪族残基は、位置２、５、７、１２、１６、２１、および２４の残基に加えて、または、それらの残基の代わりに、他の位置においても出現することが可能であることが理解され、かつ、本発明の考慮の対象とされる。例えば、ロイシンは、位置２ではなく、位置３に出現することが可能である。さらに、構造的に、ＬＲＲモチーフは、β−シート構造を形成することが理解される。したがって、例えば、ＬＲＲＮＴ、５個の別々のＬＲＲ、ＬＲＲＣＴ、および連結ペプチドを含む開示のポリペプチドは、７個のβシート構造、および、連結ペプチドのアルファヘリックスを含むと考えられる。

各内部ＬＲＲの長さおよび配列は、そのＶＬＲにおける他の内部ＬＲＲから変動することが可能であると同時に、ＬＲＲＮＴおよびＬＲＲＣＴからも変動することが可能である。例えば、ＶＬＲは、ＬＲＲＮＴ、１から９個のＬＲＲ、連結ペプチド、およびＬＲＲＣＴを含み、その際、第１内部ＬＲＲはＬＲＲ１であり、ＬＲＲ１が、約２０よりも少ないアミノ酸を含むことが可能である。さらに開示されるのは、ＬＲＲ１が約１８個のアミノ酸を含むＶＬＲである。必要に応じて、ＶＬＲはさらに、ＬＲＲ２から９のそれぞれが約２５よりも少ないアミノ酸長であるＬＲＲ２から９を含む。さらに開示されるのは、ＬＲＲ２から９のそれぞれが約２４アミノ酸を含むＶＬＲである。ＬＲＲ１から９は、任意のＶＬＲにおいて、長さおよび特定のアミノ酸配列において同じであっても、異なっていてもよい。

ＬＲＲＮＴおよびＬＲＲＣＴと表示される末端ＬＲＲは、通常、各内部ＬＲＲよりも長い。ＬＲＲＮＴおよびＬＲＲＣＴは、不変領域（同様の可変性リンパ球受容体に比べ、該ポリペプチドの残余部分に対しほとんど変動を持たない領域）を含む。可変領域は、受容体に特異性を付与するが、不変領域、および、受容体全体に共通の構造的類似性は、保護的免疫機能の維持を助ける。ＶＬＲは、約４０未満のアミノ酸を含むＬＲＲＮＴを含むことが可能である。したがって、ＬＲＲＮＴは、必要に応じて、一つ以上の、保存的アミノ酸置換の存在下または不在下に、アミノ酸配列ＣＰＳＱＣＳＣ（配列番号９）、ＣＰＳＲＣＳＣ（配列番号１０）、ＣＰＡＱＣＳＣ（配列番号１１）、ＣＰＳＱＣＬＣ（配列番号１２）、ＣＰＳＱＣＰＣ（配列番号１３）、ＮＧＡＴＣＫＫ（配列番号１４）、またはＮＥＡＬＣＫＫ（配列番号１５）を含むＬＲＲＮＴを含むことが可能である。

さらに開示されるのは、ＬＲＲＣＴであって、長さが、約６０未満のアミノ酸、必要に応じて４０から６０個のアミノ酸であるＬＲＲＣＴを含むＶＬＲである。特に、具体的に開示されるのは、ＶＬＲであって、そのＬＲＲＣＴが、一つ以上の、保存的アミノ酸置換の存在下または不在下に、アミノ酸配列ＴＮＴＰＶＲＡＶＴＥＡＳＴＳＰＳＫＣＰ（配列番号１６）、ＳＧＫＰＶＲＳＩＩＣＰ（配列番号１７）、ＳＳＫＡＶＬＤＶＴＥＥＥＡＡＥＤＣＶ（配列番号１８）、または、ＱＳＫＡＶＬＥＩＴＥＫＤＡＡＳＤＣＶ（配列番号１９）を含むＶＬＲである。

通常、ＶＬＲの連結ペプチドは、１５未満のアミノ酸長の短いペプチドで、アルファヘリックスを含む。したがって、例えば、具体的に開示されるのは、アルファヘリックスを含む、１０、１１、１２、１３、１４、および１５アミノ酸長の連結ペプチドである。連結ペプチドは、ＶＬＲの構造成分を、それ自身を含めてＬＲＲＣＴに連結する働きをする。

本明細書に記載するＶＬＲは、ちょうど抗体が、抗原または介在因子に選択的に結合するのと同様に、抗原または介在因子に選択的に結合する。選択的に結合する、または特異的に結合するとは、ＶＬＲが、他の抗原または介在因子を、部分的にまたは完全に排除して、一介在因子または抗原に結合することを意味する。結合するとは、アッセイ法の背景の、少なくとも約１．５倍の、検出可能な結合を意味する。選択的または特異的結合においては、このような検出可能な結合が、任意の抗原または介在因子に対しては検出可能であるが、コントロール抗原または介在因子に対しては検出されない。

ＶＬＲは、天然性であってもよいし、非天然性であってもよい。ＶＬＲの断片または変異体であって、抗原または介在因子に選択的に結合するＶＬＲの能力を保持する、断片または変異体が下記に記載される。したがって、ＶＬＲは、抗体という用語同様、種々の特異性を有する、種々の改変体を含む。ＶＬＲは、本明細書に記載されるインビトロアッセイ、または類似の方法を用いて所望の活性に関して試験され、その後、その治療、診断、または他の精製活性が、公知の試験法にしたがって試験される。例えば、活性および／または特異性を試験するために、ＥＬＩＳＡ、ドットブロット、ウェスタンブロット分析、およびその他の試験法を使用することが可能である。ＶＬＲは、ＶＬＲを直接標識することによって検出してもよいし、あるいは、二次抗体と同様、ＶＬＲに結合する二次ＶＬＲ、またはＶＬＲに結合する抗体を用いて検出してもよい。その際、該抗体または二次ＶＬＲは、直接的または間接的に標識される。ＶＬＲに対する抗体および標識は、下記にさらに詳細に記述される。

本明細書において提供されるものは、複数の抗原特異的ポリペプチドを含む多価タンパク質、例えば、複数のＶＬＲであって、各抗原特異的ポリペプチドが、Ｎ末端ロイシンリッチリピート（ＬＲＲＮＴ）、一つ以上のロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）、Ｃ末端ロイシンリッチリピート（ＬＲＣＣＴ）、および連結ペプチドを含み、連結ペプチドがアルファヘリックスを含む、ＶＬＲである。本明細書で用いるＬＲＲ−１という用語は、ＬＲＲＮＴに続く第１ＬＲＲを指す。本明細書で用いるＬＲＲＶという用語は、ＬＲＲ可変体、すなわち、ＬＲＲ−１の後に続くが、ＬＲＲＣＴの前に来るＬＲＲを指す。本明細書で用いる場合、ＬＲＲＶ_ｅという用語は、ＬＲＲＣＴの前に来る最後のＬＲＲである、ＬＲＲ可変体末端を指す。しかしながら、ＶＬＲが、ＬＲＲＮＴ、１ＬＲＲ、およびＬＲＲＣＴを含む場合。ＬＲＲＮＴおよびＬＲＲＣＴの間のＬＲＲは、ＬＲＲ−１と表示される。図１に多価ＶＬＲの模式図を示す。この多価タンパク質は、２から１２（すなわち、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２）個の抗原特異的ポリペプチドを含む。この多価タンパク質は、標的タンパク質、標的炭水化物、標的糖タンパク質、標的プロテオグリカン、または標的病原体に結合する。多価タンパク質は、必要に応じて、各種の標的タンパク質、炭水化物、糖タンパク質、プロテオグリカン、病原体、または、それらの任意の組み合わせに結合するように設計される。例えば、二価タンパク質は、第１および第２抗原特異的ポリペプチドを含んでもよく、その際、第１抗原特異的ポリペプチドは、第１タンパク質、炭水化物、糖タンパク質、プロテオグリカン、または病原体に結合し、第２抗原特異的ポリペプチドは、第２タンパク質、炭水化物、糖タンパク質、プロテオグリカン、または病原体に結合する。同様に、三価タンパク質は、それぞれが異なる標的に結合する、第１、第２、および第３抗原特異的ポリペプチドを含み、四価タンパク質は、それぞれが異なる標的に結合する、第１、第２、第３、および第４抗原特異的ポリペプチドを含む。一例として、ある二価タンパク質は、Ｈ血液型決定基に結合する、第１抗原特異的ポリペプチド、および、ＡまたはＢ型決定基に結合する、第２抗原特異的ポリペプチドを含む。この多価タンパク質および／または抗原特異的ポリペプチドは、可溶性であることが好ましい。

さらに本明細書に提供されるのは、標的炭水化物、例えば、血液型決定基などに結合する抗原特異的ポリペプチドである。血液型決定基としては、例えば、Ａ決定基、Ｂ決定基、またはＨ決定基が挙げられる。例として、Ｈ決定基に特異的に結合する抗原特異的ポリペプチドが提供される。さらに別の例として、Ｈ決定基に特異的に結合する抗原特異的ポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。本明細書に提供されるのは、例えば、配列番号３２を含む、配列番号２０の抗原特異的ポリペプチドをコードすることが可能な核酸である。他の例として、一つ以上の、保存的アミノ酸置換を有する、配列番号２０をコードする核酸が挙げられる。

炭水化物に結合する抗原特異的ポリペプチドは、標的炭水化物の特定、定量、単離、および画像化において多くの用途を有する。例として、本明細書で提供されるものは、血液型を決定する方法であって、ある血液型決定基に選択的に結合する抗原特異的ポリペプチドに血液サンプルを接触させることを含み、該抗原特異的ポリペプチドが、検出可能に（直接的、または間接的に）標識される方法である。血液サンプルにおいて一つ以上の細胞に結合した、この、標識抗原特異的ポリペプチドは検出される。標識の有無は、血液型を示す。したがって、例えば、Ｈ決定基に結合する、抗原特異的ポリペプチドを用いた場合、血液サンプルにおける標識の存在は、Ｏ血液型を示す。同様に、Ａ決定基特異的ポリペプチドを用いた場合、標識の存在は、ＡまたはＡＢ血液型のいずれかを示す。Ｂ決定基特異的ポリペプチドを用いた場合、標識の存在は、ＢまたはＡＢ血液型のいずれかを示す。同じ血液サンプルについて、一つ以上の抗原特異的ポリペプチドを使用することが可能である。必要に応じて、抗原特異的ポリペプチドが異なる特異性を有する場合、各抗原特異的ポリペプチドに異なる標識を付着させることが可能である。したがって、Ｈ決定基に選択的に結合するＶＬＲに対して、あるＦＩＴＣ標識を、直接または間接に連結し、一方、ＡまたはＢ決定基に選択的に結合するＶＬＲに対し、異なる波長で蛍光を発する蛍光標識を直接または間接に連結することが可能である。

したがって、本明細書に提供されるものは、血液型を決定する方法であって：第１抗原特異的ポリペプチドであって、検出可能に第１標識によって標識され、かつ、第１血液決定基に対して特異的である、第１抗原特異的ポリペプチドに血液サンプルを接触させること；第２抗原特異的ポリペプチドであって、検出可能に第２標識によって標識され、かつ、第２血液決定基に対して特異的である、第２抗原特異的ポリペプチドに該血液サンプルを接触させること；および、該血液サンプル中の一つ以上の細胞に結合した、標識された第１および第２抗原特異的ポリペプチドを検出することを含み、第１および第２標識の有無が血液型を示す方法である。

さらに開示されるのは、介在因子、例えば、病原性因子であって、細菌、より詳細には、細菌がＢａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓである、病原体に選択的に結合するＶＬＲである。より詳細には、本明細書に提供されるのは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓの細胞表面ポリペプチド、例えば、ＢｃｌＡに特異的に結合する、抗原特異的ポリペプチドである。さらに詳細には、この抗原結合ポリペプチドは、配列番号５（図７参照）、または配列番号２２、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、または６１のアミノ酸配列を有する。さらに提供されるのは、例えば、それぞれ、配列番号２１、２３、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、および６０を含む、配列番号５、２２、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、または、６１をコードする核酸である。

病原体に対して選択的な、抗原結合ポリペプチドの使用法が、数多く提供される。病原体としては、任意の既知の病原体、例えば、細菌およびウイルスなどが挙げられる。例として、本明細書において提供されるのは、サンプルにおけるＢａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓの存在を検出する方法であって、該サンプルを、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓに結合する、検出可能に標識される、抗原特異的ポリペプチドに接触させることを含む方法である。サンプルに結合する、標識された、抗原特異的ポリペプチドは検出され、標識の存在は、サンプルにおけるＢａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓの存在を示す。さらに提供されるのは、対象においてＢａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓの病原性を低減する方法であって、該対象に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓに結合する抗原特異的ポリペプチドを投与することを含む方法である。

さらに、本明細書に提供されるのは、サンプルにおけるウイルスの存在を検出する方法であって、該サンプルを、該ウイルスに結合する、検出可能に標識される、抗原特異的ポリペプチドに接触させることを含む方法である。サンプルに結合する、標識された、抗原特異的ポリペプチドは検出され、標識の存在は、サンプルにおけるウイルスの存在を示す。さらに提供されるのは、対象においてウイルスの病原性を低減する方法であって、該対象に、ウイルスに結合する抗原特異的ポリペプチドを投与することを含む方法である。このウイルスは、例えば、ＨＩＶまたはインフルエンザであってもよい。この抗原特異的ポリペプチドは、例えば、ＨＩＶエンベロープタンパク質ｇｐ１２０に結合してもよい。

さらに、対象のサンプル、または他の生物学的液体（例えば、脳脊髄液）から病原体を除去する方法が提供される。この方法は、該サンプルを、該病原体に選択的に結合する、抗原特異的ポリペプチドに接触させることを含む。さらに提供されるのは、対象の血液における病原体の量を減少させる方法であって、該対象の血液の一部を、該病原体に選択的に結合する、抗原特異的ポリペプチドに接触させることを含む。必要に応じて、接触される血液は、取り出され、次いで、該対象に戻される。必要に応じて、抗原は、固相支持体に結合される。

