CN103033617B - 基于可变淋巴细胞受体的肿瘤标志物检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种检测灵敏度高、储存与运输方便、有效期长且生产成本低廉的基于可变淋巴细胞受体（VLR）的肿瘤标志物检测试剂盒及其制备方法，与现有肿瘤标志物检测试剂盒一样有捕获试剂及检测试剂，所不同的是捕获试剂和检测试剂分别是与肿瘤标志物具有高特异性及高亲合力的重组可变淋巴细胞受体，使肿瘤标志物的临床检测更加简便，癌症早期诊断更加准确有效。

Description

基于可变淋巴细胞受体的肿瘤标志物检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种肿瘤标志物检测试剂盒及其制备方法，尤其是一种检测灵敏度高、储存与运输方便、有效期长且生产成本低廉的基于可变淋巴细胞受体（VLR）的肿瘤标志物检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

目前，对患者血清样品中肿瘤标志物的检测已被广泛的应用于癌症的早期诊断，同时对癌症在治疗过程中的病情监测及预后分析等都起到重要的辅助作用。肿瘤标志物已有很多种，常见的肿瘤标志物分为胚胎抗原、糖类抗原、天然自身抗原、细胞角蛋白、肿瘤相关的酶及激素等等，有些肿瘤标志物对不同类型的癌症检测具有广谱性，有些则对特定类型的肿瘤具有高灵敏性及特异性。几种代表性的肿瘤标志物有甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、胰胚胎抗原（pancreatic oncofetal antigen，POA）、糖类抗原（carbohydrate antigen，CA）等，其中糖类抗原还分为卵巢癌标志物CA125和HE4、乳腺癌标志物CA153 及胃癌标志物CA724等。

目前用于临床的肿瘤标志物检测方法主要有酶联免疫吸附测定法（ELISA）、化学发光免疫测定法（CLIA）及时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）等，并且市场上已经有相应的商品化检测试剂盒。它们的原理都是依赖抗体与抗原的特异性结合，通过检测标记抗体所发出的信号，来实现对样品中肿瘤标志物的定量分析，并且，这些肿瘤标志物检测试剂盒中都有捕获试剂和检测试剂，捕获试剂用于包被到固相基质，捕获待测样品中的肿瘤标志物抗原，检测试剂需要进行标记，用于检测结合到捕获试剂上的肿瘤标志物，两种试剂能够同时结合肿瘤标志物标准抗原且亲合力不相互影响。现有肿瘤标志物检测试剂盒中的捕获试剂和检测试剂都是利用高等哺乳动物的抗体，例如杂交瘤技术生产的单克隆抗体或从哺乳动物血清中纯化的多克隆抗体。但是抗体的制备技术复杂、生产成本高，而且分子稳定性差，需要冷冻保藏且保存期短。

以盲鳗和七鳃鳗为代表的无颌类脊椎动物，具有不同于高等哺乳动物的独特的适应性免疫系统。与高等哺乳动物的抗体即免疫球蛋白相对应，可变淋巴细胞受体（VLR）作为无颌类脊椎动物适应性免疫系统的核心免疫分子，具有特异性识别并结合外来抗原的功能。虽然可变淋巴细胞受体（VLR）与免疫球蛋白有着相似的功能，但是它们的分子结构、稳定性以及与抗原的结合方式存在着很大差别。研究表明，可变淋巴细胞受体（VLR）单体仅由一条肽链组成，相对分子质量在15kDa至45kDa之间，可以利用基因工程菌实现原核表达，生产成本低，适合大规模工业化生产。并且可变淋巴细胞受体（VLR）具有比抗体分子更高的稳定性、特异性和亲合力，其溶解状态在室温下放置一个月、4℃放置一年以上，仍然保持完整的抗原结合能力，同样浓度下VLR单体对特异性抗原的亲合力比抗体（IgG）高1000倍，而真核表达系统制备的VLR为同源十聚体，其抗原结合能力更强，因此VLR对抗原的识别更加灵敏。但是，迄今为止还没有关于将无颌类脊椎动物的可变淋巴细胞受体（VLR）替代捕获抗体及检测抗体应用于肿瘤标志物检测试剂盒的相关报道。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种检测灵敏度高、储存与运输方便、有效期长且生产成本低廉的基于可变淋巴细胞受体的肿瘤标志物检测试剂盒及其制备方法。

