JP6745858B2 - 複数分子の抗原に繰り返し結合する抗原結合分子 - Google Patents
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Description
〔1〕 抗原結合ドメインとヒトFcRn結合ドメインを含む抗原結合分子であって、2つの異なるカルシウム濃度条件下における抗原結合活性が異なり、抗原結合分子の低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が、高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低く、中性pH条件下においてヒトFcRnに対する結合活性を有する抗原結合分子。
〔2〕 低カルシウム濃度がイオン化カルシウム濃度0.1μM〜30μMである、〔1〕に記載の抗原結合分子。
〔3〕 高カルシウム濃度がイオン化カルシウム濃度100μM〜10 mMである、〔1〕に記載の抗原結合分子。
〔4〕 低カルシウム濃度がエンドソーム内のイオン化カルシウム濃度である、〔1〕または〔2〕に記載の抗原結合分子。
〔5〕 高カルシウム濃度が血漿中のイオン化カルシウム濃度である、〔1〕または〔3〕に記載の抗原結合分子。
〔6〕 前記FcRn結合ドメインがFc領域である、〔1〕〜〔5〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔7〕 更に、酸性pH条件下における抗原結合活性が、中性pH条件下における抗原結合活性よりも低い、〔1〕〜〔6〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔8〕 少なくとも1つのアミノ酸がヒスチジンで置換され、又は、少なくとも1つのヒスチジンが挿入されていることを特徴とする、〔7〕に記載の抗原結合分子。
〔9〕 膜抗原又は可溶型抗原に結合することを特徴とする、〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔10〕 抗原がIL-6R、IL-6、IgA、ヒトグリピカン3、およびIgEからなる群から選択される抗原であることを特徴とする、〔1〕〜〔9〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔11〕 抗原結合ドメインとヒトFcRn結合ドメインを含む抗原結合分子であって、2つの異なるカルシウム濃度条件下における抗原結合活性が異なり、抗原結合分子の低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が、高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低く、抗原結合ドメインに含まれる軽鎖または重鎖にヒト抗体由来のカルシウム結合モチーフが含まれる抗原結合分子。
〔12〕 カルシウム結合モチーフが抗原結合ドメインの軽鎖CDR1、CDR2および/またはCDR3に含まれる、〔11〕に記載の抗原結合分子。
〔13〕 カルシウム結合モチーフが軽鎖CDR1のKabatナンバリングで表される30位、31位および/または32位に含まれる、〔12〕に記載の抗原結合分子。
〔14〕 カルシウム結合モチーフが軽鎖CDR2のKabatナンバリングで表される50位に含まれる、〔12〕または〔13〕に記載の抗原結合分子。
〔15〕 カルシウム結合モチーフが軽鎖CDR3のKabatナンバリングで表される92位に含まれる、〔12〕〜〔14〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔16〕 抗原結合分子が結合する抗原がIgA、またはグリピカン3のいずれかである、〔12〕〜〔15〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔17〕 カルシウム結合モチーフが抗原結合ドメインの重鎖CDR1、CDR2および/またはCDR3に含まれる、〔11〕に記載の抗原結合分子。
〔18〕 カルシウム結合モチーフが重鎖CDR3のKabatナンバリングで表される95位、96位、100a位、および/または101位に含まれる、〔16〕に記載の抗原結合分子。
〔19〕 抗原結合分子が結合する抗原がIL-6R、またはIL-6のいずれかである、〔17〕または〔18〕に記載の抗原結合分子。
〔20〕 pH中性域の条件下でのFcRnに対する結合活性を有するFcRn結合ドメインを含む、〔11〕〜〔19〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔21〕 前記FcRn結合ドメインがFc領域である、〔20〕に記載の抗原結合分子。
〔22〕 前記Fc領域のアミノ酸配列のうち、EUナンバリングで表される248、250、252、254、255、256、257、258、265、286、289、297、303、305、307、308、309、311、312、314、315、317、332、334、360、376、380、382、384、385、386、387、389、424、428、433、434、および436のいずれかひとつ以上のアミノ酸が天然型Fc領域のアミノ酸と異なるFc領域である、〔1〕〜〔10〕、〔20〕または〔21〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔23〕 前記Fc領域のEUナンバリングで表されるアミノ酸であって;
237位のアミノ酸がMet、
248位のアミノ酸がIle、
250位のアミノ酸がAla、Phe、Ile、Met、Gln、Ser、Val、Trp、またはTyr、
252位のアミノ酸がPhe、Trp、またはTyr、
254位のアミノ酸がThr、
255位のアミノ酸がGlu、
256位のアミノ酸がAsp、Glu、またはGln、
257位のアミノ酸がAla、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr、またはVal、
258位のアミノ酸がHis、
265位のアミノ酸がAla、
286位のアミノ酸がAlaまたはGlu、
289位のアミノ酸がHis、
297位のアミノ酸がAla、
303位のアミノ酸がAla、
305位のアミノ酸がAla、
307位のアミノ酸がAla、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp、またはTyr、
308位のアミノ酸がAla、Phe、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、またはThr、
309位のアミノ酸がAla、Asp、Glu、Pro、またはArg、
311位のアミノ酸がAla、His、またはIle、
312位のアミノ酸がAlaまたはHis、
314位のアミノ酸がLysまたはArg、
315位のアミノ酸がAla、AspまたはHis、
317位のアミノ酸がAla、
332位のアミノ酸がVal、
334位のアミノ酸がLeu、
360位のアミノ酸がHis、
376位のアミノ酸がAla、
380位のアミノ酸がAla、
382位のアミノ酸がAla、
384位のアミノ酸がAla、
385位のアミノ酸がAspまたはHis、
386位のアミノ酸がPro、
387位のアミノ酸がGlu、
389位のアミノ酸がAlaまたはSer、
424位のアミノ酸がAla、
428位のアミノ酸がAla、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp、またはTyr、
433位のアミノ酸がLys、
434位のアミノ酸がAla、Phe、His、Ser、Trp、またはTyr、もしくは
436位のアミノ酸がHis 、Ile、Leu、Val、
のいずれかひとつ以上の組合せである、〔22〕に記載の抗原結合分子。
〔24〕 抗原結合分子が抗体であることを特徴とする、〔1〕〜〔23〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔25〕 以下の工程(a)〜(e)を含む、(i) 抗原の細胞内への取込みを促進させる機能、(ii)抗原に2回以上結合する機能、(iii)血漿中の抗原濃度の減少を促進させる機能、及び(iv)優れた血漿中滞留性機能、から選ばれる少なくとも1つの機能を有する抗原結合分子の製造方法;
(a) 低カルシウム濃度条件下における抗原結合分子の抗原結合活性を得る工程、
(b) 高カルシウム濃度条件下における抗原結合分子の抗原結合活性を得る工程、
(c) 低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が、高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低い抗原結合分子を選択する工程、
(d) 前記工程(c)で選択された抗原結合分子をコードする遺伝子を得る工程、
(e) 前記工程(d)で得られた遺伝子を用いて抗原結合分子を製造する工程。
〔26〕 以下の工程(a)〜(e)を含む、(i) 抗原の細胞内への取込みを促進させる機能、(ii)抗原に2回以上結合する機能、(iii)血漿中の抗原濃度の減少を促進させる機能、及び(iv)優れた血漿中滞留性機能、から選ばれる少なくとも1つの機能を有する抗原結合分子の製造方法;
(a) 高カルシウム濃度条件下で抗原結合分子又は抗原結合分子ライブラリーを抗原に接触させる工程、
(b) 前記工程(a)で抗原に結合した抗原結合分子を低カルシウム濃度条件下に置く工程、
(c) 前記工程(b)で解離した抗原結合分子を取得する工程、
(d) 前記工程(c)で取得された抗原結合分子をコードする遺伝子を得る工程、
(e) 前記工程(d)で得られた遺伝子を用いて抗原結合分子を製造する工程。
〔27〕 以下の工程(a)〜(f)を含む、(i) 抗原の細胞内への取込みを促進させる機能、(ii)抗原に2回以上結合する機能、(iii)血漿中の抗原濃度の減少を促進させる機能、及び(iv)優れた血漿中滞留性機能、から選ばれる少なくとも1つの機能を有する抗原結合分子の製造方法;
(a) 低カルシウム濃度条件下で抗原結合分子又は抗原結合分子ライブラリーを抗原に接触させる工程、
(b) 前記工程(a)で抗原に結合しない抗原結合分子を選択する工程、
(c) 前記工程(b)で選択された抗原結合分子を高カルシウム濃度条件下で抗原に接触させる工程、
(d) 前記工程(c)で抗原に結合した抗原結合分子を取得する工程、
(e) 前記工程(d)で取得された抗原結合分子をコードする遺伝子を得る工程、
(f) 前記工程(e)で得られた遺伝子を用いて抗原結合分子を産生する工程。
〔28〕 さらに、抗原結合分子中のアミノ酸を改変し、中性pH条件下におけるヒトFcRnに対する結合活性を付与する或いは高める工程を含む、〔25〕〜〔27〕のいずれかに記載の製造方法。
〔29〕 さらに、抗原結合分子中のアミノ酸を改変し、酸性pH条件下における抗原結合活性を中性pH条件下における抗原結合活性よりも低下させる工程を含む、〔25〕〜〔27〕のいずれかに記載の製造方法。
〔30〕 低カルシウム濃度がイオン化カルシウム濃度0.1μM〜30μMである、〔25〕〜〔27〕のいずれかに記載の製造方法。
〔31〕 高カルシウム濃度がイオン化カルシウム濃度100μM〜10mMである、〔25〕〜〔27〕のいずれかに記載の製造方法。
〔32〕 低カルシウム濃度がエンドソーム内のイオン化カルシウム濃度である、〔25〕〜〔27〕のいずれかに記載の製造方法。
〔33〕 高カルシウム濃度が血漿中のイオン化カルシウム濃度である、〔25〕〜〔27〕のいずれかに記載の製造方法。
〔34〕 抗原結合分子中のアミノ酸の改変が、抗原結合分子中の少なくとも1つ以上のアミノ酸をヒスチジンで置換する又は少なくとも1つのヒスチジンを挿入する改変である、〔29〕に記載の製造方法。
〔35〕 前記抗原結合分子が結合する抗原がIL-6R、IL-6、IgA、ヒトグリピカン3、およびIgEからなる群から選択される抗原であることを特徴とする、〔25〕〜〔34〕のいずれかに記載の製造方法。
〔36〕 前記抗原結合分子が抗体であることを特徴とする、〔25〕〜〔35〕のいずれかに記載の製造方法。
〔37〕 〔1〕〜〔24〕のいずれかに記載の抗原結合分子または〔25〕〜〔36〕のいずれかに記載の製造方法により製造された抗原結合分子、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
〔38〕 抗原の細胞内への取込みを促進させるために用いられる医薬組成物である、〔37〕に記載の医薬組成物。
〔39〕 血漿中の抗原濃度の減少を促進させるために用いられる医薬組成物である、〔37〕に記載の医薬組成物。
〔40〕 抗原結合ドメインとヒトFcRn結合ドメインを含む抗原結合分子であって、2つの異なるカルシウム濃度条件下における抗原結合活性が異なり、抗原結合分子の低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が、高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低い抗原結合分子を含む、抗原の細胞内への取込み、または血漿中の抗原濃度の減少を促進させるために用いられる医薬組成物。
〔41〕 低カルシウム濃度がイオン化カルシウム濃度0.1μM〜30μMである、〔40〕に記載の医薬組成物。
〔42〕 高カルシウム濃度がイオン化カルシウム濃度100μM〜10 mMである、〔40〕に記載の医薬組成物。
〔43〕 低カルシウム濃度がエンドソーム内のイオン化カルシウム濃度である、〔40〕または〔41〕に記載の医薬組成物。
〔44〕 高カルシウム濃度が血漿中のイオン化カルシウム濃度である、〔40〕または〔42〕に記載の医薬組成物。
〔45〕 前記抗原結合分子に含まれるFcRn結合ドメインがFc領域である〔40〕〜〔44〕のいずれかに記載の医薬組成物。
〔46〕 更に、前記抗原結合分子の酸性pH条件下における抗原結合活性が、中性pH条件下における抗原結合活性よりも低い、〔40〕〜〔45〕のいずれかに記載の医薬組成物。
〔47〕 前記抗原結合分子の少なくとも1つのアミノ酸がヒスチジンで置換され、又は、少なくとも1つのヒスチジンが挿入されていることを特徴とする、〔46〕に記載の医薬組成物。
〔48〕 前記抗原結合分子が結合する抗原がIL-6R、IL-6、IgA、ヒトグリピカン3、およびIgEからなる群から選択される抗原であることを特徴とする、〔40〕〜〔47〕のいずれかに記載の医薬組成物。
〔49〕 以下の工程(a)〜(c)を含む、(i) 抗原の細胞内への取込みを促進させる機能、(ii)抗原に2回以上結合する機能、(iii)血漿中の抗原濃度の減少を促進させる機能、及び(iv)優れた血漿中滞留性機能、から選ばれる少なくとも1つの機能を有する抗原結合分子のスクリーニング方法;
(a) 低カルシウム濃度条件下における抗原結合分子の抗原結合活性を得る工程、
(b) 高カルシウム濃度条件下における抗原結合分子の抗原結合活性を得る工程、
(c) 低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が、高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低い抗原結合分子を選択する工程。
〔50〕 以下の工程(a)〜(c)を含む、(i) 抗原の細胞内への取込みを促進させる機能、(ii)抗原に2回以上結合する機能、(iii)血漿中の抗原濃度の減少を促進させる機能、及び(iv)優れた血漿中滞留性機能、から選ばれる少なくとも1つの機能を有する抗原結合分子のスクリーニング方法;
(a) 高カルシウム濃度条件下で抗原結合分子又は抗原結合分子ライブラリーを抗原に接触させる工程、
(b) 前記工程(a)で抗原に結合した抗原結合分子を低カルシウム濃度条件下に置く工程、
(c) 前記工程(b)で解離した抗原結合分子を取得する工程。
〔51〕 以下の工程(a)〜(d)を含む、(i) 抗原の細胞内への取込みを促進させる機能、(ii)抗原に2回以上結合する機能、(iii)血漿中の抗原濃度の減少を促進させる機能、及び(iv)優れた血漿中滞留性機能、から選ばれる少なくとも1つの機能を有する抗原結合分子のスクリーニング方法;
(a) 低カルシウム濃度条件下で抗原結合分子又は抗原結合分子ライブラリーを抗原に接触させる工程、
(b) 前記工程(a)で抗原に結合しない抗原結合分子を選択する工程、
(c) 前記工程(b)で選択された抗原結合分子を高カルシウム濃度条件下で抗原に結合させる工程、
(d) 前記工程(c)で抗原に結合した抗原結合分子を取得する工程。
〔52〕 低カルシウム濃度がイオン化カルシウム濃度0.1μM〜30μMである、〔49〕〜〔51〕のいずれかに記載のスクリーニング方法。
〔53〕 高カルシウム濃度がイオン化カルシウム濃度100μM〜10mMである、〔49〕〜〔51〕のいずれかに記載のスクリーニング方法。
〔54〕 低カルシウム濃度がエンドソーム内のイオン化カルシウム濃度である、〔49〕〜〔52〕のいずれかに記載のスクリーニング方法。
〔55〕 高カルシウム濃度が血漿中のイオン化カルシウム濃度である、〔49〕〜〔51〕または〔53〕のいずれかに記載のスクリーニング方法。
〔56〕 前記抗原結合分子が結合する抗原がIL-6R、IL-6、IgA、ヒトグリピカン3、およびIgEからなる群から選択される抗原であることを特徴とする、〔49〕〜〔55〕のいずれかに記載のスクリーニング方法。
〔57〕 抗原結合分子が抗体であることを特徴とする、〔49〕〜〔56〕のいずれかに記載のスクリーニング方法。
〔58〕 〔1〕〜〔24〕のいずれかに記載の抗原結合分子または〔25〕〜〔36〕のいずれかに記載の製造方法により製造された抗原結合分子を投与することにより、抗原結合分子による抗原の細胞内への取込みを促進させる方法。
〔59〕 〔1〕〜〔24〕のいずれかに記載の抗原結合分子または〔25〕〜〔36〕のいずれかに記載の製造方法により製造された抗原結合分子を投与することにより、血漿中の抗原濃度の減少を促進させる方法。
〔60〕 〔1〕〜〔24〕のいずれかに記載の抗原結合分子または〔25〕〜〔36〕のいずれかに記載の製造方法により製造された抗原結合分子を用いることにより、1分子の抗原結合分子による抗原への結合回数を増加させる方法。
〔61〕 〔1〕〜〔24〕のいずれかに記載の抗原結合分子または〔25〕〜〔36〕のいずれかに記載の製造方法により製造された抗原結合分子を用いることにより、抗原結合分子の血漿中滞留性を改善する方法。
〔62〕 抗原結合ドメインとヒトFcRn結合ドメインを含む抗原結合分子であって、2つの異なるカルシウム濃度条件下における抗原結合活性が異なり、抗原結合分子の低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が、高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低い抗原結合分子を投与することにより、抗原結合分子による抗原の細胞内への取込みを促進させる方法。
〔63〕 抗原結合ドメインとヒトFcRn結合ドメインを含む抗原結合分子であって、2つの異なるカルシウム濃度条件下における抗原結合活性が異なり、抗原結合分子の低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が、高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低い抗原結合分子を投与することにより、血漿中の抗原濃度の減少を促進させる方法。
〔64〕 抗原結合ドメインとヒトFcRn結合ドメインを含む抗原結合分子であって、2つの異なるカルシウム濃度条件下における抗原結合活性が異なり、抗原結合分子の低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が、高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低い抗原結合分子を用いることにより、1分子の抗原結合分子による抗原への結合回数を増加させる方法。
〔65〕 抗原結合ドメインとヒトFcRn結合ドメインを含む抗原結合分子であって、2つの異なるカルシウム濃度条件下における抗原結合活性が異なり、抗原結合分子の低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が、高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低い抗原結合分子を用いることにより、抗原結合分子の血漿中滞留性を改善する方法。
〔66〕 前記低カルシウム濃度がイオン化カルシウム濃度0.1μM〜30μMである、〔62〕〜〔65〕のいずれかに記載の方法。
〔67〕 高カルシウム濃度がイオン化カルシウム濃度100μM〜10 mMである、〔62〕〜〔66〕のいずれかに記載の方法。
〔68〕 低カルシウム濃度がエンドソーム内のイオン化カルシウム濃度である、〔62〕〜〔67〕のいずれかに記載の方法。
〔69〕 高カルシウム濃度が血漿中のイオン化カルシウム濃度である、〔62〕〜〔68〕のいずれかに記載の方法。
〔70〕 前記抗原結合分子に含まれるFcRn結合ドメインがFc領域である〔62〕〜〔69〕のいずれかに記載の方法。
〔71〕 更に、前記抗原結合分子の酸性pH条件下における抗原結合活性が、中性pH条件下における抗原結合活性よりも低い、〔62〕〜〔70〕のいずれかに記載の方法。
〔72〕 前記抗原結合分子の少なくとも1つのアミノ酸がヒスチジンで置換され、又は、少なくとも1つのヒスチジンが挿入されていることを特徴とする、〔71〕に記載の方法。
〔73〕 前記抗原結合分子が結合する抗原がIL-6R、IL-6、IgA、ヒトグリピカン3、およびIgEからなる群から選択される抗原であることを特徴とする、〔62〕〜〔72〕のいずれかに記載の方法。
〔74〕 前記抗原結合分子が抗体である、〔62〕〜〔73〕のいずれかに記載の方法。
本明細書において、たとえば、Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/I、Val/Vと表されるように、アミノ酸は1文字コードまたは3文字コード、またはその両方で表記されている。
