JP6719438B2 - ヒト補体c5に結合するポリペプチド - Google Patents
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Description
(RA)、シェーグレン症候群、皮膚筋炎ならびに他の自己抗体による疾患、例えばギラン−バレー症候群(GBS)、フィッシャー症候群(非特許文献6)、さまざまなタイプの血管炎、全身性硬化、抗糸球体基底膜(anti−GBM)および抗リン脂質抗体症候群(APS)(非特許文献7)である。
に関するドナーとレシピエントとの間の免疫学的障壁ならびにドナーに対するレシピエントの前感作の程度、すなわち急性抗体介在性拒絶反応(AMR)に至るドナー特異的抗体(DSA)の発生;ならびに2)移植器官の状態および一定の血液灌流なしに保たれた期間、すなわち移植片の虚血性損傷または虚血再灌流障害(IRI)の程度がある。AMRおよびIRIではいずれも、補体系は、外来性、したがって拒絶すべき実体として認識された器官を攻撃する。AMRでは、既存の抗ドナー抗体は、外来器官の表面に免疫複合体を速やかに形成してC1qによる認識および古典経路を介した補体系のその後の活性化を導く。超急性拒絶として知られているこの過程は、数分以内に起こり、したがって、不適性器官の最新の移植には、プラスマフェレーシスまたは血漿交換および異なる免疫抑制剤と組み合わせた静脈内IgGによる移植前のDSAの除去が含まれる。また、新規な治療には、抗CD20抗体リツキシマブの使用を介したB細胞欠乏も含まれる(非特許文献17)。これらのプロトコールにより、超急性拒絶の発生はかなり排除されてきたが、それでも、高度に感作された患者では、急性AMRの発生率(数週〜数ヵ月)が40%と高い(非特許文献18;非特許文献19、早期オンライン公開)。IRIに関して、ほとんどのエビデンスは、組織損傷の主因として、その後のMAC形成および溶解を伴う最終経路を示している。したがって、C5遮断ポリペプチドは、原因がAMR、IRI、または、しばしば起こるように、AMRおよびIRIの両方の組合せであるかどうかにかかわらず拒絶反応に対する保護となるであろう。期待されるように、肝臓(非特許文献20)、心臓および腎臓のような高度に灌流された器官は、特に補体介在性損傷を受けやすい。
クローナル抗体であり、C5がC5aおよびC5bへ切断されるのを防止する。エクリズマブは、PNH、血管内溶血性貧血、血栓形成傾向および骨髄機能不全を特徴とする、しばしば致命的となるまれな血液疾患の治療に有効であることが示されており、この適応症に対して承認されている。最近、エクリズマブは、非定型溶血性症候群(aHUS)の治療に対してもFDAによって承認されたが、これは、致命的であるがまれな疾患であり、副補体経路の制御消失により過剰活性化となり、血栓性微小血管症(TMA)として現れ、腎臓、心臓および脳のような生体器官に一定の損傷リスクを導く。aHUSでは、損傷した器官の移植は、肝臓が存続するように患者を一時的に助けるだけで、制御タンパク質(多くの場合、補体因子Hまたは副経路の他のタンパク質)の変異型を産生する。一過性急性病態生理学による関連疾患は、志賀毒素陽性大腸菌(STEC−HUS)の感染によって生じるHUSであり、この状態についても有効性を示唆する有望な臨床データがある(非特許文献21)。最後に、C5遮断抗体エクリズマブは、高度に不適性な腎臓のレシピエントにおけるAMRの防止に有効であると立証されている(非特許文献22)。
からのC5阻害タンパク質Ornithodoros moubata補体インヒビター(OmCI, 非特許文献23)は、CUB−C5d−MG8スーパードメインの遠位端に結合すると仮定されており、これは転換酵素切断部位に近い(非特許文献24)。C5の切断を阻害する上記3つの
タンパク質と対照的に、モノクローナル抗体TNX−558は、C5の切断を阻害することなく、無傷のC5および放出されたC5aの両方に存在するC5aエピトープに結合する(非特許文献25)。
用いるPNHの標準的な生涯にわたる治療レジメンは、2週毎のタンパク質900mgの静脈内注入であり、治療は主に診療所で行われため、患者にとって非常に不便であり、社会的にも費用がかかることになる。また、SolirisTMは、胸痛、発熱、悪寒、かゆみ、じ
んま疹、顔面紅潮、発疹、めまい、呼吸困難、または顔面、舌および咽喉の腫れを生じることが報告されているが、これらの副作用の理由は明らかではない。さらにまた、エクリズマブは、霊長類の動物を含むあらゆる試験動物モデルにおいて活性でなく、活性薬物を用いた動物実験が不可能となっている。上記のように、AMDの現在の治療は、抗体依存性でもあり、したがって、より低い分子量の分子を用いた注射剤または他の投与経路に基づく治療が、大いに必要である。
i)EX2X3X4A X6X7EID X11LPNL X16X17X18QW X21AFIX25 X26LX28D、
(式中、互いに独立して、
X2は、H、Q、S、TおよびVから選択され;
X3は、I、L、MおよびVから選択され;
X4は、A、D、E、H、K、L、N、Q、R、S、TおよびYから選択され;
X6は、NおよびWから選択され;
X7は、A、D、E、H、N、Q、R、SおよびTから選択され;
X11は、A、E、G、H、K、L、Q、R、S、TおよびYから選択され;
X16は、NおよびTから選択され;
X17は、I、LおよびVから選択され;
X18は、A、D、E、H、K、N、Q、R、SおよびTから選択され;
X21は、I、LおよびVから選択され;
X25は、D、E、G、H、N、SおよびTから選択され;
X26は、KおよびSから選択され;
X28は、A、D、E、H、N、Q、S、TおよびYから選択される)
および
ii)i)に定義された配列に対して少なくとも86%の同一性を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列からなり、
ここで、ポリペプチドは、C5と結合する。
標的結合領域に相当し、この領域は、3ヘリックス束タンパク質ドメイン内に2つのアルファへリックスを構成する。親骨格中、2つのBMヘリックスの多様なアミノ酸残基は、抗体の定常Fc部分と相互作用するための結合表面を構成する。表面残基を結合するランダム変動およびその後の変異体の選択によって、結合表面のFc相互作用力は、C5との相互作用力と置き換えられてきた。
をチップ上に通過させる実験において試験してもよい。別法として、試験対象となるポリペプチドを、機器のセンサチップ上に固定し、C5またはそのフラグメントを含むサンプルを、チップ上に通過させる。次いで、当業者は、このような実験によって得られた結果を解釈して、C5に対するポリペプチドの少なくとも定性的な測定を確立してもよい。定量的測定が望ましい場合、例えば相互作用についての見かけの平衡解離定数KDを決定するために、表面プラスモン共鳴法を用いてもよい。結合値は、例えば、Biacore 2000機器(GE Healthcare)において定義してもよい。C5を測定器のセンサチップ上に固定し、
親和性を測定することになっているポリペプチドのサンプルを段階希釈によって調製し、チップ上に注射する。次いで、KD値は、例えば機器製造元によって提供されたBIAevaluationソフトウェアの1:1のラングミュア結合モデルを用いた結果から計算してもよい
。KD測定に用いたC5またはそのフラグメントは、例えば配列番号:760によって表されるアミノ酸配列を含んでもよい。
6〜18、21、25〜26および28である)によって表される13個の可変位置において、i)に定義され5q配列と少なくとも84%の同一性を有し、かつ位置1、5、8〜10、12〜15、19〜20、22〜24、27および29において、i)に定義される配列と少なくとも87%の同一性を有するアミノ酸配列から選択される。
れる。別の実施態様において、X2は、TおよびVから選択される。さらに別の実施態様
において、X2はVである。
れる。別の実施態様において、X3は、IおよびLから選択される。さらに別の実施態様
において、X3はIである。別の実施態様において、X3はLである。
よびRから選択される。別の実施態様において、X4は、A、D、E、KおよびRから選
択される。さらに別の関連した実施態様において、X4は、DおよびEから選択される。
択される。別の実施態様において、X7は、DおよびNから選択される。さらに別の関連
した実施態様において、X7はDである。別の実施態様において、X7はNである。
たはそれ以上において、制限されたアミノ酸配列を定義している。
I. X2はVである;
II. X3は、IおよびLから選択される;
III. X6はWである;
IV. X7は、DおよびNから選択される;
V. X17は、IおよびLから選択される;
VI. X21はLである;
VII. X25はNである;
VIII. X28はDである;
の少なくとも4つを満たすように組み合わせてもよい。
ばドメインB、およびその誘導体である。いくつかの実施態様において、3ヘリックス束タンパク質ドメインは、タンパク質Zの変異体であり、それはブドウ球菌プロンテインAの上記ドメインBに由来する。
i)K−[BM]−DPSQS XaXbLLXc EAKKL NDXdQ;
(式中、