さらに本明細書において提供されるのは、選ばれた抗原特異性を有する抗原特異的タンパク質、およびこれらの方法において有用な組成物を作製する方法であって、ヤツメウナギまたはヌタウナギに、一つ以上の標的抗原（例えば、標的炭水化物、標的タンパク質、標的病原体、標的糖タンパク質、標的脂質、標的糖脂質、標的細胞、および、それらの組み合わせ、例えば、二つの炭水化物、一つの炭水化物と一つのタンパク質など）を投与することを含む方法である。例として、本明細書に提供されるのは、血液型決定基に結合する、抗原特異的タンパク質を作製する方法であって、ヤツメウナギまたはヌタウナギに、血液型決定基を投与すること；該ヤツメウナギまたはヌタウナギのリンパ球から抗原特異的タンパク質をコードするＲＮＡを単離すること；単離ＲＮＡから、抗原特異的タンパク質をコードするｃＤＮＡを増幅すること；該ｃＤＮＡを発現ベクターにクローンすること；該発現ベクターによって形質転換した細菌において該発現ベクターを発現させること；ｃＤＮＡクローンを単離すること；該ｃＤＮＡクローンによって培養細胞をトランスフェクトすること；該血液型決定基に対する結合能力に関して培養上清をスクリーニングすること；および、培養上清から、該血液型決定基に結合する抗原特異的タンパク質を単離すること、を含む方法である。それとは別に、抗原特異的タンパク質を生成するために、赤血球そのもの、例えば、ヒトのＯ型赤血球を、ヤツメウナギまたはヌタウナギに投与してもよい。

もう一つの例として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓなどの病原体に特異的に結合するＶＬＲは、ヤツメウナギまたはヌタウナギに、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓの細胞表面ポリペプチドを投与すること；該ヤツメウナギまたはヌタウナギのリンパ球から、抗原特異的タンパク質をコードするＲＮＡを単離すること；単離ＲＮＡから、抗原特異的タンパク質をコードするｃＤＮＡを増幅すること；該ｃＤＮＡを発現ベクターにクローンすること；該発現ベクターによって形質転換した細菌において該発現ベクターを発現させること；ｃＤＮＡクローンを単離すること；該ｃＤＮＡクローンによって培養細胞をトランスフェクトすること；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓの該細胞表面ポリペプチドに対する結合能力に関して培養上清をスクリーニングすること；および、培養上清から、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓの該細胞表面ポリペプチドに結合する抗原特異的タンパク質を単離すること、によって作製することが可能である。それとは別に、抗原特異的タンパク質を生成するために、病原体そのもの、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓを、ヤツメウナギまたはヌタウナギに投与してもよい。

病原体、例えば、ＨＩＶまたはインフルエンザなどのウイルスに特異的に結合するＶＬＲは、ヤツメウナギまたはヌタウナギに、ウイルス抗原を投与すること；該ヤツメウナギまたはヌタウナギのリンパ球から、抗原特異的タンパク質をコードするＲＮＡを単離すること；単離ＲＮＡから、抗原特異的タンパク質をコードするｃＤＮＡを増幅すること；該ｃＤＮＡを発現ベクターにクローンすること；該発現ベクターによって形質転換した細菌において該発現ベクターを発現させること；ｃＤＮＡクローンを単離すること；該ｃＤＮＡクローンによって培養細胞をトランスフェクトすること；抗原結合能力に関して培養上清をスクリーニングすること；および、培養上清から、抗原に結合する抗原特異的タンパク質を単離すること、によって作製することが可能である。本発明で用いるウイルス抗原は、ウイルス、ウイルス様粒子、ウイルス断片、ウイルスによって発現されるポリペプチド、または、ヤツメウナギまたはヌタウナギにおいて抗原性反応を誘発する、ウイルスの、他の、任意の部分または成分を含む。

抗原特異的ポリペプチド、および、その断片および変異体を作製する方法は、該抗原特異的ポリペプチド、またはその断片または変異体をコードする核酸を発現する安定な細胞系統を作製することを含む。安定な細胞系統は、種々の方法で生産することが可能である。例えば、安定な細胞系統は、ＶＬＲ ｃＤＮＡ、および、選択可能マーカー、例えば、抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子を同時発現する、発現ベクターによって細胞をトランスフェクトすることによって生産することが可能である。抗生物質選択の場合、発現ベクターをそのゲノムの中に安定に組み込んだ細胞は、抗生物質選択に対し耐性を示し、生き延びるが、一方、他の細胞は、抗生物質処理によって死滅する。限界希釈クローニングなどの方法によって最高レベルのＶＬＲ分泌を示す細胞について、サブクローンを確立してもよい。このようにして、本明細書に提供されるのは、抗原特異的ポリペプチドを作製する方法であって、安定細胞系統の細胞を、該細胞が、抗原特異的ポリペプチドを発現することを可能とする条件下で培養すること、および、該細胞または培養媒体から、抗原特異的ポリペプチドを単離すること、によって作製する方法である。

さらに、ＶＬＲ生産リンパ球の単離集団も提供される。本明細書で用いる場合、ＶＬＲ生産リンパ球、ＶＬＲ細胞、およびＶＬＲリンパ球は、同義語として使用される。例えば、ＶＬＲ−Ｂ＋リンパ球の単離集団が提供される。下記の実施例において論じられるように、ＶＬＲ−Ｂ＋リンパ球は、ＶＬＲ−Ｂ転写物を発現するが、ＶＬＲ−Ａ転写物は発現しない。必要に応じて、ＶＬＲ−Ｂ＋リンパ球は、ＴＣＲ−様、ＣＤ−４様、および／またはＴＮＦＲ１４を発現する。ＶＬＲ−Ａ＋細胞は、ＶＬＲ−Ａ転写物を発現するが、ＶＬＲ−Ｂ転写物は発現しない。必要に応じて、ＶＬＲ−Ａ＋細胞の単離集団は、ＣＤ４５および／またはＧＡＴＡを発現する。単離細胞集団は、例えば、フローサイトメトリー、または、ＶＬＲ−ＢまたはＶＬＲ−Ａ特異的抗体使用による、通例の実験手法を用いて取得することが可能である。さらに、抗原特異的ＶＬＲ−Ｂ＋細胞の単離集団が提供される。本明細書で用いる場合、用語、抗原特異的ＶＬＲ−Ｂ＋細胞とは、抗原特異的ポリペプチドを発現する細胞を指す。このような細胞は、例えば、抗原によってヤツメウナギまたはヌタウナギを免疫化すること、および、フローサイトメトリー、または、ＶＬＲ−Ｂ抗体、例えば、本明細書において提供されるもの、例えば、４Ｃ４または６Ｃ３を用いて、ＶＬＲ−Ｂ＋細胞を単離することによって生産することが可能である。ＶＬＲ−Ａ＋細胞も同様にして単離することが可能である。

本明細書に提供されるのは、抗原特異的タンパク質をコードする核酸（例えば、単離核酸、例えば、ＲＮＡおよびＤＮＡなど）である。ＶＬＲまたはその領域、および開示ＶＬＲの変異体および断片をコードすることが可能な核酸が、本明細書には開示される。ＶＬＲをコードすることが可能な核酸としては、例えば、ただしこれらに限定されないが、配列番号２１、２３、４５、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、および３２が挙げられる。ＬＲＲＮＴをコードすることが可能な核酸としては：

が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。ＬＲＲＣＴをコードすることが可能な核酸としては、配列番号２９

が挙げられるが、ただしこれに限定されない。核酸の例は、特異的ポリペプチド配列、およびその変異体および誘導体に関連する、全ての縮重配列を含む。本明細書において提供される核酸は、コード配列の相補体を含む。配列番号５、６、２０、２２、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１の内のいずれか一つ、または、その任意の特定領域、例えば、ＬＲＲＮＴ（例えば、配列番号９−１５をコードする核酸）、ＬＲＲ、ＬＲＣＣＴ（例えば、配列番号１６−１９をコードする核酸）、または連結ペプチドをコードする核酸が提供される。より具体的には、本明細書に提供されるのは、配列番号２１、２３、４５、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、および３２、またはその縮重変異体または相補体を含む核酸である。

さらに提供されるものは、高度に厳格な条件下で、配列番号２１、２３、４５、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、または３２、または、配列番号２１、２３、４５、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、および３２の相補体、の全てまたは任意の一部にハイブリダイズする配列を含む単離核酸である。このハイブリダイズ核酸のハイブリダイズ部分は、通常、少なくとも１５（例えば、２０、２０、４０以上）ヌクレオチド長である。ハイブリダイズ部分は、それがハイブリダイズする配列の一部に対し、少なくとも８０％（例えば、９０％、または９５％）同一である。ハイブリダイズ核酸は、例えば、クローニングベクター、プライマー（例えば、ＰＣＲプライマー）、または診断プローブとして有用である。核酸の２本鎖またはハイブリッドの安定性は、プローブが標的ＤＮＡから解離する温度である、融解温度すなわちＴｍとして表される。必要な厳格度条件を定義するために、この融解温度が使用される。プローブと同一ではなく、プローブと関連し、事実上同一な配列を特定しなければならない場合、ある特定の塩濃度において（例えば、ＳＳＣ、またはＳＳＰＥ）相同的ハイブリダイゼーションのみが起こる最低温度を先ず定めることが有用である。１％のミスマッチが、Ｔｍにおいて１℃の低下をもたらすと仮定すると、ハイブリダイゼーション反応の最終洗浄液の温度もそれに応じて下げる（例えば、９５％を超える同一性を有する配列を求める場合、最終洗浄温度は、５℃下げる）。実際には、Ｔｍの変化は、１％のミスマッチ当たり０．５と１．５℃の間であってよい。高度に厳格な条件は、５Ｘ ＳＳＣ／５Ｘデンハルト液／１．０％ ＳＤＳにおいて６８℃でハイブリダイズし、０．２Ｘ ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳにおいて室温で洗浄することを含む。中等度に厳格な条件は、３Ｘ ＳＳＣにおいて４２℃で洗浄することを含む。プローブと標的核酸の間に最適レベルの同一性を実現するために、塩濃度および温度を変動させることが可能である。この条件に関する、さらに詳細な案内知識は、当該分野において、例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，”Ｔｈｅ Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，２００１において簡単に入手することが可能である。

さらに提供されるのは、本明細書に教示される核酸に対し、８０−９９％の同一性（すなわち、８０、８１、８２、．．．９９％）を有する核酸である。同一性パーセントを決定する方法は、当該技術分野で公知であり、アミノ酸と関連して後述される。

開示されるものは、ＶＬＲ遺伝子、または相当遺伝子と相互作用を持つことが可能なプライマーおよびプローブを含む組成物である。ある実施態様では、プライマーは、ＤＮＡ増幅反応を支持するために用いられる。通常、プライマーは、配列特異的に伸長することが可能である。配列特異的なプライマーの伸長は、該プライマーがハイブリダイズするか、または他のやり方で会合する核酸分子の配列および／または組成が、該プライマーの伸長によって生産される産物の組成または配列を指令するか、または該組成または配列に影響を及ぼす、任意の方法を含む。したがって、配列特異的なプライマーの伸長としては、例えば、ただしこれらに限定されないが、ＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡ伸長、ＤＮＡ重合、ＲＮＡ転写、または逆転写が挙げられる。配列特異的にプライマーを増幅する技術および条件が好ましい。ある実施態様では、プライマーは、ＤＮＡ増幅反応、例えば、ＰＣＲ、または直接的配列決定のために使用される。ある実施態様では、プライマーはさらに、非酵素技術を用いて伸長させることも可能であること、その場合例えば、プライマーを伸長させるために使用されるヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、化学的に反応して配列特異的にプライマーを伸長させるように修飾されることが理解される。本明細書において教示されるプライマーの例としては、例えば、ただしこれらに限定されないが、１）

および２）

が挙げられる。このようなプライマーはさらに、前述のハイブリダイゼーションプローブとして使用することが可能である。好ましくは、最適翻訳のために、第１プライマーは、開始コドンに先行する共通Ｋｏｚａｋ配列を含む。さらに、ＰＣＲ産物が、平滑末端制限酵素部位にクローン可能となるように、５’リン酸化されることが好ましい。第２プライマーは、制限酵素部位を所有することが好ましい。次に、得られたＰＣＲ産物を、制限酵素によって消化し、発現ベクターにクローンすることが可能となる。第２プライマーにおける制限酵素部位は、ＮｈｅＩ制限部位であることが好ましい。なぜなら、これらの部位は、これまで特徴解明されたＶＬＲのいずれにも見出されていないからである。

さらに提供されるのは、ＶＬＲ、またはその断片または変異体をコードする核酸を含む発現ベクターである。必要に応じて、これらの発現ベクターはさらに、ＶＬＲ、またはその断片または変異体をコードする核酸に動作可能的に連結される発現調節配列を含む。したがって、提供されるのは、抗原特異的ポリペプチドをコードする核酸（例えば、配列番号５または２２をコードする核酸）を含むベクターである。さらに提供されるのは、発現ベクターを含む培養細胞である。例えば、本明細書において提供されるのは、ベクターによってトランフェクトされた培養細胞、または、抗原特異的ポリペプチド、またはその断片または変異体を発現する、該細胞の子孫である。好適な発現ベクターとしては、例えば、ただしこれらに限定されないが、ｐＬＰＣＸおよびｐＩＲＥＳ−ＰＵＲＯ２（共に、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡから販売される）が挙げられる。例えば、発現ベクターは、ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ（ＩＲＥＳ）配列を利用することによって、同じ転写物から、ＶＬＲコード核酸と抗生物質耐性遺伝子の両方を含むことが可能である。これによって、安定細胞系統の効率的選択が可能となる。

本明細書に記載されるＶＬＲで、本明細書に記載される方法によって作製されるＶＬＲは、所望の機能が改善されるか、または維持される限り、修飾および変更することが可能である。必要に応じて、ＶＬＲの陥凹表面に配されるアミノ酸が修飾される。例えば、アビディティーを上げるために、部位特異的突然変異誘発またはアフィニティー熟成によって、ＶＬＲ５（配列番号６）を修飾することが可能である。アビディティーを向上させたＶＬＲ５の変異体が提供される。上昇アビディティーを伴うＶＬＲ５の変異体としては、例えば、ＶＬＲ５^Ｙ５５Ｒ、ＶＬＲ５^{Ｗ１２７Ｙ}、およびＶＬＲ５^{Ｙ５５Ｒ／Ｗ１２７Ｙ}が挙げられる。他のＶＬＲも、本明細書に提供される方法を用いて同様に修飾することが可能である。複数の変異体を作成し、スクリーニングする方法としては、例えば、ファージ、酵母、細菌、またはリボソームディスプレイ技術によるインビトロアフィニティー突然変異誘発が挙げられる。

本明細書に開示される遺伝子およびポリペプチドの、任意の既知の変異体および誘導体、または、それらから生じる可能性のある変異体および誘導体を定義する一つの方法は、既知の指定の配列に対する同一性に関して、それらの変異体および誘導体を定義することによることが理解される。例えば、特異的に開示されるものは、指定配列に対し、少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９パーセントの同一性を有するＶＬＲ変異体である。当業者であれば、二つのタンパク質、または遺伝子などの核酸の同一性パーセントの決定法は簡単に理解するであろう。例えば、同一性が最高レベルとなるように二つの配列を整列した後、その同一性を計算することが可能である。

