WO1999008707A1 - Preventifs et/ou medicaments contre le lupus erythemateux systemique, contenant un anticorps anti-recepteur d'il-6 comme ingredient actif - Google Patents

Preventifs et/ou medicaments contre le lupus erythemateux systemique, contenant un anticorps anti-recepteur d'il-6 comme ingredient actif Download PDF

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WO1999008707A1
WO1999008707A1 PCT/JP1998/003636 JP9803636W WO9908707A1 WO 1999008707 A1 WO1999008707 A1 WO 1999008707A1 JP 9803636 W JP9803636 W JP 9803636W WO 9908707 A1 WO9908707 A1 WO 9908707A1
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Masahiko Mihara
Yoshiyuki Ohsugi
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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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Definitions

  • Anti-inflammatory agent for systemic erythematosus containing anti-IL- 6 receptor antibody as an active ingredient
  • the present invention relates to a preventive and / or therapeutic agent for systemic lupus erythematosus, which comprises an anti-interleukin-6 receptor antibody as an active ingredient.
  • Interleukin-6 is a site also called B cell stimulating factor 2 (BSF2) or interferon 2 (IFN- / 32).
  • BSF2 B cell stimulating factor 2
  • IFN- / 32 interferon 2
  • IL-6 has been discovered as a differentiation factor involved in the activation of B-lymphoid cells (Hirano, T. et al., Nature (1986) 324, 73-76), and then various cell functions. It has become clear that it is a multifunctional site that influences the activity of the patient (Akira, S. et al., Adv. In Immunology (1993) 54, 1-78).
  • IL-6 transmits its biological activity via two proteins on cells.
  • One is the IL-6 receptor, which is a ligand binding protein to which IL-6 binds.
  • IL-6 receptor which is a ligand binding protein to which IL-6 binds.
  • a soluble IL- having a molecular weight of about 40 to 50 kD consisting essentially of its extracellular region 6 also exists as a receptor.
  • the other is the membrane protein gpl30, which has a molecular weight of about 130 kD, involved in non-ligand binding signal transduction.
  • IL-6 and IL-6 receptors form an IL-6 ZIL-6 receptor complex, which is then bound to gpl30
  • the biological activity of IL-6 is transmitted intracellularly (Taga, T. et al., J. Exp. Med. (1987) 166, 967).
  • Anti-IL_6 receptor antibodies have been reported to date (Novick, D. et al., Hybridoma (1991) 10, 137-146, Huang, YW et al., Hybridoma (1993) 12, 621-) 630, International Patent Application Publication No. WO 95-09873, French Patent Application Publication No. FR 2694767, US Patent No. US 521 628).
  • a mouse antibody PM-1 Hirata. Et al., J. Immunology (1989) 143. 2900-2906), which is one of the anti-IL-6 receptor antibodies, and its tolerance determining region (CDR) are prepared.
  • a human-typed PM-1 antibody International Patent Application Publication No. W0 92-19759 obtained by transplantation into an antibody is known.
  • Lupus erythematosus (SLE; Systemic lupus erythematosus) is a systemic effect caused by the induction of an inflammatory response by the deposition of antinuclear antibodies or anti-DNA antibodies or their immune complexes in various organs and tissues. It is an autoimmune disease. Lupus nephritis develops when antinuclear antibodies or anti-DNA antibodies or their immune complexes are deposited on the glomeruli. There are few patients showing increased IL-6 in the blood in systemic erythematosus, and the involvement of IL-6 in the pathology is negative (Peterson. E. et al., Lupus. (1996) 5, 5 571-57 6) ⁇
  • Kiberd, J. J. Am. Soc. Nephrol. (1993) 4, 58-61 describes the effects of anti-IL-6 receptor antibody on renal function and tissue changes in MRL-lpr / lpr mice.
  • Kiberd, J. the appearance time and the survival time of essential urinary protein as an indicator of clinical symptoms of systemic erythematosus have not been examined. Therefore, it can not be judged from these results that anti-IL-6 receptor antibody is effective for lupus nephritis.
  • the pathological condition of the MR lpr / lpr mice used was histologically whole body Although similar to sexual death, the pathogenesis of the pathological condition is related to the abnormality of Fas antigen.
  • Fas antigen In the case of systemic lupus erythematosus in humans, no abnormality in the Fas antigen has been observed (Watanabe-Fukunaga, R. et a1. Nature. (1992) 356, 314-317).
  • anti-l-6 antibody increases the number of mice that develop nephritis from 7 months of age, and there is a good possibility that it may increase even after 9 months of age not shown in the data. Therefore, it is suggested that the effect of anti-IL-6 antibody on systemic lupus erythematosus is not sufficient.
  • International Patent Application Publication No. WO 96-12503 describes that an anti-IL-6 receptor antibody is effective in nephritis, particularly in the treatment of proliferative nephritis.
  • International Patent Application Publication No. WO 96-12503 describes nephritis in which mesangial cells are proliferated by IL-6 produced in large amounts by genetic engineering and the proliferation of the mesothelial cells is a direct cause. It is only done.
  • anti-IL-6 receptor 1 antibody has a therapeutic effect on systemic erythematosus.
  • steroids and immunosuppressants are used to treat systemic lupus erythematosus, but they are symptomatic and require long-term administration, and side effects are a problem. Disclosure of the invention
  • the present invention seeks to provide a preventive and / or therapeutic agent for systemic lupus erythematosus which does not have the above-mentioned drawbacks.
  • the present invention provides a preventive and / or therapeutic agent for systemic lupus erythematosus, which comprises an anti-IL-6 receptor antibody as an active ingredient.
  • the present invention also provides a preventive and / or therapeutic agent for autoimmune nephritis in systemic lupus erythematosus, which comprises an anti-IL-6 receptor antibody as an active ingredient.
  • the present invention also provides a preventive and / or therapeutic agent for lupus nephritis in systemic lupus erythematosus, which comprises an anti-IL-6 receptor antibody as an active ingredient.
  • the present invention also provides a preventive and therapeutic agent for the above-mentioned systemic erythematosus, which comprises an anti-human IL-6 receptor antibody as an active ingredient.
  • the present invention also provides the agent for preventing and / or treating systemic erythematosus described above, which comprises an anti-IL-6 receptive monoclonal antibody as an active ingredient.
  • the present invention also provides a preventive and / or therapeutic agent for the above-mentioned systemic lupus erythematosus, which comprises a recombinant anti-IL-6 receptor antibody as an active ingredient.
  • the present invention also provides a preventive and / or therapeutic agent for the above-mentioned systemic erythematosus, which comprises a PM-1 antibody as an active ingredient.
  • the present invention also provides a preventive and / or therapeutic agent comprising an anti-IL-6 receptor antibody having a human antibody constant region as an active ingredient.
  • the present invention also provides the aforementioned preventive and / or therapeutic agent for systemic lupus erythematosus, which comprises a chimeric antibody or humanized antibody against IL-6 receptor as an active ingredient.
  • the present invention also provides a preventive and Z or therapeutic agent for the above-mentioned systemic lupus erythematosus, which comprises a humanized PM-1 antibody as an active ingredient.
  • the present invention also provides a method for reducing anti-DNA antibody or anti-nuclear antibody in systemic erythematosus which comprises anti-IL-6 receptor antibody as an active ingredient.
  • the present invention further provides a preventive and Z or therapeutic agent for reducing urinary protein leakage in systemic lupus erythematosus, which comprises an anti-IL-6 receptor antibody as an active ingredient.
  • FIG. 1 is a graph showing the urinary protein excretion inhibitory action of MR16-1 in NZB / W F1 mice.
  • FIG. 2 is a graph showing the effect of MR16-1 on the survival days of NZB / W F1 mice.
  • FIG. 3 is a graph showing the effect of MR16-1 on the amount of anti-DNA antibody in blood.
  • the anti-IL-6 receptor antibody used in the present invention has a therapeutic effect on systemic lupus erythematosus, a reduction in anti-DNA antibody on systemic lupus erythematosus, or urine protein leakage in systemic lupus erythematosus.
  • the origin, type, and shape are not limited as long as it shows a reduction effect of
  • the anti-IL-6 receptor antibody used in the present invention inhibits the binding of IL-6 to the IL-6 receptor by binding to the IL-6 receptor, thereby the biology of IL- 16 .
  • Antibody that inhibits the intracellular transmission of biological activity. Therefore, the anti-IL-6 receptor antibody used in the present invention is preferably an antibody that neutralizes the biological activity of IL-6.
  • the anti-IL-6 receptor antibody used in the present invention can be obtained as a polyclonal ⁇ - or monoclonal antibody using known methods. Ru.
  • a monoclonal antibody is preferred.
  • mammalian-derived monoclonal antibodies are particularly preferred as monoclonal antibodies.
  • mammalian-derived monoclonal antibodies include those produced by hybridomas and those produced by hosts transformed with expression vectors containing antibody genes by genetic engineering techniques.
  • MR16-1 antibody (Saito, et al., J. Immu nol. (1993) 147, 168-173)
  • PM-1 antibody Hirata, et al., J. I mm) unology (1989) 143, 2900-2906)
  • AUK12-20 antibody AUK64-7 antibody or AUK146-15 antibody
  • PM-1 antibody is mentioned as a particularly preferred antibody.
  • the PM-1 antibody-producing hybridoma cell line is designated PM-1 in Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Ibaraki prefecture Tsukuba 1st Street, No. 1-3), on July 10, 1990. , Internationally deposited under the Budapest Treaty as FERM BP-2998.
  • the MR16-1 antibody-producing hybridoma cell line is designated as Rat-mouse hybridoma MR16-1 by the Institute of Advanced Industrial Science and Technology of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Ibaraki Prefecture Tsukuba 1st Street, No. 1-3), 1997. It was deposited internationally on 13 March under the Budapest Treaty as FERM BP-5875.
  • the sensitizing antigen, IL-6 receptor can basically be prepared using known techniques.
  • IL-6 receptor gene is disclosed in European Patent Application Publication No. EP 325 474
  • mouse IL-6 receptor vector is disclosed in Japanese Patent Application Publication No. 3-155795.
  • the amino acid sequence Obtained by The IL-6 receptor antibody used as a sensitizing antigen for antibody acquisition is preferably human IL-6 receptor antibody.
  • the IL-6 receptor protein is expressed on the cell membrane and is separated from the cell membrane (soluble IL-6 receptor 1) (Yasukawa et al 1., J. Bioc em. (1990) 108, 673-676).
  • Soluble IL-6 receptor antibody consists essentially of the extracellular domain of the IL-6 receptor bound to the cell membrane and is defective in the transmembrane domain or the transmembrane domain and the intracellular domain It differs from the membrane-bound IL-6 receptor in that
  • the IL-6 receptor used as a sensitizing antigen for antibody acquisition may be either the IL-6 receptor linked to the cell membrane or the soluble 1-re 6 receptor 1 as far as its purpose is reached.
  • the gene sequence of the IL-6 receptor is inserted into a known expression vector system to transform a suitable host cell, and then the target IL-6 receptor protein is extracted from the host cell or in the culture supernatant.
  • the purified IL-6 receptor protein may be used as a sensitizing antigen after purification by a known method.
  • cells expressing the IL-6 receptor or a fusion protein of the IL-6 receptor protein with another protein may be used as a sensitizing antigen.
  • IL-6 receptor variant can be used as a sensitizing antigen for antibody acquisition.
  • E. coli containing plasmid PIBIBSF2 R containing cDNA encoding human IL-6 receptor E1 was designated as HB101-PIBIBSF2R on January 9, 1989.
  • the Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Institute of Technology and Technology, has made an international deposit under the Budapest Treaty under the accession number FERM BP-2232.
  • a hybridoma producing a monoclonal antibody can be basically prepared as follows using known techniques. That is, the IL-6 receipt Immunization is carried out according to a conventional immunization method, using the antigen as a sensitizing antigen, and the obtained immune cells are fused with known parent cells by a conventional cell fusion method to carry out conventional screening. According to the method, monoclonal antibody-producing cells can be generated by screening. Mammals immunized with the sensitizing antigen are not particularly limited, but are preferably selected in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion, The teeth, teeth and primates are used. As a rodent, for example, a mouse, a rat, a hamster or the like is used.
  • a Japanese snail is used as a Japanese order animal.
  • a monkey is used as a primate.
  • monkeys monkeys with narrow nose and lower nose (old world monkeys), for example, two-eyed monkeys, lizard monkeys, man-made baboons, chimpanzees etc. are used.
  • the sensitizing antigen may be intraperitoneally or
  • the sensitizing antigen is diluted to an appropriate amount with PBS (Phosphate-Buffered Saline), physiological saline, etc. and suspended as needed, and a normal adjuvant such as, for example, an adequate mixture of Freund's complete adjuvant is optionally mixed. After emulsification, it is preferable to administer to mammals several times every 4 to 21 days. In addition, an appropriate carrier can be used at the time of sensitizing antigen immunization.
  • PBS Phosphate-Buffered Saline
  • physiological saline physiological saline
  • a normal adjuvant such as, for example, an adequate mixture of Freund's complete adjuvant
  • an appropriate carrier can be used at the time of sensitizing antigen immunization.
  • immune cells such as lymph node cells and splenocytes are removed from the mammal and subjected to cell fusion.
  • Preferred immune cells to be subjected to cell fusion include, in particular, splenocytes.
  • Mammalian epithelial cells as the other parent cell fused to the above immune cells are already known various cell lines, such as P3X63Ag8.653 (J. Imranol. (1979) 123, 1548-1550. ), P3X63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6. 511 -519), MPC-11 (Margulies. DH et al., Cell (1976) 8. 405-415), SP 2/0 (S ulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), FO (de St.
  • P3X63Ag8.653 J. Imranol. (1979) 123, 1548-1550.
  • P3X63Ag8U.1 Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7)
  • NS-1
  • the cell fusion between the immune cells and the myeloma cells is basically a known method, for example, the method of Milstein et al. (Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46) It can be done according to
  • the cell fusion is performed, for example, in a normal nutrient culture medium in the presence of a cell fusion promoter.
  • a fusion promoter for example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ) or the like is used, and if desired, an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide can be added and used to enhance the fusion efficiency.
  • the ratio of use of immune cells to myeloma cells is, for example, 1 to 10 times as large as that of myeloma cells.
  • a culture medium used for the cell fusion for example, RPMI 1640 culture medium suitable for growth of the myeloma cell line, MEM culture medium, and other common culture media used for this type of cell culture can be used.
  • serum supplements such as fetal calf serum (FCS) can also be used in combination.
  • a predetermined amount of the immune cells and myeloma cells are mixed well in the culture solution, and a PEG solution previously heated to about 37 ° C., for example, a PEG solution having an average molecular weight of about 1000 to 6000 is used.
  • the target fusion cell (Hive is added by mixing at a concentration of 30 to 60% (w / v)
  • the rhomboma is formed.
  • cell fusion agents and the like which are not preferable for growth of a hybridoma can be removed by repeating the procedure of sequentially adding an appropriate culture solution, centrifuging and removing the supernatant.
  • the hybridomas are selected by culturing in a conventional selective culture solution, for example, HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidin).
  • HAT culture solution a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidin.
  • the culture in the HAT medium is continued for a sufficient time, usually several days to several weeks, for the cells other than the target hybridoma (non-fused cells) to die.
  • a conventional limiting dilution method is performed to perform screening and cloning of the hybridoma that produces the target antibody.
  • human lymphocytes are sensitized with a desired antigen protein or antigen-expressing cells, and sensitized B lymphocytes are obtained.