[BM]は、上に定義されたC5結合モチーフであり;
Xaは、AおよびSから選択され;
Xbは、NおよびEから選択され;
Xcは、A、SおよびCから選択され;
Xdは、AおよびSから選択される)
および
ii)上に定義された配列のいずれか1つと少なくとも79%の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含んでもよい。上記アミノ酸配列は、上に定義された配列の任意の1つに対する少なくとも81%、例えば少なくとも83%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも87%、例えば少なくとも89%、例えば少なくとも91%、例えば少なくとも93%、例えば少なくとも95%、例えば少なくとも97%の同一性を有してもよい。
義されたC5結合ポリペプチドの別の実施態様において、XaはSである。
施態様において、XbはEである。
施態様において、XcはSである。さらに別の実施態様において、XcはCである。
施態様において、XdはSである。
XbはNであり;XcはCであり、かつXdはAである。
XbはEであり;XcはSであり、かつXdはSである。
XbはEであり;XcはCであり、かつXdはSである。
i)YAK−[BM]−DPSQS SELLXc EAKKL NDSQA P;
(式中、[BM]は、上に定義されたC5結合モチーフであり、かつ
Xcは、SおよびCから選択される)
および
ii)上のi)に定義された配列のいずれか1つと少なくとも81%の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含むC5結合ポリペプチドを提供する。
i)FNK−[BM]−DPSQS ANLLXc EAKKL NDAQA P;
(式中、[BM]は、上に定義されたC5結合モチーフであり、かつXcは、AおよびC
から選択される)および
ii)上のi)に定義された配列のいずれか1つと少なくとも81%の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含むC5結合ポリペプチドを提供する。
、配列番号:739および配列番号:745〜757のいずれか1つから選択される配列、例えば配列番号:497〜508および配列番号:745〜757から選択される配列を含んでもよい。別の実施態様において、アミノ酸配列は、配列番号:497、配列番号:498、配列番号:499、配列番号:500、配列番号:501、配列番号:746、配列番号:747、配列番号:748、配列番号:750および配列番号:753から、例えば配列番号:497、配列番号:500、配列番号:748および配列番号:753のいずれか1つから選択される。
別にまたはまとめて付加してもよい。このようなさらなるアミノ酸残基は、化学的結合のために付加された1つまたはそれ以上のアミノ酸残基を含んでもよい。この一例は、システイン残基の付加である。また、このようなさらなるアミノ酸残基は、ポリペプチドの精製または検出のための「タグ」、例えばHis6タグまたは「myc」(c−myc)タ
グまたは「FLAG」タグを提供してもよく、His6タグの場合、タグに特異的な抗体との相互作用または固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)のためである。
リペプチドの半減期を増強する半減期延長部分を含んでもよい。当業者によって理解されるように、半減期の増強または延長とは、血液から特定分子のクリアランスが遅いこと意味する。in vivoでの特定のポリペプチド半減期を延長するための多くの知られている戦
略、例えば抗体(Fc結合)のFcドメインへの結合またはアルブミンへの結合がある。別の例は、in vivoで血清アルブミンに結合することになる半減期延長部分、例えばペプ
チドまたはタンパク質への結合である。特に、半減期延長部分は、アルブミン結合性部分であってもよい。アルブミン結合部分は、例えば天然のポリペプチド、またはそのアルブミン結合フラグメント、または改変されたポリペプチドからなる。改変されたポリペプチドは、アルブミンのような分子に対する結合親和性といったような、新規なまたは増強された性質を生み出すという観点では、天然の出発ポリペプチドをタンパク質工学技術、例えば部位特異的または無作為化されたアプローチにおける突然変異および変性にかけることにより、天然の出発ポリペプチドから誘導してもよい。このような改変されたアルブミン結合ポリペプチドは、例えば、タンパク質骨格の変異体であってもよく、この変異体は、アルブミンに対するその特異的結合親和性に関して選択されている。特定の実施態様において、タンパク質骨格は、例えば連鎖球菌株G148からのGタンパク質のドメインGA1、ドメインGA2およびドメインGA3、特にドメインGA3のような、連鎖球菌Gタンパク質またはその誘導体のドメインから選択してもよい。
ブミン結合ドメイン(ABD)を含む。本発明のC5結合ポリペプチド中にさらなるポリペプチドドメインとして含まれてもよいアルブミン結合ドメインの1つの例は、配列番号:759に提示される。適したアルブミン結合ドメインの他の例は、WO2009/016043およびWO2012/004384に開示されている。このようなABD延長ポリペプチドは、in vivoで血清アルブミンに結合し、そのより長い半減期から利益を受け
、これはポリペプチド自体の正味の半減期を増強する(例えばWO91/01743参照)。したがって、上に定義されたアルブミン結合部分を含むC5結合ポリペプチドの薬物動態学的プロファイルは、例えば哺乳動物対象に投与したときの血清アルブミンのそれに似ている。ABDおよびその誘導体は、ヒト血清アルブミン(HSA)だけでなく、マウスおよびラットのような他の種からの血清アルブミンにも非常に強く結合する。
プチドの全体的なサイズは比較的小さい。例えばヒト対象のような哺乳動物対象に投与したとき、C5結合ポリペプチドのアルブミン結合部分は、血清アルブミンと非共有結合により結合することになり、それによってポリペプチドは、腎臓クリアランスの低下および上皮細胞における再循環の増加から利益を受けることがある。しかし、血清アルブミンの浸出性のため、組織浸透は依然として速い。さらにまた、半減期延長部分を含むC5結合ポリペプチドは、対応する半減期延長部分がないポリペプチドと比較して、in vivoで半
減期の延長を示すだけでなく、in vivoでの免疫反応も低下させる(例えばWO2005
/097202参照)。
に対しても高い親和性を有し、血清アルブミンへの結合は、C5との相互作用を妨げない。
[CBP1]−[L1]−[ALBD];
[CBP1]−[CBP2]−[L1]−[ALBD];
[CBP1]−[L1]−[ALBD]−[L2]−[CBP2];
[ALBD]−[L1]−[CBP1];
[ALBD]−[L1]−[CBP1]−[CBP2];
[CBP1]−[L1]−[CBP2]−[L2]−[ALBD];および
[ALBD]−[L1]−[CBP1]―[L2]―[CBP2]
(式中、互いに独立して、
[CBP1]および[CBP2]は、同一または異なってもよいC5結合ポリペプチドであり;
[L1]および[L2]は、同一または異なってもよい結合部分であり;かつ
[ALBD]は、連鎖球菌Gタンパク質のアルブミン結合ドメインまたはその誘導体である)
から選択される構造を有する。
[CBP1]−[CBP2]−[L1]−[ALBD];
[CBP1]−[L1]−[ALBD]−[L2]−[CBP2];
そして最も好ましくは、[CBP1]−[L1]−[ALBD]から選択される構造を有する。
(式中、[CBP1]は、配列番号:748および配列番号:753から選択されるポリペプチドであり、[L1]は、GSであり、かつ[ALBD]は、配列番号:759として示されるポリペプチドである)を有する。
流障害(IRI)および急性抗体介在性拒絶(AMR);眼疾患、例えば加齢性黄斑変性(AMD)、ブドウ膜炎、糖尿病性眼疾患および障害、ならびに未熟児網膜症;腎疾患、例えば膜性糸球体腎炎、膜性腎炎、免疫グロブリンA腎症、ループス腎炎、グッドパスチャー症候群およびレンサ球菌感染後糸球体腎炎;肺疾患、例えば成人呼吸窮迫症候群、慢性閉塞性肺疾患および嚢胞性線維症;血液疾患;例えば溶血性貧血、発作性寒冷血色素尿症、非定型溶血性尿毒症症候群(aHUS)および発作性夜間血色素尿症(PNH);アレルギー疾患、例えばアナフィラキシーショック、アレルギーおよび喘息;ならびに皮膚疾患、例えば天疱瘡、水疱性類天疱瘡、光毒性反応および乾癬から選択される。より具体的な実施態様において、本発明によるC5結合ポリペプチド、化合物または組合せは、発作性夜間血色素尿症(PNH)の治療に用いられる。
2010, 6:269-277)、敗血症(Ward et al. The Sci World#160;J 2010, 10:2395-2402)、およびC活性化関連の仮性アレルギーを含む過敏症症候群(CARPA、まれな場合、生命を脅かす心肺の窮迫に至ることがある特定の治療リポソームおよび脂質賦形剤ベースの薬物に対する反応(Szebeni et al. Adv Drug Delivery Rev 2011, 63:1020-1030)の
