JP2018052942A - ヒト補体ｃ５に結合するポリペプチド - Google Patents

ヒト補体ｃ５に結合するポリペプチド Download PDF

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Abstract

【課題】治療用途に使用するための新たなＣ５結合剤の提供。【解決手段】前記Ｃ５結合モチーフ、ＢＭを含む前記Ｃ５結合ポリペプチドで、ｉ）ＥＸ2Ｘ3Ｘ4Ａ、Ｘ6Ｘ7ＥＩＤ、Ｘ11ＬＰＮＬ、Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＱＷ、Ｘ21ＡＦＩ、Ｘ25、Ｘ26ＬＸ28Ｄ、及びｉｉ）ｉ）に定義した前記配列と少なくとも８６％の同一性を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸からなり、前記ポリペプチドが前記Ｃ５と結合するポリペプチド。【選択図】なし

Description

本開示は、ヒト補体成分５（Ｃ５）に結合するポリペプチドおよび治療におけるこのようなポリペプチドの使用に関する。
補体タンパク質Ｃ５は、補体系の中心成分；先天性免疫系の重要な部分である。補体系は、緊密に制御された多様な過程で多くの作業課題を伴う複雑な免疫生存システムである。その機能の１つは、健常な宿主組織を細胞残屑ならびにアポトーシスおよび壊死細胞と識別することによって他の生物による感染に対する最前線の宿主防御としてである。さらにまた、それは、免疫複合体のクリアランス、適応免疫応答の調節、組織再生の促進、血管新生、幹細胞の動員および中枢神経系の発生に関与している（非特許文献１）；非特許文献２）。なんらかのトリガー、例えば、補体の活性化および調節の微妙なバランスを妨げる、誤ったもしくは無制限の活性化または不十分な調節は、広範な組織損傷に至る宿主細胞の自己攻撃を含む病理学的条件を導くことがある。
補体系は、約３０のタンパク質からなる。補体免疫を開始するには３つの経路、すなわちＣ１ｑを用いて細胞の表面上で免疫複合体を認識する古典経路、マンノース−結合レクチン（ＭＢＬ）が特定の糖質を認識するときに開始されるレクチン経路、および補体因子３（Ｃ３）の加水分解によって自発的に開始される副経路、侵入病原体上に存在しない特定の哺乳動物細胞表面分子によって抑制される過程がある。副経路は、補体系の増幅ループとしても作用する。３つの経路は、すべてＣ３のレベルで収束する。Ｃ３の切断によりＣ３ａおよびＣ３ｂとなることで転換酵素が形成され、これが、次に補体因子５（Ｃ５）を切断してＣ５ａおよびＣ５ｂとなる。Ｃ５ａは、さまざまな免疫細胞の非常に強力な誘引物質であるが、Ｃ５ｂは、Ｃ６〜９とオリゴマー形成して膜侵襲複合体（ＭＡＣ）またはしばしば終末補体複合体（ＴＣＣ）として知られている穴をあける。補体系の活性化は、病原体を中和する目的で多くの機構を導く；侵入細菌のような細胞の表面上にＭＡＣが形成されると溶解し、Ｃ３およびＣ４切断生成物Ｃ３ｂおよびＣ４ｂの付着は、マクロファージおよびアナフィラトキシンによる病原体の食作用を導くオプソニン化を助け、例えばＣ３ａおよびＣ５ａは、単球および好中球を活性化部位に誘引し、免疫学的感受性の増加およびサイトカインの放出を導く表面マーカーを上方制御する。
Ｃ５は、それぞれ１１５ｋＤａおよび７５ｋＤａの分子質量を有する、アルファおよびベータ、２本のジスルフィド結合したポリペプチド鎖を含む１９０ｋＤａの糖タンパク質である（非特許文献３）。Havilandら（非特許文献４）は、１８−アミノ酸リーダーペプチドおよびベータ鎖とアルファ鎖とを分割している４−アミノ酸リンカーを含む１，６７６−アミノ酸プロ分子をコードすると予測されるヒト補体プロＣ５の完全ｃＤＮＡ配列を構築した。Ｃ５がＣ５ａおよびＣ５ｂへ切断されるのを遮断すると、ＭＡＣ形成および炎症誘発性Ｃ５ａの形成が阻止されるが、上流補体効果系を無傷のままにしてＣ３／Ｃ４が仲介するオプソニン化が可能となる。
一般に、病原体に対する防御における補体系の重要な役割のため、補体系は、薬剤介入の興味の標的となる。このことは、補体の多くの突然変異または調節障害がさまざまな疾患および状態に関与しているという事実によって強調される。これには、免疫複合体の付着が古典経路を誘発する全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のような自己免疫疾患に対する感受性の増加が含まれる（非特許文献５）。さらに、補体タンパク質Ｃ１〜Ｃ５の突然変異は、しばしばＳＬＥまたはＳＬＥ様の症状を引き起こす。補体系の強い関与を伴う他の自己免疫疾患は、免疫複合体がＲＡ関節中の補体を活性化することがある関節リウマチ
（ＲＡ）、シェーグレン症候群、皮膚筋炎ならびに他の自己抗体による疾患、例えばギラン−バレー症候群（ＧＢＳ）、フィッシャー症候群（非特許文献６）、さまざまなタイプの血管炎、全身性硬化、抗糸球体基底膜（ａｎｔｉ−ＧＢＭ）および抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）（非特許文献７）である。
さらに、補体系は、Ａβプラークが補体系を直接活性化して、Ｃ５ａが仲介する小膠細胞の補充を導くアルツハイマー病（ＡＤ）のような神経変性障害に関与している。これは、ＡＤのマウスモデルにおいてＣ５ａＲアンタゴニストが神経保護すると示されたときにさらに確認された（非特許文献８）。アセチルコリン受容体およびその後の補体活性化に対する自己抗体は、神経筋接合部に影響を及ぼす疾患、重症筋無力症の最もよくみられる原因である（非特許文献９）。ＭＡＣ形成は、多発性硬化症（ＭＳ）の病態生理学に関与している（非特許文献１０）。また、パーキンソン病、ハンチントン病およびクロイツフェルト−ヤコブ病のようなプリオン病でも、補体活性化が病理の一部である（非特許文献１１）。創傷治癒において、炎症性反応は組織の恒常性を修復する重要な成分であり、補体系は損傷した組織の早期の認識に関与している。しかし、慢性創傷および重度の熱傷のモデルでは、例として、例えばＣ１インヒビターにより補体を阻害すると、治癒が改善され、組織損傷が減少し、その補体を示唆している。さらにまた、Ｃ４ノックアウトマウスによって例示されるようなさまざまな補体欠損症は、創傷から生じる長期的な組織損傷に対して保護されることが見いだされている（非特許文献１２、オンライン公開に概説された）。最近、腫瘍増殖および増殖は、特にＣ５ａによる補体活性化によって促進されること、およびＣ５ａレセプターの遮断によりこの過程が遅延されることが示されている。さらに、Ｃ３が欠如したマウスは、野生型同腹子よりも有意に遅い腫瘍増殖を示す（非特許文献１３）。
機能不全の補体調節は、溶血が病理の重要な特徴である、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）および非定型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）のようないくつかのまれな状態、あるいは極めてまれな状態の原因となる。ＰＮＨでは、ホスファチジルイノシトールＮ−アセチルグルコサミン転移酵素サブユニットＡをコードする突然変異ＰＩＧ−Ａ遺伝子を有する造血幹細胞のクローンは、血液細胞のプールを吸収する。この突然変異により補体調節因子ＣＤ５５およびＣＤ５９のようなＧＰＩ結合タンパク質が失われる。表面にＣＤ５５およびＣＤ５９が欠如した赤血球は、ＭＡＣによる補体介在性溶解に曝露される。臨床的に、ＰＮＨは、溶血によって現れ、貧血、血栓症および骨髄機能不全に至る。非定型ＨＵＳは、主に副経路の調節タンパク質における突然変異によって、例えばＨ因子の突然変異によって生じる。
眼は、補体誘発型病理の部位として強く示される。視覚喪失の最もよくみられる原因は、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）であり、ここで、そのより重度の形態（滲出型またはウェット型ＡＭＤ）では、網膜下に病理学的脈絡膜神経血管膜を発症する。米国では、６５〜７４歳の集団の約１０％が黄斑変性の徴候を示し、５％もの人がＡＭＤの結果、視覚障害となる。これらの数は、年齢と共に劇的に増加するが、遺伝的要因もある。ＡＭＤに関連した最も強い遺伝子の中には、補体因子Ｈ、因子ＢならびにＣ３およびＣ１インヒビターがある（非特許文献１４）。さらにまた、さまざまな補体遮断分子を用いるいくつかの研究および臨床試験は、有益であると立証されており、これは、Ｃ５遮断分子がこれらの患者群を助けることができることを示唆している。しかし、進行したＡＭＤの現在の治療は、例えばラニビズマブ（モノクローナル抗体フラグメント）およびビバシズマブ（モノクローナル抗体）の硝子体内注射によって、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）誘導性血管新生の阻害を目的としている。眼内抗原に対する免疫応答による眼の炎症、ブドウ膜炎の動物モデルでは、副経路因子Ｂ（非特許文献１５）に対する、およびＣ５（非特許文献１６）に対する遮断抗体は、疾患状態を改善した。実質器官の移植では、移植片の拒絶または機能遅延／障害に至る２つの主要な機構的経路：１）血液型群（ＡＢＯ）およびＭＣＨクラス
に関するドナーとレシピエントとの間の免疫学的障壁ならびにドナーに対するレシピエントの前感作の程度、すなわち急性抗体介在性拒絶反応（ＡＭＲ）に至るドナー特異的抗体（ＤＳＡ）の発生；ならびに２）移植器官の状態および一定の血液灌流なしに保たれた期間、すなわち移植片の虚血性損傷または虚血再灌流障害（ＩＲＩ）の程度がある。ＡＭＲおよびＩＲＩではいずれも、補体系は、外来性、したがって拒絶すべき実体として認識された器官を攻撃する。ＡＭＲでは、既存の抗ドナー抗体は、外来器官の表面に免疫複合体を速やかに形成してＣ１ｑによる認識および古典経路を介した補体系のその後の活性化を導く。超急性拒絶として知られているこの過程は、数分以内に起こり、したがって、不適性器官の最新の移植には、プラスマフェレーシスまたは血漿交換および異なる免疫抑制剤と組み合わせた静脈内ＩｇＧによる移植前のＤＳＡの除去が含まれる。また、新規な治療には、抗ＣＤ２０抗体リツキシマブの使用を介したＢ細胞欠乏も含まれる（非特許文献１７）。これらのプロトコールにより、超急性拒絶の発生はかなり排除されてきたが、それでも、高度に感作された患者では、急性ＡＭＲの発生率（数週〜数ヵ月）が４０％と高い（非特許文献１８；非特許文献１９、早期オンライン公開）。ＩＲＩに関して、ほとんどのエビデンスは、組織損傷の主因として、その後のＭＡＣ形成および溶解を伴う最終経路を示している。したがって、Ｃ５遮断ポリペプチドは、原因がＡＭＲ、ＩＲＩ、または、しばしば起こるように、ＡＭＲおよびＩＲＩの両方の組合せであるかどうかにかかわらず拒絶反応に対する保護となるであろう。期待されるように、肝臓（非特許文献２０）、心臓および腎臓のような高度に灌流された器官は、特に補体介在性損傷を受けやすい。
補体カスケードの近位部分および末端部分とつながっているＣ５タンパク質の中心的な配置により、Ｃ５タンパク質は、薬剤介入にとって魅力的な標的となる。Ｃ５は補体活性化のすべての経路に共通であるため、Ｃ５の遮断は、刺激に関係なくカスケードの進行を停止することになり、それによって、近位補体カスケードの免疫保護および免疫調節機能を損なうことなく、末端の補体活性化の有害な性質を防止する。
ヒト補体Ｃ５を標的とする抗体は、例えば、特許文献１；特許文献２；および特許文献３から知られている。エクリズマブ（Soliris）は、タンパク質Ｃ５に対するヒト化モノ
クローナル抗体であり、Ｃ５がＣ５ａおよびＣ５ｂへ切断されるのを防止する。エクリズマブは、ＰＮＨ、血管内溶血性貧血、血栓形成傾向および骨髄機能不全を特徴とする、しばしば致命的となるまれな血液疾患の治療に有効であることが示されており、この適応症に対して承認されている。最近、エクリズマブは、非定型溶血性症候群（ａＨＵＳ）の治療に対してもＦＤＡによって承認されたが、これは、致命的であるがまれな疾患であり、副補体経路の制御消失により過剰活性化となり、血栓性微小血管症（ＴＭＡ）として現れ、腎臓、心臓および脳のような生体器官に一定の損傷リスクを導く。ａＨＵＳでは、損傷した器官の移植は、肝臓が存続するように患者を一時的に助けるだけで、制御タンパク質（多くの場合、補体因子Ｈまたは副経路の他のタンパク質）の変異型を産生する。一過性急性病態生理学による関連疾患は、志賀毒素陽性大腸菌（ＳＴＥＣ−ＨＵＳ）の感染によって生じるＨＵＳであり、この状態についても有効性を示唆する有望な臨床データがある（非特許文献２１）。最後に、Ｃ５遮断抗体エクリズマブは、高度に不適性な腎臓のレシピエントにおけるＡＭＲの防止に有効であると立証されている（非特許文献２２）。
完全長抗体は別として、Ｃ５を標的とする単鎖可変フラグメント（ｓｃＦＶ）、ミニ抗体およびアプタマーは、文献に記述されている。これらのＣ５インヒビターは、Ｃ５分子上の異なる部位（エピトープ）に結合してもよく、異なる作用様式を有してもよい。例えば、エクリズマブが転換酵素切断部位から少し離れてＣ５と相互作用するのに対して、ミニ抗体Mubodina(R)は、Ｃ５の切断部位で相互作用する。ヒメダニOrnithodoros moubata
からのＣ５阻害タンパク質Ornithodoros moubata補体インヒビター（OmCI, 非特許文献２３）は、ＣＵＢ−Ｃ５ｄ−ＭＧ８スーパードメインの遠位端に結合すると仮定されており、これは転換酵素切断部位に近い（非特許文献２４）。Ｃ５の切断を阻害する上記３つの
タンパク質と対照的に、モノクローナル抗体ＴＮＸ−５５８は、Ｃ５の切断を阻害することなく、無傷のＣ５および放出されたＣ５ａの両方に存在するＣ５ａエピトープに結合する（非特許文献２５）。
大きな多領域構造、１２本の内部鎖および４本の鎖間のジスルフィド架橋ならびに複雑なグリコシル化パターンを有する抗体は、その分子構造に関連する多くの固有の欠点を有する。例えば、エクリズマブのサイズは、約１４８ｋＤａである。ヒト血液中のＣ５の濃度は、約４００ｎＭであり、Ｃ５活性を完全に遮断するには、インヒビターの濃度を、少なくともそれと同等またはそれより高くしなければならない。したがって、SolirisTMを
用いるＰＮＨの標準的な生涯にわたる治療レジメンは、２週毎のタンパク質９００ｍｇの静脈内注入であり、治療は主に診療所で行われため、患者にとって非常に不便であり、社会的にも費用がかかることになる。また、SolirisTMは、胸痛、発熱、悪寒、かゆみ、じ
んま疹、顔面紅潮、発疹、めまい、呼吸困難、または顔面、舌および咽喉の腫れを生じることが報告されているが、これらの副作用の理由は明らかではない。さらにまた、エクリズマブは、霊長類の動物を含むあらゆる試験動物モデルにおいて活性でなく、活性薬物を用いた動物実験が不可能となっている。上記のように、ＡＭＤの現在の治療は、抗体依存性でもあり、したがって、より低い分子量の分子を用いた注射剤または他の投与経路に基づく治療が、大いに必要である。
さらに、抗体産生は小さなタンパク質の産生よりも、より困難であり、かつより高価である（非特許文献２６）。一般に抗体に関連する他の欠点は、Reillyら（非特許文献２７）によって記載されており、例えば交差反応性および正常組織への非特異的結合、注射された抗体の代謝亢進ならびにヒト抗ヒト抗体（ＨＡＭＡ）の形成は、治療効果の低下または損失を生じる。
したがって、同等のＣ５遮断活性を有する薬剤の継続的供給は、依然として、当分野における実質的な重要な問題である。特に、終末補体カスケードおよび炎症誘発性分子Ｃ５ａの形成を防止する分子については、引き続き必要とされている。また、疾患の治療におけるこのような分子の使用を提供することが非常に重要である。
ＷＯ９５／２９６９７ ＷＯ０２／３０９８５ ＷＯ２００４／００７５５３
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新たなＣ５結合剤を提供することが、本発明の目的である。さらに、治療用途に使用するための新たなＣ５結合剤を提供することが、本発明の目的である。
一態様において、Ｃ５結合モチーフ、ＢＭを含むＣ５結合ポリペプチドを提供し、このモチーフは、
ｉ）ＥＸ2Ｘ3Ｘ4Ａ Ｘ6Ｘ7ＥＩＤ Ｘ11ＬＰＮＬ Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＱＷ Ｘ21ＡＦＩＸ25 Ｘ26ＬＸ28Ｄ、
（式中、互いに独立して、
Ｘ2は、Ｈ、Ｑ、Ｓ、ＴおよびＶから選択され；
Ｘ3は、Ｉ、Ｌ、ＭおよびＶから選択され；
Ｘ4は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴおよびＹから選択され；
Ｘ6は、ＮおよびＷから選択され；
Ｘ7は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＴから選択され；
Ｘ11は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴおよびＹから選択され；
Ｘ16は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ17は、Ｉ、ＬおよびＶから選択され；
Ｘ18は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＴから選択され；
Ｘ21は、Ｉ、ＬおよびＶから選択され；
Ｘ25は、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｎ、ＳおよびＴから選択され；
Ｘ26は、ＫおよびＳから選択され；
Ｘ28は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、ＴおよびＹから選択される）
および
ｉｉ）ｉ）に定義された配列に対して少なくとも８６％の同一性を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列からなり、
ここで、ポリペプチドは、Ｃ５と結合する。
Ｃ５に対する結合親和性を有する上に定義されたクラスの配列に関連するポリペプチドは、一般の親ポリペプチド配列に由来する。より詳しくは、クラスの定義は、選択実験においてＣ５との相互作用について選択された親ポリペプチドの多数のランダムポリペプチド変異体の分析に基づく。確認されたＣ５結合モチーフ、すなわち「ＢＭ」は、親骨格の
標的結合領域に相当し、この領域は、３ヘリックス束タンパク質ドメイン内に２つのアルファへリックスを構成する。親骨格中、２つのＢＭヘリックスの多様なアミノ酸残基は、抗体の定常Ｆｃ部分と相互作用するための結合表面を構成する。表面残基を結合するランダム変動およびその後の変異体の選択によって、結合表面のＦｃ相互作用力は、Ｃ５との相互作用力と置き換えられてきた。
以下の実施例で説明するように、Ｃ５結合ポリペプチド変異体の選択は、例えば、タンパク質骨格の未処置変異体の選択、場合により、その後の親和性成熟については、ファージディスプレイ、そして親和性成熟したＣ５結合変異体の選択については、細胞ディスプレイによって達成してもよい。しかし、Ｃ５結合ポリペプチドの選択のためには、ファージベース、細菌ベース、細胞ベースまたはその他かどうかにかかわらず、あらゆる選択システムを用いてもよいことが理解される。
本明細書に用いる「Ｃ５結合」および「Ｃ５に対する結合親和性」という用語は、ポリペプチドの性質のことであり、これは、例えば、Biacore機器（GE Healthcare）におけるような表面プラスモン共鳴技術を用いて試験してもよい。Ｃ５結合親和性は、例えばＣ５をBiacore機器のセンサチップ上に固定し、試験対象となるポリペプチドを含むサンプル
をチップ上に通過させる実験において試験してもよい。別法として、試験対象となるポリペプチドを、機器のセンサチップ上に固定し、Ｃ５またはそのフラグメントを含むサンプルを、チップ上に通過させる。次いで、当業者は、このような実験によって得られた結果を解釈して、Ｃ５に対するポリペプチドの少なくとも定性的な測定を確立してもよい。定量的測定が望ましい場合、例えば相互作用についての見かけの平衡解離定数ＫＤを決定するために、表面プラスモン共鳴法を用いてもよい。結合値は、例えば、Biacore 2000機器（GE Healthcare）において定義してもよい。Ｃ５を測定器のセンサチップ上に固定し、
親和性を測定することになっているポリペプチドのサンプルを段階希釈によって調製し、チップ上に注射する。次いで、ＫＤ値は、例えば機器製造元によって提供されたBIAevaluationソフトウェアの１：１のラングミュア結合モデルを用いた結果から計算してもよい
。ＫＤ測定に用いたＣ５またはそのフラグメントは、例えば配列番号：７６０によって表されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本発明によるＣ５結合ポリペプチドの一実施態様において、Ｃ５結合ポリペプチドは、相互作用のＫＤ値が、多くとも１×１０-6Ｍ、例えば多くとも１×１０-7Ｍ、１×１０-8Ｍ、または１×１０-9ＭとなるようにＣ５に結合する。
本発明によるＣ５結合ポリペプチドは、さまざまな医学、獣医学および診断上の用途における普通抗体または低分子量物質の代替物として用いてもよい。特に、Ｃ５結合ポリペプチドは、試薬のＣ５に対する親和性を必要とするあらゆる方法で有用でありうる。したがって、Ｃ５結合ポリペプチドは、このような方法における検出試薬、捕捉試薬、分離試薬、診断剤または治療剤として用いてもよい。
当業者に理解されるように、本明細書に定義されるポリペプチドのＣ５結合能力のような、なんらかのポリペプチドの機能は、ポリペプチドの第三級構造によって決まる。したがって、第三級構造およびその機能にほとんど影響を及ぼすことなく、ポリペプチドのアミノ酸配列に少しの変化を加えることは可能である。したがって、一実施態様において、ポリペプチドは、ｉ）のＢＭの修飾された変異体を含み、それは、得られた配列が、ｉ）によって定義されたクラスに属する配列と少なくとも８９％同一、例えば少なくとも９３％同一、例えばｉ）によって定義されたクラスに属する配列と少なくとも９６％同一であるような変異体である。例えば、アミノ酸残基の特定の機能性分類（例えば疎水性、親水性、極性など）に属するアミノ酸残基は、同じ官能基群からの別のアミノ酸残基に関して交換することができる可能性がある。
上に定義されたＣ５結合ポリペプチドの別の実施態様において、アミノ酸配列は、ｉ）上に定義されたとおり、および（ｉｉｉ）Ｘn（ここで、ｎは２〜４、６〜７、１１、１
６〜１８、２１、２５〜２６および２８である）によって表される１３個の可変位置において、ｉ）に定義され５ｑ配列と少なくとも８４％の同一性を有し、かつ位置１、５、８〜１０、１２〜１５、１９〜２０、２２〜２４、２７および２９において、ｉ）に定義される配列と少なくとも８７％の同一性を有するアミノ酸配列から選択される。
本発明によるポリペプチドの一実施態様において、Ｘ2は、Ｈ、ＴおよびＶから選択さ
れる。別の実施態様において、Ｘ2は、ＴおよびＶから選択される。さらに別の実施態様
において、Ｘ2はＶである。
本発明によるポリペプチドの一実施態様において、Ｘ3は、Ｉ、ＬおよびＶから選択さ
れる。別の実施態様において、Ｘ3は、ＩおよびＬから選択される。さらに別の実施態様
において、Ｘ3はＩである。別の実施態様において、Ｘ3はＬである。
本発明によるポリペプチドの一実施態様において、Ｘ4は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｌ、Ｑお
よびＲから選択される。別の実施態様において、Ｘ4は、Ａ、Ｄ、Ｅ、ＫおよびＲから選
択される。さらに別の関連した実施態様において、Ｘ4は、ＤおよびＥから選択される。
本発明によるポリペプチドの一実施態様において、Ｘ6はＷである。
本発明によるポリペプチドの一実施態様において、Ｘ7は、Ａ、Ｄ、ＮおよびＴから選