同一性パーセントを計算する、もう一つの方法は、公刊アルゴリスムによって実行することが可能である。比較のための配列同士の最適整列は、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所相同性アルゴリスム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．ＭｏＬ Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同整列アルゴリスム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４の類似性探索法、これらのアルゴリスムのコンピュータ実装（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ実装）、または、目視によって実行してもよい。

核酸については、同じタイプの同一性パーセントは、例えば、Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：４８−５２，１９８９，Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：７７０６−７７１０，１９８９、Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１−３０６，１９８９に開示されるアルゴリスムによって取得することが可能である。なお、これらの文献を、少なくとも核酸整列および同一性パーセントの計算に関連する資料について、引用により本明細書に含める。上記方法のいずれも通常に使用することが可能であり、かつ、ある場合には、これら、各種の方法の結果が異なる場合があったにしても、これらの方法の少なくとも一つにおいて、同一性が見出された場合、それらの配列は、指定の同一性または類似性を有すると言ってもよいと考えられることが理解される。

例えば、本明細書では、他の配列に対しある特定の同一性パーセントを有すると言及される配列は、前述の計算法の内の、任意の一つ以上の計算によって、言及された同一性を有する配列同士を指す。例えば、第１配列が、第２配列に対し、Ｚｕｋｅｒ計算法を用いて８０パーセントの同一性を有すると計算された場合、仮令、該第１配列が、他の計算法のいずれかによって計算した場合、第２配列に対し８０パーセントの同一性を持たなくとも、該第１配列は、第２配列に対し、本明細書における定義にしたがって８０パーセントの同一性を有する。

ＶＬＲ変異体および誘導体は、アミノ酸配列修飾体を含んでもよい。例えば、アミノ酸修飾体は、通常、三つのクラス：置換、挿入、または削除変異体の内の一つ以上に所属する。挿入体は、アミノおよび／またはカルボキシル末端融合体の外、単一または複数のアミノ酸残基による配列内挿入を含む。挿入体は、通常、アミノまたはカルボキシル末端融合体よりも、例えば、１から４残基だけ小さい挿入体である。削除体は、タンパク質配列からの一つ以上のアミノ酸残基の除去によって特徴づけられる。通常、たかだか約２から６個の残基が、タンパク質配列内部の任意の一部位において削除される。これらの変異体は、通常、そのペプチドをコードするＤＮＡのヌクレオチドに対し部位特異的突然変異誘発し、それによって該変異体をコードするＤＮＡを生産し、その後、組み換え細胞培養体において該ＤＮＡを発現することによって調製される。既知の配列を有するＤＮＡの指定部位に置換突然変異を作製するための技術、例えば、Ｍ１３プライマー突然変異誘発、およびＰＣＲ突然変異誘発は、周知されている。アミノ酸置換は、通常単一残基を含むが、同時に異なるいくつかの位置において起こってもよく；挿入は、通常、約１から１０アミノ酸残基の桁で行われ；削除は、約１から３０残基の範囲である。削除または挿入は、隣接ペアとして行われること、すなわち、２残基の削除、または２残基の挿入が行われることが好ましい。最終構築体に到達するために、置換、削除、挿入、またはそれらの任意の組み合わせを組み合わせてよい。これらの突然変異は、配列を、読み枠から外してはならず、二次ｍＲＮＡ構造を生じる可能性のある相補性領域を創製しないものであることが好ましい。置換変異体は、少なくとも一つの残基が除去され、別の残基が、その位置に挿入されるものである。このような置換体は、下記の、保存的置換体を示す表１にしたがって作製される。

置換性または削除性突然変異を用いて、Ｎ−グリコシル化（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）、またはＯ−グリコシル化（ＳｅｒまたはＴｈｒ）のための部位を挿入してもよい。システイン、またはその他の、不安定残基の削除が望ましい場合がある。可能なタンパク質分解部位、例えば、Ａｒｇの削除または置換は、例えば、塩基性残基の一つを削除するか、または、それを、グルタミニルまたはヒスチジル残基によって置換することによって実現される。

ある翻訳後誘導体は、発現ポリペプチドに対する組み換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、しばしば翻訳後に脱アミド化されて、対応するグルタミルおよびアスパリル残基となる。それとは別に、これらの残基は、穏やかな酸性条件下で脱アミド化される。他の、翻訳後修飾としては、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖の０−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ｐｐ７９−８６）、Ｎ末端アミンのアセチル化、および、ある場合には、Ｃ末端カルボキシルのアミド化が挙げられる。

本明細書に提供されるのは、抗原特異的ポリペプチド、またはＶＬＲに選択的に結合する抗体、または、抗原特異的タンパク質またはＶＬＲの断片または変異体に選択的に結合する抗体である。このような抗体は、ＶＬＲ、またはＶＬＲ生産細胞を位置決めするために使用することが可能である。このような抗体としては、例えば、ストーク領域に選択的に結合する抗体、または、その一部が挙げられる。抗体は、モノクロナールであっても、ポリクロナールであってもよい。モノクロナール抗体は、ハイブリドーマ法、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）、または、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋによって記載される方法によって調製してもよい。免疫化因子は、抗原特異的ポリペプチド、または、その任意の断片（例えば、ストーク領域など）、またはその変異体であってもよい。

クローンによって分泌されるモノクロナール抗体は、通例の免疫グロブリン精製法、例えば、タンパク質Ａセファロース、タンパク質Ｇ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーによって、培養媒体または腹水から単離または精製してよい。抗原特異的ポリペプチド、またはその断片または変異体に選択的に結合する抗体を選択するために、各種のイムノアッセイ方式を用いてよい。例えば、標的と選択的に免疫反応する抗体を選択するのに、通常、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイが使用される。選択的結合を決定するために使用することが可能な、イムノアッセイの方式および条件の記述に関しては、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８８）を参照されたい。モノクロナール抗体の結合アフィニティーは、例えば、Ｍｕｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のＳｃａｔｃｈａｒｄ分析によって決定することが可能である。

さらに提供されるのは、抗原特異的ポリペプチドに選択的に結合する、キメラ抗体、単一鎖抗体、およびハイブリッド抗体（例えば、二重または複数の抗原またはエピトープ特異性を有するもの）、抗体接合体、および抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂなどで、ハイブリッド断片を含む）である。

ＶＬＲ、およびＶＬＲに対する抗体は、検出可能なタグまたは標識に直接または間接に連結されてもよい。検出可能なタグまたは標識は、インビトロまたはインビボにおいて、画像法または検出法によって可視化することが可能であるならば、いずれのタグであってもよい。この検出可能タグは、放射線不透過物質、放射性標識、化学発光標識、蛍光標識、または磁気標識であってもよい。検出可能タグは、ガンマ線発射体、ベータ線発射体、およびアルファ線発射体、ガンマ線発射体、ポジトロン発射体、Ｘ線発射体、および蛍光発射体から成る群から選んでもよい。適切な蛍光化合物としては、フルオレセインナトリウム、フルオレセインイソチオシアネート、フィコエリスリン、およびテキサスレッドスルフォニルクロリド、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、Ｃｙ５−ＰＥ、ＣＹ７−ＡＰＣ、およびカスケードイェローが挙げられる。必要に応じて、組織化学技術、ＥＬＩＳＡ様アッセイ、共焦点顕微鏡検査、蛍光検出、セルソーティング法、核磁気共鳴、ラジオイムノシンチグラフィー、Ｘ線撮影法、ポジトロン放射断層撮影法、軸方向コンピュータ断層撮影法、磁気共鳴画像法、および超音波画像法を用いて、検出可能タグを可視化することが可能である。

標識またはタグは、ＶＬＲまたは抗体に直接結合させてもよいし、あるいはそれとは別に、標識またはタグは、該標識に直接連結される、分子または他の介在因子を用いて間接的に連結させてもよい。例えば、ＶＬＲまたは抗体をビオチニル化し、蛍光標識ストレプトアビジンなどの、後続検出可能標識を加えて、該ビオチンに結合させることも可能である。ビオチンは、当該技術分野で既知のいくつかの技術のいずれかを用いて検出される。例えば、ビオチンは、蛍光標識アビジンと結合させることによって検出することが可能であり、アビジンは、各結合事象と関連する信号を増すために、フィコエリスリンまたは連鎖蛍光標識によって標識される。

必要に応じて、抗原特異的ポリペプチドまたはＶＬＲ、またはその断片または変異体、または、該抗原特異的ポリペプチドまたはＶＬＲに対する抗体は、固相支持体、または可動固相支持体、例えば、スライド、培養皿、マルチウェルプレート、カラム、チップ、アレイ、またはビーズに結合される。アレイとしては、一つ以上のマルチウェル配列手段、例えば、マイクロプレートまたはスライドが挙げられる。可動固相支持体とは、一組の、別々に標識される微小球またはビーズを指す。この微小球は、ポリスチレンジビニールベンゼン・ビーズであることが好ましい。特異的蛍光染料によってマークされ、特異的蛍光プロフィールを有する、数組の微小球が、例えば、Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）から市販されている。

さらに提供されるのは、複数のポリペプチド、核酸、または抗体である。この複数体は、選ばれたポリペプチド、核酸、または抗体に関して均一であっても、不均一であってもよい。必要に応じて、ポリペプチドのＬＲＲは、ポリペプチドの間で高度に変動的である。したがって、この複数体は、内部ＬＲＲの変動性に応じて、異なる結合特異性を有するポリペプチドを含むことが可能である。

さらに提供されるのは、ポリペプチド（可溶性、または、膜結合形）、核酸、または抗体、あるいは、ポリペプチド、核酸、または抗体を付着させた、安定であるか、または可動の固相支持体を包含する容器を含むキットである。

このポリペプチドおよび核酸は、種々の技術において使用することが可能である。例えば、このポリペプチドは、画像化ツールとして、かつ、治療剤として、選ばれた介在因子の検出、選ばれた介在因子の活動の阻止、介在因子の精製のために使用することが可能である。

本明細書で提供されるのは、ポリペプチドまたは核酸、および薬学的に受容可能な担体を含む組成物である。この組成物は、インビボにおいて投与することも可能である。組成物は、経口的に、非経口的（例えば、静脈内）に、筋肉内注入によって、腹腔内注入によって、経皮的に、体外的に、局所的などによって投与してよい。必要とされる組成物の正確な量は、被験者によってまちまちであり、該被験者の人種、年齢、体重、および一般的状態、処置されるアレルギー障害の程度、使用される特定の核酸またはベクター、その投与方式などに応じて変動する。したがって、各組成物の正確な量を特定することは不可能である。しかしながら、当該技術分野において通常の錬度を有する当業者であれば、本明細書の教示が得られれば、通例の実験操作を用いるだけで適切な量を決定することが可能である。

使用する場合、組成物の非経口投与は、一般に、注入によって特徴づけられる。注入剤は、溶液または縣濁液のいずれかなど通例の形状、注入前に溶液または縣濁液とするのに好適な固体形状、または乳液として調製することが可能である。非経口投与のための、比較的最近改定された方法は、一定投与が持続されるように、徐放または持続放出システムの使用を含む。例えば、米国特許第３，６１０，７９５号を参照されたい。なお、これを、引用により本明細書に含める。

物質は、溶液、縣濁液（例えば、微粒子、リポソーム、または細胞の中に取り込まれる）形状を取ってもよい。これらは、抗体、受容体、または受容体リガンドを介して、特定の細胞型を標的としてもよい。

薬学的に受容可能とは、生物学的に、またはその他の観点において有害でない物質を意味する、すなわち、その物質は、いかなる有害な生物学的作用も引き起こすことなく、または、それが含まれる製薬組成物の、他のいずれの成分とも破滅的相互作用を持つことなく、該ポリペプチドと共に被験者に投与することが可能である。当然ながら、当業者に周知されるように、担体は、活性成分の変性を、例えあるとしてもそれを最小化するように、副作用を、例えあるとしてもそれを最小化するように選ばれる。適切な担体およびその処方は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２１ｓｔ ｅｄ．）ｅｄ．Ｄａｖｉｄ Ｂ．Ｔｒｏｙ，ｐｕｂｌ．Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ ２００５に記載される。通常、処方を等張とするために、処方の中に、適切量の、薬学的に受容可能な塩が使用される。薬学的に受容可能な担体の例としては、例えば、ただしこれらに限定されないが、生理的食塩水、リンゲル液、およびデキストロース液が挙げられる。溶液のｐＨは、約５から約８であることが好ましく、より好ましくは約７から約７．５である。

製薬組成物は、選ばれた分子の外に、担体、増粘剤、希釈剤、バッファー、防腐剤、界面活性剤などを含んでもよい。製薬組成物はさらに、一つ以上の活性成分、例えば、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔剤などを含んでもよい。

非経口投与のための調剤は、滅菌水性または非水性溶液、縣濁液、および乳液を含む。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、エチルオレエートなどの注入可能な有機エステル類がある。水性担体としては、水、アルコール／水溶液、乳液または縣濁液、例えば、生理的食塩水およびバッファー媒体などが挙げられる。非経口ベヒクルとしては、塩化ナトリウム液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸添加リンゲル液、または固定油が挙げられる。静注ベヒクルとしては、液体および栄養補給剤、電解質補給剤（例えば、リンゲルデキストロース系のもの）などが挙げられる。さらに、防腐剤、およびその他の添加剤、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどが存在してもよい。

局所投与用処方は、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点滴剤、坐剤、スプレイ、液体、および散剤を含んでもよい。通例の製剤担体、水性、粉末状、または油性基材、増粘剤なども、必要であるか、望ましい場合がある。

経口投与用組成物としては、散剤または顆粒剤、水性または非水性媒体における縣濁液または溶液、カプセル、粉末剤、または錠剤が挙げられる。増粘剤、芳香剤、希釈剤、乳化剤、分散支援剤、または結合剤が望ましい場合がある。

さらに、この可変性リンパ球受容体、および可変性リンパ球受容体断片および変異体は、該可変性リンパ球受容体または可変性リンパ球受容体断片または変異体をコードする、核酸調剤（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）として、患者または被験者に投与され、そのために、該患者または被験者自身の細胞が、該核酸を摂取し、コードされる、その可変性リンパ球受容体、または可変性リンパ球受容体断片を生産、分泌することが可能とされる。

