KR20160068744A - 돌연변이된 스캐폴드를 갖는 결합 폴리펩티드 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 일부류의 조작된 폴리펩티드에 관한 것이며, 서열 EX2X3X4AX6X7EIX10 X11LPNLX16X17X18QX20 X21AFIX25X26LX28X29X30 PX32QSX35X36LLX39E AKKLX45X46X47Q를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명은 또한 폴리펩티드 변이체 군 내의 각 폴리펩티드가 아미노산 서열 EX2X3X4AX6X7EIX10 X11LPNLX16X17X18QX20 X21AFIX25X26LX28X29X30 PX32QSX35X36LLX39E AKKLX45X46X47Q를 포함하는, 공지된 스캐폴드에 기반한 폴리펩티드 변이체 군 및 상기 군으로부터 기결정된 표적물에 대해 친화성을 갖는 목적하는 폴리펩티드를 선별하기 위한 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 공지된 스캐폴드(common scaffold)에 기반한 신규 폴리펩티드, 이의 생산 방법 및 신규 폴리펩티드 변이체 군에 관한 것이다. 상기 군은, 예를 들어, 신규 결합 단백질 및 폴리펩티드를 제공하기 위하여 사용될 수 있다.
신규 결합 단백질의 작제를 위한 상이한 방법이 문헌[참조: Nygren PA and Uhlen M (1997) Curr Opin Struct Biol 7:463-469]에 기재되어 있다. 한가지 전략은 라이브러리 생성 및 스크리닝을 목적하는 특성에 대한 선별과 조합하는 것이었다.
공지된 제1 세대 스캐폴드에 기반한 제1 세대 Z 변이체 폴리펩티드, 이러한 분자 군(population) 및 이와 관련되는 방법이 문헌[참조: WO95/19374]에 기재되어 있다. 추가적으로, 제2 세대 스캐폴드에 기반한 Z 변이체 폴리펩티드, 이러한 분자 군 및 이와 관련되는 방법이 문헌[참조: WO2009/080811]에 기재되어 있다. 이러한 2개 개시의 교시가 본원에 참조로서 원용된다.
일부 적용의 경우, 예를 들어, 보다 높은 알칼리 안정성, 낮은 항원성, 구조적 안정성, 화학적 합성에 대한 순응성(amenability) 및 친수성과 같은 개선된 특성을 갖는 Z 변이체 폴리펩티드 또는 이의 군이 요구된다. 문헌[참조: WO2009/080811]은 개선된 특성을 지닌 공지된 스캐폴드를 갖는 Z 변이체를 개시하나, 모든 목적하는 특성이 그에 기재되는 바와 같은 Z 변이체 폴리펩티드에 의해 수득될 수 있는 것은 아니다.
폴리펩티드 의약품으로 성공하기 위한 한가지 중요한 인자는 이들의 안정성이다. 높은 구조적 안정성을 나타내는 폴리펩티드는, 아마도 생산 시 뿐만 아니라 인체 내에서도 화학적 변형, 물리적 조건에서의 변화 및 단백질분해를 함수적으로 견딜 것이다. 또한, 안정성은, 인체 내에서 폴리펩티드 의약품의 활성 저장 수명(shelf-life) 뿐만아니라 폴리펩티드 의약품의 활성 수명에 영향을 끼칠 것이다.
따라서, Z 변이체 폴리펩티드의 안정성 개선에 대한 지속적 요구가 존재한다.
본 발명의 목적은 신규 스캐폴드를 갖는 폴리펩티드를 제공하는 것이며, 이러한 폴리펩티드는 현재 이용가능한 Z 변이체 폴리펩티드의 상기-결점 및 다른 결점을 경감시킨다.
본 발명의 또 다른 목적은 신규 스캐폴드에 기반한 폴리펩티드의 생산 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 개선된 폴리펩티드 변이체 군을 제공하는 것이며, 이는 전부 신규 스캐폴드에 기반한다.
본 발명의 또 다른 목적은 폴리뉴클레오티드 군을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 폴리펩티드 군 및 폴리뉴클레오티드 군의 배합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가적인 목적은 폴리펩티드 군으로부터 기결정된(predetermined) 표적물에 대해 친화성을 갖는 목적하는 폴리펩티드를 선별하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 기결정된 표적물에 대해 친화성을 갖는 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 단리하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 목적은 기결정된 표적물에 대해 친화성을 갖는 목적하는 폴리펩티드를 동정하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
추가적인 목적은 기결정된 표적물에 대해 친화성을 갖는 목적하는 폴리펩티드를 선별 및 동정하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
관련된 목적은 기결정된 표적물에 대해 친화성을 갖는 목적하는 폴리펩티드를 생산하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
이러한 및 다른 목적은 본 출원에서 개시된 상이한 양태들에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 제1 양태에서, 하기 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 제공된다:
i) EX2X3X4AX6X7EIX10 X11LPNLX16X17X18QX20 X21AFIX25X26LX28X29X30 PX32QSX35X36LLX39E AKKLX45X46X47Q; 및
ii) i)에서 정의된 서열과 적어도 91% 동일성을 갖고, 단 X45가 N일 때 X46은 D가 아닌, 아미노산 서열.
여기서, 각각의 X2, X3, X4, X6, X7, X10, X11, X17, X18, X20, X21, X25 및 X28은 독립적으로 임의의 아미노산 잔기에 해당하고;
서로 독립적으로,
X16은 N 및 T 중에서 선택되고;
X26은 K 및 S 중에서 선택되고;
X29X30PX32는 DDPS 및 RQPE 중에서 선택되고;
X35는 A 및 S 중에서 선택되고;
X36은 E 및 N 중에서 선택되고;
X39는 A, C 및 S 중에서 선택되고;
X45는 E, N 및 S 중에서 선택되고;
X46은 D, E 및 S 중에서 선택되고, 단 X45가 N일 때 X46은 D가 아니고;
X47은 A 및 S 중에서 선택된다.
상기 폴리펩티드 서열 i)에서, "독립적으로 임의의 아미노산에 해당하고"와 같이 정의된 각각의 아미노산 X는 모든 가능한 아미노산으로부터 선택된 아미노산 잔기에 각각 해당한다. 명확하게는, 이는 상기 서열 i)에서의 위치 X2, X3, X4, X6, X7, X10, X11, X17, X18, X20, X21, X25 및 X28에 해당하는 아미노산 위치에 적용된다. 이는, 서열 내의 X로 지정된 임의의 다른 잔기의 정체와는 별개로, 각각의 이러한 X가 임의의 아미노산 잔기일 수 있다는 것을 의미한다. 상기 아미노산 서열에서, 임의의 이러한 20개 천연 발생 아미노산 잔기가 임의의 소정의 변이체 내의 상응하는 X 위치에 존재할 수 있도록 이러한 아미노산 X는 모든 20개 천연 발생 아미노산 잔기 중에서 선택될 수 있다. 각 위치에서 아미노산 잔기의 선택은 다소 무작위적일 수 있다. 또한, 상이한 다양한 아미노산 잔기가 20개 천연 발생 아미노산 잔기중 19, 18, 17, 16개 이하로 선택되도록 그룹을 제한하는 것도 가능하다. 상이한 위치에서의 다양성은 1개(무작화가 없음을 의미) 내지 모든 20개 아미노산 잔기로 각각 조정될 수 있다. 보다 작은 서브세트의 아미노산의 무작위적 도입은, 예를 들어, 코돈 T(A/C)C가 도입되어 폴리펩티드 쇄 내의 소정의 위치에서 세린 또는 티로신의 무작위적 도입을 수득할 수 있는 바와 같이, 도입되는 데옥시리보뉴클레오티드 염기의 주의깊은 선별에 의해 수득될 수 있다. 마찬가지로, 코돈 (T/C/A/G)CC이 도입되어 폴리펩티드 쇄 내의 소정의 위치에서 페닐알라닌, 류신, 알라닌 및 발린의 무작위적 도입을 수득할 수 있다. 당업자는, 폴리펩티드 쇄 내의 소정의 위치에서 아미노산의 상이한 조합을 수득하는데 사용될 수 있는, 수많은 대안적 데옥시리보뉴클레오티드 염기 조합을 알고 있을 것이다. 또한, 폴리펩티드 쇄 내의 소정의 위치에서 나타날 수 있는 아미노산 세트는 올리고뉴클레오티드 합성 동안 한 번에 하나의 데옥시리보뉴클레오티드 염기 대신에 트리뉴클레오티드를 도입함으로써 결정될 수 있다. 지정된 아미노산 세트는 또한, 합성시 목적하는 위치에서 지정된 코돈의 삽입을 가능하게 하는 스플릿-풀(split-pool) 합성을 사용하여 수득될 수 있다. 무작위화된 2중 가닥 링커를 수득하기 위한 또 다른 대안은, 결찰 및 제한을 사용하여 트리뉴클레오티드 빌딩 블럭의 무작위화된 세트를 삽입하고 이어서 이중 가닥 DNA를 제조하는 것이다.
본 발명의 한가지 실시형태에서, 기결정된 표적물에 대해 친화성을 갖는 폴리펩티드가 제공된다. 한가지 이러한 실시형태에서, 표적물 결합 특이성을 부여하는 아미노산 잔기는 상기 서열 i)에서 위치 2, 3, 4, 6, 7, 10, 11, 17, 18, 20, 21, 25 및 28에 해당하는 위치에서의 아미노산 잔기이다. 마찬가지로, 이러한 폴리펩티드에서 표적물 결합 특이성을 부여하지 않는 아미노산 잔기를 "스캐폴드 아미노산" 또는 간단히 "스캐폴드"라 지칭한다. 따라서, 한가지 실시형태에서, 본원에서 정의된 바와 같은 스캐폴드 아미노산 잔기는 상기 서열 i)에서 위치 1, 5, 8, 9, 12 내지 15, 19, 22 내지 24, 27, 31, 33 내지 34, 37 내지 38, 40 내지 44 및 48에 해당하는 위치에서의 아미노산 잔기이다. 당업자는, 본원에서 정의되는 바와 같은 폴리펩티드의 스캐폴드 아미노산에 의해 부여되는 유리한 특성이 상기 폴리펩티드의 표적물 결합 특이성과는 별개라는 것을 이해할 것이다.
당업자가 인식하는 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드와 같은 임의의 폴리펩티드의 기능은 폴리펩티드의 3차 구조에 의존한다. 따라서, 이의 기능에 영향을 주지 않고 폴리펩티드 내의 아미노산 서열에 미미한 변화를 주는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명은, 폴리펩티드의 기능적 특성(예를 들어, 이의 개선된 안정성 및/또는 기결정된 표적물에 대한 이의 결합 친화성)을 변경하지 않는 상기 폴리펩티드의 변형된 변이체를 포함한다.
이러한 방식으로, 본 발명은 i)에서 정의된 서열과 91 % 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 폴리펩티드는 i)에서 정의된 서열과 적어도 93 %, 예를 들어 적어도 95 %, 예를 들어 적어도 97 % 동일한 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 서열 정의 i) 및 ii) 간의 이러한 차이가 본원에서 개시된 바와 같은 폴리펩티드 서열의 임의의 위치에서 발견될 수 있다. 다른 실시형태에서, 이러한 차이는 오직 스캐폴드 아미노산 잔기에서만 발견될 수 있다. 다른 실시형태에서, 상기 차이는 오직 표적물 결합 특이성을 부여하는 아미노산에서만 발견될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 잔기의 특정 작용기(예: 소수성, 친수성, 극성 등)에 속하는 아미노산 잔기는 동일한 작용기로부터의 또 다른 아미노산 잔기로 교환될 수 있다.
본 명세서 전반에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 용어 "% 동일성"을 예를 들어 하기와 같이 계산할 수 있다. CLUSTAL W 알고리즘[Thompson et al, Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680 (1994)]을 사용하여 검색(query) 서열을 표적물 서열과 정렬한다. 정렬된 서열 중 하나의 서열(예: 가장 짧은 서열)에 상응하는 윈도우(window)에 걸쳐 비교한다. 일부 예에서, 윈도우는 표적 서열로 정의될 수 있다. 다른 예에서, 윈도우는 검색 서열로 정의될 수 있다. 각 위치에서의 아미노산 잔기를 비교하고, 표적물 서열에서 동일한 대응을 갖는 검색 서열에서의 위치 백분율을 % 동일성으로서 기록한다.
폴리펩티드 결합을 위한 스캐폴드로서 사용되는 경우, 본원에서 개시된 서열은, 공지된, 유사한 스캐폴드와 비교하여 이점을 제공하고, 높은 구조적 안정성, 나아가 개선된 보존(storage) 저장 수명을 나타내기 위하여 조작되었다. 이러한 이점은 또한 이러한 제1 양태의 폴리펩티드 변이체 군에 관한 본 발명의 제3 양태(아래 참조)에 적용된다.
본 발명의 한가지 실시형태에서, X16은 T이다.
한가지 실시형태에서, X26은 K이다.
한가지 실시형태에서, X29X30PX32는 DDPS이다.
한가지 실시형태에서, X29X30PX32는 RQPE이다.
한가지 실시형태에서, X35는 S이다.
한가지 실시형태에서, X36은 E이다.
한가지 실시형태에서, X39는 S이다.
한가지 실시형태에서, X45는 E 및 S 중에서 선택된다.
한가지 실시형태에서, X45는 E이다.
한가지 실시형태에서, X45는 S이다.
한가지 실시형태에서, X46은 E 및 S 중에서 선택된다.
한가지 실시형태에서, X46은 E이다.
한가지 실시형태에서, X46은 S이다.
한가지 실시형태에서, X46은 D이다.
한가지 실시형태에서, X45가 N일 때, X46는 D 또는 E가 아니다.
한가지 실시형태에서, X45X46은 EE, ES, SE 및 SS 중(예: ES 및 SE)에서 선택된다.
한가지 실시형태에서, X45X46은 ES이다.
한가지 실시형태에서, X45X46은 SE이다.
한가지 실시형태에서, X45X46은 SD이다.