択される。別の実施態様において、Ｘ7は、ＤおよびＮから選択される。さらに別の関連
した実施態様において、Ｘ7はＤである。別の実施態様において、Ｘ7はＮである。
本発明によるポリペプチドの一実施態様において、Ｘ11は、Ａ、Ｈ、Ｋ、Ｑ、ＲおよびＳから選択される。別の実施態様において、Ｘ11は、Ａ、Ｈ、ＫおよびＲから選択される。さらに別の関連した実施態様において、Ｘ11は、Ａ、ＫおよびＲから選択される。さらに別の関連した実施態様において、Ｘ11は、ＫおよびＲから選択される。
本発明によるポリペプチドの一実施態様において、Ｘ16はＴである。
本発明によるポリペプチドの一実施態様において、Ｘ17は、ＩおよびＬから選択される。別の実施態様において、Ｘ17はＩである。別の実施態様において、Ｘ17はＬである。
本発明によるポリペプチドの一実施態様において、Ｘ18は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、ＳおよびＴから選択される。別の実施態様において、Ｘ18は、Ａ、Ｄ、Ｅ、ＱおよびＳから選択される。さらに別の関連した実施態様において、Ｘ18は、Ｄ、ＥおよびＱから選択される。さらに別の関連した実施態様において、Ｘ18は、ＤおよびＥから選択される。さらに別の関連した実施態様において、Ｘ18はＤである。別の実施態様において、Ｘ18はＥである。
本発明によるポリペプチドの一実施態様において、Ｘ21は、ＩおよびＬから選択される。別の実施態様において、Ｘ21はＩである。別の実施態様において、Ｘ21はＬである。
本発明によるポリペプチドの一実施態様において、Ｘ25は、Ｅ、Ｈ、ＮおよびＴから選択される。別の実施態様において、Ｘ25は、ＥおよびＮから選択される。さらに別の関連した実施態様において、Ｘ25はＮである。
本発明によるポリペプチドの一実施態様において、Ｘ26はＫである。
本発明によるポリペプチドの一実施態様において、Ｘ28は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｎ、ＱおよびＳから選択される。上に開示されたポリペプチドの別の実施態様において、Ｘ28は、Ａ、Ｄ、ＥおよびＳから選択される。さらに別の関連した実施態様において、Ｘ28は、Ａ、ＤおよびＥから選択される。さらに別の関連した実施態様において、Ｘ28は、ＤおよびＥから選択される。さらに別の関連した実施態様において、Ｘ28はＤである。
本発明によるポリペプチドの一実施態様において、Ｘ3Ｘ4は、ＬＥおよびＬＤから選択される。
本発明によるポリペプチドの一実施態様において、Ｘ17Ｘ18は、ＩＥおよびＬＤから選択される。第１の態様の上の実施態様において、このクラスのポリペプチドの範囲内にあるＣ５結合ポリペプチドの例が同定される。上の個々の実施態様は、すべての考えられるやり方で組み合わせてもよく、依然として本発明の範囲内にあると考えられる。個々の実施態様のこのような組合せは、ｉ）のアミノ酸定義と比較して、位置Ｘ2〜Ｘ28の１つま
たはそれ以上において、制限されたアミノ酸配列を定義している。
Ｃ５結合ポリペプチドの上の実施態様は、例えば、アミノ酸ｉ）が、以下の８つの条件Ｉ〜ＶＩＩＩ：
Ｉ． Ｘ2はＶである；
ＩＩ． Ｘ3は、ＩおよびＬから選択される；
ＩＩＩ． Ｘ6はＷである；
ＩＶ． Ｘ7は、ＤおよびＮから選択される；
Ｖ． Ｘ17は、ＩおよびＬから選択される；
ＶＩ． Ｘ21はＬである；
ＶＩＩ． Ｘ25はＮである；
ＶＩＩＩ． Ｘ28はＤである；
の少なくとも４つを満たすように組み合わせてもよい。
第１の態様によるＣ５結合ポリペプチドのいくつかの実施例において、アミノ酸配列ｉ）は、８つの条件Ｉ〜ＶＩＩＩの少なくとも５つを満たす。より詳しくは、アミノ酸配列ｉ）は、８つの条件Ｉ〜ＶＩＩＩの少なくとも６つ、例えば８つの条件Ｉ〜ＶＩＩＩの少なくとも７つ、例えば８つの条件Ｉ〜ＶＩＩＩのすべてを満たしてもよい。
以下の実施例に記述するように、Ｃ５結合変異体の選択により個々のＣ５結合モチーフ（ＢＭ）配列を確定してきた。これらの配列は、この態様によるＣ５結合ポリペプチドの個々の実施態様を構成する。個々のＣ５結合モチーフの配列を、図１および配列番号：１〜２４８に示す。この態様のいくつかの実施態様において、ＢＭ配列ｉ）は、配列番号：１〜１２、配列番号：２０、配列番号：２３〜２４、配列番号：２６〜２８、配列番号：３２〜３５、配列番号：３８〜３９、配列番号：４１、配列番号：４６、配列番号：４９、配列番号：５６〜５７、配列番号：５９、配列番号：６６、配列番号：７８〜７９、配列番号：８７、配列番号：９２、配列番号：１０６、配列番号：１１０、配列番号：１１９、配列番号：１２５、配列番号：１４１、配列番号：１５１、配列番号：１６１、配列番号：１６６、配列番号：１８７、配列番号：１９７、配列番号：２０３、配列番号：２０５、配列番号：２１５および配列番号：２４３のいずれか１つから選択される。より詳しくは、ＢＭ配列ｉ）は、配列番号：１〜１２のいずれか１つから、例えば配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：５から選択される。特に、ＢＭ配列ｉ）は、配列番号：１および配列番号：４から選択してもよい。
特定の実施態様において、Ｃ５結合モチーフ（ＢＭ）は、３ヘリックス束タンパク質ドメインの一部を構成する。例えば、ＢＭは、上記３ヘリックス束タンパク質ドメイン内で相互接続ループと２つのアルファヘリックスを本質的に構成してもよい。
３ヘリックス束タンパク質ドメインは、別の実施態様において、細菌受容体タンパク質のドメインから選択される。このようなドメインの非限定的な例は、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）からのプロテインＡの５つの異なる３ヘリックスドメイン、例え
ばドメインＢ、およびその誘導体である。いくつかの実施態様において、３ヘリックス束タンパク質ドメインは、タンパク質Ｚの変異体であり、それはブドウ球菌プロンテインＡの上記ドメインＢに由来する。
本発明のＣ５結合ポリペプチドが３ヘリックス束タンパク質ドメインの一部を形成する実施態様において、Ｃ５結合ポリペプチドは、
ｉ）Ｋ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ ＸaＸbＬＬＸc ＥＡＫＫＬ ＮＤＸdＱ；
（式中、
［ＢＭ］は、上に定義されたＣ５結合モチーフであり；
Ｘaは、ＡおよびＳから選択され；
Ｘbは、ＮおよびＥから選択され；
Ｘcは、Ａ、ＳおよびＣから選択され；
Ｘdは、ＡおよびＳから選択される）
および
ｉｉ）上に定義された配列のいずれか１つと少なくとも７９％の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含んでもよい。上記アミノ酸配列は、上に定義された配列の任意の１つに対する少なくとも８１％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９７％の同一性を有してもよい。
上に定義されたＣ５結合ポリペプチドの一実施態様において、ＸaはＡである。上に定
義されたＣ５結合ポリペプチドの別の実施態様において、ＸaはＳである。
上に定義されたＣ５結合ポリペプチドの一実施態様において、ＸbはＮである。別の実
施態様において、ＸbはＥである。
上に定義されたＣ５結合ポリペプチドの一実施態様において、ＸcはＡである。別の実
施態様において、ＸcはＳである。さらに別の実施態様において、ＸcはＣである。
上に定義されたＣ５結合ポリペプチドの一実施態様において、ＸdはＡである。別の実
施態様において、ＸdはＳである。
上に定義されたＣ５結合ポリペプチドの一実施態様において、ＸaはＡであり；ＸbはＮであり；ＸcはＡであり、かつＸdはＡである。
上に定義されたＣ５結合ポリペプチドのさらなる実施態様において、ＸaはＡであり；
ＸbはＮであり；ＸcはＣであり、かつＸdはＡである。
上に定義されたＣ５結合ポリペプチドのさらなる実施態様において、ＸaはＳであり；
ＸbはＥであり；ＸcはＳであり、かつＸdはＳである。
上に定義されたＣ５結合ポリペプチドのさらなる実施態様において、ＸaはＳであり；
ＸbはＥであり；ＸcはＣであり、かつＸdはＳである。
なおさらなる実施態様において、上に定義されたＣ５結合ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：２４９〜４９６から、特に配列番号：２４９〜２６０、配列番号：２６８、配列番号：２７１〜２７２、配列番号：２７４〜２７６、配列番号：２８０〜２８３、配列番号：２８６〜２８７、配列番号：２８９、配列番号：２９４、配列番号：２９７、配列番号：３０４〜３０５、配列番号：３０７、配列番号：３１４、配列番号：３２６〜３２７、配列番号：３３５、配列番号：３４０、配列番号：３５４、配列番号：３５８、配列番号：３６７、配列番号：３７３、配列番号：３８９、配列番号：３９９、配列番号：４０９、配列番号：４１４、配列番号：４３５、配列番号：４４５、配列番号：４５１、配列番号：４５３、配列番号：４６３および配列番号：４９１から、例えば配列番号：２４９〜２６０から選択される。さらなる実施態様において、アミノ酸配列は、配列番号：２４９、配列番号：２５０、配列番号：２５１、配列番号：２５２および配列番号：２５３、例えば配列番号：２４９および配列番号：２５２から選択される。
したがって、さらなる実施態様において、
ｉ）ＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ ＳＥＬＬＸc ＥＡＫＫＬ ＮＤＳＱＡ Ｐ；
（式中、［ＢＭ］は、上に定義されたＣ５結合モチーフであり、かつ
Ｘcは、ＳおよびＣから選択される）
および
ｉｉ）上のｉ）に定義された配列のいずれか１つと少なくとも８１％の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含むＣ５結合ポリペプチドを提供する。
別法として、
ｉ）ＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ ＡＮＬＬＸc ＥＡＫＫＬ ＮＤＡＱＡ Ｐ；
（式中、［ＢＭ］は、上に定義されたＣ５結合モチーフであり、かつＸcは、ＡおよびＣ
から選択される）および
ｉｉ）上のｉ）に定義された配列のいずれか１つと少なくとも８１％の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含むＣ５結合ポリペプチドを提供する。
上に議論したように、第三級構造およびその機能にほとんど影響を及ぼすことなく上のアミノ酸配列と比較して少しの変化を含むポリペプチドも、また本明細書の範囲内にある。したがって、いくつかの実施態様において、上に定義されたＣ５結合ポリペプチドは、例えばｉ）に定義された配列と少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％または少なくとも９８％同一である配列を有してもよい。
いくつかの実施態様において、そして下の実施例に開示するように、Ｃ５結合モチーフは、５８または６０個のアミノ酸ポリペプチドの一部を形成してもよい。このようなポリペプチドは、例えば配列番号：４９７〜７５７のいずれか１つから選択される配列、特に、配列番号：４９７〜５０８、配列番号：５１６、配列番号：５１９〜５２０、配列番号：５２２〜５２４、配列番号：５２８〜５３１、配列番号：５３４〜５３５、配列番号：５３７、配列番号：５４２、配列番号：５４５、配列番号：５５２〜５５３、配列番号：５５５、配列番号：５６２、配列番号：５７４〜５７５、配列番号：５８３、配列番号：５８８、配列番号：６０２、配列番号：６０６、配列番号：６１５、配列番号：６２１、配列番号：６３７、配列番号：６４７、配列番号：６５７、配列番号：６６２、配列番号：６８３、配列番号：６９３、配列番号：６９９、配列番号：７０１、配列番号：７１１
、配列番号：７３９および配列番号：７４５〜７５７のいずれか１つから選択される配列、例えば配列番号：４９７〜５０８および配列番号：７４５〜７５７から選択される配列を含んでもよい。別の実施態様において、アミノ酸配列は、配列番号：４９７、配列番号：４９８、配列番号：４９９、配列番号：５００、配列番号：５０１、配列番号：７４６、配列番号：７４７、配列番号：７４８、配列番号：７５０および配列番号：７５３から、例えば配列番号：４９７、配列番号：５００、配列番号：７４８および配列番号：７５３のいずれか１つから選択される。
Ｃ５への分子の結合は、Ｃ５の切断を必ずしも阻害しない。阻害は、結合部位に左右され、何がＣ５の特異的領域との相互作用に影響を及ぼすかは、完全に明らかではないため、いくつかのＣ５結合分子は、Ｃ５がＣ５ａおよびＣ５ｂへ切断されるのを阻害することなくＣ５と相互作用してもよい。本発明の一実施態様において、Ｃ５結合ポリペプチドは、例えば哺乳動物対象に投与したときに、Ｃ５の切断を阻害する。本発明によるＣ５結合ポリペプチドは、ヒト対象に投与したときに、ヒトＣ５の切断をより特異的に阻害してもよい。
Ｃ５の構造は、種の間でいくらか異なり、したがって、１つの種のＣ５に結合することがわかっているＣ５結合剤は、別の種において不活性であってもよい。ヒト化抗体エクリズマブは、例えば、しばしばＭＧ７と呼ばれるＣ５のドメインに結合する。この領域は種の間で非常に可変的であり、したがって、エクリズマブの結合はヒトＣ５に制限される。しかし、本発明のＣ５結合ポリペプチドは、ヒトＣ５に制限されず、添付の実施例に示したように、動物のモデルにおいて同様に活性を示す。
当業者は、本発明の範囲を逸脱することなく、特定の用途に合わせてポリペプチドを作製するために本明細書に開示された任意の態様によるＣ５結合ポリペプチドにさまざまな修飾および／または付加を加えることができることを理解することになる。例えば、任意の態様によるＣ５結合ポリペプチドは、さらなるＣ末端および／またはＮ末端アミノ酸を含んでもよい。このようなポリペプチドは、ポリペプチド鎖のいちばん最初のおよび／またはいちばん最後の位置で、すなわちＮ末端および／またはＣ末端で、さらなるアミノ酸残基を有するポリペプチドとして理解しなければならない。したがって、Ｃ５結合ポリペプチドは、任意の適した数のさらなるアミノ酸残基、例えば少なくとも１つのさらなるアミノ酸残基を含んでもよい。それぞれのさらなるアミノ酸残基は、例えば、ポリペプチドの産生、精製、in vivoもしくはin vitro安定化、結合、または検出を改善するために個
別にまたはまとめて付加してもよい。このようなさらなるアミノ酸残基は、化学的結合のために付加された１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を含んでもよい。この一例は、システイン残基の付加である。また、このようなさらなるアミノ酸残基は、ポリペプチドの精製または検出のための「タグ」、例えばＨｉｓ6タグまたは「ｍｙｃ」（ｃ−ｍｙｃ）タ
グまたは「ＦＬＡＧ」タグを提供してもよく、Ｈｉｓ６タグの場合、タグに特異的な抗体との相互作用または固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）のためである。
上で議論したさらなるアミノ酸は、化学的結合（知られている有機化学方法を用いる）によって、または融合タンパク質としてＣ５結合ポリペプチドを発現させるような他のいずれかの手段によってＣ５結合ポリペプチドに結合してもよい。
上に議論したさらなるアミノ酸は、例えば、１つまたはそれ以上のポリペプチドドメインを含んでもよい。さらなるポリペプチドドメインは、他の機能、例えば他の結合機能、または酵素機能、または毒性機能（例えば免疫毒素）、または蛍光シグナル伝達機能、またはそれらの組合せを有するＣ５結合ポリペプチドを提供してもよい。
さらなるポリペプチドドメインは、同じ結合機能を有するＣ５結合ポリペプチドをさらに提供してもよい。したがって、さらなる実施態様において、少なくとも２つのＣ５結合ポリペプチドモノマー単位を含み、それらのアミノ酸配列が同一または異なってもよいＣ５結合ポリペプチドが提供される。ポリペプチドの多量体形態は、適した数のドメインを含んでもよく、それぞれは、Ｃ５結合モチーフを有し、かつそれぞれは、多量体の内に「モノマー」を形成する。これらのドメインは、すべて、同じアミノ酸配列を有してもよいが、代わりに、異なるアミノ酸配列を有してもよい。特に、本発明のＣ５結合ポリペプチドは、ホモ−またはヘテロ二量体を形成してもよい。
上記のようなさらなるポリペプチドドメインを、知られている有機化学の方法を用いて共有結合によってＣ５結合ポリペプチドに結合してもよい。別法として、さらなるポリペプチドドメインを含むＣ５結合ポリペプチドは、例えば、ポリペプチドの組換え発現のための系において１つもしくはそれ以上の融合ポリペプチドとして発現させてもよく、または直接もしくはリンカー、例えばアミノ酸リンカーを介してのいずれかで、他のなんらかのやり方で結合させてもよい。
いくつかの実施態様では、さらなるポリペプチドドメインは、in vivoでのＣ５結合ポ
リペプチドの半減期を増強する半減期延長部分を含んでもよい。当業者によって理解されるように、半減期の増強または延長とは、血液から特定分子のクリアランスが遅いこと意味する。in vivoでの特定のポリペプチド半減期を延長するための多くの知られている戦
略、例えば抗体（Ｆｃ結合）のＦｃドメインへの結合またはアルブミンへの結合がある。別の例は、in vivoで血清アルブミンに結合することになる半減期延長部分、例えばペプ
チドまたはタンパク質への結合である。特に、半減期延長部分は、アルブミン結合性部分であってもよい。アルブミン結合部分は、例えば天然のポリペプチド、またはそのアルブミン結合フラグメント、または改変されたポリペプチドからなる。改変されたポリペプチドは、アルブミンのような分子に対する結合親和性といったような、新規なまたは増強された性質を生み出すという観点では、天然の出発ポリペプチドをタンパク質工学技術、例えば部位特異的または無作為化されたアプローチにおける突然変異および変性にかけることにより、天然の出発ポリペプチドから誘導してもよい。このような改変されたアルブミン結合ポリペプチドは、例えば、タンパク質骨格の変異体であってもよく、この変異体は、アルブミンに対するその特異的結合親和性に関して選択されている。特定の実施態様において、タンパク質骨格は、例えば連鎖球菌株Ｇ１４８からのＧタンパク質のドメインＧＡ１、ドメインＧＡ２およびドメインＧＡ３、特にドメインＧＡ３のような、連鎖球菌Ｇタンパク質またはその誘導体のドメインから選択してもよい。
したがって、Ｃ５結合ポリペプチドの一実施態様において、さらなるアミノ酸は、in vivoまたはin vitro安定化を改善し、かつ連鎖球菌Ｇタンパク質またはその誘導体のアル
ブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む。本発明のＣ５結合ポリペプチド中にさらなるポリペプチドドメインとして含まれてもよいアルブミン結合ドメインの１つの例は、配列番号：７５９に提示される。適したアルブミン結合ドメインの他の例は、ＷＯ２００９／０１６０４３およびＷＯ２０１２／００４３８４に開示されている。このようなＡＢＤ延長ポリペプチドは、in vivoで血清アルブミンに結合し、そのより長い半減期から利益を受け
、これはポリペプチド自体の正味の半減期を増強する（例えばＷＯ９１／０１７４３参照）。したがって、上に定義されたアルブミン結合部分を含むＣ５結合ポリペプチドの薬物動態学的プロファイルは、例えば哺乳動物対象に投与したときの血清アルブミンのそれに似ている。ＡＢＤおよびその誘導体は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）だけでなく、マウスおよびラットのような他の種からの血清アルブミンにも非常に強く結合する。
連鎖球菌Ｇタンパク質のＡＢＤは、長さ４６個のアミノ酸であり、したがって、本発明によるＣ５結合ポリペプチドがＡＢＤ部分またはその誘導体を含むとき、Ｃ５結合ポリペ
プチドの全体的なサイズは比較的小さい。例えばヒト対象のような哺乳動物対象に投与したとき、Ｃ５結合ポリペプチドのアルブミン結合部分は、血清アルブミンと非共有結合により結合することになり、それによってポリペプチドは、腎臓クリアランスの低下および上皮細胞における再循環の増加から利益を受けることがある。しかし、血清アルブミンの浸出性のため、組織浸透は依然として速い。さらにまた、半減期延長部分を含むＣ５結合ポリペプチドは、対応する半減期延長部分がないポリペプチドと比較して、in vivoで半
減期の延長を示すだけでなく、in vivoでの免疫反応も低下させる（例えばＷＯ２００５
／０９７２０２参照）。
関連した態様において、上記の請求項のいずれかによる少なくとも１つのＣ５結合ポリペプチド；連鎖球菌Ｇタンパク質の少なくとも１つのアルブミン結合ドメイン、またはその誘導体、および上記少なくとも１つのドメインまたはその誘導体を上記少なくとも１つのＣ５結合ポリペプチドのＣまたはＮ末端に結合するための少なくとも１つの結合部分を含むＣ５結合化合物を提供する。このようなＣ５結合化合物は、以下の実施例に示すように、例えば哺乳動物対象に投与したときに、in vivoでＣ５だけでなく、血清アルブミン
に対しても高い親和性を有し、血清アルブミンへの結合は、Ｃ５との相互作用を妨げない。
一実施態様において、Ｃ５結合化合物は、
［ＣＢＰ１］−［Ｌ１］−［ＡＬＢＤ］；
［ＣＢＰ１］−［ＣＢＰ２］−［Ｌ１］−［ＡＬＢＤ］；
［ＣＢＰ１］−［Ｌ１］−［ＡＬＢＤ］−［Ｌ２］−［ＣＢＰ２］；
［ＡＬＢＤ］−［Ｌ１］−［ＣＢＰ１］；
［ＡＬＢＤ］−［Ｌ１］−［ＣＢＰ１］−［ＣＢＰ２］；
［ＣＢＰ１］−［Ｌ１］−［ＣＢＰ２］−［Ｌ２］−［ＡＬＢＤ］；および
［ＡＬＢＤ］−［Ｌ１］−［ＣＢＰ１］―［Ｌ２］―［ＣＢＰ２］
（式中、互いに独立して、
［ＣＢＰ１］および［ＣＢＰ２］は、同一または異なってもよいＣ５結合ポリペプチドであり；
［Ｌ１］および［Ｌ２］は、同一または異なってもよい結合部分であり；かつ
［ＡＬＢＤ］は、連鎖球菌Ｇタンパク質のアルブミン結合ドメインまたはその誘導体である）
から選択される構造を有する。
好ましいＣ５結合化合物は、
［ＣＢＰ１］−［ＣＢＰ２］−［Ｌ１］−［ＡＬＢＤ］；
［ＣＢＰ１］−［Ｌ１］−［ＡＬＢＤ］−［Ｌ２］−［ＣＢＰ２］；
そして最も好ましくは、［ＣＢＰ１］−［Ｌ１］−［ＡＬＢＤ］から選択される構造を有する。
このようなＣ５結合化合物に用いてもよい結合部分の例は、Ｇ、ＧＳ；［Ｇ2Ｓ］n；［Ｇ3Ｓ］n；［Ｇ4Ｓ］n；ＧＳ［Ｇ4Ｓ］n、［式中、ｎは、０〜７であり（好ましくは、ｎは０〜２である）］；［Ｓ2Ｇ］m；［Ｓ3Ｇ］m；［Ｓ4Ｇ］m；（式中、ｍは０〜７である）およびＶＤＧから選択される。
好ましいリンカーは、ＧＳおよびＧＳ［Ｇ4］2である。
Ｃ５結合化合物に含まれてもよいアルブミン結合ドメインまたはその誘導体の例は、上記のとおりである。特に、アルブミン結合ドメインの１つの例は、配列番号：７５９に提示される。
特に好ましいＣ５結合化合物は、構造［ＣＢＰ１］−［Ｌ１］−［ＡＬＢＤ］
（式中、［ＣＢＰ１］は、配列番号：７４８および配列番号：７５３から選択されるポリペプチドであり、［Ｌ１］は、ＧＳであり、かつ［ＡＬＢＤ］は、配列番号：７５９として示されるポリペプチドである）を有する。