ようなC5関連の状態の治療に潜在的に活性でありうる。さらに、本発明によるC5結合ポリペプチドは、輸血レシピエントが不適合な型の血液を受けたときに補体阻害に用いてもよい(米国では約1:14000の輸血単位で起こっている状況であり、それは高い死亡率と関係がある、Goodnough et al. Lancet 2003, 361:161-169)。
する。
特に明記した場合を除き、本研究を通して以下の物質を用いた。
・大腸菌(Escherichia coli)株RR1ΔM15(Ruether, Nucleic Acids Res 10:5765-5772, 1982)。
・大腸菌(Escherichia coli)株XL1-Blue(Agilent Technologies,カタログ番号200268)。
・ヒト補体タンパク質C5(hC5)。完全な1676個のアミノ酸プロタンパク質は、GenBank受入番号:NP_001726(配列番号:760)を有し、ここで、アミノ
酸19〜673がベータ鎖であり、アミノ酸678〜1676がアルファ鎖である。本明細書に用いたヒトC5は、Quidel(カタログ番号A403)から購入した。
・カニクイザル(Cynomolgus)補体タンパク質C5(cC5;配列番号:762)。cC5配列は、カニクイザル(Cynomolgus)(オナガザル科(Macaca fascicularis))ゲ
ノム配列(www.ebi.ac.uk/ena; Ebeling et al. (2001) Genome Res. 21(10):1746-1756
)から誘導した。ヒトC5のコード領域をwww.ensembl.orgから検索し、C5遺伝子を染
色体15に限局化した。この遺伝子を含む領域は、約110000塩基長であり、コンティグCAEC01154150〜CAEC01154178に含まれる。コンティグを手作業で単一ファイルにつなぎ、カニクイザルゲノム原物質に対してヒトC5のコード領域を整列させるsim4ソフトウェアにゲノムコンテキスト(genomic context)として用
いた。本明細書に用いるカニクイザルC5は、3ステップ手順;PEG6000沈降、イオン交換およびOmCIアフィニティークロマトグラフィーを用いて血清から組織内で精製した。
・ラット補体タンパク質C5(rC5;GenBank受入番号:XP_001079130
)。本明細書に用いるラットC5は、3ステップ手順;PEG6000沈降、イオン交換およびOmCIアフィニティークロマトグラフィーを用いている血清から組織内で精製した。
・フリースタイルHEK293細胞中に組織内で産生したヒトC5のアミノ酸残基822〜931(配列番号:760;Fredslund et al. (2008) Nature Immunology 9: 753-760)に対応する補体タンパク質C5のヒトMG7(hMG7)ドメイン。
・hMG7結合タンパク質。
・C末端にHis6タグを有するヒメダニOrnithodoros moubata OmCIからのOmCI(AF2999、前出のNunn, M. A.ら)(配列番号:761)を、E. coli株Origami
(DE3)中で組織内で産生し、HisTrap1カラムで精製した。
物質および方法
標的タンパク質hC5のビオチン化:No-Weigh EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin(Pierce, カタログ番号21327)を10倍(10×)モル過剰で用いて室温(RT)で40分間、
hC5を製造元の推奨に従ってビオチン標識した。その後、緩衝液をPBS(10mMリン酸塩、137mM NaCl、2.68mM KCl、pH7.4)に交換するのは、Protein Desalting Spin Columns(Pierce, カタログ番号89849)を、製造元の説明書に従
って用いて実施した。
/pAY02947/pAY02592中に構築された、バクテリオファージ上に示されるタンパク質Zのランダム変異体のライブラリーを用いて、C5結合ポリペプチドを選択した。3つの異なるライブラリーベクターを用いた。これらの2つは、ライブラリーZl
ib003Naive.IおよびZlib006Naive.IIを構築するZ変異体の融合パートナーとしてアルブミン結合ドメイン(連鎖球菌株G148からのGタンパク質のABD、GA3)を利用する。第3のライブラリー、Zlib004Naive.Iは、融合パートナーとしてTaq DNAポリメラーゼ結合分子Z03639(Gunneriusson et al. Protein Eng 1999, 12:873-878中に示されたZTaqS1-1)を利用する。ライブラリーは、以下の実測サイズ:3×109(Zlib003Naive.I);1.5×1
010(Zlib006Naive.II);および1.4×1010(Zlib004Naive.I)を有し、数は変異体の量に相当する。
ib003Naive.I)中、または20lのファーメンター(Zlib006Naive.IIおよびZlib004Naive.I)中のいずれかに調製した。ファージミドライブラリーZlib004Naive.Iを含むグリセロールストックからの細胞を、2%グルコースおよび100g/mlアンピシリンを補充した、20lのTSB−YE(Tryptic Soy Broth-Yeast Extract;30g/l TSB、5g/l酵母エキス)中に接種した。ファージミドライブラリーZlib006Naive.IIを含むグリセロールストックからの細胞を、100μg/mlのアンピシリンを補充した、20lの定義された無プロリン培地[リン酸水素二カリウム7g/l、クエン酸三ナトリウム二水和物1g/l、ウラシル0.02g/l、YNB(DifcoTM;アミノ酸なしのYeast Nitrogen Base、Becton Dickinson)6.7g/l、グルコース一水和物5.5g/l、L−アラニン0.3g/l、L−アルギニン一塩酸塩0.24g/l、L−アスパラギン一水和物0.11g/l、L−システイン0.1g/l、L−グルタミン酸0.3g/l、L−グルタミン0.1g/l、グリシン0.2g/l、L−ヒスチジン0.05g/l、L−イソロイシン0.1g/l、L−ロイシン0.1g/l、L−リシン一塩酸塩0.25g/l、L−メチオニン0.1g/l、L−フェニルアラニン0.2g/l、L−セリン0.3g/l、L−トレオニン0.2g/l、L−トリプトファン0.1g/l、l−チロシン0.05g/l、L−バリン0.1g/l]に接種した。培養物を、ファーメンター(Belach
Bioteknik, BR20)中37℃で増殖させた。細胞が光学濃度(OD)0.7〜0.8に達したときに、10×モル過剰のM13K07ヘルパーファージ(New England Biolabs #N0315S)を用いて約2.6lの培養物を感染させた。細胞を30分間インキュベートし、
その後、ファーメンターを、100μM IPTG(イソプロピル−β−D−1−チオガ
ラクトピラノシド、発現の誘導のため)、25μg/mlのカナマイシンおよび12.5μg/mlのカルベニシリンを補充したTSB−YEで20lまで充填し、30℃で22時間増殖させた。培養中の細胞を15,900gで遠心分離によって沈殿させ、その後、培地中に残っているファージ粒子を、PEG/NaCl(ポリエチレングリコール/塩化ナトリウム)中で2回沈澱させ、濾過し、そして前出のGroenwallら中に記述されたとお
りPBSおよびグリセロール中に溶解した。ファージストックを、使用前に−80℃で保存した。
補体タンパク質C5 10μg当たりビーズ1mgを用いた。E. coli株RR1ΔM15をファージ増幅に用いた。選択のサイクル1では、100nM hC5を用い、PBST 0.1%(0.1%Tween−20を補充したPBS)を用いて2回の洗浄を実施した。その後の3つのサイクルでは、低下した標的濃度および増加した洗浄回数を用いて高めた厳密性を適用した。サイクル2、3および4では;50または33nM hC5、25または1
1nM hC5および12.5または3.7nM hC5を用いた。サイクル2、3および
4では;すべてのサイクルにおいてPBST0.1%、またはサイクル2、3および4においてPBST0.2%、0.3%および0.4%を用いて4、6および8回の洗浄を実施した。
たTSB−YE培地1mlに接種することによって産生した。プレートを、37℃で18〜24時間インキュベートした。細胞を遠心分離によって沈殿させ、0.05%PBST300μl中で再懸濁し、−80℃で凍結して細胞の周辺質画分を放出させた。凍結サンプルを水浴中で解凍し、細胞を遠心分離によって沈殿させた。周辺質上清は、aqhdeale−[Z#####]−vdyv−[aBD]−yvpg(前出、Groenwallら)と
して表されるアルブミン結合ドメイン(連鎖球菌(Streptococcus)株G148からのG
タンパク質のGA3)への、またはaqhdeale−[Z#####]−vdyv−[Z03639]−yvpgとして表されるTaqDNAポリメラーゼ結合分子Z03639への融合物としてZ変異体を含んだ。Z#####は、個々の58個のアミノ酸残基Z変異体のことをいう。
