KR20010022846A

KR20010022846A - 항 인터루킨-6 수용체 항체를 유효성분으로서 함유하는 전신성 홍반성 낭창의 예방 및/또는 치료제

Info

Publication number: KR20010022846A
Application number: KR1020007001448A
Authority: KR
Inventors: 미하라마사히코; 오수기요시유키
Original assignee: 나가야마 오사무; 츄가이 세이야꾸 가부시키가이샤
Priority date: 1997-08-15
Filing date: 1998-08-14
Publication date: 2001-03-26
Also published as: DE69839517D1; WO1999008707A1; KR20090068385A; EP1004315B1; EP1004315A4; DK1004315T3; EP1916020A2; AU747883B2; JP2017002087A; ATE395933T1; EP1004315A1; JP2009185073A; JP2012214517A; CA2296322A1; PT1004315E; KR20100068498A; JP2015098491A; AU8649498A; EP1916020A3; KR20040024561A

Abstract

항 인터루킨-6 (IL-6) 수용체 항체를 유효성분으로서 함유하는 전신성 홍반성 낭창의 예방 및/또는 치료제.

Description

항 인터루킨-6 수용체 항체를 유효성분으로서 함유하는 전신성 홍반성 낭창의 예방 및/또는 치료제{PREVENTIVES AND/OR REMEDIES FOR SYSTEMIC LUPUS ERYTHEMATOSUS CONTAINING ANTI-IL-6 RECEPTOR ANTIBODY AS THE ACTIVE INGREDIENT}

인터루킨-6 (IL-6)는 B 세포 자격 인자 2 (BSF2) 또는 인터페론β2 (INF-β2)으로도 불리는 사이토카인이다. IL-6는 B 임파구 세포의 활성화에 관여하는 분화인자로서 발견되었다 (Hirano, T. et al., Nature (1986) 324, 73-76). 그후, 여러가지 세포의 기능에 영향을 미치는 다기능 사이토카인이라는 것이 명백하게 되었다 (Akira, S. et al., Adv. in Immunology (1993) 54, 1-78).

IL-6는 세포 위에 두 종류의 단백질을 매개로 그 생물학적 활성을 전달한다. 하나는 IL-6가 결합하는 리간드 결합성 단백질의 IL-6 수용체이다. IL-6 수용체는 세포막을 관통하여 세포막 위에 발현하는 분자량 약 80kD의 막결합형 IL-6 수용체로서 뿐만 아니라, 본질적으로 그의 세포외 영역을 구성하는 분자량 40 내지 50kD의 가용성 IL-6 수용체로서도 존재한다.

다른 하나는, 비리간드 결합성의 시그날 전달에 속하는 분자량 약 130kD의 막단백질 gp130 이다. IL-6와 IL-6 수용체는 IL-6/IL-6 수용체 복합체를 형성하고, 이어서 gp130과 결합하는 것에 의해, IL-6의 생물학적 활성이 세포 내에 전달된다 (Taga et al., J. Exp. Med. (1987) 166, 967).

항 IL-6 수용체 항체는 지금까지 여러 보고서에 기재되어 있다 (Novick, D. et al., Hybridoma (1991) 10, 137-146, Huang, Y. W. et al., Hybridoma (1993) 12, 621-630, 국제특허출원공개번호 WO 95-09873, 프랑스 특허출원공개번호 FR 2694767, 미국특허번호 US 521628). 항 IL-6 수용체 항체의 하나인 마우스 항체 PM-1 (Hirata, et al., J. Immunology (1989) 143, 2900-2906) 및 그의 상보성 결정 영역 (CDR)을 인간 항체로 이식하는 것에 의해 얻어지는 인간형화 PM-1 항체 (국제특허출원공개번호 WO 92-19759)가 알려져 있다.

전신성 홍반성 낭창은 항핵 항체 또는 항 DNA 항체와 그의 면역 복합체가 각종 장기·조직에 침착하는 것에 의해 염증 반응이 유도되어 생기는 전신성 자기면역질환이다. 항핵 항체 또는 항 DNA 항체와 그의 면역 복합체가 신사구체에 침착하면 루프스 신염이 발증한다. 전신성 홍반성 낭창은 혈중 IL-6의 증가를 나타내는 환자는 거의 없고, IL-6의 병인으로서의 관계는 부정적이다 (Peterson, E. et al., Lupus. (1996) 5, 571-576).

Kiberd, J. J. Am. Soc. Nephrol. (1993) 4, 58-61에는, MRL-lpr/lpr 마우스에서의 항 IL-6 수용체 항체의 신기능과 조직변화에 관한 효과가 기재되어 있다. 그러나, Kiberd, J.의 실험에는 전신성 홍반성 낭창의 임상 증상의 지표로서 필수적인 요단백질의 출현 시기와 생존일수가 검토되어 있지 않다. 따라서, 이것만의 결과로부터 항 IL-6 수용체 항체가 루프스 신염에 유효한 것으로는 판단할 수 없다.

또, 사용된 MRL-lpr/lpr 마우스의 병인은 조직학적으로는 전신성 홍반성 낭창과 유사하지만, 병인의 발증 메카니즘에서는 Fas 항원 이상(異常)이 관계하고 있다. 한편, 인간의 전신성 홍반성 낭창에는 Fas 항원의 이상은 확인되어 있지 않다 (Watanabe-Fukunaga, R. et al., Nature. (1992) 356, 314-371).

따라서, 이 마우스를 사용하여 얻어진 실험 결과가 곧바로 인간의 전신성 홍반성 낭창에 적용될 수 있다고는 말하기 어렵다. 전신성 홍반성 낭창에서의 루프스 신염의 모델로는 NZB/WF1 마우스가 가장 인간의 전신성 홍반성 낭창의 병인에 근접한 것이 알려져 있다 (Howie, J. B. et al., Adv. Immunol. (1968) 9, 215-266).

또, 항 IL-6 수용체 항체 투여군과 대조 IgG 투여군 사이의 통계학적 유의차가 없기 때문에, 항 IL-6 수용체 항체가 치료 효과를 갖는다고는 결론 지울 수 없다. 따라서, 상기 Kiberd, J.의 문헌에서 항 IL-6 수용체 항체의 전신성 홍반성 낭창에 대한 효과는 예측할 수 없었다.

Finck, B. K. et al., J. Clin. Invest. (1994) 94, 585-591, NZB/NZB F1 마우스에서의 항 IL-6 항체의 요단백질 배설 억제 효과, 혈중 항 DNA 항체가 및 생존일수 연장효과가 기재되어 있다.

그러나, 항 IL-6 항체를 투여하면, 7 개월령부터 신염을 발증하는 마우스가 증가되고, 9 개월령 이후도 증가될 가능성이 충분하게 고려될 수 있다. 따라서, 항 IL-6 항체의 전신성 홍반성 낭창에 대한 효과는 충분하지 않은 것이 시사된다.

또, 지금까지 항 IL-6 항체를 인간과 마우스에 투여하는 경우, 혈중의 IL-6 농도가 현저하게 상승하는 경우가 다수 보고되어 있다 (Wendling, D. et al., J. Rheumatol. (1993) 20, 259-262, Heremans, H. et al., Eur. J. Immunol. (1992) 22, 2395-2401). 또한 IL-6와 IL-6 항체를 동시투여하면 IL-6의 활성이 현저하게 상승하는 것도 발견되어 있다(Mihara, M. et al., Immunology (1991) 74, 55-59). 이런 사실은 항 IL-6 항체를 사용한 경우에는 내인성의 IL-6의 활성이 증강되고, 부작용을 발현할 가능성을 나타낸다. 따라서, 전신성 홍반성 낭창에 항 IL-6 항체를 투여하면 바람직하지 않은 효과가 생길 수 있는 것이 시사된다.

또, 국제특허출원공개번호 WO 96-12503에는 항 IL-6 수용체 항체가 신염, 특히 메센지움 증식성 신염에 효과가 있는 것이 기재되어 있다. 그러나, 국체특허출원공개번호 WO 96-12503에는, 유전자 조작에 의해 대량으로 생산되는 IL-6에 의해 메센지움 세포가 증식되고, 메센지움 세포의 증식이 직접적인 원인으로서 발증하는 신염이 기재되어 있을 뿐이다. IL-6가 발증에 관여되어 있지 않고, 항핵 항체 또는 항 DNA 항체 또는 그들 항체의 면역 복합체가 신장의 사구체에 침착하여 생기는 전신성 홍반성 낭창에서의 자기면역성 신염, 예를 들면 루프스 신염에 대한 항 IL-6 수용체 항체가 치료 효과를 갖는 것은 어떠한 것도 개시되어 있지 않고, 시사되어 있지 않다.

따라서, 지금까지 항 IL-6 수용헤가 전신성 홍반성 낭창에 대한 치료 효과를 갖는 것은 알려져 있지 않았다.

현재, 전신성 홍반성 낭창의 치료에는 스테로이드제와 면역억제제가 사용되고 있지만, 대증치료이고, 더욱이 장기간의 투여가 필요하여, 부작용라는 문제가 있다.

본 발명은 항 인터루킨-6 수용체 항체를 유효성분으로 함유하는 전신성 홍방성 낭창의 예방 및/또는 치료제에 관한 것이다.

도 1은 NZB/WF1 마우스에서의 MR16-1의 요단백질 배설억제작용을 나타내는 그래프이다.

도 2는 NZB/WF1 마우스의 생존일수에 미치는 MR16-1의 효과를 나타내는 그래프이다.

도 3은 혈중 항 DNA 항체 양에 미치는 MR16-1 효과를 나타내는 그래프이다.

본 발명은, 상기 결점을 갖지 않는 전신성 홍반성 낭창의 예방 및/또는 치료제를 제공하려고 하는 것이다.

즉, 본 발명은 항 IL-6 수용체 항체를 유효성분으로서 함유하는 전신성 홍반성 낭창의 예방 및/또는 치료제를 제공한다.

