KR20160147787A - 인간화 가변 림프구 수용체（ｖｌｒ） 및 이와 관련된 조성물 및 용도 - Google Patents

인간화 가변 림프구 수용체（ｖｌｒ） 및 이와 관련된 조성물 및 용도 Download PDF

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에모리 유니버시티
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Abstract

본 발명은 표적 분자에 특이적으로 결합하는 그러한 서열을 포함하는 인간화 서열 및 폴리펩티드와 같은 가변 림프구 수용체 (VLR) 변형 및 이와 관련된 용도에 관한 것이다. 특정한 실시 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 재조합 폴리펩티드 VLR 및 이의 변이체에 관한 것이다. 특정한 실시 양태에서, 본 발명은 질환 또는 병태의 치료 또는 예방에 관한 것으로서, 이는 본원에 개시된 재조합 폴리펩티드 또는 변이체의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

Description

인간화 가변 림프구 수용체（ＶＬＲ） 및 이와 관련된 조성물 및 용도{HUMANIZED VARIABLE LYMPHOCYTE RECEPTORS (VLR) AND COMPOSITIONS AND USES RELATED THERETO}
미국 연방 정부에 의해 재정 지원된 연구에 관한 진술
본 발명은 미국 국립 보건원 (National Institutes of Health)에 의해 수여되는 보조금 5R01A1072435 하의 정부 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 있어서 특정한 권리를 갖는다.
관련 출원과의 상호 참조
본 출원은 그 전체가 본원에 참고로 포함된, 2014년 5월 2일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/987,566호의 우선권을 주장한다.
면역의 연구는 척추동물에 있어서 2가지 유형의 적응 면역계 (adaptive immune system; AIS)의 출현을 지시한다. 인간은 주로 Ig V- (D)-J 유전자 절편 (gene segment)의 조립 (assembly) 및 체세포 과돌연변이에 의해 광대한 레퍼토리 (repertoire)의 Ig-도메인-기반의 T- 및 B-세포 항원 수용체를 생성한다. 칠성장어 (lamprey) 및 먹장어는 가변 림프구 수용체 (variable lymphocyte receptors; VLRs)를 기반으로 하는 대안적인 AIS를 갖는데, 이의 다양성은 류신-풍부 반복 (류신-rich repeat; LRR) 카세트로부터 생성된다. 조합적 VLR 조립은 다양성 면에서 인간 면역글로불린에 비견되는 광대한 레퍼토리의 수용체를 생성할 수 있다. 문헌[Han et al. Antigen recognition by variable lymphocyte receptors, Science, 2008 321:1834-183]; 문헌[Hirano et al., The evolution of adaptive immunity in vertebrates, Adv Immunol, 2011, 109:125-57]; 국제 공개 제2013/078425호; 미국 특허 공개 제2011/0230374호; 국제 공개 제2010/065407호; 및 국제 공개 제2008/016854호를 참조한다. 구오 (Guo) 등은 칠성장어에서의 적응 면역계를 보고한다. 문헌[Nature, 2009, 459 (7248):796-80]. 타수미 (Tasumi) 등은 고 친화성 칠성장어 VLRA 및 VLRB 단클론 항체를 보고한다. 문헌[Proc Natl AcadSci U S A, 2009, 106 (31):12891-6]. 나카하라 (Nakahara) 등은 칠성장어 이디오토프 (idiotope)-특이적 항체를 이용한 만성 림프구성 백혈병의 모니터링을 보고한다. 문헌[Cancer Immunol Res, 2013, 1 (4):223-228].
빈즈 (Binz) 등은 비-면역글로불린 도메인으로부터의 결합 단백질의 엔지니어링 (engineering)을 보고한다. 문헌[Nat Biotechnol., 2005, 23 (10):1257-68].
리 (Lee) 등은 모듈 엔지니어링 (module engineering)에 의한 무턱 척추 동물의 가변 림프구 수용체를 기반으로 하는 결합 스캐폴드 (scaffold)를 보고한다. 문헌[Proc Natl AcadSci U S A, 2012,109 (9):3299-304].
본원에 인용된 참고 문헌은 종래 기술을 인정하는 것이 아니다.
본 발명은 표적 분자에 특이적으로 결합하는 그러한 서열을 포함하는 인간화 서열 및 폴리펩티드와 같은 가변 림프구 수용체 (VLR) 변형 및 이와 관련된 용도에 관한 것이다. 특정한 실시 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 재조합 폴리펩티드 VLR 및 이의 변이체에 관한 것이다. 특정한 실시 양태에서, 본 발명은 질환 또는 병태의 치료 또는 예방에 관한 것으로서, 이는 본원에 개시된 재조합 폴리펩티드 또는 변이체의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 인간 세포, 예컨대 형질 세포, B-세포, 또는 T-세포에 특이적으로 결합하는 재조합 폴리펩티드 VLR에 관한 것이다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 인간화 아미노산 서열을 포함하도록 임의로 변형된 가변 림프구 수용체에 인간 항체 Fc 서열을 콘쥬게이션시키는 (conjugating) 것에 관한 것이다. 특정한 실시 양태에서, 본 발명은 무턱 척추 동물의 가변 림프구 수용체 (VLR)로부터의 아미노산 위치를 류신-풍부 반복 (LRR) 서열을 포함하는 인간 단백질에 그래프팅시키는 (grafting) 것에 관한 것이다. 특정한 실시 양태에서, 본 발명은 인간 유사 서열이 풍부화된 가변 림프구 수용체 서열에 대하여 유사성을 갖는 단백질 디스플레이 라이브러리 (display library)를 생성하고, 치료 응용에서 사용하기 위한 양립가능한 그 안의 서열을 확인하는 것에 관한 것이다. 특정한 실시 양태에서, 변형된 인간화 서열은 인간 면역계의 이펙터 (effector) 기능을 활성화하기에 충분한, Fc 수용체 및 보체에 의해 인식되는 인간 항체 Fc 서열에 콘쥬게이션된다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 분자에 결합하는 무턱 척추 동물의 가변 림프구 수용체 (VLR)의 아미노산 서열을 제공하는 단계; 가변 림프구 수용체에서의 어떠한 아미노산이 결합된 분자에 가장 가까운 공간적 근접 상태로 있고/있거나 이온 상호작용, 및/또는 수소 결합을 제공하고/하거나 결합된 분자에 반 데르 발스 (Van der Waals) 힘을 제공하여 가변 림프구 수용체에서의 표적 아미노산을 제공하는지를 추정하는 단계; 가변 림프구 수용체 (VLR) 아미노산 서열에 대하여 20, 25 또는 30% 초과의 또는 이보다 더 큰 서열 동일성을 갖는 공지된 인간 아미노산 서열을 제공하는 단계; 공지된 인간 아미노산 서열 내에서 가변 림프구 수용체에서의 상기 표적 아미노산 및 표적 아미노산을 둘러싸고 있는 충분한 수의 아미노산을 대체하여 분자에 특이적으로 결합하도록 구성된 변형된 인간 아미노산 서열을 제공하는 단계; 및 재조합 핵산으로부터의 변형된 인간 아미노산 서열을 발현시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 만들어진, 분자에 특이적으로 결합하는 단리된 변형 인간 아미노산 서열에 관한 것이다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 방법에 의해 만들어진 변형된 공지된 인간 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다. 특정한 실시 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 방법에 의해 만들어진 변형된 공지된 인간 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 발현 시스템에 관한 것이다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은, 본원에 개시된 변형된 인간 아미노산 서열 및 인간 Fc 서열 또는 이의 단편을 포함하는 융합 단백질에 관한 것으로서, 이는 적응 면역 기능을 도입할 수 있다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은
Figure pct00001
(서열 번호 38)를 포함하는 재조합 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서, 각각의 위치의 X는 개별적으로 그리고 독립적으로 임의의 아미노산이되, 단, 폴리펩티드는 (서열 번호 16)
Figure pct00002
, 및 (서열 번호 17)
Figure pct00003
로부터 선택되는 하기 야생형 Slit2-D2 서열 중 적어도 하나를 함유하지 않는다. 특정한 실시 양태에서, 재조합 폴리펩티드는 인간 Fc 서열을 추가로 포함한다. 특정한 실시 양태에서, 재조합 폴리펩티드는 서열 (서열 번호 66),
Figure pct00005
(서열 번호 67), 또는
Figure pct00006
(서열 번호 68)를 갖는다. 특정한 실시 양태에서, 재조합 폴리펩티드는 형질 세포에는 특이적으로 결합할 수 있지만 B 세포에는 그렇지 않다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 서열 번호 56의 MM3 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 재조합 폴리펩티드에 관한 것이다. 특정한 실시 양태에서, 본 발명은 이 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다. 특정한 실시 양태에서, 본 발명은 이 벡터를 포함하는 발현 시스템에 관한 것이다.
도 1은 VLR을 위한 인간화 스캐폴드로서의 인간 Slit2-D2를 도시한다. Slit2 (Slit-D2)의 제2 VLR-유사 RRR 도메인은 그의 리간드인 Robo1과 함께 동시 결정화되었는데, 상기 Robo1은 항원이 VLR에 결합하는 것과 동일한 방식으로 오목한 표면의 베타-가닥에 결합한다.
도 2는 상당한 중첩을 나타내는 VLR과 Slit2-D2의 정렬을 도시한다.
도 3은 칠성장어 VLRB 항체 및 인간 LRR 수용체의 삼차 구조를 도시한다. (좌측) 바실루스 안트라시스 (Bacillus anthracis) (VLR4) 및 에이치 트리사카라이드 (H trisaccharide) (RBC36)에 특이적인 칠성장어 VLRB 클론의 삼차 구조. (우측) 인간은 칠성장어 VLRB와 유사한 삼차 구조를 갖는 많은 류신-풍부 반복 수용체를 발현한다. 예를 들어, Slit-D2, CD42b, 및 Nogo-66 수용체는 평행 베타-시트로 구성된 오목한 표면을 포함하는, VLRB와 동일한 초승달형을 갖는다.
도 4는 VLRB 특이성의 인간 면역 이펙터 기작에의 커플링을 도시한다. (좌측) 인간 IgG1 항체는 3개의 불변 도메인 (CH1-CH3) 및 1개의 가변 도메인 (VH)을 갖는 중쇄와, 1개의 불변 도메인 (CL) 및 1개의 가변 도메인 (VL)을 갖는 경쇄로 구성된다. 가변 도메인은 항원 결합에 책임이 있는 반면, CH2 및 CH3 도메인은 보체-의존성 세포독성 (complement-dependent cytotoxicity; CDC), 항체-의존성 세포 독성 (antibody-dependent cellular cytotoxicity; ADCC), 및 대식세포에 의한 항체-코팅된 세포의 포식 작용 (phagocytosis) (Mφ)을 포함하는 면역 이펙터 기능에 항체를 연결시키는 기능을 한다. 또한 중쇄 불변 영역은 FcRn과의 상호작용에 의해 순환 중 항체의 반감기를 향상시키는데, 이는 엔도좀 (endosome)으로부터의 항체를 재활용한다. (우측) IgG1의 CH2 및 CH3 도메인에의 VLRB 가변 도메인의 융합은 VLRB 특이성을 인간 면역 제거 기작에 커플링시킨다.
도 5는 포유류 발현 벡터를 도시한다.
도 6은 인간화 RB36이 H-트리사카라이드에 결합하는 것을 나타내는 데이터를 도시한다. 인간 Slit2-D2 야생형 (좌측), 칠성장어 RBC36 VLR (중앙) 및 SLIT2-RBC36 돌연변이체 (우측)는 H-트리사카라이드를 발현하도록 엔지니어링된 CHO 세포의 염색에 사용되는 그리고 HEK-293T 세포로부터 분비되는 IgG1-Fc 융합 단백질로서 발현되었다. 회색 음영은 미염색 세포를 나타내며, 선은 융합 단백질에 의한 염색을 나타낸다.
도 7은 칠성장어 VLRB 단클론 항체 (RBC36)의 서열 (서열 번호 73)을 도시한다. 인간 Slit2-D2는 4개의 VLR-유사 LRR 도메인을 포함하며, Slit2의 제2 도메인 (Slit-D2)의 결정 구조가 풀렸는데, 이는 칠성장어 VLRB와의 구조 비교를 허용하였다. RBC36이 그의 항원, H-트리사카라이드와 복합체 상태로 있는 것의 구조가 결정되었다. 상기 항원과 접촉하는 잔기를 회색 음영 처리된 박스로 나타낸다. Slit2-D2에는 VLRB에 존재하고 항원-결합 부위의 일부를 형성하는 LRRCT 가변 삽입 루프가 결여되어 있지만, 상기 서열은 서열 번호 1에 제공된 Slit2-D2의 위치들 내로 회색 박스 내의 잔기를 삽입하는 것을 허용한다.
도 8은 서열 번호 1 (쿼리 (query))과 Slit2-D2 (대상)의 절편, 호모 사피엔스 (homo sapiens) (서열 번호 72)의 비교를 도시한다.
VLR MM3을 나타내는 도 9의 데이터는 인간 형질 세포-특이적이다. MM3은 인간 형질 세포에는 결합하지만 배 중심(germinal center) 및 기억 B 세포를 포함하는 다른 B 계열 세포에는 결합하지 않는다.
도 10은 인간 골수에서 형질 세포의 하위집단 (subpopulation)에서 관찰되는 고밀도 표면 염색에 대한 데이터를 도시한다.
도 11은 VLR 항원-접촉 아미노산 잔기의 특징을 도시한다. 전체 VLR에서 발견되는 총 아미노산에 비하여 접촉 잔기에서의 각각의 아미노산의 과다 사용 또는 과소 사용.
도 12는 칠성장어 MM3 VLR mAB의 LRRVe 및 LRRCP 도메인 (서열 번호 69의 부분 서열), 인간 Slit2-D2 (서열 번호 70의 부분 서열) 및 합쳐진 서열 (huMM3-1) (서열 번호 71)의 인간화 Slit-MM3 서열 정렬을 도시한다. 회색 박스에는 칠성장어 MM3 유래의 가변 아미노산 잔기가 강조되어 있다.
도 13은 LRRCT 루프들의 비교를 도시한다.
본 발명을 더욱 상세하게 기술하기 전에, 본 발명은 기술된 특정 실시 양태에 한정되지 않으며, 따라서 물론 변할 수 있음이 이해되어야 한다. 본 발명의 범주가 첨부된 청구범위에 의해서만 한정되기 때문에, 본원에서 사용되는 용어는 특정 실시 양태를 설명하기 위한 목적만을 위한 것으로서, 한정하고자 하는 것은 아님이 또한 이해되어야 한다.
달리 정의되지 않으면, 본원에서 사용되는 모든 기술적 용어 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 이와 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에서 또한 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 이제 기술된다.
본 명세서에서 인용되는 모든 간행물 및 특허는 마치 개별 간행물 또는 특허가 특정하게 그리고 개별적으로 참고로 포함되는 것으로 지시되는 것처럼 본원에 참고로 포함되며, 인용된 간행물과 관련하여 방법 및/또는 재료를 개시하고 설명하도록 본원에 참고로 포함된다. 임의의 간행물의 인용은 출원일 전 그의 개시를 위한 것이며, 본 발명이 종래의 개시 내용에 의해서 그러한 간행물에 선행한다는 자격이 주어지는 것이 아님을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 또한, 제공된 공개일은 독립적으로 확인될 필요가 있을 수 있는 실제 공개일과는 상이할 수 있다.
이러한 개시 내용을 읽을 시에 당업자에게 명백한 바와 같이, 본원에 기술되고 예시된 개별 실시 양태 각각은 본 발명의 범주 도는 사상으로부터 벗어나지 않고서 임의의 다른 몇몇 실시 양태의 특징으로부터 쉽게 분리되거나 상기 특징과 쉽게 조합될 수 있는 별개의 구성요소 및 특징을 갖는다. 임의의 인용된 방법이 인용된 이벤트(event)의 순서대로 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서대로 실시될 수 있다.
본 발명의 실시 양태는, 달리 지시되지 않으면, 면역학, 의학, 유기 화학, 생화학, 분자 생물학, 약리학, 생리학 등의 기술을 이용하는데, 이는 본 기술 분야의 기술 내에 있다. 그러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수형 ("a", "an" 및 "the")은 그 문맥이 명백히 달리 기술하지 않으면 복수형 지시 대상을 포함함이 주지되어야 한다. 본 명세서에서 그리고 이어지는 청구범위에서, 많은 용어에 대하여 언급되는데, 이는 반대의 의도가 명백하지 않으면 하기 의미를 갖도록 정의될 것이다.
다양한 실시 양태를 설명하기 전에, 하기 정의가 제공되며, 달리 지시되지 않으면 이것이 사용되어야 한다.
"단백질" 및 "폴리펩티드"라는 용어는 펩티드 결합을 통하여 연결된 아미노산들을 포함하는 화합물을 나타내며, 이는 상호교환가능하게 사용된다. 특정한 실시 양태에서, N-말단은 1개 이상의 아세틸 또는 알카노일 기로 치환될 수 있으며, C-말단은 아미드일 수 있다.
폴리펩티드와 관련하여 사용될 때, "변이체" 및 "돌연변이체"라는 용어는 1개 이상의 아미노산이 또 다른, 일반적으로 관련된 폴리펩티드와는 상이한 아미노산 서열을 나타낸다. 변이체는 "보존적" 변화를 가질 수 있으며, 여기서, 치환된 아미노산은 유사한 구조적 또는 화학적 특성을 갖는다. 보존적 아미노산 치환들 중 1가지의 유형은 유사한 측쇄를 갖는 잔기들의 상호교환가능성을 나타낸다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산의 군으로는 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신이 있으며; 지방족-히드록실 측쇄를 갖는 아미노산의 군으로는 세린 및 트레오닌이 있으며; 아미드-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 군으로는 아스파라긴 및 글루타민이 있으며; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산의 군으로는 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이 있으며; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산의 군으로는 라이신, 아르기닌 및 히스티딘이 있으며, 황-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 군으로는 시스테인 및 메티오닌이 있다. 바람직한 보존적 아미노산 치환기로는 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 라이신-아르기닌, 알라닌-발린 및 아스파라긴-글루타민이 있다. 더욱 드물게는, 변이체는 "비-보존적" 변화 (예를 들어, 트립토판에 의한 글리신의 대체)를 가질 수 있다. 유사한 사소한 변이는 또한 아미노산 결실 또는 삽입 (환언하면, 부가), 또는 이들 둘 모두를 포함할 수 있다. 어떠한 그리고 얼마나 많은 아미노산 잔기가 생물학적 활성을 무효화하지 않고서 치환되거나, 삽입되거나 결실될 수 있는지를 결정하는 데 있어서의 가이던스(guidance)는 본 기술 분야에 잘 알려진 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 DNAStar 소프트웨어를 이용하여 발견될 수 있다. 변이체는 기능 분석에서 시험될 수 있다. 바람직한 변이체는 10% 미만, 그리고 바람직하게는 5% 미만, 그리고 더욱 더 바람직하게는 2% 미만의 변화를 갖는다 (치환이든지, 결실이든지 간에, 그리고 기타 등등).
"핵산"이라는 용어는 뉴클레오티드의 중합체, 또는 폴리뉴클레오티드를 나타내며, 이는 상기에 기술된 바와 같다. 상기 용어는 단일 분자, 또는 분자들의 콜렉션(collection)을 표기하는 데 사용된다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으며, 코딩 영역과, 다양한 제어 요소의 영역을 포함할 수 있고, 이는 하기에 기술된 바와 같다.
특정한 폴리펩티드를 "코딩하는 핵산 서열"이라는 용어는 유전자의 코딩 영역을 포함하는 핵산 서열 또는 환언하면 유전자 생성물을 코딩하는 핵산 서열을 나타낸다. 코딩 영역은 cDNA, 게놈 DNA 또는 RNA 형태로 존재할 수 있다. DNA 형태로 존재할 때, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 단일 가닥 (즉, 센스(sense) 가닥) 또는 이중 가닥일 수 있다. 적합한 제어 요소, 예컨대 인핸서(enhancer)/프로모터(promoter), 스플라이스 접합부 (splice junction), 폴리아데닐화 시그널 (polyadenylation signal) 등은 필요할 경우 유전자의 코딩 영역에 근접하여 위치하여 적당한 전사 개시 및/또는 일차 RNA 전사체의 올바른 프로세싱 (processing)을 가능하게 할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 발현 벡터에서 이용되는 코딩 영역은 내인성 인핸서/프로모터, 스플라이스 접합부, 개재 서열, 폴리아데닐화 시그널 등, 또는 내인성 제어 요소와 외인성 제어 요소 둘 모두의 조합을 포함할 수 있다.
특정한 실시 양태에서, 서열 "동일성"은 동일한 위치의 수를 더 큰 가장 짧은 서열, 또는 오버행(overhang)을 배제한 등가의 위치들의 수 (여기서, 내부 갭은 등가의 위치로서 카운팅됨)로 나눈 것을 사용하여 계산된, 서열 정렬의 두 서열들 사이의 서열 정렬에서의 정확하게 매칭되는(matching) 아미노산의 수 (백분율로 표현됨)를 나타낸다. 예를 들어, 폴리펩티드 GGGGGG 및 GGGGT는 5개 중 4개의 또는 80%의 서열 동일성을 갖는다. 예를 들어, 폴리펩티드 GGGPPP 및 GGGAPPP는 7개 중 6개 또는 85%의 서열 동일성을 갖는다. 특정한 실시 양태에서, 본원에서 표현되는 서열 동일성의 임의의 인용은 서열 유사성 대신 사용될 수 있다. "유사성" 퍼센트는 상기 정렬의 두 서열들 사이의 유사성을 정량화하는 데 사용된다. 이러한 방법은 특정한 아미노산들이 매치를 갖도록 동일할 필요는 없는 것을 제외하고는 동일성을 결정하는 것과 동일하다. 아미노산들은, 이들이 하기 아미노산 군에 따라 유사한 특성을 갖는 군 사이에 있을 경우 매치로서 분류된다: 방향족 - F Y W; 소수성-A V I L; 양으로 하전됨: R K H; 음으로 하전됨 - D E; 극성 - S T N Q.
