KR20200105953A - 인간 보체 c5에 결합하는 폴리펩티드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 i) EX2X3X4AX6X7EIDX11LPNLX16X17X18QWX21AFIX25X26LX28D 및 ii) i)에 정의된 서열에 대해 적어도 86% 동일성을 갖는 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 C5 결합 모티프 BM을 포함하는, C5에 결합하는 C5 결합 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 요법에 사용하기 위한, 예컨대 C5 관련 병태의 치료에 사용하기 위한 C5 결합 폴리펩티드, 및 치료 방법에 관한 것이다.

Description

인간 보체 C5에 결합하는 폴리펩티드 {POLYPEPTIDES BINDING TO HUMAN COMPLEMENT C5}
본 발명은 인간 보체 성분 5 (C5)에 결합하는 폴리펩티드 및 요법에서의 상기 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.
보체 단백질 C5는 보체계의 중추적인 성분으로서; 선천성 면역계의 핵심적인 부분이다. 보체계는 긴밀하게 제어되는 다양한 과정에 많은 임무를 수행하는 복잡한 면역 생존 시스템이다. 그 기능 중의 하나는 건강한 숙주 조직을 세포 파편 및 아폽토시스성 및 괴사성 세포로부터 구별함으로써 다른 유기체에 의한 감염에 대한 제1선 숙주 방어이다. 또한, 이것은 면역 복합체의 클리어런스, 적응 면역 반응의 조절, 조직 재생의 촉진, 혈관신생, 줄기 세포의 이동 및 중추신경계의 발달에 관여한다 (문헌 [Woodruff et al. Mol Immunol 2011, 48 (14):1631-1642]; [Ricklin et al. Nat Immunol 2010, 11(9):785-795]). 임의의 촉발제, 예를 들어 보체 활성화 및 조절의 양호한 균형을 방해하는 잘못된 또는 비제한된 활성화 또는 불충분한 조절은 광범한 조직 손상을 야기하는 숙주 세포의 자가공격을 비롯한 병리학적 상태를 야기할 수 있다.
보체계는 약 30개의 단백질로 이루어진다. 보체 면역을 개시하기 위한 3개의 경로가 존재한다; 세포 표면 상의 면역 복합체를 인식하는 C1q를 이용하는 전형적인 경로, 만노스-결합 렉틴 (MBL)이 특정 당을 인식할 때 개시되는 렉틴 경로, 및 침습 병원체 상에 존재하지 않는 특정 포유동물 세포 표면 분자에 의해 억제되는 과정인, 보체 인자 3 (C3)의 가수분해에 의해 자연적으로 개시되는 대안적 경로. 대안적 경로는 또한 보체계에 대한 증폭 루프(loop)로서 작용한다. 3개의 모든 경로는 C3의 수준에서 수렴된다. C3의 C3a 및 C3b로의 절단은 컨버타제의 형성을 유도하고, 이 효소는 다시 보체 인자 5 (C5)를 C5a 및 C5b로 절단한다. C5a는 다양한 면역 세포의 매우 효능있는 유인물질인 반면, C5b는 C6-9와 함께 올리고머화하여 막 공격 복합체 (MAC) 또는 때때로 말단 보체 복합체 (TCC)로 알려진 세공을 형성한다. 보체계의 활성화는 병원체 중화를 목적으로 하는 많은 메카니즘을 유도하고; 세포, 예컨대 침습성 박테리아의 표면 상의 MAC의 형성은 용해를 유발하고, C3 및 C4 절단 생성물 C3b 및 C4b의 침착은 대식세포 및 아나필라톡신(anaphylatoxin)에 의한 병원체의 식세포작용을 유도하는 옵소닌화(opsonization)를 돕고, 예컨대 C3a 및 C5a는 단핵구 및 호중구를 활성화 부위로 유인하고, 표면 마커를 상향조절하여 증가된 면역학적 감수성 및 시토카인의 방출을 유도한다.
C5는 분자량이 각각 115 및 75 kDa인 2개의 디술피드-연결된 폴리펩티드 쇄, 즉 알파 및 베타를 포함하는 190-kDa 당단백질이다 (문헌 [Tack et al. Biochem 1979, 18: 1490-1497]). 하빌랜드(Haviland) 등 (문헌 [J Immun 1991, 146: 362-368])은 18개 아미노산의 리더 펩티드 및 베타 및 알파 쇄를 분리하는 4개 아미노산의 링커를 포함하는 1,676개 아미노산의 프로-분자를 코딩하는 것으로 예측되는 인간 보체 프로-C5의 완전한 cDNA 서열을 구축하였다. C5a 및 C5b로의 C5 절단의 차단은 MAC 형성 및 염증유발(pro-inflammatory) C5a의 형성을 억제하지만, 상류 보체 이펙터 시스템은 무손상 상태로 유지하여 C3/C4 매개 옵소닌화를 허용한다.
일반적으로 병원체에 대한 방어에서 보체계의 핵심적인 역할 때문에, 보체계는 제약적 개입을 위한 관심을 끄는 표적이 된다. 이것은 보체의 많은 돌연변이 또는 손상된 조절이 다양한 질환 및 병태와 관련된다는 사실에 의해 강조된다. 이것은 자가면역 질환, 예컨대 면역 복합체의 침착이 전형적인 경로를 촉발하는 전신 홍반성 루푸스 (SLE)에 대한 증가된 감수성을 포함한다 (문헌 [Manderson et al. Annu Rev Immunol 2004, 22:431-456]). 또한, 보체 단백질 C1-C5의 돌연변이는 종종 SLE 또는 SLE 유사 증상을 야기한다. 보체계가 강하게 개입되는 다른 자가면역 질환은 면역 복합체가 류마티스 관절염 (RA) 관절 내의 보체를 활성화시킬 수 있는 RA, 쇼그렌(Sjoegren) 증후군, 피부근염 및 다른 자가항체 유도 질환, 예컨대 길랑-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome; GBS), 피셔(Fisher) 증후군 (문헌 [Kaida et al. J. Neuroimmun 2010, 223:5-12]), 상이한 종류의 혈관염, 전신 경화증, 항-사구체 기저막 (항-GBM) 및 항-인지질 증후군 (APS)이다 (문헌 [Chen et al. J Autoimmun 2010, 34:J276-J286]).
보체계는 또한 신경변성 장애, 예컨대 Aβ 플라크가 보체계를 직접 활성화하여 소교세포의 C5a 매개 동원을 유발하는 알츠하이머병(Alzheimer's disease; AD)에 관여한다. 이것은 C5aR 길항제가 AD의 마우스 모델에서 신경보호성인 것으로 밝혀졌을 때 추가로 확인되었다 (문헌 [Fonseca et al. J Immunol 2009, 183:1375-1383]). 아세틸콜린 수용체에 대한 자가항체 및 후속 보체 활성화는 신경근 접합부에 영향을 주는 질환인 중증 근무력증에 대한 가장 흔한 원인이다 (문헌 [Toyka and Gold, Schweizer Archive Neurol Psych 2007, 158:309-321]). MAC 형성은 다발성 경화증 (MS)의 병리생리학에 관련된다 (문헌 [Oh et al. Immunol Res 2008, 40:224-234]). 또한, 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅톤병(Huntington's disease) 및 프리온(prion) 질환, 예컨대 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeld-Jacob disease)에서, 보체 활성화는 병리상태의 일부이다 (문헌 [Bonifati and Kishore, Mol Immunol 2007, 44:999-1010]). 상처 치유에서, 염증 반응은 조직 항상성을 회복시키기 위한 핵심 성분이고, 보체계는 손상된 조직의 조기 인식에 관련된다. 그러나, 만성 상처 및 심한 화상의 모델에서, 예를 들어, C1 억제제에 의한 보체의 억제는 개선된 치유 및 감소된 조직 손상을 유도하였고, 이것은 보체를 시사한다. 또한, 예컨대 C4 녹아웃(knockout) 마우스에 의해 예시되는 바와 같은 다양한 보체 결핍은 상처에 의한 장기 조직 손상에 대해 보호 작용을 하는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Cazender et al. Clinical and Developmental Immunology 2012, on-line publication]에서 검토됨). 최근에, 종양 성장 및 증식이 보체 활성화에 의해, 특히 C5a에 의해 촉진되고, C5a 수용체의 차단은 상기 과정의 진행을 늦추는 것으로 밝혀졌다. 또한, C3 결여 마우스는 야생형 한배새끼보다 유의하게 더 느린 종양 성장을 보인다 (문헌 [Markiewski et al. Nat Immunol 2008, 9: 1225-1235]).
기능장애성 보체 조절은 여러 희귀 내지 극히 희귀한 병태, 예컨대 발작성 야간 혈색소뇨 (PNH) 및 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS) (용혈이 병리상태의 핵심 특징임)의 원인이다. PNH에서, 포스파티딜이노시톨 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 서브유닛 A를 코딩하는 돌연변이된 PIG-A 유전자를 갖는 조혈성 줄기 세포의 클론은 혈액 세포의 풀(pool)을 이어받는다. 상기 돌연변이는 GPI 고정된(anchored) 단백질, 예컨대 보체 조절제 CD55 및 CD59의 상실을 야기한다. 표면에 CD55 및 CD59가 결여된 적혈구는 MAC에 의한 보체 매개 용해를 위해 노출된다. 임상적으로, PNH는 빈혈, 혈전증 및 골수 부전을 야기하는 용혈에 의해 표시된다. 비정형 HUS는 주로 대안적 경로의 조절 단백질의 돌연변이, 예컨대 인자 H의 돌연변이에 의해 야기된다.
눈은 보체 유도 병리상태에 대한 부위로서 강하게 표시된다. 시력 상실의 가장 통상적인 원인은 노화 관련 황반 변성 (AMD)이고, 그의 보다 심각한 형태 (삼출성 또는 습성 AMD)에서, 병적 맥락막 신경혈관 막이 망막 아래에 발생한다. 미국에서, 65-74세 중 약 10%의 집단이 황반 변성의 징후를 보이고, 5%의 많은 집단은 AMD의 결과로서 시력 손상을 보인다. 이러한 수치는 나이와 함께 크게 증가하지만, 또한 유전적 요인도 존재한다. 유전자 중에서 AMD와 가장 강하게 연관되는 것은 보체 인자 H, 인자 B 및 C3 및 C1 억제제이다 (문헌 [Bradley et al. Eye 2011, 25:683-693]). 또한, 다양한 보체 차단 분자를 사용한 여러 연구 및 임상 시험은 유익한 것으로 증명되었고, 이것은 C5 차단 분자가 상기 환자 군을 도울 수 있음을 시사한다. 그러나, 진행된 AMD에 대한 현재의 치료는 예를 들어 라니비주맙 (모노클로날 항체 단편) 및 베바시주맙 (모노클로날 항체)의 유리체내 주사에 의한 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 유도 혈관화의 억제를 목적으로 한다. 안구 항원에 대한 면역 반응에 의한 눈의 염증인 포도막염의 동물 모델에서, 대안적 경로 인자 B (문헌 [Manickam et al. J Biol Chem 2011, 286:8472-8480]) 및 C5 (문헌 [Copland et al. Clin Exp Immunol 2009, 159:303-314])에 대한 항체의 차단은 질환 상태를 개선하였다.
고형 장기의 이식에서, 이식편의 거부 또는 기능 지연/손상을 야기하는 다음과 같은 2개의 주요 기계적 경로가 존재한다: 1) 혈액형 (ABO) 및 MCH 부류에 대한 공여자와 수여자 사이의 면역학적 장애 및 공여자에 대한 수요자의 예비-감작화의 정도, 즉 급성 항체 매개 거부 (AMR)를 야기하는 공여자 특이적 항체 (DSA)의 발생; 및 2) 이식된 장기의 상태 및 일정한 수혈 없이 유지되는 시간, 즉 이식편의 허혈 손상 또는 허혈 재관류 손상 (IRI)의 정도. AMR 및 IRI 둘 모두에서, 보체계는 외래 물질, 따라서 거부되어야 하는 실체로 인식되는 장기를 공격한다. AMR에서, 기존재하는 항-공여자 항체가 외래 장기의 표면상에 면역 복합체를 신속하게 형성하여, C1q에 의한 인식 및 전형적인 경로를 통한 보체계의 후속적인 활성화를 야기한다. 초급성 거부로 알려진 상기 과정은 수 분 내에 발생하고, 따라서 현재의 불일치된 장기의 이식은 이식 전에 혈장분리반출술(plasmapheresis) 또는 혈장 교환에 의한 DSA의 제거 및 상이한 면역억제제와 조합한 정맥내 IgG 주사를 포함한다. 신규한 치료는 또한 항-CD20 항체 리툭시맙의 사용을 통한 B-세포 고갈을 포함한다 (문헌 [Genberg et al. Transplant 2008, 85: 1745-1754]). 이들 프로토콜은 초급성 거부의 발생을 크게 제거하였지만, 고도로 감작화된 환자에서는 급성 AMR의 발생 (수 주-수 개월)은 40%만큼 계속 높다 (문헌 [Burns et al. Am J Transplant 2008, 6:2684-2694]; [Stegall et al. Am J Transplant 2011, early on-line publication]). IRI에 대해, 대부분의 증거는 후속적인 MAC 형성 및 용해를 보이는 말단 경로를 조직 손상의 주원인으로서 제시한다. 따라서, C5 차단 폴리펩티드는 원인이 AMR, IRI, 또는 종종 발생하는 바와 같이 AMR 및 IRI의 조합임에도 불구하고 거부에 대해 보호 작용을 할 것이다. 예상되는 바와 같이, 고도로 관류되는 장기, 예컨대 간 (문헌 [Qin et al. Cell Mol Immunol 2006, 3:333-340]), 심장 및 신장은 특히 보체 매개 손상에 감수성이다.
보체 캐스케이드의 근위 및 말단부를 연결하는 C5 단백질의 중앙 배치는 이 단백질을 제약적 개입을 위한 매력적인 표적으로 만든다. C5는 보체 활성화의 모든 경로에 공통적이기 때문에, C5의 차단은 자극에도 불구하고 캐스케이드의 진행을 중지시키고, 따라서 근위 보체 캐스케이드의 면역보호 및 면역조절 기능은 무손상 상태로 유지하면서 말단 보체 활성화의 유해한 특성을 억제할 것이다.
인간 보체 C5를 표적으로 하는 항체는 예를 들어 WO 95/29697; WO 02/30985; 및 WO 2004/007553으로부터 알 수 있다. 에쿨리주맙 (솔리리스(Soliris)™)은 단백질 C5에 대해 작용하는 인간화된 모노클로날 항체이고, C5의 C5a 및 C5b로의 절단을 억제한다. 에쿨리주맙은 혈관내 용혈성 빈혈, 혈전성향증 및 골수 부전을 특징으로 하는 희귀하고 때때로 생명을 위협하는 질환인 PNH의 치료에 효과적인 것으로 밝혀졌고, 상기 증상에 대해 승인되었다. 에쿨리주맙은 또한 최근에 필수적인 장기, 예컨대 신장, 심장 및 뇌에 대한 지속적인 손상 위험을 유발하는 혈전성 미세혈관병증 (TMA)으로서 표시되는 과다-활성화를 야기하는, 대체 보체 경로의 제어 상실에 의해 유발되는 희귀하지만 생명을 위협하는 질환인 비정형 용혈성 증후군 (aHUS)의 치료를 위해 FDA에 의해 승인되었다. aHUS에서, 간이 제어 단백질 (가장 종종 보체 인자 H 또는 대안적 경로의 다른 단백질)의 돌연변이된 형태를 계속 생산하기 때문에 손상된 장기의 이식은 환자를 단지 일시적으로 돕는다. 일시적 급성 병리생리학을 보이는 질환은 시가(Shiga) 독소 양성 이. 콜라이(E. coli)의 감염에 의해 야기되는 HUS (STEC-HUS)이고, 상기 병태에 대해서도 효능을 제시하는 유망한 임상 데이터가 존재한다 (문헌 [Lapeyraque et al., N Engl J Med 2011, 364:2561-2563]). 마지막으로, C5 차단 항체 에쿨리주맙은 크게 불일치한 신장의 수여자에서 AMR을 억제할 때 효능이 있는 것으로 입증되었다 (문헌 [Stegall, M. D. et al. Am J Transplant 2011, 11:2405-2413]).
전장 항체 이외에, C5를 표적으로 하는 단쇄 가변 단편 (scFV), 미니바디(minibody) 및 압타머가 문헌에 설명되어 있다. 이들 C5 억제제는 C5 분자 상의 상이한 부위 (에피토프)에 결합할 수 있고, 상이한 작용 방식을 가질 수 있다. 예를 들어, 에쿨리주맙은 컨버타제 절단 부위의 다소간의 거리에서 C5와 상호작용하는 반면, 미니바디 무보디나(Mubodina)®는 C5의 절단 부위와 상호작용한다. 연진드기 오르니토도로스 모우바타(Ornithodoros moubata)로부터의 C5 억제 단백질인 오르니토도로스 모우바타 보체 억제제 (문헌 [OmCI, Nunn, M. A. et al. J Immunol 2005, 174:2084-2091])는 컨버타제 절단 부위에 근접한 CUB-C5d-MG8 수퍼도메인의 원위 말단에 결합하는 것으로 가정되었다 (문헌 [Fredslund et al. Nat Immunol 2008, 9 (7):753-760]). C5의 절단을 억제하는 상기 언급된 3개의 단백질과 달리, 모노클로날 항체 TNX-558은 C5의 절단을 억제하지 않으면서 무손상 C5 및 방출된 C5a 둘 모두 상에 존재하는 C5a 에피토프에 결합한다 (문헌 [Fung et al. Clin Exp Immunol 2003, 133 (2):160-169]).
큰 다중도메인 구조, 12개의 쇄내 및 4개의 쇄간 디술피드 가교 및 복잡한 글리코실화 패턴을 갖는 항체는 그의 분자 구조에 관련된 많은 고유한 단점을 갖는다. 예를 들어, 에쿨리주맙의 크기는 약 148 kDa이다. 인간 혈액 내의 C5의 농도는 약 400 nM이고, C5 활성을 완전히 차단하기 위해서 억제제의 농도는 적어도 이와 같거나 이보다 높아야 한다. 따라서, 솔리리스™를 사용한 PNH의 평생 동안의 표준 치료 요법은 2주마다 900 mg 단백질의 정맥내 주입이고, 이것은 임상에서 주로 시행되는 치료법으로서 환자에게 매우 불편하고 사회적 비용을 필요로 한다. 솔리리스™는 또한 흉통, 열, 오한, 가려움증, 두드러기, 안면홍조, 발진, 어지럼증, 호흡 곤란, 또는 안면, 혀, 및 인후의 팽윤을 야기하는 것으로 보고되었지만, 이러한 부작용의 원인은 밝혀지지 않았다. 또한, 에쿨리주맙은 영장류를 포함하는 임의의 시험 동물 모델에서 활성을 보이지 않고, 따라서 활성 약물을 사용한 동물 연구가 불가능하다. 상기 언급한 바와 같이, AMD에 대한 현재의 치료법은 또한 항체 의존성이고, 따라서, 분자량이 보다 작은 분자를 사용한 주사 또는 다른 투여 경로를 기초로 한 치료를 크게 필요로 한다.
또한, 항체 생산은 작은 단백질의 생산보다 더 어렵고 비용이 많이 소요된다 (문헌 [Kenanova et al. Expert Opin Drug Deliv 2006, 3 (1):53-70]). 일반적으로 항체에 관련된 다른 결점, 예컨대 치료 효과의 저하 또는 상실을 야기하는 정상 조직에 대한 교차-반응성 및 비-특이적 결합, 주사된 항체의 증가된 대사 및 인간 항-인간 항체 (HAMA)의 형성은 문헌 [Reilly et al. (Clin Pharmacokinet 1995, 28: 126-142)]에 제시되어 있다.
따라서, 비슷한 C5 차단 활성을 갖는 작용제의 지속적인 제공은 당업계의 큰 관심사가 되고 있다. 특히, 말단 보체 캐스케이드 및 염증유발 분자 C5a의 형성을 방지하는 분자에 대한 필요성이 지속되고 있다. 또한, 질환의 치료에서 상기 분자의 용도를 제공하는 것이 큰 관심의 대상이다.
본 발명의 목적은 새로운 C5 결합제를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은 치료 용도로 사용하기 위한 새로운 C5 결합제를 제공하는 것이다.
한 측면에서,
i) EX2X3X4AX6X7EIDX11LPNLX16X17X18QWX21AFIX25X26LX28D
상기 서열에서, 서로 독립적으로
X2는 H, Q, S, T 및 V로부터 선택되고;
X3은 I, L, M 및 V로부터 선택되고;
X4는 A, D, E, H, K, L, N, Q, R, S, T 및 Y로부터 선택되고;
X6은 N 및 W로부터 선택되고;
X7은 A, D, E, H, N, Q, R, S 및 T로부터 선택되고;
X11은 A, E, G, H, K, L, Q, R, S, T 및 Y로부터 선택되고;
X16은 N 및 T로부터 선택되고;
X17은 I, L 및 V로부터 선택되고;
X18은 A, D, E, H, K, N, Q, R, S 및 T로부터 선택되고;
X21은 I, L 및 V로부터 선택되고;
X25는 D, E, G, H, N, S 및 T로부터 선택되고;
X26은 K 및 S로부터 선택되고;
X28은 A, D, E, H, N, Q, S, T 및 Y로부터 선택됨; 및
ii) i)에 정의된 서열에 대해 적어도 86% 동일성을 갖는 아미노산 서열
로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 C5 결합 모티프 BM을 포함하는, C5에 결합하는 C5 결합 폴리펩티드가 제공된다.
C5에 대한 결합 친화도를 갖는 폴리펩티드에 관련된 서열의 상기 정의된 부류는 공통적인 모 폴리펩티드 서열로부터 유래된다. 보다 구체적으로, 부류의 정의는 선택 실험에서 그의 C5와의 상호작용에 대해 선택된 모 폴리펩티드의 매우 많은 무작위 폴리펩티드 변이체의 분석을 기초로 한다. 확인된 C5 결합 모티프, 또는 "BM"은 모 스캐폴드(scaffold)의 표적 결합 영역에 상응하고, 상기 영역은 3개-나선 다발(bundle) 단백질 도메인 내의 2개의 알파 나선을 구성한다. 모 스캐폴드에서, 2개의 BM 나선의 변이된 아미노산 잔기는 항체의 불변 Fc 부분과의 상호작용을 위한 결합 표면을 구성한다. 결합 표면 잔기의 무작위 변이 및 변이체의 후속적인 선택에 의해, 결합 표면의 Fc 상호작용 능력은 C5와의 상호작용을 위한 능력으로 교체되었다.
다음 실시예에서 설명되는 바와 같이, C5 결합 폴리펩티드 변이체의 선택은 예를 들어 단백질 스캐폴드의 나이브(naive) 변이체의 선택을 위한 파지 디스플레이, 이어서 임의로 친화도 성숙된 C5 결합 변이체의 선택을 위한 친화도 성숙 및 세포 디스플레이에 의해 달성될 수 있다. 그러나, 파지-기반, 박테리아-기반, 세포-기반 등과 무관한 임의의 선택 시스템이 C5 결합 폴리펩티드의 선택을 위해 사용될 수 있음이 이해된다.
본원 명세서에서 사용되는 용어 "C5 결합" 및 "C5에 대한 결합 친화도"는 예를 들어 비아코어(Biacore) 기기 (지이 헬쓰케어(GE Healthcare))에서 표면 플라즈몬 공명 기술의 사용에 의해 시험될 수 있는 폴리펩티드의 특성을 의미한다. C5 결합 친화도는 예를 들어 C5가 비아코어 기기의 센서 칩에 고정되고, 폴리펩티드를 함유하는 샘플은 칩 상을 통과하는 실험에서 시험될 수 있다. 대안적으로, 시험되는 폴리펩티드가 기기의 센서 칩에 고정되고, C5 또는 그의 단편을 함유하는 샘플이 칩 상을 통과한다. 당업자는 이때 적어도 폴리펩티드의 C5에 대한 결합의 정량적 척도를 확립하기 위해 상기 실험에 의해 얻어진 결과를 해석할 수 있다. 예를 들어 상호작용에 대한 겉보기 평형 해리 상수 KD를 결정하기 위해 정량적 척도가 요구될 경우, 표면 플라즈몬 공명 방법이 또한 사용될 수 있다. 결합 값은 예를 들어 비아코어 2000 기기 (지이 헬쓰케어)로 정의될 수 있다. C5는 측정 센서 칩 상에 고정되고, 그의 친화도가 결정되는 폴리펩티드의 샘플은 연속 희석에 의해 제조되고, 칩 상에 주입된다. 이어서, KD 값은 예를 들어 기기 제조자에 의해 제공되는 비아이벨류에이션(BIAevaluation) 소프트웨어의 1:1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델을 사용하여 결과로부터 계산될 수 있다. KD 결정에서 사용되는 C5 또는 그의 단편은 예를 들어 서열 760으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 C5 결합 폴리펩티드의 한 실시양태에서, C5 결합 폴리펩티드는 상호작용의 KD 값이 최대 1 x 10-6 M, 예컨대 최대 1 x 10-7 M, 1 x 10-8 M, 또는 1 x 10-9 M이 되도록 C5에 결합한다.