本明細書において「抗原」は抗原結合ドメインが結合するエピトープを含む限りその構造は特定の構造に限定されない。別の意味では、抗原は無機物でもあり得るし有機物でもあり得るし、本発明が投与される生体にとって外来性の、または内在性のものでもあり得る。本発明の方法により薬物動態が改善された抗原結合分子が含む抗原結合ドメインが結合する抗原の例としては、例えば、受容体タンパク質(膜結合型受容体、可溶型受容体)や細胞表面マーカーなどの膜抗原、サイトカインなどの可溶型抗原、外来性生物にのみ存在するエピトープを含む抗原等が好適に挙げられる。抗原としては下記のような分子;17-IA、4-1 BB、4Dc、6-ケト-PGF1a、8-イソ-PGF2a、8-オキソ-dG、A1アデノシン受容体、A33、ACE、ACE-2、アクチビン、アクチビンA、アクチビンAB、アクチビンB、アクチビンC、アクチビンRIA、アクチビンRIA ALK-2、アクチビンRIB ALK-4、アクチビンRIIA、アクチビンRIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、アドレシン(Addressins)、アディポネクチン、ADPリボシルシクラーゼ-1、aFGF、AGE、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、アレルゲン、α1-アンチキモトリプシン、α1-アンチトリプシン、α-シヌクレイン、α-V/β-1アンタゴニスト、アミニン(aminin)、アミリン、アミロイドβ、アミロイド免疫グロブリン重鎖可変領域、アミロイド免疫グロブリン軽鎖可変領域、アンドロゲン、ANG、アンジオテンシノーゲン、アンジオポエチンリガンド-2、抗Id、アンチトロンビンIII、炭疽、APAF-1、APE、APJ、アポA1、アポ血清アミロイドA、アポ-SAA、APP、APRIL、AR、ARC、ART、アルテミン(Artemin)、ASPARTIC、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ペプチド、心房性ナトリウム利尿ペプチドA、心房性ナトリウム利尿ペプチドB、心房性ナトリウム利尿ペプチドC、av/b3インテグリン、Axl、B7-1、B7-2、B7-H、BACE、BACE-1、バチルス・アントラシス(Bacillus anthracis)防御抗原、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、Bcl、BCMA、BDNF、b-ECGF、β-2-ミクログロブリン、βラクタマーゼ、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、Bリンパ球刺激因子(BIyS)、BMP、BMP-2 (BMP-2a)、BMP-3 (オステオゲニン(Osteogenin))、BMP-4 (BMP-2b)、BMP-5、BMP-6 (Vgr-1)、BMP-7 (OP-1)、BMP-8 (BMP-8a)、BMPR、BMPR-IA (ALK-3)、BMPR-IB (ALK-6)、BMPR-II (BRK-3)、BMP、BOK、ボンベシン、骨由来神経栄養因子(Bone-derived neurotrophic factor)、ウシ成長ホルモン、BPDE、BPDE-DNA、BRK-2、BTC、Bリンパ球細胞接着分子、C10、C1阻害因子、C1q、C3、C3a、C4、C5、C5a(補体5a)、CA125、CAD-8、カドヘリン-3、カルシトニン、cAMP、炭酸脱水酵素-IX、癌胎児抗原(CEA)、癌関連抗原(carcinoma-associated antigen)、カルジオトロフィン-1、カテプシンA、カテプシンB、カテプシンC/DPPI、カテプシンD、カテプシンE、カテプシンH、カテプシンL、カテプシンO、カテプシンS、カテプシンV、カテプシンX/Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1/I-309、CCL11/エオタキシン、CCL12/MCP-5、CCL13/MCP-4、CCL14/HCC-1、CCL15/HCC-2、CCL16/HCC-4、CCL17/TARC、CCL18/PARC、CCL19/ELC、CCL2/MCP-1、CCL20/MIP-3-α、CCL21/SLC、CCL22/MDC、CCL23/MPIF-1、CCL24/エオタキシン-2、CCL25/TECK、CCL26/エオタキシン-3、CCL27/CTACK、CCL28/MEC、CCL3/M1P-1-α、CCL3Ll/LD-78-β、CCL4/MIP-l-β、CCL5/RANTES、CCL6/C10、CCL7/MCP-3、CCL8/MCP-2、CCL9/10/MTP-1-γ、CCR、CCR1、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD10、CD105、CD11a、CD11b、CD11c、CD123、CD13、CD137、CD138、CD14、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD15、CD152、CD16、CD164、CD18、CD19、CD2、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD26、CD27L、CD28、CD29、CD3、CD30、CD30L、CD32、CD33 (p67タンパク質)、CD34、CD37、CD38、CD3E、CD4、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD49b、CD5、CD51、CD52、CD54、CD55、CD56、CD6、CD61、CD64、CD66e、CD7、CD70、CD74、CD8、CD80 (B7-1)、CD89、CD95、CD105、CD158a、CEA、CEACAM5、CFTR、cGMP、CGRP受容体、CINC、CKb8-1、クローディン18、CLC、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)毒素、クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)毒素、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)毒素、c-Met、CMV、CMV UL、CNTF、CNTN-1、補体因子3 (C3)、補体因子D、コルチコステロイド結合グロブリン、コロニー刺激因子-1受容体、COX、C-Ret、CRG-2、CRTH2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、CX3CL1/フラクタルカイン、CX3CR1、CXCL、CXCL1/Gro-α、CXCL10、CXCL11/I-TAC、CXCL12/SDF-l-α/β、CXCL13/BCA-1、CXCL14/BRAK、CXCL15/ラングカイン(Lungkine)、CXCL16、CXCL16、CXCL2/Gro-β CXCL3/Gro-γ、CXCL3、CXCL4/PF4、CXCL5/ENA-78、CXCL6/GCP-2、CXCL7/NAP-2、CXCL8/IL-8、CXCL9/Mig、CXCLlO/IP-10、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、シスタチンC、サイトケラチン腫瘍関連抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、崩壊促進因子、デルタ様タンパク質(Delta-like protein)リガンド4、des(1-3)-IGF-1 (脳IGF-1)、Dhh、DHICAオキシダーゼ、Dickkopf-1、ジゴキシン、ジペプチジルペプチダーゼIV、DK1、DNAM-1、Dnase、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR (ErbB-1)、EGF様ドメイン含有タンパク質7(EGF like domain containing protein 7)、エラスターゼ、エラスチン、EMA、EMMPRIN、ENA、ENA-78、エンドシアリン(Endosialin)、エンドセリン受容体、エンドトキシン、エンケファリナーゼ、eNOS、Eot、エオタキシン、エオタキシン-2、エオタキシニ(eotaxini)、EpCAM、エフリンB2/EphB4、Epha2チロシンキナーゼ受容体、上皮増殖因子受容体 (EGFR)、ErbB2受容体、ErbB3チロシンキナーゼ受容体、ERCC、エリスロポエチン(EPO)、エリスロポエチン受容体、E-セレクチン、ET-1、エクソダス(Exodus)-2、RSVのFタンパク質、F10、F11、F12、F13、F5、F9、第Ia因子、第IX因子、第Xa因子、第VII因子、第VIII因子、第VIIIc因子、Fas、FcαR、FcイプシロンRI、FcγIIb、FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa、FcγRIIIb、FcRn、FEN-1、フェリチン、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF-2受容体、FGF-3、FGF-8、酸性FGF(FGF-acidic)、塩基性FGF(FGF-basic)、FGFR、FGFR-3、フィブリン、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)、線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子-10、フィブロネクチン、FL、FLIP、Flt-3、FLT3リガンド、葉酸受容体、卵胞刺激ホルモン(FSH)、フラクタルカイン(CX3C)、遊離型重鎖、遊離型軽鎖、FZD1、FZD10、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、G250、Gas 6、GCP-2、GCSF、G-CSF、G-CSF受容体、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-15 (MIC-1)、GDF-3 (Vgr-2)、GDF-5 (BMP-14/CDMP-1)、GDF-6 (BMP-13/CDMP-2)、GDF-7 (BMP-12/CDMP-3)、GDF-8 (ミオスタチン)、GDF-9、GDNF、ゲルゾリン、GFAP、GF-CSF、GFR-α1、GFR-α2、GFR-α3、GF-β1、gH外被糖タンパク質、GITR、グルカゴン、グルカゴン受容体、グルカゴン様ペプチド1受容体、Glut 4、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼII、糖タンパク質ホルモン受容体、糖タンパク質llb/llla (GP llb/llla)、グリピカン-3、GM-CSF、GM-CSF受容体、gp130、gp140、gp72、顆粒球-CSF (G-CSF)、GRO/MGSA、成長ホルモン放出因子、GRO-β、GRO-γ、ピロリ菌(H. pylori)、ハプテン(NP-capまたはNIP-cap)、HB-EGF、HCC、HCC 1、HCMV gB外被糖タンパク質、HCMV UL、造血増殖因子(Hemopoietic growth factor) (HGF)、Hep B gp120、ヘパラナーゼ、ヘパリン補因子II、肝細胞増殖因子(hepatic growth factor)、バチルス・アントラシス防御抗原、C型肝炎ウイルスE2糖タンパク質、E型肝炎、ヘプシジン、Her1、Her2/neu (ErbB-2)、Her3 (ErbB-3)、Her4 (ErbB-4)、単純ヘルペスウイルス(HSV) gB糖タンパク質、HGF、HGFA、高分子量メラノーマ関連抗原(High molecular weight melanoma-associated antigen) (HMW-MAA)、GP120等のHIV外被タンパク質、HIV MIB gp 120 V3ループ、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFG PEM、HMGB-1、HRG、Hrk、HSP47、Hsp90、HSV gD糖タンパク質、ヒト心筋ミオシン、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)、ヒト成長ホルモン(hGH)、ヒト血清アルブミン、ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子(t-PA)、ハンチンチン、HVEM、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IgA、IgA受容体、IgE、IGF、IGF結合タンパク質、IGF-1、IGF-1 R、IGF-2、IGFBP、IGFR、IL、IL-1、IL-10、IL-10受容体、IL-11、IL-11受容体、IL-12、IL-12受容体、IL-13、IL-13受容体、IL-15、IL-15受容体、IL-16、IL-16受容体、IL-17、IL-17受容体、IL-18 (IGIF)、IL-18受容体、IL-1α、IL-1β、IL-1受容体、IL-2、IL-2受容体、IL-20、IL-20受容体、IL-21、IL-21受容体、IL-23、IL-23受容体、IL-2受容体、IL-3、IL-3受容体、IL-31、IL-31受容体、IL-3受容体、IL-4、IL-4受容体、IL-5、IL-5受容体、IL-6、IL-6受容体、IL-7、IL-7受容体、IL-8、IL-8受容体、IL-9、IL-9受容体、免疫グロブリン免疫複合体、免疫グロブリン、INF-α、INF-α受容体、INF-β、INF-β受容体、INF-γ、INF-γ受容体、I型IFN、I型IFN受容体、インフルエンザ、インヒビン、インヒビンα、インヒビンβ、iNOS、インスリン、インスリンA鎖、インスリンB鎖、インスリン様増殖因子1、インスリン様増殖因子2、インスリン様増殖因子結合タンパク質、インテグリン、インテグリンα2、インテグリンα3、インテグリンα4、インテグリンα4/β1、インテグリンα-V/β-3、インテグリンα-V/β-6、インテグリンα4/β7、インテグリンα5/β1、インテグリンα5/β3、インテグリンα5/β6、インテグリンα-δ (αV)、インテグリンα-θ、インテグリンβ1、インテグリンβ2、インテグリンβ3(GPIIb-IIIa)、IP-10、I-TAC、JE、カリクレイン、カリクレイン11、カリクレイン12、カリクレイン14、カリクレイン15、カリクレイン2、カリクレイン5、カリクレイン6、カリクレインL1、カリクレインL2、カリクレインL3、カリクレインL4、カリスタチン、KC、KDR、ケラチノサイト増殖因子(KGF)、ケラチノサイト増殖因子-2 (KGF-2)、KGF、キラー免疫グロブリン様受容体、kitリガンド (KL)、Kitチロシンキナーゼ、ラミニン5、LAMP、LAPP (アミリン、膵島アミロイドポリペプチド)、LAP (TGF-1)、潜伏期関連ペプチド、潜在型TGF-1、潜在型TGF-1 bp1、LBP、LDGF、LDL、LDL受容体、LECT2、レフティー、レプチン、黄体形成ホルモン(leutinizing hormone)(LH)、Lewis-Y抗原、Lewis-Y関連抗原、LFA-1、LFA-3、LFA-3受容体、Lfo、LIF、LIGHT、リポタンパク質、LIX、LKN、Lptn、L-セレクチン、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺サーファクタント、黄体形成ホルモン、リンホタクチン、リンホトキシンβ受容体、リゾスフィンゴ脂質受容体、Mac-1、マクロファージ-CSF (M-CSF)、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、マスピン、MCAM、MCK-2、MCP、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-I (MCAF)、M-CSF、MDC、MDC (67 a.a.)、MDC (69 a.a.)、メグシン(megsin)、Mer、METチロシンキナーゼ受容体ファミリー、メタロプロテアーゼ、膜糖タンパク質OX2、メソテリン、MGDF受容体、MGMT、MHC (HLA-DR)、微生物タンパク質(microbial protein)、MIF、MIG、MIP、MIP-1 α、MIP-1 β、MIP-3 α、MIP-3 β、MIP-4、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、単球誘引タンパク質(monocyte attractant protein)、単球コロニー阻害因子(monocyte colony inhibitory factor)、マウスゴナドトロピン関連(gonadotropin-associated)ペプチド、MPIF、Mpo、MSK、MSP、MUC-16、MUC18、ムチン(Mud)、ミュラー管抑制因子、Mug、MuSK、ミエリン関連糖タンパク質、骨髄前駆細胞阻害因子-1 (MPIF-I)、NAIP、ナノボディ(Nanobody)、NAP、NAP-2、NCA 90、NCAD、N-カドヘリン、NCAM、ネプリライシン、神経細胞接着分子、ニューロセルピン(neroserpin)、神経成長因子(NGF)、ニューロトロフィン-3、ニューロトロフィン-4、ニューロトロフィン-6、ニューロピリン1、
ニュールツリン、NGF-β、NGFR、NKG20、N-メチオニルヒト成長ホルモン、nNOS、NO、Nogo-A、Nogo受容体、C型肝炎ウイルス由来の非構造タンパク質3型 (NS3)、NOS、Npn、NRG-3、NT、NT-3、NT-4、NTN、OB、OGG1、オンコスタチンM、OP-2、OPG、OPN、OSM、OSM受容体、骨誘導因子(osteoinductive factor)、オステオポンチン、OX40L、OX40R、酸化型LDL、p150、p95、PADPr、副甲状腺ホルモン、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-カドヘリン、PCNA、PCSK9、PDGF、PDGF受容体、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-D、PDK-1、PECAM、PEDF、PEM、PF-4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIGF、PIN、PLA2、胎盤増殖因子、胎盤アルカリホスファターゼ(PLAP)、胎盤ラクトゲン、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子-1、血小板増殖因子(platelet-growth factor)、plgR、PLP、異なるサイズのポリグリコール鎖(poly glycol chain)(例えば、PEG-20、PEG-30、PEG40)、PP14、プレカリクレイン、プリオンタンパク質、プロカルシトニン、プログラム細胞死タンパク質1、プロインスリン、プロラクチン、プロタンパク質転換酵素PC9、プロリラキシン(prorelaxin)、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、プロテインA、プロテインC、プロテインD、プロテインS、プロテインZ、PS、PSA、PSCA、PsmAr、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、P-セレクチン糖タンパク質リガンド-1、R51、RAGE、RANK、RANKL、RANTES、リラキシン、リラキシンA鎖、リラキシンB鎖、レニン、呼吸器多核体ウイルス(RSV) F、Ret、レチキュロン(reticulon)4、リウマチ因子、RLI P76、RPA2、RPK-1、RSK、RSV Fgp、S100、RON-8、SCF/KL、SCGF、スクレロスチン(Sclerostin)、SDF-1、SDF1 α、SDF1 β、セリン(SERINE)、血清アミロイドP、血清アルブミン、sFRP-3、Shh、志賀様毒素II、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、スフィンゴシン一リン酸受容体1、ブドウ球菌のリポテイコ酸、Stat、STEAP、STEAP-II、幹細胞因子(SCF)、ストレプトキナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、シンデカン-1、TACE、TACI、TAG-72 (腫瘍関連糖タンパク質-72)、TARC、TB、TCA-3、T細胞受容体α/β、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、テネイシン、TERT、精巣PLAP様アルカリホスファターゼ、TfR、TGF、TGF-α、TGF-β、TGF-β汎特異的(TGF-β Pan Specific)、TGF-β RII、TGF-β RIIb、TGF-β RIII、TGF-β Rl (ALK-5)、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5、TGF-I、トロンビン、トロンボポエチン(TPO)、胸腺間質性リンホプロテイン(Thymic stromal lymphoprotein)受容体、胸腺Ck-1、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、チロキシン、チロキシン結合グロブリン、Tie、TIMP、TIQ、組織因子、組織因子プロテアーゼインヒビター、組織因子タンパク質、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF受容体I、TNF受容体II、TNF-α、TNF-β、TNF-β2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A (TRAIL R1 Apo-2/DR4)、TNFRSF10B (TRAIL R2 DR5/KILLER/TRICK-2A/TRICK-B)、TNFRSF10C (TRAIL R3 DcR1/LIT/TRID)、TNFRSF10D (TRAIL R4 DcR2/TRUNDD)、TNFRSF11A (RANK ODF R/TRANCE R)、TNFRSF11B (OPG OCIF/TR1)、TNFRSF12 (TWEAK R FN14)、TNFRSF12A、TNFRSF13B (TACI)、TNFRSF13C (BAFF R)、TNFRSF14 (HVEM ATAR/HveA/LIGHT R/TR2)、TNFRSF16 (NGFR p75NTR)、TNFRSF17 (BCMA)、TNFRSF18 (GITR AITR)、TNFRSF19 (TROY TAJ/TRADE)、TNFRSF19L (RELT)、TNFRSF1A (TNF Rl CD120a/p55-60)、TNFRSF1B (TNF RII CD120b/p75-80)、TNFRSF21 (DR6)、TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2)、TNFRSF25 (DR3 Apo-3/LARD/TR-3/TRAMP/WSL-1)、TNFRSF26 (TNFRH3)、TNFRSF3 (LTbR TNF RIII/TNFC R)、TNFRSF4 (OX40 ACT35/TXGP1 R)、TNFRSF5 (CD40 p50)、TNFRSF6 (Fas Apo-1/APT1/CD95)、TNFRSF6B (DcR3 M68/TR6)、TNFRSF7 (CD27)、TNFRSF8 (CD30)、TNFRSF9 (4-1 BB CD137/ILA)、TNFRST23 (DcTRAIL R1 TNFRH1)、TNFSF10 (TRAIL Apo-2リガンド/TL2)、TNFSF11 (TRANCE/RANKリガンドODF/OPGリガンド)、TNFSF12 (TWEAK Apo-3リガンド/DR3リガンド)、TNFSF13 (APRIL TALL2)、TNFSF13B (BAFF BLYS/TALL1/THANK/TNFSF20)、TNFSF14 (LIGHT HVEMリガンド/LTg)、TNFSF15 (TL1A/VEGI)、TNFSF18 (GITRリガンド AITRリガンド/TL6)、TNFSF1A (TNF-a コネクチン(Conectin)/DIF/TNFSF2)、TNFSF1B (TNF-b LTa/TNFSF1)、TNFSF3 (LTb TNFC/p33)、TNFSF4 (OX40リガンドgp34/TXGP1)、TNFSF5 (CD40リガンドCD154/gp39/HIGM1/IMD3/TRAP)、TNFSF6 (Fasリガンド Apo-1リガンド/APT1リガンド)、TNFSF7 (CD27リガンドCD70)、TNFSF8 (CD30リガンドCD153)、TNFSF9 (4-1 BBリガンド CD137リガンド)、TNF-α、TNF-β、TNIL-I、毒性代謝産物(toxic metabolite)、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、トランスフェリン受容体、TGF-αおよびTGF-β等のトランスフォーミング増殖因子(TGF)、膜貫通型糖タンパク質NMB、トランスサイレチン、TRF、Trk、TROP-2、トロホブラスト糖タンパク質、TSG、TSLP、腫瘍壊死因子(TNF)、腫瘍関連抗原CA 125、Lewis Y関連糖を示す腫瘍関連抗原、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、ウロキナーゼ、VAP-1、血管内皮増殖因子(VEGF)、バスピン(vaspin)、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-カドヘリン、VE-カドヘリン-2、VEFGR-1 (flt-1)、VEFGR-2、VEGF受容体 (VEGFR)、VEGFR-3 (flt-4)、VEGI、VIM、ウイルス抗原、ビタミンB12受容体、ビトロネクチン受容体、VLA、VLA-1、VLA-4、VNRインテグリン、フォン・ヴィルブランド因子(vWF)、WIF-1、WNT1、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9B、XCL1、XCL2/SCM-l-β、XCLl/リンホタクチン、XCR1、XEDAR、XIAP、XPD、HMGB1、IgA、Aβ、CD81, CD97, CD98, DDR1, DKK1, EREG、Hsp90, IL-17/IL-17R、IL-20/IL-20R、酸化LDL, PCSK9, prekallikrein , RON, TMEM16F、SOD1, Chromogranin A, Chromogranin B、tau, VAP1、高分子キニノーゲン、IL-31、IL-31R、Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.5、Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、EPCR、C1, C1q, C1r, C1s, C2, C2a, C2b, C3, C3a, C3b, C4, C4a, C4b, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9, factor B, factor D, factor H, properdin、sclerostin、fibrinogen, fibrin, prothrombin, thrombin, 組織因子, factor V, factor Va, factor VII, factor VIIa, factor VIII, factor VIIIa, factor IX, factor IXa, factor X, factor Xa, factor XI, factor XIa, factor XII, factor XIIa, factor XIII, factor XIIIa, TFPI, antithrombin III, EPCR, トロンボモデュリン、TAPI, tPA, plasminogen, plasmin, PAI-1, PAI-2、GPC3、Syndecan-1、Syndecan-2、Syndecan-3、Syndecan-4、LPA、S1Pならびにホルモンおよび成長因子のための受容体のうち生体の体液中で細胞に係留されずに可溶型で存在する分子が例示され得る。