본원에서 사용되는 바와 같이, "콘쥬게이트"라는 용어는 공유 결합에 의한 2개의 분자 엔티티(entity)의 연결을 나타낸다. 분자 엔티티는 표준 합성 커플링 절차를 이용하여 연결 기들을 통하여 또는 직접적으로 공유 결합될 수 있다. 예를 들어, 두 펩티드는 동시 폴리펩티드 발현에 의해 함께 연결될 수 있으며, 이는 전형적으로 융합 또는 키메라 단백질로 칭해진다. 1개 이상의 아미노산이 상응하는 핵산 서열의 발현 벡터 내로의 포함에 의해 연결 기로서 폴리펩티드 내에 삽입될 수 있다. 다른 고려되는 연결 기는 각각 카르복실산 또는 아미노 기를 포함하는 아미노산 측쇄를 갖는 단백질과의 아미드 커플링을 허용하기 위하여 아미노 또는 카르복실산 기로 말단 치환된 탄화수소 또는 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 대안적으로 아미노 및 카르복실산 기는 트리아졸의 구리 촉매작용된 형성을 겪는 알킬렌 및 아지드와 같은 다른 결합 파트너(partner)로 치환될 수 있다. 또 다른 콘쥬게이션의 예에서, 폴리펩티드는 티올 기를 함유하는 자연 발생 또는 자연 비발생 아미노산을 함유하도록 발현된다. 티올 기는 카르복실산과의 커플링 반응에서 아미노기 대신 사용될 수 있거나, 2개의 티올 기는 산화 조건에 노출될 때 반응하여 디술피드를 형성한다.
핵산 분자와 관련하여 이루어질 때 "재조합"이라는 용어는 분자 생물학적 기술에 의해 함께 연결되는 핵산의 절편들로 이루어진 핵산 분자를 나타낸다. 단백질 또는 폴리펩티드와 관련하여 이루어질 때 "재조합"이라는 용어는 재조합 핵산 분자를 이용하여 발현되는 단백질 분자를 나타낸다.
"벡터" 또는 "발현 벡터"라는 용어는 특별한 숙주 유기체 또는 발현 시스템, 예를 들어 세포에서 또는 무세포 상태에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 적절한 핵산 서열 및 요망되는 코딩 서열을 포함하는 재조합 핵산을 나타낸다. 원핵 생물에서의 발현에 필요한 핵산 서열은 일반적으로 프로모터, 오퍼레이터 (임의적), 및 리보좀 결합 부위를, 흔히 다른 서열과 함께 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 인핸서, 및 종결 및 폴리아데닐화 시그널을 이용하는 것으로 공지되어 있다.
단백질 "발현 시스템"은 생체 내 (in vivo) 및 시험관 내 (in vitro) (무세포) 시스템을 나타낸다. 재조합 단백질 발현을 위한 시스템은 전형적으로, 주형을 포함하는 DNA 발현 벡터에 의해 형질감염되는 세포를 이용한다. 세포는 세포가 요망되는 단백질을 번역하도록 하는 조건 하에서 배양된다. 발현된 단백질은 후속적인 정제를 위하여 추출된다. 원핵 및 진핵 세포를 사용하는 생체 내 단백질 발현 시스템이 잘 알려져 있다. 또한, 일부 단백질은 변성제 및 단백질-재폴딩 절차를 이용하여 회수된다. 시험관 내 (무세포) 단백질 발현 시스템은 전형적으로 전체 세포의 번역-양립가능 추출물 또는 전사, 번역 및 임의로 번역 후 변형에 충분한 성분, 예컨대 RNA 폴리머라아제, 조절 단백질 인자, 전사 인자, 리보좀, tRNA 보조 인자, 아미노산 및 뉴클레오티드를 함유하는 조성물을 이용한다. 발현 벡터의 존재 하에, 이러한 추출물 및 성분은 관심 대상의 단백질을 합성한다. 전형적으로 무세포 시스템은 프로테아제를 함유하지 않으며 변형 아미노산을 이용한 단백질의 표지를 가능하게 한다. 일부 무세포 시스템은 번역을 위한 코딩된 구성요소를 발현 벡터 내에 포함시켰다. 예를 들어, 문헌[Shimizu et al., Cell-free translation reconstituted with purified components, 2001, Nat. Biotechnol., 19, 751-755] 및 문헌[Asahara& Chong, Nucleic Acids Research, 2010, 38 (13): e141]을 참조하는데, 이들 둘 모두는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
"선발가능한 마커"는 인공적인 선발 또는 확인에 적합한 형질을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 벡터 내에 도입되는 핵산이며, 예를 들어, 베타-락타마아제는 항생제 내성을 부여하는데, 이는 베타-락타마아제를 발현하는 유기체가 성장 배지 중 항생제의 존재 하에 생존하게 한다. 또 다른 예로는 티미딘 키나아제가 있는데, 이는 숙주가 간시오클로비르(ganciclovir) 선발에 대하여 민감하게 만든다. 이것은 예상되는 색의 존재 또는 부재를 기반으로 하여 원하는 세포와 원하지 않는 세포를 구별하게 하는 스크리닝가능한 마커일 수 있다. 예를 들어, lac-z-유전자는 X-gal (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드)의 존재 하에 청색을 부여하는 베타-갈락토시다아제 효소를 생성한다. 재조합적 삽입이 lac-z-유전자를 불활성화시킨다면, 생성된 콜로니는 무색이다. 1가지 이상의 선발가능한 마커, 예를 들어 발현 유기체가 그의 성장에 요구되는 특정 화합물을 합성하지 못하는 것 (영양 요구성)을 보완할 수 있는 효소 및 화합물을 성장에 독성인 또 다른 것으로 전환시킬 수 있는 것이 있을 수 있다. 오로티딘-5' 포스페이트 데카르복실라아제인 URA3은 우라실 생합성에 필요하며, 우라실에 대하여 영양 요구성인 ura3 돌연변이체를 보완할 수 있다. 또한 URA3은 5-플루오로오로트산을 독성 화합물 5-플루오로우라실로 전환시킨다. 추가의 고려되는 선발가능한 마커는 항균제 내성을 부여하거나 형광 단백질을 발현하는 임의의 유전자를 포함한다. 예는 하기 유전자를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다: ampr, camr, tetr, 블라스티시딘(blasticidin)r, neor, hygr, abxr, 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 제II형 유전자 (nptII), p-글루큐로니다아제 (gus), 녹색 형광 단백질 (gfp), egfp, yfp, mCherry, p-갈락토시다아제 (lacZ), lacZa, lacZAM15, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제 (cat), 알칼리 포스파타아제 (phoA), 박테리아 루시퍼라아제 (luxAB), 비알라포스 내성 유전자 (bialaphos resistance gene) (bar), 포스포만노스 이소머라아제 (pmi), 자일로스 이소머라아제 (xylA), 아라비톨 데히드로게나아제 (atlD), UDP-글루코스:갈락토스-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라아제I (galT), 안트라닐레이트 신타아제의 피드백-비민감성(feedback-insensitive) α 서브유닛(subunit) (OASA1D), 2-데옥시글루코스 (2-DOGR), 벤질아데닌-N-3-글루큐로니드, 이. 콜라이(E. coli) 트레오닌 데아미나아제, 글루타메이트 1-세미알데히드 아미노트랜스퍼라아제 (GSA-AT), D-아미노 애시드옥시다아제 (DAAO), 염-내성 유전자 (rstB), 페레독신-유사 단백질 (pflp), 트레할로스-6-P 신타아제 유전자 (AtTPS1), 라이신 라세마아제 (lyr), 디히드로디피콜리네이트 신타아제 (dapA), 트립토판 신타아제 베타 1 (AtTSB1), 데할로게나아제 (dhlA), 만노스-6-포스페이트 리덕타아제 유전자 (M6PR), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 (HPT), 및 D-세린 암모니아라이아제 (dsdA).
"표지체"는 직접적으로 또는 간접적으로 또 다른 분자, 예컨대 항체 또는 단백질에 콘쥬게이션되어 그 분자의 검출을 용이하게 하는 검출가능한 화합물 또는 조성물을 나타낸다. 표지체의 구체적인 비제한적 예는 형광 태그, 효소적 결합체, 및 방사성 동위원소를 포함한다. 하나의 예에서, "표지 수용체"는 수용체에서의 이종성 폴리펩티드의 포함을 나타낸다. 표지체는 마킹된(marked) 아비딘에 의해 검출될 수 있는 폴리펩티드에의 비오티닐 모이어티(moiety)의 공유적 부착 또는 방사성 표지된 아미노산의 포함을 포함한다 (예를 들어, 광학적 또는 비색적 방법에 의해 검출될 수 있는 효소 활성 또는 형광 마커를 포함하는 스트렙타비딘). 폴리펩티드 및 당단백질을 표지하는 다양한 방법이 본 기술 분야에 공지되어 있으며, 이것이 사용될 수 있다. 폴리펩티드용 표지체의 예는 하기를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다: 방사성 동위원소 또는 방사성 뉴클레오티드 (예컨대 35S 또는 131I) 형광 표지체 (예컨대 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), 로다민, 란탄계 인광체), 효소 표지체 (예컨대 서양 고추냉이 퍼옥시다아제, 베타-갈락토시다아제, 루시퍼라아제, 알칼리 포스파타아제), 화학발광 마커, 비오티닐 그룹, 이차 리포터에 의해 인식되는 소정의 폴리펩티드 에피토프 (예컨대 류신 지퍼(zipper) 쌍 서열, 이차 항체의 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그), 또는 자성 에이전트(agent), 예컨대 가돌리늄 킬레이트. 일부 실시 양태에서, 표지체에는 잠재적인 입체 장애를 감소시키기 위하여 다양한 길이의 스페이서 아암(spacer arm)이 부착된다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 서열을 포함하는 재조합 폴리펩티드 또는 이의 변이체 또는 융합물에 관한 것이며, 여기서, 아미노산 서열의 아미노 말단 또는 탄소 말단은 이종성 아미노산 서열, 표지체 또는 리포터 분자에 임의로 부착된다. 특정한 실시 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 폴리펩티드 또는 이의 키메라 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.
특정한 실시 양태에서, 재조합 벡터는 포유류, 인간, 곤충, 바이러스, 박테리아, 박테리아 플라스미드, 효모 결부된 복제 원점 또는 유전자, 예컨대 유전자 또는 레트로바이러스 유전자 또는 렌티바이러스 LTR, TAR, RRE, PE, SLIP, CRS, 및 INS 뉴클레오티드 절편 또는 유전자를 임의로 포함한다.
특정한 실시 양태에서, 재조합 벡터는 유전자 벡터 요소 (핵산), 예컨대 선발가능한 마커 영역, lac 오페론, CMV 프로모터, 하이브리드 닭 B-액틴/CMV 인핸서 (CAG) 프로모터, tac 프로모터, T7 RNA 폴리머라아제 프로모터, SP6 RNA 폴리머라아제 프로모터, SV40 프로모터, 내부 리보좀 엔트리 부위 (internal ribosome entry site; IRES) 서열, 시스-작용 (cis-acting) 우드척 사후 조절 요소 (woodchuck post regulatory element; WPRE), 스캐폴드-부착 영역 (scaffold-attachment region; SAR), 역방향 말단 반복체 (inverted terminal repeat; ITR), FLAG 태그 코딩 영역, c-myc 태그 코딩 영역, 금속 친화성 태그 코딩 영역, 스트렙타비딘 결합 펩티드 태그 코딩 영역, 폴리His 태그 코딩 영역, HA 태그 코딩 영역, MBP 태그 코딩 영역, GST 태그 코딩 영역, 폴리아데닐화 코딩 영역, SV40 폴리아데닐화 시그널, SV40 복제 원점, Col E1 복제 원점, f1 원점, pBR322 원점 또는 pUC 원점, TEV 프로테아제 인식 부위, loxP 부위, Cre 리콤비나아제 (recombinase) 코딩 영역, 또는 다중 클로닝 부위, 예컨대 50 또는 60개 미만의 뉴클레오티드의 연속 절편 내에 5, 6 또는 7개 또는 이보다 더 많은 제한효소 부위를 갖는 것 또는 20개 또는 30개 미만의 뉴클레오티드의 연속 절편에서 3 또는 3개 또는 이보다 더 많은 제한효소 부위를 갖는 것을 임의로 포함한다.
가변 림프구 수용체 (VLR)
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 분자에의 특정 결합 에이전트의 생성 방법에 관한 것이며, 이는 분자를, 가변 림프구 수용체 (VLR)를 함유하는 세포가 그 분자에 결합하고 무턱 척추동물의 형질세포가 그 분자에 결합하는 가변 림프구 수용체 (VLR)를 생성하도록 하는 조건 하에 분자를 무턱 척추 동물에게 투여하는 단계를 포함한다. 표적 분자에 결합하는 가변 림프구 수용체 (VLR)의 아미노산 서열의 제공은 다양한 방법에 의해 성취될 수 있다. 유 (Yu) 등은 인간 T 세포에 의해 면역화된 칠성장어 유충으로부터의 단클론 VLR 항체의 패널의 생성 및 항원 정제 및 질량 분광계 확인에 있어서의 재조합 단클론 VLR 항체의 사용을 보고한다. 문헌[J Immunol Methods, 2012, 386 (1-2):43-9, 제목: "Purification and identification of cell surface antigens using lamprey monoclonal antibodies"]을 참조한다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 VLR 아미노산 서열들을 갖는 VLR을 포함하는 재조합 폴리펩티드들, 이의 서열 또는 변이체들에 관한 것이다. 특정한 실시 양태에서, 본 발명은 VLR 서열 및 다른 폴리펩티드 서열, 예컨대 형광 단백질, 태그 또는 마커를 포함하여서 재조합 펩티드가 자연 발생적이지 않게 되는 재조합 폴리펩티드에 관한 것이다. 특정한 실시 양태에서, 본 발명은 항체가 형성되도록 하는 조건 하에 무턱 척추동물을 항원에 노출시키는 방법에 의해 만들어진 재조합 단백질에 관한 것이며, 여기서, 항원은 무턱 척추동물이 그러한 항원에의 노출을 자연적으로는 경험하지 않도록 하는 것이다.
특정한 실시 양태에서, 변이체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 치환을 포함하거나 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 초과의 이의 동일성 또는 유사성을 갖는다. 특정한 실시 양태에서, 변이체는 자연 비발생 서열을 제공한다. 특정한 실시 양태에서, 아미노산 치환은 보존된 아미노산 치환이다. 특정한 실시 양태에서, 아미노산 치환은 예를 들어 MM3인 VLR인 VLR 내의 XXLXLXX 내에 있지 않으며, 여기서, X는 임의의 아미노산이고, L은 류신 또는 이소류신일 수 있다. 특정한 실시 양태에서, 재조합 핵산은 VLR MM3 또는 이의 변이체를 코딩한다. 특정한 실시 양태에서, 재조합 벡터는 본원에 개시된 VLR을 코딩하는 핵산 또는 이의 변이체를 포함한다. 특정한 실시 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 재조합 벡터를 포함하는 발현 시스템에 관한 것이다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 재조합 VLR 또는 이의 변이체에 관한 것으로서, 이는 발현 시스템에서 상기 단백질 또는 이의 변이체를 코딩하는 핵산을 발현시키는 방법에 의해 만들어진다.
표적 서열의 그래프팅에 의한 VLR로부터의 변형 인간 서열
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 분자에 결합하는 무턱 척추 동물의 가변 림프구 수용체 (VLR)의 아미노산 서열을 제공하는 단계; 가변 림프구 수용체에서의 어떠한 아미노산이 결합된 분자에 가장 가까운 공간적 근접 상태로 있고/있거나 이온 상호작용, 및/또는 수소 결합을 제공하고/하거나 결합된 분자에 반 데르 발스 힘을 제공하여 가변 림프구 수용체에서의 표적 아미노산을 제공하는지를 추정하는 단계; 가변 림프구 수용체 (VLR) 아미노산 서열에 대하여 20, 25 또는 30% 초과의 또는 이보다 더 큰 서열 동일성을 갖는 공지된 인간 아미노산 서열을 제공하는 단계; 공지된 인간 아미노산 서열 내에서 가변 림프구 수용체에서의 상기 표적 아미노산 및 표적 아미노산을 둘러싸고 있는 충분한 수의 아미노산을 대체하여 분자에 특이적으로 결합하도록 구성된 변형된 인간 아미노산 서열을 제공하는 단계; 및 재조합 핵산으로부터의 변형된 인간 아미노산 서열을 발현시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 만들어진, 분자에 특이적으로 결합하는 단리된 변형 인간 아미노산 서열에 관한 것이다.
무턱 척추동물, 칠성장어 및 먹장어는 가변 림프구 수용체 (VLR)를 발현하는 클론 다양성 림프구로 구성된 적응 면역계를 갖는다. 생식 세포 계열(germ-line) VLRB 유전자는 불완전하며, 비코딩 개재 서열에 의해 분리된 불변형 5' 및 3' 불변 영역으로 이루어진다. 상기 5' 불변 영역은 시그널 펩티드 및 N-말단 LRR (LRR-NT)의 일부를 코딩한다. 3' 불변 영역은 LRR-CT의 일부분 및 불변형 줄기 영역(stalk region)을 코딩한다. 불완전 생식 세포 계열 유전자에는 수 백개의 부분적 LRR 유전자 절편이 측면에 위치한다. 발달 중인 림프구에서, 측면에 위치하는 LRR 유전자 절편들은 랜덤하게 그리고 순차적으로 불완전 VLRB 유전자 내에 복제된다. 각각의 LRR 유전자 절편이 유전자좌 내에 복제될 때, 이것은 개재 서열의 일부분을 대체한다. 개재 서열 전부가 LRR 모듈로 대체되고 기능성 VLRB가 발현될 때까지 조립 기작은 계속된다. VLRB 유전자 조립은 각각의 림프구가 하나의 VLRB 유전자를 발현하도록 단지 하나의 대립유전자에서 일어난다. VLRB 유전자 조립 기작은 1014가지 초과의 독특한 항원 수용체를 생성할 수 있는데, 이는 인간 항체 레퍼토리의 이론적인 다양성에 필적한다.
성숙 VLRB 유전자는 초승달형 단백질을 코딩하며, 이때 아미노산 서열 다양성은 오목한 표면에 집중된다. 오목한 표면은 평행 β-가닥 및 C-말단 가변 루프로 구성된다. 각각의 LRR 서브유닛은 하나의 β-가닥을 제공하며, 각각의 β-가닥은 5개의 가변 아미노산 위치를 갖는다. VLRB 항체는 또한 가변적인 수의 LRR 서브유닛을 갖는다. 가장 작은 VLRB 항체는 4개의 LRR 서브유닛을 가지며, 가장 큰 것은 11개의 LRR 서브유닛을 갖는다. 각각의 LRR 서브유닛은 오목한 표면의 곡률을 약 10o만큼 증가시키며, 오목한 표면 영역을 약 220 Å만큼 증가시킨다. C-말단 LRR, LRR-CT는 가변적인 길이 및 서열 조성의 루프를 코딩하는데, 상기 루프는 오목한 표면 위로 돌출된다. 미립자형 항원, 예컨대 바실루스 안트라시스 외막 (exosporium) 또는 인간 적혈구 세포 (RBC)를 이용한 면역화는 항원-결합 VLRB+ 세포가 증식하여 형질세포로 분화되는 것을 유도한다. 형질세포는 혈액에서 순환하는 다가 VLRB 항체를 분비한다. 각각의 분비된 VLRB 항체는 가요성, 불변형 줄기 영역의 C-말단에서 디술피드 결합에 의해 결합되는 이량체들의 사량체 또는 오량체로 배열되는 동일한 VLRB 폴리펩티드 사슬들로 구성된다. 이러한 다가성으로 인하여, VLRB 항체는 그의 항원에 고 친화력으로 결합한다.
포유류 세포주 (HEK-293T 및 CHO 세포)에서 발현되는 VLRB cDNA는 생체 내에서 VLRB와 같이 디술피드-연결된 다가 항체로서 조직 배양 상청액 내로 분비된다. 재조합 VLRB 항체는 월등히 안정하다. 상기 항체는 극단적인 pH (<1.5 및 >12) 및 온도 (55℃에서 36시간)에의 노출 후 그의 항원 결합 능력을 유지한다. 항원-특이적 VLRB 클론을 단리하기 위하여, VLRB cDNA 라이브러리를 면역화된 칠성장어의 림프구로부터 제조한다. VLRB cDNA로 HEK-293T를 형질감염시키고, VLRB-함유 조직 배양 상청액을 항원 결합에 대하여 스크리닝한다. 단클론 VLRB 항체는 면역화 항원에 고도로 특이적이다. 비. 안트라시스의 BclA 포자-코트(coat) 단백질에 특이적인 VLRB 항체는 비. 안트라시스의 BclA과 비. 세레우스 (B. cereus)의 BclA을 90% 아미노산 서열 동일성에도 불구하고 정확하게 구별하였다 (7회 중 7회).
인간 적혈구 H-트리사카라이드 항원과 복합체를 형성한 VLRB 항체 (RBC-36)의 X-선 결정학에 의해 오목한 표면이 항원 결합 부위임이 확인되었다. H-트리사카라이드 상호작용은 오목한 VLRB 표면 상의 7개 중 6개의 β-가닥에서의 아미노산과의 반 데르 발스 접촉 및 수소 결합에 의해 안정화되었다. RBC-36의 LRR-CT는 연장된 루프의 단부 근처의 트립토판 (TRP204) 잔기를 통한 H-트리사카라이드의 갈락토스 고리와의 핵심적인 상호작용을 제공하는 연장된 루프를 형성한다.