본 발명에 따른 C5 결합 폴리펩티드는 다양한 의료, 수의학 및 진단 용도에서 종래의 항체 또는 저분자량 물질에 대한 대안으로서 사용될 수 있다. 특히, C5 결합 폴리펩티드는 시약의 C5에 대한 친화도를 필요로 하는 임의의 방법에서 유용할 수 있다. 따라서, C5 결합 폴리펩티드는 상기 방법에서 검출 시약, 포획(capture) 시약, 분리 시약, 진단제 또는 치료제로서 사용될 수 있다.
당업자가 알 수 있는 바와 같이, 임의의 폴리펩티드의 기능, 예컨대 본원에서 정의되는 폴리펩티드의 C5 결합 능력은 폴리펩티드의 3차 구조에 의존한다. 따라서, 그의 3차 구조 및 기능에 큰 영향을 주지 않으면서 폴리펩티드의 아미노산 서열에 작은 변화를 만들 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 폴리펩티드는, 생성되는 서열이 i)에 정의된 부류에 속하는 서열에 대해 적어도 89% 동일하도록, 예컨대 i)에 정의된 부류에 속하는 서열에 적어도 93% 동일하도록, 예컨대 적어도 96% 동일하도록 하는 i)의 BM의 변형된 변이체를 포함한다. 예를 들어, 아미노산 잔기의 특정 기능적 분류 (예를 들어 소수성, 친수성, 극성 등)에 속하는 아미노산 잔기가 동일한 기능적 군으로부터의 또 다른 아미노산 잔기로 교체될 수 있는 것이 가능하다.
상기 정의된 C5 결합 폴리펩티드의 또 다른 실시양태에서, 아미노산 서열은 상기 정의된 바와 같은 i), 및 iii) Xn (여기서, n은 2-4, 6-7, 11, 16-18, 21, 25-26 및 28임)에 의해 표시되는 13개의 가변 위치에서 i)에 정의된 서열에 대해 적어도 84% 동일성을 갖고, 위치 1, 5, 8-10, 12-15, 19-20, 22-24, 27 및 29에서 i)에 정의된 서열에 대해 적어도 87% 동일성을 갖는 아미노산 서열로부터 선택된다.
본 발명에 따른 폴리펩티드의 한 실시양태에서, X2는 H, T 및 V로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, X2는 T 및 V로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, X2는 V이다.
본 발명에 따른 폴리펩티드의 한 실시양태에서, X3은 I, L 및 V로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, X3은 I 및 L로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, X3은 I이다. 대안적 실시양태에서, X3은 L이다.
본 발명에 따른 폴리펩티드의 한 실시양태에서, X4는 A, D, E, K, L, Q 및 R로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, X4는 A, D, E, K 및 R로부터 선택된다. 또 다른 관련 실시양태에서, X4는 D 및 E로부터 선택된다.
본 발명에 따른 폴리펩티드의 한 실시양태에서, X6은 W이다.
본 발명에 따른 폴리펩티드의 한 실시양태에서, X7은 A, D, N 및 T로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, X7은 D 및 N으로부터 선택된다. 또 다른 관련 실시양태에서, X7은 D이다. 대안적 실시양태에서, X7은 N이다.
본 발명에 따른 폴리펩티드의 한 실시양태에서, X11은 A, H, K, Q, R 및 S로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, X11은 A, H, K 및 R로부터 선택된다. 또 다른 관련 실시양태에서, X11은 A, K 및 R로부터 선택된다. 또 다른 관련 실시양태에서, X11은 K 및 R로부터 선택된다.
본 발명에 따른 폴리펩티드의 한 실시양태에서, X16은 T이다.
본 발명에 따른 폴리펩티드의 한 실시양태에서, X17은 I 및 L로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, X17은 I이다. 대안적 실시양태에서, X17은 L이다.
본 발명에 따른 폴리펩티드의 한 실시양태에서, X18은 A, D, E, N, Q, S 및 T로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, X18은 A, D, E, Q 및 S로부터 선택된다. 또 다른 관련 실시양태에서, X18은 D, E 및 Q로부터 선택된다. 또 다른 관련 실시양태에서, X18은 D 및 E로부터 선택된다. 또 다른 관련 실시양태에서, X18은 D이다. 대안적 실시양태에서, X18은 E이다.
본 발명에 따른 폴리펩티드의 한 실시양태에서, X21은 I 및 L로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, X21은 I이다. 대안적 실시양태에서, X21은 L이다.
본 발명에 따른 폴리펩티드의 한 실시양태에서, X25는 E, H, N 및 T로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, X25는 E 및 N으로부터 선택된다. 또 다른 관련 실시양태에서, X25는 N이다.
본 발명에 따른 폴리펩티드의 한 실시양태에서, X26은 K이다.
본 발명에 따른 폴리펩티드의 한 실시양태에서, X28은 A, D, E, H, N, Q 및 S로부터 선택된다. 상기 개시될 폴리펩티드의 또 다른 실시양태에서, X28은 A, D, E 및 S로부터 선택된다. 또 다른 관련 실시양태에서, X28은 A, D 및 E로부터 선택된다. 또 다른 관련 실시양태에서, X28은 D 및 E로부터 선택된다. 또 다른 관련 실시양태에서, X28은 D이다.
본 발명에 따른 폴리펩티드의 한 실시양태에서, X3X4는 LE 및 LD로부터 선택된다.
본 발명에 따른 폴리펩티드의 한 실시양태에서, X17X18은 IE 및 LD로부터 선택된다.
제1 측면의 상기 실시양태에서, 폴리펩티드의 부류 내에 포함되는 C5 결합 폴리펩티드의 예가 확인된다. 상기 개별적인 실시양태는 생각할 수 있는 모든 방식으로 조합될 수 있고 본 발명의 범위에 계속 포함됨이 고려된다. 상기 개별적인 실시양태의 조합은 i)에서의 아미노산 정의에 비해 위치 X2-X28 중의 하나 이상에서 제한된 아미노산 서열을 정의한다.
C5 결합 폴리펩티드의 상기 실시양태는 예를 들어 아미노산 i)이 다음 8개의 조건 I-VIII:
I. X2는 V임;
II. X3은 I 및 L로부터 선택됨;
III. X6은 W임;
IV. X7은 D 및 N으로부터 선택됨;
V. X17은 I 및 L로부터 선택됨;
VI. X21은 L임;
VII. X25는 N임;
VIII. X28은 D임
중 적어도 4개를 충족하도록 조합될 수 있다.
제1 측면에 따른 C5 결합 폴리펩티드의 일부 예에서, 아미노산 서열 i)은 8개의 조건 I-VIII 중 적어도 5개를 충족한다. 보다 구체적으로, 아미노산 서열 i)은 8개의 조건 I-VIII 중 적어도 6개, 상기 8개의 조건 I-VIII 중 적어도 7개, 예컨대 모든 8개의 조건 I-VIII을 충족할 수 있다.
하기 실시예에서 설명되는 바와 같이, C5 결합 변이체의 선택을 통해 개별적인 C5 결합 모티프 (BM) 서열을 확인하였다. 상기 서열은 상기 측면에 따른 C5 결합 폴리펩티드의 개별적인 실시양태를 구성한다. 개별적인 C5 결합 모티프는 도 1에 및 서열 1-248로서 제시된다. 상기 측면의 일부 실시양태에서, BM 서열 i)은 서열 1-12, 서열 20, 서열 23-24, 서열 26-28, 서열 32-35, 서열 38-39, 서열 41, 서열 46, 서열 49, 서열 56-57, 서열 59, 서열 66, 서열 78-79, 서열 87, 서열 92, 서열 106, 서열 110, 서열 119, 서열 125, 서열 141, 서열 151, 서열 161, 서열 166, 서열 187, 서열 197, 서열 203, 서열 205, 서열 215 및 서열 243 중 어느 하나로부터 선택된다. 보다 구체적으로, BM 서열 i)은 서열 1-12, 예컨대 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4 및 서열 5 중 어느 하나로부터 선택된다. 특히, BM 서열 i)은 서열 1 및 서열 4로부터 선택될 수 있다.
특정 실시양태에서, C5 결합 모티프 (BM)는 3개-나선 다발 단백질 도메인의 일부를 형성한다. 예를 들어, BM은 본질적으로 상기 3개-나선 다발 단백질 도메인 내에서, 상호연결 루프를 갖는 2개의 알파 나선을 구성할 수 있다.
3개-나선 다발 단백질 도메인은 또 다른 실시양태에서 박테리아 수용체 단백질의 도메인으로부터 선택된다. 상기 도메인의 비제한적인 예는 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 단백질 A의 5개의 상이한 3개-나선 도메인, 예컨대 도메인 B 및 그의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 3개-나선 다발 단백질 도메인은 스타필로코쿠스 단백질 A의 상기 도메인 B로부터 유래된 단백질 Z의 변이체이다.
본 발명의 C5 결합 폴리펩티드가 3개-나선 다발 단백질 도메인의 일부를 형성하는 실시양태에서, C5 결합 폴리펩티드는
i) K-[BM]-DPSQS XaXbLLXc EAKKL NDXdQ
상기 서열에서,
[BM]은 상기 정의된 바와 같은 C5 결합 모티프이고;
Xa는 A 및 S로부터 선택되고;
Xb는 N 및 E로부터 선택되고;
Xc는 A, S 및 C로부터 선택되고;
Xd는 A 및 S로부터 선택됨; 및
ii) 상기 정의된 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 79% 동일성을 갖는 아미노산 서열
로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 아미노산 서열은 상기 정의된 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 81%, 예컨대 적어도 83%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 87%, 예컨대 적어도 89%, 예컨대 적어도 91%, 예컨대 적어도 93%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 97% 동일성을 가질 수 있다.
상기 정의된 C5 결합 폴리펩티드의 한 실시양태에서, Xa는 A이다. 상기 정의된 C5 결합 폴리펩티드의 대안적 실시양태에서, Xa는 S이다.
상기 정의된 C5 결합 폴리펩티드의 한 실시양태에서, Xb는 N이다. 대안적 실시양태에서, Xb는 E이다.
상기 정의된 C5 결합 폴리펩티드의 한 실시양태에서, Xc는 A이다. 대안적 실시양태에서, Xc는 S이다. 또 다른 대안적 실시양태에서, Xc는 C이다.
상기 정의된 C5 결합 폴리펩티드의 한 실시양태에서, Xd는 A이다. 대안적 실시양태에서, Xd는 S이다.
상기 정의된 C5 결합 폴리펩티드의 한 실시양태에서, Xa는 A이고; Xb는 N이고; Xc는 A이고 Xd는 A이다.
상기 정의된 C5 결합 폴리펩티드의 추가의 실시양태에서, Xa는 A이고; Xb는 N이고; Xc는 C이고 Xd는 A이다.
상기 정의된 C5 결합 폴리펩티드의 추가의 실시양태에서, Xa는 S이고; Xb는 E이고; Xc는 S이고 Xd는 S이다.
상기 정의된 C5 결합 폴리펩티드의 추가의 실시양태에서, Xa는 S이고; Xb는 E이고; Xc는 C이고 Xd는 S이다.
추가의 실시양태에서, 상기 정의된 C5 결합 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열 249-496, 특히 서열 249-260, 서열 268, 서열 271-272, 서열 274-276, 서열 280-283, 서열 286-287, 서열 289, 서열 294, 서열 297, 서열 304-305, 서열 307, 서열 314, 서열 326-327, 서열 335, 서열 340, 서열 354, 서열 358, 서열 367, 서열 373, 서열 389, 서열 399, 서열 409, 서열 414, 서열 435, 서열 445, 서열 451, 서열 453, 서열 463 및 서열 491, 예컨대 서열 249-260으로부터 선택된다. 추가의 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열 249, 서열 250, 서열 251, 서열 252 및 서열 253, 예컨대 서열 249 및 서열 252로부터 선택된다.
따라서, 추가의 실시양태에서,
i) YAK-[BM]-DPSQS SELLXC EAKKL NDSQA P
상기 서열에서,
[BM]은 상기 정의된 C5 결합 모티프이고 Xc는 S 및 C로부터 선택됨; 및
ii) 상기 i)에 정의된 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 81% 동일성을 갖는 아미노산 서열
로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 C5 결합 폴리펩티드가 제공된다.
대안적으로,
i) FNK-[BM]-DPSQS ANLLXC EAKKL NDAQA P
상기 서열에서,
[BM]은 상기 정의된 C5 결합 모티프이고 Xc는 A 및 C로부터 선택됨; 및
ii) 상기 i)에 정의된 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 81% 동일성을 갖는 아미노산 서열
로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 C5 결합 폴리펩티드가 제공된다.
상기 논의된 바와 같이, 3차 구조 및 그의 기능에 큰 영향을 주지 않으면서 상기 아미노산 서열에 비해 작은 변화를 포함하는 폴리펩티드도 본원의 범위 내에 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 상기 정의된 C5 결합 폴리펩티드는 예를 들어 i)에 정의된 서열에 대해 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 86%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 94%, 적어도 96% 또는 적어도 98% 동일한 서열을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서 및 하기 실시예에서 개시되는 바와 같이, C5 결합 모티프는 58 또는 60개 아미노산의 폴리펩티드의 일부를 형성할 수 있다. 그러한 폴리펩티드는 예를 들어 서열 497-757 중 어느 하나로부터 선택되는 서열, 특히 서열 497-508, 서열 516, 서열 519-520, 서열 522-524, 서열 528-531, 서열 534-535, 서열 537, 서열 542, 서열 545, 서열 552-553, 서열 555, 서열 562, 서열 574-575, 서열 583, 서열 588, 서열 602, 서열 606, 서열 615, 서열 621, 서열 637, 서열 647, 서열 657, 서열 662, 서열 683, 서열 693, 서열 699, 서열 701, 서열 711, 서열 739 및 서열 745-757 중 어느 하나로부터 선택되는 서열, 예컨대 서열 497-508 및 서열 745-757부터 선택되는 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열 497, 서열 498, 서열 499, 서열 500, 서열 501, 서열 746, 서열 747, 서열 748, 서열 750 및 서열 753 중 어느 하나로부터, 예컨대 서열 497, 서열 500, 서열 748 및 서열 753 중 어느 하나로부터 선택된다.
C5에 대한 분자의 결합이 C5의 절단을 반드시 억제하는 것은 아니다. 억제는 결합 부위에 따라 결정되고, C5의 특이적 영역과의 상호작용이 어떠한 효과를 갖는지 완전히 명확하지는 않기 때문에, 일부 C5 결합 분자는 그의 C5a 및 C5b로의 절단을 억제하지 않으면서 C5와 상호작용할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, C5 결합 폴리펩티드는 예를 들어 포유동물 대상체에게 투여될 때 C5의 절단을 억제한다. 본 발명에 따른 C5 결합 폴리펩티드는 보다 구체적으로 인간 대상체에게 투여될 때 인간 C5의 절단을 억제한다.
C5의 구조는 종 사이에서 다소 다르고, 따라서 한 종의 C5에 결합하는 것으로 밝혀진 C5 결합제는 또 다른 종에서 불활성일 수 있다. 인간화 항체 에쿨리주맙은 예를 들어 종종 MG7로 언급되는 C5의 도메인에 결합한다. 상기 영역은 종 사이에서 매우 가변적이고, 따라서 에쿨리주맙 결합은 인간 C5로 제한된다. 그러나, 본 발명의 C5 결합 폴리펩티드는 인간 C5로 제한되지 않고, 하기 실시예에서 입증되는 바와 같이 동물 모델에서도 활성을 보인다.
당업자는 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 폴리펩티드를 특이적 용도에 적합하게 만들기 위해서 본원에 개시된 임의의 측면에 따른 C5 결합 폴리펩티드에 대한 다양한 변형 및/또는 첨가가 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 임의의 측면에 따른 C5 결합 폴리펩티드는 추가의 C 말단 및/또는 N 말단 아미노산을 포함할 수 있다. 그러한 폴리펩티드는 폴리펩티드 쇄 내의 제1 및/또는 마지막 위치에, 즉 N- 및/또는 C-말단에 추가의 아미노산 잔기를 갖는 폴리펩티드로서 이해되어야 한다. 따라서, C5 결합 폴리펩티드는 임의의 적합한 수의 추가의 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 하나의 추가의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 각각의 추가의 아미노산 잔기는 예를 들어 폴리펩티드의 생산, 정제, 생체내 또는 시험관내 안정화, 커플링 또는 검출을 개선하기 위해서 개별적으로 또는 집단적으로 부가될 수 있다. 상기 추가의 아미노산 잔기는 화학적 커플링을 위해 부가된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 그의 한 예는 시스테인 잔기의 부가이다. 상기 부가되는 아미노산 잔기는 또한 폴리펩티드의 정제 또는 검출을 위한 "태그", 예컨대 His6 태그 또는 "myc" (c-myc) 태그 또는 태그 또는 고정된 금속 친화도 크로마토그래피 (IMAC) (His6-태그의 경우)에 특이적인 항체와의 상호작용을 위한 "FLAG" 태그를 제공할 수 있다.
상기 논의된 바와 같은 추가의 아미노산은 화학적 접합 (공지의 유기 화학 방법 사용)에 의해 또는 임의의 다른 수단, 예컨대 C5 결합 폴리펩티드의 융합 단백질로서의 발현에 의해 C5 결합 폴리펩티드에 커플링될 수 있다.
상기 논의된 바와 같은 추가의 아미노산은 예를 들어 하나 이상의 폴리펩티드 도메인(들)을 포함할 수 있다. 추가의 폴리펩티드 도메인은 C5 결합 폴리펩티드에게 또 다른 기능, 예를 들어 또 다른 결합 기능, 또는 효소 기능, 또는 독성 기능 (예를 들어 면역독소), 또는 형광 신호전달 기능, 또는 이들의 조합을 제공할 수 있다.
추가의 폴리펩티드 도메인은 또한 C5 결합 폴리펩티드에게 동일한 결합 기능을 제공할 수 있다. 따라서, 추가의 실시양태에서, 그의 아미노산 서열이 동일하거나 상이할 수 있는 적어도 2개의 C5 결합 폴리펩티드 단량체 단위를 포함하는 C5 결합 폴리펩티드가 제공된다. 폴리펩티드의 다량체 형태는 적합한 수의 도메인을 포함할 수 있고, 이들은 각각 C5 결합 모티프를 갖고, 각각 다량체 내의 "단량체"를 형성한다. 상기 도메인은 모두 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있지만, 대안적으로 상이한 아미노산 서열을 가질 수도 있다. 특히, 본 발명의 C5 결합 폴리펩티드는 동종이량체 또는 이종이량체를 형성할 수 있다.
상기 설명된 추가의 폴리펩티드 도메인(들)은 공지의 유기 화학 방법을 사용하여 공유 커플링에 의해 C5 결합 폴리펩티드에 연결될 수 있다. 대안적으로, 추가의 폴리펩티드 도메인(들)을 포함하는 C5 결합 폴리펩티드는 예를 들어 폴리펩티드의 재조합 발현을 위한 시스템에서 하나 이상의 융합 폴리펩티드로서 발현될 수 있거나, 또는 직접 또는 링커, 예를 들어 아미노산 링커를 통해 임의의 다른 방식으로 연결될 수 있다.
일부 실시양태에서, 추가의 폴리펩티드 도메인(들)은 생체내에서 C5 결합 폴리펩티드의 반감기를 증가시키는 반감기 연장 모이어티(moiety)를 포함할 수 있다. 당업자에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 증가된 또는 연장된 반감기는 혈액으로부터 특정 분자의 보다 느린 클리어런스를 의미한다. 특정 폴리펩티드의 생체내 반감기를 연장하기 위한 많은 공지의 전략, 예컨대 항체의 Fc 도메인에 대한 커플링 (Fc 접합) 또는 알부민에 대한 커플링이 존재한다. 또 다른 예는 반감기 연장 모이어티, 예를 들어 생체내에서 혈청 알부민에 회합할 펩티드 또는 단백질에 대한 커플링이다. 특히, 반감기 연장 모이어티는 알부민 결합 모이어티일 수 있다. 알부민 결합 모이어티는 예를 들어 자연 발생 폴리펩티드, 또는 그의 알부민 결합 단편, 또는 조작된 폴리펩티드로 이루어질 수 있다. 조작된 폴리펩티드는 신규한 또는 향상된 특성, 예컨대 분자, 예컨대 알부민에 대한 결합 친화도를 생성하기 위해 단백질 조작 기술, 예컨대 부위-지정 또는 무작위 방법에 의한 돌연변이 및 변경에 적용함으로써 자연 발생 출발 폴리펩티드로부터 유도될 수 있다. 상기 조작된 알부민 결합 폴리펩티드는 예를 들어 알부민에 대한 그의 특이적 결합 친화도에 대해 선택된, 단백질 스캐폴드의 변이체일 수 있다. 특이적 실시양태에서, 단백질 스캐폴드는 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 단백질 G의 도메인 또는 그의 유도체, 예컨대 스트렙토코쿠스 균주 G148로부터의 단백질 G의 도메인 GA1, 도메인 GA2 및 도메인 GA3, 특히 도메인 GA3으로부터 선택될 수 있다.
따라서, C5 결합 폴리펩티드의 한 실시양태에서, 추가의 아미노산은 생체내에서 또는 시험관내에서 안정화를 개선하고, 스트렙토코쿠스 단백질 G의 알부민 결합 도메인 (ABD) 또는 그의 유도체를 포함한다. 본 발명의 C5 결합 폴리펩티드 내에 추가의 폴리펩티드 도메인으로서 포함될 수 있는 알부민 결합 도메인의 한 예는 서열 759에 제시된다. 적합한 알부민 결합 도메인의 다른 예는 WO 2009/016043 및 WO 2012/004384에 개시되어 있다. 상기 ABD-연장된 폴리펩티드는 생체내에서 혈청 알부민에 결합하고, 폴리펩티드 자체의 순 반감기를 증가시키는 그의 보다 긴 반감기로부터 이득을 얻는다 (예를 들어 WO 91/01743 참조). 따라서, 상기 정의된 알부민 결합 모이어티를 포함하는 C5 결합 폴리펩티드의 약동학적 프로파일은 예를 들어 포유동물 대상체에게 투여될 때 혈청 알부민의 것과 유사하다. ABD 및 그의 유도체는 인간 혈청 알부민 (HSA)에 뿐만 아니라 다른 종, 예컨대 마우스 및 래트로부터의 혈청 알부민에 매우 강하게 결합한다.
스트렙토코쿠스 단백질 G의 ABD는 길이가 46개 아미노산이고, 따라서 본 발명에 따른 C5 결합 폴리펩티드가 ABD 모이어티 또는 그의 유도체를 포함할 때, C5 결합 폴리펩티드의 총 크기는 비교적 작다. 예를 들어, 포유동물 대상체, 예컨대 인간 대상체에게 투여될 때, C5 결합 폴리펩티드의 알부민 결합 부분은 혈청 알부민과 비-공유적으로 회합할 것이고, 이에 의해 폴리펩티드는 감소된 신장 클리어런스 및 상피 세포 내의 증가된 재순환으로부터 이득을 볼 수 있다. 그러나, 조직 투과는 혈청 알부민의 분출 특성에 의해 계속 빨라질 수 있다. 또한, 반감기 연장 모이어티를 포함하는 C5 결합 폴리펩티드는 상응하는 반감기 연장 모이어티가 결여된 폴리펩티드에 비해 생체내에서 연장된 반감기 뿐만 아니라, 생체내에서 감소된 면역 반응을 보일 수 있다 (예를 들어 WO 2005/097202 참조).
관련 측면에서, 상기 항들 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 C5 결합 폴리펩티드, 스트렙토코쿠스 단백질 G의 적어도 하나의 알부민 결합 도메인 또는 그의 유도체, 및 상기 적어도 하나의 C5 결합 폴리펩티드의 C 또는 N 말단에 상기 적어도 하나의 도메인 또는 그의 유도체를 연결하기 위한 적어도 하나의 연결 모이어티를 포함하는 C5 결합 화합물이 제공된다. 상기 C5 결합 화합물은 예를 들어 포유동물 대상체에게 투여될 때 생체내에서 C5 및 혈청 알부민에 대한 높은 친화도를 갖고, 혈청 알부민에 대한 결합은 하기 실시예에서 예시되는 바와 같이 C5와의 상호작용을 저해하지 않는다.
한 실시양태에서, C5 결합 화합물은 다음으로부터 선택되는 구조를 갖는다:
[CBP1]-[L1]-[ALBD];
[CBP1]-[CBP2]-[L1]-[ALBD];
[CBP1]-[L1]-[ALBD]-[L2]-[CBP2];
[ALBD]-[L1]-[CBP1];
[ALBD]-[L1]-[CBP1]-[CBP2];
[CBP1]-[L1]-[CBP2]-[L2]-[ALBD]; 및
[ALBD]-[L1]-[CBP1]-[L2]-[CBP2]
여기서, 서로 독립적으로,
[CBP1] 및 [CBP2]는 동일하거나 상이할 수 있는 C5 결합 폴리펩티드이고;
[L1] 및 [L2]는 동일하거나 상이할 수 있는 연결 모이어티이고;
[ALBD]는 스트렙토코쿠스 단백질 G의 알부민 결합 도메인 또는 그의 유도체이다.