Ｃ５結合ポリペプチドに含まれるＣ５結合ポリペプチドは、一実施態様において、前述のように、５８マーまたは６０マーのＣ５結合ポリペプチドから独立して選択される。特に、Ｃ５結合化合物は、配列番号：４９７〜５０８、配列番号：５１６、配列番号：５１９〜５２０、配列番号：５２２〜５２４、配列番号：５２８〜５３１、配列番号：５３４〜５３５、配列番号：５３７、配列番号：５４２、配列番号：５４５、配列番号：５５２〜５５３、配列番号：５５５、配列番号：５６２、配列番号：５７４〜５７５、配列番号：５８３、配列番号：５８８、配列番号：６０２、配列番号：６０６、配列番号：６１５、配列番号：６２１、配列番号：６３７、配列番号：６４７、配列番号：６５７、配列番号：６６２、配列番号：６８３、配列番号：６９３、配列番号：６９９、配列番号：７０１、配列番号：７１１、配列番号：７３９および配列番号：７４６〜７５７、例えば、配列番号：４９７〜５０８および配列番号：７４６〜７５７から選択される配列のいずれか１つから独立して選択される１つまたはそれ以上のＣ５結合ポリペプチドを含んでもよい。別の実施態様において、アミノ酸配列は、配列番号：４９７、配列番号：４９８、配列番号：４９９、配列番号：５００、配列番号：５０１、配列番号：７４６、配列番号：７４７、配列番号：７４８、配列番号：７５０および配列番号：７５３、例えば配列番号：４９７、配列番号：５００、配列番号：７４８および配列番号：７５３のいずれか１つから選択される。
さらなる態様において、Ｃ５結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは上記のような化合物を提供する。このようなポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、例えば宿主細胞中の発現によってＣ５結合ポリペプチドまたはＣ５結合化合物の産生を可能にしてもよい。
本発明によるＣ５結合ポリペプチドは、治療剤または診断剤として、または、例えば補体タンパク質Ｃ５における直接または間接的な効果を有する他の治療剤もしくは診断剤を標的とする手段として有用でありうることを理解しなければならない。直接治療効果は、例えば、Ｃ５切断を阻害することによって実施してもよい。したがって、一実施態様において、本発明によるＣ５結合ポリペプチドまたはＣ５結合化合物と治療剤との組合せを提供する。このような組合せにおいて有用であることがわかっている可能性がある治療剤の非限定的な例は、免疫促進剤および放射性核種である。
したがって、このような、もしくはＣ５結合化合物に含まれるようなＣ５結合ポリペプチド、または本発明による組合せは、一実施態様において、治療に使用するため、例えば、Ｃ５関連の状態、例えばヒト対象のような哺乳動物におけるＣ５関連の状態の治療のために提供される。一実施態様において、上記Ｃ５関連の状態は、炎症性疾患、例えば抗原誘導性関節炎、敗血症、滑膜炎、血管炎および喘息；自己免疫疾患、例えば全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、寒冷凝集素病、関節リウマチ、多発性硬化症（ＭＳ）、シェーグレン症候群、皮膚筋炎、重症筋無力症および他の自己抗体誘導疾患、例えばギラン−バレー症候群（ＧＢＳ）、フィッシャー症候群、全身性硬化症、抗糸球体基底膜（ａｎｔｉ−ＧＢＭ）および抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）；感染性疾患、例えば溶血尿毒症症候群（ＨＵＳ）、ウイルス感染、細菌感染および真菌感染；心血管疾患、例えば（急性）心筋梗塞（フィブリン溶解または経皮的冠動脈形成術（ＰＣＩ）のいずれかによって血行再建術を受ける）；神経変性障害、例えばアルツハイマー病（ＡＤ）、ハンチントン病、クロイツフェルト−ヤコブ病およびパーキンソン病；がん；創傷；移植障害、例えば虚血再灌
流障害（ＩＲＩ）および急性抗体介在性拒絶（ＡＭＲ）；眼疾患、例えば加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、ブドウ膜炎、糖尿病性眼疾患および障害、ならびに未熟児網膜症；腎疾患、例えば膜性糸球体腎炎、膜性腎炎、免疫グロブリンＡ腎症、ループス腎炎、グッドパスチャー症候群およびレンサ球菌感染後糸球体腎炎；肺疾患、例えば成人呼吸窮迫症候群、慢性閉塞性肺疾患および嚢胞性線維症；血液疾患；例えば溶血性貧血、発作性寒冷血色素尿症、非定型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）および発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）；アレルギー疾患、例えばアナフィラキシーショック、アレルギーおよび喘息；ならびに皮膚疾患、例えば天疱瘡、水疱性類天疱瘡、光毒性反応および乾癬から選択される。より具体的な実施態様において、本発明によるＣ５結合ポリペプチド、化合物または組合せは、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）の治療に用いられる。
上の背景セクションで臓器移植を議論したときに記載したように、ドナーとレシピエントとの間の違い（例えばＡＢＯおよびＭＣＨクラス）および移植器官の状態は、遅延機能の遅れまたは移植器官の拒絶にさえ至ることがある。したがって、治療では、ドナー−レシピエントクロスマッチ陽性にもかかわらず抗ドナー抗体を排除すること、またはＡＢＯ障壁に対して移植を行うときにＡＢＯ抗体を排除することが必要となることがある。このような治療は、典型的に、移植またはプラスマフェレーシスの前およびその後に、例えばアフィニティークロマトグラフィー技術の使用による免疫吸着法を含む。しかし、このような手順は、血液循環中に存在するほとんど全て、したがって治療抗体を含む抗体を排除するリスクがでてくる。しかし、本発明のＣ５結合ポリペプチドまたは化合物は、抗体除去手順にはなんら影響を受けることなく、したがって、これらの治療に利用してもよい。
全身性病理よりもむしろ、肺および血流のような、容易に到達できる組織における、より局所的な急性の病理が優位を占めるいくつかのＣ５関連の状態では、非常に短い半減期の薬物は、除去の遅いものよりも好都合であるはずである。したがって、このようなＣ５関連の状態では、半減期延長部分のないＣ５結合ポリペプチドが、有益でありうる。上に説明したように、本発明によるＣ５結合ポリペプチドは、その比較的小さなサイズのため、ヒトのような哺乳動物に投与したとき、比較的迅速な薬物動態学的プロファイルを示す。本発明によるＣ５結合ポリペプチドは、喘息（Zhang et al. Expert Rev Clin Immunol
2010, 6:269-277）、敗血症（Ward et al. The Sci World#160;J 2010, 10:2395-2402）、およびＣ活性化関連の仮性アレルギーを含む過敏症症候群（ＣＡＲＰＡ、まれな場合、生命を脅かす心肺の窮迫に至ることがある特定の治療リポソームおよび脂質賦形剤ベースの薬物に対する反応（Szebeni et al. Adv Drug Delivery Rev 2011, 63:1020-1030）の
ようなＣ５関連の状態の治療に潜在的に活性でありうる。さらに、本発明によるＣ５結合ポリペプチドは、輸血レシピエントが不適合な型の血液を受けたときに補体阻害に用いてもよい（米国では約１：１４０００の輸血単位で起こっている状況であり、それは高い死亡率と関係がある、Goodnough et al. Lancet 2003, 361:161-169）。
関連した態様では、上記のようなＣ５結合ポリペプチドまたは組合せを、その必要性のある哺乳動物対象に投与することを含む、Ｃ５関連の状態の治療方法を提供する。したがって、この治療方法では、本発明によるＣ５結合ポリペプチド、Ｃ５結合化合物または組合せを用いて対象を治療する。上記方法のより具体的な実施態様では、対象の細胞表面上に発現したＣ５にＣ５結合ポリペプチドまたは組合せが結合することにより、Ｃ５切断が阻害される。治療方法の一実施態様において、Ｃ５関連の状態は、炎症性疾患；自己免疫疾患；感染性疾患；心血管疾患；神経変性障害；がん；創傷；移植障害；眼疾患；腎疾患；肺疾患；血液疾患；アレルギー疾患および皮膚疾患から選択される。特に、Ｃ５関連の状態は、本発明によるＣ５結合ポリペプチド、化合物または組合せの治療使用に関して上に定義されたとおりであってもよい。Ｃ５関連の状態は、例えば、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）であってもよい。治療方法の一実施態様では、上記Ｃ５結合ポリペプチドを、静脈内に、皮下に、吸入によって、鼻内に、経口的に、硝子体内に、または局所的に投与
する。
さて、本発明を、以下の非限定的な実施例により更に説明する。
本発明のＣ５結合ポリペプチド（配列番号：１〜２４８）に含まれるＣ５結合モチーフの例、本発明による４９マーのＣ５結合ポリペプチド（配列番号：２４９〜４９６）の例、本発明による５８マーのＣ５結合ポリペプチド（配列番号：４９７〜７４４）の例および本発明による６０マーのＣ５結合ポリペプチド（配列番号：７４５〜７５７）の例のアミノ酸配列、ならびにタンパク質Ｚ（配列番号：７５８）の配列、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ０９４、配列番号：７５９）、ヒトＣ５のSwiss-Prot登録Ｐ０１０３１（アミノ酸残基１〜１６７６、配列番号：７６０；そのうちのα鎖がアミノ酸残基６７８〜１６７６に相当し、β−鎖がアミノ酸残基１９〜６７３に相当する）、本明細書に用いたＨｉｓ6タグ付きチックタンパク質ＯｍＣＩの配列（配列番号：７６１）およびテンプレートとしてヒトＣ５を用いてゲノム配列から誘導されたカニクイザルＣ５（配列番号：７６２）（www.ebi.ac.uk/enaでオンライン公開; Ebeling et al. (2001) Genome Res. 21(10):1746-1756）のリストである。配列は、位置６３および１３４６において、２つの未知のアミノ酸「Ｘ」を含む。 図１−１の続き。 図１−２の続き。 図１−３の続き。 図１−４の続き。 図１−５の続き。 図１−６の続き。 図１−７の続き。 図１−８の続き。 図１−９の続き。 図１−１０の続き。 図１−１１の続き。 図１−１２の続き。 図１−１３の続き。 図１−１４の続き。 図１−１５の続き。 図１−１６の続き。 図１−１７の続き。 図１−１８の続き。 図１−１９の続き。 図１−２０の続き。 図１−２１の続き。 図１−２２の続き。 図１−２３の続き。 図１−２４の続き。 図１−２５の続き。 図１−２６の続き。 図１−２７の続き。 図１−２８の続き。 図１−２９の続き。 図１−３０の続き。 実施例２に記述したBiacore機器で実施した典型的な結合分析の結果を示す。センサーグラムは、それぞれ、固定化二量体Ｚ変異体（Ｚ０５４７７、配列番号：５０９）上へのヒトＣ５（ｈＣ５；黒色の実線曲線）、カニクイザルＣ５（ｃＣ５；黒色の短い破線の曲線）、ラットＣ５（ｒＣ５；黒色の長い破線の曲線）、ヒトＭＧ７ドメイン（ｈＭＧ７；灰色の点線の曲線）、およびヒト免疫グロブリンＧ（ｈＩｇＧ；灰色の実線の曲線）の注射によって得た。 それぞれ、選択された成熟Ｚ変異体についての、ＥＬＩＳＡにおけるｈＣ５およびｒＣ５に対する反応を示すカラムチャートである。黒いカラムは、実施例４に記載したように、各Ｚ変異体について、０．０５μｇ／ｍｌのｈＣ５（各群の左のカラム）を用いて得た４５０ｎｍの吸光度および４μｇ／ｍｌのｒＣ５を用いて得た４５０ｎｍの吸光度に相当する。Ｚ変異体Ｚ０５３６３（配列番号：５１０）に対する反応を、陽性対照としてプロットする。 ＡＢＤ０９４（配列番号：７５９）に場合により結合した、配列番号：７４５〜７５７から選択される１つまたはいくつかのＣ５結合Ｚ変異体を包含するさまざまな構築物を、概略的に示す。 実施例６に記述したように、Instant Blueによって視覚化した、精製されたＣ５結合Ｚ変異体（還元状態）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。Ａ）は、二量体Ｚ−Ｚ−ＡＢＤの１つの例（レーン１、ここで、Ｚは配列番号：７４５に相当し、ＡＢＤは配列番号：７５９に相当する）を、さまざまなＺ−ＡＢＤ融合タンパク質（ここで、Ｚは、配列番号：７４５（レーン２）、ＧＳリンカーによってＡＢＤ０９４（配列番号：７５９）に融合した配列番号：７４８−７５７（レーン４〜１３）に相当する）と比較して表し；Ｂ）は、さまざまな構築物中の１つのＣ５結合Ｚ変異体（配列番号：７５３）を表し、そしてＣ）は、単量体形態（レーン６〜７）における、およびＧＳ（Ｇ４）２リンカー（レーン２〜５）を介したＡＢＤ０９４（配列番号：７５９）との融合における、２つの異なるＣ５結合Ｚ変異体（配列番号：７４８、レーン２〜３および６ならびに配列番号：７５３、レーン４〜５および７）を表す。 実施例６に記述した溶血アッセイに見られるように、さまざまなＣ５結合Ｚ変異体の補体活性化を阻害する能力の用量−反応特性の例示的なデータを示すダイアグラムである。Ｃ５欠損血清を６３倍に希釈し、０．１ｎＭ ｈＣ５を補充した。Ａ）は、ｈＣ５へのさまざまなＺ−ＡＢＤ融合タンパク質（ＧＳリンカーによってＡＢＤ０９４（配列番号：７５９）に融合した配列番号：７４５、配列番号：７４８〜７５３および配列番号：７５６に相当するＺ変異体）の効果を示す。 実施例６に記述した溶血アッセイに見られるように、さまざまなＣ５結合Ｚ変異体の補体活性化を阻害する能力の用量−反応特性の例示的なデータを示すダイアグラムである。Ｃ５欠損血清を６３倍に希釈し、０．１ｎＭ ｈＣ５を補充した。Ｂ）は、同じＣ５結合Ｚ変異体（Ｚ０６１７５ａ、配列番号：７５３）を、単量体もしくは二量体として、ＡＢＤ０９４（配列番号：７５９）と融合して、またはＨｉｓ6−タグ（６ヒスチジン基）付きで提供して含むさまざまなＣ５結合構築物の効果を、Ｃ５結合ダニタンパク質ＯｍＣＩ（配列番号：７６１）と比較して示す。 実施例６に記述した置換ＥＣＬ技術に基づく平衡結合の例示的なデータを示すダイアグラムである。図７Ａは、ＡＢＤ０９４（配列番号：７５９）と融合したさまざまなＺ変異体（配列番号：７４５、配列番号：７４８〜７５７）のＣ５結合を、ダニタンパク質ＯｍＣＩ（配列番号：７６１）のＣ５結合と比較して示す。 実施例６に記述した置換ＥＣＬ技術に基づく平衡結合の例示的なデータを示すダイアグラムである。図７Ｂは、同じＣ５結合Ｚ変異体（配列番号：７５３）を、単量体もしくは二量体として、ＡＢＤ０９４（配列番号：７５９）と融合して、またはＨｉｓ6−タグ付きで提供して含む、さまざまなＣ５結合構築物の結合を示す。 実施例７に記述したとおり研究したＺ−ＡＢＤ変異体とヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）との間の相互作用を示す。Ａ）サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、ここで、Ｚ−ＡＢＤ（ＧＳリンカーによってＡＢＤ０９４（配列番号：７５９）に融合したＺ０６１７５ａ（配列番号：７５３））は、等モル量のＨＳＡ（１）と共にプレインキュベートされている。比較として、ＨＳＡ単独（２）およびＺ−ＡＢＤ単独（３）についてのクロマトグラムもグラフに示す。 実施例７に記述したとおり研究したＺ−ＡＢＤ変異体とヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）との間の相互作用を示す。Ｂ）ＨＳＡコーティングされた表面上に注射したＺ−ＡＢＤおよびＺ−ＡＢＤ−Ｚ（それぞれ、構築物２および構築物５において、図４に明記されたリンカーによってＡＢＤ０９４（配列番号：７５９）に融合したＺ０６１７５ａ（配列番号：７５３））のBiacoreセンサーグラム。２つの構築物のそれぞれを、２５、１００および４００ｎＭの濃度で注射した。 実施例８に記述したように、静脈内（i.v.０．２５ｍｏｌ／ｋｇ）および皮下（s.c.、０．５ｍｏｌ／ｋｇ）投与後の時間にわたる、雄Sprague Dawleyラットにおける、Ｃ５結合化合物Ｚ−ＡＢＤおよびＺ−ＡＢＤ−Ｚ（それぞれ、構築物２および構築物５中の、図４に明記されたリンカーによってＡＢＤ０９４（配列番号：７５９）に融合したＺ０６１７５ａ、配列番号：７５３）についての薬物動態学的プロファイルを示すダイアグラムである。各データポイントは、i.v投与動物については、投与後５分から２週まで、s.c.投与動物については１５分から２週までの範囲の特定の時点での３匹の個々の動物からの平均を表す。 実施例８に記述したように、Ｚ−ＡＢＤ（ＧＳリンカーによってＡＢＤ０９４（配列番号：７５９）に融合したＺ０６１７５ａ（配列番号：７５３））の静脈（i.v.；０．２５μｍｏｌ／ｋｇ）投与後、Sprague Dawleyラットから採取した動物サンプルから１：５希釈した血清に曝露した後のヒツジ赤血球におけるex vivoでの溶血を示す。各点は、投与後５分から２週の範囲における特定の時点での１匹の個々の動物を表す。 実施例８に記述したように、Ｚ−ＡＢＤ（ＧＳリンカーによってＡＢＤ０９４（配列番号：７５９）に融合したＺ０６１７５ａ（配列番号：７５３））の皮下（s.c.；０．５μｍｏｌ／ｋｇ）投与後、Sprague Dawleyラットから採取した動物サンプルから１：５希釈した血清に曝露した後のヒツジ赤血球におけるex vivoでの溶血を示す。各点は、投与後５分から２週の範囲における特定の時点での１匹の個々の動物を表す。 実施例８に記述したように、雄Sprague Dawleyラットに対してi.v.およびs.c.投与した後の、Ｚ−ＡＢＤ（ＧＳリンカーによってＡＢＤ０９４（配列番号：７５９）に融合したＺ０６１７５ａ（配列番号：７５３））血清中濃度に対する溶血を示す。 実施例８に記述したように、雄Sprague Dawleyラットに対してi.v.およびs.c.投与した後の、Ｚ−ＡＢＤ−Ｚ（図４に明記されたリンカーによってＡＢＤ０９４（配列番号：７５９）に融合したＺ０６１７５ａ（配列番号：７５３）、構築物５）血清中濃度に対するヒツジ赤血球における溶血を示す。 実施例９に記述したように、雄カニクイザルにおける、i.v.（４１５ｎｍｏｌ／ｋｇ）およびs.c.（１２５０ｎｍｏｌ／ｋｇ）投与後の、Ｚ−ＡＢＤ（ＧＳリンカーによってＡＢＤ０９４（配列番号：７５９）に融合したＺ０６１７５ａ（配列番号：７５３））の血清曝露を示す。各データポイントは、３匹の個々の動物の平均を表す。 単独のおよびＣ５結合Ｚ−ＡＢＤ融合分子（ＧＳリンカーによってＡＢＤ０９４（配列番号：７５９）に融合したＺ０６１７５ａ（配列番号：７５３））と組み合わせた炎症誘発性分子ザイモサン（４０ｍｇ／ｋｇ i.p.）または実施例１０に記述したように分析したＯｍＣＩ（配列番号：７６１）の効果（洗浄液中のＣ５ａ濃度）を示すダイアグラムである。Ｚ−ＡＢＤは、ザイモサンによる誘導の１８時間前に２０ｎｍｏｌ／ｋｇ（ＬＤ）、１００ｎｍｏｌ／ｋｇ（Ｍｄ）および５００ｎｍｏｌ／ｋｇ（ＨＤ）でs.c.投与した。ＯｍＣＩ（３０ｎｍｏｌ／ｋｇ）は、ザイモサン処置の１時間前にi.p.投与し、ザイモサン誘導の１時間後にサンプルを採取した。 実施例１１に記述したように、雌Ｃ５７ｂｌマウスへの５００ｎｍｏｌ／ｋｇの気管内投与後のＺ−ＡＢＤ（ＧＳリンカーによってＡＢＤ０９４（配列番号：７５９）に融合したＺ０６１７５ａ（配列番号：７５３））の薬物動態学的プロファイルを示す。Ａ）各動物の血清中濃度（各時点についてｎ＝３、全体で２７匹の動物）。 実施例１１に記述したように、雌Ｃ５７ｂｌマウスへの５００ｎｍｏｌ／ｋｇの気管内投与後のＺ−ＡＢＤ（ＧＳリンカーによってＡＢＤ０９４（配列番号：７５９）に融合したＺ０６１７５ａ（配列番号：７５３））の薬物動態学的プロファイルを示す。Ｂ）１：５希釈したこれらの血清サンプルに曝露したヒツジ赤血球における溶血。
実施例
特に明記した場合を除き、本研究を通して以下の物質を用いた。
・大腸菌（Escherichia coli）株RR1ΔM15（Ruether, Nucleic Acids Res 10:5765-5772, 1982）。
・大腸菌（Escherichia coli）株XL1-Blue（Agilent Technologies，カタログ番号２００２６８）。
・ヒト補体タンパク質Ｃ５（ｈＣ５）。完全な１６７６個のアミノ酸プロタンパク質は、GenBank受入番号：ＮＰ＿００１７２６（配列番号：７６０）を有し、ここで、アミノ
酸１９〜６７３がベータ鎖であり、アミノ酸６７８〜１６７６がアルファ鎖である。本明細書に用いたヒトＣ５は、Quidel（カタログ番号Ａ４０３）から購入した。
・カニクイザル（Cynomolgus）補体タンパク質Ｃ５（ｃＣ５；配列番号：７６２）。ｃＣ５配列は、カニクイザル（Cynomolgus）（オナガザル科（Macaca fascicularis））ゲ
ノム配列（www.ebi.ac.uk/ena; Ebeling et al. (2001) Genome Res. 21(10):1746-1756
）から誘導した。ヒトＣ５のコード領域をwww.ensembl.orgから検索し、Ｃ５遺伝子を染
色体１５に限局化した。この遺伝子を含む領域は、約１１００００塩基長であり、コンティグＣＡＥＣ０１１５４１５０〜ＣＡＥＣ０１１５４１７８に含まれる。コンティグを手作業で単一ファイルにつなぎ、カニクイザルゲノム原物質に対してヒトＣ５のコード領域を整列させるｓｉｍ４ソフトウェアにゲノムコンテキスト（genomic context）として用
いた。本明細書に用いるカニクイザルＣ５は、３ステップ手順；ＰＥＧ６０００沈降、イオン交換およびＯｍＣＩアフィニティークロマトグラフィーを用いて血清から組織内で精製した。
・ラット補体タンパク質Ｃ５（ｒＣ５；GenBank受入番号：ＸＰ＿００１０７９１３０
）。本明細書に用いるラットＣ５は、３ステップ手順；ＰＥＧ６０００沈降、イオン交換およびＯｍＣＩアフィニティークロマトグラフィーを用いている血清から組織内で精製した。
・フリースタイルＨＥＫ２９３細胞中に組織内で産生したヒトＣ５のアミノ酸残基８２２〜９３１（配列番号：７６０；Fredslund et al. (2008) Nature Immunology 9: 753-760）に対応する補体タンパク質Ｃ５のヒトＭＧ７（ｈＭＧ７）ドメイン。
・ｈＭＧ７結合タンパク質。
・Ｃ末端にＨｉｓ6タグを有するヒメダニOrnithodoros moubata ＯｍＣＩからのＯｍＣＩ（ＡＦ２９９９、前出のNunn, M. A.ら）（配列番号：７６１）を、E. coli株Origami
（ＤＥ３）中で組織内で産生し、ＨｉｓＴｒａｐ１カラムで精製した。
実施例１：補体タンパク質Ｃ５結合ポリペプチドの選択およびスクリーニング
物質および方法
標的タンパク質ｈＣ５のビオチン化：No-Weigh EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin（Pierce, カタログ番号21327）を１０倍（１０×）モル過剰で用いて室温（ＲＴ）で４０分間、
ｈＣ５を製造元の推奨に従ってビオチン標識した。その後、緩衝液をＰＢＳ（１０ｍＭリン酸塩、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）に交換するのは、Protein Desalting Spin Columns（Pierce, カタログ番号89849）を、製造元の説明書に従
って用いて実施した。
Ｃ５結合ポリペプチドのファージディスプレイ選択：本質的にGroenwall et al. J Biotechnol 2007, 128:162-183に記述されたファージミドｐＡｆｆｉ１／ｐＡＹ０００６５
／ｐＡＹ０２９４７／ｐＡＹ０２５９２中に構築された、バクテリオファージ上に示されるタンパク質Ｚのランダム変異体のライブラリーを用いて、Ｃ５結合ポリペプチドを選択した。３つの異なるライブラリーベクターを用いた。これらの２つは、ライブラリーＺｌ
ｉｂ００３Ｎａｉｖｅ．ＩおよびＺｌｉｂ００６Ｎａｉｖｅ．ＩＩを構築するＺ変異体の融合パートナーとしてアルブミン結合ドメイン（連鎖球菌株Ｇ１４８からのＧタンパク質のＡＢＤ、ＧＡ３）を利用する。第３のライブラリー、Ｚｌｉｂ００４Ｎａｉｖｅ．Ｉは、融合パートナーとしてＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ結合分子Ｚ０３６３９（Gunneriusson et al. Protein Eng 1999, 12:873-878中に示されたＺTaqS1-1）を利用する。ライブラリーは、以下の実測サイズ：３×１０9（Ｚｌｉｂ００３Ｎａｉｖｅ．Ｉ）；１．５×１