실험에서 VLRB 단백질은 반복된 면역화 후 마우스에서 면역원성이 되었다. VLRB 항체의 면역원성은 인간에 있어서의 치료 시약으로서의 그의 잠재성을 제한한다. VLRB와 구조적으로 유사한 류신-풍부 반복 수용체가 척추 동물, 무척추 동물, 식물 및 원핵 생물에서 발견된다. 몇몇 인간 류신-풍부 반복 수용체, 예컨대 Slit-패밀리(family) 단백질 (Slit 1, 2, 및 3), CD42b, 및 Nogo-66은 VLRB에 대한 구조적 중첩부를 갖는다. 항원 결합에 책임이 있는 VLRB 항체 (RBC36)의 서열은 VLRB를 "인간화"하기 위하여 구조적으로 유사한 인간 LRR 수용체 (Slit2-D2)에 그래프팅될 수 있다. 실제로, 오목한 표면의 베타-시트 상의 아미노산 전부가 치환되어야 하는 것은 아니며, 그 이유는 선발된 아미노산이 항원 결합에 참여할 가능성이 있기 때문이다. 게다가, 생체 내에서 항원-결합된 상태로 주로 존재하는 고 친화성 VLRB는 완전히 인간화된 볼록한 표면을 체액성 면역계에 주로 노출시킨다. Slit2-D2 및 CD42b 둘 모두는 인간에 있어서 분비형 단백질이며, 오목한 표면 상에서 그의 천연 리간드인, 각각 Robo1 및 폰 빌레브란트 인자 (von Willebrand Factor; vWF)에 결합한다. 이러한 인간 LRR 수용체에의 VLRB 서열의 그래프팅은 VLRB 항체의 항원-결합 에피토프를 그의 천연 리간드에 결합하는 것을 무효화하면서 부가한다.
문헌[Han et al. Science, 2008, 321:1834-183]을 특별히 참고하는데, 상기 문헌에는 VLR 내의 어떠한 아미노산이 결합된 분자와 상호작용하는지를 추정하는 상세한 방법이 보고되어 있다. 결합된 분자에 가장 가깝게 공간적으로 근접하고/하거나 이온 상호작용 및/또는 수소 결합을 제공하고/하거나 반 데르 발스 힘을 관심 대상의 분자에 제공하여 가변 림프구 수용체에서의 표적 아미노산을 제공하는 가변 림프구 수용체에서의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 이보다 더 많은 아미노산의 추정은 다양한 방법에 의해 성취될 수 있다. 반 데르 발스 힘은 서로와의 또는 중성 분자 또는 하전된 분자와의 이온의 정전기적 상호작용, 수소 결합 또는 공유 결합으로 인한 상기 이외의 분자들 사이의 인력 또는 척력을 나타낸다. 상기 용어는 두 영구 쌍극자 사이의 힘 (키섬 (Keesom) 힘), 영구 쌍극자와 상응하는 유도 쌍극자 사이의 힘 (데바이 (Debye) 힘), 두 순간 유도 쌍극자 사이의 힘 (런던 분산력 (London dispersion force))을 포함한다. 이러한 힘은 전형적으로 컴퓨터 시뮬레이션 (simulation)을 통하여 추정된다. 문헌[Ohue et al., MEGADOCK: An All-to-all Protein-protein Interaction Prediction System Using Tertiary Structure Data, Protein Pept Lett, 2013]; 문헌[Matsuzaki et al., MEGADOCK 3.0: a high-performance protein-protein interaction prediction software using hybrid parallel computing for petascale supercomputing environments, Source Code Biol Med, 2013, 8 (1):18]; 문헌[Tuncbag et al., Predicting protein-protein interactions on a proteome scale by matching evolutionary and structural similarities at interfaces using PRISM. Nat Protoc, 2011, 6 (9):1341-54]; 문헌[Wang et al., Protein recognition and selection through conformational and mutually induced fit, Proc Natl AcadSci U S A, 2013, 110 (51):20545-50]; 문헌[Solernou& Fernandez-Recio, pyDockCG: new coarse-grained potential for protein-protein docking, J Phys Chem B, 2011, 115 (19):6032-9]; 문헌[Antes, DynaDock: A new molecular dynamics-based algorithm for protein-peptide docking including receptor flexibility, Proteins, 2010, 78 (5):1084-104]; 문헌[Cerqueira et al.,MADAMM: a multistaged docking with an automated molecular modeling protocol, Proteins, 2009, 74 (1):192-206]; 문헌[Claussen et al., FlexE: efficient molecular docking considering protein structure variations.J MolBiol, 2001, 308 (2):377-95]을 참조한다.
다른 실시 양태에서, 컴퓨터 시뮬레이션과 X-선 결정학, NMR 분광법 또는 동결-전자 현미경 실험의 조합이 이용된다. 전형적으로, 가변 림프구 수용체의 구조 및 관심 대상의 결합 분자의 구조는 결정화 복합체를 형성한다. 상기 복합체가 결정화를 흔드는 경우, 다른 방법을 시도할 수 있다. 일부 예에서, 컴퓨터에 의한 방법과 임의로 조합된 2차원 NMR 기법을 사용하여 분자 상호작용 및 공간 관계를 추정할 수 있다. 문헌[Nishida & Shimada, An NMR method to study protein-protein interactions, Methods MolBiol, 2012, 757:129-37] 및 문헌[O'Connell et al., The structural analysis of protein-protein interactions by NMR spectroscopy, Proteomics, 2009, 9 (23):5224-32]을 참조한다.
가변 림프구 수용체 (VLR) 아미노산 서열에 대하여 20, 25, 30, 35, 또는 40% 초과의 또는 이보다 더 큰 서열 동일성을 갖는 공지된 인간 아미노산 서열의 제공은 공적으로 이용가능한 데이터베이스, 예컨대 BLAST를 사용하여 행해질 수 있다. 특정한 실시 양태에서, 서열 동일성 또는 유사성의 비교 윈도(window)는 100, 150, 200, 또는 250개의 아미노산 위에 만들어진다.
공지된 인간 아미노산 서열에서의, 상이할 경우 위치 면에서 상관되는, 공지된 인간 아미노산 서열 내에서의 가변 림프구 수용체에서의 표적 아미노산들의 치환은 전형적으로, 서열 정렬을 만들고 이어서 치환함으로써 성취된다. 표적 아미노산의 아미노산에 더하여, 표적 아미노산의 N-쪽 또는 C-쪽의 아미노산 중 하나, 둘 모두, 또는 이보다 많은 것이, 상이할 경우 또한 치환될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 위치 면에서 인간 아미노산 서열과 상관되는, 공지된 인간 아미노산 서열 내의 가변 림프구 수용체에서의 표적 아미노산들 각각의 다음의 하나 이상의 아미노산이 치환된다. 특정한 실시 양태에서, 각각의 표적 아미노산의 N-쪽의 2개 및 C-쪽의 1개, C-쪽의 2개 및 N-쪽의 1개, 또는 N-쪽의 2개 및 C-쪽의 2개가 치환된다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 분자에 결합하는 무턱 척추 동물의 가변 림프구 수용체 (VLR)의 아미노산 서열을 제공하는 단계; 분자와 수소 결합하고/하거나 결합된 분자와 이온 상호작용을 갖고/갖거나 결합된 분자와 가장 가깝게 공간적으로 근접하여 가변 림프구 수용체에서의 표적 아미노산을 제공하는, 가변 림프구 수용체에서의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 또는 이보다 더 많은 아미노산을 결정하거나, 선발하거나, 추정하는 단계; 가변 림프구 수용체 (VLR) 아미노산 서열에 대하여 20, 25, 30 또는 40% 초과의 또는 이보다 더 큰 서열 동일성을 갖는 공지된 인간 아미노산 서열을 제공하는 단계; 공지된 인간 아미노산 서열에서 상이할 경우 위치 면에서 상관되는, 공지된 인간 아미노산 서열 내에서의 가변 림프구 수용체에서의 표적 아미노산을 치환하는 단계; 가변 림프구 수용체에서의 표적 아미노산들 각각의 다음의 하나 이상의 아미노산을 변형된 인간 아미노산 서열을 제공하는 조건 하에서 위치 면에서 상관되는 공지된 인간 아미노산 서열로 대체하고 변형된 인간 아미노산 서열은 생성될 경우 분자에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 제공하는 단계; 및 재조합 핵산으로부터의 변형된 인간 아미노산 서열을 발현시킴에 의해 분자에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 생성하는 단계를 포함하는, 분자에 특이적으로 결합하는 단리된 변형 인간 아미노산 서열에 관한 것이다.
특정한 실시 양태에서, 분자는 폴리펩티드 서열 또는 다당류를 포함한다.
특정한 실시 양태에서, 무턱 척추 동물은 칠성장어 또는 먹장어이다. 특정한 실시 양태에서, 가변 림프구 수용체는 칠성장어 가변 림프구 수용체 B (VLRB)이다.
특정한 실시 양태에서, 분자와 수소 결합하고/하거나 분자에 가장 가깝게 공간적으로 근접한 상태로 있는 가변 림프구 수용체에서의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 또는 이보다 더 많은 아미노산은 초승달형 VLR의 오목한 표면의 C-말단 가변 루프 및 β-가닥의 가변 아미노산 위치 내에서 선택된다.
특정한 실시 양태에서, 분자는 바이러스 또는 미생물 결부된 분자이다.
특정한 실시 양태에서, 바이러스 또는 미생물 결부된 분자는 바실루스 안트라시스, 인플루엔자 (Influenza) 또는 HIV-1 항원이다.
특정한 실시 양태에서, 분자는 특정한 정상 또는 악성 인간 세포와 결부된 분자이다. 특정한 실시 양태에서, 정상 또는 악성 인간 세포는 O형 혈액형 적혈구, B 세포 백혈병 세포, B 림프종 세포주이다. 특정한 실시 양태에서, 공지된 인간 아미노산 서열은 인간 류신-풍부 반복 수용체이다. 특정한 실시 양태에서, 공지된 인간 아미노산 서열은 Slit-패밀리 단백질 (Slit 1, 2, 및 3), CD42b, 또는 Nogo-66이다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 방법에 의해 만들어진 단리된 변형 인간 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 방법에 의해 만들어진 단리된 변형 인간 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 발현 시스템에 관한 것이다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 분자에 특이적으로 결합하는 에이전트를 생성하는 방법에 관한 것이며, 이는 분자를 가변 림프구 수용체 (VLR)가 분자에 결합하도록 그리고 무턱 척추 동물의 형질세포가 분자에 결합하는 가변 림프구 수용체 (VLR)를 생성하도록 하는 조건 하에 무턱 척추 동물에 투여하는 단계; 분자에 결합하는 가변 림프구 수용체 (VLR)의 아미노산 서열을 제공하는 단계; 분자에 가장 가깝게 공간적으로 근접한 상태로 있고 있거나 분자와 수소 결합하여 가변 림프구 수용체에서의 표적 아미노산을 제공하는, 가변 림프구 수용체에서의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 또는 이보다 더 많은 아미노산을 추정하는 단계; 가변 림프구 수용체 (VLR) 아미노산 서열에 대하여 20, 25, 30, 35, 또는 40% 초과의 또는 이보다 더 큰 서열 동일성을 갖는 공지된 인간 아미노산 서열을 제공하는 단계; VLR 서열과 공지된 인간 아미노산 서열을 정렬하는 단계; 공지된 인간 아미노산 서열에서 상이할 경우 위치 면에서 상관되는, 공지된 인간 아미노산 서열 내에서의 가변 림프구 수용체에서의 표적 아미노산들을 치환하는 단계; 변형된 인간 아미노산 서열이 분자에 특이적으로 결합하도록 구성되게 하는 조건 하에서 가변 림프구 수용체에서의 표적 아미노산들 각각의 다음의 1개 이상의 아미노산을, 위치 면에서 상관되는 공지된 인간 아미노산 서열에서의 아미노산으로 대체하는 단계; 및 재조합 핵산으로부터의 변형 인간 아미노산 서열의 발현에 의해 특이적 결합 에이전트를 생성하는 단계를 포함한다.
가변 림프구 수용체는 전형적으로 N-말단 LRR 서열, C-말단 LRR 서열, 및 대략 12 내지 25개의 아미노산의 다수의 내부 LRR 모듈을 포함한다. 전형적으로 C-말단 LRR 서열은 가변 루프 (고도 가변성 삽입체)를 포함한다. 내부 LRR 모듈 내에서, 7개의 아미노산은 전형적으로 1개 또는 2개의 류신 또는 이소류신을 포함하며, 이는 2개일 경우 단일 아미노산, 예를 들어, 오목한 표면 상에 전형적으로 위치하는 (서열 번호 21) XXLXLXX에 의해 분리되고, 여기서, X는 임의의 아미노산일 수 있으며, L은 류신 또는 이소류신일 수 있다. 일부 예에서, 1개의 L (류신 또는 이소류신)은 임의의 아미노산으로 치환될 수 있다. 특정한 실시 양태에서, 인간 서열 내로의 그래프팅을 위한 표적 아미노산은 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산이며, 이는 LRR 모듈들 중 적어도 1, 2, 3개 또는 상기 LRR 모듈 전부 및 임의로 전부의 또는 일부분의, C-말단 고도 가변성 삽입체에서의 아미노산에 있어서 결부된 7개 잔기 내에 있다. 특정한 실시 양태에서, 가변 림프구 수용체는 서열 VXCXXXXLXSVPAXIPTTTXXLXXXXNXITKXXPGVFDXLXXLXXXXLXXNXLXXXPXGXFD (서열 번호 25)를 가지며, 여기서, X는 임의의 아미노산일 수 있다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 83, 85, 90, 95, 97, 98, 또는 99% 초과의 서열 동일성 또는 85, 90, 95, 97, 98, 또는 99% 초과의 서열 유사성을 갖는 서열 번호 1 또는 10의 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 특정한 실시 양태에서, 변이체는 1개, 2개 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산 치환을 포함한다. 특정한 실시 양태에서, 아미노산 치환은 보존된 치환이다.
특정한 실시 양태에서, 변이체는 서열 번호 3 (IIYLHD), 서열 번호 4 (EIYLGS), 서열 번호 5 (VLDLGT),서열 번호 6 (ELFLCC), 서열 번호 7 (HLALDQ), 서열 번호 8 (HMYLFG), 서열 번호 9 (IAMRWDGKAVNDPDS) 내에 있지 않은 아미노산 치환을 포함한다.
특정한 실시 양태에서, 변이체는 하기 서열들 중 2가지, 3가지, 4가지, 5가지 또는 6가지를 포함한다: 서열 번호 3 (IIYLHD), 서열 번호 4 (EIYLGS), 서열 번호 5 (VLDLGT),서열 번호 6 (ELFLCC), 서열 번호 7 (HLALDQ), 서열 번호 8 (HMYLFG), 서열 번호 9 (IAMRWDGKAVNDPDS).
특정한 실시 양태에서, 변이체는 각각의 하기 서열 내에 하나의 보존된 아미노산 치환을 임의로 포함한다: 서열 번호 3 (IIYLHD), 서열 번호 4 (EIYLGS), 서열 번호 5 (VLDLGT),서열 번호 6 (ELFLCC), 서열 번호 7 (HLALDQ), 서열 번호 8 (HMYLFG), 서열 번호 9 (IAMRWDGKAVNDPDS).
특정한 실시 양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 9 (IAMRWDGKAVNDPDS) 또는 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 포함하는 변이체를 포함한다.
인간화 Slit2-VLR
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 하기 서열 (서열 번호 10) 또는 이의 변이체를 포함하는 단리된 재조합 폴리펩티드를 고려한다:
Figure pct00007
여기서, 각각의 위치의 X는 개별적으로 그리고 독립적으로 임의의 아미노산이며, n은 5 내지 20이거나 n은 10 내지 18이거나, n은 14, 15, 또는 16이되, 단, 폴리펩티드는 하기의, (서열 번호 11) IVDCRG, (서열 번호 12) EIRLEQ, (서열 번호 13) RIDLSN, (서열 번호 14) SLVLYG, (서열 번호 15) LLLLNA, (서열 번호 16) LLSLYD, 및 (서열 번호 17) TMHLAQ로부터 선택되는 야생형 Slit2-D2 서열들 중 적어도 1가지, 2가지, 3가지, 4가지, 5가지, 6가지 또는 상기 서열들 전부를 포함하지 않는다. 특정한 실시 양태에서, 변이체는 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 포함하되, 단, 아미노산 치환은 X 아미노산이 아니다. 특정한 실시 양태에서, 치환은 보존된 치환이다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 하기 서열 (서열 번호 26) 또는 이의 변이체를 포함하는 단리된 재조합 폴리펩티드를 고려한다:
Figure pct00008
여기서, 각각의 위치의 X는 개별적으로 그리고 독립적으로 임의의 아미노산이며, n은 5 내지 20이거나 n은 10 내지 18이거나, n은 14, 15, 또는 16이되, 임의로, 단, 폴리펩티드는 하기의, (서열 번호 11) IVDCRG, (서열 번호 12) EIRLEQ, (서열 번호 13) RIDLSN, (서열 번호 14) SLVLYG, (서열 번호 15) LLLLNA, (서열 번호 16) LLSLYD, 및 (서열 번호 17) TMHLAQ로부터 선택되는 야생형 Slit2-D2 서열 중 적어도 1가지, 2가지, 3가지, 4가지, 5가지, 6가지 또는 이들 전부를 포함하지 않는다.