下記にIL-6Rに対する抗原結合ドメインを含む被験抗原結合分子によるエピトープに対する結合の確認方法が例示されるが、IL-6R以外の抗原に対する抗原結合ドメインを含む被験抗原結合分子によるエピトープに対する結合の確認方法も下記の例示に準じて適宜実施され得る。
FACSCantoTM II
FACSAriaTM
FACSArrayTM
FACSVantageTM SE
FACSCaliburTM (いずれもBD Biosciences社の商品名)
EPICS ALTRA HyPerSort
Cytomics FC 500
EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC
Cell Lab Quanta / Cell Lab Quanta SC(いずれもBeckman Coulter社の商品名)
本明細書において、「抗原結合ドメイン」は目的とする抗原に結合するかぎりどのような構造のドメインも使用され得る。そのようなドメインの例として、例えば、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域、生体内に存在する細胞膜タンパクであるAvimerに含まれる35アミノ酸程度のAドメインと呼ばれるモジュール(WO2004/044011、WO2005/040229)、細胞膜に発現する糖タンパク質であるfibronectin中のタンパク質に結合するドメインである10Fn3ドメインを含むAdnectin(WO2002/032925)、ProteinAの58アミノ酸からなる3つのヘリックスの束(bundle)を構成するIgG結合ドメインをscaffoldとするAffibody(WO1995/001937)、33アミノ酸残基を含むターンと2つの逆並行ヘリックスおよびループのサブユニットが繰り返し積み重なった構造を有するアンキリン反復(ankyrin repeat:AR)の分子表面に露出する領域であるDARPins(Designed Ankyrin Repeat proteins)(WO2002/020565)、好中球ゲラチナーゼ結合リポカリン(neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL))等のリポカリン分子において高度に保存された8つの逆並行ストランドが中央方向にねじれたバレル構造の片側を支える4つのループ領域であるAnticalin等(WO2003/029462)、ヤツメウナギ、ヌタウナギなど無顎類の獲得免疫システムとしてイムノグロブリンの構造を有さない可変性リンパ球受容体(variable lymphocyte receptor(VLR))のロイシン残基に富んだリピート(leucine-rich-repeat(LRR))モジュールが繰り返し積み重なった馬てい形の構造の内部の並行型シート構造のくぼんだ領域(WO2008/016854)が好適に挙げられる。本発明の抗原結合ドメインの好適な例として、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域を含む抗原結合ドメインが挙げられる。こうした抗原結合ドメインの例としては、「scFv(single chain Fv)」、「単鎖抗体(single chain antibody)」、「Fv」、「scFv2(single chain Fv 2)」、「Fab」または「F(ab')2」等が好適に挙げられる。
本発明の抗原結合分子における抗原結合ドメインは、カルシウム結合モチーフを含む。カルシウム結合モチーフは、低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が、高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低い限り、抗原結合ドメインのいずれの位置にも含まれ得る。抗原結合ドメインが抗体の可変領域である場合は、カルシウム結合モチーフは可変領域の重鎖にも含まれ得るし、可変領域の軽鎖にも含まれ得る。また、カルシウム結合モチーフは、重鎖および軽鎖の両方にも含まれ得る。非限定な別の一態様では、カルシウム結合モチーフは、可変領域のフレームワーク配列にも含まれ得るし、可変領域のCDR配列にも含まれ得る。また、カルシウム結合モチーフは、フレームワーク配列とCDR配列の両方にも含まれ得る。
特異的とは、一方の分子がその結合相手である一または複数の分子以外の分子に対しては何ら有意な結合を示さない状態をいう。また、抗原結合ドメインが、ある抗原中に含まれる複数のエピトープのうち特定のエピトープに対して特異的である場合にも用いられる。また、抗原結合ドメインが結合するエピトープが複数の異なる抗原に含まれる場合には、当該抗原結合ドメインを有する抗原結合分子は当該エピトープを含む様々な抗原と結合することができる。
本明細書において、抗体とは、天然のものであるかまたは部分的もしくは完全合成により製造された免疫グロブリンをいう。抗体はそれが天然に存在する血漿や血清等の天然資源や抗体を産生するハイブリドーマ細胞の培養上清から単離され得るし、または遺伝子組換え等の手法を用いることによって部分的にもしくは完全に合成され得る。抗体の例としては免疫グロブリンのアイソタイプおよびそれらのアイソタイプのサブクラスが好適に挙げられる。ヒトの免疫グロブリンとして、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgMの9種類のクラス(アイソタイプ)が知られている。本発明の抗体には、これらのアイソタイプのうちIgG1、IgG2、IgG3、IgG4が含まれ得る。
−IL-6Rのような膜蛋白質の構造を維持して免疫刺激が与えられ得る
−免疫抗原を精製する必要が無い
より具体的には、例えば細胞融合促進剤の存在下で通常の栄養培養液中で、前記細胞融合が実施され得る。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール(PEG)、センダイウイルス(HVJ)等が使用され、更に融合効率を高めるために所望によりジメチルスルホキシド等の補助剤が添加されて使用される。
−グアニジン超遠心法(Biochemistry (1979) 18 (24), 5294-5299)
−AGPC法(Anal. Biochem. (1987) 162 (1), 156-159)
(1)ハイブリドーマから得られたcDNAによってコードされるV領域を含む抗体をIL-6R発現細胞に接触させる工程、
(2)IL-6R発現細胞と抗体との結合を検出する工程、および
(3)IL-6R発現細胞に結合する抗体を選択する工程。
(1)哺乳類細胞、:CHO、COS、ミエローマ、BHK (baby hamster kidney )、Hela、Veroなど
(2)両生類細胞:アフリカツメガエル卵母細胞など
(3)昆虫細胞:sf9、sf21、Tn5など
−酵母:サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces serevisiae)などのサッカロミセス(Saccharomyces )属、メタノール資化酵母(Pichia pastoris)などのPichia属
−糸状菌:アスペスギルス・ニガー(Aspergillus niger)などのアスペルギルス(Aspergillus )属
本発明で使用されている方法によると、抗体のCDRとFRに割り当てられるアミノ酸位置はKabatにしたがって規定される(Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health, Bethesda, Md., 1987年および1991年)。本明細書において、抗原結合分子が抗体または抗原結合断片である場合、可変領域のアミノ酸はKabatナンバリングにしたがい、定常領域のアミノ酸はKabatのアミノ酸位置に準じたEUナンバリングにしたがって表される。
本発明において抗原結合分子による「抗原の細胞内への取込み」とは、抗原がエンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれることを意味する。また本発明において「細胞内への取込みを促進する」とは、血漿中において抗原と結合した抗原結合分子が細胞内に取り込まれる速度が促進されること、および/または、取り込まれた抗原が血漿中にリサイクルされる量が減少することを意味する。本発明における細胞内への取り込み速度の促進の程度は、抗原結合分子の低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性を高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低下させる前の抗原結合分子と比較して、細胞内への取込み速度が促進されていればよい。したがって、本発明において、抗原結合分子により抗原の細胞内への取り込みが促進されたかどうかは、抗原の細胞内への取り込み速度が増大したかどうかで判断することが可能である。抗原の細胞内への取り込み速度は、例えば、ヒトFcRn発現細胞を含む培養液に抗原結合分子と抗原を添加し、抗原の培養液中濃度の減少を経時的に測定すること、あるいは、ヒトFcRn発現細胞内に取り込まれた抗原の量を経時的に測定すること、により算出することができる。
また、本発明における「1分子の抗原結合分子による抗原への結合回数」とは、1分子の抗原結合分子が分解されて消失するまでの間に抗原へ結合することができる回数のことを意味する。本発明における「1分子の抗原結合分子による抗原への結合回数を増加させる」とは、血漿中で抗原が抗原結合分子に結合し、抗原が結合した抗原結合分子が細胞内に取り込まれエンドソーム内で抗原を解離した後に、抗原結合分子が血漿中に戻ることを1サイクルとした時に、1分子の抗原結合分子が分解されて消失するまでの間に回すことができたこのサイクルの数を増加させることである。本発明においては、抗原結合分子の低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低くない抗原結合分子、あるいは、低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性を高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低下させる前の抗原結合分子と比較して、サイクル数が増えていればよい。したがって、サイクル数が増えたかどうかは、前述の「細胞内への取込みを促進した」か否か、あるいは、後述の「血漿中滞留性の改善した」か否かによって、判断することが可能である。
本発明において「血漿中滞留性の改善」は、「薬物動態の向上」、「薬物動態の改善」、「優れた薬物動態」、「血漿中滞留性の向上」、「優れた血漿中滞留性」または「血漿中滞留性を長くする」と言い換えることが可能であり、これらの語句は同じ意味で使用される。
また、本発明は、細胞外で抗原結合分子に結合した抗原の細胞内での抗原結合分子からの解離を促進させる方法として利用することも可能である。本発明において抗原が抗原結合分子から解離する箇所は細胞内であればいかなる箇所でもよいが、好ましくは早期エンドソーム内である。本発明において、「細胞外で抗原結合分子に結合した抗原の細胞内での抗原結合分子からの解離」とは、細胞外で抗原結合分子に結合して細胞内に取り込まれた抗原全てが細胞内で抗原結合分子から解離する必要はなく、細胞内で抗原結合分子から解離する抗原の割合が、抗原結合分子の低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低くない抗原結合分子、あるいは、低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性を高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低下させる前の抗原結合分子と比較して、細胞内で抗原結合分子から解離する抗原の割合がより高くなっていればよい。また、細胞外で抗原結合分子に結合した抗原の細胞内での抗原結合分子からの解離を促進させる方法は、抗原と結合した抗原結合分子の細胞内への取込みを促進させ、細胞内での抗原結合分子からの抗原の解離が促進されやすくなる性質を抗原結合分子に付与する方法ともいえる。
また、本発明は、抗原と結合した状態で細胞内に取り込まれた抗原結合分子の、抗原と結合していない状態での細胞外への放出を促進させる方法として利用することも可能である。本発明において、「抗原と結合した状態で細胞内に取り込まれた抗原結合分子の、抗原と結合していない状態での細胞外への放出」とは、抗原と結合した状態で細胞内に取り込まれた抗原結合分子全てが抗原と結合していない状態で細胞外に放出される必要はなく、抗原と結合していない状態で細胞外に放出される抗原結合分子の割合が、抗原結合分子の低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低くない抗原結合分子、あるいは、低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性を高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低下させる前と比較して、細胞外に放出される抗原結合分子の割合が高くなっていればよい。細胞外に放出された抗原結合分子は、抗原結合活性を維持していることが好ましい。また、抗原と結合した状態で細胞内に取り込まれた抗原結合分子の抗原と結合していない状態での細胞外への放出を促進させる方法は、抗原と結合した抗原結合分子の細胞内への取り込みを促進させ、抗原結合分子の抗原と結合していない状態での細胞外への放出が促進されやすくなる性質を抗原結合分子に付与する方法ともいえる。
本発明において、低カルシウム濃度条件下とは、通常、イオン化カルシウム濃度が0.1μM〜30μMであることを意味する。好ましくは0.5μM〜10μMであり、特に生体内の早期エンドソーム内でのイオン化カルシウム濃度に近い1μM〜5μMであることが好ましい。また、本発明において、高カルシウム濃度条件下とは、通常、イオン化カルシウム濃度が、100μM〜10 mMを意味し、好ましくは200μM〜5 mM、特に生体内の血漿中(血中)でのイオン化カルシウム濃度に近い0.5 mM〜2.5 mMが好ましい。
免疫グロブリンスーパーファミリーに属するFcγレセプターと異なり、FcRn、特にヒトFcRnは構造的には主要組織不適合性複合体(MHC)クラスIのポリペプチドに構造的に類似しクラスIのMHC分子と22から29%の配列同一性を有する(Ghetieら,Immunol. Today (1997) 18 (12), 592-598)。FcRnは、可溶性βまたは軽鎖(β2マイクログロブリン)と複合体化された膜貫通αまたは重鎖よりなるヘテロダイマーとして発現される。MHCのように、FcRnのα鎖は3つの細胞外ドメイン(α1、α2、α3)よりなり、短い細胞質ドメインはタンパク質を細胞表面に繋留する。α1およびα2ドメインが抗体のFc領域中のFcRn結合ドメインと相互作用する(Raghavanら(Immunity (1994) 1, 303-315)。
本発明の抗原結合分子は、抗原結合ドメインとヒトFcRn結合ドメインを有する。ヒトFcRn結合ドメインは、抗原結合分子が酸性pHおよび/または中性pHにおいてヒトFcRn結合活性を有していれば特に限定されず、また、直接または間接的にヒトFcRnに対して結合活性を有するドメインであってもよい。そのようなドメインとしては、例えば、直接的にヒトFcRnに対する結合活性を有するIgG型免疫グロブリンのFc領域、アルブミン、アルブミンdomain3、抗ヒトFcRn抗体、抗ヒトFcRnペプチド、抗ヒトFcRn Scaffold分子等、あるいは間接的にヒトFcRnに対する結合活性を有するIgGやアルブミンに結合する分子等を挙げることができる。本発明においては、pH酸性域およびpH中性域においてヒトFcRn結合活性を有するドメインが好ましい。当該ドメインは、あらかじめpH酸性域およびpH中性域においてヒトFcRn結合活性を有しているドメインであればそのまま用いてもよい。当該ドメインがpH酸性域および/またはpH中性域においてヒトFcRn結合活性がない若しくは弱い場合には、抗原結合分子中のアミノ酸を改変してヒトFcRn結合活性を得てもよいが、ヒトFcRn結合ドメイン中のアミノ酸を改変してpH酸性域および/またはpH中性域におけるヒトFcRn結合活性を得るのが好ましい。また、あらかじめpH酸性域および/またはpH中性域においてヒトFcRn結合活性を有しているドメイン中のアミノ酸を改変して、ヒトFcRn結合活性を高めてもよい。ヒトFcRn結合ドメインのアミノ酸改変は、アミノ酸改変前と改変後のpH酸性域および/またはpH中性域におけるヒトFcRn結合活性を比較することによって目的の改変を見出すことができる。
237番目のGlyをMetに置換するアミノ酸置換、
238番目のProをAlaに置換するアミノ酸置換、
239番目のSerをLysに置換するアミノ酸置換、
248番目のLysをIleに置換するアミノ酸置換、
250番目のThrをAla、Phe、Ile、Met、Gln、Ser、Val、Trp、またはTyrに置換するアミノ酸置換、
252番目のMetをPhe、Trp、またはTyrに置換するアミノ酸置換、
254番目のSerをThrに置換するアミノ酸置換、
255番目のArgをGluに置換するアミノ酸置換、
256番目のThrをAsp、Glu、またはGlnに置換するアミノ酸置換、
257番目のProをAla、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr、またはValに置換するアミノ酸置換、
258番目のGluをHisに置換するアミノ酸置換、
265番目のAspをAlaに置換するアミノ酸置換、
270番目のAspをPheに置換するアミノ酸置換、
286番目のAsnをAlaまたはGluに置換するアミノ酸置換、
289番目のThrをHisに置換するアミノ酸置換、
297番目のAsnをAlaに置換するアミノ酸置換、
298番目のSerをGlyに置換するアミノ酸置換、
303番目のValをAlaに置換するアミノ酸置換、
305番目のValをAlaに置換するアミノ酸置換、
307番目のThrをAla、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp、またはTyrに置換するアミノ酸置換、
308番目のValをAla、Phe、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、またはThrに置換するアミノ酸置換、
309番目のLeuまたはValをAla、Asp、Glu、Pro、またはArgに置換するアミノ酸置換、
311番目のGlnをAla、His、またはIleに置換するアミノ酸置換、
312番目のAspをAlaまたはHisに置換するアミノ酸置換、
314番目のLeuをLysまたはArgに置換するアミノ酸置換、
315番目のAsnをAlaまたはHisに置換するアミノ酸置換、
317番目のLysをAlaに置換するアミノ酸置換、
325番目のAsnをGlyに置換するアミノ酸置換、
332番目のIleをValに置換するアミノ酸置換、
334番目のLysをLeuに置換するアミノ酸置換、
360番目のLysをHisに置換するアミノ酸置換、
376番目のAspをAlaに置換するアミノ酸置換、
380番目のGluをAlaに置換するアミノ酸置換、
382番目のGluをAlaに置換するアミノ酸置換、
384番目のAsnまたはSerをAlaに置換するアミノ酸置換、
385番目のGlyをAspまたはHisに置換するアミノ酸置換、
386番目のGlnをProに置換するアミノ酸置換、
387番目のProをGluに置換するアミノ酸置換、
389番目のAsnをAlaまたはSerに置換するアミノ酸置換、
424番目のSerをAlaに置換するアミノ酸置換、
428番目のMetをAla、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp、またはTyrに置換するアミノ酸置換、
433番目のHisをLysに置換するアミノ酸置換、
434番目のAsnをAla、Phe、His、Ser、Trp、またはTyrに置換するアミノ酸置換、および
436番目のTyrまたはPheをHisに置換するアミノ酸置換、
を挙げることができる。
本発明は、抗原結合ドメインとヒトFcRn結合ドメインを有する抗原結合分子であって、2つの異なるカルシウム濃度条件下における抗原結合活性が異なり、抗原結合分子の低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が、高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低い抗原結合分子を提供する。
さらに、本発明は2つの異なるカルシウム濃度条件下における抗原結合活性が異なり、低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低い抗原結合分子を提供する。本発明は好ましくはイオン化カルシウム濃度0.1μM〜30μMの低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が、イオン化カルシウム濃度100μM〜10 mMの高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性よりも低い抗原結合分子を提供する。より具体的には、生体内の早期エンドソーム内のイオン化カルシウム濃度(低カルシウム濃度、例えば1μM〜5μM)における抗原結合活性が、生体内の血漿中のイオン化カルシウム濃度(高カルシウム濃度、例えば0.5 mM〜2.5 mM)における抗原結合活性よりも低い抗原結合分子を挙げることができる。
本発明は、抗原結合分子の低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性よりも低い抗原結合分子をスクリーニングする方法を提供する。また、
(i)抗原の細胞内への取込みを促進させる機能、
(ii)抗原に2回以上結合する機能、
(iii)血漿中の抗原濃度の減少を促進させる機能、および
(iv)優れた血漿中滞留性機能、
から選ばれる少なくとも1つの機能を有する抗原結合分子のスクリーニング方法を提供する。
(a) 低カルシウム濃度条件下における抗原結合分子の抗原結合活性を得る工程、
(b) 高カルシウム濃度条件下における抗原結合分子の抗原結合活性を得る工程、
(c) 低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が、高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低い抗原結合分子を選択する工程。
(a) 高カルシウム濃度条件下で抗原結合分子又は抗原結合分子ライブラリーを抗原に接触させる工程、
(b) 前記工程(a)で抗原に結合した抗原結合分子を低カルシウム濃度条件下に置く工程、
(c) 前記工程(b)で解離した抗原結合分子を取得する工程。
(a) 低カルシウム濃度条件下で抗原結合分子又は抗原結合分子ライブラリーを抗原に接触させる工程、
(b) 前記工程(a)で抗原に結合しない抗原結合分子を選択する工程、
(c) 前記工程(b)で選択された抗原結合分子を高カルシウム濃度条件下で抗原に結合させる工程、