インビトロまたはインビボのいずれかにおいて細胞に核酸を送達するために使用することが可能な組成物および方法はいくつかある。これらの方法および組成物は、大きく二つのクラスに分割される：ウイルス系送達システム、および非ウイルス系送達システムである。例えば、核酸は、いくつかの直接的送達システム、例えば、電気穿孔、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、ファージ核酸、ファージ、コスミドを通じて、または、細胞、または陽イオンリポソームなどの担体における遺伝材料の転送を通じて送達することが可能である。ウイルスベクター、化学的トランスフェクション因子などの、適切なトランスフェクション手段、または、電気穿孔および、ＤＮＡの直接的拡散などの物理的−力学的方法は、例えば、Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５−１４６８，（１９９０）；および、Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ，３５２，８１５−８１８（１９９１）に記載される。転送ベクターは、細胞中に核酸を送達するために使用されるか（例えば、プラスミド）、または、遺伝子を送達するための一般的戦略の一部として、例えば、組み換えレトロウイルスまたはアデノウイルスの一部として（Ｒａｍ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：８３−８８，（１９９３））使用されるものであれば、いずれのヌクレオチド構築体であってもよい。本明細書で用いるプラスミドまたはウイルスベクターは、開示核酸、例えば、ＶＬＲを、細胞中に変性させることなく輸送する介在因子であり、送達される細胞における該遺伝子の発現を実現するプロモーターを含む。ウィルルベクターは、例えば、アデノウイルス、アデノ近縁ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、エイズウイルス、神経向性ウイルス、シンドビスおよびその他のＲＮＡウイルス、例えば、ＨＩＶバックボーンを有するこれらのウイルスである。その外、これらのウイルスを、ベクターとして使用するのに好適なものとする特性を共有するものであれば、いずれのウイルス族も好まれる。レトロウイルスとしては、げっ歯類マロネイ白血病ウイルス、ＭＭＬＶ、およびベクターとしてＭＭＬＶの、所望の特性を発現するレトロウイルスが挙げられる。

開示されるのは、本開示の方法および組成物のために使用されるか、それらと組み合わせて使用されるか、その調製のために使用されるか、または、それらの生産物となる物質、組成物、および成分である。これら、およびその他の物質が、本明細書に開示されるが、これらの物質の組み合わせ、サブセット、相互作用、グループなどが開示される場合、これらの化合物の、種々の、個別の、全体的組み合わせおよび順列のそれぞれについて特異的参照は、はっきりそれと開示されないかも知れないが、本明細書では、それぞれが、特異的に考慮の対象とされ、記載されることを理解しなければならない。例えば、あるＶＬＲが開示、考察され、そのＶＬＲを含むいくつかの分子に対して実行が可能ないくつかの修飾が考察される場合、そのＶＬＲおよび可能な修飾体の全ての組み合わせおよび順列のそれぞれが、特に指定してその逆と表示されない限り、特異的に考慮の対象とされる。したがって、分子Ａ、Ｂ、およびＣのクラスと同時に、分子Ｄ、Ｅ、およびＦのクラスが開示され、かつ、組み合わせ分子Ａ−Ｄの例が開示された場合、例え各組み合わせ分子が個別に言及されなくとも、それぞれが、個別に、全体として考慮の対象とされる。したがって、この例では、組み合わせＡ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−Ｅ、およびＣ−Ｆのそれぞれが特異的に考慮の対象とされるので、これらは、Ａ、Ｂ、およびＣ；Ｄ、Ｅ、およびＦ；および例示の組み合わせＡ−Ｄの開示から、開示されたものと見なさなければならない。同様に、これらの、任意のサブセットまたは組み合わせも、特異的に考慮の対象とされ、開示される。したがって、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、およびＣ−Ｅのサブグループも特異的に考慮の対象とされるので、これらは、Ａ、Ｂ、およびＣ；Ｄ、Ｅ、およびＦ；および例示の組み合わせＡ−Ｄの開示から、開示されたものと見なさなければならない。この概念は、本出願の全ての局面、例えば、ただしこれらに限定されないが、開示の成分の作製法および使用法における工程にも当てはまる。したがって、実行可能な、種々の追加工程が、本出願を通じて議論される場合、それら追加工程のそれぞれが、開示の方法の、任意の特異的実施態様、または実施態様の組み合わせと関連して実行が可能であること、かつ、そのような組み合わせのそれぞれが考慮の対象とされ、開示されたものと見なされることを理解しなければならない。

本明細書で用いる対象とは、脊椎動物、さらに具体的には哺乳類（例えば、ヒト、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、非ヒト霊長類、ウシ、ネコ、モルモット、またはげっ歯類）、魚、鳥、または爬虫類または両生類であってもよい。この用語は、特定の年齢または性別を指定しない。したがって、男女を問わず、成人および新生児対象の外、胎児も、その範囲に含まれることが意図される。本明細書で用いる場合、患者、対象は相互交換的に使用してよく、病気または障害を抱える対象を指すことが可能である。患者または対象という用語は、ヒトおよび獣医学的対象を含む。

本明細書および付属の特許請求項で用いる場合、単数形、ある、および該は、文脈からはっきりと別様に示されない限り、複数の参照物を含む。したがって、例えば、あるＶＬＲに対する参照は、二つ以上のＶＬＲなどの混合物を含む。

本明細書で用いる場合、単離または精製という用語は、組成物（例えば、ポリペプチド、細胞、または核酸）であって、該組成物が天然において通常関連する物質から、事実上切り離された組成物を含む。ポリペプチド、またはその断片は、例えば、天然供給源からの抽出、該ポリペプチドをコードする組み換え核酸の発現（例えば、細胞、または無細胞翻訳システムにおいて）、または該ポリペプチドの化学的合成によって取得することが可能である。

本明細書では、範囲は、約一つの特定値から、および／または、約もう一つの特定値までと表される場合がある。このように範囲が表される場合、もう一つの実施態様は、該一つの特定値、および／または、該他の特定値までを含む。同様に、数値が、先行詞約の使用によって近似値として表される場合、該特定値がもう一つの実施態様を形成することを理解しなければならない。さらに、範囲のそれぞれの端末点は、他の端末点と関連しても、他の端末点と独立しても、意味を持つことを理解しなければならない。

任意の、または必要に応じてとは、後述の事象または状況は起こっても、起こらなくともよいこと、記載は、前記事象または状況が起こる場合、おより、それが起こらない場合を含むことを意味する。

本明細書で用いる場合、ポリペプチド、タンパク質、およびペプチドは相互交換的に使用されて、アミノ酸配列を指す。

本明細書を通じて、種々の公刊物が参照される。本発明の関わる当該技術分野の状態をより完全に記述するために、これら公刊物の開示の全体を、参照により本出願に含める。さらに、開示の参照文献は、該参照文献の依拠する文章において議論され、該参照文献の中に含まれる資料に関して、参照により個別的、特異的に本明細書に含まれる。

開示され、記載される、本発明の化合物、組成物、物品、デバイス、および／または方法は、別様に指定されない限り、特定の合成法、特定の組み換え生物工学的方法に限定されないし、または、別様に指定されない限り、当然変動する可能性のある、特定の試薬に限定されるものでもない。

下記の実施例は、本出願において特許請求される化合物、組成物、物品、デバイス、および／または方法が、どのように作製され、評価されるかに関し、その完全な開示および記述を、当該技術分野において通常の錬度を有する当業者に提供するために記載されるもので、純粋に例示的であることが意図され、範囲において限定的であることを意図するものではない。数字（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するよう努力してはいるが、若干の誤差および偏倚は斟酌されなければならない。別様に指示しない限り、部は重量部であり、温度は℃であるか、または周囲温であり、圧は、大気圧か、またはその近傍である。

実施例１ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓに特異的に結合するＶＬＲ
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ ｅｘｏｓｐｏｒｉｕｍ免疫化ヤツメウナギから、ＶＬＲ陽性リンパ球を収集し、そのＲＮＡを単離した。プライマーを用いてＶＬＲ ｃＤＮＡを増幅し、これを発現ベクターにクローンし、細菌に転送した。選ばれたコロニーを、ＶＬＲ特異的プライマーによるＰＣＲによって選別した。ＰＣＲ産物の不均一サイズは、ＶＬＲ ｃＤＮＡライブラリーの多様性を示した。個別コロニーからプラスミドを精製し、ＨＥＫ−２９３細胞をトランスフェクトし、界面活性剤可溶性細胞分解物を、還元条件下に抗ＶＬＲ ｍＡｂによるウェスタンブロッティングによって、ＶＬＲ発現について調べた。発現された、最初の６個のＶＬＲは、その構成ＬＲＲモジュールの変動数による、種々のサイズの（図３Ａ、３Ｂ、および３Ｃ）、モノマーＶＬＲユニットから構成されていた。トランスフェクトＨＥＫ−２９３細胞の培養上清を、分泌ＶＬＲの存在について調べてみると、これら６個のＶＬＲクローンの内三つの産物が同時に分泌されていた。非還元条件下では、分泌ＶＬＲは、ヤツメウナギ血漿に見られるＶＬＲマルチマーと同様の分子量を持つマルチマーである（図３Ｂ）。２−メルカプトエタノールの存在下では、分泌ＶＬＲは還元されて、ヤツメウナギ血漿由来のＶＬＲモノマーユニットとほぼ同じ分子量を持つモノマーとされた（図３Ｃ）。これらのトランスフェクション実験を繰り返したところ、ＶＬＲ−２、−４、および−５は培養上清において検出されたが、ＶＬＲ−１、−３、および−６は検出されなかった。ＤＮＡ配列分析から、分泌と、Ｃ末端ＬＲＲにおけるペプチドモチーフの間には相関のあることが示唆された。

組み換えＶＬＲが、トランスフェクトＨＥＫ−２９３の培養上清へ分泌されるため、ＥＬＩＳＡによって、抗原結合に関してＶＬＲクローンをスクリーニングすることが可能となる。ＢｃｌＡのＣ末端ドメインは、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ ｅｘｏｓｐｏｒｉｕｍ免疫化マウスから得られるモノクロナール抗体によって認識される主要ドメインである。ＢｃｌＡはさらに、免疫化ヤツメウナギの血漿中のポリクロナールＶＬＲによって認識される。したがって、ＥＬＩＳＡプレートウェルに、下記の抗原：精製組み換えＢｃｌＡ−ＣＴＤ、野生型Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ胞子、ＢｃｌＡ−欠損Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ胞子、および、そのＢｃｌＡ−ＣＴＤが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓのＢｃｌＡ−ＣＴＤと１５アミノ酸（１３４個の内）だけ異なるＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ由来の胞子を塗布した。ＶＬＲ４でトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞の上清は、組み換えＢｃｌＡ−ＣＴＤおよび野生型Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ胞子と特異的に反応した（図４）。ＶＬＲ４は、ＢｃｌＡ欠損Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ胞子、または、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ ＢｃｌＡに対し広汎な相同性を有する、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ ＢｃｌＡタンパク質を認識しない（図４）。

注目すべきことに、ＶＬＲ４とＶＬＲ５は、僅かに２０アミノ酸しか違わないのに、前者はＢｃｌＡ−ＣＴＤを認識し、後者は認識しない（図５Ａ）。アミノ酸差は、ＶＬＲのソレノイド構造の内面に置かれ、進化時選択されると予測された位置に認められた（Ａｌｄｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１０：１９７０，２００５）。ＶＬＲ−４トランスフェクト細胞は、膜結合ＶＬＲと、分泌されるＶＬＲマルチマーの両方を発現する（図１Ａ）。

実施例２ Ｈ血液型決定基に特異的に結合するＶＬＲ
ヤツメウナギを、１×１０^７個の、Ｏ型ヒト赤血球によって、週に１回４週間免疫化した。最後の免疫化の１週後、ヤツメウナギ血漿を収集した。さらに、二つのＣＨＯ細胞系統を用いた。すなわち、一方は、ＣＨＯ細胞の表面にＨ抗原を生成するためにα１，２−フコシルトランスフェラーゼでトランスフェクトしたもの、他方は、ベクターのみでトランスフェクトしたものである（Ｐｒｉｅｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７ Ｊａｎ ２４；２７２（４）：２０８９−９７）。細胞は先ず、ヤツメウナギ血漿の１：１０希釈液、または、Ｈ抗原に対して特異的な、モノクロナール抗体９２ＦＲ Ａ２の１：５０希釈液においてインキュベートした。全ての細胞を洗浄し、次に、ヤツメウナギ血漿とインキュベートしたこれらの細胞を、ＶＬＲ分子を認識するｍＡｂ ４Ｃ４においてインキュベートし、次いで洗浄した。全細胞を、ヤギ抗マウスＲＰＥ二次抗体によって染色し、次いで二度洗浄した。ＦＡＣＳヒストグラムは、ヒト赤血球で免疫化したヤツメウナギからの血漿のみが、酵素でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を染色することを示す（図６）。したがって、ヤツメウナギＶＬＲは、炭水化物抗原を認識した。

実施例３ 規定された抗原特異性の、ヤツメウナギモノクロナールＶＬＲ−Ｂ抗体の生産と特徴解明
抗原特異的ＶＬＲ−Ｂクローンの単離。 ＶＬＲ生産性ヤツメウナギ細胞またはハイブリドーマ培養における制限を克服するために、完全長ＶＬＲ−Ｂ ｃＤＮＡでトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を利用して、組み換えオリゴマーＶＬＲ−Ｂ抗体を、組織培養上清に自発的に分泌する異種発現システムを開発した。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞によるＶＬＲ−Ｂクローンの分泌によって、ハイブリドーマスクリーニングと同様の方法原理を用い、抗原結合に関して多数のクローンをスクリーニングするための手段が得られた。この手順は、生物学実験室において利用可能な技術による抗原特異的ＶＬＲ−Ｂクローンの単離を可能とするが、モノクロナール抗体生産に匹敵する時間投資を必要とする（図８Ａおよび８Ｂ）。ヤツメウナギ幼生を、２週間に１回、合計８週免疫化し、次いで、ＦＡＣＳにより、血液サンプルから、ＶＬＲ−Ｂ^＋リンパ球のＦＡＣＳ単離を行った。選別したＶＬＲ−Ｂ^＋リンパ球からＲＮＡを単離し、ＶＬＲ−Ｂ転写体の定常域に対して特異的なプライマーによるＰＣＲによってＶＬＲ−Ｂ ｃＤＮＡを増幅した。このＶＬＲ−Ｂ ｃＤＮＡを、哺乳類発現ベクターにクローンし、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションに用いた。次に、抗原特異的ＶＬＲ−Ｂ抗体を生産するクローンを特定するために、組織培養上清を、ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーによってスクリーニングした。

