CN104114574B - 结合人补体c5的多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及C5结合多肽，其包括C5结合基序，BM，所述基序由选自以下的氨基酸序列构成：i)EX2X3X4A X6X7EID X11LPNL X16X17X18QW X21AFIX25X26LX28D，和ii)与i)中定义的序列具有至少86％同一性的氨基酸序列，其中多肽结合C5。本发明还涉及C5结合多肽，用于在治疗中使用，例如用于在C5相关的状况的治疗中使用，以及涉及治疗的方法。

Description

结合人补体C5的多肽
技术领域
本公开内容涉及结合人补体组分5(C5)的多肽，并涉及此类多肽在治疗中的用途。
背景
补体蛋白质C5是补体系统的核心组分，所述补体系统是先天免疫系统的关键部分。补体系统是复杂的免疫生存系统(immune survival system)，具有处于严格控制的、多样化的过程的许多任务。其功能之一是通过从细胞碎片以及凋亡和坏死细胞中识别健康的宿主组织，作为对抗由其它生物体感染的第一道宿主防线(first line host defense)。此外，其参与免疫复合物的清除、适应性免疫应答的调节、组织再生的促进、血管生成、干细胞的动员和中枢神经系统的发育(Woodruff等人Mol Immunol2011,48(14):1631-1642)；Ricklin等人Nat Immunol2010,11(9):785-795)。干扰补体激活和调节的微妙平衡的任何触发，例如错误的或不受限制的激活或非足够的调节可导致病理状况，包括导致广泛的组织损伤的宿主细胞的自我攻击。
补体系统由约30种蛋白质组成。存在三种途径启动补体免疫；使用C1q识别细胞表面的免疫复合物的经典途径、当甘露糖结合凝集素(MBL)识别某些糖时启动的凝集素途径、以及通过补体因子3(C3)的水解自发启动的旁路途径，所述补体因子3(C3)的水解是一种被不在侵入病原体上存在的某些哺乳类细胞表面分子抑制的过程。旁路途径还可作为补体系统的放大回路(amplification loop)。所有三种途径在C3水平汇合(converge)。将C3裂解为C3a和C3b导致转化酶的形成，其进而将补体因子5(C5)裂解为C5a和C5b。C5a是各种免疫细胞的非常有效的引诱剂(attractant)，而C5b与C6-9寡聚以形成称为膜攻击复合物(MAC)或有时称为末端补体复合物(TCC)的孔。补体系统的激活引起一些具有中和病原体的目的的机制：细胞诸如入侵的细菌表面MAC的形成导致裂解；C3和C4裂解产物C3b和C4b的积累(deposition)辅助调理作用(opsonization)，导致病原体通过巨噬细胞的吞噬作用；以及过敏毒素诸如C3a和C5a引诱单核细胞和嗜中性粒细胞至激活位点，上调表面标志物，导致增加的免疫敏感性及细胞因子的释放。
C5是190-kDa的糖蛋白，包括2个二硫键连接的多肽链α和β，分子量分别为115kDa和75kDa(Tack等人Biochem1979,18:1490-1497)。Haviland等人(J Immun1991,146:362-368)构建了人补体前-C5(pro-C5)的完整cDNA序列，其被预测编码1,676个氨基酸的前分子(pro-molecule)，所述前分子包含分隔β和α链的18个氨基酸的前导肽和4个氨基酸的接头。C5裂解为C5a和C5b的阻断阻止MAC的形成和促炎性C5a的形成，但保持上游补体效应系统完整，允许C3/C4介导的调理作用。
补体系统在针对病原体的防御中的关键作用通常使其成为药学干预的感兴趣的靶。这通过补体的许多突变或受损的调节参与各种疾病和状况的事实被强调。这些包括对自身免疫性疾病例如系统性红斑狼疮(SLE)的增加的易感性，其中免疫复合物的积累触发了经典途径(Manderson等人Annu Rev Immunol2004,22:431-456)。此外，补体蛋白质C1-C5的突变往往导致SLE或SLE样症状。具有补体系统强烈参与的其它自身免疫性疾病是类风湿关节炎(RA)，其中免疫复合物可激活RA关节中的补体；干燥综合征、皮肌炎及其它自身抗体驱动的疾病诸如格林-巴利综合征(Guillain-Barré syndrome,GBS)、Fisher综合征(Kaida等人J.Neuroimmun2010,223:5-12)不同类型的血管炎、系统性硬化症、抗肾小球基底膜(抗GBM)和抗磷脂综合征(APS)(Chen等人J Autoimmun2010,34:J276-J286)。
补体系统还参与神经退行性紊乱诸如阿尔茨海默氏病(AD)，其中Aβ斑块直接激活补体系统，导致C5a介导的小神经胶质细胞的募集。这在当C5aR拮抗剂在AD小鼠模型中被证明是神经保护的时被进一步证实(Fonseca等人J Immunol2009,183:1375-1383)。针对乙酰胆碱受体的自身抗体和随后的补体激活是重症肌无力的最常见原因，重症肌无力是一种影响神经肌肉接头的疾病(Toyka和Gold,Schweizer Archive Neurol Psych2007,158:309-321)。MAC的形成涉及多发性硬化(MS)的病理生理学(Oh等人Immunol Res2008,40:224-234)。此外，在帕金森氏病、亨廷顿氏病和朊病毒病诸如Creutzfeld-Jacob病中，补体激活是病理学的一部分(Bonifati和Kishore,Mol Immunol2007,44:999-1010)。在创伤愈合中，炎性反应是恢复组织内稳态的关键组分，且补体系统参与损伤组织的早期识别。然而，在例如慢性创伤和严重烧伤模型中，补体通过例如C1抑制剂的抑制导致改善的愈合和减少的组织损伤，显示补体。此外，各种补体缺陷，诸如由C4敲除小鼠示例的，被发现保护免受由创伤引起的长期组织损伤(综述于Cazender等人Clinical and DevelopmentalImmunology2012中，在线出版)。最近已显示，肿瘤的生长和增殖通过补体激活特别是通过C5a被促进，且C5a受体的阻断减慢该过程。此外，相比野生型同窝小鼠，缺乏C3的小鼠显示显著较慢的肿瘤生长(Markiewski等人Nat Immunol2008,9:1225-1235)。
功能失调性补体调节是若干罕见至超罕见状况诸如阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)和非典型性溶血尿毒综合征(aHUS)的原因，其中溶血是病理中的关键特征。在PNH中，具有突变的编码磷脂酰肌醇N-乙酰氨基葡萄糖转移酶亚基A的PIG-A基因的造血干细胞的克隆在血细胞库中占优势(take over)。该突变导致GPI锚定蛋白质诸如补体调节剂CD55和CD59的损失。表面缺乏CD55和CD59的红血细胞暴露于通过MAC的补体介导的裂解。在临床上，PNH的表现为导致贫血、血栓形成和骨髓衰竭的溶血。非典型性HUS是通过主要为旁路途径的调节蛋白质中的突变，例如通过因子H中的突变引起的。
眼部被强烈指示作为补体驱动的病理的部位。视力丧失的最常见原因是年龄相关性黄斑变性(AMD)，其中在其较为严重的形式(渗出性或湿性AMD)中，在视网膜下形成病理性脉络膜神经血管膜。在美国，约10％的65-74岁的群体显示黄斑变性的病征，并且多达5％的群体由于AMD而患有视力障碍。这些数目随着年龄而显着增加，但也存在遗传因素。在这些基因中，与AMD最强烈相关的是补体因子H、因子B及C3和C1抑制剂(Bradley等人Eye2011,25:683-693)。此外，使用各种补体阻断分子(complement blocking molecule)的一些研究和临床试验已被证明是有益的，表明C5阻断分子可帮助这些患者群体。然而，目前晚期AMD的治疗旨在通过玻璃体内注射例如雷珠单抗(单克隆抗体片段)和贝伐单抗(单克隆抗体)来抑制血管内皮生长因子(VEGF)诱导的血管形成。在葡萄膜炎的动物模型中，眼部的炎症是由于针对眼部抗原的免疫应答引起，阻断针对旁路途径因子B(Manickam等人J BiolChem2011,286:8472-8480)以及针对C5(Copland等人Clin Exp Immunol2009,159:303-314)的抗体，改善了疾病状态。
在实体器官移植中，存在导致移植物排斥或功能延迟/受损的两种主要的机制途径：1)供体和受体之间的关于血型(ABO)和MCH类的免疫屏障，以及受体针对供体的预先致敏作用的程度，即，导致急性抗体介导的排斥(AMR)的供体特异性抗体(DSA)的发生；和2)移植器官的条件以及其在没有恒定的血液灌注的情况下被保持的时间段，即移植物的缺血损伤或缺血再灌注损伤(IRI)的程度。在AMR和IRI两者中，补体系统攻击被识别为外来的器官，并因此，实体应被排斥。在AMR中，预先存在的抗-供体抗体在外来器官表面快速地形成免疫复合物，导致通过C1q和后续的补体系统激活经由经典途径的识别。称为超急性排斥的这一过程发生在几分钟内，并因此不匹配的器官的现代移植，包括移植前通过血浆除去法或血浆置换以及静脉注射结合不同的免疫抑制剂的IgG来消除DSA。新的治疗还包括通过使用抗-CD20抗体利妥昔单抗的B-细胞耗竭(Genberg等人Transplant2008,85:1745-1754)。这些方案已极大地消除了超急性排斥的发生，但在高致敏患者中，急性AMR的发病率(周-月)仍高达40％(Burns等人Am J Transplant2008,6:2684-2694；Stegall等人Am JTransplant早期在线出版)。关于IRI，大多数证据指向末端途径，具有后续的MAC形成和裂解作为组织损伤的主要原因。因此，C5阻断多肽将保护免受排斥，不管病因是AMR、IRI或如经常发生的AMR和IRI两者的组合。如预期的，高度灌注器官，诸如肝脏(Qin等人Cell MolImmunol2006,3:333-340)、心脏和肾脏，特别容易受到补体介导的损伤的影响。
C5蛋白质的中心位置：连接补体级联的近端和末端部分，使得其成为药学干预的有吸引力的靶。既然C5是补体激活的所有途径共有的，不管刺激如何，阻断C5将阻止级联的进展，并从而阻止末端补体激活的有害性质，而保持近端补体级联的免疫保护和免疫调节功能的完整。
靶向人补体C5的抗体从例如WO95/29697、WO02/30985、和WO2004/007553是已知的。依库珠单抗(Eculizumab)(SolirisTM)是直接针对蛋白质C5的人源化单克隆抗体并阻止C5裂解成C5a和C5b。依库珠单抗已显示在治疗PNH方面是有效的并已被批准用于该适应症，所述PNH是一种罕见的且有时危及生命的血液疾病，其特征为血管内溶血性贫血、血栓形成倾向和骨髓衰竭。依库珠单抗最近还被FDA批准用于治疗非典型性溶血综合征(aHUS)，一种罕见但危及生命的疾病，该疾病是由于旁路补体途径的失控所致，导致过度激活，表现为血栓性微血管病(TMA)，导致重要器官诸如肾脏、心脏和脑的损伤的恒定风险。在aHUS中，损伤的器官的移植仅暂时地有助于患者，因为肝脏继续产生突变形式的控制蛋白质(最常见为补体因子H或旁路途径的其它蛋白质)。具有暂时性急性病理生理学的相关疾病是HUS，所述HUS是由于志贺毒素阳性大肠杆菌(E.coli)(STEC-HUS)的感染所致，且存在表明依库珠单抗用于该状况也是有效的有前景的临床数据(Lapeyraque等人，N Engl J Med2011,364:2561-2563)。最后，C5阻断抗体依库珠单抗已被证明在预防高度不匹配的肾脏受体中的AMR方面是有效的(Stegall,M.D.等人Am J Transplant2011,11:2405-2413)。
除了全长抗体，靶向C5的单链可变区片段(scFV)、微抗体(minibody)和适体在文献中被描述。这些C5抑制剂可与C5分子上的不同位点(表位)结合，并可具有不同的作用模式。例如，鉴于依库珠单抗在转化酶裂解位点的一段距离处与C5相互作用，微抗体与C5的裂解位点相互作用。来自软蜱非洲钝缘蜱(Ornithodoros moubata)的C5抑制蛋白质非洲钝缘蜱补体抑制剂(OmCI,Nunn,M.A.等人J Immunol2005,174:2084-2091)，已被推测与CUB-C5d-MG8超级结构域(superdomain)的远端结合，其在转化酶裂解位点附近(Fredslund等人Nat Immunol2008,9(7):753-760)。与以上提到的抑制C5的裂解的三种蛋白质相反，单克隆抗体TNX-558与完整C5和释放的C5a两者上存在的C5a表位结合，而不抑制C5的裂解(Fung等人Clin Exp Immunol2003,133(2):160-169)。
具有其大的、多结构域结构、12个链内和4个链间二硫键和复杂糖基化模式的抗体，具有一些与其分子结构相关的固有的缺点。例如，依库珠单抗的大小为约148kDa。人血液中C5的浓度为约400nM，且为了完全阻断C5活性，抑制剂的浓度必须至少等于或高于其。因此，使用SolirisTM的PNH标准终身治疗方案是每两周静脉输注900mg蛋白质，所述治疗方案是一种主要在诊所进行的治疗，导致患者极大的不便和社会成本。SolirisTM还被报道引起胸痛、发热、寒战、瘙痒、荨麻疹、面部潮红、皮疹、头晕、呼吸困难、或面部、舌头和喉咙肿胀，虽然这些副作用的原因不清楚。此外，依库珠单抗在任何测试动物模型包括灵长类中是没有活性的，使得具有活性药物的动物研究是不可能的。如以上所提到的，目前AMD的治疗还是抗体依赖性的，并因此，基于注射或其它施用途径的低分子量分子的治疗，是非常需要的。
此外，抗体的生产相比小蛋白质的生产是更加困难且更昂贵的(Kenanova等人Expert Opin Drug Deliv2006,3(1):53-70)。通常与抗体相关的其它缺点由Reilly等人(Clin Pharmacokinet1995,28:126-142)列出，例如与正常组织的交叉反应性和非特异性结合，注射抗体的增加的代谢，以及导致治疗效果的减少或损失的人抗-人抗体(HAMA)的形成。
因此，具有可比的C5阻断活性的剂的继续提供依然是领域内十分关心的问题。特别地，对防止末端补体级联以及促炎性分子C5a的形成的分子存在持续的需求。对提供此类分子在疾病治疗中的用途也具有极大的兴趣。
描述
本发明的一个目的是提供新的C5结合剂。此外，本发明的一个目的是提供新的C5结合剂用于在治疗应用中使用。
在一个方面，提供了C5结合多肽(C5binding polypeptide)，所述C5结合多肽包括C5结合基序(C5binding motif)，BM，所述基序由选自以下的氨基酸序列构成
i)EX2X3X4A X6X7EID X11LPNL X16X17X18QW X21AFIX25X26LX28D,
其中，彼此独立地，
X2选自H、Q、S、T和V；
X3选自I、L、M和V；
X4选自A、D、E、H、K、L、N、Q、R、S、T和Y；
X6选自N和W；
X7选自A、D、E、H、N、Q、R、S和T；
X11选自A、E、G、H、K、L、Q、R、S、T和Y；
X16选自N和T；
X17选自I、L和V；
X18选自A、D、E、H、K、N、Q、R、S和T；
X21选自I、L和V；
X25选自D、E、G、H、N、S和T；
X26选自K和S；
X28选自A、D、E、H、N、Q、S、T和Y；
和
ii)与i)中定义的序列具有至少86％同一性的氨基酸序列，其中多肽结合C5。
以上定义的具有C5结合亲和力的序列相关的多肽的种类，来源于共同的亲本多肽序列。更具体地，种类的定义是基于在选择实验中由于其与C5的相互作用被选择的亲本多肽的大量随机多肽变体的分析。鉴定的C5结合基序，或“BM”，对应于亲本支架的靶结合区，该区域构成三螺旋束蛋白质结构域中的两个α-螺旋。在亲本支架中，两个BM螺旋的不同氨基酸残基构成用于与抗体的恒定Fc部分相互作用的结合表面。通过结合表面残基的随机变化和随后变体的选择，结合表面的Fc相互作用能力已被替换为与C5相互作用的能力。
如在以下实施例中解释的，C5结合多肽变体的选择，可通过例如用于蛋白质支架的幼稚变体(variant)的选择的噬菌体展示，任选地随后为亲和力成熟，和用于亲和力成熟的C5结合变体的选择的细胞展示实现。然而，被理解的是，任何选择系统，无论是基于噬菌体的、基于细菌的、基于细胞的或其它的，都可用于C5结合多肽的选择。
如在本说明书中使用的术语“C5结合”和“对C5的结合亲和力”是指可通过例如使用表面等离子共振技术，例如在Biacore仪器(GE Healthcare)中被测试的多肽的性质。C5结合亲和力可例如在实验中被测试，其中C5被固定在Biacore仪器的传感器芯片上，并将含有待被测试的多肽的样品通过芯片。可选地，将待被测试的多肽固定在仪器的传感器芯片上，并将包含C5、或其片段的样品通过芯片。然后，技术人员可解释通过此类实验获得的结果，以建立多肽与C5结合的至少一种定性测量。如果需要定量测量，例如，以确定相互作用的表观平衡解离常数KD，也可以使用表面等离子共振方法。结合值可在例如Biacore2000仪器(GE Healthcare)中被确定。将C5固定在测量的传感器芯片上，并通过连续稀释制备其亲和力待被确定的多肽的样品，并注射在芯片上。然后，可使用例如由仪器制造商提供的BIA评价软件的1:1Langmuir结合模型从结果计算KD值。用于KD测定的C5或其片段可包括例如由SEQ ID NO:760所代表的氨基酸序列。