lを、PBSC中5μg/mlの濃度で各ウェルに加えた。プレートを室温で1.5時間インキュベートし、続いて上記のように洗浄した。ストレプトアビジン−HRP(ホースラディッシュペルオキシダーゼ;Dako,カタログ番号P0397)をPBSC中で1:1
0,000に希釈し、ウェルに加え、次いで、それを45分間インキュベートした。上記
のように洗浄後、ImmunoPure TMB基質(Thermo Scientific,カタログ番号34021)50μlをウェルに加え、プレートを製造元の推奨に従って処理した。ウェルの吸光度は、マルチウェルプレートリーダー、Victor3(Perkin Elmer)を用いて450nmで測定し
た。
FI−22(5'−cggaaccagagccaccaccgg)を用いて単一コロニ
ーから増幅した。増幅されたフラグメントのシークエンシングは、ビオチン化オリゴヌクレオチドAFFI−72(5'−ビオチン−cggaaccagagccaccaccg
g)およびBigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)を用い、製造元のプロトコールに従って使用して実施した。シークエンシング反応物は、Magnatrix 8000(Magnetic Biosolution)を用いて、磁性ストレプトアビジンコーティング
ビーズ(Detach Streptavidin Beads, Nordiag,カタログ番号2012−01)に結合す
ることによって精製し、ABI PRISM(R) 3100 Genetic Analyzer(PE Applied Biosystems
)上で分析した。
補体タンパク質C5結合ポリペプチドのファージディスプレイ選択:ビオチン化hC5に対するファージディスプレイ選択の2〜4サイクル後に個々のクローンを得た。
物質および方法
Z変異体のサブクローニング、タンパク質発現および精製:5つの補体タンパク質C5結合Z変異体(Z05363(配列番号:510);Z05477(配列番号:509);Z05483(配列番号:511);Z05538(配列番号:512)およびZ05692(配列番号:513)を、pAffi1/pAY00065/pAY02947ライブラリーベクターから増幅した。N末端His6タグを有する二量体Affibody
分子の構築のためのサブクローニング戦略は、標準分子生物学的手法を用いて、WO2009/077175に詳細に記述されたとおり適用した。Z遺伝子フラグメントを、コードされた配列MGSSHHHHHHLQ−[Z#####][Z#####]−VDが得られる発現ベクターpAY01448にサブクローニングした。
0μg/mlカナマイシンを含むTSB−YE−培地800ml中37℃で増殖させた。OD600約1で、IPTGの自動添加により、培養物を0.05mMの最終濃度に誘導した。誘導の5時間後、培養物を約10℃に冷却し、遠心分離(20分、15,900g)によって収穫した。上清を捨て、細胞沈殿物を集め、さらなる使用まで−20℃で保存した。発現レベルおよび溶解度は、クーマシーブルー染色を用いて4〜12%NuPAGETMゲル(Invitrogen)上のSDS−PAGE分析によって算定した。
酸ナトリウム、0.5M NaCl、20mMイミダゾール、pH7.4)中で細胞沈殿
物を再懸濁し、超音波処理によって破壊した。Z変異体のそれぞれについては、超音波処理した懸濁液を、遠心分離(40分、25,000g、4℃)によって清澄化し、上清を1mlのHis GraviTrapTMカラム(GE Healthcare)上に装填した。カラムを洗浄緩衝液(20mMリン酸ナトリウム、0.5M NaCl、60mMイミダゾール、pH7.4)
で洗浄した後、溶離緩衝液(20mMリン酸ナトリウム、0.5M NaCl、0.5M
イミダゾール、pH7.4)3mlでZ変異体を溶離した。主に不溶性タンパク質として発現したZ変異体は同様に精製したが、しかし、結合および洗浄緩衝液中に8M尿素を含んだ。必要に応じて、移動相として0.1%TFA(トリフルオロ酢酸)を含む水を用い、かつ0.1%TFAを含むアセトニトリルの適当な勾配(典型的に20カラム体積にわたって0〜50%)による溶離を用いて、1mlのResourceTMカラム(GE Healthcare)
上で逆相クロマトグラフィー(RPC)によってZ変異体を更に精製した。
)において実施した。
用いて実施した。各チップ上の1つのフローセル表面を活性化し、そして検体注射におけるブランクとして不活性化した。HBS−EPランニングバッファー(GE Healthcare)
中で100nMの最終濃度に希釈した検体を、10μl/分の流速で1分間注射した。解離2分後、10mM HClを1回注射して表面を再生した。結果を、BiaEvaluationソフトウェア(GE Healthcare)で分析した。ブランク表面の曲線を、リガンド表面の曲線か
ら減算した。
Z変異体のサブクローニング:選択した5つ独特なクローン(Z05477(配列番号:509)、Z05363(配列番号:510)、Z05483(配列番号:511)、Z05538(配列番号:512)およびZ05692(配列番号:513))を、発現ベクターpAY01448中で二量体としてサブクローニングするために選択し、その後、シークエンシングによって確認した。
可溶性遺伝子産物が得られた。産生バッチの純度は、SDS−PAGE分析による評価で90%を超えると推定された。LC/MS分析により、すべてのZ変異体分子について正確な分子量を確認した。
異なる種、hC5のサブドメインへの結合、ならびにIgGへのバックグラウンド結合を、Biacore機器において、Z変異体を含む表面上に異なるタンパク質を注射することによ
って試験した。表面上のさまざまなZ変異体についてのリガンド固定化レベルは、Z05363:2080RU、Z05477:2180RU、Z05483:2010RU、Z05538:2570RUおよびZ05692:3270RUであった。さまざまなZ変異体を、100nMの濃度で注射したタンパク質の異なるセットへの結合について試験した、表3参照。試験したZ変異体の結果を、各タンパク質について+/−の結果として表に示す。
gGに対して検定した固定化二量体Z05477から得たセンサーグラムを示す。
本実施例では、成熟ライブラリーを構築した。ライブラリーは、hC5−結合ポリペプチドの選択に用いた。成熟ライブラリーからの選択は、通常、親和性が増加した結合剤になることが期待される(Orlova et al. Cancer Res 2006, 66(8):4339-48)。本研究では、その後に構築した二本鎖DNAの連結および制限を用いてトリヌクレオチド構成要素のランダム化セットの取り込みが可能となるSlonomics(R)技術によってランダム化二本鎖リンカーを生成した。
ライブラリーデザイン:ライブラリーは、実施例1および2に記述したhC5結合Z変異体の配列の選択に基づいた。新たなライブラリーでは、Z分子骨格中の13の可変位置を、配列番号:509〜513(Z05477、Z05363、Z05483、Z05538、Z05692)に定義されたZ変異体配列に基づく戦略に従って特定のアミノ酸残基の方へ偏らせた。制限部位XhoIおよびSacIに隣接するアミノ酸配列5'−AA
ATA AAT CTC GAG GTA GAT GCC AAA TAC GCC
AAA GAA/GAG NNN NNN NNN GCA/GCC NNN NNN
GAG/GAA ATC/ATT NNN NNN TTA/CTG CCT AAC
TTA ACC/ACT NNN NNN CAA/CAG TGG NNN GCC
/GCG TTC ATC/ATT NNN AAA/AAG TTA/CTG NNN
GAT/GAC GAC CCA AGC CAG AGC TCA TTA TTT
A−3’(ランダム化コドンは、NNNとして示す)の147塩基対の部分ランダム化ヘリックス1および2を含む二本鎖DNAのSlonoMax(R)ライブラリーを、Sloning BioTechnology GmbH(Pucheim,ドイツ)に注文した。最終的に12個の可変Z位置を含む新た
なライブラリーにおけるアミノ酸残基の理論分布を表4に示す。
AmpliTaq Goldポリメラーゼ(Applied Biosystems,カタログ番号4311816)を用いて、12サイクルのPCRの間、ライブラリーを増幅し、プールした生成物を、QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN,カタログ番号28106)を用いて、供給者の推奨に従って精製した。精製したランダム化ライブラリーフラグメントのプールを、制限酵素XhoIおよびSacI(New England Biolabs,カタログ番号R01460Lおよびカタログ番号R0156L)で消化し、PCR Purification Kitでさらに1回精製した。その後、1%アガロースゲル上で分取ゲル電気泳動を用いて生成物を精製した。
pAffi1として)を同じ酵素で制限し、フェノール/クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を用いて精製した。制限されたフラグメントおよび制限されたベクターを、5:1のモル比で、T4DNAリガーゼ(New England Biolabs,カタログ番号M0202S)により室温で2時間、続いて4℃で一晩インキュベーションして連結した。連結したDNAをフェノール/クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によって回収し、続いて10mM Tris−HCl(pH8.5)中に溶解した。