０10（Ｚｌｉｂ００６Ｎａｉｖｅ．ＩＩ）；および１．４×１０10（Ｚｌｉｂ００４Ｎａｉｖｅ．Ｉ）を有し、数は変異体の量に相当する。
ファージストックは、前出のGroenwallらに記述されたように、振とうフラスコ（Ｚｌ
ｉｂ００３Ｎａｉｖｅ．Ｉ）中、または２０ｌのファーメンター（Ｚｌｉｂ００６Ｎａｉｖｅ．ＩＩおよびＺｌｉｂ００４Ｎａｉｖｅ．Ｉ）中のいずれかに調製した。ファージミドライブラリーＺｌｉｂ００４Ｎａｉｖｅ．Ｉを含むグリセロールストックからの細胞を、２％グルコースおよび１００ｇ／ｍｌアンピシリンを補充した、２０ｌのＴＳＢ−ＹＥ（Tryptic Soy Broth-Yeast Extract；３０ｇ／ｌ ＴＳＢ、５ｇ／ｌ酵母エキス）中に接種した。ファージミドライブラリーＺｌｉｂ００６Ｎａｉｖｅ．ＩＩを含むグリセロールストックからの細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補充した、２０ｌの定義された無プロリン培地［リン酸水素二カリウム７ｇ／ｌ、クエン酸三ナトリウム二水和物１ｇ／ｌ、ウラシル０．０２ｇ／ｌ、ＹＮＢ（DifcoTM；アミノ酸なしのYeast Nitrogen Base、Becton Dickinson）６．７ｇ／ｌ、グルコース一水和物５．５ｇ／ｌ、Ｌ−アラニン０．３ｇ／ｌ、Ｌ−アルギニン一塩酸塩０．２４ｇ／ｌ、Ｌ−アスパラギン一水和物０．１１ｇ／ｌ、Ｌ−システイン０．１ｇ／ｌ、Ｌ−グルタミン酸０．３ｇ／ｌ、Ｌ−グルタミン０．１ｇ／ｌ、グリシン０．２ｇ／ｌ、Ｌ−ヒスチジン０．０５ｇ／ｌ、Ｌ−イソロイシン０．１ｇ／ｌ、Ｌ−ロイシン０．１ｇ／ｌ、Ｌ−リシン一塩酸塩０．２５ｇ／ｌ、Ｌ−メチオニン０．１ｇ／ｌ、Ｌ−フェニルアラニン０．２ｇ／ｌ、Ｌ−セリン０．３ｇ／ｌ、Ｌ−トレオニン０．２ｇ／ｌ、Ｌ−トリプトファン０．１ｇ／ｌ、ｌ−チロシン０．０５ｇ／ｌ、Ｌ−バリン０．１ｇ／ｌ］に接種した。培養物を、ファーメンター（Belach
Bioteknik, BR20）中３７℃で増殖させた。細胞が光学濃度（ＯＤ）０．７〜０．８に達したときに、１０×モル過剰のＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージ（New England Biolabs #N0315S）を用いて約２．６ｌの培養物を感染させた。細胞を３０分間インキュベートし、
その後、ファーメンターを、１００μＭ ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガ
ラクトピラノシド、発現の誘導のため）、２５μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび１２．５μｇ／ｍｌのカルベニシリンを補充したＴＳＢ−ＹＥで２０ｌまで充填し、３０℃で２２時間増殖させた。培養中の細胞を１５，９００ｇで遠心分離によって沈殿させ、その後、培地中に残っているファージ粒子を、ＰＥＧ／ＮａＣｌ（ポリエチレングリコール／塩化ナトリウム）中で２回沈澱させ、濾過し、そして前出のGroenwallら中に記述されたとお
りＰＢＳおよびグリセロール中に溶解した。ファージストックを、使用前に−８０℃で保存した。
選択は、ビオチン化ｈＣ５について４サイクルで実施した。ファージストック調製、選択手順および選択サイクル間のファージの増幅は、ＷＯ２００９／０７７１７５に記述されたとおり本質的に実施した。３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を補充したＰＢＳを、選択緩衝液として用い、標的−ファージ複合体をDynabeads(R) M-280ストレプトアビジン（Dynal, カタログ番号112.06）によって直接捕捉した。
補体タンパク質Ｃ５ １０μｇ当たりビーズ１ｍｇを用いた。E. coli株RR1ΔM15をファージ増幅に用いた。選択のサイクル１では、１００ｎＭ ｈＣ５を用い、ＰＢＳＴ ０．１％（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を補充したＰＢＳ）を用いて２回の洗浄を実施した。その後の３つのサイクルでは、低下した標的濃度および増加した洗浄回数を用いて高めた厳密性を適用した。サイクル２、３および４では；５０または３３ｎＭ ｈＣ５、２５または１
１ｎＭ ｈＣ５および１２．５または３．７ｎＭ ｈＣ５を用いた。サイクル２、３および
４では；すべてのサイクルにおいてＰＢＳＴ０．１％、またはサイクル２、３および４においてＰＢＳＴ０．２％、０．３％および０．４％を用いて４、６および８回の洗浄を実施した。
Ｚ変異体のＥＬＩＳＡスクリーニング：選択されたＺ変異体分子が、ヒト補体タンパク質Ｃ５と実際に相互作用することができるか試験するため、ＥＬＩＳＡアッセイを実施した。Ｚ変異体は、選択物からの単一コロニーを、ディープウェルプレート（Nunc, カタログ番号278752）中の１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび０．１ｍＭ ＩＰＴＧを補充し
たＴＳＢ−ＹＥ培地１ｍｌに接種することによって産生した。プレートを、３７℃で１８〜２４時間インキュベートした。細胞を遠心分離によって沈殿させ、０．０５％ＰＢＳＴ３００μｌ中で再懸濁し、−８０℃で凍結して細胞の周辺質画分を放出させた。凍結サンプルを水浴中で解凍し、細胞を遠心分離によって沈殿させた。周辺質上清は、ａｑｈｄｅａｌｅ−［Ｚ＃＃＃＃＃］−ｖｄｙｖ−［ａＢＤ］−ｙｖｐｇ（前出、Groenwallら）と
して表されるアルブミン結合ドメイン（連鎖球菌（Streptococcus）株Ｇ１４８からのＧ
タンパク質のＧＡ３）への、またはａｑｈｄｅａｌｅ−［Ｚ＃＃＃＃＃］−ｖｄｙｖ−［Ｚ０３６３９］−ｙｖｐｇとして表されるＴａｑＤＮＡポリメラーゼ結合分子Ｚ０３６３９への融合物としてＺ変異体を含んだ。Ｚ＃＃＃＃＃は、個々の５８個のアミノ酸残基Ｚ変異体のことをいう。
ハーフエリア９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Costar，カタログ番号３６９０）Ｚ変異体に対する４μｇ／ｍｌの特異的抗体（Affibody，カタログ番号２０．１０００．０１．０００５）を含む５０μｌ／ウェルのコーティング緩衝液（５０ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６）でコートし、４℃で一夜インキュベートした。抗体溶液を洗い流し、ウェルをＰＢＳＣ（０．５％カゼインを補充したＰＢＳ（Sigma，カタログ番号C8654）１００μｌにより室温で１〜２時間ブロックした。ブロッキング溶液を捨て、周辺質溶液５０μｌをウェルに加え、遅い振盪下、室温で１時間インキュベートした。上清を洗い流し、ウェルを０．０５％ＰＢＳＴで４回洗浄した。次いでビオチン化補体タンパク質ｈＣ５ ５０μ
ｌを、ＰＢＳＣ中５μｇ／ｍｌの濃度で各ウェルに加えた。プレートを室温で１．５時間インキュベートし、続いて上記のように洗浄した。ストレプトアビジン−ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ；Dako,カタログ番号Ｐ０３９７）をＰＢＳＣ中で１：１
０,０００に希釈し、ウェルに加え、次いで、それを４５分間インキュベートした。上記
のように洗浄後、ImmunoPure TMB基質（Thermo Scientific,カタログ番号３４０２１）５０μｌをウェルに加え、プレートを製造元の推奨に従って処理した。ウェルの吸光度は、マルチウェルプレートリーダー、Victor3（Perkin Elmer）を用いて４５０ｎｍで測定し
た。
また、陽性対照として、ａｑｈｄｅａｌｅ−［Ｚ０３９３８］−ｖｄｙｖ−［Ｚ０３６３９］−ｙｖｐｇとして表されるＰＳＭＡ結合分子Ｚ０３９３８を含む周辺質画分を、５μｇ／ｍｌのビオチン化ＰＳＭＡタンパク質に対して検定した。陰性対照として；同じ周辺質調製物を、補体タンパク質ｈＣ５に対して測定した。シークエンシングは、ｈＣ５に対して陽性吸光度値を有するクローンに対して実施した。
シークエンシング：ＰＣＲフラグメントを、標準ＰＣＲプログラムおよびプライマーＡＦＦＩ−２１（５'−ｔｇｃｔｔｃｃｇｇｃｔｃｇｔａｔｇｔｔｇｔｇｔｇ）およびＡＦ
ＦＩ−２２（５'−ｃｇｇａａｃｃａｇａｇｃｃａｃｃａｃｃｇｇ）を用いて単一コロニ
ーから増幅した。増幅されたフラグメントのシークエンシングは、ビオチン化オリゴヌクレオチドＡＦＦＩ−７２（５'−ビオチン−ｃｇｇａａｃｃａｇａｇｃｃａｃｃａｃｃｇ
ｇ）およびBigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）を用い、製造元のプロトコールに従って使用して実施した。シークエンシング反応物は、Magnatrix 8000（Magnetic Biosolution）を用いて、磁性ストレプトアビジンコーティング
ビーズ（Detach Streptavidin Beads, Nordiag,カタログ番号２０１２−０１）に結合す
ることによって精製し、ABI PRISM(R) 3100 Genetic Analyzer（PE Applied Biosystems
）上で分析した。
ブロッキングＥＬＩＳＡ：ＥＬＩＳＡスクリーニングにおいてｈＣ５に対して陽性であることがわかったクローンを、それらの標的結合がｈＣ５結合タンパク質ＯｍＣＩおよび／またはｈＭＧ７結合タンパク質の存在によって影響を受けるかどうかを明らかにするため、ＥＬＩＳＡブロッキングアッセイにかけた。ブロッキングＥＬＩＳＡは、上のＥＬＩＳＡスクリーニングのセクションに記述したように、周辺質画分に発現したＺ変異体を用いて行ったが、しかし、１２ｍｌ丸底チューブ中の５ｍｌの培養物に設定し、沈殿物溶解には０．０５％ＰＢＳＴ２ｍｌを用いた。ＥＬＩＳＡブロッキングアッセイは、標的ステップで導入したプロトコール修飾を用いて、ＥＬＩＳＡスクリーニングアッセイのように行い；ＯｍＣＩまたはｈＭＧ７結合タンパク質を、アッセイプレートに添加する前に、標的タンパク質と混合した。５μｇ／ｍｌのビオチン化ｈＣ５を、それぞれ５倍または２０倍モル過剰のＯｍＣＩまたはｈＭＧ７結合タンパク質と混合し、室温で１時間インキュベートしてプレートに添加する前に複合体形成させた。各クローンについて、それぞれ、参照（１）、陰性対照（２）およびバックグラウンド（３）反応／シグナルを、以下のように得た：標的ステップで、ｈＣ５を単独でＺ変異体に加え（スクリーニングＥＬＩＳＡ中のとおり）（１）；ＯｍＣＩまたはｈＭＧ７結合タンパク質の代わりに無関連のタンパク質ＰＳＭＡ（組織内で産生した）を、補体タンパク質ｈＣ５に加え（２）；緩衝液のみをＺ変異体に加えた（３）。
結果
補体タンパク質Ｃ５結合ポリペプチドのファージディスプレイ選択：ビオチン化ｈＣ５に対するファージディスプレイ選択の２〜４サイクル後に個々のクローンを得た。
ＥＬＩＳＡスクリーニングＺ変異体：選択の４サイクル後に得たクローンを９６ウェルプレート中で産生し、ＥＬＩＳＡにおいて活性をＣ５結合補体タンパク質についてスクリーニングした。全体で、約４００クローンをスクリーニングした。吸光度測定値は、多くの明らかにｈＣ５陽性のクローンを示した。クローンの選択から結果を、表１に示す；Ｚ０５３６３（配列番号：５１０）変異体は、ＡＢＤでタグ付けしたのに対して、他の列記されたＺ変異体は、方法セクションに記述したようなＴａｑ結合分子Ｚ０３６３９でタグ付けした。陰性対照として用いたＰＳＭＡ特異的分子Ｚ０３９３８では、ＰＳＭＡについて陽性シグナルを得たが、ｈＣ５についてはシグナルが得られなかった。
ブロッキングＥＬＩＳＡ：ｈＣ５結合タンパク質ＯｍＣＩおよびｈＭＧ７結合タンパク質を用いて、ｈＣ５について陽性のクローンをブロッキングアッセイにかけた。５つのクローンについて、補体タンパク質Ｃ５への結合シグナルは、ＯｍＣＩの存在によって完全に消滅し、バックグラウンドと同じレベルに達した（表１）。これらのクローンの１つ、すなわちＺ０５３６３変異体（配列番号：５１０）については、ｈＭＧ７結合タンパク質の存在下でｈＣ５を結合するその能力についても試験した。ｈＭＧ７結合タンパク質は、Ｚ０５３６３がｈＣ５に結合することを阻害しなかった。
シークエンシング：シークエンシングは、ＥＬＩＳＡスクリーニングにおいて補体タンパク質Ｃ５に対して陽性の吸光度値を有するクローンについて実施した。各変異体に固有の識別番号＃＃＃＃＃を与え、個々の変異体をＺ＃＃＃＃＃と称する。５８個のアミノ酸残基長のＺ変異体のアミノ酸配列を、図１に、そして配列番号：５０９〜５１３の配列リストに記載する。これらのＺ変異体の推測された補体タンパク質Ｃ５結合モチーフを、図１に、そして配列番号：１３〜１７として配列リストに記載する。これらのＺ変異体のそれぞれの中で完全３ヘリックス束を構成すると予測される４９個のアミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列を、図１に、そして配列番号：２６１〜２６５として配列リストに記載する。
実施例２：Ｚ変異体の産生および特徴づけ
物質および方法
Ｚ変異体のサブクローニング、タンパク質発現および精製：５つの補体タンパク質Ｃ５結合Ｚ変異体（Ｚ０５３６３（配列番号：５１０）；Ｚ０５４７７（配列番号：５０９）；Ｚ０５４８３（配列番号：５１１）；Ｚ０５５３８（配列番号：５１２）およびＺ０５６９２（配列番号：５１３）を、ｐＡｆｆｉ１／ｐＡＹ０００６５／ｐＡＹ０２９４７ライブラリーベクターから増幅した。Ｎ末端Ｈｉｓ6タグを有する二量体Ａｆｆｉｂｏｄｙ
分子の構築のためのサブクローニング戦略は、標準分子生物学的手法を用いて、ＷＯ２００９／０７７１７５に詳細に記述されたとおり適用した。Ｚ遺伝子フラグメントを、コードされた配列ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＬＱ−［Ｚ＃＃＃＃＃］［Ｚ＃＃＃＃＃］−ＶＤが得られる発現ベクターｐＡＹ０１４４８にサブクローニングした。
サブクローニングしたＺ変異体をE. coli BL21（ＤＥ３）に形質転換し、マルチファーメンターシステムGreta（Belach Bioteknik）中で発現させた。要するに、培養物を、５
０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＴＳＢ−ＹＥ−培地８００ｍｌ中３７℃で増殖させた。ＯＤ６００約１で、ＩＰＴＧの自動添加により、培養物を０．０５ｍＭの最終濃度に誘導した。誘導の５時間後、培養物を約１０℃に冷却し、遠心分離（２０分、１５，９００ｇ）によって収穫した。上清を捨て、細胞沈殿物を集め、さらなる使用まで−２０℃で保存した。発現レベルおよび溶解度は、クーマシーブルー染色を用いて４〜１２％ＮｕＰＡＧＥＴＭゲル（Invitrogen）上のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって算定した。
主に可溶性タンパク質として発現されるＺ変異体については、１０００ＵのBenzonase(R)（Merck,カタログ番号１．０１６５４．００１）を添加した結合緩衝液（２０ｍＭリン
酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）中で細胞沈殿
物を再懸濁し、超音波処理によって破壊した。Ｚ変異体のそれぞれについては、超音波処理した懸濁液を、遠心分離（４０分、２５，０００ｇ、４℃）によって清澄化し、上清を１ｍｌのHis GraviTrapTMカラム（GE Healthcare）上に装填した。カラムを洗浄緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、６０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）
で洗浄した後、溶離緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ
イミダゾール、ｐＨ７．４）３ｍｌでＺ変異体を溶離した。主に不溶性タンパク質として発現したＺ変異体は同様に精製したが、しかし、結合および洗浄緩衝液中に８Ｍ尿素を含んだ。必要に応じて、移動相として０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を含む水を用い、かつ０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリルの適当な勾配（典型的に２０カラム体積にわたって０〜５０％）による溶離を用いて、１ｍｌのResourceTMカラム（GE Healthcare）
上で逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）によってＺ変異体を更に精製した。
ＰＤ−１０カラムを用いて緩衝液をＰＢＳに交換した（GE Healthcare）。
タンパク質の特徴づけ：精製したＺ変異体の濃度は、理論的な吸光係数を用いて２８０ｎｍでの吸光度測定によって決定した。純度は、クーマシーブルー染色を用いて４〜１２％ＮｕＰＡＧＥTMゲル（Invitrogen）上のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって算定した。同一性を確認するため、そして精製したＺ変異体の分子量を決定するため、ＬＣ／ＭＳ分析をAgilent 1100 LC/MSDシステム（Agilent Technologies）上で実施した。
ＣＤ分析：精製したＺ変異体を、ＰＢＳ中で０．５ｍｇ／ｍｌに希釈した。希釈したそれぞれのＺ変異体について、ＣＤスペクトルを２０℃の温度で、２５０〜１９５ｎｍの間で記録した。さらに、温度可変測定（ＶＴＭ）を実施して融解温度（Ｔｍ）を決定した。ＶＴＭでは、５℃／分の温度勾配で、温度を２０から９０℃まで上昇させながら、吸光度を２２１ｎｍで測定した。Ｚ変異体のリフォールディングする能力は、２０℃まで冷却した後、２５０〜１９５ｎｍでさらなるＣＤスペクトルを集めることによって評価した。ＣＤ測定は、光路長１ｍｍのセルを用いてJasco J-810分光偏光計（Jasco Scandinavia AB
）において実施した。
Biacore結合分析：５つのサブクローニングしたＨｉｓ6タグ付き二量体ｈＣ５−結合Ｚ変異体のｈＣ５、ｃＣ５、ｒＣ５、ｈＭＧ７およびｈＩｇＧ（Sigma,カタログ番号Ｇ４３８６）との相互作用をBiacore機器（GE Healthcare）において分析した。Ｚ変異体を、いくつかのＣＭ５チップ表面のカルボキシル化デキストラン層上の異なるフローセル（GE Healthcare）中に固定した。固定化は、製造元のプロトコールに従ってアミン結合化学を
用いて実施した。各チップ上の１つのフローセル表面を活性化し、そして検体注射におけるブランクとして不活性化した。ＨＢＳ−ＥＰランニングバッファー（GE Healthcare）
中で１００ｎＭの最終濃度に希釈した検体を、１０μｌ／分の流速で１分間注射した。解離２分後、１０ｍＭ ＨＣｌを１回注射して表面を再生した。結果を、BiaEvaluationソフトウェア（GE Healthcare）で分析した。ブランク表面の曲線を、リガンド表面の曲線か
ら減算した。
結果
Ｚ変異体のサブクローニング：選択した５つ独特なクローン（Ｚ０５４７７（配列番号：５０９）、Ｚ０５３６３（配列番号：５１０）、Ｚ０５４８３（配列番号：５１１）、Ｚ０５５３８（配列番号：５１２）およびＺ０５６９２（配列番号：５１３））を、発現ベクターｐＡＹ０１４４８中で二量体としてサブクローニングするために選択し、その後、シークエンシングによって確認した。
タンパク質産生：ヒスチジンタグ付き二量体Ｚ変異体からは、許容される発現レベルの
可溶性遺伝子産物が得られた。産生バッチの純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による評価で９０％を超えると推定された。ＬＣ／ＭＳ分析により、すべてのＺ変異体分子について正確な分子量を確認した。
ＣＤ分析：さまざまなＺ変異体の融解温度（Ｔｍ）は、ＣＤシグナル対温度プロットにおける転移の中間点を決定することによって計算した。可逆的に折り畳まれている多くのＺ変異体についての結果を、下の表２にまとめる。
Biacore結合分析：５つのサブクローニングした二量体Ｚ変異体のＣ５およびＭＧ７の
異なる種、ｈＣ５のサブドメインへの結合、ならびにＩｇＧへのバックグラウンド結合を、Biacore機器において、Ｚ変異体を含む表面上に異なるタンパク質を注射することによ
って試験した。表面上のさまざまなＺ変異体についてのリガンド固定化レベルは、Ｚ０５３６３：２０８０ＲＵ、Ｚ０５４７７：２１８０ＲＵ、Ｚ０５４８３：２０１０ＲＵ、Ｚ０５５３８：２５７０ＲＵおよびＺ０５６９２：３２７０ＲＵであった。さまざまなＺ変異体を、１００ｎＭの濃度で注射したタンパク質の異なるセットへの結合について試験した、表３参照。試験したＺ変異体の結果を、各タンパク質について＋／−の結果として表に示す。
Biacore結合分析の例として、図２は、ｈＣ５、ｃＣ５、ｒＣ５、ｈＭＧ７およびｈＩ
ｇＧに対して検定した固定化二量体Ｚ０５４７７から得たセンサーグラムを示す。
実施例３：補体タンパク質Ｃ５結合Ｚ変異体の成熟ライブラリーのデザインおよび構築
本実施例では、成熟ライブラリーを構築した。ライブラリーは、ｈＣ５−結合ポリペプチドの選択に用いた。成熟ライブラリーからの選択は、通常、親和性が増加した結合剤になることが期待される（Orlova et al. Cancer Res 2006, 66(8):4339-48）。本研究では、その後に構築した二本鎖ＤＮＡの連結および制限を用いてトリヌクレオチド構成要素のランダム化セットの取り込みが可能となるSlonomics(R)技術によってランダム化二本鎖リンカーを生成した。
物質および方法
ライブラリーデザイン：ライブラリーは、実施例１および２に記述したｈＣ５結合Ｚ変異体の配列の選択に基づいた。新たなライブラリーでは、Ｚ分子骨格中の１３の可変位置を、配列番号：５０９〜５１３（Ｚ０５４７７、Ｚ０５３６３、Ｚ０５４８３、Ｚ０５５３８、Ｚ０５６９２）に定義されたＺ変異体配列に基づく戦略に従って特定のアミノ酸残基の方へ偏らせた。制限部位ＸｈｏＩおよびＳａｃＩに隣接するアミノ酸配列５'−ＡＡ
ＡＴＡ ＡＡＴ ＣＴＣ ＧＡＧ ＧＴＡ ＧＡＴ ＧＣＣ ＡＡＡ ＴＡＣ ＧＣＣ
ＡＡＡ ＧＡＡ／ＧＡＧ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＧＣＡ／ＧＣＣ ＮＮＮ ＮＮＮ
ＧＡＧ／ＧＡＡ ＡＴＣ／ＡＴＴ ＮＮＮ ＮＮＮ ＴＴＡ／ＣＴＧ ＣＣＴ ＡＡＣ
ＴＴＡ ＡＣＣ／ＡＣＴ ＮＮＮ ＮＮＮ ＣＡＡ／ＣＡＧ ＴＧＧ ＮＮＮ ＧＣＣ
／ＧＣＧ ＴＴＣ ＡＴＣ／ＡＴＴ ＮＮＮ ＡＡＡ／ＡＡＧ ＴＴＡ／ＣＴＧ ＮＮＮ
ＧＡＴ／ＧＡＣ ＧＡＣ ＣＣＡ ＡＧＣ ＣＡＧ ＡＧＣ ＴＣＡ ＴＴＡ ＴＴＴ
Ａ−３’（ランダム化コドンは、ＮＮＮとして示す）の１４７塩基対の部分ランダム化ヘリックス１および２を含む二本鎖ＤＮＡのSlonoMax(R)ライブラリーを、Sloning BioTechnology GmbH（Pucheim,ドイツ）に注文した。最終的に１２個の可変Ｚ位置を含む新た
なライブラリーにおけるアミノ酸残基の理論分布を表４に示す。
ライブラリー構築：
AmpliTaq Goldポリメラーゼ（Applied Biosystems,カタログ番号４３１１８１６）を用いて、１２サイクルのＰＣＲの間、ライブラリーを増幅し、プールした生成物を、QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN,カタログ番号２８１０６）を用いて、供給者の推奨に従って精製した。精製したランダム化ライブラリーフラグメントのプールを、制限酵素ＸｈｏＩおよびＳａｃＩ（New England Biolabs,カタログ番号Ｒ０１４６０Ｌおよびカタログ番号Ｒ０１５６Ｌ）で消化し、PCR Purification Kitでさらに１回精製した。その後、１％アガロースゲル上で分取ゲル電気泳動を用いて生成物を精製した。