본 발명은 또 항 IL-6 수용체 항체를 유효성분으로서 함유하는 전신성 홍반성 낭창에서의 자기면역성 신염의 예방 및/또는 치료제를 제공한다.

본 발명은 또 항 IL-6 수용체 항체를 유효성분으로서 함유하는 전신성 홍반성 낭창에서의 루프스 신염의 예방 및/또는 치료제를 제공한다.

본 발명은 또 항 인간 IL-6 수용체 항체를 유효성분으로서 함유하는 상기 전신성 홍반성 낭창의 예방 및/또는 치료제를 제공한다.

본 발명은 또 항 IL-6 수용체 모노클로날 항체를 유효성분으로서 함유하는 상기 전신성 홍반성 낭창의 예방 및/또는 치료제를 제공한다.

본 발명은 또 재조합형 항 IL-6 수용체 항체를 유효성분으로서 함유하는 상기 전신성 홍반성 낭창의 예방 및/또는 치료제를 제공한다.

본 발명은 또 PM-1 항체를 유효성분으로서 함유하는 상기 전신성 홍반성 낭창의 예방 및/또는 치료제를 제공한다.

본 발명은 또 인간 항체 정상 영역을 갖는 항 IL-6 수용체 항체를 유효성분으로서 함유하는 예방 및/또는 치료제를 제공한다.

본 발명은 또 IL-6 수용체에 대한 키메라 항체 또는 인간형화 항체를 유효성분으로서 함유하는 상기 전신성 홍반성 낭창의 예방 및/또는 치료제를 제공한다.

본 발명은 또 인간형화 PM-1 항체를 유효성분으로서 함유하는 상기 전신성 홍반성 낭창의 예방 및/또는 치료제를 제공한다.

본 발명은 또 항 IL-6 수용체 항체를 유효성분으로서 함유하는 전신성 홍반성 낭창에서의 항 DNA 항체 또는 항핵 항체를 감소시키기 위한 예방 및/또는 치료제를 제공한다.

본 발명은 또한 항 IL-6 수용체 항체를 유효성분으로서 함유하는 전신성 홍반성 낭창에서의 요단백질 누출을 감소시키기 위한 예방 및/또는 치료제를 제공한다.

1. 항 IL-6 수용체 항체

본 발명에서 사용되는 항 IL-6 수용체 항체는 전신성 홍반성 낭창의 치료 효과, 전신성 홍반성 낭창에서의 항 DNA 항체의 감소 효과, 또는 전신성 홍반성 낭창에서의 요단백질 누출의 감소 효과를 나타내는 것이라면, 그 유래, 종류 및 형상을 문제삼지 않는다.

본 발명에서 사용되는 항 IL-6 수용체 항체는 IL-6 수용체와 결합하는 것에 의해, IL-6의 IL-6 수용체에서의 결합을 저해하고 IL-6의 생물학적 활성의 세포 내 전달을 저해하는 항체이다. 따라서, 본 발명에서 사용되는 항 IL-6 수용체 항체는 IL-6의 생물학적 활성을 중화하는 항체가 바람직하다.

본 발명에서 사용되는 항 IL-6 수용체 항체는 공지의 수단을 사용하여 폴리클로날 또는 모노클로날 항체로서 얻을 수 있다. 본 발명에서 사용되는 항 IL-6 수용체 항체로서, 모노클로날 항체가 바람직하다. 또한, 모노클로날 항체로서, 특히 포유 동물 유래의 모노클로날 항체가 바람직하다.

포유 동물 유래의 모노클로날 항체로서는, 하이브리도마에 의해 생산되는 것, 및 유전자 공학적 수법에 의한 항체 유전자를 함유하는 발현 벡터에서 형질전환된 숙주에 의해 생산되는 것을 들 수 있다.

이와 같은 항체로서는, MR16-1 항체 (Saito, et al., J. Immunol. (1993) 147, 168-173), PM-1 항체 (Hirata, et al., J. Immunology (1989) 143, 2900-2906), AUK12-20 항체, AUK64-7 항체 또는 AUK146-15 항체 (국제특허출원공개번호 WO 92-19759) 등을 들 수 있다. 이들 중에서, 특히 바람직한 항체로서는 PM-1 항체를 들 수 있다.

또, PM-1 항체 생산 하이브리도마 세포주는, PM-1으로서, 공업기술원 생명공학 공업기술연구소 (일본국 이바라키 츠쿠바시 히가시 1쪼메 1반 3고)에 1990년 7월 10일에 FERM BP-2998로서 부다페스트 조약에 기하여 국제기탁되어 있다.

또, MR16-1 항체 생산 하이브리도마 세포주는, 랫-마우스 하이브리도마 MR16-1으로서 공업기술원 생명공학 공업기술연구소 (일본국 이바라키 츠쿠바시 히가시 1쪼메 1반 3고)에 1997년 3월 13일에 FERM BP-5875로서 부다페스트 조약에 기하여 국제기탁되어 있다.

2. IL-6 수용체의 제조

감작항원인 IL-6 수용체는, 기본적으로는 공지 기술을 사용하여 제조할 수 있다.

구체적으로는 IL-6 수용체는 다음 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들면, 인간 IL-6 수용체는, 유럽특허출원공개번호 EP 325475에, 마우스 IL-6 수용체는 일본특허출원공개번호 특개평3-155795에 개시된 IL-6 수용체 유전자/아미노산 서열을 사용하는 것에 의해 얻을 수 있다. 항체 취득의 감작항원으로서 사용되는 IL-6 수용체는 인간 IL-6 수용체가 바람직하다.

IL-6 수용체 단백질은 세포막 위에서 발현되고 있는 것과 세포막으로부터 이탈되어 있는 것 (가용성 IL-6 수용체) (Yasukawa, et al., J. Biochem. (1990) 108, 673-676) 등의 두 종류가 있다. 가용성 IL-6 수용체 항체는 세포막에 결합되어 있고, IL-6 수용체에 본질적으로 세포외 영역으로 구성되어 있으며, 세포막 관통 영역, 또는 세포막 관통 영역과 세포내 영역이 결여되어 있는 점에서 막결합형 IL-6 수용체와 다르다. 항체 취득의 감작항원으로서 사용되는 IL-6 수용체는, 그 목적을 도달하는 한에서, 세포막에 결합되어 있는 IL-6 수용체 및 가용성 IL-6 수용체 중 어느 것이라도 좋다.

IL-6 수용체의 유전자 서열을 공지의 발현 벡터계에 삽입하여 적당한 숙주세포를 형질전환시킨 후, 그 숙주세포 중 또는 배양 상청 중에서 목적의 IL-6 수용체 단백질을 공지의 방법으로 정제하고, 이 정제 IL-6 수용체 단백질을 감작항원으로서 사용한다면 좋다. 또, IL-6 수용체를 발현하고 있는 세포와 IL-6 수용체 단백질과 다른 단백질과의 융합 단백질을 감작항원으로서 사용하여도 좋다. 또, 그 목적을 도달하는 한에서, IL-6 수용체 변이체를 항체 취득의 감작항원으로서 사용할 수 있다.

인간 IL-6 수용체를 코드하는 cDNA를 함유하는 플라스미드 pIBIBSF2R을 함유하는 대장균 (E. coli)은 HB101-pIBIBSF2R으로서, 1989년 1월 9일부로 공업기술원 생명공학 공업기술연구소에, 수탁번호 FERM BP-2232로서 부다페스트 조약에 기하여 국제기탁되어 있다.

3. 항체 생산 하이브리도마의 제조

모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마는, 기본적으로 공지 기술을 사용하여, 아래와 같이 제조할 수 있다. 즉, IL-6 수용체를 감작항원으로서 사용하고, 이것을 통상의 면역 방법에 따라서 면역하고, 얻어지는 면역 세포를 통상의 세포 융합법에 의해 공지의 친세포와 융합시키고, 통상의 스크린법에 의해 모노클로날인 항체 생산 세포를 스크린하는 것에 의해 제조할 수 있다.

감작항원으로 면역된 포유 동물으로는, 특히 한정되는 것은 아니지만, 세포 융합에 사용하는 친세포와의 적합성을 고려하여 선택하는 것이 바람직하다. 일반적으로는 설치목, 토키목, 영장목의 동물이 사용된다. 설치목의 동물로서는, 예를 들면 마우스, 랫, 햄스터 등이 사용된다. 토끼목의 동물로서는, 예를 들면 토끼가 사용된다. 영장목의 동물로서는, 예를 들면 원숭이가 사용된다. 원숭이로서는,협비하목 원숭이 (구세계 원숭이), 예를 들면 짧은꼬리 원숭이 (게잡이 원숭이), 붉은털 원숭이, 망토개코 원숭이, 침팬지 등이 사용된다.

감작항원을 동물에 면역하는 것은 공지 방법에 따라서 행한다. 예를 들면 일반적 방법으로서 감작항원을 포유 동물의 복강 내에 또는 피하에 주사하는 것에 의해 행하여 진다. 구체적으로는, 감작항원을 인산 완충액 (PBS)과 생리식염수 등에 적당량으로 희석, 현탁한 것을 소망에 의해 통상의 보조제, 예를 들면 프로인트 완전 보조제를 적량 혼합하여, 유화한 후, 포유 동물에 4 내지 21일 동안 매일 수회 투여하는 것이 바람직하다. 또, 감작항원 면역 시에 적당한 담체를 사용할 수 있다.

이와 같이 면역하여, 혈청 중에 소망의 항체 레벨이 상승하는 것을 확인한 후에, 포유 동물에서 면역 세포, 예를 들면 임파구절 세포와 비장 세포를 추출하고, 세포 융합시킨다. 세포 융합된 바람직한 면역 세포로서는 특히 비장 세포를 들 수 있다.