한가지 실시형태에서, X47은 S이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "기결정된 표적물에 대한 결합 친화성"은, 예를 들어, 표면 플라스몬 공명(SPR) 기술을 이용하여 시험될 수 있는 폴리펩티드의 특성을 지칭한다. 예를 들어, 상기 결합 친화성은, 기결정된 표적물, 또는 이의 단편이 기기의 센서 칩 상에 고정되고 시험될 폴리펩티드를 포함하는 샘플이 칩 상에 통과되는 실험에서 시험될 수 있다. 대안적으로, 시험될 폴리펩티드가 기기의 센서 칩 상에 고정되고, 기결정된 표적물, 또는 이의 단편을 포함하는 샘플이 칩 상에 통과된다. 이때, 당업자는 이러한 실험으로 수득된 결과를 해석하여 기결정된 표적물에 대한 폴리펩티드의 결합 친화성에 대한 적어도 정성적인 측정을 규정할 수 있다. 예를 들어, 상호작용에 대한 KD 값을 측정하기 위해 정량적인 측정이 요구되는 경우, 표면 플라스몬 공명 방법을 또한 사용할 수 있다. 결합값(binding value)은, 예를 들어, Biacore(GE Healthcare) 또는 ProteOn XPR 36(Bio-Rad) 기기에서 규명될 수 있다. 기결정된 표적물은 적절하게는 기기의 센서 칩 상에 고정되고, 일련의 희석으로 친화성이 측정될 폴리펩티드의 샘플이 제조되며 무작위 순서로 주입된다. 이어서, 결과물로부터, 예를 들어, BIAevaluation 4.1 소프트웨어 또는 기기 제조자에 의해 제공되는 다른 적절한 소프트웨어의 1:1 랭뮤어 결합 모델을 사용하여, KD 값을 계산할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "기결정된 표적물에 대한 결합 친화성"은 또한, 예를 들어, ELISA로 시험될 수 있는 폴리펩티드의 특성을 지칭한다. 예를 들어, 상기 결합 친화성은, 폴리펩티드의 샘플이 항체-코팅된 ELISA 플레이트 상에 포획되고 비오티닐화된 기결정된 표적물, 또는 이의 단편이 첨가되고 이어서 스트렙타비딘(streptavidin) 접합된 HRP가 첨가되는 실험에서 시험될 수 있다. TMB 기질이 첨가되고, 예를 들어, Victor3(Perkin Elmer)와 같은 다중-웰 플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서의 흡광도가 측정된다. 당업자는 이러한 실험으로 수득된 결과를 해석하여 기결정된 표적물에 대한 복합체의 결합 친화성에 대한 적어도 정성적인 측정을 규정할 수 있다. 예를 들어, 상호작용에 대한 EC50 값(최대 효과적 농도의 절반)을 측정하기 위해 정량적인 측정이 요구되는 경우, ELISA를 또한 사용할 수 있다. 상기 기재된 바와 같이 ELISA를 사용하여 기결정된 표적물 또는 이의 단편의 희석물 시리즈에 대한 폴리펩티드의 반응을 측정한다. 당업자는 이러한 실험으로 수득된 결과를 해석하고, 그 결과물로부터, 예를 들어, GraphPad Prism 5 및 비선형 회기를 사용하여 EC50 값을 계산할 수 있다.
이전에 기재된 바와 같이, Z 변이체 폴리펩티드는 3개-나선 다발 도메인을 구성(또는 이의 일부를 형성)하는 것으로 생각되며, 이 모티프는, 상기 3개-나선 다발 단백질 도메인 내에서 상호연결 루프를 갖는 2개의 알파 나선의 일부를 본질적으로 형성하는 기결정된 표적물에 대해 친화성을 갖는다.
폴리펩티드를 의도된 특정 용도에 맞추기 위해, 본 발명의 범위로부터 벗어나지 않으면서, 상기 정의된 바와 같이 폴리펩티드에 대해 상이한 변형 및/또는 첨가를 수행할 수 있다.
상기 변형 및 첨가가 하기에 보다 상세히 기재되고, 상기 변형 및 첨가는 동일한 폴리펩티드 쇄에 포함되는 추가적인 아미노산, 또는 폴리펩티드에 화학적으로 접합되거나 달리 결합되는 표지 및/또는 치료제를 포함할 수 있다.
또한, 한가지 실시형태에서, 추가적인 아미노산 잔기를 포함하는 상기 기재된 바와 같은 폴리펩티드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 추가적인 아미노산 잔기는 폴리펩티드의 C-말단에 위치될 수 있다. 일부 실시형태에서, 추가적인 아미노산 잔기는 폴리펩티드의 N-말단에 위치될 수 있다.
한가지 실시형태에서, C-말단에서의 상기 추가적인 아미노산 잔기는 AP를 포함한다.
한가지 실시형태에서, N-말단에서의 상기 추가적인 아미노산 잔기는 AEAKYAK를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 상기 기재한 바와 같은 폴리펩티드가 제공되며, 이는 N-말단에서의 0 내지 7개의 추가적인 아미노산 잔기를 갖고 C-말단에서의 0 내지 3개의 추가적인 아미노산 잔기를 갖는 서열 i) 또는 ii)로 구성된다.
추가적인 아미노산 잔기는 폴리펩티드의 결합시 역할을 할 것이나, 예를 들어, 폴리펩티드의 생산, 정제, 안정화, 커플링 또는 검출 중 하나 이상과 연관되는 다른 목적에도 동일하게 잘 이용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 추가적인 아미노산 잔기는 하나 이상의 폴리펩티드 도메인을 구성한다.
이러한 추가적인 아미노산 잔기는 화학적 커플링의 목적으로 추가된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 일례로, 폴리펩티드 쇄 내의 맨 처음 또는 맨 마지막 위치(즉, N- 또는 C-말단)에서 시스테인 잔기의 첨가가 있다. 화학적 커플링에 사용되는 시스테인 잔기는 또한, 단백질 도메인의 표면, 바람직하게는 표적물 결합에 관련되지 않는 표면부 상의 또 다른 아미노산을 대체함으로써 도입될 수 있다. 또한, 이러한 추가적인 아미노산 잔기는, 예를 들어, 헥사히스티딜 (His6) 태그, 또는 태그에 특이적인 항체와의 상호작용을 위한 "myc" 태그 또는 "FLAG" 태그와 같은, 폴리펩티드의 정제 또는 검출을 위한 "태그"를 포함할 수 있다. 당업자는 다른 대안을 알고 있을 것이다.
또한, 상기 논의된 "추가적인 아미노산 잔기"는, 예를 들어, 또 다른 결합 기능, 또는 반감기 연장 기능, 또는 효소적 기능, 또는 금속 이온 킬레이트 기능, 또는 형광 기능, 또는 이의 임의의 조합과 같은 임의의 목적하는 기능을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드 도메인으로 구성될 수 있다.
한가지 실시형태에서, 기결정된 표적물에 대해 친화성을 갖는 화합물이 제공되며, 상기 화합물은 하기를 포함한다:
A. 상기 정의된 바와 같은 적어도 하나의 폴리펩티드;
B. 스트렙토코커스 단백질 G의 적어도 하나의 알부민 결합 도메인, 또는 이의 유도체; 및
C. 임의로, 상기 적어도 하나의 알부민 결합 도메인 또는 이의 유도체를 상기 적어도 하나의 폴리펩티드의 C 또는 N 말단에 연결하기 위한 적어도 하나의 연결 모이어티.
스트렙토코커스 단백질 G에 대한 알부민 결합 도메인의 유도체의 비제한적인 예가 WO2009/016043 및 WO2012/004384에서 개시된다.
또한, 추가의 실시형태에서, 하기 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 상기 정의된 바와 같은 폴리펩티드가 제공된다 :
YAK EX2X3X4AX6X7EIX10 X11LPNLX16X17X18QX20 X21AFIX25X26LX28X29X30 PX32QSX35X36LLX39E AKKLX45X46X47Q AP; 및
FNK EX2X3X4AX6X7EIX10 X11LPNLX16X17X18QX20 X21AFIX25X26LX28X29X30 PX32QSX35X36LLX39E AKKLX45X46X47Q AP.
여기서, 각각의 Xy는 상기와 같이 정의된다(및 y는 상기 i)에 의해 정의되는 폴리펩티드 서열 내의 잔기 X의 아미노산 위치를 나타냄).
일부 실시형태에서, 하기 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 제공된다:
ADNNFNK EX2X3X4AX6X7EIX10 X11LPNLX16X17X18QX20 X21AFIX25X26LX28X29X30 PX32QSX35X36LLX39E AKKLX45X46X47Q APK;
ADNKFNK EX2X3X4AX6X7EIX10 X11LPNLX16X17X18QX20 X21AFIX25X26LX28X29X30 PX32QSX35X36LLX39E AKKLX45X46X47Q APK;
VDNKFNK EX2X3X4AX6X7EIX10 X11LPNLX16X17X18QX20 X21AFIX25X26LX28X29X30 PX32QSX35X36LLX39E AKKLX45X46X47Q APK;
VDAKYAK EX2X3X4AX6X7EIX10 X11LPNLX16X17X18QX20 X21AFIX25X26LX28X29X30 PX32QSX35X36LLX39E AKKLX45X46X47Q APK; 및
AEAKYAK EX2X3X4AX6X7EIX10 X11LPNLX16X17X18QX20 X21AFIX25X26LX28X29X30 PX32QSX35X36LLX39E AKKLX45X46X47Q APK.
여기서, 각각의 Xy는 상기와 같이 정의된다(및 y는 상기 i)에 의해 정의되는 폴리펩티드 서열 내의 잔기 X의 아미노산 위치를 나타냄).
본원에서 개시된 폴리펩티드 변이체는, 예를 들어, 공지된 스캐폴드에 기반하고 소정의 표적물에 대해 친화성을 갖는 Z 변이체 폴리펩티드를 취하고, 선택된 위치에서 부위-특이적 돌연변이를 수행함으로써 표적물 친화성을 지닌, 본 발명에 따른 스캐폴드를 갖는 폴리펩티드를 수득함으로써 생성될 수 있다. 대안적으로, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 당업자에게 공지된 전체 분자의 화학적 합성 또는 다른 분자생물학적 방법을 사용하여 Z 변이체 폴리펩티드의 결합 모티프를 본원에서 개시된 스캐폴드에 접목함으로써 제조될 수 있다.
일례로서, 하기의 공지된 스캐폴드 서열을 포함하고 결합 모티프 [BM]내에서 아미노산 서열에 의해 규명된 결합 특이성을 갖는 최초(original)의 Z 변이체 폴리펩티드:
AEAKYAK-[BM]-DDPSQSSELL SEAKKLNDSQ APK
를 변형하여 본원에서 개시된 바와 같은 폴리펩티드를 제공할 수 있다.
본 발명의 이러한 양태에 대한 다양한 구체적인 실시형태에서, 하기의 폴리펩티드가 제공된다;
AEAKYAK-[BM]-RQPEQSSELL SEAKKLNDSQ APK
AEAKYAK-[BM]-DDPSQSSELL SEAKKLSESQ APK
AEAKYAK-[BM]-DDPSQSSELL SEAKKLESSQ APK
AEAKYAK-[BM]-DDPSQSSELL SEAKKLSDSQ APK
AEAKYAK-[BM]-DDPSQSSELL SEAKKLNESQ APK
AEAKYAK-[BM]-RQPEQSSELL SEAKKLSESQ APK
AEAKYAK-[BM]-RQPEQSSELL SEAKKLESSQ APK
AEAKYAK-[BM]-RQPEQSSELL SEAKKLSDSQ APK
AEAKYAK-[BM]-RQPEQSSELL SEAKKLNSSQ APK
본원에서 개시된 폴리펩티드는, 예를 들어, 질환을 치료, 진단 또는 예방하기 위한 적용과 같은 수많은 적용을 갖는다. 상기 폴리펩티드가 치료적, 진단적 또는 예방적 용도로 사용될 수 있는 질환에 대한 비제한적 목록은 암, 염증성 질환, 자가면역 질환, 감염 질환, 신경학적 질환, 신경퇴행성 질환, 안구 질환, 신장 질환, 폐 질환, 위장관 질환, 심혈관성 질환, 혈액성 질환, 피부과성 질환, 알레르기 등을 포함한다.
따라서, 한가지 실시형태에서, 기결정된 표적물에 대해 친화성을 갖는 폴리펩티드가 제공된다. 보다 구체적인 실시형태에서, 상기 표적물은 HER2, TNFα, EGFR, IGF1R, IgG, PDGFRβ, HER3, C5, FcRn, CAIX, 아밀로이드 β, CD4, IL8, IL6 및 인슐린으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 다른 실시형태에서, 상기 폴리펩티드는 유전공학적, 산업적 및 약제학적 적용, 예를 들어, 분리 기술, 정제 적용에서 친화성 리간드로서 또는 검출제로서 사용할 수 있다. 보다 구체적인 이러한 실시형태에서, 기결정된 표적물은 스트렙토코커스 단백질 G로부터의 알부민 결합 도메인("ABD" 또는 "GA 모듈"), 또는 이의 유도체일 수 있다.
당업자는 기결정된 표적물에 대한 목록이 비제한적인 것으로 간주되며, 다른 본원에서 정의되는 바와 같이 기결정된 표적물에 대해 친화성을 갖는 폴리펩티드가 본 발명의 범위 내에 포함된다는 것을 이해할 것이다.
공지된 스캐폴드에 기반하고 상이한 표적물에 대해 친화성을 갖는 공지된 Z 변이체 폴리펩티드의 비제한적인 예로는, EGF 수용체(WO2007/065635에서 개시됨), HER2 수용체(WO2009/080810에서 개시됨), HER3 수용체(WO2010/056124에서 개시됨), IGF1 수용체(WO2009/019117에서 개시됨), PDGF 수용체 β(WO2009/077175에서 개시됨), 알부민 결합 도메인(ABD) (WO2014/064237에서 개시됨), 신생아 Fc 수용체(FcRn) (PCT/EP2014/055299에서 개시됨) 및 탄산 탈수 효소 IX(WO2014/096163에서 개시됨)에 대해 친화성을 갖는 Z 변이체가 있다. 명확하게는, 본 발명에서 Z 변이체의 결합 모티프 [BM]은 상기 언급된 문헌에서 개시된 이러한 결합 모티프의 맨 처음 28개 아미노산 잔기에 해당하고, 여기서 결합 모티프는 29개 아미노산 잔기이고 상기 서열 i)의 위치 1 내지 29에 해당하는 위치에서의 아미노산 잔기에 해당한다는 것을 유의해야 한다.