免疫原としてＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ ｅｘｏｓｐｏｒｉｕｍを選んだ。その理由は、本明細書に記載するように、ＢｃｌＡ胞子コートタンパク質のＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）が、インビボ反応においてＶＬＲ−Ｂ抗体によって認識される、主要な免疫反応エピトープだからである。２４ウェルプレートにおいて、単一コロニー由来の精製プラスミドによってＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を一過性にトランスフェクトした。これにより、各ウェルは、ＶＬＲ−Ｂ ｃＤＮＡの単一クローンを表す。Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ ｅｘｏｓｐｏｒｉｕｍ免疫化ヤツメウナギ由来のＶＬＲ−Ｂ ｃＤＮＡを含む精製プラスミドをこのようにトランスフェクトし、上清を、ＢｃｌＡ−ＣＴＤ結合に関してスクリーニングしたところ、２１２個のクローンの内１４個（６．６％）が、ＢｃｌＡ−ＣＴＤを認識するが、ＧＳＴコントロールタンパク質は認識しない、ＶＬＲ−Ｂ抗体を分泌した。１４個の抗原反応性クローンの内８個が、背景を１０倍上回るレベルにおいてＢｃｌＡ−ＣＴＤを認識した（図９Ａ）。これらの組み換えＶＬＲ−Ｂ抗体の特異性は、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ、および二つのごく近縁のＢａｃｉｌｌｕｓ種、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓおよびＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓに対する結合によって評価した。ＶＬＲ−Ｂ抗体は、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ胞子とは反応するが、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、またはＢｃｌＡ欠損Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ胞子とは反応しないことが判明した（図９Ｂ）。ＢｃｌＡ−ＣＴＤ組み換えタンパク質を認識するＶＬＲ−Ｂ抗体の内一例のみ（ｖＢａ４９）が、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ胞子を認識しなかった。ＥＬＩＳＡによって、胞子と反応することが認められた組み換えＶＬＲ−Ｂ抗体は全て、フローサイトメトリーによる免疫蛍光アッセイにおいてＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ胞子を特異的に認識した（図９Ｃ）。

Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ胞子を認識する、７個の組み換えＶＬＲ−Ｂ抗体のいずれも、近縁Ｂａｃｉｌｌｕｓ種の胞子とは反応しなかった。これは、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ ＢｃｌＡ−ＣＴＤは、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ ＢｃｌＡ−ＣＴＤとは、１３４のアミノ酸位置の僅かに１４において異なるだけであるにも拘わらずそうであった。ただし、溶媒暴露されるのは１４の内僅かに９だけである（図１０Ｄ）。さらに、ＢｃｌＡ−ＣＴＤ配列の不一致は、化学的に近似のアミノ酸を含む。溶媒暴露アミノ酸差を、ＢｃｌＡ−ＣＴＤの結晶構造座標軸の上にプロットすると、このアミノ酸差は、凝集せずに、分子表面に分散することが注目された。ＶＬＲ−Ｂ抗体が、これら不一致アミノ酸の全てに接触するとは考えられないから、ＶＬＲ−Ｂ抗体は、ごく少数の微妙なアミノ酸変動に基づいて近縁タンパク質を識別することが可能なのであろうと我々は考える。
抗原アフィニティークロマトグラフィーによるＶＬＲ−Ｂ抗体の精製。 ＥＬＩＳＡおよび免疫蛍光アッセイによって、ＶＬＲ−Ｂ抗体が、簡単にＢｃｌＡ−ＣＴＤ抗原を検出できることから、抗原に対するＶＬＲ−Ｂ抗体の相互作用は、アフィニティークロマトグラフィーによる精製を促進するほど十分な強度および安定性を有することが示唆された。したがって、ＶＬＲ−４抗体を生産するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞クローンからの上清を、ＢｃｌＡ−ＣＴＤに共有的に接合させたセファローズビーズと共にインキュベートした。次に、ＢｃｌＡ−ＣＴＤビーズからＶＬＲ４を溶出するのに必要な条件を、抗原コートビーズからＶＬＲ４を解離することが可能な処理である、５Ｍ ＬｉＣｌ、３．５Ｍ ＭｇＣｌ_２、０．１ＭグリシンｐＨ２．５、０．１Ｍ ＨＣｌ、５０％エチレングリコール、０．１ＭトリエチルアミンｐＨ１１．５、および０．１Ｍ ＮａＯＨ，ｐＨ１２．５、０．１ＭトリエチルアミンｐＨ１１．５、および０．１Ｍ ＮａＯＨ ｐＨ１２．５を用いて調べた（図１０Ａ）。ｐＨ条件の勾配を調べることによって、我々は、ＢｃｌＡ−ＣＴＤから組み換えＶＬＲ４抗体を解離するためには、ｐＨ≧１１．０が必要であることを見出した。ＶＬＲ４結合および溶出の最適条件を決定した後、ＶＬＲ４分泌細胞の安定クローンを選んで拡張し、より大量のＶＬＲ−４抗体を取得し、これを、ＢｃｌＡ−ＣＴＤアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、０．１ＭトリエチルアミンｐＨ１１．５によって溶出した。この精製ＶＬＲ４抗体は、厳しい溶出条件にも拘わらず抗原結合能力を保持し、かつ、抗原反応性を失うことなく、ｐＨ７．２ＭＯＰＳバッファー生理的食塩水において４℃で＞６ヶ月保存された。

ＶＬＲ４抗体の、二つの分子量形が、ＢｃｌＡ−ＣＴＤアフィニティーカラムから溶出したが、これらはいずれも、非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて２２５ｋＤａ標準よりも大きかった（図１０Ｂ）。両タンパク質のバンドは、精製前の上清、および、抗原アフィニティーカラムからの溶出液において、抗ＶＬＲ−Ｂ ｍＡｂ（４Ｃ４）によるウェスタンブロッティングによって検出された。分子量についてさらに正確な推定値を得るために、組み換えＶＬＲ４抗体および分子量標準の相対的移動度を、未加工アクリルアミドゲル（５、６、７、８、１０、および１２％）において測定し、このデータを用いてＦｅｒｇｕｓｏｎプロットを構築した（図１０Ｃ）。この方法によって、大きい方のＶＬＲ４バンドは、約４００ｋＤａの分子量を有することが示された。モノマーの分子量は、４０ｋＤａであると推定された。したがって、このオリゴマーは、１０個のサブユニットから構成されることが示唆される。同様に、より分子量の低いＶＬＲ４オリゴマーは、８個のＶＬＲサブユニットを含むと推定された。比較的低濃度の還元剤に暴露された上清のウェスタンブロットには、約８０ｋＤａの部分的に還元されたバンドが観察された。これは、該オリゴマーＶＬＲ−Ｂ抗体が、ダイマーサブユニットから構成される可能性のあることを示唆する（図１０Ｄ）。これらの所見から、ヤツメウナギＶＬＲ−Ｂ抗体の四元構造は、ＩｇＭとまったく同様の、ダイマーの、ジスルフィド連結ペンタマーまたはテトラマーから構成されるモデルが創製された（図１Ｂ）。
ＶＬＲ−Ｂ抗体集合体の分析。 ＶＬＲ−Ｂ細胞表面分子は、ＧＰＩ連結によってリンパ球表面に繋留される。ＶＬＲ−Ｂ抗体を分泌する、プラズマ細胞様細胞はさらに、細胞表面ＶＬＲ−Ｂを発現する。細胞表面におけるこのＧＰＩ−連結ＶＬＲ−Ｂが、フォスフォリパーゼによって解放される場合、オリゴマー形成のために使用されるシステインは、ＧＰＩ切断部位に対しＮ末端側に配置されていなければならない。なぜならば、ＧＰＩ切断部位に対するアミノ酸Ｃ末端は、ＥＲにおけるＧＰＩ付加によって取り除かれると考えられるからである。この問題を評価するために、開始コドンからＧＰＩ切断部位までＶＬＲ４抗体をコードする構築体（ＶＬＲ４^{ＧＰＩ−ｓｔｏｐ}）を、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞において発現させた。得られた野生型ＶＬＲ４（ＶＬＲ４^ＷＴ）およびＶＬＲ４^{ＧＰＩ−ｓｔｏｐ}分子を非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、その分子量を、抗ＶＬＲ−Ｂ ｍＡｂ（４Ｃ４）によるウェスタンブロッティングによって求めた。この分析から、ＶＬＲ４^ＷＴは、＞２２５ｋＤａの分子量を有するが、一方、ＶＬＲ４^{ＧＰＩ−ｓｔｏｐ}分子は、約４０ｋＤａモノマーとして移動することが確かめられた（図１１Ａ）。この所見から、ＶＬＲ−Ｂオリゴマー形成に使用されるシステインは、ＧＰＩ切断部位のＣ末端側に配置されることが示唆された。

分泌されたＶＬＲ４のシステインリッチＣ末端が、ＥＲにおける処理の際に、ＧＰＩ切断によって除去されるかどうかを決めるために、精製ＶＬＲ４抗体を還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、Ｇｅｌｃｏｄｅ Ｂｌｕｅ染色によって可視化した。これにより、ＶＬＲ４抗体は、イオドアセタミドによってアセチル化される前に、アクリルアミドゲルから除去され、そのため、ジスルフィド結合の再形成およびトリプシンによる消化が阻止された。次に、このトリプシン処理ペプチドを、逆相クロマトグラフィーによって分離し、ＭＳ／ＭＳによって配列決定した。この分析から、全体システインリッチペプチド配列は、ＶＬＲ４抗体分泌形のＣ末端中に存在することが明らかにされた。これは、マルチマーＶＬＲ４抗体は、ＧＰＩ−連結前駆体からは得られないことを示す。これらの実験の結果はさらに、オリゴマー形成に与るシステインは、ＶＬＲ−Ｂ抗体の、比較的疎水性の高いＣ末端に配されることを示す（図１１Ｂおよび図１１Ｃ）。

モノマーとしてのＶＬＲ４^{ＧＰＩ−ｓｔｏｐ}の分泌は、個別のＶＬＲ４抗体ユニットによる抗原結合の寄与を調べることを可能にする。このＥＬＩＳＡ評価では、ＢｃｌＡ−ＣＴＤ塗布ウェルを、オリゴマーＶＬＲ４^ＷＴまたはモノマーＶＬＲ４^{ＧＰＩ−ｓｔｏｐ}抗体を含む上清と共にインキュベートした。オリゴマーＶＬＲ４抗体は、ＢｃｌＡ−ＣＴＤとの緊密な相互作用を示す、強力な結合信号を誘発したが、一方、ＶＬＲ４抗体のモノマー形は、ＢｃｌＡ−ＣＴＤと相互作用を示したが、背景を上回る、かろうじて検出可能な信号を生成した（図１１Ｄ）。これらの複合結果から、ＶＬＲ−Ｂモノマーユニットの抗原結合親和性は比較的低いが、オリゴマーＶＬＲ−Ｂ抗体の抗原結合活性は比較的高いことが示された。
ＶＬＲ−Ｂ抗原結合部位。 ＶＬＲ−Ｂの陥凹面は、各一つが、ＬＲＲ−ＮＴ、ＬＲＲ１、ＬＲＲ−Ｖ（単数または複数）、ＬＲＲＶｅ、およびＬＲＲ−ＣＰに由来する、平行なβ鎖から構成される。陥凹面の、このβ鎖が、従来から抗原結合部位であると想定されていた。なぜなら、もっとも高い配列変動性が、その場所に観察されたからである。したがって、抗原結合に与るアミノ酸残基が、ＶＬＲ−Ｂ陥凹面のβ鎖に配置されるかどうかを調べた。多数のＢｃｌＡ−ＣＴＤ特異的ＶＬＲ−Ｂクローンの利用が可能であることによって、部位指向性突然変異誘発による本試験のための手段が得られた。ＢｃｌＡ−ＣＴＤに対する組み換えＶＬＲ−Ｂ抗体の内、四つは、高い配列同一性を示した。これらの内三つは、高いアビディテイーでＢｃｌＡ−ＣＴＤに結合したが（ＶＬＲ４、ｖＢＡ４１、ｖＢＡ１９１）、他のもの（ＶＬＲ５）の、この抗原に対する結合は弱かった。結合の弱いＶＬＲ５抗体は、高アビディティー抗ＢｃｌＡ−ＣＴＤクローンの共通配列に対し、陥凹面における、２０個の、可能な超可変アミノ酸位置の内の、６箇所（Ｈ３４、Ｙ５５、Ｔ５８、Ｑ１０１、Ｓ１０３、Ｗ１２７）において異なっていた（図１２Ａおよび図１２Ｂ）。この所見は、これら６個のアミノ酸残基の内の一つ以上が、ＶＬＲ５のアビディティー低下に与ることを示唆し、かつ、ＢｃｌＡ−ＣＴＤ抗原に対し高い結合アビディティーを有する組み換えＶＬＲ−Ｂ抗体によって利用される、対応アミノ酸に、これらの残基を変えることによって、ＶＬＲ５のアビディティーを上昇させることが可能かもしれないことを意味する。

ＶＬＲ４、ＶＬＲ５^Ｗｔ、およびＶＬＲ５抗原結合部位突然変異体（ＶＬＲ５^Ｈ３４Ｎ、ＶＬＲ５^Ｙ５５Ｒ、ＶＬＲ５^Ｔ５８ＩＶＬＲ５^{Ｑ１０１Ｈ}、ＶＬＲ５^{Ｓ１０３Ａ}、およびＶＬＲ５^{Ｗ１２７Ｙ}）の相対的結合活性を測定するために、表面プラズモン共鳴を用いた。このアッセイは、Ｂｉａｃｏｒｅチップに共有的に結合させたＢｃｌＡ−ＣＴＤの上に、各種ＶＬＲ−Ｂ抗体を含む、トランスフェクト細胞上清を流すことによって実行した。ＶＬＲ５^Ｗｔと比べると、ＢｃｌＡ−ＣＴＤに対してより高い結合を示す上昇反応は、ＶＬＲ５^Ｙ５５ＲおよびＶＬＲ５^{Ｗ１２７Ｙ}において明白であった（図１２Ｃ）。他の突然変異ＶＬＲ５抗体は、ＶＬＲ５^Ｗｔと等価であるか、または、やや弱い結合アビディティーを示した。

抗体残基Ｙ５５、Ｗ１２７は、共に、ＶＬＲ５のＶＬＲ５陥凹面の中心に軸揃えされることが予想されているが、これらの残基のいずれかの突然変異は、ＶＬＲ５の結合アビディティーの上昇をもたらした（図１２Ｂ）。これらの残基が、抗原結合において共同的に機能するのかどうかを調べるために、ＶＬＲ５の二重変異体（Ｙ５５Ｒ／Ｗ１２７Ｙ）を、ＢｃｌＡ−ＣＴＤに対する結合に関して、表面プラズモン共鳴によって調べた（図１２Ｃ）。Ｙ５５およびＷ１２７両方の突然変異は、ＶＬＲ５の結合活性の上昇をもたらした。

抗Ｈ抗原モノクロナールＶＬＲ−Ｂ（ｍＶＬＲ−Ｂ）（ｖＲＢＣ−３６）抗原結合部位のモデルを作製した（図１３）。このｖＲＢＣ−３６モデルは、ヌタウナギＶＬＲ−Ｂ（ＰＤＢ特定番号：２Ｏ６Ｒ）の結晶構造データに対し、ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬ（ｈｔｔｐ：／／ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／）を用いて相同性に基づくモデル作製によって構築した。超可変アミノ酸位置は、紫色で強調した。赤矢印は、他の炭水化物成分からＨ抗原を識別する、フコース糖の接触面であると考えられる、陥凹面上の凹部を示す。表２は、各ＬＲＲ分子の超可変残基によってコードされるアミノ酸を掲げる。

