CN101679486A - C5抗原及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及补体抑制剂在治疗眼部病症中的用途,和补体抑制剂在制备用于治疗眼部病症的药物中的用途。
Description
发明背景
黄斑变性是主要存在于老年成人中的医学病症,其中眼衬里的中心(称作视网膜斑点区)遭受变薄、萎缩并在一些情况下出血。这会导致中央视觉丧失,包括不能看到细微的细节、不能阅读或不能识别脸部。对新脉络膜血管形成的病理学了解较少,但是认为下述因素是重要,例如炎症、缺血和生血管因子的局部生产。
已经确定补体系统蛋白质的基因与人发生黄斑变性的风险密切相关。补体系统是先天免疫抵抗微生物感染的关键性组件,并且包含一组通常以失活状态存在于血清中的蛋白质。这些蛋白质以经典通路、凝集素通路和旁路通路这三种活化通路组织在一起。微生物表面上的分子能够活化这些通路,导致形成称作C3-转化酶的蛋白酶复合物。经典通路是钙/镁依赖性的级联,其通常通过抗原-抗体复合物的形成被活化。经典通路也可以通过与配体复合的C-反应性蛋白质的结合和通过许多病原体(包括革兰氏阴性细菌),以不依赖于抗体的方式被活化。旁路通路是镁依赖性的级联,其通过某些易感表面(例如酵母和细菌的细胞壁多糖,和某些生物多聚体材料)上C3的沉积和活化被活化。
旁路通路参与经典通路和凝集素通路活性的增加。补体通路的活化产生补体蛋白质例如C3a、C4a和C5a过敏毒素和C5b-9膜攻击复合物(MAC)的具有生物活性的片段,所述片段介导涉及以下的炎性应答:白细胞趋化性、巨噬细胞,嗜中性粒细胞,血小板,肥大细胞和内皮细胞的活化、提高的血管渗透性、细胞溶解和组织损伤。
补体组件C5是补体级联中凝集素通路、经典通路和旁路通路共有的最终通路的主要组件。旁路通路和经典通路C5转化酶对C5的切割产生C5b和C5a片段。C5a和C5b片段均为促炎症反应分子。C5a是强效的过敏毒素。C5a与C5a受体(C5aR)结合并刺激促炎症反应细胞因子例如TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8从人白细胞中合成和释放。C5b发挥C5b-9(C5b、C6、C7、C8和C9)装配的成核位点的作用,所述C5b-9也已知为终端补体复合物或穿透细胞膜形成孔的膜攻击复合物(MAC),其在亚裂解(sublytic)浓度下可有助于促炎症反应细胞活化,但是在裂解(lytic)浓度下导致细胞死亡。还原C5b-9(MAC)的形成和C5a的产生可能是抑制促成AMD的炎症应答所需要的。抑制由旁路通路和经典通路的C5转化酶催化的C5切割可能对AMD的治疗是至关重要的。
尽管对于治疗与经典或旁路补体通路(尤其是AMD)相关的疾病和病症存在治疗选择,但是仍然需要发现导致有效和充分耐受的治疗的特异靶标。
发明概述
本发明涉及C5蛋白质(包括选自SEQ ID 1-6的序列)、其片段以及制备或使用所述蛋白质的方法。本发明还涉及包含C5多核苷酸和多肽的载体和重组宿主细胞。本发明的另一方面提供了用于鉴定调控C5补体组件活性的测试试剂的方法,和用于鉴定C5抗原的结合配偶体的方法。本发明的分离的C5蛋白质的有用性基于C5特异表位的发现,所述表位涉及与补体活性失调特别是黄斑变性相关的生物活性。
本发明提供了C5蛋白质或其片段作为免疫原而产生结合分子从而预防、治疗和/或延迟涉及补体通路活性失调的疾病或病症的用途,所述结合分子与选自SEQ ID 1-6的至少一个C5表位结合。
在其他方面中,本发明提供了抑制旁路补体通路至少一个组件的结合分子,并且包括制备或使用所述结合分子用于预防、治疗和/或延迟眼部疾病或病症例如AMD的方法。
在某些其他方面中,本发明提供了治疗或预防眼部疾病或病症、或延迟其发展的方法,所述方法包括施用有效量的抗体,所述抗体与一个或多个C5表位特异结合,从而抑制需要这类治疗的受试者补体通路系统中的C5蛋白质功能。
在本发明的另一方面中,提供了治疗性或预防性治疗方法中使用的药物组合物,所述组合物包含补体C5功能的蛋白质抑制剂,C5b与C6结合的蛋白质抑制剂或其可药用盐,以及一种或多种可药用稀释剂或运载体。
本发明还提供了能够抑制旁路补体通路的结合分子在制备下述药物中的用途,所述药物用于治疗眼部疾病或病症,或用于延迟它们的发展,其中蛋白质能够抑制C5蛋白质功能或MAC复合体的生产。
本发明还提供了如下在样品中鉴定C5表位或编码C5表位的核酸的方法:将样品与特异结合表位或编码这类多肽的核酸的结合分子(例如抗体)接触,并如果存在则检测复合体形成。还提供了如下鉴定调控C5蛋白质活性的化合物或结合分子的方法:将C5表位与这样的化合物接触,并检测C5蛋白质活性是否被修饰。
还在另一方面中,本发明提供了检测受试者中补体通路失调相关病症的存在或诱因的方法,其包括提供来自受试者的样品和测量受试者样品中C5蛋白质量的步骤。然后将受试者样品中具体蛋白质的量或抑制与对照样品中该蛋白质的量或抑制进行比较。对照样品优选地取自匹配的个体,即年龄、性别或其他一般条件类似,但是不怀疑患有补体通路失调相关病症的个体。或者,对照样品可以在受试者不被怀疑患有补体通路失调相关病症时取自该受试者。在一些方面中,使用本文所述的结合分子(特别是抗体)检测目的化合物或结合分子。
在本发明的另一方面中,提供了用于结合血清样品中C5蛋白质的筛选方法,所述方法包括步骤:允许样品中的抗体与已知量本发明抗体(抗-C5)或其功能等价变体或片段之间竞争性结合,并测量已知抗体的量。
在另一方面中,本发明涉及用于检测补体通路失调相关病症的诊断试剂盒,其在合适的包装内包含本发明的化合物或结合分子和运载体。试剂盒优选地含有使用抗体检测C5表位存在的说明书。优选载体是可药用的。
描述和优选的实施方案
在本文中使用时,“化合物”或“本发明的化合物”应当表示蛋白质(包括肽)、寡核苷酸、肽模拟物、同源物、类似物及其经修饰或衍生的形式。本发明的化合物优选包括选自SEQ ID No 2、4和6的核酸序列、其片段和衍生物。本发明还包括突变体或变体序列,其任何碱基可与相应的SEQID No 2、4和6不同但是仍然编码蛋白质,优选编码选自SEQ ID No 1、3和5的抗原性蛋白质。
“结合分子”应当表示抗体、有机分子、蛋白质(包括肽)、寡核苷酸、肽模拟物、同源物、类似物及其经修饰或衍生的形式,其与本发明的化合物结合,优选与选自SEQ ID No 1-6的化合物结合。
本发明化合物和结合分子的衍生物或类似物包括但不仅限于下述分子,所述分子包含与本文公开的核酸或蛋白质基本同源的区域,在多个实施方案中,在相同尺寸的核酸或氨基酸序列上或者与比对序列比较时至少具有约70%、80%或95%的同一性(优选的同一性为80-95%),其中比对通过本领域已知的计算机同源性程序完成,或者所述分子的编码核酸能够在严格、中度严格或低严格度条件下与编码前述蛋白质的序列的互补体杂交(Ausubel等,1987)。
本发明提供了C5蛋白质的抗原性表位,与线性或非线性表位特异结合的结合分子,制备和使用这类抗原性表位和结合分子的方法。本发明首次描述了具有选自SEQ ID No 1-6的序列的C5表位,其可以被调控用于预防、治疗或减轻补体通路失调相关的病症,优选眼部疾病和病症。
可以通过本发明治疗或预防的某些眼部疾病和病症包括至少一部分眼的炎症和/或新血管生产。可以用本文提供的方法治疗或预防的某些非限制性疾病和病症包括黄斑变性、糖尿病性眼部疾病和病症、眼部水肿、缺血性视网膜病变、视神经炎、囊样黄斑水肿、视网膜疾病和病症、病理性近视、早产儿视网膜病、血管化的,排斥的或者以其他方式发炎的角膜(使用或不使用角膜手术或移植)、干燥性角结膜炎或干眼。在某些方面中,适合通过本发明的化合物、结合分子和方法治疗的优选的眼部疾病和病症包括选自年龄相关黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿和早产儿视网膜病的眼部疾病和病症。可能适合这类治疗途径的其他眼部疾病包括内部和外部眼炎性病症,例如葡萄膜炎、巩膜炎、巩膜外层炎、结膜炎、角膜炎、眼眶蜂窝织炎、眼部肌炎、甲状腺眶病、泪腺和眼睑炎症。
本申请中定义的“眼部疾病或病症”包括但不仅限于糖尿病性眼部疾病或病症、眼部水肿、具有新血管生成的缺血性视网膜病变、视神经炎、囊样黄斑水肿(CME)、视网膜疾病或病症例如新血管生成型病理性近视、早产儿视网膜病(ROP)、血管化的,排斥的或者以其他方式发炎的角膜(使用或不使用角膜手术或移植)、干燥性角结膜炎或干眼。可能适用于这类治疗途径的其他眼部疾病包括内部和外部眼炎性病症,例如葡萄膜炎、巩膜炎、巩膜外层炎、结膜炎、角膜炎、眼眶蜂窝织炎、眼部肌炎、甲状腺眶病、泪腺或眼睑炎症。
在该申请中定义的“糖尿病性眼部疾病或病症”包括但不仅限于糖尿病性视网膜病变(DR)、糖尿病性黄斑水肿(DME)、增殖性糖尿病视网膜病变(PDR)。
本发明的具体抗原性表位由SEQ ID No 1到6及其互补体编码。
具体的抗原性表位具有与SEQ ID 1、3和6至少85%、优选90%、更优选95%相同的氨基酸序列。
在C5蛋白质上鉴定三个表面暴露的抗原性表位。这些表位基于三条线性氨基酸序列(两条在C5补体组件的α链上,一条在β链上),作为用于结合的抗原性位点,其包含:
1)C5α链上包含CVNNDETCEQ(SEQ ID No.1)的氨基酸序列,由核苷酸序列TGCGTTAATAATGATGAAACCTGTGAGCAG(SEQ ID NO.2)编码;
2)C5α链上包含QDIEASHYRGYGNSD(SEQ ID No 3)的氨基酸序列,由核苷酸序列CAGGATATTGAAGCATCCCACTACAGAGGCTACGGAAACTCTGAT(SEQ ID No.4)编码;
3)C5β链上包含DLKDDQKEM(SEQ ID No 5)的氨基酸序列,由核苷酸序列ACTTAAAAGATGATCAAAAAGAAATG(SEQ ID No.6)编码。
多核苷酸和多肽
可以通过本领域已知的任何合适方法产生本发明的分离的多肽和多核苷酸。这类方法的范围从直接蛋白质合成方法到构建编码分离多肽序列的DNA序列并在合适的经转化的宿主中表达这些序列。
可以使用体外蛋白质合成的标准方法,应用标准方法合成分离的目的多肽序列。
在重组方法的一方面中,通过分离或合成编码野生型目的蛋白质的DAN序列,构建DNA序列。任选地,可以通过位点特异诱变对序列进行诱变或者通过任何其他手段对序列进行修饰,以提供其功能类似物,所述任何其他手段例如通过与另一基因序列融合从而产生融合蛋白质,或者通过缺失基因序列的特异部分,导致表达与野生型形式相比缺乏特定部分的蛋白质。例如,可以缺失跨膜结构域,从而产生在其原始状态下与膜锚着的分泌版蛋白质。
构建编码目的多肽的DNA序列的另一方法应当是通过使用寡核苷酸合成仪的化学合成。这类寡核苷酸可优选以期望多肽的氨基酸序列为基础设计,并优选地选择将产生目的重组多肽的宿主细胞中偏好的那些密码子。例如,可以合成DNA寡聚物,其含有编码SEQ ID No 1、3或5表位的核苷酸序列。在一个特性中,可以合成编码这些表位部分的若干小寡核苷酸,然后连接。个体寡核苷酸通常含有用于互补性装配的5’或3’突出端。可以使用完整的氨基酸序列构建回复翻译(back-translated)的基因。
一旦被装配(通过合成、聚合酶链式反应、定点诱变,或通过任何其他方法),编码具体的分离的目的多肽的突变DNA序列会被插入表达载体中,并与适合蛋白质在期望宿主中表达的表达控制序列有效连接。可以通过核苷酸测序、限制性内切酶图谱和生物活性多肽在合适宿主中的表达验证正确的装配。如本领域所公知的,为了在宿主中获得转染的基因的高表达水平,可以将基因与转录和翻译表达控制序列有效连接,所述控制序列在选择的用所述载体转化的表达宿主中有功能。
表达控制序列和表达载体的选择会取决于相应宿主的选择。可以使用多种表达宿主/载体组合。适用于真核宿主的表达载体包括例如含有来自SV40、牛乳头瘤病毒、逆转录病毒、腺病毒和巨细胞病毒的表达控制序列的载体。适用于细菌宿主的有用的表达载体包括已知的细菌质粒,例如来自大肠杆菌(Escherichia coli)的质粒,包括pCRI、pBR322、pMB9及其衍生物、更广阔宿主范围的质粒,例如M13和丝状单链DNA噬菌体。优选的大肠杆菌载体包括含有λ噬菌体pL启动子(美国专利号No.4,874,702)的pL载体,含有T7聚合酶启动子的pET载体,和pSP72载体。适用于酵母细胞的表达载体例如包括2g和着丝粒质粒。
另外,在每个特异的表达载体中,可以选择多个位点用于插入这些DNA序列。这些位点通常通过切割它们的限制性内切核酸酶来命名。它们是本领域技术人员公认的。应当明白,适用于本发明的给定的表达载体不必须具有限制性内切核酸酶位点以用于插入选择的DNA片段。相反,可以借助于替代性手段通过片段结合载体。
针对所选择的DNA片段的插入和与表达控制序列的有效连接而选择的表达载体和位点由多种因素决定,例如:对具体限制性酶易感的位点数、多肽的大小、多肽被蛋白质水解性降解的难度等等。针对给定的DNA选择的载体和插入位点由这些因素的平衡决定。
为了提供本发明的重组构建体的足量转录,可优选将合适的启动子/增强子序列整合进重组载体中,条件是所述启动子/表达控制序列能够驱动编码目的多肽的核苷酸序列的转录。在这些载体中可以使用多种表达控制序列中的任一种。这些有用的表达控制序列包括与前述表达载体的结构基因相关的表达控制序列。有用的表达控制序列的例子包括例如,SV40或腺病毒、lac体系、trp体系、TAC或TRC体系的早期和晚期启动子,噬菌体λ的主要操纵子和启动子区例如pL,fd外壳蛋白的控制区,3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶的启动子,酸性磷酸酶的启动子例如Pho5,酵母α-交配系统的启动子,和已知控制原核细胞或真核细胞及其病毒的基因表达的其他序列,及其多种组合。提到的许多载体是可商业获得的。
可使用任何合适的宿主大量产生本发明的分离的化合物,所述宿主包括细菌、真菌(包括酵母)、植物、昆虫、哺乳动物或其他合适的动物细胞或细胞系,以及转基因动物或植物。更具体地,这些宿主可包括公知的真核宿主和原核宿主,例如大肠杆菌、假单胞菌(Pseudomonas)、芽孢杆菌(Bacillus)、链霉菌(Streptomyces)、真菌、酵母(例如汉逊酵母(Hansenula)),昆虫细胞例如草地贪夜蛾(Spodoptera firugiperda,SF9)和HIGH FIVE,动物细胞例如中国仓鼠卵巢(CHO)、小鼠细胞例如NS/O细胞、非洲绿猴细胞、COS 1、COS 7、BSC 1、BSC 40和BMT 10和人细胞,以及植物细胞。
可用于在真核细胞中控制多肽表达的启动子包括但不仅限于SV40早期启动子区、劳斯肉瘤病毒3’长末端重复中含有的启动子、疱疹胸苷激酶启动子、金属硫蛋白基因的调节序列。
在植物中表达多肽的情况下,应当使用下述植物表达载体,其包含胭脂碱合成酶启动子区或花椰菜花叶病毒35S RNA启动子和用于光合酶核酮糖二磷酸-羧化酶的启动子。
在酵母或其他真菌中表达多肽的情况下,应当选择例如Gal 4启动子、ADC(醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子、碱性磷酸酶启动子的启动子元件。
在转基因动物中表达多肽的情况下,可以使用以下的动物转录控制区,其显示组织特异性并已在转基因动物中使用:在胰腺细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因控制区;针对在胰腺细胞中有活性的启动子的胰岛素基因增强子;在淋巴细胞中有活性的免疫球蛋白基因增强子或启动子;巨细胞病毒早期启动子和增强子区;在睾丸、乳房、淋巴和肥大细胞中有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒控制区;在肝中有活性的白蛋白基因控制区;在肝中有活性的α-胎儿球蛋白基因控制区;在肝中有活性的α-抗胰蛋白酶基因控制区;在骨髓细胞中有活性的β-珠蛋白基因控制区,在脑中少突胶质细胞中有活性的髓磷脂碱性蛋白质基因控制区;在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区;和在下丘脑中有活性的促性腺激素释放激素基因控制区。
DNA序列与表达控制序列的有效连接包括在DNA序列上游正确的读码框中提供翻译起始信号。如果被表达的具体DNA序列不以甲硫氨酸起始,则起始信号会产生位于产物N-端的额外的氨基酸(甲硫氨酸)。如果要将疏水部件与含N-端甲硫氨酰的蛋白质连接,则可在本发明的组合物中直接使用该蛋白质。另外,可在本领域中获得从表达N-端甲硫氨酸的多肽上去除N-端甲硫氨酸的方法。例如,某些宿主和发酵条件允许体内去除几乎所有N-端甲硫氨酸。
应当理解,并非所有载体和表达控制序列在表达给定的分离多肽时功能都同样良好。对相同表达体系而言并非所有宿主也同样良好。然而,本领域技术人员能够在这些载体、表达控制体系和宿主间进行选择而不需过量实验。
可以通过三种常见途径鉴定这些多核苷酸构建体进入给定表达载体的成功整合:(a)DNA-DNA杂交,(b)“标记物”基因功能的存在或缺失,和(c)插入序列的表达。在第种一途径中,可以使用包含与插入基因同源的序列的探针,通过DNA-DNA杂交检测插入表达载体中的基因的存在。在第二种途径中,可以基于载体中外源基因的插入引起某些“标记物”基因功能(例如腺苷激酶活性,对抗生素例如G418的抗性,转化表型,杆状病毒中包涵体的形成等)的存在或缺失来鉴定和选择重组载体/宿主体系。例如,如果插入多核苷酸从而中断载体的标记物基因序列,则可以通过标记物基因功能的缺失鉴定含有该插入片段的重组体。在第三种途径中,可以通过测定重组载体表达的外源基因产物,鉴定重组表达载体。这类测定可基于例如生物测定体系中基因产物的物理特性或功能特性。