한가지 실시형태에서, 기결정된 표적물에 대해 친화성을 갖고, 예를 들어, 형광 염료 및 금속, 발색단 염료, 화학발광성 화합물 및 생물발광성 단백질, 효소, 방사성 핵종 및 입자로 이루어진 그룹 중에서 선택된 표지와 같은 표지를 추가로 포함하는 폴리펩티드가 제공된다. 이러한 표지는, 예를 들어, 폴리펩티드의 검출에 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 목적하는 생물학적 활성을 갖는 제2 모이어티를 또한 포함하는 융합 폴리펩티드 또는 접합체 중에 모이어티로서 존재한다. 이러한 목적하는 생물학적 활성의 비제한적인 예로는 치료적 활성, 결합 활성 및 효소적 활성을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 모이어티는 표지를 추가로 포함한다. 일부 예에서 표지는 기결정된 표적물에 대해 친화성을 갖는 폴리펩티드에만 커플링하고, 일부 예에서는 기결정된 표적물에 대해 친화성을 갖는 폴리펩티드 및 접합체 또는 융합 폴리펩티드의 제2 모이어티 모두에 커플링할 수 있다. 또한, 표지는 오직 제2 모이어티에만 커플링하며, 기결정된 표적물에 대해 친화성을 갖는 폴리펩티드에는 커플링하지 않을 수 있다. 또한, 또 다른 실시형태에서, 제2 모이어티를 포함하는 기결정된 표적물에 대해 친화성을 갖는 폴리펩티드가 제공되며, 여기서 상기 표지는 제2 모이어티에만 커플링된다.
본원에서 개시된 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드는 검출제, 포획제, 분리제(separation reagent), 생체 내 또는 시험관 내 진단을 위한 진단제, 또는 치료제로서 사용할 수 있다. 시험관 내에서 본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드를 사용하는 방법은, 예를 들어, 마이크로역가판에서, 단백질 검정에서, 바이오센서 표면 상에서, 조직 절편 상에서 등의 상이한 형식으로 수행된다.
본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드가, 그 자체로 치료, 진단 또는 예후 제제로서 유용하거나, 예를 들어, 상기 표적물에 대해 직접적 또는 간접적 효과를 갖는 다른 치료, 진단 또는 예후 제제를 표적화하기 위한 수단으로서 유용할 수 있는 것으로 이해되어야 할 것이다. 직접적인 치료 효과는, 예를 들어, 상기 표적물에 의해 신호화를 억제함으로써 달성될 수 있다. 상기 표적물은 또한 유용한 마커로 사용되어 특정 질환(예: 상기 기재된 질환)의 예후를 예측할 수 있다.
또한, 한가지 실시형태에서, 치료에 사용하거나 진단제로서 사용하기 위한 본원에서 기재되는 바와 같은 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드가 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 상기 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드는 치료제를 추가로 포함한다. 이러한 치료제의 비제한적인 예로는, 상기 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드의 효과를 강화시키는 치료제, 상기 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드와 시너지 작용을 하는 치료제, 및 치료될 질환의 상이한 양태에 영향을 미치는 치료제가 있다. 또한, 본원에서 개시된 바와 같은 폴리펩티드를 단독으로, 또는 추가로 치료제를 함께 포함하는 약제학적 조성물도 가능하다.
본 발명의 제2 양태에서, 본원에서 기재되는 바와 같은 폴리펩티드 또한 융합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 또한, 본원에는, 이러한 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 것을 포함하는 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드의 생산방법; 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터; 및 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포가 포함된다.
본 발명의 제3 양태에 있어서, 공지된 스캐폴드에 기반하는 폴리펩티드 변이체 군이 제공되며, 상기 군 내의 각 폴리펩티드는 하기 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다:
i) EX2X3X4AX6X7EIX10 X11LPNLX16X17X18QX20 X21AFIX25X26LX28X29X30 PX32QSX35X36LLX39E AKKLX45X46X47Q;
ii) i)에서 정의된 서열과 적어도 91 % 동일성을 갖고, 단 X45가 N일 때 X46은 D가 아닌, 아미노산 서열.
여기서, 각각의 X2, X3, X4, X6, X7, X10, X11, X17, X18, X20, X21, X25 및 X28은 독립적으로 임의의 아미노산 잔기에 해당하고;
서로 독립적으로,
X16은 N 및 T 중에서 선택되고;
X26은 K 및 S 중에서 선택되고;
X29X30PX32는 DDPS 및 RQPE 중에서 선택되고;
X35는 A 및 S 중에서 선택되고;
X36은 E 및 N 중에서 선택되고;
X39는 A, C 및 S 중에서 선택되고;
X45는 E, N 및 S 중에서 선택되고;
X46은 D, E 및 S 중에서 선택되고, 단 X45가 N일 때 X46은 D가 아니고;
X47은 A 및 S 중에서 선택된다.
상기 서열 i)에서, 각각의 X2, X3, X4, X6, X7, X10, X11, X17, X18, X20, X21, X25 및 X28는 각각 상기 군 내에서 달라지는 아미노산 잔기에 해당한다. 또한, 각각의 이러한 아미노산 잔기는 서열 내에서 Xy로 지정된 임의의 다른 잔기의 정체와는 별개인 임의의 아미노산 잔기일 수 있으며, 이는 본 발명의 제1 양태에 관하여 상기 설명된 바와 같다. 폴리펩티드 군 내의 특정한 아미노산 잔기 Xy 및 서열 i) 또는 ii)의 말단에의 임의의 추가적인 아미노산 잔기에 대한 비제한적인 옵션은 본 발명의 제1 양태의 실시형태로서 상기 기재된 것과 동일하다.
상기 논의된 바와 같이, 상기의 아미노산 서열과 비교하여 3차 구조 및 이의 기능에 크게 영향을 끼치지 않으면서 미미한 변화를 포함하는 폴리펩티드 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다. 따라서, 공지된 스캐폴드에 기반하는 폴리펩티드 변이체 군 또한 본 발명에 포함되며, 여기서 상기 군 내의 각 폴리펩티드는 i)에 정의된 바와 같은 서열과 91 % 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부의 실시형태에서, 각 폴리펩티드는 i)에서 정의되는 바와 같은 서열과 적어도 93%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 97% 동일한 서열을 포함할 수 있다.
본원에서 정의되는 군은 상기 정의된 폴리펩티드 분자의 다수의 독특한 상이한 변이체로 구성된다. 이러한 맥락에서, 다수란, 예를 들어, 상기 군이 적어도 1 x 104개의 독특한 폴리펩티드 분자, 또는 적어도 1 x 106개, 적어도 1 x 108개, 적어도 1 x 1010개, 적어도 1 x 1012개, 또는 적어도 1 x 1014개의 독특한 폴리펩티드 분자를 포함한다는 것을 의미할 수 있다. 당업자는 목적하는 크기의 군을 제공하기에 충분히 큰 그룹을 사용하는 것이 필요하다는 것을 이해할 것이다. 본원에서 기재되는 "군"은 또한 "라이브러리"로 지정될 수 있다.
당업자는 본원에서 개시된 바와 같은 군이 i)에서 정의된 폴리펩티드에 기반한 새로운 결합 분자의 선별을 위한 라이브러리로서 유용할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 결합 분자가 무작위화된 폴리펩티드 군(또는 라이브러리)으로부터 단리될 수 있다는 것이 종래 분야에 널리 공지되어 있다. 이러한 기술이 PCT 공보 WO95/19374, 문헌[참조: Nord et al (1997) Nature Biotechnology 15:772-777] 및 공보 WO2009/080811에 기재되어 있고, 이러한 기술은, 13개의 상이한 표적물 결합 위치의 무작위적 변이에 이어서 파지 디스플레이 내에서의 관심있는 결합체의 선별 또는 유전자형-표현형 커플링에 기반하는 다른 선별 시스템을 통하여, 다양한 표적물 분자에 대해 공지된 Z 도메인 스캐폴드에 기반한 결합 분자를 선별하기 위하여 성공적으로 적용되었다. 본원에서 개시되는 바와 같은 군은, 종래 기술에서의 군과 비교하여 개선된 특성(특히, 안정성)을 나타내는 폴리펩티드 변이체 군이다. 무작위화된 폴리펩티드의 군(또는 라이브러리)으로부터 단리된 Z 변이체의 예로 EGF 수용체(WO2007/065635에서 개시됨), HER2 수용체(WO2009/080810에서 개시됨), HER3 수용체(WO2010/056124에서 개시됨), IGF1 수용체(WO2009/019117에서 개시됨), PDGF 수용체 β(WO2009/077175에서 개시됨), ABD(WO2014/064237에서 개시됨), 신생아 Fc 수용체(FcRn) (PCT/EP2014/055299에서 개시됨) 및 탄산 탈수 효소 IX(WO2014/096163에서 개시됨)에 대해 친화성을 갖는 Z 변이체를 포함한다.
본 발명의 제4 양태에 있어서, 폴리뉴클레오티드의 군이 제공된다. 이러한 군 내의 각각의 폴리뉴클레오티드는 제3 양태에 관하여 상기 설명된 바와 같은 폴리펩티드 군의 구성원을 코딩한다.
본 발명의 제5 양태에서, 제3 양태에 따른 폴리펩티드 군과 제4 양태에 따른 폴리뉴클레오티드 군의 배합물이 제공되며, 상기 배합물에서, 폴리펩티드 군의 각 구성원은 유전자형-표현형 커플링을 위한 수단을 통해 그 구성원을 코딩하는 상응하는 폴리뉴클레오티드와 물리적으로 또는 공간적으로(spatially) 연합된다. 이러한 물리적 또는 공간적 연합은 사용되는 시스템에 의존하여 다소 제한적일 것이다.
유전자형-표현형 커플링을 위한 수단은 파지 디스플레이 시스템을 포함할 수 있다. 파지 디스플레이 시스템은 당업자에게 잘 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[참조: Smith GP (1985) Science 228:1315-1317 및 Barbas CF et al (1991) Proc Natl Acad Sci U S A 88:7978-7982]에 기재된다.
또한, 유전자형-표현형 커플링을 위한 수단은 세포 표면 디스플레이 시스템을 포함할 수 있다. 세포 표면 디스플레이 시스템은 그람-양성 세포와 같은 원핵 세포, 또는 효모 세포와 같은 진핵 세포를 포함할 수 있다. 세포 표면 디스플레이 시스템은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 원핵성 시스템은, 예를 들어, 문헌[참조: Francisco JA et al (1993) Proc Natl Acad Sci U S A 90:10444-10448 및 Lee SY et al (2003) Trends Biotechnol 21:45-52]에 기재되어 있다. 진핵성 시스템은, 예를 들어, 문헌[참조: Boder ET et al (1997) Nat Biotechnol 15:553-557 및 Gai SA et al (2007) Curr Opin Struct Biol 17:467-473]에 기재되어 있다. 한가지 실시형태에서, 상기 유전자형-표현형 커플링은 파지 디스플레이 시스템을 포함할 수 있다.
또한, 유전자형-표현형 커플링을 위한 수단은 세포 유리(free) 디스플레이 시스템을 포함할 수 있다. 세포 유리 디스플레이 시스템은 리보솜 디스플레이 시스템, 또는 시험관 내 구역화(compartmentalization) 디스플레이 시스템, 또는 시스 디스플레이를 위한 시스템, 또는 마이크로비드 디스플레이 시스템을 포함할 수 있다. 리보솜 디스플레이 시스템은 당업자에게 잘 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[참조: Mattheakis LC et al (1994) Proc Natl Acad Sci U S A 91:9022-9026 및 Zahnd C et al (2007) Nat Methods 4:269-279]에 기재되어 있다. 시험관 내 구역화 시스템은 당업자에게 잘 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[참조: Sepp A et al (2002) FEBS Lett 532:455-458]에 기재되어 있다. 시스 디스플레이 시스템은 당업자에게 잘 공지되어 있고, 에를 들어 문헌[참조: Odegrip R et al (2004) Proc Natl Acad Sci U S A 101:2806-2810]에 기재되어 있다. 마이크로비드 디스플레이 시스템은 당업자에게 잘 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[참조: Nord O et al (2003) J Biotechnol 106:1-13]에 기재되어 있다.
또한, 유전자형-표현형 커플링을 위한 수단은 단백질-단편 상보성 검정(PCA)와 같은 비-디스플레이 시스템을 포함할 수 있다. PCA 시스템은 당업자에게 잘 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[참조: Koch H et al (2006) J Mol Biol 357:427-441]에 기재되어 있다.
본 발명의 제6 양태에 있어서, 폴리펩티드 군으로부터 기결정된 표적물에 대해 친화성을 갖는 목적하는 폴리펩티드를 선별하기 위한 방법이 제공되며, 이는 하기의 단계를 포함한다:
(a) 제3 양태에 따른 폴리펩티드 군을 제공하는 단계;
(b) 표적물과 표적물에 대해 친화성을 갖는 적어도 하나의 목적하는 폴리펩티드 간의 특이적인 상호작용을 가능하게 하는 조건하에서, 폴리펩티드 군을 기결정된 표적물과 접촉시키는 단계; 및
(c) 상기 특이적인 상호작용에 기반하여, 남아있는(remaining) 폴리펩티드 군으로부터 적어도 하나의 목적하는 폴리펩티드를 선별하는 단계.
하기에서, 이러한 방법을 본 발명에 따른 "선별 방법"이라 칭한다.
단계 (a)는, 폴리뉴클레오티드 군을 제공하고 상기 폴리뉴클레오티드 군을 발현시켜 상기 폴리펩티드 군을 수득하는 제조 단계를 포함할 수 있다. 폴리펩티드 군을 수득하기 위한 수단은 사용되는 디스플레이 시스템에 따라 다양하며, 이러한 수단의 예는 상기 유전자형-표현형 참고 문헌에서 찾을 수 있다. 선별 방법에 사용되는 상기 폴리펩티드 군의 각각의 그 구성원은 유전자형-표현형 커플링을 위한 수단을 통해 구성원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 물리적으로 연합될 수 있다. 유전자형-표현형 커플링을 위한 수단은 상기 논의된 것 중 하나일 수 있다.
단계 (b)는 표적물과 표적물에 대해 친화성을 갖는 적어도 하나의 목적하는 폴리펩티드 간의 특이적인 상호작용을 가능하게 하는 조건하에서, 폴리펩티드 군을 기결정된 표적물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 적용 가능한 조건의 범위는 표적물의 강건함(robustness), 디스플레이 시스템의 강건함으로, 및 표적물과의 상호작용에 대한 목적하는 특성으로 결정된다. 예를 들어, 기결정된 pH로의 산성화와 같은 상호작용을 분리하는 특정한 방법이 요구될 수 있다. 당업자는 적절한 조건을 결정하기 위하여 어떠한 실험이 요구되는지 알고 있을 것이다.