상기 면역 세포와 융합되는 다른 친세포로서의 포유 동물의 골수종 세포는, 이미 공지된 여러 종류의 세포주, 예를 들면 P3X63Ag8.653 (J. Immnol. (1979) 123, 1548-1550), P3X63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunol. (1976) 81, 1-7), NS-1 (Kohler, G. and Milstein, C. Eur. J. Immunology (1978) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies. D. H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), FO(de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323), R210 (Gafre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133) 등이 적당이 사용된다.

상기 면역 세포와 골수종 세포의 세포 융합은 기본적으로는 공지 방법, 예를 들면 밀스테인 등의 방법 (Kohler, G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46) 등에 준하여 행할 수 있다.

보다 구체적으로는, 상기 세포 융합은 예를 들면 세포 융합 촉진제의 존재 하에 통상의 영양 배양액 중에서 실시된다. 융합 촉진제로서는, 예를 들면 폴리에틸렌글리콜 (PEG), 센다이 바이러스 (HVJ) 등이 사용되고, 또한 소망에 의해 융합 효율을 높이기 위하여 디메틸술폭시드 등의 보조제를 첨가 사용할 수 있다.

면역 세포와 골수종 세포와의 사용비는, 예를 들면 골수종 세포에 대하여 면역 세포를 1 내지 10배로 하는 것이 바람직하다. 상기 세포 융합에 사용하는 배양액으로서는, 예를 들면 상기 골수종 세포주의 증식에 적합한 RPMI1640 배양액, MEM 배양액, 그 밖의 이러한 종류의 세포 배양에 사용되는 통상의 배양액이 사용가능하고, 또한 소태아 혈청(FCS) 등의 혈청보액을 병용할 수 있다.

세포 융합은 상기 면역 세포와 골수종 세포와의 소정량을 상기 배양액 중에 잘 혼합하고, 미리 37℃ 정도로 가온한 PEG 용액, 예를 들면 평균 분자량 1000 내지 6000 정도의 PEG 용액을 통상 30 내지 60%(w/v)의 농도로 첨가하고, 혼합하는 것에 의해 목적으로 하는 융합 세포 (하이브리도마)가 형성된다. 이어서, 적당한 배양액을 추가로 첨가하고, 원심분리하여 상청을 제거하는 조작을 반복하는 것에 의해 하이브리도마의 생육에 바람직하지 않은 세포 융합제 등을 제거할 수 있다.

해당 하이브리도마는, 통상의 선택 배양액, 예를 들면 HAT 배양액 (히폭산틴, 아미노프테린, 및 티미딘을 함유하는 배양액)에서 배양하는 것에 의해 선택된다. 해당 HAT 배양액에서의 배양은 목적으로 하는 하이브리도마 이외의 세포 (비융합 세포) 가 사멸하기에 충분한 시간, 통상 수일 내지 수주간 계속된다. 잠시 후에, 통상의 한계 희석법을 실시하고, 목적으로 하는 항체를 생산하는 하이브리도마의 스크린 및 클로닝을 행한다.

또, 인간 이외의 동물에 항원을 면역하여 상기 하이브리도마를 얻는 이외에, 인간 임파구를 시험관 내에서 소망의 항원 단백질 또는 항원 발현 세포에서 감작하고, 감작 B 임파구를 인간 골수종 세포, 예를 들면 U266과 융합시켜, 특정의 항원 또는 항원 발현 세포에서의 결합 활성을 갖는 소망의 인간 항체를 얻을 수 있다 (특공평1-59878 참조). 또한, 인간 항체 유전자의 레파토리를 갖는 트랜스제닉 동물에 항원 또는 항원 발현 세포를 투여하고, 상기 방법에 따라서 소망의 인간 항체를 취득하여도 좋다 (국제특허출원공개번호 WO 93-12227, WO 92-03918, WO 94-02602, WO 94-25585, WO 96-34096, WO 96-33735, 미국특허번호 US 5545806 참조).

이와 같이 제조된 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마는 통상의 배양액 중에 계대 배양하는 것이 가능하고, 또 액체 질소 중에서 장기 보존하는 것이 가능하다.

해당 하이브리도마에서 모노클로날 항체를 취득하는 것은, 해당 하이브리도마를 통상의 방법에 따라서 배양하고, 그 배양 상청으로서 얻는 방법, 또는 하이브리도마를 이것과 적합성이 있는 포유 동물에 투여하고 증식시켜, 그의 복수로서 얻는 방법 등이 채용된다. 전자의 방법은 고순도의 항체를 얻는데에 적합하고, 한편 후자의 방법은 항체의 대량생산에 적합하다.

예를 들면, 항 IL-6 수용체 항체 생산 하이브리도마의 제조는, 특개평3-139293에 개시된 방법에 의해 행할 수 있다. 공업기술원 생명공학 공업기술연구소 (일본국 이바라키 츠쿠바시 히가시 1쪼메 1반 3고)에, 1990년 7월 10일에, FERM BP-2998으로서 부다페스트 조약에 기하여 국제기탁된 PM-1 항체 생산 하이브리도마를 BALB/c마우스 (일본 클레아제)의 복강 내에 주입하여 복수를 얻고, 이 복수에서 PM-1 항체를 정제하는 방법과, 본 하이브리도마를 적당한 배지, 예를 들면 10% 소태아 혈청, 5% BM-Condimed H1 (베린거 만헤임제) 함유 RPMI1640 배지, 하이브리도마 SFM 배지 (지브코-비알엘제), PFHM-Ⅱ 배지 (지브코-비알엘제) 등에서 배양하고, 그 배양 상청에서 PM-1 항체를 정제하는 방법으로 행할 수 있다.

하이브리도마를 제조하여 항체를 생산시키는 이외에, 소망의 항체를 생산하는 면역 세포, 예를 들면 감작 임파구 등을 암유전자 (oncogene)에 의해 불사화시킨 세포를 사용하여 항체를 얻어도 좋다.

4. 재조합형 항체

본 발명에서는 모노클로날 항체로서, 항체 유전자를 항체 생산 세포, 예를 들면 하이브리도마에서 클로닝하고, 적당한 벡터에 삽입하고, 이것을 숙주 세포에 도입하는 유전자 재조합 기술을 사용하여 생산시킨 재조합형 항체를 사용할 수 있다 (예를 들면, Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 참조).

구체적으로는, 목적으로 하는 항체를 생산하는 하이브리도마와 항체를 생산하는 면역 세포, 예를 들면 감작 임파구 등을 암유전자 등에 의해 불사화시킨 세포에서 항체의 가변 영역 (V 영역)을 코드하는 mRNA를 단리한다. mRNA의 단리는, 공지의 방법, 예를 들면, 구아니딘 초원심법 (Chirgwin, J. M. 등, Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), AGPC법 (Chmczynski, P. 등, (1987) 162, 156-159) 등에 의해 전 RNA를 제조하고, mRNA Purification Kit (파마시아제) 등을 사용하여 mRNA를 제조한다. 또, QuickPrep mRNA Purification Kit (파마시아제)를 사용하는 것에 의해 mRNA를 직접 제조할 수 있다.

얻어진 mRNA에서 역전사 효소를 사용하고 항체 V 영역의 cDNA를 합성한다. cDNA의 합성은 AMV Reverse Transcriptase First-Strand cDNA Synthesis Kit 등을 사용하여 행할 수 있다. 또, cDNA의 합성 및 증폭을 행하는 것은 5'-Ampli FINDER RACE Kit (클론테크제) 및 PCR을 사용한 5'-RACE법 (Frohman, M. A. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. 등, Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) 을 사용할 수 있다. 얻어진 PCR 산물에서 목적으로 하는 DNA 단편을 정제하고, 벡터 DNA와 연결한다. 또한, 이것으로부터 재조합 벡터를 제조하고, 대장균 등에 도입하고 클론을 선택하여 소망의 재조합 벡터를 제조한다. 목적으로 하는 DNA 염기서열을 공지 방법, 예를 들면 디데옥시법에 의해 확인한다.

목적으로하는 항체의 V 영역을 코드하는 DNA가 얻어진다면, 이것을 소망의 항체 정상 영역 (C 영역)을 코드하는 DNA와 연결하고, 이것을 발현 벡터에 삽입한다. 또는, 항체의 V 영역을 코드하는 DNA를 항체 C 영역의 DNA를 함유하는 발현 벡터에 삽입하여도 좋다.

본 발명에서 사용되는 항체를 제조하는 것은 후술하는 바와 같이 항체 유전자를 발현 억제 영역, 예를 들면 인핸서 및/또는 프로모터의 제어 하에서 발현하도록 발현 벡터에 삽입한다. 이어서, 이 발현 벡터에 의해 숙주 세포를 형질전환하고, 항체를 발현시킬 수 있다.

항체 유전자의 발현은, 항체의 중쇄 (H 쇄) 또는 경쇄 (L 쇄)를 별개로 발현 벡터에 삽입하여 숙주를 동시형질전환시켜도 좋고, 또는 H 쇄 및 L 쇄를 코드하는 DNA를 단일의 발현 벡터에 삽입하여 숙주를 형질전환시켜도 좋다 (국제특허출원공개번호 WO 94-11523 참조).

5. 개변 항체

본 발명에서는 인간에 대한 이종 항원성을 저하시키는 것 등을 목적으로서 인위적으로 개변한 유전자 재조합형 항체, 예를 들면 키메라 항체, 인간형화 항체를 사용할 수 있다. 이들 개변 항체는 기지의 방법을 사용하여 제조할 수 있다.

키메라 항체는 상기와 같이 하여 얻어진 항체 V 영역을 코드하는 DNA를 인간 항체 C 영역을 코드하는 DNA와 연결하고, 이것을 발현 벡터에 삽입하고 숙주에 도입하여 생산시키는 것에 의해 얻어질 수 있다 (유럽특허출원공개번호 EP 125023, 국제특허출원공개번호 WO 92-19759 참고). 이 기지의 방법을 사용하여, 본 발명의 유용한 키메라 항체를 얻을 수 있다.