ファージミドベクターｐＡＹ０２５９２（本質的に、前出のGroenwallらに記述された
ｐＡｆｆｉ１として）を同じ酵素で制限し、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を用いて精製した。制限されたフラグメントおよび制限されたベクターを、５：１のモル比で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs,カタログ番号Ｍ０２０２Ｓ）により室温で２時間、続いて４℃で一晩インキュベーションして連結した。連結したＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によって回収し、続いて１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）中に溶解した。
連結反応物（ＤＮＡ／形質転換約２５０ｎｇ）をエレクトロコンピテントE. coli RR1
ΔM15細胞（１００μｌ）にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの直
後、ＳＯＣ培地（ＴＳＢ−ＹＥ培地、１％グルコース、５０μＭ ＭｇＣｌ2、５０μＭ
ＭｇＳＯ4、５０μＭ ＮａＣｌおよび１２．５μＭ ＫＣｌ）約１ｍｌを加えた。形質転
換細胞を３７℃で５０分間インキュベートした。滴定のため、そして形質転換体の数の測定のためサンプルを採取した。その後、細胞をプールし、２％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補充したＴＳＢ−ＹＥ培地７ｌ中３７℃で一夜培養した。細胞を４，０００ｇで１５分間沈殿させ、ＰＢＳ／グリセロール溶液（約４０％グリセロール）中に再懸濁した。細胞を等分し、８０Ｃで保存した。Ｚ変異体のライブラリーからのクローンについて、含量を確認するため、そしてライブラリーデザインと比較して構築ライブラリーの結果を評価するため、シークエンシングした。実施例１に記述したとおり、シークエンシングを実施し、アミノ酸分布を確認した。
ファージストックの調製：Ｃ５ファージミドライブラリーを含むグリセロールストックから細胞を１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補充した定義済み無プロリン培地（実施例１に記述した）２０ｌ中に接種し、ファーメンター（Belach Bioteknik, BR20）中３７℃で増殖させた。すべてのステップを、ライブラリーＺｌｉｂ００６Ｎａｉｖｅ．ＩＩについて実施例１に記載したとおり実施した。培養後、１５，９００ｇで遠心分離によって細胞を沈殿させ、その後、培地に残っているファージ粒子をＰＥＧ／ＮａＣｌ中で２回沈澱させ、濾過し、実施例１に記述したようにＰＢＳおよびグリセロールに溶解した。ファージストックは、選択に用いるまで−８０℃で保存した。
結果
ライブラリー構築：確認された結合性（実施例１および２）を有するＯｍＣＩブロックトＣ５結合Ｚ変異体のセットに基づいて新たなライブラリーを設計した。設計したライブラリーの理論サイズは、６．７×１０9のＺ変異体であった。E. coli. RR1ΔM15細胞に形質転換後、滴定によって決定されたライブラリーの実測サイズは、１．４×１０9の形質
転換体であった。
ライブラリー品質は、６４個の形質転換体のシークエンシングおよびそれらの実際の配列を理論デザインと比較することによって試験した。設計したライブラリーと比較した実際のライブラリーの内容は、満足すべきものであることがわかった。設計されたアミノ酸配列（位置２７のＷ）中のロックされた位置は、期待のアミノ酸のみが、その位置に生じたという点で、実際の配列に反映された。したがって、ｈＣ５結合ポリペプチドの成熟ライブラリーは、良好に構築された。
実施例４：成熟ライブラリーからのＺ変異体の選択、スクリーニングおよび特徴づけ
物質および方法
補体タンパク質Ｃ５結合ポリペプチドのファージディスプレイ選択：標的タンパク質ｈＣ５を、実施例１に記述したとおりビオチン化した。ファージディスプレイ選択は、実施例３に記述したＺ変異体分子の新たなライブラリーを用いて、本質的に実施例１に記述したｈＣ５に対して実施した。ファージ増幅には、E. coli XL1-Blueを用いた。選択は、２つの並行なトラックで最初に実施した。一方のトラックでは、選択の時間が２時間であったが、もう一方のトラックでは、より短い選択時間：第１のサイクルで２０分およびその後のサイクル２〜４では１０分を用いた。これらの２つのトラック（１および２）を第２のサイクルで更に分けて、全部で６トラック（１ａ−ｃおよび２ａ−ｃ、標的濃度および洗浄条件が異なる）となった。選択は、合計４サイクルで実施した。選択のサイクル１では、２５ｎＭ補体タンパク質Ｃ５を用い、０．１％ＰＢＳＴにより５回の洗浄を実施した。その後の３つのサイクルでは、低下した標的濃度および増加した洗浄回数を用いて高めた厳密性を適用した。サイクル２、３および４では；１０、５または２．５ｎＭ補体タンパク質Ｃ５、４、１または０．２５ｎＭ補体タンパク質Ｃ５および１．６、０．２または０．０５ｎＭ補体タンパク質Ｃ５を用いた。サイクル２、３および４では；０．１％ＰＢＳＴを用いて１０、１５および、２０回の洗浄を実施した。さらに、２番目の最後の洗浄は、２つのトラック（１ｃおよび２ｃ）について洗浄溶液中の５０×過剰の非ビオチン化
ｈＣ５を用いて３時間に延長した。
潜在的結合剤のシークエンシング：シークエンシングのため、異なる選択トラックからの個々のクローンを選んだ。ＥＬＩＳＡスクリーニングを行ったすべてのクローンをシークエンシングした。遺伝子フラグメントの増幅および遺伝子フラグメントの配列分析は、実施例１に記述したように実施した。
Ｚ変異体のＥＬＩＳＡスクリーニング：補体タンパク質Ｃ５成熟ライブラリーの選択されたクローンからＺ変異体を含む単一コロニーをランダムに選び、実施例１に記述したとおり、１ｍｌの培養物中で増殖させた。凍結融解サイクルを８回繰り返すとペリプラズマタンパク質が放出された。ＥＬＩＳＡスクリーニングは、以下を除外して、本質的に実施例１に記述したとおり実施した。ハーフエリア９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、コーティング緩衝液中に希釈した２μｇ／ｍｌのＡＢＤ特異的ヤギ抗体（組織内で産生）でコートした。ビオチン化ｈＣ５を０．１５μｇ／ｍｌの濃度で用い、インキュベーションを１．５〜２時間実施した。ストレプトアビジン結合ＨＲＰを、Thermo Scientific（カタロ
グ番号Ｎ１００）から入手した。一次選択（実施例１）から得たＺ変異体Ｚ０５３６３（配列番号：５１０）を、陽性対照だけでなく、ｈＣ５を除いた陰性対照としても用いた。
選択した成熟Ｚ変異体を、より低い濃度でｈＣ５に対して第２のスクリーンにかけ、ｒＣ５と比較した。アッセイは、本質的に上記のように実施した。ｈＣ５およびｒＣ５を、それぞれ０．０５μｇ／ｍｌおよび４μｇ／ｍｌの濃度で用いた。Ｚ変異体Ｚ０５３６３（配列番号：５１０）を、同様に本実験の陽性対照として用いた。陰性対照として、ＰＤＧＦ−Ｒβ（Ｚ０１９７７；ＷＯ２００９／０７７１７５に記述された）に結合したＺ変異体を、ビオチン化ｈＣ５またはｒＣ５に対して検定した。
選択されたＺ変異体における大規模配列分析（deep sequence analysis）ならびに１３のランダム化位置におけるアミノ酸と測定された融解温度との相関性ならびに溶血アッセイ（実施例６に記述した）におけるヒトＣ５およびマウスＣ５についてのＩＣ50値は、５５８個の配列決定されたクローンの中には望ましいＺ変異体が確認されなかったことを示唆している。Ｚ変異体Ｚ０５９９８（配列番号：４９９）に基づいて、部位特異的突然変異誘発法のための従来の技術を用いて位置１０の単一アミノ酸、ＩｌｅをＬｅｕで置換した。新たな変異体は、Ｚ０８０４４（配列番号：４９８）と称する。このＺ変異体の推測された補体タンパク質Ｃ５結合モチーフを、図１に、そして配列番号：２として配列リストに記載する。これらのＺ変異体内に完全な３ヘリックス束を構成すると予測される４９個のアミノ酸残基長ポリペプチドのアミノ酸配列を、図１に、そして配列番号：２５０として配列リストに記載する。
結果
補体タンパク質Ｃ５結合ポリペプチドのファージディスプレイ選択：選択は、それぞれ４サイクルを含む全部で６つの並行なトラックにおいて実施した。選択トラックが異なると、以下のように標的濃度および洗浄条件が異なる：１ａ）選択時間２時間、高い濃度、標準洗浄、１ｂ）選択時間２時間、低い濃度、標準洗浄、１ｃ）選択時間２時間、中程度の濃度、長い洗浄、２ａ）選択時間１０分、高い濃度、標準洗浄、２ｂ）選択時間１０分、低い濃度、標準洗浄、および２ｃ）選択時間１０分、中程度の濃度、長い洗浄。各選択サイクルについては、標的濃度を低下させ、洗浄条件をより厳密にした。すべてのトラックから各ラウンドで溶出液中の十分な量のファージ粒子を得た。ほとんどのファージ粒子は、最も高い標的濃度および最も温和な洗浄条件を表すトラック１ａおよび２ａに見いだされた。
シークエンシング：ランダムに選択されたクローン（５５８）を配列決定した。それぞ
れ個々のＺ変異体に、実施例１に記述したとおり、識別番号Ｚ＃＃＃＃＃を与えた。全体で、２４２個の新たなユニークＺ変異体分子が確認された。５８個のアミノ酸残基長のＺ変異体のアミノ酸配列を、図１に、そして配列リストに配列番号：４９７、配列番号：４９９〜５０８および配列番号：５１４〜７４４として記載する。これらのＺ変異体の推測された補体タンパク質Ｃ５結合モチーフを、図１に、そして配列番号：１、配列番号：３〜１２および配列番号：１８〜２４８として配列リストに記載する。これらのＺ変異体のそれぞれの中に完全な３ヘリックス束を構成すると予測される４９個のアミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列を、図１に、そして配列番号：２４９、配列番号：２５１〜２６０および配列番号：２６６〜４９６として配列リストに記載する。配列決定されたクローンの中で、６３個の配列は、２回またはそれ以上生じた。
Ｚ変異体のＥＬＩＳＡスクリーニング：４つの選択サイクル後に得られたクローンを９６ウェルプレート中で産生し、ＥＬＩＳＡを用いてｈＣ５−結合活性についてスクリーニングした。ランダムに選択されたクローンをすべて分析した。２４２個の独特なＺ変異体のうちの２２９個については、一次選択（実施例１）から得た陽性対照クローンＺ０５３６３（配列番号：５１０；平均吸光度シグナル０．３ＡＵ）と比較して、０．１５μｇ／ｍｌの濃度で、ｈＣ５に対してより高い反応（０．３〜３．１ＡＵ）が得られることが見いだされた。すべての選択トラックからのクローンが、陽性シグナルを示した。陰性対照は、約０．１ＡＵの吸光度を有した。
Ｚ変異体は、ｈＣ５についてのＥＬＩＳＡスクリーンにおけるそれらの性能
および発生頻度に基づいて選択した。４３個の独特なＺ変異体を、より低い濃度のｈＣ５（０．０５μｇ／ｍｌ）およびｒＣ５（４μｇ／ｍｌ）について検定した。試験した４０個のＺ変異体について、ｒＣ５に対して陽性の結果が得られ、これは、陰性対照（０．４ＡＵ）についての２×シグナルとして定義された。ｈＣ５およびｒＣ５のより低い濃度に対して試験したすべてのＺ変異体についての結果を図３に示す。
実施例５：補体タンパク質Ｃ５結合Ｚ変異体のサブセットのサブクローニング、産生および特徴づけ
物質および方法
発現ベクターへのＺ変異体分子のサブクローニング：配列分析ならびにヒトおよびラット補体タンパク質Ｃ５に対するＥＬＩＳＡにおける性能に基づいて、発現ベクターｐＡＹ０１４４８へのサブクローニングのために、４５個のクローンを選択した。単量体Ｚ変異体フラグメントを、ファージミドベクターｐＡＹ０２５９２から増幅し、ｐＡＹ０１４４８へのサブクローニングを、実施例２に記述したように実施して、タンパク質配列ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＬＱ−［Ｚ＃＃＃＃＃］−ＶＤをコードするベクターを得た。
タンパク質発現および精製：Ｈｉｓ6−（Ｚ＃＃＃＃＃）フォーマットにおける４５個
のＺ変異体を、実施例２に記述した自動化マルチファーメンターシステムにおいて、または同様に、手作業でＩＰＴＧにより０．４ｍＭの最終濃度に誘導した振盪機フラスコ中培養物１００ｍｌの小スケールの設定で発現させた。精製は、本質的に実施例２に記述した１ｍｌのHisGraviTrapTMカラムを用いて、またはより小スケールで、０．１ｍｌのHis SpinTrap（GE Healthcare,カタログ番号２８−４０１３−５３）を用いて実施した。PD-10
カラムまたはPD SpinTrap G-25（GE Healthcare,カタログ番号２８−９１８０−０４）を用いて、製造元の説明書に従って緩衝液をＰＢＳに交換した。精製したＺ変異体の濃度は、２８０ｎｍでの吸光度測定によって決定し、純度および同一性は、実施例２に記述したＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＬＣ／ＭＳによって評価した。サンプルを等分し、さらなる使用まで−８０℃で保存した。
ＣＤ分析：融解温度およびフォールディング可逆性の測定のためのＣＤ分析を、実施例
２に記述したように実施した。
結果
タンパク質発現および精製：全４５個のサブクローニングしたＺ変異体は、発現しることができ、精製したすべての変異体についてin vitro溶解性は、良好であった。純度は、ＬＣ／ＭＳによって、すべての変異体について９０％を超えることが推定された。正確な分子量は、ＬＣ−ＭＳによって確認した。
ＣＤ分析：２０℃で実施したＣＤスペクトル測定は、この温度でＺ変異体のαヘリックスの構造を確認した。温度可変測定前に得られたスペクトル上に温度可変測定（９０℃に加熱し、続いて２０℃に冷却する）後に得られたスペクトルを重ねると、９０℃に加熱した後、すべてのＺ変異体が、完全にまたはほとんど完全にそれらのαヘリックスの構造に折り畳まれたことがわかった（結果は示していない）。一連のＺ変異体についての融解温度を、温度可変測定から決定し、表５に示す。
実施例６：Ｃ５結合Ｚ変異体のin vitroでの特徴づけ
物質および方法
クローニングおよびタンパク質産生：Ｃ５結合Ｚ変異体（配列番号：７４５〜７５７）のサブセットをコードするＤＮＡ、ここで、E. coliコドンを、GeneArt, GmbHによって最適化し、合成した。Ｃ５結合Ｚ変異体を表す合成遺伝子をサブクローニングし、E. coli
中で発現させた。場合によりアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ０９４、配列番号：７５９）に結合されたＺ変異体の単量体または二量体の構築物をコードする発現ベクターを、図４に概略的に説明する。
細胞内に発現されたＺ変異体を、従来のクロマトグラフィー方法を用いて精製した。ホモジナイズおよび清澄化は、超音波処理、続いて遠心分離および濾過によって実施した。陰イオン交換クロマトグラフィーを捕捉ステップとして用いた。さらなる精製を、疎水的相互作用クロマトグラフィーによって行った。精製は、酸性条件（ｐＨ５．５）で実行した。研磨および緩衝液交換は、サイズ排除クロマトグラフィーによって実施した。最終的なタンパク質含量に濃縮する前に、内毒素レベルをポリミキシンＢアフィニティークロマトグラフィーによって低減した。産生されたタンパク質を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳお
よびＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分析した。
さらに、組換え発現されたＯｍＣＩタンパク質（配列番号：７６１）をin vitro研究の参照分子として用いた。
溶血の阻害：古典補体経路機能およびＣ５結合ポリペプチドによるその阻害の研究のため、ヒツジ赤血球を、オルシーバー液（Alsever's solution）中の新たなヒツジ全血（Swedish National Veterinary Institute）から調製し、その後、ウサギ抗ヒツジ赤血球抗血
清（Sigma）で処理して抗体に感作したヒツジ赤血球（ＥＡ）とした。工程全体を無菌条
件下で行った。すべての他の試薬は、商業的供給源からであった。
in vitroアッセイは、９６ウェルＵ型マイクロタイタープレート中で、試験タンパク質、補体血清およびＥＡ懸濁液の逐次添加によって行った。ウェル当たり全反応体積５０μｌ中のすべての試薬の最終濃度は、ｐＨ７．３〜７．４で以下の通りであった：０．１５ｍＭ ＣａＣｌ2；０．５ｍＭ ＭｇＣｌ2；３ｍＭ ＮａＮ3；１３８ｍＭ ＮａＣｌ；０．
１％ゼラチン；１．８ｍＭバルビタールナトリウム；３．１ｍＭバルビツール酸；５００万個のＥＡ；適した希釈度の補体タンパク質Ｃ５血清、および所望の濃度のＣ５結合Ｚ変異体。アッセイでは異なる種の補体血清を用いてＺ変異体の異種間効力を明らかにした。マウス血清については、Ｃ５減損ヒト血清（C5 depleted human serum）（Quidelからの
Ｃ５Ｄ カタログ番号Ａ５０１）を等量で補充しなければならなかった。
ＥＡ懸濁液の添加によって反応を開始する前に、Ｚ変異体を、上記の補体血清と共に氷上で２０分間プレインキュベートした。溶血反応を、３７℃で４５分間撹拌しながら進行させ、次いで、場合により０．０２％Ｔｗｅｅｎ ２０を含む氷冷生理食塩水１００μｌ
の添加によって終了させた。細胞を底部と上清１００μｌに相当する上部とに遠心分離し、ハーフエリアおよびフラットボトムウェルを有する透明なマイクロプレートへ移した。反応結果は、波長４１５ｎｍのマイクロタイタープレートリーダーを用いて光学濃度として分析した。
すべての試験の場合において、各プレートには、対照、ビヒクルおよびＯｍＣＩ（配列番号：７６１）が含まれており、それぞれ、阻害されてない反応および完全に阻害された反応の値を確定した。これらの値を用いて任意の所定のサンプル濃度で補体溶血の％阻害を計算した。試験したＺ変異体の阻害効力（ＩＣ50値）は、濃度を調節したヒトＣ５添加〜Ｃ５減損血清の存在下で同じアッセイを適用することによって確定した。非常に強力な阻害剤（低ｎＭ〜ｎＭ以下）については、反応混合物の最終的なＣ５濃度を０．１ｎＭに調節し、これは、場合によりＣ５減損または欠損血清を用いて確立した。
固定化ｈＣ５に対するＣ５結合Ｚ変異体の親和性およびin vitro動態：ｈＣ５に対するＣ５結合Ｚ変異体（配列番号：７４８〜７５７）の結合親和性を、Biacore T200機器（GE
Healthcare）を用いて分析した。アミン結合化学を用いて、製造元のプロトコールに従
って、ヒトＣ５（Ａ４０３、Quidel Corporation）をＣＭ５センサチップ（９００ＲＵ）に結合した。結合は、１０ｍＭ酢酸Ｎａ緩衝液ｐＨ５（GE Healthcare）中７．５μｇ／
ｍｌの濃度でｈＣ５を注射することによって実施した。参照細胞は、同じ試薬で処理したが、ヒトＣ５を注射しなかった。
すべての実験は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％Surfactant P20（ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液、GE Healthcare）中で実施
した。動態解析については、流速を３０μｌ／分とし、データを２５℃で集めた。参照細胞からのデータを減算して容積屈折率（bulk refractive index）変化を補正した。また
、ほとんどの場合、センサーグラムがダブルブランクされるように、ＨＢＳ−ＥＰの注射を対照として含んだ。表面は、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中で再生した。
固定化ｈＣ５に対するＺ変異体の結合は、一サイクル動態法で研究し、５濃度のサンプルを、注射間の再生なしに同じサイクルで次々に注射する。速度定数は、ラングミュア１：１またはBiacore T200 Evaluation Softwareバージョン１．０の二価検体モデルを用いてセンサーグラムから計算した。
固定化ｈＣ５に対するＣ５結合Ｚ−ＡＢＤ分子の親和性およびin vitro動態：固定化ｈＣ５に対するＺ−ＡＢＤ分子（ＧＳリンカーによってＡＢＤ０９４（配列番号：７５９）に融合した配列番号：７４８〜７５７）の結合は、Biacore T200機器（GE Healthcare）
を用いて評価した。
単量体または二量体としてＺ０６１７５ａ（配列番号：７５３）が、図４に明記したように異なるリンカーを介してＮ末端またはＣ末端のいずれかにおいてＡＢＤ０９４（配列番号：７５９）に融合したＺ−ＡＢＤ構築物（構築物２、７、５および４）を、組換えヒトアルブミン（Cell Prime rAlbumin AF-G, 9301, Novozymes）と共にプレインキュベー
トし、希釈し、次いで上記のような一サイクル動態法に従って固定化ヒトＣ５上に注射した。比較として、同じ構築物を、ＨＳＡなしで注射した。２つの構築物、Ｚ０６１７５ａ−ＧＳ（図４、構築物１）およびＺ０６１７５ａ−ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ−ＡＢＤ０９４（図４、構築物３）は、ＨＳＡなしで試験しただけである。
Ｃ５コーティングＥＣＬプレートに対するＣ５結合Ｚ変異体の定常状態結合：ヒトＣ５に対する、Ｚ変異体（図４に明記した構築物中のＡＢＤ０９４（配列番号：７５９）に場合により融合した配列番号：７４５、配列番号：７４８〜７５７）を含む、多くのＣ５結合構築物の親和性を、ルテニウム標識Ｃ５結合Ｚ−ＡＢＤ変異体（ＧＳ−リンカーによって配列番号：７５９に融合した配列番号：７４８）の置換によって測定した。
トレーサーとして用いるＺ−ＡＢＤ変異体（ＧＳリンカーによって配列番号：７５９に融合した配列番号：７４８）を、モル比１：１２〜１：２０（タンパク質：SULFO-TAG NHS-Ester, Meso Scale Discovery,カタログ番号Ｒ９１ＡＮ−１）で標識した。標識反応を、氷上で２時間実施した。ＺｅｂａTM回転脱塩カラム（Thermo Scientific,カタログ番号８９８８９）を用いて非結合ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧを除去し、ブラッドフォード試薬（Bradford, M.M., Anal. Biochem. 72: 248-254, 1976）を用いて最終的なタンパク質濃度を測定した。ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ標識Ｚ−ＡＢＤ変異体の親和性（解離定数、ＫＤ）は、Ｃ５コーティングされた電気化学ルミネセンスウェル（ＥＣＬ，Meso Scale Discovery）に対して標識Ｚ−ＡＢＤ変異体の濃度を高める飽和結合分析によって決定した。Ｚ−ＡＢＤ変異体上のＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ分子の分布を決定するため、標識Ｚ−ＡＢＤ変異体をＬＣ／ＭＳによって更に分析した。
置換は、ＥＣＬ、マルチアレイ９６ウェル高結合非コーティング（Meso Scale Discovery,カタログ番号Ｌ１５ＸＢ）プレートを、５０ｆｍｏｌ／ウェルのｈＣ５により４℃で
一夜コーティングすることによって実施した。その後、非特異的部位を、１％カゼイン入