在根据本发明的C5结合多肽的一个实施方案中，C5结合多肽与C5结合，使得相互作用的KD值为至多1×10-6M，诸如至多1×10-7M、1×10-8M、或1×10-9M。
根据本发明的C5结合多肽可被用作多种医学、兽医和诊断应用中常规抗体或低分子量物质的替代物。特别地，C5结合多肽可被用于需要试剂的对C5的亲和力的任何方法。因此，C5结合多肽可被用作此类方法中的检测试剂、捕获试剂、分离试剂、诊断剂、或治疗剂。
如技术人员将意识到的，任何多肽的功能，例如如本文所定义的多肽的C5结合能力，依赖于多肽的三级结构。因此，对多肽的氨基酸序列进行微小的改变而没有大幅影响其三级结构和功能是可能的。因此，在一个实施方案中，多肽包括i)的BM的修饰的变体，其使得所得序列与属于通过i)定义的种类的序列至少89％相同，诸如与属于通过i)定义的种类的序列至少93％相同、诸如与属于通过i)定义的种类的序列至少96％相同。例如，属于特定的氨基酸残基的功能分组(functional grouping)(例如疏水性、亲水性、极性等)的氨基酸残基可被来自相同功能组(functional group)的另一个氨基酸残基交换是可能的。
在如以上所定义的C5结合多肽的另一个实施方案中，氨基酸序列选自：i)如以上所定义的，以及iii)在由Xn表示的13个可变位置处与i)中定义的序列具有至少84％同一性，其中n为2-4、6-7、11、16-18、21、25-26和28，并且在位置1、5、8-10、12-15、19-20、22-24、27和29处与i)中定义的序列具有至少87％同一性的氨基酸序列。
在根据本发明的多肽的一个实施方案中，X2选自H、T和V。在另一个实施方案中，X2选自T和V。在又另一个实施方案中，X2是V。
在根据本发明的多肽的一个实施方案中，X3选自I、L和V。在另一个实施方案中，X3选自I和L。在又另一个实施方案中，X3是I。在可选的实施方案中，X3是L。
在根据本发明的多肽的一个实施方案中，X4选自A、D、E、K、L、Q和R。在另一个实施方案中，X4选自A、D、E、K和R。在又另一个相关的实施方案中，X4选自D和E。
在根据本发明的多肽的一个实施方案中，X6是W。
在根据本发明的多肽的一个实施方案中，X7选自A、D、N和T。在另一个实施方案中，X7选自D和N。在又另一个相关的实施方案中，X7是D。在可选的实施方案中，X7是N。
在根据本发明的多肽的一个实施方案中，X11选自A、H、K、Q、R和S。在另一个实施方案中，X11选自A、H、K和R。在又另一个相关的实施方案中，X11选自A、K和R。在又另一个相关的实施方案中，X11选自K和R。
在根据本发明的多肽的一个实施方案中，X16是T。
在根据本发明的多肽的一个实施方案中，X17选自I和L。在另一个实施方案中，X17是I。在可选的实施方案中，X17是L。
在根据本发明的多肽的一个实施方案中，X18选自A、D、E、N、Q、S和T。在另一个实施方案中，X18选自A、D、E、Q和S。在又另一个相关的实施方案中，X18选自D、E和Q。在又另一个相关的实施方案中，X18选自D和E。在又另一个相关的实施方案中，X18是D。在可选的实施方案中，X18是E。
在根据本发明的多肽的一个实施方案中，X21选自I和L。在另一个实施方案中，X21是I。在可选的实施方案中，X21是L。
在根据本发明的多肽的一个实施方案中，X25选自E、H、N和T。在另一个实施方案中，X25选自E和N。在又另一个相关的实施方案中，X25是N。
在根据本发明的多肽的一个实施方案中，X26是K。
在根据本发明的多肽的一个实施方案中，X28选自A、D、E、H、N、Q和S。在以上公开的多肽的另一个实施方案中，X28选自A、D、E和S。在又另一个相关的实施方案中，X28选自A、D和E。在又另一个相关的实施方案中，X28选自D和E。在又另一个相关的实施方案中，X28是D。
在根据本发明的多肽的一个实施方案中，X3X4选自LE和LD。
在根据本发明的多肽的一个实施方案中，X17X18选自IE和LD。
在以上第一方面的实施方案中，落入多肽种类之内的C5结合多肽的实例被鉴定。被预期的是，以上单个实施方案可以以所有可能的方式被组合，并仍落入本发明的范围之内。单个实施方案的此类组合，与i)中的氨基酸定义相比，定义了在位置X2-X28的一个或更多个位置处被限制的氨基酸序列。
以上C5结合多肽的实施方案可例如被组合，使得氨基酸i)满足以下八个条件I-VIII中的至少四个：
I.X2是V；
II.X3选自I和L；
III.X6是W；
VI.X7选自D和N；
V.X17选自I和L；
VI.X21是L；
VII.X25是N；
VIII.X28是D。
在根据第一方面的C5结合多肽的一些实施例中，氨基酸序列i)满足八个条件I-VIII中的至少五个。更具体地，氨基酸序列i)可满足八个条件I-VIII的至少六个、诸如八个条件I-VIII的至少七个、诸如八个条件I-VIII的全部。
如以下实施例中描述的，C5结合变体的选择已导致单个C5结合基序(BM)序列的鉴定。这些序列构成根据该方面的C5结合多肽的单独的实施方案。单个C5结合基序的序列示于图1并展示为SEQ ID NO:1-248。在该方面的一些实施方案中，BM序列i)选自以下的任一个：SEQ ID NO:1-12、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23-24、SEQ ID NO:26-28、SEQ ID NO:32-35、SEQ ID NO:38-39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:56-57、SEQID NO:59、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:78-79、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:151、SEQID NO:161、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:215和SEQ ID NO:243。更具体地，BM序列i)选自SEQ ID NO:1-12中的任一个、诸如选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5。特别地，BM序列i)可选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4。
在特定的实施方案中，C5结合基序(BM)形成三螺旋束蛋白质结构域的部分。例如，BM可基本上构成所述三螺旋束蛋白质结构域中具有互连环(interconnecting loop)的两个α-螺旋。
在另一个实施方案中，三螺旋束蛋白质结构域选自细菌受体蛋白质的结构域。此类结构域的非限制性实例为来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白质A的五个不同的三螺旋结构域，诸如结构域B，及其衍生物。在一些实施方案中，三螺旋束蛋白质结构域是来源于金黄色葡萄球菌蛋白质A的所述结构域B的蛋白质Z的变体。
在其中本发明的C5结合多肽形成三螺旋束蛋白质结构域的部分的实施方案中，C5结合多肽可包括选自以下的氨基酸序列：
i)K-[BM]-DPSQS XaXbLLXc EAKKL NDXdQ；
其中
[BM]是如以上所定义的C5结合基序；
Xa选自A和S；
Xb选自N和E；
Xc选自A、S和C；
Xd选自A和S；
以及
ii)与以上定义的任一序列具有至少79％同一性的氨基酸序列。所述氨基酸序列可与以上定义的任一序列具有至少81％、诸如至少83％、诸如至少85％、诸如至少87％、诸如至少89％、诸如至少91％、诸如至少93％、诸如至少95％、诸如至少97％的同一性。
在如以上定义的C5结合多肽的一个实施方案中，Xa是A。在如以上定义的C5结合多肽的可选的实施方案中，Xa是S。
在如以上定义的C5结合多肽的一个实施方案中，Xb是N。在可选的实施方案中，Xb是E。
在如以上定义的C5结合多肽的一个实施方案中，Xc是A。在可选的实施方案中，Xc为S。在又另一个可选的实施方案中，Xc是C。
在如以上定义的C5结合多肽的一个实施方案中，Xd是A。在可选的实施方案中，Xd是S。
在如以上定义的C5结合多肽的一个实施方案中，Xa是A；Xb是N；Xc是A且Xd是A。
在如以上定义的C5结合多肽的另外的实施方案中，Xa是A；Xb是N；Xc是C且Xd是A。
在如以上定义的C5结合多肽的另外的实施方案中，Xa是S；Xb是E；Xc是S且Xd是S。
在如以上定义的C5结合多肽的另外的实施方案中，Xa是S；Xb是E；Xc是C且Xd是S。
在又另外的实施方案中，如以上定义的C5结合多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:249-496，特别地选自SEQ ID NO:249-260、SEQ ID NO:268、SEQ ID NO:271-272、SEQ IDNO:274-276、SEQ ID NO:280-283、SEQ ID NO:286-287、SEQ ID NO:289、SEQ ID NO:294、SEQ ID NO:297、SEQ ID NO:304-305、SEQ ID NO:307、SEQ ID NO:314、SEQ ID NO:326-327、SEQ ID NO:335、SEQ ID NO:340、SEQ ID NO:354、SEQ ID NO:358、SEQ ID NO:367、SEQID NO:373、SEQ ID NO:389、SEQ ID NO:399、SEQ ID NO:409、SEQ ID NO:414、SEQ ID NO:435、SEQ ID NO:445、SEQ ID NO:451、SEQ ID NO:453、SEQ ID NO:463和SEQ ID NO:491，诸如选自SEQ ID NO:249-260。在另外的实施方案中，氨基酸序列选自SEQ ID NO:249、SEQ IDNO:250、SEQ ID NO:251、SEQ ID NO:252和SEQ ID NO:253，诸如选自SEQ ID NO:249和SEQID NO:252。
因此，在另外的实施方案中，提供了C5结合多肽，其包括选自以下的氨基酸序列：
i)YAK-[BM]-DPSQS SELLXc EAKKL NDSQA P；
其中[BM]是如以上定义的C5结合基序，且
Xc选自S和C；
以及
ii)与以上i)中定义的任一序列具有至少81％同一性的氨基酸序列。
可选地，提供了C5结合多肽，其包括选自以下的氨基酸序列：
i)FNK-[BM]-DPSQS ANLLXc EAKKL NDAQA P；
其中[BM]是如以上定义的C5结合基序，且
Xc选自A和C；
以及
ii)与以上i)中定义的任一序列具有至少81％同一性的氨基酸序列。
如以上讨论的，与以上氨基酸序列相比包括微小的改变而没有大幅影响其三级结构和功能的多肽也在本申请的范围之内。因此，在一些实施方案中，如以上定义的C5结合多肽可具有例如与i)中定义的序列具有至少83％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％或至少98％相同的序列。
在一些实施方案中以及如以下实施例中公开的，C5结合基序可形成58或60个氨基酸的多肽的部分。此类多肽可包括例如选自SEQ ID NO:497-757中的任一个的序列，特别地选自以下的任一个的序列：SEQ ID NO:497-508、SEQ ID NO:516、SEQ ID NO:519-520、SEQID NO:522-524、SEQ ID NO:528-531、SEQ ID NO:534-535、SEQ ID NO:537、SEQ ID NO:542、SEQ ID NO:545、SEQ ID NO:552-553、SEQ ID NO:555、SEQ ID NO:562、SEQ ID NO:574-575、SEQ ID NO:583、SEQ ID NO:588、SEQ ID NO:602、SEQ ID NO:606、SEQ ID NO:615、SEQ ID NO:621、SEQ ID NO:637、SEQ ID NO:647、SEQ ID NO:657、SEQ ID NO:662、SEQID NO:683、SEQ ID NO:693、SEQ ID NO:699、SEQ ID NO:701、SEQ ID NO:711、SEQ ID NO:739和SEQ ID NO:745-757，诸如选自SEQ ID NO:497-508和SEQ ID NO:745-757的序列。在另一个实施方案中，氨基酸序列选自SEQ ID NO:497、SEQ ID NO:498、SEQ ID NO:499、SEQID NO:500、SEQ ID NO:501、SEQ ID NO:746、SEQ ID NO:747、SEQ ID NO:748、SEQ ID NO:750和SEQ ID NO:753，诸如选自SEQ ID NO:497、SEQ ID NO:500、SEQ ID NO:748和SEQ IDNO:753中的任一个。
分子与C5的结合并不一定抑制C5的裂解。抑制依赖于结合位点，且由于与C5的特定区域的相互作用具有什么作用不完全清楚，一些C5结合分子可与C5相互作用而不抑制其裂解为C5a和C5b。在本发明的一个实施方案中，当例如施用至哺乳类受试者时，C5结合多肽抑制C5的裂解。当施用至人受试者时，根据本发明的C5结合多肽可更特异性地抑制人C5的裂解。
C5的结构在物种之间有所不同，并且因此，被发现结合一个物种C5的C5结合剂在另一个物种中可能是无活性的。例如，人源化抗体依库珠单抗与通常被称为MG7的C5的结构域结合。该区域在物种之间是高度可变的，并因此，依库珠单抗局限于与人C5结合。然而，本发明的C5结合多肽并不局限于人C5，而在动物模型中也表现出活性，如在所附实施例中展示的。
技术人员将理解，可对根据本文所公开的任一方面的C5结合多肽进行各种修饰和/或添加，以调整多肽适于特定的应用而不偏离本发明的范围。例如，根据任一方面的C5结合多肽还可包括C末端和/或N末端的氨基酸。此类多肽应被理解为在多肽链的第一个和/或最后一个位置处，即在N-和/或C-末端具有另外的氨基酸残基的多肽。因此，C5结合多肽可包括任何合适数目的另外的氨基酸残基，例如至少一个另外的氨基酸残基。每个另外的氨基酸残基可单独地或共同地被添加，以例如改善多肽的制备、纯化、体内或体外稳定性、偶联、或检测。此类另外的氨基酸残基可包括被添加用于化学偶联目的的一个或更多个氨基酸残基。这方面的一个实例是添加半胱氨酸残基。此类另外的氨基酸残基还可提供用于多肽纯化或检测的“标签”，例如His6标签或“myc”(c-myc)标签或“FLAG”标签，用于与标签特异性抗体相互作用，或在His6-标签的情况下用于固定化金属亲和层析(IMAC)。
如以上讨论的另外的氨基酸可通过化学缀合(使用已知的有机化学方法)或通过任何其它手段诸如表达C5结合多肽作为融合蛋白，被偶联至C5结合多肽。
如以上讨论的另外的氨基酸可构成例如一个或更多个多肽结构域。另外的多肽结构域可提供具有另一种功能的C5结合多肽，诸如例如另一种结合功能、或酶促功能、或毒性功能(例如，免疫毒素)、或荧光信号传导功能，或其组合。
另外的多肽结构域可另外提供具有相同结合功能的C5结合多肽。因此，在另外的实施方案中，提供了C5结合多肽，其包括至少2个C5结合多肽的单体单元，其氨基酸序列可以是相同的或不同的。多肽的多聚体形式可包括合适数目的结构域，每个都具有C5结合基序，且每个都形成多聚体中的“单体”。这些结构域可全部具有相同的氨基酸序列，但可选地，它们可具有不同的氨基酸序列。特别地，本发明的C5结合多肽可形成同源或异源二聚体。
如以上描述的另外的多肽结构域可使用已知的有机化学方法通过共价偶联连接到C5结合多肽。可选地，包括另外的多肽结构域的C5结合多肽可在例如用于多肽重组表达的系统中被表达为一个或更多个融合多肽，或以任何其它形式直接地或经由接头例如氨基酸接头连接。
在一些实施方案中，另外的多肽结构域可包括半衰期延长部分(half lifeextending moiety)，其增加了C5结合多肽的体内半衰期。如技术人员理解的，增加的或延长的半衰期是指特定分子从血液中较慢的清除。存在一些已知的策略用于延长特定多肽的体内半衰期，诸如偶联至抗体的Fc结构域(Fc缀合)或偶联至白蛋白。另一个实例是偶联至半衰期延长部分，例如将在体内与血清白蛋白缔合的肽或蛋白质。特别地，半衰期延长部分可以是白蛋白结合部分(albumin binding moiety)。白蛋白结合部分可例如由天然存在的多肽、或其白蛋白结合片段、或工程化的多肽组成。工程化的多肽可通过使天然存在的起始多肽经受蛋白质工程技术诸如以定点或随机化的方式的突变和改变而源自天然存在的起始多肽，目的在于创建新的或增强的性质，诸如对分子诸如白蛋白的结合亲和力。此类工程化的白蛋白结合多肽可以是例如蛋白质支架的变体，其变体已针对其对白蛋白的特异性结合亲和力被选择。在一个具体的实施方案中，蛋白质支架可选自链球菌蛋白质G或其衍生物的结构域，诸如例如选自链球菌菌株G148的蛋白质G的结构域GA1、结构域GA2和结构域GA3，特别是结构域GA3。