예를 들면, 키메라 PM-1 항체의 L 쇄 및 H 쇄의 V 영역을 코드하는 DNA를 함유하는 플라스미드는, 각각 pPM-k3 및 pPM-h1으로 명명되고, 이 플라스미드를 갖는 대장균은 내셔날 컬렉션스 오브 인더스트리얼 앤드 마린 박테리아 리미티드에 1991년 2월 12일에, 각각 NCIMB 40366, NCIMB40362로서 부다페스트 조약에 기하여 국제기탁되어 있다(국제특허출원공개번호 WO 92019759 참조).

인간형화 항체는 재구성 인간 항체로도 불리고, 인간 이외의 포유 동물, 예를 들면 마우스 항체의 상보성 결정 영역 (CDR)을 인간 항체의 CDR로 이식한 것이고, 그의 일반적인 유전자 재조합 수법도 알려져 있다 (유럽특허출원공개번호 EP 125023, 국제특허출원공개번호 WO 92-19759 참조).

구체적으로는, 마우스 항체의 CDR과 인간 항체의 프레임워크 영역 (FR)과 연결하도록 설계한 DNA 서열을, 말단부에 겹친 부분을 갖도록 제조한 수개의 올리고뉴클레오티드에서 PCR법에 의해 합성한다. 얻어진 DNA를 인간 항체 C 영역을 코드하는 DNA와 연결하고, 이어서 발현 벡터에 삽입하고, 이것을 숙주에 도입하여 생산된 것에 의해 얻어질 수 있다 (유럽특허출원공개번호 EP 239400, 국제특허출원공개번호 WO 92-19757 참조).

CDR을 매개로 연결되는 인간 항체의 FR은 CDR이 양호한 항원 결합부위를 형성하는 것으로 선택된다. 필요에 따라, 재구성 인간 항체의 CDR이 적절한 항원 결합 부위를 형성하도록 항체의 V 영역의 FR의 아미노산을 치환하여도 좋다 (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).

키메라 항체, 인간형화 항체에서는, 인간 항체 C 영역이 사용된다. 바람직하게는 인간 항체 C 영역으로서는, Cγ을 들 수 있고, 예를 들면 Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4를 사용할 수 있다. 또, 항체 또는 그의 생산의 안전성을 개선하기 위하여, 인간 항체 C 영역을 수식(修飾)하여도 좋다.

키메라 항체는 인간 이외의 포유 동물 항체 유래의 V 영역과 인간 항체 유래의 C 영역으로 이루어지고, 인간형화 항체는 인간 이외의 포유 동물 항체 유래의 CDR과 인간 항체 유래의 FR 및 C 영역으로 이루어지고, 인간 체내에서의 항원성이 저하하기 때문에, 본 발명의 치료제의 유효성분으로서 유용하다.

본 발명에 사용되는 인간형화 항체의 바람직한 구체적인 예로서는, 인간형화 PM-1 항체를 들 수 있다 (국제특허출원공개번호 WO 92-19759 참조).

6. 항체 단편 및 항체 수식물

본 발명에 사용되는 항체는 본 발명에 적합하게 사용되어 얻어질 수 있고, 항체 단편과 항체 수식물인 것이 좋다. 예를 들면, 항체 단편으로서는, Fab, F(ab')2, Fv 또는 단일쇄 Fv (scFv)를 들 수 있다. scFv는 H 쇄와 L 쇄의 Fv를 적당한 링커에 연결시킨 구조를 갖는다.

이들 항체 단편을 얻기 위해서는 항체를 효소, 예를 들면 파파인 또는 펩신으로 처리하여, 항체 단편을 생성시키거나, 또는 이들 항체 단편을 코드하는 유전자를 구축하고, 이것을 발현 벡터에 도입한 후, 적당한 숙주 세포에서 발현시킨다 (예를 들면, Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976, Better, M. ＆ Horwitz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Academic Press, Inc., Plueckthun, A. ＆ Skerra, A. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Academic Press, Inc., Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663, Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology (1989) 121, 663-669, Bird, R. E. et al., TIBTECH (1991) 9, 132-137 참조).

scFv는 항체의 H 쇄 V 영역과 L 쇄 V 영역을 연결하는 것에 의해 얻어진다 (국제특허출원공개번호 WO 88-09344 참조). 이 scFv에서의 H 쇄 V 영역과 L 쇄 V 영역은 링커, 바람직하게는, 펩티드 링커를 매개로 연결된다 (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883). scFv에서 H 쇄 V 영역 및 L 쇄 V 영역은 상기 항체로서 기재된 것 중 어느 하나에서 유래하여도 좋다. V 영역을 연결하는 펩티드 링커로서는, 예를 들면 아미드산 12 내지 19 잔기로 이루어진 임의의 일본쇄(一本鎖) 펩티드가 사용될 수 있다 (미국특허 US 525491 참조).

scFv를 코드하는 DNA는 상기 항체의 H 쇄 또는 H 쇄 V 영역을 코드하는 DNA, 및 L 쇄 또는 L 쇄 V 영역을 코드하는 DNA를 주형으로하고, 그들의 서열 중 소망의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 부분을, 그 양단을 규정하는 프라이머 쌍을 사용하여 PCR법에 의해 증폭하고, 이어서 추가로 펩티드 링커 부분을 코드하는 DNA 및 그의 양단을 각각 H 쇄, L 쇄와 연결되도록 규정하는 프라이머 쌍을 삽입시켜 증폭하는 것에 의해 얻어진다.

또, 일단 scFv를 코드하는 DNA가 제조되면, 그들을 함유하는 발현 벡터, 및 이 발현 벡터에 의해 형질전환된 숙주를 통상적인 방법에 따라서 얻을 수 있다. 또, 그 숙주를 사용하여 통상적인 방법에 따라서, scFv를 얻을 수 있다.

이들 항체 단편은, 상기와 같은 그 유전자를 취득하고 발현시켜서, 숙주에 의해 생산될 수 있다. 본원 특허청구범위에서 『항체』는 이들의 항체 단편도 포함된다.

항체 수식물로서는, 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 등의 각종 분자와 결합한 항체를 사용할 수 있다. 본원 특허청구범위에서 『항체』는 이들의 항체 수식물도 포함된다. 이와 같은 항체 수식물을 얻는 것은, 얻어진 항체에 화학적인 수식을 시행하는 것에 의해 얻어질 수 있다. 이들 방법은 이 분야에서 이미 확립되어 있다.

7. 발현 및 생산

상기와 같이 구축한 항체 유전자는 공지의 방법에 의해 발현시켜 항체를 취득할 수 있다. 포유류 세포를 사용하는 경우, 사용되는 유용한 프로모터/인핸서, 발현되는 항체 유전자, 그의 3'측 하류에 폴리A 시그날을 기능적으로 결합시킨 DNA 또는 그것을 함유하는 벡터에 의해 발현시킬 수 있다. 예를 들면 프로모터/인핸서로서는, 인간 세포 확대 바이러스 전기 프로모터/인핸서를 들수 있다.

또, 그 외에 본 발명에 사용된 항체 발현에 사용될 수 있는 프로모터/인핸서로서는 레트로바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 및 시미안 바이러스 40 (SV 40) 등의 바이러스 프로모터/인핸서와 인간 연장 인자 (human elongation fator 1α) (HEF1α) 등의 포유류 세포 유래의 프로모터/인핸서를 사용한다면 좋다.

예를 들면, SV 40 프로모터/인핸서를 사용하는 경우, Mulligan 등의 방법 (Nature (1979) 277, 108), 또 HEF1α 프로모터/인핸서를 사용하는 경우, Mizushima 등의 방법 (Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322)에 따라서 용이하게 실시될 수 있다.

대장균의 경우, 상용되는 유용한 프로모터, 항체 분비를 위한 시그날 서열, 발현시킨 항체 유전자를 기능적으로 결합시키고 발현시킬 수 있다. 예를 들면 프로모터로서는, lacZ 프로모터, araB 프로모터를 들 수 있다. lacZ 프로모터를 사용하는 경우, Ward 등의 방법 (Nature (1098) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), araB 프로모터를 사용하는 경우, Better 등의 방법 (Science (1988) 240, 1041-1043) 에 따른다면 좋다.

항체 분비를 위한 시그날 배열로서는, 대장균의 페리플라즘에서 생산시키는 경우, pe1B 시그날 서열 (Lei, S. P. et al., Bacteriol. (1987) 169, 4379)을 사용한다면 좋다. 페리플리즘에서 생산된 항체를 분리한 후, 항체의 구조를 적절하게 리폴드 (refold) 하여 사용한다 (예를 들면, 국제특허출원공개번호 WO 96-30394, 일본특허출원공고특공평7-93879 참조).

복제기원으로서는 SV 40, 폴리오마 바이러스, 아데노바이로스, 소 유두종 바이러스 (BPV) 등의 유래의 것을 사용할 수 있다. 또한, 숙주 세포계에서 유전자 카피수 증폭을 위하여, 발현 벡터는 선택 마커로서, 아미노글리코시드 전이효소 (APH) 유전자, 티미딘 키나아제 (TK) 유전자, 대장균 크산틴 구아닌포스포리보실 전이효소 (Ecogpt) 유전자, 디히드로 엽산 환원 효소 (dhfr) 유전자 등을 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 항체의 제조를 위하여, 임의의 생산계를 사용할 수 있다. 항체 제조를 위한 생산계는 시험관 내 및 생체 내의 생산계가 있다. 시험관 내의 생산계로서는, 진핵 세포를 사용하는 생산계와 원핵 세포를 사용하는 생산계를 들 수 있다.