특정한 실시 양태에서, 본원에 개시된 서열들 중 임의의 것에 있어서, [X]n은 [X]m-[VLR 또는 MM3의 루프 서열] 또는 [X]m-[VLR 또는 MM3의 루프 서열]A이며, 여기서, [X]m은 임의로 X1, X1X2, X1X2X3, X1X2X3X4이고, X1은 H이며, X2는 T이고, X3은 N이며, X4는 P이다. 특정한 실시 양태에서, 변이체는 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함하되, 단, 아미노산 치환, 결실 또는 삽입은 X 아미노산이 아니다. 특정한 실시 양태에서, 치환은 보존된 치환이다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 하기 서열 (서열 번호 27) 또는 이의 변이체를 포함하는 단리된 재조합 폴리펩티드를 고려한다:
Figure pct00009
여기서, 각각의 위치의 X는 개별적으로 그리고 독립적으로 임의의 아미노산이며, n은 5 내지 20이거나 n은 10 내지 18이거나, n은 14, 15, 또는 16이되, 임의로, 단, 폴리펩티드는 하기의, (서열 번호 12) EIRLEQ, (서열 번호 13) RIDLSN, (서열 번호 14) SLVLYG, (서열 번호 15) LLLLNA, (서열 번호 16) LLSLYD, 및 (서열 번호 17) TMHLAQ로부터 선택되는 야생형 Slit2-D2 서열들 중 적어도 1가지, 2가지, 3가지, 4가지, 5가지 또는 이들 전부를 포함하지 않는다. 특정한 실시 양태에서, 변이체는 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함하되, 단, 아미노산 치환, 결실 또는 삽입은 X 아미노산이 아니다. 특정한 실시 양태에서, 치환은 보존된 치환이다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 하기 서열 (서열 번호 28) 또는 이의 변이체를 포함하는 단리된 재조합 폴리펩티드를 고려한다:
Figure pct00010
여기서, 각각의 위치의 X는 개별적으로 그리고 독립적으로 임의의 아미노산이며, n은 5 내지 20이거나 n은 10 내지 18이거나, n은 14, 15, 또는 16이되, 임의로, 단, 폴리펩티드는 하기의, (서열 번호 13) RIDLSN, (서열 번호 14) SLVLYG, (서열 번호 15) LLLLNA, (서열 번호 16) LLSLYD, 및 (서열 번호 17) TMHLAQ로부터 선택되는 야생형 Slit2-D2 서열들 중 적어도 1가지, 2가지, 3가지, 4가지 또는 이들 전부를 포함하지 않는다. 특정한 실시 양태에서, 변이체는 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함하되, 단, 아미노산 치환, 결실 또는 삽입은 X 아미노산이 아니다. 특정한 실시 양태에서, 치환은 보존된 치환이다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 하기 서열 (서열 번호 29) 또는 이의 변이체를 포함하는 단리된 재조합 폴리펩티드를 고려한다:
Figure pct00011
여기서, 각각의 위치의 X는 개별적으로 그리고 독립적으로 임의의 아미노산이며, n은 5 내지 20이거나 n은 10 내지 18이거나, n은 14, 15, 또는 16이되, 임의로, 단, 폴리펩티드는 하기의, (서열 번호 14) SLVLYG, (서열 번호 15) LLLLNA, (서열 번호 16) LLSLYD, 및 (서열 번호 17) TMHLAQ로부터 선택되는 야생형 Slit2-D2 서열들 중 적어도 1가지, 2가지, 3가지, 4가지 또는 이들 전부를 포함하지 않는다. 특정한 실시 양태에서, 변이체는 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함하되, 단, 아미노산 치환, 결실 또는 삽입은 X 아미노산이 아니다. 특정한 실시 양태에서, 치환은 보존된 치환이다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 하기 서열 (서열 번호 30) 또는 이의 변이체를 포함하는 단리된 재조합 폴리펩티드를 고려한다:
Figure pct00012
여기서, 각각의 위치의 X는 개별적으로 그리고 독립적으로 임의의 아미노산이며, n은 5 내지 20이거나 n은 10 내지 18이거나, n은 14, 15, 또는 16이되, 임의로, 단, 폴리펩티드는 하기의, (서열 번호 14) SLVLYG, (서열 번호 15) LLLLNA, (서열 번호 16) LLSLYD, 및 (서열 번호 17) TMHLAQ로부터 선택되는 야생형 Slit2-D2 서열들 중 적어도 1가지, 2가지, 3가지, 4가지 또는 이들 전부를 포함하지 않는다. 특정한 실시 양태에서, 변이체는 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함하되, 단, 아미노산 치환, 결실 또는 삽입은 X 아미노산이 아니다. 특정한 실시 양태에서, 치환은 보존된 치환이다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 하기 서열 (서열 번호 31) 또는 이의 변이체를 포함하는 단리된 재조합 폴리펩티드를 고려한다:
Figure pct00013
여기서, 각각의 위치의 X는 개별적으로 그리고 독립적으로 임의의 아미노산이며, n은 5 내지 20이거나 n은 10 내지 18이거나, n은 14, 15, 또는 16이되, 임의로, 단, 폴리펩티드는 하기의, (서열 번호 15) LLLLNA, (서열 번호 16) LLSLYD, 및 (서열 번호 17) TMHLAQ로부터 선택되는 야생형 Slit2-D2 서열들 중 적어도 1가지, 2가지, 3가지, 4가지 또는 이들 전부를 포함하지 않는다. 특정한 실시 양태에서, 변이체는 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함하되, 단, 아미노산 치환, 결실 또는 삽입은 X 아미노산이 아니다. 특정한 실시 양태에서, 치환은 보존된 치환이다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 하기 서열 (서열 번호 32) 또는 이의 변이체를 포함하는 단리된 재조합 폴리펩티드를 고려한다:
Figure pct00014
여기서, 각각의 위치의 X는 개별적으로 그리고 독립적으로 임의의 아미노산이며, n은 5 내지 20이거나 n은 10 내지 18이거나, n은 14, 15, 또는 16이되, 임의로, 단, 폴리펩티드는 하기의, (서열 번호 16) LLSLYD, 및 (서열 번호 17) TMHLAQ로부터 선택되는 야생형 Slit2-D2 서열들 중 적어도 1가지, 2가지, 3가지, 4가지 또는 이들 전부를 포함하지 않는다. 특정한 실시 양태에서, 변이체는 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함하되, 단, 아미노산 치환, 결실 또는 삽입은 X 아미노산이 아니다. 특정한 실시 양태에서, 치환은 보존된 치환이다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 하기 서열 (서열 번호 33) 또는 이의 변이체를 포함하는 단리된 재조합 폴리펩티드를 고려한다:
Figure pct00015
여기서, 각각의 위치의 X는 개별적으로 그리고 독립적으로 임의의 아미노산이며, n은 5 내지 20이거나 n은 10 내지 18이거나 n은 14, 15 또는 16이되, 임의로, 단, 폴리펩티드는 하기의, (서열 번호 12) EIRLEQ, (서열 번호 13) RIDLSN, (서열 번호 14) SLVLYG, (서열 번호 15) LLLLNA, (서열 번호 16) LLSLYD, 및 (서열 번호 17) TMHLAQ로부터 선택되는 야생형 Slit2-D2 서열들 중 적어도 1가지, 2가지, 3가지, 4가지, 5가지 또는 이들 전부를 포함하지 않는다. 특정한 실시 양태에서, 변이체는 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함하되, 단, 아미노산 치환, 결실 또는 삽입은 X 아미노산이 아니다. 특정한 실시 양태에서, 치환은 보존된 치환이다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 하기 서열 (서열 번호 34) 또는 이의 변이체를 포함하는 단리된 재조합 폴리펩티드를 고려한다:
Figure pct00016
여기서, 각각의 위치의 X는 개별적으로 그리고 독립적으로 임의의 아미노산이며, n은 5 내지 20이거나 n은 10 내지 18이거나 n은 14, 15 또는 16이되, 임의로, 단, 폴리펩티드는 하기의, (서열 번호 13) RIDLSN, (서열 번호 14) SLVLYG, (서열 번호 15) LLLLNA, (서열 번호 16) LLSLYD, 및 (서열 번호 17) TMHLAQ로부터 선택되는 야생형 Slit2-D2 서열들 중 적어도 1가지, 2가지, 3가지, 4가지 또는 이들 전부를 포함하지 않는다. 특정한 실시 양태에서, 변이체는 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함하되, 단, 아미노산 치환, 결실 또는 삽입은 X 아미노산이 아니다. 특정한 실시 양태에서, 치환은 보존된 치환이다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 하기 서열 (서열 번호 35) 또는 이의 변이체를 포함하는 단리된 재조합 폴리펩티드를 고려한다:
Figure pct00017
여기서, 각각의 위치의 X는 개별적으로 그리고 독립적으로 임의의 아미노산이며, n은 5 내지 20이거나 n은 10 내지 18이거나 n은 14, 15 또는 16이되, 임의로, 단, 폴리펩티드는 하기의, (서열 번호 14) SLVLYG, (서열 번호 15) LLLLNA, (서열 번호 16) LLSLYD, 및 (서열 번호 17) TMHLAQ로부터 선택되는 야생형 Slit2-D2 서열들 중 적어도 1가지, 2가지, 3가지, 4가지 또는 이들 전부를 포함하지 않는다. 특정한 실시 양태에서, 변이체는 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함하되, 단, 아미노산 치환, 결실 또는 삽입은 X 아미노산이 아니다. 특정한 실시 양태에서, 치환은 보존된 치환이다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 하기 서열 (서열 번호 36) 또는 이의 변이체를 포함하는 단리된 재조합 폴리펩티드를 고려한다:
Figure pct00018
여기서, 각각의 위치의 X는 개별적으로 그리고 독립적으로 임의의 아미노산이며, n은 5 내지 20이거나 n은 10 내지 18이거나 n은 14, 15 또는 16이되, 임의로, 단, 폴리펩티드는 하기의, (서열 번호 14) SLVLYG, (서열 번호 15) LLLLNA, (서열 번호 16) LLSLYD, 및 (서열 번호 17) TMHLAQ로부터 선택되는 야생형 Slit2-D2 서열들 중 적어도 1가지, 2가지, 3가지 또는 이들 전부를 포함하지 않는다. 특정한 실시 양태에서, 변이체는 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함하되, 단, 아미노산 치환, 결실 또는 삽입은 X 아미노산이 아니다. 특정한 실시 양태에서, 치환은 보존된 치환이다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 하기 서열 (서열 번호 37) 또는 이의 변이체를 포함하는 단리된 재조합 폴리펩티드를 고려한다:
Figure pct00019
여기서, 각각의 위치의 X는 개별적으로 그리고 독립적으로 임의의 아미노산이며, n은 5 내지 20이거나 n은 10 내지 18이거나 n은 14, 15 또는 16이되, 임의로, 단, 폴리펩티드는 하기의, (서열 번호 15) LLLLNA, (서열 번호 16) LLSLYD, 및 (서열 번호 17) TMHLAQ로부터 선택되는 야생형 Slit2-D2 서열들 중 적어도 1가지, 2가지 또는 이들 전부를 포함하지 않는다. 특정한 실시 양태에서, 변이체는 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함하되, 단, 아미노산 치환, 결실 또는 삽입은 X 아미노산이 아니다. 특정한 실시 양태에서, 치환은 보존된 치환이다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 하기 서열 (서열 번호 38) 또는 이의 변이체를 포함하는 단리된 재조합 폴리펩티드를 고려한다:
Figure pct00020
여기서, 각각의 위치의 X는 개별적으로 그리고 독립적으로 임의의 아미노산이며, n은 5 내지 20이거나 n은 10 내지 18이거나 n은 14, 15 또는 16이되, 임의로, 단, 폴리펩티드는 하기의, (서열 번호 16) LLSLYD, 및 (서열 번호 17) TMHLAQ로부터 선택되는 야생형 Slit2-D2 서열들 중 적어도 1가지 또는 이들 전부를 포함하지 않는다. 특정한 실시 양태에서, 변이체는 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함하되, 단, 아미노산 치환, 결실 또는 삽입은 X 아미노산이 아니다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 하기 서열 (서열 번호 23) 또는 이의 변이체를 포함하는 단리된 재조합 폴리펩티드를 고려한다:
Figure pct00021
여기서, 각각의 위치의 X는 개별적으로 그리고 독립적으로 임의의 아미노산이되, 단, 폴리펩티드는 하기의, (서열 번호 16) LLSLYD, 및 (서열 번호 17) TMHLAQ로부터 선택되는 야생형 Slit2-D2 서열들 중 적어도 1가지를 포함하지 않는다. 특정한 실시 양태에서, 변이체는 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 포함하되, 단, 아미노산 치환은 X 아미노산이 아니다. 특정한 실시 양태에서, 치환은 보존된 치환이다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 하기 서열 (서열 번호 65) 또는 이의 변이체를 포함하는 단리된 재조합 폴리펩티드를 고려한다:
Figure pct00022
여기서, 각각의 위치의 X는 개별적으로 그리고 독립적으로 임의의 아미노산이되, 단, 폴리펩티드는 하기의, (서열 번호 15) LLLLNA, (서열 번호 16) LLSLYD, 및 (서열 번호 17) TMHLAQ로부터 선택되는 야생형 Slit2-D2 서열들 중 적어도 1가지, 2가지 또는 이들 전부를 포함하지 않는다. 특정한 실시 양태에서, 변이체는 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 포함하되, 단, 아미노산 치환은 X 아미노산이 아니다. 특정한 실시 양태에서, 치환은 보존된 치환이다.
인간화 Slit2-MM3 서열
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 하기 서열 (서열 번호 39) 또는 이의 변이체를 포함하는 단리된 재조합 폴리펩티드를 고려한다:
Figure pct00023
여기서, 각각의 위치의 X는 개별적으로 그리고 독립적으로 임의의 아미노산이며, n은 5 내지 20이거나 n은 10 내지 18이거나 n은 14, 15 또는 16이다. 특정한 실시 양태에서, 본원에 개시된 서열들 중 임의의 것에 있어서 [X]n은 [X]m-[VLR 또는 MM3의 루프 서열] 또는 [X]m-[VLR 또는 MM3의 루프 서열]A이며, 여기서, [X]m은 임의로 X1, X1X2, X1X2X3, X1X2X3X4이고, X1은 H이며, X2는 T이고, X3은 N이며, X4는 P이다.
특정한 실시 양태에서, 변이체는 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함하되, 단, 아미노산 치환, 결실 또는 삽입은 X 아미노산이 아니다. 특정한 실시 양태에서, 치환은 보존된 치환이다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 하기 서열 (서열 번호 40) 또는 이의 변이체를 포함하는 단리된 재조합 폴리펩티드를 고려한다:
Figure pct00024
여기서, 각각의 위치의 X는 개별적으로 그리고 독립적으로 임의의 아미노산이며, n은 5 내지 20이거나 n은 10 내지 18이거나 n은 14, 15 또는 16이다. 특정한 실시 양태에서, 변이체는 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함하되, 단, 아미노산 치환, 결실 또는 삽입은 X 아미노산이 아니다. 특정한 실시 양태에서, 치환은 보존된 치환이다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 하기 서열 (서열 번호 41) 또는 이의 변이체를 포함하는 단리된 재조합 폴리펩티드를 고려한다:
Figure pct00025
여기서, 각각의 위치의 X는 개별적으로 그리고 독립적으로 임의의 아미노산이며, n은 5 내지 20이거나 n은 10 내지 18이거나 n은 14, 15 또는 16이다. 특정한 실시 양태에서, 변이체는 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함하되, 단, 아미노산 치환, 결실 또는 삽입은 X 아미노산이 아니다. 특정한 실시 양태에서, 치환은 보존된 치환이다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 하기 서열 (서열 번호 42) 또는 이의 변이체를 포함하는 단리된 재조합 폴리펩티드를 고려한다:
Figure pct00026
여기서, 각각의 위치의 X는 개별적으로 그리고 독립적으로 임의의 아미노산이며, n은 5 내지 20이거나 n은 10 내지 18이거나 n은 14, 15 또는 16이다. 특정한 실시 양태에서, 변이체는 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함하되, 단, 아미노산 치환, 결실 또는 삽입은 X 아미노산이 아니다. 특정한 실시 양태에서, 치환은 보존된 치환이다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 하기 서열 (서열 번호 43) 또는 이의 변이체를 포함하는 단리된 재조합 폴리펩티드를 고려한다:
Figure pct00027
여기서, 각각의 위치의 X는 개별적으로 그리고 독립적으로 임의의 아미노산이며, n은 5 내지 20이거나 n은 10 내지 18이거나 n은 14, 15 또는 16이다. 특정한 실시 양태에서, 변이체는 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함하되, 단, 아미노산 치환, 결실 또는 삽입은 X 아미노산이 아니다. 특정한 실시 양태에서, 치환은 보존된 치환이다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 하기 서열 (서열 번호 44) 또는 이의 변이체를 포함하는 단리된 재조합 폴리펩티드를 고려한다:
Figure pct00028
여기서, 각각의 위치의 X는 개별적으로 그리고 독립적으로 임의의 아미노산이며, n은 5 내지 20이거나 n은 10 내지 18이거나 n은 14, 15 또는 16이다. 특정한 실시 양태에서, 변이체는 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함하되, 단, 아미노산 치환, 결실 또는 삽입은 X 아미노산이 아니다. 특정한 실시 양태에서, 치환은 보존된 치환이다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 하기 서열 (서열 번호 45) 또는 이의 변이체를 포함하는 단리된 재조합 폴리펩티드를 고려한다:
Figure pct00029
여기서, 각각의 위치의 X는 개별적으로 그리고 독립적으로 임의의 아미노산이며, n은 5 내지 20이거나 n은 10 내지 18이거나 n은 14, 15 또는 16이다. 특정한 실시 양태에서, 변이체는 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함하되, 단, 아미노산 치환, 결실 또는 삽입은 X 아미노산이 아니다. 특정한 실시 양태에서, 치환은 보존된 치환이다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 하기 서열 (서열 번호 46) 또는 이의 변이체를 포함하는 단리된 재조합 폴리펩티드를 고려한다:
Figure pct00030
여기서, 각각의 위치의 X는 개별적으로 그리고 독립적으로 임의의 아미노산이며, n은 5 내지 20이거나 n은 10 내지 18이거나 n은 14, 15 또는 16이다. 특정한 실시 양태에서, 변이체는 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함하되, 단, 아미노산 치환, 결실 또는 삽입은 X 아미노산이 아니다. 특정한 실시 양태에서, 치환은 보존된 치환이다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 하기 서열 (서열 번호 47) 또는 이의 변이체를 포함하는 단리된 재조합 폴리펩티드를 고려한다:
Figure pct00031
여기서, 각각의 위치의 X는 개별적으로 그리고 독립적으로 임의의 아미노산이며, n은 5 내지 20이거나 n은 10 내지 18이거나 n은 14, 15 또는 16이다. 특정한 실시 양태에서, 변이체는 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함하되, 단, 아미노산 치환, 결실 또는 삽입은 X 아미노산이 아니다. 특정한 실시 양태에서, 치환은 보존된 치환이다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 하기 서열 (서열 번호 48) 또는 이의 변이체를 포함하는 단리된 재조합 폴리펩티드를 고려한다:
Figure pct00032
여기서, 각각의 위치의 X는 개별적으로 그리고 독립적으로 임의의 아미노산이며, n은 5 내지 20이거나 n은 10 내지 18이거나 n은 14, 15 또는 16이다. 특정한 실시 양태에서, 변이체는 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함하되, 단, 아미노산 치환, 결실 또는 삽입은 X 아미노산이 아니다. 특정한 실시 양태에서, 치환은 보존된 치환이다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 하기 서열 (서열 번호 49) 또는 이의 변이체를 포함하는 단리된 재조합 폴리펩티드를 고려한다:
Figure pct00033
여기서, 각각의 위치의 X는 개별적으로 그리고 독립적으로 임의의 아미노산이다. 특정한 실시 양태에서, 변이체는 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함하되, 단, 아미노산 치환, 결실 또는 삽입은 X 아미노산이 아니다. 특정한 실시 양태에서, 치환은 보존된 치환이다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 하기 서열 (서열 번호 50) 또는 이의 변이체를 포함하는 단리된 재조합 폴리펩티드를 고려한다:
Figure pct00034
여기서, 각각의 위치의 X는 개별적으로 그리고 독립적으로 임의의 아미노산이다. 특정한 실시 양태에서, 변이체는 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함하되, 단, 아미노산 치환, 결실 또는 삽입은 X 아미노산이 아니다. 특정한 실시 양태에서, 치환은 보존된 치환이다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 하기 서열 (서열 번호 51) 또는 이의 변이체를 포함하는 단리된 재조합 폴리펩티드를 고려한다:
Figure pct00035
여기서, 각각의 위치의 X는 개별적으로 그리고 독립적으로 임의의 아미노산이다. 특정한 실시 양태에서, 변이체는 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함하되, 단, 아미노산 치환, 결실 또는 삽입은 X 아미노산이 아니다. 특정한 실시 양태에서, 치환은 보존된 치환이다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 하기 서열들 (서열 번호 58 내지 63) 또는 이의 변이체를 포함하는 융합물 또는 Slit2-MM3 폴리펩티드를 고려한다:
Figure pct00036
단백질 디스플레이 라이브러리로부터의 선발에 의한 VLR로부터의 변형 인간 서열
인간화된 특이적 결합 에이전트는 단백질 디스플레이 기술, 예를 들어 파지(phage) 디스플레이, 효모 표면 디스플레이, 박테리아 디스플레이 또는 무세포 시스템을 이용하여 변이형 단백질의 조합 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 문헌[Finlay et al., Methods Mol. Biol., 2011, 681:87-101]; 문헌[Daugherty, Curr. Opin. Struct. Biol., 2007,17:474-480]; 문헌[Gai&Wittrup, Curr. Opin. Struct. Biol., 2007, 17: 467-473]; 문헌[Zhou et al., MAbs., 2010, 2:508-518 ; Shen et al.,Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 2005, 102: 5969-5974]을 참조한다. 전형적으로, 독특한 변이형 단백질들의 콜렉션은 상응하는 돌연변이된 핵산으로부터의 발현에 의해 디스플레이 플랫폼(platform)을 통하여 연결된다. 디스플레이 플랫폼 상에 발현된 변이형 단백질의 노출/표적 분자와의 혼합 후, 분자 결합된 변이체는 분석을 위하여 확인되고/되거나 분리된다. 전형적으로, 단백질 서열은 디스플레이 플랫폼에서의 결부된 핵산의 서열 결정에 의해 결정된다. 예를 들어, 효모 표면 디스플레이에서, 재조합 효모는 변이형 단백질을 발현하며, 여기서, 효모 세포는 세포벽 단백질에 콘쥬게이션된 변이형 단백질을 발현한다. 효모 세포는 효모 세포의 표면 상에 발현되는 변이형 단백질을 코딩하는 플라스미드 DNA를 포함할 수 있으며, 이 플라스미드 DNA의 서열 결정은 변이형 단백질의 단백질 서열을 제공한다. 문헌[Gera et al., Protein selection using yeast surface display, Methods, 2013, 60 (1):15-26]을 참조한다. 파지 디스플레이에서, 변이형 단백질은 전형적으로 박테리오파지 (bacteriophage) 코트 단백질에 콘쥬게이션된다. 또한 세포-기반 시스템은 전형적으로 예를 들어 박테리아, 효모 및 포유류 세포에서 세포 표면 단백질에 콘쥬게이션된 변이형 단백질의 발현에 의존적이며, 숙주 세포는 변이형 단백질을 코딩하는 플라스미드 벡터를 지닌다. 무세포 시스템이 또한 개발되었으며, 여기서, 변이형 단백질은 직접적으로 그의 코딩 mRNA에 콘쥬게이션되는데, 이는 리보좀 디스플레이 또는 mRNA 디스플레이로 칭해진다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 하기 단계 중 1개 이상을 포함하는, 인간화된 특이적 결합 에이전트를 생성하는 방법을 고려한다:
a) 표적 분자에 특이적으로 결합하는 칠성장어 항체 서열을 제공하는 단계,
b) 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 만들어진 류신 풍부 반복 서열의 라이브러리를 확인하는 단계:
1) 비교 윈도 위에서 칠성장어 항체 서열과 인간 류신 풍부 반복 서열을 비교하고, 중첩 아미노산 위치, 보존된 치환을 포함하는 비중첩 아미노산 위치, 및 비보존된 치환을 포함하는 비중첩 아미노산 위치를 확인하는 단계;
2) 상기 각각의 위치에 대하여 중첩 아미노산 위치를 아미노산으로서 할당하는 단계;
3) 상기 각각의 위치에 대하여 인간 풍부 반복 서열의 아미노산을 보존된 치환을 포함하는 비중첩 아미노산 위치에 할당하는 단계;
4) 상기 각각의 위치에 대하여 인간 류신 풍부 반복 서열의 아미노산 또는 칠성장어의 아미노산 서열 사이의 무작위 선택을 할당하여 변이형 류신 풍부 반복 서열의 라이브러리를 제공하는 단계;
b) 각각의 위치에 대하여 할당된 아미노산을 포함하는 변이형 류신 풍부 반복 서열의 디스플레이 라이브러리를 제조하고 이를 결합을 위하여 표적 분자와 혼합하는 단계;
c) 표적 분자에 결합하는 변이형 류신 풍부 반복 서열들 중 하나 이상을 확인하여 인간화된 특이적 결합 에이전트를 제공하는 단계; 및
d) 인간화된 특이적 결합 에이전트를, 인간화된 특이적 결합 에이전트를 코딩하는 재조합 벡터를 포함하는 발현 시스템에서 발현시키는 단계.
특정한 실시 양태에서, 비교 윈도는 길이가 50, 100, 250, 500, 또는 1000개의 아미노산이거나, 적어도 50, 100, 250, 500, 또는 1000개의 아미노산이거나, 50, 100, 250, 500, 또는 1000개 초과의 아미노산이다. 특정한 실시 양태에서, 비교 윈도는 하기 도메인 LRRNT, LRR1, LRRV1, LRRV2, LRRV3, (LRRVX)n, LRRVe, LRRCP, 및 LRRCT 중 1가지, 2가지, 3가지, 4가지, 5가지, 6가지, 7가지 또는 이보더 더 많은 도메인/이들 도메인 전부의 위에 있으며, 여기서, X 및 n은 정수, 예를 들어 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6을 나타낸다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 다수의 인간화된 특이적 결합 에이전트를 확인하고, 인자들의 균형을 맞춤으로써, 예컨대 결합 친화성을 최대화하고 중첩 인간 아미노산 위치의 수를 최대화함으로써 바람직한 후보를 선발하는 것을 고려한다.
특정한 실시 양태에서, 아미노산은 이것이 하기 아미노산 군에 따라 유사한 특성을 갖는 군 사이에 있을 경우 보존된 치환이다: 방향족 - F Y W; 소수성-A V I L; 양으로 하전됨 - R K H; 음으로 하전됨 - D E; 극성 - S T N Q.