바람직한 C5 결합 화합물은 다음으로부터 선택되는 구조를 갖는다:
[CBP1]-[CBP2]-[L1]-[ALBD];
[CBP1]-[L1]-[ALBD]-[L2]-[CBP2]; 및
가장 바람직하게는, [CBP1]-[L1]-[ALBD].
상기 C5 결합 화합물에서 사용될 수 있는 연결 모이어티의 예는 G, GS; [G2S]n; [G3S]n; [G4S]n; GS[G4S]n (여기서, n은 0-7임 (바람직하게는, n은 0-2임)); [S2G]m; [S3G]m; [S4G]m (여기서, m은 0-7임), 및 VDGS로부터 선택된다. 바람직한 링커는 GS 및 GS[G4S]2이다.
C5 결합 화합물에 포함될 수 있는 알부민 결합 도메인 또는 그의 유도체의 예는 상기 설명한 바와 같다. 특히, 알부민 결합 도메인의 일례는 서열 759에 제시된다.
특히 바람직한 C5 결합 화합물은 구조 [CBP1]-[L1]-[ALBD]를 갖고, 여기서 [CBP1]은 서열 748 및 서열 753으로부터 선택되는 폴리펩티드이고, [L1]은 GS이고, [ALBD]는 서열 759에 제시된 폴리펩티드이다.
C5 결합 폴리펩티드에 포함된 C5 결합 폴리펩티드(들)은 한 실시양태에서 이전에 설명된 58량체 또는 60량체 C5 결합 폴리펩티드로부터 독립적으로 선택된다. 특히, C5 결합 화합물은 서열 497-508, 서열 516, 서열 519-520, 서열 522-524, 서열 528-531, 서열 534-535, 서열 537, 서열 542, 서열 545, 서열 552-553, 서열 555, 서열 562, 서열 574-575, 서열 583, 서열 588, 서열 602, 서열 606, 서열 615, 서열 621, 서열 637, 서열 647, 서열 657, 서열 662, 서열 683, 서열 693, 서열 699, 서열 701, 서열 711, 서열 739 및 서열 746-757 중 어느 하나로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 C5 결합 폴리펩티드, 예컨대 서열 497-508 및 서열 746-757로부터 선택되는 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열 497, 서열 498, 서열 499, 서열 500, 서열 501, 서열 746, 서열 747, 서열 748, 서열 750 및 서열 753, 예컨대 서열 497, 서열 500, 서열 748 및 서열 753 중 어느 하나로부터 선택된다.
추가의 측면에서, C5 결합 폴리펩티드 또는 상기 설명된 화합물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터는 예를 들어 숙주 세포 내에서의 발현에 의한 C5 결합 폴리펩티드 또는 C5 결합 화합물의 생산을 가능하게 할 수 있다.
본 발명에 따른 C5 결합 폴리펩티드가 그 자체의 능력에 의해 치료제 또는 진단제로서 또는 예를 들어 보체 단백질 C5에 대해 직접적인 또는 간접적인 효과를 갖는 다른 치료제 또는 진단제를 표적화하기 위한 수단으로서 유용할 수 있음이 이해되어야 한다. 직접적인 치료 효과는 예를 들어 C5 절단을 억제함으로써 달성될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 C5 결합 폴리펩티드 또는 C5 결합 화합물과 치료제와의 조합물이 제공된다. 상기 조합물에 유용한 것으로 입증될 수 있는 치료제의 비제한적인 예는 면역자극제 및 방사성 핵종이다.
따라서, 그 자체로서의 C5 결합 폴리펩티드 또는 본 발명에 따른 C5 결합 화합물 또는 조합물에 포함된 C5 결합 폴리펩티드는, 한 실시양태에서 요법에 사용하기 위해, 예를 들어 C5 관련 병태, 예컨대 포유동물, 예컨대 인간 대상체에서의 C5 관련 병태의 치료를 위해 제공된다. 한 실시양태에서, 상기 C5 관련 병태는 염증성 질환, 예컨대 항원-유도 관절염, 패혈증, 윤활막 염증, 혈관염 및 천식; 자가면역 질환, 예컨대 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 한랭 응집소 질환, 류마티스 관절염, 다발성 경화증 (MS), 쇼그렌 증후군, 피부근염, 중증 근무력증 및 다른 자가항체 유도 질환, 예컨대 길랑-바레 증후군 (GBS), 피셔 증후군, 전신 경화증, 항-사구체 기저막 (항-GBM) 및 항-인지질 증후군 (APS); 감염성 질환, 예컨대 용혈성-요독성 증후군 (HUS), 바이러스 감염, 박테리아 감염 및 진균 감염; 심혈관 질환, 예컨대 (급성) 심근경색 (섬유소용해 또는 경피 관상동맥 개입 (PCI)에 의해 재혈관화를 겪음); 신경변성 장애, 예컨대 알츠하이머병 (AD), 헌팅톤병, 크로이츠펠트-야콥병 및 파킨슨병; 암; 상처; 이식편 손상, 예컨대 허혈 재관류 손상 (IRI) 및 급성 항체 매개 거부 (AMR); 안 질환, 예컨대 노화 관련 황반 변성 (AMD), 포도막염, 당뇨병성 안구 질환 및 장애, 및 미숙아 망막병증; 신장 질환, 예컨대 막성 사구체신염, 막성 신염, 이뮤노글로불린 A 신병증, 루푸스 신염, 굿패스쳐(Goodpasture) 증후군 및 스트렙토코쿠스 감염후 사구체신염; 폐 질환, 예컨대 성인 호흡 곤란 증후군, 만성 폐쇄성 폐 질환 및 낭성 섬유증; 혈액 질환, 예컨대 용혈성 빈혈, 발작성 한랭 혈색소뇨, 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS) 및 발작성 야간 혈색소뇨 (PNH); 알레르기성 질환, 예컨대 아나필락시스성 쇼크, 알레르기 및 천식; 및 피부과 질환, 예컨대 천포창, 수포성 유천포창, 광독성 반응 및 건선으로부터 선택된다. 보다 특정한 실시양태에서, 본 발명에 따른 C5 결합 폴리펩티드, 화합물 또는 조합물은 발작성 야간 혈색소뇨 (PNH)의 치료를 위해 사용된다.
상기 배경 섹션에서 장기 이식을 논의할 때 언급한 바와 같이, 공여자와 수여자 사이의 차이 (예를 들어 ABO 및 MCH 부류) 및 이식 장기의 상태는 이식 장기의 기능 지연 또는 심지어 거부를 야기할 수 있다. 따라서, 치료는 양성 공여자-수여자 교차매치(crossmatch)에도 불구하고 항-공여자 항체를 제거하거나 또는 ABO 장벽에도 불구하고 이식이 수행될 때 ABO 항체를 제거하기 위해 필요할 수 있다. 상기 치료는 일반적으로 이식 또는 혈장분리반출술의 전 및 후에, 예를 들어 친화도 크로마토그래피 기술의 사용에 의한 면역흡착을 포함한다. 그러나, 상기 절차는 치료 항체를 비롯하여 순환계에 존재하는 거의 모든 항체를 제거할 위험이 있다. 그러나, 본 발명의 C5 결합 폴리펩티드 또는 화합물은 임의의 항체 제거 절차에 의해 영향받지 않고, 따라서 상기 치료에 이용될 수 있다.
쉽게 접근가능한 조직, 예컨대 폐 및 혈류에서 보다 국소적인 급성 병리상태가 전신 병리상태보다 우세한 몇몇 C5 관련 병태에서, 반감기가 매우 짧은 약물이 느리게 제거되는 것보다 유리할 수 있다. 따라서, 상기 C5 관련 병태에서, 반감기 연장 모이어티가 없는 C5 결합 폴리펩티드가 유리할 수 있다. 앞에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 C5 결합 폴리펩티드는 그의 비교적 작은 크기 때문에 포유동물, 예컨대 인간에게 투여될 때 비교적 신속한 약동학적 프로파일을 보일 것이다. 본 발명에 따른 C5 결합 폴리펩티드는 C5 관련 병태, 예컨대 천식 (문헌 [Zhang et al. Expert Rev Clin Immunol 2010, 6:269-277]), 패혈증 (문헌 [Ward et al. The Sci World J 2010, 10:2395-2402]), 및 C 활성화-관련 위알레르기 (CARPA, 매우 드문 경우에 생명을 위협하는 심폐 이상을 야기할 수 있는 특정 치료 리포솜 및 지질 부형제-기반 약물)를 포함하는 과민성 증후군 (문헌 [Szebeni et al. Adv Drug Delivery Rev 2011, 63: 1020-1030])의 치료에 잠재적으로 활성을 보일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 C5 결합 폴리펩티드는 수혈 수여자가 부적합한 종류의 혈액을 받을 때 보체 억제를 위해 사용될 수 있다 (높은 사망률과 관련된, 미국에서 약 1:14000 수혈 단위에서 발생하는 상황, 문헌 [Goodnough et al. Lancet 2003, 361:161-169]).
관련 측면에서, C5 결합 폴리펩티드 또는 상기 설명한 조합물을 치료를 필요로 하는 포유동물 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, C5 관련 병태의 치료 방법이 제공된다. 따라서, 치료 방법에서, 대상체는 본 발명에 따른 C5 결합 폴리펩티드, C5 결합 화합물 또는 조합물로 치료된다. 상기 방법의 보다 특이적 실시양태에서, 대상체의 세포 표면 상에 발현된 C5에 대한 C5 결합 폴리펩티드 또는 조합물의 결합은 C5 절단을 억제한다. 치료 방법의 한 실시양태에서, C5 관련 병태는 염증성 질환; 자가면역 질환; 감염성 질환; 심혈관 질환; 신경변성 장애; 암; 상처; 이식편 손상; 안 질환; 신장 질환; 폐 질환; 혈액 질환; 알레르기성 질환 및 피부과 질환으로부터 선택된다. 특히, C5 관련 병태는 본 발명에 따른 C5 결합 폴리펩티드, 화합물 또는 조합물의 치료 용도와 관련하여 상기 정의된 바와 같을 수 있다. C5 관련 병태는 예를 들어 발작성 야간 혈색소뇨 (PNH)일 수 있다. 치료 방법의 한 실시양태에서, 상기 C5 결합 폴리펩티드 정맥내, 피하, 흡입에 의해, 비내, 경구, 유리체내, 또는 국소 투여된다.
이제 본 발명을 다음 비-제한적인 실시예에 의해 추가로 예시할 것이다.
도 1은 본 발명의 C5 결합 폴리펩티드에 포함되는 C5 결합 모티프의 예 (서열 1-248), 본 발명에 따른 49량체 C5 결합 폴리펩티드의 예 (서열 249-496), 본 발명에 따른 58량체 C5 결합 폴리펩티드의 예 (서열 497-744) 및 본 발명에 따른 60량체 C5 결합 폴리펩티드의 예 (서열 745-757)의 아미노산 서열, 및 단백질 Z의 서열 (서열 758), 알부민 결합 도메인 (ABD094, 서열 759), 인간 C5의 스위스-프로트(Swiss-Prot) 등록 P01031 (아미노산 잔기 1-1676, 서열 760, 그의 α-쇄는 아미노산 잔기 678-1676에 상응하고, β-쇄는 아미노산 잔기 19-673에 상응함), 주형으로서 인간 C5를 사용하여 게놈 서열로부터 유도된 본원에서 사용된 His6-태그부착된(tagged) 진드기 단백질 OmCI (서열 761) 및 시노몰구스(cynomolgus) C5 (서열 762)의 서열 (www.ebi.ac.uk/ena에서 온라인 공개됨; [Ebeling et al. (2001) Genome Res. 21(10):1746-1756])의 목록이다. 서열은 위치 63 및 1346에 2개의 미지의 아미노산 "X"를 함유한다.
도 2는 실시예 2에서 설명되는 비아코어 기기에서 수행된 전형적인 결합 분석의 결과를 보여준다. 센서그램은 각각 고정된 이량체 Z 변이체 (Z05477, 서열 509) 상에 인간 C5 (hC5; 흑색 실선 곡선), 시노몰구스 C5 (cC5; 흑색 짧은-파선 곡선), 래트 C5 (rC5; 흑색 긴-파선 곡선), 인간 MG7 도메인 (hMG7; 회색 점선 곡선), 및 인간 이뮤노글로불린 G (hIgG; 회색 실선 곡선)의 주입에 의해 얻었다.
도 3은 선택된 성숙된 Z 변이체에 대해, 각각 hC5 및 rC5에 대한 ELISA에서의 반응을 보여주는 막대 그래프이다. 흑색 막대는 실시예 4에서 설명되는 바와 같이 각각의 Z 변이체에 대해 0.05 ㎍/ml hC5를 사용하여 얻은 450 nm에서의 흡광도 (각각의 군에서 좌측 막대) 및 4 ㎍/ml rC5를 사용하여 얻은 450 nm에서의 흡광도 (각각의 군에서 우측 막대)에 대응한다. Z 변이체 Z05363 (서열 510)에 대한 반응을 양성 대조군으로서 플로팅한다.
도 4는 ABD094 (서열 759)에 임의로 연결된, 서열 745-757로부터 선택된 하나 또는 몇 개의 C5 결합 Z 변이체를 포함하는 상이한 구축물을 도식적으로 보여준다.
도 5는 실시예 6에서 설명되는 바와 같이, 인스턴트 블루(Instant Blue)로 가시화된 정제된 C5 결합 Z 변이체 (환원 상태)의 SDS-PAGE 분석을 보여준다. A)는 상이한 Z-ABD 융합 단백질 (여기서 Z는 GS 링커에 의해 ABD094 (서열 759)에 융합된 서열 745 (레인 2), 서열 748-757 (레인 4-13)과 동일함)과 비교한 이량체 Z-Z-ABD (레인 1, 여기서, Z는 서열 745과 동일하고 ABD는 서열 759와 동일함)의 일례를 나타내고; B)는 상이한 구축물 내의 하나의 C5 결합 Z 변이체 (서열 753)를 나타내고, C)는 단량체 형태 (레인 6-7) 및 GS(G4S)2 링커를 통한 ABD094 (서열 759)와의 융합체 (레인 2-5)로서 2개의 상이한 C5 결합 Z 변이체 (서열 748, 레인 2-3 및 6; 및 서열 753, 레인 4-5 및 7)를 나타낸다.
도 6a 및 b는 실시예 6에서 설명되는 용혈 검정에서 볼 수 있는 바와 같이 보체 활성화를 억제하는 상이한 C5 결합 Z 변이체의 효능에 대한 용량-반응 특성화의 예시적인 데이터를 보여주는 도표이다. C5 결핍 혈청을 63배 희석하고, 0.1 nM hC5로 보충하였다. a)는 상이한 Z-ABD 융합 단백질 (GS 링커에 의해 ABD094 (서열 759)에 융합된 서열 745, 서열 748-753 및 서열 756에 상응하는 Z 변이체)의 hC5에 대한 효과를 보여주고, b)는 C5 결합 진드기 단백질 OmCI (서열 761)와 비교하여, 단량체 또는 이량체로서, ABD094 (서열 759)와의 융합체로서, 또는 His6-태그 (6개의 히스티딘 잔기)가 제공된 형태로서 동일한 C5 결합 Z 변이체 (Z06175a, 서열 753)를 포함하는 상이한 C5 결합 구축물의 효과를 보여준다.
도 7a 및 b는 실시예 6에서 설명되는 치환(displacement) ECL 기술을 기초로 한 평형 결합의 예시적인 데이터를 보여주는 도표이다. 도 7a는 진드기 단백질 OmCI (서열 761)의 C5 결합과 비교한, ABD094 (서열 759)와 융합된 상이한 Z 변이체 (서열 745, 서열 748-757)의 C5 결합을 보여준다. 도 7b는 단량체 또는 이량체로서, ABD094 (서열 759)와의 융합체로서, 또는 His6-태그가 제공된 형태로서 동일한 C5 결합 Z 변이체 (서열 753)를 포함하는 상이한 C5 결합 구축물의 결합을 보여준다.
도 8a 및 8b는 실시예 7에서 설명되는 바와 같이 연구된 Z-ABD 변이체와 인간 혈청 알부민 (HSA) 사이의 상호작용을 보여준다. a) Z-ABD (GS 링커에 의해 ABD094 (서열 759)에 융합된 Z06175a (서열 753))을 등몰량의 HSA (1)과 함께 예비인큐베이션된 크기 배제 크로마토그래피 (SEC). 비교를 위해, HSA 단독 (2) 및 Z-ABD 단독 (3)에 대한 크로마토그램도 그래프에 제시된다. b) HSA 코팅된 표면 상에 주입된, Z-ABD 및 Z-ABD-Z (각각 구축물 2 및 구축물 5에서 도 4에 구체화된 링커에 의해 ABD094 (서열 759)에 융합된 Z06175a (서열 753))의 비아코어 센서그램. 각각의 2개의 구축물은 25, 100 및 400 nM의 농도에서 주입되었다.
도 9는 실시예 8에서 설명되는 바와 같이 정맥내 (i.v., 0.25 μmol/kg) 및 피하 (s.c., 0.5 μmol/kg) 투여 후에 시간이 흐르면서 수컷 스프라그 돌리(Sprague Dawley) 래트에서 C5 결합 화합물 Z-ABD 및 Z-ABD-Z (각각 구축물 2 및 구축물 5에서 도 4에 구체화된 링커에 의해 ABD094 (서열 759)에 융합된 Z06175a (서열 753))의 약동학적 프로파일을 보여주는 도표이다. 각각의 데이터 점은 i.v. 투여된 동물에 대해 투여 후 5분 내지 2주 및 s.c. 투여된 동물에 대해 투여 후 15분 내지 2주 범위의 특정 시점에서 3마리의 개별적인 동물의 평균을 나타낸다.
도 10은 실시예 8에서 설명되는 바와 같이 Z-ABD (GS 링커에 의해 ABD094 (서열 759)에 융합된 Z06175a (서열 753))의 정맥내 (i.v.; 0.25 μmol/kg) 투여 후에 스프라그 돌리 래트로부터 채취한 동물 샘플로부터의 1:5 희석한 혈청에 대한 노출 후에 양(sheep) 적혈구의 생체외 용혈을 보여준다. 각각의 점은 투여 후 5분 내지 2주 범위의 특정 시점에서 하나의 개별적인 동물을 나타낸다.
도 11은 실시예 8에서 설명되는 바와 같이 Z-ABD (GS 링커에 의해 ABD094 (서열 759)에 융합된 Z06175a (서열 753))의 피하 (s.c; 0.5 μmol/kg) 투여 후에 스프라그 돌리 래트로부터 채취한 동물 샘플로부터의 1:5 희석한 혈청에 대한 노출 후에 양 적혈구의 생체외 용혈을 보여준다. 각각의 점은 15분 내지 2주 범위의 특정 시점에서 하나의 개별적인 동물을 나타낸다.
도 12는 실시예 8에서 설명되는 바와 같이 수컷 스프라그 돌리 래트에 대한 i.v. 및 s.c. 투여 후에 Z-ABD (GS 링커에 의해 ABD094 (서열 759)에 융합된 Z06175a (서열 753)) 혈청 농도 대 용혈을 보여준다.
도 13은 실시예 8에서 설명되는 바와 같이 수컷 스프라그 돌리 래트에 대한 i.v. 및 s.c. 투여 후에 Z-ABD-Z (도 4, 구축물 5에서 구체화된 링커에 의해 ABD094 (서열 759)에 융합된 Z06175a (서열 753)) 혈청 농도 대 양 적혈구의 용혈을 보여준다.
도 14는 실시예 9에서 설명되는 바와 같이 수컷 시노몰구스 원숭이에서 i.v. (415 nmol/kg) 및 s.c. (1250 nmol/kg) 투여 후에 Z-ABD (GS 링커에 의해 ABD094 (서열 759)에 융합된 Z06175a (서열 753))의 혈청 노출을 보여준다. 각각의 데이터 점은 3마리의 개별적인 동물의 평균을 나타낸다.
도 15는 실시예 10에서 설명되는 바와 같이 분석된, C5 결합 Z-ABD 융합 분자 (GS 링커에 의해 ABD094 (서열 759)에 융합된 Z06175a (서열 753)) 또는 OmCI (서열 761)과 조합된 염증유발 분자 지모산 (40 mg/kg i.p.) 및 그 단독 처리의 효과 (세척액 내의 C5a 농도)를 보여주는 도표이다. Z-ABD를 지모산을 사용한 유도 18 h 전에 20 nmol/kg (LD), 100 nmol/kg (MD) 및 500 nmol/kg (HD)으로 s.c. 투여하였다. OmCI (30 nmol/kg)를 지모산 처리 1 h 전에 i.p. 투여하고, 샘플을 지모산 유도 1 h 후에 채취하였다.
도 16a 및 16b는 실시예 11에서 설명되는 바와 같이 암컷 C57bl 마우스에게 500 nmol/kg의 기관내 투여 후에 Z-ABD (GS 링커에 의해 ABD094 (서열 759)에 융합된 Z06175a (서열 753))의 약동학적 프로파일을 보여준다. a) 각각의 동물의 혈청 농도 (각각의 시점에 대해 n=3, 총 27마리의 동물) 및 b) 1:5로 희석된 상기 혈청 샘플에 노출된 양 적혈구의 용혈.
실시예
다음 물질을 달리 나타내지 않으면 본 실험 전체에 걸쳐 사용하였다.
- 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 균주 RR1△AM15 (문헌 [Ruether, Nucleic Acids Res 10:5765-5772, 1982).
- 에스케리키아 콜라이 균주 XL1-Blue (애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies), cat. no. 200268).
- 인간 보체 단백질 C5 (hC5). 전장 1676 아미노산 프로-단백질은 진뱅크(GenBank) 등록 번호: NP_001726 (서열 760)으로 기탁되었고, 여기서 아미노산 19-673은 베타 쇄이고 아미노산 678-1676은 알파 쇄이다. 여기서 사용된 인간 C5는 퀴델(Quidel) (cat. no. A403)로부터 구입하였다.
- 시노몰구스 보체 단백질 C5 (cC5; 서열 762). cC5 서열은 시노몰구스 (마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis)) 게놈 서열로부터 유래되었다 (www.ebi.ac.uk/ena; 문헌 [Ebeling et al. (2001) Genome Res. 21(10):1746-1756)]). 인간 C5의 코딩 영역은 www.ensembl.org로부터 검색하였고, C5 유전자는 15번 염색체에 위치하였다. 유전자를 함유하는 영역은 약 110,000개 염기 길이이고, 콘티그(contig) CAEC01154150 내지 CAEC01154178에 함유된다. 콘티그를 단일 파일로 수동으로 연결하고, 인간 C5의 코딩 영역을 원(raw) 시노몰구스 게놈 물질에 정렬하기 위한 sim4 소프트웨어에 대한 게놈 컨텍스트(context)로서 사용하였다. 여기서 사용된 시노몰구스 C5는 PEG6000 침전, 이온 교환 및 OmCI 친화도 크로마토그래피의 3단계 절차를 사용하여 혈청으로부터 사내에서 정제하였다.
- 래트 보체 단백질 C5 (rC5; 진뱅크 등록 번호: XP_001079130). 여기서 사용된 래트 C5는 PEG6000 침전, 이온 교환 및 OmCI 친화도 크로마토그래피의 3단계 절차를 사용하여 혈청으로부터 사내에서 정제하였다.
- 프리스타일(Freestyle) HEK293 세포에서 사내에서 생산된 인간 C5의 아미노산 잔기 822-931에 상응하는 보체 단백질 C5의 인간 MG7 (hMG7) 도메인 (서열 760; 문헌 [Fredslund et al. (2008) Nature Immunology 9: 753-760]).
- hMG7 결합 단백질.
- 연진드기 오르니토도로스 모우바타로부터의 OmCI (AF2999, Nunn, M. A. et al. 상기 문헌). C-말단에 His6 태그를 갖는 OmCI (서열 761)는 이. 콜라이 균주 오리가미(Origami) (DE3)에서 사내에서 생산하고, 히스트랩(HisTrap)1 칼럼에서 정제하였다.
실시예 1: 보체 단백질 C5 결합 폴리펩티드의 선택 및 스크리닝
물질 및 방법
표적 단백질 hC5의 비오티닐화: hC5를 No-Weigh EZ-Link Sulfo-NHS-LC-비오틴 (피어스, cat. no. 21327)을 10배 (10x) 몰 과량으로 사용하여 실온 (RT)에서 40 min 동안 제조사의 권장사항에 따라 비오티닐화하였다. PBS (10 mM 포스페이트, 137 mM NaCl, 2.68 mM KCl, pH 7.4)로의 후속 완충제 교환을 제조사의 지시사항에 따라 단백질 탈염 스핀 칼럼 (피어스, cat. no. 89849)를 사용하여 수행하였다.