ΔM15細胞(100μl)にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの直
後、SOC培地(TSB−YE培地、1%グルコース、50μM MgCl2、50μM
MgSO4、50μM NaClおよび12.5μM KCl)約1mlを加えた。形質転
換細胞を37℃で50分間インキュベートした。滴定のため、そして形質転換体の数の測定のためサンプルを採取した。その後、細胞をプールし、2%グルコースおよび100μg/mlアンピシリンを補充したTSB−YE培地7l中37℃で一夜培養した。細胞を4,000gで15分間沈殿させ、PBS/グリセロール溶液(約40%グリセロール)中に再懸濁した。細胞を等分し、80Cで保存した。Z変異体のライブラリーからのクローンについて、含量を確認するため、そしてライブラリーデザインと比較して構築ライブラリーの結果を評価するため、シークエンシングした。実施例1に記述したとおり、シークエンシングを実施し、アミノ酸分布を確認した。
ライブラリー構築:確認された結合性(実施例1および2)を有するOmCIブロックトC5結合Z変異体のセットに基づいて新たなライブラリーを設計した。設計したライブラリーの理論サイズは、6.7×109のZ変異体であった。E. coli. RR1ΔM15細胞に形質転換後、滴定によって決定されたライブラリーの実測サイズは、1.4×109の形質
転換体であった。
物質および方法
補体タンパク質C5結合ポリペプチドのファージディスプレイ選択:標的タンパク質hC5を、実施例1に記述したとおりビオチン化した。ファージディスプレイ選択は、実施例3に記述したZ変異体分子の新たなライブラリーを用いて、本質的に実施例1に記述したhC5に対して実施した。ファージ増幅には、E. coli XL1-Blueを用いた。選択は、2つの並行なトラックで最初に実施した。一方のトラックでは、選択の時間が2時間であったが、もう一方のトラックでは、より短い選択時間:第1のサイクルで20分およびその後のサイクル2〜4では10分を用いた。これらの2つのトラック(1および2)を第2のサイクルで更に分けて、全部で6トラック(1a−cおよび2a−c、標的濃度および洗浄条件が異なる)となった。選択は、合計4サイクルで実施した。選択のサイクル1では、25nM補体タンパク質C5を用い、0.1%PBSTにより5回の洗浄を実施した。その後の3つのサイクルでは、低下した標的濃度および増加した洗浄回数を用いて高めた厳密性を適用した。サイクル2、3および4では;10、5または2.5nM補体タンパク質C5、4、1または0.25nM補体タンパク質C5および1.6、0.2または0.05nM補体タンパク質C5を用いた。サイクル2、3および4では;0.1%PBSTを用いて10、15および、20回の洗浄を実施した。さらに、2番目の最後の洗浄は、2つのトラック(1cおよび2c)について洗浄溶液中の50×過剰の非ビオチン化
hC5を用いて3時間に延長した。
グ番号N100)から入手した。一次選択(実施例1)から得たZ変異体Z05363(配列番号:510)を、陽性対照だけでなく、hC5を除いた陰性対照としても用いた。
補体タンパク質C5結合ポリペプチドのファージディスプレイ選択:選択は、それぞれ4サイクルを含む全部で6つの並行なトラックにおいて実施した。選択トラックが異なると、以下のように標的濃度および洗浄条件が異なる:1a)選択時間2時間、高い濃度、標準洗浄、1b)選択時間2時間、低い濃度、標準洗浄、1c)選択時間2時間、中程度の濃度、長い洗浄、2a)選択時間10分、高い濃度、標準洗浄、2b)選択時間10分、低い濃度、標準洗浄、および2c)選択時間10分、中程度の濃度、長い洗浄。各選択サイクルについては、標的濃度を低下させ、洗浄条件をより厳密にした。すべてのトラックから各ラウンドで溶出液中の十分な量のファージ粒子を得た。ほとんどのファージ粒子は、最も高い標的濃度および最も温和な洗浄条件を表すトラック1aおよび2aに見いだされた。
れ個々のZ変異体に、実施例1に記述したとおり、識別番号Z#####を与えた。全体で、242個の新たなユニークZ変異体分子が確認された。58個のアミノ酸残基長のZ変異体のアミノ酸配列を、図1に、そして配列リストに配列番号:497、配列番号:499〜508および配列番号:514〜744として記載する。これらのZ変異体の推測された補体タンパク質C5結合モチーフを、図1に、そして配列番号:1、配列番号:3〜12および配列番号:18〜248として配列リストに記載する。これらのZ変異体のそれぞれの中に完全な3ヘリックス束を構成すると予測される49個のアミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列を、図1に、そして配列番号:249、配列番号:251〜260および配列番号:266〜496として配列リストに記載する。配列決定されたクローンの中で、63個の配列は、2回またはそれ以上生じた。
および発生頻度に基づいて選択した。43個の独特なZ変異体を、より低い濃度のhC5(0.05μg/ml)およびrC5(4μg/ml)について検定した。試験した40個のZ変異体について、rC5に対して陽性の結果が得られ、これは、陰性対照(0.4AU)についての2×シグナルとして定義された。hC5およびrC5のより低い濃度に対して試験したすべてのZ変異体についての結果を図3に示す。
物質および方法
発現ベクターへのZ変異体分子のサブクローニング:配列分析ならびにヒトおよびラット補体タンパク質C5に対するELISAにおける性能に基づいて、発現ベクターpAY01448へのサブクローニングのために、45個のクローンを選択した。単量体Z変異体フラグメントを、ファージミドベクターpAY02592から増幅し、pAY01448へのサブクローニングを、実施例2に記述したように実施して、タンパク質配列MGSSHHHHHHLQ−[Z#####]−VDをコードするベクターを得た。
のZ変異体を、実施例2に記述した自動化マルチファーメンターシステムにおいて、または同様に、手作業でIPTGにより0.4mMの最終濃度に誘導した振盪機フラスコ中培養物100mlの小スケールの設定で発現させた。精製は、本質的に実施例2に記述した1mlのHisGraviTrapTMカラムを用いて、またはより小スケールで、0.1mlのHis SpinTrap(GE Healthcare,カタログ番号28−4013−53)を用いて実施した。PD-10
カラムまたはPD SpinTrap G-25(GE Healthcare,カタログ番号28−9180−04)を用いて、製造元の説明書に従って緩衝液をPBSに交換した。精製したZ変異体の濃度は、280nmでの吸光度測定によって決定し、純度および同一性は、実施例2に記述したSDS−PAGEおよびLC/MSによって評価した。サンプルを等分し、さらなる使用まで−80℃で保存した。
2に記述したように実施した。
タンパク質発現および精製:全45個のサブクローニングしたZ変異体は、発現しることができ、精製したすべての変異体についてin vitro溶解性は、良好であった。純度は、LC/MSによって、すべての変異体について90%を超えることが推定された。正確な分子量は、LC−MSによって確認した。
物質および方法
クローニングおよびタンパク質産生:C5結合Z変異体(配列番号:745〜757)のサブセットをコードするDNA、ここで、E. coliコドンを、GeneArt, GmbHによって最適化し、合成した。C5結合Z変異体を表す合成遺伝子をサブクローニングし、E. coli
中で発現させた。場合によりアルブミン結合ドメイン(ABD094、配列番号:759)に結合されたZ変異体の単量体または二量体の構築物をコードする発現ベクターを、図4に概略的に説明する。
よびSDS−PAGEにおいて分析した。
清(Sigma)で処理して抗体に感作したヒツジ赤血球(EA)とした。工程全体を無菌条
件下で行った。すべての他の試薬は、商業的供給源からであった。
1%ゼラチン;1.8mMバルビタールナトリウム;3.1mMバルビツール酸;500万個のEA;適した希釈度の補体タンパク質C5血清、および所望の濃度のC5結合Z変異体。アッセイでは異なる種の補体血清を用いてZ変異体の異種間効力を明らかにした。マウス血清については、C5減損ヒト血清(C5 depleted human serum)(Quidelからの
C5D カタログ番号A501)を等量で補充しなければならなかった。
の添加によって終了させた。細胞を底部と上清100μlに相当する上部とに遠心分離し、ハーフエリアおよびフラットボトムウェルを有する透明なマイクロプレートへ移した。反応結果は、波長415nmのマイクロタイタープレートリーダーを用いて光学濃度として分析した。
Healthcare)を用いて分析した。アミン結合化学を用いて、製造元のプロトコールに従