因此，在C5结合多肽的一个实施方案中，另外的氨基酸改善了体内或体外稳定性且构成链球菌蛋白质G的白蛋白结合结构域(albumin binding domain，ABD)，或其衍生物。可被包括在本发明的C5结合多肽中作为另外的多肽结构域的白蛋白结合结构域的一个实例列于SEQ ID NO:759。适合的白蛋白结合结构域的其它实例在WO2009/016043和WO2012/004384中公开。此类ABD延长的多肽与体内血清白蛋白结合，并受益于其较长的半衰期，这增加了多肽本身的净半衰期(参见，例如WO91/01743)。因此，当施用至例如哺乳类受试者时，如以上定义的包括白蛋白结合部分的C5结合多肽的药代动力学特征(pharmacokineticprofile)类似于血清白蛋白的药代动力学特征。ABD和其衍生物与人血清白蛋白(HSA)以及来自其它物种诸如小鼠和大鼠的血清白蛋白非常强烈地结合。
链球菌蛋白质G的ABD长度为46个氨基酸，并因此，当根据本发明的C5结合多肽包括ABD部分或其衍生物时，C5结合多肽的整体大小是相对小的。当施用至例如哺乳类受试者例如人受试者时，C5结合多肽的白蛋白结合部分将与血清白蛋白非共价地缔合，且多肽可从而受益于减少的肾清除和在上皮细胞中增加的再循环。但是，由于血清白蛋白的外渗性质，组织渗透可仍然是快的。此外，相比缺乏相应的半衰期延长部分的多肽，包括半衰期延长部分的C5结合多肽不仅可展示延长的体内半衰期，也可展示降低的体内免疫应答(参见，例如WO2005/097202)。
在相关的方面，提供了C5结合化合物(C5binding compound)，包括至少一种根据任一前述权利要求所述的C5结合多肽；至少一种链球菌蛋白质G的白蛋白结合结构域、或其衍生物，和至少一种连接部分，所述连接部分用于将所述至少一种结构域或其衍生物连接至所述至少一种C5结合多肽的C或N末端。如在以下实施例中展示的，当施用至例如哺乳类受试者时，此类C5结合化合物具有对C5以及对体内血清白蛋白的高亲和力，并且与血清白蛋白的结合不干扰与C5的相互作用。
在一个实施方案中，C5结合化合物具有选自以下的结构：
[CBP1]-[L1]-[ALBD]；
[CBP1]-[CBP2]-[L1]-[ALBD]；
[CBP1]-[L1]-[ALBD]-[L2]-[CBP2]；
[ALBD]-[L1]-[CBP1]；
[ALBD]-[L1]-[CBP1]-[CBP2]；
[CBP1]-[L1]-[CBP2]-[L2]-[ALBD]；和
[ALBD]-[L1]-[CBP1]-[L2]-[CBP2]
其中，彼此独立地，
[CBP1]和[CBP2]是C5结合多肽，其可以是相同的或不同的；
[L1]和[L2]是连接部分，其可以是相同的或不同的；和
[ALBD]是链球菌蛋白质G的白蛋白结合结构域，或其衍生物。
优选的C5结合化合物具有选自以下的结构：
[CBP1]-[CBP2]-[L1]-[ALBD]；
[CBP1]-[L1]-[ALBD]-[L2]-[CBP2]；且最优选地，
[CBP1]-[L1]-[ALBD]。
可被用于此类C5结合化合物的连接部分的实例选自G、GS；[G2S]n；[G3S]n；[G4S]n；GS[G4S]n，其中n是0-7(优选地，n是0-2)；[S2G]m；[S3G]m；[S4G]m；其中m是0-7，及VDGS。优选的接头是GS和GS[G4S]2。
可被包括在C5结合化合物中的白蛋白结合结构域或其衍生物的实例是如以上所描述的。特别地，白蛋白结合结构域的一个实例列于SEQ ID NO:759。
特别优选的C5结合化合物具有结构[CBP1]-[L1]-[ALBD]，其中[CBP1]是选自SEQID NO:748和SEQ ID NO:753的多肽，[L1]是GS，且[ALBD]是如SEQ ID NO:759所示的多肽。
在一个实施方案中，包括在C5结合多肽中的C5结合多肽独立地选自如前所述的58-mer或60-mer C5结合多肽。特别地，C5结合化合物可包括独立地选自以下的任一个的一个或更多个C5结合多肽：SEQ ID NO:497-508、SEQ ID NO:516、SEQ ID NO:519-520、SEQ IDNO:522-524、SEQ ID NO:528-531、SEQ ID NO:534-535、SEQ ID NO:537、SEQ ID NO:542、SEQ ID NO:545、SEQ ID NO:552-553、SEQ ID NO:555、SEQ ID NO:562、SEQ ID NO:574-575、SEQ ID NO:583、SEQ ID NO:588、SEQ ID NO:602、SEQ ID NO:606、SEQ ID NO:615、SEQID NO:621、SEQ ID NO:637、SEQ ID NO:647、SEQ ID NO:657、SEQ ID NO:662、SEQ ID NO:683、SEQ ID NO:693、SEQ ID NO:699、SEQ ID NO:701、SEQ ID NO:711、SEQ ID NO:739和SEQ ID NO:746-757，诸如选自SEQ ID NO:497-508和SEQ ID NO:746-757的序列。在另一个实施方案中，氨基酸序列选自SEQ ID NO:497、SEQ ID NO:498、SEQ ID NO:499、SEQ ID NO:500、SEQ ID NO:501、SEQ ID NO:746、SEQ ID NO:747、SEQ ID NO:748、SEQ ID NO:750和SEQ ID NO:753，诸如选自SEQ ID NO:497、SEQ ID NO:500、SEQ ID NO:748和SEQ ID NO:753中的任一个。
在另外的方面，提供了编码如以上所述的C5结合多肽或化合物的多核苷酸。包括此类多核苷酸的表达载体可通过例如在宿主细胞中的表达使得C5结合多肽或C5结合化合物的生产成为可能。
应当理解的是，根据本发明的C5结合多肽其自身可作为治疗剂或诊断剂或作为靶向其它治疗剂或诊断剂的手段是有用的，具有对例如补体蛋白质C5的直接或间接的作用。直接的治疗作用可例如通过抑制C5裂解实现。因此，在一个实施方案中，提供了根据本发明的C5结合多肽或C5结合化合物与治疗剂的组合。可证明在此类组合中是有用的治疗剂的非限制性实例为免疫刺激剂和放射性核素。
因此，在一个实施方案中，提供了根据本发明的原样的C5结合多肽或如包括在C5结合化合物或组合中的C5结合多肽，用于在治疗中使用，例如用于治疗C5相关的状况，诸如在哺乳类诸如人受试者中的C5相关的状况。在一个实施方案中，所述C5相关的状况选自炎性疾病，诸如抗原诱导的关节炎、败血症、滑膜炎、血管炎和哮喘；自身免疫性疾病，诸如系统性红斑狼疮(SLE)、冷凝集素病、类风湿关节炎、多发性硬化症(MS)、干燥综合征、皮肌炎、重症肌无力、及其它自身抗体驱动的疾病，诸如如格林-巴利综合征(GBS)、Fisher综合征、系统性硬化症、抗肾小球基底膜(抗-GBM)和抗磷脂综合征(APS)；传染病，诸如溶血尿毒症综合征(HUS)、病毒感染、细菌感染和真菌感染；心血管疾病，诸如(急性)心肌梗塞(通过纤维蛋白溶解或经皮冠状动脉介入(PCI)经受血管重建)；神经退行性紊乱诸如阿尔茨海默氏病(AD)、亨廷顿氏病、Creutzfeld-Jacob病和帕金森氏病；癌症；创伤；移植物损伤，诸如缺血再灌注损伤(IRI)和急性抗体介导的排斥(AMR)；眼部疾病，诸如年龄相关性黄斑变性(AMD)、葡萄膜炎、糖尿病性眼部疾病和紊乱、及早产儿视网膜病变；肾脏疾病，诸如膜性肾小球肾炎、膜性肾炎、免疫球蛋白A肾病(immunoglobulin A nephropathy)、狼疮性肾炎、肺出血性肾炎综合征和链球菌感染后肾小球肾炎；肺部疾病，诸如成人呼吸窘迫综合征、慢性阻塞性肺疾病和囊性纤维化；血液疾病，诸如溶血性贫血、阵发性冷血红蛋白尿、非典型性溶血尿毒综合征(aHUS)和阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)；变应性疾病，诸如过敏性休克、变态反应和哮喘；以及皮肤病，诸如天疱疮、大疱性类天疱疮、光毒性反应和银屑病。在一个更具体的实施方案中，根据本发明的C5结合多肽、化合物或组合被用于治疗阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)。
如当在以上背景部分中讨论器官移植时所提到的，供体和受体(例如，ABO血型和MCH类)之间的差异以及移植的器官的状况可导致功能延迟或甚至移植的器官的排斥。因此，处理可以是必要的，以消除尽管是阳性供体-受体交叉配型的抗-供体抗体，或消除当移植针对ABO血型屏障进行时的ABO血型抗体。此类处理通常包括在移植或血浆除去法之前以及之后通过例如使用亲和层析技术的免疫吸附。但是，此类程序冒着消除存在于循环中的几乎所有抗体因此包括治疗性抗体的风险。然而，本发明的C5结合多肽或化合物不会受到任何抗体去除程序的影响，并因此可在这些处理中被利用。
在其中更为局部的急性病理而不是全身性病理在易于接近的组织诸如肺和血流中占主导地位的一些C5相关的状况中，具有非常短的半衰期的药物相对于具有缓慢消除的药物可以是有利的。因此，在此类C5相关的状况中，不具有半衰期延长部分的C5结合多肽可以是有利的。如先前解释的，根据本发明的C5结合多肽，当施用于哺乳类诸如人时，由于其相对小的大小，将表现出相对快的药代动力学特征。根据本发明的C5结合多肽在C5相关的状况诸如哮喘(Zhang等人Expert Rev Clin Immunol2010,6:269-277)、败血症(Ward等人The Sci World J2010,10:2395-2402)、以及超敏综合征包括C激活相关的假性过敏(CARPA，对特定的治疗性脂质体和基于脂质赋形剂的药物的反应，其在极少数情况下可导致危及生命的心肺痛苦(Szebeni等人Adv Drug Delivery Rev2011,63:1020-1030))的治疗中可潜在地是有活性的。此外，当输血的受体已接受了不相容类型的血液时(一种在美国以约1:14000输血单位发生的情况，其与高死亡率相关，Goodnough等人Lancet2003,361:161-169)，根据本发明的C5结合多肽可被用于补体抑制。
在相关的方面，提供了一种治疗C5相关的状况的方法，包括将以上所述的C5结合多肽、或组合施用至有相应需要的哺乳类受试者。因此，在治疗方法中，受试者以根据本发明的C5结合多肽、C5结合化合物或组合治疗。在所述方法的更具体的实施方案中，C5结合多肽或组合与受试者中细胞表面表达的C5的结合，抑制了C5裂解。在治疗方法的一个实施方案中，C5相关的状况选自炎性疾病；自身免疫性疾病；传染病；心血管疾病；神经退行性紊乱；癌症；创伤；移植物损伤；眼部疾病；肾脏疾病；肺部疾病；血液疾病；变应性疾病和皮肤病。特别地，在关于根据本发明的C5结合多肽、化合物或组合的治疗用途中，C5相关的状况可以是如以上定义的。C5相关的状况可以是例如阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)。在治疗方法的一个实施方案中，所述C5结合多肽被静脉内、皮下、通过吸入、经鼻、口服、玻璃体内、或局部施用。
现在，本发明将通过以下非限制性实施例进一步被阐述。
附图简述
图1是包含在本发明的C5结合多肽中的C5结合基序的实例(SEQ ID NO:1-248)、根据本发明的49-mer C5结合多肽的实例(SEQ ID NO:249-496)、根据本发明的58-mer C5结合多肽的实例(SEQ ID NO:497-744)、和根据本发明的60-mer C5结合多肽的实例(SEQ IDNO:745-757)的氨基酸序列、以及蛋白质Z(SEQ ID NO:758)、白蛋白结合结构域(ABD094,SEQ ID NO:759)、人C5的Swiss-Prot条目P01031(氨基酸残基1-1676，SEQ ID NO:760；其中α-链对应于氨基酸残基678-1676且β-链对应于氨基酸残基19-673)的氨基酸序列，本文使用的His6-加标签的蜱蛋白质OmCI的序列(SEQ ID NO:761)和使用人C5作为模板来源于基因组序列(在www.ebi.ac.uk/ena在线公布；Ebeling等人(2001)Genome Res.21(10):1746-1756)的食蟹猴C5的序列(SEQ ID NO:762)的列表。序列在位置63和1346处包含两个未知的氨基酸“X”。
图2显示了如实施例2中所述的在Biacore仪器上进行的典型的结合分析的结果。通过分别将人C5(hC5；黑色实曲线)、食蟹猴C5(cC5；黑色短虚曲线)、大鼠C5(rC5；黑色长虚曲线)、人MG7结构域(hMG7；灰色点曲线)、和人免疫球蛋白G(hIgG；灰色实曲线)注射于固定的二聚体Z变体(Z05477，SEQ ID NO:509)上，获得传感图。
图3是显示在ELISA中选择的成熟的Z变体分别针对hC5和rC5的响应的柱状图。如实施例4中所述的，黑色柱对应于每个Z变体的使用0.05μg/ml hC5在450nm处获得的吸光度(每组中的左侧柱)，以及使用4μg/ml rC5在450nm处获得的吸光度(每组中的右侧柱)。Z变体Z05363(SEQ ID NO:510)的响应被绘制作为阳性对照。
图4示意性地显示了包含一个或多个选自SEQ ID NO:745-757的任选地与ABD094(SEQ ID NO:759)连接的C5结合Z变体的不同的构建体。
图5显示了如实施例6中所述的通过Instant Blue可视化的纯化的C5结合Z变体(还原条件)的SDS-PAGE分析。A)表示相比不同的Z-ABD融合蛋白(其中，Z等于SEQ ID NO:745(泳道2)、SEQ ID NO:748-757(泳道4-13)，通过GS接头与ABD094(SEQ ID NO:759)融合)，二聚体Z-Z-ABD的一个实例(泳道1，其中Z等于SEQ ID NO:745且ABD等于SEQ ID NO:759)；B)表示在不同构建体中一个C5结合Z变体(SEQ ID NO:753)；及C)表示呈单体形式(泳道6-7)和经由GS(G4S)2接头与ABD094(SEQ ID NO:759)融合(泳道2-5)的两个不同的C5结合Z变体(SEQ ID NO:748，泳道2-3和6及SEQ ID NO:753，泳道4-5和7)。
图6A和6B是显示实施例6中描述的如在溶血测定中所见的不同的C5结合Z变体抑制补体激活的效力的剂量-响应特征的示例性数据的图形。C5缺乏的血清被稀释63倍，并补充0.1nM hC5。A)显示了不同Z-ABD融合蛋白(Z变体对应于SEQ ID NO:745、SEQ ID NO:748-753和SEQ ID NO:756，通过GS接头与ABD094(SEQ ID NO:759)融合)对hC5的作用，而B)显示了相比于C5结合蜱蛋白质OmCI(SEQ ID NO:761)，不同C5结合构建体的作用，所述C5结合构建体包括相同的C5结合Z变体(Z06175a，SEQ ID NO:753)作为单体或二聚体与ABD094(SEQID NO:759)融合、或具有His6-标签(6个组氨酸残基)。
图7A和7B是显示实施例6中所描述的基于位移ECL技术(displacement ECLtechnique)的平衡结合的示例性数据的图形。图7A显示了相比蜱蛋白质OmCI(SEQ ID NO:761)的C5结合，与ABD094(SEQ ID NO:759)融合的不同Z变体(SEQ ID NO:745，SEQ ID NO:748-757)的C5结合。图7B显示了不同的C5结合构建体的结合，所述C5结合构建体包括相同的C5结合Z变体(SEQ ID NO:753)作为单体或二聚体与ABD094(SEQ ID NO:759)融合或具有His6-标签。
图8A和8B显示了如实施例7中描述的研究的Z-ABD变体与人血清白蛋白(HSA)之间的相互作用。A)尺寸排阻色谱法(SEC)，其中Z-ABD(Z06175a(SEQ ID NO:753)通过GS接头与ABD094(SEQ ID NO:759)融合)与等摩尔量的HSA预温育(1)。作为比较，对单独的HSA(2)和单独的Z-ABD(3)的色谱分析也示于图中。B)注射在HSA包被的表面的Z-ABD和Z-ABD-Z(Z06175a(SEQ ID NO:753)通过图4中说明的接头分别以构建体2和构建体5的方式与ABD094(SEQ ID NO:759)融合)的Biacore传感图。两个构建体各自以25nM、100nM和400nM的浓度被注射。
图9是显示如实施例8中所述的，静脉内(i.v.,0.25μmol/kg)和皮下(s.c.,0.5μmol/kg)施用后，雄性Sprague Dawley大鼠中C5结合化合物Z-ABD和Z-ABD-Z(Z06175a(SEQID NO:753)通过图4中说明的接头分别以构建体2和构建体5的方式与ABD094(SEQ ID NO:759)融合)随时间的推移的药代动力学特征的图形。每个数据点代表来自i.v.给药的动物给药后五分钟至两周以及s.c.给药的动物给药后15分钟至两周范围的特定时间点的3个个体动物的平均值。
图10显示了如实施例8中描述的，暴露于1:5稀释的来自动物样品的血清之后，绵羊红细胞的离体溶血，所述动物样品取自静脉内(i.v.；0.25μmol/kg)施用Z-ABD(Z06175a(SEQ ID NO:753)通过GS接头与ABD094(SEQ ID NO:759)融合)后的Sprague Dawley大鼠。每个点表示在给药后五分钟至两周范围的特定时间点的一个个体动物。