りのＰＢＳにより室温で２時間ブロックした。ＡＢＤ０９４（配列番号：７５９）（図４参照）と場合により融合した異なるＺ変異体を、異なる濃度で、１％カゼイン入りＰＢＳ中、約１００ｐＭのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ標識Ｃ５結合Ｚ−ＡＢＤ変異体と共にインキュベートした。プレートを３００ｒｐｍで撹拌しながら、インキュベーションを室温で３時間続けた。最後に、氷冷ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０ １５０ｌで３回洗浄してインキュベーシ
ョンを終了した。最終洗浄の直後、リーディングバッファー（reading buffer）（超高純度Ｈ２Ｏ中に１：１希釈した、４×リーディングバッファーＴ、Meso Scale Discoveryカタログ番号Ｒ９２ＴＣ−３）１５０μｌ×２を各ウェルに加え、プレートリーダー（SECTOR Imager 2400, Meso Scale Discovery）を用いてシグナルを検出した。置換アッセイでは、陽性対照として天然のＣ５結合タンパク質ＯｍＣＩ（前出Nunnら、配列番号：７６１）を含んだ。Ｃ５に対して競合するＣ５結合構築物および対照の結合親和性を、Excel plugin XLfit5およびGraphPad Prism 4を用いて非線形回帰分析によって決定した。
Ｃ３、Ｃ４およびＩｇＧよりもＣ５に対するＺ−ＡＢＤ結合の選択性：ヒトからの密接に関連する補体タンパク質Ｃ３およびＣ４に対する１つのＺ−ＡＢＤ変異体（ＧＳリンカーによって配列番号：７５９に融合した配列番号：７４８）の結合ならびにヒトＩｇＧに対する結合（Ｚ−ドメインの起源、ブドウ球菌プロンテインＡが、ＩｇＧ結合タンパク質であるため）は、Biacore 2000機器（GE Healthcare）を用いて表面プラスモン共鳴（Ｓ
ＰＲ）によって取り組んだ。アミン結合（７０ＲＵ）を用いて、Ｚ−ＡＢＤ構築物をＣＭ５チップ（GE-Healthcare）上に固定した。ＨＢＳ−Ｐ緩衝液（GE Healthcare）中に希釈した、それぞれ４０ｎＭおよび４００ｎＭのヒトＣ３（Ａ４０１、Quidel）、Ｃ４（Ａ４０２、Quidel）、およびＩｇＧ（Ｉ２５１１、Sigma）を、表面上に注射した。各注射に
続いて３０秒間２０ｍＭ ＮａＯＨを注射して再生サイクルを行った。同濃度のヒトＣ５
を、陽性対照として並行して行った。
結果
クローニングおよびタンパク質産生：「Ｚ」が配列番号：７４５および配列番号：７４８〜７５７によって表すことができる、図４に概略的に記述した、産生されたタンパク質変異体を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによっておよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分析した（図５）。
溶血の阻害：Ｃ５結合Ｚ変異体のサブセットを、in vitroでのＣ５結合活性およびヒツジ赤血球中の溶血の阻害について検定した。溶血の５０％阻害（ＩＣ50）またはヒトＣ５に対するトレーサー結合の５０％阻害を生じるＺ変異体の濃度を計算した。方法セクションに記述したように溶血を阻害する、配列番号：７４５および配列番号：７４８−７５７として示されるＺ変異体についての代表的な濃度−反応曲線を、図６Ａおよび６Ｂに示す。短いＧＳリンカーを介してＡＢＤ０９４（配列番号：７５９）に融合した異なるＺ変異体についての結果を、図６Ａに示す。
短いＧＳリンカーによって分離されたＡＢＤ０９４（配列番号：７５９）に融合した親のＺ変異体Ｚ０５４７７ａ（配列番号：７４５）は、約１００ｎＭのＩＣ50値を示したが、試験した第二世代のＣ５結合Ｚ−ＡＢＤ変異体は、典型的に約１ｎＭまたはそれ未満のＩＣ50値で溶血を阻害した。これは、成熟選択およびその後のスクリーニングにおいて、Ｃ５結合Ｚ変異体に対する効力の１００倍を超える増加が確認されたことを示唆している。図６Ｂでは、単独、二量体として、およびＮ末端またはＣ末端のいずれかで図中に明記した異なるリンカーを介したＡＢＤ０９４（配列番号：７５９）との融合において１つの代表的なＺ変異体（Ｚ０６１７５ａ；配列番号：７５３）のさまざまな組合せについてＣ５結合を示す。Ｃ５結合の組合せは、上記アッセイを用いて測定したヒト血清で８６ｐＭ〜１２ｎＭの範囲のＩＣ50値を示した。ダニタンパク質ＯｍＣＩについての対応する値は、典型的に３００〜５００ｐｍであった。
in vitro動態：場合によりＡＢＤ０９４（配列番号：７５９）に融合した多くのＺ変異体（配列番号：７４８−７５７）についての、ヒトアルブミンの存在下での固定化ｈＣ５およびＣ５に対する結合特性の動態研究を、Biacore T200機器を用いて実施した。ＧＳリンカーを介してＡＢＤ０９４に融合した１０個の異なるＺ変異体についてのデータを表６に示す。
異なる構築物中；すなわちＡＢＤを有する／有しない、および異なるリンカーであるが、同じＺ変異体（配列番号：７５３）の結合を、Biacore T200を用いて分析した。さらに、また、いくつかのＺ−ＡＢＤ融合物におけるアルブミンの効果を、ヒトアルブミンの非存在下および存在下で同じ分析を行うことによって評価した。これらのデータを、下の表７に示す。
驚くべきことに、アルブミンの存在下および非存在下で、ｈＣ５に対する構築物（配列番号：７６０）の親和性と比較したときに、わずかな効果を認めることができた。これは、構築物のＡＢＤ部分に対するアルブミンの同時結合は、Ｃ５相互作用を妨げないことを示唆している。
Ｃ５コーティングＥＣＬプレートに対するＣ５結合Ｚ変異体の定常状態結合：図４に明記された構築物中で場合によりＡＢＤ０９４（配列番号：７５９）に融合した、異なるＺ変異体（配列番号：７４５および７４８〜７５７）で構成されたＣ５結合構築物の、ｈＣ５に対する定常状態結合を、競合アッセイで評価した。Ｃ５コーティングＥＣＬプレートに対する結合について、ＡＢＤ（配列番号：７５９）に融合したＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ標識Ｃ５結合Ｚ変異体（配列番号：７４８）と競合することによって、Ｃ５構築物の定常状態結合を評価した。比較としてダニタンパク質ＯｍＣＩ（配列番号：７６１）も含めた。配列番号：７４８を含む標識Ｚ−ＡＢＤ変異体は、ｈＣ５について０．９ｎＭの親和性（Ｋｄ）を有した。さらに、この標識Ｚ−ＡＢＤ変異体は、Ｋｄ０．３４ｎＭで濃度依存的にＺ変異体の定常領域に特異的な抗体と結合することが見いだされた。
ＧＳリンカーによってカルボキシ末端でＡＢＤ０９４（配列番号：７５９）に融合したＣ５結合Ｚ−変異体（配列番号：７４８〜７５７）は、約３００ｐＭ〜１ｎＭの範囲のＩＣ50値で２００ｐＭ ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ標識Ｚ−ＡＢＤ変異体を置換することが見いだ
されたが（図７Ａ）、親のＺ変異体Ｚ０５４７７ａ（配列番号：７４５）を含む対応する構築物は、約３０ｎＭの親和性ＩＣ50値を示した。対照的に、天然のＣ５結合タンパク質ＯｍＣＩは、１．５ｎＭのＩＣ50でｈＣ５に結合することが見いだされた（図７Ａ）。し
たがって、試験したすべての第二世代のＺ変異体（配列番号：７４８〜７５７）は、親のＺ変異体Ｚ０５４７７ａ（配列番号：７４５）よりもヒトＣ５に対する高い結合親和性を示した。さらに、同じ方法を用いたヒトＣ５に対するＯｍＣＩ結合のそれよりも親和性が高かった。
また、ＡＢＤを有するまたは有しないだけでなく、異なるドメイン間でリンカーが少し異なる、同じＣ５結合ドメインを含む多くの異なる構築物を、単量体、二量体として試験した（図７Ｂ）。Ｚ０６１７５ａ（Ｈｉｓ6−タグまたはＣ末端のＡＢＤに場合により融
合した配列番号：７５３）の単量体変異体およびＣ末端のＡＢＤリンカーを有する二量体変異体は、約５００ｐＭ〜１．７ｎＭの範囲のＩＣ50値で２００ｐＭ ＳＵＬＦＯ−ＴＡ
Ｇ標識Ｚ−ＡＢＤ変異体を置換することが見いだされたが、ＡＢＤを有しない二量体変異体およびＮ末端ＡＢＤを有する単量体変異体は、それぞれ４ｎＭおよび１７ｎＭのＩＣ50値で２００ｐＭ ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ標識Ｚ−ＡＢＤを置換した。
選択性：選択性については、ＳＰＲ分析を用いて取り組み、Ｃ５パラログヒトＣ３およびＣ４ならびにヒトＩｇＧの４０および４００ｎＭにかけたとき、固定化Ｚ−ＡＢＤ変異体（ＧＳリンカーによって配列番号：７５９に融合した配列番号：７４８）を有する表面は、有意なＳＰＲシグナルを示さなかった。比較として、４００ｎＭヒトＣ５は、約４５０ＲＵのＳＰＲ反応を生じ、試験したＺ−ＡＢＤ変異体が、実際にＣ３、Ｃ４およびＩｇＧよりもＣ５に対して選択的であることを示している。
実施例７：Ｚ−ＡＢＤ変異体とラットおよびマウスからのＨＳＡ、ＢＳＡおよび血清アルブミンとの相互作用研究
物質および方法
２つの異なる方法、サイズ排除クロマトグラフィーおよびBiacoreを用いて、Ｃ５結合
Ｚ変異体に融合したアルブミン結合ドメインＡＢＤ０９４間の相互作用を研究した。
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて、Ｚ０６１７５ａ−ＧＳ−ＡＢＤ０９４（ＧＳリンカーによって配列番号：７５９に融合した配列番号：７５３）とＨＳＡとの間の相互作用を研究した。簡潔には、等モル量のＺ０６１７５ａ−ＧＳ−ＡＢＤ０９４および組換えＨＳＡ（Novozymes）を、ＰＢＳ中、室温で６０分間インキュベートし、そ
の後、ＳＭＡＲＴシステム（GE Healthcare）を用いてSuperdex200カラム（GE Healthcare）上で実行した。また、Ｚ０６１７５ａ−ＧＳ−ＡＢＤ０９４およびＨＳＡは、対照と
して別々に実行した。
固定化アルブミンに対する結合は、Biacore 2000機器（GE Healthcare）を用いて研究
した。組換えヒトアルブミン（Recombumin(R), Novozymes）を、アミン結合化学を用いて、製造元によって記述されたように、ＣＭ５センサチップ（３８５ＲＵ）に結合させた。１０ｍＭ 酢酸Ｎａ緩衝液ｐＨ４.５中のヒトアルブミン（GE Healthcare）を注射するこ
とによって結合を実施した。参照細胞は、同じ試薬で処理したが、ヒトアルブミンを注射しなかった。また、センサーグラムが二重に打ち消されるように、対照としてＨＢＳ−ＥＰの注射を含んだ。実験は、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中で実施し、１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ
ｐＨ２（GE Healthcare）を再生に用い、流速は３０μｌ／分であり、データを２５℃で集めた。２つの異なる構築物、Ｚ−ＡＢＤ（Ｚ０６１７５ａ−ＧＳ−ＡＢＤ０９４）およびＺ−ＡＢＤ−Ｚ（Ｚ０６１７５ａ−ＧＳ−ＡＢＤ０９４−ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ−Ｚ０６１７５ａ）を、３種の異なる濃度；２５ｎＭ、１００ｎＭおよび４００ｎＭで試験した。センサーグラムデータの評価にはBIAevaluationバージョン４．１．１を用いた。
同じように、ラット（Ａ４５３８、Sigma）、マウス（Ａ３５５９、Sigma）、およびウシ（ＢＳＡ、Sigma）からの血清アルブミンで固定化された表面に対するＺ−ＡＢＤ（Ｚ０
６１７５ａ−ＧＳ−ＡＢＤ０９４）の結合も調べた。
結果
ＳＥＣカラムでは、より大きな分子ほど、小さいものより速く溶出する。図８Ａに見られるように、同時に注射されたＨＳＡ＋Ｚ０６１７５ａ−ＧＳ−ＡＢＤ０９４は、ＨＳＡを単独で注射したときよりも早く溶出しており、２つの分子がこれらの条件下で安定な複合体としてふるまうことを示唆している。より小さなＺ０６１７５ａ−ＧＳ−ＡＢＤ０９４は、複合体またはＨＳＡ単独よりもゆっくり溶出し、これらのタンパク質単独では複合体より小さいことを示している。
分析したＺ−ＡＢＤおよびＺ−ＡＢＤ−Ｚ変異体についてのBiacore 2000データによれば、Ｚ−ＡＢＤは、ＡＢＤがいずれかの側のＺ−ドメインに隣接するときよりも、より速いオンレート（on-rate）を有することがわかる（図８Ｂ）。ＡＢＤ融合Ｚドメインの結
合親和性の分析は、Ｚ−ＡＢＤに対する１ｎＭ未満の親和性を示しているが、Ｚ−ＡＢＤ−Ｚ変異体は、１ｎＭより上のＫＤで固定化ＨＳＡに結合する。
Ｚ０６１７５ａ−ＧＳ−ＡＢＤ０９４は、非常に高い親和性（ＫＤおよび１００ｐＭ）でラット血清アルブミンに結合したが、固定化マウス血清アルブミンとの相互作用は、ヒトおよびラット血清アルブミンの両方よりも弱かった（ＫＤ約４ｎＭ）。ウシ血清アルブミンとの相互作用は、計測不可能あった。
これらのデータは、ＡＢＤのより早期の変異体における公開データ（Jonsson et al. Protein Engineering, Design & Selection 2008, 21: 515-527）と十分に一致しており、試験したＺ−ＡＢＤ変異体が、臨床的に関連した濃度でヒトにおいて血清アルブミンに強く結合するだけでなく、マウスおよびラットにおいても同様であり、動物とヒトとの間で薬物動態学的データの比較が可能となることを示している。
実施例８：ラットにおけるＣ５結合Ｚ変異体の薬物動態研究
物質および方法
生存相の齧歯動物：２つのＣ５結合構築物Ｚ−ＡＢＤ（Ｚ０６１７５ａ−ＧＳ−ＡＢＤ０９４；ＧＳリンカーによって配列番号：７５９に融合した配列番号：７５３、図４、構築物２）およびＺ−ＡＢＤ−Ｚ（Ｚ０６１７５ａ−ＧＳ−ＡＢＤ０９４−ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ−Ｚ０６１７５ａ；（ＧＳリンカーによって配列番号：７５９に融合し、続いてＧＳ（Ｇ4）2リンカーによって配列番号：７５３の第２のモチーフに融合した配列番号：７５３、図４、構築物５）の薬物動態を、雄Sprague Dawley（ＳＤ）ラット（体重２５０〜３００ｇ）において研究した。各ラットに、Ｚ−ＡＢＤまたはＡ−ＡＢＤ−Ｚの単一用量をi.v.（２５０ｎｍｏｌ／ｋｇ）またはs.c.（５００ｎｍｏｌ／ｋｇ）投与した（用量群当たりｎ＝３）。血液サンプル（２００Ｌ）を、i.v.群については投与後、５、２０および４５分、ならびに１．５、４、７、２４、４８、７２、１２０、１６８、２４０および３３６時間で採血し、s.c.群については、投与後１５および３０分、１、２、４、７、２４、４８、７２、１２０、１６８、２４０および３３６時間で採血した。血液をチューブに集め、冷蔵庫に２０分間置いて凝固させた。続いて、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、血清を得た。血清サンプルを−７０℃に保ち、分析にかけた。
ＬＣ／ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いた、動物からの血清サンプル中のＣ５結合Ｚ変異体濃度の測定：上記のような、投与したＣ５結合構築物Ｚ−ＡＢＤおよびＺ−ＡＢＤ−Ｚの血清中濃度を、質量分析（ＬＣ／ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）によって決定した。血清または血漿サンプル（２５μｌ）を、５００μｌエッペンドルフチューブ中で、１Ｍギ酸アンモニウム緩衝液ｐＨ３．０中に懸濁したペプシンアガロース（７ｍｇ／ｍｌ、Sigma、カタログ番号
Ｐ０６０９）１５０μｌで希釈した。チューブにふたをかぶせ、小型のエッペンドルフサーモミキサー中、３７℃で２０分間撹拌した。撹拌した後、０．１％トリフルオロ酢酸（
ＴＦＡ）中０．５μＭに希釈した内部標準溶液Ｉ（13Ｃ6；15Ｎ）ＮＫＬＤＤＤＰＳＱＳ
ＳＥＬ（配列番号：７４６〜７５７のアミノ酸３１〜４４）（Thermo Fisher Scientific
GmbH）２５μｌを加えた。内部標準を添加した後、サンプルを混合し、０．４５μｍセ
ルローススピンフィルター（Grace）を通して濾過した。
較正用の標準サンプルは、既知タンパク質濃度（５〜１０ｍｇ／ｍｌ）のタンパク質保存溶液２０μｌを秤量し、続いて分析する種からのブランク血漿で希釈することによって調製した。第１の保存血漿標準（３μＭ）を、さらに０．１μＭに希釈した。
サンプル４０μｌを、多段カラムシステム、続いて多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を備えたタンデム型質量分析に注射した。第１のカラムは、５μｍ粒子（２．１×１５０ｍｍ、Supelco）を充填されたAscentis RP-Amideカラムであった。濃縮カラム（enrichment
column）；７μｍのＣ１８粒子を充填されたBrownlee newgardカラム（３．２×１５ｍ
ｍ）を用いて、第１のカラムからの検体ペプチド画分を捕捉した。第１のカラムから溶出液を、Shimadzuポンプによって回転ミキサー（Lee Scientific）にポンピングした１ｍｌ／分の水で希釈した。最後のカラムは、５μｍ粒子Primesep 100（SIELC Inc）を充填さ
れた混合型逆相カチオン交換カラム（２．１×１００ｍｍ）であった。
第１の液体クロマトグラフ（Acquity ＵＰＬＣ）に提供された第１のカラムの移動相（RP-Amide）は、Ａ：２％アセトニトリル、０．１％酢酸、０．１％ＴＦＡおよび９７．８％水、ならびにＢ：０．１％酢酸および０．０２％ＴＦＡ入りのアセトニトリルであった。流量は０．５ｍｌ／分であり、溶離には直線勾配を用いた。サンプルを、１００％Ａで１分間、続いて７．９分で８０％Ａのアイソクラチック条件で溶離した。８．１分で、カラムを１００％Ｂで１分間洗浄し、続いて１００％Ａで再生した。カラムからの溶出液を、質量分析計ソフトウェアから制御されたValco ６ポートバルブに接続した。
トラップカラム（３．２×１５ｍｍ）を、バックフラッシュモードで６ポートバルブに接続した。第２の液体クロマトグラフ（Agilent 1100）提供された第２のカラムの移動相は、Ａ：８０％アセトニトリル、１９．９％水、および０．１％ギ酸、ならびにＢ：８０％アセトニトリル、１９％水、０．５％酢酸および０．５％ＴＦＡであり、Agilent 1100液体クロマトグラフによって０．５ｍｌ／分でポンピングし、以下の勾配で溶離した：最初の５分間１００％Ａ、続いて５分から１０分までＢを０％から４０％まで徐々に上げ、続いて次の６秒（１０〜１０．１の分）の間に１００％Ｂに上げた。Ｂを１１．５分まで１００％に保ち、続いて次の６秒（１１．５〜１１．６分）の間に、０％（１００％Ａ）に下げ、１３分で停止するまでサイクルを通して０％Ｂに保った。
最後のカラムからの溶出物を、陽イオンモードで作動するエレクトロスプレーイオン源を備えた三連四重極質量分析計（Sciex API 4000）に接続した。ＭＲＭ遷移は、検体については７８０．９＞８１４．４であり、内部標準については７８４．５＞８２１．４であった。デクラスタリング可能性を５５Ｖで、そして衝突エネルギーを３５Ｖに最適化した。前駆体イオンが二荷であり、一荷のフラグメントイオンが得られるため、有効衝突エネルギーは７０ｅＶであった。検体と内部標準との間のピーク面積比を、定量に用いた。回復８５％および定量限界約４０ｎＭで直線の検量線を得た。
ex vivo溶血：上記のin vivo研究からの血清サンプルについて、in vivo条件を最適に
するために、補体活性化に関するex vivo溶血性アッセイを実施した。５００万個の抗体
感作ヒツジ赤血球（ＥＡ）を含む血清サンプルを、全反応体積２５μｌ／ウェル中で５×希釈した。一般に、すべての他の成分（実施例６参照）を含むＥＡ懸濁液２０μｌの一部を、血清サンプル５μｌと混合して（撹拌１０分）、３７℃で溶血活性化を開始した。しかし、実施例１１のようなマウス血清サンプルについては、ＥＡ懸濁液２０μｌ中にＣ５
Ｄ １μｌを含まなければならなかった。ex vivoアッセイは、本質的に実施例６のin vitroアッセイに記述したように実施した。
計算：薬物動態パラメータの評価は、個々の血清中濃度データに基づき、各用量群について平均（±標準偏差）を報告する。終末サンプリングポイントに現れる定量化（ＬＬＯＱ）の最低限界に満たないレベルは、薬物動態分析から除いた。最大血清中濃度、Ｃmax
、および観察された最大血清中濃度までの時間、ｔmaxは、直接血清中濃度データから得
た。
薬物動態パラメータ；曲線下面積（線形台形法（linear trapezoidal method）による
ＡＵＣ、ＡＵＣ0-∞およびＡＵＣ0-last）、皮下生物学的利用能（Ｆ、（ＡＵＣsc／ＡＵＣiv）＊（Ｄｏｓｅiv／Ｄｏｓｅsc）として計算した）、終末相血中半減期（Ｔ1/2,z、
終末勾配、ｚの見積りが、少なくとも４Ｃ＝ｆ（ｔ）観察に基づく場合、ｌｎ２／λzと
して計算した）、平均滞留時間（ＭＲＴ、ＡＵＭＣ／ＡＵＣとして計算した）、血清クリアランス（ＣＬ、用量／ＡＵＣ0-∞として計算した）、定常状態の分布容積（Ｖss、ＣＬ＊ＭＲＴとして計算した）および終末相の分布容積（Ｖz、ＣＬ／λzとして計算した）を、WinNonlinソフトウェアバージョン5.2.1（Pharsight Corp.，米国）、ノンコンパート
メント解析（Non-Compartmental-Analysis）を用いて計算した。
結果
i.v.（２５０ｎｍｏｌ／ｋｇ）およびs.c.（５００ｎｍｏｌ／ｋｇ）投与後のＺ−ＡＢＤおよびＺ−ＡＢＤ−Ｚについての薬物動態データを表８にまとめる。Ｚ−ＡＢＤは、i.v.群では投与後１０〜１４日まで、そしてs.c.群では１４日まで血清中で定量化可能であったが、Ｚ−ＡＢＤ−Ｚは、両方の用量群において投与後１０日まで血清中で定量化可能であった（図９）。１４日は、最終的なサンプリング時点であった。
Ｃ５結合ポリペプチドの血清中濃度をヒツジ赤血球中の溶血量と関連づけると、記述された条件（例えば血清希釈１：５）下で、１μＭより上の血清中濃度のＺ−ＡＢＤによって溶血の十分な阻害が得られたが（図１２）、Ｚ−ＡＢＤ−Ｚは、約０．５μＭの血清中濃度で十分な阻害に達した（図１３）ことが見いだされた。驚くべきことに、図９および表８に見られるように、Ｚ−ＡＢＤは、Ｚ−ＡＢＤ−Ｚよりも、低い血清クリアランス、長い終末相血中半減期および高い生物学的利用能を有する。時間に関しては、Ｓ．Ｄ．ラットに２５０ｎｍｏｌ／ｋｇのＺ−ＡＢＤ（図１０）i.v.または５００ｎｍｏｌ／ｋｇのs.c（図１１）投与した後、約３日間は溶血が十分に阻害された。
実施例９：サルにおけるＣ５結合Ｚ変異体の薬物動態研究
物質および方法
生存相における研究を、Charles River, Nevada（www.criver.com）で実施し、投与薬
物の調製および血清サンプルの分析を組織内で実施した。Ｚ−ＡＢＤ変異体の薬物動態（ＧＳリンカーによってＡＢＤ０９４（配列番号：７５９）に融合したＺ０６１７５ａ（配列番号：７５３））を、雄カニクイザル（ｎ＝３）において、i.v.（静脈内）およびs.c.（皮下）投与後に調べた。薬物動態パラメータの評価は、実施例８に従って実施したが、しかし、静脈投与後、対数線形血清中濃度−時間曲線の最初の傾きに対応する初期血清半減期（Ｔ1/2α）、第二（中間）相に関連する、対数線形血清中濃度−時間曲線の傾きに
対する対応する中間血清半減期（Ｔ1/2β）および対数線形血清中濃度−時間曲線の終末
の傾きに対応する終末相血清半減期（Ｔ1/2γ）を決定した。Ｔ1/2は、ｌｎ２／λとして計算し、ここで、傾きλの見積りは、少なくとも４Ｃ＝ｆ（ｔ）観察に基づく。ｓｃ投与について示した薬物動態データは、Ｚ−ＡＢＤの投与前レベルについて補正したが、血清中濃度対ｓｃ投与後の時間を示すグラフは、決定された実際の血清中濃度を示す。サルは、２〜４歳で、体重２．３〜３ｋｇであった。それぞれのサルは、１回のi.v.投与（５４０ｎｍｏｌ／ｋｇ）、続いてi.v.投与の３週後に１回のs.c.投与（１６３５ｎｍｏｌ／ｋｇ）を受けた。血液サンプルは、いずれの投与の後も、投与後１０および３０分ならびに１、２、４、８、２４、４８、７２、１２０、１６８、２４０、３３６および５０４時間で採取した。血液サンプルを、室温で２０〜４０分間凝固させ、次いで、１５００〜２２００ＲＣＦで、２〜８℃で１０〜１５分間遠心分離した後、血清を回収し、凍結させた。分析まで、血清サンプルを−２０℃未満の温度で保存した。