단계 (c)는 적어도 하나의 폴리펩티드에 대한 선별을 포함한다. 기결정된 표적물과 표적물에 대해 친화성을 갖는 적어도 하나의 목적하는 폴리펩티드 간의 특이적인 상호작용에 기반하는, 남아있는 군으로부터 목적하는 폴리펩티드를 선별하기 위한 수단은 사용되는 디스플레이 시스템에 따라 다양하며, 상기 유전자형-표현형 참고 문헌에서 찾을 수 있다. 예를 들어, 시험관 내 디스플레이 선별 시스템은 파지 디스플레이 및 단백질 단편 구역화 검정과 같은 시스템과는 대조적으로 세포 유리성(cell free)이다.
본 발명의 제7 양태에 있어서, 기결정된 표적물에 대해 친화성을 갖는 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 단리하기 위한 방법이 제공되며, 이는 하기의 단계를 포함한다:
- 제6 양태에 따른 선별 방법을 사용하여 폴리펩티드 군으로부터 상기 목적하는 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 선별하는 단계; 및
- 이에 따라 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 단리하는 단계.
하기에서, 이러한 방법을 본 발명에 따른 "단리 방법"이라 칭한다.
폴리펩티드로부터의 폴리뉴클레오티드의 분리는 선별을 위해 사용되는 디스플레이 시스템에 따라 상이하게 수행될 수 있다. 예를 들어, 시스 디스플레이 및 리보솜 디스플레이와 같은 세포 유리 디스플레이 시스템에서, 폴리뉴클레오티드 또는 상응하는 mRNA는 상기 유전자형-표현형 참고문헌에서 기재된 수단을 사용하여 폴리펩티드로부터 효율적인 용출법을 통하여 검색된다.
폴리뉴클레오티드의 단리는 선별에 사용되는 디스플레이 시스템에 따라 상이한 방법으로 수행될 수 있다. 대부분의 상기 기재된 선별 시스템(예: 단백질 단편 구역화 검정)에서, 폴리뉴클레오티드는 적절한 올리고뉴클레오티드를 사용하는 특이적 PCR 증폭에 의해 직접적으로 단리될 수 있다. 또한, 리보솜 디스플레이에서와 같이, 폴리뉴클레오티드는 역전사를 사용하여 상응하는 mRNA로부터 단리될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 단리를 위한 다양한 수단은 상기 유전자형-표현형 참고 문헌에서 찾아볼 수 있다.
본 발명의 제8 양태에 있어서, 기결정된 표적물에 대해 친화성을 갖는 목적하는 폴리펩티드를 동정하기 위한 방법이 제공되며, 이는 하기의 단계를 포함한다:
- 제7 양태에 따른 단리 방법을 사용하여 상기 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 단리하는 단계; 및
- 폴리뉴클레오티드를 시퀀싱하여 상기 목적하는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 연역에 의해 규정(establish)하는 단계.
폴리뉴클레오티드의 시퀀싱은 당업자에게 잘 공지된 표준 절차에 따라 수행될 수 있다.
본 발명의 제9 양태에 있어서, 폴리펩티드 군으로부터 기결정된 표적물에 대해 친화성을 갖는 목적하는 폴리펩티드를 선별 및 동정하기 위한 방법이 제공되며, 이는 하기의 단계를 포함한다:
(a) 별도의 캐리어 또는 비드 상에 제3 양태에 따른 폴리펩티드 군의 각 구성원을 합성하는 단계;
(b) 폴리펩티드와 기결정된 표적물과의 상호작용에 기반하여 캐리어 또는 비드를 선별하거나 농축시키는 단계; 및
(c) 단백질 특성화 절차(methodology)에 의해 폴리펩티드를 동정하는 단계.
단계 (c)에서, 예를 들어, 질량 분광계 분석을 사용하는 것이 가능하다.
하기에서, 이러한 방법을 본 발명에 따른 "선별 및 동정 방법"이라 칭한다.
본 발명의 제10 양태에 있어서, 기결정된 표적물에 대해 친화성을 갖는 목적하는 폴리펩티드를 생산하기 위한 방법이 제공되며, 이는 하기의 단계를 포함한다:
- 제6 양태에 따른 선별 방법 또는 제9 양태에 따른 선별 및 동정 방법을 사용하여 목적하는 폴리펩티드를 선별 및 동정하는 단계; 및
- 상기 목적하는 폴리펩티드를 생산하는 단계.
하기에서, 이러한 방법을 본 발명에 따른 "생산 방법"이라 칭한다.
생산 방법에 있어서, 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 재조합 발현을 사용하여 생산을 수행할 수 있다. 생산은 또한 목적하는 폴리펩티드의 드노보(de novo) 화학적 합성을 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 제11 양태에 있어서, 기결정된 표적물에 대해 친화성을 갖는 목적하는 폴리펩티드를 생산하기 위한 방법이 제공되며, 이는 하기의 단계를 포함한다:
(a1) 제7 양태에 따른 단리 방법을 사용하여 상기 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 단리하는 단계; 또는
(a2) 제9 양태에 따른 선별 및 동정 방법을 사용하여 동정된 폴리펩티드를 역번역(backtracslating)하는 단계; 및
(b) 이에 따라 단리된 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 상기 목적하는 폴리펩티드를 생산하는 단계,
여기서 단계 (b)는 단계 (a1) 또는 단계 (a2) 이후에 수행된다.
본 발명에 따른 폴리펩티드, 군 및 방법은, 기결정된 표적물에 대해 특이적으로 결합으로 특징지어지는 폴리펩티드의 제공을 통해, 기결정된 표적물에 대해 친화성을 갖는 제제의 제공을 가능하게 한다.
또한, 비특이적 결합을 거의 나타내지 않거나 나타내지 않는 기결정된 표적물에 결합하는 폴리펩티드를 제공하는 것이 가능하다.
또한, 융합 폴리펩티드 내의 모이어티로서 용이하게 사용될 수 있는 기결정된 표적물에 결합하는 폴리펩티드를 제공하는 것이 가능하다.
또한, 기존의 항체 시약으로 경험된 하나 이상의 공지된 문제를 해결하는 기결정된 표적물에 결합하는 폴리펩티드를 제공하는 것이 가능하다.
게다가, 치료적 및/또는 진단적 적용에 사용될 수 있는 기결정된 표적물에 결합하는 폴리펩티드를 제공하는 것이 가능하다.
또한, 화학적 펩티드 합성으로 용이하게 제조되는 기결정된 표적물에 결합하는 폴리펩티드를 제공하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명은, 동일한 표적물에 결합하는 공지된 제제에 비해 개선된 안정성을 나타내는 기결정된 표적물에 결합하는 폴리펩티드의 동정을 가능하게 한다.
포유동물에서 생체 내 사용시 낮은 항원성을 나타내고/나타내거나 포유동물에 투여시 개선된 생체분포(biodistribution)를 나타내는 기결정된 표적물에 결합하는 폴리펩티드를 제공하는 것 또한 가능하다.
본 발명에 따른 군을 구성하는 폴리펩티드에 대한 상기 논의된 변형을 또한 임의의 상기 언급된 방법으로 수득된 폴리펩티드에도 적용할 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드는 임의의 공지된 수단으로 생산될 수 있으며, 이는 박테리아 세포, 효모 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 모든 식물 및 유전자삽입 동물과 같은 상이한 원핵 또는 진핵 숙주에서의 화학적 합성 또는 발현을 포함한다.
본원에서 개시된 폴리펩티드, 폴리펩티드군 및 동정, 선별, 단리 및 생산 방법이 다양한 예시적 양태 및 실시형태를 참조하여 기재되었으나, 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 다양한 변경이 이뤄질 수 있고 등가물이 이의 요소로 치환될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 이외에도, 본 발명의 필수적인 범위를 벗어나지 않는 교시에 따른 특정한 상황 또는 분자를 적응시키기 위하여 많은 변형이 수행될 수 있다. 따라서, 본 발명은 임의의 특정 실시형태로 제한되지 않으나, 첨부된 청구 범위 내에 있는 모든 실시예를 포함하지는 않는 것으로 의도된다.
도 1은 본원에서 개시되는 바와 같은 예시적 폴리펩티드의 아미노산 서열의 목록이다. 실시예 2 및 3에 나타난 개선된 안정성을 갖는 C5 결합 Z 변이체 폴리펩티드의 서열이 서열 번호 12, 17, 18 및 22로서 도 1에 기재되고, 본원에서 정의된 가장 짧은 서열에 해당하는 이의 서열이 서열 번호 19 내지 21로서 기재된다. 알부민 결합 도메인에 융합된 C5 결합 폴리펩티드의 아미노산 서열이 서열 식별자(identifier) 서열 번호 4 내지 11, 13 내지 16 및 23 내지 25와 함께 도 1에 기재된다. 개선된 안정성을 갖는 실시예 12에 나타난 HER2, PDGF-Rβ, FcRn 및 CAIX에 대해 친화성을 갖는 Z 변이체 폴리펩티드의 서열이 상응하는 조절 폴리펩티드 서열 번호 27, 30, 33 및 36과 함께, 서열 번호 28 내지 29, 서열 번호 31 내지 32, 서열 번호 34 내지 35 및 서열 번호 37 내지 42로서 기재된다. 본원에서 정의된 가장 짧은 서열에 해당하는 HER2, PDGF-Rβ, FcRn 및 CAIX에 대해 친화성을 갖는 상기 Z 변이체 폴리펩티드의 서열이 서열 번호 43 내지 54로서 기재된다. 추가적으로, 조절 C5 결합 폴리펩티드, 알부민에 융합된 조절 C5 결합 폴리펩티드, 알부민 결합 도메인 및 인간 C5의 아미노산 서열이 각각 서열 번호 26, 1, 2, 및 3으로 기재된다.
도 2는 SDS-PAGE 겔의 이미지이고, 여기서 제1 레인은 SeeBlue 2P 사이즈 마커를 포함하고, 밴드는 안정성 시험 이전 (0); 및 2주 동안의 안정성 시험 이후 (2w)의 C5 결합 폴리펩티드 PSI0242(서열 번호 1)를 나타낸다.
도 3은 안정성 시험 이전 (실선) 및 2주 동안의 안정성 시험 이후 (점선)의 PSI0242(서열 번호 1)에 대한 역상 HPLC로부터의 크로마토그램이다.
도 4는 SDS-PAGE 겔의 이미지이고, 여기서 제1 레인은 SeeBlue 2P 사이즈 마커를 포함하고, 밴드는 초기 샘플 (0); 및 2주 동안의 안정성 시험 이후 (2w)의 샘플을 나타낸다. A: 서열 번호 1; B: 서열 번호 13; 서열 번호 14; D: 서열 번호 16.
도 5는 안정성 시험 이전 (실선) 및 2주 동안의 안정성 시험 이후 (점선)의 변형된 C5 억제자(서열 번호 5)에 대한 역상 HPLC로부터의 크로마토그램이다.
도 6는 안정성 시험 이전 (실선) 및 2주 동안의 안정성 시험 이후 (점선)의 변형된 C5 억제자(서열 번호 16)에 대한 역상 HPLC로부터의 크로마토그램이다.
도 7은 A: Z17351(서열 번호 37); B: Z17352(서열 번호 38); C: Z17355(서열 번호 39); D: Z17357(서열 번호 40); E: Z17359(서열 번호 41); F: Z17360(서열 번호 42); 및 G: Z09782(서열 번호 36)에 대해 수집된 CD 스펙트럼이다.
도 8은 안정성 시험 이전 (0) 및 2주 동안의 안정성 시험 이후 (2w)의 최초(original) 폴리펩티드 및 발명(inventive) 폴리펩티드를 나타내는 SDS-PAGE 겔의 이미지이다. A: HER2 표적화 폴리펩티드: 레인 1: Mw, 레인 2: Z02891(0), 레인 3:Z02891(2w), 레인 4: Mw, 레인 5: Z17341(0), 레인 6: Z17341(2w), 레인 7: Z17342(0), 레인 8: Z17342(2w); B: PDGF-Rβ 표적화 폴리펩티드: 레인 1: Mw, 레인 2: Z15805(0), 레인 3:Z15805(2w), 레인 4: Mw, 레인 5: Z17343(0), 레인 6: Z17343(2w), 레인 7: Z17344(0), 레인 8: Z17344(2w); C: FcRn 표적화 폴리펩티드: 레인 1: Z10103(0), 레인 2:Z10103(2w), 레인 3: Mw, 레인 4: Z17347(0), 레인 5: Z17347(2w), 레인 6: Z17348(0), 레인 7: Z17348(2w); 및 D: CAIX 표적화 폴리펩티드: 레인 1:Mw, 레인 2: Z09782(0), 레인 3:Z09782(2w), 레인 4: Mw, 레인 5: Z17351(0), 레인 6: Z17351(2w), 레인 7: Z17352(0), 레인 8: Z17352(2w); 레인 9: Z17355(0), 레인 10: Z17355(2w), 레인 11: Z17357(0), 레인 12: Z17357(2w), 레인 13: Z17359(0), 레인 14: Z17359(2w), 레인 15: Z17360(0), 레인 16: Z17360(2w). 분자 사이즈 마커(Mw)는 Novex® Sharp 예비-염색된(pre-stained) 단백질 표준물(216, 160, 110, 80, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 3.5 kDa) 이다. (도 8c에서 보여지는 대각선 밴드는 동일한 컨테이너 내에서 염색된 제2 겔로부터의 흔적에 기인한 부산물이다).
도 9는 2주 동안의 안정성 시험 후, 동일한 표적물에 대해 친화성을 갖는 위치 52 내지 53에서 아미노산 치환 ND 내지 SE을 포함하는 Z 변이체(검정색) 및 기존의 Z 변이체(회색)의 결합에 대한 센서그램을 도시한다. A: Z017341(서열 번호 28) 및 Z02891(서열 번호 27)의 HER2로의 결합; B: Z017343(서열 번호 31) 및 Z15805(서열 번호 30)의 PDGF-Rβ로의 결합; C: Z017347(서열 번호 34) 및 Z10130(서열 번호 33)의 FcRn로의 결합 및 D: Z017351(서열 번호 37) 및 Z09782(서열 번호 36)의 CAIX로의 결합. 각각의 Z 변이체의 주입된 농도를 실시예 13에 기재하였다.
도 2는 SDS-PAGE 겔의 이미지이고, 여기서 제1 레인은 SeeBlue 2P 사이즈 마커를 포함하고, 밴드는 안정성 시험 이전 (0); 및 2주 동안의 안정성 시험 이후 (2w)의 C5 결합 폴리펩티드 PSI0242(서열 번호 1)를 나타낸다.
도 3은 안정성 시험 이전 (실선) 및 2주 동안의 안정성 시험 이후 (점선)의 PSI0242(서열 번호 1)에 대한 역상 HPLC로부터의 크로마토그램이다.