编码经修饰的蛋白质治疗剂的重组核酸分子可以通过本领域已知的任何方法获得(Maniatis等,1982,Molecular Cloning;A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.),或者从公众可获得的克隆获得。修饰包括但不限于缺失、插入、点突变、与其他多肽的融合。在本发明的一些实施方案中,可以产生提供下述序列的重组载体系统,所述序列在正确的读码框中编码带有合成铰链区的目的治疗剂。另外,可能期望包含对应于免疫球蛋白基因3’侧翼区的核酸作为重组载体体系的部分,所述核酸包括RNA切割/多聚腺苷酸化位点和下游序列。另外,可能期望改造经修饰的蛋白质治疗剂上游的信号序列,以促进用重组载体转化的细胞对蛋白质治疗剂的分泌。在对通常与膜接合的蛋白质进行修饰使其变为分泌型时,这是尤其感兴趣的。
可以根据任何合适的方法纯化由转化的宿主生产的蛋白质。这类标准方法包括层析(例如离子交换、亲和力和分筛柱层析)、离心、差异溶解度,或通过用于蛋白质纯化的任何其他标准技术。对免疫亲和层析而言,可以如下分离目的蛋白质:将其与亲和柱结合并附着在固定支持物上得到基本纯净的蛋白质,所述亲和柱含有针对所述蛋白质或交叉反应性蛋白质产生的抗体。术语“基本纯净”旨在表示蛋白质不含与其天然连接的杂质。基本纯净可以由电泳的单一条带证明。也可以使用例如蛋白酶解、核磁共振和X-射线晶体学的技术物理表征分离的蛋白质。
反义、核酶、三股螺旋RNA干扰和适体技术
本发明的另一方面涉及化合物和/或经修饰的化合物作为治疗剂的用途。在一些方面中,通过基因转移载体在细胞中生产核酸。在其他方面中,这些核酸被直接体内施用给哺乳动物受试者,所述施用包括例如下文所述的四种不同技术:反义、核酶、RNA干扰和适体。
可以通过本领域已知用于合成DNA和RNA分子的任何方法,制备本发明的反义RNA和DNA、核酶和三股螺旋分子。这些方法包括本领域公知的用于化学合成寡聚脱氧核糖核苷酸和寡聚核糖核苷酸的技术,例如固相亚磷酰胺化学合成。或者,可以通过编码反义RNA分子的DNA序列的体外和体内转录,生产RNA分子。可以将这类DNA序列整合进多种载体中,所述载体整合合适的RNA聚合酶启动子例如T7或SP6聚合酶启动子。或者可以将反义cDNA构建体稳定地引入细胞系中,所述反义cDNA构建体取决于使用的启动子组成型或诱导型地合成反义RNA。
另外,可以引入对核酸分子的多种公知的修饰,作为提高细胞内稳定性和半衰期的手段。可能的修饰包括但不仅限于向分子的5’和/或3’端添加核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的侧翼序列,或者在寡聚脱氧核糖核苷酸主链中使用硫代磷酸酯或2’-O-甲基代替磷酸二酯酶键。
反义
在本文中使用时,“反义”疗法是指施用或原位产生在细胞条件下与编码一个或多个C5表位的细胞mRNA和/或基因组DNA特异杂交(结合)的寡核苷酸分子或其衍生物,从而例如通过抑制C5蛋白质的转录和/或翻译来抑制C5的表达或活化。结合可以通过常规的碱基对互补性实现,或例如在与DNA双链体结合的情况下,通过双链螺旋大沟中的特异相互作用实现。通常,“反义”疗法是指本领域中普遍使用的技术范围,并且包括依赖于特异结合寡核苷酸序列的任何疗法。
本发明的反义构建体可以例如作为表达质粒被递送,所述表达质粒在细胞中被转录时,产生与编码C5抗原性蛋白质的细胞mRNA序列互补的RNA。或者,反义构建体是寡核苷酸探针,其为离体产生的并且被引入细胞中时通过与C5多核苷酸的mRNA和/或基因组序列杂交而引起表达抑制。这类寡核苷酸探针优选地是抗内源核酸酶(例如外切核酸酶和/或内切核酸酶)并因此体内稳定的经修饰的寡核苷酸。用作反义寡核苷酸的示范性核酸分子是DNA的氨基磷酸酯(phosphoramidate)、硫代磷酸酯和甲基磷酸酯类似物(也见美国专利号No.5,176,996;5,264,564和5,256,775)。对反义DNA而言,优选从选自SEQ ID 2、4或6的序列得来的寡聚脱氧核糖核苷酸。
反义途径涉及与编码C5蛋白质表位的mRNA互补的寡核苷酸(DNA或RNA)的设计。反义寡核苷酸应当与mRNA转录物结合并阻止翻译。绝对互补性尽管是优选的,但并非必需。在双链反义核酸的情况下,可以测试双链DNA的单链,或可测定三链体形成。杂交能力会取决于互补性程度和反义核酸的长度。一般而言,杂交的核酸越长,其可能含有越多的与RNA的碱基错配,并仍然形成稳定的双链体(或根据情况为三链体)。本领域技术人员通过使用测定杂交复合体解链温度的标准步骤,能够查明可耐受的错配程度。
与mRNA 5’端(例如直至或包括AUG起始密码子的5’非翻译序列)互补的寡核苷酸在抑制翻译时应当最为有效。与mRNA 3’非翻译序列互补的序列也显示有效抑制mRNA的翻译。因此,与基因的5’或3’非翻译、非编码区互补的寡核苷酸可以在反义途径中被用于抑制该mRNA的翻译。与mRNA 5’非翻译区互补的寡核苷酸应当包含AUG起始密码子的互补物。与mRNA编码区互补的反义寡核苷酸是翻译较不有效的抑制剂,但是也能够根据本发明使用。无论被设计为与mRNA的5’、3’或编码区杂交,反义核酸长度应当至少为6个核苷酸,并优选长度少于约100个,更优选少于约50、25、17或10个核苷酸。
与靶序列的选择无关,优选首先进行体外研究定量反义寡核苷酸抑制基因表达的能力。优选这些研究使用对照从而区别寡核苷酸的反义基因抑制和非特异性生物效应。还优选这些研究将靶RNA或蛋白质的水平与内部对照RNA或蛋白质的水平进行比较。另外,计划将使用反义寡核苷酸获得的结果与使用对照寡核苷酸获得的结果比较。优选对照寡核苷酸与测试寡核苷酸长度基本相同,并且寡核苷酸的核苷酸序列与反义序列的差异不大于防止与靶序列特异杂交所必需的差异。
寡核苷酸可以是DNA或RNA或其嵌合混合物或衍生物或经修饰的形式,可以是单链或双链。可以在碱基部件、糖部件或磷酸主链上修饰寡核苷酸,从而例如提高分子的稳定性、杂交等。寡核苷酸可包含其他附带的基团,例如肽(例如用于靶向宿主细胞受体),或促进跨细胞膜转运(见例如PCT公开号No.W088/09810)或跨血脑屏障转运(见例如PCT公开号No.W089/10134)的物质,杂交引发的切割剂(cleavage agent)或嵌入剂(intercalating agent)。为此,可以将寡核苷酸与另一分子缀合,所述另一分子例如为肽、杂交引发的交联剂、转运剂、杂交引发的切割剂等。
反义寡核苷酸可包含至少一个修饰的碱基部分,其选自但不限于5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟基三乙基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基辫苷(β-D-galactosylqueosine)、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶;β-D-甘露糖基辫苷、5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、假尿苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辫苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2,6-二氨基嘌呤。
反义寡核苷酸也可以包含至少一个修饰的糖部分,其选自但不限于阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和己糖。
反义寡核苷酸也可以含有中性肽样主链。这类分子被称作肽核酸(PNA)-寡聚体。PNA寡聚体的一个优点是:由于DNA具有中性主链,所以它们结合互补的DNA的能力与介质的离子强度基本无关。还在另一实施方案中,反义寡核苷酸包含至少一个修饰的磷酸主链,其选自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、酰氨基硫代硫酸酯(phosphoramidothioate)、氨基磷酸酯(phosphoramidate)、二氨基磷酸酯、甲基磷酸酯、烷基磷酸三酯,及其formacetal或类似物。
还在另一方面中,反义寡核苷酸是端基异构的寡核苷酸。异头寡核苷酸与互补的RNA形成特异的双链杂合物,其中与正常单元相反的是两条链彼此平行。寡核苷酸是2’-O-甲基核糖核苷酸或嵌合的RNA-DNA类似物。
本发明的寡核苷酸可以通过本领域已知的标准方法合成,例如通过使用自动化DNA合成仪(例如可商业得自Biosearch,Applied Biosystems,等)合成。例如,硫代磷酸酯寡核苷酸可以通过本领域已知的方法合成,甲基磷酸酯寡核苷酸可以通过使用受控的多孔玻璃聚合物支架来制备。
尽管可以使用与mRNA序列编码区互补的反义核苷酸,但是最优选的是与被转录的非翻译区互补和与包含起始甲硫氨酸的区域互补的反义核苷酸。
反义分子可以被递送至体内表达C5蛋白质的细胞。已经开发了用于将反义DNA或RNA递送至细胞的大量方法;例如,可以将反义分子直接注射进组织位点中,或者被设计为靶向期望细胞的经修饰的反义分子(例如与特异性结合靶细胞表面上表达的受体或抗原的肽或抗体连接的反义分子)可以被全身性地施用。
然而,在某些情况下可能难以达到足以阻抑内源mRNA翻译的反义分子的细胞内浓度。因此,一种优选的途径利用重组DNA构建体,其中反义寡核苷酸被置于强pol m或pol II启动子的控制下。使用这样的构建体转染患者中的靶细胞会导致足量单链RNA的转录,所述单链RNA会与内源刺猬(hedgehog)信号发放转录物形成互补的碱基对,并因此防止翻译。例如,可以体内引入载体,使其被细胞摄入并且指导反义RNA的转录。这样的载体可以保持为附加型或者被染色体整合,只要其能够被转录产生期望的反义RNA即可。这类载体可以通过本领域标准的重组DNA技术方法构建。载体可以是用于在哺乳动物细胞中复制和表达的质粒、病毒或本领域已知的其他载体。编码反义RNA的序列的表达可以受本领域已知在哺乳动物细胞中、优选地在人细胞中发挥作用的任何启动子控制。这类启动子可以是诱导型或组成型的。这类启动子包括但不限于SV40早期启动子区、劳斯肉瘤病毒3’长末端重复中含有的启动子、疱疹胸苷激酶启动子、金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster等,1982,Nature 296:3942)等。任何种类的质粒、粘粒、YAC或病毒载体可被用于制备可直接引入组织位点中的重组DNA构建体。或者可使用选择性感染期望的组织的病毒载体,在这种情况下可通过另一途径(例如全身性地)完成施用。
核酶
也可以使用被设计为催化性切割C5 mRNA转录物的核酶分子来阻止mRNA的翻译(见例如1990年10月4日公开的PCT国际公开号W090/11364;美国专利号No.5,093,246)。尽管可以使用在位点特异性识别序列上切割mRNA的核酶来破坏具体的mRNA,但是优选使用锤头状核酶。锤头状核酶在由侧翼区指定的位置处切割mRNA,所述侧翼区与靶mRNA形成互补的碱基对。唯一的要求是靶mRNA具有以下的两碱基序列:5’-UG-3’。
本发明的核酶还包括RNA内切核糖核酸酶(下文中称作“Cech-型核酶”),例如嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)(称作IVS或L-19 IVSRNA)中天然存在并在国际专利申请WO88/04300中公开的RNA内切核糖核酸酶。Cech-型核酶具有八碱基对活性位点,所述活性位点与靶RNA序列杂交,之后发生靶RNA的切割。本发明包括靶向八碱基活性位点序列的Cech-型核酶。
在反义途径中时,核酶可以由经修饰的寡核苷酸组成(例如为了提高的稳定性、靶向等),并且应当被递送至体内表达C5蛋白质的细胞。优选的递送方法涉及使用“编码”处于强组成型pol III或pol II启动子控制下核酶的DNA构建体,从而被转染的细胞会生产破坏靶信息并抑制翻译的足量核酶。因为与反义分子不同,核酶是催化性的,所以其功效需要更低的细胞内浓度。
三股螺旋形成
或者,可以如下降低内源C5基因的表达:将与基因调节区(即启动子和/或增强剂)互补的脱氧核糖核苷酸序列寻靶,形成阻止体内靶细胞中基因转录的三股螺旋结构。
用于抑制转录的三股螺旋形成中要使用的核酸分子优选为单链,并由脱氧核糖核苷酸组成。这些寡核苷酸的碱基组成应当通过Hoogsteen碱基配对原则促进三股螺旋形成,所述Hoogsteen碱基配对原则通常要求双链体一条链上存在相当大的嘌呤或嘧啶串。核苷酸序列可以是基于嘧啶的,这会导致得到的三股螺旋的三条结合的链间TAT和CGC三联体的形成。富含嘧啶的分子对与该链平行定位的双链体的单链中富含嘌呤的区域提供了碱基互补性。另外,可以选择富含嘌呤的核酸分子,例如包含一串G残基的核酸分子。这些分子会与富含GC对的DNA双链体形成三股螺旋,其中大部分嘌呤残基位于靶双链体的单链上,产生三联体中三条链间的CGC三联体。
或者可以通过产生所谓的“锯齿形(switchback)”核酸分子,增加可靶向三股螺旋形成的潜在序列。以交替的5’-3’、3’-5’方式合成锯齿形分子,使得它们首先与双链体一条链碱基配对然后与另一条链碱基配对,消除双链体一条链上存在相当大的嘌呤或嘧啶串的必须性。
RNA干扰
RNA干扰(RNAi)似乎是使基因沉默的遍在机制的这一发现提出了降低基因表达的一种替代性的、新颖的途径,其能够克服上文列出的其他途径的局限性。短干扰RNA(siRNAs)是RNAi的核心。通过RNAi沉默复合体使用siRNA的反义链指导互补性mRNA分子的切割,进而沉默相应基因的表达。
因此本发明——杠杆性RNAi(leveraging RNAi)——在途径和有效性两方面与其他基于核酸的策略(反义和核酶方法)不同:(a)与反义策略相比,RNAi对催化过程发挥杠杆作用,即小量的siRNA能够降低靶细胞中靶基因mRNA的浓度。反义是以化学计量(stochiometric)过程为基础的,靶细胞中需要大得多的效应分子浓度,即需要等于或大于内源mRNA浓度的浓度。因此,因为RNAi是催化性的过程,所以较少量的效应分子(即siRNA)足以介导治疗效果。(b)与核酶(其同样具有催化功能)相比,RNAi似乎是更灵活的策略,其允许靶向更多种的靶序列,并因此在构建体设计中提供更大的灵活性。另外,RNAi构建体的设计是快速和便利的,因为技术人员可以基于RNAi靶序列的序列信息设计这些构建体。使用核酶时需要更多的尝试错误(trial-and-error)实验和更复杂的设计算法,因为核酶在自然界中更复杂。最后,(c)RNAi与核酶相比在体内更加有效,因为RNAi对遍在的、内源性细胞机器有杠杆作用。
本发明还与基于蛋白质的策略不同,因为RNAi不需要表达非内源的蛋白质(例如人造转录因子),从而降低了不想要的免疫应答的风险。
总而言之,RNAi-介导的基因表达的下调是具有优于现存基因表达下调途径的显著优点的新机制。
RNAi构建体包含特异地阻断靶基因表达的双链RNA。因此,RNAi构建体可以通过特异地阻断具体基因的表达而发挥拮抗剂的作用。“RNA干扰”或“RNAi”是最初应用于植物和蠕虫中观察到的下述现象的术语,其中双链RNA(dsRNA)以特异和转录后的方式阻断基因表达。不受理论束缚,RNAi似乎涉及mRNA降解,然而生物化学机制是目前活跃的研究区域。尽管关于作用机制有些神秘,但是RNAi提供了体外或体内抑制基因表达的有用方法。
在本文中使用时,术语“dsRNA”是指siRNA分子,或包含双链特征并且能够在细胞中被加工为siRNA的其他RNA分子,例如发夹RNA部件。
涉及被受试者RNAi方法抑制的基因时,术语“丧失功能”是指与无RNAi构建体时的水平相比,基因表达水平的降低。
在本文中使用时,短语“介导RNAi”是指(表明)区别RNAi过程要降解哪种RNA的能力,例如降解以序列特异性的方式发生,而不是通过与序列无关的dsRNA应答例如PKR应答发生。
在本文中使用时,术语“RNAi构建体”是在说明书中通篇使用的通用术语,其包括小干扰RNA(siRNAs)、发夹RNA和可以体内被切割形成siRNA的其他RNA物类。RNAi构建体在本文中也包括能够产生下述转录物的表达载体(也称作RNAi表达载体),所述转录物在细胞中形成dsRNA或发夹RNA,和/或能够体内生产siRNA。
“RNAi表达载体”(在本文中也称作“编码dsRNA的质粒”)是指用于表达(转录)RNA的可复制的核酸构建体,其在表达构建体的细胞中生产siRNA部件。这类载体包括转录单元,所述转录单元包含一套:(1)在基因表达中具有调节作用的遗传元件,例如启动子、操纵子或增强子,其与(2)有效连接;(2)被转录产生双链RNA(在细胞中复性形成siRNA的两个RNA部件,或可以被加工成为siRNA的单个发夹RNA)的“编码序列”,和(3)适当的转录起始和终止序列。启动子和其他调节元件的选择通常根据预期的宿主细胞而变化。一般地,在重组DNA技术中使用的表达载体通常是“质粒”的形式,其表示环状双链DNA环,其为载体形式时不与染色体结合。在本说明书中,“质粒”和“载体”可互换使用,因为质粒是最常用的载体形式。然而,本发明旨在包括这些其他形式的表达载体:发挥等同功能的表达载体和本发明公开之后在本领域中已知的表达载体。
RNAi构建体含有下述核苷酸序列,其在细胞的生理条件下与待抑制基因(即“靶”基因)的mRNA转录物至少一部分的核苷酸序列杂交。双链RNA仅需要与具有介导RNAi能力的天然RNA足够相似即可。因此,本发明具有下述优点:其能够耐受由于基因变异、菌株多态现象或进化趋异而预期的序列变异。靶序列和RNAi构建体序列之间耐受的核苷酸错配数不多于5个碱基对中1个,或10个碱基对中1个,或20个碱基对中1个,或50个碱基对中1个。
siRNA双链体中心中的错配是最关键的,并且可能基本消除靶RNA的切割。相反,与靶RNA互补的siRNA链3’端核苷酸对靶标识别的特异性没有显著贡献。