  • the spheres can be fused with human myeloma cells, such as U266, to obtain a desired human antibody having binding activity to a specific antigen or antigen-expressing cell (see Japanese Patent Publication No. 1-59878).
  • antigens or antigen-expressing cells may be administered to a transgenic animal having a repertoire of human antibody genes, and a desired human antibody may be obtained according to the method described above (International Patent Application Publication Nos.
  • the hybridomas producing monoclonal antibodies produced in this manner can be subcultured in a normal culture medium, and can be stored for a long time in liquid nitrogen. is there.
  • the hybridoma may be cultured according to a conventional method to obtain a culture supernatant as the culture supernatant, or a mammal compatible with the hybridoma. Administration and growth, and then used as a Ru.
  • the former method is suitable for obtaining high purity antibodies, while the latter method is suitable for mass production of antibodies.
  • preparation of anti-IL-6 receptor antibody-producing hybridomas can be carried out by the method disclosed in Japanese Patent Publication No. 3-139293.
  • International Institute of Industrial Technology, Institute of Technology for Life Science and Technology Ibaraki Prefecture, Tsukuba, Ibaraki Pref., 1-chome, No.
  • Ascites fluid is obtained by injecting the selected PM-1 antibody-producing hybridoma into the abdominal cavity of a BALB / c mouse (manufactured by Nippon Clea), and a method for purifying the PM-1 antibody from the ascites fluid, Media such as 10% fetal calf serum, RPMI 1640 medium containing 5% BM-Condimed HI (manufactured by Boehringer Mannheim), HYDROMA SFM medium (manufactured by GIBCO- BRL), PFHM-I medium (manufactured by GIBCO- BRL), etc. Culture and the purification of the PM-1 antibody from the culture supernatant.
  • Media such as 10% fetal calf serum, RPMI 1640 medium containing 5% BM-Condimed HI (manufactured by Boehringer Mannheim), HYDROMA SFM medium (manufactured by GIBCO- BRL), PFHM-I medium (manufacture
  • an antibody may be obtained using an immune cell that produces a desired antibody, for example, a cell obtained by immortalizing a sensitized lymphocyte or the like with an oncogene. .
  • an antibody gene was cloned from an antibody-producing cell such as a hybridoma, incorporated into an appropriate vector, introduced into a host, and produced using genetic recombination technology.
  • Recombinant antibodies can be used (see, for example, Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTI BODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISH ERS LTD, 1990).
  • the antibody variable region (V) can be isolated from a hybridoma that produces the target antibody or an immune cell that produces the antibody, for example, a cell in which a sensitized primer or the like is immortalized with an oncogene or the like.
  • Area Isolate the mRNA.
  • known methods such as guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, JM et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), AGPC method (Chmczynski, P. et al., (1987) 162, 156) -159) Prepare total RNA by using, etc., and use the mRNA Purification Kit (manufactured by Pharmacia) to prepare mRNA.
  • mRNA can be directly prepared by using QuickPrep mRNA Purification Kit (manufactured by Pharmacia).
  • cDNA of antibody V region is synthesized using reverse transcriptase.
  • the synthesis of cDNA can be performed using AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit or the like.
  • 5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech) and 5'-RACE method using PCR (Frohman, MA et al., Pro Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85) for cDNA synthesis and amplification.
  • 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17. 2919-2932) can be used.
  • the target DNA fragment is purified from the obtained PCR product and ligated with vector 1 DNA. Furthermore, a recombinant vector is prepared therefrom, introduced into E. coli etc., colonies are selected, and a desired recombinant vector is prepared.
  • the nucleotide sequence of the target DNA is confirmed by a known method, for example, the Deoxy method.
  • the DNA coding for the V region of the target antibody is obtained, it is ligated to the DNA coding for the desired antibody constant region (C region) and incorporated into an expression vector.
  • the DNA encoding the V region of the antibody may be incorporated into an expression vector containing the DNA of the antibody C region.
  • the antibody gene is incorporated into an expression vector so as to be expressed under the control of an expression control region, eg, the enhansano promoter, as described later.
  • host cells can be transformed with this expression vector to allow antibody expression.
  • Expression of the antibody gene may be carried out by separately transforming the antibody heavy chain (H chain) or light chain (L chain) into an expression vector to co-transform the host, or by coding the H chain and L chain.
  • the DNA may be integrated into a single expression vector to transform the host (see International Patent Application Publication No. WO 94-11523).
  • a recombinant antibody artificially modified for the purpose of reducing heteroantigenicity to human etc. for example, a chimeric (Chimeric) antibody, a humanized (Humanized) antibody It can be used.
  • modified antibodies can be produced using known methods.
  • the chimeric antibody is prepared by ligating the DNA encoding the antibody V region obtained as described above with the DNA encoding the human antibody C region, and incorporating it into the expression vector to introduce it into the host. (See European Patent Application Publication No. EP 125023, International Patent Application Publication No. WO 92-19759). This known method can be used to obtain chimeric antibodies useful in the present invention.
  • plasmids containing DNA encoding the V region of the L chain and H chain of the quinula PM-1 antibody are designated as pPM-k3 and pPM-hi, respectively, and E. coli having this plasmid is designated as pPM-k3 and pPM-hi, respectively.
  • NC 1MB 40366 and NC IMB 40362 were internationally deposited under the Budapest Treaty on February 11, 1991 as NC 1MB 40366 and NC IMB 40362, respectively (see International Patent Application Publication No. W 0 92-19759). ).
  • a humanized antibody is also referred to as a reshaped human antibody, and for example, the complementarity determining region (CDR) of a mammal other than human, for example, a mouse antibody, is used as the CDR of the antibody that casts the complementarity determining region (CDR).
  • CDR complementarity determining region
  • the general genetic recombination method is also known. Publication No. EP 125023, see International Patent Application Publication No. WO 92-19759).
  • a DNA sequence designed to connect the CDRs of a mouse antibody and the framework region (FR: frame work region) of a human antibody should have a portion at the end.
  • the compound is synthesized by PCR from several oligonucleotides prepared in The obtained DNA is ligated with the DNA encoding the human antibody C region and then incorporated into an expression vector, which is then introduced into the host for production (European Patent Application Publication No. EP 239400, See International Patent Application Publication No. W 0 92-19759).
  • the FRs of human antibodies linked via CDRs are selected such that the CDRs form a good antigen binding site. If necessary, the FR amino acid of the V region of the antibody may be substituted so that the CDRs of the reshaped human antibody form a suitable antigen binding site (Sato, K. et al., Cancer Res. Cancer Res. (1993) 5 3, 851-856) o
  • Human antibody C regions are used for chimeric antibodies and humanized antibodies.
  • a preferred human antibody C region includes C r, for example, C 71, C 2, C 3 and C 7 4 can be used.
  • human antibody C region may be modified to improve the stability of the antibody or its production.
  • the chimeric antibody is composed of V regions derived from mammalian antibodies other than human and C regions derived from human antibodies, and the humanized antibodies are CDRs derived from mammalian antibodies other than human and FR derived from human antibodies It is useful as an active ingredient of the therapeutic agent of the present invention because it consists of the C region and the antigenicity in the human body is reduced.
  • humanized antibodies used in the present invention include humanized PM-1 antibodies (International Patent Application Publication No. W0 92-9759). See).
  • the antibody used in the present invention may be an antibody fragment or a modified antibody as long as it can be suitably used in the present invention.
  • antibody fragments include Fab, F (ab ') 2, Fv or single chain Fv (scFv).
  • the scFv has a structure in which the H chain and the F chain of the L chain are linked by an appropriate linker.
  • the antibody is treated with an enzyme such as papain or pepsin to produce an antibody fragment, or a gene encoding these antibody fragments is constructed, and this is used as an expression vector. After introduction, it is expressed in appropriate host cells (eg, Co, MS et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976, Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology ( 1989) 178, 476-496, Academic Press, Inc., Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology (1 989) 178, 476-496, Academic Press. Inc., Lamoyi, E ..
  • the scFv is obtained by linking the H chain V region of the antibody and the L chain V region (see International Patent Application Publication No. W0 88-09344).
  • the H chain V region and the L chain V region are linked via a linker, preferably a peptide linker (Huston, JS et al., Pro Natl. Acad. Sci USA (1988) 85, 5879-5883).
  • the H chain V region and the L chain V region in the scFv may be derived from any of those described above as antibodies.
  • any single-stranded peptide consisting of 12 to 19 amino acid residues can be used as a Peptidoglycan which links the V region (see US Pat. No.
  • the DNA encoding the scFv may be a DNA encoding the H chain or H chain V region of the antibody, or an L chain or DNA encoding the L chain V region as a template.
  • the DNA portion coding for the desired amino acid sequence is amplified by PCR using a pair of primers defining the ends thereof, and then the DNA fragment coding for the peptidic linker portion and DNA and It is obtained by combining and amplifying a primer pair which defines that both ends are respectively linked to H chain and L chain.
  • DNA encoding scFv is prepared, an expression vector containing them and a host transformed by the expression vector can be obtained according to a conventional method. Moreover, scFv can be obtained according to a conventional method using the host.
  • antibody fragments can be produced by the host by obtaining and expressing the gene as described above.
  • the term "antibody” as referred to in the claims of the present application also encompasses these antibody fragments.
  • antibodies conjugated to various molecules such as polyethylene glycol (PEG) can also be used.
  • PEG polyethylene glycol
  • the term "antibody” as referred to in the claims of the present application also encompasses such modified antibodies. Such antibody modifications can be obtained by chemically modifying the obtained antibodies. These methods are already established in this field.
  • the antibody gene constructed as described above can be expressed by a known method to obtain an antibody.
  • expression is carried out using a commonly used useful promoter, Z. enhancer, an antibody gene to be expressed, a DNA functionally linked with a poly A signal downstream of the 3 'side thereof, or a vector containing the same. be able to.
  • Z. enhancer an antibody gene to be expressed
  • DNA functionally linked with a poly A signal downstream of the 3 'side thereof or a vector containing the same. be able to.
  • the first half of the site Megalo virus It is possible to mention the human cytomegalovirus immediate early promoter / enhancer.
  • promoters / enhancers that can be used to express the antibody used in the present invention
  • viruses such as retrovirus, polio virus, adenovirus, simian virus 40 (SV 40) and the like can be used.
  • Promoters / enhancers derived from mammalian cells such as promoter / en- ergy / hyper lon function 1 a (HEF 1 a) may be used.
  • E. coli In the case of E. coli, a commonly used useful promoter, a signal sequence for antibody secretion, and an antibody gene to be expressed can be functionally linked and expressed.
  • lacZ promotion and araB promoter can be mentioned. Ward et al.'s method (Nature (1098) 341, 544-546; FA SEB J. (1992) 6, 2422-2427) when using lacZ promoter, and when using araB promoter, Better et al. It can be done according to the method (Science (1988) 240, 1041-1043).
  • pelB signal sequence (Lei, SP et al. J. Bacteriol. (1987) 169. 4379) may be used when producing in E. coli periplasmic cells. After isolation of the antibody produced in the periplasm, the structure of the antibody is appropriately refolded and used (eg, International Patent Application Publication No. W096-30394, Japanese Patent Application Publication No. 7- See 93879).
  • the replication origin those derived from SV40, poliomyelitis, adenovirus, sicapipiromavirus (BPV) and the like can be used.
  • expression vector 1 is used as a selection marker, such as an amino glycosyltransferase (APH) gene, a thymidin kinase (TK) gene, E. coli vector. It can contain the genes such as ching- ing phosphoribosyltransferase (Ecogpt) gene and dihydrofolate reductase (dhfr) gene.
  • APH amino glycosyltransferase
  • TK thymidin kinase
  • E. coli vector E. coli vector. It can contain the genes such as ching- ing phosphoribosyltransferase (Ecogpt) gene and dihydrofolate reductase (dhfr) gene.
  • Production systems for antibody production include in vitro and in vivo production systems.
  • in vitro production systems include production systems using eukaryotic cells and production systems using prokaryotic cells.
  • animal cells there are production systems using animal cells, plant cells and fungal cells.
  • animal cells (1) mammalian cells such as CH0 (J. Exp. Med. (1995) 108. 945), COS, myeloma, BHK (ba by hamster kidney), HeLa, Vero, (2) Amphibian cells are known, for example, A. clavula oocytes (Valle, et al., Nature (1981) 291. 35 8-340), or (3) insect cells such as sf9, sf2K Tn5.
  • CH0 cells in particular, dhfr-CHO (Pro Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4 220), which is a CH0 cell lacking the DHFR gene, and CHO Kl (Proc. Natl. Acad. Sci) USA (1968) 60, 1275) can be suitably used.
  • cells derived from Nicotiana tabacum are known, and these may be callus cultured.
  • fungal cells include yeasts, for example, the genus Saccharomyces, such as Saccharomyces 'Serpices cerevisiae, filamentous fungi, such as the genus Aspergillus, for example, Aspergius' Niga. One (Aspergillus niger) etc. are known.
  • prokaryotic cells there are production systems that use bacterial cells.
  • E. coli and Bacillus subtilis are known.
  • the antibody gene of interest is introduced into these cells by transformation, and the transformed cells are cultured in vitro to obtain an antibody. Culturing is performed according to known methods. For example, DMEM, MEM, RPMI 1640, IMDM can be used as a culture solution. At that time, serum supplementation such as fetal calf serum (FCS) may be used in combination or serum-free culture may be performed. Alternatively, antibodies may be produced in vivo by transferring cells into which the antibody gene has been introduced to the abdominal cavity of an animal or the like.
  • FCS fetal calf serum
  • examples of in vivo production systems include production systems using animals and production systems using plants. Introduce antibody genes into these animals or plants, produce antibodies in the animals or plants, and recover them.
  • mammals there are mammalian and insect production systems. As mammals, it is possible to use archaea, puffera, hiji, mouse, and sushi (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). In addition, if mammals are used, transgenic animals can be used.
  • an antibody gene is inserted into the middle of a gene coding for a protein uniquely produced in milk such as Xagi / S casein to prepare a fusion gene.
  • the DNA fragment containing the fusion gene into which the antibody gene has been inserted is injected into the barbed embryo, and this embryo is introduced into the female barbed.
  • Desired antibodies are obtained from the milk produced by Transgeny cypress or its progeny born from the cypress that received the embryo. Where appropriate, hormones may be used for transfection to increase the milk yield containing the desired antibodies produced from the lungs. (Ebert, K. M. et al., Bio / Technology (1994) 12, 699-702).
  • silkworms can be used.
  • a silkworm is infected with a baculovirus into which a target antibody gene has been inserted, and the desired antibody is obtained from the body fluid of the silkworm (Susu mu, M. et al., Nature (1985) 315, 592- 594).
  • tobacco when using plants, for example, tobacco can be used.
  • the antibody gene of interest is inserted into a plant expression vector, such as pMON530, and this vector is introduced into bacteria such as Agrobacterium tumefaciens.
  • This bacterium is infected with tobacco, for example, Nicotiana tabacum, and the desired antibody is obtained from leaves of this tobacco (Julian, K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138. ) o
  • DNA encoding the antibody H chain or L chain is separately incorporated into an expression vector to cotransform the host.
  • DNA encoding the H chain and L chain may be incorporated into a single expression vector to transform the host (see International Patent Application Publication No. WO 094 1 1523).
  • the antibody produced and expressed as described above can be isolated from the host, in and out of cells, and purified to homogeneity.
  • the separation and purification of the antibody used in the present invention are not limited in any way, as long as separation and purification methods used in purification of ordinary proteins are used.