C5-결합 폴리펩티드의 파지 디스플레이 선택: 본질적으로 문헌 [Groenwall et al. J Biotechnol 2007, 128:162-183]에 설명된 바와 같이 박테리오파지 상에 디스플레이되고 파지미드 pAffi1/pAY00065/pAY02947/pAY02592에 구축된 단백질 Z의 무작위 변이체의 라이브러리를 C5 결합 폴리펩티드를 선택하기 위해 사용하였다. 3개의 상이한 라이브러리 벡터를 사용하였다. 그 중 2개는 라이브러리 Zlib003Naive.I 및 Zlib006Naive.II를 생성하는, Z 변이체에 대한 융합 파트너로서 알부민 결합 도메인 (ABD, 스트렙토코쿠스 균주 G148로부터의 단백질 G의 GA3)을 이용한다. 제3 라이브러리, 즉 Zlib004Naive.I은 Taq DNA 폴리머라제 결합 분자 Z03639 (문헌 [Gunneriusson et al. Protein Eng 1999, 12:873-878]에서 ZTaqS1-1로 지정됨)를 융합 파트너로서 이용한다. 라이브러리는 다음과 같은 실제 크기를 가졌다: 3 x 109 (Zlib003Naive.I); 1.5 x 1010 (Zlib006Naive.II); 및 1.4 x 1010 (Zlib004Naive.I) (여기서, 수치는 변이체의 양을 나타냄).
파지 원액을 문헌 [Groenwall et al. 상기 문헌]에 설명된 바와 같이 진탕 플라스크 (Zlib003Naive.I)에 또는 20 리터 발효조 (Zlib006Naive.II 및 Zlib004Naive.I)에 제조하였다. 파지미드 라이브러리 Zlib004Naive.I을 함유하는 글리세롤 원액으로부터의 세포를 2% 글루코스 및 100 ㎍/ml 암피실린으로 보충된 20 리터의 TSB-YE (트립틱 소이 브로쓰(Tryptic Soy Broth)-효모 추출물; 30 g/l TSB, 5 g/l 효모 추출물)에 접종하였다. 파지미드 라이브러리 Zlib006Naive.II를 함유하는 글리세롤 원액으로부터의 세포를 100 ㎍/ml 암피실린이 보충된 20 리터의 한정된 프롤린 미함유 배지 [인산수소이칼륨 7 g/l, 시트르산삼나트륨 2수화물 1 g/l, 우라실 0.02 g/l, YNB (디프코(Difco)™ 효모 질소 염기 (아미노산 미함유), 벡톤 디킨슨) 6.7 g/l, 글루코스 1수화물 5.5 g/l, L- 알라닌 0.3 g/l, L-아르기닌 모노히드로클로라이드 0.24 g/l, L-아스파라긴 1수화물 0.11 g/l, L-시스테인 0.1 g/l, L-글루탐산 0.3 g/l, L-글루타민 0.1 g/l, 글리신 0.2 g/l, L-히스티딘 0.05 g/l, L-이소류신 0.1 g/l, L-류신 0.1 g/l, L-리신 모노히드로클로라이드 0.25 g/l, L-메티오닌 0.1 g/l, L-페닐알라닌 0.2 g/l, L-세린 0.3 g/l, L-트레오닌 0.2 g/l, L-트립토판 0.1 g/l, L-티로신 0.05 g/l, L-발린 0.1 g/l]에 접종하였다. 배양물을 37℃에서 발효조 (벨라흐 비오테크니크(Belach Bioteknik), BR20)에서 성장시켰다. 세포가 0.7-0.8의 광학 밀도 (OD)에 도달할 때, 약 2.6 리터의 배양물을 10x 몰 과량의 M13K07 헬퍼 파지 (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs) #N0315S)를 사용하여 감염시켰다. 세포를 30분 동안 인큐베이션하고, 이 때 발효조를 100 μM IPTG (이소프로필-β-D-1-티오갈락토피라노시드, 발현 유도를 위함), 25 ㎍/ml 카나마이신 및 12.5 ㎍/ml 카르베니실린이 보충된 TSB-YE로 20 리터까지 채우고, 30℃에서 22 h 동안 성장시켰다. 배양물 내의 세포를 15,900 g에서 원심분리에 의해 펠릿화하고, 이어서 배지 내에 잔류하는 파지 입자를 PEG/NaCl (폴리에틸렌 글리콜/염화나트륨) 내에 2회 침전시키고, 여과한 후, 문헌 [Groenwall et al., 상기 문헌]에 설명된 바와 같이 PBS 및 글리세롤에 용해시켰다. 파지 원액을 사용 전에 -80℃에서 보관하였다.
선택을 비오티닐화된 hC5에 대해 4 사이클 수행하였다. 선택 사이클 사이의 파지 원액 제조, 선택 절차 및 파지의 증폭을 본질적으로 WO 2009/077175에 기재된 바와 같이 수행하였다. 3% 소 혈청 알부민 (BSA) 및 0.1% 트윈20으로 보충된 PBS를 선택 완충제로 사용하고, 표적-파지 복합체를 디나비즈(Dynabeads)® M-280 스트렙타비딘 (디날(Dynal), cat. no. 112.06)에 의해 직접 포획하였다. 10 ㎍ 보체 단백질 C5당 1 mg 비드를 사용하였다. 이. 콜라이 균주 RR1△M15를 파지 증폭을 위해 사용하였다. 선택 사이클 1에서, 100 nM hC5를 사용하고, PBST 0.1% (0.1% 트윈-20으로 보충된 PBS)로 2회 세척하였다. 저하된 표적 농도 및 증가된 수의 세척을 사용한 증가된 엄격도를 후속적인 3개의 사이클에 적용하였다. 사이클 2, 3 및 4에서; 50 또는 33 nM hC5, 25 또는 11 nM hC5 및 12.5 또는 3.7 nM hC5를 사용하였다. 사이클 2, 3 및 4에서; 모든 사이클에서 PBST 0.1%를 또는 사이클 2, 3 및 4에서 PBST 0.2%, 0.3% 및 0.4%를 사용하여 4, 6 및 8회 세척을 수행하였다.
Z 변이체의 ELISA 스크리닝: 선택된 Z 변이체 분자가 실제로 인간 보체 단백질 C5와 상호작용할 수 있는지 시험하기 위해서, ELISA 검정을 수행하였다. Z 변이체는 선택물로부터의 단일 콜로니를 딥-웰 플레이트 (눈크(Nunc), cat. no. 278752) 내의 100 ㎍/ml 암피실린 및 0.1 mM IPTG로 보충된 1 ml TSB-YE 배지 내에 접종함으로써 생산하였다. 플레이트를 18-24 h 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 세포를 원심분리에 의해 펠릿화하고, 300 ㎕ PBST 0.05%에 재현탁하고, 세포의 주변세포질 분획을 방출시키기 위해 -80℃에서 동결하였다. 동결된 샘플을 수조에서 해동하고, 원심분리에 의해 펠릿화하였다. 주변세포질 상청액은 AQHDEALE-[Z#####]-VDYV-[ABD]-YVPG로서 표현되는 알부민 결합 도메인 (스트렙토코쿠스 균주 G148로부터의 단백질 G의 GA3) (Groenwall et al., 상기 문헌), 또는 AQHDEALE-[Z#####]-VDYV-[Z03639]-YVPG로서 표현되는 Taq DNA 폴리머라제 결합 분자 Z03639에 대한 융합체로서 Z 변이체를 포함하였다. Z#####는 개별적인 58개 아미노산 잔기의 Z 변이체를 의미한다.
하프-에어리어(half-area) 96-웰 ELISA 플레이트 (코스타(Costar), cat. no. 3690)를 Z 변이체에 특이적인 4 ㎍/ml의 항체 (아피바디(Affibody), cat. no. 20.1000.01.0005)를 함유하는 50 ㎕/웰의 코팅 완충제 (50 mM 탄산나트륨, pH 9.6)로 코팅하고, 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 항체 용액을 따라내고, 웰을 100 ㎕의 PBSC (0.5% 카세인으로 보충된 PBS (시그마, cat. no. C8654))로 1-2 h 동안 RT에서 차단하였다. 차단 용액을 버리고, 50 ㎕의 주변세포질 용액을 웰에 첨가하고, 서서히 진탕하면서 1 h 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 상청액을 따라내고, 웰을 PBST 0.05%로 4회 세척하였다. 이어서, 50 ㎕의 비오티닐화된 보체 단백질 hC5를 PBSC 내의 5 ㎍/ml의 농도로 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 1.5 h 동안 RT에서 인큐베이션한 후, 상기한 바와 같이 세척하였다. 스트렙타비딘-HRP (양고추냉이 퍼옥시다제; 다코(Dako), cat. no. P0397)를 PBSC 내에 1:10,000으로 희석하고, 웰에 첨가한 후, 45 min 동안 인큐베이션하였다. 상기한 바와 같이 세척한 후, 50 ㎕ 이뮤노퓨어(ImmunoPure) TMB 기질 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific), cat. no. 34021)을 웰에 첨가하고, 플레이트를 제조사의 권장사항에 따라 처리하였다. 웰의 흡광도를 다중-웰 플레이트 판독기, Victor3 (퍼킨-엘머(Perkin Elmer))를 사용하여 450 nm에서 측정하였다.
양성 대조군으로서, AQHDEALE-[Z03938]-VDYV-[Z03639]-YVPG로 표현되는 PSMA 결합 분자 Z03938을 또한 함유하는 주변세포질 분획을 5 ㎍/ml 비오티닐화된 PSMA 단백질에 대해 검정하였다. 음성 대조군으로서; 동일한 주변세포질 제제를 보체 단백질 hC5에 대해 검정하였다. 서열분석은 hC5에 대해 양성 흡광도 값을 갖는 클론에 대해 수행하였다.
서열분석: PCR 단편을 표준 PCR 프로그램 및 프라이머 AFFI-21 (5'-tgcttccggctcgtatgttgtgtg) 및 AFFI-22 (5'-cggaaccagagccaccaccgg)를 사용하여 단일 콜로니로부터 증폭하였다. 증폭된 단편의 서열분석을 제조사의 프로토콜에 따라 비오티닐화된 올리고뉴클레오티드 AFFI-72 (5'-비오틴-cggaaccagagccaccaccgg) 및 빅다이(BigDye)® 터미네이터 v3.1 사이클 서열분석 키트 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))를 사용하여 수행하였다. 서열분석 반응물은 마그나트릭스(Magnatrix) 8000 (마그네틱 바이오솔루션(Magnetic Biosolution))을 사용하여 자기 스트렙타비딘 코팅된 비드 (디태치(Detach) 스트렙타비딘 비드, 노르디아그(Nordiag), cat. no. 2012-01)에 대한 결합에 의해 정제하고, ABI PRISM® 3100 유전자 분석기 (PE 어플라이드 바이오시스템즈)로 분석하였다.
차단 ELISA: ELISA 스크리닝에서 hC5에 대해 양성인 것으로 밝혀진 클론을 그의 표적 결합이 hC5 결합 단백질 OmCI 및/또는 hMG7 결합 단백질의 존재에 의해 영향받는지 밝히기 위해 ELISA 차단 검정에 적용하였다. 차단 ELISA는 상기 ELISA 스크리닝에 대한 섹션에서 설명된 바와 같이 주변세포질 분획에서 발현된 Z 변이체를 사용하여 실시하되, 5 ml 배양물을 12 ml 둥근 바닥 튜브에 넣고, 2 ml PBST 0.05%를 펠릿 용해를 위해 사용하였다. ELISA 차단 검정은 표적 단계에서 프로토콜을 변경한 것을 제외하고 ELISA 스크리닝 검정에서처럼 수행하였고; OmCI 또는 hMG7 결합 단백질을 검정 플레이트에 첨가하기 전에 표적 단백질과 혼합하였다. 5 ㎍/ml 비오티닐화된 hC5를 각각 5배 또는 20배 몰 과량의 OmCI 또는 hMG7 결합 단백질과 혼합한 후, 플레이트에 첨가하기 전에 1 h 동안 RT에서 인큐베이션하여 복합체를 형성하도록 하였다. 각각의 클론에 대해, 참조물질 (1), 음성 대조군 (2) 및 배경 (3) 반응/신호를 각각 다음과 같이 얻었다: 표적 단계에서, hC5만을 Z 변이체에 첨가하였다 (스크리닝 ELISA에서처럼) (1); 비관련 단백질 PSMA (사내에서 생산됨)를 OmCI 또는 hMG7 결합 단백질 대신에 보체 단백질 hC5에 첨가하였다 (2); 완충제만을 Z 변이체에 첨가하였다 (3).
결과
보체 단백질 C5 결합 폴리펩티드의 파지 디스플레이 선택: 개별적인 클론을 비오티닐화된 hC5에 대한 2-4 사이클의 파지 디스플레이 선택 후에 얻었다.
Z 변이체의 ELISA 스크리닝: 4 사이클의 선택 후에 얻은 클론을 96-웰 플레이트에서 생산하고, ELISA로 보체 단백질 C5 결합 활성에 대해 스크리닝하였다. 거의 총 400개의 클론을 스크리닝하였다. 흡광도 측정은 많은 분명한 hC5 양성 클론을 보여주었다. 클론 선택의 결과를 표 1에 제시하고; Z05363 (서열 510) 변이체는 ABD로 태그부착된 반면, 다른 나열된 Z 변이체는 방법 섹션에서 설명된 바와 같이 Taq 결합 분자 Z03639로 태그부착된다. 음성 대조군으로서 사용된 PSMA 특이적 분자 Z03938은 PSMA에 대한 양성 신호를 제시한 반면, hC5에 대해서는 어떠한 신호도 얻어지지 않았다.
차단 ELISA: hC5에 대해 양성인 클론을 hC5 결합 단백질 OmCI 및 hMG7 결합 단백질을 사용한 차단 검정에 적용하였다. 5개의 클론에 대해, 보체 단백질 C5에 대한 결합 신호는 OmCI의 존재에 의해 완전히 사라졌고, 배경과 동일한 수준에 도달하였다 (표 1). 상기 클론 중의 하나, 즉 Z05363 변이체 (서열 510)를 또한 hMG7 결합 단백질의 존재 하에 hC5에 결합하는 그의 능력에 대해 시험하였다. hMG7 결합 단백질은 Z05363의 hC5에 대한 결합을 억제하지 않았다.
Figure pat00001
서열분석: 서열분석은 ELISA 스크리닝에서 보체 단백질 C5에 대해 양성 흡광도 값을 갖는 클론에 대해 수행하였다. 각각의 변이체에게 특유한 확인 번호 #####를 부여하였고, 개별적인 변이체는 Z#####로 언급한다. 58개 아미노산 잔기 길이의 Z 변이체의 아미노산 서열은 도 1 및 서열 목록에 서열 509-513으로 제시된다. 상기 Z 변이체의 추정된 보체 단백질 C5 결합 모티프는 도 1 및 서열 목록에 서열 13-17로 제시된다. 각각의 상기 Z 변이체 내의 완전한 3개-나선 다발을 구성하는 것으로 예측된 49개 아미노산 잔기 길이의 폴리펩티드의 아미노산 서열은 도 1 및 서열 목록에 서열 261-265로 제시된다.
실시예 2: Z 변이체의 생산 및 특성화
물질 및 방법
Z 변이체의 서브클로닝, 단백질 발현 및 정제:
5개의 보체 단백질 C5 결합 Z 변이체 (Z05363 (서열 510); Z05477 (서열 509); Z05483 (서열 511); Z05538 (서열 512) 및 Z05692 (서열 513))를 pAffi1/pAY00065/pAY02947 라이브러리 벡터로부터 증폭하였다. N-말단 His6 태그를 갖는 이량체 아피바디 분자의 구축을 위한 서브클로닝 전략을 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 WO 2009/077175에 상세히 설명된 바와 같이 적용하였다. Z 유전자 단편을 발현 벡터 pAY01448 내로 서브클로닝하여 코딩되는 서열 MGSSHHHHHHLQ-[Z#####][Z#####]-VD를 생성하였다.
서브클로닝된 Z 변이체로 이. 콜라이 BL21(DE3)을 형질전환시키고, 다중발효조 시스템 그레타(Greta) (벨라흐 비오테크니크)에서 발현시켰다. 간단히 설명하면, 배양물을 50 ㎍/ml 카나마이신을 함유하는 800 ml TSB-YE-배지에서 37℃에서 성장시켰다. ~1의 OD600에서, 배양물을 0.05 mM의 최종 농도로 IPTG의 자동 첨가를 통해 유도하였다. 배양물을 유도 5 h 후에 약 10℃로 냉각하고, 원심분리 (20 min, 15,900 g)에 의해 회수하였다. 상청액을 버리고, 세포 펠릿을 수거하고, 추가 사용시까지 -20℃에서 보관하였다. 발현 수준 및 가용성 정도는 쿠마시 블루(Coomassie blue) 염색을 사용하여 4-12% NuPAGE™ 겔 (인비트로젠(Invitrogen))에 대한 SDS-PAGE 분석에 의해 평가하였다.
주로 가용성 단백질로서 발현되는 Z 변이체에 대해, 세포 펠릿을 1000 U 벤조나제(Benzonase)® (머크(Merck), cat. no. 1.01654.001)를 첨가하면서 결합 완충제 (20 mM 인산나트륨, 0.5 M NaCl, 20 mM 이미다졸, pH 7.4)에 재현탁하고, 초음파처리에 의해 붕괴시켰다. 각각의 Z 변이체에 대해, 초음파처리된 현탁액을 원심분리 (40 min, 25,000 g, 4℃)에 의해 청정화하고, 상청액을 1 ml 히스 그라비트랩(His GraviTrap)™ 칼럼 (지이 헬쓰케어) 상에 로딩하였다. 칼럼을 세척 완충제 (20 mM 인산나트륨, 0.5 M NaCl, 60 mM 이미다졸, pH 7.4)로 세척한 후, Z 변이체를 3 ml 용리 완충제 (20 mM 인산나트륨, 0.5 M NaCl, 0.5 M 이미다졸, pH 7.4)로 용리하였다. 주로 불용성 단백질로서 발현된 Z 변이체를 유사하게 정제하되, 8 M 우레아가 결합 및 세척 완충제에 포함되었다. 필요한 경우, Z 변이체는 이동상으로서 0.1% TFA (트리플루오로아세트산)을 함유하는 물 및 0.1% TFA를 포함하는 아세토니트릴의 적절한 구배 (일반적으로 20 칼럼 부피에 걸쳐 0-50%)를 사용한 용리를 이용하는 1 ml 리소스(Resource)™ 칼럼 (지이 헬쓰케어)에 대한 역상 크로마토그래피 (RPC)에 의해 추가로 정제되었다.
완충제는 PD-10 칼럼 (지이 헬쓰케어)을 사용하여 PBS로 교환하였다.
단백질 특성화: 이론적 흡광 계수를 사용하여 280 nm에서 흡광도 측정에 의해 정제된 Z 변이체의 농도를 결정하였다. 순도는 쿠마시 블루 염색을 사용하여 4-12% NuPAGE™ 겔 (인비트로젠)에 대한 SDS-PAGE 분석에 의해 평가하였다. 정제된 Z 변이체의 종류 및 분자량을 결정하기 위해, LC/MS-분석을 애질런트 1100 LC/MSD 시스템 (애질런트 테크놀로지스)으로 수행하였다.
CD 분석: 정제된 Z 변이체를 PBS 내에서 0.5 mg/ml로 희석하였다. 각각의 희석된 Z 변이체에 대해, CD 스펙트럼을 20℃의 온도에서 250-195 nm 사이에서 기록하였다. 또한, 가변 온도 측정 (VTM)을 수행하여 용융 온도 (Tm)를 결정하였다. VTM에서, 흡광도는 5℃/min의 온도 기울기로 온도를 20℃로부터 90℃로 승온시키면서 221 nm에서 측정하였다. Z 변이체의 재폴딩(refolding)하는 능력은 20℃로 냉각한 후 250-195 nm에서 추가의 CD 스펙트럼을 수집함으로써 평가하였다. CD 측정은 1 mm의 광로 길이에서 세포를 사용하여 자스코(Jasco) J-810 분광편광계 (자스코 스칸디나비아 에이비(Jasco Scandinavia AB))로 수행하였다.
비아코어 결합 분석: 5개의 서브클로닝된 His6-태그부착된 이량체 hC5-결합 Z 변이체의 hC5, cC5, rC5, hMG7 및 hIgG (시그마, cat. no. G4386)와의 상호작용을 비아코어 기기 (지이 헬쓰케어)로 분석하였다. Z 변이체를 몇 개의 CM5 칩 표면 (지이 헬쓰케어)의 카르복실화된 덱스트란층 상의 상이한 유동 세포에 고정하였다. 고정화는 제조사의 프로토콜에 따라 아민 커플링 화학을 사용하여 수행하였다. 각각의 칩 상의 하나의 유동 세포 표면을 활성화하고, 분석물 주입 동안 블랭크(blank)로서 사용하기 위해 탈활성화시켰다. HBS-EP 이동 완충제 (지이 헬쓰케어) 내에 100 nM의 최종 농도로 희석된 분석물을 10 ㎕/min의 유량으로 1 min 동안 주입하였다. 2 min의 해리 후에, 표면을 10 mM HCl의 1회 주입으로 재생하였다. 결과를 비아이벨류에이션 소프트웨어 (지이 헬쓰케어)로 분석하였다. 블랭크 표면의 곡선을 리간드 표면의 곡선으로부터 공제하였다.
결과
Z 변이체의 서브클로닝: 5개의 선택된 특유한 클론 (Z05477 (서열 509), Z05363 (서열 510), Z05483 (서열 511), Z05538 (서열 512) 및 Z05692 (서열 513))을 발현 벡터 pAY01448에서 이량체로서 서브클로닝하기 위해 선택하고, 후속적으로 서열분석에 의해 확인하였다.
단백질 생산: 히스티딘-태그부착된 이량체 Z 변이체는 가용성 유전자 생성물의 허용가능한 발현 수준을 생성하였다. 생산된 배치(batch)의 순도는 SDS-PAGE 분석에 의해 평가될 때 90%를 초과하는 것으로 평가되었다. LC/MS 분석을 통해 모든 Z 변이체 분자에 대한 정확한 분자량을 확인하였다.
CD 분석: 상이한 Z 변이체의 용융 온도 (Tm)는 CD 신호 대 온도 플롯에서 전이 과정의 중간 지점을 결정함으로써 계산하였다. 많은 가역적으로 폴딩하는 Z 변이체에 대한 결과를 아래 표 2에 요약한다.
Figure pat00002
비아코어 결합 분석:
C5의 상이한 종 및 MG7, 즉 hC5의 하위도메인에 대한 5개의 서브클로닝된 이량체 Z 변이체의 결합, 및 IgG에 대한 배경 결합을 Z 변이체를 함유하는 표면 상에 상이한 단백질을 주입함으로써 비아코어 기기에서 시험하였다. 표면 상의 상이한 Z 변이체에 대한 리간드 고정화 수준은 다음과 같았다: Z05363: 2080 RU, Z05477: 2180 RU, Z05483: 2010 RU, Z05538: 2570 RU 및 Z05692: 3270 RU. 상이한 Z 변이체를 100 nM의 농도에서 주입된 상이한 세트의 단백질에 대한 결합에 대해 시험하였다 (표 3 참조). 시험한 Z 변이체에 대한 결과를 각각의 단백질에 대해 +/- 결과로서 표에 제시한다. 비아코어 결합 분석의 예로서, 도 2는 hC5, cC5, rC5, hMG7 및 hIgG에 대해 검정된 고정된 이량체 Z05477로부터 얻은 센서그램을 보여준다.
Figure pat00003
실시예 3: 보체 단백질 C5 결합 Z 변이체의 성숙 라이브러리의 설계 및 구축
본 실시예에서, 성숙 라이브러리를 구축하였다. 라이브러리는 hC5-결합 폴리펩티드의 선택을 위해 사용하였다. 성숙 라이브러리는 대체로 증가된 친화도를 갖는 결합제를 생성할 것으로 예상된다 (문헌 [Orlova et al. Cancer Res 2006, 66(8):4339-48]). 본 연구에서, 무작위 이중 가닥 링커를 슬로노믹스(Slonomics)® 기술에 의해 생성하였고, 이것은 후속적으로 생산되는 이중 가닥 DNA의 라이게이션 및 제한을 사용하여 무작위 세트의 트리뉴클레오티드 빌딩 블록의 도입을 가능하게 한다.
물질 및 방법
라이브러리 설계: 라이브러리는 실시예 1 및 2에 설명된 바와 같이 hC5 결합 Z 변이체의 서열의 선택을 기초로 하였다. 새로운 라이브러리에서, Z 분자 스캐폴드 내의 13개의 가변 위치는 서열 509-513(Z05477, Z05363, Z05483, Z05538, Z05692)에 정의된 Z 변이체 서열을 기초로 한 전략에 따라 특정 아미노산 잔기를 향해 편향되었다. 제한 부위 XhoI 및 SacI이 인접한 아미노산 서열
Figure pat00004
(무작위 코돈은 NNN으로 제시됨)의 147 bp 부분적 무작위 나선 1 및 2를 함유하는 이중 가닥 DNA의 슬로노맥스(SlonoMax)® 라이브러리는 슬로닝 바이오테크놀로지 게엠베하(Sloning BioTechnology GmbH, 독일 푸크하임)으로부터 주문하였다. 최종적으로 12개의 가변 Z 위치를 포함하는 새로운 라이브러리 내의 아미노산 잔기의 이론적 분포는 표 4에 제시된다.