图11显示了如实施例8中描述的，暴露于1:5稀释的来自动物样品的血清之后，绵羊红细胞的离体溶血，所述动物样品取自皮下(s.c.；0.5μmol/kg)施用Z-ABD(Z06175a(SEQID NO:753)通过GS接头与ABD094(SEQ ID NO:759)融合)后的Sprague Dawley大鼠。每个点表示在15分钟至两周范围的特定时间点的个体动物。
图12显示了如实施例8中描述的，i.v.和s.c.施用至雄性Sprague Dawley大鼠之后，溶血对Z-ABD(Z06175a(SEQ ID NO:753)通过GS接头与ABD094(SEQ ID NO:759)融合)血清浓度。
图13显示了如实施例8中描述的，i.v.和s.c.施用至雄性Sprague Dawley大鼠之后，绵羊红细胞中的溶血对Z-ABD-Z(Z06175a(SEQ ID NO:753)通过在图4中说明的接头与ABD094(SEQ ID NO:759)融合，构建体5)血清浓度。
图14显示了如实施例9所述的，i.v.(415nmol/kg)和s.c.(1250nmol/kg)施用之后，雄性食蟹猴中Z-ABD(Z06175a(SEQ ID NO:753)通过GS接头与ABD094(SEQ ID NO:759)融合)的血清暴露。每个数据点代表三个个体动物的平均值。
图15是显示如实施例10中描述的，分析的单独的促炎性分子酵母聚糖(40mg/kgi.p.)以及与C5结合Z-ABD融合分子(Z06175a(SEQ ID NO:753)通过GS接头与ABD094(SEQID NO:759)融合)或OmCI(SEQ ID NO:761)组合的作用(灌洗中C5a的浓度)的图形。在以酵母聚糖诱导前18h，s.c.施用20nmol/kg(LD)、100nmol/kg(MD)和500nmol/kg(HD)的Z-ABD。在酵母聚糖处理前1h，i.p.施用OmCI(30nmol/kg)且在酵母聚糖诱导后1h采集样品。
图16A和16B显示了如实施例11中描述的，在气管内施用500nmol/kg至雌性C57bl小鼠中之后，Z-ABD(Z06175a(SEQ ID NO:753)通过GS接头与ABD094(SEQ ID NO:759)融合)的药代动力学特征。A)每只动物中的血清浓度(每个时间点n＝3，共27只动物)，以及B)暴露于1:5稀释的这些血清样品的绵羊红细胞中的溶血。
实施例
除非另有说明，下列材料观察该研究工作被使用。
·大肠杆菌(Escherichia coli)菌株RR1ΔM15(Rüther,Nucleic Acids Res10:5765–5772,1982)。
·大肠杆菌菌株XL1-Blue(Agilent Technologies,目录号200268)。
·人补体蛋白质C5(hC5)。完整的1676个氨基酸的前蛋白质(pro-protein)具有GenBank登录号：NP_001726(SEQ ID NO:760)，其中氨基酸19-673是β链且氨基酸678-1676是α链。本文所用的人C5购自Quidel(目录号A403)。
·食蟹猴补体蛋白质C5(cC5，SEQ ID NO:762)。cC5序列源自食蟹猴(食蟹猴(Macaca fascicularis))基因组序列(www.ebi.ac.uk/ena；Ebeling等人(2001)GenomeRes.21(10):1746-1756)。人C5的编码区从www.ensembl.org检索，且C5基因定位于15号染色体。含有基因的区域为约110000个碱基长，并包含在重叠群(contig)CAEC01154150至CAEC01154178中。将重叠群手动地加入到单个文件，并用作sim软件的基因组环境(genomiccontext)以匹配人C5的编码区至原始食蟹猴基因组材料(genomic material)。使用以下的三步程序从血清中内部(in-house)纯化本文使用的食蟹猴C5：PEG6000沉淀、离子交换和OmCI亲和色谱。
·大鼠补体蛋白质C5(rC5；GenBank登录号：XP_001079130)。使用以下的三步程序从血清中内部纯化本文使用的大鼠C5：PEG6000沉淀、离子交换和OmCI亲和色谱。
·补体蛋白质C5的人MG7(hMG7)结构域，对应于人C5的氨基酸残基822-931(SEQID NO:760；Fredslund等人(2008)Nature Immunology9:753-760)，在Freestyle HEK293细胞中内部产生。
·hMG7结合蛋白质。
·来自软蜱非洲钝缘蜱OmCI的在C-末端具有His6标签的OmCI(SEQ ID NO:761)(AF2999，Nunn,M.A.等人，同上)在大肠杆菌菌株Origami(DE3)中内部产生，并在HisTrap1柱上纯化。
实施例1：补体蛋白质C5结合多肽的选择与筛选
材料和方法
靶蛋白hC5的生物素化：按照制造商的建议，使用10倍(10x)摩尔过量的No-WeighEZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin(Pierce,目录号21327)在室温(RT)下持续40min生物素化hC5。根据制造商的说明，使用Protein Desalting Spin Columns(Pierce,目录号89849)进行随手的缓冲液交换至PBS(10mM磷酸盐、137mM NaCl、2.68mM KCl、pH7.4)。
C5结合多肽的噬菌体展示选择：基本上如等人J Biotechnol2007,128:162-183中所述的构建于噬菌粒pAffi1/pAY00065/pAY02947/pAY02592中的展示在噬菌体上的蛋白质Z的随机变体的文库，被用于选择C5结合多肽。使用三种不同的文库载体。其中的两种利用白蛋白结合结构域(ABD，来自链球菌菌株G148的蛋白质G的GA3)作为Z变体的融合伴侣(fusion partner)，产生文库Zlib003Naive.I和Zlib006Naive.II。第三文库，Zlib004Naive.I利用Taq DNA聚合酶结合分子Z03639(在Gunneriusson等人ProteinEng1999,12:873-878中指定为ZTaqS1-1)作为融合伴侣。文库具有以下实际大小：3×109(Zlib003Naive.I)；1.5×1010(Zlib006Naive.II)；和1.4×1010(Zlib004Naive.I)，数值指变体的数量。
如在前的等人所描述的在摇瓶中(Zlib003Naive.I)或在20l发酵罐中(Zlib006Naive.II和Zlib004Naive.I)制备噬菌体原液(stock)。将来自含有噬菌粒文库Zlib004Naive.I的甘油原液(glycreol stock)的细胞接种于20l补充有2％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的TSB-YE(胰蛋白酶大豆肉汤-酵母提取物(Tryptic Soy Broth-YeastExtract)；30g/l TSB、5g/l酵母提取物)中。将来自含有噬菌粒文库Zlib006Naive.II的甘油原液的细胞接种于20l补充有100μg/ml氨苄青霉素的定义的无脯氨酸培养基[磷酸氢二钾7g/l、柠檬酸三钠二水合物1g/l、尿嘧啶0.02g/l、YNB(DifcoTM不含氨基酸的酵母氮源基础，Becton Dickinson)6.7g/l、葡萄糖一水合物5.5g/l、L-丙氨酸0.3g/l、L-精氨酸单盐酸盐0.24g/l、L-天冬酰胺一水合物0.11g/l、L-半胱氨酸0.1g/l、L-谷氨酸0.3g/l、L-谷氨酰胺0.1g/l、甘氨酸0.2g/l、L-组氨酸0.05g/l、L-异亮氨酸0.1g/l、L-亮氨酸0.1g/l、L-赖氨酸单盐酸盐0.25g/l、L-甲硫氨酸0.1g/l、L-苯丙氨酸0.2g/l、L-丝氨酸0.3g/l、L-苏氨酸0.2g/l、L-色氨酸0.1g/l、L-酪氨酸0.05g/l、L-缬氨酸0.1g/l]中。培养物(cultivation)于37℃在发酵罐(Belach Bioteknik，BR20)中生长。当细胞达到0.7-0.8的光密度(OD)时，使用10x摩尔过量的M13K07辅助噬菌体(New England Biolabs#N0315S)感染约2.6l的培养物。将细胞温育30分钟，届时(whereupon)发酵罐充满至20l的补充有100μM IPTG(异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷，用于诱导表达)、25μg/ml卡那霉素和12.5μg/ml羧苄青霉素的TSB-YE，并在30℃生长22小时。培养物中的细胞通过在15900g的离心沉淀，且其后保留在培养基中的噬菌体颗粒在PEG/NaCl(聚乙二醇/氯化钠)中沉淀两次、过滤、并溶解于PBS和甘油中，如在前的等人所描述的。使用之前，噬菌体原液被保存在-80℃。
在四个循环中针对生物素化的hC5进行选择。噬菌体原液制备、选择程序和选择循环之间噬菌体的扩增，基本上如在WO2009/077175中描述的进行。补充有3％牛血清白蛋白(BSA)和0.1％吐温20的PBS被用作选择缓冲液，且靶-噬菌体复合物通过M-280链霉亲和素(Dynal,目录号112.06)被直接捕获。每10μg补体蛋白质C5使用1mg珠子。大肠杆菌菌株RR1ΔM15被用于噬菌体扩增。在选择的循环1中，使用100nM hC5并进行用PBST0.1％(补充有0.1％吐温-20的PBS)的两次洗涤。在随后的3个循环中，应用了使用降低的靶浓度和增加的洗涤次数的增加严格性。在循环2、3和4中，使用50或33nM hC5、25或11nMhC5和12.5或3.7nM hC5。在循环2、3和4中，使用在所有循环中的PBST0.1％或循环2、3和4中的PBST0.2％、0.3％和0.4％进行4、6和8次洗涤。
Z变体的ELISA筛选：为了测定选择的Z变体分子是否确实能够与人补体蛋白质C5相互作用，进行了ELISA测定。通过将来自选择物(selections)的单菌落接种到深孔平板(Nunc,目录号278752)中的补充有100μg/ml氨苄青霉素和0.1mM IPTG的1ml TSB-YE培养基中制备Z变体。平板在37℃温育18-24h。细胞通过离心沉淀，重悬于300μl PBST0.05％中并于-80℃冷冻，以释放细胞的周质部分。冷冻的样品在水浴中解冻，并通过离心沉淀细胞。周质上清液包含与白蛋白结合结构域(来自链球菌菌株G148的蛋白质G的GA3)融合的Z变体，表示为AQHDEALE-[Z#####]-VDYV-[ABD]-YVPG(等人，同上)，或与Taq DNA聚合酶结合分子Z03639融合的Z变体，表示为AQHDEALE-[Z#####]-VDYV-[Z03639]-YVPG。Z#####是指单独的58个氨基酸残基的Z变体。
半区96孔ELISA平板(Costar,目录号3690)以50μl/孔的含有4μg/ml的Z变体特异性的抗体(Affibody,目录号20.1000.01.0005)的包被缓冲液(50mM碳酸钠，pH9.6)包被并在4℃温育过夜。将抗体溶液倒出，并将孔以100μl的PBSC(PBS补充以0.5％酪蛋白(Sigma,目录号C8654))于RT封闭1-2h。将封闭溶液丢弃，并加入50μl周质溶液至孔中，并于RT在缓慢摇动下温育1h。将上清液倒出，并将孔以PBST0.05％洗涤4次。然后，向每个孔加入50μl的PBSC中5μg/ml浓度的生物素化的补体蛋白质hC5。将平板在RT温育1.5h，随后如上所述的洗涤。链霉亲和素-HRP(辣根过氧化物酶；Dako,目录号P0397)在PBSC中1:10,000稀释，加入孔中，然后将其温育45min。如以上描述的洗涤之后，将50μl ImmunoPure TMB底物(ThermoScientific,目录号34021)加入孔中，并将平板按照制造商的建议处理。使用多孔平板读取器Victor3(Perkin Elmer)，在450nm处测量孔的吸光度。
作为阳性对照，还包含表示为AQHDEALE-[Z03938]-VDYV-[Z03639]-YVPG的PSMA结合分子Z03938的周质部分，针对5μg/ml生物素化的PSMA蛋白质被测定。作为阴性对照；相同的周质制品针对补体蛋白质hC5被测定。针对具有针对hC5的阳性吸光度的克隆进行测序。
测序：使用标准PCR程序和引物AFFI-21(5’-tgcttccggctcgtatgttgtgtg)和AFFI-22(5’-cggaaccagagccaccaccgg)从单菌落扩增PCR片段。使用生物素化的寡核苷酸AFFI-72(5'-生物素-cggaaccagagccaccaccgg)和按照制造商的方案使用的Terminatorv3.1Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)进行扩增片段的测序。测序反应物通过使用Magnatrix8000(Magnetic Biosolution)结合至磁性链霉亲和素包被的珠子(DetachStreptavidin Beads，Nordiag，目录号2012-01)来纯化，并在ABI3100GeneticAnalyzer(PE Applied Biosystems)上分析。
阻断ELISA：将在ELISA筛选中发现对hC5阳性的克隆经受ELISA阻断测定，以阐明它们的靶结合是否受hC5结合蛋白质OmCI和/或hMG7结合蛋白质存在的影响。如以上ELISA筛选部分描述的，但设置5ml培养物于12ml圆底管中并使用2ml PBST0.05％用于沉淀物溶解，使用在周质部分表达的Z变体进行阻断ELISA。ELISA阻断测定如ELISA筛选测定进行，具有在靶步骤引入的修改的方案：在加入测定平板之前OmCI或hMG7结合蛋白质与靶蛋白质混合。5μg/ml生物素化的hC5分别与5倍或20倍摩尔过量的OmCI或hMG7结合蛋白质混合，然后在RT下温育1h以允许在加入平板之前复合物的形成。如下分别获得每个克隆的参考(1)、阴性对照(2)和背景(3)的响应/信号：在靶步骤，仅将hC5加入Z变体(如在筛选ELISA中的)(1)；将不相关的蛋白质PSMA(内部制备)代替OmCI或hMG7结合蛋白质加入补体蛋白hC5(2)；只向Z变体加入缓冲液(3)。
结果
补体蛋白质C5结合多肽的噬菌体展示选择：在针对生物素化的hC5的2-4个循环的噬菌体展示选择之后获得单个克隆。
Z变体的ELISA筛选：4个循环的选择后获得的克隆在96孔板中制备，并在ELISA中筛选补体蛋白质C5的结合活性。总计近400个克隆被筛选。吸光度测量显示许多明确的hC5阳性克隆。来自克隆的选择的结果展示在表1中；Z05363(SEQ ID NO:510)变体以ABD加标签，而其它列出的Z变体以Taq结合分子Z03639加标签，如在方法部分描述的。用作阴性对照的PSMA特异性分子Z03938，给出了针对PSMA的阳性信号，而没有获得针对hC5的信号。
阻断ELISA：hC5阳性的克隆经受使用hC5结合蛋白质OmCI和hMG7结合蛋白质的阻断测定。对于5个克隆，对补体蛋白质C5的结合信号通过OmCI的存在被完全消除，达到与背景相同的水平(表1)。还测试了这些克隆中的一个，即Z05363变体(SEQ ID NO:510)，以确认其在hMG7结合蛋白质的存在下结合hC5的能力。hMG7结合蛋白质不抑制Z05363与hC5的结合。
表1.ELISA中具有或不具有一些Z变体的阻断分子的情况下对靶的响应。
Z变体 SEQ ID NO:# hC5(OD 450nm) OmCI-阻断
Z05363 SEQ ID NO:510 3.143 完全
Z05477 SEQ ID NO:509 2.872 完全
Z05483 SEQ ID NO:511 0.531 完全
Z05538 SEQ ID NO:512 0.099 完全
Z05692 SEQ ID NO:513 0.944 完全
测序：对ELISA筛选中具有针对补体蛋白质C5的阳性吸光度值的克隆进行测序。每个变体被赋予唯一的标识号#####，且个体变体被称为为Z#####。58个氨基酸残基长的Z变体的氨基酸序列在图1和序列表中被列为SEQ ID NO:509-513。这些Z变体的推导的补体蛋白质C5结合基序在图1和序列表中被列为SEQ ID NO:13-17。经预测构成这些Z变体的每一个中的完整的三螺旋束的49个氨基酸残基长的多肽的氨基酸序列在图1和序列表中被列为SEQ ID NO:261-265。
实施例2：Z变体的制备和表征
材料和方法
Z变体的亚克隆，蛋白质表达和纯化：
从pAffi1/pAY00065/pAY02947文库载体中扩增五个补体蛋白质C5结合Z变体(Z05363(SEQ ID NO:510)、Z05477(SEQ ID NO:509)、Z05483(SEQ ID NO:511)、Z05538(SEQID NO:512)和Z05692(SEQ ID NO:513))。使用标准分子生物学技术并如在WO2009/077175中详细描述的，应用用于构建具有N-末端His6标签的二聚体Affibody分子的亚克隆策略。Z基因片段被亚克隆进入表达载体pAY01448，产生编码的序列MGSSHHHHHHLQ-[Z#####][Z#####]-VD。