  • chromatography columns such as affinity chromatography, Appropriate selection of luter, ultrafiltration, salting out, dialysis etc. can be used to separate and purify antibodies (Antibodies: A Laboratory anua 1. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
  • Examples of columns used for affinity chromatography include protein A columns and protein G columns.
  • Examples of the carrier used for the protein A column include Hyper D, P0R0S, Sepharose F. F. (Pharmacia) and the like.
  • chromatographies can be performed using liquid phase chromatography, for example, liquid phase chromatography such as HPLC and FPLC o
  • the concentration of the obtained antibody can be measured by measurement of absorbance, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) or the like. That is, in the case of measuring the absorbance, after appropriately diluting the obtained antibody with PBS, the absorbance at 280 nm is measured. For example, in the case of a human antibody, 1 mg / ml may be calculated as 1.35 0D.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • ELISA in the case of ELISA, it can be measured as follows. That is, diluted to 1 mg / ml with 0.1 M bicarbonate buffer (pH 9.6). Add 100 ml of anti-human IgG (manufactured by TAGO) to a 96-well plate (manufactured by Nunc) and incubate at 4 ° C overnight to solidify the antibody. After blocking, add an appropriately diluted sample of the antibody or antibody used in the present invention, or 100 ml of a human IgG (CAPPEL) of known concentration as a concentration standard, and Incubate time.
  • CAPPEL human IgG
  • BIAcore manufactured by Pharmacia
  • BIAcore manufactured by Pharmacia
  • IL-6 is added to a plate cultured with IL-6 reactive cells, such as MH60.BSF2. Then, by coexistence of an anti-IL-6 receptor antibody, 3 H-labeled thymidine uptake of IL-6 reactive cells may be evaluated as an index.
  • anti-IL-6 receptor antibody and 125 I-labeled IL-6 are added to a plate cultured with IL-6 receptor-expressing cells, for example, U266. Then, evaluation may be performed by measuring 125 I-labeled IL-6 bound to IL-6 receptor-expressing cells (Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. 0 )
  • ELISA, EIA (enzyme immunoassay), RIA (radioimmunoassay) or fluorescent antibody method may be used as a method for measuring the antigen binding activity of the anti-IL-6 receptor antibody used in the present invention. It can be used.
  • the IL-6 receptor when using an ELISA, is added to a 96-well plate immobilized with an antibody against the IL-6 receptor antibody, such as an antibody against its C region, and then the desired anti-IL-6 receptor is obtained. Add a sample containing the antibody, for example, culture supernatant of anti-IL-6 receptor antibody-producing cells or purified antibody.
  • the antigen binding activity can be evaluated by measuring the absorbance by adding an enzyme substrate of As IL-6 receptor, soluble IL-6 receptor may be used.
  • cells expressing IL-6 receptor are cultured in 96-well plates, adhered, and immobilized with paraformaldehyde or the like.
  • a membrane fraction of cells expressing the IL-6 receptor is prepared and immobilized on a 96-well plate.
  • the radioactivity can be measured to determine the amount of IL-6 bound to the IL-6 receptor, and the receptor binding of anti-IL-6 receptor antibody can be performed. Inhibitory activity can be assessed.
  • Radioactive isotope eg 125
  • BIAcore manufactured by Pharmacia
  • Diseases to be treated with the preventive and therapeutic agents of the present invention are systemic erythematosus.
  • the effect is confirmed by administering anti-IL-6 receptor antibody to a model animal exhibiting a state of systemic lupus erythematosus in human. be able to.
  • model animal As a model animal to be used, a model animal that most closely represents the pathogenesis of human systemic lupus erythematosus is used.
  • the model animal that best represents the pathogenesis of systemic lupus erythematosus in humans is the NZB / WF 1 mouse.
  • NZB / WF1 mice are already known and available model animals.
  • Systemic immune disease is a systemic autoimmune disease that results from an inflammatory reaction induced by deposition of antinuclear antibodies or anti-DNA antibodies or their immune complexes on various organs and tissues. . Autoimmune lupus nephritis develops when antinuclear antibodies or anti-DNA antibodies or their immune complexes are deposited on the glomeruli. In systemic lupus erythematosus, few patients show an increase in blood IL-6, and the involvement of IL-6 in the pathology is negative (Peterson, E. et al., Lupus. (1996) 5, 571- 576).
  • IL-6 acts directly on mesangial cells present in kidney glomeruli, and may cause glomerulonephritis by proliferating mesangial cells. It has been reported (Suemat su, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86, 7547-7551). In lupus nephritis, IgG class anti-nuclear antibody or anti-DNA antibody or its immune complex is deposited on glomeruli, and inflammation reaction is induced in the glomerulus, causing glomerular injury and causing nephritis. From this, it is distinguished from the mesogenic hyperplasia glomerulonephritis induced by IL-6 in the pathogenesis.
  • anti-IL-6 receptor antibody As shown in the examples below, administration of anti-IL-6 receptor antibody to NZB / WF1 mice resulted in suppression of anti-DNA antibody of class IgG and suppression of leakage of urine.
  • the preventive and Z or therapeutic agents of the present invention are useful as preventive and / or therapeutic agents for systemic lupus erythematosus.
  • the prophylactic and Z or therapeutic agents of the present invention may be used as a prophylactic and / or therapeutic agent for reducing anti-DNA antibodies in systemic lupus erythematosus and to prevent urine protein leakage in systemic lupus erythematosus. It is useful as a therapeutic agent.
  • the prophylactic and / or therapeutic agent of the present invention can be orally or parenterally administered systemically or locally.
  • parenteral administration for example, intravenous injection such as infusion, intramuscular injection, intraperitoneal injection, and subcutaneous injection can be selected, and an appropriate administration method is selected according to the patient's age and symptoms. be able to.
  • the prophylactic and / or therapeutic agent of the present invention is administered to a patient already suffering from a disease in an amount sufficient to cure or at least partially arrest the symptoms of the disease.
  • the effective dose may be It is selected in the range of 0.1 mg to 100 mg per kg body weight with AU98 / 00648.
  • a dose of 1-1 000 mg, preferably 5-50 mg, can be selected per patient.
  • the prophylactic and therapeutic agents of the present invention are not limited to these dosages.
  • Dosing may be performed after systemic onset of cerebrovascular disease, or may be administered prophylactically to alleviate symptoms at onset when systemic lupus erythematosus is expected to occur. Good.
  • the administration period can be selected appropriately according to the patient's age and symptoms.
  • the prophylactic and / or therapeutic agent of the present invention may also contain pharmaceutically acceptable carriers and additives, depending on the administration route.
  • pharmaceutically acceptable carriers and additives include water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, polyoxyvinyl polymer, carboxymethyl cellulose sodium, poly Sodium oxalate, sodium alginate, water-soluble dextran, carboxymethyl starch sodium, pectin, methyl cellulose, acetyl cellulose, xylan gum, arabia gum, casein, Gelatin, Agar, Diglycerin, Propylene glycol, Polyethylen glycol, Waseline, No ,.
  • the soluble IL- was obtained by PCR using a plasmid PBSF2R.236 containing a cDNA encoding the IL-6 receptor obtained according to the method of Yamasaki et al. (Science (1988) 241, 825-828). Six receptors were made.
  • the plasmid PBSF2R.236 was digested with the restriction enzyme Sph I to obtain an IL-6 receptor cDNA, which was inserted into mpl8 (manufactured by Amersham).
  • synthetic oligonucleotide primers designed to introduce a stopcodon into the cDNA of IL-6 receptor the PCR method was used to generate IL-6 by the in vitro digestion system (manufactured by Amersham). Mutations were introduced into the receptor cDNA. As a result of this operation, stopcodon was introduced at the position of amino acid 345, and a cDNA coding for soluble IL-6 receptor was obtained.
  • soluble IL-6 receptor cDNA In order to express soluble IL-6 receptor cDNA in CHO cells, it was ligated with plasmid pSV (manufactured by Pharmacia) to obtain plasmid PSVL344.
  • the soluble IL-6 receptor cDNA cleaved with Hindll I-Sal I was inserted into plasmid pECEdhfr containing dhfr cDNA to obtain CHO cell expression plasmid pE CEdhfr344.
  • CH0 cells were screened by limiting dilution to obtain single CH0 cell clones.
  • This CH0 cell clone is amplified by methotrexate (MTX) at a concentration of 20 nM to 200 nM to obtain a human soluble IL-6 receptor.
  • the production CHO cell line 5E27 was obtained.
  • the CH0 cell line 5E27 was cultured in Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM, Gibco) containing 5% FBS. The culture supernatant was collected, and the concentration of soluble IL-6 receptor in the culture supernatant was measured by ELISA.
  • IMDM Iscove's modified Dulbecco's medium
  • the anti-IL-6 antibody MT18 prepared by the method of Hirata et al. (J. Immunol., 143: 2900-2906, 1989) and sepharose 4B (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) attached with CNBr activated. According to the formulation, they were combined, and the IL-6 receptor 1 (Science (1988) 241, 825-82 8) was purified.
  • the human myeloma cell line U266 is 1 mM digitonin (Wako Chemicals), 10 mM triethanolamine (pH 7.8), and 1 mM p-paraphenyl phenyl hydrolyzide with 0.15 M NaCl (Wako Chemicals) ) (Solution with digitonin buffer) and mixed with MT18 antibody conjugated to Sepharose 4B beads. Thereafter, the beads were washed six times with digitonin buffer to obtain partially purified IL-6 receptor for immunization.
  • mice were immunized four times every 10 days with the partially purified IL-6 receptor obtained from 3 ⁇ 10 9 U266 cells, and then hybridomas were prepared by a conventional method.
  • the hybridoma culture supernatants from the growth positive wells were examined for their binding activity to the IL-6 receptor according to the following method. 5 ⁇ 10 7 U266 cells were labeled with 35 S-methionine (2.5 mCi) and solubilized with the above digitonin buffer.
  • Solubilized U266 cells are mixed with MT18 antibody conjugated to 0.04 ml volume of Sepharose 4B beads, then washed 6 times with digitonin buffer, and 35 S-methionine with 0.25 ml digitonin buffer (PH 3.4) The labeled IL-6 receptor was flushed out and neutralized with 0.025 ml of 1 M Tris (pH 7.4).
  • hybridoma culture supernatant in 0.01 ml of Protein G Cepharo
  • the mixture was mixed with sodium hydroxide (manufactured by Phramacia). After washing, Sepharose was incubated with 0.005 ml of 35 S-labeled IL-6 receptor solution prepared above. The immunoprecipitated material was analyzed by SDS-PAGE, and the hybridoma culture supernatant that reacted with the IL-6 receptor was examined. As a result, a reactive positive hybrid clone PM-1 was established.
  • the antibody produced from hybridoma PM-1 has a subtype of IgG1 type.
  • the binding inhibitory activity of IL-6 to human IL-6 receptor of the antibody produced by hybridoma PM-1 was examined using human cell line U266.
  • Human recombinant IL-6 was prepared from E. coli (Hirano et al., Immunol. Lett.
  • CH0 cells producing mouse soluble IL-6 receptor are cultured in IMDM medium containing 10% FCS, and from the culture supernatant, mouse soluble IL-6 receptor-RS12 (see Saito, et al. Above) and Affigel 10 gel Mouse soluble IL-6 receptor using an affinity column fixed to (Biorad) Refined.
  • mice soluble IL-6 receptive was mixed with Freund's complete adjuvant and injected into the abdomen of Wistar rat (manufactured by Japan Charles River). After 2 weeks, I was boosted with Freund's incomplete adjuvant. Rats were sacrificed on the 45th day, and 2 ⁇ 10 8 spleen cells were routinely used with 1 ⁇ 10 7 mouse myeloma cells P3U1 and 50% PEG1500 (manufactured by Hopkins Mannheim). After cell fusion, hybridomas were screened in HAT medium.
  • hybridoma culture supernatant was added to a plate coated with a rabbit anti-rat IgG antibody (manufactured by Kappel), and then the mouse soluble IL-6 receptor was reacted.
  • screening hybridomas that produce antibodies against mouse soluble IL-6 receptor by ELISA with ELISA anti-mouse IL-6 receptor antibody and alkaline phosphatase-labeled Hedge anti- IgG antibody. did.
  • Hybridoma clones for which antibody production was confirmed were subjected to two rounds of subscreening to obtain a single hybridoma. This clone was named MR16-1.
  • BSF2 cells (Matsuda et al., J. immunol . (1 988) 18, 951-956) using three The uptake of H-labeled thymine was examined.
  • MH60. BSF2 cells were prepared to be 1 ⁇ 10 4 cells / 200 1 / well in 96 well plates. After this plates to 10 pg / ral mouse IL-6 and MR16 -1 antibody or RS12 antibody 12.3- lOOOng / ml at 37 ° C, 5% C0 2 by addition of 44 hours culture, the 1 Ci / Uweru 3 H labeled thymine was added. Four hours later, the uptake of 3 H-labeled thymine was measured. As a result, MR16-1 antibody inhibited 3 H-labeled thymidine uptake in MH60.BSF2 cells.
  • Humanized PM-1 antibody was obtained by the method described in International Patent Application Publication No. W092-17959. Total RNA was prepared from the hybridoma PM-1 prepared in Reference Example 2 by a conventional method, and single-stranded cDNA was synthesized from this. DNA encoding the variable region (V region) of mouse PM-1 antibody was amplified by the polymerase chain reaction (PCR) method. For PCR, the primers described in Jones, S.T. et al., Bio / Tchnology (1991) 9, 88-89 are used / ⁇
  • the amplified DNA fragment was purified by PCR to obtain a DNA fragment containing a gene encoding a mouse k-type L chain V region and a fragment containing a DNA encoding a mouse 7 type H chain V region. .
  • These DNA fragments were ligated to plasmid PUC19, and introduced into E. coli DH5 ⁇ recombinant cells to obtain an E. coli transformant.
  • the above plasmid was obtained from this transformant, and the nucleotide sequence of the cDNA coding region in the plasmid was determined according to a conventional method, and the complementarity determining regions (CDRs) of each V region were further determined. .
  • a vector expressing the chimeric PM-1 antibody In order to prepare a vector expressing the chimeric PM-1 antibody, cDNA coding for each of the V regions of the k-type light chain and the heavy chain of mouse PM-1 antibody was inserted into the HCMV expression vector. After confirming that the produced chimeric PM-1 antibody had the correct antigen binding activity, a humanized PM-1 antibody was produced by the CDR-grafting method. Amino acids were substituted in the framework region (FR) to prepare a humanized PM-1 antibody having the same antigen binding activity as the quinula antibody.
  • each of them can be expressed as a human (HEF-1 a) ) It was introduced into a vector containing a promoter. By co-transforming CH0 cells with these expression vectors, a CH0 cell line producing a humanized PM-1 antibody was established. Obtained human It was confirmed by ELISA that the typed PM-1 antibody has antigen binding activity to human IL-6 receptor. Furthermore, humanized PM-1 antibody inhibits binding of human IL-6 to human IL-6 receptor as much as mouse PM-1 antibody and chimeric PM-1 antibody. did.
  • MR16-1 and KH-5 are rat IgG, and continuous administration to mice may cause the production of antibodies against rat IgG and symptoms of shock. . Therefore, before starting administration of MR16-1 or KH-5, the immune tolerance to these antibodies is determined using the method described in Finck, BK et al., J. Clin. Invest. (1994) 94, 585-591. Induced.
  • Table 1 shows the effect of MR16-1 on the amount of immunoglobulin in the blood.
  • results for igG subclass, IgM and IgA are at 32 weeks of age.