특정한 실시 양태에서, 인간 류신 풍부 서열에서 1개 이상의 아미노산 결실이 있다면, 상기 각각의 위치에 대하여 칠성장어의 아미노산을 할당한다.
특정한 실시 양태에서, 인간 류신 풍부 반복 서열은 Slit-D2이다. 예를 들어, 폴리펩티드 라이브러리는 인간화 결합 에이전트의 확인을 위하여 각각의 위치의 할당된 아미노산일 수 있으며, 여기서, 라이브러리는 하기 서열, CPX1X2CTCSX3NX4VDCRGKX5X6 (서열 번호 22)을 포함하는 LRRNT 도메인을 발현하고, X1 내지 X6은 임의의 아미노산이다. 특정한 실시 양태에서, X1은 A 또는 S이며, X2는 A 또는 Q이고, X3은 N 또는 G이며, X4는 I 또는 T이고, X5는 G 또는 R이며, X6은 L 또는 H이다.
특정한 실시 양태에서, 인간 류신 풍부 반복 서열은 하기 도메인 LRRNT, LRR1, LRRV1, LRRV2, LRRV3, LRRV4, LRRV5, LRRV6, LRRV7, LRRV8, LRRV9, LRRVe, LRRCP, 및 LRRCT 중 1가지, 2가지, 3가지, 4가지, 5가지, 6가지, 7가지, 또는 이보다 더 많은 도메인을 포함한다.
특정한 실시 양태에서, 인간 류신 풍부 반복 서열은 하기 도메인 LRRNT, LRR1, LRRV1, LRRV2, LRRV3, LRRVe, LRRCP, 및 LRRCT 중 1가지, 2가지, 3가지, 4가지, 5가지, 6가지, 7가지, 또는 이들 도메인 전부를 포함한다.
특정한 실시 양태에서, 인간 류신 풍부 반복 서열은 하기 도메인 LRRV1, LRRV2, LRRV3, LRRVe, LRRCP, 및 LRRCT 중 1가지, 2가지, 3가지, 4가지, 5가지, 또는 이들 도메인 전부를 포함한다.
특정한 실시 양태에서, 인간 류신 풍부 반복 서열은 하기 도메인 LRRV2, LRRV3, LRRVe, LRRCP, 및 LRRCT 중 1가지, 2가지, 3가지, 4가지, 또는 이들 도메인 전부를 포함한다.
특정한 실시 양태에서, 인간 류신 풍부 반복 서열은 하기 도메인 LRRV3, LRRVe, LRRCP, 및 LRRCT 중 1가지, 2가지, 3가지, 또는 이들 도메인 전부를 포함한다.
특정한 실시 양태에서, 인간 류신 풍부 반복 서열은 하기 도메인 LRRVe, LRRCP, 및 LRRCT 중 1가지, 2가지, 또는 이들 도메인 전부를 포함한다.
특정한 실시 양태에서, 인간 류신 풍부 반복 서열은 하기 도메인 LRRCP 및 LRRCT 중 하나 또는 이들 둘 모두를 포함한다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 펩티드 라이브러리 발현 시스템에서 고 수준의 발현을 허용하기 위하여 바람직한 서열로 치환된 LRRNT, LRR1, LRRV1, LRRV2, LRRV3, LRRVe, LRRCP, 및 LRRCT와 같은 도메인의 조합을 포함할 수 있음을 고려한다. 예를 들어, 문헌[Lee et al. Proc Natl AcadSci U S A, 2009, 106 (31):12891-6]에는 인터날린(Internalin) B의 LRRNT, LRR1, 및 LRRV1의 치환이 박테리아에서의 고 수준의 발현을 허용함이 보고되어 있다. 특정한 실시 양태에서, 본 발명은 본원에서 생성된 인간 류신 풍부 반복 라이브러리의 도메인 (LRRVX)n, LRRVe, LRRCP, 및 LRRCT에 콘쥬게이션된 인터날린 B의 LRRNT, LRR1, 및 LRRV1을 포함하는 라이브러리를 고려하며, 여기서, X 및 n은 정수, 예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8을 나타낸다.
융합 단백질
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 인간 면역계의 이펙터 기능에 충분한 보체 및 Fc 수용체에 의해 인식되는 인간 항체 불변 영역에 콘쥬게이션된, 본원에 개시된 인간화 아미노산 서열을 포함하도록 임의로 변형된 가변 림프구 수용체에 관한 것이다. 특정한 실시 양태에서, 본 발명은 이펙터 기능의 제공, 예를 들어 생체 내에서 또는 시험관 내에서 항체-의존성 세포 독성의 유발이 가능한, 본원에 개시된 변형된 인간 아미노산 서열 및 Fc 서열 또는 이의 단편을 포함하는, 그리고 임의로 야생형 인간 항체에 비견되는 반감기를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. 치료용 항체는 전형적으로 온전한 IgG 분자를 이용한다. IgG1 Fc는 이펙터 기능을 선동하는 Fc 감마 수용체와 상호작용할 수 있다. Fc는 보체 활성화 인자 (activator) C1q의 결합 부위를 포함한다. 신생 Fc 수용체 (FcRn)의 결합 부위는 반감기에 영향을 준다.
천연적으로 생성된 항체는 Fc 영역에 부착된 Fab 항원-결합 부위 아암을 포함한다. IgG Fc 영역은 CH3 도메인 및 CH2 도메인을 포함하는 호모이량체 (homodimer)이다. 전형적으로 CH2 도메인은 Asn297을 통하여 글리코실화된다. IgG Fc CH2 도메인은 항체-의존성 세포 독성 (ADCC)과 같은 이펙터 기작에 책임이 있는 Fc감마RI, Fc감마RII, Fc감마RIII 및 C1q 이펙터 리간드의 상호작용 부위를 포함한다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 그 Fc 서열이 항체-의존성 세포 독성을 유발할 수 있고 Fc감마RI, Fc감마RII, Fc감마RIII, 보체 활성화 인자 C1q, 신생 Fc 수용체 (FcRn), 및 이들의 조합을 위한 결합 부위를 포함하는 Fc 융합 단백질을 고려한다. 특정한 실시 양태에서, 본 발명은 융합 단백질이 변형된 인간 서열과 Fc 서열의 단쇄 융합물인 것을 고려한다. 파워즈 (Powers) 등은 단쇄 Fv-Fc 융합물이 이펙터로서 인간 말초 혈액 단핵 세포를 사용하여 종양 표적 세포에 대한 항체-의존성 세포 독성을 매개할 수 있음을 보고한다. 문헌[J Immunol Methods, 2001, 251 (1-2):123-35].
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 그 Fc 서열이 특정한 결실 또는 돌연변이, 예를 들어 CH3 도메인을 포함할 수 있다는 것을 고려한다. 보츠니악 (Wozniak)-크놉 (Knopp) 등은 CH3 도메인의 C-말단 단부의 루프 서열이 무작위화된 인간 IgG1 Fc 영역이 제조되었음을 보고한다. 이러한 단백질은 야생형 항체와 유사한 항원 결합성, 이펙터 기능 및 생체 내 반감기를 제공할 수 있었다. 문헌[Protein Engineering, Design and Selection, 2010, 23 (4): 289-297].
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 융합 단백질을 포함하는 재조합 벡터 및 이 벡터를 포함하는 발현 시스템을 고려한다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 서열 번호 19, 20, 24의 서열 또는 83, 85, 90, 95, 97, 98, 또는 99% 초과의 서열 동일성 또는 85, 90, 95, 97, 98, 또는 99% 초과의 서열 유사성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 특정한 실시 양태에서, 변이체는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산 치환을 포함한다. 특정한 실시 양태에서, 아미노산 치환은 보존된 치환이다.
특정한 실시 양태에서, VLR 또는 변형된 VLR 또는 단편은 CD3-제타와 같은 T-세포 항원 수용체의 신호-전달 (signal-transduction) 성분에 융합될 수 있다. 특정한 실시 양태에서, T-세포 항원 수용체의 신호-전달 성분은 콘센서스 (consensus) 서열 YXXLXXXXXXXXYXXL (서열 번호 52)을 갖는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프를 갖는 펩티드이며, 여기서, X는 임의의 아미노산이고, L은 류신 또는 이소류신이며, 서열 번호 15는 임의로 중간 절편 XXXXXXXX (서열 번호 53) 내에 1개 또는 2개의 아미노산 결실을 갖는다. 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (밑줄이 그어져 있음)는 부분적 CD3-제타 서열
Figure pct00037
, 또는 단편 또는 변이체, 예를 들어, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실, 부가 또는 치환을 갖는 변이체, 또는 이에 대하여 50, 60, 70, 80, 90, 95% 초과의 또는 이보다 더 큰 동일성을 갖는 서열 내에 있다.
특정한 실시 양태에서, T-세포 항원 수용체의 신호-전달 성분은 면역글로불린 엡실론 수용체 서브유닛 감마 전구체의 서열
Figure pct00038
, 이의 단편 또는 변이체, 이에 대하여 50, 60, 70, 80, 90, 95% 초과의 또는 이보다 더 큰 동일성을 갖는 변이체 또는 서열을 갖는, 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (밑줄이 그어져 있음)를 갖는 펩티드이다.
사용 방법
B 세포는 항원을 T 세포에 제시하여 전형적으로 B 세포가 더욱 특수화된 세포, 예컨대 미성숙 및 성숙 형질 세포로 분화하는 것을 촉진한다. 형질 세포는 다량의 항체를 생성한다. 다발성 골수종은 형질 세포에서 형성되는 암이다. B 세포 악성 종양은 CD20 표면 항원에 특이적인 치료용 항체에 의해 효과적으로 치료되는데, 이는 정상 및 악성 B 세포를 고갈시킨다. B 세포 림프종 및 백혈병의 치료에서의 성공에도 불구하고, 항-CD20 항체는 다발성 골수종의 치료에 효과적이지 않으며, 그 이유는 성숙 B 세포가 형질 세포로 분화됨에 따라 CD20 표면 발현이 손실되기 때문이다. 다발성 골수종 형질 세포의 표적화를 위하여 현재 연구 중인 다른 형질 세포 표면 항원이 많은 다른 세포 유형 및 조직에 의해 또한 발현되는데, 이는 허용되지 않는 부작용에 대한 잠재성 때문에 형질 세포 표적화를 복잡하게 한다. 현재, 어떠한 단클론 항체-기반 치료법도 다발성 골수종을 갖는 환자에게 이용가능하지 않다. 화학요법용 약물 및 자가 조혈 줄기-세포 이식을 이용한 치료는 전체 생존성을 연장시키지만, 때때로 대상체를 치유하지 않는다. 따라서, 개선된 치료 방법을 확인할 필요가 있다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 형질 세포 악성 종양, 예컨대 다발성 골수종을 치료하는 것을 고려하며, 이는 본원에 개시된 융합 단백질 또는 폴리펩티드 또는 이의 단편의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계에 의한 것이다. 특정한 실시 양태에서, 융합 단백질은 MM3 서열 또는 인간화 MM3 서열과, 인간 Fc 서열과 같은 T-세포 항원 수용체의 신호-전달 성분을 포함한다. 특정한 실시 양태에서, 융합 단백질은 레날리도미드 (lenalidomide) 및 덱사메타손 (dexamethasone), 보르테조밉 (bortezomib), 또는 이들의 조합과 조합되어 투여된다. 특정한 실시 양태에서, 치료는 자가 또는 동종 이계 줄기 세포 이식과 조합된다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 암을 치료 또는 예방하는 것을 고려하며, 이는 종양 결부된 항원에 결합하는 본원에 개시된 변형된 인간 서열을 포함하는 VLR 기반 융합 단백질의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 융합 단백질은 본원에 보고된 방법을 이용하여 생성된, VLR 또는 변형된 VLR 서열, 또는 인간화 VLR 서열, Slit2-VLR 서열을 포함할 수 있다.
특정한 실시 양태에서, VLR 기반 융합 단백질은 CD20, CD20, CD30, CD33, CD52, EpCAM, 상피 세포 유착 분자, gpA33, 당단백질 A33, 뮤신 (Mucin), TAG-72, 종양-결부된 당단백질 72, 폴레이트-결합 단백질, VEGF, 혈관 내피 성장 인자, 인테그린 αVβ3, 인테그린 α5β1, FAP, 섬유아세포 활성화 단백질, CEA, 암종 배아 항원, 테나신 (tenascin), Le y , 루이스 (Lewis) Y 항원, CAIX, 탄산탈수효소 (carbonic anhydrase) IX, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR; ERBB1로도 공지됨), ERBB2 (HER2로도 공지됨), ERBB3, MET (HGFR로도 공지됨), 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 (IGF1R), 에프린 수용체 A3 (EPHA3), 종양 괴사 인자 (TNF)-관련된 아폽토시스 (apoptosis)-유도 리간드 수용체 1 (TRAILR1; TNFRSF10A로도 공지됨), TRAILR2 (TNFRSF10B로도 공지됨) 및 핵 인자-κB 리간드의 수용체 활성화 인자 (RANKL; TNFSF11로도 공지됨) 및 이들의 단편으로부터 선택되는 종양 결부된 항원에 결합한다.
특정한 실시 양태에서, 대상체는 림프종, B 세포 림프종, 유방암, 전립선암, 결장직장암, 위암, 폐암, 피부암, 방광암, 뇌암, 신장암, 자궁내막암, 췌장암 및 갑상선암의 위험이 있거나, 이들의 증상을 나타내거나, 이들로 진단된다.
특정한 실시 양태에서, 고려되는 방법은 제2 항암제, 예컨대 베바시주맙 (bevacizumab), 게피티닙 (gefitinib), 에를로티닙 (erlotinib), 테마졸라미드 (temazolamide), 도세탁셀 (docetaxel), 시스-플라틴 (cis-platin), 5-플루오로우라실, 겜시타빈 (gemcitabine), 테가푸르 (tegafur), 랄티트렉세드 (raltitrexed), 메토트렉세이트 (methotrexate), 시토신 아라비노시드, 히드록시우레아, 아드리아마이신 (adriamycin), 블레오마이신 (bleomycin), 독소루비신 (doxorubicin), 다우노마이신 (daunomycin), 에피루비신 (epirubicin), 이다루비신 (idarubicin), 미토마이신 (mitomycin)-C, 닥티노마이신 (dactinomycin), 미트라마이신 (mithramycin), 빈크리스틴 (vincristine), 빈블라스틴 (vinblastine), 빈데신 (vindesine), 비노렐빈탁솔 (vinorelbinetaxol), 탁소티어 (taxotere), 에토포시드 (etoposide), 테니포시드 (teniposide), 암사크린 (amsacrine), 토포테칸 (topotecan), 캄프토테신 (camptothecin), 보르테조밉, 아네그릴리드 (anegrilide), 타목시펜 (tamoxifen), 토레미펜 (toremifene), 랄록시펜 (raloxifene), 드롤록시펜 (droloxifene), 요오독시페네풀베스트란트 (iodoxyfenefulvestrant), 비칼루타미드 (bicalutamide), 플루타미드 (flutamide), 닐루타미드 (nilutamide), 사이프로테론 (cyproterone), 고세렐린 (goserelin), 류프로렐린 (leuprorelin), 부세렐린 (buserelin), 메게스트롤 (megestrol), 아나스트로졸 (anastrozole), 레트로졸 (letrozole), 보라졸 (vorazole), 엑세메스탄 (exemestane), 피나스테리드(finasteride), 마리마스탓 (marimastat), 트라스투주맙 (trastuzumab), 세툭시맙 (cetuximab), 다사티닙 (dasatinib), 이마티닙 (imatinib), 콤브레타스타틴 (combretastatin), 탈리도미드 (thalidomide), 및/또는 레날리도미드 또는 이들의 조합을 추가로 투여하는 단계를 포함한다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 융합 단백질 및 1가지 이상의 다른 항암제를 사용하여 유방암을 치료 또는 예방하는 것을 고려한다. 특정한 실시 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 융합 단백질 및 트라스투주맙 및/또는 라파티닙 (lapatinib)을 사용하여 유방암을 치료 또는 예방하는 것을 고려한다. 특정한 실시 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 융합 단백질 및 도세탁셀 및 시클로포스파미드를 사용하여 유방암을 치료 또는 예방하는 것을 고려한다. 특정한 실시 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 융합 단백질 및 도세탁셀, 카보플라틴 (carboplatin), 및 트라스투주맙을 사용하여 유방암을 치료 또는 예방하는 것을 고려한다. 특정한 실시 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 융합 단백질 및 시클로포스파미드, 독소루비신, 및 5-플루오로우라실 (5-FU)을 사용하여 유방암을 치료 또는 예방하는 것을 고려한다. 특정한 실시 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 융합 단백질 및 도세탁셀, 독소루비신, 및 시클로포스파미드를 사용하여 유방암을 치료 또는 예방하는 것을 고려한다. 특정한 실시 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 융합 단백질 및 독소루비신 및 시클로포스파미드, 이어서 파클리탁셀 (paclitaxel) 또는 도세탁셀을 사용하여 유방암을 치료 또는 예방하는 것을 고려한다. 특정한 실시 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 융합 단백질 및 5-FU, 에피루비신, 및 시클로포스파미드, 이어서 도세탁셀 또는 파클리탁셀을 사용하여 유방암을 치료 또는 예방하는 것을 고려한다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 융합 단백질 및 1가지 이상의 다른 항암제를 사용하여 전립선암을 치료 또는 예방하는 것을 고려한다. 특정한 실시 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 융합 단백질 및 류프롤리드 (leuprolide), 고세렐린, 또는 부세렐린을 사용하여 전립선암을 치료 또는 예방하는 것을 고려한다. 특정한 실시 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 융합 단백질 및 플루타미드, 비칼루타미드, 엔잘루타미드 (enzalutamide), 또는 닐루타미드를 사용하여 전립선암을 치료 또는 예방하는 것을 고려한다. 특정한 실시 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 융합 단백질 및 케토코나졸 또는 아미노글루테티미드를 사용하여 전립선암을 치료 또는 예방하는 것을 고려한다. 특정한 실시 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 융합 단백질 및 아비라테론 (abiraterone), 비칼루타미드, 카바지탁셀 (cabazitaxel), 비칼루타미드, 데가렐릭스 (degarelix), 데노수맙 (denosumab), 도세탁셀, 엔잘루타미드, 카바지탁셀, 류프롤리드, 프레드니손 (prednisone), 데노수맙, 시풀류셀 (sipuleucel)-T, 또는 라듐 223 디클로라이드 및 이들의 조합을 사용하여 전립선암을 치료 또는 예방하는 것을 고려한다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 융합 단백질 및 1가지 이상의 다른 항암제를 사용하여 결장암을 치료 또는 예방하는 것을 고려한다. 특정한 실시 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 융합 단백질 및 5-FU, 류코보린 (leucovorin), 또는 카페시타빈 (capecitabine) 또는 이들의 조합을 사용하여 결장암을 치료 또는 예방하는 것을 고려한다. 특정한 실시 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 융합 단백질 및 카페시타빈 및 옥살리플라틴 (oxaliplatin)을 사용하여 결장암을 치료 또는 예방하는 것을 고려한다. 특정한 실시 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 융합 단백질 및 5-FU, 류코보린, 및 옥살리플라틴을 사용하여 결장암을 치료 또는 예방하는 것을 고려한다. 특정한 실시 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 융합 단백질 및 류코보린, 5-FU, 및 이리노테칸 (irinotecan)을 사용하여 결장암을 치료 또는 예방하는 것을 고려한다. 특정한 실시 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 융합 단백질 및 류코보린, 5-FU, 옥살리플라틴, 및 이리노테칸을 사용하여 결장암을 치료 또는 예방하는 것을 고려한다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 융합 단백질 및 베바시주맙 또는 세툭시맙을 사용하여 결장암을 치료 또는 예방하는 것을 고려한다. 특정한 실시 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 융합 단백질 및 5-FU 및 류코보린 (임의로 베바시주맙을 포함함)을 사용하여 결장암을 치료 또는 예방하는 것을 고려한다. 특정한 실시 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 융합 단백질 및 카페시타빈 (임의로 베바시주맙을 포함함)을 사용하여 결장암을 치료 또는 예방하는 것을 고려한다. 특정한 실시 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 융합 단백질 및 이리노테칸 (임의로 세툭시맙을 포함함)을 사용하여 결장암을 치료 또는 예방하는 것을 고려한다. 특정한 실시 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 융합 단백질 및 세툭시맙을 사용하여 결장암을 치료 또는 예방하는 것을 고려한다. 특정한 실시 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 융합 단백질 및 파니투무맙 (panitumumab)을 사용하여 결장암을 치료 또는 예방하는 것을 고려한다. 특정한 실시 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 융합 단백질 및 레고라페닙 (regorafenib)을 사용하여 결장암을 치료 또는 예방하는 것을 고려한다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 융합 단백질 및 비노렐빈 (vinorelbine), 에토포시드, 미토마이신 C, 겜시타빈, 이리노테칸, 페메트렉세드 (pemetrexed), 게피티닙, 에를로티닙, 라파티닙, 크리조티닙 (crizotinib), 및 빈카 알칼로이드 (vinca alkaloid) 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 화합요법제를 사용하여 폐암을 치료 또는 예방하는 것을 고려한다. 특정한 실시 양태에서, 빈카 알칼로이드는 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 또는 비노렐빈이다. 특정한 실시 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 융합 단백질을 사용하여 폐암을 치료 또는 예방하는 것을 고려하며, 화학요법제는 베바시주맙 파니투무맙, 잘루투무맙 (zalutumumab), 니모투주맙, 마투주맙 (matuzumab), 또는 세툭시맙이다. 특정한 실시 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 융합 단백질 및 백금계 에이전트 및/또는 탁산, 예를 들어 파클리탁셀 및 도세탁셀 또는 이들의 조합을 사용하여 폐암을 치료 또는 예방하는 것을 고려한다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 뇌암, 다형성 아교모세포종, 희소돌기아교세포종, 원시 신경외배엽 종양, 뇌실막종 또는 신경교종을 치료 또는 예방하는 것을 고려한다. 특정한 실시 양태에서, 융합 단백질은 임의로 테모졸로미드 (temozolomide), 프로카르바진 (procarbazine), 카르무스틴 (carmustine) (BCNU), 로무스틴 (lomustine) (CCNU), 빈크리스틴, 및 이들의 조합과 조합되어 투여된다. 특정한 실시 양태에서, 프로카르바진, 로무스틴 (CCNU) 및 빈크리스틴이 조합된다. 특정한 실시 양태에서, 융합 단백질은 임의로 이리노테칸, 시스-플라틴, 카보플라틴, 메토트렉세이트, 에토포시드, 블레오마이신, 빈블라스틴, 악티노마이신 (actinomycin) (닥티노마이신), 시클로포스파미드, 또는 이포스파미드 (ifosfamide)와 조합되어 투여된다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 융합 단백질과 테모졸로미드의 조합을 투여하는 것을 고려한다. 교모세포종의 치료는 방사선 요법 동안의 그리고 방사선 요법 후의 화학요법을 포함한다. 평균적으로, 수술 및 방사선 요법 후 화학요법은 처음에 종양 크기를 감소시킬 수 있다. 방사선 요법 동안 그리고 방사선 요법을 한 후 6개월 동안 테모졸로미드를 사용하면 추가의 독성을 최소로 하면서 중앙 생존값이 유의하게 증가한다. 이러한 치료 요법은 현재, 환자가 임상 실험에 등록되어 있지 않은 대부분의 교모세포종 사례에 있어서 표준이다. 테모졸로미드는 종양 세포의 방사선에의 감작에 의해 작용하는 것으로 보인다. 미국 식품 의약국 (U.S. Food and Drug Administration)은 표준 요법 후 진행하는 교모세포종을 갖는 환자의 치료를 위한 아바스틴 (Avastin) (베바시주맙)을 승인하였다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 전달-강화 전달법 (convection-enhanced delivery; CED)에 의한 뇌에서의 암 또는 종양의 관리를 위한 본원에 개시된 조성물의 투여에 관한 것이다. CED는 카테터 배치 후 유체 압력 구배를 이용하여 뇌 간질 공간 내로 직접적으로 주입함으로써 조성물을 투여하는 방법이다.