Ｚ−ＡＢＤの血清中濃度は、実施例８に記述したように、ＬＣ／ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって分析した。ＬＣ／ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって決定した血清中濃度は、定量的サンドイッチ酵素イムノアッセイ技術によっても確認した。Ｚ−ＡＢＤのＺ区分に特異的なポリクローナル抗体を、マイクロプレートにコーティングした。非結合ポリクローナル抗体を洗い流し、カゼインをブロッキング剤として加えてプラスチック表面への非特異的結合を低減した。サンプルおよび標準を、０．５％カゼインを含むＰＢＳ中で、サル正常血清１〜５％の間に希釈した。非結合カゼインを洗い流した後、標準およびサンプルを、ピペットでウェルに移し、主に血清アルブミンと結合すると推定される、サンプル中に存在する任意のＺ−ＡＢＤを、固定化抗体と結合させる。非結合Ｚ−ＡＢＤをすべて洗い流した後、アルブミンに特異的なＨＲＰ標識ポリクローナル抗体を加え、比色法によって固定化Ｚ−ＡＢＤ−アルブミン複合体を検出した。非結合ポリクローナル抗体を洗い流し、基質溶液をウェルに加えると、Ｚ−ＡＢＤ結合の量に応じて色が現れた。薬物動態パラメータの評価および計算は、実施例８に記述したように実施した。
上記Ｚ−ＡＢＤ変異体を投与したカニクイザルからの血清中のex vivo溶血を、実施例
６および８に記述した方法を用いてモニターしたが、齧歯動物血清の５倍と比較してサル血清を２倍にしか希釈しなかったという修正を加えた。
結果
各用量群の平均（±標準偏差）薬物動態におけるデータを示す。Ｚ−ＡＢＤの血清中濃度は、ＬＣ／ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって、i.v.およびs.c.投与後のすべての時点で定量化可能であった（図１４）。ＥＬＩＳＡデータおよびＬＣ／ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータであるが、係数０．９８６によって線形的に補正されたＬＣ／ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータを計算に用いた。Ｚ−ＡＢＤのi.v.投与後、初期血清半減期は９．１（０．８）時間であり、中間血清半減期は８４（４）時間であり、そして終末相血清半減期は１９８（５１）時間であった。平均滞留時間は２４６（６２）時間であった。分布容積、ＶssおよびＶzは、それ
ぞれ１１０（２３）ｍｌ／ｋｇおよび１２７（２７）ｍｌ／ｋｇと計算され、クリアランスは０．４５（０．０２）ｍＬ／ｈ＊ｋｇと推定された。
s.c.投与後、i.v.投与から残っている投与前血清レベルについて補正し、投与後８〜２４時間で最大血清中濃度（平均Ｃmax２１（３）μＭ）に達した。終末相血清半減期は２
０６（４０）時間であり、平均滞留時間は２５０（６８）時間であった。皮下生物学的利用能は、７０％を超えると推定された。
注射したＺ−ＡＢＤ変異体（ＧＳリンカーによってＡＢＤ０９４（配列番号：７５９）に融合したＺ０６１７５ａ（配列番号：７５３））の薬力学的作用は、溶血によってモニターした。カニクイザルにおける溶血作用は、５ｍｇ／ｋｇのＺ−ＡＢＤ i.v.および１
５ｍｇ／ｋｇのＺ−ＡＢＤ s.c.投与後、少なくとも７日間は、完全に抑制された（≦投
与前の２０％）
実施例１０：ザイモサン誘導腹膜炎を用いたin vivo研究
物質および方法
マウスへの投与：Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスは、ザイモサンで誘導する１時間前に腹腔内に（i.p.）、またはザイモサンで誘導する１８時間前に皮下に（s.c.）、異なる濃度のＺ−ＡＢＤ融合分子（Ｚ０６１７５ａ−ＧＳ−ＡＢＤ０９４、ＧＳリンカーによって配列番号：７５９に融合した配列番号：７５３）または陽性対照ＯｍＣＩを受けた。０．８ｍｇ／マウスのザイモサンをi.p.投与し、１時間後、眼窩血液サンプル（凝固活性化剤入りの血清バイアル中）をイソフルラン麻酔下で採取した。動物を頚椎脱臼により殺した。皮膚切開を行い、腹部筋肉壁を視覚化した。ＰＢＳ溶液（２ｍＭ ＥＤＴＡを含む）を、腹腔
に静かに注射した。腹部をマッサージし、液体サンプル（１〜２ｍｌ）を採取した。サンプルを試験管に移し、濡れた氷の上に保存した後、６００ｇで１０分間遠心分離した。上清中の総タンパク質量およびＣ５ａ濃度を分析した。
血液サンプルを、少なくとも３０分間冷蔵庫中に保ち、その後、遠心分離を２０００ｇで実施した。Ｚ０６１７５ａ−ＧＳ−ＡＢＤ０９４のレベルおよび溶血活性を後で分析するため、血清サンプルを冷凍庫（−７０℃）に保存した。
動物の血清サンプル中の溶血活性の分析：溶血活性の分析は、実施例６および７に記述した溶血アッセイに従って実施した。
ザイモサンおよびＣ５結合Ｚ−ＡＢＤ融合分子を投与したマウスからの洗浄液中のＣ５ａ濃度の分析：マウス腹腔洗浄サンプル中のＣ５ａの検出のため、マイクロタイタープレート（MaxiSorp, Nunc）を、０．０５Ｍ炭酸ナトリウム−重炭酸塩緩衝液ｐＨ９．６（カタログ番号Ｃ−３０４１，Sigma）中１μｇ／ｍｌの濃度で１００μｌ／ウェルの抗Ｃ５
ａ抗体（カタログ番号ＭＡＢ２１５０１，R&D Systems）により４℃で一夜コーティング
した。プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ、カタログ番号０９−９４１０−１００、Medicago）で３回洗浄し、４５０ｒｐｍで撹拌しながら室温で１〜１．５時間、ＰＢＳＴ中１％ＢＳＡ（カタログ番号Ａ７０３０，Sigma）２００μｌ／
ウェルを用いてブロッキングした。プレートを、再びＰＢＳＴで３回洗浄し、次いで、０．１％ＢＳＡ入りＰＢＳＴ中のさまざまな濃度の組換えマウスＣ５ａ標準（カタログ番号２１５０−Ｃ５，R&D Systems）１００μｌ／ウェルまたはサンプルと共に、４５０ｒｐ
ｍで撹拌しながら室温で２時間インキュベートした。また、高濃度サンプルも、０．１％ＢＳＡ入りＰＢＳＴ中で希釈した。プレートを、再びＰＢＳＴで３回洗浄し、ビオチン化抗Ｃ５ａ抗体（カタログ番号ＢＡＦ２１５０，R&D Systems）１００μｌ／ウェルと共に
、４５０ｒｐｍでプレートを振盪しながら室温で、０．１μｇ／ｍｌの濃度で１．５時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３×洗浄した後、プレートを、ブロッキング緩衝液中希釈度２００倍でストレプトアビジン−ＨＲＰ（カタログ番号ＤＹ９９８，R&D Systems）
１００μｌ／ウェルと共に、４５０ｒｐｍで撹拌しながら室温で２０分間インキュベートした。最終的に３回洗浄した後、プレートを、ＴＭＢ基質（カタログ番号Ｔ０４４０，Sigma）１００μｌ／ウェルで展開した。２０〜３０分後、Spectramax Plusプレートリーダー（Molecular Devices）を用いて６５０ｎｍで読み取った。
それぞれの標準について、その濃度（範囲０〜４０００ｐｇ／ｍｌ）に対して６５０ｎｍでの吸光度をプロットすることによって標準曲線を作製した。
ＥＣＬを用いた動物の血清サンプル中のＺ変異体濃度の決定：投与したＣ５結合Ｚ０６１７５ａ−ＧＳ−ＡＢＤ０９４（ＧＳリンカーによって配列番号：７５９に融合した配列番号：７５３）およびＺ０６１７５ａ−ＧＳ−ＡＢＤ０９４−ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳ−Ｚ０６１７５ａ（ＧＳリンカーによって配列番号：７５９に融合し、続いてＧＳ（Ｇ４）２リンカーによって配列番号：７５３の第２のモチーフに融合した配列番号：７５３、構築物の説明については図４を参照のこと）の血清中濃度をＥＣＬによって決定した。マルチアレイ９６ウェル高結合非コーティング（Meso Scale Discoveryカタログ番号Ｌ１５ＸＢ）プレートを、ヤギanti-Affibody分子Ｉｇ（Affibody AB,カタログ番号20.1000.01.0005）でコーティングした。
実施例６、Ｚ−ＡＢＤ変異体（ＡＢＤ０９４、配列番号：７５９に融合したＺ０６００９ａ、配列番号：７４８と同様に、マルチアレイプレートを、ヤギanti-Affibody分子Ｉ
ｇＧ（Affibody AB）により４℃で一夜コーティングし、その後、非特異的部位は、室温
で２時間、１％カゼイン入りＰＢＳでブロッキングした。
その間に、血清サンプルを−７０℃から解凍し、同じ動物株からの血清においてカゼイン入りＰＢＳ中で希釈した。標準および対照を、対応する緩衝液で希釈した。プレートを３００ｒｐｍで振盪しながら、サンプルおよび標準を室温で３時間インキュベートした。氷冷ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０ ３×１５０μＬで洗浄してインキュベーションを終了した
。最終洗浄の直後、リーディングバッファー（超高純度Ｈ２Ｏ中に１：１希釈した、４×リーディングバッファーＴ、Meso Scale Discoveryカタログ番号Ｒ９２ＴＣ−３）１５０μｌ×２を各ウェルに加え、プレートリーダー（SECTOR Imager 2400, Meso Scale Discovery）を用いてシグナルを検出した。
別の実験では、プレートをヒトＣ５（配列番号７６０、１ｐｍｏｌ／ウェル）でコーティングした。コーティングされたプレートに添加する前に、内因性Ｃ５を変性させるため、血清中または血清およびカゼイン入りＰＢＳ中で希釈した血清サンプルおよび標準（すべてのサンプルおよび標準を同じ血清中濃度に合わせた）を、６０℃に３０分間加熱した。この代替実験は、Ｃ５結合タンパク質の排他的検出方法を提供したが、上記の抗体依存性戦略は、その特定の抗体と結合するすべてのタンパク質に適用することができる。
結果
動物からの血清サンプルにおけるＺ−ＡＢＤの血清中濃度および溶血活性の分析：Ｚ−ＡＢＤ融合分子（Ｚ０６１７５ａ−ＧＳ−ＡＢＤ０９４、ＧＳリンカーによって配列番号：７５９に融合した配列番号：７５３））の血清中濃度およびヒツジ赤血球における溶血に影響を及ぼす能力を、低用量（２０ｎｍｏｌ／ｋｇ）、中用量（１００ｎｍｏｌ／ｋｇ）および高用量（５００ｎｍｏｌ／ｋｇ）の投与後に評価した。血清中濃度は、比較的に用量と比例し、溶血の阻害からは、血清中の分子が活性であり、かつ溶血の阻害も実際に濃度依存性であることが確認された。
ザイモサンおよびＣ５結合Ｚ−ＡＢＤ融合分子を投与したマウスからの洗浄液中のＣ５ａ濃度の分析：炎症誘発性分子ザイモサンをi.p.投与し、図１５に、ザイモサン単独投与、ならびにザイモサン治療の１８時間前にs.c.投与した、２０、１００および５００ｎｍｏｌ／ｋｇのＣ５結合Ｚ変異体の投与後に投与したザイモサン、またはザイモサン治療の１時間前にi.p.投与したＯｍＣＩの関数として、洗浄液中の高度に炎症性のＣ５切断生成物Ｃ５ａにおける作用を示す。ザイモサン単独投与は、洗浄液中のＣ５ａの強力な上昇を導く。この作用は、提示されたＣ５結合Ｚ−ＡＢＤ融合分子によって用量依存的にブロックされる。
実施例１１：気管内投与後のマウスにおけるＣ５結合タンパク質の薬物動態研究
物質および方法
雌Ｃ５７ｂｌマウスに気管内投与した後のＣ５結合構築物Ｚ０６１７５ａ−ＧＳ−ＡＢＤ０９４（ＧＳリンカーによって配列番号：７５９融合した配列番号：７５３）の薬物動態プロファイルを研究した。温度、相対湿度および照明を設定して２２±１℃、５５±５％および明１２時間−暗１２時間サイクルに維持し、食事および水は自由に摂らせた。動物にイソフルランで麻酔し、５００ｎｍｏｌ／ｋｇのＺ０６１７５ａ−ＧＳ−ＡＢＤ０９４入りのマイクロスプレー（provided ad libitum）を用いて肺に直接投与した。血清サ
ンプルの調製のため、５分、３０分、１時間、３時間、７時間、１６時間、２４時間、４８時間および７２時間（３匹の動物／時点）で、イソフルランによる麻酔下で大静脈からできるだけ多くの血液を回収した。チューブ中に血液を集めることによって血清サンプルを調製し、チューブを冷蔵庫に２０分間置いた。その後、チューブを４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。各血液サンプルから、少なくとも１００μｌの血清を調製した。血清サンプルを、分析前に−７０℃に保った。各サンプル中のＺ０６１７５ａ−ＧＳ−ＡＢＤ０９４の血清中濃度は、実施例１０に記述したように、ＥＣＬによって決定し、ヒツジ
赤血球中の溶血に影響を及ぼす血清サンプルの能力は、実施例６および８に記述したように決定した。
結果
各サンプル中の血清中濃度およびヒツジ赤血球における溶血に影響を及ぼす対応する能力を、それぞれ、図１６Ａおよび図１６Ｂに記述する。３００〜１０００ｎＭの範囲の血清中濃度では３０分以内にプラトーに達し、ここで、溶血はほとんど完全にブロックされる。投与後７時間より後の時点でサンプリングした血清では、溶血が徐々に再発生している。投与３日後の最終時点で、溶血は、対照の約７０％であった（図１６Ｂ）。これらのデータは、気管内投与後の体循環へのＺ０６１７５ａ−ＧＳ−ＡＢＤ０９４の吸収および分子が溶血を機能的に阻害することを明らかに示している。
実施例１２：局所および硝子体内投与後のウサギ眼中のＣ５結合Ｚ変異体の薬物動態研究物質および方法
生存相のウサギ：Ｚ変異体（Ｚ０６１７５ａ、配列番号：７５３、続いてＧＳ（図４、構築物１））の薬物動態を、硝子体内投与後のウサギ眼において研究した。生存相研究および投薬した動物（有色ウサギ、２〜２．５ｋｇ）の眼の解剖を、Iris Pharma, La Gaude,フランス（www.iris-pharma.com）で実施した。動物は、２０±２℃、相対湿度５５±
１０％で個別に収容して食物および水は自由に摂らせた。
動物を３群に分けた：１）硝子体内投与（各眼に５０μｌ、ｎ＝３、全体で６眼）、続いて１日後に解剖および血清サンプリング、２）硝子体内投与（各眼に５０μｌ、ｎ＝３）、続いて４日後に解剖および血清サンプリングおよび３）未処置動物（ｎ＝５）。
４つの明瞭な眼区分（房水、硝子体、神経網膜およびＲＰＥ−脈絡膜）を解剖し、直ちに−８０℃で凍結した。投与した薬物（１０ｍＭリン酸緩衝液中２０．２ｍｇ／ｍｌ、１４５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）の剤形およびさまざまな眼区分中の薬物の分析を、組
織内で実施した。
解剖した眼区分中のＺ−変異体の分析：解剖した眼区分をドライアイス上で運び、分析まで−８０℃で保存した。セラミックビーズを含むLysing Matrix Dチューブ（MP Biomedical）中の１％ヒト血清アルブミンを含む１０倍（体積／質量）のＰＢＳ中で、網膜および脈絡膜サンプルを解凍し、Savant Bio 101ホモジナイザー中、速度４で２×２０秒間撹拌した。ピペットを用いてビーズからホモジネートを取り出し、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、９００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。房水および硝子体サンプルは、ホモジナイズが必要なかったことを除いて、網膜および脈絡膜と同じ方法で処理した。群１および２からの硝子体サンプルを、上と同じ緩衝液中で更に１０倍希釈した。ＨＳＡ入りのＰＢＳ中で５つの標準（３５．８μＭ、３．５８μＭ、３５８ｎＭ、３５．８ｎＭおよび１７．９ｎＭ）を調製した。その後、標準およびサンプルをペプシン消化にかけ、実施例８に記述したＬＣ／ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ方法を用いて組織抽出物中のＺ変異体の濃度の分析を決定した。
結果
硝子体内投与後のＺ変異体の濃度は、１日後、すべての区分で高く（６〜２００μＭ）、驚くべきことに、投与４日後でも高いままであった（１．５〜７８μＭ）。特に、硝子体中のＺ分子の濃度は、注射１日後、１１８〜２０１μＭの範囲（平均１６１μＭ、ｎ＝６眼）であり、注射４日後、２６〜７８μＭ（平均４６μＭ、ｎ＝６）でとどまっており、数日のＴ1/2を示している。薬物のサイズと、ウサギ眼における硝子体内注射後の薬物
の排出との間には相反関係があると考えられ、以下の例によって記述されている；モキシフロキサシン（ＭＷ＜０．３５ｋＤａ、Ｔ1/2＝１．７２時間、Mohan et al. Trans Am O
phthalmol Soc 2005, 103:76-83）、ＥＳＢＡ１０５（ＭＷ＝２６ｋＤａ、Ｔ1/2＝２５時間、Ottiger et al. Investigative Ophthalmology & Visual Science 2009, 50: 779-786）およびラニビズマブ（ＭＷ＝４８ｋＤａ、Ｔ1/2＝２．８８日、Bakri et al. American Academy of Ophthalmology 2007, 114:2179-2182）。ここで試験したＺ変異体は、７．０ｋＤａの分子量を有しており、Ｚ分子の排除が、硝子体中でこのような小分子に期待されると考えられるものよりもゆっくりであったことを示唆している。

Claims (110)

  1. Ｃ５結合モチーフ、ＢＭを含むＣ５結合ポリペプチドであって、該モチーフが、
    ｉ）ＥＸ2Ｘ3Ｘ4Ａ Ｘ6Ｘ7ＥＩＤ Ｘ11ＬＰＮＬ Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＱＷ Ｘ21ＡＦＩＸ25 Ｘ26ＬＸ28Ｄ、
    （式中、互いに独立して、
    Ｘ2は、Ｈ、Ｑ、Ｓ、ＴおよびＶから選択され；
    Ｘ3は、Ｉ、Ｌ、ＭおよびＶから選択され；
    Ｘ4は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴおよびＹから選択され；
    Ｘ6は、ＮおよびＷから選択され；
    Ｘ7は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＴから選択され；
    Ｘ11は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴおよびＹから選択され；
    Ｘ16は、ＮおよびＴから選択され；
    Ｘ17は、Ｉ、ＬおよびＶから選択され；
    Ｘ18は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＴから選択され；
    Ｘ21は、Ｉ、ＬおよびＶから選択され；
    Ｘ25は、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｎ、ＳおよびＴから選択され；
    Ｘ26は、ＫおよびＳから選択され；
    Ｘ28は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、ＴおよびＹから選択される）
    および
    ｉｉ）ｉ）に定義された配列に対して少なくとも８６％の同一性を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列からなり、
    ここで、該ポリペプチドがＣ５と結合する、Ｃ５結合ポリペプチド。
  2. Ｘ2がＨ、ＴおよびＶから選択される、請求項１に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  3. Ｘ2がＴおよびＶから選択される、請求項２に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  4. Ｘ2がＶである、請求項３に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  5. Ｘ3がＩ、ＬおよびＶから選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＣ５結合
    ポリペプチド。
  6. Ｘ3がＩおよびＬから選択される、請求項５に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  7. Ｘ3がＩである、請求項６に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  8. Ｘ3がＬである、請求項６に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  9. Ｘ4がＡ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｌ、ＱおよびＲから選択される、請求項１〜８のいずれか１項
    記載のＣ５結合ポリペプチド。
  10. Ｘ4がＡ、Ｄ、Ｅ、ＫおよびＲから選択される、請求項９に記載のＣ５結合ポリペプチ
    ド。
  11. Ｘ4がＤおよびＥから選択される、請求項１０に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  12. Ｘ6がＷである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  13. Ｘ7がＡ、Ｄ、ＮおよびＴから選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＣ
    ５結合ポリペプチド。