  • MR16-1 apparently prolonged the survival days even in the survival days, and only one animal died by 64 weeks of age.
  • the amount of anti-DNA antibody the production of anti-DNA antibody of IgG class was significantly suppressed in the MR16-1 administration group, but no effect was observed in the antibody of IgM class.
  • the amount of immunoglobulin in blood the amount of IgG1, IgG2 and IgG3 decreased in the MR16-1 administration group, but the amount of IgM and IgA was not affected.
  • anti-IL-6 receptor antibody is useful as a preventive and / or therapeutic agent for systemic erythematosus.
  • anti-IL-6 antibody and anti-IL-6 receptor antibody may be used in systemic lupus erythematosus. It is considered that the therapeutic effect is stronger than anti-IL-6 antibody.
  • the anti-IL-6 receptor antibody has a therapeutic effect on systemic lupus erythematosus. Therefore, the anti-IL-6 receptor antibody is useful as a preventive and / or therapeutic agent for systemic erythematosus.
  • anti-IL-6 receptor antibody is used in systemic lupus erythematosus. It is useful as a prophylactic and / or therapeutic agent for reducing anti-DNA antibodies and as a prophylactic and / or therapeutic agent for reducing urine protein leakage in systemic lupus erythematosus.

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明 紬 書 抗 I L— 6 レセプター抗体を有効成分として含有する全身性ェリ テ マ トーデスの予防および/または治療剤 技術分野
本発明は抗イ ンターロイキン- 6レセプ夕一抗体を有効成分と して 含有する全身性エリ テマ トーデスの予防および または治療剤に関 する。 背景技術
イ ンターロイキン- 6 (IL-6) は B 細胞刺激因子 2 (BSF2) あるい はイ ンターフ ェ ロ ン 2 (IFN-/32 ) とも呼称されたサイ ト力イ ン である。 IL-6は、 B リ ンパ球系細胞の活性化に関与する分化因子と して発見され （Hirano, T. et al.， Nature (1986) 324， 73-76 ) 、 その後種々 の細胞の機能に影響を及ぼす多機能サイ トカイ ンであ るこ とが明らかになった （Akira, S. et al. , Adv. in Immunology (1993) 54， 1-78) 。
IL - 6は、 細胞上で二種の蛋白質を介してその生物学的活性を伝達 する。 一つは、 IL-6が結合する リ ガン ド結合性蛋白質の IL-6レセプ 夕一である。 IL- 6レセプタ一は、 細胞膜を貫通して細胞膜上に発現 する分子量約 80kDの膜結合型 IL- 6レセプターの他に、 本質的にその 細胞外領域からなる分子量約 40〜50kDの可溶性 IL-6レセプターと し ても存在する。
もう一つは、 非リ ガン ド結合性のシグナル伝達に係わる分子量約 130kD の膜蛋白質 gpl30 である。 IL- 6と IL- 6レセプターは IL- 6ZIL -6レセプ夕一複合体を形成し、 次いで gpl30 と結合するこ とにより 、 IL- 6の生物学的活性が細胞内に伝達される （Taga, T. et al. , J . Exp. Med. (1987) 166, 967 ) 。
抗 I L_6レセプター抗体はこれまでにいくつかの報告がある （Novi ck， D. et al. , Hybridoma (1991) 10, 137-146 、 Huang, Y. W. e t al. , Hybridoma (1993) 12， 621-630 、 国際特許出願公開番号 WO 95-09873 、 フラ ンス特許出願公開番号 FR 2694767、 米国特許番号 US521628) 。 抗 IL- 6レセプ夕一抗体の一つであるマウス抗体 PM-1 ( Hirata. et al. , J. Immunology (1989) 143. 2900-2906 ) および その相捕性決定領域 （CDR ) をヒ ト抗体へ移植するこ とにより得ら れたヒ ト型化 PM- 1抗体 （国際特許出願公開番号 W0 92-19759 ) が知 られている。
全: ^性エリ テマ トーデス ( SLE； Systemic lupus erythematosus ) は、 抗核抗体または抗 DNA 抗体やその免疫複合体が各種臓器 · 組 織に沈着するこ とにより炎症反応が誘導されて生ずる全身性の自己 免疫疾患である。 抗核抗体または抗 DNA 抗体やその免疫複合体が腎 糸球体に沈着するとループス腎炎が発症する。 全身性ェリ テマ トー デスでは血中 IL- 6の増加を示す患者は少なく、 IL- 6の病態への関与 は否定的である （Peterson. E. et al. , Lupus. (1996) 5, 571-57 6 ) ο
Kiberd, J. J. Am. Soc. Nephrol. (1993) 4, 58-61 には、 MRL - lpr/lpr マウスにおける抗 IL- 6レセプ夕一抗体の腎機能と組織変化 に対する効果が述べられている。 しかしながら、 Kiberd, J.の実験 では、 全身性ェリ テマ トーデスの臨床症状の指標と して必須な尿夕 ンパクの出現時期や生存日数の検討がされていない。 したがって、 これだけの結果から抗 IL- 6レセプター抗体がループス腎炎に有効で あるとは判断できない。
また、 使用された MRい lpr/lpr マウスの病態は組織学的には全身 性ェリ テマ ト一デスに似てはいるが、 病態の発症機序には Fas 抗原 の異常が関係している。 一方、 ヒ トの全身性エリ テマ トーデスでは Fas 抗原の異常は認められていない （Watanabe- Fukunaga, R. et a 1.. Nature. (1992) 356, 314-317 ) 。
したがって、 このマウスを用いて得られた実験結果が、 すぐにヒ トの全身性エリ テマ トーデスに適応できるとは言いがたい。 全身性 エリテマ トーデスにおけるループス腎炎のモデルとしては、 NZB/W F1マウスが最も ヒ トの全身性エリ テマ トーデスの病態に近いこ とが 知られている （Howie, J. B. et al.， Adv. Immunol. (1968) 9, 215 -266) 。
また、 Kiberd, J. の示したデータには抗 IL-6レセプター抗体投 与群とコ ン トロール IgG 投与群の間に統計学的有意差がないため、 抗 Iし- 6レセプター抗体が治療効果を有するとはいえないと考えられ る。 したがって、 上記 Kiberd, J.の文献から抗 IL-6レセプ夕一抗体 の全身性ェリ テマ トーデスに対する効果は予測されなかった。
Finck, B. K. et al. , J. Clin. Invest. (1994) 94. 585- 591に は、 NZB/NZB Flマウスにおける抗 IL- 6抗体の尿タンパク排泄抑制効 果、 血中抗 DNA 抗体価および生存日数延長効果が記載されている。
しかしながら、 抗 1レ6抗体を投与すると、 7 ヶ月齢から腎炎を発 症するマウスが増加しており、 データに示されていない 9 ヶ月齢以 降も増加する可能性が十分に考えられる。 したがって、 抗 IL- 6抗体 の全身性エリテマ トーデスに対する効果は十分ではないこ とが示唆 される。
また、 これまでに抗 IL-6抗体をヒ トゃマウスに投与した場合、 血 中の IL-6濃度が著しく上昇するこ とが数多く 報告されている （Wend ling, D. et al. , J. Rheumatol. (1993) 20， 259 - 262, Heremans, H. et al. , Eur. J. Immunol. (1992) 22, 2395-2401) 。 さ らに IL - 6 と抗 IL- 6抗体を同時投与する と IL- 6の活性が著しく上昇するこ とも 見出されている （Mihara, M. et al. , Immunology (1991) 74, 55- 59) 。 このこ とは、 抗 IL- 6抗体を用いた場合には内因性の IL- 6の活 性が増強され、 副作用を発現する可能性を示す。 したがって、 全身 性ェリテマ トーデスに抗 IL-6抗体を投与すると好ま しく ない効果が 生じう るこ とが示唆される。
また、 国際特許出願公開番号 W0 96-12503 には、 抗 IL- 6レセプ夕 —抗体が腎炎、 特にメサンジゥム増殖性腎炎に効果があるこ とが記 載されている。 しかしながら、 国際特許出願公開番号 W0 96-12503 には、 遺伝子操作により大量に産生された IL-6により メサンジゥム 細胞が増殖し、 メサンジゥ厶細胞の増殖が直接の原因と して発症す る腎炎が記載されているのみである。 IL-6が発症に関与せず、 抗核 抗体または抗 DNA 抗体あるいはそれら抗体の免疫複合体が腎臓の糸 球体に沈着して生ずる全身性エリ テマ トーデスにおける自己免疫性 腎炎、 例えばループス腎炎に対し抗 IL- 6レセプター抗体が治療効果 を有するこ とは何ら開示されておらず、 示唆さえされていない。
したがって、 これまでに抗 IL- 6レセプ夕一抗体が全身性ェリ テマ トーデスに対して治療効果を有するこ とは知られていなかった。 現在、 全身性エリ テマ トーデスの治療にはステロイ ド剤ゃ免疫抑 制剤が使用されているが、 対症療法であり、 しかも長期間の投与が 必要とされ、 副作用が問題となっている。 発明の開示
本発明は、 前記の欠点を有さない全身性エリ テマ トーデスの予防 および/または治療剤を提供しよう とする ものである。
すなわち、 本発明は抗 IL- 6レセプ夕一抗体を有効成分と して含有 する全身性エリ テマ トーデスの予防および Zまたは治療剤を提供す る o
本発明はまた、 抗 I L- 6レセプター抗体を有効成分と して含有する 全身性エリ テマ トーデスにおける自己免疫性腎炎の予防および Zま たは治療剤を提供する。
本発明はまた、 抗 I L- 6レセプ夕一抗体を有効成分と して含有する 全身性エリ テマ トーデスにおけるループス腎炎の予防および/また は治療剤を提供する。
本発明はまた、 抗ヒ ト I L-6レセプ夕一抗体を有効成分として含有 する上記全身性ェリテマ トーデスの予防およびノまたは治療剤を提 供する。
本発明はまた、 抗 I L- 6レセプ夕一モノ クローナル抗体を有効成分 と して含有する上記全身性ェリ テマ トーデスの予防および/または 治療剤を提供する。
本発明はまた、 組換型抗 I L- 6レセプタ一抗体を有効成分として含 有する上記全身性エリ テマ トーデスの予防および/または治療剤を 提供する。
本発明はまた、 PM- 1抗体を有効成分と して含有する上記全身性ェ リ テマ トーデスの予防および/または治療剤を提供する。
本発明はまた、 ヒ ト抗体定常領域を有する抗 I L- 6レセプター抗体 を有効成分として含有する予防および または治療剤を提供する。 本発明はまた、 I L-6レセプターに対するキメ ラ抗体またはヒ ト型 化抗体を有効成分として含有する上記全身性エリ テマ トーデスの予 防および Zまたは治療剤を提供する。
本発明はまた、 ヒ ト型化 PM- 1抗体を有効成分として含有する上記 全身性エリ テマ トーデスの予防および Zまたは治療剤を提供する。 本発明はまた、 抗 I L- 6レセプター抗体を有効成分として含有する 全身性ェリ テマ トーデスにおける抗 DNA 抗体または抗核抗体を減少 させるための予防および または治療剤を提供する。
本発明はさ らに、 抗 IL- 6レセプター抗体を有効成分と して含有す る全身性エリ テマ トーデスにおける尿タ ンパク漏出を減少させるた めの予防および Zまたは治療剤を提供する。 図面の簡単な説明
図 1 は、 NZB/W F1 マウスにおける MR16-1の尿タ ンパク排泄抑制 作用を示すグラフである。
図 2は、 NZB/W F1マウスの生存日数に及ぼす MR16-1の効果を示す グラフである。
図 3は、 血中の抗 DNA 抗体量に及ぼす MR16- 1の効果を示すグラフ である。 発明の実施の形態
1 . 抗 IL- 6レセプ夕一抗体
本発明で使用される抗 IL-6レセプター抗体は、 全身性エリ テマ ト 一デスの治療効果、 全身性ェリテマ ト一デスにおける抗 DNA 抗体の 減少効果、 または全身性エリ テマ トーデスにおける尿タ ンパク漏出 の減少効果を示すものであれば、 その由来、 種類および形状を問わ ない。
本発明で使用される抗 IL- 6レセプ夕一抗体は、 IL- 6レセプターと 結合するこ とにより、 IL-6の IL- 6レセプ夕一への結合を阻害して IL 一 6の生物学的活性の細胞内への伝達を阻害する抗体である。 したが つて、 本発明で使用される抗 IL- 6レセプター抗体は、 IL-6の生物学 的活性を中和する抗体が好ま しい。
本発明で使用される抗 IL-6レセプ夕一抗体は、 公知の手段を用い てポリ ク α—ナルまたはモノ クロ一ナル抗体と して得るこ とができ る。 本発明で使用される抗 IL-6レセプ夕一抗体として、 モノ クロ一 ナル抗体が好ま しい。 さ らに、 モノ クローナル抗体として、 特に哺 乳動物由来のモノ クローナル抗体が好ま しい。
哺乳動物由来のモノ クローナル抗体としては、 ハイプリ ドーマに 産生される もの、 および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む 発現べクターで形質転換した宿主に産生される ものが挙げられる。
このような抗体と しては、 MR16- 1抗体 （Saito, et al.， J. Immu nol. (1993) 147, 168-173) 、 PM- 1抗体 （Hirata, et al. , J. I mm unology (1989) 143, 2900-2906 ) 、 AUK12- 20抗体、 AUK64- 7 抗体 あるいは AUK146- 15 抗体 （国際特許出願公開番号 WO 92-19759 ) な どが挙げられる。 これらのうちで、 特に好ま しい抗体と して PM-1抗 体が挙げられる。
なお、 PM- 1抗体産生ハイプリ ドーマ細胞株は、 PM- 1として、 工業 技術院生命工学工業技術研究所 （茨城県つく ば市東 1 丁目 1 番 3 号 ) に、 平成 2 年 7 月 10日に、 FERM BP-2998としてブダぺス ト条約に 基づき国際寄託されている。
また、 MR16-1抗体産生ハイプリ ドーマ細胞株は、 Rat- mouse hybr idoma MR16- 1として、 工業技術院生命工学工業技術研究所 （茨城県 つく ば市東 1 丁目 1 番 3 号） に、 平成 9 年 3 月 13日に、 FERM BP- 58 75と してブダぺス ト条約に基づき国際寄託されている。
2. IL- 6レセプターの調製
感作抗原である IL- 6レセプ夕一は、 基本的には公知技術を使用し て作製できる。
具体的には、 IL- 6レセプ夕一を作製するには次のようにすればよ い。 例えば、 ヒ ト IL - 6レセプ夕一は、 欧州特許出願公開番号 EP 325 474 に、 マウス IL- 6レセプ夕一は日本特許出願公開番号特開平 3-15 5795に開示された IL- 6レセプター遺伝子/ァ ミ ノ酸配列を用いるこ とによって得られる。 抗体取得の感作抗原と して使用される IL- 6レ セプ夕一は、 ヒ ト IL- 6レセプ夕一が好ま しい。