可以通过本领域已知的序列比较和比对算法(见Gribskov和Devereux,Sequence Analysis Primer,Stockton Press,1991)优化序列同一性,并例如使用默认参数,通过植入BESTFIT软件程序中的Smith-Waterman算法(例如University of Wisconsin Genetic Computing Group)计算核苷酸序列之间的百分比差异。优选抑制性RNA和靶基因部分之间大于90%的序列同一性,或甚至100%的序列同一性。或者,RNA的双链体区可以在功能上被定义为能够与靶基因转录物一部分杂交(例如400mM NaCl、40mM PIPES pH 6.4、1mM EDTA,50℃或70℃杂交12-16小时;然后洗涤)的核苷酸序列。
RNAi构建体的产生可以通过化学合成方法或通过重组核酸技术完成。受处理的细胞的内源RNA聚合酶可以介导体内转录,或克隆的RNA聚合酶可用于体外转录。RNAi构建体可包含对磷酸-糖主链或核苷酸的修饰,例如从而降低对细胞核酸酶的易感性,提高生物利用度,改进配制物性状和/或改变其他药物代谢动力学特性。例如,可以修饰天然RNA的磷酸二酯键,使其包含至少一个氮或硫杂原子。可以定制RNA结构中的修饰,允许特异的遗传抑制同时避免对dsRNA的普遍应答。类似地,可以修饰碱基从而封闭腺苷脱氨酶的活性。RNAi构建体可以通过酶产生或通过部分/完全有机合成产生,可以通过体外酶合成或有机合成引入任何经修饰的核糖核苷酸。
化学修饰RNA分子的方法可以被改变以用于修饰RNAi构建体。仅为了阐述,可以用含硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、二硫代磷酸酯、嵌合的甲基磷酸酯-磷酸二酯、肽核酸、5-丙炔基-嘧啶的寡聚物或糖修饰(例如2’-取代的核糖核苷,a-构型)来修饰RNAi构建体的主链。
可以通过单个自身互补的RNA链或两条互补的RNA链形成双链结构。RNA双链体形成可以在细胞内或细胞外开始。可以以下述量引入RNA,所述量允许每个细胞至少递送一个拷贝。更高剂量(例如每个细胞至少5、10、100、500或1000个拷贝)的双链材料可以产生更有效的抑制,而更低的剂量也可以适用于特定的应用。当对应于RNA双链区的核苷酸序列被靶向用于遗传抑制时,抑制是序列特异性的。
在某些实施方案中,受试者RNAi构建体是“小干扰RNA”或“siRNA”。这些核酸长度约19-30个核苷酸,甚至更优选长度为21-23个核苷酸,例如在长度上对应于通过核酸酶“剪切”更长双链RNA产生的片段。siRNA被理解为募集核酸酶复合体,并通过与特异序列的配对将复合体引导至靶mRNA。结果是靶mRNA被蛋白质复合体中的核酸酶降解。在一个具体的实施方案中,21-23个核苷酸的siRNA分子包含3’羟基。
可以使用本领域技术人员已知的大量技术获得本发明的siRNA分子。例如,可以使用本领域已知的方法化学合成或重组产生siRNA。例如,短的有义和反义RNA寡聚物可以合成并彼此退火形成每个末端都带有2-核苷酸突出端的双链RNA结构。然后可以将这些双链siRNA结构通过被动吸收或选择的递送体系直接引入细胞。
在某些方面,可以例如在存在切丁酶(dicer)时通过加工更长的双链RNA产生siRNA构建体。在一个实施方案中,使用果蝇(Drosophila)体外系统。在该实施方案中,将dsRNA与来自果蝇胚胎的可溶提取物组合,从而产生联合体(combination)。将该联合体在下述条件下维持,其中dsRNA被加工为约21到约23个核苷酸的RNA分子。
可以使用本领域技术人员已知的大量技术纯化siRNA分子。例如,可以使用凝胶电泳纯化siRNA。或者可以使用非变性方法例如非变性的柱层析来纯化siRNA。另外,可以使用层析(例如大小排阻层析)、甘油梯度离心、使用抗体的亲和纯化来纯化siRNA。
在某些优选的特性中,siRNA分子的至少一条链具有长度从约1到约6个核苷酸的3’突出端,尽管其长度可以从2到4个核苷酸。更优选3’突出端长度为1-3个核苷酸。在某些实施方案中,一条链具有3’突出端,另一条链是平末端或者也具有突出端。对每条链而言突出端的长度可以相同或不同。为了进一步增强siRNA的稳定性,可以将3’突出端针对降解进行稳定化。在一个方面中,通过包含嘌呤核苷酸例如腺苷或鸟苷核苷酸将RNA稳定化。或者耐受用修饰的类似物取代嘧啶核苷酸(例如用2’-脱氧胸苷取代尿苷核苷酸3’突出端)并且不影响RNAi的效率。2’羟基的缺失显著增强了组织培养基中突出端的核酸酶抗性,并可能在体内是有益的。
在其他特性中,RNAi构建体是长双链RNA的形式。在某些实施方案中,RNAi构建体至少25、50、100、200、300或400个碱基。在某些实施方案中,RNAi构建体长度为400-800个碱基。将双链RNA细胞内消化,例如在细胞中产生siRNA序列。然而,长双链RNA的体内使用并非总是实用的,推测是因为与序列无关的dsRNA应答可能引起的有害作用。在这类实施方案中,优选使用降低干扰素或PKR作用的局部递送体系和/或药剂。
在某些方面中,RNAi构建体是发夹结构的形式(称作发夹RNA)。该发夹RNA可以外源合成,或可以由RNA聚合酶III启动子通过转录体内形成。优选这类发夹RNA在细胞或动物中被改造,以确保持续和稳定地阻抑期望的基因。本领域已知可以通过在细胞中加工发夹RNA来生产siRNA。
还在其他方面中,使用质粒递送双链RNA,例如作为转录产物递送。在这些特性中,质粒被设计为包含RNAi构建体的每条有义链和反义链的“编码序列”。编码序列可以是相同的序列,例如其侧翼是倒置的启动子,或者可以是各自处于不同启动子转录控制下的两条不同的序列。在编码序列被转录后,互补的RNA转录物碱基配对形成双链RNA。
PCT申请WO01/77350描述了用于在真核细胞中双向转录转基因,产生同一转基因的有义和反义两种RNA转录物的示范性载体。因此,在某些方面中,本发明提供了具有以下特有特征的重组载体:其包含具有两个重叠的转录单元的病毒复制子,所述两个转录单元以相反的方向排列并位于目的RNAi构建体转基因的侧翼,其中两个重叠的转录单元在宿主细胞中产生来自同一转基因片段的有义和反义两种RNA转录物。
RNAi构建体可包含与靶核酸序列相同或基本相同的长双链RNA串,或仅与靶核酸序列的一个区域相同到基本相同的短双链RNA串。制备和递送长或短RNAi构建体的示范性方法可见于例如WO01/68836和WO01/75164中。
可以使用上文关于反义寡核苷酸的选择详细列出的方法,选择特异识别具体基因或具体基因家族的示范性RNAi构建体。类似地,递送RNAi构建体的方法包括在上文中详细列出的递送反义寡核苷酸的方法。一般而言,据推测任何前述方法降低C5蛋白质的存在或翻译,或活性。
RNAi表达盒的设计不限制本发明的范围。可以应用设计RNAi表达盒的不同策略,并且基于不同设计的RNAi表达盒将能够体内诱导RNA干扰。(尽管RNAi表达盒的设计不限制本发明的范围,但是一些RNAi表达盒设计包括在本发明的详述和下文中)。
所有RNAi表达盒共有的特性是它们包含编码下述RNA分子的RNA编码区,所述RNA分子能够单独地或通过分子内或分子间形成双链RNA复合体而与另一RNA分子组合诱导RNA干扰。
不同的设计原则可被用于实现相同的目标,并且是本领域技术人员已知的。例如,RNAi表达盒可编码一个或多个RNA分子。在从RNAi表达盒表达RNA之后或期间,可以通过单个、自身互补的RNA分子或两个互补的RNA分子形成双链RNA复合体。dsRNA复合体的形成可以在核内或核外开始。
RNAi靶基因不限制本发明的范围,并且可以是参与C5活性或表达的任何基因。因此,RNAi靶基因的选择对本发明而言不是限制性的:技术人员会知道如何设计RNAi表达盒以下调任何目的RNAi靶基因的基因表达。根据具体的RNAi靶基因和递送方法,所述操作可以提供RNAi靶基因功能的部分或全部丧失。
适体
适体是对靶标具有期望作用的非天然存在的核酸。期望的作用包括但不限于靶标的结合、靶标的催化性改变、以修饰/改变靶标或靶标功能活性的方式与靶标反应、作为自杀性抑制剂与靶标共价结合、促进靶标与另一分子之间的反应。本发明情况下的靶标是Hedgehog信号发放通路的一个组件。
适体以SELEX过程(Gold等,PNAS 94:59-64,1997)为基础鉴定。SELEX过程最基础的形式可以通过以下一系列步骤确定:
制备序列差异的核酸的候选混合物。候选混合物通常包含固定序列的区域(即候选混合物的每个成员在相同位置中含有相同的序列)和随机化序列的区域。选择固定序列区域,从而(a)有助于下文所述的扩增步骤,(b)模拟已知与靶标结合的序列,或(c)增强候选混合物中给定的核酸结构排列的浓度。随机化的序列可以是完全随机化的(即在任何位置上发现碱基的概率是四分之一)或仅部分随机化(即在任何位置上发现碱基的概率可以在0和100百分比之间任何水平上选择)。
在有助于靶标和候选混合物成员之间结合的条件下,将候选混合物与所选择的靶标接触。在这些环境下,靶标和候选混合物核酸之间的相互作用可以被认为是靶标和对靶标具有强亲和力的那些核酸之间形成核酸-靶标对。
将对靶标具有最高亲和力的核酸与对靶标具有较小亲和力的那些核酸分离。因为候选混合物中仅存在极小量的对应于最高亲和力核酸的序列(并可能仅有一个核酸分子),所以通常期望设定分离标准使得在分离期间保留候选混合物中的大量核酸(约5-50%)。
然后扩增在分离期间被选择为对靶标具有相对更高亲和力的那些核酸,从而产生富含对靶标具有相对更高亲和力的核酸的新候选混合物。
通过重复上文的分离和扩增步骤,新形成的候选混合物含有越来越少的弱结合的序列,并且核酸与靶标的平均亲和力程度通常会提高。最终,SELEX过程会产生含有一种或小量特有核酸的候选混合物,所述特有核酸代表了来自原始候选混合物的、对靶分子具有最高亲和力的那些核酸。
为了产生期望用作药物的核酸,优选核酸配体(1)以能够对靶标达到预期作用的方式与靶标结合;(2)尽可能小以获得期望的作用;(3)尽可能稳定;和(4)是所选择的靶标的特异配体。在大部分情况下,优选核酸配体对靶标具有可能的最高亲和力。
SELEX专利申请非常详细地描述并阐述了该过程。其中包括该过程中可以使用的靶标;用于分离候选混合物中核酸的方法;和用于扩增分离的核酸以产生富集的候选混合物的方法。SELEX专利申请还描述了获得的针对大量靶物类(species)的配体,所述靶物类包括其中蛋白质是或者不是核酸结合蛋白质的两种蛋白质靶标。SELEX方法还包括将选择的核酸配体与亲脂或非免疫原性的、高分子量的化合物在诊断或治疗性复合体中组合,如1995年5月4日提交的题为“Nucleic Acid Ligand Complexes”的美国专利申请系列号No.08/434,465中所述。
在本发明的某些方面中,期望提供下述复合体,所述复合体包含与非免疫原性的高分子量化合物或亲脂化合物共价连接的一种或多种针对C5蛋白质组分的核酸配体。非免疫原性的高分子量化合物是约100Da到1,000,000Da,更优选1000Da到500,000Da,最优选1000Da到200,000Da之间的化合物,其通常不产生免疫原性应答。就本发明的目的而言,免疫原性应答是引起生物生产抗体蛋白质的应答。在本发明的一个优选的实施方案中,非免疫原性的高分子量化合物是聚亚烷基二醇。在最优选的实施方案中,聚亚烷基二醇是聚乙二醇(PEG)。更优选PEG具有约10-80K的分子量。最优选PEG具有约20-45K的分子量。在本发明的某些实施方案中,非免疫原性高分子量化合物也可以是核酸配体。
抗体
在特定的特性中,本发明的化合物适用于鉴定抑制补体通路功能的结合分子。
可以使用多克隆和单克隆抗体制备的标准技术,使用本发明的化合物(即C5的表位)——包括其部分或片段——作为免疫原来产生与C5多肽结合的结合分子,优选抗体。本发明的化合物包含SEQ ID No:1、3和5中所示氨基酸序列的至少4个氨基酸残基,并包括线性和非线性表位,使得以这样的方式与C5肽的抗原部分结合的结合分子以形成特异的免疫复合体。优选化合物包含至少6、8、10、15、20或30个氨基酸。取决于用途和根据本领域技术人员公知的方法,更长的肽有时比更短的肽更优选。
通常,通过用免疫原免疫合适的受试者(例如兔、山羊、小鼠或其他哺乳动物),使用肽制备抗体。适当的免疫原性制剂可含有例如重组的旁路通路组件例如C5蛋白质或其部分或片段,或化学合成的旁路通路组件例如C5肽或拮抗剂。见例如美国专利号No 5,460,959,5,601,826,5,994,127,6,048,729,6,083,725,每个专利通过完整引入本文作为参考。制剂还可包含佐剂,例如弗氏完全或不完全佐剂,或类似的免疫刺激剂。用免疫原性旁路通路组件例如C5或其部分或片段免疫合适的受试者,诱导多克隆抗体应答。
对独立提出的每个表位序列SEQ ID No 1、3、5而言,应当预期被鉴定为抗体识别位点一部分的与所有氨基酸残基结合的一个或多个抗体,或被鉴定为抗体识别位点一部分的氨基酸残基部分,以与C5的α链和/或β链上的切割位点密切接近,所述切割位点由旁路或经典通路的C5转化酶蛋白质水解。因此提出,通过与接近C5α或β切割位点的表位结合,这类抗体会具有下述潜力:通过位阻功能性抑制切割位点的蛋白质水解,从而抑制C5的切割。
本发明预测了结合或以其他方式阻断人补体组件的产生和/或活性的结合分子。因此,结合分子在本文中适用于预防或抑制C5a产生和/或与C5b相关的膜攻击复合体(MAC)装配。本发明的一些结合分子包括下述结合分子,其与补体组件C5相关,进而抑制导致MAC复合体装配的、C5成为C5a和Cb5的转化。
与目的抗原(例如C5多肽抗原)“结合”的结合分子是下述结合分子,其以足够的亲和力结合抗原使得结合分子可以在表达抗原的细胞或组织的靶向中用作诊断和/或治疗剂,并且不显著地与其他蛋白质交叉反应。在一个方面中,通过荧光激活细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀反应(RIA)测定的结合程度,例如抗体与“非靶标”蛋白质的结合程度,应当少于抗体与其特定靶蛋白结合的约10%。关于抗体与靶分子的结合,术语与特定多肽或特定多肽靶标上的表位“特异结合”或“与之特异结合”或“对其是特异性的”表示与非特异性相互作用显著差异的结合。可以与对照分子的结合相比,例如通过测定分子的结合来测量特异性结合,所述对照分子通常是不具有结合活性的具有相似结构的分子。例如,可以通过与对照分子的竞争测定特异性结合,所述对照分子与靶标靶标类似,例如是过量的无标签的靶标。在这种情况下,如果过量的无标签的靶标竞争性抑制了带标签靶标与探针的结合,则表明是特异性结合。在本文中使用时,术语与特定多肽或特定多肽靶标上表位“特异性结合”或“与之特异结合”或“对其是特异性的”可以通过例如下述分子展示,所述分子对所述靶标具有至少约10-4M、或至少约10-5M、或至少约10-6M、或至少约10-7M、或至少约10-8M、或至少约10-9M、或至少约10-10M、或至少约10-11M、或至少约10-12M或更大的Kd。在一个方面中,术语“特异结合”是指下述结合,其中化合物与特定多肽或特定多肽上的表位结合,而不与任何其他多肽或多肽表位大量结合。
在本文中尤其有用的结合分子是直接或间接降低补体组件C5转化成为补体组件C5a和C5b的抗体。一类有用的抗体是具有至少一个抗体-抗原结合位点并对人补体组件C5显示特异性结合的抗体,其中所述特异性结合被靶向至人补体组件C5的α链。更具体地,可以使用单克隆抗体(mAb)。这样的抗体1)抑制人体液中的补体活化;2)抑制纯化的人补体组件C5与人补体组件C3或人补体组件C4任一的结合;和/或3)不与C5a的人补体活化产物特异性结合。尤其有用的补体抑制剂是通过C5a ELISA或通过溶血测定法测量时,将C5a和/或C5b-9的产生减少了大于约30%、40%或50%的化合物。
在功能上,合适的抗体抑制C5的切割,这阻断了有效的促炎症反应分子C5a和C5b-9(末端补体复合体)的产生。用于治疗根据本公开的补体通路失调相关病症(优选眼部疾病)的优选的抗-C5抗体与C5或其片段例如C5a或C5b结合。优选地,抗-C5抗体针对纯化的人补体成分C5的α和/或β链上的表位是有免疫反应性的,并且能够阻断C5转化酶使C5成为C5a和C5b的转化。这一能力可使用Wurzner,等,ComplementInflamm 8:328-340,1991中所述技术测量。
在尤其有用的方面,抗-C5抗体针对纯化的人补体成分C5的β链上的表位和/或α链内的表位是有免疫反应性的,优选地针对选自SEQ IDNo 1、3和5的表位是有免疫反应性的。在这一方面中,抗体也能够阻断C5转化酶使C5成为C5a和C5b的转化。在α链中,最优选的抗体与氨基端区域结合,然而它们不结合游离的C5a。
本发明的另一方面是治疗性抗体的产生和用途,所述治疗性抗体结合C5并且仅通过旁路通路的C5转化酶(C3bBbC3b)抑制C5的切割。预期这类抗体会抑制多态现象引起的补体活化,所述多态现象导致旁路通路的失调而不影响经典的补体通路的C5转化酶(C3bC4bC2a)的正常功能。
本文所述的抗-C5抗体包括人单克隆抗体。在一些方面,与C3b结合的抗体的抗原结合部分(VH和VL链)被“混搭(mixed and matched)”产生其他抗-C5结合分子。可以使用前述结合测定法(例如ELISA)测试这类“混搭”抗体的结合。当选择VH与特定VL序列混搭时,通常选择在结构上与其在与VL配对中所代替的VH相似的VH。类似地,来自具体全长重链/全长轻链配对的全长重链序列通常被结构上类似的全长重链序列代替。类似地,来自特定VH/VL配对的VL序列应当被结构上类似的VL序列代替。类似地,来自特定全长重链/全长轻链配对的全长轻链序列应当被结构上类似的全长轻链序列代替。在本文中鉴定结构相似性是本领域中公知的方法。