将亚克隆的Z变体转化进入大肠杆菌BL21(DE3)，并在多发酵罐系统Greta(BelachBioteknik)中表达。简言之，将培养物于37℃生长在800ml含有50μg/ml卡那霉素的TSB-YE-培养基中。在OD600为～1时，培养物通过自动加入IPTG至0.05mM的终浓度被诱导。5h的诱导后，将培养物冷却至约10℃，并通过离心(20min，15,900g)收集。丢弃上清液，并收集细胞沉淀物并储存在-20℃直至进一步使用。通过使用考马斯蓝染色在4-12％NuPAGETM凝胶(Invitrogen)上的SDS-PAGE分析评价表达水平和溶解度的程度。
由于Z变体主要表达为可溶性蛋白质，将细胞沉淀物重悬浮于添加了1000U(Merck,目录号1.01654.001)的结合缓冲液(20mM磷酸钠、0.5M NaCl、20mM咪唑，pH7.4)中，并通过超声波处理破碎。对于每个Z变体，经声处理的悬浮液通过离心(40min，25,000g，4℃)澄清，并将上清液上样至1ml His GraviTrapTM柱(GE Healthcare)。柱在以3ml洗脱缓冲液(20mM磷酸钠、0.5M NaCl、0.5M咪唑，pH7.4)洗脱Z变体前，以洗涤缓冲液(20mM磷酸钠、0.5M NaCl、60mM咪唑，pH7.4)洗涤。主要表达为不溶性蛋白质的Z变体被同样地纯化，但结合和洗涤缓冲液中包括8M尿素。如果需要，通过在1ml ResourceTM柱(GEHealthcare)上，使用含0.1％TFA(三氟乙酸)的水作为流动相并以适当梯度(通常为0-50％的超过20个柱体积)的包括0.1％TFA的乙腈洗脱的反相色谱法(RPC)进一步纯化Z变体。
使用PD-10柱(GE Healthcare)将缓冲液交换为PBS。
蛋白质表征：纯化的Z变体的浓度使用理论消光系数通过在280nm处的吸光度测量被确定。纯度通过使用考马斯蓝染色在4-12％NuPAGETM凝胶(Invitrogen)上的SDS-PAGE分析被评价。为了验证特性并为了确定纯化的Z变体的分子量，在Agilent1100LC/MSD系统(Agilent Technologies)上进行LC/MS-分析。
CD分析：将纯化的Z变体在PBS中稀释至0.5mg/ml。对于每种稀释的Z变体，在20℃的温度下记录250-195nm之间CD谱。此外，进行可变温度测量(VTM)，以确定解链温度(Tm)。在VTM中，当温度以5℃/min的温度斜率从20℃上升至90℃时，在221nm处测量吸光度。Z变体的再折叠能力通过冷却至20℃后在250-195nm处收集另外的CD谱被评价。使用具有1mm的光路长度的细胞在Jasco J-810分光偏振计(Jasco Scandinavia AB)上进行CD测量。
Biacore结合分析：五种亚克隆的His6-加标签的二聚体hC5结合Z变体与hC5、cC5、rC5、hMG7和hIgG(Sigma,目录号G4386)的相互作用在Biacore仪器(GE Healthcare)上被分析。不同流通池(flow cell)中的Z变体被固定在若干CM5芯片表面的羧基化的葡聚糖层(GEHealthcare)上。根据制造商的方案使用胺偶联化学反应进行固定。分析物注射期间，每个芯片上的一个流通池表面被激活并被失活用作空白。在HBS-EP运行缓冲液(GEHealthcare)中稀释至100nM的终浓度的分析物，以10μl/min的流速持续1min被注射。解离2min后，表面以10mM HCl的一次注射再生。结果在BiaEvaluation软件(GE Healthcare)中被分析。从配体表面的曲线中减去空白表面的曲线。
结果
Z变体的亚克隆：五个选择的唯一的克隆(Z05477(SEQ ID NO:509)、Z05363(SEQID NO:510)、Z05483(SEQ ID NO:511)、Z05538(SEQ ID NO:512)和Z05692(SEQ ID NO:513))被选择用于亚克隆至表达载体pAY01448中作为二聚体，且随后通过测序验证。
蛋白质制备：组氨酸-加标签的二聚体Z变体产生可接受的表达水平的可溶性基因产物。如通过SDS-PAGE分析评价的，生产的批次的纯度被评价超过90％。LC/MS分析证实了所有Z变体分子的正确的分子量。
CD分析：不同Z变体的解链温度(TM)通过确定CD信号对温度绘图中转变中点(midpoint of the transition)来计算。一些可逆地折叠的Z变体的结果总结于以下表2中。
表2.一些Z变体的解链温度
Z变体 单体Z变体的SEQ ID NO:# Tm(℃)
His6-(Z05477)2 SEQ ID NO:509 45
His6-(Z05363)2 SEQ ID NO:510 35
His6-(Z05483)2 SEQ ID NO:511 44
His6-(Z05538)2 SEQ ID NO:512 54
His6-(Z05692)2 SEQ ID NO:513 52
Biacore结合分析：在Biacore仪器中，通过注射不同的蛋白质至含有Z变体的表面上，测试了5种亚克隆的二聚体Z变体与不同物种的C5和hC5的亚结构域MG7的结合，以及与IgG背景结合。表面的不同Z变体的配体固定化水平是：Z05363：2080RU、Z05477：2180RU、Z05483：2010RU、Z05538：2570RU和Z05692：3270RU。测试了不同的Z变体与100nM的浓度注射的不同组的蛋白质的结合，参见表3。对于每种蛋白质，测试的Z变体的结果展示在表中作为每一种蛋白质的+/-的结果。作为Biacore结合分析的一个实例，图2显示了从针对hC5、cC5、rC5、hMG7和hIgG测定的固定化的二聚体Z05477获得的传感图。
表3.不同的Z变体针对来自不同物种的C5和相关选择的背景蛋白质的Biacore响应。
实施例3：补体蛋白质C5结合Z变体的成熟的文库的设计与构建
在该实施例中，构建了成熟的文库。文库用于hC5结合多肽的选择。来自成熟的文库的选择物通常被预期导致具有增加的亲和力的结合剂(Orlova等人Cancer Res2006,66(8):4339-48)。在该研究中，通过技术产生随机化的双链接头，其使得使用随后建立的双链DNA的连接和限制性酶切掺入三核苷酸构建区段(building block)的随机化的组成为可能。
材料和方法
文库设计：文库基于实施例1和2中描述的hC5结合Z变体的序列的选择。在新文库中，根据基于在SEQ ID NO:509-513(Z05477、Z05363、Z05483、Z05538、Z05692)中定义的Z变体序列的策略，Z分子支架中13个可变位置偏向于某些氨基酸残基。包含147bp的部分随机化的螺旋1和2的氨基酸序列5’-AA ATA AAT CTC GAG GTA GAT GCC AAA TAC GCC AAAGAA/GAG NNN NNN NNN GCA/GCC NNN NNN GAG/GAA ATC/ATT NNN NNN TTA/CTG CCT AACTTA ACC/ACT NNN NNN CAA/CAG TGG NNN GCC/GCG TTC ATC/ATT NNN AAA/AAG TTA/CTGNNN GAT/GAC GAC CCA AGC CAG AGC TCA TTA TTT A-3’(随机化的密码子被示为NNN)、侧翼为限制性位点XhoI和SacI的双链DNA的文库订购自SloningBioTechnology GmbH(Pucheim,Germany)。在新文库中最终包括12个可变Z位置的氨基酸残基的理论分布列于表4。
表4.文库设计。
文库构建：在12个循环的PCR过程中使用AmpliTaq Gold聚合酶(AppliedBiosystems,目录号4311816)扩增文库，且汇集的产物根据供应商的建议使用QIAquickPCR纯化试剂盒(QIAGEN,目录号28106)纯化。随机化的文库片段的纯化的集合体以限制性酶XhoI和SacI(New England Biolabs,目录号R01460L和目录号R0156L)消化，并以PCR纯化试剂盒再次纯化。随后，使用制备凝胶电泳在1％琼脂糖凝胶上纯化产物。
噬菌粒载体pAY02592(基本上如在前的等人中描述的pAffi1)以相同的酶限制性酶切，使用苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀纯化。将以5:1的摩尔比的限制性酶切的片段和限制性酶切的载体用T4DNA连接酶(New England Biolabs,目录号M0202S)在室温下连接2小时，随后在4℃下温育过夜。连接的DNA通过苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀回收，随后溶解在10mM Tris-HCl，pH8.5中。
将连接反应产物(约250ng DNA/转化)电穿孔进入电感受态大肠杆菌RR1ΔM15细胞(100μl)。电穿孔后随即加入约1ml SOC培养基(TSB-YE培养基，1％葡萄糖、50μM MgCl2、50μM MgSO4、50μM NaCl和12.5μM KCl)。转化的细胞在37℃下温育50min。采集样品用于滴度测定以及用于确定转化子的数目。随后，汇集细胞并于37℃在补充以2％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的7l的TSB-YE培养基中培养过夜。细胞以4,000g持续15min沉淀，重悬浮于PBS/甘油溶液(约40％甘油)中。将细胞等分并储存在-80℃。来自Z变体文库的克隆被测序，以验证内含物并评价对应文库设计的构建的文库的结果。如实施例1中所述的进行测序，并验证了氨基酸分布。
噬菌体原液的制备：将来自含有C5噬菌粒文库的甘油原液的细胞接种于20l的补充有100μg/ml氨苄青霉素的定义的无脯氨酸培养基中(实施例1中描述的)，并于37℃在发酵罐(Belach Bioteknik,BR20)中生长。所有步骤都如实施例1中描述的用于文库Zlib006Naive.II的进行。培养后，如实施例1中描述的，细胞通过以15,900g离心沉淀，且保留在培养基中的噬菌体颗粒随后在PEG/NaCl中沉淀两次，过滤并溶解在PBS和甘油中。将噬菌体原液储存在-80℃直到在选择中使用。
结果
文库构建：新文库基于具有经验证的结合特性的一组OmCI阻断的C5结合Z变体(实施例1和2)而设计。设计的文库的理论大小为6.7×109个Z变体。通过转化至大肠杆菌RR1ΔM15细胞之后的滴度测定确定的文库的实际大小为1.4×109个转化子。
文库质量通过对64个转化子测序并通过比较其实际序列与理论设计来测试。与设计的文库相比，实际文库的容量显示是令人满意的。设计的氨基酸序列中的锁定的位置(位置27处的W)被反映在实际的序列中仅预期的氨基酸存在于该位置处。因此，成功地构建了hC5结合多肽的成熟的文库。
实施例4：Z变体从成熟的文库的选择、筛选和表征
材料和方法
补体蛋白质C5结合多肽的噬菌体展示选择：如实施例1中描述的生物素化靶蛋白质hC5。基本上如实施例1中描述的，使用实施例3中描述的Z变体分子的新文库针对hC5进行噬菌体展示选择。大肠杆菌XL1-Blue用于噬菌体扩增。最初在两条平行的过程(twoparallel tracks)中进行选择。在一个过程中，选择的时间为2h，而在另一个过程中，使用较短的选择时间：第一循环中为20min，且随后的循环2-4中为10min。这两个过程(1和2)在第二个循环中被进一步划分，产生总计六个过程(1a-c和2a-c，靶浓度和洗涤条件方面不同)。在总计四个循环中进行选择。在选择的循环1中，使用25nM补体蛋白质C5以及进行以PBST0.1％的5次洗涤。在随后的3个循环中，应用了使用降低的靶浓度和增加的洗涤次数的增加的严格性。在循环2、3和4中，使用10nM、5nM或2.5nM的补体蛋白质C5，4nM、1nM或0.25nM补体蛋白质C5以及1.6nM、0.2nM或0.05nM补体蛋白质C5。在循环2、3和4中，使用PBST0.1％进行10、15和20次洗涤。此外，使用洗涤溶液中50x过量的非生物素化的hC5，将两个过程(1c和2c)的倒数第二次洗涤时间延长至3h。
潜在的结合剂的测序：挑取来自不同的选择过程的单个克隆用于测序。对在ELISA筛选中运行的所有克隆进行测序。如实施例1中描述的进行基因片段的扩增和基因片段的序列分析。
Z变体的ELISA筛选：从补体蛋白质C5成熟的文库的选择的克隆中随机挑取含有Z变体的单个菌落，且如实施例1中描述的在1ml培养基(cultivation)中生长。通过8次重复的冷冻-解冻循环释放周质蛋白质。除了以下之外，基本上如实施例1中描述的进行ELISA筛选。半区96孔ELISA平板以2μg/ml在包被缓冲液中稀释的ABD特异性山羊抗体(内部制备)包被。使用0.15μg/ml浓度的生物素化的hC5，且温育进行1.5-2h。链霉亲和素缀合的HRP获自Thermo Scientific(目录号N100)。使用来源于初级选择(实施例1)的Z变体Z05363(SEQ IDNO:510)作为阳性对照并省略hC5作为阴性对照。
经选择的成熟的Z变体以较低的浓度经受针对hC5的第二次筛选，并与rC5比较。基本上如以上描述的进行测定。分别使用0.05μg/ml和4μg/ml浓度的hC5和rC5。在该实验中也使用了Z变体Z05363(SEQ ID NO:510)作为阳性对照。作为阴性对照，与PDGF-Rβ结合的Z变体(Z01977；在WO2009/077175中描述)针对生物素化的hC5或rC5被测定。
在选择的Z变体的深度序列分析中以及13个随机化位置中的氨基酸与测量的解链温度的相关性和在溶血测定中人C5和小鼠C5的IC50值(实施例6中所述)表明，在558个测序的克隆中未鉴定到有利的Z变体。基于Z变体Z05998(SEQ ID NO:499)，使用用于定点突变的常规技术将单个氨基酸，位置10处的Ile，取代为Leu。新的变体被称为Z08044(SEQ ID NO:498)。该Z变体的推导的补体蛋白质C5结合基序在图1和序列表中被列为SEQ ID NO:2。经预测构成这些Z变体内的完整的三螺旋束的49个氨基酸残基长的多肽的氨基酸序列在图1和序列表中被列为SEQ ID NO:250。
结果
补体蛋白质C5结合多肽的噬菌体展示选择：在各自含有四个循环的总计六个平行的过程中进行选择。不同的选择过程在靶浓度和洗涤条件方面不同，如下：1a)2h选择时间、高浓度、标准洗涤，1b)2h选择时间、低浓度、标准洗涤，1c)2h选择时间、中浓度、长洗涤，2a)10min选择时间、高浓度、标准洗涤，2b)10min选择时间、低浓度、标准洗涤，及2c)10min选择时间、中浓度、长洗涤。对于每个选择循环，降低靶浓度且洗涤条件更为严格。所有的过程在每一轮中都给出了洗脱液中足够量的噬菌体颗粒。大多数噬菌体颗粒在过程1a和2a中被发现，代表了最高的靶浓度和最温和的洗涤条件。
测序：对随机地挑取的克隆(558)进行测序。如实施例1中描述的，每个个体Z变体被赋予一个标识号，Z#####。鉴定了总计242个新的独特的Z变体分子。58个氨基酸残基长的Z变体的氨基酸序列在图1以及在序列表中被列为SEQ ID NO:497、SEQ ID NO:499-508和SEQ ID NO:514-744。这些Z变体的推导的补体蛋白质C5结合基序在图1以及在序列表中被列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3-12和SEQ ID NO:18-248。经预测构成这些Z变体的每一个中的完整的三螺旋束的49个氨基酸残基长的多肽的氨基酸序列在图1以及在序列表中被列为SEQ ID NO:249、SEQ ID NO:251-260和SEQ ID NO:266-496。在测序的克隆中，63个序列出现了两次或更多次。
Z变体的ELISA筛选：4个选择循环后获得的克隆在96孔平板中制备，并使用ELISA筛选hC5结合活性。分析了所有随机地挑取的克隆。相比从初级选择(实施例1)中获得的阳性对照克隆Z05363(SEQ ID NO:510；平均吸光度信号为0.3AU)，242个独特的Z变体中的229个被发现在0.15μg/ml的浓度时给出了针对hC5的较高的响应(0.3-3.1AU)。来自所有选择过程的克隆都显示阳性信号。阴性对照具有约0.1AU的吸光度。
基于其在针对hC5的ELISA筛选中的表现和出现频率选择Z变体。针对较低浓度的hC5(0.05μg/ml)以及rC5(4μg/ml)测定43个独特的Z变体。获得40个测试的Z变体的针对rC5的阳性结果，定义为2x阴性对照的信号(0.4AU)。所有测试的Z变体针对较低浓度的hC5以及针对rC5的结果示于图3。
实施例5：补体蛋白质C5结合Z变体的亚组的亚克隆、制备和表征
材料和方法
将Z变体分子亚克隆进入表达载体：基于序列分析及在针对人和大鼠补体蛋白质C5的ELISA中的表现，45个克隆被选择用于亚克隆进入表达载体pAY01448。如实施例2中描述的，从噬菌粒载体pAY02592扩增单体Z变体片段并进行了将单体Z变体片段亚克隆进入pAY01448，产生编码蛋白质序列MGSSHHHHHHLQ-[Z#####]-VD的载体。