진핵 세포를 사용하는 경우, 동물 세포, 식물 세포, 진균 세포를 사용하는 생산계가 있다. 동물 세포로서는 (1) 포유류 세포, 예를 들면 CHO (J. Exp. Med. (1995) 108, 945), COD, 골수종, BHK (baby hamster kindey), HeLa, Vero, (2) 양서류 세포, 예를 들면 발톱 개구리속의 각종 개구리의 난모 세포 (Valle, et al., Nature (1981) 291, 358-340), 또는 (3) 곤충 세포, 예를 들면 sf9, sf21, Tn5가 알려져 있다. CHO 세포로서는, 특히 DHFR 유전자에 결합이 있는 CHO 세포인 dhfr-CHO (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220)와 CHO K-1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275)를 적당하게 사용할 수 있다.

식물 세포로서는, 니코티나 타바쿰 (Nicotina tabacum) 유래의 세포가 알려져 있고, 이것을 유합 조직 배양하면 좋다. 진균 세포로서는 효모, 예를 들면 사카로미세스 (Saccharomyces) 속, 예를 들면 사카로미세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae) 속, 사상균, 예를 들면 아스페르길러스 (Aspergillus) 속, 예를 들면 아스페르길러스 니거 (Aspergillus niger) 등이 알려져 있다.

원핵 세포를 사용하는 경우, 세균 세포를 사용하는 생산계가 있다. 세균 세포로서는 대장균, 고초균(枯草菌)이 알려져 있다.

이들 세포에서, 목적하는 항체 유전자를 형질전환에 의해 도입하고, 형질전환된 세포를 시험관 내에서 배양하는 것에 의해 항체가 얻어진다. 배양은 공지의 방법에 따라서 행한다. 예를 들면, 배양액으로서 DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM을 사용할 수 있다. 그때, 소태아 혈청 (FCS) 등의 혈청 보액을 병용할 수 있고, 무혈청 배양을 해도 좋다. 또, 항체 유전자를 도입한 세포를 동물의 복강 등에 이식하는 것에 의해, 생체 내에서 항체를 생산하여도 좋다.

한편, 생체 내의 생산계로서는, 동물을 사용하는 생산계와 식물을 사용하는 생산계를 들 수 있다. 이들 동물 또는 식물에 항체 유전자를 도입하고, 동물 또는 식물 체내에서 항체를 생산시켜, 회수한다.

동물을 사용하는 경우, 포유류 동물, 곤충을 사용하는 생산계가 있다.

포유류 동물로서는, 염소, 돼지, 양, 마우스 및 소를 사용할 수 있다 (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). 또, 포유류 동물을 사용하는 경우, 트랜스제닉 동물을 사용할 수 있다.

예를 들면, 항체 유전자를 염소 β 카세인과 같은 우유 중에 고유하게 생산되는 단백질을 코드하는 유전자 중간에 삽입하여 융합 유전자로서 제조한다. 항체 유전자가 삽입된 융합 유전자를 함유하는 DNA 단편을 염소의 태아에 주입하고, 이 태아를 암염소에 도입한다. 태아를 수용한 염소에서 태어난 트랜스제닉 염소 또는 그의 손자가 생산하는 우유에서 소망의 항체를 얻는다. 트랜스제닉 염소에서 생산된 소망의 항체를 함유하는 우유 양을 증가시키기 위하여, 적당한 호르몬을 트랜스제닉 염소에 사용하여도 좋다 (Ebert, K. M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702).

또, 곤충으로서는 예를 들면 누에를 사용할 수 있다. 누에를 사용하는 경우, 목적의 항체 유전자를 삽입한 벡큘로 바이러스를 누에에 감염시키고, 이 누에의 체액으로부터 항체를 얻는다 (Susumu, M. et al., Nature (1985) 315, 592-594).

또한 식물을 사용하는 경우, 예를 들면 담배 식물를 사용할 수 있다. 담배 식물를 사용하는 경우, 목적의 항체 유전자를 식물 발현용 벡터, 예를 들면 pMON 530에 삽입하고, 이 벡터를 아가로박테리움 투메파코엔스 (Agrobacterium tumefacoens)와 같은 박테리아에 도입한다. 이 박테리아를 담배 식물, 예를 들면 니코티아나 타바쿰 (Nicotiana tabacum)에 감염시키고, 본 담배 식물의 잎으로부터 소망의 항체를 얻는다 (Julian, K. -C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138).

상기와 같은 시험관 내 또는 생체 내의 생산계에서 항체를 생산하는 경우, 항체의 H 쇄 또는 L 쇄를 코드하는 DNA를 각각의 발현 벡터에 융합시키고, 숙주를 동시 형질전환시켜도 좋고, 또는 H쇄 및 L쇄를 코드하는 DNA를 단일의 발현 벡터에 삽입하고, 숙주를 형질전환시켜도 좋다 (국제특허출원공개번호 WO 94-11523 참조).

숙주에서의 발현 벡터의 도입 방법으로서는, 공지의 방법, 예를 들면 인산 칼슘법 (Virology (1973) 52, 456-467)과 일렉트로폴레이션 (electropolation) 법 (EMBO J. (1982) 1, 841-845) 등이 사용될 수 있다.

8. 항체의 분리, 정제

상기와 같이 생산, 발현된 항체는, 세포내외, 숙주에서 분리하여 균일하게 정제될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 항체의 분리, 정제는 통상의 단백질 정제에서 사용되고 있는 분리, 정제 방법을 사용한다면 좋고, 어떤 한정이 되어 있는 것은 아니다. 예를 들면, 친화 크로마토그래피 등의 크로마토그래피 컬럼, 여과, 한외여과, 염석, 투석 등을 적당하게 선택하고, 조합한다면 항체를 분리, 정제할 수 있다 (Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).

친화 크로마토그래피에 사용하는 컬럼으로서는 예를 들면 프로테인 A 컬럼, 프로테인 G 컬럼을 들 수 있다. 프로테인 A 컬럼에 사용하는 담체로서는, 예를 들면 Hyper D, POROS, Sepharose F.F.(파마시아제) 등을 들 수 있다.

친화 크로마토그래피 이외의 크로마토그래피로서는, 예를 들면 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔여과, 역상 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피 등을 들 수 있다 (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996).

이들의 크로마토그래피는, 액상 크로마토그래피, 예를 들면 HPLC, FPLC 등의 액상 크로마토그래피를 사용하여 행할 수 있다.

9. 항체의 농도 측정

얻어진 항체의 농도 측정은, 흡광도의 측정 또는 효소 결합 면역 흡착 검정법 (enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA) 등에 의해 행하여 질 수 있다. 즉, 흡광도를 측정하는 경우에는, 얻어진 항체를 PBS로 적당하게 희석한 후, 280nm에서 흡광도를 측정한다. 예를 들면, 인간 항체의 경우, 1㎎/㎖를 1.35OD로서 산출한다면 좋다.

또, ELISA에 의한 경우에는 다음과 같이 측정할 수 있다. 즉, 0.1M 중탄산 완충액 (pH 9.6) 에서 1㎎/㎖로 희석한 염소 항 인간 IgG (타고제) 100㎖를 96웰 플레이트 (눈크제) 에 첨가하고, 4℃에서 철야로 배양하고, 항체를 고층화(固層化)한다. 블로킹 후, 적당하게 희석한 본 발명에서 사용되는 항체 또는 항체를 함유하는 샘플, 또는 농도 표준품으로서 기지 농도의 인간 IgG (캐피얼제) 100㎖를 첨가하고, 실온에서 1 시간 배양한다.

세정 후, 5000배 희석한 알칼리 포스파타아제 표지 인간 IgG (바이오 소스제) 100㎖를 첨가하고, 실온에서 1시간 배양한다. 세정 후, 기질 용액을 첨가하여 배양한 후, MICROPLATE READER Model 3550 (바이오래드제) 를 사용하여 450nm에서의 흡광도를 측정하고, 목적 항체의 농도를 산출한다.

또, 항체의 농도측정에서는, BIAcore (파마시아제)를 사용할 수 있다.

10. 항체 활성의 확인

본 발명에서 사용되는 항 IL-6 수용체 항체의 항원 결합 활성, 결합 저해 활성, 중화 활성의 평가는, 통상 알려진 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, IL-6 반응성 세포, 예를 들면 MH60.BSF2를 배양한 플레이트에 IL-6를 첨가한다. 그래서 항 IL-6 수용체 항체를 공존시키는 것에 의해 IL-6 반응성 세포의³H 표지 티미딘 병합을 지표로서 평가한다면 좋다.

또, IL-6 수용체 발현 세포, 예를 들면 U266을 배양한 플레이트에 항 IL-6 수용체 항체와¹²⁵I 표지 IL-6를 첨가한다. 그리하여, IL-6 수용체 발현 세포에 결합한¹²⁵I 표지 IL-6를 측정하는 것에 의해 평가한다면 좋다 (Antibodies:A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Labaratory, 1988).

또, 본 발명에 사용되는 항 IL-6 수용체 항체의 항원 결합 활성을 측정하는 방법으로서, ELISA, EIA (효소 면역 측정법), RIA (방사 면역 측정법) 또는 형광 항체법을 사용할 수 있다.

예를 들면, ELISA를 사용하는 경우, IL-6 수용체 항체에 대한 항체, 예를 들면 그의 C 영역에 대한 항체를 고상화(固相化)한 96웰 플레이트에 IL-6 수용체를 첨가하고, 이어서 목적의 항 IL-6 수용체 항체를 함유하는 시료, 예를 들면 항 IL-6 수용체 항체 생산 세포의 배양 상청과 정제 항체를 첨가한다.

알칼리 포스파타아제 등의 효소로 표지한 목적 항 IL-6 수용체 항체를 인식하는 이차 항체를 첨가하고, 플레이트를 배양 및 세정한 후, p-니트로페닐 인산 등의 효소 기질을 첨가하여 흡광도를 측정하는 것에 의해 항원 결합 활성을 평가할 수 있다. IL-6 수용체 항체로서, 가용성 IL-6 수용체를 사용하여도 좋다.