암 및 형질 세포 악성 종양을 치료하는 것에 더하여, 항체 분비 형질 세포의 고갈은 항체-매개된 자가면역 (예를 들어, 홍반성 루푸스) 및 알러지성 질환, 예컨대 항-CD20 단클론 항체에 의한 B 세포 고갈에 의해 완화되지 않는 것의 치료에 또한 사용될 수 있으며, 그 이유는 해로운 자가항체 및 알레르겐-반응성 항체가 CD20 항원이 결여된 장수 형질 세포에 의해 생성되기 때문이다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 자가면역 질환의 치료에 관한 것이며, 이는 유효량의 MM3 융합물 또는 인간화 Slit2-MM3 융합물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정한 실시 양태에서, 자가면역 질환으로는 홍반성 루푸스, 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증, 자가면역성 간염, 자가면역성 췌장염, 베헤트병 (
Figure pct00039
), 셀리악병 (celiac disease), 제1형 진성 당뇨병, 길랑-바레 증후군 (
Figure pct00040
), 건성성 관절염 및 류마티스 관절염이 있다.
실험
독특한 결합 특이성을 갖는 단클론 VLR 항체
큰 진화적 거리와 조합된 근본적으로 상이한 단백질 아키텍처 (architecture)는, 아키텍처적 이유 또는 면역관용적 (tolerogenic) 이유 (즉, "자기"를 인식하고 따라서 자가면역 합병증을 초래하는 항체의 생성을 숙주가 방지할 필요성) 때문에 종래의 항체에 의해서는 검출될 수 없는 항원을 VLR 항체가 검출할 수 있음을 시사한다. VLR 항체의 근본적으로 상이한 단백질 아키텍처 및 칠성장어의 진화적 거리는 구조적 이유 또는 면역관용적 이유 때문에 종래의 항체를 사용해서는 검출될 수 없는 바이오마커 (biomarker)의 발견에 있어서 이들이 이상적인 시약이 되게 한다. VLR 항체 MM3의 결합 특징은 임의의 공지된 세포 표면 항원에 상응하지 않으며, 이에 의해 VLR 항체의 독특한 항원 인식 특성이 지지된다. 특정 인간 조혈 세포 집단에 결합하는 단클론 칠성장어 VLR 항체를 확인하였다. 이러한 VLR 항체들 중 몇몇의 결합 특이성의 분석은 어떠한 종래의 포유류 단클론 항체도 유도되지 않았던 항원 구조를 이들이 인식함을 나타낸다.
재조합 VLR 항체는 상기 항체를 코딩하는 cDNA로 인간 HEK293 세포를 형질감염시킴으로써 생성한다. 재조합 VLR 항체는 세포 상청액 내로 분비되며, 이를 후속적으로 세포 특이성의 결정에 사용한다. 이러한 VLR 서열의 재조합 버전은 결합된 VLR 항체의 유동 세포 분석법에 의한 검출뿐만 아니라 단클론 VLR 항체의 효율적인 정제를 위한 히스티딘 잔기를 코딩하는 6개 코돈의 스트레치 (stretch)의 포함을 포함한다.
스캐폴드로서 인간 Slit2-D2를 사용한 인간화 VLRB 클론 RBC36
문헌[Han et al., 2008, Science 321:1834-183]에는 본 발명자의 칠성장어 VLR2913 결정 구조를 사용한, 분자 대체에 의한 1.67 Å의 해상도에서의 O형의 인간 혈액형의 적혈구의 H-항원으로부터 유래된 H-트리사카라이드와 복합된 VLR RBC36 엑토도메인 (ectodomain) (ECD)의 결정 구조가 보고되어 있다. 제II형 H-항원 트리사카라이드는
Figure pct00041
이다.
Slit2-D2 스캐폴드를 사용하여 인간화 VLRB 항체를 생성하기 위하여, RBC36으로부터의 가변 아미노산 위치를 Slit-D2 상의 상응하는 위치에 그래프팅시켜서 (도 7 참조) 하기 서열 (서열 번호 1)을 생성한다:
Figure pct00042
야생형 Slit-D2 (도 7, 상부 참조, 서열 번호 2)는 206개의 아미노산으로 구성되며, 상기 아미노산들 중 밑줄이 그어져 있는 일부는 LRRCT 영역으로부터 제거되었다.
Figure pct00043
VLRB 클론 RBC36로부터의 41개의 아미노산을 Slit-D2 스캐폴드의 나머지 196개의 아미노산에 그래프팅시켰으며, 이는 LRRNT, LRR1, LRRV에서의 26개의 아미노산의 치환 (회색 배경에서 적색), 및 가변 삽입 루프를 코딩하는 LRRCT 영역 내로의 15개의 아미노산의 삽입 (회색 배경에서 적색, 그리고 밑줄이 그어져 있음)을 포함한다. 마지막의 213개 아미노산의 인간화 서열에서, 41개는 칠성장어 VLR로부터 유래되며, 172개는 인간 Slit2-D2로부터 유래된다. (인간의 %= 172/213=80.8%; 칠성장어 VLR의 %=41/213=19.2%). 가변 위치들 중 일부는 RBC36-H 트리사카라이드 결정 구조에서 항원과 접촉하지 않는다. 예를 들어, LRRNT에서의 아미노산들 중 어떠한 것도 H 트리사카라이드와 접촉하지 않으며 LRR1에서의 단지 1개의 잔기가 H 트리사카라이드와 접촉한다. 따라서, 항원 접촉 잔기 및 아마도 몇 개의 이웃하는 잔기를 치환하는 것만이 필요할 수 있다. 그러나, VLR:항원 결정 구조 또는 돌연변이 결합 부위 데이터를 이용할 수 없을 때에는 가변 아미노산 위치들 전부의 치환을 일반적인 접근법으로서 사용하여 VLRB 단클론 항체를 인간화할 수 있다. 예를 들어, 서열 번호 24는 "Slit-M4"로 표기되는, Slit2-D2 내에 그래프팅된 3개의 아미노산 및 RBC38의 루프를 포함한다. Slit-M4는 제II형 H-항원 트리사카라이드에 결합하며, 이는
Figure pct00044
이다.
Figure pct00045
Slit-M4에서, 214개의 아미노산 위치들 중 195개는 인간이다 (91%).
VLR 오목 표면 상의 각각의 β-가닥 (LRRNT, LRR1, LRRV, LRRVe 및 LRRCP에 의해 코딩됨)은 xLxLxx 모티프에 의해 규정되는 4개의 가변 위치를 가지며, 여기서, x는 임의의 아미노산이다 (이 모티프에서의 류신 잔기는 가끔, 이소류신, 발린 및 메티오닌을 포함하는 다른 소수성 아미노산으로 대체됨을 주지하라). 이 모티프에서의 류신은 항원 접촉을 하지 않으며, 대신, 단백질의 내부와 직면하여 LRR 솔레노이드 (solenoid)의 소수성 코어를 형성하는데, 이는 상기 내부에 또한 직면하는 볼록 표면 상에 위치하는 보존된 페닐알라닌 잔기에 대한 패킹 (packing)에 의한 것이다. 가변 아미노산 위치는 오목한 표면 상에서 바깥쪽으로 향하며, 총괄적으로, LRRCT에서의 가변 삽입 루프와 함께, 항원 결합 표면을 형성한다. 가변 아미노산은 강성 이차 구조를 형성하는 β-가닥 상에 위치하고, 상기 아미노산은 항상 xLxLxx 모티프에서의 4개의 위치 중 하나에 위치하기 때문에, VLR로부터 Slit2-D2 스캐폴드까지의 잔기의 상응하는 위치를 심지어 구조 데이터 없이도 일차 아미노산 서열로부터 결정할 수 있다.
예로서 RBC36을 사용하면, Asp153은 LRRVe LRR 모티프 (HLALDQ)의 세 번째 가변 위치에 있다. Slit2-D2의 LRRVe에서의 LRR 모티프 서열은 LLSLYD여서, RBC36으로부터의 Asp153을 Slit2-D2 스캐폴드에 그래프팅하기 위해서는 LRRVexLxLXx 모티프의 세 번째 위치의 상응하는 아미노산을 교환하는 것만이 필요해지게 된다. 이 경우, 치환은 Slit2-D2의 티로신 대신 RBC36의 아스파르트산이다 (예를 들어, Slit2-D2로부터의 LRRVe는 LLSLYD로부터 LLSLDD로 변화된다). 원칙적으로, 임의의 아미노산을 가변 위치에서 사용할 수 있지만, 아미노산 사용은 아미노산들의 하위세트 (subset) 쪽으로 편향된다. 티로신 (Tyr)이 가장 빈번하게 사용되는 아미노산이고, 다른 방향족 아미노산 (페닐알라닌 (Phe), 트립토판 (Trp) 및 히스티딘 (His)), 아스파라긴 (Asn) 및 아스파르트산 (Asp)이 뒤따른다. 더욱이, 4가지의 이용가능한 VLR:항원 결정 구조에서, 대다수의 항원 접촉은 이러한 하위세트의 아미노산에 의해 형성된다 (도 11). RBC36에서, H-트리사카라이드와 접촉하는 12개의 아미노산 중, 2개의 Tyr, 2개의 Phe, 1개의 Trp, 2개의 Asp, 및 1개의 His이 있어서, 12개의 항원-결합 아미노산 중 9개의 아미노산이 이러한 하위세트의 잔기로부터 유래된다. 유사한 패턴이 다른 3가지의 VLR 구조에서 관찰된다. 또한 모든 4가지의 VLR:항원 결정 구조에서, 더 많은 C-말단 LRR 모듈 (LRRVe, LRRCP 및 LRRCT, 도 7)이 가장 많은 항원 접촉부를 만들며, LRRNT는 단지 상기 구조들 중 하나인 VLR4-BclA에서 항원과 접촉하며, 그렇다고 하더라도 이것은 단지 단일 아미노산이다. 따라서, 심지어 VLR-항원 결정 구조 데이터 없이도, 이러한 관찰을 이용하여, Slit2-D2 스캐폴드에 그래프팅하기 위한 잔기의 선택을 인도할 수 있다.
SLIT2 스캐폴드 상에의 VLRB LRRCT 루프의 융합은 변이체에 순응할 수 있다. VLR 구조 및 SLIT 구조 둘 모두에서의 LRRCT 루프에는 알파-나선이 선행한다 (도 13에 예시됨). 구체적으로 고려되는 변이체는 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산의 부가 또는 결실 상태로 있을 수 있으며, 여기서, 알파-나선 후에 SLIT2 서열이 끝나고 VLR 루프 서열이 시작된다. VLR의 LRRCT 루프는 길이 및 서열 조성 면에서 다양할 수 있으며, 따라서 아미노산을 부가할 수 있고, 결합을 위한 올바른 배향의 루프를 얻기 위하여 알파-나선:루프 접합부에서 최적 서열 - 추가 잔기를 실험적으로 결정하였다. SLIT2 스캐폴드에 도로 융합된 루프의 다른 쪽에, LRRCT 루프의 말단을 규정하는, VLR 및 SLIT2 둘 모두에서의 R 또는 K 잔기가 선행하는 보존된 시스테인이 있다 (도 13). 특정한 실시 양태에서, 본 발명은 LRRCT 루프의 말단에 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산의 부가 또는 결실을 포함하는 변이체에 관한 것이다.
따라서, 특정한 실시 양태에서, 본 발명은 본원의 Slit2-D2 서열의 변이체를 고려하며, 여기서, 인간화 Slit2 VLR 서열 또는 인간화 Slit2-MM3 서열은 절편 (서열 번호 78) CDCHLKWLADYL-[X]m-[VLR 또는 MM3의 루프 서열]-X5C 또는 CDCHLKWLADYL-[X]m-[VLR 또는 MM3의 루프 서열]-AX5C를 포함하고, 여기서, 볼드체는 알파-나선이며, [X]m은 임의로 X1, X1X2, X1X2X3, X1X2X3X4이고, X1은 H이며, X2는 T이고, X3은 N이며, X4는 P이고, X5는 R 또는 K이다.
VLR의 인간화는 Slit-패밀리 단백질에 한정되지 않는다. 스캐폴드로서 또한 사용될 수 있는 칠성장어 VLR에 대하여 구조적 유사성 (예를 들어, 30 내지 40%보다 더 큰 서열 동일성)을 갖는 많은 다른 인간 LRR-기반 수용체가 있다. 이 실시예는 단지 일반적인 인간화의 개념을 예시하는 역할을 한다. 가변 아미노산 위치의 치환 외에, 인간화 VLR의 배좌 및 표면 상보성을 최적화하기 위하여 항원-결합 부위에서 떨어져 있는 아미노산에 사소한 변화를 이루는 것이 또한 필요할 수 있다.
인간화 VLRB 융합물
많은 치료용 항체에 의한 생체 내에서의 종양 세포의 제거는 항체의 불변 영역 (Fc)에 의해 매개된다. 인간 IgG1의 불변 영역은 CH2 도메인을 통하여 보체 및 Fcγ 수용체 (FcγR)에 결합하는데, 이는 보체 의존성 세포독성 (CDC), 항체-의존성 세포 독성 (ADCC), 및 FcγR-보유 대식세포에 의한 항체-옵소닌화(opsonized) 세포의 식세포 작용 (phagocytic engulfment)을 통한 표적 세포의 사멸을 용이하게 한다. VLR의 항원-결합 도메인 및 인간 항체, 예컨대 IgG1의 불변 영역으로 이루어진 융합 단백질은 VLR 항체의 독특한 항원 검출을 인간 면역 제거 기작과 커플링시킨다. 인간 IgG 항체의 불변 영역은 또한 인간 혈장 중 항체의 반감기를 증가시킨다. FcRn은 IgG 불변 영역의 CH2 및 CH3 도메인에 결합하며, 식균 작용 구획으로부터의 항체의 재순환을 용이하게 하는데, 이는 순환 중 그의 존재를 연장시키고 치료제로서의 그의 효능을 증가시킨다.
(1) 히말라야 원숭이 (rhesus macaque) IgG1, (2) 인간 IgG1 및 (3) 마우스 IgG2a의 Fc 영역에 융합된 VLR의 발현을 위한 벡터를 제조하였다 (도 5). 발현 구성물들은 상기 구성물로 패키징 세포주를 형질감염시킨 후 일시적 형질감염 또는 안정한 렌티바이러스 형질도입에 의해 발현을 허용하는 신장 인자 1α (EF1α) 프로모터의 제어 하의 렌티바이러스-기반 벡터 내에 있다. 둘 모두의 접근법을 이용하여 HEK-293 및 CHO 세포에서 VLR을 발현시켰다. 상기 발현 벡터는 또한 고도 발현을 갖는 세포의 분류를 위한 IRES-GFP 서열을 포함한다. MM3 VLR-IgG1-Fc 단백질을 정치 배양용 셀라인 (CELLine) 생물반응기 플라스크 (인테그라 바이오사이언시즈 (Integra Biosciences))를 이용하여 수득하였다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 변형 인간 아미노산 서열, 인간화 VLRB 서열을 인간 Fc 서열, 전형적으로 콘센서스 서열과 콘쥬게이션시켜 이를 인간 IgG1 Fc에의 융합물로서 이. 콜라이에서 발현시키는 것을 고려한다. 특정한 구현된 Fc 융합 단백질의 인간 IgG1 Fc 서열 부분의 아미노산 서열은 다음과 같다:
Figure pct00046
인간화 VLRB 서열-Fc 서열 융합 단백질의 특정한 실시 양태의 전체 아미노산 서열은 다음과 같다:
Figure pct00047
M-인간화 VLRB 서열 -Fc 서열
Figure pct00048
봉입체, 및 고압 균질화를 이용하여 인간화 VLRB 서열 및 Fc 서열의 융합 단백질을 발현하는 이. 콜라이 세포를 용해시킬 수 있다. 후속적인 단백질 폴딩 (folding), 선택적 침전, 및 여과 후, 크로마토그래피 정제 단계 (예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피, 단백질 A, 또는 히드록시아파타이트 크로마토그래피)를 이용할 수 있다.
특정한 실시 양태에서, VLR 또는 변형 VLR 또는 단편을 CD3-제타와 같은 T-세포 항원 수용체의 신호-전달 성분에 융합시킬 수 있다. 특정한 실시 양태에서, T-세포 항원 수용체의 신호-전달 성분은 콘센서스 서열 YXXLXXXXXXXXYXXL (서열 번호 52)을 갖는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프를 포함하는 펩티드이며, 여기서, X는 임의의 아미노산이고, L은 류신 또는 이소류신이며, 서열 번호 52의 서열은 임의로, 중간 절편 XXXXXXXX (서열 번호 53) 내에 1개 또는 2개의 X 아미노산 결실을 갖는다. 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (밑줄이 그어져 있음)는 부분적인 CD3-제타 서열
Figure pct00049
또는 단편 또는 변이체, 예를 들어 1, 2, 또는 3개의 아미노산 결실, 부가, 또는 치환을 갖는 변이체, 또는 이에 대하여 50, 60, 70, 80, 90, 95% 초과의 또는 이보다 더 큰 동일성을 갖는 서열 내에 있다.
특정한 실시 양태에서, T-세포 항원 수용체의 신호-전달 성분은 면역글로불린 엡실론 수용체 서브유닛 감마 전구체의 서열
Figure pct00050
또는 이의 단편 또는 변이체, 또는 이에 대하여 50, 60, 70, 80, 90, 95% 초과의 또는 이보다 더 큰 동일성을 갖는 서열을 갖는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (밑줄이 그어져 있음)를 포함하는 펩티드이다.
H-트리사카라이드에의 인간화 RBC36의 결합
Slit2-D2 돌연변이체를 IgG1-Fc를 포함하는 렌티바이러스 발현 벡터 내로 클로닝하고, 일시적 형질감염에 의해 HEK-293T 세포에서 발현시켰다. Slit2-D2 돌연변이체의 발현을 항-IgG-HRP 콘쥬게이션 이차 항체를 이용하여 그 상청액을 웨스턴 블로팅 (western blotting)함으로써 입증하였다. 상기 상청액을 이용하여 CHO-H 세포주를 염색시키고, 결합을 유동 세포 분석법에 의해 항-IgG-PE 콘쥬게이션 이차 Ab를 이용하여 탐지하였다. 양성 대조구로서, CHO-H 세포를 야생형 RBC36-IgG-Fc 융합 단백질로 또한 염색하였다. Slit-M4-IgG-Fc 단백질은 CHO-H 세포를 염색시켰으며, 이는 H-트리사카라이드 특이성이 Slit2-D2 스캐폴드로 이전될 수 있음을 입증하는 것이었다 (도 6).
인간 형질 세포 특이적 VLR mAb (MM3)
칠성장어를 인간 다발성 골수종 세포로 면역화함으로써 형질 세포-특이적 VLR mAb (MM3)를 생성하였다. 인간 형질 세포 항원에 대한 마우스 항체는 이전에 만들어졌지만, 어떠한 것도 형질 세포 특이적인 것이 아니었다. MM3 VLR mAb는 정상 (시험한 25가지의 도너 (donor) 샘플 중 25가지) 및 악성 인간 형질 세포 (32명의 골수종 환자 중 27명) 둘 모두에 결합하지만, 다른 B 또는 조혈 계통 세포에는 결합하지 않는다 (도 9). 또한 MM3은 인간외 영장류 (히말라야 원숭이 및 수티 망가베스 (sooty mangabes))에서 형질 세포를 인식하지만, 이것은 마우스 형질 세포에는 결합하지 않는다. 히말라야 원숭이 골수로부터의 MM3+ 세포가 형질 세포임을 확인하기 위하여, 상기 세포를 유동 세포 분석법에 의해 분류하고 투과 전자 현미경법에 의해 분석하였다. MM3+ 세포는 작고, 조밀한 기이한 핵, 및 크게 확장된 조면 소포체 및 골지 (golgi)를 포함하는 큰 세포질 부피를 가졌는데, 이는 형질 세포의 특징적인 특징이다. 인간외 영장류에서의 형질 세포 상에서의 MM3 항원의 보존은 생체 내에서 형질 세포를 표적화하여 고갈시키는 VLR 항체의 능력의 평가를 위한 모델 시스템을 제공한다. 다중파라미터 유동 세포 분석법을 이용하여, CD19 및 CD138의 발현을 기반으로 하는 건강한 인간 도너로부터의 인간 골수-유래 형질 세포 하위세트 상에서의 MM3의 발현을 분석하였다 (도 10). MM3 VLR mAb는 장수 형질 세포 집단 (CD19-, CD27+, CD138+, CD38hi)을 포함하여 모든 4가지의 CD38hi 형질 세포 하위세트를 염색시켰다. 이것은 또한 가장 널리 사용되는 형질 세포 마커인 CD138을 발현하지 않는 인간 골수에서의 Ab-분비 세포의 하위집단 (subpopulation)을 염색시킨다.