蛋白质的表达和纯化：呈His6-(Z#####)格式的45个Z变体，如实施例2中描述的在自动化的多发酵罐系统中表达，或类似地，在振动器烧瓶中小规模设置的100ml培养物中表达，以0.4mM的终浓度的IPTG手动诱导。基本上如实施例2中描述的使用1ml HisGraviTrapTM柱进行纯化，或以更小的规模，使用0.1ml His SpinTrap(GE Healthcare,目录号28-4013-53)进行纯化。根据制造商的说明，使用PD-10柱或PD SpinTrap G-25(GE Healthcare,目录号28-9180-04)将缓冲液交换为PBS。如实施例2中描述的，纯化的Z变体的浓度通过在280nm处吸光度的测量来确定，且纯度和特性通过SDS-PAGE和LC/MS进行评价。将样品等分并储存在-80℃，直到进一步使用。
CD分析：如实施例2中描述的进行用于确定解链温度和折叠可逆性的CD分析。
结果
蛋白表达和纯化：所有45个亚克隆的Z变体都可被表达，且所有纯化的变体的体外溶解性良好。通过LC/MS评价的所有的变体的纯度超过90％。正确的分子量通过LC-MS被验证。
CD分析：在20℃下进行的CD谱测量证实了在该温度下Z变体的α-螺旋结构。可变温度测量(加热到90℃，随后冷却至20℃)后获得的谱在可变温度测量前获得的谱上的叠加，显示加热到90℃后，所有Z变体完全或几乎完全地折叠回其α-螺旋结构(结果未示出)。一组Z变体的解链温度从可变温度测量被确定，并示于表5中。
表5.具有直接融合于SEQ ID NO:497和SEQ ID NO:499-508的氨基末端的组氨酸标签的成熟的Z变体的解链温度。
Z变体 Z变体的SEQ ID NO:# Tm(℃)
His6-Z06175 SEQ ID NO:497 44
His6-Z05998 SEQ ID NO:499 45
His6-Z06009 SEQ ID NO:500 45
His6-Z06079 SEQ ID NO:501 46
His6-Z06126 SEQ ID NO:502 44
His6-Z06140 SEQ ID NO:503 42
His6-Z06189 SEQ ID NO:504 47
His6-Z06214 SEQ ID NO:505 44
His6-Z06215 SEQ ID NO:506 41
His6-Z06226 SEQ ID NO:507 44
His6-Z06018 SEQ ID NO:508 46
实施例6：C5结合Z变体的体外表征
材料和方法
克隆和蛋白质制备：编码C5结合Z变体(SEQ ID NO:745-757)的亚组的DNA是大肠杆菌密码子优化的并通过GeneArt、GmbH合成。代表C5结合Z变体的合成基因被亚克隆至大肠杆菌并在大肠杆菌中表达。编码任选与白蛋白结合结构域(ABD094，SEQ ID NO:759)连接的Z变体的单体或二聚体的构建体的表达载体，在图4中示意性地示出。
细胞内表达的Z变体使用常规的色谱法来纯化。通过声处理、随后为离心和过滤进行匀质化和澄清。使用阴离子交换色谱法作为捕获步骤。通过疏水相互作用色谱法获得进一步的纯化。纯化在酸性条件下(pH5.5)执行。通过尺寸排阻色谱法进行精制和缓冲液交换。浓缩至终蛋白质含量之前，通过多粘菌素B亲和色谱法降低内毒素水平。制备的蛋白质经MALDI-TOF MS并在SDS-PAGE上分析。
此外，使用重组表达的OmCI蛋白质(SEQ ID NO:761)作为体外研究中的参考分子。
溶血的抑制：对于经典补体途径功能和其通过C5结合多肽的抑制的研究，从Alsever’s溶液中的新鲜的绵羊全血(瑞典国家兽医研究所，Swedish NationalVeterinary Institute)中制备绵羊红细胞，且然后以兔抗绵羊红细胞抗血清(Sigma)处理以成为抗体致敏的绵羊红细胞(EA)。整个程序在无菌条件下进行。所有其它试剂均来自商业来源。
通过连续添加测试蛋白质、补体血清和EA悬浮液，在96孔U-型微滴定平板中运行体外测定。在每孔50μl总反应体积中并在pH7.3-7.4条件下，所有试剂的终浓度是：0.15mMCaCl2、0.5mM MgCl2、3mM NaN3、138mM NaCl、0.1％明胶、1.8mM巴比妥钠、3.1mM巴比妥酸、5百万EA、合适稀释的补体蛋白质C5血清、以及所需浓度的C5结合Z变体。测定中使用不同物种的补体血清以确定Z变体的跨物种效力。对于小鼠血清，C5耗竭的人血清(来自Quidel目录号A501的C5D)以等量补充。
在开始通过加入EA悬浮液的反应之前，Z变体与以上描述的补体血清在冰上预温育20min。允许溶血反应在37℃持续45min的搅拌期间进行，且然后任选地通过加入100μl冰冷却的含有0.02％吐温20的盐水终止。将细胞离心至底部，且将对应于100μl上清液的上部转移到具有半区和平底孔的透明微型平板中。反应结果使用微量滴定平板读取器在415nm的波长下作为光密度被分析。
在所有测试情况下，对照、媒介物和OmCI(SEQ ID NO:761)被包括在每个平板中以分别确定未抑制的和完全抑制的反应的值。这些值被用于计算任何给定样品浓度的补体溶血的％抑制。测试的Z变体的抑制效力(IC50值)通过在受控制浓度的添加至C5耗竭的血清的人C5的存在下应用相同的测定被确定。对于高度有效的抑制剂(低纳摩尔级至亚纳摩尔级)，将反应混合物的最终C5浓度控制在0.1nM，这任选地通过使用C5耗竭的或缺乏的血清确立。
C5结合Z变体与固定化的hC5的体外动力学和亲和力：使用Biacore T200仪器(GEHealthcare)分析了一些C5结合Z变体(SEQ ID NO:748-757)与hC5的结合亲和力。根据制造商的方案，使用胺偶联化学反应将人C5(A403，Quidel Corporation)偶联至CM5传感器芯片(900RU)。通过注射在10mM醋酸钠缓冲液pH5(GE Healthcare)中浓度为7.5μg/ml的hC5进行偶联。参考细胞以同样的试剂处理，但没有注射人C5。
所有实验都在10mM HEPES pH7.4、150mM NaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P20(HBS-EP缓冲液，GE Healthcare)中进行。对于动力学分析，流速为30μl/min，并在25℃下收集数据。减去来自参考细胞的数据，以补偿本体折射率变化。在大多数情况下，HBS-EP的注射还被包括作为对照，使得传感图具有双空白。在HBS-EP缓冲液中再生表面。
以单循环动力学的方法研究了Z变体与固定化的hC5的结合，其中5个浓度的样品在相同的循环中逐一被注射，注射之间没有再生。使用Biacore T200评价软件1.0版的Langmuir1:1模型或二价分析物模型从传感图计算动力学常数。
C5结合Z-ABD分子与固定化的hC5的体外动力学和亲和力：使用Biacore T200仪器(GE Healthcare)评价Z-ABD分子(SEQ ID NO:748-757通过GS接头与ABD094(SEQ ID NO:759)融合)与固定化的hC5的结合。
其中如图4中说明的(构建体2、7、5和4)，Z06175a(SEQ ID NO:753)作为单体或二聚体已通过不同的接头在N-末端或C-末端与ABD094(SEQ ID NO:759)融合的Z-ABD构建体，也按照如以上描述的单循环动力学的方法，与重组人白蛋白(Cell Prime rAlbumin AF-G,9301,Novozymes))预温育、稀释、并然后注射到固定化的人C5上。作为比较，在不存在HSA的情况下注射相同的构建体。两种构建体，Z06175a-GS(图4，构建1)和Z06175a-GSGGGGSGGGGS-ABD094(图4，构建体3)只在不存在HSA的情况下被测试。
C5结合Z变体与C5包被的ECL平板的稳定状态的结合：包括Z变体(SEQ ID NO:745、SEQ ID NO:748-757，任选以如在图4中说明的构建体中与ABD094(SEQ ID NO:759)融合)的一些C5结合构建体与人C5的亲和力通过钌标记的C5结合Z-ABD变体(SEQ ID NO:748通过GS-接头与SEQ ID NO:759融合)的置换被测量。
待被用作示踪剂的Z-ABD变体(SEQ ID NO:748通过GS-接头与SEQ ID NO:759融合)，以摩尔比1:12至1:20(蛋白质：SULFO-TAG NHS-酯，Meso Scale Discovery,目录号R91AN-1)被标记。标记反应在冰上进行两小时。使用ZebaTM离心式脱盐柱(ThermoScientific,目录号89889)除去未结合的SULFO-TAG，并通过使用Bradford试剂(Bradford,M.M.,Anal.Biochem.72:248–254,1976)测量最终蛋白质浓度。SULFO-TAG标记的Z-ABD变体的亲和力(解离常数，KD)通过递增浓度的标记的Z-ABD变体与C5包被的电化学发光孔(ECL,Meso Scale Discovery)的饱和结合分析被确定。标记的Z-ABD变体通过LC/MS进一步被分析，以确定SULFO-TAG分子在Z-ABD变体上的分布。
通过以50fmol/孔的hC5包被ECL、多阵列96孔高结合、非包被的(Meso ScaleDiscovery,目录号L15XB)平板在4℃过夜进行置换。随后，非特异性位点以具有1％酪蛋白的PBS于RT封闭两小时。任选与ABD094(SEQ ID NO:759)融合的不同的Z变体(见图4)以不同的浓度与具有1％酪蛋白的PBS中的约100pM的SULFO-TAG标记的C5结合Z-ABD变体一起温育。温育于RT持续3小时，同时以300rpm摇动平板。最后，以150μl冰冷却的PBS-吐温20洗涤3次终止温育。最后一次洗涤后立即加入150μl2x读取缓冲液(reading buffer)(在超纯H2O中1:1稀释的4x读取缓冲液T，Meso Scale Discovery目录号R92TC-3)至每个孔中，并使用平板读取器(SECTOR Imager2400,Meso Scale Discovery)检测信号。天然存在的C5结合蛋白质OmCI(Nunn等人，同上,SEQ ID NO:761)被包括在置换测定中作为阳性对照。使用Excel插件XLfit5和GraphPad Prism4通过非线性回归分析确定竞争性C5结合构建体和对照与C5的结合亲和力。
Z-ABD与C5结合相对C3、C4和IgG的选择性：使用Biacore2000仪器(GEHealthcare)通过表面等离子共振(SPR)处理了一种Z-ABD变体(SEQ ID NO:748通过GS-接头与SEQ ID NO:759融合)与来自人的密切相关的补体蛋白质C3和C4的结合以及与人IgG的结合(由于Z-结构域的来源葡萄球菌蛋白质A，是IgG结合蛋白质)。使用胺偶联(70RU)将Z-ABD构建体固定在CM5芯片(GE-Healthcare)上。将40nM和400nM的在HBS-P缓冲液(GEHealthcare)中稀释的人C3(A401，Quidel)、C4(A402，Quidel)和IgG(I2511，Sigma)的每一种注射至表面。每次注射之后为持续30s注射的20mM NaOH的再生循环。平行运行相同浓度的人C5，作为阳性对照。
结果
克隆和蛋白质制备：通过MALDI-TOF MS以及在SDS-PAGE上分析了制备的如图4中示意性描述的蛋白质变体，其中“Z”可由SEQ ID NO:745和SEQ ID NO:748-757表示(图5)。
溶血的抑制：测定了一个亚组的C5结合Z变体的体外C5结合活性和绵羊红细胞中溶血的抑制。计算了导致50％溶血抑制(IC50)或50％的与人C5结合的示踪剂的抑制的Z变体的浓度。如方法部分中描述的显示为SEQ ID NO:745和SEQ ID NO:748-757的抑制溶血的Z变体的代表性浓度-响应曲线示于图6A和6B。经由短的GS-接头与ABD094(SEQ ID NO:759)融合的不同Z变体的结果示于图6A。
与ABD094(SEQ ID NO:759)融合的通过短的GS接头分隔的亲本Z变体Z05477a(SEQID NO:745)表现出约100nM的IC50值，而测试的第二代C5结合Z-ABD变体通常以约1nM或低于1nM的IC50值抑制溶血。这表明在成熟选择和随后的筛选中鉴定的C5结合Z变体的效力超过100倍的增加。
在图6B中，显示了以下的多种组合的C5结合：单独的一种代表性的Z变体(Z06175a；SEQ ID NO:753)、作为二聚体以及经由图中说明的不同接头与ABD094(SEQ IDNO:759)在N-末端或C-末端融合。如使用以上描述的测定测量的，结合C5的组合表现出与人血清的从86pM至12nM范围的IC50值。蜱蛋白质OmCI的相应值通常为300pM至500pM。
体外动力学：使用Biacore T200仪器，进行了一些任选与ABD094(SEQ ID NO:759)融合的Z变体(SEQ ID NO:748-757)与固定的hC5，以及在人白蛋白存在下与C5的结合特征的动力学研究。
关于经由GS接头与ABD094融合的十种不同的Z变体的数据示于表6。
表6.不同的Z-ABD融合体(fusion)的人C5结合特征
使用Biacore T200还分析了相同的Z变体(SEQ ID NO:753)但在不同的构建体中，即具有/不具有ABD和不同的接头的结合。此外，通过在人白蛋白的不存在和存在下运行相同的分析还评价了白蛋白对一些Z-ABD融合体的影响。这些数据列于以下表7中。
表7.包括在不同构建体中的Z-ABD融合变体Z06175a(SEQ ID NO:753，缩写为Z)的人C5结合特征。
当比较白蛋白存在和不存下的hC5(SEQ ID NO:760)的构建体的亲和力时，可以看到令人惊讶的小的影响。这表明，白蛋白与构建体的ABD部分的同时结合不干扰C5的相互作用。
C5结合Z变体与C5包被的ECL平板的稳定状态的结合：在竞争测定中评价了C5结合构建体与hC5的稳定状态的结合，所述C5结合构建体包括如在图4中说明的构建体中的，任选与ABD094(SEQ ID NO:759)融合的不同的Z变体(SEQ ID NO:745和748-757)。通过与SULFO-TAG标记的与ABD(SEQ ID NO:759)融合的C5结合Z变体(SEQ ID NO:748)竞争结合ECL平板上包被的C5，评价了C5构建体的稳定状态的结合。作为比较，蜱蛋白质OmCI(SEQ IDNO:761)也包括在内。标记的包含SEQ ID NO:748的Z-ABD变体具有对hC5的0.9nM的亲和力(Kd)。该标记的Z-ABD变体还被发现以浓度依赖的方式与Z变体的恒定区特异性的抗体结合，具有0.34nM的Kd。
通过GS接头与ABD094(SEQ ID NO:759)的羧基末端融合的C5结合Z-变体(SEQ IDNO:748-757)，被发现以约300pM至1nM范围的IC50值置换200pM SULFO-TAG标记的Z-ABD变体(图7A)，然而含有亲本Z变体Z05477a(SEQ ID NO:745)的对应的构建体显示出约30nM的亲和力IC50值。相比之下，天然存在的C5结合蛋白质OmCI被发现以1.5nM的IC50结合hC5(图7A)。因此，所有被测试的第二代Z变体(SEQ ID NO:748-757)相比亲本Z变体Z05477a(SEQID NO:745)表现出对人C5的更高的结合亲和力。此外，使用相同的方法，与人C5的结合亲和力高于OmCI与人C5的结合亲和力。
含有相同的C5结合结构域作为单体、二聚体，具有或不具有ABD以及在不同结构域之间的一些不同的接头的一些不同的构建体也被测试(图7B)。Z06175a(SEQ ID NO:753，任选与His6-标签或C-末端ABD融合)的单体变体和具有C-末端ABD接头的二聚体变体被发现以约500pM至1.7nM范围的IC50值置换200pM SULFO-TAG标记的Z-ABD变体，而不具有ABD的二聚体变体和具有N-末端ABD的单体变体分别以4nM和17nM的IC50值置换200PM SULFO-TAG标记的Z-ABD。
选择性：使用SPR分析处理了选择性，且具有固定化的Z-ABD变体(SEQ ID NO:748通过GS-接头与SEQ ID NO:759融合)的表面，当经受40nM和400nM的C5旁系同源的人C3和C4以及人IgG时没有显示显著的SPR信号。作为比较，400nM的人C5引起约450RU的SPR响应，表明相对于C3、C4和IgG，测试的Z-ABD变体确实是C5选择性的。
实施例7：Z-ABD变体与HSA、BSA和来自大鼠和小鼠的血清白蛋白的相互作用研究。
材料和方法
两种不同的方法，尺寸排阻色谱法和Biacore，被用于在与C5结合Z变体融合的白蛋白结合结构域ABD094之间研究该相互作用。
使用尺寸排阻色谱法(SEC)研究Z06175a-GS-ABD094(SEQ ID NO:753通过GS接头与SEQ ID NO:759融合)和HSA之间的相互作用。简言之，将等摩尔量的Z06175a-GS-ABD094和重组HSA(Novozymes)于室温在PBS中预温育60分钟，并随后使用SMART系统(GEHealthcare)在Superdex200柱(GE Healthcare)上运行。还分别运行了Z06175a-GS-ABD094与HSA作为对照。