본 발명에 사용되는 항 IL-6 수용체 항체의 리간드 수용체 결합 저해 활성을 측정하는 방법으로서는, 통상의 Cell ELISA, 또는 리간드 수용체 결합 에세이를 사용할 수 있다.

예를 들면, Cell ELISA의 경우, IL-6 수용체를 발현하는 세포를 96웰 플레이트에 배양하고 접착시켜, 파라포름알데히드 등으로 고정화한다. 또는, IL-6 수용체를 발현하는 세포의 막분획을 제조하고 고정화한 96웰 플레이트를 제조한다. 이 플레이트에 목적의 항 IL-6 수용체 항체를 함유하는 시료, 예를 들면 항 IL-6 수용체 항체 생산 세포의 배양 상청과 정제 항체를 방사성 동위 원소, 예를 들면¹²⁵I 등으로 표지한 IL-6를 첨가한다.

플레이트를 배양 및 세정 한 후, 방사 활성을 측정하는 것으로 IL-6 수용체에 결합한 IL-6 양을 측정할 수 있고, 항 IL-6 수용체 항체의 리간드 수용체 결합 저해 활성을 평가할 수 있다.

예를 들면, 세포 상의 IL-6 수용체에 대한 IL-6 결합 저해 에세이에서는 IL-6 수용체를 발현하는 세포를 원심분리 등의 수단으로 분리한 후, 세포 현탁액으로서 제조한다. 방사선 동위원소, 예를 들면¹²⁵I 등으로 표지한 IL-6의 용액 또는 비표지 IL-6와 표지 IL-6 혼합 용액과 농도 제조한 항 IL-6 수용체 항체를 함유하는 용액을 세포 현탁액에 첨가한다. 일정 기간 후, 세포를 분리하고, 세포 위에 결합한 표지 IL-6 방사 활성을 측정하면 좋다.

상기 항체의 활성 평가에서는, BIAcore (파마시아제) 를 사용할 수 있다.

11. 치료 효과의 확인

본 발명의 예방 및/또는 치료제의 치료 대상 환자는, 전신성 홍반성 낭창이다. 본 발명에 의해 달성되는 효과를 확인하는 것은, 항 IL-6 수용체 항체를 인간의 전신성 홍반성 낭창의 병인을 나타내는 모델 동물에 투여하는 것에 의해 효과를 확인할 수 있다.

사용되는 모델 동물로서는, 인간의 전신성 홍반성 낭창의 병인을 가장 잘 나타내는 모델 동물이 사용된다. 인간의 전신성 홍반성 낭창의 병인을 가장 잘 나타내는 모델 동물은 NZB/WF1 마우스이다. NZB/WF1 마우스는 이미 알려져 있고, 입수가능한 모델 동물이다.

전신성 홍반성 낭창은 항핵 항체 또는 항 DNA 항체와 그의 면역 복합체가 각종 장기·조직에 침착하는 것에 의해 염증 반응이 유도되어 생기는 전신성의 자기면역 질환이다. 항핵 세포 또는 항 DNA 항체와 그의 면역 복합체가 신사구체에 침착하면 자기면역성의 루프스 신염이 발증한다. 전신성 홍반성 낭창에서는 혈중 IL-6의 증가를 나타내는 환자는 거의 없고, IL-6의 병인에서의 관련은 부정적이다 (Peterson, E. et al., Lupus. (1996) 5, 571-576).

IL-6는 신사구체에 존재하는 메센지움 세포에 직접 작용하고, 메센지움 세포를 증식시키는 것에 의해 사구체 신염을 유도하는 것이 보고되어 있다 (Suematsu, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86, 7547-7551). 루프스 신염은 사구체에 IgG 클래스의 항핵 항체 또는 항 DNA 항체와 그의 면역 복합체가 침착하고, 사구체에서 염증 반응이 유도되는 것에 의해 사구체가 상해를 받아서 신염을 발증하는 것으로부터, 발증 메카니즘에서의 IL-6에 의해 유도되는 메센지움 증식성 사구체 신염과 구별된다.

후술하는 실시예에 나타낸 바와 같이, NZB/WF1 마우스에 항 IL-6 수용체 항체를 투여하는 것에 의해, IgG 클래스의 항 DNA 항체의 제어 및 요단백질의 누출 억제가 확인되었다. NZB/WF1 마우스는 인간 전신성 홍반성 낭창의 병인을 가장 잘 반영하고 있는 모델 동물인 것으로부터, 항 IL-6 수용체 항체는 전신성 홍반성 낭창에 대하여 치료 효과를 갖는 것을 나타내었다.

따라서, 본 발명의 예방 및/또는 치료제는 전신성 홍반성 낭창의 예방 및/또는 치료제로서 유용하다. 또, 본 발명의 예방 및/또는 치료제는, 전신성 홍반성 낭창에서의 항 DNA 항체를 감소시키기 위한 예방 및/또는 치료제 및 전신성 홍반성 낭창에서 요단백질 누출을 감소시키기 위한 예방 및/또는 치료제로서 유용하다.

12. 투여 경로 및 제제

본 발명의 예방 및/또는 치료제는 경구적 또는 비경구적으로 전신 또는 국소적으로 투여할 수 있다. 비경구적 투여로서는, 예를 들면 점적 주입 등의 정맥 내 주사, 근육 내 주사, 복강 내 주사, 피하 주사를 선택할 수 있고, 환자의 연령, 증상에 의해 적절한 투여 방법을 선택할 수 있다.

본 발명의 예방 및/또는 치료제는 병으로 이미 시달리는 환자에게, 병의 증상을 치유하거나, 또는 적어도 부분적으로 저지하기 위한 충분한 양으로 투여된다. 예를 들면, 유효 투여량은 일회 투여에 체중 1㎏ 당 0.01 내지 100㎎의 범위로 선택된다. 또는 환자 당 1 내지 1000㎎, 바람직하게는 5 내지 50㎎의 투여량을 선택할 수 있다. 그러나, 본 발명의 예방 및/또는 치료제는 이들 투여량에 제한되는 것은 아니다.

투여 기간은, 전신성 홍반성 낭창이 생 길때부터 투여되어도 좋고, 또는 전신성 홍반성 낭창의 발증이 예측되는 때에 발증 시의 증상 완화를 위하여 예방적으로 투여되어도 좋다.

또, 투여 기간은 환자의 연령, 증상에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 예방 및/또는 치료제는 투여 경로에 따라서 약학적으로 허용가능한 담체와 첨가물을 함께 함유하는 것이어도 좋다. 이와 같은 담체 및 첨가물의 예로서는 물, 약학적으로 허용가능한 유기용매, 콜라겐, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐피롤리돈, 카르복실비닐 폴리머, 카르복시메틸 셀룰로스 나트륨, 폴라아크릴산 나트륨, 알긴산 나트륨, 수용성 덱스트란, 카르복실메틸 스타치 나트륨, 펙틴, 메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 크산단검, 아라비아검, 카세인, 젤라틴, 한천, 디글리세린, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 바세린, 파라핀, 스테아릴 알코올, 스테아린산, 인간 형청 알부민(HSA), 만니톨, 소르비톨, 락토스, 약학 첨가물로서는 허용되는 계면활성제 등을 들 수 있다. 사용되는 첨가물은 제형에 따라서 상기 중에서 적절하게 또는 조합시켜 선택되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

실시예

이하, 실시예, 참고예 및 실험예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

참고예 1. 인간 가용성 IL-6 수용체의 제조

Yamasaki 등의 방법 (Science (1988) 241, 825-828)에 따라 얻어진 IL-6 수용체를 코드하는 cDNA를 함유하는 플라스미드 pBSF2R.236을 사용하고, PCR법에 의해 가용성 IL-6 수용체를 제조하였다. 플라스미드 pBSF2R.236을 제한 효소 SphⅠ으로 소화하고, IL-6 수용체 cDNA를 얻고, 이것을 mp18 (아머샴제)에 삽입하였다. IL-6 수용체 cDNA에 종료 코돈을 도입하도록 고안한 합성 올리고 프라이머를 사용하고, 시험관 내 돌연변이 유발 시스템 (아머샴제)에 의해 PCR법으로 IL-6 수용체 cDNA에 변이를 도입하였다. 이 조작에 의해 종료 코돈이 아미노산 345의 위치에 도입되고, 가용성 IL-6 수용체를 코드하는 cDNA가 얻어졌다.

가용성 IL-6 수용체 cDNA를 CHO 세포에서 발현하기 위하여, 플라스미드 pSV (파마시아제)와 연결시키고, 플라스미드 pSVL344를 얻었다. dhfr의 cDNA를 함유하는 플라스미드 pECEdhfr에 HindⅢ-SalⅠ으로 절단한 가용성 IL-6 수용체 cDNA를 삽입하고, CHO 세포 발현 플라스미드 pECEdhfr344를 얻었다.

10㎍의 플라스미드 pECEdhfr344를 dhfr-CHO 세포주 DXB-11 (Urland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220)에서 칼슘 포스페이트 침강법 (Chen et al., Mol. Cell. Biol. (1987) 7, 2745-2751)에 의해, 트랜스펙트하였다. 트랜스펙트 한 CHO 세포를 1mM 글루타민, 10% 투석 FCS, 100U/㎖의 페니실린 및 100㎍/㎖의 스트렙토마이신을 함유하는 뉴클레오시드 유리-αMEM 선택 배양액에서 3시간 배양하였다.