(d) 前記工程(c)で抗原に結合した抗原結合分子を取得する工程。
(a) 抗原を固定したカラムに高カルシウム濃度条件下で抗原結合分子又は抗原結合分子ライブラリーを接触させる工程、
(b) 前記工程(a)でカラムに結合した抗原結合分子を低カルシウム濃度条件下でカラムから溶出する工程、
(c) 前記工程(b)で溶出された抗原結合分子を取得する工程。
(a) 抗原を固定したカラムに低カルシウム濃度条件下で抗原結合分子又は抗原結合分子ライブラリーを通過させる工程、
(b) 前記工程(a)でカラムに結合せずに溶出した抗原結合分子を回収する工程、
(c) 前記工程(b)で回収された抗原結合分子を高カルシウム濃度条件下で抗原に結合させる工程、
(d) 前記工程(c)で抗原に結合した抗原結合分子を取得する工程。
(a) 高カルシウム濃度条件下で抗原結合分子又は抗原結合分子ライブラリーを抗原に接触させる工程、
(b) 前記工程(a)で抗原に結合した抗原結合分子を取得する工程、
(c) 前記工程(b)で取得した抗原結合分子を低カルシウム濃度条件下に置く工程、
(d) 前記工程(c)で抗原結合活性が、前記工程(b)で選択した基準より弱い抗原結合分子を取得する工程。
(ii)抗原に2回以上結合する機能、
(iii)血漿中の抗原濃度の減少を促進させる機能、及び
(iv)優れた血漿中滞留性機能、
から選ばれる少なくとも1つの機能を有する抗原結合分子を得ることが可能である。従って、本発明のスクリーニング方法は、これらの機能のうち少なくとも1つの機能を有する抗原結合分子を得る為のスクリーニング方法として利用することができる。
本発明は、抗原結合分子の低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性よりも低い抗原結合分子の製造方法を提供する。また、(i)抗原の細胞内への取込みを促進させる機能、
(ii)抗原に2回以上結合する機能、
(iii)血漿中の抗原濃度の減少を促進させる機能、および、
(iv)優れた血漿中滞留性機能、
から選ばれる少なくとも1つの機能を有する抗原結合分子の製造方法を提供する。
(a) 低カルシウム濃度条件下における抗原結合分子の抗原結合活性を得る工程、
(b) 高カルシウム濃度条件下における抗原結合分子の抗原結合活性を得る工程、
(c) 低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が、高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低い抗原結合分子を選択する工程、
(d) 前記工程(c)で選択された抗原結合分子をコードする遺伝子を得る工程、
(e) 前記工程(d)で得られた遺伝子を用いて抗原結合分子を産生する工程。
(a) 高カルシウム濃度条件下で抗原結合分子又は抗原結合分子ライブラリーを抗原に接触させる工程、
(b) 前記工程(a)で抗原に結合した抗原結合分子を低カルシウム濃度条件下に置く工程、
(c) 前記工程(b)で解離した抗原結合分子を取得する工程、
(d) 前記工程(c)で取得された抗原結合分子をコードする遺伝子を得る工程、
(e) 前記工程(d)で得られた遺伝子を用いて抗原結合分子を産生する工程。
なお、(a)〜(d)の工程は2回以上繰り返されてもよい。従って、本発明は上述の方法において、(a)〜(d)の工程を2回以上繰り返す工程をさらに含む方法を提供する。(a)〜(d)の工程が繰り返される回数は特に限定されないが、通常10回以内である。
(a) 低カルシウム濃度条件下で抗原結合分子又は抗原結合分子ライブラリーを抗原に接触させる工程、
(b) 前記工程(a)で抗原に結合しない抗原結合分子を選択する工程、
(c) 前記工程(b)で選択された抗原結合分子を高カルシウム濃度条件下で抗原に接触させる工程、
(d) 前記工程(c)で抗原に結合した抗原結合分子を取得する工程、
(e) 前記工程(d)で取得された抗原結合分子をコードする遺伝子を得る工程、
(f) 前記工程(e)で得られた遺伝子を用いて抗原結合分子を産生する工程。
なお、(a)〜(e)の工程は2回以上繰り返されてもよい。従って、本発明は上述の方法において、(a)〜(e)の工程を2回以上繰り返す工程をさらに含む方法を提供する。(a)〜(e)の工程が繰り返される回数は特に限定されないが、通常10回以内である。
(a) 抗原を固定したカラムに高カルシウム濃度条件下で抗原結合分子又は抗原結合分子ライブラリーを接触させる工程、
(b) 前記工程(a)でカラムに結合した抗原結合分子を、低カルシウム濃度条件下でカラムから溶出する工程、
(c) 前記工程(b)で溶出された抗原結合分子を取得する工程、
(d) 前記工程(c)で取得された抗原結合分子をコードする遺伝子を得る工程、
(e) 前記工程(d)で得られた遺伝子を用いて抗原結合分子を産生する工程。
なお、(a)〜(d)の工程は2回以上繰り返されてもよい。従って、本発明は上述の方法において、(a)〜(d)の工程を2回以上繰り返す工程をさらに含む方法を提供する。(a)〜(d)の工程が繰り返される回数は特に限定されないが、通常10回以内である。
(a) 抗原を固定したカラムに低カルシウム濃度条件下で抗原結合分子又は抗原結合分子ライブラリーを通過させる工程、
(b) 前記工程(a)でカラムに結合せずに溶出した抗原結合分子を回収する工程、
(c) 前記工程(b)で回収された抗原結合分子を高カルシウム濃度条件下で抗原に結合させる工程、
(d) 前記工程(c)で抗原に結合した抗原結合分子を取得する工程、
(e) 前記工程(d)で取得された抗原結合分子をコードする遺伝子を得る工程、
(f) 前記工程(e)で得られた遺伝子を用いて抗原結合分子を産生する工程。
なお、(a)〜(e)の工程は2回以上繰り返されてもよい。従って、本発明は上述の方法において、(a)〜(e)の工程を2回以上繰り返す工程をさらに含む方法を提供する。(a)〜(e)の工程が繰り返される回数は特に限定されないが、通常10回以内である。
(a) 高カルシウム濃度条件下で抗原結合分子又は抗原結合分子ライブラリーを抗原に接触させる工程、
(b) 前記工程(a)で抗原に結合した抗原結合分子を取得する工程、
(c) 前記工程(b)で取得した抗原結合分子を低カルシウム濃度条件下に置く工程、
(d) 前記工程(c)で抗原結合活性が、前記工程(b)で選択した基準より弱い抗原結合分子を取得する工程、
(e) 前記工程(d)で取得された抗原結合分子をコードする遺伝子を得る工程、
(f) 前記工程(e)で得られた遺伝子を用いて抗原結合分子を産生する工程。
なお、(a)〜(e)の工程は2回以上繰り返されてもよい。従って、本発明は、上述の方法において、(a)〜(e)の工程を2回以上繰り返す工程をさらに含む方法を提供する。(a)〜(e)の工程が繰り返される回数は特に限定されないが、通常10回以内である。
(i)抗原の細胞内への取込みを促進させる機能、
(ii)抗原に2回以上結合する機能、
(iii)血漿中の抗原濃度の減少を促進させる機能、及び
(iv)優れた血漿中滞留性機能、
から選ばれる少なくとも1つの機能を有する抗原結合分子を製造することが可能である。従って、本発明の製造方法は、これらの機能のうち少なくとも1つの機能を有する抗原結合分子を得る為の製造方法として利用することができる。
また本発明は、本発明の抗原結合分子、本発明のスクリーニング方法により単離された抗原結合分子、または本発明の製造方法により製造された抗原結合分子を含む医薬組成物に関する。本発明の抗原結合分子、本発明のスクリーニング方法により単離された抗原結合分子、または本発明の製造方法により製造された抗原結合分子は、
(i)抗原の細胞内への取込みを促進させる機能、
(ii)抗原に2回以上結合する機能、
(iii)血漿中の抗原濃度の減少を促進させる機能、及び
(iv)優れた血漿中滞留性機能、
から選ばれる少なくとも1つの機能を有する抗原結合分子であって、抗原結合分子の投与頻度を減らせることが期待されるので医薬組成物として有用である。また、本発明の医薬組成物は薬学的に許容される担体を含むことができる。
注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
〔実施例1〕カルシウム依存的抗原結合抗体の抗原消失加速効果のコンセプト
(1−1)pH依存的結合抗体の抗原結合抗体による抗原消失加速効果
WO 2009/125825に記載されているH54/L28-IgG1はヒト化抗IL-6レセプター抗体であり、Fv4-IgG1は、H54/L28-IgG1に対して可溶型ヒトIL-6レセプターへpH依存的に結合する特性(中性条件下において結合し、酸性条件下において解離する)を付与したヒト化抗IL-6レセプター抗体である。WO 2009/125825に記載されているマウスのin vivo試験において、H54/L28-IgG1と抗原である可溶型ヒトIL-6レセプターの混合物を投与した群と比較して、Fv4-IgG1と抗原である可溶型ヒトIL-6レセプターの混合物を投与した群において、可溶型ヒトIL-6レセプターの消失を大幅に加速できることが示された。
図1および図2に示したpH依存的結合抗体による作用においては、血漿中とエンドソーム内の環境の違い、すなわちpHの違い(血漿中:pH7.4、エンドソーム内:pH6.0)を利用して、血漿中では抗原に強く結合させ、エンドソーム内では抗原から解離させることが重要である。血漿中とエンドソーム内でpH依存的結合抗体の抗原への結合能にこのような差異を作りだすためには、血漿中とエンドソーム内の環境の違いの大きさが重要である。pHの違いはすなわち水素イオン濃度の違いである。つまり、pH7.4の血漿中の水素イオン濃度は約40 nMであり、pH6.0のエンドソーム内の水素イオン濃度は約1000 nMであり、血漿中とエンドソーム内で因子(水素イオン)の濃度に約25倍の違いがある。
(2−1)naiveヒト抗体ファージディスプレイライブラリーの作製
ヒトPBMCから作成したpolyA RNAや、市販ヒトpolyA RNAなどをtemplateとして、(Methods Mol Biol. 2002;178:87-100.)に習い、ヒト抗体配列からなるFabドメインを提示する複数のヒト抗体ファージディスプレイライブラリーを構築した。
構築したヒト抗体ファージディスプレイライブラリーからの最初の選抜は、抗原への結合能をもつ抗体断片のみを濃縮、もしくはCa依存的結合能を指標に濃縮させた。Ca依存的結合能をもつ抗体断片を濃縮させる場合には、Caイオン存在下で抗原と結合させた後、EDTAによりCaイオンをキレートすることによりファージの溶出を行った。抗原として、ビオチン標識したヒトIL-6レセプターを用いた。
上記の方法により得られた大腸菌シングルコロニーから、(Methods Mol Biol. 2002;178:133-145.)に習い、ファージ含有培養上清を回収した。
ファージ含有培養上清に終濃度4%BSA, カルシウムイオン濃度1.2 mMとなるようBSA、 CaCl2を加え、ELISAに供した。StreptaWell 96マイクロタイタープレート(Roche)をビオチン標識抗原を含むPBS 100μLにて一晩コートした。PBST(0.1%Tween20を含むPBS)にて洗浄し、抗原を除いた後、4% BSA-TBS 250μLにて1時間以上ブロッキングした。4% BSA-TBSを除き、ここに調製した培養上清を加え37℃で1時間静置しファージ提示抗体を結合させた。1.2 mM CaCl2/TBST (1.2 mM CaCl2, 0.1% Tween20を含むTBS)にて洗浄後、1.2 mM CaCl2/TBSもしくは1 mM EDTA/TBSを加え37℃で30分間静置しインキュベートした。1.2 mM CaCl2/TBSTにて洗浄後、4% BSA, イオン化カルシウム濃度1.2 mMとしたTBSにて希釈したHRP結合抗M13抗体(Amersham Parmacia Biotech)を1時間インキュベートさせた。1.2 mM CaCl2/TBSTにて洗浄後、TMB single solution(ZYMED)で検出し、硫酸の添加により反応を停止した後、450 nmの吸光度を測定した。Ca依存的結合能があると判断した抗体断片に対し、特異的なプライマーを用いて塩基配列解析を行った。
ファージELISAにより、Ca依存的結合能があると判断されたクローンについて、動物細胞発現用プラスミドへの導入を行った。抗体の発現は以下の方法を用いて行った。ヒト胎児腎細胞由来FreeStyle 293-F株(Invitrogen)をFreeStyle 293 Expression Medium培地(Invitrogen)へ懸濁し、1.33 × 106個 /mLの細胞密度で6well plateの各ウェルへ3 mLずつ蒔きこみ、リポフェクション法により調製したプラスミドを細胞へ導入した。CO2インキュベーター(37度、8%CO2, 90 rpm)で4日間培養を行い、得られた培養上清から、rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)を用いて当業者公知の方法で抗体を精製した。精製抗体濃度は、分光光度計を用いて280 nmでの吸光度を測定した。得られた値からPACE法により算出された吸光係数を用いて抗体濃度を算出した(Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423)。
実施例2で取得された抗体6RL#9-IgG1(重鎖配列番号:1、軽鎖配列番号:2)、6RK#12-IgG1(重鎖配列番号:66、軽鎖配列番号:67)及び、FH4-IgG1(重鎖配列番号:3、軽鎖配列番号:4)を、Biacore T100(GE Healthcare)を用いてpH7.4でヒトインターロイキン6レセプター (hIL6R) 結合活性が評価された。ランニングバッファーとして3 μMもしくは2 mM CaCl2を含有する0.05% Surfactant P20, 10 mmol/l ACES 150 mmol/l NaCl(pH7.4もしくはpH6.0)を用いて測定を行った。
Req (RU): 定常状態結合レベル(Steady state binding levels)
Rmax (RU):アナライトの表面結合能(Analyte binding capacity of the surface)
RI (RU): 試料中の容積屈折率寄与(Bulk refractive index contribution in the sample)
C (M): アナライト濃度(Analyte concentration)
KD (M): 平衡解離定数(Equilibrium dissociation constant)
次に、抗体へのカルシウムイオンの結合の評価を行うために、示差走査型熱量測定(DSC)による熱変性中間温度(Tm値)の評価を行った(MicroCal VP-Capillary DSC、MicroCal製)。熱変性中間温度(Tm値)は安定性の指標であり、カルシウムイオンが結合してタンパク質が安定化すると、熱変性中間温度(Tm値)はカルシウムイオンが結合していない場合に比べて高くなる(J Bio Chem. 2008 Sep 12 ; Vol.283 ; No. 37:pp 25140 - 25149)ことを利用して、抗体へのカルシウムイオンの結合の評価を行った。精製した抗体を20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2, pH7.4、または20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 3μM CaCl2, pH7.4の溶液に対して透析(EasySEP, TOMY)を行った。タンパク質溶液を透析に用いた溶液で0.1 mg/mLに調製し、20℃から115℃まで240℃/hrの昇温速度でDSC測定を行った。得られたDSCの変性曲線を元に各抗体のFabドメインの熱変性中間温度(Tm値)を算出し表10に示した。
(5−1)ノーマルマウスを用いたin vivo試験
ノーマルマウス(C57BL/6J mouse、Charles River Japan)にhsIL-6R(可溶型ヒトIL-6レセプター:参考例1にて作製)を単独投与もしくはhsIL-6Rおよび抗ヒトIL-6レセプター抗体を同時投与した後のhsIL-6Rおよび抗ヒトIL-6レセプター抗体の体内動態を評価した。hsIL-6R溶液(5μg/mL)、もしくは、hsIL-6Rと抗ヒトIL-6レセプター抗体の混合溶液を尾静脈に10 mL/kgで単回投与した。抗ヒトIL-6レセプター抗体としては、上述のH54/L28-IgG1、6RL#9-IgG1、FH4-IgG1を使用した。
マウス血漿中の抗ヒトIL-6レセプター抗体濃度はELISA法にて測定した。まずAnti-Human IgG(γ-chain specific) F(ab')2 Fragment of Antibody (SIGMA) をNunc-Immuno Plate, MaxiSoup (Nalge nunc International)に分注し、4℃で1晩静置しAnti-Human IgG固相化プレートを作成した。血漿中濃度として0.64、0.32、0.16、0.08、0.04、0.02、0.01μg/mLの検量線試料と100倍以上希釈したマウス血漿測定試料を調製し、Anti-Human IgG固相化プレートに分注して25℃で1時間インキュベーションした。その後Biotinylated Anti-human IL-6 R Antibody(R&D)を25℃で1時間反応させ、さらにStreptavidin-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies)を25℃で0.5時間反応させ、TMB One Component HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories)を基質として用い発色反応を行い、1N-Sulfuric acid(Showa Chemical)で反応停止後、マイクロプレートリーダーにて450 nmの吸光度を測定した。マウス血漿中濃度は検量線の吸光度から解析ソフトウェアSOFTmax PRO(Molecular Devices)を用いて算出した。この方法で測定した静脈内投与後のノーマルマウスにおけるH54/L28-IgG1、6RL#9-IgG1、FH4-IgG1の血漿中抗体濃度推移を図10に示した。
マウスの血漿中hsIL-6R濃度は電気化学発光法にて測定した。2000、1000、500、250、125、62.5、31.25 pg/mLに調整したhsIL-6R検量線試料および50倍以上希釈したマウス血漿測定試料を調製し、SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)でルテニウム化したMonoclonal Anti-human IL-6R Antibody(R&D)およびBiotinylated Anti-human IL-6 R Antibody (R&D)およびトシリズマブ(重鎖配列番号:13、軽鎖配列番号:14)溶液を混合し4℃で1晩反応させた。その際のAssay bufferには10 mM EDTAが含まれており、サンプル中のFree Ca濃度を低下させ、サンプル中のほぼ全てのhsIL-6Rが6RL#9-IgG1もしくはFH4-IgG1から解離し、添加したトシリズマブと結合した状態とすることを目的とした。その後、MA400 PR Streptavidin Plate(Meso Scale Discovery)に分注した。さらに25℃で1時間反応させ洗浄後、Read Buffer T(×4)(Meso Scale Discovery)を分注し、ただちにSECTOR PR 400 reader(Meso Scale Discovery)で測定を行った。hSIL-6R濃度は検量線のレスポンスから解析ソフトウェアSOFTmax PRO(Molecular Devices)を用いて算出した。この方法で測定した静脈内投与後のノーマルマウスにおける血漿中hsIL-6R濃度推移を図11に示した。
(6−1)IgG抗体のFcRnへの結合に関して
IgG抗体はFcRnに結合することで長い血漿中滞留性を有する。IgGとFcRnの結合は酸性条件下(pH6.0)においてのみ認められ、中性条件下(pH7.4)においてはほとんど結合は認められない。IgG抗体は非特異的に細胞に取り込まれるが、エンドソーム内の酸性条件下においてエンドソーム内のFcRnに結合することで細胞表面上に戻り、血漿中の中性条件下においてFcRnから解離する。IgGのFc領域に変異を導入し、酸性条件下におけるFcRnへの結合を失わせると、エンドソーム内から血漿中にリサイクルされなくなるため、抗体の血漿中滞留性は著しく損なわれる。
カルシウム依存的抗原結合能を有するFH4-IgG1と6RL#9-IgG1、および、コントロールとしてカルシウム依存的抗原結合能を有さないH54/L28-IgG1に対して、中性条件下(pH7.4)におけるFcRnに対する結合を増加させるアミノ酸変異を導入した。アミノ酸変異の導入はPCRを用いた当業者公知の方法を用いて行った。具体的にはIgG1の重鎖定常領域に対して、IgG1の重鎖定常領域に対して、EUナンバリングにおける434番目をAsnからTrpに置換したFH4-N434W(重鎖配列番号:7、軽鎖配列番号:8)と6RL#9-N434W(重鎖配列番号:9、軽鎖配列番号:10)とH54/L28-N434W(重鎖配列番号:11、軽鎖配列番号:12)を作製した。アミノ酸置換の導入方法としては、QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)を用いて、添付説明書記載の方法で変異体を作製し、得られたプラスミド断片を動物細胞発現ベクターに挿入し、目的の発現ベクターを作成した。抗体の発現、精製、濃度測定は実施例2に記載の方法で実施した。
(7−1)ノーマルマウスを用いたin vivo試験
ノーマルマウス(C57BL/6J mouse、Charles River Japan)にhsIL-6R(可溶型ヒトIL-6レセプター:参考例1にて作製)を単独投与もしくはhsIL-6Rおよび抗ヒトIL-6レセプター抗体を同時投与した後のhsIL-6Rおよび抗ヒトIL-6レセプター抗体の体内動態を評価した。hsIL-6R溶液(5μg/mL)、もしくは、hsIL-6Rと抗ヒトIL-6レセプター抗体の混合溶液を尾静脈に10 mL/kgで単回投与した。抗ヒトIL-6レセプター抗体としては、上述のH54/L28-N434W、6RL#9-N434W、FH4-N434Wを使用した。
マウス血漿中の抗ヒトIL-6レセプター抗体濃度は実施例6と同様のELISA法にて測定した。この方法で測定した静脈内投与後のノーマルマウスにおけるH54/L28-N434W、6RL#9-N434W、FH4-N434Wの血漿中抗体濃度推移を図12に示した。
マウスの血漿中hsIL-6R濃度は電気化学発光法にて測定した。2000、1000、500、250、125、62.5、31.25 pg/mLに調整したhsIL-6R検量線試料および50倍以上希釈したマウス血漿測定試料を調製し、SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)でルテニウム化したMonoclonal Anti-human IL-6R Antibody(R&D)およびBiotinylated Anti-human IL-6 R Antibody (R&D)を混合し4℃で1晩反応させた。その際のAssay bufferには10 mM EDTAが含まれており、サンプル中のFree Ca濃度を低下させ、サンプル中のほぼ全てのhsIL-6Rが6RL#9-N434WもしくはFH4-N434Wから解離し、free体として存在する状態とすることを目的とした。その後、MA400 PR Streptavidin Plate(Meso Scale Discovery)に分注した。さらに25℃で1時間反応させ洗浄後、Read Buffer T(×4)(Meso Scale Discovery)を分注し、ただちにSECTOR PR 400 reader(Meso Scale Discovery)で測定を行った。hsIL-6R濃度は検量線のレスポンスから解析ソフトウェアSOFTmax PRO(Molecular Devices)を用いて算出した。この方法で測定した静脈内投与後のノーマルマウスにおける血漿中hsIL-6R濃度推移を図13に示した。
(8−1)X線結晶構造解析
実施例4に示されたように、6RL#9抗体はカルシウムイオンと結合することが熱変性温度Tm値の測定から示唆された。しかし、6RL#9抗体のどの部位がカルシウムイオンと結合しているか予想できなかったため、X線結晶構造解析の手法を用いることによって、カルシウムイオンが相互作用する6RL#9抗体の配列中の残基が特定された。