도 4는 SDS-PAGE 겔의 이미지이고, 여기서 제1 레인은 SeeBlue 2P 사이즈 마커를 포함하고, 밴드는 초기 샘플 (0); 및 2주 동안의 안정성 시험 이후 (2w)의 샘플을 나타낸다. A: 서열 번호 1; B: 서열 번호 13; 서열 번호 14; D: 서열 번호 16.
도 5는 안정성 시험 이전 (실선) 및 2주 동안의 안정성 시험 이후 (점선)의 변형된 C5 억제자(서열 번호 5)에 대한 역상 HPLC로부터의 크로마토그램이다.
도 6는 안정성 시험 이전 (실선) 및 2주 동안의 안정성 시험 이후 (점선)의 변형된 C5 억제자(서열 번호 16)에 대한 역상 HPLC로부터의 크로마토그램이다.
도 7은 A: Z17351(서열 번호 37); B: Z17352(서열 번호 38); C: Z17355(서열 번호 39); D: Z17357(서열 번호 40); E: Z17359(서열 번호 41); F: Z17360(서열 번호 42); 및 G: Z09782(서열 번호 36)에 대해 수집된 CD 스펙트럼이다.
도 8은 안정성 시험 이전 (0) 및 2주 동안의 안정성 시험 이후 (2w)의 최초(original) 폴리펩티드 및 발명(inventive) 폴리펩티드를 나타내는 SDS-PAGE 겔의 이미지이다. A: HER2 표적화 폴리펩티드: 레인 1: Mw, 레인 2: Z02891(0), 레인 3:Z02891(2w), 레인 4: Mw, 레인 5: Z17341(0), 레인 6: Z17341(2w), 레인 7: Z17342(0), 레인 8: Z17342(2w); B: PDGF-Rβ 표적화 폴리펩티드: 레인 1: Mw, 레인 2: Z15805(0), 레인 3:Z15805(2w), 레인 4: Mw, 레인 5: Z17343(0), 레인 6: Z17343(2w), 레인 7: Z17344(0), 레인 8: Z17344(2w); C: FcRn 표적화 폴리펩티드: 레인 1: Z10103(0), 레인 2:Z10103(2w), 레인 3: Mw, 레인 4: Z17347(0), 레인 5: Z17347(2w), 레인 6: Z17348(0), 레인 7: Z17348(2w); 및 D: CAIX 표적화 폴리펩티드: 레인 1:Mw, 레인 2: Z09782(0), 레인 3:Z09782(2w), 레인 4: Mw, 레인 5: Z17351(0), 레인 6: Z17351(2w), 레인 7: Z17352(0), 레인 8: Z17352(2w); 레인 9: Z17355(0), 레인 10: Z17355(2w), 레인 11: Z17357(0), 레인 12: Z17357(2w), 레인 13: Z17359(0), 레인 14: Z17359(2w), 레인 15: Z17360(0), 레인 16: Z17360(2w). 분자 사이즈 마커(Mw)는 Novex® Sharp 예비-염색된(pre-stained) 단백질 표준물(216, 160, 110, 80, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 3.5 kDa) 이다. (도 8c에서 보여지는 대각선 밴드는 동일한 컨테이너 내에서 염색된 제2 겔로부터의 흔적에 기인한 부산물이다).
도 9는 2주 동안의 안정성 시험 후, 동일한 표적물에 대해 친화성을 갖는 위치 52 내지 53에서 아미노산 치환 ND 내지 SE을 포함하는 Z 변이체(검정색) 및 기존의 Z 변이체(회색)의 결합에 대한 센서그램을 도시한다. A: Z017341(서열 번호 28) 및 Z02891(서열 번호 27)의 HER2로의 결합; B: Z017343(서열 번호 31) 및 Z15805(서열 번호 30)의 PDGF-Rβ로의 결합; C: Z017347(서열 번호 34) 및 Z10130(서열 번호 33)의 FcRn로의 결합 및 D: Z017351(서열 번호 37) 및 Z09782(서열 번호 36)의 CAIX로의 결합. 각각의 Z 변이체의 주입된 농도를 실시예 13에 기재하였다.
실시예
하기의 실시예는 개선된 안정성을 나타내는 신규 Z 변이체 폴리펩티드를 개시한다. 본원에서, 이전 세대의 스캐폴드에 기반하는 Z 변이체 폴리펩티드의 특성을 본원에서 기재된 스캐폴드에 기반하는 Z 변이체 폴리펩티드와 비교하였다.
비교
실시예
1
공지된 C5 결합 Z
변이체의
안정성 시험
PSI0242(서열 번호 1)로 명칭된 C5 결합 Z 변이체를 25 mM NaP /125 mM NaCl pH 7.0에서 제조하고 37°C에서 2주 동안 가속 안정성 연구(accelerated stability study)를 실시하였다. SDS-PAGE 및 역상 HPLC(RPC)로 안정성을 시험한 후 새로운 변이체의 출현에 의해 안정성을 측정하였다. 이 두 분석에서, 초기 샘플 및 안정성 연구가 실시된 샘플은 병렬로 수행되었다. SDS-PAGE 동안, 각 웰에 7.5 ㎍의 단백질을 로딩하였다. 물 중의 0.1 % 트리플루오로아세트산(TFA)을 포함하는 이동상 A, 및 0.1% TFA / 45 % MeOH / 45 % 이소프로필아민(IPA) / 10 % 물을 포함하는 이동상 B를 사용하여 애질런트(Agilent) 1100 HPLC 상에서 RPC를 수행하였다.
그 결과는, 항온처리 동안 SDS-PAGE에서의 밴드(도 2) 및 역상 HPLC(RPC) 크로마토그램에서의 새로운 피크(도 3)로 시각화되는 새로운 형태의 단백질이 형성되었다는 것을 나타낸다. 도 3에서, 2주 동안의 항온처리 후의 메인 피크는 최초 단백질 샘플의 57 %에 상응한다.
서열 번호 1의 위치 1 내지 60은 WO2013/126006에서 서열 번호 753로 이전에 개시된, 폴리펩티드 Z06175a에 상응한다.
실시예
2
변형된 C5 결합 폴리펩티드 및 화합물의 안정성 시험
변형된 C5 결합 폴리펩티드 및 화합물을 기본적으로 WO2013/126006에 설명된 바와 같이 합성하고 정제하였다.
간략하게는, C5 결합 Z 변이체를 코딩하는 DNA를 이.콜라이(E. coli) 코돈으로 최적화시키고 GeneArt, GmbH로 합성하였다. 새로운 C5 결합 Z 변이체를 나타내는 합성 유전자를 서브클로닝하고 이.콜라이에 발현시켰다.
통상적인 크로마토그래피 방법을 사용하여 세포내에서 발현된 Z 변이체를 정제하였다. 초음파처리에 이어서 원심분리 및 여과로 분쇄 및 청징화(clarification)를 수행하였다. 포획 단계(capture step)로 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하였다. 소수성 상호작용 크로마토그래피로 추가로 정제하였다. 산성 조건(pH 5.5) 하에서 정제를 수행하였다. 크기 배제 크로마토그래피에 의해 폴리싱(polishing) 및 완충액 교환을 수행하였다.
정제된 단백질을 25 mM NaP /125 mM NaCl pH 7.0에서 제조하고 37°C에서 2주 동안 가속 안정성 연구를 실시하였다. SDS-PAGE 및 역상 HPLC(RPC)로 안정성을 시험한 후 새로운 변이체의 출현으로써 안정성을 측정하였다. 이 두 분석에서, 초기 샘플 및 안정성 연구가 실시된 샘플을 병렬로 수행하였다. SDS-PAGE 동안, 각 웰에 7.5 ㎍의 단백질을 로딩시켰다. 생성되는 겔의 예를 도 4에 도시한다.
물 중의 0.1 % 트리플루오로아세트산(TFA)을 포함하는 이동상 A, 및 0.1% TFA / 45 % MeOH / 45 % 이소프로필아민(IPA) / 10 % 물을 포함하는 이동상 B를 사용하여 애질런트 1100 HPLC 상에서 RPC를 수행하였다. 서열 번호 5에 대하여 생성되는 크로마토그램의 예를 도 5에 도시한다.
안정성 시험의 결과를 표 1에 요약한다.
서열 번호 |
명칭 |
SDS-PAGE 밴드 |
RPC 프리피크 (prepeak) |
메인 피크 (% 총 단백질) |
RPC 포스트피크 (postpeak) |
1 | PSI0242 | 2 | 2 | 57 | 1 |
4 | PSI0332 | 2 | 1 | 57 | 1 |
5 | PSI0334 | 1 | 1 | 73 | 0 |
6 | PSI0335 | 2 | 2 | 57 | 1 |
7 | PSI0336 | 2 | 2 | 57 | 1 |
8 | PSI0337 | 2 | 2 | 57 | 1 |
9 | PSI0339 | 2 | 2 | 57 | 1 |
10 | PSI0340 | 2 | 2 | 67 | 1 |
11 | PSI0369 | 2 | 1 | 90 | 1 |
12 | PSI0377 | 1 | 0 | 77 | 0 |
13 | PSI0378 | 1 | 0 | 89 | 0 |
14 | PSI0379 | 1 | 0 | 88 | 0 |
15 | PSI0381 | 1 | 0 | 87 | 0 |
16 | PSI0383 | 1 | 0 | 91 | 0 |
22 | PSI0400 | 1 | 0 | 91 | 0 |
23 | PSI0410 | 1 | 1 | 72 | 1 |
24 | PSI0403 | 1 | 1 | 77 | 1 |
25 | PSI0404 | 1 | 1 | 88 | 0 |
표 1.
37 ℃에서
2주 동안 항온처리한 후의 Z
변이체
폴리펩티드의 안정성. SDS-PAGE 및
HPLC로부터의
결과를 비교한다.
표 1로부터, 특정 변형된 C5 결합 폴리펩티드 또는 화합물이 PSI0242와 비교하여 개선된 특성(예: 증가된 안정성)을 갖는다는 것을 결론을 내릴 수 있다. 이러한 개선된 C5 결합 폴리펩티드 또는 화합물은 PSI0334 (서열 번호 5), PSI0340 (서열 번호 10), PSI0369 (서열 번호 11), PSI0377 (서열 번호 12), PSI0378 (서열 번호 13), PSI0379 (서열 번호 14), PSI0381 (서열 번호 15), PSI0383 (서열 번호 16), PSI0400 (서열 번호 22), PSI0410 (서열 번호 23), PSI0403 (서열 번호 24) 및 PSI0404 (서열 번호 25)를 포함한다. 상기 변이체 중 6개(서열 번호 5, 12, 13, 14, 16 및 22)는 공통적으로 아미노산 잔기 중 위치 52 내지 53이 ND(cf. PSI0242)에서부터 SE로 치환된다. 서열 번호 15에서, 해당하는 치환은 ND로부터 ES이다. 서열 번호 24에서는, 오직 위치 53에서의 아미노산 잔기만을 D로부터 E로 치환하였고, 서열 번호 25에서, 위치 52의 아미노산 잔기를 N으로부터 S로 치환하였다.
실시예
3
변형된 화합물의 인간
C5에 대한 결합
인간 혈청 알부민을 아민 커플링으로 아민 반응성 제2 세대(AR2G) 딥(Dip) 및 판독 바이오센서(Read Biosensor) (Pall Life sciences (ForteBio) Cat # 18-5092)에 고정시켰다. 판독 완충액[HBS-EP 완충액(10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20), GE Healthcare, cat. no. BR100188] 내의 PSI0242 (서열 번호 1; 1 μM) 및 변형된 C5 결합 화합물을 120초 동안 HSA를 갖는 개별 센서 상에 각각 로딩시키고, 판독 완충액 내에서 60초 동안 기준선(base line)을 기록한 후, 이어서 재생 주기 및 각 농도 간의 기준선 기록과 함께 판독 완충액 내 0.79 내지 25 nM 범위 농도의 인간 C5에 대해 수행하였다. 각 센서에 대한 재생 조건은 10 mM 글리신, pH 2(30초의 3회 펄스 및 60초 동안 러닝 완충액)이었다. C5 결합능이 없는 알부민 결합 도메인(서열 번호 2)을 포함하는 유사 작제물에 대하여 각 스펙트로그램을 기준 제거하였다. 포르테바이오 분석(ForteBio Analysis) 7.1 [Pall Life sciences (ForteBio) kinetics software]을 사용하는 랭뮤어(Langmuir) 1:1 모델에 따라 데이터를 분석하였다.
PSI0242(서열 번호 1)와 C5의 상호작용에 대한 상대적인 KD를 표 2에 도시한다. 상이한 실행에서 PSI0242(서열 번호 1)의 KD는 1 내지 3 nM으로 다양하였다.
표 2에서의 결과는 본 발명에 따른 C5 결합 화합물이 인간 C5에 대하여, WO2013/126006에서 개시된 폴리펩티드 PSI0242(서열 번호 1)의 결합력과 유사한 결합력을 갖는다는 것을 나타낸다.
서열 번호 | 명칭 | 상대적인 KD |
1 | PSI0242 | 1.0 |
5 | PSI0334 | 1.1 |
13 | PSI0378 | 1.3 |
15 | PSI0381 | 23 |
16 | PSI0383 | 2.1 |
표 2. C5의 서열 번호 1과의 상호작용에 대한 K
D
값과 비교된, 서열 번호 5, 13, 15 및 16의 C5와의 상호작용에 대한 K
D
값
실시예
4
화학적으로 합성된 C5 결합 폴리펩티드의 안정성
베이켐 에이지(BACHEM AG)로부터 화학적으로 합성된 PSI0400(서열 번호 22)을 주문하였다. 실시예 2와 동일한 방법에 따라 폴리펩티드의 안정성을 시험하였다. 안정성 시험의 결과를 표 3에 도시한다.
서열 번호 | 명칭 | SDS-PAGE 밴드 |
RPC 프리피크 |
메인 피크 (% 총 단백질) |
RPC 포스트피크 |
22 | PSI0400 | 1 | 0 | 91 | 0 |
표 3. 2주 동안 항온처리한 후의 화학적으로 생산된 C5 결합 폴리펩티드 PSI0400(서열 번호
22)의
안정성
PSI0400의 안정성은 실시예 2에서의 이.콜라이에서 생산된 동일한 폴리펩티드와 필적하였다.
PSI0400(서열 번호 22)에 대한 배율의 통합성은, UV 원평광 이색성(CD) 스펙트럼을 사용하여 실시예 2의 방법에 따라 생산된 재조합 C5 결합 폴리펩티드(PSI0257, 서열 번호 26)와 필적하였다.