선택된 CHO 세포를 한계 희석법으로 스크린하고, 단일 CHO 세포 클론을 얻었다. 이 CHO 세포 클론을 20nM 내지 200nM의 농도의 메토트렉세이트 (MTX)에서 증폭하고, 인간 가용성 IL-6 수용체 생산 CHO 세포주 5E27을 얻었다. CHO 세포주 5E27을 5% FBS를 함유하는 인스코브 개량 듈벡코 배양액 (IMDM, 지브코제)에서 배양하였다. 배양 상청을 회수하고, 배양 상청 중의 가용성 IL-6 수용체의 농도를 ELISA에서 측정하였다.

참고예 2. 항 인간 IL-6 수용체 항체의 제조

Hirata 등의 방법 (J. Immunol., 143:2900-2906, 1989)에 의해 제조한 항 IL-6 항체 MT18을 CNBr에 의해 활성화 시킨 세파로스 4B (파마시아 파인 케미칼스제, Piscataway, NJ)와 첨부의 처방에 따라 결합시키고, IL-6 수용체 (Science (1988) 241, 825-828)를 정제하였다. 인간 골수종 세포주 U266DMF 1% 디지토닝 (와코 케미칼스제), 10mM 트리에탄올아민 (pH 7.8) 및 0.15M NaCl을 함유하는 1mM p-파라-아미노페닐 메탄 술포닐 플루오리드 히드로클로리드 (와코 케미칼스제) (디지토닌 완충액)에서 가용화하고, 세파로스 4B 비드와 결합시킨 MT18 항체와 혼합하였다. 그 후, 비드를 디지토닌 완충액으로 6회 세정하고, 면역하기 위한 부분 정제 IL-6 수용체로 하였다.

BALB/c 마우스를 3×10⁹개의 U266 세포에서 얻은 상기 부분 정제 IL-6 수용체에서 10일 간격으로 4회 면역하고, 그 후 통상적인 방법에 의해 하이브리도마를 제조하였다. 성장양성혈에서의 하이브리도마 배양 상청을 다음의 방법으로 IL-6 수용체에서의 결합 활성을 조사하였다. 5×10⁷개의 U266 세포를³⁵S-메티오닌 (2.5mCi)으로 표지하고, 상기 디지토닌 완충액으로 가용화하였다. 가용화 한 U266 세포를 0.04㎖ 용량의 세파로스 4B 비드와 결합시킨 MT18 항체와 혼합하고, 그 후 디지토닌 완충액으로 6회 세정하고, 0.25㎖의 디지토닌 완충액 (pH 3.4)에 의해³⁵S-메티오닌 표지 IL-6 수용체를 유출시키고, 0.025㎖의 1M Tris (pH 7.4)에서 중화하였다.

0.05㎖의 하이브리도마 배양 상청을 0.01㎖의 프로테인 G 세파로스 (파마시아제)와 혼합하였다. 세정한 후, 세파로스를 상기에서 제조한 0.005㎖의³⁵S-메티오닌 표지 IL-6 수용체 용액과 함께 배양하였다. 면역 침강 물질을 SDS-PAGE에서 분석하고, IL-6 수용체와 반응하는 하이브리도마 배양 상청을 조사하였다. 그 결과, 반응양성 하이브리도마 클론 PM-1을 수립하였다. 하이브리도마 PM-1에서 생산된 항체는 IgG1κ형의 서브타입을 갖는다.

하이브리도마 PM-1을 생산하는 항체의 인간 IL-6 수용체에 대한 IL-6의 결합 저해 활성을 인간 골수종 세포주 U266을 사용하여 조사하였다. 인간 재조합형 IL-6를 대장균으로부터 제조한다 (Hirano 등, Immunol. Lett. (1988) 17, 41). 볼튼-헌터 시약 (뉴 잉글랜드 뉴클레어제, Boston, MA)에 의해¹²⁵I 표지하였다 (Taga, T. et al., J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981). 4×10⁵개의 U266 세포를 100배량의 과량의 비표지 IL-6의 존재 하에서 실온으로 1시간, 70%(v/v)의 하이브리도마 PM-1 배양 상청을 14000cpm의¹²⁵I 표지 IL-6와 함께 배양하였다. 70㎕의 샘플을 400㎕ 마이크로퓨지 폴리에틸렌 튜브에 300㎕의 FCS 위에 적층하고, 원심한 후, 세포 상의 방사 활성을 측정하였다.

그 결과, 하이브리도마 PM-1이 생산하는 항체는, IL-6의 IL-6 수용체에 대한결합을 저해하는 것이 명백하게 되었다.

참고예 3. 항 마우스 IL-6 수용체 항체의 제조

Saito, et al., J. Immunol. (1993) 147, 168-173에 기재한 방법에 의해, 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체를 제조하였다.

마우스 가용성 IL-6 수용체를 생산하는 CHO 세포를 10% FCS를 함유하는 IMDM 배양액에서 배양하고, 그 배양 상청으로부터 마우스 가용성 IL-6 수용체 RS12 (상기 Saito, et al. 참조)와 Affigel 10 겔 (바이오래드제)에 고정한 친화 컬럼을 사용하여 마우스 가용성 IL-6 수용체를 제조하였다.

얻어진 마우스 가용성 IL-6 수용체 50㎍를 프로인트 완전 보조제와 혼합하고, 위스터 랫 (일본 칼스 리버제)의 복부에 주사하였다. 2주간 후부터는 프로인트 불완전 보조제에서 추가 면역하였다. 45일째에 랫을 희생시키고, 그 비장 세포 약 2×10⁸개를 1×10⁷개의 마우스 골수종 세포 P3U1과 50%의 PEG1500 (베린거 만헤임제) 를 사용하여 통상적인 방법에 의해 세포 융합 시킨 후, HAT 배지에서 하이브리도마를 스크린하였다.

토키 항 랫 IgG 항체 (케필제)를 코팅한 플레이트에 하이브리도마 배양 상청을 첨가한 후, 마우스 가용성 IL-6 수용체를 반응시켰다. 이어서, 토끼 항 마우스 IL-6 수용체 항체 및 알칼리 포스파타아제 표지 양 항 토끼 IgG에 의한 ELISA 방법에 의해 마우스 가용성 IL-6 수용체에 대한 항체를 생산하는 하이브리도마를 스크린하였다. 항체 생산이 확인된 하이브리도마 클론은 2회의 서브스크린을 행하여, 단일의 하이브리도마 클론을 얻었다. 이 클론을 MR16-1으로 명명하였다.

이 하이브리도마가 생산하는 항체의 마우스 IL-6의 정보전달에서의 중화 활성을 MH60.BSF2 세포 (Matsuda et al., J. Immunol. (1988) 18, 951-956)를 사용한³H 표지 티아민 병합에 의해 조사하였다. 96웰 플레이트에 MH60.BSF2세포를 1×10⁴개/200㎕/웰이 되도록 제조하였다. 이 플레이트에 10pg/㎖의 마우스 IL-6와 MR16-1 항체 또는 RS12항체를 12.3 내지 1000ng/㎖를 첨가하고 37℃, 5% CO₂에서 44시간 배양한 후, 1μCi/웰의³H 티아민을 첨가하였다. 4시간 후에³H 표지 티아민의 병합을 측정하였다. 그 결과 MR16-1 항체는 MH60.BSF2 세포의³H 표지 티아민 병합을 억제하였다.

따라서, 하이브리도마 MR16-1이 생산하는 항체는, IL-6의 IL-6 수용체에 대한 결합을 저해하는 것이 명백하게 되었다.

참고예 4. 인간형화 PM-1 항체의 제조

인간형화 PM-1 항체를 국제출원공개번호 WO 92-19759에 기재된 방법에 의해 얻었다. 참고예 2에서 제조된 하이브리도마 PM-1로부터 통상적인 방법에 의해 전 RNA를 제조하고, 이것으로부터 일본쇄 cDNA의 합성을 행하였다. 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 법에 의해 마우스 PM-1 항체의 가변 영역 (V 영역)을 코드하는 DNA를 증폭하였다. PCR법에는 Jones, S. T. et al., Bio/Technology (1991) 9, 88-89에 기재된 프라이머를 사용하였다.

PCR법에 의해 증폭한 DNA 단편을 정제하고, 마우스 κ 형 L 쇄 V 영역을 코드하는 유전자를 함유하는 DNA 단편 및 마우스 γ 형 H 쇄 V 영역을 코드하는 유전자를 함유하는 DNA 단편을 얻었다. 이들 DNA 단편을 플라스미드 pUC19에 연결하고, 대장균 DH5α의 수용성 세포 (competent cell)에 도입하여 대장균 형질전환체를 얻었다. 이 형질전환체에서 상기 플라스미드를 얻고, 플라스미드 중의 cDNA 코드 영역의 염기서열을 통상적인 방법에 따라서 결정하고, 또한 각 V 영역의 상보성 결정 영역 (CDR) 을 결정하였다.

키메라 PM-1 항체를 발현하는 벡터를 제조하기 위하여, 마우스 PM-1 항체의 κ 형 L 쇄 및 H 쇄의 각각 V 영역을 코드하는 cDNA를 HCMV 발현 벡터에 삽입하였다. 생산된 키메라 PM-1 항체가 정확한 항원 결합성을 갖는 것을 확인 한 후, CDR-이식법에 의해 인간형화 PM-1 항체를 제조하였다. 프레임 영역 (FR)의 아미노산을 치환하고, 키메라 항체와 같은 정도의 항원 결합 활성을 갖는 인간형화 PM-1 항체를 제조하였다.

얻어진 인간형화 PM-1 항체의 L 쇄 및 H 쇄를 코드하는 유전자를 포유류 세포 중에서 발현시키기 위해, 각각을 인간 연장 인자 1α (human elongation factor 1α; HEF-1α) 프로모터를 함유하는 벡터에 도입하였다. 이들 발현 벡터에서 CHO 세포를 동시형질전환하는 것에 의해, 인간형화 PM-1 항체를 생산하는 CHO 세포주를 수립하였다. 얻어진 인간형화 PM-1 항체가 인간 IL-6 수용체에서의 항원 결합성을 갖는 것을 ELISA에 의해 확인하였다. 또한, 인간형화 PM-1 항체는 마우스 PM-1 항체 및 키메라 PM-1 항체와 같은 정도로, 인간 IL-6의 인간 IL-6 수용체에서의 결합을 저해하였다.