X線結晶構造解析に用いるために発現させた6RL#9抗体が精製された。具体的には、6RL#9抗体の重鎖(配列番号:1)と軽鎖(配列番号:2)をそれぞれ発現させることが出来るように調製された動物発現用プラスミドが動物細胞に一過的に導入された。最終細胞密度1 x 106細胞/mLとなるようにFreeStyle 293 Expression Medium培地(Invitrogen)へ懸濁された800 mLのヒト胎児腎細胞由来FreeStyle 293-F株(Invitrogen)に、リポフェクション法により調製されたプラスミドが導入された。プラスミドが導入された細胞はCO2インキュベーター(37℃、8%CO2、90 rpm)中で5日間培養された。rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)を用いた当業者公知の方法にしたがって、上記のように得られた培養上清から抗体が精製された。分光光度計を用いて精製された抗体溶液の280 nmでの吸光度が測定された。PACE法により算出された吸光係数を用いて測定値から抗体濃度が算出された(Protein Science (1995) 4, 2411-2423)。
分子量分画サイズ10000MWCOの限外ろ過膜 を用いて6RL#9抗体が21 mg/mLまで濃縮された。L-Cystein 4 mM、EDTA 5 mM、20 mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH 6.5)を用いて5 mg/mLによって希釈された2.5 mLの当該抗体の試料が調製された。0.125 mgのPapain(Roche Applied Science)を加えて攪拌された当該試料が35℃にて2時間静置された。静置後、プロテアーゼインヒビターカクテルミニ、EDTAフリー(Roche Applied Science)1錠を溶かした10 mLの25 mM MES 緩衝液(pH6)をさらに当該試料に加え、氷中に静置することによって、Papainによるプロテアーゼ反応が停止された。次に、当該試料が、下流に1 mLサイズのProteinA担体カラムHiTrap MabSelect Sure(GE Healthcare)がタンデムにつながれた25 mM MES 緩衝液pH6で平衡化された1 mLサイズの陽イオン交換カラムHiTrap SP HP(GE Healthcare)に添加された。同緩衝液中NaCl濃度を300 mMまで直線的に上げて溶出をおこなうことで6RL#9抗体のFabフラグメントの精製画分が得られた。次に、得られた精製画分が5000MWCOの限外ろ過膜 により0.8 mL程度まで濃縮された。50 mM NaCl を含む100 mM HEPES緩衝液(pH 8)で平衡化されたゲルろ過カラムSuperdex 200 10/300 GL(GE Healthcare)に濃縮液が添加された。結晶化用の精製6RL#9抗体のFabフラグメントが同緩衝液を用いてカラムから溶出された。なお、上記のすべてのカラム操作は6から7.5℃の低温下にて実施された。
予め一般的な条件設定で6RL#9 Fabフラグメントの種結晶が得られた。つぎに5 mM となるようにCaCl2が加えられた精製6RL#9抗体のFabフラグメントが5000MWCOの限外ろ過膜を用いて12 mg/mLに濃縮された。つぎに、ハンギングドロップ蒸気拡散法によって、前記のように濃縮された試料の結晶化が実施された。リザーバー溶液として20-29%のPEG4000を含む100 mM HEPES緩衝液(pH7.5)が用いられた。カバーグラス上で0.8μlのリザーバー溶液および0.8μlの前記濃縮試料の混合液に対して、29% PEG4000および5 mM CaCl2を含む100 mM HEPES緩衝液(pH7.5)中で破砕された前記種結晶が100-10000倍に希釈された希釈系列の溶液0.2μlを加えることによって結晶化ドロップが調製された。当該結晶化ドロップを20℃に2日から3日静置することによって得られた薄い板状の結晶のX線回折データが測定された。
精製6RL#9抗体のFabフラグメントが5000MWCOの限外ろ過膜 を用いて15 mg/mlに濃縮された。つぎに、ハンギングドロップ蒸気拡散法によって、前記のように濃縮された試料の結晶化が実施された。リザーバー溶液として18-25%のPEG4000を含む100 mM HEPES緩衝液(pH7.5)が用いられた。カバーグラス上で0.8μlのリザーバー溶液および0.8μlの前記濃縮試料の混合液に対して、25% PEG4000を含む100 mM HEPES緩衝液(pH7.5)中で破砕されたCa存在下で得られた6RL#9抗体のFabフラグメントの結晶が100-10000倍に希釈された希釈系列の溶液0.2μlを加えることによって結晶化ドロップが調製された。当該結晶化ドロップを20℃に2日から3日静置することによって得られた薄い板状の結晶のX線回折データが測定された。
35% PEG4000および5 mM CaCl2を含む100mM HEPES緩衝液(pH7.5)の溶液に浸された6RL#9抗体のFabフラグメントのCa存在下で得られた単結晶一つを、微小なナイロンループ付きのピンを用いて外液ごとすくいとることによって、当該単結晶が液体窒素中で凍結された。高エネルギー加速器研究機構の放射光施設フォトンファクトリーのビームラインBL-17Aを用いて、前記の凍結結晶のX線回折データが測定された。なお、測定中は常に-178℃の窒素気流中に凍結結晶を置くことで凍結状態が維持された。ビームラインに備え付けられたCCDディテクタQuantum315r(ADSC)を用い、結晶を1°ずつ回転させながらトータル180枚の回折画像が収集された。格子定数の決定、回折斑点の指数付け、および回折データの処理がプログラムXia2(CCP4 Software Suite)、XDS Package(Walfgang Kabsch)ならびにScala(CCP4 Software Suite)によって行われた。最終的に分解能2.2Åまでの回折強度データが得られた。本結晶は、空間群P212121に属し、格子定数a=45.47Å、b=79.86Å、c=116.25Å、α=90°、β=90°、γ=90°であった。
35% PEG4000を含む100 mM HEPES緩衝液(pH7.5)の溶液に浸された6RL#9抗体のFabフラグメントのCa非存在下で得られた単結晶一つを、微小なナイロンループ付きのピンを用いて外液ごとすくいとることによって、当該単結晶が液体窒素中で凍結された。高エネルギー加速器研究機構の放射光施設フォトンファクトリーのビームラインBL-5Aを用いて、前記の凍結結晶のX線回折データが測定された。なお、測定中は常に-178℃の窒素気流中に凍結結晶を置くことで凍結状態が維持された。ビームラインに備え付けられたCCDディテクタQuantum210r(ADSC)を用い、結晶を1°ずつ回転させながらトータル180枚の回折画像が収集された。格子定数の決定、回折斑点の指数付け、および回折データの処理がプログラムXia2(CCP4 Software Suite)、XDS Package(Walfgang Kabsch)ならびにScala(CCP4 Software Suite)によって行われた。最終的に分解能2.3Åまでの回折強度データが得られた。本結晶は、空間群P212121に属し、格子定数a=45.40Å、b=79.63Å、c=116.07Å、α=90°、β=90°、γ=90°であり、Ca存在下の結晶と同型であった。
プログラムPhaser(CCP4 Software Suite)を用いた分子置換法によって、6RL#9抗体のFabフラグメントのCa存在下での結晶の構造が決定された。得られた結晶格子の大きさと6RL#9抗体のFabフラグメントの分子量から、非対称単位中の分子数が一個であると予想された。一次配列上の相同性をもとにPDB code: 1ZA6の構造座標から取り出されたA鎖112-220番およびB鎖116-218番のアミノ酸残基部分が、CLおよびCH1領域の探索用モデル分子とされた。次にPDB code: 1ZA6の構造座標から取り出されたB鎖1-115番のアミノ酸残基部分が、VH領域の探索用モデル分子とされた。最後にPDB code 2A9Mの構造座標から取り出された軽鎖3-147番のアミノ酸残基が、VL領域の探索用モデル分子とされた。この順番にしたがい各探索用モデル分子の結晶格子内での向きと位置を回転関数および並進関数から決定することによって、6RL#9抗体のFabフラグメントの初期構造モデルが得られた。当該初期構造モデルに対してVH、VL、CH1、CLの各ドメインを動かす剛体精密化をおこなうことにより、25-3.0Åの反射データに対する結晶学的信頼度因子R値は46.9%、Free R値は48.6%となった。さらにプログラムRefmac5(CCP4 Software Suite)を用いた構造精密化と、実験的に決定された構造因子Foとモデルから計算された構造因子Fcおよび位相を用い計算された2Fo-Fc、Fo-Fcを係数とする電子密度マップを参照しながらモデル修正を繰り返しプログラムCoot(Paul Emsley)上でおこなうことによってモデルの精密化がおこなわれた。最後に2Fo-Fc、Fo-Fcを係数とする電子密度マップをもとにCaイオンおよび水分子をモデルに組み込むことによって、プログラムRefmac5(CCP4 Software Suite)を用いて精密化がおこなわれた。分解能25-2.2Åの21020個の反射データを用いることによって、最終的に3440原子のモデルに対する結晶学的信頼度因子R値は20.0%、Free R値は27.9%となった。
6RL#9抗体のFabフラグメントのCa非存在下での結晶の構造は、同型であるCa存在下結晶の構造を使って決定された。6RL#9抗体のFabフラグメントのCa存在下での結晶の構造座標から水分子とCaイオン分子がのぞかれ、VH、VL、CH1、CLの各ドメインを動かす剛体精密化がおこなわれた。25-3.0Åの反射データに対する結晶学的信頼度因子R値は30.3%、Free R値は31.7%となった。さらにプログラムRefmac5(CCP4 Software Suite)を用いた構造精密化と、実験的に決定された構造因子Foとモデルから計算された構造因子Fcおよび位相を用い計算された2Fo-Fc、Fo-Fcを係数とする電子密度マップを参照しながらモデル修正を繰り返しプログラムCoot(Paul Emsley)上でおこなうことによってモデルの精密化がおこなわれた。最後に2Fo-Fc、Fo-Fcを係数とする電子密度マップをもとに水分子をモデルに組み込むことによって、プログラムRefmac5(CCP4 Software Suite)を用いて精密化がおこなわれた。分解能25-2.3Åの18357個の反射データを用いることによって、最終的に3351原子のモデルに対する結晶学的信頼度因子R値は20.9%、Free R値は27.7%となった。
6RL#9抗体のFabフラグメントのCa存在下での結晶およびCa非存在下での結晶の構造を比較すると、重鎖CDR3に大きな変化がみられた。X線結晶構造解析で決定された6RL#9抗体のFabフラグメントの重鎖CDR3の構造を図14に示した。具体的には、Ca存在下での6RL#9抗体のFabフラグメントの結晶では、重鎖CDR3ループ部分の中心部分にカルシウムイオンが存在していた。カルシウムイオンは、重鎖CDR3の95位、96位および100a位(Kabatナンバリング)と相互作用していると考えられた。Ca存在下では、抗原との結合に重要である重鎖CDR3ループがカルシウムと結合することによって安定化し、抗原との結合に最適な構造となっていることが考えられた。抗体の重鎖CDR3にカルシウムが結合する例はこれまでに報告されておらず、抗体の重鎖CDR3にカルシウムが結合した構造は新規な構造である。重鎖CDR3は抗原との結合に最も重要であることが知られており、重鎖CDR3の構造維持にカルシウムイオンが必要となっている本実施例で見出されたモチーフは、抗原への結合にカルシウムイオンが重要な役割を果たしていると考えられる。すなわち、本モチーフを有する抗体はカルシウムイオン依存的に抗原に対する結合を有する可能性が極めて高いと考えられ、例えば本モチーフを有する合成ライブラリーを作製することができれば、そのようなライブラリーから効率的にカルシウム依存的結合抗体を取得することが可能であると考えられた。
(9−1)ナイーブヒト抗体ファージディスプレイライブラリーの作製
ヒトPBMCから作成したポリA RNAや、市販されているヒトポリA RNAなどを鋳型として当業者に公知な方法にしたがい、互いに異なるヒト抗体配列のFabドメインを提示する複数のファージからなるヒト抗体ファージディスプレイライブラリーが構築された。
構築されたナイーブヒト抗体ファージディスプレイライブラリーからの最初の選抜は、抗原(IL-6)への結合能をもつ抗体断片のみの濃縮によって実施された。抗原としてビオチン標識されたIL-6が用いられた。
上記の方法によって得られた大腸菌のシングルコロニーから、常法(Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145)に習い、ファージ含有培養上清が回収された。終濃度4%BSAおよび1.2 mMカルシウムイオン濃度となるようにBSAおよびCaCl2が加えられたファージを含有する培養上清が以下の手順でELISAに供された。StreptaWell 96マイクロタイタープレート(Roche)がビオチン標識抗原を含む100μLのPBSにて一晩コートされた。当該プレートの各ウェルをPBSTにて洗浄することによって抗原が除かれた後、当該ウェルが1時間以上250μLの4%BSA-TBSにてブロッキングされた。4%BSA-TBSが除かれた各ウェルに調製された培養上清が加えられた当該プレートを37℃で1時間静置することによって、ファージを提示する抗体を各ウェルに存在する抗原に結合させた。1.2 mM CaCl2/TBSTにて洗浄された各ウェルに、1.2 mM CaCl2/TBSもしくは1 mM EDTA/TBSが加えられ、当該プレートは37℃で30分間静置しインキュベートされた。1.2 mM CaCl2/TBSTにて洗浄された後に、終濃度4%のBSAおよび1.2 mMのイオン化カルシウム濃度としたTBSによって希釈されたHRP結合抗M13抗体(Amersham Pharmacia Biotech)が各ウェルに添加されたプレートを1時間インキュベートさせた。1.2 mM CaCl2/TBSTにて洗浄後、TMB single溶液(ZYMED)が添加された各ウェル中の溶液の発色反応が、硫酸の添加により停止された後、450 nmの吸光度によって当該発色が測定された。
ファージELISAの結果、Ca依存的な抗原に対する結合能があると判断されたクローンが、動物細胞発現用プラスミドへ導入された。抗体の発現は以下の方法を用いて行われた。ヒト胎児腎細胞由来FreeStyle 293-F株(Invitrogen)がFreeStyle 293 Expression Medium培地(Invitrogen)に懸濁され、1.33 x 106細胞/mLの細胞密度で6ウェルプレートの各ウェルへ3 mLずつ蒔きこまれた。調製されたプラスミドは、リポフェクション法によって細胞へ導入された。CO2インキュベーター(37度、8%CO2、90 rpm)中で4日間培養が行われた。rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)を用いて当業者公知の方法を用いて、上記で得られた培養上清から抗体が精製された。分光光度計を用いて精製された抗体溶液の280 nmでの吸光度が測定された。PACE法により算出された吸光係数を用いることによって、得られた測定値から抗体濃度が算出された(Protein Science (1995) 4, 2411-2423)。
取得された抗体を、Biacore T100(GE Healthcare)を用いてpH7.4でヒトインターロイキン6 (hIL6) 結合活性(解離定数KD (M))に関して評価した。ランニングバッファーとして3μMもしくは1.2mM CaCl2を含有する0.05% Tween20, 10 mmol/l ACES, 150 mmol/l NaCl(pH7.4)を用いて測定を行った。
(10−1)6KC4-1#85抗体のカルシウムイオン結合評価
ヒト抗体ライブラリーから取得されたカルシウム依存的抗原結合抗体6KC4-1#85抗体がカルシウムと結合するか評価された。イオン化カルシウム濃度が異なる条件で、測定されるTm値が変動するか否かが実施例4に記載された方法で評価された。
実施例10の(10−1)で6KC4-1#85抗体はカルシウムイオンと結合することが示されたが、6KC4-1#85は後述されるhVk5-2配列のようなカルシウム結合モチーフを持たない。そこで、カルシウムイオンが6KC4-1#85抗体のどの残基とカルシウムイオンが結合しているか同定するために、6KC4-1#85抗体のCDRに存在するAsp(D)残基をカルシウムイオンの結合もしくはキレートに関与できないAla(A)残基に置換した改変重鎖(6_H1-11(配列番号:30)、6_H1-12(配列番号:31)、6_H1-13(配列番号:32)、6_H1-14(配列番号:33)、6_H1-15(配列番号:34))および改変軽鎖(6_L1-5(配列番号:35)および6_L1-6(配列番号:36))が作製された。改変抗体遺伝子を含む発現ベクターが導入された動物細胞の培養液から、改変抗体が実施例2に記載された方法にしたがって精製された。精製された改変抗体のカルシウム結合が、実施例4に記載された方法にしたがって測定された。測定された結果を表12に示した。
(11−1)ヒト生殖細胞系列配列の取得
ヒト生殖細胞系列配列を含む抗体でカルシウムイオンが結合するものはこれまで報告されていない。そこで、ヒト生殖細胞系列配列を含む抗体がカルシウムイオンと結合するか否かを判定するため、Human Fetal Spreen Poly RNA(Clontech)から調製されたcDNAを鋳型としてヒト生殖細胞系列配列を含む抗体の生殖細胞系列の配列がクローニングされた。クローニングされたDNA断片は動物細胞発現ベクターに挿入された。得られた発現ベクターの塩基配列が、を当業者公知の方法で決定し、その配列番号を表13に示した。配列番号:37(Vk1)、配列番号:38(Vk2)、配列番号:39(Vk3)、配列番号:40(Vk4)ならびに配列番号:41(Vk5)をコードするポリヌクレオチドが、PCR法によって天然型Kappa鎖の定常領域(配列番号:28)をコードするポリヌクレオチドと連結されたDNA断片が、動物細胞発現用ベクターに組み込まれた。また、配列番号:42(Vk1)、配列番号:43(Vk2)、配列番号:44(Vk3)、配列番号:45(Vk4)ならびに配列番号:46(Vk5)をコードするポリヌクレオチドが、PCR法によってIgG1のC末端2アミノ酸が欠失したポリペプチド(配列番号:65)をコードするポリヌクレオチドと連結されたDNA断片が、動物細胞発現用ベクターに組み込まれた。作製された改変体の配列は当業者公知の方法で確認された。
取得された5種類のヒト生殖細胞系列配列を含むDNA断片が挿入された動物細胞発現ベクターが動物細胞へ導入された。抗体の発現は以下の方法を用いて行われた。ヒト胎児腎細胞由来FreeStyle 293-F株(Invitrogen)がFreeStyle 293 Expression Medium培地(Invitrogen)に懸濁され、1.33 x 106細胞/mLの細胞密度で6ウェルプレートの各ウェルへ3 mLずつ蒔きこまれた。調製されたプラスミドは、リポフェクション法によって細胞へ導入された。CO2インキュベーター(37度、8%CO2、90 rpm)中で4日間培養が行われた。rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)を用いて当業者公知の方法を用いて、上記で得られた培養上清から抗体が精製された。分光光度計を用いて精製された抗体溶液の280 nmでの吸光度が測定された。PACE法により算出された吸光係数を用いることによって、得られた測定値から抗体濃度が算出された(Protein Science (1995) 4, 2411-2423)。
精製された抗体のカルシウムイオン結合活性が評価された。精製された抗体が20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、2 mM CaCl2(pH7.4)または20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl, 3μM CaCl2(pH7.4)の溶液を外液とする透析(EasySEP、TOMY)処理に供された。透析に用いられた溶液を用いておよそ0.1 mg/mLに調製された抗体溶液を被験物質として、20℃から115℃まで240℃/hrの昇温速度でDSC測定が行われた。得られたDSCの変性曲線にもとづいて算出された各抗体のFabドメインの熱変性中間温度(Tm値)を表14に示した。
(12−1)hVk5配列
Kabatデータベース中には、hVk5配列としてhVk5-2配列のみが登録されている。以下では、hVk5とhVk5-2は同義で扱われる。
hVk5-2配列は20位(Kabatナンバリング)のアミノ酸にN型糖鎖が付加する配列を有する。タンパク質に付加する糖鎖にはヘテロジェニティーが存在するため、物質の均一性の観点から糖鎖は付加されないほうが望ましい。そこで、20位(Kabatナンバリング)のAsn(N)残基がThr(T)残基に置換された改変体hVk5-2_L65(配列番号:47)が作製された。アミノ酸の置換はQuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)を用いる当業者公知の方法で行われた。改変体hVk5-2_L65をコードするDNAが動物発現用ベクターに組み込まれた。作製された改変体hVk5-2_L65のDNAが組み込まれた動物発現用ベクターは、重鎖としてCIM_H(配列番号:48)が発現するように組み込まれた動物発現用のベクターと、実施例2で記載した方法で共に動物細胞中に導入された。導入された動物細胞中で発現したhVk5-2_L65 およびCIM_Hを含む抗体が、実施例2で記載した方法で精製された。
取得された改変配列hVk5-2_L65を含む抗体が、改変に供されたもとのhVk5-2配列を含む抗体よりも、そのヘテロジェニティーが減少しているか否かが、イオン交換クロマトグラフィーを用いて分析された。イオン交換クロマトグラフィーの方法を表15に示した。分析の結果、図16に示したように糖鎖付加部位が改変されたhVk5-2_L65は、元のhVk5-2配列よりもヘテロジェニティーが減少していることが示された。
(13−1)hVk5-2配列のCDR配列を含む改変抗体の作製、発現および精製
hVk5-2_L65配列はヒトVk5-2配列のフレームワークに存在する糖鎖付加部位のアミノ酸が改変された配列である。実施例12で糖鎖付加部位を改変してもカルシウムイオンが結合することが示されたが、フレームワーク配列は生殖細胞系列の配列であることが免疫原性の観点から一般的には望ましい。そこで、抗体のフレームワーク配列を、当該抗体に対するカルシウムイオンの結合活性を維持しながら、糖鎖が付加されない生殖細胞系列配列のフレームワーク配列に置換することが可能であるか否かが検討された。
hVk5-2配列以外の生殖細胞系列配列(hVk1、hVk2、hVk3、hVk4)のフレームワーク配列およびhVK5-2配列のCDR配列を含む改変抗体に、カルシウムイオンが結合するか否かが実施例4に記載された方法によって評価された。評価された結果を表17に示した。各改変抗体のFabドメインのTm値は、抗体溶液中のカルシウムイオン濃度の変化によって変動することが示された。よって、hVk5-2配列のフレームワーク配列以外のフレームワーク配列を含む抗体もカルシウムイオンと結合することが示された。すなわち、hVk5-2配列のCDR配列が有するモチーフがカルシウムイオンとの結合に重要であることが示され、フレームワーク配列は任意のフレームワークであってもよいことが確認された。
(14−1)hVk5-2配列のCDR配列中の変異部位の設計
実施例13に記載されているように、hVk5-2配列のCDR部分が他の生殖細胞系列のフレームワーク配列に導入された軽鎖を含む抗体もカルシウムイオンと結合することが示された。この結果からhVk5-2に存在するカルシウムイオン結合部位はCDRの中に存在することが示唆された。カルシウムイオンと結合する、すなわち、カルシウムイオンをキレートするアミノ酸として、負電荷のアミノ酸もしくは水素結合のアクセプターとなりうるアミノ酸が挙げられる。そこで、hVk5-2配列のCDR配列中に存在するAsp(D)残基またはGlu(E)残基がAla(A)残基に置換された変異hVk5-2配列を含む抗体がカルシウムイオンと結合するか否かが評価された。