J-720 분광편광계(Jasco, Japan)로 CD 스펙트럼을 기록하였다. 파이 완충액(Pi buffer, 5 mM Na-K-PO4, pH 7.0)을 사용하여 샘플을 0.17 mg/ml 단백질 농도로 희석하였다. 먼저, 파이 완충액의 CD 스펙트럼을 기록하고, 이어서 각 샘플에 대해 기록하고 마지막으로 다시 파이 완충액에 대해 기록하였다. 2개의 완충액 스펙스트럼이 동일하기 때문에, 첫번째로 기록한 스펙트럼을 완충액 스펙트럼으로 사용하였다. 폭 25의 컨볼루션(convolution)을 갖는 사비츠키-골레이(Savitzky-Golay) 과정을 사용하여 완충액 스펙트럼을 평탄화(smoothen)하였다. 다른 스펙트럼도 폭 15의 컨볼루션을 갖는 동일한 과정에 따라 평탄화하였다. 이어서 각각의 다른 평탄화된 스펙트럼으로부터 평탄화된 완충액 스펙트럼을 제거하였다. 단백질의 2차 함량을 추정하기 위하여 CDNN 프로그램을 사용하고 추정 결과를 표 4에 나타냈다. 결과는, 위치 52 및 53에서의 2개 아미노산 치환 또는 화학적 합성에 의한 폴리펩티드 생산 어느 것도 화학적으로 합성된 폴리펩티드의 2차 구조물 함량에 영향을 미칠 수 없음을 밝혔다. 2차 구조물 함량의 통합성은 재조합으로 생산된 PSI0257(서열 번호 26)과 필적하였다.
서열 번호 26 | 서열 번호 22 | |
나선 | 63 % | 69 % |
역평행 | 3 % | 2 % |
평행 | 3 % | 3 % |
베타-회전 | 13 % | 12 % |
무작위화된 코일 | 13 % | 11 % |
표 4. CD로 측정된 2개 C5 결합 폴리펩티드에 대한 2차 구조물 함량의 비교
실시예
5
변형된 Z
변이체
및 폴리펩티드의 인간
C5에 대한 결합
바이어코어(Biacore) T200 장비(GE Healthcare)를 사용하여 C5 결합 화합물 PSI0242(서열 번호 1), PSI0340(서열 번호 10), PSI0378(서열 번호 13), 및 PSI0410(서열 번호 23) 및 인간 C5에 대한 C5 결합 폴리펩티드 PSI0400(서열 번호 22)의 결합 친화성을 분석하였다. 제조자의 프로토콜에 따른 아민 커플링 화학을 사용하여 인간 C5(Quidel, cat. no. A403)를 CM5 센서 칩(900 RU)에 커플링시켰다. 10 mM의 나트륨-아세테이트 완충액 pH 5(GE Healthcare) 중 7.5 ㎍/ml의 농도로 hC5를 주입함으로 커플링을 수행하였다. 기준 세포(reference cell)를 인간 C5 주입이 없는 동일한 시약으로 처리하였다. 전형적으로 HBS-EP 완충액 내의 25, 12.5, 6.25, 3.12 및 1.56 nM의 5개 농도의 샘플이 주입 간의 재생성이 없는 동일한 주기에서 25 ℃에서 30 ㎕/분의 유속으로 차례로 주입되는, 단일 주기 동역학 방법으로 C5 폴리펩티드 및 화합물의 고정된 hC5로의 결합을 연구하였다. 벌크 굴절률 변화를 보상하기 위하여 기준 세포로부터의 데이터를 제거하였다. 대부분의 경우에서, 센서 그램이 이중 블랭크(double blacnked)가 되도록 대조군으로 HBS-EP의 주입을 또한 포함하였다. HBS-EP 완충액으로 표면을 재생시켰다. 바이어코어 T200 평가 소프트웨어 버전 1.0의 랭뮤어 1:1 분석물 모델을 사용하는 센서 그램으로부터 운동 상수를 계산하였다. 주입에 대해 생성된 KD 값을 표 5에 도시한다.
서열 번호 | 명칭 | KD (nM) |
1 | PSI0242 | 1.3 |
10 | PSI0340 | 2.5 |
13 | PSI0378 | 2.1 |
22 | PSI0400 | 0.53 |
23 | PSI0410 | 1.3 |
표 5. C5의 서열 번호 1과의 상호작용에 대한 K
D
값과 비교된, 서열 번호 10, 13, 22 및 23의 C5와의 상호작용에 대한 K
D
값
본 데이터는, 안정성-증진된 아미노산 치환이 C5에 결합하는 분자의 능력에 대한 어떤 유의한 부정적인 효과도 갖지 않고, 따라서 이의 생물학적 활성에도 영향을 끼치지 않는다는 것을 밝힌다.
실시예
6
용혈의 억제
고전적 보체 경로 기능 및 C5 결합 화합물 PSI0378(서열 번호 13) 및 PSI0410(서열 번호 23), 및 C5 결합 폴리펩티드 PSI0400(서열 번호 22)에 의한 이의 억제에 대한 연구를 위하여, 알시버 용액(Alsever's solution: Swedish National Veterinary Institute) 중의 신선한 양 전혈로부터 양 적혈구를 제조하였다. 그 후, 항체 민감화 양 적혈구 (EA)를 제조하기 위하여 적혈구를 토끼 항-양 적혈구 항혈청(Sigma)으로 처리하였다. 모든 과정은 무균 조건하에서 수행되었다. 모든 다른 시약들은 상업적으로 입수하였다.
96-웰 U-자형 마이크로역가판에 시험 단백질, 보체 혈청 및 EA 현탁액을 연속적으로 첨가함으로 시험관 내 검정을 수행하였다. 모든 시약들의 최종 농도(웰 당 50 ㎕의 총 반응 부피 및 pH 7.3 내지 7.4)는 다음과 같았다: 0.15 mM CaCl 2; 0.5 mM MgCl 2; 3 mM NaN 3; 138 mM NaCl; 0.1 % 젤라틴; 1.8 mM 나트륨 바르비탈; 3.1 mM 바르비투르산; 5×106 EA; 적절한 희석액에서 보체 단백질 C5 혈청, 및 목적하는 농도에서의 C5 결합 화합물 또는 폴리펩티드.
EA 현탁액을 첨가함으로 반응을 개시하기 전에, 얼음 상에서 20분 동안 상기 기재된 보체 혈청으로 C5 결합 화합물 및 폴리펩티드를 예비-항온처리(pre-incubated) 하였다. 37 ℃에서 45분 동안 교반함으로 용혈 반응을 진행하고, 이어서 0.02 % 트윈 20을 포함하는 100 ㎕의 얼음처럼 차가운 염수를 첨가함으로 반응을 종료하였다. 바이알의 아래 부분으로 세포를 원심분리하고, 100 ㎕ 상층액에 해당하는 윗 부분을 절반-면적 및 넓은 바닥 웰을 갖는 투명한 마이크로플레이트로 옮겼다. 415 nm의 파장에서 마이크로역가판 판독기를 사용하여 광학 밀도로서 반응 결과를 분석하였다.
각각 비억제된 및 완전 억제된 반응에 대한 값을 정의하기 위하여 대조군 샘플(PSI0242, 서열 번호 1) 및 비히클을 각 플레이트에 포함하였다. 임의의 소정 샘플 농도에서 보체 용혈의 억제율(%)을 계산하기 위하여 이러한 값을 사용하였다. C5-제거된(C5 depleted) 혈청이 첨가된 인간 C5의 조절된 농도하에서 동일한 검정을 적용함으로, 시험된 C5 결합 화합물 및 폴리펩티드의 억제 효능(IC 50-값)을 정의하였다. 매우 강력한 억제제를 위하여(낮게는 나노몰 내지 나노몰 이하), 반응 혼합물의 최종 C5 농도를 0.1 nM으로 조절하였고, 이는 C5이 제거되거나 결핍된 혈청을 사용함으로 임의로 확립하였다. 결과를 하기 표 6에 도시한다.
서열 번호 | 명칭 | 효능 (%) | IC 50 (nM) |
1 | PSI0242 | 100 | 0.47 |
13 | PSI0378 | 83 | 0.58 |
22 | PSI0400 | - | 4 |
23 | PSI0410 | 107 | 0.49 |
표 6. C5-결합 화합물 및 폴리펩티드의 억제 능력
용혈 검정으로부터의 결과는 개선된 C5 결합 화합물 PSI0378(서열 번호 13) 및 PSI0410(서열 번호 23)가 기능적인 관점에서 기준 화합물 PSI0242(서열 번호 1)과 크게 상이하지 않다는 것을 밝힌다. C5 결합 폴리펩티드 PSI0400(서열 번호22)는 검정에서 기능적이며 알부민 결합 도메인을 포함하지 않기 때문에, 그 결과는 기준 화합물과 직접적으로 비교할 수 없다.
실시예
7
인간
알부민에 대한 결합
알부민에 대한 C5 결합 화합물의 친화성을 평가하기 위하여, 인간 알부민 ELISA를 사용하고, 코팅제로서 재조합 인간 알부민(Novozymes) 및 애피바디(Affibody) AB(1차) 및 DakoCytomation (검출)로부터 시판되는 항체를 이용하였다. 샘플의 정량을 위하여 PSI0242(서열 번호 1)로부터 제조되고 스트렙토코커스(streptococcal) 단백질 G의 C5 결합 폴리펩티드 및 알부민 결합 도메인을 포함하는 표준 방법을 사용하였다.
96-웰 마이크로플레이트를 재조합 인간 알부민으로 코팅하였다. 이어서 0.05 % 트윈 20을 포함하는 인산염 완충된 식염수(PBST)로 세척하고, PBS 중의 1 % 카제인으로 1 내지 2시간 동안 차단하였다. 플레이트를 세척한 후, 표준물, 방법 대조군, 대조군 샘플 및 시험 샘플을 플레이트에 첨가하였다. 2시간 동안 항온처리 한 후, 비결합 물질을 세척하여 제거하였다. 염소 항-애피바디® IgG(Affibody AB, cat no. 20.1000.01.0005)를 웰에 첨가하고, 플레이트를 1.5시간 동안 항온처리 하여 결합된 C5 결합 화합물에 결합시켰다. 세척한 후, 1시간 동안 토끼 항-염소 IgG HRP(DakoCytomation)를 염소 항체에 결합시켰다. 최종 세척한 후, TMB 기질(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘)의 첨가로 결합된 HRP의 양을 검출하고, 효소로써 이를 푸른색 생성물로 전환시켰다. 반응이 멈추고 30분 후에, 1 M 염산을 첨가하여 웰 함량의 색이 푸른색에서 노란색으로 변하였다. 기준 파장으로 650 nm에서의 흡광도를 사용하여 측광법적으로 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 색의 선명도는 PSI0242(서열 번호 1)의 양과 비례하고, 샘플 농도를 표준 곡선으로부터 측정하였다.
스트렙토코커스 단백질 G(ABD)로부터의 알부민 결합 도메인의 유도체를 포함하는 C5 결합 화합물이 인간 알부민에 결합하는 능력이 있음을 밝혔다. 데이터를 표 7에 도시한다.
서열 번호 | 명칭 | 총 단백질 함량에 대한 비율(%) |
1 | PSI0242 | 103 |
13 | PSI0378 | 85 |
23 | PSI0410 | 150 |
표 7. ELISA로부터의 결과 요약
이 검정에 대한 해석은 개선된 안정성을 갖는 조사된 C5 결합 폴리펩티드 모두가 인간 혈청 알부민에 결합하는 능력을 유지한다는 것이다.
실시예
8
C5 결합 Z
변이체
및 폴리펩티드에 대한 3개월 동안의 안정성 시험
37 ℃에서 2주 동안 안정성 시험을 한 PSI0242와 비교하여 개선된 안정성을 나타내는 C5 결합 변이체 및 폴리펩티드를 37 ℃에서 더 긴 기간인 3개월 동안 안정성 시험을 실시하였다. 안정성 시험 및 RPC에 의한 분석의 구성은 실시예 2에 기재되어 있다. 크로마토그램의 메인 피크를 측정하고 총 단백질 함량의 해당하는 백분율을 계산함으로 안정성을 평가하였다. 이해를 돕기 위하여 실시예 2로부터의 데이터을 하기의 표 8에 도시한다.
서열 번호 |
명칭 |
2 주, 37 ℃ 메인 피크 [총 단백질 함량(%)] |
3 개월, 37 ℃ 메인 피크 [총 단백질 함량(%)] |
5 | PSI0334 | 73 | 16 |
13 | PSI0378 | 89 | 59 |
14 | PSI0379 | 88 | 58 |
15 | PSI0381 | 87 | 46 |
16 | PSI0383 | 91 | 59 |
23 | PSI0410 | 72 | 16 |
24 | PSI0403 | 77 | 35 |
25 | PSI0404 | 88 | 46 |
표 8.
37 ℃에서
3개월 동안 항온처리한 후의 C5 결합 폴리펩티드 및 화합물의 안정성.
PSI0242와 비교하여 위치 52 내지 53에서 ND 내지 SE로 치환된 아미노산(서열 번호 13, 14 및 16)을 포함하는 C5 결합 화합물이, 동일한 조건하에서 2주 동안 시험한 후(표 1 참조)의 PSI0242(서열 번호 1)보다 37 ℃에서 3개월 동안 시험한 후의 더 높은 원래 형태 단백질의 비율을 보였다. 또한 다른 시험된 화합물도 PSI0242와 비교하여 증가된 안정성을 나타낸다.
실시예
9
상이한 표적물에 대해 특이성을 갖는
스캐폴드
-변형된
폴리펩드의
생성, 안정성 연구 및 결합 평가
상이한 표적물에 대해 특이성을 갖는 스캐폴드 -변형된 폴리펩티드의 생성: 상이한 표적물에 대한 특이성을 갖는 Z 변이체 폴리펩티드를 취함으로써 본원에서 기재된 새로운 스캐폴드를 포함하는 폴리펩티드 변이체를 생성시키고, 스캐폴드 내의 선택된 위치에서 부위-특이적 돌연변이 유도(site-directed mutagenesis)를 수행한다. Z 변이체 폴리펩티드의 결합 모티프를 새로운 스캐폴드로 이식하기 위하여, 종래 기술의 당업자에게 공지된 전체 분자의 화학적 합성 또는 다른 분자 생물학적 방법으로써 대안적으로 새로운 분자를 만들 수 있다.