って、ヒトC5(A403、Quidel Corporation)をCM5センサチップ(900RU)に結合した。結合は、10mM酢酸Na緩衝液pH5(GE Healthcare)中7.5μg/
mlの濃度でhC5を注射することによって実施した。参照細胞は、同じ試薬で処理したが、ヒトC5を注射しなかった。
した。動態解析については、流速を30μl/分とし、データを25℃で集めた。参照細胞からのデータを減算して容積屈折率(bulk refractive index)変化を補正した。また
、ほとんどの場合、センサーグラムがダブルブランクされるように、HBS−EPの注射を対照として含んだ。表面は、HBS−EP緩衝液中で再生した。
を用いて評価した。
トし、希釈し、次いで上記のような一サイクル動態法に従って固定化ヒトC5上に注射した。比較として、同じ構築物を、HSAなしで注射した。2つの構築物、Z06175a−GS(図4、構築物1)およびZ06175a−GSGGGGSGGGGS−ABD094(図4、構築物3)は、HSAなしで試験しただけである。
一夜コーティングすることによって実施した。その後、非特異的部位を、1%カゼイン入
りのPBSにより室温で2時間ブロックした。ABD094(配列番号:759)(図4参照)と場合により融合した異なるZ変異体を、異なる濃度で、1%カゼイン入りPBS中、約100pMのSULFO−TAG標識C5結合Z−ABD変異体と共にインキュベートした。プレートを300rpmで撹拌しながら、インキュベーションを室温で3時間続けた。最後に、氷冷PBS−Tween20 150lで3回洗浄してインキュベーシ
ョンを終了した。最終洗浄の直後、リーディングバッファー(reading buffer)(超高純度H2O中に1:1希釈した、4×リーディングバッファーT、Meso Scale Discoveryカタログ番号R92TC−3)150μl×2を各ウェルに加え、プレートリーダー(SECTOR Imager 2400, Meso Scale Discovery)を用いてシグナルを検出した。置換アッセイでは、陽性対照として天然のC5結合タンパク質OmCI(前出Nunnら、配列番号:761)を含んだ。C5に対して競合するC5結合構築物および対照の結合親和性を、Excel plugin XLfit5およびGraphPad Prism 4を用いて非線形回帰分析によって決定した。
PR)によって取り組んだ。アミン結合(70RU)を用いて、Z−ABD構築物をCM5チップ(GE-Healthcare)上に固定した。HBS−P緩衝液(GE Healthcare)中に希釈した、それぞれ40nMおよび400nMのヒトC3(A401、Quidel)、C4(A402、Quidel)、およびIgG(I2511、Sigma)を、表面上に注射した。各注射に
続いて30秒間20mM NaOHを注射して再生サイクルを行った。同濃度のヒトC5
を、陽性対照として並行して行った。
クローニングおよびタンパク質産生:「Z」が配列番号:745および配列番号:748〜757によって表すことができる、図4に概略的に記述した、産生されたタンパク質変異体を、MALDI−TOF MSによっておよびSDS−PAGEにおいて分析した(図5)。
されたが(図7A)、親のZ変異体Z05477a(配列番号:745)を含む対応する構築物は、約30nMの親和性IC50値を示した。対照的に、天然のC5結合タンパク質OmCIは、1.5nMのIC50でhC5に結合することが見いだされた(図7A)。し
たがって、試験したすべての第二世代のZ変異体(配列番号:748〜757)は、親のZ変異体Z05477a(配列番号:745)よりもヒトC5に対する高い結合親和性を示した。さらに、同じ方法を用いたヒトC5に対するOmCI結合のそれよりも親和性が高かった。
合した配列番号:753)の単量体変異体およびC末端のABDリンカーを有する二量体変異体は、約500pM〜1.7nMの範囲のIC50値で200pM SULFO−TA
G標識Z−ABD変異体を置換することが見いだされたが、ABDを有しない二量体変異体およびN末端ABDを有する単量体変異体は、それぞれ4nMおよび17nMのIC50値で200pM SULFO−TAG標識Z−ABDを置換した。
物質および方法
2つの異なる方法、サイズ排除クロマトグラフィーおよびBiacoreを用いて、C5結合
Z変異体に融合したアルブミン結合ドメインABD094間の相互作用を研究した。
の後、SMARTシステム(GE Healthcare)を用いてSuperdex200カラム(GE Healthcare)上で実行した。また、Z06175a−GS−ABD094およびHSAは、対照と
して別々に実行した。
した。組換えヒトアルブミン(Recombumin(R), Novozymes)を、アミン結合化学を用いて、製造元によって記述されたように、CM5センサチップ(385RU)に結合させた。10mM 酢酸Na緩衝液pH4.5中のヒトアルブミン(GE Healthcare)を注射するこ
とによって結合を実施した。参照細胞は、同じ試薬で処理したが、ヒトアルブミンを注射しなかった。また、センサーグラムが二重に打ち消されるように、対照としてHBS−EPの注射を含んだ。実験は、HBS−EP緩衝液中で実施し、10mMグリシン−HCl
pH2(GE Healthcare)を再生に用い、流速は30μl/分であり、データを25℃で集めた。2つの異なる構築物、Z−ABD(Z06175a−GS−ABD094)およびZ−ABD−Z(Z06175a−GS−ABD094−GSGGGGSGGGGS−Z06175a)を、3種の異なる濃度;25nM、100nMおよび400nMで試験した。センサーグラムデータの評価にはBIAevaluationバージョン4.1.1を用いた。
同じように、ラット(A4538、Sigma)、マウス(A3559、Sigma)、およびウシ(BSA、Sigma)からの血清アルブミンで固定化された表面に対するZ−ABD(Z0
6175a−GS−ABD094)の結合も調べた。
SECカラムでは、より大きな分子ほど、小さいものより速く溶出する。図8Aに見られるように、同時に注射されたHSA+Z06175a−GS−ABD094は、HSAを単独で注射したときよりも早く溶出しており、2つの分子がこれらの条件下で安定な複合体としてふるまうことを示唆している。より小さなZ06175a−GS−ABD094は、複合体またはHSA単独よりもゆっくり溶出し、これらのタンパク質単独では複合体より小さいことを示している。
合親和性の分析は、Z−ABDに対する1nM未満の親和性を示しているが、Z−ABD−Z変異体は、1nMより上のKDで固定化HSAに結合する。
物質および方法
生存相の齧歯動物:2つのC5結合構築物Z−ABD(Z06175a−GS−ABD094;GSリンカーによって配列番号:759に融合した配列番号:753、図4、構築物2)およびZ−ABD−Z(Z06175a−GS−ABD094−GSGGGGSGGGGS−Z06175a;(GSリンカーによって配列番号:759に融合し、続いてGS(G4)2リンカーによって配列番号:753の第2のモチーフに融合した配列番号:753、図4、構築物5)の薬物動態を、雄Sprague Dawley(SD)ラット(体重250〜300g)において研究した。各ラットに、Z−ABDまたはA−ABD−Zの単一用量をi.v.(250nmol/kg)またはs.c.(500nmol/kg)投与した(用量群当たりn=3)。血液サンプル(200L)を、i.v.群については投与後、5、20および45分、ならびに1.5、4、7、24、48、72、120、168、240および336時間で採血し、s.c.群については、投与後15および30分、1、2、4、7、24、48、72、120、168、240および336時間で採血した。血液をチューブに集め、冷蔵庫に20分間置いて凝固させた。続いて、4000rpmで10分間遠心分離した後、血清を得た。血清サンプルを−70℃に保ち、分析にかけた。
P0609)150μlで希釈した。チューブにふたをかぶせ、小型のエッペンドルフサーモミキサー中、37℃で20分間撹拌した。撹拌した後、0.1%トリフルオロ酢酸(
TFA)中0.5μMに希釈した内部標準溶液I(13C6;15N)NKLDDDPSQS
SEL(配列番号:746〜757のアミノ酸31〜44)(Thermo Fisher Scientific
GmbH)25μlを加えた。内部標準を添加した後、サンプルを混合し、0.45μmセ
ルローススピンフィルター(Grace)を通して濾過した。
column);7μmのC18粒子を充填されたBrownlee newgardカラム(3.2×15m
m)を用いて、第1のカラムからの検体ペプチド画分を捕捉した。第1のカラムから溶出液を、Shimadzuポンプによって回転ミキサー(Lee Scientific)にポンピングした1ml/分の水で希釈した。最後のカラムは、5μm粒子Primesep 100(SIELC Inc)を充填さ
れた混合型逆相カチオン交換カラム(2.1×100mm)であった。
するために、補体活性化に関するex vivo溶血性アッセイを実施した。500万個の抗体