在其他方面中,本发明提供了包含一个或多个C5-结合抗体的重链和轻链CDR1s、CDR2s和CDR3s(多种组合)的抗体。考虑到这些抗体中的每一个都能够结合C5,并且抗原结合特异性主要由CDR1、2和3区提供,所以可以将VH CDR1、2和3序列与VL CDR1、2和3“混搭”(即来自不同抗体的CDR可以混搭)。可以使用本文所述的结合测定法(例如ELISA)来测试这类“混搭”抗体的C5结合。当VH CDR序列被混搭时,来自特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列应当被结构上类似的CDR序列代替。类似地,当VL CDR序列被混搭时,来自特定VL序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列应当被结构上类似的CDR序列代替。在本文中鉴定结构相似性是本领域公知的方法。
在本文中使用时,人抗体包含重链或轻链可变区或全长重链或轻链,如果抗体的可变区或全长链是从使用人种系免疫球蛋白基因作为序列来源的体系获得,则所述重链或轻链可变区或全长重链或轻链是具体种系序列的“产物”或“来自于”具体的种系序列。在一个这样的体系中,人抗体在带有人免疫球蛋白基因的转基因小鼠中产生。转基因小鼠被目的抗原(例如C5的表位并在下文中进一步描述)免疫。或者,通过提供在噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因文库并用目的抗原(C5蛋白质或表位)筛选文库,鉴定人抗体。
是人种系免疫球蛋白序列“产物”或“来自于”人种系免疫球蛋白序列的人抗体可以如下鉴定:将人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列比较,并选择在序列上与人抗体序列最接近(即最大%同一性)的人种系免疫球蛋白序列。是具体人种系免疫球蛋白序列“产物”或“来自于”具体人种系免疫球蛋白序列的人抗体可含有与种系编码的序列相比不同的氨基酸,这归因于例如天然存在的体细胞突变或人工定点突变。然而,所选择的人抗体通常具有与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少90%相同的氨基酸序列,并含有与其他物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如鼠种系序列)比较时鉴定人抗体属于人的氨基酸残基。在某些情况下,人抗体在氨基酸序列上可与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少60%、70%、80%、90%,或至少95%,或甚至至少96%、97%、98%或99%相同。
将为了两条序列的最佳比对必须引入的缺口数和每个缺口的长度考虑在内,两条序列之间的百分比同一性是序列共享的相同位置数的函数(即%同一性=相同位置的#/总位置#x100)。使用PAM120权重残数表、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分,使用E.Meyers和W.Miller(1988Comput.Appl.Biosci.,4:11-17)的算法测定序列的比较和两条序列间百分比同一性的测定,所述算法已被整合进ALIGN程序(2.0版)中。
通常,来自特定人种系序列的人抗体的VH或VL会展示与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不多于10个氨基酸的差异。在某些情况下,人抗体的VH或VL可展示与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不多于5个,或甚至不多余4、3、2或1个氨基酸的差异。
Camelid抗体
已经针对大小、结构复杂性和对人受试者的抗原性,表征了从骆驼和单峰骆驼(双峰骆驼(Camelus bactrianus)和Calelus dromaderius)科的成员中获得的抗体蛋白质,所述成员包括New World成员例如美洲驼(Llama)物种(美洲驼(Lama paccos)、大羊驼(Lama glama)和小羊驼(Lamavicugna))。在该哺乳动物的科中天然存在的某些IgG抗体缺乏轻链,并因此在结构上与其他动物抗体具有两条重链和两条轻链的典型四链四级结构不同。见WO 94/04678。
可以通过遗传工程获得被鉴定为VHH的小的、单链可变结构域的camelid抗体区,以产生对靶标具有高度亲和力的小蛋白质,得到低分子量的、来自抗体的、称作“camelid纳米体(nanobody)”的蛋白质。见美国专利号No.5,759,808;还见Stijlemans等,2004 J.Biol.Chem.279:1256-1261;Dumoulin等,2003 Nature 424:783-788;Pleschberger等,2003Bioconjugate Chem.14:440-448;Cortez-Retamozo等,2002 Int.J.Cancer89:456-62;和Lauwereys.等,1998 EMBO J.17:3512-3520。经改造的camelid抗体和抗体片段文库可商业得自例如Ablynx,Ghent,比利时。与非人来源的其他抗体一样,可以重组地改变camelid抗体的氨基酸序列,获得与人序列更为相似的序列,即纳米体可以被“人源化”。因此,camelid抗体对人的天然低抗原性可以被进一步降低。
camelid纳米体具有约为人IgG分子十分之一的分子量,并且蛋白质仅具有数纳米的物理直径。小尺寸的一个结果是camelid纳米体与更大的抗体蛋白质在功能上不可见的抗原位点结合的能力,即camelid纳米体适合用作检测使用经典免疫技术时以其他方式被隐藏的抗原的试剂,并且适合用作可能的治疗剂。因此,小尺寸的另一个结果是camelid纳米体因为与靶蛋白质的沟或窄裂口中的特异位点结合所以能够抑制,并因此可发挥与经典抗体相比更类似经典低分子量药物功能的能力。
低分子量和紧密型进一步导致camelid纳米体极端耐热,在极端pH下和对蛋白水解消化是稳定的,并且免疫原性弱。另一结果是camelid纳米体容易从循环系统移动进入组织甚至穿过血脑屏障,并且能够治疗影响神经组织的病症。纳米体可进一步简化药物穿过血脑屏障的转运。见2004年8月19日公开的美国专利公开号No.20040161738。这些特征与人中低抗原性组合表明巨大的治疗潜能。另外,这些分子可在原核细胞例如大肠杆菌中充分表达。
因此,本发明的特征是对C5具有高度亲和力的camelid抗体或camelid纳米体。在本文的某些方面中,camelid抗体或纳米体在骆驼(camelid)动物中天然生产,即在使用本文针对其他抗体所述的技术用C5或其肽片段免疫骆驼后产生。或者,抗-C5camelid纳米体被改造,即例如用本文所述的C5或C5表位作为靶标,通过使用淘洗步骤从噬菌体展示恰当突变的camelid纳米体蛋白质的文库中选择产生。可以通过遗传工程进一步定制经改造的纳米体,从而将受体受试者中的半衰期从45分钟提高至两周。
双抗体
双抗体是二价的、双特异性的分子,其中通过下述连接子连接的VH和VL结构域在单个多肽链上表达,所述连接子太短而不允许相同链上的两个结构域之间配对。VH和VL结构域与另一链的互补结构域配对,从而产生两个抗原结合位点(见例如Holliger等,1993 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448;Poljak等,1994 Structure 2:1121-1123)。可以通过在同一细胞中表达具有结构VHA-VLB和VHB-VLA(VH-VL构型)或VLA-VHB和VLB-VHA(VL-VH构型)的两条多肽链,产生双抗体。其中大部分可以以可溶形式在细菌中表达。
可以通过用约15个氨基酸残基的连接子将两条形成双抗体的多肽链连接,产生单链双抗体(scDb)(见Holliger和Winter,1997 Cancer Immunol.Immunother.,45(3-4):128-30;Wu等,1996 Immunotechnology,2(1):21-36)。可以以可溶的、活性单体的形式在细菌中表达scDb(见Holliger和Winter,1997 Cancer Immunol.Immunother.,45(34):128-30;Wu等,1996 Immunotechnology,2(1):21-36;Pluckthun和Pack,1997Immunotechnology,3(2):83-105;Ridgway等,1996 Protein Eng.,9(7):617-21)。双抗体可以与Fc融合,产生“双-双抗体”(见Lu等,2004J.Biol.Chem.,279(4):2856-65)。
改造和修饰的抗体
可以使用具有一个或多个VH和/或VL序列的抗体作为起始材料来改造经修饰的抗体,制备本发明的抗体,所述经修饰的抗体可具有相对于起始抗体改变的特性。可以通过修饰一个或两个可变区(即VH和/或VL)内,例如一个或多个CDR区内和/或一个或多个框架区内的一个或多个残基,来改造抗体。另外或可选地,可以通过修饰恒定区内的残基来改造抗体,例如改变抗体的效应器功能。
可以进行的一种可变区改造是CDR移植。抗体主要通过位于六个重链和轻链CDR中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。为此,CDR中的氨基酸序列比CDR外的序列在个别抗体之间的差异更大。因为CDR序列负责大部分抗体-抗原相互作用,所以可能通过构建表达载体来表达模拟特定天然存在的抗体的特性后的重组抗体,所述表达载体包含来自特定天然存在的抗体的CDR序列,所述CDR序列被移植进来自具有不同特性的不同抗体的框架序列内(见例如Riechmann等,1998 Nature 332:323-327;Jones等,1986 Nature 321:522-525;Queen等,1989 Proc.Natl.Acad,见美国86:10029-10033;美国专利号No.5,225,539和美国专利号No.5,530,101;5,585,089;5,693,762和6,180,370)。
框架序列可得自包含种系抗体基因序列的公共DNA数据库或出版的参考文献。例如,人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可发现于″VBase″人种系序列数据库(可在因特网上www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase处获得)中,以及Kabat等,1991 Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版,U.S.Department of Health and Human Services,NIHPublication No.91-3242;Tomlinson等,1992 J.Mol.Biol.227:776-798;和Cox等,1994 Eur.J.Immunol.24:827-836;每篇参考文献的内容引入本文作为参考。
可以将VH CDR1、2和3序列和VL CDR1、2和3序列移植至框架区中,所述框架区具有与框架序列所来源的种系免疫球蛋白基因中存在的框架区相同的序列,或者CDR序列可以被移植至与种系序列相比含有一个或多个突变的框架区中。例如,已经发现在某些情况下突变框架区内的残基以维持或增强抗体的抗原结合能力是有益的(见例如美国专利号No.5,530,101;5,585,089;5,693,762和6,180,370)。
CDR也可以被移植进除免疫球蛋白结构域以外的其他多肽框架区中。适当的支架形成构型稳定的框架,所述框架展示被移植的残基,以使得它们形成定位的表面并与目的靶标(例如C5抗原)结合。例如,可以将CDR移植至支架上,其中框架区基于纤连蛋白、锚蛋白、脂笼蛋白、新制癌菌素(neocarzinostain)、细胞色素b、CP1锌指、PST1、卷曲螺旋、LACI-D1、Z结构域或tendramisat(见例如Nygren和Uhlen,1997 Current Opinion inStructural Biology,7,463-469)。
另一种类型的可变区修饰是突变VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3区中的氨基酸残基,从而改进目的抗体的一个或多个结合特性(例如亲和力),这称作“亲和力突变”。可进行定点诱变或PCR-介导的诱变以引入突变,并且可如本文所述在体外或体内测定中评价对抗体结合或其他感兴趣的功能特性的影响。可以引入保守修饰。突变可以是氨基酸取代、添加或缺失。另外,通常CDR区中不多于一个、两个、三个、四个或五个残基被改变。
经改造的本发明的抗体包括其中对VH和/或VL内的框架残基进行了修饰(例如从而改进抗体特性)的抗体。通常可进行这类框架修饰来降低抗体的免疫原性。例如,一种途径是将一个或多个框架残基“回复突变”为相应的种系序列。更明确地,经历过体细胞突变的抗体可含有与抗体来源的种系序列不同的框架残基。可以通过将抗体框架序列与抗体来源的种系序列进行比较,来鉴定这类残基。为了将框架区序列恢复为其种系构型,可以通过例如定点诱变或PCR-介导的诱变将体细胞突变“回复突变”为种系序列。这类“回复突变的”抗体也旨在被本发明所涵盖。
任何类型的框架修饰涉及突变框架区内或甚至一个或多个CDR区内的一个或多个残基以去除T细胞表位,从而降低抗体的潜在免疫原性。该途径也称作“去免疫化”,并且在Carr等的美国专利公开号No.20030153043中进一步详细描述。
除了在框架或CDR区内进行的修饰以外或可选地,可以将本发明的抗体改造为在Fc区内包含修饰,通常来改变抗体的一个或多个功能特性,例如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。另外,本发明的抗体可以被化学修饰(例如一个或多个化学部件可以与抗体结合)或被修饰以改变其糖基化,进而改变抗体的一个或多个功能特性。
在一方面中,修饰CH1的铰链区使得铰链区中半胱氨酸残基的数量被改变,例如被提高或降低。该途径进一步描述于Bodmer等的美国公开号No.5,677,425中。改变CH1铰链区中的半胱氨酸残基数,从而例如简化轻链与重链的装配,或提高或降低抗体的稳定性。
在另一方面中,抗体的Fc铰链区被突变,以降低抗体的生物半衰期。更明确地,向Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区中引入一个或多个氨基酸突变,使得抗体相对于天然Fc-铰链结构域Spa结合而言具有受损的葡萄球菌(Staphylococcyl)A蛋白(SpA)结合。该途径在Ward等的美国专利号No.6,165,745中进一步详细描述。
在另一方面中,修饰抗体以提高其生物半衰期。多种途径是可能的。例如,美国专利号No.6,277,375描述了IgG中提高其体内半衰期的以下突变:T252L、T254S、T256F。或者,为了提高生物半衰期,可以将CH1或CL区内的抗体改变为含有补救(salvage)受体结合表位,所述补救受体结合表位来自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环,如Presta等的美国专利号No.5,869,046和6,121,022中所述。
还在其他方面中,通过用不同的氨基酸残基代替至少一个氨基酸残基来改变Fc区,从而改变抗体的效应器功能。例如,可以用不同的氨基酸残基代替一个或多个氨基酸,使得抗体针对效应器配体具有改变的亲和力,但是保留亲本抗体的抗原结合能力。与之亲和力被改变的效应器配体可以是例如Fc受体或补体的C1组件。该途径在Winter等的美国专利号No.5,624,821和5,648,260中进一步详细描述。
在另一方面中,可以用不同的氨基酸残基代替一个或多个选自氨基酸残基的氨基酸,使得抗体具有改变的C1q结合和/或降低或废除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。该途径在Idusogie等的美国专利号No.6,194,551中进一步详细描述。
在另一方面中,一个或多个氨基酸残基被改变,从而改变抗体与补体结合的能力。该途径在WO 94/29351中进一步描述。
还在另一方面中,通过修饰一个或多个氨基酸来修饰Fc区以提高抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力,和/或提高抗体对Fcγ受体的亲和力。该途径在Presta的WO 00/42072中进一步描述。另外,已经对人IgG1上针对FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点进行作图,并描述了具有改进的结合的变体(见Shields,R.L.等,2001 J.Biol.Chem.276:6591-6604)。
还在另一方面中,修饰了抗体的糖基化。例如,可以制备无糖基化(aglycoslated)的抗体(即抗体缺乏糖基化)。可以改变糖基化,以例如提高抗体对抗原的亲和力。这类糖类修饰可以通过例如改变抗体序列中一个或多个糖基化位点来实现。例如,可以制备导致一个或多个可变区框架糖基化位点消除的一个或多个氨基酸替代,从而消除该位点上的糖基化。这类无糖基化可提高抗体对抗原的亲和力。这样的途径在美国专利号No.5,714,350和6,350,861中进一步描述。
另外或可选地,可以制备具有改变的糖基化类型的抗体,例如具有减少的岩藻糖基残基量的次岩藻糖基化(hypofucosylated)抗体,或具有增加的二等分GlcNac结构的抗体。这类改变的糖基化模式已显示提高抗体的ADCC能力。可以通过例如在具有改变的糖基化手段的宿主细胞中表达抗体来实现这类糖类修饰。具有改变的糖基化手段的细胞是本领域已描述过的,并且可以用作在其中表达本发明重组抗体的宿主细胞,从而产生具有改变的糖基化的抗体。例如,Hang等的EP 1,176,195描述了下述细胞系,所述细胞系具有功能性断裂的编码岩藻糖基转移酶的FUT8基因,使得在该细胞系中表达的抗体显示亚岩藻糖基化。Presta的PCT公开号WO03/035835描述了变体CHO细胞系Lecl3细胞,其具有降低的将岩藻糖与Asn(297)-连接的糖类结合的能力,还导致在该宿主细胞中表达的抗体的亚岩藻糖基化(还见Shields,R.L.等,2002 J.Biol.Chem.277:26733-26740)。Umana等的WO 99/54342描述了被改造为表达糖蛋白-修饰性糖基转移酶(例如β(1,4)-N乙酰葡糖胺转移酶III(GnTIII))的细胞系,使得在所述被改造的细胞系中表达的抗体显示增加的二等分GlcNac结构,这导致抗体的提高的ADCC活性(也见Umana等,1999 Nat.Biotech.17:176-180)。