本发明的技术解决方案是：一种基于可变淋巴细胞受体的肿瘤标志物检测试剂盒，有捕获试剂及检测试剂，其特征在于：所述捕获试剂和检测试剂分别是与肿瘤标志物具有高特异性及高亲合力的重组可变淋巴细胞受体。

所述捕获试剂和检测试剂依次按如下步骤制备：

a. 以肿瘤标志物为抗原免疫无颌类脊椎动物，建立所免疫的无颌类脊椎动物可变淋巴细胞受体（VLR）酵母表面展示文库，通过酵母表面展示技术和流式细胞术筛选得到几个阳性克隆，这些阳性克隆是能够表达与肿瘤标志物具有高特异性、高亲合力的单克隆VLR的酵母；

b. 选取所表达的单克隆VLR与肿瘤标志物具有最高亲合力的一个阳性克隆，对其扩大培养并提取质粒DNA；回收编码VLR抗原结合区的DNA片段；将所回收的DNA片段与原核或真核表达载体重组，转化基因工程菌或转染真核表达宿主细胞，大量表达重组的单克隆VLR；采用与纯化标签相对应的纯化方法，获得高纯度的重组VLR；最后对重组VLR进行标记，作为检测VLR；

c. 将剩余的几个阳性克隆分别扩大培养，并诱导酵母细胞表达VLR。将每种表达VLR的酵母细胞与肿瘤标志物标准品孵育，使肿瘤标志物充分结合到酵母细胞表面的VLR上，离心收集酵母细胞；洗涤除去未与VLR结合的肿瘤标志物；再用缓冲液重新悬浮酵母细胞，加入b步骤所制备的检测VLR；待检测VLR与结合到酵母细胞表面的肿瘤标志物充分结合后，洗涤除去未结合的检测VLR；加入与检测VLR相对应的显色底物，挑取与最佳显色效果所对应的酵母，用于制备捕获VLR；

d. 对c步骤所得用于制备捕获VLR的酵母扩大培养并提取质粒DNA；回收编码VLR抗原结合区的DNA片段；用基因重组技术，将VLR基因的抗原结合区DNA与VLR基因的其它保守部分DNA连接，得到VLR基因的全长；将全长的VLR基因与真核表达载体重组，并转染真核宿主细胞；通过真核表达系统大量表达的VLR，作为捕获VLR。

所述a步骤的方法是以肿瘤标志物标准品为抗原，免疫刺激无颌类脊椎动物；取被免疫后动物的血液并分离类淋巴细胞；提取类淋巴细胞总RNA，并使用通用引物Oligo-dT将mRNA反转录成cDNA；根据VLR基因两端的保守区设计引物同时引入酶切位点，PCR扩增VLR基因的抗原结合区；将扩增得到的PCR产物与酵母表面展示载体重组，建立VLR酵母表面展示文库；重组质粒转化酵母细胞，经酵母表达系统异源表达，将VLR的抗原结合区展示到酵母细胞表面；通过流式细胞术富集筛选能够表达肿瘤标志物特异性VLR的酵母细胞。经过几轮筛选后，挑取几个阳性克隆，这些阳性克隆是能够表达与肿瘤标志物具有高特异性、高亲合力的单克隆VLR的酵母。 

本发明采用可变淋巴细胞受体（VLR）作为抗体的替代物，所制备的卵巢癌肿瘤标志物检测试剂盒具有检测灵敏度高，储存与运输方便，有效期长及生产成本低廉，使肿瘤标志物的临床检测更加简便，癌症早期诊断更加准确有效。

具体实施方式

实施例1：肿瘤标志物 ELISA检测试剂盒

ELISA检测试剂盒中的捕获试剂和检测试剂是由与肿瘤标志物具有高特异性及高亲合力的重组可变淋巴细胞受体（捕获VLR和检测VLR）替代现有肿瘤标志物 ELISA检测试剂盒中的捕获抗体和检测抗体，其余试剂等均与现有肿瘤标志物 ELISA检测试剂盒相同。