感作ヒツジ赤血球(EA)を含む血清サンプルを、全反応体積25μl/ウェル中で5×希釈した。一般に、すべての他の成分(実施例6参照)を含むEA懸濁液20μlの一部を、血清サンプル5μlと混合して(撹拌10分)、37℃で溶血活性化を開始した。しかし、実施例11のようなマウス血清サンプルについては、EA懸濁液20μl中にC5
D 1μlを含まなければならなかった。ex vivoアッセイは、本質的に実施例6のin vitroアッセイに記述したように実施した。
、および観察された最大血清中濃度までの時間、tmaxは、直接血清中濃度データから得
た。
AUC、AUC0-∞およびAUC0-last)、皮下生物学的利用能(F、(AUCsc/AUCiv)*(Doseiv/Dosesc)として計算した)、終末相血中半減期(T1/2,z、
終末勾配、zの見積りが、少なくとも4C=f(t)観察に基づく場合、ln2/λzと
して計算した)、平均滞留時間(MRT、AUMC/AUCとして計算した)、血清クリアランス(CL、用量/AUC0-∞として計算した)、定常状態の分布容積(Vss、CL*MRTとして計算した)および終末相の分布容積(Vz、CL/λzとして計算した)を、WinNonlinソフトウェアバージョン5.2.1(Pharsight Corp.,米国)、ノンコンパート
メント解析(Non-Compartmental-Analysis)を用いて計算した。
i.v.(250nmol/kg)およびs.c.(500nmol/kg)投与後のZ−ABDおよびZ−ABD−Zについての薬物動態データを表8にまとめる。Z−ABDは、i.v.群では投与後10〜14日まで、そしてs.c.群では14日まで血清中で定量化可能であったが、Z−ABD−Zは、両方の用量群において投与後10日まで血清中で定量化可能であった(図9)。14日は、最終的なサンプリング時点であった。
物質および方法
生存相における研究を、Charles River, Nevada(www.criver.com)で実施し、投与薬
物の調製および血清サンプルの分析を組織内で実施した。Z−ABD変異体の薬物動態(GSリンカーによってABD094(配列番号:759)に融合したZ06175a(配列番号:753))を、雄カニクイザル(n=3)において、i.v.(静脈内)およびs.c.(皮下)投与後に調べた。薬物動態パラメータの評価は、実施例8に従って実施したが、しかし、静脈投与後、対数線形血清中濃度−時間曲線の最初の傾きに対応する初期血清半減期(T1/2α)、第二(中間)相に関連する、対数線形血清中濃度−時間曲線の傾きに
対する対応する中間血清半減期(T1/2β)および対数線形血清中濃度−時間曲線の終末
の傾きに対応する終末相血清半減期(T1/2γ)を決定した。T1/2は、ln2/λとして計算し、ここで、傾きλの見積りは、少なくとも4C=f(t)観察に基づく。sc投与について示した薬物動態データは、Z−ABDの投与前レベルについて補正したが、血清中濃度対sc投与後の時間を示すグラフは、決定された実際の血清中濃度を示す。サルは、2〜4歳で、体重2.3〜3kgであった。それぞれのサルは、1回のi.v.投与(540nmol/kg)、続いてi.v.投与の3週後に1回のs.c.投与(1635nmol/kg)を受けた。血液サンプルは、いずれの投与の後も、投与後10および30分ならびに1、2、4、8、24、48、72、120、168、240、336および504時間で採取した。血液サンプルを、室温で20〜40分間凝固させ、次いで、1500〜2200RCFで、2〜8℃で10〜15分間遠心分離した後、血清を回収し、凍結させた。分析まで、血清サンプルを−20℃未満の温度で保存した。
6および8に記述した方法を用いてモニターしたが、齧歯動物血清の5倍と比較してサル血清を2倍にしか希釈しなかったという修正を加えた。
各用量群の平均(±標準偏差)薬物動態におけるデータを示す。Z−ABDの血清中濃度は、LC/LC/MS/MSによって、i.v.およびs.c.投与後のすべての時点で定量化可能であった(図14)。ELISAデータおよびLC/LC/MS/MSデータであるが、係数0.986によって線形的に補正されたLC/LC/MS/MSデータを計算に用いた。Z−ABDのi.v.投与後、初期血清半減期は9.1(0.8)時間であり、中間血清半減期は84(4)時間であり、そして終末相血清半減期は198(51)時間であった。平均滞留時間は246(62)時間であった。分布容積、VssおよびVzは、それ
ぞれ110(23)ml/kgおよび127(27)ml/kgと計算され、クリアランスは0.45(0.02)mL/h*kgと推定された。
06(40)時間であり、平均滞留時間は250(68)時間であった。皮下生物学的利用能は、70%を超えると推定された。
5mg/kgのZ−ABD s.c.投与後、少なくとも7日間は、完全に抑制された(≦投
与前の20%)
物質および方法
マウスへの投与:C57BL/6雌マウスは、ザイモサンで誘導する1時間前に腹腔内に(i.p.)、またはザイモサンで誘導する18時間前に皮下に(s.c.)、異なる濃度のZ−ABD融合分子(Z06175a−GS−ABD094、GSリンカーによって配列番号:759に融合した配列番号:753)または陽性対照OmCIを受けた。0.8mg/マウスのザイモサンをi.p.投与し、1時間後、眼窩血液サンプル(凝固活性化剤入りの血清バイアル中)をイソフルラン麻酔下で採取した。動物を頚椎脱臼により殺した。皮膚切開を行い、腹部筋肉壁を視覚化した。PBS溶液(2mM EDTAを含む)を、腹腔
に静かに注射した。腹部をマッサージし、液体サンプル(1〜2ml)を採取した。サンプルを試験管に移し、濡れた氷の上に保存した後、600gで10分間遠心分離した。上清中の総タンパク質量およびC5a濃度を分析した。
a抗体(カタログ番号MAB21501,R&D Systems)により4℃で一夜コーティング
した。プレートを、0.05%Tween20を含むPBS(PBST、カタログ番号09−9410−100、Medicago)で3回洗浄し、450rpmで撹拌しながら室温で1〜1.5時間、PBST中1%BSA(カタログ番号A7030,Sigma)200μl/
ウェルを用いてブロッキングした。プレートを、再びPBSTで3回洗浄し、次いで、0.1%BSA入りPBST中のさまざまな濃度の組換えマウスC5a標準(カタログ番号2150−C5,R&D Systems)100μl/ウェルまたはサンプルと共に、450rp
mで撹拌しながら室温で2時間インキュベートした。また、高濃度サンプルも、0.1%BSA入りPBST中で希釈した。プレートを、再びPBSTで3回洗浄し、ビオチン化抗C5a抗体(カタログ番号BAF2150,R&D Systems)100μl/ウェルと共に
、450rpmでプレートを振盪しながら室温で、0.1μg/mlの濃度で1.5時間インキュベートした。PBSTで3×洗浄した後、プレートを、ブロッキング緩衝液中希釈度200倍でストレプトアビジン−HRP(カタログ番号DY998,R&D Systems)
100μl/ウェルと共に、450rpmで撹拌しながら室温で20分間インキュベートした。最終的に3回洗浄した後、プレートを、TMB基質(カタログ番号T0440,Sigma)100μl/ウェルで展開した。20〜30分後、Spectramax Plusプレートリーダー(Molecular Devices)を用いて650nmで読み取った。
gG(Affibody AB)により4℃で一夜コーティングし、その後、非特異的部位は、室温
で2時間、1%カゼイン入りPBSでブロッキングした。
。最終洗浄の直後、リーディングバッファー(超高純度H2O中に1:1希釈した、4×リーディングバッファーT、Meso Scale Discoveryカタログ番号R92TC−3)150μl×2を各ウェルに加え、プレートリーダー(SECTOR Imager 2400, Meso Scale Discovery)を用いてシグナルを検出した。
動物からの血清サンプルにおけるZ−ABDの血清中濃度および溶血活性の分析:Z−ABD融合分子(Z06175a−GS−ABD094、GSリンカーによって配列番号:759に融合した配列番号:753))の血清中濃度およびヒツジ赤血球における溶血に影響を及ぼす能力を、低用量(20nmol/kg)、中用量(100nmol/kg)および高用量(500nmol/kg)の投与後に評価した。血清中濃度は、比較的に用量と比例し、溶血の阻害からは、血清中の分子が活性であり、かつ溶血の阻害も実際に濃度依存性であることが確認された。
物質および方法
雌C57blマウスに気管内投与した後のC5結合構築物Z06175a−GS−ABD094(GSリンカーによって配列番号:759融合した配列番号:753)の薬物動態プロファイルを研究した。温度、相対湿度および照明を設定して22±1℃、55±5%および明12時間−暗12時間サイクルに維持し、食事および水は自由に摂らせた。動物にイソフルランで麻酔し、500nmol/kgのZ06175a−GS−ABD094入りのマイクロスプレー(provided ad libitum)を用いて肺に直接投与した。血清サ