hVk5-2配列のCDR配列中に存在するAspおよび/ またはGlu残基がAla残基に改変された軽鎖を含む抗体分子が作製された。実施例12で記載されるように、糖鎖が付加されない改変体hVk5-2_L65はカルシウムイオン結合を維持していたことから、カルシウムイオン結合性という観点ではhVk5-2配列と同等と考えられる。本実施例ではhVk5-2_L65をテンプレート配列としてアミノ酸置換が行われた。作製された改変体を表18に示した。アミノ酸の置換はQuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)、PCRまたはIn fusion Advantage PCR cloning kit(TAKARA)等の当業者公知の方法によって行われ、アミノ酸が置換された改変軽鎖の発現ベクターが構築された。
得られた精製抗体がカルシウムイオンと結合するか否かが判定された。具体的には、精製された抗体が20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、2 mM CaCl2(pH7.5)または20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl(pH7.5)の溶液(表19ではカルシウムイオン濃度0μMと表記)を外液とする透析(EasySEP、TOMY)処理に供された。透析に用いられた溶液を用いておよそ0.1 mg/mLに調製された抗体溶液を被験物質として、20℃から115℃まで240℃/hrの昇温速度でDSC測定が行われた。得られたDSCの変性曲線にもとづいて算出された各抗体のFabドメインの熱変性中間温度(Tm値)が表19に示されている。hVk5-2配列のCDR配列中に存在するAspまたはGlu残基をカルシウムイオンの結合もしくはキレートに関与できないAla残基に置換することによって、抗体溶液のカルシウムイオン濃度の変化によってそのFabドメインのTm値が変動しない抗体が存在した。Ala置換によってTm値が変動しない置換部位(32位および92位(Kabatナンバリング))はカルシウムイオンと抗体の結合に特に重要であることが示された。
(15−1)カルシウムイオン結合モチーフを有するhVk1配列の作製ならびに抗体の発現および精製
実施例14で記載されたAla置換体のカルシウムの結合活性の結果から、hVk5-2配列のCDR配列の中でAspやGlu残基がカルシウム結合に重要であることが示された。そこで、30位、31位、32位、50位および92位(Kabatナンバリング)の残基のみを他の生殖細胞系列の可変領域配列に導入してもカルシウムイオンと結合できるか否かが評価された。具体的には、ヒト生殖細胞系配列であるhVk1配列の30位、31位、32位、50位および92位(Kabatナンバリング)の残基がhVk5-2配列の30位、31位、32位、50位および92位(Kabatナンバリング)の残基に置換された改変体LfVk1_Ca(配列番号:61)が作製された。すなわち、hVk5-2配列中のこれらの5残基のみが導入されたhVk1配列を含む抗体がカルシウムと結合できるか否かが判定された。改変体の作製は実施例2と同様に行われた。得られた軽鎖改変体LfVk1_Caおよび軽鎖hVk1配列を含むLfVk1(配列番号:62)を、重鎖CIM_H(配列番号:48)と共に発現させた。抗体の発現および精製は実施例14と同様の方法で実施された。
上記のように得られた精製抗体がカルシウムイオンと結合するか否かが実施例4に記載された方法で判定された。その結果を表20に示した。hVk1配列を有するLfVk1を含む抗体のFabドメインのTm値は抗体溶液中のカルシウムの濃度の変化によっては変動しない一方で、LfVk1_Caを含む抗体配列の、Tm値は、抗体溶液中のカルシウムの濃度の変化によって1℃以上変化したことから、LfVk1_Caを含む抗体がカルシウムと結合することが示された。上記の結果から、カルシウムイオンの結合には、hVk5-2のCDR配列がすべて必要ではなく、LfVk1_Ca配列を構築する際に導入された残基のみでも十分であることが示された。
実施例15の(15−2)でヒト生殖細胞系配列であるhVk1配列の30位、31位、32位、50位および92位(Kabatナンバリング)の残基がhVk5-2配列の30位、31位、32位、50位および92位(Kabatナンバリング)の残基に置換された改変体LfVk1_Ca(配列番号:61)が作製され、カルシウムイオンが結合することが示された。そこで、LfVk1_Ca配列を含むCa依存性抗体(Ca結合抗体)が考えられるが、新規配列であるLfVk1_Ca配列の医薬品としての保存安定性は不明であることから、その医薬品としての応用可能性は不明である。そこで、LfVk1_Caの熱加速試験により安定性を評価した。LfVk1_CaをL鎖に有する抗体を20 mM Histidine-HCl、150 mM NaCl、pH6.0の溶液に一晩4℃の条件で透析された。透析された抗体は0.5 mg/mLに調製され、5℃または50℃で3日間保存された。保存後の各抗体を実施例12に記載された方法でイオン交換クロマトグラフィーが行われた。その結果、図17に示すように、LfVk1_Caは50℃で3日間保存で著しく分解することが確認された。LfVk1_Ca配列は、30位、31位および32位(Kabatナンバリング)にAspが存在し、酸性条件下で分解することが報告されているAsp-Asp配列がCDR1配列中に存在する(J. Pharm. Biomed. Anal. (2008) 47(1), 23-30)ため、30位、31位および32位(Kabatナンバリング)が分解箇所である可能性が考えられた。そこで、LfVk1_Caの分解を回避するため、分解する可能性がある3か所のAsp(D)残基がAla(A)残基に置換された改変体LfVk1_Ca1(配列番号:72)、LfVk1_Ca2(配列番号:73)およびLfVk1_Ca3(配列番号:74)が作製された。アミノ酸の置換はQuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)を用いる当業者公知の方法で行われた。改変体をコードするDNAが動物発現用ベクターに組み込まれた。作製された改変体のDNAが組み込まれた動物発現用ベクターは、重鎖としてGC H(配列番号:102)が発現するように組み込まれた動物発現用のベクターと、実施例14で記載した方法で共に動物細胞中に導入された。導入された動物細胞中で発現した抗体が、実施例14で記載した方法で精製された。
実施例15の(15−3)で取得された抗体が、改変に供されたもとのLfVk1_Ca配列を含む抗体よりも、pH6.0溶液中での分解が抑制されているか否かが熱加速後の各抗体のヘテロジェニティーの比較によって評価された。上述と同様に抗体は5℃または50℃で3日間保存された。保存後の各抗体を実施例12に記載された方法でイオン交換クロマトグラフィーが行われた。分析の結果、図17に示されるように30番目(Kabatナンバリング)部位が改変されたLfVk1_Ca1は、元のLfVk1_Ca配列よりもヘテロジェニティーが少なく、熱加速による分解が著しく抑制されていることが示された。すなわち、LfVk1_Ca配列中の30位に存在するAsp(D)残基が分解することが示され、そしてAsp残基の分解はアミノ酸改変によって回避できることが示された。
実施例15の(15−4)で記載されたAla置換体の分解抑制の結果から、LfVk1_Ca配列のCDR配列の中で30位(Kabatナンバリング)のAsp(D)残基が酸性条件で分解し、30位(Kabatナンバリング)を他のアミノ酸((15−4)では、Ala(A)残基に置換された)に置換することで分解が抑制できることが示された。そこで、30位(Kabatナンバリング)の残基をカルシウムイオンがキレートできる残基の一つであるSer(S)残基に置換した配列(LfVk1_Ca6とよぶ。配列番号:75)としても、カルシウム結合能を維持しつつ、分解が抑制されるか否かが評価された。改変体の作製は実施例14と同様に行われた。得られた軽鎖改変体LfVk1_Ca6および軽鎖LfVk1_Ca配列を、重鎖GC_H(配列番号:102)と共に発現させた。抗体の発現および精製は実施例14と同様の方法で実施された。
上記のように得られた精製抗体の酸性条件下における保存安定性が実施例15の(15−4)に記載された方法で判定された。その結果、図18に示すように、LfVk1_Ca6配列を含む抗体は、元のLfVk1_Ca配列を含む抗体よりも分解が抑制されていることが示された。
(16−1)抗体の発現と精製
NMR測定に用いるために発現させたLfVk1_Caを含む抗体とLfVk1を含む抗体が精製された。具体的には、LfVk1_Caを含む抗体は重鎖(配列番号:13)と軽鎖(配列番号:61)をそれぞれ発現させることが出来るように調製された動物発現用プラスミドが動物細胞に一過的に導入された。また、LfVk1を含む抗体は重鎖(配列番号:13)と軽鎖(配列番号:62)をそれぞれ発現させることが出来るように調製された動物発現用プラスミドが動物細胞に一過的に導入された。最終細胞密度1 x 106細胞/mLとなるようにFreeStyle 293 Expression Medium培地(Invitrogen)へ懸濁された100 mLのヒト胎児腎細胞由来FreeStyle 293-F株(Invitrogen)の細胞懸濁液に、標識アミノ酸が加えられた。具体的には、Asp/Glu/Gln/Asn標識体についてはL-Aspartic acid-13C4,15N(10 mg)、L-Glutamic acid-13C5,15N(2.5 mg)、L-Glutamine-13C5,15N2(60 mg)、L-Asparagine-13C4,15N2・H2O(2.5 mg)、β-chloro-L-alanine(6 mg)を10 mLの水に懸濁した溶液を0.22μmフィルターでろ過した液を加えた。Leu標識体については、L-Leucine-15N(30 mg)、β-chloro-L-alanine(6 mg)を10 mLの水に懸濁した溶液を0.22μmフィルターでろ過した液を加えた。リポフェクション法により調製されたプラスミドが細胞に導入された。プラスミドが導入された細胞はCO2インキュベーター(37℃、8%CO2、90 rpm)中で5日間培養された。rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)を用いた当業者公知の方法にしたがって、上記のように得られた培養上清から抗体が精製された。分光光度計を用いて精製された抗体溶液の280 nmでの吸光度が測定された。PACE法により算出された吸光係数を用いて測定値から抗体濃度が算出された(Protein Science (1995) 4, 2411-2423)。
分子量分画サイズ30,000MWCOの限外ろ過膜 を用いて、各種抗体が8.2-11.8 mg/mLまで濃縮された。L-Cystein 1 mM、EDTA 2 mM、50 mM酢酸/125 mMトリス緩衝液(pH 6.8)を用いて8 mg/mLに希釈された当該抗体の試料が調製された。各抗体に対して1/240量のPapain(Roche Applied Science)を加えて攪拌された当該試料が37℃にて1時間静置された。静置後、それぞれ下流に1 mLサイズのProteinA担体カラムHiTrap MabSelect Sure(GE Healthcare)がタンデムにつながれた50 mM酢酸/125 mMトリス緩衝液(pH 6.8)で平衡化されたGly-Gly-Tyr-Arg(Sigma)ペプチドを結合した1 mLサイズのHiTrap NHS-activated HP(GE Healthcare)に添加された。上流のGly-Gly-Tyr-Argペプチドによって活性化Papainを除去するとともに、下流のProteinA担体カラムでFcフラグメントおよび未消化抗体を除去することでFabフラグメントの精製画分が得られた。Fab画分に含まれる不活性Papainが活性化するのを防ぐために、Fab画分にはシステインプロテアーゼ阻害剤E64(Sigma)を10μM添加した。なお、上記のすべてのカラム操作は20から25℃の室温下にて実施された。
抗体溶液をMWCO 5000の限外濾過器Vivaspin(Sartorius)を用いて0.5 mLまで遠心により濃縮した。次に上記限外濾過器にダイアフィルトレーションカップを設置して、NMR用緩衝液:5 mM d-BisTris, 20 mM NaCl, 0.001 % (w/v) NaN3, 5 % (v/v) 2H2O, pH 7.0(NaOH、HClを用いてpHを調製した)へ緩衝液置換(ダイアフィルトレーションカップに上記緩衝液を5 mL足して0.5 mLまで遠心濃縮することを3回繰り返した)を行い、最後に0.25 mLまで濃縮した。最後に、NMR緩衝液で限外濾過器を洗いこみ、濃縮液とあわせて抗体溶液をLfVk1_Ca抗体については420μL、LfVk1抗体については270μLとした。この段階で再度、pHを確認し、必要に応じてNaOH、HClによりpH 7.0に調整した。UV測定器Nanodrop(Thermo Fisher Scientific)を用いて280 nmにおける吸光度を測定し、280 nmにおけるモル吸光係数を70000 M-1・cm-1としてFabフラグメントを定量した。Leu標識LfVk1_Ca抗体、Leu標識LfVk1抗体は0.12 mM、Asp、Glu、Asn、Gln標識LfVk1_Ca抗体、Asp、Glu、Asn、Gln標識LfVk1抗体は0.24 mMとなった。これらの試料の内、LfVk1_Ca抗体については、直径5 mmのNMR試料管(shigemi)に、LfVk1抗体については直径5 mmの水溶液用対称形ミクロ試料管(shigemi)にパスツールピペットを用いて充填した。LfVk1_Ca抗体のCa2+滴定実験においては、抗体溶液に、抗体に対して、Ca2+が1、2、5、10、20モル等量となるよう、CaCl2溶液を順次、添加した。添加に用いたCaCl2溶液にはNMRバッファーに溶解した10、20、50、100 mM CaCl2溶液を準備した。シリンジ部分を既製品から延長した特注マイクロシリンジ(ITO)により、添加容量が3-10μLの範囲となるように、CaCl2溶液の必要量を直接、NMR試料管に充填された抗体溶液に添加し、試料管をボルテックスミキサーにより攪拌後、手動遠心器(Shimadzu)により遠心分離した。
NMR測定には、TCI CryoProbeを設置したNMR分光器DRX750(Bruker Biospin)を用いた。設定温度を307K(GasFlow 535 L/h)とした。アミド基シグナルを観測するためのNMR測定には1H-15N HSQCを用いた。測定法としては、15N展開期にα炭素とカルボニル炭素の同時13Cデカップリング、および溶媒水シグナル消去のための3-9-19パルストレインを伴う1H-15N FHSQCを用い、それを制御するパルスプログラムには、メーカー(Bruker Biospin)により標準として準備されているものを用いた。NMRの測定条件は以下の通りとした。スペクトル幅:12019Hz (f2), 1976 Hz (f1)、データポイント数: 2048 (f2), 128 (f1)。データ処理にはTopspin 3.0(Bruker Biospin)を用いた。データ処理条件は以下の通りとした。f2、f1共に、ウィンドウ関数としてshifted Sine (QSINE) を乗じ、2倍のデータポイント数となるようにゼロフィリングを行った後に、フーリエ変換を行った。シグナルの化学シフトはNMR解析ソフトウェアSparky(UCSF)を用いて算出した。
これまでにトシリズマブ(重鎖配列番号:13、軽鎖配列番号:14)のFabフラグメントの主鎖アミド基のNMRシグナルの内、80%が帰属された(データ未公開)。LfVk1_Ca抗体のFabフラグメントのアミノ酸配列は、軽鎖CDR1、CDR2、CDR3の一部、および軽鎖73、83番のアミノ酸残基およびを除き、トシリズマブとFabフラグメントのアミノ酸配列と同じである。両抗体でアミノ酸配列が同じ部分については、そのNMRシグナルが同一の化学シフトを有する、あるいはそれらが近いため、トシリズマブの帰属情報を移行することが可能であった。Leu標識試料については、軽鎖11、(33)、(46)、(47)、(54)、(78)、125、135、136、154、175、179、181、201、重鎖18、46、64、71、81、83、114、144、147、165、176、181、184、195が帰属を移行することが可能であった。上記、括弧が付いていない番号はトシリズマブと同一の化学シフトであるため、帰属が移行できた残基番号、括弧が付いた番号は、トシリズマブと近い化学シフトを有しており、それ以外に近い化学シフトを有するシグナルがないため、帰属が可能であった残基番号であった。一方、Asp、Glu、Asn、Gln標識試料については、LfVk1_Ca抗体とLfVk1抗体のスペクトルを比較し、4個のシグナルがLfVk1_Caで新たに観測されていた。これは、この両抗体間でAsp、Glu、Asn、Gln残基の内、Ca2+結合モチーフとして導入した配列の異なる軽鎖Asp30、31、32、92、Glu50の5残基の内のいずれか4残基由来であると分類できた。
LfVk1_Ca抗体のFabフラグメントのCa2+未添加状態と、20モル等量添加の1H-15N HSQCスペクトルを比較して、化学シフトが変化しているシグナルを抽出した。その結果、Leu標識試料からは、軽鎖Leu33が結合に関与しており、それ以外のLeu残基は結合に関与していないことが分かった。また、Asp、Glu、Asn、Gln標識試料からは、軽鎖Asp30、31、32、92、Glu50の5残基の内のいずれか4残基が結合に関与し、それ以外のAsp、Glu、Asn、Gln残基の内の1残基を除くすべてが結合に関与していないことが明らかとなった。以上のことから、Ca2+結合モチーフとして導入されたアミノ酸配列の内、少なくとも軽鎖CDR1、これに加えて軽鎖CDR2、CDR3の両方もしくはいずれかのアミノ酸がCa2+結合に関与していると同定された。このことは実施例15において確認された30位、31位、32位、50位および92位(Kabatナンバリング)のうち4つがhVk5-2配列のアミノ酸であることがカルシウムイオンの結合に重要であった結果と一致している。
Ca2+濃度がLfVk1_Ca抗体のFabフラグメントに対して、0、1、2、5、10、20モル等量の時の1H-15N HSQCスペクトルを利用した。結合部位として同定された軽鎖Leu33のシグナルの1Hまたは15N化学シフトを縦軸に、上記Ca2+のモル等量を横軸にプロットし、グラフ作成ソフトウェアGnuplotを用いて以下の式2で示される関数のフィッティングを行った。
f(x) = s ×[1-0.5/a×{(a×x+a+Kd)-( (a×x+a+Kd)2 - 4×x×a2)0.5} + t×[0.5/a×{(a×x+a+Kd)-( (a×x+a+Kd)2 - 4×x×a2)0.5}
Vk5-2(配列番号:41)のほかにVk5-2に分類されるVk5-2バリアント1(配列番号:63)およびVk5-2バリアント2(配列番号:64)が得られた。これらのバリアントについてもカルシウム結合評価が行われた。Vk5-2、Vk5-2バリアント1およびVk5-2バリアント2のDNA断片がそれぞれ動物細胞用発現ベクターに組み込まれた。得られた発現ベクターの塩基配列は当業者公知の方法で決定された。Vk5-2、Vk5-2バリアント1およびVk5-2バリアント2のDNA断片がそれぞれ組み込まれた動物細胞用発現ベクターは、重鎖としてCIM_H(配列番号:48)が発現するように組み込まれた動物発現用のベクターと、実施例13で記載された方法で共に動物細胞中に導入され、抗体が精製された。精製された抗体のカルシウムイオン結合活性が評価された。精製された抗体が20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、2 mM CaCl2(pH7.5)または20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl(pH7.5)の溶液(表22ではカルシウムイオン濃度0mMと表記)を外液とする透析(EasySEP、TOMY)処理に供された。透析に用いられた溶液を用いておよそ0.1 mg/mLに調製された抗体溶液を被験物質として、20℃から115℃まで240℃/hrの昇温速度でDSC測定が行われた。得られたDSCの変性曲線にもとづいて算出された各抗体のFabドメインの熱変性中間温度(Tm値)が表22に示されている。
(18−1)可溶型ヒトCD4の調製
可溶型ヒトCD4は以下のように調製された。膜貫通領域を欠損したヒトCD4のアミノ酸配列にMycタグを付加した配列(配列番号:76)をコードするDNA配列が動物細胞発現用ベクターに組み込まれた。作製された組み換えヒトCD4の配列は当業者公知の方法で確認された。
TNX355-IgG1(重鎖配列番号:77、軽鎖配列番号:78)およびQ425(重鎖配列番号:79、軽鎖配列番号:80)は抗ヒトCD4抗体である。さらにQ425L9(重鎖配列番号:81、軽鎖配列番号:82)はQ425のL鎖改変体である。TNX355-IgG1(重鎖配列番号:77、軽鎖配列番号:78)、Q425(重鎖配列番号:79、軽鎖配列番号:80)およびQ425L9(重鎖配列番号:81、軽鎖配列番号:82)のアミノ酸をコードするDNA配列が、動物細胞発現用プラスミドへ導入された。抗体の発現は以下の方法を用いて行われた。ヒト胎児腎細胞由来FreeStyle 293-F株(Invitrogen)がFreeStyle 293 Expression Medium培地(Invitrogen)に懸濁され、1.33 x 106細胞/mLの細胞密度で6ウェルプレートの各ウェルへ3 mLずつ蒔きこまれた。調製されたプラスミドは、リポフェクション法によって細胞へ導入された。CO2インキュベーター(37℃、8%CO2、90 rpm)中で4日間培養が行われた。rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)を用いて当業者公知の方法を用いて、上記で得られた培養上清から抗体が精製された。分光光度計を用いて精製された抗体溶液の280 nmでの吸光度が測定された。PACE法により算出された吸光係数を用いることによって、得られた測定値から抗体濃度が算出された(Protein Science (1995) 4, 2411-2423)。
取得された抗体の可溶型ヒトCD4に対するカルシウム依存的結合能がBiacore T100 (GE Healthcare)を用いて評価された。高カルシウムイオン濃度として、1.2 mMを使用し、低カルシウムイオン濃度の条件として3μMを使用した。抗原は可溶型ヒトCD4(18−1で調製した)を用いた。Sensor chip CM4(GE Healthcare)上にアミンカップリング法でprotein G(Invitrogen)を適当量固定化し、そこへ目的の抗体をキャプチャーさせた。ランニングバッファーには1.2 mmol/L CaCl2または3μmol/L CaCl2を含む10 mmol/L ACES、150 mmol/L NaCl、0.05% (w/v) Tween20、1.2 mmol/L CaCl2、pH7.4またはpH6.0を用いた。測定は全て37℃で実施し、ヒトCD4の希釈にもそれぞれのバッファーを使用した。抗体のセンサーグラムを図19に示した。図19に示したようにTNX355-IgG1抗体はランニングバッファーの条件が変化してもセンサーグラムの形状は変化しなかったことから、TNX355-IgG1はヒトCD4に対してカルシウム依存的に結合活性を示さない通常の抗体であることが確認された。一方で、Q425抗体およびQ425L9抗体はいずれもカルシウムイオン濃度が3μM(低カルシウムイオン濃度)のときの抗原結合量はカルシウムイオン濃度が1.2 mM(高カルシウムイオン濃度)のときの抗原結合量よりも少なく、Ca依存的結合能が示された。特にQ425L9抗体は、カルシウムイオン濃度が3μMとなると、200 nMのアナライト(可溶性ヒトCD4)で測定した場合でも全く結合相が観測できなかった。すなわち、Q425抗体およびQ425L9抗体はヒトCD4に対してカルシウム依存的に結合活性を示すカルシウム依存的結合であることが確認された。
(19−1)ノーマルマウスを用いたin vivo試験