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 하기 MM3 항원 결합 도메인 서열 (서열 번호 56) 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드 또는 융합물에 관한 것이다:
Figure pct00051
특정한 실시 양태에서, 변이체는 이에 대하여 80, 85, 90, 95, 97, 98% 초과의 동일성 또는 유사성 퍼센트를 갖는 것이다. 특정한 실시 양태에서, 변이체는 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함한다. 특정한 실시 양태에서, 치환은 보존된 치환이다.
시그널 펩티드 및 줄기 (밑줄이 그어져 있음)를 포함하는 MM3 전체 서열 (서열 번호 57)
Figure pct00052
MM3 VLR mAb의 인간화
특정한 실시 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 Slit2-MM3 폴리펩티드를 고려한다:
Figure pct00053
도 11에 설명된 바와 같이, VLR 가변 위치에서의 아미노산의 하위세트가 대다수의 항원 접촉을 만든다. MM3 VLR mAb의 오목한 표면 상의 β-가닥은 이러한 아미노산 잔기들 중 총 13개 (4개의 Tyr, 2개의 Trp, 4개의 Asn, 2개의 Asp 및 1개의 His)를 포함한다. 인간화 MM3 (huMM3-1)은 RBC36 LRRCT 삽입체와 동일한 위치에 그래프팅된 MM3 LRRCT 삽입체 및 Slit2-D2 스캐폴드 상의 상응하는 위치들 내로 치환되는 이러한 잔기를 포함한다. 도 12는 어떻게 이러한 접근법이 MM3의 2개의 가장 C-말단인 LRR 모듈 (LRRVe 및 LRRCP)에 적용되는지를 도시한다. 이 도면은 가변 아미노 위치가 회색으로 음영 처리된 VLR 및 이러한 모듈을 위한 인간 Slit2-D2 모듈 및 MM3의 정렬을 도시한다. 이러한 예에서, MM3 LRRVe로부터의 Tyr, Asp 및 2개의 Asn 잔기, 및 MM3 LRRCP로부터의 His, Trp 및 Tyr은 Slit2-D2 스캐폴드 상으로 치환된다. MM3 LRRCP에서의 Gln 잔기는 처음 구성물에서 치환되지 않으며, 그 이유는 이것이 가장 빈번하게 항원과 접촉하는 VLR 아미노산의 하위세트 내에 있지는 않지만 이것이 부가될 수 있기 때문이다. 이러한 접근법은 다른 LRR 모듈 (LRRV, LRR1 및 LRRNT)에 적용된다.
용해성 IgG-Fc 융합 단백질로서 그리고 효모 표면 디스플레이 포맷에서 HuMM3-1을 발현시켜서 항원 결합성을 평가하였다. 효모 디스플레이 포맷에서, MM3+ 세포로부터의 비오티닐화 용해물을 이용한 huMM3 발현 효모의 염색 및 검출을 위한 스트렙타비딘-PE의 사용에 의해 항원 결합성을 결정한다. RBC36 인간화에 사용한 것과 유사한 접근법에 따라, MM3의 가변 위치로부터의 추가의 잔기를 huMM3-1 스캐폴드 상에 반복적으로 포함시킬 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Emory University Herrin, Brantley R. Cooper, Max Dale Ehrhardt, Rudolf <120> HUMANIZED VARIABLE LYMPHOCYTE RECEPTORS (VLR) AND COMPOSITIONS AND USES RELATED THERETO <130> 13203 PCT <150> US 61/987,566 <151> 2014-05-02 <160> 78 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 213 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Cys Pro Ala Ala Cys Thr Cys Ser Asn Asn Thr Val Asp Cys Arg Ser 1 5 10 15 Lys Gly Leu Thr Glu Ile Pro Thr Asn Leu Pro Glu Thr Ile Thr Ile 20 25 30 Ile Tyr Leu His Asp Asn Thr Ile Lys Val Ile Pro Pro Gly Ala Phe 35 40 45 Ser Pro Tyr Lys Lys Leu Arg Glu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Gln Ile 50 55 60 Ser Glu Leu Ala Pro Asp Ala Phe Gln Gly Leu Arg Ser Leu Asn Val 65 70 75 80 Leu Asp Leu Gly Thr Asn Lys Ile Thr Glu Leu Pro Lys Ser Leu Phe 85 90 95 Glu Gly Leu Phe Ser Leu Gln Glu Leu Phe Leu Cys Cys Asn Lys Ile 100 105 110 Asn Cys Leu Arg Val Asp Ala Phe Gln Asp Leu His Asn Leu Asn His 115 120 125 Leu Ala Leu Asp Gln Asn Lys Leu Gln Thr Ile Ala Lys Gly Thr Phe 130 135 140 Ser Pro Leu Arg Ala Ile Gln His Met Tyr Leu Phe Gly Asn 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naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (106)..(106) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (108)..(109) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (128)..(128) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (130)..(130) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (132)..(133) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (152)..(152) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (154)..(154) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (156)..(157) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (175)..(189) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 10 Cys Pro Ala Ala Cys Thr Cys Ser Asn Asn Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa 1 5 10 15 Lys Gly Leu Thr Glu 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can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 21 Xaa Xaa Leu Xaa Leu Xaa Xaa 1 5 <210> 22 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 22 Cys Pro Xaa Xaa Cys Thr Cys Ser Xaa Asn Xaa Val Asp Cys Arg Gly 1 5 10 15 Lys Xaa Xaa <210> 23 <211> 47 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 23 Xaa Leu Xaa Leu Xaa Xaa Asn Lys Leu Gln Thr Ile Ala Lys Gly Thr 1 5 10 15 Phe Ser Pro Leu Arg Ala Ile Gln Xaa Met Xaa Leu Xaa Xaa Asn Pro 20 25 30 Phe Ile Cys Asp Cys His Leu Lys Trp Leu Ala Asp Tyr Leu His 35 40 45 <210> 24 <211> 213 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (114)..(114) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 24 Cys Pro Ala Ala Cys Thr Cys Ser Asn Asn Ile Val Asp Cys Arg Gly 1 5 10 15 Lys Gly Leu Thr Glu Ile Pro Thr Asn Leu Pro Glu Thr Ile Thr Glu 20 25 30 Ile Arg Leu Glu Gln Asn Thr Ile Lys Val Ile Pro Pro Gly Ala Phe 35 40 45 Ser Pro Tyr Lys 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<220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (23)..(26) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (32)..(33) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (41)..(42) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (44)..(47) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (49)..(50) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (52)..(52) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (54)..(56) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (58)..(58) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (60)..(60) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 25 Val Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Ser Val Pro Ala Xaa Ile Pro 1 5 10 15 Thr Thr Thr Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Ile Thr Lys Xaa 20 25 30 Xaa Pro Gly Val Phe Asp Xaa Leu Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Leu 35 40 45 Xaa Xaa Asn Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Gly Xaa Phe Asp 50 55 60 <210> 26 <211> 212 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (11)..(13) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (34)..(37) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (56)..(56) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (58)..(61) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (80)..(80) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (82)..(82) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (84)..(85) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (104)..(104) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (106)..(106) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (108)..(109) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (128)..(128) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (130)..(130) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (132)..(133) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (152)..(152) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (154)..(154) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (156)..(157) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (174)..(189) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 26 Cys Pro Ala Ala Cys Thr Cys Ser Asn Asn Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa 1 5 10 15 Lys Gly Leu Thr Glu Ile Pro Thr Asn Leu Pro Glu Thr Ile Thr Xaa 20 25 30 Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Thr Ile Lys Val Ile Pro Pro Gly Ala Phe 35 40 45 Ser Pro Tyr Lys Lys Leu Arg Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Gln Ile 50 55 60 Ser Glu Leu Ala Pro Asp Ala Phe Gln Gly Leu Arg Ser Leu Asn Xaa 65 70 75 80 Leu Xaa Leu Xaa Xaa Asn Lys Ile Thr Glu Leu Pro Lys Ser Leu Phe 85 90 95 Glu Gly Leu Phe Ser Leu Gln Xaa Leu Xaa Leu Xaa Xaa Asn Lys Ile 100 105 110 Asn 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<221> misc_feature <222> (82)..(82) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (84)..(85) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (104)..(104) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (106)..(106) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (108)..(109) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (128)..(128) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (130)..(130) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (132)..(133) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (152)..(152) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (154)..(154) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (156)..(157) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (174)..(189) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 27 Cys Pro Ala Ala Cys Thr Cys Ser Asn Asn Ile Val Asp Cys Arg Gly 1 5 10 15 Lys Gly Leu Thr Glu Ile Pro Thr Asn Leu Pro Glu Thr Ile Thr Xaa 20 25 30 Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Thr Ile Lys Val Ile Pro Pro Gly Ala Phe 35 40 45 Ser Pro Tyr Lys Lys Leu Arg Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Gln Ile 50 55 60 Ser Glu Leu Ala Pro Asp Ala Phe Gln Gly Leu Arg Ser Leu Asn Xaa 65 70 75 80 Leu Xaa Leu Xaa Xaa Asn Lys Ile Thr Glu Leu Pro Lys Ser Leu Phe 85 90 95 Glu Gly Leu Phe Ser Leu Gln Xaa Leu Xaa Leu Xaa Xaa Asn Lys Ile 100 105 110 Asn Cys Leu Arg Val Asp Ala Phe Gln Asp Leu His Asn Leu Asn Xaa 115 120 125 Leu Xaa Leu Xaa Xaa Asn Lys Leu Gln Thr Ile Ala Lys Gly Thr Phe 130 135 140 Ser Pro Leu Arg Ala Ile Gln Xaa Met Xaa Leu Xaa Xaa Asn Pro Phe 145 150 155 160 Ile Cys Asp Cys His Leu Lys Trp Leu Ala Asp Tyr Leu Xaa Xaa Xaa 165 170 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 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misc_feature <222> (130)..(130) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (132)..(133) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (152)..(152) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (154)..(154) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (156)..(157) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (174)..(187) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 28 Cys Pro Ala Ala Cys Thr Cys Ser Asn Asn Ile Val Asp Cys Arg Gly 1 5 10 15 Lys Gly Leu Thr Glu Ile Pro Thr Asn Leu Pro Glu Thr Ile Thr Glu 20 25 30 Ile Arg Leu Glu Gln Asn Thr Ile Lys Val Ile Pro Pro Gly Ala Phe 35 40 45 Ser Pro Tyr Lys Lys Leu Arg Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Gln Ile 50 55 60 Ser Glu Leu Ala Pro Asp Ala Phe Gln Gly Leu Arg Ser Leu Asn Xaa 65 70 75 80 Leu Xaa Leu Xaa Xaa Asn Lys Ile Thr Glu Leu Pro Lys Ser 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naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (62)..(63) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (82)..(82) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (84)..(84) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (86)..(87) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (104)..(119) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 35 Ala Phe Gln Gly Leu Arg Ser Leu Asn Xaa Leu Xaa Leu Xaa Xaa Asn 1 5 10 15 Lys Ile Thr Glu Leu Pro Lys Ser Leu Phe Glu Gly Leu Phe Ser Leu 20 25 30 Gln Xaa Leu Xaa Leu Xaa Xaa Asn Lys Ile Asn Cys Leu Arg Val Asp 35 40 45 Ala Phe Gln Asp Leu His Asn Leu Asn Xaa Leu Xaa Leu Xaa Xaa Asn 50 55 60 Lys Leu Gln Thr Ile Ala Lys Gly Thr Phe Ser Pro Leu Arg Ala Ile 65 70 75 80 Gln Xaa Met Xaa Leu Xaa Xaa Asn Pro Phe Ile Cys Asp Cys His Leu 85 90 95 Lys Trp Leu Ala Asp Tyr Leu Xaa Xaa Xaa Xaa 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<220> <221> misc_feature <222> (73)..(73) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (75)..(76) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 36 Xaa Leu Xaa Gly Asn Lys Ile Thr Glu Leu Pro Lys Ser Leu Phe Glu 1 5 10 15 Gly Leu Phe Ser Leu Gln Xaa Leu Xaa Leu Xaa Xaa Asn Lys Ile Asn 20 25 30 Cys Leu Arg Val Asp Ala Phe Gln Asp Leu His Asn Leu Asn Xaa Leu 35 40 45 Xaa Leu Xaa Xaa Asn Lys Leu Gln Thr Ile Ala Lys Gly Thr Phe Ser 50 55 60 Pro Leu Arg Ala Ile Gln Xaa Met Xaa Leu Xaa Xaa 65 70 75 <210> 37 <211> 54 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (49)..(49) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (51)..(51) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (53)..(54) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 37 Xaa Leu Xaa Leu Xaa Xaa Asn Lys Ile Asn Cys Leu Arg Val Asp Ala 1 5 10 15 Phe Gln Asp Leu His Asn Leu Asn Xaa Leu Xaa Leu Xaa Xaa Asn Lys 20 25 30 Leu Gln Thr Ile Ala Lys Gly Thr Phe Ser Pro Leu Arg Ala Ile Gln 35 40 45 Xaa Met Xaa Leu Xaa Xaa 50 <210> 38 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Xaa can be any naturally 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(58)..(61) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (80)..(80) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (82)..(82) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (84)..(85) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (104)..(104) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (106)..(106) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (108)..(109) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (157)..(157) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (174)..(189) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 39 Cys Pro Ala Ala Cys Thr Cys Ser Asn Asn Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa 1 5 10 15 Lys Gly Leu Thr Glu Ile Pro Thr Asn Leu Pro Glu Thr Ile Thr Xaa 20 25 30 Ile Xaa Xaa Xaa Xaa 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<222> (34)..(37) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (56)..(56) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (58)..(61) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (80)..(80) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (82)..(82) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (84)..(85) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (104)..(104) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (106)..(106) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (108)..(109) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (157)..(157) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (174)..(189) <223> Xaa can be any naturally 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naturally occurring amino acid <400> 45 Cys Pro Ala Ala Cys Thr Cys Ser Asn Asn Ile Val Asp Cys Arg Gly 1 5 10 15 Lys Gly Leu Thr Glu Ile Pro Thr Asn Leu Pro Glu Thr Ile Thr Glu 20 25 30 Ile Arg Leu Glu Gln Asn Thr Ile Lys Val Ile Pro Pro Gly Ala Phe 35 40 45 Ser Pro Tyr Lys Lys Leu Arg Arg Ile Asp Leu Ser Asn Asn Gln Ile 50 55 60 Ser Glu Leu Ala Pro Asp Ala Phe Gln Gly Leu Arg Ser Leu Asn Ser 65 70 75 80 Leu Val Leu Tyr Gly Asn Lys Ile Thr Glu Leu Pro Lys Ser Leu Phe 85 90 95 Glu Gly Leu Phe Ser Leu Gln Leu Leu Leu Leu Asn Ala Asn Lys Ile 100 105 110 Asn Cys Leu Arg Val Asp Ala Phe Gln Asp Leu His Asn Leu Asn Tyr 115 120 125 Leu Asp Leu Asn Asn Asn Lys Leu Gln Thr Ile Ala Lys Gly Thr Phe 130 135 140 Ser Pro Leu Arg Ala Ile Gln His Met Trp Leu Tyr Xaa Asn Pro Phe 145 150 155 160 Ile Cys Asp Cys His Leu Lys Trp Leu Ala Asp Tyr Leu Xaa Xaa Xaa 165 170 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Cys Thr 180 185 190 Ser Pro Arg Arg Leu Ala Asn 195 <210> 46 <211> 182 <212> 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(140)..(140) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (157)..(172) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 46 Gly Leu Thr Glu Ile Pro Thr Asn Leu Pro Glu Thr Ile Thr Xaa Ile 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Thr Ile Lys Val Ile Pro Pro Gly Ala Phe Ser 20 25 30 Pro Tyr Lys Lys Leu Arg Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Gln Ile Ser 35 40 45 Glu Leu Ala Pro Asp Ala Phe Gln Gly Leu Arg Ser Leu Asn Xaa Leu 50 55 60 Xaa Leu Xaa Xaa Asn Lys Ile Thr Glu Leu Pro Lys Ser Leu Phe Glu 65 70 75 80 Gly Leu Phe Ser Leu Gln Xaa Leu Xaa Leu Xaa Xaa Asn Lys Ile Asn 85 90 95 Cys Leu Arg Val Asp Ala Phe Gln Asp Leu His Asn Leu Asn Tyr Leu 100 105 110 Asp Leu Asn Asn Asn Lys Leu Gln Thr Ile Ala Lys Gly Thr Phe Ser 115 120 125 Pro Leu Arg Ala Ile Gln His Met Trp Leu Tyr Xaa Asn Pro Phe Ile 130 135 140 Cys Asp Cys His Leu Lys Trp Leu Ala Asp Tyr Leu Xaa Xaa Xaa Xaa 145 150 155 160 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Cys Thr Ser 165 170 175 Pro Arg Arg Leu Ala Asn 180 <210> 47 <211> 153 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (12)..(15) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (38)..(39) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (58)..(58) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (60)..(60) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (62)..(63) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (111)..(111) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (128)..