本发明关注的本文中抗体的另一修饰是聚乙二醇化(pegylation)。抗体可以被聚乙二醇化,以例如提高抗体的生物(例如血清)半衰期。为了将抗体聚乙二醇化,通常将抗体或其片段与聚乙二醇(PEG,例如PEG的反应性酯或醛衍生物)在下述条件下反应,所述条件下一个或多个PEG部件成为与抗体或抗体片段结合。可以通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应完成聚乙二醇化。在本文中使用时,术语“聚乙二醇”旨在包括已用于衍生化其他蛋白质的任何形式的PEG,例如单(C1-C10)烷氧基或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇马来酰亚胺。在某些方面中,要被聚乙二醇化的抗体是无糖基化的抗体。用于将蛋白质聚乙二醇化的方法是本领域已知的,并可应用于本发明的抗体。见例如Nishimura等的EP 0 154 316和Ishikawa等的EP 0 401 384。
另外,可以通过引入非天然氨基酸,在本发明的C5结合多肽的任何部分中实现聚乙二醇化。可以通过Deiters等,J Am Chem Soc125:11782-11783,2003;Wang和Schultz,Science 301:964-967,2003;Wang等,Science 292:498-500,2001;Zhang等,Science 303:371-373,2004或美国专利号No.7,083,970中所述技术引入某些非天然氨基酸。简言之,这些表达体系中的一些涉及定点诱变,从而向编码本发明多肽的开放读码框中引入无义密码子例如amber TAG。然后将这类表达载体引入下述宿主中,所述宿主能够利用所引入的无义密码子特异性的tRNA,并且带有所选择的非天然氨基酸。对将部件与本发明多肽缀合的目的而言,有益的具体非天然氨基酸包括具有乙炔和叠氮侧链的氨基酸。然后可以在蛋白质中这些选择的位点上,将含有这些新颖氨基酸的多肽聚乙二醇化。
改造抗体的方法
如上所述,可以使用抗-C5抗体,通过修饰全长重链和/或轻链序列、VH和/或VL序列或与之结合的恒定区,来产生新的抗-C5抗体。例如,可以将抗体的一个或多个CDR与已知的框架区和/或其他CDR重组组合,产生新的、重组改造的抗-C5抗体。其他类型的修饰包括前一章节中所述的修饰。改造方法的起始材料是一条或多条VH和/或VL序列,或其一个或多个CDR区。为了产生改造的抗体,不必须实际地制备(即作为蛋白质表达)具有一个或多个VH和/或VL序列的抗体,或其一个或多个CDR区。相反,使用序列中含有的信息作为起始材料,产生来自于原始序列的“第二代”序列,然后制备“第二代”序列并作为蛋白质表达。
可使用标准分子生物学技术制备和表达改变的抗体序列。一个或多个改变的抗体序列所编码的抗体是保留其来源的抗C-5抗体的一个、一些或所有功能特性的抗体,所述功能特性包括但不仅限于本文中所述的C5活性。可以使用本领域可获得的和/或本文所述的标准测定法(例如ELISA)评价改变的抗体的功能特性。
在改造本发明抗体的方法的某些方面中,可以沿着整体或部分抗C-5抗体编码序列随机或选择性地引入突变,并可如本文所述针对结合活性和/或其他功能特性(例如抑制MAC形成、调控补体通路失调)筛选得到的经修饰的抗-C5抗体。突变方法已在本领域中描述。例如,Short的PCT公开WO 02/092780描述了使用饱和诱变、合成连接装配或其组合产生和筛选抗体突变的方法。或者,Lazar等的WO 03/074679描述了使用计算机筛选方法优化抗体的物理化学特性的方法。
如果核苷酸序列被改变为使用生产细胞或生物中优选的密码子编码氨基酸序列,则所述核苷酸序列称作“优化的”,所述生产细胞或生物一般是真核细胞,例如酵母细胞如毕赤酵母(Pichia)、昆虫细胞、哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人细胞。优化的核苷酸序列被改造为编码与原始起始核苷酸序列(称作“亲本”序列)所编码的氨基酸序列相同或几乎相同的氨基酸序列。
非抗体C5结合分子
本发明还提供了C5结合分子,其显示抗体的功能特性但是其框架和抗原结合部分来自于其他多肽(例如除抗体基因编码的或通过抗体基因的体内重组产生的多肽以外的多肽)。这些结合分子的抗原结合结构域(例如本发明的C5结合结构域或表位)通过定向进化过程产生。见美国专利号No.7,115,396。具有与抗体可变结构域的折叠类似的总体折叠(“免疫球蛋白样”折叠)的分子是适当的支架蛋白质。适合衍生化抗原结合分子的支架蛋白质包括纤连蛋白或纤连蛋白二聚体、生腱蛋白、N-钙黏着蛋白、E-钙黏着蛋白、ICAM、肌联蛋白、GCSF-受体、细胞因子受体、糖苷酶抑制剂、抗生素色蛋白、髓鞘质膜黏附分子P0、CD8、CD4、CD2、I类MHC、T-细胞抗原受体、CD1、C2和VCAM-1的I-set结构域、肌球蛋白结合蛋白质C的I-set免疫球蛋白结构域、肌球蛋白结合蛋白质H的I-set免疫球蛋白结构域、端蛋白的I-set免疫球蛋白结构域、NCAM、颤搐蛋白、神经胶质蛋白、生长激素受体、促红细胞生成素受体、促乳素受体、干扰素-γ受体、β-半乳糖苷酶/葡糖醛酸糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、转谷氨酰胺酶、T-细胞抗原受体、超氧化物岐化酶、组织因子结构域、细胞色素F、绿色荧光蛋白、GroEL和奇异果甜蛋白。
非抗体结合分子的抗原结合结构域(例如免疫球蛋白样折叠)可具有少于10kDa或大于7.5kDa的分子量(例如7.5-10kD之间的分子量)。用于衍生抗原结合结构域的蛋白质是天然存在的哺乳动物蛋白质(例如人蛋白质),并且抗原结合结构域与其来源的蛋白质的免疫球蛋白样折叠相比,包含多达50%(例如多达34%、25%、20%或15%)的突变的氨基酸。具有免疫球蛋白样折叠的结构域一般由50-150个氨基酸(例如40-60个氨基酸)组成。
为了产生非抗体结合分子,创建其中形成抗原结合表面的支架蛋白质区域中的序列(例如在位置和结构上与抗体可变结构域免疫球蛋白CDR折叠的相似的区域)被随机化的克隆文库。针对与目的表位(例如C5)的特异性结合和其他功能(例如对C5活性的抑制)测试文库克隆。所选择的克隆可以被用作进一步随机化和选择的基础,产生对抗原具有更高亲和力的衍生物。
例如使用纤连蛋白III(10Fn3)的第十个模块作为支架产生高亲和力结合分子。针对残基23-29、52-55和78-87上10FN3的三个CDR-样环中的每一个构建文库。为了构建每个文库,通过寡核苷酸合成,将与每个CDR-样区域重叠的DNA区段编码序列随机化。用于生产可选择的10Fn3文库的技术描述于美国专利号No.6,818,418和7,115,396;Roberts和Szostak,1997Proc.Natl.Acad.Sci USA 94:12297;美国专利号No.6,261,804;美国专利号No.6,258,558;和Szostak等WO98/31700中。
非抗体结合分子可以作为二体或多聚体产生,以提高对靶抗原的亲合力。例如,抗原结合结构域被表达为形成Fc-Fc二聚体的抗体恒定区(Fc)的融合物。见例如美国专利号No.7,115,396。
编码本发明抗体的核酸分子
本发明的另一方面涉及编码本发明的C5结合分子的核酸分子。核酸可存在于完整细胞中、细胞裂解液中,或者可以是部分纯化或基本纯净形式的核酸。当通过标准技术从其他细胞组件或其他污染物(例如其他细胞核酸或蛋白质)中纯化时,核酸是“分离的”或“使得基本纯净的”,所述标准技术包括碱/SDS处理、CsCl条带法(CsCl banding)、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和本领域公知的其他方法。见F.Ausubel等编辑,1987 CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York。本发明的核酸可例如是DNA或RNA,或者可以含有或不含内含子序列。在一方面中,核酸是cDNA分子。核酸可以存在于载体例如噬菌体展示载体中,或存在于重组质粒载体中。
可使用标准分子生物学技术获得结合分子的核酸序列。对杂交瘤(例如由带有人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤,如下文进一步描述的)表达的抗体而言,可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术,获得编码杂交瘤制备的抗体轻链和重链的cDNA。对从免疫球蛋白基因文库(例如使用噬菌体展示技术)获得的抗体而言,可以从文库成员的多个噬菌体克隆中回收编码抗体的核酸。
一旦获得编码VH和VL区段的DNA片段后,可通过标准重组DNA技术进一步操作这些DNA片段,例如将可变区基因转化为全长抗体链基因、Fab区段基因或scFv基因。在这些操作中,将VL-或VH-编码DNA片段与另一DNA分子有效连接,或与编码另一蛋白质如抗体恒定区或灵活连接子(flexible linker)的片段有效连接。在本文中使用术语“有效连接”旨在表示两条DNA片段以功能性方式接合,例如使得两条DNA片段编码的氨基酸序列保持按照读码框(融合),或者使得蛋白质在期望的启动子控制下表达。
可以通过将VH-编码DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一DNA分子有效连接,将编码VH区的分离的DNA转化为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(见例如Kabat等,1991Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,U.S.Departmentof Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242),并且可以通过标准PCR扩增获得包含这些区域的DNA片段。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区。对Fab片段重链基因而言,VH-编码DNA可以与仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子有效连接。
可以通过将VL-编码DNA与编码轻链恒定区CL的另一DNA分子有效连接,将编码VL区的分离的DNA转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(见例如Kabat等,1991Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,U.S.Departmentof Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242),并且可以通过标准PCR扩增获得包含这些区域的DNA片段。轻链恒定区可以是κ和λ恒定区。
为了产生scFv基因,将VH-和VL-编码DNA片段与编码灵活连接子例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的另一片段有效连接,使得VH和VL序列可以被表达为连续的单链蛋白质,其中VL和VH区通过灵活的连接子接合(见例如Bird等,1988 Science 242:423-426;Huston等,1988 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883;McCafferty等,1990 Nature 348:552-554)。
单克隆抗体的产生
可以通过多种技术,包括常规的单克隆抗体方法例如Kohler和Milstein(1975 Nature,256:495)的标准体细胞杂交技术,或者使用文库展示方法例如噬菌体展示,来生产单克隆抗体(mAb)。
用于制备杂交瘤的动物体系是鼠体系。小鼠中的杂交瘤生产是公知的步骤。免疫方案和分离经免疫的脾细胞用于融合的技术是本领域已知的。融合配偶体(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合步骤也是已知的。
可以以如上所述制备的鼠单克隆抗体的序列为基础,制备本发明的嵌合抗体或人源化抗体。可从目的鼠杂交瘤获得编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA,并使用标准分子生物学技术将其改造为含有非鼠(例如人)免疫球蛋白的序列。例如,为了产生嵌合抗体,可以使用本领域已知的方法(见例如Cabilly等的美国专利号No.4,816,567)将鼠可变区与人恒定区连接。为了产生人源化抗体,可以使用本领域已知的方法将鼠CDR区插入人框架中。见例如美国专利号No.5,225,539和美国专利号No.5,530,101;5,585,089;5,693,762和6,180,370。
在某一个方面中,本发明的抗体是人单克隆抗体。这类针对C5表位的人单克隆抗体可以使用带有人免疫系统而不是小鼠免疫系统部分的转基因小鼠或转染色体小鼠(transchromosomic mice)产生。这些转基因小鼠和转染色体小鼠包括在本文中分别称作HuMAb小鼠和KM小鼠并且在本文中集体称作“人Ig小鼠”的小鼠。
HuMAb(Medarex,Inc.)含有人免疫球蛋白基因迷你基因座(miniloci)以及使内源μ和κ链基因座失活的定向突变,所述迷你基因座编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列(见例如Lonberg等,1994 Nature 368(6474):856-859)。因此,小鼠显示降低的小鼠IgM或κ表达,并且对免疫应答时,引入的人重链和轻链转基因经历类型转换和体细胞突变,产生高亲和力的人IgGκ单克隆(Lonberg,N.等,1994上文;在Lonberg,N.,1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101;Lonberg,N.和Huszar,D.,1995 Intern.Rev.Immunol.13:65-93,和Harding,F.和Lonberg,N.,1995 Ann.N.Y.Acad.Sci.764:536-546中综述)。HuMAb小鼠的制备和使用,以及这类小鼠带有的基因组修饰在Taylor,L.等,1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295;Chen,J.等,1993International Immunology 5:647-656;Tuaillon等,1993 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:3720-3724;Choi等,1993 Nature Genetics 4:117-123;Chen,J.等,1993 EMBO J.12:821-830;Tuaillon等,1994 J.Immunol.152:2912-2920;Taylor,L.等,1994 International Immunology 579-591;和Fishwild,D.等,1996 Nature Biotechnology 14:845-851中进一步描述,所述所有参考文献的内容完整引入本文作为参考。还见美国专利号No.5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;5,789,650;5,877,397;5,661,016;5,814,318;5,874,299和5,770,429,均属于Lonberg和Kay;Surani等的美国专利号No.5,545,807;PCT公开号No.WO 92103918、WO 93/12227、WO 94/25585、WO 97113852、WO 98/24884和WO 99/45962,均属于Lonberg和Kay;和Korman等的PCT公开号No.WO 01/14424。
在另一方面中,可以使用在转基因和转染色体上带有人免疫球蛋白序列的小鼠,例如带有人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠,来生成本发明的人抗体。在本文中称作“KM小鼠”的这类小鼠在WO 02/43478中详述。
再进一步而言,表达人免疫球蛋白基因的可选的转基因动物体系是本领域可获得的,并且可以被用于产生本发明的抗-C5抗体。例如,可以使用称作(Abgenix,Inc.)的可选的转基因体系。这类小鼠描述于例如Kucherlapati等的美国专利号No.5,939,598;6,075,181;6,114,598;6,150,584和6,162,963中。
另外,表达人免疫球蛋白基因的可选的转染色体动物体系是本领域可获得的,并且可以被用于产生本发明的抗-C5抗体。例如,可以使用称作“TC小鼠”的带有人重链转染色体以及人轻链转染色体二者的小鼠;这类小鼠描述于Tomizuka等,2000 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:722-727中。另外,带有人重链和轻链转染色体的牛已在本领域描述(Kuroiwa等,2002Nature Biotechnology 20:889-894)并且可以被用于产生本发明的抗-C5抗体。