実施例18で調製されたQ425およびQ425L9はカルシウム依存的に可溶型ヒトCD4に結合する抗体であった。しかし、これまでにカルシウム依存的に抗原と結合する性質を有する抗体と抗原を同時に投与した場合に、カルシウム依存的に抗原と結合する性質が無い抗体と抗原を同時に投与した場合よりも抗原の消失を加速させる性質を持っていることは実施例5および実施例6で示したようにIL6Rで明らかになっているが、他の抗原でも抗原の消失を加速させる性質を持っているかは不明である。
マウス血漿中の抗ヒトCD4抗体濃度はELISA法にて測定した。まずAnti-Human IgG(γ-chain specific) F(ab')2 Fragment of Antibody (SIGMA) をNunc-Immuno Plate, MaxiSoup (Nalge nunc International)に分注し、4℃で1晩静置しAnti-Human IgG固相化プレートを作成した。血漿中濃度として0.64、0.32、0.16、0.08、0.04、0.02、0.01μg/mLの検量線試料と100倍以上希釈したマウス血漿測定試料を調製し、Anti-Human IgG固相化プレートに分注して25℃で1時間incubationした。その後Biotinylated Anti-human IL-6 R Antibody(R&D)を25℃で1時間反応させ、さらにStreptavidin-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)を25℃で0.5時間反応させ、TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)を基質として用い発色反応を行い、1N-Sulfuric acid(Showa Chemical)で反応停止後、マイクロプレートリーダーにて450 nmの吸光度を測定した。マウス血漿中濃度は検量線の吸光度から解析ソフトウェアSOFTmax PRO(Molecular Devices)を用いて算出した。
マウスの血漿中可溶型ヒトCD4濃度はELISA法にて測定した。
(20−1)ヒトIgA(hIgA)の調製
抗原であるヒトIgAの組み換えヒトIgA(以下hIgA)は以下のように調製した。H(WT)-IgA1(配列番号:83)とL(WT)(配列番号:14)とを含むhIgAを発現させて、当業者公知の方法によってイオン交換クロマトグラフィーおよびゲルろ過クロマトグラフィーを用いて精製した。
GA1-IgG1(重鎖配列番号:84、軽鎖配列番号:85)、GA2-IgG1(重鎖配列番号:86、軽鎖配列番号:87)、GA3-IgG1(重鎖配列番号:88、軽鎖配列番号:89)およびGA4-IgG1(重鎖配列番号:90、軽鎖配列番号:91)はヒトIgAに結合する抗体である。さらに、実施例6および実施例7と同様に、血漿中からの抗原(hIgA)の消失をさらに増大させるために、GA2-IgG1に対してマウスFcRnに対するpH7.4における結合を増強するためにN434Wのアミノ酸置換を導入したGA2-N434W(重鎖配列番号:92、軽鎖配列番号:87)を作製した。GA1-IgG1(重鎖配列番号:84、軽鎖配列番号:85)、GA2-IgG1(重鎖配列番号:86、軽鎖配列番号:87)、GA3-IgG1(重鎖配列番号:88、軽鎖配列番号:89)、GA4-IgG1(重鎖配列番号:90、軽鎖配列番号:91)およびGA2-N434W(重鎖配列番号:92、軽鎖配列番号:87)をコードするDNA配列が動物発現用プラスミドに当該業者公知の方法で組み込まれた。抗体の発現は以下の方法を用いて行った。ヒト胎児腎細胞由来FreeStyle 293-F株(Invitrogen)をFreeStyle 293 Expression Medium培地(Invitrogen)へ懸濁し、1.33 x 106個 /mLの細胞密度で6well plateの各ウェルへ3 mLずつ蒔きこみ、リポフェクション法により調製したプラスミドを細胞へ導入した。CO2インキュベーター(37℃、8%CO2, 90 rpm)で4日間培養を行い、得られた培養上清から、rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)を用いて当業者公知の方法で抗体を精製した。精製抗体濃度は、分光光度計を用いて280 nmでの吸光度を測定した。得られた値からPACE法により算出された吸光係数を用いて抗体濃度を算出した(Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423)。
取得された抗体を、Biacore T200(GE Healthcare)を用いてヒトIgA結合活性(解離定数KD (M))に関して評価した。ランニングバッファーとして3μMもしくは1.2 mM CaCl2を含有する0.05% tween20, 20 mmol/l ACES, 150 mmol/l NaCl(pH7.4およびpH5.8)、0.1μMもしくは10 mM CaCl2を含有する0.05% tween20, 20 mmol/l ACES, 150 mmol/l NaCl、pH8.0を用いて測定を行った。
(21−1)ノーマルマウスを用いたin vivo試験
ノーマルマウス(C57BL/6J mouse、Charles River Japan)にヒトIgA(ヒトIgA:実施例20にて作製)を単独投与もしくはヒトIgAおよび抗ヒトIgA抗体を同時投与した後のヒトIgAおよび抗ヒトIgA抗体の体内動態を評価した。ヒトIgA溶液(80μg/mL)、もしくは、ヒトIgAおよび抗ヒトIgA抗体の混合溶液を尾静脈に10 mL/kgで単回投与した。抗ヒトIgA抗体としては、上述のGA1-IgG1、GA2-IgG1、GA3-IgG1およびGA2-N434Wを使用した。
マウス血漿中の抗ヒトIgA抗体濃度はELISA法にて測定した。まずAnti-Human IgG(γ-chain specific) F(ab')2 Fragment of Antibody (SIGMA) をNunc-Immuno Plate, MaxiSoup(Nalge nunc International)に分注し、4℃で1晩静置しAnti-Human IgG固相化プレートを作成した。血漿中濃度として0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.01563、0.07813μg/mLの検量線試料と100倍以上希釈したマウス血漿測定試料を調製し、Anti-Human IgG固相化プレートに分注して25℃で1時間インキュベーションした。その後Goat Anti-Human IgG (γ chain specific) Biotin (BIOT) Conjugate(Southern Biotechnology Associats Inc.)を25℃で1時間反応させ、さらにStreptavidin-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)を25℃で1時間反応させ、TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)を基質として用い発色反応を行い、1N-Sulfuric acid(Showa Chemical)で反応停止後、マイクロプレートリーダーにて450 nmの吸光度を測定した。マウス血漿中濃度は検量線の吸光度から解析ソフトウェアSOFTmax PRO(Molecular Devices)を用いて算出した。この方法で測定した静脈内投与後のノーマルマウスにおけるGA1-IgG1、GA2-IgG1、GA3-IgG1およびGA2-N434Wの血漿中抗体濃度推移を図23に示した。
マウスの血漿中ヒトIgA濃度はELISA法にて測定した。まずGoat anti-Human IgA Antibody(BETHYL)をNunc-Immuno Plate, MaxiSoup(Nalge nunc International)に分注し、4℃で1晩静置しAnti-Human IgA固相化プレートを作成した。血漿中濃度として0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625μg/mLに調整したヒトIgA検量線試料および100倍以上希釈したマウス血漿測定試料を調製し、これら検量線試料および血漿測定試料100μLに500 ng/mLのhsIL-6Rを200μL加え、室温で1時間静置した。その後Anti-Human IgA固相化プレートに分注しさらに室温で1時間静置した。その後Biotinylated Anti-human IL-6 R Antibody(R&D)を室温で1時間反応させ、さらにStreptavidin-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)を室温で1時間反応させ、TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)を基質として用い発色反応を行い、1N-Sulfuric acid(Showa Chemical)で反応停止後、マイクロプレートリーダーにて450 nmの吸光度を測定した。マウス血漿中濃度は検量線の吸光度から解析ソフトウェアSOFTmax PRO(Molecular Devices)を用いて算出した。この方法で測定した静脈内投与後のノーマルマウスにおける血漿中ヒトIgA濃度推移を図24に示した。
(22−1)ヒトグリピカン3(GPC3)の調製
抗原として用いる組み換えヒトグリピカン3(以下GPC3)を以下のように調製した。ヒトグリピカン3の膜貫通領域を含まないアミノ酸配列に6残基のヒスチジンが連結した配列(配列番号:93)を発現するプラスミドが定常的に導入されているCHO細胞を培養し、培養上清を回収した。得られた培養上清を、イオン交換クロマトグラフィー精製後、Hisタグを用いたアフィニティー精製およびゲルろ過クロマトグラフィー精製を行って、GPC3を得た。
抗ヒトグリピカン3抗体である、CSCM-01_005(重鎖配列:94、軽鎖配列:95)、CSCM-01_009(重鎖配列:96、軽鎖配列:97)、CSCM-01_015(重鎖配列:98、軽鎖配列:99)、CSCM-01_023(重鎖配列:100、軽鎖配列:101)およびGC-IgG1(重鎖配列:102、軽鎖配列:103)がそれぞれ動物発現用プラスミドへ挿入された。抗体の発現は以下の方法を用いて行った。ヒト胎児腎細胞由来FreeStyle 293-F株(Invitrogen)をFreeStyle 293 Expression Medium培地(Invitrogen)へ懸濁し、1.33 x 106個 /mLの細胞密度で6well plateの各ウェルへ3 mLずつ蒔きこみ、リポフェクション法により調製したプラスミドを細胞へ導入した。CO2インキュベーター(37℃、8%CO2, 90 rpm)で4日間培養を行い、得られた培養上清から、rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)を用いて当業者公知の方法で抗体を精製した。精製抗体濃度は、分光光度計を用いて280 nmでの吸光度を測定した。得られた値からPACE法により算出された吸光係数を用いて抗体濃度を算出した(Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423)。なお、GC-IgG1抗体については、GC-IgG1抗体が定常的に発現するCHO細胞培養上清から同様の方法で抗体を精製し、濃度を算出した 。
取得された抗体が以下の手順でELISAに供された。StreptaWell 96マイクロタイタープレート(Roche)がビオチン標識抗原を含む100μLのPBSにて一晩コートされた。該当プレートの各ウェルをACES buffer(10 mM ACES, 150 mM NaCl, 100 mM CaCl2,0.05% Tween20, pH7.4)にて洗浄することによって抗原が除かれた後、当該ウェルが2%BSAを含むACES Buffer 250μLにて1時間以上ブロッキングされた。2%BSAを含むACES Bufferが除かれた各ウェルに、あらかじめ10μg/mLから4倍ずつ希釈を行った精製IgG各100μLが加えられた当該プレートを一時間静置することによって、IgGを各ウェルに存在する抗原に結合させた。ACES Bufferにて洗浄された各ウェルに、「10 mM ACES,150 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, pH7.4」、「10 mM ACES, 150 mM NaCl, 3μM CaCl2, pH7.4」、「10 mM ACES, 150 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, pH5.8」もしくは「10 mM ACES, 150 mM NaCl, 3μM CaCl2, pH5.8」が加えられ、当該プレートは37℃で30分間静置しインキュベートされた。ACES Bufferにて洗浄された後に、2%BSAを含むACES Bufferによって希釈されたHRP結合抗ヒトIgG抗体(BIOSOURCE)が各ウェルに添加されたプレートを1時間インキュベートさせた。ACES Bufferにて洗浄後、TMB single溶液(ZYMED)が添加された各ウェル中の溶液の発色反応が、硫酸の添加により停止された後、450 nmの吸光度によって当該発色が測定された。
(23−1)ビオチン化ヒトIgEの調製
抗原であるヒトIgEは以下のように調製された。IgE-H(配列番号:104、C末端にビオチン付加配列が連結されている)およびL(WT)(配列番号:14)をコードするDNA配列を挿入した動物細胞発現ベクターを作製し、当該発現ベクターおよびFreeStyle293(Invitrogen)を用いて培養上清中にビオチン付加配列がC末端に結合した全長のヒトIgE蛋白質を発現させた。得られた培養上清からイオン交換クロマトグラフィー、アビジンを用いたアフィニティー精製さらにゲルろ過クロマトグラフィー精製を行い、ビオチン化ヒトIgEを得た。
GEB0100(重鎖配列番号:105、軽鎖配列番号:106)、GEB0220(重鎖配列番号:107、軽鎖配列番号:108)、GEB0230(重鎖配列番号:109、軽鎖配列番号:110)およびXolair(重鎖配列番号:111、軽鎖配列番号:112)はヒトIgEに結合する抗体である。GEB0100(重鎖配列番号:105、軽鎖配列番号:106)、GEB0220(重鎖配列番号:107、軽鎖配列番号:108)、GEB0230(重鎖配列番号:109、軽鎖配列番号:110)およびXolair(一般名Omalizumab)(重鎖配列番号:111、軽鎖配列番号:112)がそれぞれ動物発現用プラスミドに当該業者公知の方法で組み込まれた。抗体の発現は以下の方法を用いて行った。ヒト胎児腎細胞由来FreeStyle 293-F株(Invitrogen)へリポフェクション法により調製したプラスミドを細胞へ導入した。CO2インキュベーター(37℃、8%CO2, 90 rpm)で4から7日間培養を行い、得られた培養上清から、rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)を用いて当業者公知の方法で抗体を精製した。精製抗体濃度は、分光光度計を用いて280 nmでの吸光度を測定した。得られた値からPACE法により算出された吸光係数を用いて抗体濃度を算出した(Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423)。
取得された抗体のヒトIgEに対するCa依存的結合能の評価はELISA法を用いて行われた。具体的には、NUNCイムノ384ウェルプレートマキシソープ(Thermo fisher scientific社製464718)に1μg/mLのGoat anti-rabbit IgG-Fc polyclonal antibody(Bethyl laboratory社製 A120-111A)または1μg/mLのGoat anti-human IgG-Fc polyclonal antibody(ICN biomedicals社製 55071)を40μL加えた。室温で1時間インキュベートした後、溶液を取り除き、20%に希釈したBlocking One試薬(ナカライテスク社製03953-95)を50μL加えた。室温で1時間インキュベートした後、溶液を取り除き、1.2 mMの塩化カルシウムを含むトリス緩衝溶液で希釈した精製抗体を40μL加えた。4℃で一晩インキュベートした後、1.2 mMの塩化カルシウムと0.05%(w/v)のTween-20を含むトリス緩衝溶液80μLで3回洗浄し、1.2 mMの塩化カルシウムを含むトリス緩衝溶液で500ng/mLに希釈したビオチン化ヒトIgE((23−1)で作製)を40μL加えた。室温で1時間インキュベートした後、1.2 mMの塩化カルシウムと0.05%(w/v)のTween-20を含むトリス緩衝溶液80μLで3回洗浄し、2 mMの塩化カルシウムを含むACES緩衝溶液(pH7.4)または3μMの塩化カルシウムを含むACES緩衝溶液(pH7.4)を80μL加え、ただちに溶液を取り除いた後、再び2 mMの塩化カルシウムを含むACES緩衝溶液(pH7.4)または3μMの塩化カルシウムを含むACES緩衝溶液(pH7.4)を80μL加えた。37℃で1時間インキュベートした後、1.2 mMの塩化カルシウムと0.05%(w/v)のTween-20を含むトリス緩衝溶液80μLで3回洗浄し、1.2 mMの塩化カルシウムを含むトリス緩衝溶液で25 ng/mLに希釈したHRP標識ストレプトアビジン(Thermo fisher scientific社製21132)を40μL加えた。室温で1時間インキュベートした後、1.2 mMの塩化カルシウムと0.05%(w/v)のTween-20を含むトリス緩衝溶液80μLで3回洗浄し、発色基質(KPL社製50-66-06: ABTS peroxidase substrate system 1 component)を40μL加える。室温で15分または30分インキュベートした後、405nmの吸光度を測定した(Molecular devices社製SpectraMax Plus384)。
抗原であるヒトIL-6レセプターの組み換えヒトIL-6レセプターは以下のように調製した。J. Immunol. 152, 4958-4968 (1994)で報告されているN末端側1番目から357番目のアミノ酸配列からなる可溶型ヒトIL-6レセプター(以下、hsIL-6R)のCHO定常発現株を当業者公知の方法で構築し、培養し、hsIL-6Rを発現させた。得られた培養上清から、Blue Sepharose 6 FFカラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーの2工程によりhsIL-6Rを精製した。最終工程においてメインピークとして溶出した画分を最終精製品とした。
FcRnは、FcRnとβ2-ミクログロブリンとの複合体である。公表されているヒトFcRn遺伝子配列に基づいてオリゴDNAプライマーを調製した(J Exp Med. 1994 Dec 1; 180(6): 2377-81)。遺伝子全体をコードするDNA断片は、調製したプライマーおよび鋳型としてヒトcDNA(Human Placenta Marathon-Ready cDNA, Clontech)を用いてPCRによって調製した。得られたDNA断片を鋳型として用い、シグナル領域(Met1〜Leu290)を含有する細胞外ドメインをコードするDNA断片をPCRによって増幅し、哺乳動物細胞発現ベクターに挿入した。同様に、公表されているヒトβ2-ミクログロブリン遺伝子配列(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26): 16899-16903 (2002))に基づいてオリゴDNAプライマーを調製した。遺伝子全体をコードするDNA断片は、調製したプライマーおよび鋳型としてヒトcDNA(Human Placenta Marathon-Ready cDNA, Clontech)を用いてPCRによって調製した。得られたDNA断片を鋳型として用い、シグナル領域(Met1〜Met119)を含有するタンパク質全体をコードするDNA断片をPCRによって増幅し、哺乳動物細胞発現ベクターに挿入した。
(3−1)中性条件下におけるFcRnへの結合を有するpH依存的ヒトIL-6受容体結合抗体の調製
VH3-IgG1(配列番号:19)とVL3-CK(配列番号:20)とを含むFv4-IgG1に対して、中性条件下(pH7.4)におけるFcRnに対する結合を増加させる変異を導入した。具体的にはIgG1の重鎖定常領域に対して、EUナンバリングにおける252番目をMetからTyrに、254番目をSerからThrに、256番目をThrからGluに置換したVH3-IgG1-v1(配列番号:21)、および、IgG1の重鎖定常領域に対して、EUナンバリングにおける434番目をAsnからTrpに置換したVH3-IgG1-v2(配列番号:22)を調製した。アミノ酸置換の導入は、 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)またはIn-Fusion HD Cloning Kit(Clontech)を用いて、添付説明書記載の方法で変異体を作製し、得られたプラスミド断片を動物細胞発現ベクターに挿入し、目的のH鎖発現ベクターおよびL鎖発現ベクターを作製した。得られた発現ベクターの塩基配列は当業者公知の方法で決定した。
ヒトFcRnトランスジェニックマウス(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg 系統276 +/+マウス、Jackson Laboratories、Methods Mol Biol. 2010;602:93-104.)および正常マウス(C57BL/6Jマウス、Charles River Japan)にhsIL-6R(可溶型ヒトIL-6受容体:参考例1にて調製)を単独投与もしくはhsIL-6Rおよび抗ヒトIL-6受容体抗体を同時投与した後のhsIL-6Rおよび抗ヒトIL-6受容体抗体の生体内における動態を評価した。hsIL-6R溶液(5μg/mL)もしくはhsIL-6Rおよび抗ヒトIL-6受容体抗体の混合溶液(それぞれ5μg/mL、0.1 mg/mL)を尾静脈に10 mL/kgで単回投与した。このとき、hsIL-6Rに対して抗ヒトIL-6受容体抗体は十分量過剰に存在することから、hsIL-6Rはほぼ全て抗体に結合していると考えられる。投与15分後、7時間後、1日後、2日後、3日後、4日後、7日後、14日後、21日後、28日後に血液を採取した。採取した血液は直ちに4℃、15,000 rpmで15分間遠心分離し、血漿を得た。分離した血漿は、測定を実施するまで-20℃以下に設定された冷凍庫に保存した。抗ヒトIL-6受容体抗体としては、ヒトFcRnトランスジェニックマウスには上述のH54/L28-IgG1、Fv4-IgG1、および、Fv4-IgG1-v2、正常マウスには上述のH54/L28-IgG1、Fv4-IgG1、Fv4-IgG1-v1、および、Fv4-IgG1-v2を使用した。
マウス血漿中の抗ヒトIL-6受容体抗体濃度はELISA法にて測定した。まず抗ヒトIgG(γ鎖特異的)F(ab')2抗体断片(Sigma) をNunc-ImmunoPlate, MaxiSorp (Nalge Nunc International)に分注し、4℃で一晩静置し抗ヒトIgG固相化プレートを調製した。血漿中濃度として0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125μg/mLの検量線試料と100倍以上希釈したマウス血漿測定試料を調製し、これら検量線試料および血漿測定試料100μLに20 ng/mLのhsIL-6Rを200μL加え、室温で1時間静置した。その後抗ヒトIgG固相化プレートに分注しさらに室温で1時間静置した。その後ビオチン化抗ヒトIL-6 R抗体(R&D)を室温で1時間反応させ、さらにStreptavidin-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies)を室温で1時間反応させ、TMB One Component HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories)を基質として用い発色反応を行い、1N硫酸(Showa Chemical)で反応停止後、マイクロプレートリーダーにて450 nmの吸光度を測定した。マウス血漿中濃度は検量線の吸光度から解析ソフトウェアSOFTmax PRO(Molecular Devices)を用いて算出した。この方法で測定した静脈内投与後のヒトFcRnトランスジェニックマウスにおける血漿中抗体濃度推移を図31に、正常マウスにおける血漿中抗体濃度推移を図33に示した。