Figure pat00005
라이브러리 구축: 라이브러리를 12 사이클의 PCR 동안 앰플리택 골드(AmpliTaq Gold) 폴리머라제 (어플라이드 바이오시스템즈, cat. no. 4311816)를 사용하여 증폭하고, 공급자의 권고에 따라 퀴아퀵(QIAquick) PCR 정제 키트 (키아겐, cat. no. 28106)를 사용하여 정제하였다. 무작위 라이브러리 단편의 정제된 풀을 제한 효소 XhoI 및 SacI (뉴 잉글랜드 바이오랩스, cat. no. R01460L, 및 cat. no. R0156L)로 소화시키고, PCR 정제 키트를 사용하여 한번 더 정제하였다. 후속적으로, 생성물을 1% 아가로스 겔 상에서 예비 겔 전기영동을 사용하여 정제하였다.
파지미드 벡터 pAY02592 (본질적으로 문헌 [Groenwall et al. 상기 문헌]에 설명된 바와 같은 pAffi1)를 동일한 효소로 제한하고, 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전을 사용하여 정제하였다. 제한된 단편 및 제한된 벡터를 T4 DNA 리가제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스, cat. no. M0202S)로 2시간 동안 RT에서 5:1의 몰비로 라이게이션한 후, 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 라이게이션된 DNA를 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전에 의해 회수한 후, 10 mM 트리스(Tris)-HCl, pH 8.5에 용해시켰다.
라이게이션 반응물 (약 250 ng DNA/형질전환)을 전기적격(electrocompetent) 이. 콜라이 RR1△M15 세포 (100 ㎕) 내로 전기천공시켰다. 전기천공 직후에, 약 1 ml의 SOC 배지 (TSB-YE 배지, 1% 글루코스, 50 μM MgCl2, 50 μM MgSO4, 50 μM NaCl 및 12.5 μM KCl)를 첨가하였다. 형질전환된 세포를 37℃에서 50 min 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 적정 및 형질전환체 수의 결정을 위해 채취하였다. 이어서, 세포를 모으고, 2% 글루코스 및 100 ㎍/ml 암피실린으로 보충된 7 리터의 TSB-YE 배지에서 밤새 37℃에서 배양하였다. 세포를 15 min 동안 4,000 g에서 펠릿화하고, PBS/글리세롤 용액 (약 40% 글리세롤)에 재현탁하였다. 세포를 분취하고, -80℃에서 보관하였다. 성분을 확인하고 라이브러리 설계와 비교하여 구축된 라이브러리의 결과를 평가하기 위해서 Z 변이체의 라이브러리로부터의 클론을 서열분석하였다. 서열분석은 실시예 1에서 설명된 바와 같이 수행하고, 아미노산 분포를 확인하였다.
파지 원액의 제조: C5 파지미드 라이브러리를 함유하는 글리세롤 원액으로부터의 세포를 100 ㎍/ml 암피실린으로 보충된 20 리터의 한정된 프롤린 미함유 배지 (실시예 1에 설명된 바와 같은)에 접종하고, 37℃에서 발효조 (벨라흐 비오테크니크, BR20)에서 성장시켰다. 모든 단계는 라이브러리 Zlib006Naive.II에 대해 실시예 1에서 설명한 바와 같이 수행하였다. 배양 후에, 세포를 15,900 g에서 원심분리에 의해 펠릿화하고, 배지에 잔류하는 파지 입자를 PEG/NaCl로 2회 침전시키고, 여과한 후, 실시예 1에서 설명된 바와 같이 PBS 및 글리세롤에 용해시켰다. 파지 원액을 선택시에 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다.
결과
라이브러리 구축물: 새로운 라이브러리를 확인된 결합 특성을 갖는 OmCI-차단된 C5 결합 Z 변이체의 세트를 기초로 하여 설계하였다 (실시예 1 및 2). 설계된 라이브러리의 이론적 크기는 6.7 x 109 Z 변이체이었다. 이. 콜라이. RR1△M15 세포로의 형질전환 후 적정에 의해 결정된 라이브러리의 실제 크기는 1.4 x 109 형질전환체이었다.
라이브러리 품질은 64개 형질전환체의 서열분석에 의해 및 그의 실제 서열을 이론적 설계와 비교함으로써 시험하였다. 설계된 라이브러리에 비해 실제 라이브러리의 함량은 만족스러운 것으로 밝혀졌다. 설계된 아미노산 서열에서 고정된(locked) 위치 (위치 27의 W)는 예상된 아미노산만 그 위치에서 발생했기 때문에 실제 서열에서 반영되었다. 따라서, hC5 결합 폴리펩티드의 성숙 라이브러리가 성공적으로 구축되었다.
실시예 4: 성숙 라이브러리로부터 Z 변이체의 선택, 스크리닝 및 특성화
물질 및 방법
보체 단백질 C5 결합 폴리펩티드의 파지 디스플레이 선택: 표적 단백질 hC5를 실시예 1에 설명된 바와 같이 비오티닐화하였다. 파지 디스플레이 선택은 실시예 3에 설명된 바와 같이 Z 변이체 분자의 새로운 라이브러리를 사용하여 본질적으로 실시예 1에 설명된 바와 같이 hC5에 대해 수행하였다. 이. 콜라이 XL1-블루를 파지 증폭을 위해 사용하였다. 선택은 초기에 2개의 병행 트랙(parallel track)으로 수행하였다. 한 트랙에서, 선택 시간은 2 h인 반면, 다른 트랙에서는 더 짧은 선택 시간이 사용되었다: 제1 사이클에서 20 min 및 후속적인 사이클 2-4에서 10 min. 상기 2개의 트랙 (1 및 2)은 제2 사이클로 추가로 분할되어, 총 6개의 트랙 (1a-c 및 2a-c, 표적 농도 및 세척 조건 상이)이 실시되었다. 선택은 총 4 사이클로 수행되었다. 선택 사이클 1에서, 25 nM 보체 단백질 C5를 사용하고, PBST 0.1%로 5회 세척하였다. 저하된 표적 농도 및 증가된 수의 세척을 사용한 증가된 엄격도를 후속적인 3개의 사이클에 적용하였다. 사이클 2, 3 및 4에서; 10, 5 또는 2.5 nM 보체 단백질 C5, 4, 1 또는 0.25 nM 보체 단백질 C5 및 1.6, 0.2 또는 0.05 nM 보체 단백질 C5가 사용되었다. 사이클 2, 3 및 4에서; 10, 15 및 20회 세척을 PBST 0.1%를 사용하여 수행하였다. 또한, 제2 마지막 세척은 트랙 중의 2개 (1c 및 2c)에 대해 세척 용액 내의 50x 과량의 비-비오티닐화된 hC5를 사용하여 3 h으로 연장되었다.
잠재적인 결합제의 서열분석: 상이한 선택 트랙으로부터의 개별적인 클론을 서열분석을 위해 선발하였다. ELISA 스크리닝에서 사용된 모든 클론을 서열분석하였다. 유전자 단편의 증폭 및 유전자 단편의 서열 분석은 실시예 1에 설명된 바와 같이 수행하였다.
Z 변이체의 ELISA 스크리닝: Z 변이체를 함유하는 단일 콜로니를 보체 단백질 C5 성숙 라이브러리의 선택된 클론으로부터 무작위로 선발하고, 실시예 1에 설명된 바와 같이 1 ml 배양물에서 성장시켰다. 주변세포질 단백질을 8회의 반복된 동결-해동 사이클에 의해 방출시켰다. ELISA 스크리닝은 다음을 제외하고 본질적으로 실시예 1에 설명된 바와 같이 수행하였다. 하프-에어리어 96-웰 ELISA 플레이트를 코팅 완충제 내에 희석된 2 ㎍/ml의 ABD 특이적 염소 항체 (사내에서 생산됨)로 코팅하였다. 비오티닐화된 hC5를 0.15 ㎍/ml의 농도로 사용하고, 1.5-2 h 동안 인큐베이션하였다. 스트렙타비딘 접합된 HRP는 써모 사이언티픽 (cat. no. N100)으로부터 얻었다. 1차 선택 (실시예 1)으로부터 유래된 Z 변이체 Z05363 (서열 510)을 양성 대조군으로서 뿐만 아니라 hC5가 없는 음성 대조군으로서 사용하였다.
선택된 성숙 Z 변이체를 보다 낮은 농도의 hC5에 대한 제2 스크리닝에 적용하고, rC5와 비교하였다. 검정은 본질적으로 상기한 바와 같이 수행하였다. hC5 및 rC5는 각각 0.05 ㎍/ml 및 4 ㎍/ml의 농도에서 사용하였다. Z 변이체 Z05363 (서열 510)을 또한 상기 실험에서 양성 대조군으로서 사용하였다. 음성 대조군으로서, PDGF-Rβ에 결합하는 Z 변이체 (Z01977; WO 2009/077175에 설명됨)를 비오티닐화된 hC5 또는 rC5에 대해 검정하였다.
선택된 Z 변이체의 심층 서열 분석 및 용혈 검정 (실시예 6에서 설명됨)에서 인간 C5 및 마우스 C5에 대한 측정된 용융 온도 및 IC50 값과 13개의 무작위 위치의 아미노산의 상관성은 558개의 서열분석된 클론 중에서 확인되지 않은 유리한 Z 변이체를 제시하였다. Z 변이체 Z05998 (서열 499)를 기초로 하여, 위치 10의 단일 아미노산 Ile은 부위 지정 돌연변이유발을 위한 종래의 기술을 사용하여 Leu으로 교체되었다. 새로운 변이체는 Z08044 (서열 498)로 언급된다. 상기 Z 변이체의 추정된 보체 단백질 C5 결합 모티프는 도 1 및 서열 목록에 서열 2로서 제시된다. 상기 Z 변이체 내의 완전한 3개-나선 다발을 구성할 것으로 예상되는 49개 아미노산 잔기 길이의 폴리펩티드의 아미노산 서열은 도 1 및 서열 목록에 서열 250으로서 제시된다.
결과
보체 단백질 C5 결합 폴리펩티드의 파지 디스플레이 선택:
선택은 각각 4회의 사이클을 포함하는 총 6개의 병행 트랙에서 수행하였다. 상이한 선택 트랙은 다음과 같이 표적 농도 및 세척 조건이 상이하였다: 1a) 2 h 선택 시간, 고농도, 표준 세척, 1b) 2 h 선택 시간, 저농도, 표준 세척, 1c) 2 h 선택 시간, 배지 농도, 긴 세척, 2a) 10 min 선택 시간, 고농도, 표준 세척, 2b) 10 min 선택 시간, 저농도, 표준 세척, 및 2c) 10 min 선택 시간, 배지 농도, 긴 세척. 각각의 선택 사이클에 대해, 표적 농도는 감소하였고, 세척 조건은 보다 엄격하였다. 모든 트랙은 각각의 라운드에서 용리액에 충분한 양의 파지 입자를 제시하였다. 대부분의 파지 입자는 트랙 1a 및 2a에서 발견되었고, 이것은 최고 표적 농도 및 가장 약한 세척 조건을 나타낸다.
서열분석: 무작위로 선발된 클론 (558)을 서열분석하였다. 각각의 개별적인 Z 변이체에게 실시예 1에서 설명된 바와 같이 확인 번호 Z#####를 부여하였다. 총 242개의 새로운 특유한 Z 변이체 분자가 확인되었다. 58개 아미노산 잔기 길이의 Z 변이체의 아미노산 서열은 도 1 및 서열 목록에 서열 497, 서열 499-508 및 서열 514-744로 제시된다. 상기 Z 변이체의 추정된 보체 단백질 C5 결합 모티프는 도 1 및 서열 목록에 서열 1, 서열 3-12 및 서열 18-248로 제시된다. 각각의 상기 Z 변이체 내의 완전한 3개-나선 다발을 구성하는 것으로 예측된 49개 아미노산 잔기 길이의 폴리펩티드의 아미노산 서열은 도 1 및 서열 목록에 서열 249, 서열 251-260 및 서열 266-496으로 제시된다. 서열분석된 클론 중에서, 63개의 서열은 2회 이상 발생하였다.
Z 변이체의 ELISA 스크리닝: 4회의 선택 사이클 후에 얻은 클론을 96-웰 플레이트에서 생산하고, ELISA를 사용하여 hC5-결합 활성에 대해 스크리닝하였다. 모든 무작위로 선발된 클론을 분석하였다. 242개의 특유한 Z 변이체 중에서 229개는 1차 선택 (실시예 1)으로부터 얻은 양성 대조군 클론 Z05363 (서열 510; 평균 흡광도 신호 0.3 AU)에 비해 0.15 ㎍/ml의 농도에서 hC5에 대해 보다 높은 반응 (0.3-3.1 AU)을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 모든 선택 트랙으로부터의 클론은 양성 신호를 보였다. 음성 대조군의 흡광도는 약 0.1 AU이었다.
Z 변이체는 hC5에 대한 ELISA 스크리닝에서 그의 활성능 및 발생 빈도를 기초로 하여 선택하였다. 43개의 특유한 Z 변이체를 보다 낮은 농도의 hC5 (0.05 ㎍/ml) 및 rC5 (4 ㎍/ml)에 대해 검정하였다. rC5에 대한 양성 결과는 시험된 Z 변이체의 40개에서 얻어졌고, 음성 대조군의 신호 (0.4 AU)의 2x로 정의되었다. 보다 낮은 농도의 hC5 및 rC5에 대한 모든 시험된 Z 변이체에 대한 결과를 도 3에 제시한다.
실시예 5: 보체 단백질 C5 결합 Z 변이체의 하위세트의 서브클로닝, 생산 및 특성화
물질 및 방법
Z 변이체 분자의 발현 벡터 내로의 서브클로닝:
서열 분석 및 인간 및 래트 보체 단백질 C5에 대한 ELISA에서의 활성능을 기초로 하여, 45개의 클론을 발현 벡터 pAY01448 내로의 서브클로닝을 위해 선택하였다. 단량체 Z 변이체 단편을 파지미드 벡터 pAY02592로부터 증폭하고, pAY01448 내로의 서브클로닝을 실시예 2에 설명된 바와 같이 수행하여, 단백질 서열 MGSSHHHHHHLQ-[Z#####]-VD를 코딩하는 벡터를 생성하였다.
단백질 발현 및 정제: His6-(Z#####) 포맷의 45개의 Z 변이체를 0.4 mM의 최종 농도로 IPTG에 의해 수동 유도된 진탕기 플라스크 내의 100 ml 배양물의 소규모 설정으로, 실시예 2에 설명된 바와 같이 또는 그와 유사하게 자동화 다중발효조 시스템에서 발현시켰다. 정제는 본질적으로 실시예 2에서 설명된 바와 같이 1 ml 히스 그라비트랩™ 칼럼을 사용하여 또는 0.1 ml 히스 스핀트랩(His SpinTrap) (지이 헬쓰케어, cat. no. 28-4013-53)을 사용하여 소규모로 수행하였다. 완충제는 제조사의 지시사항에 따라 PD-10 칼럼 또는 PD 스핀트랩 G-25 (지이 헬쓰케어, cat. no. 28-9180-04)를 사용하여 PBS로 교환하였다. 정제된 Z 변이체의 농도는 280 nm에서의 흡광도 측정에 의해 결정하고, 순도 및 정체는 실시예 2에서 설명된 바와 같이 SDS-PAGE 및 LC/MS에 의해 평가하였다. 샘플을 분취하고, 추가로 사용시까지 -80℃에서 보관하였다.
CD 분석: 용융 온도 및 폴딩 가역성의 결정을 위한 CD 분석을 실시예 2에 설명된 바와 같이 수행하였다.
결과
단백질 발현 및 정제: 모든 45개의 서브클로닝된 Z 변이체는 발현될 수 있었고, 모든 정제된 변이체에 대한 시험관내 가용성은 양호하였다. 순도는 LC/MS에 의해 모든 변이체에 대해 90%를 초과하는 것으로 추정되었다. 정확한 분자량은 LC-MS에 의해 확인되었다.
CD 분석: 20℃에서 수행된 CD 스펙트럼 측정은 상기 온도에서 Z 변이체의 α-나선 구조를 확인하였다. 가변 온도 측정 (90℃로 가열한 후 20℃로 냉각) 후에 얻은 스펙트럼을 가변 온도 측정 전에 얻은 스펙트럼 상에 겹친 오버레이는, 모든 Z 변이체가 90℃로 가열 후 그의 α-나선 구조로 완전히 또는 거의 완전히 재폴딩됨을 보여주었다 (결과를 제시하지 않는다). Z 변이체의 세트에 대한 용융 온도는 가변 온도 측정에 의해 결정하였고, 표 5에 제시한다.
Figure pat00006
실시예 6: C5 결합 Z 변이체의 시험관내 특성화
물질 및 방법
클로닝 및 단백질 생산: 이. 콜라이 코돈 최적화된 C5 결합 Z 변이체의 하위세트 (서열 745-757)를 코딩하는 DNA는 진아트, 게엠베하(GeneArt, GmbH)에 의해 합성되었다. C5 결합 Z 변이체를 나타내는 합성 유전자를 이. 콜라이에 서브클로닝하여 발현시켰다. 알부민 결합 도메인 (ABD094, 서열 759)에 임의로 연결된 Z 변이체의 단량체 또는 이량체의 구축물을 코딩하는 발현 벡터는 도 4에 도식적으로 제시한다.
세포 내에서 발현된 Z 변이체는 종래의 크로마토그래피 방법을 사용하여 정제하였다. 균질화 및 청정화는 초음파처리, 이어서 원심분리 및 여과에 의해 수행하였다. 음이온 교환 크로마토그래피를 포획 단계로서 사용하였다. 추가의 정제는 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 수행하였다. 정제는 산성 조건 (pH 5.5) 하에 실시하였다. 폴리싱(polishing) 및 완충제 교환은 크기 배제 크로마토그래피에 의해 수행하였다. 최종 단백질 함량으로 농축하기 전에, 내독소 수준은 폴리믹신 B 친화도 크로마토그래피에 의해 감소되었다. 생산된 단백질을 MALDI-TOF MS 및 SDS-PAGE로 분석하였다.
또한, 재조합 방식으로 발현된 OmCI 단백질 (서열 761)을 시험관내 연구에서 참조 분자로서 사용하였다.
용혈의 억제: 전형적인 보체 경로 기능 및 C5 결합 폴리펩티드에 의한 그의 억제에 대한 연구를 위해, 양 적혈구를 알세버(Alsever) 용액 (스웨디쉬 내셔널 베테리너리 인스티튜트(Swedish National Veterinary Institute)) 내의 신선한 양 전혈로부터 제조한 후, 항체 감작화된 양 적혈구 (EA)가 되도록 토끼 항-양 적혈구 항혈청 (시그마)으로 처리하였다. 전체 과정은 무균 조건 하에 수행하였다. 모든 다른 시약은 상업적 공급원으로부터 얻었다.
시험관내 검정은 시험 단백질, 보체 혈청 및 EA 현탁액의 연속적인 첨가에 의해 96-웰 U자형 마이크로타이터 플레이트에서 수행하였다. 50 ㎕의 총 반응 부피/웰 및 pH 7.3-7.4에서 모든 시약의 최종 농도는 다음과 같았다: 0.15 mM CaCl2; 0.5 mM MgCl2; 3 mM NaN3; 138 mM NaCl; 0.1% 젤라틴; 1.8 mM 나트륨 바르비탈; 3.1 mM 바르비투르산; 5백만 개의 EA; 적합한 희석 비율의 보체 단백질 C5 혈청, 및 요구되는 농도의 C5 결합 Z 변이체. 상이한 종의 보체 혈청을 Z 변이체의 종간 효능을 정의하기 위해 검정에 사용하였다. 마우스 혈청에 대해, C5 고갈 인간 혈청 (퀴델로부터의 C5D, cat. no. A501)을 등몰량으로 보충하여야 하였다.
Z 변이체를 상기 설명된 보체 혈청과 20 min 동안 빙상에서 예비-인큐베이션한 후, EA 현탁액의 첨가에 의해 반응을 개시시켰다. 용혈성 반응을 45 min 동안 교반하면서 37℃에서 진행시킨 후, 임의로 0.02% 트윈 20을 함유하는 100 ㎕ 빙냉 염수를 첨가하여 종료시켰다. 세포를 기저부로 원심분리하고, 100 ㎕ 상청액에 상응하는 상부 부분을 하프-에어리어 및 편평 바닥 웰을 갖는 투명 마이크로플레이트에 옮겼다. 반응 결과를 415 nm의 파장에서 마이크로타이터 플레이트 판독기를 사용하여 광학 밀도로서 분석하였다.
모든 시험에서, 대조군, 비히클 및 OmCI (서열 761)가 미억제된 및 완전히 억제된 반응의 값을 각각 정의하기 위해 각각의 플레이트에 포함되었다. 상기 값은 임의의 제시된 샘플 농도에서 보체 용혈의 % 억제를 계산하기 위해 사용되었다. 시험된 Z 변이체의 억제 효능 (IC50 값)은 C5 고갈 혈청에 첨가된 제어된 농도의 인간 C5의 존재 하에 동일한 검정을 적용함으로써 정의되었다. 고도로 효능있는 억제제 (낮은 나노몰 내지 나노몰 미만(sub-nanomolar))에 대해, 반응 혼합물의 최종 C5 농도는 0.1 nM에서 제어되었고, 이것은 C5 고갈 또는 결핍 혈청을 사용함으로써 임의로 확립되었다.
고정된 hC5에 대한 C5 결합 Z 변이체의 시험관내 동역학 및 친화도: hC5에 대한 많은 C5 결합 Z 변이체 (서열 748-757)의 결합 친화도를 비아코어 T200 기기 (지이 헬쓰케어)를 이용하여 분석하였다. 인간 C5 (A403, 퀴델 코퍼레이션)를 제조사의 프로토콜에 따라 아민 커플링 화학을 사용하여 CM5 센서 칩 (900 RU)에 커플링하였다. 커플링은 10 mM Na-아세테이트 완충제 pH 5 (지이 헬쓰케어) 내의 7.5 ㎍/ml의 농도로 hC5를 주입함으로써 수행하였다. 참조 세포는 동일한 시약으로 처리하되, 인간 C5를 주입하지 않았다.
모든 실험은 10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20 (HBS-EP 완충제, 지이 헬쓰케어)에서 수행하였다. 동역학적 분석을 위해, 유량은 30 ㎕/min이었고, 데이터는 25℃에서 수집하였다. 참조 세포로부터의 데이터는 벌크 굴절률(bulk refractive index) 변화를 보상하기 위해 차감되었다. 대부분의 경우에, HBS-EP의 주입이 또한, 센서그램이 이중 블랭크되도록 대조군으로서 포함되었다. 표면은 HBS-EP 완충제로 재생되었다.
Z 변이체의 고정된 hC5에 대한 결합은 5개 농도의 샘플을 주입 간에 재생하지 않으면서 동일한 사이클에서 차례로 주입하는 단일 사이클 동역학적 방법으로 연구하였다. 동역학적 상수는 랭뮤어 1:1 또는 비아코어 T200 이벨류에이션 소프트웨어 버전 1.0의 2가 분석물 모델을 사용한 센서그램으로부터 계산하였다.
고정된 hC5에 대한 C5 결합 Z-ABD 분자의 시험관내 동역학 및 친화도: 고정된 hC5에 대한 Z-ABD 분자 (GS 링커에 의해 ABD094 (서열 759)에 융합된 서열 748-757)의 결합을 비아코어 T200 기기 (지이 헬쓰케어)를 사용하여 평가하였다.
단량체 또는 이량체로서 Z06175a (서열 753)가 도 4에 구체화된 바와 같이 상이한 링커를 통해 N-말단 또는 C-말단에서 ABD094 (서열 759)에 융합된 Z-ABD 구축물 (구축물 2, 7, 5 및 4)을, 또한 재조합 인간 알부민 (셀 프라임 r알부민(Cell Prime rAlbumin) AF-G, 9301, 노보자임스(Novozymes))과 예비-인큐베이션하고, 희석한 후, 상기 설명된 바와 같이 단일-사이클 동역학 방법에 따라 고정된 인간 C5 상에 주입하였다. 비교로서, 동일한 구축물을 HSA의 부재 하에 주입하였다. 2개의 구축물, 즉 Z06175a-GS (도 4, 구축물 1) 및 Z06175a-GSGGGGSGGGGS-ABD094 (도 4, 구축물 3)는 HSA의 부재 하에서만 시험되었다.