실시예 1

MR-1 및 KH-5 (항 DNP-KLH 항체)는 랫의 IgG이고, 마우스에 연속 투여하면 랫 IgG에 대한 항체의 생산과 쇼크 증상을 일으킬 수 있는 가능성이 있다. 그러므로, MR16-1과 KH-5의 투여를 개시하시 전에, 이들 항체에 대한 면역 관성을 Finck, B.K. et al., J. Clin. Invest. (1994) 94, 585-591에 기재되어 있는 방법을 사용하여 유도하였다.

즉, 13 주령의 암컷 NZB/WF1 마우스 (일군 10마리(단 비히클 투여 9마리)) 에 항 CD4 항체 (GK1.5) 1㎎을 3일간 연속해서 복강 내 투여하고, 0.5㎎의 MR16-1 또는 KH-5를 2회째의 항 CD4 항체의 투여와 동시에 복강 내에 투여하였다. 그 후, MR16-1 (0.5㎎), 대조 항체로서는 동량의 KH-5 및 비히클·대조로서는 식염수를 주 1회, 64 주령까지 복강 내 투여하고, 요단백질 배설량 및 혈중 항 DNA 항체량을 정기적으로 측정하였다.

또, 혈중 면역 글로블린양에 대해서도 측정하였다. 요단백질 양의 측정은 콤비스틱지 (Combisticks paper) (산쿄제)를 사용하여 행하였고, 단백질 양이 100㎎/㎗을 초과한 개체를 양성으로 하였다. 결과는 도 1에 나타냈다. 또한 생존일수에 대해서도 관찰하였다. 결과를 도 2에 나타냈다. 혈중의 항 DNA 항체 양은 ELISA법에 의해 측정하였다. 결과(평균±표준오차)를 도 3에 나타냈다. 혈중의 면역 글로블린양은 방사 면역 확산법으로 측정하였다. 결과(평균±표준오차)를 표 1에 나타냈다.

표 1은 혈중의 면역 글로블린양에 미치는 MR-1의 효과를 나타낸다. 표 중, IgG 서브클래스, IgM와 IgA에 대한 결과는 32 주령 시의 것이다.

즉, 비히클 투여군에서는 28 주령부터, KH-5 투여군에서는 38 주령부터 요단백질의 배설이 관찰되었고, 실험 종료의 64 주령에서는 비히클 투여군에서는 전예의 마우스가, 또는 KH-5 투여군에서는 90%의 마우스가 양성으로 되었던 것에 대하여, MR16-1 투여군에서는 요단백질의 출현 시기가 현저하게 연장되고, 발증률도 현저하게 억제되었다.

생존일수에서도 MR16-1은 명백하게 생존일수를 연장하고, 64 주령까지 1마리가 사망하였을 뿐이다. 또, 항 DNA 항체양에서는, MR16-1 투여군에서는 IgG 클래스의 항 DNA 항체의 생산이 현저하게 억제되었지만, IgM 클래스의 항체에서 영향이 발견되지 않았다. 혈중의 면역 글로블린양에서는, MR16-1 투여군에서는 IgG1, IgG2 및 IgG3 양이 감소하였지만, IgM 및 IgA 양에서는 영향이 발견되지 않았다.

이상의 성적에서, 항 IL-6 수용체 항체는 전신성 홍방성 낭창의 예방 및/또는 치료제로서 유용한 것이 명백하게 되었다.

IL-6의 생물학적 활성을 저해하는 것은, 항 IL-6 항체와 IL-6 수용체 항체를 사용하는 것이 고려될 수 있지만, 전신성 홍반성 낭창에서의 항 IL-6 수용체 항체는 항 IL-6 항체에 비하여, 치료 효과가 강한 것으로 고려된다.

본 발명에서의 항 IL-6 수용체 항체를 사용한 경우, 한마리의 마우스를 제외하고는 신염의 발증이 완전히 발견되지 않은 것에 대하여, Finck, B. K. et al., J. Clin. Invest. (1994) 94, 585-591의 실험에서는 항 IL-6 항체를 사용하는 것에 의해, 7 개월령부터 신염을 발증하는 마우스가 증가되고, 9 개월령 이후도 증가할 가능성이 고려될 수 있다. 이로부터, 항 IL-6 항체는 항 IL-6 수용체 항체에 비하여 효과가 불충분한 것으로 추측된다.

또, Flnck 등의 보고에는, 혈중 면역 글로블린양의 변화로서, IgG1에서는 2% 감소, IgG2a에서는 12% 감소, IgG3에서는 92% 증가하고, 혈중의 면역 글로블린양에서는 항 IL-6 항체는 영향을 미치지 않았다고 서술되어 있다. 한편, 본 발명의 항 IL-6 수용체 항체를 사용한 실험에서는 대조 항체 투여군과 비교하여, IgG1은 27%, IgG2a는 23%, IgG3는 32% 감소하고 있었다. 이 결과에서도 항 IL-6 수용체 항체 편이 효과가 강력하다고 생각된다.

지금까지 항 IL-항체를 인간과 마우스에 투여한 경우, 혈중의 IL-6 농도가 현저하게 상승하는 것이 다수 보고되어 있다 (Wending, D. et al., J. Rheumatol. (1993) 20, 259-262, Heremans, H. et al., Eur. J. Immunol. (1992) 22, 2395-2401). 또한 IL-6와 항 IL-6 항체를 동시 투여하면 IL-6의 활성이 현저하게 상승하는 것도 발견되고 있다 (Mihara, M. et al., Immunology (1991) 74, 55-59).

본 발명에서, 항 IL-6 수용체 항체를 투여한 마우스의 혈중 IL-6 농도를 측정하는 경우, 측정 한계 이하였다. 따라서, 항 IL-6 수용체 항체를 투여하여도, 혈중의 IL-6는 상승하지 않는 가능성이 시사되었다. 이 사실을 고려하여 볼 때, 항 IL-6 항체로부터 항 IL-6 수용체 항체 편이 우수하다고 생각된다.

본 발명에 의해, 항 IL-6 수용체 항체가 전신성 홍반성 낭창의 치료 효과를 갖는 것을 알 수 있다. 따라서, 항 IL-6 수용체 항체는 전신성 홍반성 낭창의 예방 및/또는 치료제로서 사용한다.

또, 항 IL-6 수용체 항체는 전신성 홍반성 낭창에서의 항 DNA 항체를 감소시키기 위한 예방 및/또는 치료제 및 전신성 홍반성 낭창에서의 요단백질 누출을 감소시키기 위한 예방 및/치료제로서 유용하다.

특허협력조약, 13-2 규정 하에서 기탁된 미생물 및 기탁 기관에 대한 참조

기관 :

기탁기관

이름 : 공업기술원 생명공학 공업기술연구소

주소 : 일본국 이바라키 츠쿠바시 히가시 1쪼메 1반 3고

미생물(1)

식별표시 : 랫-마우스 하이브리도마 MR16-1

수탁번호 : FERM BP-5875

수 탁 일 : 1997년 3월 13일

미생물(2)

식별표시 : HB 101-pIBIBSF2R

수탁번호 : FERM BP-2232

수 탁 일 : 1989년 1월 9일

미생물(3)

식별표시 : PM-1

수탁번호 : FERM BP-2998

수 탁 일 : 1989년 7월 12일

기탁기관 :

이름 : 내셔날 컬렉션스 오브 인더스트리얼 앤드 마린 박테리아 리미티드

주소 : 아베르딘. 에이비2 아이알와이 23 세인트 마셔 드라이브

미생물(4)

식별표시 : 대장균 DH5α-pPM-k3

수탁번호 : NCIMB 40366

수 탁 일 : 1991년 2월 12일

미생물(5)

식별표시 : 대장균 DH5α-pPM-h1

수탁번호 : NCIMB 40362

수 탁 일 : 1991년 2월 12일

Claims

항 인터루킨-6 (IL-6) 수용체 항체를 유효성분으로서 함유하는 전신성 홍반성 낭창의 예방 및/또는 치료제.
전신성 홍반성 낭창에서의 자기면역성 신염의 예방 및/또는 치료제.
제 2항에 있어서, 자기면역성 신염이 루프스 신염인 것을 특징으로 하는 예방 및/또는 치료제.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항 IL-6 수용체 항체가 항 인간 IL-6 수용체 항체인 것을 특징으로 하는 예방 및/또는 치료제.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항 IL-6 수용체 항체가 항 IL-6 수용체 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 예방 및/또는 치료제.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항 IL-6 수용체 항체가 재조합형 항 IL-6 수용체 항체인 것을 특징으로 하는 예방 및/또는 치료제.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항 IL-6 수용체 항체가 PM-1 항체인 것을 특징으로 하는 예방 및/또는 치료제.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항 IL-6 수용체 항체가 인간 항체 정상 영역을 갖는 항체인 것을 특징으로 하는 예방 및/또는 치료제.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항 IL-6 수용체 항체가 IL-6 수용체에 대한 키메라 항체 또는 인간형화 항체인 것을 특징으로 하는 예방 및/또는 치료제.
제 1항 내지 제 9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항 IL-6 수용체 항체는 인간형화 PM-1 항체인 것을 특징으로 하는 예방 및/또는 치료제.
항 IL-6 수용체 항체를 유효성분으로서 함유하는 전신성 홍반성 낭창에서의 항 DNA 항체 또는 항핵 항체를 감소시키기 위한 예방 및/또는 치료제.
항 IL-6 수용체 항체를 유효성분으로서 함유하는 전신성 홍반성 낭창에서의 요단백질 누출을 감소시키기 위한 예방 및/또는 치료제.