使用Biacore2000仪器(GE Healthcare)研究了与固定化的白蛋白的结合。如制造商描述的，使用胺偶联化学反应将重组人白蛋白(，Novozymes)偶联至CM5传感器芯片(385RU)。通过注射在10mM醋酸钠缓冲液pH4.5(GE Healthcare)中的人白蛋白进行偶联。参考细胞以同样的试剂处理，但没有注射人白蛋白。HBS-EP的注射也被包括作为对照，使得传感图具有双空白。在HBS-EP缓冲液中进行实验，将10mM甘氨酸-HCl pH2(GEHealthcare)用于再生，流速为30μl/min，且在25℃收集数据。在三种不同浓度：25nM、100nM和400nM下测试了两种不同的构建体，Z-ABD(Z06175a-GS-ABD094)和Z-ABD-Z(Z06175a-GS-ABD094-GSGGGGSGGGGS-Z06175a)。BIA评价版本4.1.1被用于传感图数据的评价。以类似的方式，还研究了Z-ABD(Z06175a-GS-ABD094)与固定有来自大鼠(A4538，Sigma)、小鼠(A3559，Sigma)、和牛(caw)(BSA，Sigma)的血清白蛋白的表面的结合。
结果
在SEC柱上，较大的分子比小的分子洗脱较快。如图8A中所示的，相比当单独注射HSA时，共注射的HSA+Z06175a-GS-ABD094洗脱较快，表明在这些条件下两种分子表现为稳定的复合物。较小的Z06175a-GS-ABD094比复合物或单独的HSA洗脱较慢，显示相比复合物单独的这些蛋白质更小。
分析的Z-ABD和Z-ABD-Z变体的Biacore2000数据显示，当ABD任一侧的侧翼为Z-结构域时，Z-ABD具有更快的结合速率(on-rate)(图8B)。与Z结构域融合的ABD的结合亲和力的分析指向低于1nM的对Z-ABD的亲和力，而Z-ABD-Z变体以超过1nM的KD与固定化的HSA结合。
Z06175a-GS-ABD094以非常高的亲和力(KD<100pM)与大鼠血清白蛋白结合，而与固定化的小鼠血清白蛋白的相互作用比与人和大鼠血清白蛋白两者的相互作用都弱(KD约4nM)。与牛血清白蛋白的相互作用是不可测量的。
这些数据与关于ABD的早期变体的公布的数据(Jonsson等人ProteinEngineering,Design&Selection2008,21:515-527)吻合良好，并显示了测试的Z-ABD变体以临床相关的浓度与人中以及小鼠和大鼠中的血清白蛋白牢固地结合，允许动物和人之间的药代动力学数据的比较。
实施例8：大鼠中C5结合Z变体的药代动力学研究
材料和方法
啮齿类活体(in-life)阶段：在雄性Sprague Dawley(SD)大鼠(体重250-300g)中研究了两种C5结合构建体Z-ABD(Z06175a-GS-ABD094；SEQ ID NO:753通过GS接头与SEQ IDNO:759融合，图4，构建体2)和Z-ABD-Z(Z06175a-GS-ABD094-GSGGGGSGGGGS-Z06175a；(SEQID NO:753通过GS接头与SEQ ID NO:759融合，随后为GS(G4S)2接头和第二SEQ ID NO:753基序，图4，构建体5))的药代动力学。每只大鼠给予单剂量施用，i.v.(250nmol/kg)或s.c.(500nmol/kg)的Z-ABD或A-ABD-Z(n＝3每剂量组)。对于i.v.组，在施用之后5min、20min和45min，以及1.5h、4h、7h、24h、48h、72h、120h、168h、240h、和336h抽取血样样品(200μL)，且对于s.c.组，在施用之后15min和30min、1h、2h、4h、7h、24h、48h、72h、120h、168h、240h、和336h抽取血样样品(200μL)。将血液收集在管中，并在冰箱中放置20min以允许凝结。随后，以4000rpm离心10分钟后收集血清。血清样品保存在-70℃直到分析。
使用LC/LC/MS/MS确定来自动物的血清样品中C5结合Z变体的浓度：如上所述，施用的C5结合构建体Z-ABD和Z-ABD-Z的血清浓度，通过质谱(LC/LC/MS/MS)确定。
将血清或血浆样品(25μl)在500μl Eppendorf管中以150μl的悬浮于1M甲酸铵缓冲液pH3.0中的胃蛋白酶琼脂糖(7mg/ml，Sigma,目录号P0609)稀释。将试管加盖并于37℃在Eppendorf恒温混匀仪中摇动20min。摇动后，加入在0.1％三氟乙酸(TFA)中稀释至0.5μM的25μl内部标准品溶液I(13C6；15N)NKLDDDPSQSSEL(SEQ ID NO:746-757的氨基酸31-44)(Thermo Fisher Scientific GmbH)。加入内部标准品之后，将样品混合，并通过0.45μm纤维素离心过滤器(Grace)过滤。
通过称量20μl具有已知蛋白质浓度(5-10mg/ml)的蛋白质原液溶液，然后以来自待被分析的物种的空白血浆稀释，制备用于校准的标准样品。第一原液血浆标准品(3μM)被进一步稀释低于0.1μM。
将40μl的样品注射进入偶联的柱系统，随后为具有多重反应监测(MRM)的串联质谱。第一柱是以5μm颗粒填充的Ascentis RP-Amide柱(2.1×150mm，Supelco)。富集柱：以7μm C18颗粒填充的Brownlee newgard柱(3.2×15mm)，被用于捕获来自第一柱中分析物肽级分。来自第一柱的流出液以由Shimadzu泵抽送入旋转混合器(Lee Scientific)的1ml/min的水稀释。最后一个柱是以5μm颗粒Primesep100(SIELC Inc)填充的混合模式反相和阳离子交换柱(2.1×100mm)。
用于第一液相色谱(Acquity UPLC)上提供的第一柱(RP-Amide)的流动相为A：2％乙腈、0.1％乙酸、0.1％TFA、和97.8％的水，以及B：具有0.1％乙酸和0.02％的TFA的乙腈。流量为0.5ml/min，且将线性梯度用于洗脱。在等梯度(isocratic)条件下以100％A持续1min洗脱样品、随后在7.9min时以80％A洗脱样品。在8.1min时，将柱用100％B洗涤一分钟，随后用100％A重调(recondition)。将来自柱的流出液连接到由质谱仪软件控制的Valco六通阀。
将捕获柱(3.2×15mm)以反冲洗模式连接至六通阀。用于第二液相色谱(Agilent1100)上提供的第二柱的流动相为A：80％乙腈、19.9％水、和0.1％甲酸，以及B：80％乙腈、19％水、0.5％乙酸和0.5％TFA，通过Agilent1100液相色谱以0.5ml/min抽送，并用以下梯度洗脱：在第一个5分钟期间为100％A，随后从第5至10分钟为从0逐渐提高至40％的B，随后在接下来的6秒(第10至10.1分钟)期间为提高至100％的B。将B保持在100％直至第11.5分钟，随后在接下来的6秒(第11.5至11.6分钟)期间为下降到0％(100％A)，并在整个循环期间保持在0％的B，直到在第13分钟停止。
将来自最后一个柱的流出液连接到配备有以正离子模式操作的电喷雾离子源的三重四极杆质谱仪(Sciex API4000)。对于分析物，MRM转换为780.9>814.4，且对于内部标准品，MRM转换为784.5>821.4。在55V时优化了去簇电压，且碰撞能量为35V。有效碰撞能量为70eV，因为前体离子带双电荷，给出了带单电荷碎片离子。分析物和内部标准品之间的峰面积比被用于定量。获得具有85％的回收率和约40nM的定量极限的线性校准曲线。
离体溶血：进行了确定补体激活的离体溶血测定，以优化组装来自以上描述的体内研究的血清样品的体内条件。将血清样品在25μl/孔的含有5百万抗体致敏的绵羊红细胞(EA)的总反应体积中5x稀释。通常，于37℃将含有所有其它组分的20μl EA悬浮液的部分(参见实施例6)与5μl血清样品混合(摇动10分钟)，以引发溶血活性。然而，对于诸如实施例11中的小鼠血清样品，1μl C5D必须被包括在20μl EA悬浮液中。基本上如实施例6描述的用于体外测定的进行离体测定。
计算：药代动力学参数的评价基于个体血清浓度数据，报道了每个剂量组的平均值(±stdev)。将出现在末端采样点的低于定量下限(LLOQ)的水平从药代动力学分析中省略。从血清浓度数据直接获得最大血清浓度，Cmax和观察到最大血清浓度的时间，tmax。使用WinNonlin软件版本5.2.1(Pharsight Corp.,USA)、无隔分析(Non-compartmentalAnalysis)计算药代动力学参数：曲线下面积(AUC，通过线性梯形法计算的AUCo-∞和AUC0-最终)、皮下生物利用度(F，根据(AUCsc/AUCiv)*(剂量iv/剂量sc)计算)、终末血清半衰期(T1/2,z，根据ln2/λz计算，其中终末斜率λz的评价基于至少4C＝f(t)的观察值)、平均滞留时间(MRT，根据AUMC/AUC计算)、血清清除率(CL，根据剂量/AUC0-∞计算)、稳定状态下的分布容积(Vss，根据CL*MRT计算)、及在终末阶段的分布容积(Vz，根据CL/λz计算)。
结果
i.v.(250nmol/kg)和s.c.(500nmol/kg)施用之后的Z-ABD和Z-ABD-Z的药代动力学数据总结在表8中。在i.v.组中直至给药后第10-14天且在s.c.组中直至给药后的第14天，血清中的Z-ABD是可定量的，而在两个剂量组中直至给药后第10天血清中的Z-ABD-Z是可定量的(图9)。第14天是最后的采样时间点。
将C5结合多肽的血清浓度与绵羊红细胞中溶血的量相关联，发现在描述的条件(例如血清稀释1:5)下，通过超过1μM的血清浓度的Z-ABD获得了溶血的完全抑制(图12)，而Z-ABD-Z在约0.5μM的血清浓度时实现完全抑制(图13)。令人惊讶的是，如图9和表8所示，相比Z-ABD-Z，Z-ABD具有较低的血清清除率，较长的终末血清半衰期和较高的生物利用度。在时间方面，这在施用250nmol/kg Z-ABD(图10)i.v.或500nmol/kg s.c(图11)至S.D.大鼠后约三天导致溶血的完全抑制。
表8.在雄性Sprague Dawley大鼠中i.v.和s.c.施用之后Z-ABD和Z-ABD-Z的平均(±stdev)药代动力学。
实施例9：猴中C5结合Z变体的药代动力学研究
材料和方法
在Charles River,Nevada(www.criver.com)进行活体阶段的研究，内部进行了施用的药物的配制和血清样品的分析。在雄性食蟹猴(n＝3)中i.v.(静脉内)和s.c.(皮下)施用之后研究了Z-ABD变体(Z06175a(SEQ ID NO:753)通过GS接头与ABD094(SEQ ID NO:759)融合)的药代动力学。药代动力学参数的评价按照实施例8进行，然而，在i.v施用之后，对应于对数线性血清浓度-时间曲线的初始斜率的初始血清半衰期(T1/2α)、对应于与第二(中间)阶段相关联的对数线性血清浓度-时间曲线的斜率的中间血清半衰期(T1/2β)、及对应于对数线性血清浓度-时间曲线的终末斜率的终末血清半衰期(T1/2γ)被确定。T1/2根据ln2/λ计算，其中斜率λ的评价基于至少4C＝f(t)的观察值。展示的sc施用的药代动力学数据补偿了Z-ABD的前剂量(pre-dose)水平，而展示sc施用后血清浓度对时间的图，显示了确定的实际血清浓度。猴龄为2-4岁，具有2.3-3kg的体重。每只猴都接受单次i.v.剂量(540nmol/kg)，随后为i.v.施用后三周的单次s.c.剂量(1635nmol/kg)。在遵循两种施用的给药后10和30分钟、以及1、2、4、8、24、48、72、120、168、240、336和504小时采集血液样品。允许血液样品在室温凝结20-40分钟，且然后收集并冷冻血清之前，于2-8℃以1500至2200RCF离心10-15分钟。将血清样品储存在低于-20℃的温度下直到分析。
Z-ABD的血清浓度通过LC/LC/MS/MS被分析，如实施例8中描述的。通过LC/LC/MS/MS确定的血清浓度还通过定量夹心酶联免疫测定技术被证实。将Z-ABD的Z区室特异性的多克隆抗体包被在微型平板上。未结合的多克隆抗体被洗去，并加入酪蛋白作为封闭剂以减少与塑料表面的非特异性结合。将样品和标准品在含有0.5％酪蛋白和1-5％之间的猴正常血清的PBS中稀释。洗去未结合的酪蛋白后，将标准品和样品吸移至孔中，允许样品中存在的假定主要与血清白蛋白缔合的任何Z-ABD与固定化的抗体结合。洗去任何未结合的Z-ABD后，加入白蛋白特异性的HRP标记的多克隆抗体，以通过比色方法检测固定化的Z-ABD-白蛋白复合物。洗去未结合的多克隆抗体，且将底物溶液加入至孔中，且与Z-ABD结合的量成比例地显色。药代动力学参数的评价和计算如实施例8中描述的进行。
使用在实施例6和8中描述的方法，具有以下修改：相比啮齿类血清的5倍稀释，猴血清只稀释两倍，监测来自以以上描述的Z-ABD变体给药的食蟹猴的血清中的体外溶血。
结果
展示了各剂量组的平均值(±stdev)药代动力学的数据。在i.v.和s.c.两者施用之后，通过LC/LC/MS/MS，Z-ABD的血清浓度在所有时间点都是可定量的(图14)。ELISA数据和LC/LC/MS/MS数据以0.986的系数线性相关，但LC/LC/MS/MS数据被用于计算。在i.v.施用Z-ABD之后，初始血清半衰期为9.1(0.8)小时，中间血清半衰期为84(4)小时，以及终末血清半衰期为198(51)小时。平均滞留时间为246(62)小时。计算分布容积VSS和VZ分别为110(23)ml/kg和127(27)ml/kg且评价清除率为0.45(0.02)mL/h*kg。
s.c.施用之后，且针对来自i.v.施用剩余的前剂量血清水平的校正后，最大血清浓度(平均Cmax21(3)μM)在给药后8-24h到达。终末血清半衰期为206(40)小时，且平均滞留时间为250(68)小时。评价皮下生物利用度为70％以上。
注射的Z-ABD变体(Z06175a(SEQ ID NO:753)通过GS接头与ABD094(SEQ ID NO:759)融合)的药效学作用通过溶血被监测。在i.v.施用5mg/kg Z-ABD和s.c.施用15mg/kgZ-ABD后持续至少七天，食蟹猴中的溶血作用被完全压制(≤20％的前剂量)。
实施例10：使用酵母聚糖诱导的腹膜炎的体内研究
材料和方法
施用至小鼠：C57BL/6雌性小鼠在以酵母聚糖诱导前1小时腹腔内地(i.p.)、或在以酵母聚糖诱导前18小时皮下地(s.c.)接受了不同浓度的Z-ABD融合分子(Z06175a-GS-ABD094，SEQ ID NO:753通过GS接头与SEQ ID NO:759融合)或阳性对照OmCI。
i.p.施用0.8mg/小鼠酵母聚糖1小时后，在异氟烷麻醉下采集眼窝血液样品(在具有凝血激活剂的血清小瓶中)。通过颈椎脱臼处死动物。制造皮肤切口，且腹部肌肉壁(muscular wall)是可视的。将PBS溶液(包括2mM EDTA)温和地注入腹腔。按摩腹部且取出流体样品(1-2ml)。将样品转移到试管中并在以600g持续10min离心之前储存在湿冰上。分析上清液中的总蛋白质和C5a浓度。
血液样品被保存在冰箱中至少30min，且随后进行以2000g的离心。将血清样品储存在冰箱(-70℃)中用于随后的溶血活性和Z06175a-GS-ABD094水平的分析。
来自动物的血清样品中溶血活性的分析：根据实施例6和7中描述的溶血测定进行溶血活性分析。
来自以酵母聚糖和C5结合Z-ABD融合分子给药的小鼠的灌洗液中C5a浓度的分析：为了检测小鼠腹腔灌洗样品中的C5a，将微量滴定平板(MaxiSorp，Nunc)以100μl/孔的0.05M碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH9.6(目录号C-3041,Sigma)中1μg/ml浓度的抗-C5a抗体(目录号MAB21501,R&D Systems)于4℃包被过夜。将平板以含有0.05％吐温20的PBS(PBST,目录号09-9410-100,Medicago)洗涤三次，并以200μl/孔的PBST中的1％BSA(目录号A7030,Sigma)于RT封闭1-1.5h，期间以450rpm摇动。将平板以PBST再洗涤三次，且然后以100μl/孔的含有0.1％BSA的PBST中不同浓度的重组小鼠C5a标准品(目录号2150-C5,R&D Systems)或样品于RT温育2h，期间以450rpm摇动。还将高浓度样品在含有0.1％BSA的PBST中稀释。将平板再次以PBST洗涤三次，且然后以100μl/孔的0.1μg/ml浓度的生物素化的抗-C5a抗体(目录号BAF2150,R&D Systems)于RT温育1.5h，同时以450rpm摇动平板。以PBST3×洗涤之后，将平板以100μl/孔的在封闭缓冲液中200倍稀释的链霉亲和素-HRP(目录号DY998,R&DSystems)于RT温育20min，期间以450rpm摇动。3次最终洗涤后，将平板以100μl/孔的TMB底物(目录号T0440,Sigma)显影，且20-30min后在650nm处使用Spectramax Plus平板读取器(Molecular Devices)读取。