(143) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 47 Ala Phe Ser Pro Tyr Lys Lys Leu Arg Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Asn 1 5 10 15 Gln Ile Ser Glu Leu Ala Pro Asp Ala Phe Gln Gly Leu Arg Ser Leu 20 25 30 Asn Xaa Leu Xaa Leu Xaa Xaa Asn Lys Ile Thr Glu Leu Pro Lys Ser 35 40 45 Leu Phe Glu Gly Leu Phe Ser Leu Gln Xaa Leu Xaa Leu Xaa Xaa Asn 50 55 60 Lys Ile Asn Cys Leu Arg Val Asp Ala Phe Gln Asp Leu His Asn Leu 65 70 75 80 Asn Tyr Leu Asp Leu Asn Asn Asn Lys Leu Gln Thr Ile Ala Lys Gly 85 90 95 Thr Phe Ser Pro Leu Arg Ala Ile Gln His Met Trp Leu Tyr Xaa Asn 100 105 110 Pro Phe Ile Cys Asp Cys His Leu Lys Trp Leu Ala Asp Tyr Leu Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg 130 135 140 Cys Thr Ser Pro Arg Arg Leu Ala Asn 145 150 <210> 48 <211> 129 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (38)..(39) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (87)..(87) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (104)..(119) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 48 Ala Phe Gln Gly Leu Arg Ser Leu Asn Xaa Leu Xaa Leu Xaa Xaa Asn 1 5 10 15 Lys Ile Thr Glu Leu Pro Lys Ser Leu Phe Glu Gly Leu Phe Ser Leu 20 25 30 Gln Xaa Leu Xaa Leu Xaa Xaa Asn Lys Ile Asn Cys Leu Arg Val Asp 35 40 45 Ala Phe Gln Asp Leu His Asn Leu Asn Tyr Leu Asp Leu Asn Asn Asn 50 55 60 Lys Leu Gln Thr Ile Ala Lys Gly Thr Phe Ser Pro Leu Arg Ala Ile 65 70 75 80 Gln His Met Trp Leu Tyr Xaa Asn Pro Phe Ile Cys Asp Cys His Leu 85 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Leu Asp Leu Asn Asn Asn Lys Leu Gln Thr Ile Ala Lys Gly Thr Phe 50 55 60 Ser Pro Leu Arg Ala Ile Gln His Met Trp Leu Tyr Xaa Asn Pro Phe 65 70 75 80 Ile Cys Asp Cys His Leu Lys Trp Leu Ala Asp Tyr Leu 85 90 <210> 50 <211> 72 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (56)..(56) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 50 Leu Gln Xaa Leu Xaa Leu Xaa Xaa Asn Lys Ile Asn Cys Leu Arg Val 1 5 10 15 Asp Ala Phe Gln Asp Leu His Asn Leu Asn Tyr Leu Asp Leu Asn Asn 20 25 30 Asn Lys Leu Gln Thr Ile Ala Lys Gly Thr Phe Ser Pro Leu Arg Ala 35 40 45 Ile Gln His Met Trp Leu Tyr Xaa Asn Pro Phe Ile Cys Asp Cys His 50 55 60 Leu Lys Trp Leu Ala Asp Tyr Leu 65 70 <210> 51 <211> 55 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 51 Ala Phe Gln Asp Leu His Asn Leu Asn Tyr Leu Asp Leu Asn Asn Asn 1 5 10 15 Lys Leu Gln Thr Ile Ala Lys Gly Thr Phe Ser Pro Leu Arg Ala Ile 20 25 30 Gln His Met Trp Leu Tyr Xaa Asn Pro Phe Ile Cys Asp Cys His Leu 35 40 45 Lys Trp Leu Ala Asp Tyr Leu 50 55 <210> 52 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (5)..(12) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 52 Tyr Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Leu 1 5 10 15 <210> 53 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 53 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 54 <211> 132 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ile Leu Thr Ala Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala 20 25 30 Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu 35 40 45 Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly 50 55 60 Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln 65 70 75 80 Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr 85 90 95 Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp 100 105 110 Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala 115 120 125 Leu His Met Gln 130 <210> 55 <211> 62 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Glu Pro Gln Leu Cys Tyr Ile Leu Asp Ala Ile Leu Phe Leu Tyr Gly 1 5 10 15 Ile Val Leu Thr Leu Leu Tyr Cys Arg Leu Lys Ile Gln Val Arg Lys 20 25 30 Ala Ala Ile Thr Ser Tyr Glu Lys Ser Asp Gly Val Tyr Thr Gly Leu 35 40 45 Ser Thr Arg Asn Gln Glu Thr Tyr Glu Thr Leu Lys His Glu 50 55 60 <210> 56 <211> 193 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Ala Cys Pro Ser Gln Cys Ser Cys Pro Gly Thr Asp Val Asn Cys His 1 5 10 15 Glu Arg Arg Leu Ala Ser Val Pro Ala Glu Ile Pro Thr Thr Thr Lys 20 25 30 Ile Leu Arg Leu Tyr Ile Asn Gln Ile Thr Lys Leu Glu Pro Gly Val 35 40 45 Phe Asp Arg Leu Thr Gln Leu Thr Gln Leu Gly Leu Trp Asp Asn Gln 50 55 60 Leu Gln Ala Leu Pro Glu Gly Val Phe Asp Arg Leu Val Asn Leu Gln 65 70 75 80 Lys Leu Tyr Leu Asn Gln Asn Gln Leu Leu Ala Leu Pro Val Gly Val 85 90 95 Phe Asp Lys Leu Thr Gln Leu Thr Tyr Leu Asp Leu Asn Asn Asn Gln 100 105 110 Leu Lys Ser Ile Pro Arg Gly Ala Phe Asp Asn Leu Lys Ser Leu Thr 115 120 125 His Ile Trp Leu Tyr Gly Asn Pro Trp Asp Cys Glu Cys Ser Asp Ile 130 135 140 Leu Tyr Leu Lys Asn Trp Ile Val Gln His Ala Ser Ile Val Asn Pro 145 150 155 160 His Pro Tyr Gly Gly Val Asp Asn Val Lys Cys Ser Gly Thr Asn Thr 165 170 175 Pro Val Arg Ala Val Thr Glu Ala Ser Thr Ser Pro Ser Lys Cys Pro 180 185 190 Gly <210> 57 <211> 294 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 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Leu Asn Asn Asn Lys Leu Gln Thr Ile Ala Lys Gly Thr Phe 130 135 140 Ser Pro Leu Arg Ala Ile Gln His Ile Trp Leu Tyr Gln Asn Pro Phe 145 150 155 160 Ile Cys Asp Cys His Leu Lys Trp Leu Ala Asp Tyr Leu Ile Val Gln 165 170 175 His Ala Ser Ile Val Asn Pro His Pro Tyr Gly Gly Val Asp Ala Arg 180 185 190 Cys Thr Ser Pro Arg Arg Leu Ala Asn 195 200 <210> 64 <211> 199 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Cys Pro Ala Ala Cys Thr Cys Ser Asn Asn Ile Val Asp Cys Arg Gly 1 5 10 15 Lys Gly Leu Thr Glu Ile Pro Thr Asn Leu Pro Glu Thr Ile Thr Glu 20 25 30 Ile Arg Leu Glu Gln Asn Thr Ile Lys Val Ile Pro Pro Gly Ala Phe 35 40 45 Ser Pro Tyr Lys Lys Leu Arg Ile Leu Arg Leu Tyr Ile Asn Gln Ile 50 55 60 Ser Glu Leu Ala Pro Asp Ala Phe Gln Gly Leu Arg Ser Leu Asn Gln 65 70 75 80 Leu Val Leu Trp Asp Asn Lys Ile Thr Glu Leu Pro Lys Ser Leu Phe 85 90 95 Glu Gly Leu Phe Ser Leu Gln Leu Leu Tyr Leu Asn Ala Asn Lys Ile 100 105 110 Asn Cys Leu Arg Val Asp Ala Phe Gln Asp Leu His Asn Leu Asn Tyr 115 120 125 Leu Asp Leu Asn Asn Asn Lys Leu Gln Thr Ile Ala Lys Gly Thr Phe 130 135 140 Ser Pro Leu Arg Ala Ile Gln His Ile Trp Leu Tyr Gly Asn Pro Phe 145 150 155 160 Ile Cys Asp Cys His Leu Lys Trp Leu Ala Asp Tyr Leu His Ala Ser 165 170 175 Ile Val Asn Pro His Pro Tyr Gly Gly Val Asp Asn Ala Arg Cys Thr 180 185 190 Ser Pro Arg Arg Leu Ala Asn 195 <210> 65 <211> 71 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (49)..(49) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (51)..(51) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (53)..(54) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 65 Xaa Leu Xaa Leu Xaa Xaa Asn Lys Ile Asn Cys Leu Arg Val Asp Ala 1 5 10 15 Phe Gln Asp Leu His Asn Leu Asn Xaa Leu Xaa Leu Xaa Xaa Asn Lys 20 25 30 Leu Gln Thr Ile Ala Lys Gly Thr Phe Ser Pro Leu Arg Ala Ile Gln 35 40 45 Xaa Met Xaa Leu Xaa Xaa Asn Pro Phe Ile Cys Asp Cys His Leu Lys 50 55 60 Trp Leu Ala Asp Tyr Leu His 65 70 <210> 66 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 Tyr Leu Asp Leu Asn Asn Asn Lys Leu Gln Thr Ile Ala Lys Gly Thr 1 5 10 15 Phe Gly Thr Phe Ser Pro Leu Arg Ala Ile Gln His Met Trp Leu Tyr 20 25 30 <210> 67 <211> 33 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Tyr Leu Asp Leu Asn Asn Asn Lys Leu Gln Thr Ile Ala Lys Gly Thr 1 5 10 15 Phe Gly Thr Phe Ser Pro Leu Arg Ala Ile Gln His Met Trp Leu Tyr 20 25 30 Gln <210> 68 <211> 33 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Tyr Leu Asp Leu Asn Asn Asn Lys Leu Gln Thr Ile Ala Lys Gly Thr 1 5 10 15 Phe Gly Thr Phe Ser Pro Leu Arg Ala Ile Gln His Met Trp Leu Tyr 20 25 30 Gly <210> 69 <211> 43 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Lys Leu Thr Gln Leu Thr Tyr Leu Asp Leu Asn Asn Asn Gln Leu Lys 1 5 10 15 Ser Ile Pro Arg Gly Ala Phe Asp Asn Leu Lys Ser Leu Thr His Ile 20 25 30 Trp Leu Tyr Gly Asn Pro Trp Asp Cys Glu Cys 35 40 <210> 70 <211> 43 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Asp Leu His Asn Leu Asn Leu Leu Ser Leu Tyr Asp Asn Lys Leu Gln 1 5 10 15 Thr Ile Ala Lys Gly Thr Phe Ser Pro Leu Arg Ala Ile Gln Thr Met 20 25 30 His Leu Ala Gln Asn Pro Phe Ile Cys Asp Cys 35 40 <210> 71 <211> 43 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 Asp Leu His Asn Leu Asn Tyr Leu Asp Leu Asn Asn Asn Lys Leu Gln 1 5 10 15 Thr Ile Ala Lys Gly Thr Phe Ser Pro Leu Arg Ala Ile Gln His Met 20 25 30 Trp Leu Tyr Gln Asn Pro Phe Ile Cys Asp Cys 35 40 <210> 72 <211> 206 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72 Cys Pro Ala Ala Cys Thr Cys Ser Asn Asn Ile Val Asp Cys Arg Gly 1 5 10 15 Lys Gly Leu Thr Glu Ile Pro Thr Asn Leu Pro Glu Thr Ile Thr Glu 20 25 30 Ile Arg Leu Glu Gln Asn Thr Ile Lys Val Ile Pro Pro Gly Ala Phe 35 40 45 Ser Pro Tyr Lys Lys Leu Arg Arg Ile Asp Leu Ser Asn Asn Gln Ile 50 55 60 Ser Glu Leu Ala Pro Asp Ala Phe Gln Gly Leu Arg Ser Leu Asn Ser 65 70 75 80 Leu Val Leu Tyr Gly Asn Lys Ile Thr Glu Leu Pro Lys Ser Leu Phe 85 90 95 Glu Gly Leu Phe Ser Leu Gln Leu Leu Leu Leu Asn Ala Asn Lys Ile 100 105 110 Asn Cys Leu Arg Val Asp Ala Phe Gln Asp Leu His Asn Leu Asn Leu 115 120 125 Leu Ser Leu Tyr Asp Asn Lys Leu Gln Thr Ile Ala Lys Gly Thr Phe 130 135 140 Ser Pro Leu Arg Ala Ile Gln Thr Met His Leu Ala Gln Asn Pro Phe 145 150 155 160 Ile Cys Asp Cys His Leu Lys Trp Leu Ala Asp Tyr Leu His Thr Asn 165 170 175 Pro Ile Glu Thr Ser Gly Ala Arg Cys Thr Ser Pro Arg Arg Leu Ala 180 185 190 Asn Lys Arg Ile Gly Gln Ile Lys Ser Lys Lys Phe Arg Cys 195 200 205 <210> 73 <211> 199 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73 Ala Cys Pro Ser Gln Cys Ser Cys Ser Gly Thr Thr Val Asp Cys Arg 1 5 10 15 Ser Lys Arg His Ala Ser Val Pro Ala Gly Ile Pro Thr Asn Ala Gln 20 25 30 Ile Leu Tyr Leu His Asp Asn Gln Ile Thr Lys Leu Glu Pro Gly Val 35 40 45 Phe Asp Ser Leu Ile Asn Leu Lys Glu Leu Tyr Leu Gly Ser Asn Gln 50 55 60 Leu Gly Ala Leu Pro Val Gly Val Phe Asp Ser Leu Thr Gln Leu Thr 65 70 75 80 Val Leu Asp Leu Gly Thr Asn Gln Leu Thr Val Leu Pro Ser Ala Val 85 90 95 Phe Asp Arg Leu Val His Leu Lys Glu Leu Phe Met Cys Cys Asn Lys 100 105 110 Leu Thr Glu Leu Pro Arg Gly Ile Glu Arg Leu Thr His Leu Thr His 115 120 125 Leu Ala Leu Asp Gln Asn Gln Leu Lys Ser Ile Pro His Gly Ala Phe 130 135 140 Asp Arg Leu Ser Ser Leu Thr His Ala Tyr Leu Phe Gly Asn Pro Trp 145 150 155 160 Asp Cys Glu Cys Arg Asp Ile Met Tyr Leu Arg Asn Trp Val Ala Asp 165 170 175 His Thr Ser Ile Ala Met Arg Trp Asp Gly Lys Ala Val Asn Asp Pro 180 185 190 Asp Ser Ala Lys Cys Ala Gly 195 <210> 74 <211> 200 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74 Cys Pro Ala Ala Cys Thr Cys Ser Asn Asn Ile Val Asp Cys Arg Gly 1 5 10 15 Lys Gly Leu Thr Glu Ile Pro Thr Asn Leu Pro Glu Thr Ile Thr Glu 20 25 30 Ile Arg Leu Glu Gln Asn Thr Ile Lys Val Ile Pro Pro Gly Ala Phe 35 40 45 Ser Pro Tyr Lys Lys Leu Arg Ile Leu Arg Leu Tyr Ile Asn Gln Ile 50 55 60 Ser Glu Leu Ala Pro Asp Ala Phe Gln Gly Leu Arg Ser Leu Asn Gln 65 70 75 80 Leu Val Leu Trp Asp Asn Lys Ile Thr Glu Leu Pro Lys Ser Leu Phe 85 90 95 Glu Gly Leu Phe Ser Leu Gln Leu Leu Tyr Leu Asn Ala Asn Lys Ile 100 105 110 Asn Cys Leu Arg Val Asp Ala Phe Gln Asp Leu His Asn Leu Asn Tyr 115 120 125 Leu Asp Leu Asn Asn Asn Lys Leu Gln Thr Ile Ala Lys Gly Thr Phe 130 135 140 Ser Pro Leu Arg Ala Ile Gln His Ile Trp Leu Tyr Gly Asn Pro Phe 145 150 155 160 Ile Cys Asp Cys His Leu Lys Trp Leu Ala Asp Tyr Leu His His Ala 165 170 175 Ser Ile Val Asn Pro His Pro Tyr Gly Gly Val Asp Asn Ala Arg Cys 180 185 190 Thr Ser Pro Arg Arg Leu Ala Asn 195 200 <210> 75 <211> 200 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Cys Pro Ala Ala Cys Thr Cys Ser Asn Asn Ile Val Asp Cys Arg Gly 1 5 10 15 Lys Gly Leu Thr Glu Ile Pro Thr Asn Leu Pro Glu Thr Ile Thr Glu 20 25 30 Ile Arg Leu Glu Gln Asn Thr Ile Lys Val Ile Pro Pro Gly Ala Phe 35 40 45 Ser Pro Tyr Lys Lys Leu Arg Ile Leu Arg Leu Tyr Ile Asn Gln Ile 50 55 60 Ser Glu Leu Ala Pro Asp Ala Phe Gln Gly Leu Arg Ser Leu Asn Gln 65 70 75 80 Leu Val Leu Trp Asp Asn Lys Ile Thr Glu Leu Pro Lys Ser Leu Phe 85 90 95 Glu Gly Leu Phe Ser Leu Gln Leu Leu Tyr Leu Asn Ala Asn Lys Ile 100 105 110 Asn Cys Leu Arg Val Asp Ala Phe Gln Asp Leu His Asn Leu Asn Tyr 115 120 125 Leu Asp Leu Asn Asn Asn Lys Leu Gln Thr Ile Ala Lys Gly Thr Phe 130 135 140 Ser Pro Leu Arg Ala Ile Gln His Ile Trp Leu Tyr Gly Asn Pro Phe 145 150 155 160 Ile Cys Asp Cys His Leu Lys Trp Leu Ala Asp Tyr Leu His Thr His 165 170 175 Ala Ser Ile Val Asn Pro His Pro Tyr Gly Gly Val Asp Asn Arg Cys 180 185 190 Thr Ser Pro Arg Arg Leu Ala Asn 195 200 <210> 76 <211> 202 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 Cys Pro Ala Ala Cys Thr Cys Ser Asn Asn Ile Val Asp Cys Arg Gly 1 5 10 15 Lys Gly Leu Thr Glu Ile Pro Thr Asn Leu Pro Glu Thr Ile Thr Glu 20 25 30 Ile Arg Leu Glu Gln Asn Thr Ile Lys Val Ile Pro Pro Gly Ala Phe 35 40 45 Ser Pro Tyr Lys Lys Leu Arg Ile Leu Arg Leu Tyr Ile Asn Gln Ile 50 55 60 Ser Glu Leu Ala Pro Asp Ala Phe Gln Gly Leu Arg Ser Leu Asn Gln 65 70 75 80 Leu Val Leu Trp Asp Asn Lys Ile Thr Glu Leu Pro Lys Ser Leu Phe 85 90 95 Glu Gly Leu Phe Ser Leu Gln Leu Leu Tyr Leu Asn Ala Asn Lys Ile 100 105 110 Asn Cys Leu Arg Val Asp Ala Phe Gln Asp Leu His Asn Leu Asn Tyr 115 120 125 Leu Asp Leu Asn Asn Asn Lys Leu Gln Thr Ile Ala Lys Gly Thr Phe 130 135 140 Ser Pro Leu Arg Ala Ile Gln His Ile Trp Leu Tyr Gly Asn Pro Phe 145 150 155 160 Ile Cys Asp Cys His Leu Lys Trp Leu Ala Asp Tyr Leu His Thr Asn 165 170 175 His Ala Ser Ile Val Asn Pro His Pro Tyr Gly Gly Val Asp Asn Ala 180 185 190 Arg Cys Thr Ser Pro Arg Arg Leu Ala Asn 195 200 <210> 77 <211> 202 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77 Cys Pro Ala Ala Cys Thr Cys Ser Asn Asn Ile Val Asp Cys Arg Gly 1 5 10 15 Lys Gly Leu Thr Glu Ile Pro Thr Asn Leu Pro Glu Thr Ile Thr Glu 20 25 30 Ile Arg Leu Glu Gln Asn Thr Ile Lys Val Ile Pro Pro Gly Ala Phe 35 40 45 Ser Pro Tyr Lys Lys Leu Arg Ile Leu Arg Leu Tyr Ile Asn Gln Ile 50 55 60 Ser Glu Leu Ala Pro Asp Ala Phe Gln Gly Leu Arg Ser Leu Asn Gln 65 70 75 80 Leu Val Leu Trp Asp Asn Lys Ile Thr Glu Leu Pro Lys Ser Leu Phe 85 90 95 Glu Gly Leu Phe Ser Leu Gln Leu Leu Tyr Leu Asn Ala Asn Lys Ile 100 105 110 Asn Cys Leu Arg Val Asp Ala Phe Gln Asp Leu His Asn Leu Asn Tyr 115 120 125 Leu Asp Leu Asn Asn Asn Lys Leu Gln Thr Ile Ala Lys Gly Thr Phe 130 135 140 Ser Pro Leu Arg Ala Ile Gln His Ile Trp Leu Tyr Gly Asn Pro Phe 145 150 155 160 Ile Cys Asp Cys His Leu Lys Trp Leu Ala Asp Tyr Leu His Thr Asn 165 170 175 Pro His Ala Ser Ile Val Asn Pro His Pro Tyr Gly Gly Val Asp Asn 180 185 190 Arg Cys Thr Ser Pro Arg Arg Leu Ala Asn 195 200 <210> 78 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Cys Asp Cys His Leu Lys Trp Leu Ala Asp Tyr Leu 1 5 10

Claims (22)

  1. 분자에 결합하는 무턱 척추 동물의 가변 림프구 수용체 (variable lymphocyte receptor; VLR)의 아미노산 서열을 제공하는 단계;
    가변 림프구 수용체에서의 어떠한 아미노산이 결합된 분자에 가장 가까운 공간적 근접 상태로 있고/있거나 이온 상호작용, 및/또는 수소 결합을 제공하고/하거나 결합된 분자에 반 데르 발스 (Van der Waals) 힘을 제공하여 가변 림프구 수용체에서의 표적 아미노산을 제공하는지를 추정하는 단계;
    가변 림프구 수용체 (VLR) 아미노산 서열에 대하여 20% 초과의 또는 이보다 더 큰 서열 동일성을 갖는 공지된 인간 아미노산 서열을 제공하는 단계;
    공지된 인간 아미노산 서열 내에서 가변 림프구 수용체에서의 상기 표적 아미노산 및 표적 아미노산을 둘러싸고 있는 충분한 수의 아미노산을 치환하여 분자에 특이적으로 결합하도록 구성된 변형된 인간 아미노산 서열을 제공하는 단계; 및
    재조합 핵산으로부터의 변형된 인간 아미노산 서열을 발현시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 만들어진, 분자에 특이적으로 결합하는 단리된 변형 인간 아미노산 서열.
  2. 제1항에 있어서, 가변 림프구 수용체는 칠성장어 가변 림프구 수용체 B (VLRB)인 단리된 변형 인간 아미노산 서열.
  3. 제1항에 있어서, 공지된 인간 아미노산 서열은 인간 류신-풍부 반복 수용체인 단리된 변형 인간 아미노산 서열.
  4. 제1항에 있어서, 공지된 인간 아미노산 서열은 Slit-패밀리 (family) 단백질 (Slit 1, 2, 및 3), CD42b, 또는 Nogo-66인 단리된 변형 인간 아미노산 서열.
  5. 제1항에 있어서, 분자는 바이러스 또는 미생물 항원인 단리된 변형 인간 아미노산 서열.
  6. 제5항에 있어서, 바이러스 또는 미생물 항원은 바실루스 안트라시스 (Bacillus anthracis), 인플루엔자 (Influenza) 또는 HIV-1 항원인 단리된 변형 인간 아미노산 서열.
  7. 제1항에 있어서, 분자는 종양 결부된 항원인 단리된 변형 인간 아미노산 서열.
  8. 제1항에 있어서, 분자는 정상 또는 악성 인간 세포와 특이적으로 결부되는 단리된 변형 인간 아미노산 서열.
  9. 제8항에 있어서, 정상 또는 악성 인간 세포는 O형 혈액형의 적혈구, B 세포 백혈병 세포 또는 B 림프종 세포주인 단리된 변형 인간 아미노산 서열.
  10. 제1항의 단리된 변형 인간 아미노산 서열을 포함하는 재조합 벡터.
  11. 제12항의 벡터를 포함하는 발현 시스템.
  12. 누락
  13. 제1항의 변형 인간 아미노산 서열 및 Fc 서열을 포함하는 융합 단백질.
  14. 제13항의 융합 단백질을 포함하는 재조합 벡터.
  15. 제14항의 벡터를 포함하는 발현 시스템.
  16. 하기 서열을 포함하는 하나 이상의 서열을 포함하는 재조합 폴리펩티드:
    Figure pct00054

    (여기서, 각각의 위치의 X는 개별적으로 그리고 독립적으로 임의의 아미노산이되, 단, 폴리펩티드는 하기의, (서열 번호 16) LLSLYD, 및 (서열 번호 17) TMHLAQ로부터 선택되는 야생형 Slit2-D2 서열들 중 적어도 1가지를 포함하지 않음).
  17. 제16항에 있어서, 인간 Fc 서열을 추가로 포함하는 재조합 폴리펩티드.
  18. 제16항에 있어서, 하기 서열을 갖는 재조합 폴리펩티드:
    YLDLNNNKLQTIAKGTFGTFSPLRAIQHMWLY (서열 번호 66),
    YLDLNNNKLQTIAKGTFGTFSPLRAIQHMWLYQ (서열 번호 67), 또는
    YLDLNNNKLQTIAKGTFGTFSPLRAIQHMWLYG (서열 번호 68).
  19. 제16항에 있어서, 형질 세포에는 특이적으로 결합하는 것이 가능하지만 B 세포에는 특이적으로 결합하는 것이 가능하지 않은 재조합 폴리펩티드.
  20. 서열 번호 56의 서열, 이의 변이체를 포함하는 재조합 폴리펩티드.
  21. 제20항의 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터.
  22. 제21항의 벡터를 포함하는 발현 시스템.
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