也可以使用用于筛选人免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示方法来制备本发明的人单克隆抗体。这类用于分离人抗体的噬菌体展示方法是本领域确立的。见例如Ladner等的美国专利号No.5,223,409;5,403,484和5,571,698;Dower等的美国专利号5,427,908和5,580,717;McCafferty等的美国专利号No.5,969,108和6,172,197;和Griffiths等的美国专利号No.5,885,793;6,521,404;6,544,731;6,555,313;6,582,915和6,593,081。可以针对与全长C5抗原或与SEQ ID 1、3、5的具体C5表位的结合,来筛选文库。
也可以使用SCID小鼠制备本发明的人单克隆抗体,所述SCID小鼠中已重建了人免疫细胞,使得在免疫后可以产生人抗体应答。这类小鼠描述于例如Wilson等的美国专利号No.5,476,996和5,698,767中。
在人Ig小鼠中产生人单克隆抗体
可以使用纯化的在原核细胞(例如大肠杆菌)或真核细胞(例如哺乳动物细胞,例如HEk293细胞)中表达的重组人C5作为抗原。可以将蛋白质与运载体例如钥孔血蓝蛋白(KLH)缀合。
使用HuMab转基因小鼠的HCo7、HCo12和HCo17品种和转基因转染色体小鼠的KM品种(其均表达人抗体基因)制备针对C5新表位的完全人单克隆抗体。在这些小鼠品种的每一个中,可以如Chen等,1993EMBO J.12:811-820中所述纯合地破坏内源小鼠κ轻链基因,并如WO01109187的实施例1中所述纯合地破坏内源小鼠重链基因。这些小鼠品种的每一个带有人κ轻链转基因KCo5,如Fishwild等,1996 NatureBiotechnology 14:845-851中所述。HCo7品种带有HCo7人重链转基因,如美国专利号No.5,545,806;5,625,825;和5,545,807中所述。HCo12品种带有HCo12人重链转基因,如WO 01/09187的实施例2中所述。HCo17品种带有HCo17人重链转基因。KNM品种带有如WO 02/43478中所述的SC20转染色体。
为了产生针对C5表位的完全人单克隆抗体,用纯化的重组C5、C5片段或其缀合物(例如C5-KL)作为抗原免疫HuMab小鼠和KM小鼠。针对HuMab小鼠的一般免疫方案描述于Lonberg,N.等,1994 Nature368(6474):856-859;Fishwild,D.等,1996 Nature Biotechnology 14:845-851和WO 98/24884中。第一次输注抗原时小鼠为6-16周龄。使用纯化的抗原重组制剂(5-50μg)在腹膜腔内、皮下(Sc)或通过足垫注射来免疫HuMab小鼠和KM小鼠。
用完全弗氏佐剂或Ribi佐剂中的抗原,在腹膜腔中(IP)、皮下(Sc)或通过足垫(FP)将转基因小鼠免疫两次,之后3-21天用不完全弗氏佐剂或Ribi佐剂中的抗原进行IP、Sc或FP免疫(至多总计11次免疫)。通过眶后出血监测免疫应答。通过ELISA筛选血浆,并使用具有足量抗-C5人免疫球蛋白滴度的小鼠进行融合。在处死前3天和2天用抗原对小鼠进行静脉内强化,并取出脾。通常针对每种抗原进行10-35次融合。针对每种抗原免疫几十只小鼠。用C5抗原免疫HCo7、HCo12、HCo17和KM小鼠品种的总计82只小鼠。
为了选择生产与C5表位结合的抗体的HuMab或KM小鼠,可以如Fishwild,D.等,1996所述通过ELISA测试来自被免疫的小鼠的血清。简言之,用PBS中1-2μg/ml的纯化的重组C5以50μl/孔4℃孵育过夜来包被微量滴定平板,然后用PBS/Tween(0.05%)中5%鸡血清以200μl/孔封闭。向每个孔中添加来自C5-免疫小鼠的血浆稀释液,并在室温下孵育1-2小时。用PBS/Tween洗涤平板,然后用与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊-抗-人IgG Fc多克隆抗体在室温下孵育1小时。洗涤后用ABTS底物(Sigma,A-1888,0.22mg/ml)使平板显影,并通过分光光度计在OD 415-495下分析。使用显示最高抗-C5抗体效价的小鼠脾细胞用于融合。进行融合并通过ELISA测试杂交瘤上清的抗-C5活性。
以标准方案为基础,用PEG将从HuMab小鼠和KM小鼠中分离的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系融合。然后针对抗原特异性抗体的生产,筛选得到的杂交瘤。用50%PEG(Sigma),将来自免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬浮液与四分之一数量的SP2/0非分泌型小鼠骨髓瘤细胞(ATCC,CRL 1581)融合。将细胞以大约1×105/孔涂布在平底微量滴定板上,然后在选择培养基中孵育约两周,所述选择培养基在DMEM(Mediatech,CRL10013,含高葡萄糖、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠)中含有10%胎牛血清、10%P388D 1(ATCC,CRL TIB-63)条件培养基、3-5%(IGEN)加上5mM HEPES、0.055mM 2-巯基乙醇、50mg/ml庆大霉素和1x HAT(Sigma,CRL P-7185)。1-2周后,在用HT代替HAT的培养基中培养细胞。然后针对人抗-C5单克隆IgG抗体,通过ELISA筛选各个孔。一旦发生了广泛的杂交瘤生长,通常在10-14天后监测培养基。将分泌抗体的杂交瘤重新涂板,再次筛选,并且如果对人IgG仍然是阳性的话,通过有限稀释将抗-C5单克隆抗体亚克隆至少两次。然后将稳定的亚克隆体外培养,在组织培养基中产生小量抗体用于进一步表征。
产生生产人单克隆抗体的杂交瘤
为了产生生产本发明的人单克隆抗体的杂交瘤,可以分离来自免疫小鼠的脾细胞和/或淋巴结细胞,并与适当的无限增殖化细胞系例如小鼠骨髓瘤细胞系融合。可以针对抗原特异性抗体的生产筛选得到的杂交瘤。例如,可以用50%PEG将来自免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬浮液与六分之一数量的P3X63-Ag8.653非分泌型小鼠骨髓瘤细胞(ATCC,CRL 1580)融合。将细胞以约2×145涂布在平底微量滴定板中,然后在选择培养基上孵育两周,所述选择培养基含有20%胎克隆血清、18%″653″条件培养基、5%(IGEN)、4mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、5mM HEPES、0:055mM 2-巯基乙醇、50单位/ml青霉素、50μg/ml链霉素、50μg/ml庆大霉素(gentamycin)和1X HAT(Sigma;在融合后24小时添加HAT)。约两周后,在用HT代替HAT的培养基中培养细胞。然后针对人单克隆IgM和IgG抗体,通过ELISA筛选各个孔。一旦发生了广泛的杂交瘤生长,通常在10-14天后观察培养基。将分泌抗体的杂交瘤重新涂板,再次筛选,并且如果对人IgG仍然是阳性的话,可以通过有限稀释将单克隆抗体亚克隆至少两次。然后将稳定的亚克隆体外培养,在组织培养基中产生小量抗体用于表征。
为了纯化人单克隆抗体,可以在两升摇瓶(spinner-flasks)中培养选择的杂交瘤用于单克隆抗体纯化。可以过滤并浓缩上清,之后用A蛋白-sepharose(Pharmacia,Piscataway,N.J.)进行亲和层析。可以通过凝胶电泳和高效液相层析检查洗脱的IgG,以确保纯度。可以将缓冲溶液更换为PBS,并使用1.43的消光系数通过OD280测定浓度。可以将单克隆抗体分为等分并储存于-80℃下。
产生生产单克隆抗体的转染瘤
也可以如本领域所公知的(例如Morrison,1985 Science 229:1202),使用例如重组DNA技术和基因转染方法的组合,在宿主细胞转染瘤中生产本发明的抗体。
例如,为了表达抗体或其抗体片段,可以使用标准分子生物学技术(例如使用表达目的抗体的杂交瘤的PCR扩增或cDNA克隆)获得编码部分或全长轻链和重链的DNA,并可以将该DNA插入表达载体中,使得基因与转录和翻译控制序列有效连接。在本文中,术语“有效连接”旨在表示抗体基因与载体连接,使得载体内的转录和翻译控制序列发挥它们调节抗体基因转录和翻译的预期功能。选择与使用的表达宿主细胞相容的表达载体和表达控制序列。可以将抗体轻链基因和抗体重链基因插入独立的载体,或更普遍地将两个基因均插入相同的表达载体中。通过标准方法(例如抗体基因片段和载体上互补性限制位点的连接,或如果不存在限制位点时平末端连接)将抗体基因插入表达载体中。可以如下使用本文所述抗体的轻链和重链可变区创建任何抗体同种型的全长抗体基因:将本文所述抗体的轻链和重链可变区插入已经编码目的同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中,使得VH区段与载体内的CH区段有效连接,VL区段与载体内的CL区段有效连接。另外或可选地,重组表达载体能够编码便于抗体链从宿主细胞中分泌的信号肽。可以将抗体链基因克隆进载体中,使得信号肽与抗体链基因的氨基端按照读码框连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或者是异源的信号肽(即来自非免疫球蛋白蛋白质的信号肽)。
除了抗体链基因外,本发明的重组表达载体带有控制抗体链基因在宿主细胞中表达的调节序列。术语“调节序列”旨在包括启动子、增强子和控制抗体链基因转录或翻译的其他表达控制元件(例如多聚腺苷酸化信号)。这类调节序列描述于例如Goeddel(Gene Expression Technology.1990Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA)中。本领域技术人员应当理解,表达载体的设计,包括调节序列的选择可取决于例如待转化的宿主细胞的选择、期望的蛋白质表达水平等因素。用于哺乳动物宿主细胞表达的调节序列包括指导哺乳动物细胞中高水平蛋白质表达的病毒元件,例如来自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤的启动子和/或增强子。或者可使用非病毒调节序列,例如泛素启动子或P-珠蛋白启动子。更进一步,由来自不同来源的序列组成的调节元件,例如SRa启动子体系含有来自SV40早期启动子的序列和1型人T细胞白血病病毒的长末端重复(Takebe等,1988Mol.Cell.Biol.8:466-472)。
除了抗体链基因和调节序列以外,本发明的重组表达载体可带有额外的序列,例如调节载体在宿主细胞中复制的序列(例如复制起点)和选择性标记基因。选择性标记基因简化了引入载体的宿主细胞的选择(见例如美国专利号No.4,399,216;4,634,665;和5,179,017,均属于Axel等)。例如,通常选择性标记基因给引入载体的宿主细胞赋予了针对药物例如G418、潮霉素或甲氨喋呤的抗性。选择性标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于进行甲氨喋呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)。
为了表达轻链和重链,通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染进宿主细胞中。术语“转染”的多种形式旨在包括通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞中的大范围的技术,例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等等。理论上可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体。讨论真核细胞中、尤其是哺乳动物宿主细胞中的抗体表达是因为这类真核细胞、尤其是哺乳动物细胞比原核细胞更可能装配和分泌经过正确折叠并具有免疫活性的抗体。据报道,抗体基因的原核表达对活性抗体的高产率生产是无效的(Boss和Wood,1985 Immunology Today 6:12-13)。
用于表达本发明重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞,在Urlaub和Chasin,1980 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-4220中描述,其与例如Kaufman和Sharp,1982Mol.Biol.159:601-621中所述的DH FR选择性标记一起使用)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。具体地,用于与NSO骨髓瘤细胞一起使用的另一表达体系是WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338,841中所示的GS基因表达体系。将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞中时,通过将宿主细胞培养一段时间来产生抗体,所述时间足以允许抗体在宿主细胞中表达或将抗体分泌进培养宿主细胞的培养基中。可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。
双特异性分子
在另一方面中,本发明涉及包含本发明的C5结合分子(例如抗-C5抗体或其片段)的双特异性分子。本发明的C5结合分子可以被衍生为另一功能性分子例如另一肽或蛋白质(例如另一抗体或针对受体的配体)或与之连接,产生与至少两种不同结合位点或靶分子结合的双特异性分子。本发明的C5结合分子事实上可以被衍生为多于一种其他功能性分子或与之连接,产生与多于两种不同结合位点和/或靶分子结合的多特异性分子;这类多特异性分子也旨在被本文中使用的术语“双特异性分子”包括。为了产生本发明的双特异性分子,本发明的抗体可以与一个或多个其他的结合分子(例如通过化学偶联、遗传融合、非共价结合或以其他方式)功能性连接从而得到双特异性分子,所述其他结合分子例如另一抗体、抗体片段、肽或结合拟肽。
因此,本发明包括双特异性分子,其至少包含针对C5表位的第一结合特异性和针对第二靶表位的第二结合特异性。
在一方面中,本发明的双特异性分子包含至少一种抗体或其抗体片段的结合特异性,所述抗体片段包括例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或单链Fv。抗体也可以是轻链或重链二聚体,或其任何最小片段例如Fv或单链构建体,如Ladner等的美国专利号No.4,946,778中所述,所述专利的内容明确地通过参考并入。
可以使用本领域已知的方法,通过缀合结合特异性组件制备本发明的双特异性分子。例如,可以独立地生产双特异性分子的每种结合特异性,然后将其彼此缀合。当结合特异性是蛋白质或肽时,可以使用多种偶联或交联剂用于共价缀合。交联剂的例子包括A蛋白、碳二亚胺、N-琥珀酰亚氨基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻苯二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸盐(SPDP)和磺基琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)(见例如Karpovsky等,1984 J.Exp.Med.160:1686;Liu等,1985 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:8648)。其他方法包括Paulus,1985 Behring Ins.Mitt.No.78,118-132;Brennan等,1985 Science229:81-83和Glennie等,1987 J.Immunol.139:2367-2375中所述方法。缀合剂是SATA和磺基-SMCC,均可得自Pierce Chemical Co.(Rockford,IL)。
当结合特异性是抗体时,可以通过两条重链C-端铰链区的巯基键合将它们缀合。在一个具体的方面,铰链区被修饰为在缀合前含有奇数个(例如一个)巯基残基。
或者,两种结合特异性可以在同一个载体中编码并表达,并在同一宿主细胞中装配。该方法尤其适用于双特异性分子是mAb x mAb、mAb xFab、Fab x F(ab’)2或配体x Fab融合蛋白时。本发明的双特异性分子可以是包含一个单链抗体和结合决定簇的单链分子,或者是包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可包含至少两个单链分子。用于制备双特异性分子的方法描述于例如美国专利号5,260,203;5,455,030;4,881,175;5,132,405;5,091,513;5,476,786;5,013,653;5,258,498和5,482,858中。
双特异性分子与其特异性靶标的结合可以通过例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(REA)、FACS分析、生物测定法(例如生长抑制)或Western印迹测定法验证。这些测定法中的每一种通常通过使用对目的复合物特异性的带标签的试剂(例如抗体)来检测具体的目的蛋白质-抗体复合体的存在。
测量补体活化