捕获VLR和检测VLR的制备方法是：

a. 是以卵巢癌肿瘤标志物CA125标准品为抗原，免疫刺激无颌类脊椎动物；取被免疫后动物的血液并分离类淋巴细胞；提取类淋巴细胞总RNA，并使用通用引物Oligo-dT将mRNA反转录成cDNA；根据VLR基因两端的保守区设计引物同时引入酶切位点，PCR扩增VLR基因的抗原结合区；将扩增得到的PCR产物与酵母表面展示载体重组，建立VLR酵母表面展示文库；重组质粒转化酵母细胞，经酵母表达系统异源表达，将VLR的抗原结合区展示到酵母细胞表面；通过流式细胞术富集筛选能够表达CA125特异性VLR的酵母细胞，经过几轮筛选后，挑取几个阳性克隆，这些阳性克隆是能够表达与肿瘤标志物具有高特异性、高亲合力的单克隆VLR的酵母；

b. 选取所表达的单克隆VLR与肿瘤标志物具有最高亲合力的一个阳性克隆，对其扩大培养并提取质粒DNA；所提取的质粒DNA经限制性内切酶消化，电泳切胶回收编码VLR抗原结合区的DNA片段；将所回收的DNA片段与原核表达载体重组，转化基因工程菌，大量表达重组的单克隆VLR；由原核表达系统合成的重组VLR带有纯化标签（例如His标签或GST标签等），采用与纯化标签相对应的纯化方法，获得高纯度的重组VLR；最后对重组VLR进行酶标记，作为检测VLR；用于测定结合到捕获VLR上的抗原；

c. 将剩余的几个阳性克隆分别扩大培养，并诱导酵母细胞表达VLR。将每种表达VLR的酵母细胞与肿瘤标志物标准品孵育，使肿瘤标志物充分结合到酵母细胞表面的VLR上，离心收集酵母细胞；用缓冲液将酵母细胞悬浮，再离心收集酵母细胞，重复操作几次，洗涤除去未与VLR结合的肿瘤标志物；再用缓冲液重新悬浮酵母细胞，加入b步骤所制备的检测VLR；待检测VLR与结合到酵母细胞表面的肿瘤标志物充分结合后，洗涤除去未结合的检测VLR；加入与检测VLR相对应的显色底物，挑取与最佳显色效果所对应的酵母，用于制备捕获VLR；

d. 对c步骤所得用于制备捕获VLR的酵母扩大培养并提取质粒DNA；质粒DNA经限制性内切酶消化，电泳切胶回收编码VLR抗原结合区的DNA片段；用基因重组技术，将VLR基因的抗原结合区DNA与VLR基因的其它保守部分DNA连接，得到VLR基因的全长；将全长的VLR基因与真核表达载体重组，并转染真核宿主细胞（例如HEK-293T或酵母等）；通过真核表达系统大量表达的VLR，具有十聚体形式的天然构象，可直接作为捕获VLR。

可用不同的肿瘤标志物标准品，如甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、胰胚胎抗原（pancreatic oncofetal antigen，POA）、卵巢癌标志物CA125和HE4、乳腺癌标志物CA153 及胃癌标志物CA724等制备肝癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌及胃癌等肿瘤标志物检测试剂盒，采用双VLR夹心法检测血清样品中肿瘤标志物的含量，检测方法同现有技术。

用本发明实施例1检测CA125样品，其批内精密度CV值＜4.3%，批间精密度CV值＜7.9%；灵敏度＜9 pM；回收率为102±4.5%；4℃储存有效期两年，-20℃储存有效期五年；本试剂盒对肿瘤标志物的检测结果，不受样品中所含的任何肿瘤标志物结构类似物的影响。

实施例2：肿瘤标志物 CLIA检测试剂盒

CLIA检测试剂盒中的捕获试剂和检测试剂是由与肿瘤标志物具有高特异性及高亲合力的重组可变淋巴细胞受体（捕获VLR和检测VLR）替代现有肿瘤标志物 CLIA检测试剂盒中的捕获抗体和检测抗体，其余试剂等均与现有肿瘤标志物 CLIA检测试剂盒相同。

检测VLR的制备方法除与实施例1的酶标记不同，是采用化学发光剂标记外，其他均与实施例1相同。

使用CLIA检测试剂盒的检测方法同现有技术。

用本发明实施例2检测CA125样品，其批内精密度CV值＜4.3%，批间精密度CV值＜7.9%；灵敏度＜5 pM；回收率为103±4.1%；4℃储存有效期两年，-20℃储存有效期五年；本试剂盒对肿瘤标志物的检测结果，不受样品中所含的任何肿瘤标志物结构类似物的影响。