ンプルの調製のため、5分、30分、1時間、3時間、7時間、16時間、24時間、48時間および72時間(3匹の動物/時点)で、イソフルランによる麻酔下で大静脈からできるだけ多くの血液を回収した。チューブ中に血液を集めることによって血清サンプルを調製し、チューブを冷蔵庫に20分間置いた。その後、チューブを4000rpmで10分間遠心分離した。各血液サンプルから、少なくとも100μlの血清を調製した。血清サンプルを、分析前に−70℃に保った。各サンプル中のZ06175a−GS−ABD094の血清中濃度は、実施例10に記述したように、ECLによって決定し、ヒツジ
赤血球中の溶血に影響を及ぼす血清サンプルの能力は、実施例6および8に記述したように決定した。
各サンプル中の血清中濃度およびヒツジ赤血球における溶血に影響を及ぼす対応する能力を、それぞれ、図16Aおよび図16Bに記述する。300〜1000nMの範囲の血清中濃度では30分以内にプラトーに達し、ここで、溶血はほとんど完全にブロックされる。投与後7時間より後の時点でサンプリングした血清では、溶血が徐々に再発生している。投与3日後の最終時点で、溶血は、対照の約70%であった(図16B)。これらのデータは、気管内投与後の体循環へのZ06175a−GS−ABD094の吸収および分子が溶血を機能的に阻害することを明らかに示している。
生存相のウサギ:Z変異体(Z06175a、配列番号:753、続いてGS(図4、構築物1))の薬物動態を、硝子体内投与後のウサギ眼において研究した。生存相研究および投薬した動物(有色ウサギ、2〜2.5kg)の眼の解剖を、Iris Pharma, La Gaude,フランス(www.iris-pharma.com)で実施した。動物は、20±2℃、相対湿度55±
10%で個別に収容して食物および水は自由に摂らせた。
織内で実施した。
硝子体内投与後のZ変異体の濃度は、1日後、すべての区分で高く(6〜200μM)、驚くべきことに、投与4日後でも高いままであった(1.5〜78μM)。特に、硝子体中のZ分子の濃度は、注射1日後、118〜201μMの範囲(平均161μM、n=6眼)であり、注射4日後、26〜78μM(平均46μM、n=6)でとどまっており、数日のT1/2を示している。薬物のサイズと、ウサギ眼における硝子体内注射後の薬物
の排出との間には相反関係があると考えられ、以下の例によって記述されている;モキシフロキサシン(MW<0.35kDa、T1/2=1.72時間、Mohan et al. Trans Am O
phthalmol Soc 2005, 103:76-83)、ESBA105(MW=26kDa、T1/2=25時間、Ottiger et al. Investigative Ophthalmology & Visual Science 2009, 50: 779-786)およびラニビズマブ(MW=48kDa、T1/2=2.88日、Bakri et al. American Academy of Ophthalmology 2007, 114:2179-2182)。ここで試験したZ変異体は、7.0kDaの分子量を有しており、Z分子の排除が、硝子体中でこのような小分子に期待されると考えられるものよりもゆっくりであったことを示唆している。
Claims (17)
- 3ヘリックス束タンパク質ドメインの部分を形成するC5結合モチーフを含むC5結合ポリペプチドであって、該モチーフが、
EX2X3X4A X6X7EID X11LPNL X16X17X18QW X21AFIX25 X26LX28D、
(式中、互いに独立して、
X2は、H、Q、S、TおよびVから選択され;
X3は、I、L、MおよびVから選択され;
X4は、A、D、E、H、K、L、N、Q、R、S、TおよびYから選択され;
X6は、NおよびWから選択され;
X7は、A、D、E、H、N、Q、R、SおよびTから選択され;
X11は、A、E、G、H、K、L、Q、R、S、TおよびYから選択され;
X16は、NおよびTから選択され;
X17は、I、LおよびVから選択され;
X18は、A、D、E、H、K、N、Q、R、SおよびTから選択され;
X21は、I、LおよびVから選択され;
X25は、D、E、G、H、N、SおよびTから選択され;
X26は、KおよびSから選択され;そして
X28は、A、D、E、H、N、Q、S、TおよびYから選択される)
に従うアミノ酸配列からなる、C5結合ポリペプチド。 - 前記アミノ酸が、i)以下の8つの条件I〜VIII:
I. X2はVである;
II. X3は、IおよびLから選択される;
III. X6はWである;
IV. X7は、DおよびNから選択される;
V. X17は、IおよびLから選択される;
VI. X21はLである;
VII. X25はNである;
VIII. X28はDである;
の少なくとも4つを満たす、請求項1に記載のC5結合ポリペプチド。 - 前記C5結合ポリペプチドが、
K−[BM]−DPSQS XaXbLLXc EAKKL NDXdQ;
(式中、
[BM]は、請求項1または2に定義されたC5結合モチーフであり;
Xaは、AおよびSから選択され;
Xbは、NおよびEから選択され;
Xcは、A、SおよびCから選択され;そして
Xdは、AおよびSから選択される)
に従うアミノ酸配列を含む、請求項1または2に記載のC5結合ポリペプチド。 - C5の切断を阻害する、請求項1〜3のいずれか1項に記載のC5結合ポリペプチド。
- 前記相互作用のKD値が、多くとも1×10-6M、多くとも1×10-7Mといった、多くとも1×10-8Mといった、多くとも1×10-9Mといったようになるように、C5結合ポリペプチドがC5に結合する、請求項1〜4のいずれか1項に記載のC5結合ポリペプチド。
- 前記ポリペプチドの産生、精製、in vivoもしくはin vitro安定化、結合、または検出を改善する、さらなるC末端および/またはN末端アミノ酸を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載のC5結合ポリペプチド。
- 少なくとも2つのC5結合ポリペプチド単量体単位を含み、それらのアミノ酸配列が同一または異なってもよい、多量体形態の請求項1〜6のいずれか1項に記載のC5結合ポリペプチド。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の少なくとも1つのC5結合ポリペプチド;少なくとも1つの連鎖球菌Gタンパク質のアルブミン結合ドメイン、またはその誘導体、および前記少なくとも1つのドメインまたはその誘導体を前記少なくとも1つのC5結合ポリペプチドのCまたはN末端に結合するための少なくとも1つの結合部分を含むC5結合化合物。
- [CBP1]−[L1]−[ALBD];
[CBP1]−[CBP2]−[L1]−[ALBD];
[CBP1]−[L1]−[ALBD]−[L2]−[CBP2];
[ALBD]−[L1]−[CBP1];
[ALBD]−[L1]−[CBP1]−[CBP2];
[CBP1]−[L1]−[CBP2]−[L2]−[ALBD];および
[ALBD]−[L1]−[CBP1]―[L2]―[CBP2]
(式中、互いに独立して、
[CBP1]および[CBP2]は、同一または異なってもよいC5結合ポリペプチドであり;
[L1]および[L2]は、同一または異なってもよい結合部分であり;かつ
[ALBD]は、連鎖球菌Gタンパク質のアルブミン結合ドメインまたはその誘導体である)
から選択される構造を有する、請求項8に記載のC5結合化合物。 - 前記結合部分が、G、GS;[G2S]n;[G3S]n;[G4S]n;GS[G4S]n、
(式中、nは0〜7である);[S2G]m;[S3G]m;[S4G]m;(式中、mは0〜7である)およびVDGSから選択される、請求項9に記載のC5結合化合物。 - 前記アルブミン結合ドメインが配列番号:759に設定されるような請求項8〜10のいずれか1項に記載のC5結合化合物。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のポリペプチドまたは請求項8〜11のいずれか1項に記載の化合物をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のC5結合ポリペプチドまたは請求項8〜11のいずれか1項に記載のC5結合化合物と治療剤との組合せ。
- 治療に使用するための、請求項1〜7のいずれか1項に記載のC5結合ポリペプチド、請求項8〜11のいずれか1項に記載のC5結合化合物または請求項13に記載の組合せ。
- C5関連の状態を治療するための、請求項1〜7のいずれか1項に記載のC5結合ポリペプチド、請求項8〜11のいずれか1項に記載のC5結合化合物または請求項13に記載の組合せ。
- 炎症性疾患;自己免疫疾患;感染性疾患;心血管疾患;神経変性障害;がん;移植障害;創傷;眼疾患;腎疾患;肺疾患;血液疾患;アレルギー疾患および皮膚疾患から選択されるC5関連の状態を治療するための、請求項1〜7のいずれか1項に記載のC5結合ポリペプチド、請求項8〜11のいずれか1項に記載のC5結合化合物または請求項13に記載の組合せ。
- 発作性夜間血色素尿症(PNH)を治療するための、請求項1〜7のいずれか1項に記載のC5結合ポリペプチド、請求項8〜11のいずれか1項に記載のC5結合化合物または請求項13に記載の組合せ。
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