可使用多种方法测量补体通路分子的存在和补体系统的活化(见例如美国专利号No.6,087,120;和Newell等,J Lab Clin Med,100:437-44,1982)。例如,可以如下监测补体活性:(i)测量对补体介导的红细胞裂解(溶血)的抑制;(ii)测量抑制C3或C5切割的能力;和(iii)抑制旁路通路介导的溶血。
两种最常用的技术是溶血测定法(见例如Baatrup等,Ann Rheum Dis,51:892-7,1992)和免疫测定法(见例如Auda等,Rheumatol Int,10:185-9,1990)。溶血技术测量整个序列(经典或旁路通路任一)的功能性容量。免疫技术测量特异补体成分或裂解产物的蛋白质浓度。可在本发明的方法中用于检测补体活化或测量补体成分活性的其他测定法包括例如T细胞增殖测定法(Chain等,J Immunol Methods,99:221-8,1987)和迟发型超敏感性(DTH)测定法(Forstrom等,1983,Nature 303:627-629;Hallidayet等,1982,in Assessment of Immune Status by the Leukocyte AdherenceInhibition Test,Academic,New York,第1-26页;Koppi等,1982,Cell.Immunol.66:394-406;和美国专利号No.5,843,449)。
在溶血技术中,所有补体成分必须存在并且有功能。因此,溶血技术可以筛选补体系统的功能完整性和缺乏二者(见例如Dijk等,J ImmunolMethods 36:29-39,1980;Minh等,Clin Lab Haematol.5:23-34 1983;和Tanaka等,J Immunol 86:161-170,1986)。为了测量经典通路的功能性容量,使用包被了溶血素(针对绵羊红细胞的兔IgG)的绵羊红细胞作为靶细胞(致敏细胞)。当组件有功能并且以足量浓度存在时,这些Ag-Ab复合体活化经典通路并导致靶细胞的裂解。为了测定旁路通路的功能性容量,使用兔红细胞作为靶细胞(见例如美国专利号No.6,087,120)。
溶血补体测量适用于检测例如受试者血中的补体蛋白质的不足和功能障碍,因为其以补体诱导细胞裂解的功能为基础,所述功能需要完整的功能性补体蛋白质范围。已通过使用特定的分离的补体蛋白质代替全血清扩展了测定经典通路活化的所谓CH50方法和用于旁路通路的AP50方法,尽管高度稀释的测试样品含有未知浓度的限制补体成分。通过该方法可以进行更详细的补体系统测量,表明缺乏何种组件。
免疫技术使用针对多种补体成分(例如C3、C4和C5)不同表位的多克隆或单克隆抗体,检测例如补体成分的裂解产物(见例如Hugli等,Immunoassays Clinical Laboratory Techniques 443-460,1980;Gorski等,JImmunol Meth 47:61-73,1981;Linder等,J Immunol Meth 47:49-59,1981;和Burger等,J Immunol 141:553-558,1988)。然后可以测量抗体与裂解产物的结合,所述结合与已知浓度的带标签的裂解产物竞争。可以使用多种测定法如放射免疫测定法、ELISA和辐射扩散测定法来检测补体裂解产物。
免疫技术提供了检测补体活化的高灵敏度,因为它们允许测量血中裂解产物的形成,所述血来自患有或不患有黄斑变性相关病症的测试受试者和对照受试者。因此,在本发明的一些方法中,通过定量来自测试受试者的血浆中补体成分的可溶裂解产物(例如C3a、C4a、C5a和C5b-9末端络合物)测量异常补体活化,从而获得眼部病症相关病症的诊断。测量可以如例如Chenoweth等,N Engl J Med 304:497-502,1981;和Bhakdi等,Biochim Biophys Acta 737:343-372,1983中所述进行。优选地,仅测量体内形成的补体活化。这可以如下完成:在含有补体系统抑制剂的培养基中收集来自受试者的生物学样品(例如血清),随后测量样品中的补体活化(例如定量裂解产物)。
在患有眼部疾病或病症相关病症的患者的临床诊断或监测中,与来自正常受试者的相应生物学样品中的水平相比,补体蛋白质的检测表明患者患有黄斑变性相关的病症。
体内诊断或成像描述于US2006/0067935中。简言之,这些方法通常包括对患者施用或引入诊断有效量的C5结合分子,所述C5结合分子与可通过无创方法检测的标记物或标签有效连接。允许抗体-标记物缀合物有足够的时间定位并结合眼内的补体蛋白质。然后将患者暴露于检测设备,以鉴定可检测的标记物,从而形成C5结合分子在患者眼中定位的图像。通过测定抗体-标记物是否与眼的补体结合,检测C5结合分子或其复合体的存在。与未患有AMD疾病的正常个体相比,在选择的补体蛋白质或蛋白质组合中检测到提高的水平表明有与黄斑变性相关病症的诱因和/或发病。本发明的这些方面也优选用于眼成像方法,和组合的血管发生诊断和治疗方法中。
还在另一方面中,在无细胞测定法中,可以将C5蛋白质或表位与已知结合分子接触,所述结合分子结合C5蛋白质形成测定混合物,然后将所述测定混合物与测试化合物或结合分子接触,以测定测试化合物或结合分子超过已知化合物与C5蛋白质相互作用的能力。
转基因动物
可以使用本发明的化合物或结合分子形成转基因动物。具体地,可以通过将野生型或突变核酸分子插入宿主动物的细胞中,形成转基因非人动物。核酸分子进入宿主动物细胞的插入可以通过多种方法完成,包括但不仅限于转染、粒子轰击、电穿孔和显微注射。插入可以对种系细胞、胚胎细胞或成熟的成年宿主动物细胞进行。
例如在一个方面中,本发明的宿主细胞是其中引入了C5蛋白质-编码序列的受精的卵母细胞或胚胎干细胞。这些宿主细胞可随后被用于产生其基因组中引入了外源C5核酸序列的非人转基因动物,或者产生其中内源C5序列被改变的同源重组动物。这类动物适用于研究C5蛋白质的功能和/或活性,和用于鉴定和/或评价蛋白质活性的调节剂。在本文中使用时,“转基因动物”是其中一个或多个动物细胞包含转基因的非人动物,优选哺乳动物,更优选啮齿动物例如兔或小鼠。转基因动物的其他实例包括非人灵长动物、绵羊、狗、牛、山羊、鸡、两栖动物等。
转基因是外源DNA,其被整合进产生转基因动物的细胞的基因组中,并保留在成熟动物的基因组中,从而指导所编码的基因产物在转基因动物的一个或多个细胞类型(例如肝)或组织中表达。在本文中使用时,“同源重组动物”是非人动物,优选哺乳动物,更优选小鼠,其中通过动物发育前内源基因和引入动物细胞(例如动物的胚胎细胞)中的外源DNA分子之间的同源重组,改变内源C5蛋白质基因。
可以通过将编码C5蛋白质的核酸引入(例如通过显微注射、逆转录病毒感染)受精卵母细胞的雄原核中,并允许卵母细胞在假孕的雌性代孕动物中发育,产生本发明的转基因动物。可以将C5蛋白质DNA序列例如SEQ ID No:2、4或5之一作为转基因引入非人动物的基因组中。或者,可以基于与人基因DNA的杂交分离C5蛋白质基因的非人同源物例如小鼠C5蛋白质基因,并将其用作转基因。转基因内也可以包含内含子序列和多聚腺苷酸化信号,以提高转基因的表达效率。一个或多个组织特异性调节序列可以与C5蛋白质转基因有效连接,以指导蛋白质在具体细胞例如肝细胞中的表达。通过胚胎操作和显微注射动物(尤其是例如小鼠)产生转基因动物的方法是本领域中常规的,并且描述于例如美国专利号4,736,866;4,870,009和4,873,191;和Hogan,1986.In:MANIPULATING THEMOUSE EMBRYO,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y中。类似的方法用于生产其他转基因动物。
也可以根据Wilmut,等,1997.Nature 385:810-813中所述方法生产非人转基因动物的克隆。简言之,可以分离来自转基因动物的细胞(例如体细胞)并诱导其退出生长周期进入G0期。然后可以例如通过使用电脉冲,将静止的细胞与分离静止细胞的相同物种动物的去核卵母细胞融合。然后培养重建的卵母细胞,使得其发育成为桑椹胚或胚细胞,然后转移至假孕的雌性代孕动物中。该雌性代孕动物的后代携带的应当是分离所述细胞(例如体细胞)的动物的克隆。
诊断测定法
在本文中鉴定的表位序列(和相应的全基因序列)可以以多种方式用作多核苷酸试剂。例如但并非限制,这些序列可用于:(i)将它们各自的基因在染色体上作图;和进而定位与遗传疾病相关的基因区域;(ii)根据微小的生物学样品鉴定个体(组织定型);和(iii)有助于生物学样品的法医鉴定。
在一个方面中,本发明包括在生物学样品(例如血、血清、细胞、组织)的环境中或下述个体中测定C5蛋白质和/或核酸表达以及C5蛋白质功能的诊断测定法,所述个体遭受AMD相关疾病或病症,或者处于发生AMD相关病症的风险下。
诊断测定法例如竞争性测定法依赖于带标签的类似物(“示踪剂”)与测试样品分析物竞争共同结合配偶体上有限量结合位点的能力。一般在竞争之前或之后使结合配偶体沉淀,然后将与结合配偶体结合的示踪剂和分析物与未结合的示踪剂和分析物分离。该分离可以通过倾析(其中使结合配偶体预沉淀)或通过离心(其中在竞争性反应后沉淀结合配偶体)。如通过标记物物质的量所测量的,测试样品分析物的量与结合的示踪剂的量成反比。用已知量分析物制备剂量-应答曲线,并与测试结果比较,从而定量地测定测试样品中存在的分析物的量。使用酶作为可检测的标记物时,这些测定法称作ELISA。在这一形式的测定法中,抗体和抗-C5抗体之间的竞争性结合导致结合的C5蛋白质,优选本发明的C5表位,其为血清样品中抗体的度量,最特别地为血清样品中中和抗体的度量。
该测定法的一个显著的优点是测量直接用中和抗体(即干扰C5蛋白质结合、特别是表位结合的抗体)完成。这样的测定法,尤其是ELISA形式的测定法在临床环境中和常规血筛选中具有可观的应用。
本发明还涉及预示性药物领域,其中诊断测定法、预后测定法、药物基因组学和临床性状的监测被用于预后(预测性)目的,从而预防性地治疗个体。
本发明还提供了用于测定个体是否处于发生补体通路活性失调相关病症的风险下的预后(或预测性)测定法。例如,可以测定生物学样品中C5基因中的突变。这类测定法可以用于预后或预测性的目的,从而在病症发生前预防性地治疗个体,所述病症的特征是C5蛋白质、核酸表达或活性或者与之相关。
本发明的另一方面提供了测定个体中C5核酸表达或C5蛋白质活性,从而针对该个体选择适当的治疗或预防药剂(在本文中称作“药物基因组学”)。药物基因组学允许以个体的基因型为基础(例如检查个体的基因型以确定个体对具体药剂应答的能力)选择用于个体治疗性或预防性治疗的药剂(例如药物)。
本发明的另一方面涉及在临床试验中监测药剂(例如药物)对C5蛋白质表达或活性的影响。
除了C5核酸和蛋白质在这些方法中的用途外,可以如上所述使用抗-C5结合分子治疗病症和疾病,所述病症和疾病根据本发明被发现涉及如上所述的新血管形成、炎症。
药物组合物
本发明的化合物和结合分子可以以游离形式或者以可药用盐的形式与运载体、赋形剂和稳定剂一起施用。这类组合物可以以常规方式制备,并显示与游离化合物相同的活性等级(Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编[1980])。
抗-C5抗体或抗-C5抗体片段的效用,例如在上文中详述的涉及炎症或新血管生成事件的眼部疾病和病症的治疗中的效用,可以在动物测试方法以及临床中证明,例如根据下文所述的方法证明。
根据本发明,本发明的化合物和结合分子可以通过任何常规途径施用,尤其是肠施用,例如口施用,例如以片剂或胶囊的形式施用,或者肠胃外施用(优选皮下、静脉内或心内、玻璃体内或结膜下或subtenon’s施用),例如以可注射溶液或悬浮液的形式施用,局部施用(优选为施用给眼的眼用溶液),例如以溶液、凝胶、软膏剂或霜剂的形式施用,或者以鼻、透皮贴剂或栓剂的形式施用。
可以通过与可药用的运载体或稀释剂混合的常规方式,制备以游离形式或与至少一种可药用运载体或稀释剂组合的可药用盐形式包含本发明化合物和结合分子的药物组合物。用于口施用的单位剂型含有例如从约0.1mg到约500mg的活性物质。
优选本发明的化合物和结合分子(例如抗-C5抗体或其片段)被局部施用例如至眼表面,或肠胃外施用,例如静脉内、玻璃体内、心内(intracamerally)、结膜下或subtenon’s施用,或皮下施用。
实践本发明方法所需的每日剂量应取决于例如使用的化合物或结合分子、宿主、施用模式、待治疗的病症的严重性。
可以使用本领域公知的标准技术,以类似的方式配制通过本文公开的筛选方法鉴定的化合物或结合分子。
制备的产品(Articles of Manufacture)
在本发明的另一特性中,提供了含有适用于诊断或治疗上述病症的材料(例如包含本发明的化合物或结合分子)的制备产品。制备的产品包含容器和说明书。合适的容器包括例如瓶、管形瓶(vial)、注射器和试管。容器可以由多种材料例如玻璃或塑料制成。容器装有有效诊断或治疗病症的组合物,并可具有无菌的接入端口(例如容器可以是静脉溶液袋或管状瓶,其具有可被皮下注射针穿透的塞子)。组合物中的活性剂通常是本发明的多肽或抗体。容器上或与容器结合的说明书或标签指明组合物适用于诊断或治疗选择的病症。制备的产品可还包含第二容器,所述第二容器包含可药用的缓冲液,例如磷酸缓冲盐溶液、林格溶液和葡萄糖溶液。其还可包含从商业观点和使用者观点看来期望的其他材料,包括其他缓冲液、稀释剂、滤器、针、注射器和带有使用说明书的包装插入片段。
已全面描述的本发明还通过以下的实施例和权利要求书进一步阐述,所述实施例和权利要求书是阐述性的,并不意味着进一步限制。本领域技术人员使用不超出常规的实验会明白或者能够明确本文所述特定步骤的大量等同物。这类等同物属于本发明和权利要求书的范围内。在本申请通篇中引用的所有参考文献(包括发行的专利和公开的专利申请)的内容通过参考并入本文。
实施例
实施例1
在大部分情况下,由于小鼠和人之间C5蛋白质序列的低保守性,针对人C5产生的抗体不显示与小鼠C5结合。因此,可使用在功能性测试中保留活性的嵌合C5蛋白质(含有人和小鼠的蛋白质序列)来检测抗人抗C5-抗体的表位。
可使用表达人α链/小鼠β链,或小鼠α链/人β链的DNA构建体,将抗体针对人α链或β链上的表位作图。质粒形式的嵌合人/小鼠C5构建体的DNA得自GeneArt。使用嵌合构建体将链内的表位精细作图,所述嵌合构建体表达被移入人C5蛋白质序列中替代它们各自的人序列的小鼠蛋白质序列的100个氨基酸区段。每个嵌合蛋白质在其C-端含有一串组氨酸用于亲和纯化。
将来自质粒的编码嵌合蛋白质的插入片段分离,使用标准技术(见Sambrook,Maniatis等)克隆进哺乳动物表达载体(例如pCDNA3.1)中,得到所编码的蛋白质。简言之,将293T细胞以6×106个细胞/100mm涂布在不含青霉素-链霉素的DMEM(Gibco 11995-073)、10% FBS(HycloneSH30070.03)中。随后使用最终混合于750μl OPTI-MEM(Gibco 51985-034)中的10μg含有嵌合人/小鼠蛋白质编码序列的质粒构建体实现转染。针对10个100mm平板建立转染混合物。将30μl Lipofectamine 2000(Invitrogen 11668-019)与720μl OPTI-MEM混合(每100mm平板)。转染后24小时,用IS GRO培养基(Irvine Scientific 91103)洗涤平板,向每个平板中添加6ml新的IS GRO培养基,并孵育24-48小时。收获得到的上清。向每个平板中添加新的IS GRO培养基,并将细胞孵育24-48小时用于另一次收获。通常进行相同的过程从而第三次收获上清。
将上清滤过0.2微米滤器并进一步纯化(或者可将上清储存于80℃下直至纯化)。可使用常规的纯化方法。简言之,向上清中添加无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物片剂(Roche),并用NaOH将pH调节至8。用PBS、10mM咪唑,pH 7.4和蛋白酶抑制剂平衡Ni-NTA树脂。将上清与树脂(1.5mL BV)结合1小时并应用于重力流动柱。洗涤柱,并用PBS、300mM咪唑,pH 7.4和蛋白酶抑制剂将蛋白质洗脱。在电泳凝胶上测试级分。将级分合并,并在PBS pH 7.4中透析去除咪唑。测试蛋白质的纯度和活性。
鉴定C5抗原表位
通过使用竞争性ELISA测定法,研究抗-C5抗体片段(Fabs)和全长IgG的表位作图。还研究了针对5G1.1(α链结合子,Thomas TC等,MolecularImmunology,33,1389-1401,(1996))抗体和N19/8(β链结合子,Evans MJ等,Molecular Immunology,332 1183-1195,(1995))抗体的竞争。可如下文进一步所述,使用若干种ELISA测定法。使用包被在平板上的5G1.1或N19/8的一种测定法使用天然C5并检测抗体的结合。使用下述嵌合的C5蛋白质,其中C5的β链是小鼠来源且α链是人来源,或者使用上文所述的其他嵌合的C5蛋白质。另一测定法涉及溶液相竞争,其中以至少10倍的摩尔过量将Fab或IgG与生物素-C5预孵育,然后添加进用抗-C5Fab或抗体包被的平板中,并用链霉亲和素-HRP检测。来自这些实验的结果表明抗体候选者是否与5G1.1、N19/8或选择的其他抗体候选者竞争相同的结合位点。结果还表明测试的抗体是否结合人C5蛋白质的α或β链。
5G1.1与嵌合的人/小鼠C5竞争