マウスの血漿中hsIL-6R濃度は電気化学発光法にて測定した。2000、1000、500、250、125、62.5、および31.25 pg/mLの濃度に調整したhsIL-6R検量線試料ならびに50倍以上希釈したマウス血漿測定試料を調製した。試料を、SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)でルテニウム化したモノクローナル抗ヒトIL-6R抗体(R&D)、ビオチン化抗ヒトIL-6 R抗体(R&D)、およびWT-IgG1溶液と混合し、37℃で一晩反応させた。その際の抗ヒトIL-6受容体抗体として、H(WT)(配列番号:13)とL(WT)(配列番号:14)とを含むWT-IgG1の終濃度は試料に含まれる抗ヒトIL-6受容体抗体濃度より過剰の333μg/mLであり、試料中のほぼ全てのhsIL-6RをWT-IgG1と結合した状態にすることを目的とした。その後、MA400 PR Streptavidin Plate(Meso Scale Discovery)に分注した。さらに室温で1時間反応させ洗浄後、Read Buffer T(×4)(Meso Scale Discovery)を分注し、ただちにSECTOR PR 400 reader(Meso Scale Discovery)で測定を行った。hsIL-6R濃度は検量線のレスポンスから解析ソフトウェアSOFTmax PRO(Molecular Devices)を用いて算出した。この方法で測定した静脈内投与後のヒトFcRnトランスジェニックマウスにおける血漿中hsIL-6R濃度推移を図32に、正常マウスにおける血漿中hsIL-6R濃度推移を図34に示した。
可溶型ヒトIL-6受容体が血漿中においてどの程度中和されているかを評価するために、マウス血漿中の抗ヒトIL-6受容体抗体によって結合(中和)されていない可溶型ヒトIL-6受容体濃度(遊離hsIL-6R濃度)を電気化学発光法で測定した。10000、5000、2500、1250、625、312.5、または156.25 pg/mLに調整したhsIL-6R検量線試料及びマウスの血漿試料12μLを、0.22μmのフィルターカップ(Millipore)において乾燥させた適量のrProtein A Sepharose Fast Flow (GE Healthcare)樹脂に添加することで血漿中に存在する全てのIgG型抗体(マウスIgG、抗ヒトIL-6受容体抗体および抗ヒトIL-6受容体抗体-可溶型ヒトIL-6受容体複合体)をプロテインAに吸着させた。その後、高速遠心機でスピンダウンし、パス溶液を回収した。パス溶液にはプロテインAに結合した抗ヒトIL-6受容体抗体-可溶型ヒトIL-6受容体複合体は含まれないため、パス溶液中のhsIL-6R濃度を測定することによって、血漿中の遊離hsIL-6R濃度を測定可能である。次にパス溶液を、SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)でルテニウム化したモノクローナル抗ヒトIL-6R抗体(R&D)およびビオチン化抗ヒトIL-6 R抗体(R&D)と混合し室温で1時間反応させた。その後、MA400 PR Streptavidin Plate(Meso Scale Discovery)に分注した。さらに室温で1時間反応させ洗浄後、Read Buffer T(×4)(Meso Scale Discovery)を分注し、ただちにSECTOR PR 400 reader(Meso Scale Discovery)で測定を行った。hsIL-6R濃度は検量線のレスポンスから解析ソフトウェアSOFTmax PRO(Molecular Devices)を用いて算出した。この方法で測定した静脈内投与後の正常マウスにおける血漿中遊離hsIL-6R濃度推移を図35に示した。
H54/L28-IgG1とpH依存的ヒトIL-6受容体結合を有するFv4-IgG1のin vivo試験の結果を比較した。図31および図33に示したとおり、両者の抗体血漿中滞留性はほぼ同等であったが、図32および図34に示すとおり、pH依存的ヒトIL-6受容体結合を有するFv4-IgG1と同時に投与したhsIL-6Rのほうが、H54/L28-IgG1と同時に投与したhsIL-6Rと比較して、hsIL-6Rの消失が早くなっていることが確認された。この傾向はヒトFcRnトランスジェニックマウスと正常マウスの両方で確認され、pH依存的ヒトIL-6受容体結合能を付与することによって4日後の血漿中hsIL-6R濃度はそれぞれ約17倍および約34倍低減できることが見出された。
天然型ヒトIgG1は中性条件下(pH7.4)においてヒトFcRnにほとんど結合しない(アフィニティーが極めて弱い)ことが報告されている。天然型ヒトIgG1に対してEUナンバリングにおける434番目をAsnからTrpに置換することによって、中性条件下(pH7.4)におけるヒトFcRnに対する結合が増加することが報告されている(J Immunol. 2009;182(12):7663-71.)。Fv4-IgG1、および、Fv4-IgG1に対してこのアミノ酸置換を導入したFv4-IgG1-v2のヒトFcRnトランスジェニックマウスにおけるin vivo試験の結果を比較した。図31に示したとおり、両者の抗体血漿中滞留性はほぼ同等であったが、図32に示すとおり、中性条件下(pH7.4)におけるヒトFcRnに対する結合が増加したFv4-IgG1-v2と同時に投与したhsIL-6Rのほうが、Fv4-IgG1と同時に投与したhsIL-6Rと比較して、hsIL-6Rの消失が早くなっていることが確認された。中性条件下(pH7.4)におけるヒトFcRnに対する結合を付与することによって4日後の血漿中hsIL-6R濃度は約4倍低減できることが見出された。
Biacoreを用いた抗体とFcRnの相互作用を評価する測定系として、J Immunol. 2009;182(12):7663-71.に記されたセンサーチップへ抗体を固定化しヒトFcRnをアナライトとする系が報告されている。この目的のために、ヒトFcRnを参考例4に記載のように調製した。本系を用いて、Fv4-IgG1、Fv4-IgG1-v1およびFv4-IgG1-v2のpH6.0およびpH7.4におけるヒトFcRnへの結合活性(解離定数KD)の評価を行った。被験物質である抗体は、Series SセンサーチップCM5に直接固定化して試験に供した。センサーチップへの抗体の固定化は、ランニングバッファーとして50 mmol/Lリン酸ナトリウム/150 mmol/L NaCl, 0.05% (v/v%) Surfactant P20 pH6.0を用い、アミンカップリングキットを使用してメーカーのマニュアルに従って固定化量500RUを目指して実施した。
(5−1)Fv4-IgG1の重鎖定常領域改変体の作製
ヒトFcRnトランスジェニックマウスにおける、pH依存的ヒトIL-6受容体結合抗体の抗原消失効果を更に増大させるため、Fv4-IgG1に対して、中性条件下におけるヒトFcRnへの結合を増強するための様々な改変を導入した。具体的には、表25−1および25−2に記載のアミノ酸改変をFv4-IgG1の重鎖定常領域に導入することで、各種変異体を作製した(変異箇所のアミノ酸番号はEUナンバリングによる)。なお、アミノ酸置換の導入は参考例3に記載の当業者公知の方法に従って実施した。
Biacore T100 (GE Healthcare) を用いて、ヒトFcRnと抗体との速度論的解析を行った。この目的のために、ヒトFcRnを参考例2に記載のように調製した。センサーチップCM4 (GE Healthcare) 上にアミンカップリング法でプロテインL (ACTIGEN) を適当量固定化し、そこへ目的の抗体を捕捉させた。次に、FcRn希釈液とランニングバッファー(参照溶液として)とをインジェクトし、センサーチップ上に捕捉させた抗体にヒトFcRnを相互作用させた。ランニングバッファーには50 mmol/Lリン酸ナトリウム、150 mmol/L NaCl、0.05% (w/v) Tween20、pH7.0を用い、FcRnの希釈にもそれぞれのバッファーを使用した。チップの再生には10 mmol/Lグリシン-HCl, pH1.5を用いた。測定は全て25℃で実施した。測定で得られたセンサーグラムから、カイネティクスパラメーターである結合速度定数 ka (1/Ms)、および解離速度定数 kd (1/s) を算出し、その値をもとに各抗体のヒトFcRnに対する KD (M) を算出した。各パラメーターの算出にはBiacore T100 Evaluation Software (GE Healthcare)を用いた。
参考例4で調製した中性条件下でのヒトFcRnへの結合能を付与した重鎖を用いて、中性条件下でのヒトFcRnへの結合能を有するpH依存的ヒトIL-6受容体結合抗体を作製し、生体内での抗原消失効果の検証を行った。具体的には、
VH3-IgG1とVL3-CKとを含むFv4-IgG1、
VH3-IgG1-v2とVL3-CKとを含むFv4-IgG1-v2、
VH3-IgG1-F14とVL3-CKとを含むFv4-IgG1-F14、
VH3-IgG1-F20とVL3-CKとを含むFv4-IgG1-F20、
VH3-IgG1-F21とVL3-CKとを含むFv4-IgG1-F21、
VH3-IgG1-F25とVL3-CKとを含むFv4-IgG1-F25、
VH3-IgG1-F29とVL3-CKとを含むFv4-IgG1-F29、
VH3-IgG1-F35とVL3-CKとを含むFv4-IgG1-F35、
VH3-IgG1-F48とVL3-CKとを含むFv4-IgG1-F48、
VH3-IgG1-F93とVL3-CKとを含むFv4-IgG1-F93、
VH3-IgG1-F94とVL3-CKとを含むFv4-IgG1-F94
を、参考例3に記載の当業者公知の方法によって発現させて精製した。
参考例6で調製したFv4-IgG1-F14を用いて、低用量(0.01 mg/kg)におけるin vivo試験を参考例6の方法と同様に行い、参考例6で得られたFv4-IgG1およびFv4-IgG1-F14の1 mg/kg投与時の結果と比較した(結果を図37および38に示した)。
(8−1)中性条件下におけるマウスFcRnへの結合評価
参考例5で調製した、
VH3-IgG1(配列番号:19)とL(WT)(配列番号:14)とを含むVH3/L(WT)-IgG1、
VH3-IgG1-v2(配列番号:22)とL(WT)(配列番号:14)とを含むVH3/L(WT)-IgG1-v2、
VH3-IgG1-F20(配列番号:23)とL(WT)(配列番号:14)とを含むVH3/L(WT)-IgG1-F20、
について、以下の方法により中性条件下(pH7.4)におけるマウスFcRnへの結合評価を実施した。
実施例3および参考例5で調製した、H54/L28-IgG1、Fv4-IgG1、Fv4-IgG1-v2およびFv4-IgG1-F20を用いて、下記の方法でin vivo試験を行った。
参考例3と同様の方法で実施した。
実施例5と同様の方法で実施した。
図39に示した通り、血漿中可溶型ヒトIL-6受容体濃度が約40 ng/mLにおいて定常状態を維持している正常マウス(hsIL-6R群)に対して、可溶型ヒトIL-6受容体の中和抗体であるH54/L28-IgG1を投与すると、血漿中可溶型ヒトIL-6受容体濃度が650 ng/mL(投与前の15倍)まで上昇した。一方で、H54/L28-IgG1にpH依存的抗原結合能を付与したFv4-IgG1の投与群においては、血漿中可溶型ヒトIL-6受容体濃度が70 ng/mL程度を維持していた。このことから、通常の中和抗体であるH54/L28-IgG1の投与によって引き起こされる血漿中可溶型ヒトIL-6受容体濃度の上昇は、pH依存的結合能を付与することにより、10分の1程度にまで抑制できることが示された。
(9−1)in vivo試験のための抗体調製
pH中性域におけるFcRnに対する結合が増加したVH3-IgG1(配列番号:19)とVL3-CK(配列番号:20)とを含むFv4-IgG1のFc変異体を作製した。具体的には、VH3-M73(配列番号:24)およびVH3-IgG1-v1(配列番号:21)を調製した。アミノ酸置換の導入は参考例3に記載の当業者公知の方法に従って実施した。
VH3-IgG1(配列番号:19)とL(WT)(配列番号:14)とを含むVH3/L(WT)-IgG1、VH3-M73(配列番号:24)とL(WT)(配列番号:14)とを含むVH3/L(WT)-M73、VH3-IgG1-v1(配列番号:21)とL(WT)(配列番号:14)とを含むVH3/L(WT)-IgG1-v1、およびVH3-IgG1-v2(配列番号:22)とL(WT)(配列番号:14)とを含むVH3/L(WT)-IgG1-v2は、その全てを参考例3に記載の通りに調製し、中性pH(pH7.0)におけるヒトFcRn結合に関して評価した。
中性条件下(pH7.0)におけるヒトFcRn結合についてのBiacoreによる結果を表27に示す。
同時投与モデルを用いた抗体のin vivo試験を参考例3に記載した通りに行った。本試験において用いた抗ヒトIL-6受容体抗体は、先に記載したH54/L28-IgG1、Fv4-IgG1、Fv4-M73、Fv4-IgG1-v1、およびFv4-IgG1-v2である。この試験において用いたマウスはヒトFcRnトランスジェニックマウス(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg 系統276 +/+マウス、Jackson Laboratories; Methods Mol Biol. (2010) 602: 93-104)である。
図40に示すように、H54/L28-IgG1、Fv4-IgG1、Fv4-M73、Fv4-IgG1-v1、およびFv4-IgG1-v2の薬物動態は同等であり、これらの抗体は試験のあいだ類似の血漿中濃度を維持した。
A値:各時点での抗原のモル濃度
B値:各時点での抗体のモル濃度
C値:抗体モル濃度あたりの抗原モル濃度(抗原/抗体モル比)
C=A/B
ヒトFcRnトランスジェニックマウス系統276を用いた下記の定常状態注入モデルによるFv4-IgG1-F14のin vivo試験を行った。試験群は対照群(抗体なし)、1 mg/kgの用量でのFv4-IgG1、ならびに1 mg/kg、0.2 mg/kg、および0.01 mg/kgの用量でのFv4-IgG1-F14からなる。
これまでのin vivo試験は、ヒトFcRnトランスジェニックマウス系統276(Jackson Laboratories)を用いて行っていた。ヒトFcRnトランスジェニックマウス系統276と異なるトランスジェニック系統である系統32との差を比較するために、本発明者らは、ヒトFcRnトランスジェニックマウス系統32(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg 系統32 +/+マウス(B6.mFcRn-/- hFCRN Tg32; B6.Cg-Fcgrt<tm1Dcr> Tg(FCGRT)32Dcr) (Jackson #4915))、Jackson Laboratories; Methods Mol Biol. (2010) 602: 93-104)を用いてH54/L28-IgG1、Fv4-IgG1、およびFv4-IgG1-v2の同時投与試験を行った。試験方法は、ヒトFcRnトランスジェニックマウス系統32をヒトFcRnトランスジェニックマウス系統276の代わりに用いたこと以外は、参考例3の試験方法と同じであった。
(12−1)Fc変異体の作製
抗原消失プロファイルをさらに改善するために、pH中性域におけるヒトFcRnに対する結合アフィニティーを増大させることを目的として、様々な変異をFv4-IgG1に導入した。具体的には、表15に示されるアミノ酸変異をFv4-IgG1の重鎖定常領域に導入してFc変異体を作製した(変異部位のアミノ酸番号は、EUナンバリングに従って記載する)。アミノ酸置換の導入は参考例3に記載の当業者公知の方法に従って実施した。
抗体とヒトFcRnとの結合の動態を、IgG1-v1、IgG1-v2、およびIgG1-F2からIgG1-F1052については参考例5に記載した通りに、またはIgG1およびM73については参考例9に記載した通りに解析した。中性条件下(pH7.0)におけるヒトFcRn結合についてのBiacoreによる結果を表28−1から28−21に示す。
参考例12において作製したFc変異体を、ヒトFcRnトランスジェニックマウス系統32を用いた定常状態注入モデルにおいて血漿中抗原消失能に関して試験した。定常状態注入モデルin vivo試験は、ヒトFcRnトランスジェニックマウス系統32を系統276の代わりに用い、モノクローナル抗マウスCD4抗体を2回(注入ポンプを埋め込む前と、抗体を投与した14日後)または3回(注入ポンプを埋め込む前と、抗体を投与した10日後および20日後)投与したこと以外は、実施例1に記載した通りに行った。
VH3-IgG1とVL3-CKとを含むFv4-IgG1;
VH3-IgG1-F11とVL3-CKとを含むFv4-IgG1-F11;
VH3-IgG1-F14とVL3-CKとを含むFv4-IgG1-F14;
VH3-IgG1-F39とVL3-CKとを含むFv4-IgG1-F39;
VH3-IgG1-F48とVL3-CKとを含むFv4-IgG1-F48;
VH3-IgG1-F140とVL3-CKとを含むFv4-IgG1-F140;
VH3-IgG1-F157とVL3-CKとを含むFv4-IgG1-F157;
VH3-IgG1-F194とVL3-CKとを含むFv4-IgG1-F194;
VH3-IgG1-F196とVL3-CKとを含むFv4-IgG1-F196;
VH3-IgG1-F198とVL3-CKとを含むFv4-IgG1-F198;
VH3-IgG1-F262とVL3-CKとを含むFv4-IgG1-F262;
VH3-IgG1-F264とVL3-CKとを含むFv4-IgG1-F264;
VH3-IgG1-F393とVL3-CKとを含むFv4-IgG1-F393;
VH3-IgG1-F434とVL3-CKとを含むFv4-IgG1-F424;および
VH3-IgG1-F447とVL3-CKとを含むFv4-IgG1-F447。
図49は、マウスにおける血漿中hsIL-6R濃度推移を示す。Fv4-IgG1と比較して、pH7.0におけるヒトFcRnに対する結合アフィニティーが増大したFc変異体は全て、血漿中hsIL-6R濃度の減少を示し、ゆえに血漿からの抗原の消失を増大させた。抗原濃度減少の程度および持続はFc変異体間で異なったものの、全ての変異体が一致してIgG1と比較して血漿中hsIL-6R濃度を減少させた。これは、pH7.0におけるヒトFcRnに対する結合アフィニティーが増大することにより、血漿からの抗原の消失が一般に増大することを示している。図50は、マウスにおける血漿中抗体濃度推移を示す。抗体の薬物動態はFc変異体間で異なった。
Claims (12)
- 以下の工程(a)〜(b)を含む、(i) 抗原の細胞内への取込みを促進させる機能、(ii)抗原に2回以上結合する機能、(iii)血漿中の抗原濃度の減少を促進させる機能、及び(iv)優れた血漿中滞留性機能、から選ばれる少なくとも1つの機能を有する抗体の製造方法;
(a) 抗原結合ドメインとヒトFcRn結合ドメインを含み、2つの異なるカルシウム濃度条件下における抗原結合活性が異なり、低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が、高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低い抗体であって、前記抗原結合ドメインに含まれる軽鎖または重鎖にヒト抗体由来のカルシウム結合モチーフを含み、前記カルシウム結合モチーフを含む軽鎖または重鎖が、Kabatナンバリングで表される30位、31位、32位、50位および92位のアミノ酸のいずれかひとつ以上のアミノ酸が金属キレート作用を有するアミノ酸である軽鎖、および/または、Kabatナンバリングで表される95位、96位、100a位および101位のアミノ酸のいずれかひとつ以上のアミノ酸が金属キレート作用を有するアミノ酸である重鎖である抗体をコードする遺伝子を準備する工程、
(b) 工程(a)で準備した遺伝子を宿主に導入し、抗体を発現させる工程。 - 低カルシウム濃度がイオン化カルシウム濃度0.1μM〜30μMである、請求項1に記載の抗体の製造方法。
- 高カルシウム濃度がイオン化カルシウム濃度100μM〜10 mMである、請求項1に記載の抗体の製造方法。
- 低カルシウム濃度がエンドソーム内のイオン化カルシウム濃度である、請求項1または2に記載の抗体の製造方法。
- 高カルシウム濃度が血漿中のイオン化カルシウム濃度である、請求項1または3に記載の抗体の製造方法。
- 前記FcRn結合ドメインがFc領域である、請求項1〜5のいずれかに記載の抗体の製造方法。
- 前記工程(a)の抗体が、更に、酸性pH条件下における抗原結合活性が、中性pH条件下における抗原結合活性よりも低い抗体である、請求項1〜6のいずれかに記載の抗体の製造方法。
- 前記酸性pH条件下における抗原結合活性が、中性pH条件下における抗原結合活性よりも低い抗体が、少なくとも1つのアミノ酸がヒスチジンで置換され、又は、少なくとも1つのヒスチジンが挿入されている、請求項7に記載の抗体の製造方法。
- 前記抗体が、膜抗原又は可溶型抗原に結合する抗体である、請求項1〜8のいずれかに記載の抗体の製造方法。
- 前記抗体が、pH中性域の条件下でのFcRnに対する結合活性を有するFc領域を含む、請求項1〜9のいずれかに記載の抗体の製造方法。
- 前記Fc領域のアミノ酸配列のうち、EUナンバリングで表される248、250、252、254、255、256、257、258、265、286、289、297、303、305、307、308、309、311、312、314、315、317、332、334、360、376、380、382、384、385、386、387、389、424、428、433、434、および436のいずれかひとつ以上のアミノ酸が天然型Fc領域のアミノ酸と異なるFc領域である、請求項10に記載の抗体の製造方法。
- 前記Fc領域のEUナンバリングで表されるアミノ酸であって;
237位のアミノ酸がMet、
248位のアミノ酸がIle、
250位のアミノ酸がAla、Phe、Ile、Met、Gln、Ser、Val、Trp、またはTyr、
252位のアミノ酸がPhe、Trp、またはTyr、
254位のアミノ酸がThr、
255位のアミノ酸がGlu、
256位のアミノ酸がAsp、Glu、またはGln、
257位のアミノ酸がAla、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr、またはVal、
258位のアミノ酸がHis、
265位のアミノ酸がAla、
286位のアミノ酸がAlaまたはGlu、
289位のアミノ酸がHis、
297位のアミノ酸がAla、
303位のアミノ酸がAla、
305位のアミノ酸がAla、
307位のアミノ酸がAla、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp、またはTyr、
308位のアミノ酸がAla、Phe、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、またはThr、
309位のアミノ酸がAla、Asp、Glu、Pro、またはArg、
311位のアミノ酸がAla、His、またはIle、
312位のアミノ酸がAlaまたはHis、
314位のアミノ酸がLysまたはArg、
315位のアミノ酸がAla、AspまたはHis、
317位のアミノ酸がAla、
332位のアミノ酸がVal、
334位のアミノ酸がLeu、
360位のアミノ酸がHis、
376位のアミノ酸がAla、
380位のアミノ酸がAla、
382位のアミノ酸がAla、
384位のアミノ酸がAla、
385位のアミノ酸がAspまたはHis、
386位のアミノ酸がPro、
387位のアミノ酸がGlu、
389位のアミノ酸がAlaまたはSer、
424位のアミノ酸がAla、
428位のアミノ酸がAla、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp、またはTyr、
433位のアミノ酸がLys、
434位のアミノ酸がAla、Phe、His、Ser、Trp、またはTyr、もしくは
436位のアミノ酸がHis 、Ile、Leu、Val、
のいずれかひとつ以上の組合せである、請求項10に記載の抗体の製造方法。
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