상이한 표적물에 대해 특이성을 갖는 스캐폴드 -변형된 폴리펩티드의 비교 안정성 연구: 상기 기재된 바와 같이 생성된 각각의 새로운 폴리펩티드에 대한 안정성을 기존의 폴리펩티드 또는 또 다른 유사한 폴리펩티드의 안정성과 비교한다. (25 mM NaP, 125 mM NaCl, pH 7.0)의 제형 및, 실시예 2에서 기재된 바와 같이 2주 동안 37 ℃에서 항온처리 및/또는 실시예 8에서 기재된 바와 같이 3개월 동안 37 ℃에서 항온처리함과 같은 상이한 조건에 대하여 폴리펩티드 안정성 시험을 실시하였다. 실시예 2에서 기재된 바와 같이 SDS-PAGE 및 RPC 분석을 수행하여 새로운 변이체의 출현을 분석함으로써 안정성을 평가한다.
스캐폴드 위치에 도입된 변형을 갖는 폴리펩티드는 실시예 2 및 실시예 12에 나타난 결과와 유사한 개선된 안정성을 보일 것으로 기대된다.
스캐폴드 -변형된 폴리펩티드의 결합 평가: 스캐폴드에서 변경을 도입한 후 이의 표적물에 대한 보존된 결합능의 관점에서, 개선된 안정성 특성을 보이는 폴리펩티드를 추가로 평가한다. 바이오센서 기기 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 기기 상에서 결합 연구를 수행하고, 2개 이상의 분자 간의 상호작용을 측정한다. 예를 들어, 표적물 분자 또는 이의 단편을 기기의 센서 칩 상에 고정시키고, 칩을 통해 시험될 폴리펩티드를 포함하는 샘플을 전달한다. 대안적으로, 시험될 폴리펩티드를 기기의 센서 칩 상에 고정시키고, 칩을 통해 기결정된 표적물을 포함하는 샘플 또는 이의 단편을 전달한다. 항체-코팅된 ELISA 플레이트 상에 폴리펩티드의 샘플을 포획하고, 스트렙타비딘 접합된 HRP에 이어서 비오티닐화된 기결정된 타겟 또는 이의 단편을 첨가하는 실험에서 결합 친화성을 시험할 수 있다. TMB 기질을 첨가하고, 빅터3(Victor3, Perkin Elmer)와 같은 다중-웰 플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정한다. 예를 들어 상호작용에 대한 EC50 값(최대 효과적인 농도의 절반)을 측정하기 위하여 정량적인 측정이 요구되는 경우, ELISA 또한 사용할 수 있다. 기결정된 표적물, 또는 이의 단편의 희석물 시리즈에 대한 폴리펩티드의 반응은, 상기 기재된 바와 같이 ELISA를 사용하여 측정한다. 이러한 실험으로 수득된 결과 및 EC50 값은, 예를 들어, GraphPad Prism 5 및 비선형 회기를 사용한 결과로부터 계산할 수 있다. 폴리펩티드가 알부민 결합 도메인을 포함한다면, 알부민 결합에 대한 효과는 실시예 3 또는 실시예 7에서 기재된 바와 같이 평가할 것이다.
본원에서 기재된 스캐폴드 돌연변이 및, 추가로 이의 표적물에 대한 유사하거나 개선된 결합능을 갖는 폴리펩티드는 ,예를 들어, 바이오약품 산업으로의 추가적인 개발을 위한 더 좋은 후보자로 간주된다.
실시예
10
4개의 상이한 표적물에 대해 특이성을 갖는
스캐폴드
-변형된 폴리펩티드의 생성
상이한 표적물에 대한 특이성을 갖는 Z 변이체 폴리펩티드를 취함으로써 본원에서 기재된 새로운 스캐폴드를 포함하는 폴리펩티드 변이체를 생성시키고, 스캐폴드 내의 선택된 위치에서 부위-특이적 돌연변이 유도(site-directed mutagenesis)를 수행한다. 인간 표피 성장 인자 수용체2(HER2)를 표적화하는 폴리펩티드 변이체 Z02891(서열 번호 27), 혈소판-유래된 성장 인자 수용체 베타(PDGF-Rβ)를 표적화하는 Z15805(서열 번호 30), 신생아 Fc 수용체(FcRn)를 표적화하는 Z10103(서열 번호 33), 탄산 탈수 효소 IX(CAIX)를 표적화하는 Z09782(서열 번호 36)내의 스캐폴드 위치에서의 아미노산 치환이 표 9에 명시된다.
서열 번호 | 명칭 | 표적물 | 아미노산 치환 |
최초
vs 발명 |
27 | Z02891 | HER2 | - | 최초 |
28 | Z17341 | HER2 | N52S, D53E | 발명 |
29 | Z17342 | HER2 | D36R, D37Q, S39E, N52S, D53E | 발명 |
30 | Z15805 | PDGF-Rβ | - | 최초 |
31 | Z17343 | PDGF-Rβ | N52S, D53E | 발명 |
32 | Z17344 | PDGF-Rβ | D36R, D37Q, S39E, N52S, D53E | 발명 |
33 | Z10103 | FcRn | - | 최초 |
34 | Z17347 | FcRn | N52S, D53E | 발명 |
35 | Z17348 | FcRn | D36R, D37Q, S39E, N52S, D53E | 발명 |
36 | Z09782 | CAIX | - | 최초 |
37 | Z17351 | CAIX | N52S, D53E | 발명 |
38 | Z17352 | CAIX | D36R, D37Q, S39E, N52S, D53E | 발명 |
39 | Z17355 | CAIX | D53E | 발명 |
40 | Z17357 | CAIX | D36R, D37Q, S39E, D53E | 발명 |
41 | Z17359 | CAIX | N52S | 발명 |
42 | Z17360 | CAIX | D36R, D37Q, S39E, N52S | 발명 |
표 9. 최초 및 발명 폴리펩티드를 생성하고, 하기 기재된
실시예에서
안정성 및 기능의 관점에서 분석하였다.
모든 변이체를 N-말단 6x 히스티딘-태그(His6)로 클로닝하고 포맷 MGSSHHHHHHLQ-[Z#####]인 폴리펩티드로 코딩된 작제물을 수득하였다. 목적하는 아미노산 치환을 코딩하는 중첩 올리코뉴클레오티드 프라이머 쌍을 사용하고 확립된 분자 생물학적 기법을 적용함으로써, 발명한 폴리펩티드의 플라스미드 내에 돌연변이를 도입하였다. DNA 시퀀싱으로 정확한 플라스미드 서열을 입증하였다.
기존 및 발명한 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 단편을 포함하는 플라스미드를 사용하여 이.콜라이(E. coli: 균주 T7E2) 세포(GeneBridge)를 형질전환시켰다. 세포를 50 ㎍/ml 카나마이신으로 보충된 TSB-YE 배지 내에서 37 ℃로 배양하고, 이어서 IPTG를 첨가함으로 단백질 발현을 유도하였다. 페스트프렙®(FastPrep)- 24 균질화기(Nordic Biolabs)를 사용하여 펠렛을 형성한 세포를 분해시키고 원심분리로 세포 파편을 제거하였다. 제조자의 지침에 따른 히스 그레비트랩™(His GraviTrap) 컬럼(GE Healthcare)을 사용하는 고정된(immobilized) 금속 이온 친화성 크로마토그래피(IMAC)로 히스티딘6-태깅된 단백질으로서 Z 변이체를 포함하는 각 상층액을 정제하였다. PD-10 탈염 컬럼(GE healthcare)을 사용하여 정제된 Z 변이체의 완충액을 인산염-완충된 식염수(PBS; 1.47 mM KH2PO4, 8.1 mM Na2HPO4, 137 mM NaCl, 2.68 mM KCl, pH 7.4)로 교환하였다. SDS-PAGE 및 HPLC-MS로 각 폴리펩티드의 정확한 정체를 입증하였다.
실시예
11
스캐폴드
-변형된 폴리펩티드의
원평광
이색성
분광법
아미노산 치환의 결과로서 발명한 폴리펩티드의 융해 온도(Tm)를 측정하고 2차 구조의 잠재적인 변화를 평가하기 위하여 원평광 이색성(CD) 분석을 수행하였다.
정제된 히스티딘6-태깅된 Z 변이체를 PBS 내에서 0.5 mg/ml로 희석하였다. 각각의 희석된 Z 변이체에 대하여 20 ℃에서 250 내지 195 nm에서의 CD 스펙트럼을 기록하였다. Tm을 측정하기 위하여 가변 온도 측정(VTM)을 수행하였다. VTM에서, 5 ℃/분의 온도 슬로프로 온도를 20 내지 90 ℃로 올리는 동안 221 nm에서의 흡광도를 측정하였다. VTM 이후, 20 ℃에서 250 내지 195 nm에서의 제2 CD 스펙트럼을 기록하였다. 1 mm의 광학 경로 길이를 갖는 세포를 사용하는 제스코(Jasco) J-810 분광편광계(Jasco Scandinavia AB) 상에서 CD 측정을 수행하였다.
CD 시그널 대 온도 플롯의 전이에 대한 중점으로부터 측정되는 각각의 폴리펩티드의 Tm을 표 10에 도시한다. 모든 돌연변이된 폴리펩티드는 보존된 알파나선 구조를 나타내었으며, 심지어 90 ℃로 가열한 후에도 가역적으로 또는 거의 가역적으로 재폴딩(refolding)되었다. 선택된 세트의 CD 스펙트럼을 도 7에 도시한다.
서열 번호 | 명칭 | 표적물 | Tm ( °C ) | 최초 vs 발명 |
27 | Z02891 | HER2 | 70 | 최초 |
28 | Z17341 | HER2 | 66 | 발명 |
29 | Z17342 | HER2 | 62 | 발명 |
30 | Z15805 | PDGF-Rβ | 48 | 최초 |
31 | Z17343 | PDGF-Rβ | 46 | 발명 |
32 | Z17344 | PDGF-Rβ | 42 | 발명 |
33 | Z10103 | FcRn | 48 | 최초 |
34 | Z17347 | FcRn | 50 | 발명 |
35 | Z17348 | FcRn | 44 | 발명 |
36 | Z09782 | CAIX | 43 | 최초 |
37 | Z17351 | CAIX | 40 | 발명 |
38 | Z17352 | CAIX | 45 | 발명 |
39 | Z17355 | CAIX | 43 | 발명 |
40 | Z17357 | CAIX | 47 | 발명 |
41 | Z17359 | CAIX | 41 | 발명 |
42 | Z17360 | CAIX | 46 | 발명 |
표 10. CD에 의하여 측정된 최초 및 발명 Z
변이체의
융해 온도
실시예
12
4개 상이한 표적물에 대하여 특이성을 갖는
스캐폴드
-변형된 폴리펩티드의
비교 안정성 연구
실시예 10에서 기재되는 바와 같은 각각의 새로운 폴리펩티드에 대한 안정성을 기존의 폴리펩티드의 안정성과 비교하였다. PBS pH 7.4로 제형화된 폴리펩티드를 1 mg/ml로 희석하고 200 ㎕의 분액을 37 ℃에서 2주 동안 항온처리하였다. 10 % 비스-트리스(Bis-Tris) NuPAGE 겔(Invitrogen)을 사용하는 SDS-PAGE의 각 웰에 5 ㎍의 단백질을 로딩함으로써 안정성 시험 전후에 수집된 샘플을 분석하였다. 코마시 블루로 염색된 겔의 결과를 도 8에 도시한다. 가온에서 항온처리한 후의 새로운 변이체의 출현으로써 안정성을 평가하고, 돌연변이된 변이체를 각각의 기존의 폴리펩티드와 비교하였다.
표 9에 요약된 바와 같은 스캐폴드 위치에 도입된 변형을 갖는 모든 폴리펩티드는 각각 기존의 폴리펩티드와 비교하여 개선된 안정성을 나타냈다. 기존의 폴리펩티드의 샘플에서, 메인 밴드 바로 위의 겔 상에 제2 밴드를 볼 수 있었다. 치환 D53E 및/또는 N52S를 갖는 발명한 폴리펩티드의 샘플 상에서는 상응하는 제2 밴드를 볼 수 없었다. 이는 실시예 2 및 4에서 나타난 결과와 유사하다. 따라서, 상기 Z 변이체를 포함하는 Z 변이체 또는 폴리펩티드의 표적물 특이성과 상관없이, 발명한 스캐폴드 돌연변이에 대해 관찰된 안정화 효과는 일반적인 효과를 나타낼 것이다. 치환 D53E 및/또는 N52S를 갖는 폴리펩티드 단독, 또는 치환 D36R, D37Q 및 S39E와 조합된 폴리펩티드는 SDS-PAGE 겔 상에서 유사한 프로파일을 나타냈다. 치환 D53E 단독, 또는 치환 D36R, D37Q 및 S39E와의 조합은, SDS-PAGE 겔 상의 제2 밴드로서 관찰되는 대안적 확인(alternative confirmation)으로, 상기 종들의 양을 감소시키는 것으로 나타났지만, 이러한 종들의 형성을 완전히 막을 수는 없었다.
실시예
13
스캐폴드
-변형된 폴리펩티드의 결합
평가
스캐폴드 내 변경을 도입한 후 및, 예를 들어, 2주 동안 37 ℃에서 항온처리함과 같이 안정성 시험을 실시한 후의 이들의 표적물에 대한 보존된 결합능에 대한 관점에서, 실시예 12에서 개선된 안정성 특성을 나타내는 폴리펩티드 세트를 추가로 평가하였다. 바이어코어(Biacore) 2000 기기를 사용하여 비교 운동 상수(kon 및 koff) 및 친화성(KD)을 측정하였다. CM5 칩의 카복실화된 덱스트란 층 표면 상에 표적물 단백질 인간 HER2-Fc(R&D Systems, cat. no. 1129-ER-050), 인간 PDGF-Rβ(R&D Systems, cat. no. 385-PR-100/CF), 인간 FcRn(Biorbyt, cat. no. orb 84388) 및 인간 CAIX(R&D Systems, cat. no. 2188-CA)를 각각 고정시켰다. 제조자의 지침에 따른 아민 커플링 화학 및 러닝 완충액으로 HBS-EP를 사용하여 고정화를 수행하였다. 칩 상의 하나의 유동 세포 표면을 활성화시키고, 분석물 주입 동안 블랭크로서의 사용에 대하여 불활성화시켰다. 각각의 표면 상의 표적물 단백질에 대한 고정화 수준은 대략 HER2의 경우 850 RU, PDGF-Rβ의 경우 2200 RU, FcRn의 경우 750 및 CAIX의 경우 580이었다.