  14. Ｘ7がＤおよびＮから選択される、請求項１３に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  15. Ｘ7がＤである、請求項１４に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  16. Ｘ7がＮである、請求項１４に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  17. Ｘ11がＡ、Ｈ、Ｋ、Ｑ、ＲおよびＳから選択される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  18. Ｘ11がＡ、Ｈ、ＫおよびＲから選択される、請求項１７に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  19. Ｘ11がＡ、ＫおよびＲから選択される、請求項１８に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  20. Ｘ11がＫおよびＲから選択される、請求項１９に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  21. Ｘ16がＴである、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  22. Ｘ17がＩおよびＬから選択される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  23. Ｘ17がＩである、請求項２２に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  24. Ｘ17がＬである、請求項２２に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  25. Ｘ18がＡ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、ＳおよびＴから選択される、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  26. Ｘ18がＡ、Ｄ、Ｅ、ＱおよびＳから選択される、請求項２５に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  27. Ｘ18がＤ、ＥおよびＱから選択される、請求項２６に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  28. Ｘ18がＤおよびＥから選択される、請求項２７に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  29. Ｘ18がＤである、請求項２８に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  30. Ｘ18がＥである、請求項２８に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  31. Ｘ21がＩおよびＬから選択される、請求項１〜３０のいずれか１項に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  32. Ｘ21がＩである、請求項３１に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  33. Ｘ21がＬである、請求項３１に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  34. Ｘ25がＥ、Ｈ、ＮおよびＴから選択される、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  35. Ｘ25がＥおよびＮから選択される、請求項３４に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  36. Ｘ25がＮである、請求項３５に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  37. Ｘ26がＫである、請求項１〜３６のいずれか１項に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  38. Ｘ28がＡ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｎ、ＱおよびＳから選択される、請求項１〜３７のいずれか１項に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  39. Ｘ28がＡ、Ｄ、ＥおよびＳから選択される、請求項３８に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  40. Ｘ28がＡ、ＤおよびＥから選択される、請求項３９に記載Ｃ５結合ポリペプチド。
  41. Ｘ28がＤおよびＥから選択される、請求項４０に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  42. Ｘ28がＤである、請求項４１に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  43. Ｘ3Ｘ4がＬＥおよびＬＤから選択される、請求項８〜１１のいずれか１項に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  44. Ｘ17Ｘ18がＩＥおよびＬＤから選択される、請求項２２〜３０のいずれか１項に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  45. 前記アミノ酸が、ｉ）以下の８つの条件Ｉ〜ＶＩＩＩ：
    Ｉ． Ｘ2はＶである；
    ＩＩ． Ｘ3は、ＩおよびＬから選択される；
    ＩＩＩ． Ｘ6はＷである；
    ＩＶ． Ｘ7は、ＤおよびＮから選択される；
    Ｖ． Ｘ17は、ＩおよびＬから選択される；
    ＶＩ． Ｘ21はＬである；
    ＶＩＩ． Ｘ25はＮである；
    ＶＩＩＩ． Ｘ28はＤである；
    の少なくとも４つを満たす、請求項１〜４４のいずれか１項に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  46. 前記アミノ酸配列ｉ）が、８つの条件Ｉ〜ＶＩＩＩの少なくとも５つを満たす、請求項４５に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  47. 前記アミノ酸配列ｉ）が、８つの条件Ｉ〜ＶＩＩＩの少なくとも６つを満たす、請求項４６に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  48. 前記アミノ酸配列ｉ）が、８つの条件Ｉ〜ＶＩＩＩの少なくとも７つを満たす、請求項４７に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  49. 前記アミノ酸配列ｉ）が、８つの条件Ｉ〜ＶＩＩＩのすべてを満たす、請求項４８に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  50. 前記アミノ酸配列が配列番号：１〜２４８のいずれか１つから選択される、請求項１〜
    ４９のいずれか１項に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  51. アミノ酸配列が配列番号：１〜１２、配列番号：２０、配列番号：２３〜２４、配列番号：２６〜２８、配列番号：３２〜３５、配列番号：３８〜３９、配列番号：４１、配列番号：４６、配列番号：４９、配列番号：５６〜５７、配列番号：５９、配列番号：６６、配列番号：７８〜７９、配列番号：８７、配列番号：９２、配列番号：１０６、配列番号：１１０、配列番号：１１９、配列番号：１２５、配列番号：１４１、配列番号：１５１、配列番号：１６１、配列番号：１６６、配列番号：１８７、配列番号：１９７、配列番号：２０３、配列番号：２０５、配列番号：２１５および配列番号：２４３のいずれか１つから選択される、請求項５０に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  52. 前記アミノ酸配列が配列番号：１〜１２のいずれか１つから選択される、請求項５１に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  53. 前記アミノ酸配列が配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：５のいずれか１つから選択される、請求項５２に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  54. 前記アミノ酸配列が配列番号：１および配列番号：４から選択される、請求項５３に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  55. 前記Ｃ５結合モチーフが３ヘリックス束タンパク質ドメインの部分を形成する、請求項１〜５４のいずれか１項に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  56. 前記Ｃ５結合モチーフが前記３ヘリックス束タンパク質ドメイン内で相互接続ループと共に２つのアルファヘリックスの部分を本質的に形成する、請求項５５に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  57. 前記３ヘリックス束タンパク質ドメインが黄色ブドウ球菌からプロテインＡのドメインおよびその誘導体から選択される、請求項５５または５６に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  58. 前記Ｃ５結合ポリペプチドが、
    ｉ）Ｋ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ ＸaＸbＬＬＸc ＥＡＫＫＬ ＮＤＸdＱ；
    （式中、
    ［ＢＭ］は、請求項１〜５４のいずれか１項に定義されたＣ５結合モチーフであり；
    Ｘaは、ＡおよびＳから選択され；
    Ｘbは、ＮおよびＥから選択され；
    Ｘcは、Ａ、ＳおよびＣから選択され；
    Ｘdは、ＡおよびＳから選択される）
    および
    ｉｉ）上に定義された配列のいずれか１つと少なくとも７９％の同一性を有するアミノ酸配列
    から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜５７のいずれか１項に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  59. ＸaがＡである、請求項５８に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  60. ＸaがＳである、請求項５８に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  61. ＸbがＮである、請求項５８〜６０のいずれか１項に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  62. ＸbがＥである、請求項５８〜６０のいずれか１項に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  63. ＸcがＡである、請求項５８〜６２のいずれか１項に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  64. ＸcがＳである、請求項５８〜６２のいずれか１項に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  65. ＸcがＣである、請求項５８〜６２のいずれか１項に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  66. ＸdがＡである、請求項５８〜６５のいずれか１項に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  67. ＸdがＳである、請求項５８〜６５のいずれか１項に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  68. ＸaがＡであり；ＸbがＮであり；ＸcがＡであり、かつＸdがＡである、請求項５８に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  69. ＸaがＡであり；ＸbがＮであり；ＸcがＣであり、かつＸdがＡである、請求項５８に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  70. ＸaがＳであり；ＸbがＥであり；ＸcがＳであり、かつＸdがＳである、請求項５８に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  71. ＸaがＳであり；ＸbがＥであり；ＸcがＣであり、かつＸdがＳである、請求項５８に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  72. 前記アミノ酸配列が配列番号：２４９〜４９６のいずれか１つから選択される、請求項５８〜７１のいずれか１項に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  73. 前記アミノ酸配列が配列番号：２４９〜２６０、配列番号：２６８、配列番号：２７１〜２７２、配列番号：２７４〜２７６、配列番号：２８０〜２８３、配列番号：２８６〜２８７、配列番号：２８９、配列番号：２９４、配列番号：２９７、配列番号：３０４〜３０５、配列番号：３０７、配列番号：３１４、配列番号：３２６〜３２７、配列番号：３３５、配列番号：３４０、配列番号：３５４、配列番号：３５８、配列番号：３６７、配列番号：３７３、配列番号：３８９、配列番号：３９９、配列番号：４０９、配列番号：４１４、配列番号：４３５、配列番号：４４５、配列番号：４５１、配列番号：４５３、配列番号：４６３および配列番号：４９１のいずれか１つから選択される、請求項７２に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  74. 前記アミノ酸配列が配列番号：２４９〜２６０のいずれか１つから選択される、請求項７３に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  75. 前記アミノ酸配列が配列番号：２４９、配列番号：２５０、配列番号：２５１、配列番号：２５２および配列番号：２５３のいずれか１つから選択される、請求項７４に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  76. 前記アミノ酸配列が配列番号：２４９および配列番号：２５２のいずれか１つから選択される、請求項７５に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  77. ｉ）ＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ ＳＥＬＬＸc ＥＡＫＫＬ ＮＤＳＱＡ Ｐ；
    （式中、［ＢＭ］は、請求項１〜５４のいずれか１項に定義されたＣ５結合モチーフであり、かつＸcは、ＳおよびＣから選択される）および
    ｉｉ）上に定義された配列のいずれか１つと少なくとも８１％の同一性を有するアミノ酸配列
    から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜５７のいずれか１項に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  78. ｉ）ＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ ＳＥＬＬＸc ＥＡＫＫＬ ＮＤＳＱＡ Ｐ；
    （式中、［ＢＭ］は、請求項１〜５４のいずれか１項に定義されたＣ５結合モチーフであり、かつＸcは、ＳおよびＣから選択される）および
    ｉｉ）上のｉ）に定義された配列のいずれか１つと少なくとも８１％の同一性を有するアミノ酸配列
    から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜５７のいずれか１項に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  79. 前記アミノ酸配列が配列番号：４９７〜７５７のいずれか１つから選択される、請求項１〜５７のいずれか１項に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  80. 前記アミノ酸配列が配列番号：４９７〜５０８、配列番号：５１６、配列番号：５１９〜５２０、配列番号：５２２〜５２４、配列番号：５２８〜５３１、配列番号：５３４〜５３５、配列番号：５３７、配列番号：５４２、配列番号：５４５、配列番号：５５２〜５５３、配列番号：５５５、配列番号：５６２、配列番号：５７４〜５７５、配列番号：５８３、配列番号：５８８、配列番号：６０２、配列番号：６０６、配列番号：６１５、配列番号：６２１、配列番号：６３７、配列番号：６４７、配列番号：６５７、配列番号：６６２、配列番号：６８３、配列番号：６９３、配列番号：６９９、配列番号：７０１、配列番号：７１１、配列番号：７３９および配列番号：７４５〜７５７のいずれか１つから選択される、請求項７９に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  81. 前記アミノ酸配列が配列番号：４９７〜５０８および配列番号：７４６〜７５７のいずれか１つから選択される、請求項８０に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  82. 前記アミノ酸配列が配列番号：４９７、配列番号：４９８、配列番号：４９９、配列番号：５００、配列番号：５０１、配列番号：７４６、配列番号：７４７ 配列番号：７４８、配列番号：７５０および配列番号：７５３のいずれか１つから選択される、請求項８１に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  83. 前記アミノ酸配列が配列番号：４９７および配列番号：５００、配列番号：７４８および配列番号：７５３のいずれか１つから選択される、請求項８２に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  84. Ｃ５の切断を阻害する、請求項１〜８３のいずれか１項に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  85. 前記相互作用のＫＤ値が、多くとも１×１０-6Ｍ、多くとも１×１０-7Ｍといった、多くとも１×１０-8Ｍといった、多くとも１×１０-9Ｍといったようになるように、Ｃ５結合ポリペプチドがＣ５に結合する、請求項１〜８４のいずれか１項に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  86. 前記ポリペプチドの産生、精製、in vivoもしくはin vitro安定化、結合、または検出
    を改善する、さらなるＣ末端および／またはＮ末端アミノ酸を含む、請求項１〜８５のい
    ずれか１項に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  87. 少なくとも２つのＣ５結合ポリペプチド単量体単位を含み、それらのアミノ酸配列が同一または異なってもよい、多量体形態の請求項１〜８６のいずれか１項に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  88. 前記Ｃ５結合ポリペプチド単量体単位が融合タンパク質として発現される、請求項８７に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  89. 二量体形態の請求項８７または８８に記載のＣ５結合ポリペプチド。
  90. 請求項１〜８９のいずれか１項に記載の少なくとも１つのＣ５結合ポリペプチド；少なくとも１つの連鎖球菌Ｇタンパク質のアルブミン結合ドメイン、またはその誘導体、および前記少なくとも１つのドメインまたはその誘導体を前記少なくとも１つのＣ５結合ポリペプチドのＣまたはＮ末端に結合するための少なくとも１つの結合部分を含むＣ５結合化合物。
  91. ［ＣＢＰ１］−［Ｌ１］−［ＡＬＢＤ］；
    ［ＣＢＰ１］−［ＣＢＰ２］−［Ｌ１］−［ＡＬＢＤ］；
    ［ＣＢＰ１］−［Ｌ１］−［ＡＬＢＤ］−［Ｌ２］−［ＣＢＰ２］；
    ［ＡＬＢＤ］−［Ｌ１］−［ＣＢＰ１］；
    ［ＡＬＢＤ］−［Ｌ１］−［ＣＢＰ１］−［ＣＢＰ２］；
    ［ＣＢＰ１］−［Ｌ１］−［ＣＢＰ２］−［Ｌ２］−［ＡＬＢＤ］；および
    ［ＡＬＢＤ］−［Ｌ１］−［ＣＢＰ１］―［Ｌ２］―［ＣＢＰ２］
    （式中、互いに独立して、
    ［ＣＢＰ１］および［ＣＢＰ２］は、同一または異なってもよいＣ５結合ポリペプチドであり；
    ［Ｌ１］および［Ｌ２］は、同一または異なってもよい結合部分であり；かつ
    ［ＡＬＢＤ］は、連鎖球菌Ｇタンパク質のアルブミン結合ドメインまたはその誘導体である）
    から選択される構造を有する、請求項９０に記載のＣ５結合化合物。
  92. ［ＣＢＰ１］−［Ｌ１］−［ＡＬＢＤ］；
    ［ＣＢＰ１］−［ＣＢＰ２］−［Ｌ１］−［ＡＬＢＤ］；および
    ［ＣＢＰ１］−［Ｌ１］−［ＡＬＢＤ］−［Ｌ２］−［ＣＢＰ２］
    から選択される構造を有する、請求項９１に記載のＣ５結合化合物。
  93. 前記結合部分が、Ｇ、ＧＳ；［Ｇ2］n；［Ｇ3］n；［Ｇ4］n；ＧＳ［Ｇ4］n、（式中、ｎは０〜７である）；［Ｓ2Ｇ］m；［Ｓ3Ｇ］m；［Ｓ4Ｇ］m；（式中、ｍは０〜７である）およびＶＤＧから選択される、請求項９１に記載のＣ５結合化合物。
  94. 前記結合部分がＧＳおよびＧＳ［Ｇ4］2から選択される、請求項９３に記載のＣ５結合化合物。
  95. 前記アルブミン結合ドメインが配列番号：７５９に設定されるような請求項９０〜９４のいずれか１項に記載のＣ５結合化合物。
  96. 前記Ｃ５結合ポリペプチドのそれぞれが請求項７９〜８３のいずれか１項に定義されたポリペプチドから独立して選択される、請求項９０〜９５のいずれか１項に記載のＣ５結合化合物。
  97. 前記Ｃ５結合ポリペプチドのそれぞれが請求項８３に定義されたポリペプチドから独立して選択される、請求項９６に記載のＣ５結合化合物。
  98. 請求項１〜８９のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは請求項９０〜９７のいずれか１項に記載の化合物。
  99. 請求項９８に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  100. 請求項９９に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
  101. 請求項１〜８９のいずれか１項に記載のＣ５結合ポリペプチドまたは請求項９０〜９７のいずれか１項に記載のＣ５結合化合物と治療剤との組合せ。
  102. 治療に使用するための、請求項１〜８９のいずれか１項に記載のＣ５結合ポリペプチド、請求項９０〜９７のいずれか１項に記載のＣ５結合化合物または請求項１０１に記載の組合せ。
  103. Ｃ５関連の状態を治療するための、請求項１〜８９のいずれか１項に記載のＣ５結合ポリペプチド、請求項９０〜９７のいずれか１項に記載のＣ５結合化合物または請求項１０１に記載の組合せ。
  104. 炎症性疾患；自己免疫疾患；感染性疾患；心血管疾患；神経変性障害；がん；移植障害；創傷；眼疾患；腎疾患；肺疾患；血液疾患；アレルギー疾患および皮膚疾患から選択されるＣ５関連の状態を治療するための、請求項１〜８９のいずれか１項に記載のＣ５結合ポリペプチド、請求項９０〜９７のいずれか１項に記載のＣ５結合化合物または請求項１０１に記載の組合せ。
  105. 発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）を治療するための、請求項１〜８９のいずれか１項に記載のＣ５結合ポリペプチド、請求項９０〜９７のいずれか１項に記載のＣ５結合化合物または請求項１０１に記載の組合せ。
  106. 請求項１〜８９のいずれか１項に記載のＣ５結合ポリペプチド、請求項９０〜９７のいずれか１項に記載のＣ５結合化合物または請求項１０１に記載の組合せを、その必要性のある哺乳動物対象に投与することを含む、Ｃ５関連の状態の治療方法。
  107. 前記Ｃ５結合ポリペプチド、前記Ｃ５結合化合物または前記組合せのＣ５への結合がＣ５の切断を阻害する、請求項１０６に記載の治療方法。
  108. 前記Ｃ５関連の状態が炎症性疾患；自己免疫疾患；感染性疾患；心血管疾患；神経変性障害；がん；移植障害；創傷；眼疾患；腎疾患；肺疾患；血液疾患；アレルギー性疾患および皮膚疾患から選択される、請求項１０６または１０７に記載の治療方法。
  109. 前記Ｃ５関連の状態が発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）である、請求項１０８に記載の治療方法。
  110. 前記Ｃ５結合ポリペプチドを、静脈内に、皮下に、吸入によって、鼻内に、経口的に、硝子体内に、または局所的に投与する、請求項１０６〜１０９のいずれか１項に記載の治療方法。
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