IL-6レセプ夕一蛋白質は、 細胞膜上に発現している ものと細胞膜 より離脱しているもの （可溶性 IL- 6レセプ夕一） （Yasukawa, et a 1. , J. Bioc em. (1990) 108, 673-676 ) との二種類がある。 可溶 性 IL- 6レセプター抗体は細胞膜に結合している IL- 6レセプターの本 質的に細胞外領域から構成されており、 細胞膜貫通領域、 あるいは 細胞膜貫通領域と細胞内領域が欠損している点で膜結合型 IL- 6レセ プターと異なっている。 抗体取得の感作抗原として使用される IL - 6 レセプ夕一は、 その目的を達する限り、 細胞膜に結合している IL-6 レセプ夕一および可溶性 1レ6レセプ夕一のいずれでもよい。
IL- 6レセプターの遺伝子配列を公知の発現べクタ一系に揷入して 適当な宿主細胞を形質転換させた後、 その宿主細胞中または、 培養 上清中から目的の IL- 6レセプター蛋白質を公知の方法で精製し、 こ の精製 IL- 6レセプター蛋白質を感作抗原として用いればよい。 また 、 IL- 6レセプ夕一を発現している細胞や IL- 6レセプ夕一蛋白質と他 の蛋白質との融合蛋白質を感作抗原と して用いてもよい。 また、 そ の目的を達する限り、 IL- 6レセプ夕一変異体を抗体取得の感作抗原 と して使用することができる。
ヒ ト IL- 6レセプ夕一をコ一 ドする cDNAを含むプラス ミ ド PIBIBSF2 R を含有する大腸菌 （E.coli) は、 HB101- PIBIBSF2R と して、 平成 元年 （ 1989年） 1 月 9 日付で工業技術院生命工学工業技術研究所に 、 受託番号 FERM BP- 2232と してブダぺス ト条約に基づき国際寄託さ れている。
3. 抗体産生ハイプリ ドーマの作製
モノ クロ一ナル抗体を産生するハイブリ ドーマは、 基本的に公知 技術を使用して、 以下のように作製できる。 すなわち、 IL- 6レセプ タ一を感作抗原として使用して、 これを通常の免疫方法にしたがつ て免疫し、 得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によつて公知の親 細胞と融合させ、 通常のスク リーニング法により、 モノ クローナル な抗体産生細胞をスク リ ーニングするこ とによって作製できる。 感作抗原で免疫される哺乳動物としては、 特に限定されるもので はないが、 細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択す るのが好ま しく、 一般的にはげつ歯目、 ゥサギ目、 霊長目の動物が 使用される。 げっ歯目の動物としては、 例えばマウス、 ラ ッ ト、 ハ ムスター等が使用される。 ゥサギ目の動物としては、 例えばゥサギ が使用される。 霊長目の動物としては、 例えばサルが使用される。 サルと しては、 狭鼻下目のサル （旧世界ザル） 、 例えば力二クイザ ル、 ァカゲザル、 マン ト ヒ ヒ、 チンパンジー等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、 公知の方法にしたがって行われ る。 例えば一般的方法として、 感作抗原を哺乳動物の腹腔内または
、 皮下に注射するこ とにより行われる。 具体的には、 感作抗原を PB S (Phosphate-Buffered Saline ) や生理食塩水等で適当量に希釈 、 懸濁したものを所望により通常のアジュバン ト、 例えばフロイ ン ト完全アジュバン トを適量混合し、 乳化後、 哺乳動物に 4 〜21日毎 に数回投与するのが好ま しい。 また、 感作抗原免疫時に適当な担体 を使用するこ とができる。
このように免疫し、 血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確 認した後に、 哺乳動物から免疫細胞、 例えばリ ンパ節細胞ゃ脾細胞 が取り出され、 細胞融合に付される。 細胞融合に付される好ま しい 免疫細胞と しては、 特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物の ミ ェ 口—マ細胞は、 すでに、 公知の種々の細胞株、 例えば P3X63Ag8.653 (J. Imranol. (1979) 123, 1548-1550) 、 P3X63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7) 、 NS-1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6. 511 -519) 、 MPC-11 (Margulies. D. H. et al. , Cell (1976) 8. 405- 415 ) 、 SP2/0 (S ulman, M. et al. , Nature (1978) 276， 269-2 70) 、 FO (de St. Groth, S. F. et al. , J. Immunol. Methods (1 980) 35, 1-21 ) 、 S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978 ) 148, 313-323) 、 R210 (Galfre, G. et al. , Nature (1979) 277 , 131-133 ) 等が適宜使用される。
前記免疫細胞と ミ エローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方 法、 例えばミ ルスティ ンらの方法 （Kohler. G. and Milstein, C. 、 Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46) 等に準じて行う こ とができ ο
より具体的には、 前記細胞融合は、 例えば細胞融合促進剤の存在 下に通常の栄養培養液中で実施される。 融合促進剤としては、 例え ばポリエチレングリ コール （PEG ) 、 センダイウィ ルス （HVJ ) 等 が使用され、 更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスル ホキシ ド等の補助剤を添加使用するこ ともできる。
免疫細胞と ミ エロ一マ細胞との使用割合は、 例えばミ エローマ細 胞に対して免疫細胞を 1-10倍とするのが好ま しい。 前記細胞融合に 用いる培養液と しては、 例えば前記ミ エローマ細胞株の増殖に好適 な RPMI 1640培養液、 MEM 培養液、 その他この種の細胞培養に用いら れる通常の培養液が使用可能であり、 さ らに、 牛胎児血清 （FCS ) 等の血清補液を併用するこ ともできる。
細胞融合は、 前記免疫細胞と ミ エローマ細胞との所定量を前記培 養液中でよ く混合し、 予め、 37°C程度に加温した PEG 溶液、 例えば 平均分子量 1000- 6000 程度の PEG 溶液を通常、 30〜60% (w/v ) の 濃度で添加し、 混合するこ とによって目的とする融合細胞 （ハイブ リ ドーマ） が形成される。 続いて、 適当な培養液を逐次添加し、 遠 心して上清を除去する操作を繰り返すこ とによりハイプリ ドーマの 生育に好ま しく ない細胞融合剤等を除去できる。
当該ハイプリ ドーマは、 通常の選択培養液、 例えば HAT 培養液 （ ヒポキサンチン、 ァ ミ ノ プテリ ンぉよびチ ミ ジンを含む培養液） で 培養するこ とにより選択される。 当該 HAT 培養液での培養は、 目的 とするハイプリ ドーマ以外の細胞 （非融合細胞） が死滅するのに十 分な時間、 通常数日〜数週間継続する。 ついで、 通常の限界希釈法 を実施し、 目的とする抗体を産生するハイプリ ドーマのスク リ ー二 ングおよびクロ一ニングが行われる。
また、 ヒ ト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイプリ ドーマを得 る他に、 ヒ ト リ ンパ球を i n v i t roで所望の抗原蛋白質または抗原発 現細胞で感作し、 感作 B リ ンパ球をヒ ト ミエロ一マ钿胞、 例えば U2 66と融合させ、 特定の抗原または抗原発現細胞への結合活性を有す る所望のヒ ト抗体を得るこ ともできる （特公平 1 -59878 参照） 。 さ らに、 ヒ ト抗体遺伝子のレパ一 ト リ一を有する ト ラ ンスジヱニッ ク 動物に抗原または抗原発現細胞を投与し、 前述の方法に従い所望の ヒ ト抗体を取得してもよい （国際特許出願公開番号 W0 93- 12227 、 W0 92-03918 、 W0 94-02602 、 W0 94-25585 、 W0 96-34096 、 W0 9 6-33735 、 米国特許番号 US 5545806参照） 。
このようにして作製されるモノ クローナル抗体を産生するハイブ リ ドーマは、 通常の培養液中で継代培養するこ とが可能であり、 ま た、 液体窒素中で長期保存するこ とが可能である。
当該ハイプリ ドーマからモノ クロ一ナル抗体を取得するには、 当 該ハイプリ ドーマを通常の方法にしたがい培養し、 その培養上清と して得る方法、 あるいはハイプリ ドーマをこれと適合性がある哺乳 動物に投与して増殖させ、 その腹水と して得る方法などが採用され る。 前者の方法は、 高純度の抗体を得るのに適しており、 一方、 後 者の方法は、 抗体の大量生産に適している。
例えば、 抗 IL-6レセプター抗体産生ハイプリ ドーマの作製は、 特 開平 3- 139293に開示された方法により行う ことができる。 工業技術 院生命工学工業技術研究所 （茨城県つく ば市東 1 丁目 1 番 3 号） に 、 平成 2 年 7 月 10日に、 FERM BP- 2998としてブ夕ぺス ト条約に基づ き国際寄託された PM-1抗体産生ハイプリ ドーマを BALB/cマウス （日 本ク レア製） の腹腔内に注入して腹水を得、 この腹水から PM- 1抗体 を精製する方法や、 本ハイプリ ドーマを適当な培地、 例えば 10%ゥ シ胎児血清、 5 %BM-Condimed HI (Boehringer Mannheim 製） 含有 RPMI 1640培地、 ハイプリ ドーマ SFM 培地 （GIBCO- BRL 製） 、 PFHM - 1 I 培地 （GIBCO- BRL 製） 等で培養し、 その培養上清から PM- 1抗体を 精製する方法で行う ことができる。
ハイプリ ドーマを作製して抗体を産生させる他に、 所望の抗体を 産生する免疫細胞、 例えば感作リ ンパ球等を癌遺伝子 （oncogene) により不死化させた細胞を用いて抗体を得てもよい。
4. 組換え型抗体
本発明には、 モノ クローナル抗体として、 抗体遺伝子を抗体産生 細胞、 例えばハイブリ ドーマからクローニングし、 適当なベクタ一 に組み込んで、 これを宿主に導入し、 遺伝子組換え技術を用いて産 生させた組換え型抗体を用いることができる （例えば、 Carl, A. K . Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTI BODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISH ERS LTD, 1990 参照） 。
具体的には、 目的とする抗体を産生するハイプリ ドーマや抗体を 産生する免疫細胞、 例えば感作リ ンパ球等を癌遺伝子 （oncogene) 等により不死化させた細胞から、 抗体の可変領域 （V 領域） をコー ドする mRNAを単離する。 mRNAの単離は、 公知の方法、 例えば、 グァ 二ジン超遠心法 （Chirgwin, J. M. ら、 Biochemistry (1979) 18, 5294-5299 ) 、 AGPC法 （Chmczynski, P. ら、 （1987) 162, 156-159 ) 等により全 RNA を調製し、 mRNA Purification Kit (Pharmacia 製） 等を使用して mRNAを調製する。 また、 QuickPrep mRNA Purifi cation Kit (Pharmacia 製） を用いるこ とにより mRNAを直接調製す るこ とができる。
得られた mRNAから逆転写酵素を用いて抗体 V 領域の cDNAを合成す る。 cDNAの合成は、 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDN A Synthesis Kit 等を用いて行う こ とができる。 また、 cDNAの合成 および増幅を行うには 5' -Ampli FINDER RACE Kit (Clontech製） および PCR を用いた 5' -RACE 法 （Frohman, M. A. ら、 Pro Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85. 8998 - 9002 ； Belyavsky, A. ら、 Nucl eic Acids Res. (1989) 17. 2919-2932 ) を使用するこ とができる 。 得られた PCR 産物から目的とする DNA 断片を精製し、 ベクタ一 DN A と連結する。 さ らに、 これより組換えベクターを作成し、 大腸菌 等に導入してコロニーを選択して所望の組換えべクターを調製する 。 目的とする DNA の塩基配列を公知の方法、 例えば、 デォキシ法に より確認する。
目的とする抗体の V 領域をコー ドする DNA が得られれば、 これを 所望の抗体定常領域 （C 領域） をコー ドする DNA と連結し、 これを 発現ベクターへ組み込む。 または、 抗体の V 領域をコー ドする DNA を、 抗体 C 領域の DNA を含む発現ベクターへ組み込んでもよい。 本発明で使用される抗体を製造するには、 後述のよう に抗体遺伝 子を発現制御領域、 例えば、 ェンハンサーノプロモーターの制御の もとで発現するよう発現ベクターに組み込む。 次に、 この発現べク 夕一により宿主細胞を形質転換し、 抗体を発現させるこ とができる o
抗体遺伝子の発現は、 抗体の重鎖 （H 鎖） または軽鎖 （L 鎖） を 別々 に発現べクタ一に組み込んで宿主を同時形質転換させてもよい し、 あるいは H 鎖および L 鎖をコー ドする DNA を単一の発現べクタ 一に組み込んで宿主を形質転換させてもよい （国際特許出願公開番 号 W0 94-11523 参照） 。
5. 改変抗体
本発明では、 ヒ トに対する異種抗原性を低下させるこ と等を目的 と して人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、 例えば、 キメラ （Ch imeric) 抗体、 ヒ ト型化 （Humanized ) 抗体を使用できる。 これら の改変抗体は、 既知の方法を用いて製造するこ とができる。
キメ ラ抗体は、 前記のようにして得た抗体 V 領域をコ一 ドする DN A をヒ ト抗体 C 領域をコ一 ドする DNA と連結し、 これを発現べクタ 一に組み込んで宿主に導入し産生させるこ とにより得られる （欧州 特許出願公開番号 EP 125023 、 国際特許出願公開番号 W0 92-19759 参照） 。 この既知の方法を用いて、 本発明に有用なキメ ラ抗体を得 るこ とができる。
例えば、 キヌ ラ PM-1抗体の L 鎖および H 鎖の V 領域をコー ドする DNA を含むプラス ミ ドは、 各々 pPM-k3および pPM- hiと命名され、 こ のプラス ミ ドを有する大腸菌は、 National Collections of Indust rial and Marine Bacteria Limitedに、 1991年 2 月 11日に、 各々 NC 1MB 40366 、 NC IMB40362としてブダペス ト条約に基づき国際寄託さ れている （国際特許出願公開番号 W0 92-19759 参照） 。
ヒ ト型化抗体は、 再構成 （reshaped) ヒ ト抗体とも称され、 ヒ ト 以外の哺乳動物、 例えばマウス抗体の相補性決定領域 （CDR; compl ementar i ty determining region ) をヒ 卜抗体の CDR へ移植したも のであり、 その一般的な遺伝子組換え手法も知られている （欧州特 訐出麒公開番号 EP 125023 、 国際特許出願公開番号 WO 92- 19759 参 照） 。
具体的には、 マウス抗体の CDR とヒ ト抗体のフ レームワーク領域 ( FR : f ramework regi on) を連結するように設計した DNA 配列を、 末端部にォ一バーラ ップする部分を有するように作製した数個のォ リ ゴヌ ク レオチ ドから PCR 法により合成する。 得られた DNA をヒ ト 抗体 C 領域をコー ドする DNA と連結し、 次いで発現べクターに組み 込んで、 これを宿主に導入し産生させるこ とにより得られる （欧州 特許出願公開番号 EP 239400 、 国際特許出願公開番号 W0 92-19759 参照） 。