C5 결합 Z 변이체의 C5 코팅된 ECL 플레이트에 대한 항정 상태 결합: 인간 C5에 대한 Z 변이체 (도 4에 구체화된 구축물에서 ABD094 (서열 759)에 임의로 융합된 서열 745, 서열 748-757)를 포함하는 많은 C5 결합 구축물의 친화도는 루테늄 표지된 C5 결합 Z-ABD 변이체 (GS-링커에 의해 서열 759에 융합된 서열 748)의 치환에 의해 측정하였다.
추적자(tracer)로서 사용되는 Z-ABD 변이체 (GS-링커에 의해 서열 759에 융합된 서열 748)는 1:12 내지 1:20 (단백질: 술포-태그(SULFO-TAG)NHS-에스테르, 메조 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery), cat. no. R91AN-1)으로 표지하였다. 표지 반응은 빙상에서 2시간 동안 수행하였다. 결합되지 않은 술포-태그는 제바(Zeba)™ 스핀 탈염 칼럼 (써모 사이언티픽, cat no. 89889)을 이용하여 제거하고, 최종 단백질 농도는 브래드포드(Bradford) 시약 (문헌 [Bradford, M.M., Anal. Biochem. 72: 248-254, 1976])을 사용하여 측정하였다. 술포-태그 표지된 Z-ABD 변이체의 친화도 (해리 상수, KD)는 C5 코팅된 전기화학발광 웰 (ECL, 메조 스케일 디스커버리)에 대한 증가하는 농도의 표지된 Z-ABD 변이체의 포화 결합 분석에 의해 결정하였다. 표지된 Z-ABD 변이체를 Z-ABD 변이체에 대한 술포-태그 분자의 분포를 결정하기 위해서 LC/MS에 의해 추가로 분석하였다.
치환은 ECL, 다중-어레이 96-웰 고-결합(high-bind), 비-코팅된 (메조 스케일 디스커버리, cat. no. L15XB) 플레이트를 4℃에서 밤새 50 fmol/웰 hC5로 코팅함으로써 수행하였다. 후속적으로, 비-특이적 부위를 1% 카세인이 존재하는 PBS로 2시간 동안 RT에서 차단하였다. 임의로 ABD094 (서열 759)와 융합된 상이한 Z 변이체 (도 4 참조)를, 상이한 농도에서 1% 카세인이 존재하는 PBS 내의 약 100 pM의 술포-태그 표지된 C5 결합 Z-ABD 변이체와 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션을 300 rpm에서 플레이트를 교반하면서 RT에서 3시간 지속하였다. 마지막으로, 인큐베이션을 150 ㎕ 빙냉 PBS-트윈20으로 3회 세척함으로써 종료하였다. 최종 세척 직후에, 150 ㎕ 2x 판독 완충제 (초순수 H2O에 1:1 희석된 4x 판독 완충제 T, 메조 스케일 디스커버리 cat. no. R92TC-3)를 각각의 웰에 첨가하고, 신호를 플레이트 판독기 (섹터 이미저(SECTOR Imager) 2400, 메조 스케일 디스커버리)를 사용하여 검출하였다. 자연 발생 C5 결합 단백질 OmCI (Nunn et al. 상기 문헌, 서열 761)는 양성 대조군으로서 치환 검정에 포함되었다. C5에 대한 경쟁하는 C5 결합 구축물 및 대조군의 결합 친화도는 엑셀 플러그인(Excel plugin) XLfit5 및 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 4를 사용하여 비-선형 회귀 분석에 의해 결정하였다.
C3, C4 및 IgG보다 C5에 대한 Z-ABD 결합의 선택성: 하나의 Z-ABD 변이체 (GS-링커에 의해 서열 759에 융합된 서열 748)의 인간으로부터의 밀접하게 관련된 보체 단백질 C3 및 C4에 대한 결합 및 인간 IgG (Z-도메인, 스타필로코쿠스 단백질 A의 기원이 IgG 결합 단백질이기 때문에)에 대한 결합은 비아코어 2000 기기 (지이 헬쓰케어)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 평가하였다. Z-ABD 구축물은 아민 커플링 (70 RU)을 사용하여 CM5 칩 (지이 헬쓰케어) 상에 고정하였다. HBS-P 완충제 (지이 헬쓰케어) 내에 희석된 40 nM 및 400 nM의 각각의 인간 C3 (A401, 퀴델), C4 (A402, 퀴델) 및 IgG (I2511, 시그마)를 표면 상에 주입하였다. 각각의 주입 후에, 20 mM NaOH를 30s 동안 주입하여 재생 사이클을 수행하였다. 동일한 농도의 인간 C5를 양성 대조군으로서 병행하여 시험하였다.
결과
클로닝 및 단백질 생산: "Z"가 서열 745 및 서열 748-757에 의해 표시될 수 있는, 도 4에 도식적으로 설명된 바와 같은 생산된 단백질 변이체를 MALDI-TOF MS 및 SDS-PAGE로 분석하였다 (도 5).
용혈의 억제: C5 결합 Z 변이체의 하위세트를 시험관내 C5 결합 활성 및 양 적혈구에서 용혈의 억제를 검정하였다. 용혈의 50% 억제 (IC50) 또는 인간 C5에 대한 추적자 결합의 50% 억제를 생성하는 Z 변이체의 농도를 계산하였다. 방법 섹션에서 설명된 바와 같이 용혈을 억제하는 서열 745 및 서열 748-757로서 제시된 Z 변이체에 대한 대표적인 농도-반응 곡선을 도 6a 및 6b에 제시한다. 짧은 GS-링커를 통해 ABD094 (서열 759)에 융합된 상이한 Z 변이체를 도 6a에 제시한다.
짧은 GS 링커에 의해 분리된, ABD094 (서열 759)에 융합된 모 Z 변이체 Z05477a (서열 745)는 약 100 nM의 IC50 값을 보인 반면, 시험된 제2 세대 C5 결합 Z-ABD 변이체는 일반적으로 약 1 nM 또는 그 미만의 IC50 값으로 용혈을 억제하였다. 이것은 성숙 선택 및 후속적인 스크리닝에서 확인된 C5 결합 Z 변이체에 대해 효능의 100배 초과의 증가를 제시한다.
도 6b에서, C5 결합은 하나의 대표적인 Z 변이체 (Z06175a; 서열 753)의 단독으로서, 이량체로서, 및 도면에서 구체화된 상이한 링커를 통해 N-말단 또는 C-말단에서의 ABD094 (서열 759)와의 융합체로서의 다양한 조합에 대해 제시된다. C5 결합 조합물은 상기 설명된 검정을 사용하여 측정시에 인간 혈청에 대해 86 pM 내지 12 nM의 IC50 값을 보였다. 진드기 단백질 OmCI에 대해 상응하는 값은 일반적으로 300 내지 500 pM이었다.
시험관내 동역학: 인간 알부민의 존재 하에 ABD094 (서열 759), 고정된 hC5, 및 C5에 임의로 융합된 다수의 Z 변이체 (서열 748-757)에 대한 결합 특성의 동역학적 연구는 비아코어 T200 기기를 이용하여 수행하였다.
GS 링커를 통해 ABD094에 융합된 10가지의 상이한 Z 변이체에 대한 데이터를 표 6에 제시한다.
Figure pat00007
상이한 구축물에서; 즉, ABD 및 상이한 링커가 존재하거나 존재하지 않는 구축물에서 동일한 Z 변이체 (서열 753)의 결합을 또한 비아코어 T200을 사용하여 분석하였다. 또한, 몇몇 Z-ABD 융합체에 대한 알부민의 효과를 인간 알부민의 부재 하에 및 존재 하에 동일한 분석을 수행하여 평가하였다. 상기 데이터를 하기 표 7에 제시한다.
Figure pat00008
놀랍게도, 알부민의 존재 하에 및 부재 하에 hC5 (서열 760)에 대한 구축물의 친화도를 비교할 때 작은 효과를 볼 수 있엇다. 이것은 구축물의 ABD 모이어티에 대한 알부민의 동시 결합이 C5 상호작용을 저해하지 않음을 시사한다.
C5 코팅된 ECL 플레이트에 대한 C5 결합 Z 변이체의 항정 상태 결합: 도 4에 구체화된 구축물에서 ABD094 (서열 759)에 임의로 융합된 상이한 Z 변이체 (서열 745 및 748-757)로 이루어진 C5 결합 구축물의 hC5에 대한 항정 상태 결합을 경쟁 검정으로 평가하였다. ECL 플레이트 상에 코팅된 C5에 대한 결합을 위해 ABD (서열 759)에 융합된 술포-태그 표지된 C5 결합 Z 변이체 (서열 748)와 경쟁시킴으로써 C5 구축물의 항정 상태 결합을 평가하였다. 비교로서, 진드기 단백질 OmCI (서열 761)도 포함되었다. 서열 748을 함유하는 표지된 Z-ABD 변이체의 hC5에 대한 친화도 (Kd)는 0.9 nM이었다. 상기 표지된 Z-ABD 변이체는 0.34 nM의 Kd로 농도-의존성 방식으로 Z 변이체의 불변 영역에 특이적인 항체에 결합하는 것으로 추가로 밝혀졌다.
GS 링커에 의해 ABD094 (서열 759)에 카르복시 말단에서 융합된 C5 결합 Z-변이체 (서열 748-757)는 약 300 pM 내지 1 nM의 IC50 값으로 200 pM 술포-태그 표지된 Z-ABD 변이체를 치환하는 것으로 밝혀진 반면 (도 7a), 모 Z 변이체 Z05477a (서열 745)를 함유하는 상응하는 구축물은 약 30 nM의 친화도 IC50 값을 보였다. 이와 대조적으로, 자연 발생 C5 결합 단백질 OmCI는 1.5 nM의 IC50으로 hC5에 결합하는 것으로 밝혀졌다 (도 7a). 따라서, 모든 시험된 제2 세대 Z 변이체 (서열 748-757)는 모 Z 변이체 Z05477a (서열 745)보다 인간 C5에 대해 보다 높은 결합 친화도를 보였다. 또한, 친화도는 동일한 방법을 사용할 때 인간 C5에 대한 OmCI 결합보다 더 높았다.
ABD가 존재하거나 존재하지 않는 단량체, 이량체로서 동일한 C5 결합 도메인, 및 상이한 도메인 사이에 몇 개의 상이한 링커를 함유하는 많은 상이한 구축물을 또한 시험하였다 (도 7b). Z06175a의 단량체 변이체 (서열 753, His6-태그 또는 C-말단 ABD에 임의로 융합됨) 및 C-말단 ABD 링커가 존재하는 이량체 변이체는 약 500 pM 내지 1.7 nM의 IC50 값으로 200 pM 술포-태그 표지된 Z-ABD 변이체를 치환하는 것으로 밝혀진 반면, ABD가 존재하지 않는 이량체 변이체 및 N-말단 ABD가 존재하는 단량체 변이체는 각각 4 nM 및 17 nM의 IC50 값으로 200 pM 술포-태그 표지된 Z-ABD를 치환하였다.
선택성: 선택성은 SPR 분석을 사용하여 결정하였고, 고정된 Z-ABD 변이체 (GS-링커에 의해 서열 759에 융합된 서열 748)를 갖는 표면은 40 및 400 nM의 C5 파라로그(paralog)인 인간 C3 및 C4 및 인간 IgG에 적용될 때 유의한 SPR 신호를 보이지 않았다. 비교로서, 400 nM 인간 C5는 약 450 RU의 SPR 반응을 유도하였고, 이것은 시험된 Z-ABD 변이체가 실제로 C3, C4 및 IgG보다 C5에 대해 선택적임을 보여준다.
실시예 7: 래트 및 마우스로부터의 HSA, BSA 및 혈청 알부민을 사용한 Z-ABD 변이체의 상호작용 연구.
물질 및 방법
C5 결합 Z 변이체에 융합된 알부민 결합 도메인 ABD094 사이의 상호작용을 연구하기 위해 2개의 상이한 방법, 즉 크기 배제 크로마토그래피 및 비아코어를 사용하였다.
Z06175a-GS-ABD094 (GS 링커에 의해 서열 759에 융합된 서열 753)와 HSA 사이의 상호작용을 연구하기 위해 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 이용하였다. 간단히 설명하면, 등몰량의 Z06175a-GS-ABD094 및 재조합 HSA (노보자임스)를 실온에서 60분 동안 PBS 내에서 인큐베이션한 후, SMART 시스템 (지이 헬쓰케어)을 사용하여 슈퍼덱스(Superdex)200 칼럼 (지이 헬쓰케어)에서 이동시켰다. Z06175a-GS-ABD094 및 HSA도 대조군으로서 별개로 이동시켰다.
고정된 알부민에 대한 결합을 비아코어 2000 기기 (지이 헬쓰케어)를 사용하여 연구하였다. 재조합 인간 알부민 (리콤부민(Recombumin)®, 노보자임스)을 제조자에 의해 설명된 바와 같이 아민 커플링 화학을 사용하여 CM5 센서 칩 (385 RU)에 커플링하였다. 커플링은 10 mM Na-아세테이트 완충제 pH 4.5 (지이 헬쓰케어) 내의 인간 알부민을 주입함으로써 수행하였다. 참조 세포를 동일한 시약으로 처리하되, 인간 알부민은 주입하지 않았다. HBS-EP의 주입이 또한 센서그램이 이중 블랭크되도록 대조군으로서 포함되었다. 실험은 HBS-EP 완충제 내에서 수행하였고, 10 mM 글리신-HCl pH 2 (지이 헬쓰케어)를 재생을 위해 사용하였고, 유량은 30 ㎕/min이었고, 데이터는 25℃에서 수집하였다. 2개의 상이한 구축물 Z-ABD (Z06175a-GS-ABD094) 및 Z-ABD-Z (Z06175a-GS-ABD094-GSGGGGSGGGGS-Z06175a)를 3개의 상이한 농도, 즉 25 nM, 100 nM 및 400 nM에서 시험하였다. 비아이벨류에이션 버전 4.1.1을 센서그램 데이터 평가를 위해 사용하였다. 유사한 방식으로, 래트 (A4538, 시그마), 마우스 (A3559, 시그마), 및 소 (BSA, 시그마)로부터의 혈청 알부민으로 고정된 표면에 대한 Z-ABD (Z06175a-GS-ABD094)의 결합도 조사하였다.
결과
SEC 칼럼에서, 보다 큰 분자는 작은 것보다 더 빠르게 용리된다. 도 8a에서 볼 수 있는 바와 같이, 동시-주입된 HSA+ Z06175a-GS-ABD094는 HSA가 단독으로 주입된 경우보다 더 빠르게 용리되고, 이것은 2개의 분자가 상기 조건 후에 안정한 복합체로서 거동함을 시사한다. 보다 작은 Z06175a-GS-ABD094는 복합체 또는 HSA 단독보다 더 느리게 용리되고, 이것은 이들 단백질 단독이 복합체보다 더 작음을 보여준다.
분석된 Z-ABD 및 Z-ABD-Z 변이체에 대한 비아코어 2000 데이터는 ABD가 어느 한 측면에서 Z-도메인에 인접할 때보다 Z-ABD가 더 빠른 온-레이트(on-rate)를 갖는다는 것을 보여준다 (도 8b). ABD 융합된 Z 도메인의 결합 친화도에 대한 분석은 Z-ABD에 대한 친화도가 1 nM 미만인 반면, Z-ABD-Z 변이체는 1 nM 초과의 KD로 고정된 HSA에 결합함을 보여준다.
Z06175a-GS-ABD094는 래트 혈청 알부민에 매우 높은 친화도 (KD < 100 pM)로 결합한 반면, 고정된 마우스 혈청 알부민과의 상호작용은 인간 및 래트 혈청 알부민 둘 모두보다 더 약하였다 (약 4 nM의 KD). 소 혈청 알부민과의 상호작용은 측정가능하지 않았다.
이들 데이터는 ABD의 초기 변이체에 대해 발표된 데이터와 잘 일치하고 (문헌 [Jonsson et al. Protein Engineering, Design & Selection 2008, 21: 515-527]), 시험된 Z-ABD 변이체가 임상에 관련된 농도에서의 인간에서, 그리고 동물과 인간 사이의 약동학적 데이터의 비교를 허용하는 마우스 및 래트에서 혈청 알부민에 강력하게 결합함을 보여준다.
실시예 8: 래트에서 C5 결합 Z 변이체의 약동학적 연구
물질 및 방법
설치류 생애기(in-life phase): 2개의 C5 결합 구축물 Z-ABD (Z06175a-GS-ABD094; GS 링커에 의해 서열 759에 융합된 서열 753, 도 4, 구축물 2) 및 Z-ABD-Z (Z06175a-GS-ABD094-GSGGGGSGGGGS-Z06175a; GS 링커, 이어서 GS(G4S)2 링커 및 제2 서열 753 모티프에 의해 서열 759에 융합된 서열 753, 도 4, 구축물 5)의 약동학을 수컷 스프라그 돌리 (SD) 래트 (250-300 g 체중)에서 연구하였다. 각각의 래트에게 Z-ABD 또는 A-ABD-Z (n=3/투여군)를 단일 용량으로 i.v. (250 nmol/kg) 또는 s.c. (500 nmol/kg) 투여하였다. 혈액 샘플 (200 ㎕)을 i.v. 군에 대해 투여 후 5, 20, 및 45 min, 및 1.5, 4, 7, 24, 48, 72, 120, 168, 240, 및 336 h에, s.c. 군에 대해 투여 후 15 및 30 min, 1, 2, 4, 7, 24, 48, 72, 120, 168, 240, 및 336 h에 채취하였다. 혈액을 튜브에 수집하고, 냉장고에 20 min 동안 두어 응고시켰다. 이어서, 4000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후 혈청을 수집하였다. 혈청 샘플을 -70℃에서 분석시까지 보관하였다.
LC/LC/MS/MS를 사용하여 동물로부터의 혈청 샘플 내의 C5 결합 Z 변이체 농도의 결정: 상기 설명된 바와 같이 투여된 C5 결합 구축물 Z-ABD 및 Z-ABD-Z의 혈청 농도는 질량 분광측정법 (LC/LC/MS/MS)에 의해 결정하였다.
혈청 또는 혈장 샘플 (25 ㎕)을 500 ㎕ 에펜도르프(Eppendorf) 튜브 내의 1 M 암모늄 포르메이트 완충제 pH 3.0에 현탁된 150 ㎕의 펩신 아가로스 (7 mg/ml, 시그마, cat. no. P0609)로 희석하였다. 튜브를 마개로 막고, 37℃에서 20 min 동안 에펜도르프 열혼합기 컴팩트(thermomixer compact)에서 교반하였다. 교반 후에, 0.1% 트리플루오로아세트산 (TFA) 내에 0.5 μM로 희석된 25 ㎕의 내부 표준 용액 I (13C6; 15N)NKLDDDPSQSSEL (서열 746-757의 아미노산 31-44) (써모 피셔 사이언티픽 게엠베하(Thermo Fisher Scientific GmbH))을 첨가하였다. 내부 표준물질의 첨가 후에, 샘플을 혼합하고, 0.45 ㎛ 셀룰로스 스핀 필터 (그레이스(Grace))를 통해 여과하였다.
보정을 위한 표준물질 샘플은 공지의 단백질 농도 (5-10 mg/ml)를 갖는 20 ㎕의 단백질 원액 용액을 칭량한 후, 분석되는 종으로부터의 블랭크 혈장으로 희석하여 제조하였다. 제1 원액 혈장 표준물질 (3 μM)을 0.1 μM로 추가로 희석하였다.
40 ㎕의 샘플을 커플링된 칼럼 시스템에 주입한 후, 다중 반응 모니터링 (MRM)과 함께 직렬 질량 분광측정법을 수행하였다. 제1 칼럼은 5 ㎛ 입자 (2.1 x 150 mm, 수펠코(Supelco))가 충전된 아센티스(Ascentis) RP-아미드 칼럼이었다. 농축 칼럼으로서 7㎛ C18 입자가 충전된 브라운리 뉴가드(Brownlee newgard) 칼럼 (3.2 x 15 mm)을 사용하여 제1 칼럼으로부터 분석물 펩티드 분획을 포획하였다. 제1 칼럼으로부터의 배출액을 회전 혼합기 (리 사이언티픽(Lee Scientific)) 내로 시마즈(Shimadzu) 펌프에 의해 펌핑된 1 ml/min 물로 희석하였다. 마지막 칼럼은 5 ㎛ 입자 프리메셉(Primesep) 100 (시엘크 인크(SIELC Inc))으로 충전된 혼합 방식의 역상 및 양이온 교환 칼럼 (2.1 x 100 mm)이었다.
제1 액체 크로마토그래프 (액퀴티(Acquity) UPLC)에 제공된 제1 칼럼 (RP-아미드)에 대한 이동상은 A: 2% 아세토니트릴, 0.1% 아세트산, 0.1% TFA, 및 97.8% 물, 및 B: 0.1% 아세트산 및 0.02% TFA가 존재하는 아세토니트릴이었다. 유량은 0.5 ml/min이고, 용리를 위해 선형 구배를 이용하였다. 샘플을 100% A를 갖는 등용매 조건에서 1 min 동안, 이어서 7.9 min에 80% A에서 용리하였다. 8.1 min에서, 칼럼을 100% B로 1분간 세척한 후, 100% A로 재컨디셔닝하였다. 칼럼으로부터 배출액을 질량 분광계 소프트웨어로부터 제어된 밸코(Valco) 6 포트 밸브에 연결하였다.
트랩 칼럼 (3.2 x 15 mm)을 6 포트 밸브에 역 플러시(back flush) 방식으로 연결하였다. 제2 칼럼에 대한 이동상 (제2 액체 크로마토그래프 (애질런트 1100) 상에 제공됨)은 0.5 ml/min으로 애질런트 1100 액체 크로마토그래프에 의해 펌핑된 A: 80% 아세토니트릴, 19.9% 물, 및 0.1% 포름산, 및 B: 80% 아세토니트릴, 19% 물, 0.5% 아세트산 및 0.5% TFA이었고, 다음 구배를 이용하여 용리하였다: 처음 5분 동안 100% A, 이어서 5 내지 10분 동안 B를 0에서 40%로 점차 상승시킨 후, 다음 6초 동안 100% B로 상승시킴 (10 내지 10.1분). B는 11.5분까지 100%로 유지한 후, 다음 6초 동안 0% (100% A)로 하강시키고 (11.5 내지 11.6분), 13분에 중지할 때까지 사이클 전체에서 0% B를 유지하였다.
마지막 칼럼으로부터 배출액을 양이온 방식으로 작동하는 전기분무 이온 공급원이 장치된 삼중 4중극 질량 분광계 (Sciex API 4000)에 연결하였다. MRM 전이는 분석물에 대해 780.9>814.4 및 내부 표준물질에 대해 784.5>821.4이었다. 디클러스터링(declustering) 전위는 55 V에서 최적화되고, 충돌 에너지는 35 V로 최적화되었다. 단일 하전된 단편 이온을 제공하는 전구체 이온은 이중 하전되었으므로, 유효 충돌 에너지는 70 eV이었다. 정량을 위해 분석물 및 내부 표준물질 사이의 피크 면적비를 이용하였다. 85%의 회수율 및 약 40 nM의 정량 한계를 갖는 선형 보정 곡선을 얻었다.
생체외 용혈: 상기 설명한 생체내 연구로부터 혈청 샘플에 대한 생체내 조건을 적합하게 모으기 위해 보체 활성화에 대한 생체외 용혈 검정을 수행하였다. 혈청 샘플을 5백만개의 항체 감작화된 양 적혈구 (EA)를 포함하는 웰당 25 ㎕의 총 반응 부피로 5x 희석하였다. 일반적으로, 모든 다른 성분을 함유하는 20 ㎕ EA 현탁액 일부 (실시예 6 참조)를 37℃에서 용혈 활성화를 개시하기 위해 5 ㎕ 혈청 샘플과 혼합하였다 (교반 10분). 그러나, 실시예 11에서와 같은 마우스 혈청 샘플에 대해, 1 ㎕ C5D가 20 ㎕ EA 현탁액 내에 포함되어야 한다. 생체외 검정은 본질적으로 실시예 6의 시험관내 검정에 대해 설명된 바와 같이 수행하였다.
계산: 약동학적 파라미터의 평가는 개별적인 혈청 농도 데이터에 기반하였고, 평균 (±stdev)를 각각의 투여군에 대해 보고한다. 말단 샘플링 지점에서 나타나는 정량 하한 미만 수준 (LLOQ)은 약동학 분석에서 생략하였다. 최대 혈청 농도 (Cmax), 및 관찰된 최대 혈청 농도까지 시간 (tmax)을 혈청 농도 데이터로부터 직접 얻었다.
약동학적 파라미터; 곡선하 면적 (AUC, AUC0-∞ 및 AUC0-최종은 선형 사다리꼴 방법에 의해 계산함), 피하 생체이용률 (F, (AUCsc/AUCiv)*(용량iv/용량sc)로서 계산함), 말단 혈청 반감기 (T1/2,z, ln 2/λz (여기서, 말단 기울기 (λz)의 추정은 적어도 4 C=f(t) 관찰에 기반함)로서 계산함), 평균 체류 시간 (MRT, AUMC/AUC로서 계산함), 혈청 클리어런스율 (CL, 용량/AUC0-∞로서 계산함), 항정 상태에서 분포 부피 (Vss, CL*MRT로서 계산함) 및 말단기에서 분포 부피 (Vz, CL/λz로서 계산함)를 윈논린(WinNonlin) 소프트웨어 버전 5.2.1 (파사이트 코포레이션(Pharsight Corp., 미국)), 비-구획(Compartmental)-분석을 이용하여 계산하였다.