实施例3：肿瘤标志物TRFIA检测试剂盒

TRFIA检测试剂盒中的捕获试剂和检测试剂是由与肿瘤标志物具有高特异性及高亲合力的重组可变淋巴细胞受体（捕获VLR和检测VLR）替代现有肿瘤标志物TRFIA检测试剂盒中的捕获抗体和检测抗体，其余试剂等均与现有肿瘤标志物TRFIA检测试剂盒相同。

检测VLR的制备方法除与实施例1的酶标记不同，是采用荧光剂标记外，其他均与实施例1相同。

使用TRFIA检测试剂盒的检测方法同现有技术。

用本发明实施例2检测HE4样品，其批内精密度CV值＜3.7%，批间精密度CV值＜7.1%；灵敏度＜3 pM；回收率为101±3.7%；4℃储存有效期两年，-20℃储存有效期五年；本试剂盒对肿瘤标志物的检测结果，不受样品中所含的任何肿瘤标志物结构类似物的影响。

Claims (2)

1.一种基于可变淋巴细胞受体的肿瘤标志物检测试剂盒的制备方法，其特征在于捕获试剂和检测试剂依次按如下步骤制备：

a. 以肿瘤标志物为抗原免疫无颌类脊椎动物，建立所免疫的无颌类脊椎动物VLR酵母表面展示文库，通过酵母表面展示技术和流式细胞术筛选得到几个阳性克隆，这些阳性克隆是能够表达与肿瘤标志物具有高特异性、高亲合力的单克隆VLR的酵母；

b. 选取所表达的单克隆VLR与肿瘤标志物具有最高亲合力的一个阳性克隆，对其扩大培养并提取质粒DNA；回收编码VLR抗原结合区的DNA片段；将所回收的DNA片段与原核或真核表达载体重组，转化基因工程菌或转染真核表达宿主细胞，大量表达重组的单克隆VLR；采用与纯化标签相对应的纯化方法，获得高纯度的重组VLR；最后对重组VLR进行标记，作为检测VLR；

c. 将剩余的几个阳性克隆分别扩大培养，并诱导酵母细胞表达VLR；

将每种表达VLR的酵母细胞与肿瘤标志物标准品孵育，使肿瘤标志物充分结合到酵母细胞表面的VLR上，离心收集酵母细胞；洗涤除去未与VLR结合的肿瘤标志物；再用缓冲液重新悬浮酵母细胞，加入b步骤所制备的检测VLR；待检测VLR与结合到酵母细胞表面的肿瘤标志物充分结合后，洗涤除去未结合的检测VLR；加入与检测VLR相对应的显色底物，挑取与最佳显色效果所对应的酵母，用于制备捕获VLR；

d. 对c步骤所得用于制备捕获VLR的酵母扩大培养并提取质粒DNA；回收编码VLR抗原结合区的DNA片段；用基因重组技术，将VLR基因的抗原结合区DNA与VLR基因的其它保守部分DNA连接，得到VLR基因的全长；将全长的VLR基因与真核表达载体重组，并转染真核宿主细胞；通过真核表达系统大量表达的VLR，作为捕获VLR。

2.根据权利要求1所述的基于可变淋巴细胞受体的肿瘤标志物检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述a步骤的方法是以肿瘤标志物标准品为抗原，免疫刺激无颌类脊椎动物；取被免疫后无颌类脊椎动物的血液并分离类淋巴细胞；提取类淋巴细胞总RNA，并使用通用引物Oligo-dT将mRNA反转录成cDNA；根据VLR基因两端的保守区设计引物同时引入酶切位点，PCR扩增VLR基因的抗原结合区；将扩增得到的PCR产物与酵母表面展示载体重组，建立VLR酵母表面展示文库；重组质粒转化酵母细胞，经酵母表达系统异源表达，将VLR的抗原结合区展示到酵母细胞表面；通过流式细胞术富集筛选能够表达肿瘤标志物特异性VLR的酵母细胞；

经过几轮筛选后，挑取几个阳性克隆，这些阳性克隆是能够表达与肿瘤标志物具有高特异性、高亲合力的单克隆VLR的酵母。