CDR を介して連結される ヒ ト抗体の FRは、 CDR が良好な抗原結合 部位を形成するものが選択される。 必要に応じ、 再構成ヒ ト抗体の CDR が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の V 領域の FRのァ ミ ノ酸を置換してもよい （Sat o, K. e t a l .， Cancer Res. ( 1993) 5 3, 851 -856 ) o
キメ ラ抗体、 ヒ ト型化抗体には、 ヒ ト抗体 C 領域が使用される。 好ま しいヒ ト抗体 C 領域としては、 C rが挙げられ、 例えば、 C 7 1 、 C ァ 2 、 C ァ 3 、 C 7 4 を使用するこ とができる。 また、 抗体 またはその産生の安定性を改善するために、 ヒ ト抗体 C 領域を修飾 してもよい。
キメラ抗体はヒ ト以外の哺乳動物抗体由来の V 領域とヒ ト抗体由 来の C 領域からなり、 ヒ ト型化抗体はヒ ト以外の哺乳動物抗体由来 の CDR とヒ ト抗体由来の FRおよび C 領域からなり、 ヒ ト体内におけ る抗原性が低下しているため、 本発明の治療剤の有効成分として有 用である。
本発明に使用される ヒ ト型化抗体の好ま しい具体例としては、 ヒ ト型化 PM- 1抗体が挙げられる （国際特許出願公開番号 W0 92-19759 参照） 。
6. 抗体断片および抗体修飾物
本発明で使用される抗体は、 本発明に好適に使用され得るかぎり 、 抗体断片や抗体修飾物であってよい。 例えば、 抗体断片としては 、 Fab 、 F(ab' )2 、 Fvまたはシングルチヱイ ン Fv (scFv) が挙げら れる。 scFvは H鎖と L 鎖の Fvを適当な リ ンカーで連結させた構造を 有する。
これらの抗体断片を得るためには、 抗体を酵素、 例えば、 パパイ ン、 ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、 または、 これら抗 体断片をコー ドする遺伝子を構築し、 これを発現ベクターに導入し た後、 適当な宿主細胞で発現させる （例えば、 Co， M.S. et al. , J . Immunol. (1994) 152, 2968-2976、 Better, M. & Horwitz, A. H . Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Academic Press, Inc. 、 Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology (1 989) 178, 476-496, Academic Press. Inc. 、 Lamoyi, E.. Method s in Enzymology (1989) 121, 652-663 、 Rousseaux. J. et al. , Methods in Enzymology(1989) 121, 663-669 、 Bird, R. E. et a l.， TIBTECH (1991) 9, 132-137 参照） 。
scFvは、 抗体の H 鎖 V 領域と L 鎖 V 領域を連結するこ とにより得 られる （国際特許出願公開番号 W0 88-09344 参照） 。 この scFvにお いて、 H 鎖 V 領域と L 鎖 V 領域はリ ンカ一、 好ま しく は、 ぺプチ ド リ ンカ一を介して連結される （Huston, J. S. et al.、 Pro Natl . Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883) 。 scFvにおける H 鎖 V 領域および L 鎖 V 領域は、 上記抗体として記載されたもののいず れの由来であってもよい。 V 領域を連結するペプチ ドリ ンカ一とし ては、 例えばア ミ ノ酸 12- 19 残基からなる任意の一本鎖べプチ ドが 用いられる （米国特許 US 5525491参照） 。 scFvをコー ドする DNA は、 前記抗体の H 鎖または、 H 鎖 V 領域を コー ドする DNA 、 および L 鎖または、 L 鎖 V 領域をコ一 ドする DNA を铸型とし、 それらの配列のうちの所望のァ ミ ノ酸配列をコー ドす る DNA 部分を、 その両端を規定するプライマ一対を用いて PCR 法に より増幅し、 次いで、 さ らにペプチ ドリ ンカ一部分をコー ドする DN A およびその両端を各々 H 鎖、 L 鎖と連結されるように規定するプ ライマ一対を組み合せて増幅するこ とにより得られる。
また、 一旦 scFvをコー ドする DNA が作製されれば、 それらを含有 する発現ベクター、 および該発現べクタ一により形質転換された宿 主を常法に従って得るこ とができる。 また、 その宿主を用いて常法 に従って、 scFvを得るこ とができる。
これら抗体断片は、 前述のようにその遺伝子を取得し発現させ、 宿主により産生させるこ とができる。 本願特許請求の範囲でいう 「 抗体」 にはこれらの抗体断片も包含される。
抗体修飾物として、 ポリエチレングリ コール （PEG ) 等の各種分 子と結合した抗体を使用するこ ともできる。 本願特許請求の範囲で いう 「抗体」 にはこれらの抗体修飾物も包含される。 このような抗 体修飾物を得るには、 得られた抗体に化学的な修飾を施すこ とによ つて得るこ とができる。 これらの方法はこの分野においてすでに確 立されている。
7 . 発現および産生
前記のように構築した抗体遺伝子は、 公知の方法により発現させ 、 抗体を取得するこ とができる。 哺乳類細胞を使用する場合、 常用 される有用なプロモーター Zェンハンサ一、 発現される抗体遺伝子 、 その 3'側下流にポリ A シグナルを機能的に結合させた DNA あるい はそれを含むベクターにより発現させるこ とができる。 例えばプロ モータ一ノエンハンサ一としては、 ヒ トサイ トメガロウイ ルス前期 プロモーター/ェンノヽンサ— ( human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer ) を挙げるこ と力 できる。
また、 その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモ —ター/ェンハンサ一として、 レ トロウイ ルス、 ポリオ一マウィ ル ス、 アデノ ウイ ルス、 シ ミ アンウィ ルス 40 (SV 40 ) 等のウィ ルス プロモ一夕一/ェ ンノヽンサ一ゃヒ ト ェロンゲ一ショ ンフ ァ クタ一 1 a (HEF1 a ) などの哺乳類細胞由来のプロモータ一/ェンハンサ一 を用いればよい。
例えば、 SV 40 プロモーターノェンハンサ一を使用する場合、 Mu iliganらの方法 （Nature (1979) 277， 108) 、 また、 HEF1ひプロモ —夕一/ェンハンサーを使用する場合、 Mizushima らの方法 （Nucl eic Acids Res. (1990) 18, 5322) に従えば容易に実施するこ とが できる。
大腸菌の場合、 常用される有用なプロモータ一、 抗体分泌のため のシグナル配列、 発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて発現 させるこ とができる。 例えばプロモー夕一と しては、 lacZプロモー 夕一、 araBプロモータ一を挙げるこ とができる。 lacZプロモ一夕一 を使用する場合、 Wardらの方法 （Nature (1098) 341, 544- 546； FA SEB J. (1992) 6, 2422-2427) 、 araBプロモータ一を使用する場合 、 Betterらの方法 （Science (1988) 240, 1041-1043 ) に従えばよ い。
抗体分泌のためのシグナル配列と しては、 大腸菌のぺリ ブラズ厶 に産生させる場合、 pelBシグナル配列 （Lei, S. P. et al J. Bact eriol. (1987) 169. 4379 ) を使用すればよい。 ペリ ブラズムに産 生された抗体を分離した後、 抗体の構造を適切にリ フオール ド （re fold) して使用する （例えば、 国際特許出願公開番号 W096- 30394、 日本特許出願公告特公平 7- 93879 を参照） 。 複製起源としては、 SV 40 、 ポリオ一マウィ ルス、 アデノウィ ル ス、 ゥシパピローマウィ ルス （BPV ) 等の由来のものを用いるこ と ができる。 さ らに、 宿主細胞系で遺伝子コ ピー数増幅のため、 発現 ベクタ一は選択マーカ一として、 ア ミ ノ グリ コシ ド トラ ンスフェラ ーゼ （APH ) 遺伝子、 チミ ジンキナーゼ （TK) 遺伝子、 大腸菌キサ ンチングァニンホスホリ ボシル トラ ンスフェラ一ゼ （ Ecogpt) 遺伝 子、 ジヒ ドロ葉酸還元酵素 （dhfr) 遺伝子等を含むこ とができる。
本発明で使用される抗体の製造のために、 任意の産生系を使用す るこ とができる。 抗体製造のための産生系は、 in vitroおよび in v ivo の産生系がある。 in vitroの産生系としては、 真核細胞を使用 する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
真核細胞を使用する場合、 動物細胞、 植物細胞、 真菌細胞を用い る産生系がある。 動物細胞と しては、 （1) 哺乳類細胞、 例えば CH0 ( J. Exp. Med. (1995) 108. 945) 、 COS 、 ミ エローマ、 BHK (ba by hamster kidney ) 、 HeLa、 Vero、 (2) 両生類細胞、 例えばァフ リ カツメガエル卵母細胞 （Valle, et al. , Nature (1981) 291. 35 8-340 ) 、 あるいは（3) 昆虫細胞、 例えば sf9 、 sf2K Tn5 が知ら れている。 CH0 細胞と しては、 特に DHFR遺伝子を欠損した CH0 細胞 である dhfr - CHO (Pro Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4 220 ) や CHO K-l (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275 ) を好適に使用するこ とができる。
植物細胞と しては、 Nicotiana tabacum 由来の細胞が知られてお り、 これをカルス培養すればよい。 真菌細胞と しては、 酵母、 例え ばサッカロ ミ セス （Saccharomyces ) 属、 例えばサッカロ ミ セス ' セ レ ピシェ ( Saccharomyces cerevisiae) 、 糸状菌、 例えばァスぺ ルギウス属 （Aspergillus ) 属、 例えばァスペルギウス ' ニガ一 （ Aspergillus niger ) などが知られている。 原核細胞を使用する場合、 細菌細胞を用いる産生系がある。 細菌 細胞としては、 大腸菌 （E. coli ) 、 枯草菌が知られている。
これらの細胞に、 目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し 、 形質転換された細胞を in vitroで培養するこ とにより抗体が得ら れる。 培養は、 公知の方法に従い行う。 例えば、 培養液として、 DM EM、 MEM 、 RPMI 1640, IMDMを使用するこ とができる。 その際、 牛胎 児血清 （FCS ) 等の血清捕液を併用するこ ともできる し、 無血清培 養してもよい。 また、 抗体遺伝子を導入した細胞を動物の腹腔等へ 移すこ とにより、 in vivo にて抗体を産生してもよい。
一方、 in vivo の産生系と しては、 動物を使用する産生系や植物 を使用する産生系が挙げられる。 これらの動物または植物に抗体遺 伝子を導入し、 動物または植物の体内で抗体を産生させ、 回収する ο
動物を使用する場合、 哺乳類動物、 昆虫を用いる産生系がある。 哺乳類動物としては、 ャギ、 ブ夕、 ヒッジ、 マウス、 ゥシを用い るこ とができる （Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applica tions, 1993 ) 。 また、 哺乳類動物を用いる場合、 ト ラ ンスジェニ ッ ク動物を用いるこ とができる。
例えば、 抗体遺伝子をャギ /Sカゼイ ンのような乳汁中に固有に産 生される蛋白質をコー ドする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子と して調製する。 抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含む DNA 断片 をャギの胚へ注入し、 この胚を雌のャギへ導入する。 胚を受容した ャギから生まれる ト ラ ンスジエニッ クャギまたはその子孫が産生す る乳汁から所望の抗体を得る。 ト ラ ンスジ ニッ クャギから産生さ れる所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、 適宜ホルモンを トラ ンスジエニッ クャギに使用してもよい。 （Ebert, K. M. et al. , Bio/Technology (1994) 12, 699-702 ) 。
2 ο また、 昆虫としては、 例えばカイ コを用いることができる。 カイ コを用いる場合、 目的の抗体遺伝子を挿入したバキュロウィ ルスを カイ コに感染させ、 このカイコの体液より所望の抗体を得る （Susu mu, M. et al.， Nature (1985) 315, 592-594 ) 。
さ らに植物を使用する場合、 例えばタバコを用いることができる 。 タバコを用いる場合、 目的の抗体遺伝子を植物発現用ベクター、 例えば pMON 530に揷入し、 このベクターを Agrobacterium tumefaci ens のようなバクテリアに導入する。 このバクテリアをタバコ、 例 えば Nicotiana tabacum に感染させ、 本タバコの葉より所望の抗体 を得る （Julian, K. - C. Ma et al. , Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138) o
上述のように in vitroまたは in vivo の産生系にて抗体を産生す る場合、 抗体の H鎖または L 鎖をコー ドする DNA を別々 に発現べク ターに組み込んで宿主を同時形質転換させてもよいし、 あるいは H 鎖および L 鎖をコー ドする DNA を単一の発現ベクターに組み込んで 、 宿主を形質転換させてもよい （国際特許出願公開番号 W0 94-1152 3 参照） 。
宿主への発現ベクターの導入方法と しては、 公知の方法、 例えば リ ン酸カルシウム法 （Virology (1973) 52, 456-467 ) やエレク ト 口ポレーショ ン法 （EMBO J. (1982) 1， 841-845 ) 等が用いられる
8. 抗体の分離、 精製
前記のように産生、 発現された抗体は、 細胞内外、 宿主から分離 し均一にまで精製するこ とができる。 本発明で使用される抗体の分 離、 精製は、 通常の蛋白質の精製で使用されている分離、 精製方法 を使用すればよ く、 何ら限定される ものではない。 例えば、 ァフィ 二ティ 一クロマ トグラフィ ー等のクロマ トグラフィ ーカラム、 フィ ルター、 限外濾過、 塩析、 透析等を適宜選択、 組み合わせれば抗体 を分離、 精製するこ とができる （Antibodies: A Laboratory anua 1. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) 。
ァフィ二ティ 一クロマ トグラフィ 一に用いるカラムと しては、 例 えばプロテイ ン A カラム、 プロテイ ン G カラムが挙げられる。 プロ ティ ン A カ ラムに用いる担体として、 例えば Hyper D 、 P0R0S 、 Se pharose F. F. (Pharmacia)等が挙げられる。
ァフィ二ティ ークロマ トグラフィ ー以外のクロマ トグラフィ ーと しては、 例えばイオン交換クロマ トグラフィ ー、 疎水性クロマ ト グ ラフィ 一、 ゲル濾過、 逆相クロマ トグラフィ ー、 吸着ク ロマ トグラ フィ 一 力 挙げられる (Strategies for Protein Purif ication an d Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996) o