결과
i.v. (250 nmol/kg) 및 s.c. (500 nmol/kg) 투여 이후 Z-ABD 및 Z-ABD-Z에 대한 약동학적 데이터를 표 8에 요약한다. Z-ABD는 i.v. 군에서 투여 10-14일 후 및 s.c. 군에서 14일까지 혈청 내에서 정량가능한 반면, Z-ABD-Z는 두 투여군 모두에서 투여 10일 후까지 혈청 내에서 정량가능하였다 (도 9). 14일이 마지막 샘플링 시점이었다.
C5 결합 폴리펩티드의 혈청 농도를 양 적혈구 내에서 용혈의 양과 상관시키면, 설명된 조건 (예를 들어, 혈청 희석 1:5) 하에 용혈의 완전한 억제가 1 μM을 넘는 혈청 농도에서 Z-ABD에 의해 얻어진 반면 (도 12), Z-ABD-Z는 약 0.5 μM 혈청 농도에서 완전한 억제에 도달한 (도 13) 것으로 밝혀졌다. 놀랍게도, 도 9 및 표 8에 보이는 바와 같이, Z-ABD는 Z-ABD-Z보다 더 낮은 혈청 클리어런스율, 더 긴 말단 혈청 반감기 및 더 높은 생체이용률을 갖는다. 시간의 면에서, 이것은 S.D. 래트에 대한 250 nmol/kg Z-ABD (도 10) i.v. 또는 500 nmol/kg s.c (도 11)의 투여 후 약 3일 동안 용혈의 완전한 억제를 일으킨다.
Figure pat00009
실시예 9: 원숭이에서 C5 결합 Z 변이체의 약동학적 연구
물질 및 방법
생애기 연구를 찰스 리버(Charles River, 미국 네바다주 (www.criver.com))에서 수행하고, 투여된 약물의 제조 및 혈청 샘플의 분석은 사내에서 수행하였다. Z-ABD 변이체 (GS 링커에 의해 ABD094 (서열 759)에 융합된 Z06175a (서열 753))의 약동학을 i.v. (정맥내) 및 s.c. (피하) 투여 후 수컷 시노몰구스 원숭이 (n=3)에서 조사하였다. 약동학적 파라미터의 평가는 실시예 8에 따라 수행하였지만, i.v. 투여 후, 로그-선형 혈청 농도-시간 곡선의 초기의 기울기에 상응하는 초기의 혈청 반감기 (T1/2α), 2차 (중간)기와 연관된 로그-선형 혈청 농도-시간 곡선의 기울기에 상응하는 중간 혈청 반감기 (T1/2β), 및 로그-선형 혈청 농도-시간 곡선의 말단 기울기에 상응하는 말단 혈청 반감기 (T1/2γ)를 결정하였다. T1/2은 ln 2/λ로서 계산하였고, 여기서 기울기 λ의 추정은 적어도 4 C=f(t) 관찰에 기반하였다. sc 투여에 대해 제시된 약동학적 데이터는 Z-ABD의 투여전 수준에 대해 보정한 반면, 혈청 농도 대 sc 투여 후 시간을 보여주는 그래프는 결정된 실제 혈청 농도를 보여주었다. 원숭이는 체중 2.3-3 kg의 2-4령이었다. 각각의 원숭이에게 단일 i.v. 투여 (540 nmol/kg)에 이어, i.v. 투여의 3주 후에 단일 s.c. 투여 (1635 nmol/kg)를 시행하였다. 혈액 샘플은 두가지 투여 이후 투여의 10 및 30분, 및 1, 2, 4, 8, 24, 48, 72, 120, 168, 240, 336 및 504시간 후에 취하였다. 혈액 샘플을 20-40분 동안 실온에서 응고시킨 후, 1500 내지 2200 RCF에서 2-8℃에서 10-15분 동안 원심분리한 다음, 혈청을 수거하고 동결시켰다. 혈청 샘플은 분석시까지 -20℃ 미만의 온도에서 보관하였다.
Z-ABD의 혈청 농도는 실시예 8에 설명된 바와 같이 LC/LC/MS/MS에 의해 분석하였다. LC/LC/MS/MS에 의해 결정된 혈청 농도를 또한 정량적 샌드위치(sandwich) 효소 면역검정 기술에 의해 확인하였다. Z-ABD의 Z 구획에 특이적인 폴리클로날 항체를 마이크로플레이트 상으로 코팅하였다. 비결합된 폴리클로날 항체를 세척 제거하고, 플라스틱 표면에 대한 비특이적 결합을 감소시키기 위해 차단제로서 카세인을 첨가하였다. 샘플 및 표준물질을 0.5% 카세인을 함유한 PBS 및 1-5% 원숭이 정상 혈청 내에 희석하였다. 비결합된 카세인을 세척 제거한 후, 표준물질 및 샘플을 웰에 피펫팅하여, 샘플 내에 존재하는 임의의 Z-ABD (주로 혈청 알부민과 회합된 것으로 추정된)가 고정된 항체에 결합하도록 하였다. 임의의 비결합된 Z-ABD를 세척 제거한 후에, 비색 방법에 의해 고정된 Z-ABD-알부민 복합체를 검출하기 위해 알부민에 특이적인 HRP 표지된 폴리클로날 항체를 첨가하였다. 비결합된 폴리클로날 항체를 세척 제거하고, 기질 용액을 웰에 첨가하였고, 결합된 Z-ABD의 양에 비례하여 색상이 발색하였다. 약동학적 파라미터의 평가 및 계산은 실시예 8에 설명된 바와 같이 수행하였다.
상기 설명한 Z-ABD 변이체를 투여한 시노몰구스 원숭이로부터의 혈청 내 생체외 용혈을, 실시예 6 및 8에 설명된 방법을 이용하여 모니터링하였고, 단, 원숭이 혈청은 설치류 혈청에 대한 5배에 비해 단지 2배 희석하였다.
결과
각각의 투여군의 평균 (±stdev) 약동학에 대한 데이터를 제시한다. Z-ABD의 혈청 농도는 LC/LC/MS/MS에 의해 i.v. 및 s.c. 투여 이후 모든 시점에 정량가능하였다 (도 14). ELISA 데이터 및 LC/LC/MS/MS 데이터는 0.986의 계수에 의해 선형으로 상호관련되었지만, LC/LC/MS/MS 데이터를 계산을 위해 사용하였다. Z-ABD의 i.v. 투여 이후, 초기의 혈청 반감기는 9.1 (0.8)시간이고, 중간 혈청 반감기는 84 (4)시간이고, 말단 혈청 반감기는 198 (51)시간이었다. 평균 체류 시간은 246 (62)시간이었다. 분포 부피, Vss 및 Vz는 각각 110 (23) ml/kg 및 127 (27) ml/kg로 계산되었고, 클리어런스율은 0.45 (0.02) mL/h*kg로 추정되었다.
s.c. 투여 후에, i.v. 투여로부터 남은 투여전 혈청 수준에 대해 교정할 때, 최대 혈청 농도 (평균 Cmax 21(3) μM)는 투여 8-24 h 후에 도달하였다. 말단 혈청 반감기는 206 (40)시간이고, 평균 체류 시간은 250 (68)시간이었다. 피하 생체이용률은 70%를 초과하는 것으로 추정되었다.
주사한 Z-ABD 변이체 (GS 링커에 의해 ABD094 (서열 759)에 융합된 Z06175a (서열 753))의 약역학적 효과를 용혈에 의해 모니터링하였다. 시노몰구스 원숭이에서 용혈 효과는 5 mg/kg Z-ABD i.v. 및 15 mg/kg Z-ABD s.c의 투여 후 적어도 7일 동안 완전히 억제되었다 (≤ 투여 전의 20%).
실시예 10: 지모산 유도된 복강염을 이용한 생체내 연구
물질 및 방법
마우스에 대한 투여: C57BL/6 암컷 마우스에게 상이한 농도의 Z-ABD 융합 분자 (Z06175a-GS-ABD094, GS 링커에 의해 서열 759에 융합된 서열 753) 또는 양성 대조군 OmCI를, 지모산을 사용한 유도 1시간 전에 복강내로 (i.p.), 또는 지모산을 사용한 유도 18시간 전에 피하 (s.c.) 투여하였다.
0.8 mg/마우스의 지모산을 i.p. 투여하였다. 1시간 후에 눈 혈액 샘플 (응고 활성화제를 담은 혈청 바이알 내에)을 이소플루란 마취 하에 취하였다. 동물을 경추 탈구에 의해 치사시켰다. 피부 절개를 만들고, 복부 근육벽이 보이도록 하였다. PBS 용액 (2 mM EDTA 포함)을 복강 내로 부드럽게 주사하였다. 복부를 마사지하고, 유체의 샘플 (1-2 ml)을 취하였다. 샘플을 시험관에 옮기고, 습윤 얼음 상에서 보관한 후, 600 g에서 10 min 동안 원심분리하였다. 상청액 내의 총 단백질 및 C5a 농도를 분석하였다.
혈액 샘플을 적어도 30 min 동안 냉장고 내에서 유지하고, 그 후에 2000 g에서 원심분리를 수행하였다. Z06175a-GS-ABD094의 용혈 활성 및 수준의 나중의 분석을 위해 혈청 샘플을 냉동기 (-70℃) 내에서 보관하였다.
동물로부터의 혈청 샘플 내 용혈 활성의 분석: 용혈 활성의 분석은 실시예 6 및 7에 설명된 용혈 검정에 따라 수행하였다.
지모산 및 C5 결합 Z-ABD 융합 분자를 투여한 마우스로부터의 세척액 내 C5a 농도의 분석: 마우스 복강 세척액 샘플 내에서 C5a의 검출을 위해, 마이크로타이터 플레이트 (맥시소르프(MaxiSorp), 눈크)를 0.05 M 탄산나트륨-비카르보네이트 완충제, pH 9.6 (cat. no. C-3041, 시그마) 내의 1 ㎍/ml의 농도의 100 ㎕/웰의 항-C5a 항체 (cat. no. MAB21501, 알앤디 시스템즈(R&D Systems))로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS (PBST, cat. no. 09-9410-100, 메디카고(Medicago))로 3회 세척하고, 450 rpm에서 교반하면서 1-1.5 h 동안 RT에서 200 ㎕/웰의 PBST 내의 1% BSA (cat. no. A7030, 시그마)로 차단하였다. 플레이트를 다시 PBST로 3회 세척한 후, 0.1% BSA를 함유한 PBST 내의 다양한 농도의 100 ㎕/웰의 재조합 마우스 C5a 표준물질 (cat. no. 2150-C5, 알앤디 시스템즈), 또는 샘플과 함께 2 h 동안 RT에서 450 rpm에서 교반하면서 인큐베이션하였다. 고농도 샘플은 또한 0.1% BSA를 함유한 PBST 내에 희석하였다. 플레이트를 다시 한번 PBST로 3회 세척한 후, 100 ㎕/웰의 비오티닐화된 항-C5a 항체 (cat. no. BAF2150, 알앤디 시스템즈)와 함께 0.1 ㎍/ml의 농도에서 1.5 h 동안 RT에서 플레이트를 450 rpm에서 진탕하면서 인큐베이션하였다. PBST로 3x 세척한 후에, 플레이트를 차단 완충제 내에 200배 희석한 100 ㎕/웰의 스트렙타비딘-HRP (cat. no. DY998, 알앤디 시스템즈)과 함께 20 min 동안 RT에서 450 rpm에서 교반하면서 인큐베이션하였다. 3회의 마지막 세척 후에, 플레이트를 100 ㎕/웰 TMB 기질 (cat. no. T0440, 시그마)로 발색시키고, 20-30 min 후에 650 nm에서 스펙트라맥스 플러스(Spectramax Plus) 플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시즈(Molecular Devices))를 사용하여 판독하였다.
표준 곡선은 각각의 표준물질에 대한 650 nm에서의 흡광도를 그의 농도 (범위 0-4000 pg/ml)에 대해 그래프로 그려 작성하였다.
ECL을 이용한 동물로부터의 혈청 샘플 내 Z 변이체 농도의 결정: 투여된 C5 결합 Z06175a-GS-ABD094 (GS 링커에 의해 서열 759에 융합된 서열 753) 및 Z06175a-GS-ABD094-GSGGGGSGGGS-Z06175a (GS 링커에 의해 서열 759에 융합된 서열 753에 이어, GS(G4S)2 링커 및 제2 서열 753 모티프, 구축물 설명에 대해서는 도 4를 참조)의 혈청 농도를 ECL에 의해 결정하였다. 다중-어레이 96-웰 고-결합, 비-코팅된 (메조 스케일 디스커버리 cat. no. L15XB) 플레이트를 염소 항-아피바디 분자 Ig (아피바디 AB, cat. no. 20.1000.01.0005)로 코팅하였다.
실시예 6과 유사하게, Z-ABD 변이체 (ABD094 (서열 759)에 융합된 Z06009a (서열 748)) 다중-어레이 플레이트를 염소 항-아피바디 분자 IgG (아피바디 AB)로 4℃에서 밤새 코팅하고, 후속적으로 비-특이적 부위를 RT에서 2시간 동안 1% 카세인을 함유한 PBS로 차단하였다.
한편, 혈청 샘플을 -70℃로부터 해동하고, 동일한 동물주로부터의 혈청 내의 카세인을 함유한 PBS 내에 희석하였다. 표준물질 및 대조군을 상응하는 완충제 내에 희석하였다. 샘플 및 표준물질을 플레이트를 300 rpm에서 진탕하면서 RT에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션은 3x150 ㎕ 빙냉 PBS-트윈20으로 세척하여 종료하였다. 최종 세척 직후에, 150 ㎕ 2x 판독 완충제 (초순수 H2O 내에 1:1 희석된 4x 판독 완충제 T, 메조 스케일 디스커버리 cat. no. R92TC-3)를 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트 판독기 (섹터 이미저 2400, 메조 스케일 디스커버리)를 사용하여 신호를 검출하였다.
별도의 실험에서, 플레이트를 인간 C5 (서열 760, 1 pmol/웰)로 코팅하였다. 코팅된 플레이트에 첨가하기 전에, 내인성 C5를 변성시키기 위해 혈청 샘플 및 표준물질 (혈청 내에 또는 혈청 및 카세인을 포함한 PBS 내에 희석시킨) (모든 샘플 및 표준물질은 동일한 혈청 농도로 일치시켰다)을 30 min 동안 60℃로 가열하였다. 상기 별도의 실험은 C5 결합 단백질의 독점적인 검출을 위한 방법을 제공한 한편, 상기 설명된 항체 의존성 전략은 그의 특정 항체에 결합하는 모든 단백질에 적용될 수 있다.
결과
Z-ABD의 혈청 농도 및 동물로부터의 혈청 샘플 내 용혈 활성의 분석: Z-ABD 융합 분자 (Z06175a-GS-ABD094, 서열 759에 융합된 서열 753에 이어 GS 링커)의 혈청 농도 및 양 적혈구 내에서 용혈에 영향을 미치는 능력을 저용량 (20 nmol/kg), 중간용량 (100 nmol/kg) 및 고용량 (500 nmol/kg)의 투여 후에 평가하였다. 혈청 농도는 용량과 비교적 선형이었고, 용혈의 억제 분석은 혈청 내의 분자가 활성이고 용혈의 억제가 또한 실제로 농도 의존성임을 확인하였다.
지모산 및 C5 결합 Z-ABD 융합 분자를 투여한 마우스로부터의 세척액 내 C5a 농도의 분석: 염증유발 분자 지모산을 i.p. 투여하였고, 도 15에, 세척액 내의 고도의 염증성 C5 절단 생성물 C5a에 대한 영향을, 단독 투여한 지모산, 및 지모산 처리의 18 h 전에 s.c. 투여한 20, 100 및 500 nmol/kg로의 C5 결합 Z 변이체, 또는 지모산 처리의 1 h 전에 i.p. 투여한 OmCI의 투여 후 투여한 지모산의 함수로서 제시한다. 지모산 단독 투여는 세척액 내에 C5a의 강력한 상승을 일으킨다. 상기 효과는 제공된 C5 결합 Z-ABD 융합 분자에 의해 용량 의존 방식으로 차단된다.
실시예 11: 기관내 투여 후 마우스에서 C5 결합 단백질의 약동학적 연구
물질 및 방법
암컷 C57bl 마우스에 기관내 투여 후 C5 결합 구축물 Z06175a-GS-ABD094 (서열 759에 융합된 서열 753에 이어 GS 링커)의 약동학적 프로파일을 연구하였다. 온도, 상대 습도 및 광조건은 22±1℃, 55±5% 및 12 h 명-12 h 암 사이클을 유지하도록 설정하고, 식이 및 물은 자유롭게 제공되었다. 동물을 이소플루란으로 마취하고, 500 nmol/kg Z06175a-GS-ABD094를 마이크로스프레이를 사용하여 폐 내에 직접 투여하였다. 혈청 샘플의 제조를 위해 5 min, 30 min, 1 h, 3 h, 7 h, 16 h, 24 h, 48 h 및 72 h (3마리 동물/시점)에 대정맥으로부터의 가능한 많은 혈액을 이소플루란에 의한 마취 하에 취하였다. 혈청 샘플은 튜브 내에 혈액을 수집하고, 튜브를 20 min 동안 냉장고 넣어 제조하였다. 후속적으로, 튜브를 4000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 각각의 혈액 샘플로부터 최소 100 ㎕ 혈청을 제조하였다. 분석 전에 혈청 샘플을 -70℃에서 유지하였다. 각각의 샘플 내의 Z06175a-GS-ABD094의 혈청 농도는 실시예 10에 설명된 바와 같이 ECL에 의해 결정하고, 양 적혈구 내에서 용혈에 영향을 미치는 혈청 샘플의 능력은 실시예 6 및 8에 설명된 바와 같이 결정하였다.
결과
각각의 샘플 내의 혈청 농도 및 양 적혈구 내에서 용혈에 영향을 미치는 상응하는 능력을 각각 도 16a 및 도 16b에 기재한다. 30분 이내에, 평탄부(plateau)에 도달하였고, 여기서 혈청 농도는 300 내지 1000 nM이고, 이때 용혈은 거의 완전히 차단되었다. 투여 7 h 후가 지난 시점에 샘플링한 혈청에서, 용혈은 점차 재발하였다. 투여 3일 후의 마지막 시점에, 용혈은 대조군의 약 70%이었다 (도 16b). 이들 데이터는 기관내 투여 후 전신 혈류 내로 Z06175a-GS-ABD094의 흡수 및 분자가 용혈을 기능적으로 억제함을 명백하게 입증한다.
실시예 12: 국소 및 유리체내 투여 이후 토끼 눈에서 C5 결합 Z 변이체의 약동학적 연구
물질 및 방법
토끼 생애기: Z 변이체 (Z06175a, 서열 753 후에 GS가 이어짐 (도 4, 구축물 1))의 약동학을 토끼 눈에서 유리체내 투여 이후 연구하였다.
생애기 연구 및 투여한 동물 (색소가 있는(pigmented) 토끼, 2 - 2.5 kg)로부터 눈의 절개는 아이리스 파마(Iris Pharma, 프랑스 라 고드 (www.iris-pharma.com))에서 수행하였다. 동물들을 20±2℃ 및 55±10% 상대 습도에서 개별적으로 수용하고, 먹이 및 물에 자유롭게 접근시켰다.
동물들을 3개의 군으로 나누었다: 1) 유리체내 투여 (각각의 눈에 50 ㎕, n=3, 총 6개의 눈)에 이어서, 1일 후에 절개 및 혈청 샘플링, 2) 유리체내 투여 (각각의 눈에 50 ㎕, n=3)에 이어서, 4일 후에 절개 및 혈청 샘플링, 및 3) 비처리된 동물 (n=5).
4개의 별개의 눈 구획을 절개하고 (눈방수, 유리체, 신경-망막 및 RPE-맥락막), -80℃에서 즉시 동결하였다. 투여된 약물의 제제화 (10 mM 포스페이트 완충제, 145 mM NaCl, pH 7.4 내에 20.2 mg/ml) 및 다양한 눈 구획 내의 약물의 분석은 사내에서 수행하였다.
절개된 눈 구획 내의 Z-변이체의 분석: 절개된 눈 구획을 드라이아이스 상에서 운송하고 분석시까지 -80℃에서 보관하였다. 망막 및 맥락막 샘플을 세라믹 비드를 담은 라이싱 매트릭스(Lysing Matrix) D 튜브 (엠피 바이오메디칼(MP Biomedical)) 내에서 1% 인간 혈청 알부민을 함유한 10배 (부피/중량) PBS 내에서 해동시키고, 서번트 바이오(Savant Bio) 101 균질화기에서 2x 20s 동안 속도 4로 교반시켰다. 피펫을 사용하여 균질물을 비드로부터 제거하고, 1.5 ml 에펜도르프관에 옮기고, 900 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 눈방수 및 유리체 샘플을 망막 및 맥락막과 동일한 방식으로 처리하되, 균질화는 필요하지 않았다. 1군 및 2군으로부터 유리체내 샘플을 상기와 같이 동일한 완충제 내에 10배 추가로 희석하였다. 5개의 표준물질을 HSA를 함유한 PBS 내에 제조하였다 (35.8 μM, 3.58 μM, 358 nM, 35.8 nM 및 17.9 nM). 후속적으로, 표준물질 및 샘플을 펩신 소화하고, 조직 추출물 내의 Z 변이체의 농도의 분석을 실시예 8에 설명된 LC/LC/MS/MS 방법을 이용하여 결정하였다.
결과
유리체내 투여 후 Z 변이체의 농도는 1일 후에 모든 구획 내에서 높았고 (6 - 200 μM), 놀랍게도 투여 4일 후에 높게 유지되었다 (1.5 - 78 μM). 특히, 유리체내의 Z 분자의 농도는 주사 1일 후에 118 내지 201 μM (평균 161 μM, n = 6개의 눈)이고, 주사 4일 후에 26 내지 78 μM (평균 46 μM, n = 6)에 유지되었고, 수일의 T1/2을 나타냈다. 다음 예에 의해 설명된 토끼 눈에서 유리체내 주사 후 약물의 제거 및 크기 사이에 역관계가 있는 것으로 보인다; 목시플록사신 (MW < 0.35 kDa, T1/2 = 1.72 h, 문헌 [Mohan et al. Trans Am Ophthalmol Soc 2005, 103:76-83]), ESBA105 (MW = 26 kDa, T1/2 = 25 h, 문헌 [Ottiger et al. Investigative Ophthalmology & Visual Science 2009, 50: 779-786]) 및 라니비주맙 (MW = 48 kDa, T1/2 = 2.88일, 문헌 [Bakri et al. American Academy of Ophthalmology 2007, 114:2179-2182]). 여기서 시험된 Z 변이체는 7.0 kDa의 분자량을 가졌고, 이것은 Z 분자의 제거가 유리체내의 그러한 소분자에 대해 예상된 것보다 더 느렸음을 제안한다.