実施例４ 無顎脊椎動物におけるＶＬＲ抗体反応
材料および方法
動物の維持および免疫化。 Ｌａｍｐｒｅｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ （Ｌｕｄｉｎｇｔｏｎ，ＭＩ）によって供給された海産ヤツメウナギ幼生（１１−１５ｃｍ）を、砂を敷いたアクァリウムにおいて１６−１８℃に維持し、ビール醸造酵母で飼養した。０．１ｇ／Ｌ ＭＳ２２２（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に浸すことによって麻酔したヤツメウナギの腹腔内に、精製Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ ｅｘｏｓｐｏｒｉｕｍ、赤血球、ＬＰＳ、または組み換えタンパク質を注入した。

抗ＶＬＲモノクロナール抗体および組み換えＶＬＲ抗体。 Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）において生産した、組み換えＶＬＲ−Ｂ不変性ストーク領域タンパク質によってマウスを超免疫化した後、関連領域リンパ節細胞を、非生殖的Ａｇ８．６５３ミエローマ変異細胞と融合することによって、２種類のマウスモノクロナール抗体を生成した。ＶＬＲ−Ｂ特異性を有する抗体を生産する、二つのハイブリドーマクローン、６Ｃ３（ＩｇＭ）および４Ｃ４（ＩｇＧ２ｂ）は、ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリースクリーニングによって特定した。生細胞の免疫蛍光染色、および、固定切片の免疫組織化学的染色によって、この６Ｃ３および４Ｃ４抗体は、ヤツメウナギの血液および組織において同じリンパ球集団を認識することが示された。さらに、４Ｃ４抗体は、ウェスタンブロッティングによって、ＶＬＲ−Ｂタンパク質と反応した。ヒトＨ抗原特異性を有する、組み換えＶＬＲ−Ｂモノクロナール抗体（ｍＶＬＲ−ＲＢＣ３６）は、Ｏ血液型赤血球によって免疫化したヤツメウナギの白血球のＲＮＡを単離し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，）によってｃＤＮＡを生産することによって取得した。次に、ＶＬＲ−Ｂ座位に対して特異的なプライマーを用いて、一次的および入れ子型ＰＣＲを実行し、次いで、ベクターｐＩＲＥＳｐｕｒｏ２（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）にＰＣＲアンプリコンをクローンし、細菌を形質転換した。単一コロニーからプラスミドＤＮＡを単離し（ｎ＝２７２）（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）、次いで、これを、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）と共にＨＥＫ ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、ＣＨＯ細胞の表面にＨ抗原を生成するα１，２−フコシルトランスフェラーゼの構築体で安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を染色する能力に基づいて、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞の上清を、Ｈ抗原特異性に関して調べた。

免疫組織化学、免疫蛍光分析、および電子顕微鏡観察。 １ｇ／Ｌ ＭＳ２２２に浸してヤツメウナギを屠殺し、組織および血液サンプルを得た。免疫組織学のために、１ｃｍの死体切り身を固定し、パラフィンに包埋した。切片を脱パラフィンし、１００％、９５％、および７０％エタノールに連続浸漬し、６Ｃ３抗ＶＬＲ抗体染色については０．０１Ｍクエン酸（ｐＨ６）に、４Ｃ４抗体染色については０．０１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）に１５ｐｓｉで１０分間切片を加熱することによって抗原回収を行った。次に、切片を、３％過酸化水素で５分間処理し、次いで、３％ヤギ血清で３０分ブロックした。処理した組織切片を、前記一次抗体の一方で覆い、室温で１時間インキュベートし、次いで、Ｔｒｉｓバッファー生理的食塩水で洗浄し、ビオチニル化二次抗体およびストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｓｉｇｎｅｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｄｈａｍ，ＭＡ）をそれぞれ２０分かけて加え、次いで、発色性標識化のためにジアミノベンジジン基質（ＢｉｏＧｅｎｅｘ，Ｓａｎ Ｒａｍｏｎ，ＣＡ）を加えた。カウンターステインのために、標識化スライドを、短時間、Ｍａｙｅｒのヘマトキシリンエオジンに浸し、エタノールとキシレンの連続浴を通じて脱水し、次いで、カバースリップを被せた。免疫蛍光分析のために同じプロトコールを用いた。ただし、カバースリップは、二次抗体の添加後、ＤＡＰＩマウント媒体含有Ｐｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって布置した。電子顕微鏡観察のために、ソートした血球を、カコジル酸ナトリウム、または、２．５％グルタールアルデヒド含有Ｓｏｒｓｅｎｓｏｎバッファー中に、４℃で４時間再縣濁した。次いで、１％四酸化オスミウム中で１時間固定し、漸増濃度のアセトンシリーズ中で脱水し、エポキシ樹脂に包埋した。

抗原およびＶＬＲ抗体アッセイ。 ＢＳＡ免疫化とは、下記のベヒクル：滅菌０．６６％ＰＢＳで、注入前４時間タンパク質によって２００μｇのＡｌ（ＯＨ）_３を吸収させたもの、または、メーカーのプロトコールにしたがって調製された、ＲｉｂｉおよびＴｉｔｅｒｍａｘ Ｇｏｌｄ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）アジュバント含有乳剤、の内の一方の５０μｌに溶解した１０μｇのＢＳＡの注入である。ＢＳＡ塗布ビーズのために、カルボジイミドキットをメーカーのプロトコール（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）にしたがって用い、ＢＳＡを、１ミクロンのカルボン酸ポリスチレンビーズに接合し、注入前に、リポポリサッカリド、リポタイコ酸、およびペプチドグリカン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を加えた。Ｂ６マウス、または、ヒトの血液型Ｏのドナーから赤血球を得、注入前に３回洗浄した。抗体アッセイのために、種々の希釈度でヤツメウナギ血漿と混合した、洗浄赤血球（５×１０^６）を、円錐形底部のマイクロウェルプレートに１時間沈着させ、プレートを８０℃で２分傾斜させた後、凝集を目視で評価した。以前に記載した通りに（Ａｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１０：１９７０−３（２００５））ＥＬＩＳＡを行った。Ｈ抗原とのＶＬＲの反応性は、α１，２−フコシルトランスフェラーゼのための構築体、またはベクター単独によって安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、試験血漿サンプルとインキュベートすることによって決定した。次に、このＣＨＯ細胞を、４Ｃ４ ｍＡｂおよびヤギ抗マウスＩｇ（Ｈ＋Ｌ）−ＲＰＥ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）と、それぞれ１０分間インキュベートすることによって染色し、次いで、Ｃｙａｎ（商標）フローサイトメーター（Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）を用いて免疫蛍光を分析した。血漿ＶＬＲ吸着のために、試験サンプルを、セファロースに接合させた４Ｃ４抗ＶＬＲ ｍＡｂと混合するか、または、ＣＨＯ細胞（３×１０^６）を、４℃で１時間パラフォルムアルデヒドによって固定した。ビーズまたは細胞を回転沈着させ、上清を新しい試験管に移し、次いで、凝集またはウェスタンブロットアッセイによって抗原反応性を分析する前に、上記吸着過程を繰り返した。蛍光性胞子によってヤツメウナギリンパ球を染色するために、４×１０^６のリンパ球を、４Ｃ４抗ＶＬＲモノクロナール抗体、およびＡｌｅｘａ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で標識した４×１０^６の胞子と、氷上で１０分混ぜ合わせた。次に、細胞を洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇ（Ｈ＋Ｌ）−ＲＰＥを氷上で１０分加え、次いで２回洗浄した。次に、Ｃｙａｎ（商標）フローサイトメーター（Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）においてフローサイトメトリー分析を行った。

ＶＬＲ分泌細胞のＥＬＩＳＰＯＴ分析。 ９６ウェルプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）のマイクロウェルに、５０μｇ／ｍｌの組み換えＢｃｌＡ Ｃ末端ドメインタンパク質（参照）１００μｌを塗布し、４℃で一晩放置し、次いで、ＰＢＳに溶解した１％ＢＳＡによって３７℃で２時間ブロックし、１０％ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、インスリン、およびトランスフェリンを添加した、ＩＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）に試験細胞縣濁液を加え、５％ＣＯ２において２５℃で１８時間インキュベートした。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、１％ＢＳＡに溶解した１μｇ／ｍｌのＶＬＲ抗体を加え、３７℃で１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳ−０．５％ｔｗｅｅｎで洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）に接合させたヤギ抗マウスを加え、３７℃で１時間インキュベートし、次いで、このウェルを、ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎで１回、ＰＢＳで３回洗浄した。次に、ＡＥＣペルオキシダーゼ基質（Ｍｏｓｓ Ｉｎｃ，Ｐａｓａｄｅｎａ，ＭＤ）を加え、１時間インキュベートし、次いで、脱イオン水で洗浄し、Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ ２．０ソフトウェア（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ．，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を用いてＶＬＲ抗体スポットをカウントした。

ウェスタンブロット。 血漿サンプル（１μｌ）を、２−メルカプトエタノールの存在下または不在下に、１０％ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル上で電気泳動し、次いで、ニトロセルロース膜に転送し、これを、３％ミルクでブロックし、次に、４Ｃ４抗ＶＬＲ ｍＡｂと１時間インキュベートした。次いで、膜を、ＰＢＳ−０．５％ｔｗｅｅｎで５回洗浄し、次に、ヤギ抗マウスＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）を加え、１時間後に最終洗浄を行った。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ化学発光キット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて、ＶＬＲ−抗体接合体を検出した。

定量的ＰＣＲ。 メーカーのプロトコールにしたがって、オン・カラムＤＮＡ消化（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）と共にＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）およびＲＮｅａｓｙを用いて、ＶＬＲ−Ｂ＋およびＶＬＲ−Ｂ−選別細胞からＲＮＡを抽出した。第１鎖ｃＤＮＡは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）と共にランダムヘキサマーを用いて生成した。スプライス部位が既知の場合は、７９００ＨＴ ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）においてＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを用い、スプライス部位において設計されたプライマーによって定量的ＰＣＲを実行した。

結果
モデルタンパク質抗原に対するＶＬＲ−Ｂ抗体反応の分析。 本実施例は、ヤツメウナギのＶＬＲ−Ｂ抗体の検出のために、ＶＬＲ−Ｂストーク領域特異的モノクロナール抗体６Ｃ３（ＩｇＭ異性形）および４Ｃ４（ＩｇＧ２ｂ異性形）を用いる。先ず、比較的大型の海産ヤツメウナギ幼生（約１３ｃｍ長）を、可溶性ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（１０μｇ）によって免疫化した。ＢＳＡは、未修飾形であるか、ミヨウバン沈殿させたものであるか、または、いずれも油中水乳剤において細菌産物を含む、市販のアジュバント、Ｒｉｂｉ（登録商標）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）およびＴｉｔｅｒｍａｘ（登録商標）（ＣｙｔＲｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）と混ぜ合わせたものである。他の免疫化用として、ＢＳＡをポリスチレンビーズの表面に接合し、このビーズ１×１０^８個を、そのまま、または、リポポリサッカリド、リポタイコ酸、またはペプチドグリカンそれぞれの１μｇと共に注入した。ａｎｔｈｒａｘ ｅｘｏｓｐｏｒｉｕｍタンパク質に対する強力なＶＬＲ体液反応を誘発する免疫化プロトコールを用いた：一次免疫化の２週間後、ブースター免疫化を行い、４週目に試験するために血漿サンプルを収集した。これらのＢＳＡ免疫化法のいずれも、ＥＬＩＳＡで検出することが可能な、ＶＬＲ−Ｂ抗体の生産をもたらさなかった（ｎ＝３０、１免疫化群当たり４−５匹）。さらに免疫化ヤツメウナギは、ａｎｔｈｒａｘ ｅｘｏｓｐｏｒｉｕｍによるヤツメウナギの免疫化後観察される、循環リンパ球のリンパ芽球様形質転換の反応を示さなかった。したがって、モデルタンパク質免疫原としてのＢＳＡは、凝集形であれ、固相基質表面への塗布であれ、アジュバントと共に投与した場合でも、ＶＲＬ−Ｂ抗体反応を誘発しなかった。

ヤツメウナギは、哺乳類赤血球に反応し凝集性ＶＬＲ−Ｂ抗体を生産する。 赤血球凝集反応におけるＶＬＲ抗体の可能な役割を調べるために、マウス、またはヒトの赤血球のいずれかによって、ヤツメウナギを腹腔内注入によって免疫化した。以前の報告の通り、抗原用量依存性で、ドナー赤血球免疫原に対して特異的な赤血球凝集反応が誘発された（図１４Ａ、表３）。

ａ０および１４日目に、３匹のヤツメウナギ幼生を、１×１０^７個のヒトまたはマウス赤血球によって免疫化し、血漿サンプルを２８日目に取得した。

赤血球凝集が、ＶＬＲ−Ｂ抗体によって仲介されるかどうかを決定するために、抗−ＶＬＲ−Ｂ抗体を塗布したセファロースビーズを用いて、血漿サンプルからＶＬＲ−Ｂ抗体を除去した。抗−ＶＬＲ−Ｂ塗布ビーズによる吸着は、大多数の凝集素を取り除くが、一方、無関係の特異性を持つコントロール抗体によって塗布されたビーズは、目立った作用を持たないことが判明した（図１４Ｂ）。これらの所見は、赤血球免疫化ヤツメウナギによって作製される血球凝集素は、ＶＬＲ−Ｂ抗体であることを示す。

Ｏ血液型赤血球に対するＶＬＲ−Ｂ抗体の、炭水化物Ｈ抗原特異性。 以前の研究から、ヒトの、Ｏ血液型赤血球によって免疫化されたヤツメウナギによって作製される凝集素は、この血液型を決める、三糖の細胞表面Ｈ抗原に対して特異的であることが示唆された。ＶＬＲ−Ｂ抗体の、Ｈ抗原特異性を調べるために、Ｈ三糖を生成する、α１，２−フコシルトランスフェラーゼ酵素によって安定にトランスフェクトされるＣＨＯ細胞を用いた。Ｏ血液型赤血球によって免疫化された動物は、三糖Ｈ抗原を発現するＣＨＯ細胞を認識するＶＬＲ−Ｂ抗体を生産することが示された（図１４Ｃ）。一方、それらの動物は、ベクターのみによってトランスフェクトされたコントロールＣＨＯ細胞を認識するＶＬＲ抗体を生産しなかった。さらに、Ｈ抗原陽性ＣＨＯ細胞による、免疫血漿サンプルの吸着は、ＶＬＲ−Ｂ抗体プールの血漿レベルに対し目立った影響を及ぼすことなく、凝集性ＶＬＲ抗体を除去した（図１４Ｄ）。これらの所見から、Ｈ三糖決定基が、Ｏ血液型赤血球に対するヤツメウナギの反応の、主要抗原決定基であることが確かめられた。これらの所見はさらに、この体液性反応は、主に、ＶＬＲ−Ｂ抗体の生産によるものであることを示し、かつ、この抗原に対する反応として生産されたＶＬＲ−Ｂ抗体は、循環性ＶＬＲ−Ｂ抗体プールの僅少部分しか含まないことを明らかにする。