これらのクロマ トグラフィ ーは、 液相クロマ トグラフィ ー、 例え ば HPLC、 FPLC等の液相ク口マ トグラフィ 一を用いて行う こ とができ る o
9. 抗体の濃度測定
得られた抗体の濃度測定は、 吸光度の測定または酵素結合免疫吸 着検定法 （ enzyme - 1 inked immunosorbent assay； ELISA) 等によ り 行う こ とができる。 すなわち、 吸光度の測定による場合には、 得ら れた抗体を PBS で適当に希釈した後、 280 nmの吸光度を測定する。 例えば、 ヒ ト抗体の場合、 1 mg/ml を 1.35 0D として算出すればよ い。
また、 ELISA による場合は以下のように測定するこ とができる。 すなわち、 0.1M 重炭酸緩衝液 （pH9.6 ) で 1 mg/ml に希釈したャ ギ抗ヒ ト IgG (TAGO製） 100 mlを 96穴プレー ト （Nunc製） に加え、 4 °Cで一晩イ ンキュベー ト し、 抗体を固層化する。 ブロ ッキングの 後、 適宜希釈した本発明で使用される抗体または抗体を含むサンプ ル、 あるいは濃度標準品と して既知の濃度のヒ ト IgG (CAPPEL製） 100 mlを添加し、 室温にて 1 時間イ ンキュベー トする。
洗浄後、 5000倍希釈したアル力 リ フ ォスファターゼ標識抗ヒ ト Ig G (BIO SOURCE製） 100ml を加え、 室温にて 1 時間ィ ンキュベ一 ト する。 洗浄後、 基質溶液を加えィ ンキュペー トの後、 MICROPLATE R EADER Model 3550 (Bio-Rad 製） を用いて 405nm での吸光度を測定 し、 目的の抗体の濃度を算出する。
また、 抗体の濃度測定には、 BIAcore (Pharmacia 製） を使用す るこ とができる。
10. 抗体の活性の確認
本発明で使用される抗 IL- 6レセプター抗体の抗原結合活性、 結合 阻害活性、 中和活性の評価は、 通常知られた方法を使用するこ とが できる。 例えば、 IL- 6反応性細胞、 例えば MH60.BSF2 を培養したプ レー 卜に IL-6を添加する。 ついで抗 IL-6レセプター抗体を共存させ るこ とによ り IL-6反応性細胞の 3H 標識チ ミ ジン取込みを指標と し て評価すればよい。
また、 IL- 6レセプ夕一発現細胞、 例えば U266を培養したプレー ト に抗 IL-6レセプター抗体と 125 I標識 IL- 6を加える。 そして、 IL - 6 レセプ夕一発現細胞に結合した 125 I標識 IL-6を測定するこ とによ り評価すればよい （Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) 0 また、 本発明で使用される抗 IL- 6レセプター抗体の抗原結合活性 を測定する方法と して、 ELISA 、 EIA (酵素免疫測定法） 、 RIA ( 放射免疫測定法） あるいは蛍光抗体法を用いるこ とができる。 8/00648 例えば、 ELISA を用いる場合、 IL- 6レセプター抗体に対する抗体 、 例えばその C 領域に対する抗体を固相化した 96穴プレー トに IL-6 レセプターを添加し、 次いで目的の抗 IL-6レセプ夕一抗体を含む試 料、 例えば抗 IL-6レセプ夕一抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を 加える。
アルカ リ フ ォスファターゼ等の酵素で標識した目的の抗 Iし- 6レセ プ夕ー抗体を認識する二次抗体を添加し、 プレー トをイ ンキュベー トおよび洗浄した後、 p - ニ トロフヱニルリ ン酸等の酵素基質を加 えて吸光度を測定するこ とにより抗原結合活性を評価するこ とがで きる。 IL-6レセプ夕一として、 可溶性 IL- 6レセプ夕一を使用しても よい。
本発明で使用される抗 IL- 6レセプ夕一抗体のリ ガン ドレセプ夕一 結合阻害活性を測定する方法としては、 通常の Cell ELISA. あるい はリ ガン ドレセプター結合アツセィを用いるこ とができる。
例えば、 Cell E1LISA の場合、 IL- 6レセプ夕一を発現する細胞を 96穴プレー 卜で培養して接着させ、 パラホルムアルデヒ ド等で固定 化する。 または、 IL-6レセプターを発現する細胞の膜分画を調製し て固相化した 96穴プレー トを作製する。 このプレー トに目的の抗 IL - 6レセプター抗体を含む試料、 例えば抗 IL- 6レセプター抗体產生細 胞の培養上清や精製抗体を、 放射性同位元素、 例えば 125 I等で標 識した IL- 6を添加する。
プレー トをィ ンキュベー トおよび洗浄した後、 放射活性を測定す るこ とで IL- 6レセプターに結合した IL-6量を測定でき、 抗 IL- 6レセ プ夕ー抗体のリ ガン ドレセプター結合阻害活性を評価するこ とがで きる。
例えば、 細胞上の IL- 6レセプ夕一に対する IL- 6の結合阻害ァッセ ィには、 IL- 6レセプターを発現する細胞を遠心分離等の手段で分離 した後、 細胞懸濁液として調製する。 放射性同位元素、 例えば 125
I 等で標識した IL- 6の溶液あるいは非標識 IL-6と標識 IL- 6の混合溶 液と濃度調製した抗 IL-6レセプタ一抗体を含む溶液を細胞懸濁液に 添加する。 一定時間の後、 細胞を分離し細胞上に結合した標識 IL - 6 の放射活性を測定すればよい。
上記抗体の活性評価には、 BIAcore (Pharmacia 製） を使用する こ とができる。
11. 治療効果の確認
本発明の予防および Zまたは治療剤の治療対象疾患は、 全身性ェ リ テマ トーデスである。 本発明により達成される効果を確認するに は、 抗 IL- 6レセプ夕一抗体を、 ヒ トの全身性エリ テマ ト一デスの病 態を呈するモデル動物に投与するこ とにより効果を確認するこ とが できる。
使用されるモデル動物としては、 ヒ トの全身性エリテマ ト一デス の病態を最もよ く あらわすモデル動物が用いられる。 ヒ トの全身性 エリ テマ トーデスの病態を最もよ く あらわすモデル動物は、 NZB/WF 1 マウスである。 NZB/WF1マウスはすでに知られており、 入手可能 なモデル動物である。
全身性ェリ テマ ト一デスは、 抗核抗体または抗 DNA 抗体やその免 疫複合体が各種臓器 · 組織に沈着するこ とにより炎症反応が誘導さ れて生ずる全身性の自己免疫疾患である。 抗核抗体または抗 DNA 抗 体やその免疫複合体が腎糸球体に沈着すると自己免疫性のループス 腎炎が発症する。 全身性エリテマ トーデスでは血中 IL- 6の増加を示 す患者は少なく、 IL- 6の病態への関与は否定的である （Peterson, E. et al.， Lupus. (1996) 5, 571-576 ) 。
IL-6は腎糸球体に存在するメサンジゥム細胞に直接作用し、 メサ ンジゥム細胞を増殖させるこ とにより糸球体腎炎を誘導するこ とが 報告されている （Suemat su , S. e t a l . , P roc. Na t l . Acad. Sc i . USA ( 1989) 86， 7547-7551 ) 。 ループス腎炎は糸球体に I gGクラスの抗 核抗体または抗 DNA 抗体やその免疫複合体が沈着し、 糸球体で炎症 反応が誘導されるこ とにより糸球体が傷害を受けて腎炎を発症する こ とから、 発症機序において I L- 6により誘導されるメサンジゥム増 殖性糸球体腎炎と区別される。
後述の実施例に示されるように、 NZB/WF1マウスへ抗 I L- 6レセプ ター抗体を投与するこ とにより、 I gGクラスの抗 DNA 抗体の抑制お よび尿夕 ンパクの漏出抑制が認められた。 NZB/WF 1 マウスはヒ トの 全身性エリ テマ トーデスの病態を最もよ く反映しているモデル動物 であるこ とから、 抗 Iし- 6レセプ夕一抗体は全身性エリ テマ トーデス に対して治療効果を有するこ とが示された。
したがって、 本発明の予防および Zまたは治療剤は、 全身性エリ テマ トーデスの予防および または治療剤として有用である。 また 、 本発明の予防および Zまたは治療剤は、 全身性エリテマ トーデス における抗 DNA 抗体を減少させるための予防およびノまたは治療剤 および全身性エリ テマ トーデスにおける尿タ ンパク漏出を減少させ るための予防および/または治療剤と して有用である。
12. 投与経路および製剤
本発明の予防および/または治療剤は、 経口的あるいは非経口的 に全身あるいは局所的に投与するこ とができる。 非経口的投与投与 と しては、 例えば、 点滴などの静脈内注射、 筋肉内注射、 腹腔内注 射、 皮下注射を選択するこ とができ、 患者の年齢、 症状により適宜 投与方法を選択するこ とができる。
本発明の予防および/または治療剤は、 病気に既に悩まされる患 者に、 病気の症状を治癒するか、 あるいは少なく とも部分的に阻止 するために十分な量で投与される。 例えば、 有効投与量は、 一回に AU98/00648 つき体重 1 kgあたり 0. 0 1 mg から 1 00 mgの範囲で選ばれる。 あるい は、 患者あたり 1 - 1 000 mg 、 好ま しく は 5- 50 mg の投与量を選ぶこ とができる。 しかしながら、 本発明の予防およびノまたは治療剤は これらの投与量に制限される ものではない。
投与時期は、 全身性ェリテマ ト一デスが生じてから投与してもよ いし、 あるいは全身性エリ テマ トーデスの発症が予測される時に発 症時の症状緩和のために予防的に投与してもよい。
また、 投与期間は、 患者の年齢、 症状により適宜選択するこ とが できる。
本発明の予防および/または治療剤は、 投与経路次第で医薬的に 許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。 このよ う な担体および添加物の例と して、 水、 医薬的に許容される有機溶媒 、 コラーゲン、 ポリ ビニルアルコール、 ポリ ビニルピロ リ ドン、 力 ルポキシビ二ルポリマー、 カルボキシメチルセルロースナ ト リ ゥ厶 、 ポリ アタ リ ル酸ナ ト リ ウム、 アルギン酸ナ ト リ ウム、 水溶性デキ ス トラ ン、 カルボキシメチルスターチナ ト リ ウム、 ぺクチン、 メチ ルセルロース、 ェチルセルロース、 キサンタ ンガム、 アラ ビアゴム 、 カゼイ ン、 ゼラチン、 寒天、 ジグリセリ ン、 プロ ピレングリ コ一 ル、 ポ リ エチ レ ングリ コール、 ワセ リ ン、 ノ、。ラ フ ィ ン、 ステア リ ル アルコール、 ステア リ ン酸、 ヒ ト血清アルブミ ン （H SA ) 、 マンニ トール、 ソルビ トール、 ラ ク トース、 医薬添加物と して許容される 界面活性剤などが挙げられる。 使用される添加物は、 剤型に応じて 上記の中から適宜あるいは組合せて選択されるが、 これらに限定さ れるものではない。 実施例
以下、 実施例、 参考例および実験例により本発明を具体的に説明 するが、 本発明はこれらに限定されるものではない。
参考例 1. ヒ ト可溶性 IL-6レセプターの調製
Yamasakiらの方法 （Science (1988) 241, 825-828 ) に従い得ら れた IL-6レセプ夕一をコ一 ドする cDNAを含むプラス ミ ド PBSF2R.236 を用いて、 PCR 法により可溶性 IL- 6レセプターを作成した。 プラス ミ ド PBSF2R.236を制限酵素 Sph I で消化して、 IL- 6レセプ夕一 cDNA を得、 これを mpl8 (Amersham製） に揷入した。 I L- 6レセプ夕一 cDNA にス ト ップコ ドンを導入するようにデザイ ンした合成オリ ゴプライ マ一を用いて、 イ ンビトロ ミ ュー夕ジエネシスシステム （Amersham 製） により、 PCR 法で IL-6レセプター cDNAに変異を導入した。 この 操作によりス ト ップコ ドンがア ミ ノ酸 345 の位置に導入され、 可溶 性 I L-6レセプ夕一をコー ドする cDNAが得られた。
可溶性 IL- 6レセプ夕一 cDNAを CH0 細胞で発現するために、 プラス ミ ド pSV (Pharmacia 製） と連結させ、 プラス ミ ド PSVL344 を得た 。 dhfrの cDNAを含むプラス ミ ド pECEdhf rに Hindll I- Sal I で切断し た可溶性 IL- 6レセプター cDNAを挿入し， CH0 細胞発現プラス ミ ド pE CEdhfr344 を得た。
10〃 g のプラス ミ ド pECEdhfr344 を dhfr- CH0細胞株 DXB- 11 (Urla nd et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220) へカルシウムフ ォスフヱイ ト沈降法 （Chen et al.， ol. Cell. Bi ol. (1987) 7, 2745-2751 ) により、 トラ ンスフエ ク ト した。 トラ ンスフエ タ ト した CH0 細胞を ImM グル夕 ミ ン、 10% 透析 FCS 、 100U /ml のペニシリ ンおよび 100 UL /ml のス ト レプトマイシンを含むヌ ク レオシ ド不含ひ MEM 選択培養液で 3 週間培養した。
選択された CH0 細胞を限界希釈法でスク リ ーニングし、 単一の CH 0 細胞クロー ンを得た。 この CH0 細胞クロー ンを 20nM- 200nMの濃度 のメ ト ト レキセ一 ト （MTX ) で増幅し、 ヒ ト可溶性 IL-6レセプ夕一 産生 CHO 細胞株 5E27を得た。 CH0 細胞株 5E27を 5%FBS を含むイスコ ーブ改変ダルべコ培養液 （IMDM、 Gibco 製） で培養した。 培養上清 を回収し、 培養上清中の可溶性 IL- 6レセプ夕一の濃度を ELISA にて 測定した。
参考例 2. 抗ヒ ト IL- 6レセプター抗体の調製
Hirataらの方法 （J. Immunol. , 143:2900-2906, 1989) により作 成した抗 IL- 6抗体 MT18を CNBrにより活性化させたセファロース 4B ( Pharmacia Fine Chemicals製， Piscataway, NJ) と添付の処方にし たがって結合させ、 IL-6レセプ夕一 （Science (1988) 241, 825-82 8 ) を精製した。 ヒ ト ミエローマ細胞株 U266を 1%ジギトニン （Wako Chemicals製） ， 10mMト リエタノールァ ミ ン （pH 7.8) および 0.15 M NaClを含む lmM p-パラァ ミ ノ フエニルメ タ ンスルフ ォニルフルォ ライ ドハイ ドロクロ リ ド （Wako Chemicals製） （ジギトニン緩衝液 ) で可溶化し、 セファロ一ス 4Bビーズと結合させた MT18抗体と混合 した。 その後、 ビーズをジギトニン緩衝液で 6 回洗浄し、 免疫する ための部分精製 IL- 6レセプ夕一とした。
BALB/cマウスを 3 X 109 個の U266細胞から得た上記部分精製 IL - 6 レセプ夕一で 10日おきに 4 回免疫し、 その後常法によりハイプリ ド 一マを作成した。 成長陽性穴からのハイプリ ドーマ培養上清を下記 の方法にて IL-6レセプターへの結合活性を調べた。 5 X 107 個の U2 66細胞を35 S-メチォニン （2.5mCi) で標識し、 上記ジギトニン緩衝 液で可溶化した。 可溶化した U266細胞を 0.04ml容量のセファロース 4Bビーズと結合させた MT18抗体と混合し、 その後、 ジギトニン緩衝 液で 6 回洗浄し、 0.25mlのジギトニン緩衝液 （PH3.4 ) により 35 S - メチォニン標識 IL-6レセプ夕一を流出させ、 0.025ml の 1M Tris ( pH 7.4) で中和した。
0.05mlのハイブリ ドーマ培養上清を 0.01mlの Protein G セフ ァ ロ ース （Phramacia 製） と混合した。 洗浄した後、 セファロースを上 記で調製した 0.005ml の35 S 標識 IL- 6レセプター溶液とともにイ ン キュペー ト した。 免疫沈降物質を SDS- PAGEで分析し、 IL-6レセプ夕 一と反応するハイプリ ドーマ培養上清を調べた。 その結果、 反応陽 性ハイプリ ドーマクローン PM - 1を樹立した。 ハイプリ ドーマ PM-1か ら産生される抗体は、 IgGl 型のサブタイプを有する。
ハイプリ ドーマ PM-1が産生する抗体のヒ ト IL- 6レセプターに対す る IL-6の結合阻害活性をヒ ト ミエロ一マ細胞株 U266を用いて調べた 。 ヒ ト組換型 IL- 6を大腸菌よ り調製し （Hiranoら， Immunol. Lett.