SEQUENCE LISTING <110> Swedish Orphan Biovitrum AB <120> Polypeptides <130> P41200767PCT00 <160> 762 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 29 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 1 Glu Val Leu Glu Ala Trp Asp Glu Ile Asp Arg Leu Pro Asn Leu Thr 1 5 10 15 Ile Glu Gln Trp Leu Ala Phe Ile Asn Lys Leu Asp Asp 20 25 <210> 2 <211> 29 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 2 Glu Val Leu Glu Ala Trp Asn Glu Ile Asp Arg Leu Pro Asn Leu Thr 1 5 10 15 Ile Glu Gln Trp Leu Ala Phe Ile Asn Lys Leu Asp Asp 20 25 <210> 3 <211> 29 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 3 Glu Val Ile Glu Ala Trp Asn Glu Ile Asp Arg Leu Pro Asn Leu Thr 1 5 10 15 Ile Glu Gln Trp Leu Ala Phe Ile Asn Lys Leu Asp Asp 20 25 <210> 4 <211> 29 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 4 Glu Val Leu Glu Ala Trp Asp Glu Ile Asp Arg Leu Pro Asn Leu Thr 1 5 10 15 Leu Asp Gln Trp Leu Ala Phe Ile Asn Lys Leu Asp Asp 20 25 <210> 5 <211> 29 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 5 Glu Val Leu Asp Ala Trp Asp Glu Ile Asp Ala Leu Pro Asn Leu Thr 1 5 10 15 Leu Glu Gln Trp Leu Ala Phe Ile Asn Lys Leu Asp Asp 20 25 <210> 6 <211> 29 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 6 Glu Val Ile Asp Ala Trp Asp Glu Ile Asp Arg Leu Pro Asn Leu Thr 1 5 10 15 Leu Asp Gln Trp Leu Ala Phe Ile Asn Lys Leu Asp Asp 20 25 <210> 7 <211> 29 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 7 Glu Thr Leu Glu Ala Trp Asp Glu Ile Asp Arg Leu Pro Asn Leu Thr 1 5 10 15 Ile Glu Gln Trp Leu Ala Phe Ile Asn Lys Leu Asp Asp 20 25 <210> 8 <211> 29 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 8 Glu Val Ile Asp Ala Trp Asn Glu Ile Asp Ala Leu Pro Asn Leu Thr 1 5 10 15 Leu Asp Gln Trp Leu Ala Phe Ile Asn Lys Leu Asp Asp 20 25 <210> 9 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artificial sequence <220> <223> Modified bacterial sequence <400> 759 Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 760 <211> 1676 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 760 Met Gly Leu Leu Gly Ile Leu Cys Phe Leu Ile Phe Leu Gly Lys Thr 1 5 10 15 Trp Gly Gln Glu Gln Thr Tyr Val Ile Ser Ala Pro Lys Ile Phe Arg 20 25 30 Val Gly Ala Ser Glu Asn Ile Val Ile Gln Val Tyr Gly Tyr Thr Glu 35 40 45 Ala Phe Asp Ala Thr Ile Ser Ile Lys Ser Tyr Pro Asp Lys Lys Phe 50 55 60 Ser Tyr Ser Ser Gly His Val His Leu Ser Ser Glu Asn Lys Phe Gln 65 70 75 80 Asn Ser Ala Ile Leu Thr Ile Gln Pro Lys Gln Leu Pro Gly Gly Gln 85 90 95 Asn Pro Val Ser Tyr Val Tyr Leu Glu Val Val Ser Lys His Phe Ser 100 105 110 Lys Ser Lys Arg Met Pro Ile Thr Tyr Asp Asn Gly Phe Leu Phe Ile 115 120 125 His Thr Asp Lys Pro Val Tyr Thr Pro Asp Gln Ser Val Lys Val Arg 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970 975 Leu Ser Val Lys Gly Leu Leu Val Gly Glu Ile Leu Ser Ala Val Leu 980 985 990 Ser Gln Glu Gly Ile Asn Ile Leu Thr His Leu Pro Lys Gly Ser Ala 995 1000 1005 Glu Ala Glu Leu Met Ser Val Val Pro Val Phe Tyr Val Phe His 1010 1015 1020 Tyr Leu Glu Thr Gly Asn His Trp Asn Ile Phe His Ser Asp Pro 1025 1030 1035 Leu Ile Glu Lys Gln Lys Leu Lys Lys Lys Leu Lys Glu Gly Met 1040 1045 1050 Leu Ser Ile Met Ser Tyr Arg Asn Ala Asp Tyr Ser Tyr Ser Val 1055 1060 1065 Trp Lys Gly Gly Ser Ala Ser Thr Trp Leu Thr Ala Phe Ala Leu 1070 1075 1080 Arg Val Leu Gly Gln Val Asn Lys Tyr Val Glu Gln Asn Gln Asn 1085 1090 1095 Ser Ile Cys Asn Ser Leu Leu Trp Leu Val Glu Asn Tyr Gln Leu 1100 1105 1110 Asp Asn Gly Ser Phe Lys Glu Asn Ser Gln Tyr Gln Pro Ile Lys 1115 1120 1125 Leu Gln Gly Thr Leu Pro Val Glu Ala Arg Glu Asn Ser Leu Tyr 1130 1135 1140 Leu Thr Ala Phe Thr Val Ile Gly Ile Arg Lys Ala Phe Asp Ile 1145 1150 1155 Cys Pro Leu Val Lys Ile Asp Thr Ala Leu Ile Lys Ala Asp Asn 1160 1165 1170 Phe Leu Leu Glu Asn Thr Leu Pro Ala Gln Ser Thr Phe Thr Leu 1175 1180 1185 Ala Ile Ser Ala Tyr Ala Leu Ser Leu Gly Asp Lys Thr His Pro 1190 1195 1200 Gln Phe Arg Ser Ile Val Ser Ala Leu Lys Arg Glu Ala Leu Val 1205 1210 1215 Lys Gly Asn Pro Pro Ile Tyr Arg Phe Trp Lys Asp Asn Leu Gln 1220 1225 1230 His Lys Asp Ser Ser Val Pro Asn Thr Gly Thr Ala Arg Met Val 1235 1240 1245 Glu Thr Thr Ala Tyr Ala Leu Leu Thr Ser Leu Asn Leu Lys Asp 1250 1255 1260 Ile Asn Tyr Val Asn Pro Val Ile Lys Trp Leu Ser Glu Glu Gln 1265 1270 1275 Arg Tyr Gly Gly Gly Phe Tyr Ser Thr Gln Asp Thr Ile Asn Ala 1280 1285 1290 Ile Glu Gly Leu Thr Glu Tyr Ser Leu Leu Val Lys Gln Leu Arg 1295 1300 1305 Leu Ser Met Asp Ile Asp Val Ser Tyr Lys His Lys Gly Ala Leu 1310 1315 1320 His Asn Tyr Lys Met Thr Asp Lys Asn Phe Leu Gly Arg Pro Val 1325 1330 1335 Glu Val Leu Leu Asn Asp Asp Leu Ile Val Ser Thr Gly Phe Gly 1340 1345 1350 Ser Gly Leu Ala Thr Val His Val Thr Thr Val Val His Lys Thr 1355 1360 1365 Ser Thr Ser Glu Glu Val Cys Ser Phe 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1565 1570 1575 Ala Thr Leu Leu Asp Ile Tyr Lys Thr Gly Glu Ala Val Ala Glu 1580 1585 1590 Lys Asp Ser Glu Ile Thr Phe Ile Lys Lys Val Thr Cys Thr Asn 1595 1600 1605 Ala Glu Leu Val Lys Gly Arg Gln Tyr Leu Ile Met Gly Lys Glu 1610 1615 1620 Ala Leu Gln Ile Lys Tyr Asn Phe Ser Phe Arg Tyr Ile Tyr Pro 1625 1630 1635 Leu Asp Ser Leu Thr Trp Ile Glu Tyr Trp Pro Arg Asp Thr Thr 1640 1645 1650 Cys Ser Ser Cys Gln Ala Phe Leu Ala Asn Leu Asp Glu Phe Ala 1655 1660 1665 Glu Asp Ile Phe Leu Asn Gly Cys 1670 1675 <210> 761 <211> 170 <212> PRT <213> Ornithodoros moubata <400> 761 Met Asp Ser Glu Ser Asp Cys Thr Gly Ser Glu Pro Val Asp Ala Phe 1 5 10 15 Gln Ala Phe Ser Glu Gly Lys Glu Ala Tyr Val Leu Val Arg Ser Thr 20 25 30 Asp Pro Lys Ala Arg Asp Cys Leu Lys Gly Glu Pro Ala Gly Glu Lys 35 40 45 Gln Asp Asn Thr Leu Pro Val Met Met Thr Phe Lys Asn Gly Thr Asp 50 55 60 Trp Ala Ser Thr Asp Trp Thr Phe Thr Leu Asp Gly Ala Lys Val Thr 65 70 75 80 Ala Thr Leu Gly Asn Leu Thr Gln Asn Arg Glu Val Val Tyr Asp Ser 85 90 95 Gln Ser His His Cys His Val Asp Lys Val Glu Lys Glu Val Pro Asp 100 105 110 Tyr Glu Met Trp Met Leu Asp Ala Gly Gly Leu Glu Val Glu Val Glu 115 120 125 Cys Cys Arg Gln Lys Leu Glu Glu Leu Ala Ser Gly Arg Asn Gln Met 130 135 140 Tyr Pro His Leu Lys Asp Cys Gly Gly Gly Gly Ser Glu Asn Leu Tyr 145 150 155 160 Phe Gln Gly Ser His His His His His His 165 170 <210> 762 <211> 1676 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <220> <221> misc_feature <222> (63)..(63) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (1346)..(1346) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 762 Met Gly Leu Leu Gly Ile Leu Cys Phe Leu Ile Phe Leu Gly Lys Thr 1 5 10 15 Trp Gly Gln Glu Gln Thr Tyr Val Ile Ser Ala Pro Lys Ile Phe Arg 20 25 30 Val Gly Ala Ser Glu Asn Ile Val Ile Gln Val Tyr Gly Tyr Thr Glu 35 40 45 Ala Phe Asp Ala Thr Ile Ser Ile Lys Ser Tyr Pro Asp Lys Xaa Phe 50 55 60 Ser Tyr Ser Ser Gly His Val His Leu Ser Ser Glu Asn Lys Phe Gln 65 70 75 80 Asn Ser Ala Val Leu Thr Ile Gln Pro Lys Gln Leu Pro Gly Gly Gln 85 90 95 Asn Gln Val Ser Tyr Val Tyr Leu Glu Val Val Ser Lys His Phe Ser 100 105 110 Lys Ser Lys Lys Ile Pro Ile Thr Tyr Asp Asn Gly Phe Leu Phe Ile 115 120 125 His Thr Asp Lys Pro Val Tyr Thr Pro Asp Gln Ser Val Lys Val Arg 130 135 140 Val Tyr Ser Leu Asn Asp Asp Leu Lys Pro Ala Lys Arg Glu Thr Val 145 150 155 160 Leu Thr Phe Ile Asp Pro Glu Gly Ser Glu Ile Asp Met Val Glu Glu 165 170 175 Ile Asp His Ile Gly Ile Ile Ser Phe Pro Asp Phe Lys Ile Pro Ser 180 185 190 Asn Pro Arg Tyr Gly Met Trp Thr Ile Gln Ala Lys Tyr Lys Glu Asp 195 200 205 Phe Ser Thr Thr Gly Thr Ala Phe Phe Glu Val Lys Glu Tyr Val Leu 210 215 220 Pro His Phe Ser Val Ser Val Glu Pro Glu Ser Asn Phe Ile Gly Tyr 225 230 235 240 Lys Asn Phe Lys Asn Phe Glu Ile Thr Ile Lys Ala Arg Ile Phe Tyr 245 250 255 Asn Lys Val Val Thr Glu Ala Asp Val Tyr Ile Thr Phe Gly Ile Arg 260 265 270 Glu Asp Leu Lys Asp Asp Gln Lys Glu Met Met Gln Thr Ala Met Gln 275 280 285 Asn Thr Met Leu Ile Asn Gly Ile Ala Glu Val Thr Phe Asp Ser Glu 290 295 300 Thr Ala Val Lys Glu Leu Ser Tyr Tyr Ser Leu Glu Asp Leu Asn Asn 305 310 315 320 Lys Tyr Leu Tyr Ile Ala Val Thr Val Ile Glu Ser Thr Gly Gly Phe 325 330 335 Ser Glu Glu Ala Glu Ile Pro Gly Ile Lys Tyr Val Leu Ser Pro Tyr 340 345 350 Lys Leu Asn Leu Val Ala Thr Pro Leu Phe Leu Lys Pro Gly Ile Pro 355 360 365 Tyr Ser Ile Lys Val Gln Val Lys Asp Ala Leu Asp Gln Leu Val Gly 370 375 380 Gly Val Pro Val Thr Leu Asn Ala Gln Thr Ile Asp Val Asn Gln Glu 385 390 395 400 Thr Ser Asp Leu Glu Pro Arg Lys Ser Val Thr Arg Val Asp Asp Gly 405 410 415 Val Ala Ser Phe Val Val Asn Leu Pro Ser Gly Val Thr Val Leu Glu 420 425 430 Phe Asn Val Lys Thr Asp Ala Pro Asp Leu Pro Asp Glu Asn Gln Ala 435 440 445 Arg Glu Gly Tyr Arg Ala Ile Ala Tyr Ser Ser Leu Ser Gln Ser Tyr 450 455 460 Leu Tyr Ile Asp Trp Thr Asp Asn His Lys Ala Leu Leu Val Gly Glu 465 470 475 480 Tyr Leu Asn Ile Ile Val Thr Pro Lys Ser Pro Tyr Ile Asp Lys Ile 485 490 495 Thr His Tyr Asn Tyr Leu Ile Leu Ser Lys Gly Lys Ile Ile His Phe 500 505 510 Gly Thr Arg Glu Lys Leu Ser Asp Ala Ser Tyr Gln Ser Ile Asn Ile 515 520 525 Pro Val Thr Gln Asn Met Val Pro Ser Ser Arg Leu Leu Val Tyr Tyr 530 535 540 Ile Val Thr Gly Glu Gln Thr Ala Glu Leu Val Ser Asp Ser Val Trp 545 550 555 560 Leu Asn Ile Glu Glu Lys Cys Gly Asn Gln Leu Gln Val His Leu Ser 565 570 575 Pro Asp Ala Asp Thr Tyr Ser Pro Gly Gln Thr Val Ser Leu Asn Met 580 585 590 Val Thr Gly Met Asp Ser Trp Val Ala Leu Thr Ala Val Asp Ser Ala 595 600 605 Val Tyr Gly Val Gln Arg Arg Ala Lys Lys Pro Leu Glu Arg Val Phe 610 615 620 Gln Phe Leu Glu Lys Ser Asp Leu Gly Cys Gly Ala Gly Gly Gly Leu 625 630 635 640 Asn Asn Ala Asn Val Phe His Leu Ala Gly Leu Thr Phe Leu Thr Asn 645 650 655 Ala Asn Ala Asp Asp Ser Gln Glu Asn Asp Glu Pro Cys Lys Glu Ile 660 665 670 Ile Arg Pro Arg Arg Met Leu Gln Glu Lys Ile Glu Glu Ile Ala Ala 675 680 685 Lys Tyr Lys His Leu Val Val Lys Lys Cys Cys Tyr Asp Gly Val Arg 690 695 700 Ile Asn His Asp Glu Thr Cys Glu Gln Arg Ala Ala Arg Ile Ser Val 705 710 715 720 Gly Pro Arg Cys Val Lys Ala Phe Thr Glu Cys Cys Val Val Ala Ser 725 730 735 Gln Leu Arg Ala Asn Asn Ser His Lys Asp Leu Gln Leu Gly Arg Leu 740 745 750 His Met Lys Thr Leu Leu Pro Val Ser Lys Pro Glu Ile Arg Ser Tyr 755 760 765 Phe Pro Glu Ser Trp Leu Trp Glu Val His Leu Val Pro Arg Arg Lys 770 775 780 Gln Leu Gln Phe Ala Leu Pro Asp Ser Val Thr Thr Trp Glu Ile Gln 785 790 795 800 Gly Val Gly Ile Ser Asn Ser Gly Ile Cys Val Ala Asp Thr Ile Lys 805 810 815 Ala Lys Val Phe Lys Asp Val Phe Leu Glu Met Asn Ile Pro Tyr Ser 820 825 830 Val Val Arg Gly Glu Gln Val Gln Leu Lys Gly Thr Val Tyr Asn Tyr 835 840 845 Arg Thr Ser Gly Met Gln Phe Cys Val Lys Met Ser Ala Val Glu Gly 850 855 860 Ile Cys Thr Ser Glu Ser Pro Val Ile Asp His Gln Gly Thr Lys Ser 865 870 875 880 Ser Lys Cys Val Arg Gln Lys Val Glu Gly Ser Ser Asn His Leu Val 885 890 895 Thr Phe Thr Val Leu Pro Leu Glu Ile Gly Leu Gln Asn Ile Asn Phe 900 905 910 Ser Leu Glu Thr Ser Phe Gly Lys Glu Ile Leu Val Lys Ser Leu Arg 915 920 925 Val Val Pro Glu Gly Val Lys Arg Glu Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Leu 930 935 940 Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Gly Thr Ile Ser Arg Arg Lys Glu Phe Pro 945 950 955 960 Tyr Arg Ile Pro Leu Asp Leu Val Pro Lys Thr Glu Ile Lys Arg Ile 965 970 975 Leu Ser Val Lys Gly Leu Leu Val Gly Glu Ile Leu Ser Ala Val Leu 980 985 990 Ser Arg Glu Gly Ile Asn Ile Leu Thr His Leu Pro Lys Gly Ser Ala 995 1000 1005 Glu Ala Glu Leu Met Ser Val Val Pro Val Phe Tyr Val Phe His 1010 1015 1020 Tyr Leu Glu Thr Gly Asn His Trp Asn Ile Phe His Ser Asp Pro 1025 1030 1035 Leu Ile Glu Lys Arg Asn Leu Glu Lys Lys Leu Lys Glu Gly Met 1040 1045 1050 Val Ser Ile Met Ser Tyr Arg Asn Ala Asp Tyr Ser Tyr Ser Val 1055 1060 1065 Trp Lys Gly Gly Ser Ala Ser Thr Trp Leu Thr Ala Phe Ala Leu 1070 1075 1080 Arg Val Leu Gly Gln Val His Lys Tyr Val Glu Gln Asn Gln Asn 1085 1090 1095 Ser Ile Cys Asn Ser Leu Leu Trp Leu Val Glu Asn Tyr Gln Leu 1100 1105 1110 Asp Asn Gly Ser Phe Lys Glu Asn Ser Gln Tyr Gln Pro Ile Lys 1115 1120 1125 Leu Gln Gly Thr Leu Pro Val Glu Ala Arg Glu Asn Ser Leu Tyr 1130 1135 1140 Leu Thr Ala Phe Thr Val Ile Gly Ile Arg Lys Ala Phe Asp Ile 1145 1150 1155 Cys Pro Leu Val Lys Ile Asn Thr Ala Leu Ile Lys Ala Asp Thr 1160 1165 1170 Phe Leu Leu Glu Asn Thr Leu Pro Ala Gln Ser Thr Phe Thr Leu 1175 1180 1185 Ala Ile Ser Ala Tyr Ala Leu Ser Leu Gly Asp Lys Thr His Pro 1190 1195 1200 Gln Phe Arg Ser Ile Val Ser Ala Leu Lys Arg Glu Ala Leu Val 1205 1210 1215 Lys Gly Asn Pro Pro Ile Tyr Arg Phe Trp Lys Asp Ser Leu Gln 1220 1225 1230 His Lys Asp Ser Ser Val Pro Asn Thr Gly Thr Ala Arg Met Val 1235 1240 1245 Glu Thr Thr Ala Tyr Ala Leu Leu Thr Ser Leu Asn Leu Lys Asp 1250 1255 1260 Ile Asn Tyr Val Asn Pro Ile Ile Lys Trp Leu Ser Glu Glu Gln 1265 1270 1275 Arg Tyr Gly Gly Gly Phe Tyr Ser Thr Gln Asp Thr Ile Asn Ala 1280 1285 1290 Ile Glu Gly Leu Thr Glu Tyr Ser Leu Leu Val Lys Gln Leu Arg 1295 1300 1305 Leu Asn Met Asp Ile Asp Val Ala Tyr Lys His Lys Gly Pro Leu 1310 1315 1320 His Asn Tyr Lys Met Thr Asp Lys Asn Phe Leu Gly Arg Pro Val 1325 1330 1335 Glu Val Leu Leu Asn Asp Asp Xaa Val Val Ser Thr Gly Phe Gly 1340 1345 1350 Ser Gly Leu Ala Thr Val His Val Thr Thr Val Val His Lys Thr 1355 1360 1365 Ser Thr Ser Glu Glu Val Cys Ser Phe Tyr Leu Lys Ile Asp Thr 1370 1375 1380 Gln Asp Val Glu Ala Ser His Tyr Arg Gly Tyr Gly Asn Ser Asp 1385 1390 1395 Tyr Lys Arg Ile Val Ala Cys Ala Ser Tyr Lys Pro Ser Lys Glu 1400 1405 1410 Glu Ser Ser Ser Gly Ser Ser His Ala Val Met Asp Ile Ser Leu 1415 1420 1425 Pro Thr Gly Ile Asn Ala Asn Glu Glu Asp Leu Lys Ala Leu Val 1430 1435 1440 Glu Gly Val Asp Gln Leu Phe Thr Asp Tyr Gln Ile Lys Asp Gly 1445 1450 1455 His Val Ile Leu Gln Leu Asn Ser Ile Pro Ser Ser Asp Phe Leu 1460 1465 1470 Cys Val Arg Phe Arg Ile Phe Glu Leu Phe Glu Val Gly Phe Leu 1475 1480 1485 Ser Pro Ala Thr Phe Thr Val Tyr Glu Tyr His Arg Pro Asp Lys 1490 1495 1500 Gln Cys Thr Met Phe Tyr Ser Thr Ser Asn Ile Lys Ile Gln Lys 1505 1510 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Claims (24)

  1. (a) 3개-나선 다발(bundle) 단백질 도메인의 일부를 형성하고 (b) 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 및 서열 5로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 C5 결합 모티프 BM을 포함하는 C5 결합 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 서열 1 및 서열 4로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 C5 결합 폴리펩티드.
  3. 제1항에 있어서, 폴리펩티드의 생산, 정제, 생체내 또는 시험관내 안정화, 커플링 또는 검출을 개선하는 추가의 C 말단 및/또는 N 말단 아미노산을 포함하는 C5 결합 폴리펩티드.
  4. 제3항에 있어서, C 말단 및/또는 N 말단 아미노산이 시스테인 잔기, His6 태그, myc 태그, FLAG 태그, 및 반감기 연장 모이어티(moiety)로부터 선택되는 것인 C5 결합 폴리펩티드.
  5. 제4항에 있어서, 추가의 아미노산이 반감기 연장 모이어티를 포함하고, 반감기 연장 모이어티가 항체의 Fc 도메인인 C5 결합 폴리펩티드.
  6. 제4항에 있어서, 추가의 아미노산이 반감기 연장 모이어티를 포함하고, 반감기 연장 모이어티가 알부민 결합 도메인인 C5 결합 폴리펩티드.
  7. 제6항에 있어서, 알부민 결합 도메인이 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 단백질 G의 알부민 결합 도메인인 C5 결합 폴리펩티드.
  8. 제7항에 있어서, 알부민 결합 도메인이 서열 759의 아미노산 서열을 포함하는 것인 C5 결합 폴리펩티드.
  9. 제1항에 따른 C5 결합 폴리펩티드, 스트렙토코쿠스 단백질 G의 알부민 결합 도메인, 및 알부민 결합 도메인을 C5 결합 폴리펩티드의 C 또는 N 말단에 연결시키기 위한 연결 모이어티를 포함하는 C5 결합 화합물.
  10. 하기 구조를 갖는 C5 결합 화합물:
    [CBP1]-[L1]-[ALBD];
    여기서, 서로 독립적으로, [CBP1]은 제1항에 따른 C5 결합 폴리펩티드이고, [L1]은 연결 모이어티이고, [ALBD]는 스트렙토코쿠스 단백질 G의 알부민 결합 도메인임.
  11. 제9항에 있어서, 연결 모이어티가 G, GS; [G2S]n; [G3S]n; [G4S]n; GS[G4S]n; [S2G]m; [S3G]m; [S4G]m; 및 VDGS로부터 선택되는 것이고, 여기서 n이 0 내지 7이고 m이 0 내지 7인, C5 결합 화합물.
  12. 제10항에 있어서, 연결 모이어티가 G, GS; [G2S]n; [G3S]n; [G4S]n; GS[G4S]n; [S2G]m; [S3G]m; [S4G]m; 및 VDGS로부터 선택되는 것이고, 여기서 n이 0 내지 7이고 m이 0 내지 7인, C5 결합 화합물.
  13. 제9항에 있어서, 연결 모이어티가 GS 또는 GS[G4S]2인 C5 결합 화합물.
  14. 제10항에 있어서, 연결 모이어티가 GS 또는 GS[G4S]2인 C5 결합 화합물.
  15. 제9항에 있어서, 알부민 결합 도메인이 서열 759의 아미노산 서열을 갖는 것인 C5 결합 화합물.
  16. 제10항에 있어서, 알부민 결합 도메인이 서열 759의 아미노산 서열을 갖는 것인 C5 결합 화합물.
  17. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 C5 결합 폴리펩티드 단량체 단위를 포함하고, 다량체 형태인, C5 결합 폴리펩티드.
  18. 제9항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 C5 결합 폴리펩티드 단량체 단위를 포함하고, 다량체 형태인, C5 결합 화합물.
  19. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, C5에 최대 1 x 10-6 M, 또는 최대 1 x 10-7 M, 또는 최대 1 x 10-8 M, 또는 최대 1 x 10-9 M의 KD 값으로 결합하는 C5 결합 폴리펩티드.
  20. 제9항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, C5에 최대 1 x 10-6 M, 또는 최대 1 x 10-7 M, 또는 최대 1 x 10-8 M, 또는 최대 1 x 10-9 M의 KD 값으로 결합하는 C5 결합 화합물.
  21. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 C5 결합 폴리펩티드 또는 제9항 내지 제16항 중 어느 한 항의 C5 결합 화합물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  22. 제21항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  23. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 C5 결합 폴리펩티드 또는 제9항 내지 제16항 중 어느 한 항의 C5 결합 화합물을 활성 성분으로 포함하는, C5 관련 병태를 치료하기 위한 의약.
  24. 제23항에 있어서, C5 관련 병태가 발작성 야간 혈색소뇨 (PNH)인 의약.
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