Ｈ抗原特異的ＶＬＲ−Ｂ抗体は、ジスルフィド結合マルチマーである。 ＶＬＲ−Ｂ抗体の、赤血球凝集能力から、その多価性が推測された。これらの抗体の組成を調べるため、Ｈ抗原特異性を有する、組み換えＶＬＲ−Ｂ抗体を生成した。このために、免疫化動物の血液リンパ球から、ＶＬＲ−ｃＤＮＡライブラリーを調製し、個別ＶＬＲ−Ｂクローンを、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を、抗原特異的ＶＬＲ−Ｂの生産クローンについてスクリーニングすると、Ｈ抗原^＋ＣＨＯ細胞とは反応するが、Ｈ抗原⁻ＣＨＯ細胞とは反応しないＶＬＲ抗体を生産する、一クローンが特定された（図１５Ａ）。この組み換えＶＬＲ抗体による抗原結合は、あらかじめ可溶性Ｈ抗原とインキュベートすることによって抑制された。ウェスタンブロット分析から、このＶＬＲ抗体は、ジスルフィド結合によって一緒に連結される、複数の、個別の、〜３５ｋＤａのＶＬＲ−Ｂサブユニットによって構成される、大型の、＞２５０ｋＤａのマルチマータンパク質であることが明らかになった（図１５Ｂ）。

炭疽菌ＶＬＲ−Ｂ抗体反応の用量依存性および抗原特異性。 本明細書に記載する通り、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ ｅｘｏｓｐｏｒｉｕｍによって免疫化したヤツメウナギは、胞子表面タンパク質ＢｃｌＡに対するＶＬＲ抗体を生産した。ＶＬＲ−Ｂ抗体反応を惹起するために必要とされる抗原用量要求を定め、エピトープ特異性を決定するために、この反応を調べた。免疫原用量を増大させていくと、ＢｃｌＡ表面タンパク質に対するＶＬＲ−Ｂ抗体について、より高い力価の生産がもたらされた（図１６Ａ）。

炭疽菌免疫化マウスは、主に、ＢｃｌＡのＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）に対する抗体を作製するという所見に基づき、ＢｃｌＡ−ＣＴＤ決定基に対するヤツメウナギの反応を調べた。さらに、免疫化ヤツメウナギによって生産されるＶＬＲ−抗体は、ＢｃｌＡ−ＣＴＤとは反応するが、コントロールタンパク質とは反応しないことが認められた（図１６Ｂ）。さらに、ＶＬＲ−Ｂ抗体反応は、主に、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓの非交差性抗原決定基を指向するようである。なぜなら、近縁のＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓおよびＢ．ｃｅｒｅｕｓ胞子に対しては、ごく僅かの反応性しか検出されなかったからである（図１６Ｃ）。注目すべきことに、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓのＢｃｌＡタンパク質は、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓのＢｃｌＡタンパク質とは、そのアミノ酸の僅か１０％において異なるに過ぎない。これらの所見は、ａｎｔｈｒａｘ ｅｘｏｓｐｏｒｉｕｍに対するヤツメウナギＶＬＲの反応は、用量依存性で、きわめて特異的であり、かつ、主に、ＢｃｌＡ表面タンパク質のＣＴＤ抗原決定基を焦点的に指向することを示す。

ヤツメウナギにおけるＶＬＲ−Ｂ^＋リンパ球の組織分布。 免疫化に対する、ヤツメウナギ体液反応の細胞基盤を調べるために、ＶＬＲ−Ｂの不変ストーク領域に対して特異的な２種類の抗体を用い、免疫組織化学的染色によってＶＬＲ−Ｂ^＋細胞の組織分布を調べた。６Ｃ３抗ＶＬＲ−Ｂモノクロナール抗体を用いると、二つの造血器官である腎臓および盲腸の外、鰓にもＶＬＲ−Ｂ^＋細胞の点状局在が観察された。ＶＬＲ−Ｂ^＋リンパ球は、幼生のフィルター摂食段階では、最終鰓切痕から始まり総排泄腔で終わる、真っ直ぐな管である小腸の上皮では検出されなかった。その長さの大部分において、小腸は、血液で満たされた洞を縁取る造血系統細胞によって主に構成される盲腸の上に、引き伸ばされた馬蹄状に折りたたまれる。ＶＬＲ−Ｂ^＋リンパ球は、盲腸全体に分散することが認められるが、このＶＬＲ−Ｂ^＋リンパ球は、他の組織のＶＬＲ−Ｂ^＋リンパ球よりも、より大きな形態的多様性、および染色強度の変動性を示した（図１７Ａ）。腎臓では、小型のＶＬＲ−Ｂ^＋リンパ球が、他の造血細胞と互いに混じりあい、これらは、腎臓体長のほとんどに亘って広がり、ヤツメウナギ小腸の側壁および背側壁に接する。ＶＬＲ−Ｂ^＋リンパ球は、腎臓のもっとも腹側の面においてもっとも多量であった。陽性染色細胞の密度という点では、鰓がＶＬＲ−Ｂ^＋リンパ球の最大の蓄積を示した。ＶＬＲ−Ｂ^＋細胞は、鰓基部に局在する血管内に特に豊富であった。これらの血管内リンパ球の免疫蛍光染色パターンは、広汎な細胞内ＶＬＲ−Ｂの蓄積を示唆した（図１７Ｂ）。さらに、組織切片におけるＶＬＲ−Ｂ染色は、循環ＶＬＲ−Ｂ抗体の豊富なプールを反映して、血管および洞の内面にそって一貫して明白であったが、血管外の細胞間空間では明白ではなかった。

血液、腎臓、および盲腸から調製したばかりの生細胞縣濁液を染色することによって、ＶＬＲ−Ｂ担持細胞の分布をさらに調べた。免疫蛍光フローサイトメトリーによってリンパ球様細胞を調べるために光散乱特性を用いると、「リンパ球ゲート」における血球の１５−３５％がＶＬＲ−Ｂ^＋であり、腎臓細胞縣濁液では、約５０％がＶＬＲ−Ｂ^＋であり、盲腸では、１５−３０％がＶＬＲ−Ｂ^＋であった（図１７Ｃ）。血液および腎臓のＶＬＲ−Ｂ^＋細胞は、一貫して、比較的高レベルのＶＬＲ−Ｂを発現するが、一方、盲腸のＶＬＲ−Ｂ^＋細胞は、細胞表面ＶＬＲ−Ｂについて、より大きなバラツキ、およびより低いレベルを示した。

ＶＬＲ−Ｂ^＋リンパ球形態および遺伝子発現プロフィール。 「リンパ球ゲート」内のＶＬＲ−Ｂ^＋細胞、およびＶＬＲ−Ｂ⁻細胞を、蛍光活性細胞ソーティングによって単離し、透過型電子顕微鏡検査によって調べた。これらの実験におけるＶＬＲ−Ｂ^＋細胞は、周辺部に集中する圧縮クロマチンであって、比較的少数の、識別可能な小器官、例えば、ミトコンドリアを含む、狭い、細胞原形質辺縁によって囲まれるクロマチンを含む、比較的大型の核を含む点で、有顎脊椎動物の小型リンパ球に近似する。対照的に、「リンパ球ゲート」におけるＶＬＲ−Ｂ⁻細胞の大多数は、血小板状形態、すなわち、深い核裂溝および比較的多量の細胞原形質で特徴づけられる形態を示した（図１７Ｄ）。

さらに、単離されたＶＬＲ−Ｂ^＋およびＶＬＲ−Ｂ⁻細胞集団を用いて、それらの遺伝子発現プロフィールを比較した。この分析では、精製ＶＬＲ−Ｂ^＋細胞は、ＶＬＲ−Ｂ転写物を発現するが、ＶＬＲ−Ａ転写物は発現しないことが判明した。逆に、「リンパ球ゲート」におけるＶＬＲ−Ｂ⁻細胞は、ＶＬＲ−Ａ転写物を発現したが、ＶＬＲ−Ｂ転写物は発現しなかった（図１８）。ヤツメウナギの免疫細胞機能と連結する可能性を有すると、近年知られるようになった遺伝子の発現を比較してみると、ＣＤ４５およびＧＡＴＡは、ＶＬＲ−Ｂ⁻集団において比較的高レベルで発現することが認められたが、一方、ＴＣＲ様、ＣＤ４様、およびＴＮＦＲ１４遺伝子は、ＶＬＲ−Ｂ^＋リンパ球において比較的高レベルで発現された。これらの結果は、ＶＬＲ−Ｂ^＋細胞、およびＶＬＲ−Ａ^＋細胞は、異なるリンパ球集団を代表することを示し、リンパ系細胞は、ＴＣＲ様およびＣＤ４様遺伝子を優先的に発現することを確認し、かつ、ＴＮＦＲ１４遺伝子も、リンパ球によって優先的に発現される可能性のあることを示唆する。

インビボ抗原刺激に対するＶＬＲ−Ｂ^＋リンパ球の反応。 抗原およびフィトマイトジェンのカクテルによってヤツメウナギを免疫化したところ、広汎なリンパ芽球様反応が誘発されることが示された。この種のリンパ芽球様反応は、大用量（＞２μｇ）のａｎｔｈｒａｘ ｅｘｏｓｐｏｒｉｕｍをヤツメウナギ幼生の腹腔内に注入することによって再現された。これらの動物からの血球を、抗ＶＬＲ−Ｂ抗体で染色すると、大型の、リンパ芽球様細胞の多くは、ＶＬＲ−Ｂ^＋であることが認められたが、反面、細胞表面ＶＬＲ−Ｂのレベルは著明に低下した（図１９Ｂ）。この結果から、十分な用量として与えられると、ａｎｔｈｒａｘ ｅｘｏｓｐｏｒｉｕｍは、ヤツメウナギリンパ球のマイトジェンとして作動することが可能であることが示唆された。

特異的抗原反応を細胞レベルで評価するために、ａｎｔｈｒａｘ ｅｘｏｓｐｏｒｉｕｍによる免疫化の前後において、抗原結合細胞の頻度を求めた。これらの実験では、抗原結合ＶＬＲ−Ｂ^＋細胞を検出するために、蛍光標識炭疽菌胞子を用いた。未処置動物では、ＶＬＲ−Ｂ担持細胞の、小さなサブ集団（約１％）が、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓまたはＢ．ｃｅｒｅｕｓ胞子に結合することが認められた一方、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ ｅｘｏｓｐｏｒｉｕｍによる免疫化後、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ結合ＶＬＲ−Ｂ^＋細胞は、４倍の増加が観察されたが（図２０Ａおよび２０Ｂ）、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ結合細胞の頻度は不変であった。

抗原刺激に反応してＶＬＲ−Ｂ抗体を分泌する細胞を特定するために、免疫化ヤツメウナギの細胞の、ＶＬＲ−Ｂ^＋サブ集団、およびＶＬＲ−Ｂ⁻サブ集団を、その光散乱特性に基づいて分離し、ＢｃｌＡ−ＣＴＤ抗原に対するＶＬＲ−Ｂ抗体の分泌能力に関して、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって、それらサブ集団を評価した。血液、腎臓、および盲腸から単離した細胞を１８時間培養し、次いで、ＶＬＲ−Ｂ抗体分泌に関してそれらを評価した。ＢｃｌＡ−ＣＴＤ特異的抗体を分泌する細胞は、もっとも高い前方、側方光散乱特性を有する、ＶＬＲ−Ｂ^＋細胞中にのみ認められた。これは、それらが、比較的大きな細胞形を有することを示す所見である（図２１Ａ）。大型のＶＬＲ−Ｂ生産細胞を、透過型電子顕微鏡検査による評価のために単離すると、多数の小器官を含有する広い細胞原形質、および、粗面小胞体の拡張ネットワークを特徴とする、プラズマ細胞様形態を持つことが判明した（図２１Ｂ）。ａｎｔｈｒａｘ ｅｘｏｓｐｏｒｉｕｍｕに対する典型的反応では、第１回免疫化の４週後、ＶＬＲ−Ｂ抗体分泌細胞は、血液でも、腎臓でももっとも大量となるが、盲腸では比較的少なかった。これらの所見から、有効量の免疫原による免疫化は、抗原特異的リンパ球に作用して、該細胞の、リンパ芽球様形質転換、増殖、および、抗原特異的ＶＬＲ−Ｂ抗体を分泌する、プラズマ様細胞への分化を誘発することが示された。

実施例５ ヤツメウナギは、ウイルス免疫化に反応してＶＬＲ−Ｂ抗体を生産する。

インフルエンザウイルスとして、５０μｌの２／３ＰＢＳに希釈した、２５μｇの、フォルマリン固定インフルエンザウイルスの腹腔内注入によってヤツメウナギを免疫化した。２週後、動物に、同量の免疫原による二次注入を実施した。二次免疫化の２週後、血漿サンプルを収集し、反応性について試験した。

ＰＢＳに希釈した、１０μｇ／ｍＬの、フォルマリンで殺したインフルエンザウイルスをプレートにコートし、４℃で一晩インキュベートしてＥＬＩＳＡを実行した。コントロールとして、精製アデノウイルスを用いてプレートにコートした。次に、プレートを洗浄し、３％ＢＳＡでブロックした。抗ＶＬＲ−Ｂモノクロナール抗体（４Ｃ４）、次いで、酵素接合体を備えた二次抗体を用いて、ＶＬＲ−Ｂ抗体の検出を実行した。

ウイルスの中和活性は、血球凝集抑制アッセイおよびプラーク中和アッセイによって調べた。

図２３に示すように、インフルエンザウイルスによって免疫化されたヤツメウナギは、免疫原に対して特異的なＶＬＲを生産する。

表４は、免疫化および未処置ヤツメウナギの血漿における、インフルエンザウイルス血球凝集の抑制および中和力価を示す。

ＨＩＶウイルスとして、２５μｇ当量のＨＩＶエンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質が投与されるように、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を腹腔内に注入した。この初回免疫化の２週後、動物にブースター免疫を行った。ブースター免疫化の２週後、血漿を収集し、ＨＩＶに対するＶＬＲ−Ｂ抗体の反応性を、ＥＬＩＳＡアッセイによって調べた。