通过将每个标准品在650nm处的吸光度针对其浓度(范围0-4000pg/ml)绘图构建标准曲线。
使用ECL确定来自动物的血清样品中的Z变体浓度：通过ECL确定施用的C5结合Z06175a-GS-ABD094(SEQ ID NO:753通过GS接头与SEQ ID NO:759融合)和Z06175a-GS-ABD094-GSGGGGSGGGS-Z06175a(SEQ ID NO:753通过GS接头与SEQ ID NO:759融合，随后为GS(G4S)2接头和第二SEQ ID NO:753基序，参见图4的构建体描述)的血清浓度。将多阵列96孔高结合、非包被的(Meso Scale Discovery目录号L15XB)平板以山羊抗-Affibody分子Ig(Affibody AB,目录号20.1000.01.0005)包被。
类似于实施例6，将Z-ABD变体(Z06009a，SEQ ID NO:748与ABD094，SEQ ID NO:759融合)多阵列平板以山羊抗-Affibody分子IgG(Affibody AB)在4℃包被过夜，且随后非特异性位点以含有1％酪蛋白的PBS在RT封闭两小时。
同时，将血清样品从-70℃解冻并在来自同一动物品系的血清中以含有酪蛋白的PBS稀释。标准品和对照在相应的缓冲液中稀释。将样品和标准品在RT温育3小时，同时以300rpm摇动平板。通过150μL冰冷却的PBS-吐温20洗涤3×终止温育。最终洗涤后，立即向每个孔加入150μl2×读取缓冲液(在超纯H2O中1:1稀释的4x读取缓冲液T，Meso ScaleDiscovery目录号R92TC-3)，并使用平板读取器(SECTOR Imager2400,Meso ScaleDiscovery)检测信号。
在可选的实验中，将平板以人C5(SEQ ID NO:760，1pmol/孔)包被。在添加至包被的平板之前，将在血清中或在血清和含有酪蛋白的PBS中稀释的血清样品和标准品(所有样品和标准品匹配到相同的血清浓度)，加热至60℃持续30min以使内源性C5变性。该可选的实验提供了一种用于专门检测C5结合蛋白质的方法，而以上描述的抗体依赖性的策略可被应用至与该特定抗体结合的所有蛋白质。
结果
来自动物的血清样品中Z-ABD的血清浓度和溶血活性的分析：在施用低(20nmol/kg)、中(100nmol/kg)和高剂量(500nmol/kg)之后评价了Z-ABD融合分子(Z06175a-GS-ABD094，SEQ ID NO:753通过GS接头与SEQ ID NO:759融合)的血清浓度以及其影响绵羊红细胞中溶血的能力。血清浓度与剂量呈相对线性，且溶血的抑制证实了分子在血清中是有活性的且溶血的抑制也确实是浓度依赖性的。
来自以酵母聚糖和C5结合Z-ABD融合分子给药的小鼠的灌洗液中C5a浓度的分析：i.p.施用促炎分子酵母聚糖，且在图15中显示了对灌洗液中的高度炎性的C5裂解产物C5a的作用作为单独给药的酵母聚糖和在酵母聚糖处理之前18h s.c.施用的20nmol/kg、100nmol/kg和500nmol/kg的C5结合Z变体的给药后给药的酵母聚糖，或在酵母聚糖处理前1h i.p.施用的OmCI的函数。单独的施用酵母聚糖导致灌洗液中C5a的有效提高。这种作用被展示的C5结合Z-ABD融合分子以剂量依赖的方式阻断。
实施例11：气管内施用之后小鼠中C5结合蛋白质的药代动力学研究
材料和方法
研究了气管内施用于雌性C57bl小鼠之后C5结合构建体Z06175a-GS-ABD094(SEQID NO:753通过GS接头与SEQ ID NO:759融合)的药代动力学特征。温度、相对湿度和照明设置为保持22±1℃、55±5％和12h光照-12h黑暗周期，且随意提供饮食和水。动物以异氟烷麻醉，并使用微型喷雾器将500nmol/kg Z06175a-GS-ABD094直接给药到肺部。在异氟烷麻醉下，在5min、30min、1h、3h、7h、16h、24h、48h、和72h(三只动物/时间点)时从腔静脉抽取尽可能多的血液，用于制备血清样品。通过将血液收集在管中并将管在冰箱中放置20min制备血清样品。随后，将管以4000rpm离心10min。从每一个血液样品制备了至少100μl血清。在分析之前将血清样品保持在-70℃。每一个样品中Z06175a-GS-ABD094的血清浓度如实施例10中描述的通过ECL被确定，且血清样品影响绵羊红细胞中溶血的能力如实施例6和8中描述的被确定。
结果
每一个样品中的血清浓度和影响绵羊红细胞中溶血的相应能力分别在图16A和图16B中描述。在30分钟内，以从300至1000nM范围的血清浓度达到平稳状态，其中溶血几乎完全被阻断。在施用后7h后的时间点取样的血清中，溶血逐渐地再次发生。在给药后三天的最后的时间点，溶血为对照的约70％(图16B)。这些数据清楚地证明了气管内施用之后Z06175a-GS-ABD094吸收进入体循环且分子功能性地抑制溶血。
实施例12：局部和玻璃体内施用之后兔眼中C5结合Z变体的药代动力学研究
材料和方法
兔活体阶段：玻璃体内施用之后研究了兔眼中Z变体(Z06175a，SEQ ID NO:753，随后为GS(图4，构建体1))的药代动力学。
在Iris Pharma,La Gaude,France(www.iris-pharma.com)进行了活体阶段的研究以及来自给药的动物(有色兔，2-2.5kg)的眼部的解剖。将动物单独饲养在20±2℃、55±10％相对湿度下，随机获得食物和水。
动物被分为三组：1)玻璃体内施用(每只眼中50μl，n＝3，总计6只眼)，随后为一天后的解剖和血清采集，2)玻璃体内施用(每只眼50μl，n＝3)，随后为四天后的解剖和血清采集，以及3)未处理的动物(n＝5)。
解剖了四个不同的眼区室(房水、玻璃体、神经视网膜、和RPE-脉络膜)，并立即于-80℃冷冻。内部进行施用的药物(在10mM磷酸盐缓冲液、145mM NaCl，pH7.4中20.2mg/ml)的配制及在不同眼区室中药物的分析。
解剖的眼区室中Z变体的分析：解剖的眼区室在干冰上运输并储存在-80℃直到分析。将视网膜和脉络膜样品在含有陶瓷珠的Lysing Matrix D管(MP Biomedical)中的含有1％人血清白蛋白的10倍(体积/重量)PBS中解冻并以速度4持续2×20s在Savant Bio101匀浆器中摇动。使用吸管将匀浆从珠中移出并转移到1.5ml Eppendorf管中，并在900rpm离心十分钟。房水和玻璃体样品以与如视网膜和脉络膜相同的方式处理，除了不需要匀质化。将来自组1和2的玻璃体样品在与以上相同的缓冲液中进一步稀释10倍。以HSA(35.8μM、3.58μM、358nM、35.8nM和17.9nM)在PBS中制备五个标准品。随后，使标准品和样品经受胃蛋白酶消化并使用实施例8中描述的LC/LC/MS/MS方法确定组织提取物中Z变体的浓度的分析。
结果
玻璃体内施用后一天后Z变体的浓度在所有区室中是高的(6-200μM)，并令人惊讶的是，施用后4天维持高的浓度(1.5-78μM)。特别地，注射后一天玻璃体中Z分子的浓度范围从118μM至201μM(平均161μM，n＝6只眼)，并在注射后四天维持在26至78μM(平均46μM，n＝6)，指向若干天的T1/2。通过下列实例中的描述，玻璃体内注射后兔眼中药物的大小和消除之间似乎存在反比关系：莫西沙星(MW<0.35kDa，T1/2＝1.72h，Mohan等人Trans AmOphthalmol Soc2005,103:76-83)、ESBA105(MW＝26kDa，T1/2＝25h，Ottiger等人Investigative Ophthalmology&Visual Science2009,50:779-786)和雷珠单抗(MW＝48kDa，T1/2＝2.89天，Bakri等人American Academy of Ophthalmology2007,114:2179-2182)。本文测试的Z变体具有7.0kDa的分子量，表明Z分子在玻璃体中的消除比对这样的小分子期望的慢。

Claims (27)

1.C5结合多肽，所述C5结合多肽包括三螺旋束蛋白质结构域，所述三螺旋束蛋白质结构域包含C5结合基序，BM，所述基序形成所述三螺旋束蛋白质结构域中具有互连环的两个α-螺旋的部分并且由选自SEQ ID NO:1-248中的任一个的氨基酸序列构成，其中所述C5结合多肽抑制C5的裂解。
2.根据权利要求1所述的C5结合多肽，其中所述氨基酸序列选自以下的任一个：SEQ IDNO:1-12、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23-24、SEQ ID NO:26-28、SEQ ID NO:32-35、SEQ IDNO:38-39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:56-57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:78-79、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:106、SEQ IDNO:110、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:205、SEQ IDNO:215和SEQ ID NO:243。
3.根据权利要求2所述的C5结合多肽，其中所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:1-12中的任一个。
4.根据权利要求1所述的C5结合多肽，其中所述三螺旋束蛋白质结构域选自来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白质A的结构域及其衍生物。
5.根据权利要求1所述的C5结合多肽，所述C5结合多肽包括以下的氨基酸序列：
i)K-[BM]-DPSQS XaXbLLXc EAKKL NDXdQ；
其中
[BM]是如权利要求1-3中任一项定义的C5结合基序；
Xa选自A和S；
Xb选自N和E；
Xc选自A、S和C；并且
Xd选自A和S。
6.根据权利要求5所述的C5结合多肽，其中所述氨基酸序列i)选自SEQ ID NO:249-496中的任一个。
7.根据权利要求6所述的C5结合多肽，其中所述氨基酸序列i)选自以下的任一个：SEQID NO:249-260、SEQ ID NO:268、SEQ ID NO:271-272、SEQ ID NO:274-276、SEQ ID NO:280-283、SEQ ID NO:286-287、SEQ ID NO:289、SEQ ID NO:294、SEQ ID NO:297、SEQ IDNO:304-305、SEQ ID NO:307、SEQ ID NO:314、SEQ ID NO:326-327、SEQ ID NO:335、SEQ IDNO:340、SEQ ID NO:354、SEQ ID NO:358、SEQ ID NO:367、SEQ ID NO:373、SEQ ID NO:389、SEQ ID NO:399、SEQ ID NO:409、SEQ ID NO:414、SEQ ID NO:435、SEQ ID NO:445、SEQ IDNO:451、SEQ ID NO:453、SEQ ID NO:463和SEQ ID NO:491。
8.根据权利要求7所述的C5结合多肽，其中所述氨基酸序列i)选自SEQ ID NO:249-260中的任一个。
9.根据权利要求1所述的C5结合多肽，其中所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:497-757中的任一个。
10.根据权利要求9所述的C5结合多肽，其中所述氨基酸序列选自以下的任一个：SEQID NO:497-508、SEQ ID NO:516、SEQ ID NO:519-520、SEQ ID NO:522-524、SEQ ID NO:528-531、SEQ ID NO:534-535、SEQ ID NO:537、SEQ ID NO:542、SEQ ID NO:545、SEQ IDNO:552-553、SEQ ID NO:555、SEQ ID NO:562、SEQ ID NO:574-575、SEQ ID NO:583、SEQ IDNO:588、SEQ ID NO:602、SEQ ID NO:606、SEQ ID NO:615、SEQ ID NO:621、SEQ ID NO:637、SEQ ID NO:647、SEQ ID NO:657、SEQ ID NO:662、SEQ ID NO:683、SEQ ID NO:693、SEQ IDNO:699、SEQ ID NO:701、SEQ ID NO:711、SEQ ID NO:739和SEQ ID NO:746-757。
11.根据权利要求10所述的C5结合多肽，其中所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:497-508和SEQ ID NO:746-757中的任一个。
12.根据权利要求11所述的C5结合多肽，其中所述氨基酸序列选自以下的任一个：SEQID NO:497、SEQ ID NO:498、SEQ ID NO:499、SEQ ID NO:500、SEQ ID NO:501、SEQ ID NO:746、SEQ ID NO:747、SEQ ID NO:748、SEQ ID NO:750和SEQ ID NO:753。
13.根据权利要求1所述的C5结合多肽，其中所述C5结合多肽与C5结合使得相互作用的KD值为至多1×10-6M、至多1×10-7M、至多1×10-8M、或至多1×10-9M。
14.根据权利要求1所述的C5结合多肽，所述C5结合多肽还包括改善所述多肽的制备、纯化、体内或体外稳定性、偶联、或检测的C末端和/或N末端氨基酸。
15.根据权利要求1所述的C5结合多肽，所述C5结合多肽呈多聚体形式，所述多聚体形式包括至少两个C5结合多肽的单体单元，所述C5结合多肽的单体单元的氨基酸序列可以是相同的或不同的。
16.C5结合化合物，所述C5结合化合物包括至少一种根据前述权利要求中任一项所述的C5结合多肽；至少一种链球菌蛋白质G的白蛋白结合结构域，或其衍生物；以及至少一种连接部分，所述连接部分用于将所述至少一种结构域或其衍生物连接至所述至少一种C5结合多肽的C末端或N末端。
17.根据权利要求16所述的C5结合化合物，具有选自以下的结构：
[CBP1]-[L1]-[ALBD]；
[CBP1]-[CBP2]-[L1]-[ALBD]；
[CBP1]-[L1]-[ALBD]-[L2]-[CBP2]；
[ALBD]-[L1]-[CBP1]；
[ALBD]-[L1]-[CBP1]-[CBP2]；
[CBP1]-[L1]-[CBP2]-[L2]-[ALBD]；和
[ALBD]-[L1]-[CBP1]-[L2]-[CBP2]
其中，彼此独立地，
[CBP1]和[CBP2]是C5结合多肽，其可以是相同的或不同的；
[L1]和[L2]是连接部分，其可以是相同的或不同的；和
[ALBD]是链球菌蛋白质G的白蛋白结合结构域，或其衍生物。
18.根据权利要求17所述的C5结合化合物，其中所述连接部分选自G、GS；[G2S]n；[G3S]n；[G4S]n；GS[G4S]n，其中n是0-7；[S2G]m；[S3G]m；[S4G]m；其中m是0-7，以及VDGS。
19.根据权利要求16所述的C5结合化合物，其中所述白蛋白结合结构域如SEQ ID NO:759中所列。
20.根据权利要求16所述的C5结合化合物，其中所述C5结合多肽的每一个独立地选自如权利要求9-12中任一项定义的多肽。
21.多核苷酸，所述多核苷酸编码根据权利要求1-15中任一项所述的多肽或根据权利要求16-20中任一项所述的化合物。
22.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求1-15中任一项所述的C5结合多肽和治疗剂，或包含根据权利要求16-20中任一项所述的C5结合化合物和治疗剂。
23.根据权利要求1-15中任一项所述的C5结合多肽、根据权利要求16-20中任一项所述的C5结合化合物、或根据权利要求22所述的组合物在制备用于治疗C5相关的状况的药物中的用途，其中所述药物被施用至有相应需要的哺乳类受试者，其中所述C5相关的状况选自炎性疾病；自身免疫性疾病；传染病；心血管疾病；神经退行性紊乱；癌症；移植物损伤；创伤；眼部疾病；肾脏疾病；肺部疾病；血液疾病；变应性疾病和皮肤病。
24.根据权利要求1-15中任一项所述的C5结合多肽、根据权利要求16-20中任一项所述的C5结合化合物、或根据权利要求22所述的组合物在制备用于治疗阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)的药物中的用途。
25.根据权利要求23所述的用途，其中所述药物与C5的结合抑制C5的裂解。
26.根据权利要求23或24所述的用途，其中所述药物被静脉内、皮下、通过吸入、经鼻、口服、或玻璃体内施用。
27.根据权利要求23或24所述的用途，其中所述药物被局部施用。
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