以100μl/孔体积,用碳酸盐缓冲液(Pierce 28382)中4ug/ml的抗人C5纯化的Fab和Mab包被Maxisorp平板Nunc.442404。将平板密封并置于4℃过夜。然后将平板抽吸并用300μl/孔体积的PBS/0.5%Tween20(PBST)洗涤三次。将平板用300μl/孔SynBlock(AbD Serotec BUF034C)封闭,并在室温下孵育2小时,然后用PBST 300ul/孔体积洗涤一次。在稀释剂(2%BSA级分V(Fisher ICN16006980)、0.1%Tween20(Sigma P1379)、0.1%Triton-x-100(Sigma P234729),PBS)中1∶8稀释来自用小鼠/人嵌合C5蛋白质转染的293T细胞的上清,并以100μl/孔添加至平板,或在稀释剂中将纯化的人C5(Quidel A403)稀释至1ug/ml和100μl/孔,并添加至平板。将平板在室温下孵育1小时,并用PBST 300μl/孔体积洗涤三次。将5G1.1IgG在稀释剂中以1μg/ml稀释,并以100μl/孔添加至平板中。将平板在室温下孵育1小时并在PBST中洗涤三次。将检测抗体抗-人IgG Fc-HRP(Pierce 31125)1∶5000稀释,并以100ul/孔添加至平板。将平板在室温下孵育1小时并用PBST洗涤四次。然后以100μl/平板添加TMB底物(Pierce34028)。将平板在室温下孵育10分钟+/-2分钟,并以50μl/孔添加终止溶液(2N H2SO4)。在Spectramax 450nm-570nm上对吸光度读数。
与生物素化的人C5竞争
以50μl/孔体积,用碳酸盐缓冲液(Pierce 28382)中5μg/ml的纯化的抗人C5 Fab和IgG包被Maxisorp平板Nunc.442404。将平板密封并在室温下置于摇床上4小时。然后将平板抽吸并用PBST洗涤三次。将平板用300μl/孔SynBlock SuperBlock PBS(Pierce 37515)封闭,并在室温下孵育2小时。然后用PBST将平板洗涤一次。在Superblock中将抗人C5 Fab/Mab稀释至5μg/ml的浓度,且生物素化C5(Morphosys)浓度为0.25μg/ml,将其孵育1小时后以50μl/孔添加至平板。将平板在室温下孵育1小时,并用PBST 300μl/孔体积洗涤三次。在Superblock中1∶5000稀释多聚-链霉亲和素-HRP(Endogen N200),并以100μl/孔添加至平板。将平板在室温下孵育30分钟并用PBST洗涤三次。然后以100μl/孔添加TMB底物(Pierce34028)。将平板在室温下孵育10分钟+/-2分钟,并以50μl/孔添加终止溶液(2N H2SO4)。在Spectramax 450nm-570nm上对吸光度读数。
与5G1.1和N19/9的竞争实验
以100μl/孔体积,用碳酸盐缓冲液(Pierce 28382)pH 9.6中5μg/ml的抗人C5 IgG 5G1.1或N19/8包被Maxisorp平板Nunc.442404。将平板密封并置于4℃过夜。然后将平板抽吸并用PBST洗涤三次。将平板用300μl/孔稀释剂/Block(4% BSA级分V(Sigma A403)、0.1%Tween20(SigmaP1379)、0.1%Triton-x-100(Sigma P234729)、PBS)封闭,并在室温下孵育2小时。然后用PBST将平板洗涤一次。在稀释剂中将抗人C5 Fab/Mab稀释至2.5μg/ml的浓度,且经纯化的C5(Quidel A403)浓度为0.5μg/ml,将其孵育30分钟后以100μl/孔添加至平板。将平板在室温下孵育1小时。将平板用PBST洗涤三次。然后将抗-his(Roche 11965085001)在稀释剂中以200mU/ml稀释,或将山羊抗-小鼠Ig-HRP(BD Pharmingen 554002)1∶5000稀释,并以100μl/孔添加至平板。将平板在室温下孵育1小时并在PBST中洗涤三次。然后以100μl/孔添加TMB底物(Pierce 34028)。将平板在室温下孵育5-10分钟,并以50μl/孔添加终止溶液(2N H2SO4)。在Spectramax 450nm-570nm上对吸光度读数。
实施例2通过噬菌体展示产生人抗体
为了产生针对C5的抗体,进行使用MorphoSys HuCAL噬菌体展示文库的选择。HuCAL GOLD是基于HuCAL概念的Fab文库,其中所有六个CDR被多样化,并且其使用CYSDISPLAY技术用于连接Fab片段与噬菌体表面(Knappik等,2000 J.Mol.Biol.296:57-86;Krebs等,2001 J Immunol.Methods 254:67-84;Rauchenberger等,2003 J Biol Chem.278(40):38194-38205;WO 01/05950,,2001)。
噬菌粒回复苏(rescue)、噬菌体扩增和纯化
在含34μg/ml氯霉素和1%葡萄糖(2xYT-CG)的2xYT培养基中扩增HuCAL GOLD文库。用OD600nm为0.5(37℃下30分钟,不摇动;37℃下以250转/分钟摇动30分钟)的VCSM13辅助噬菌体感染后,将细胞离心沉淀(4120g;5分钟;4℃),重悬于2xYT/34μg/ml氯霉素/50μg/ml卡那霉素/0.25mM IPTG中并在22℃下培养过夜。将噬菌体从上清中用PEG-沉淀两次,重悬于PBS/20%甘油中并储存于-80℃下。
如下进行两轮淘洗(panning)之间的噬菌体扩增:用洗脱的噬菌体感染对数中期的大肠杆菌TG1细胞,并涂布在补充有1%葡萄糖和34μg/ml氯霉素的LB-琼脂(LB-CG平板)上。在30℃下孵育过夜后,从琼脂平板上刮取TG1菌落并用于接种2xYT-CG,直至达到0.5的OD600nm,并如上所述添加VCSM13辅助噬菌体用于感染。
用HuCALGOLD淘洗
为了选择识别C5的抗体,应用了两种不同的淘洗策略。总而言之,将HuCAL GOLD噬菌体-抗体分入包含VH主基因不同组合的四个库中(1号库:VH1/5λκ,2号库:VH3λκ,3号库:VH2/4/6λκ,4号库:VH1-6λκ)。在直接包被在Maxisorp平板上的人C5上对这些库分别进行三轮固相淘洗,另外在生物素化的C5抗原上进行三轮溶液淘洗。
第一个淘洗变体是针对C5的固相淘洗:用300μl的5μg/ml C5包被Maxisorp平板(F96 Nunc-Immunoplate)上的2个孔-每个在4℃下过夜(o/n)。将包被的孔用350μl PBS洗涤两次,并用350μl 5%MPBS在室温下微孔滴定板摇床上封闭2小时。对每个淘洗而言,将约1013HuCALGOLD噬菌体-抗体用等体积的PBST/5% MP在室温下封闭2小时。封闭后用350μl PBS将包被的孔洗涤两次。向每个包被的孔中添加300μl预封闭的HuCAL噬菌体-抗体,并在室温下摇床上孵育2小时。通过添加五次350μl PBS/0.05%Tween然后用PBS再洗涤四次,进行洗涤。用每孔10mM Tris/HCl pH8中,用300μl 20mM DTT 10分钟进行噬菌体从平板上的洗脱。将DTT噬菌体洗脱物添加至14ml大肠杆菌TG1中,并在50ml塑料管中于37℃下不摇动孵育45分钟用于噬菌体感染,所述大肠杆菌TG1在37℃下于2YT培养基中被培养至0.6-0.8的OD600。在5000转/分钟下离心10分钟后,将细菌沉淀物各自重悬于500μl 2xYT培养基中,涂布在2xYT-CG琼脂平板上,并在30℃下孵育过夜。然后从平板上刮取菌落,使噬菌体复苏并如上所述扩增。根据第一轮的方案在直接包被的C5抗原上进行第二轮和第三轮固相淘洗,但是在洗涤步骤中使用提高的严格度。
第二淘洗变体是针对生物素化人C5抗原的溶液淘洗:对溶液淘洗而言,使用与Dynabeads M-280(Dynal)偶联的生物素化的C抗原,应用以下的方案:使用经PBS 1∶1稀释的1.5ml 2xChemiblocker,将1.5mlEppendorf管在4℃下封闭过夜。用200μl PBS将200μl链霉亲和素包被的磁性Dynabeads M-280(Dynal)洗涤1次,并重悬于200μl1xChemiblocker(稀释于1x PBS中)中。珠子的封闭在预封闭的管中于4℃下进行过夜。将用于每个淘洗条件的、在500μl PBS中稀释的噬菌体与500μl 2xChemiblocker/0.1% Tween在室温下混合1小时(转动器(rotator))。噬菌体的预吸附进行两次:向封闭的噬菌体中添加50μl封闭的链霉亲和素磁珠,并在室温下在转动器上孵育30分钟。通过磁性设备(Dynal MPC-E)分离珠子后,将噬菌体上清(~1ml)转移至新封闭的管中,并在50μl封闭的珠子上将预吸附重复30分钟。然后在新封闭的1.5ml管中向封闭的噬菌体中添加200nM生物素化的C5,并在室温下转动器上孵育1小时。向每个淘洗噬菌体库中添加100μl封闭的链霉亲和素磁珠,并在室温系下在转动器上孵育10分钟。将与生物素化的C5结合的噬菌体固定在磁珠上,并用磁性颗粒分离器(Dynal MPC-E)收集。然后使用转动器在PBS/0.05% Tween中将珠子洗涤7次,之后用PBS再洗涤三次。通过向每个管中添加10mM Tris/HCl pH 8中300μl 20mM DTT 10分钟,进行噬菌体从Dynabeads上的洗脱。通过磁性颗粒分离器取出Dynabeads,并将上清添加至14ml生长至OD600nm 0.6-0.8的大肠杆菌TG-1培养物中。然后用200μl PBS将珠子洗涤一次,并且将PBS与额外去除的噬菌体一起添加至14ml大肠杆菌TG-1培养物中。对噬菌体感染而言,将培养物在50ml塑料管中于37℃下不摇动地孵育45分钟。在5000转/分钟下离心10分钟后,将细菌沉淀物各自重悬于500μl 2xYT培养基中,涂布在2xYT-CG琼脂平板上,并在30℃下孵育过夜。然后从平板上刮取菌落,使噬菌体复苏并如上所述扩增。
在生物素化的C5抗原上的第二和第三轮溶液淘洗根据第一轮的方案进行,例外的是在洗涤步骤中使用提高的严格度。
可溶性Fab片段的亚克隆和表达
将所选择的HuCAL噬菌粒的Fab-编码插入片段亚克隆进表达载体X9_Fab_FH中,从而便于快速和有效地表达可溶Fab。为此,用XbaI和EcoRI消化所选择的克隆的质粒DNA,从而切割Fab-编码插入片段(ompA-VLCL和phoA-Fd),并克隆进XbaI/EcoRI-消化的表达载体X9_Fab_FH中。由该载体表达的Fab带有用于检测和纯化的两个C-端标签(分别为FLAGTM和6xHis)。
使用将所选择的Fab亚克隆进X9_Fab_FH表达载体后获得的氯霉素抗性单个菌落来接种每孔含100μl 2xYT-CG培养基的无菌96-孔微量滴定板的孔,并在37℃下培养过夜。将每种大肠杆菌TG-1培养物5μl转移进新鲜的、无菌的96-孔微量滴定板中,所述微量滴定板每孔用100μl补充有34μg/ml氯霉素和0.1%葡萄糖的2xYT培养基预填充。将微量滴定板在微量平板摇床上于400转/分钟、30℃下孵育,直至培养物轻微混浊(~2-4小时)并具有~0.5的OD600nm。
向这些表达平板中,每孔添加20μl补充有34μg/ml氯霉素和3mMIPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)的2xYT培养基(终浓度0.5mM IPTG),将微量滴定板用可透气的胶带密封,并将平板在400转/分钟摇动、30℃下孵育过夜。
全细胞裂解物(BEL提取物)的产生:向表达平板的每个孔中,添加含2.5mg/ml溶菌酶的40μl BEL缓冲液(2xBBS/EDTA:24.7g/l硼酸,18.7g NaCl/l,1.49g EDTA/l,pH 8.0)并在22℃下在微量滴定板摇床(400转/分钟)上孵育1小时。使用BEL提取物进行借助于ELISA或BioVeris384分析器的结合分析。
酶联免疫吸附测定(ELISA)技术
将PBS中5μg/ml人重组C5抗原包被在384孔Maxisorp平板(Nunc-Immunoplate)上,在4℃下过夜。包被后,将孔用PBS/0.05% Tween(PBS-T)洗涤一次,并用PBS洗涤两次。然后用含2%BSA的PBS-T在室温下将孔封闭2小时。平行地,将15μl BEL提取物和15μl含2%BSA的PBS-T在室温下孵育2小时。将封闭的Maxisorp平板用PBS-T洗涤3次,之后将10μl封闭的BEL提取物添加至孔中,并在室温下孵育1小时。为了检测第一Fab抗体,应用以下的第二抗体:碱性磷酸酶(AP)-缀合的AffiniPure F(ab′)2片段,山羊抗人IgG、山羊抗小鼠IgG或山羊抗绵羊IgG(Jackson Immuno Research)。为了检测AP-缀合物,根据制备商的说明使用产荧光的底物如AttoPhos(Roche)。在所有孵育步骤之间,用PBS-T将微量滴定板的孔洗涤三次,并在使用二级抗体的最终孵育后洗涤三次。可以在TECAN Spectrafluor平板读数器中测量荧光。
Claims (43)
1.分离的多核苷酸,其与选自SEQ ID No.2、4和6的核酸序列具有至少95%的核酸序列同一性。
2.分离的多核苷酸,其包含选自SEQ ID No.2、4和6的核酸序列。
3.载体,其包含与控制序列有效连接的权利要求2的多核苷酸。
4.宿主细胞,其包含权利要求3的载体。
5.分离的多肽,其与选自SEQ ID No 1、3和5的氨基酸序列具有至少95%的氨基酸同一性。
6.分离的多肽,其包含选自SEQ ID No 1、3和5的氨基酸序列。
7.用于产生C5蛋白质的方法,所述方法包括在适合表达所述多肽的条件下培养权利要求4的宿主细胞,并从细胞培养物中回收所述多肽。
8.权利要求7的方法,其中所述C5蛋白质包含选自SEQ ID No 1、3和5的表位。
9.分离的C5结合分子,其包含与C5表位特异结合的抗体的抗原结合部分,所述C5表位在选自SEQ ID No 1、3和5的氨基酸内或与之重叠。
10.权利要求9的C5结合分子,其中所述抗原结合部分与非人灵长动物的C5抗原交叉反应。
11.权利要求9的C5结合分子,其中所述抗原结合部分与啮齿动物物种的C5抗原交叉反应。
12.权利要求9的C5结合分子,其中所述抗原结合部分与线性表位结合。
13.权利要求9的C5结合分子,其中所述抗原结合部分与非线性表位结合。
14.权利要求9的C5结合分子,其中所述抗原结合部分以等于或小于0.1nM的KD与人C5抗原结合。
15.权利要求9的C5结合分子,其中所述抗原结合部分以等于或小于0.3nM的KD与非人灵长动物的C5抗原结合。
16.权利要求9的C5结合分子,其中其抗原结合部分以等于或小于0.5nM的KD与小鼠C5抗原结合。
17.前述任一项权利要求的C5结合分子,其中所述抗原结合部分是人抗体的抗原结合部分。
18.权利要求9的C5结合分子,其中所述抗体是人源化的抗体。
19.前述任一项权利要求的C5结合分子,其中所述抗原结合部分是单克隆抗体的抗原结合部分。
20.权利要求9的C5结合分子,其中所述抗原结合部分是多克隆抗体的抗原结合部分。
21.权利要求9的C5结合分子,其中所述C5结合分子是嵌合抗体。
22.权利要求9的C5结合分子,其中所述C5结合分子包含抗体的Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段或Fv片段。
23.权利要求9的C5结合分子,其中所述C5结合分子包含单链Fv。
24.权利要求9的C5结合分子,其中所述C5结合分子包含双抗体。
25.前述任一项权利要求的C5结合分子,其中所述抗原结合部分来自以下同种型之一的抗体:IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
26.前述任一项权利要求的C5结合分子,其中所述抗原结合部分来自以下同种型之一的抗体:IgG1、IgG2、IgG3或IgG4,其中Fc序列相对于正常序列已被改变,从而调节效应子功能或改变与Fc受体的结合。
27.前述任一项权利要求的C5结合分子,其中所述C5结合分子抑制细胞中的MAC生产。
28.前述任一项权利要求的C5结合分子,其中所述C5结合分子抑制C5与转化酶的结合。
29.抑制细胞中MAC合成的方法,所述方法包括将细胞与C5结合分子接触。
30.在受试者中调控MAC活性的方法,所述方法包括对受试者施用调节补体系统介导的细胞活性的C5结合分子。
31.在受试者中治疗或预防眼部病症的方法,所述方法包括对受试者施用有效量的结合分子,所述结合分子与选自SEQ ID No 1、3和5的表位特异结合。
32.权利要求31的方法,其中相对于施用结合分子前受试者中的MAC水平而言,受试者的MAC水平被降低至少5%。
33.权利要求31的方法,其中所述结合分子玻璃体内施用。
34.权利要求31的方法,其中所述眼部病症选自黄斑变性、糖尿病性眼部疾病和病症、眼部水肿、缺血性视网膜病变、前部缺血性视神经病、视神经炎、囊样黄斑水肿、视网膜疾病和病症、病理性近视、早产儿视网膜病、血管化的,排斥的或者以其他方式发炎的角膜、干燥性角结膜炎、干眼、葡萄膜炎、巩膜炎,巩膜外层炎,结膜炎、角膜炎、眼眶蜂窝织炎、眼部肌炎、甲状腺眶病、泪腺和眼睑炎症。
35.权利要求31的方法,其中所述结合分子是单克隆抗体。
36.测定怀疑患有AMD的受试者的存在或诱因的方法,其包括测量从所述受试者获得的样品中C5蛋白质的量并将所述量与对照样品比较。
37.能够抑制旁路补体通路的蛋白质在制备下述药物中的用途,所述药物用于治疗眼部疾病或病症,或用于延迟眼部疾病或病症的发展,所述蛋白质能够抑制C5蛋白质活化或抑制C5b与C6的结合。
38.权利要求37的用途,其中能够抑制旁路补体通路的蛋白质是与C5上α或β链结合的抗体或抗体片段。
39.权利要求37的用途,其中与C5结合的所述抗体或抗体片段能够抑制C5活化。
40.权利要求37的用途,其中所述抗体或抗体片段与选自SEQ ID No.1、3和5的C5表位结合。
41.用于检测C5蛋白质存在的试剂盒,其包含含有权利要求9的抗体的容器,和用于检测与所述抗体结合的所述蛋白质的说明书。
42.权利要求41的试剂盒,其中所述抗体还包含可检测的标签。
43.治疗或抑制眼部疾病或病症,或延迟眼部疾病或病症发展的方法,所述方法包括对需要这类治疗的受试者施用有效量的能够抑制旁路补体通路的蛋白质。
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