(1988) 17, 41) 、 ボル ト ン—ハン夕一試薬 （New England Nuclea r 製， Boston, MA) により 125 I標識した （Taga, T. et al.， J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981 ) 。 4 x iO5 個の U266細胞を 100 倍量の過剰な非標識 IL-6の存在下で室温にて、 1 時間、 70% (v/v ) のハイプリ ドーマ PM-1の培養上清を 14000cpmの 125 1標識 IL- 6と ともに培養した。 70 1 のサンプルを 400 n 1 のマイ クロフュージ ポリエチレ ンチューブに 300 1 の FCS 上に重層し、 遠心の後、 細 胞上の放射活性を測定した。
その結果、 ハイプリ ドーマ PM- 1が産生する抗体は、 IL- 6の IL-6レ セプ夕一に対する結合を阻害するこ とが明らかとなった。
参考例 3. 抗マウス IL- 6レセプ夕一抗体の調製
Saito. et al. , J. Immunol. (1993) 147， 168- 173に記載の方法 により、 マウス IL-6レセプターに対するモノ クローナル抗体を調製 し 7こ
マウス可溶性 IL- 6レセプターを産生する CH0 細胞を 10%FCSを含む IMDM培養液で培養し、 その培養上清からマウス可溶性 IL- 6レセプ夕 -RS12 (上記 Saito, et al参照） と Affigel 10ゲル （Biorad製） に 固定したァフ ィ二ティ 一カラムを用いてマウス可溶性 IL-6レセプ夕 —を精製した。
得られたマウス可溶性 I L- 6レセプ夕一 50 g をフロイ ン ト完全ァ ジュバン ドと混合し、 ウィ スターラ ッ ト （日本チャールズリバ一製 ) の腹部に注射した。 2 週間後からはフロイ ン ト不完全アジュバン ドで追加免疫した。 45日目にラ ッ トを屠殺し、 その脾細胞約 2 X 10 8 個を 1 X 107 個のマウス ミ エローマ細胞 P3U1と 50% の PEG1500 ( ベー リ ンガーマンハイム製） をもちいて常法により細胞融合させた 後、 HAT 培地にてハイプリ ドーマをスク リ 一二ングした。
ゥサギ抗ラ ッ ト IgG 抗体 （カ ッペル製） をコー ト したプレー トに ハイプリ ドーマ培養上清を加えた後、 マウス可溶性 IL- 6レセプター を反応させた。 次いで、 ゥサギ抗マウス IL-6レセプ夕一抗体および アルカ リ フ ォスフ ァタ一ゼ標識ヒッジ抗ゥサギ IgG による ELI SA 方 によりマウス可溶性 IL-6レセプ夕一に対する抗体を産生するハイブ リ ドーマをスク リーニングした。 抗体の産生が確認されたハイブリ ドーマクローンは 2 回のサブスク リ ーニングを行い、 単一のハイブ リ ドーマクローンを得た。 このクロー ンを MR16-1と名付けた。
このハイブリ ドーマが産生する抗体のマウス IL-6の情報伝達にお ける中和活性を MH60. BSF2 細胞 （Matsuda et al.， J. immunol. (1 988) 18, 951-956) を用いた 3H 標識チ ミ ジンの取込みで調べた。 96ゥエルプレー トに MH60. BSF2 細胞を 1 x 104 個/ 200 1/ゥエルと なるように調製した。 このプレー トに 10pg/ral のマウス IL-6と MR16 -1抗体または RS12抗体を 12.3- lOOOng/mlを加えて 37°C、 5%C02 で 44 時間培養した後、 1 Ci/ ゥヱルの 3H 標識チ ミ ジンを加えた。 4 時間後に 3H 標識チ ミ ジンの取込みを測定した。 その結果 MR16- 1抗 体は MH60.BSF2 細胞の 3H 標識チ ミ ジン取込みを抑制した。
したがって、 ハイプリ ドーマ MR16- 1が産生する抗体は、 IL-6の IL -6レセプ夕一に対する結合を阻害するこ とが明らかとなった。 蔘考例 4. ヒ ト型化 PM- 1抗体の作成
ヒ ト型化 PM-1抗体を国際特許出願公開番号 W092- 19759に記載の方 法により得た。 参考例 2で作成されたハイプリ ドーマ PM- 1から常法 により全 RNA を調製し、 これより一本鎖 cDNAの合成を行った。 ポリ メ ラーゼ連鎖反応 （PCR)法によりマウス PM- 1抗体の可変領域 （V領 域） をコー ドする DNA を増幅した。 PCR 法には、 Jones, S.T.et al .， Bio/Tcchnology(1991)9， 88-89 に記載されたプライマーを使用 し/^ ·
PCR 法により増幅した DNA 断片を精製し、 マウス k型 L鎖 V領域 をコ— ドする遺伝子を含む DNA 断片及びマウス 7型 H鎖 V領域をコ ― ドする遺伝子を含む DNA を断片を得た。 これらの DNA 断片をブラ ス ミ ド PUC19 に連結し、 大腸菌 DH5 αのコ ンビテン ト細胞に導入し て大腸菌形質転換体を得た。 この形質転換体から上記プラス ミ ドを 得、 プラス ミ ド中の cDNAコー ド領域の塩基配列を常法にしたがい決 定し、 さ らに各 V領域の相補性決定領域 （CDR)を決定した。
キメ ラ PM-1抗体を発現するべクタ一を作製するため、 マウス PM-1 抗体の k型 L鎖及び H鎖の各々 V領域をコー ドする cDNAを HCMV発現 ベクターに挿入した。 産生されたキメ ラ PM - 1抗体が正しい抗原結合 活性を有するこ とを確認した後、 CDR- grafting法により ヒ ト型化 PM - 1抗体を作製した。 ク レームワーク領域 （FR) のア ミ ノ酸を置換し 、 キヌ ラ抗体と同程度の抗原結合活性を有するヒ ト型化 PM-1抗体を 作製した。
得られたヒ ト型化 PM- 1抗体の L鎖及び II鎖をコ一 ドする遺伝子を 哺乳類細胞中で発現させるため、 各々をヒ トェロ ンゲ一ショ ンフ ァ クタ一 1 ひ (HEF-1 a ) プロモーターを含むベクターに導入した。 これらの発現べクタ一で CH0 細胞を同時形質転換するこ とにより、 ヒ ト型化 PM-1抗体を産生する CH0 細胞株を樹立した。 得られたヒ ト 型化 PM- 1抗体が、 ヒ ト IL- 6レセプターへの抗原結合活性を有するこ とを ELISA により確認した。. さ らに、 ヒ ト型化 PM-1抗体はマウス PM -1抗体及びキメ ラ PM-1抗体と同程度に、 ヒ ト IL - 6のヒ ト IL-6レセプ 夕一への結合を阻害した。
実施例 1.
MR16- 1および KH- 5 (抗 DNP- KLH 抗体） はラ ッ トの IgG であり、 マ ウスに連続投与する とラ ッ ト IgG に対する抗体の産生やショ ッ ク症 状を引き起こす可能性がある。 そこで、 MR16- 1や KH- 5の投与を開始 する前に、 これら抗体に対する免疫寛容を Finck, B. K. et al., J . Clin. Invest. (1994) 94, 585-591に記載の方法を用いて誘導し た。
すなわち、 13週齢の雌性 NZB/W F1マウス （一群 10匹 （ただし Vehi cle 投与 9 匹） ） に抗 CD4 抗体 （GK1.5 ) 1 mgを 3 日間連続して腹 腔内投与し、 0.5 mg の MR16- 1あるいは KH-5を 2回目の抗 CD4 抗体 の投与と同時に腹腔内に投与した。 その後、 MR16- 1 (0.5 mg) 、 コ ン トロール抗体として同量の KH- 5およびビヒクル ' コン トロールと して salineを週 1 回、 64週齢まで腹腔内投与し、 尿タンパク排泄量 および血中抗 DNA 抗体量を定期的に測定した。
また、 血中の免疫グロブリ ン量についても測定した。 尿タ ンパク 量の測定は、 コンビスティ ッ クス紙 （バイエル三共製） を用いて行 い、 タンパク量が 100 mg/dl を越えた個体を陽性とした。 結果は図 1 に示す。 さ らに生存日数についても観察した。 結果を図 2に示す 。 血中の抗 DNA 抗体量は ELISA 法によ り測定した。 結果 （平均土標 準誤差） を図 3に示す。 血中の免疫グロプリ ン量は放射免疫拡散法 にて測定した。 結果 （平均土標準誤差） を表 1 に示す。 1 32週齢時の血中免疫グロブリン量 （mg/ml)
IgGl IgG2a IgG3 IgM IgA
Sal ine I.24±0.11 6.44±1.38 2.25 ±0.37 1.40±0.14 1.13±0.06
KH-5 1.14±0.09 4.18±0.57 1.82±0.27 1.20±0.09 1.18±0.11
MR16-1 0.84±0.14 3.21±0.46 1.23±0.15 1.21±0.13 1.15±0.04
表 1 は、 血中の免疫グロブリ ン量に及ぼす MR16-1の効果を示す。 表中、 igG サブクラス （subclass) 、 IgM と IgA についての結果は 32週齢時のものである。
すなわち、 ビヒクル投与群では 28週齢から、 KH- 5投与群では 38週 齢から尿夕 ンパクの排泄がみられ、 実験終了の 64週齢ではビヒクル 投与群では全例のマウスが、 また、 KH- 5投与群では 90% のマウスが 陽性となつたのに対して、 MR16-1投与群では尿夕 ンパクの出現時期 が著明に延長され、 発症率も著明に抑制された。
生存日数においても MR16-1は明らかに生存日数を延長し、 64週齢 までに 1 匹が死亡したにすぎなかった。 また、 抗 DNA 抗体量におい ては、 MR16- 1投与群では IgG クラスの抗 DNA 抗体の産生が著明に抑 制されたが、 IgM クラスの抗体には影響が見られなかった。 血中の 免疫グロブリ ン量においては、 MR16- 1投与群では IgGl, IgG2および IgG3量が減少していたが、 IgM および IgA 量には影響が見られなか つた。
以上の成績から、 抗 IL-6レセプター抗体は全身性ェリテマ トーデ スの予防および/または治療剤として有用であるこ とが明らかにな つ 7こ。
IL-6の生物学的活性を阻害するには、 抗 IL- 6抗体と抗 IL-6レセプ 夕一抗体を使用するこ とが考えられるが、 全身性エリテマ トーデス において抗 IL-6レセプター抗体は抗 IL-6抗体に比べ、 治療効果が強 いと考えられる。
本発明において抗 IL- 6レセプ夕一抗体を使用した場合、 1例のマ ウスを除いて腎炎の発症は全く 見られなかったのに対して、 Finck ， B. K. et al. , J. Clin. Invest. (1994) 94， 585-591 の実験で は抗 IL- 6抗体を使用したこ とにより、 7 ヶ月齢から腎炎を発症する マウスが増加しており、 9 ヶ月齢以降も増加する可能性が考えられ る。 このこ とから、 抗 IL- 6抗体は抗 IL- 6レセプター抗体に比べて効 果が不十分であると推測される。
また、 Finck らの報告では、 血中の免疫グロブリ ン量の変化とし て、 IgGlでは 2%減少， IgG2a では 12% 減少， IgG3では 92% 増加であ り、 血中の免疫グロプリ ン量には抗 IL- 6抗体は影響を及ぼさなかつ たと述べている。 一方、 本発明の抗 IL-6レセプター抗体を用いた実 験では、 コ ン トロール抗体投与群と比較して、 IgGlは 27% 、 IgG2a は 23% 、 IgG3は 32% 減少していた。 この結果からも抗 IL-6レセプ夕 一抗体の方が効果が強いと思われる。
これまでに抗 IL-6抗体をヒ トゃマウスに投与した場合、 血中の IL - 6濃度が著しく上昇するこ とが数多く 報告されている （Wendling. D. et al. , J. Rheumatol. (1993) 20, 259-262, Heremans, H. et al.， Eur. J. Immunol. (1992) 22, 2395-2401) 。 さ らに Iい 6と抗 IL -6抗体を同時投与すると IL- 6の活性が著しく上昇するこ とも見出さ れている （Mihara, M. et al. , Immunology (1991) 74, 55-59) 。 本発明において、 抗 IL- 6レセプ夕一抗体を投与したマウスの血中 の IL-6濃度を測定したところ、 測定限界以下であった。 したがって 、 抗 IL- 6レセプター抗体を投与しても、 血中の IL-6は上昇しない可 能性が示唆された。 この事実から考えて、 抗 IL-6抗体より抗 IL- 6レ セプター抗体の方が優れていると考えられる。 産業上の利用可能性
本発明により、 抗 IL- 6レセプ夕一抗体が全身性エリテマ トーデス の治療効果を有するこ とが示された。 したがって、 抗 IL- 6レセプ夕 一抗体は全身性ェリテマ トーデスの予防および/または治療剤とし て有用である。
また、 抗 IL- 6レセプター抗体は全身性エリテマ トーデスにおける 抗 DNA 抗体を減少させるための予防および Zまたは治療剤および全 身性エリテマ ト一デスにおける尿タ ンパク漏出を減少させるための 予防および/または治療剤と して有用である。
特許協力条約第 13規則の 2 の寄託された微生物への言及及び寄託 機関
寄託機関 名 称 ： 工業技術院生命工学工業技術研究所
あて名 ： 日本国茨城県つく ば巿東 1 丁目 1 一 3 微生物（1) 表 示 ： Rat- mouse hybridoma MR16-1
寄託番号 ： FERM BP-5875
寄託日 ： 1997年 3 月 13日
(2) 表 示 ： HB 101-pIBIBSF2R
寄託番号 ： FERM BP-2232
寄託日 1989年 1 月 9 日
(3) 表 示 ： PM1
寄託番号 ： FERM BP-2998
寄託日 ： 1989年 7 月 12日
寄託機関 名 称 ： National Collection of Industrial and
Marine Bacteria Limited
あて名 ： 23 st achar Drive Aberdeen AB2 1RY 微生物（4) 表 示 ： Escherichia coli DH5 a -pP -k3
寄託番号 ： NCIMB 40366
寄託日 ： 1991年 2 月 12日
(5) 表 示 ： Escherichia coli DH5 a -pPM-hl
寄託番号 ： NCIMB 40362
寄託日 ： 1991年 2月 12日

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 抗イ ンターロイキン- 6 ( I L-6) レセプター抗体を有効成分と して含有する全身性ェリテマ トーデスの予防および または治療剤 ο
2 . 全身性エリテマ ト一デスにおける自己免疫性腎炎の予防およ び または治療剤。
3 . 自己免疫性腎炎がループス腎炎であるこ とを特徴とする請求 項 2 記載の予防およびノまたは治療剤。
4 . 抗 I L-6レセプター抗体が抗ヒ ト I L- 6レセプター抗体であるこ とを特徴とする請求項 1 〜3 のいずれか 1 項に記載の予防および Z または治療剤。
5 . 抗 I L- 6レセプ夕一抗体が抗 I L- 6レセプターモノ クローナル抗 体であるこ とを特徴とする請求項 1 〜4 のいずれか 1 項に記載の予 防および または治療剤。
6 . 抗 I L- 6レセプター抗体が組換型抗 I L- 6レセプ夕一抗体である こ とを特徴とする請求項 1 〜5 のいずれか 1 項に記載の予防および ノまたは治療剤。
7 . 抗 I L-6レセプ夕一抗体が PM- 1抗体であるこ とを特徴とする請 求項 1 〜6 のいずれか 1 項に記載の予防およびノまたは治療剤。
8 . 抗 I L-6レセプター抗体がヒ ト抗体定常領域を有する抗体であ るこ とを特徴とする請求項 1 〜了 のいずれか 1 項に記載の予防およ び/または治療剤。
9 . 抗 I L-6レセプ夕一抗体が I L- 6レセプターに対するキメラ抗体 またはヒ ト型化抗体であるこ とを特徴とする請求項 1 〜8 のいずれ か 1 項に記載の予防および/または治療剤。
1 0 . 抗 I L- 6レセプター抗体がヒ ト型化 PM- 1抗体であるこ とを特 徴とする請求項 1 〜9 のいずれか 1 項に記載の予防および Zまたは 治療剤。
1 1 . 抗 I L- 6レセプ夕一抗体を有効成分として含有する全身性ェ リ テマ トーデスにおける抗 DNA 抗体または抗核抗体を減少させるた めの予防および Zまたは治療剤。
1 2 . 抗 I L- 6レセプタ一抗体を有効成分として含有する全身性ェ リテマ トーデスにおける尿タ ンパク漏出を減少させるための予防お よび または治療剤。
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