ＥＬＩＳＡのために、１μｇ／ｍＬの、可溶性ｇｐ１２０をプレートにコートし、４℃で一晩インキュベートした。次に、プレートを洗浄し、３％ＢＳＡでブロックした。抗ＶＬＲ−Ｂモノクロナール抗体（４Ｃ４）、次いで、酵素接合体を備えた二次抗体を用いて、ＶＬＲの検出を実行した。

図２４に示すように、ＨＩＶ ＶＬＰによって免疫化されたヤツメウナギは、ＨＩＶエンベロープタンパク質ｇｐ１２０サブユニットに対して特異的な、ＶＬＲ−Ｂ抗体を生産する。

これらの結果から、フォルマリン固定インフルエンザウイルスまたはＨＩＶ ＶＬＰによる免疫化は、ヤツメウナギにおいて強力な免疫反応を誘発し、抗原特異的ＶＬＲ−Ｂ抗体の生産をもたらすことが実証された。インフルエンザの場合、免疫化動物から得られた血漿は、インビトロ実験において、生のインフルエンザウイルスによる赤血球の凝集およびプラーク形成を抑制した。ＶＬＲ−Ｂ抗体反応の標的である、ＨＩＶエンベロープタンパク質のｇｐ１２０サブユニットは、ＣＤ４との相互作用を通じて、ウイルスの宿主細胞への侵入に与る。このため、大型（４００ｋＤａ）の、マルチマーＶＬＲ−Ｂ抗体の、ＨＩＶ ｇｐ１２０との相互作用は、ＨＩＶエンベロープタンパク質のＣＤ４との相互作用を阻止し、したがって、ウイルスの進入を防ぐと考えられる。

本明細書に記載される組成物および方法の範囲または精神から逸脱することなく、各種改変および変更を実行することが可能であることは、当業者には明白であろう。本明細書の考察、および本明細書に開示される組成物および方法の実地施行から、当業者には他の実施態様も明白となろう。

Claims (49)

1. 可溶性モノクロナール抗原特異的ポリペプチドを作製する方法であって：
   ａ．抗原特異的ポリペプチドであって、Ｎ末端ロイシンリッチリピート（ＬＲＲＮＴ）と、一つ以上のロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）と、Ｃ末端ロイシンリッチリピート（ＬＲＣＣＴ）と、アルファヘリックスを含む連結ペプチドとを含む、該抗原特異的ポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを単離すること；
   ｂ．培養媒体において、工程（ａ）のｃＤＮＡクローンで細胞をトランスフェクトすること；および、
   ｃ．該培養媒体から該抗原特異的ポリペプチドを単離すること、
   を含む方法。
2. 前記抗原特異的ポリペプチドが標的タンパク質に結合する、請求項１に記載の方法。
3. 前記抗原特異的ポリペプチドが標的炭水化物に結合する、請求項１に記載の方法。
4. 前記抗原特異的ポリペプチドが標的病原体に結合する、請求項１に記載の方法。
5. 前記ｃＤＮＡクローンを含む安定な細胞系統を生成する工程をさらに含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
6. 請求項１の方法によって作製される、可溶性モノクロナール抗原特異的ポリペプチド。
7. 前記ポリペプチドが、配列番号：５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、および６１から成る群から選ばれるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の、可溶性モノクロナール抗原特異的ポリペプチド。
8. 前記ポリペプチドが、配列番号２０のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の可溶性モノクロナール抗原特異的ポリペプチド。
9. 複数の抗原特異的ポリペプチドを含む多価タンパク質であって、各抗原特異的ポリペプチドが：
   ａ．Ｎ末端ロイシンリッチリピート（ＬＲＲＮＴ）、
   ｂ．一つ以上の、内部のロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）、
   ｃ．Ｃ末端ロイシンリッチリピート（ＬＲＣＣＴ）、および
   ｄ．アルファヘリックスを含む連結ペプチド
   を含む、多価タンパク質。
10. 最大１０個の抗原特異的ポリペプチドを含む、請求項９に記載の多価タンパク質。
11. 前記抗原特異的ポリペプチドが標的タンパク質に結合する、請求項９または１０に記載の多価タンパク質。
12. 前記抗原特異的ポリペプチドが標的炭水化物に結合する、請求項９または１０に記載の多価タンパク質。
13. 前記抗原特異的ポリペプチドが標的病原体に結合する、請求項９または１０に記載の多価タンパク質。
14. 前記抗原特異的ポリペプチドが可溶性である、請求項９または１０に記載の多価タンパク質。
15. 抗原特異的ポリペプチドであって：
    ａ．Ｎ末端ロイシンリッチリピート（ＬＲＲＮＴ）、
    ｂ．一つ以上の、ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）、
    ｃ．Ｃ末端ロイシンリッチリピート（ＬＲＣＣＴ）、および
    ｄ．連結ペプチドであって、該連結ペプチドは、アルファヘリックスを含み、標的炭水化物に特異的に結合する、連結ペプチド
    を含む、抗原特異的ポリペプチド。
16. 前記標的炭水化物が血液型決定基である、請求項１５に記載の抗原特異的ポリペプチド。
17. 前記血液型決定基がＨ決定基である、請求項１６に記載の抗原特異的ポリペプチド。
18. 前記抗原特異的ポリペプチドが、配列番号２０のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の抗原特異的ポリペプチド。
19. 血液型を決定する方法であって：
    ａ．検出可能に標識された請求項１６に記載の抗原特異的ポリペプチドに血液サンプルを接触させること；および、
    ｂ．該血液サンプルにおいて一つ以上の細胞に結合した標識抗原特異的ポリペプチドを検出することを含み、該標識の有無が血液型を示す、方法。
20. 血液型を決定する方法であって：
    ａ．請求項１６に記載の第１抗原特異的ポリペプチドに血液サンプルを接触させることであって、該第１抗原特異的ポリペプチドは、検出可能に第１標識によって標識され、かつ、第１血液決定基に対して特異的であること；
    ｂ．第２抗原特異的ポリペプチドに前記血液サンプルを接触させることであって、該第２抗原特異的ポリペプチドは、検出可能に第２標識によって標識され、かつ、第２血液決定基に対して特異的であること；および、
    ｃ．該血液サンプルにおいて一つ以上の細胞に結合する、標識第１および第２抗原特異的ポリペプチドを検出することを含み、前記第１および第２標識の有無が血液型を示す、方法。
21. 請求項１５に記載の抗原特異的ポリペプチドを作製する方法であって：
    ａ．ヤツメウナギまたはヌタウナギに前記標的炭水化物を投与すること；
    ｂ．該ヤツメウナギまたはヌタウナギのリンパ球から抗原特異的タンパク質をコードするＲＮＡを単離すること；
    ｃ．工程（ｂ）の該単離ＲＮＡから、抗原特異的タンパク質をコードするｃＤＮＡを増幅すること；
    ｄ．工程（ｃ）の該ｃＤＮＡを発現ベクターにクローンすること；
    ｅ．該発現ベクターで形質転換した宿主細胞において工程（ｄ）のｃＤＮＡを発現させること；
    ｆ．工程（ｅ）のｃＤＮＡクローンを単離すること；
    ｇ．工程（ｆ）のｃＤＮＡクローンで培養細胞をトランスフェクトすること；
    ｈ．該標的炭水化物に対する結合能力に関して培養上清をスクリーニングすること；および、
    ｉ．該上清から、該標的炭水化物に結合する該抗原特異的タンパク質を単離すること、を含む方法。
22. 請求項２１に記載の方法によって作製される、抗原特異的タンパク質。
23. 請求項２２に記載の抗原特異的タンパク質をコードする核酸。
24. 請求項２３に記載の核酸を含む発現ベクター。
25. 請求項２４に記載の発現ベクターを含む培養細胞。
26. 抗原特異的ポリペプチドであって：
    ａ．Ｎ末端ロイシンリッチリピート（ＬＲＲＮＴ）、
    ｂ．一つ以上の、ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）、
    ｃ．Ｃ末端ロイシンリッチリピート（ＬＲＣＣＴ）、および
    ｄ．連結ペプチドであって、該連結ペプチドは、アルファヘリックスを含み、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓの細胞表面ポリペプチドに特異的に結合する、連結ペプチド
    を含む、抗原特異的ポリペプチド。
27. 前記Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓの細胞表面ポリペプチドがＢｃｌＡである、請求項２６に記載の抗原特異的ポリペプチド。
28. 前記結合ポリペプチドが、配列番号：５、２２、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、および６１から成る群から選ばれるアミノ酸配列を有する、請求項２６に記載の抗原特異的ポリペプチド。
29. サンプルにおいてＢａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓの存在を検出する方法であって：
    ａ．検出可能に標識された請求項２６または２７に記載の抗原特異的ポリペプチドに、該サンプルを接触させること；および、
    ｂ．該サンプルに結合した標識抗原特異的ポリペプチドを検出することを含み、該標識の存在は、該サンプルにおけるＢａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓの存在を示す、方法。
30. 対象においてＢａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓの病原性を低減させる方法であって、該対象に、請求項２６に記載の抗原特異的ポリペプチドを投与することを含む、方法。
31. 請求項２６または２７に記載の抗原特異的ポリペプチドを作製する方法であって：
    ａ．該細胞表面Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓポリペプチドを、ヤツメウナギまたはヌタウナギに投与すること；
    ｂ．該ヤツメウナギまたはヌタウナギのリンパ球から抗原特異的タンパク質をコードするＲＮＡを単離すること；
    ｃ．工程（ｂ）の該単離ＲＮＡから、抗原特異的タンパク質をコードするｃＤＮＡを増幅すること；
    ｄ．工程（ｃ）の該ｃＤＮＡを発現ベクターにクローンすること；
    ｅ．該発現ベクターで形質転換した宿主細胞において工程（ｄ）のｃＤＮＡを発現させること；
    ｆ．工程（ｅ）のｃＤＮＡクローンを単離すること；
    ｇ．工程（ｆ）のｃＤＮＡクローンで培養細胞をトランスフェクトすること；
    ｈ．該細胞表面Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓポリペプチドに対する結合能力に関して培養上清をスクリーニングすること；および、
    ｉ．該上清から、該細胞表面Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓポリペプチドに結合する該抗原特異的タンパク質を単離すること、
    を含む方法。
32. 請求項２６に記載の抗原特異的ポリペプチドをコードする核酸。
33. 請求項３２に記載の核酸を含む発現ベクター。
34. 請求項３３に記載の発現ベクターを含む培養細胞。
35. 抗原特異的ポリペプチドであって：
    ａ．Ｎ末端ロイシンリッチリピート（ＬＲＲＮＴ）、
    ｂ．一つ以上のロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）、
    ｃ．Ｃ末端ロイシンリッチリピート（ＬＲＣＣＴ）、および
    ｄ．連結ペプチドであって、該連結ペプチドは、アルファヘリックスを含み、ウイルス抗原に特異的に結合する、連結ペプチド、
    を含む、抗原特異的ポリペプチド。
36. 前記ウイルス抗原がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である、請求項３５に記載の抗原特異的ポリペプチド。
37. 前記ウイルス抗原が、ＨＩＶエンベロープタンパク質ｇｐ１２０である、請求項３５に記載の抗原特異的ポリペプチド。
38. 前記ウイルス抗原がインフルエンザである、請求項３５に記載の抗原特異的ポリペプチド。
39. サンプルにおいてウイルスの存在を検出する方法であって：
    ａ．検出可能に標識された請求項３５に記載の抗原特異的ポリペプチドに、該サンプルを接触させること；および、
    ｂ．該サンプルに結合する標識抗原特異的ポリペプチドを検出することを含み、該標識の存在は、該サンプルにおける該ウイルスの存在を示す、方法。
40. 対象においてウイルスの病原性を低減させる方法であって、該対象に、請求項３５に記載の抗原特異的ポリペプチドを投与することを含む方法。
41. 請求項３５に記載の抗原特異的ポリペプチドを作製する方法であって：
    ａ．ヤツメウナギまたはヌタウナギに前記ウイルス抗原を投与すること；
    ｂ．前記ヤツメウナギまたはヌタウナギのリンパ球から抗原特異的タンパク質をコードするＲＮＡを単離すること；
    ｃ．工程（ｂ）の単離ＲＮＡから、抗原特異的タンパク質をコードするｃＤＮＡを増幅すること；
    ｄ．工程（ｃ）のｃＤＮＡを発現ベクターにクローンすること；
    ｅ．該発現ベクターによって形質転換した宿主細胞において工程（ｄ）のｃＤＮＡを発現させること；
    ｆ．工程（ｅ）のｃＤＮＡクローンを単離すること；
    ｇ．工程（ｆ）のｃＤＮＡクローンで培養細胞をトランスフェクトすること；
    ｈ．該ウイルス抗原に対する結合能力に関して該培養上清をスクリーニングすること；および、
    ｉ．該上清から、該ウイルス抗原に結合する該抗原特異的タンパク質を単離すること、を含む方法。
42. 請求項３５に記載の抗原特異的タンパク質をコードする核酸。
43. 請求項４２に記載の核酸を含む発現ベクター。
44. 請求項４３に記載の発現ベクターを含む培養細胞。
45. 抗原特異的ポリペプチドに選択的に結合する抗体であって：
    ａ．Ｎ末端ロイシンリッチリピート（ＬＲＲＮＴ）、
    ｂ．一つ以上のロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）、
    ｃ．Ｃ末端ロイシンリッチリピート（ＬＲＣＣＴ）、および
    ｄ．アルファヘリックスを含む連結ペプチド
    を含む、抗体。
46. 前記抗体が検出可能成分によって標識される、請求項４５に記載の抗体。
47. 前記抗体が４Ｃ４または６Ｃ３である、請求項４５または４６に記載の抗体。
48. 抗原特異的ポリペプチドを作製する方法であって：
    ａ．ヤツメウナギまたはヌタウナギに標的抗原を投与すること；
    ｂ．該ヤツメウナギまたはヌタウナギのリンパ球から抗原特異的タンパク質をコードするＲＮＡを単離すること；
    ｃ．工程（ｂ）の単離ＲＮＡから、抗原特異的タンパク質をコードするｃＤＮＡを増幅すること；
    ｄ．工程（ｃ）のｃＤＮＡを発現ベクターにクローンすること；
    ｅ．該発現ベクターで形質転換した宿主細胞において工程（ｄ）のｃＤＮＡを発現させること；
    ｆ．工程（ｅ）のｃＤＮＡクローンを単離すること；
    ｇ．工程（ｆ）のｃＤＮＡクローンで培養細胞をトランスフェクトすること；
    ｈ．該抗原に対する結合能力に関して培養上清をスクリーニングすること；および、
    ｉ．該上清から、該抗原に結合する該抗原特異的タンパク質を単離すること、
    を含む方法。
49. 前記抗原が、タンパク質、病原体、炭水化物、脂質、糖脂質、および糖タンパク質から成る群から選ばれる、請求項４８に記載の方法。

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