러닝 완충액으로 HBS-EP(HER2, PDGF-Rβ, CAIX) 또는 pH 6.0 Na2HPO4/시트르산 완충액(126 mM Na2HPO4, 37 mM 시트르산)(FcRn)을 사용하고, 하기 추가로 기재되는 바와 같이 25 ℃에서 수행된 결합 실험에서의 유속은 30 ㎕/분 이었다.
러닝 완충액에서 HER2를 표적화하는 Z 변이체 Z02891(서열 번호 27), Z17341(서열 번호 28), 및 Z17342(서열 번호 29)를 최종 농도 3.33, 10, 30 및 90 nM으로 희석하고, 5분 동안 주입하고 이어서 러닝 완충액에서 30분 동안 해리시켰다. 각 분석물 주입 이후, 10 mM HCl 및 10 mM NaOH 간의 4회 펄스 교대(alternating)에 이어서 러닝 완충액 내에서 5분 동안의 평형화에 의하여 재생을 적용하였다.
러닝 완충액에서 PDGF-Rβ를 표적화하는 Z 변이체 Z15805(서열 번호 30), Z17343(서열 번호 31), 및 Z17344(서열 번호 32)를 최종 농도 6.67, 20, 60 및 180 nM으로 희석하고, 5분 동안 주입하고 이어서 러닝 완충액에서 20분 동안 해리시켰다. 각 분석물 주입 이후, 10 mM NaOH의 3회 펄스에 이어서 러닝 완충액 내에서 5분 동안의 평형화에 의하여 재생을 적용하였다.
러닝 완충액에서 FcRn를 표적화하는 Z 변이체 Z10103(서열 번호 33), Z17347(서열 번호 34), 및 Z17348(서열 번호 35)을 최종 농도 3.33, 10 및 30 nM으로 희석하고, 3분 동안 주입하고 이어서 러닝 완충액에서 15분 동안 해리시켰다. 각 분석물 주입 이후, HBS-EP의 3회 펄스에 이어서 러닝 완충액 내에서 10분 동안의 평형화에 의하여 재생을 적용하였다.
러닝 완충액에서 CAIX를 표적화하는 Z 변이체 Z09782(서열 번호 36), Z17351(서열 번호 37), Z17355(서열 번호 39), 및 Z17359(서열 번호 41)를 최종 농도 30, 90 및 270 nM으로 희석하고, 5분 동안 주입하고 이어서 러닝 완충액에서 15분 동안 해리시켰다. 각 분석물 주입 이후, 10 mM 글리신-HCl pH 3.0의 3회 펄스에 이어서 러닝 완충액 내에서 평형화에 의하여 재생을 적용하였다.
랭뮤어 1:1 모델(HER2, FcRn, CAIX)을 사용하는 센서그램 또는 바이아이벨류에이션(BiaEvaluation) 소프트웨어 4.1(GE Healthcare)의 물질 이동 모델(PDGF-Rβ)을 사용하는 1:1 결합으로부터 운동 상수를 계산하였다. 신호에 대한 임의의 변이를 수정하기 위하여, 리간드 표면의 곡선으로부터 블랭크 표면의 곡선을 제거하고, 시험-샘플 주기의 데이터로부터 완충액 주기로부터의 데이터를 제거하였다.
그의 표적물 분자에 결합하는 Z 변이체에 대한 비교 운동 상수를 표 11에 도시하고, 분석된 상호작용의 아집단(subset)에 대한 센서그램을 도 9에 도시한다. 데이터는, 친화성이 오직 위치 52 내지 53에서의 ND 내지 SE로의 치환에 의해 대체로 영향을 받고, 변이체의 커플[Z17341(서열 번호 28) 및 Z17343(서열 번호 31)]에 대한 친화성이 다소 향상된다는 것을 밝힌다. 위치 52 내지 53에서의 치환 ND 내지 SE와 Z17342(서열 번호 29), Z17344(서열 번호 32) 및 Z17348(서열 번호 35)과 같은 치환 D36R, D37Q 및 S39E와의 배합물은, 주로 더 빠른 해리 속도에 기인하여 친화성에 대해 보다 부정적인 효과를 가졌으나, 10-9 M 범위에서의 KD로 기능적 결합체를 수득하였다. 37 ℃에서 2주 동안 항온처리한 후, 평가된 변이체는 또한 보존된 결합 능력을 가졌다.
HER2 결합 Z 변이체 | |||||||
서열 번호 |
시험 샘플 |
최초 vs
발명 |
k a (Ms -1 ) | k d (s -1 ) | K D (M) * | K DInv / K DOrig ** | K D(2w) / K D(0) *** |
27 | Z02891 (0) | 최초 | 1.33x106 | 7.10x10-5 | 5.4x10-11 | 1.0 | |
27 | Z02891 (2w) | 최초 | 1.15x106 | 7.19x10-5 | 6.2x10-11 | 1.0 | 1.17 |
28 | Z17341 (0) | 발명 | 1.88x106 | 8.35x10-5 | 4.5x10-11 | 0.83 | |
28 | Z17341 (2w) | 발명 | 2.06x106 | 8.91x10-5 | 4.3x10-11 | 0.69 | 0.97 |
29 | Z17342 (0) | 발명 | 8.94x105 | 1.57x10-3 | 1.8x10-9 | 33 | |
29 | Z17342 (2w) | 발명 | 6.49x105 | 1.50x10-3 | 2.3x10-9 | 37 | 1.31 |
PDGF - Rβ 결합 Z 변이체 | |||||||
서열 번호 |
시험 샘플 |
최초 vs
발명 |
k a (Ms -1 ) | k d (s -1 ) | K D (M) * | K DInv / K DOrig ** | K D(2w) / K D(0) *** |
30 | Z15805 (0) | 최초 | 7.15x106 | 1.39x10-3 | 1.9x10-10 | 1.0 | |
30 | Z15805 (2w) | 최초 | 5.81x106 | 1.66x10-3 | 2.9x10-10 | 1.0 | 1.47 |
31 | Z17343 (0) | 발명 | 4.80x106 | 1.77x10-3 | 3.7x10-10 | 1.90 | |
31 | Z17343 (2w) | 발명 | 6.45x106 | 1.71x10-3 | 2.3x10-10 | 0.93 | 0.72 |
32 | Z17344 (0) | 발명 | 5.15x107 | 6.16x10-2 | 1.2x10-9 | 6.19 | |
32 | Z17344 (2w) | 발명 | 5.62x107 | 6.23x10-2 | 1.1x10-9 | 3.88 | 0.93 |
FcRn 결합 Z 변이체 | |||||||
서열 번호 |
시험 샘플 |
최초 vs
발명 |
k a (Ms -1 ) | k d (s -1 ) | K D (M) * | K DInv / K DOrig ** | K D(2w) / K D(0) *** |
33 | Z10103 (0) | 최초 | 1.60x106 | 4.56x10-3 | 2.9x10-9 | 1.0 | |
33 | Z10103 (2w) | 최초 | 3.15x106 | 5.75 x10-3 | 1.8x10-9 | 1.0 | 0.64 |
34 | Z17347 (0) | 발명 | 1.18x106 | 7.99 x10-3 | 6.7x10-9 | 2.36 | |
34 | Z17347 (2w) | 발명 | 2.27x106 | 8.79 x10-3 | 3.9x10-9 | 2.13 | 0.57 |
35 | Z17348 (0) | 발명 | 1.82x106 | 1.00 x10-2 | 5.5x10-9 | 1.93 | |
35 | Z17348 (2w) | 발명 | 1.28x106 | 8.09 x10-3 | 6.3x10-9 | 3.46 | 1.14 |
CAIX 결합 Z 변이체 | |||||||
서열 번호 |
시험 샘플 |
최초 vs
발명 |
k a (Ms -1 ) | k d (s -1 ) | K D (M) * | K DInv / K DOrig ** | K D(2w) / K D(0) *** |
36 | Z09782 (0) | 최초 | 2.08x105 | 1.46x10-3 | 7.0x10-9 | 1.0 | |
36 | Z09782 (2w) | 최초 | 1.40x105 | 1.38x10-3 | 9.9x10-9 | 1.0 | 1.41 |
37 | Z17351 (0) | 발명 | 1.51x105 | 2.63x10-3 | 1.8x10-8 | 2.49 | |
37 | Z17351 (2w) | 발명 | 1.91x105 | 2.86x10-3 | 1.5x10-8 | 1.52 | 0.86 |
39 | Z17355 (0) | 발명 | 1.57x105 | 1.23x10-3 | 7.9x10-9 | 1.12 | |
39 | Z17355 (2w) | 발명 | 1.16x105 | 1.23x10-3 | 1.1x10-8 | 1.07 | 1.35 |
41 | Z17359 (0) | 발명 | 1.68x105 | 2.15x10-3 | 1.3x10-8 | 1.82 | |
41 | Z17359 (2w) | 발명 | 1.78x105 | 2.33x10-3 | 1.3x10-8 | 1.32 | 1.02 |
표 11. 최초 및 발명 폴리펩티드의 비교 동역학 분석
* KD 값은, 이들이 비교 목적으로 측정되고 단지 제한된 수의 샘플 농도만을 포함하기 때문에, 절대적인 것으로 간주하지 않아야 한다.
** 실시예 12에서 기재되는 안정성 시험 전(0)과 후(2w) 각각의 발명한 폴리펩티드의 KD를 이의 최초의 폴리펩티드(1.0로 설정)의 KD와 비교하는 상대적인 KD.
*** 서열이 동일한 각 폴리펩티드 쌍에 대해 (2w)로부터의 KD를 (0)으로부터의 KD와 비교하는 상대적인 KD.
실시형태에 대한 항목별 목록
1. 하기 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드:
i) EX2X3X4AX6X7EIX10 X11LPNLX16X17X18QX20 X21AFIX25X26LX28X29X30 PX32QSX35X36LLX39E AKKLX45X46X47Q; 및
ii) i)에서 정의된 서열과 적어도 91 % 동일성을 갖고, 단 X45가 N일 때 X46은 D가 아닌, 아미노산 서열;
여기서, 각각의 X2, X3, X4, X6, X7, X10, X11, X17, X18, X20, X21, X25 및 X28은 독립적으로 임의의 아미노산 잔기에 해당하고;
서로 독립적으로,
X16은 N 및 T 중에서 선택되고;
X26은 K 및 S 중에서 선택되고;
X29X30PX32는 DDPS 및 RQPE 중에서 선택되고;
X35는 A 및 S 중에서 선택되고;
X36은 E 및 N 중에서 선택되고;
X39는 A, C 및 S 중에서 선택되고;
X45는 E, N 및 S 중에서 선택되고;
X46은 D, E 및 S 중에서 선택되고, 단 X45가 N일 때 X46은 D가 아니고;
X47은 A 및 S 중에서 선택된다.
2. 항목 1에 있어서, X16이 T인 폴리펩티드.
3. 항목 1 또는 2에 있어서, X26이 K인 폴리펩티드.
4. 임의의 상기 항목에 있어서, X29X30PX32가 DDPS인 폴리펩티드.
5. 항목 1 내지 3에 있어서, X29X30PX32가 RQPE인 폴리펩티드.
6. 임의의 상기 항목에 있어서, X35가 S인 폴리펩티드.
7. 임의의 상기 항목에 있어서, X36이 E인 폴리펩티드.
8. 임의의 상기 항목에 있어서, X39가 S인 폴리펩티드.
9. 임의의 상기 항목에 있어서, X45가 E 및 S 중에서 선택되는 폴리펩티드.
10. 항목 9에 있어서, X45가 E인 폴리펩티드.
11. 항목 9에 있어서, X45가 S인 폴리펩티드.
12. 임의의 상기 항목에 있어서, X46이 E 및 S 중에서 선택되는 폴리펩티드.
13. 항목 12에 있어서, X46이 E인 폴리펩티드.
14. 항목 12에 있어서, X46이 S인 폴리펩티드.
15. 항목 12에 있어서, X46이 D인 폴리펩티드.
16. 임의의 상기 항목에 있어서, 단 X45가 N일 때 X46은 D가 아닌 폴리펩티드.
17. 임의의 상기 항목에 있어서, X45X46이 EE, ES, SE 및 SS 중에서 선택되는 폴리펩티드.
18. 항목 17에 있어서, X45X46이 ES 및 SE 중에서 선택되는 폴리펩티드.
19. 항목 18에 있어서, X45X46이 ES인 폴리펩티드.
20. 항목 18에 있어서, X45X46이 SE인 폴리펩티드.
21. 항목 18에 있어서, X45X46이 SD인 폴리펩티드.
22. 임의의 상기 항목에 있어서, X47이 S인 폴리펩티드.
23. 항목 1 내지 22 중 어느 한 항목에 있어서, 추가적인 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드.
24. 항목 23에 있어서, 상기 폴리펩티드의 C-말단에 추가적인 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드.
25. 항목 24에 있어서, AP를 포함하는 상기 폴리펩티드의 C-말단에 추가적인 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드.
26. 항목 23에 있어서, 상기 폴리펩티드의 N-말단에 추가적인 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드.
27. 항목 26에 있어서, AEAKYAK를 포함하는 상기 폴리펩티드의 N-말단에 추가적인 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드.
28. 항목 23 내지 27 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 추가적인 아미노산 잔기가 폴리펩티드의 결합, 생산, 정제, 안정화, 커플링 또는 검출의 목적으로 첨가되는 폴리펩티드.
29. 항목 23 내지 28 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 추가적인 아미노산 잔기가 하나 이상의 폴리펩티드 도메인을 구성하는 폴리펩티드.
30. 항목 29에 있어서, 상기 하나 이상의 폴리펩티드 도메인이 결합 기능, 효소적 기능, 금속 이온 킬레이트 기능 및 형광성 기능으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 기능을 갖는 상기 하나 이상의 폴리펩티드 도메인, 또는 이의 혼합물인 폴리펩티드.
31. 항목 1 내지 28 중 어느 한 항목에 있어서, 하기 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드:
YAK EX2X3X4AX6X7EIX10 X11LPNLX16X17X18QX20 X21AFIX25X26LX28X29X30 PX32QSX35X36LLX39E AKKLX45X46X47Q AP; 및
FNK EX2X3X4AX6X7EIX10 X11LPNLX16X17X18QX20 X21AFIX25X26LX28X29X30 PX32QSX35X36LLX39E AKKLX45X46X47Q AP,
여기서 각각의 Xy는 항목 1 내지 22 중 어느 한 항목에서 정의되는 바와 같다.
32. 항목 31에 있어서, 하기 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드:
ADNNFNK EX2X3X4AX6X7EIX10 X11LPNLX16X17X18QX20 X21AFIX25X26LX28X29X30 PX32QSX35X36LLX39E AKKLX45X46X47Q APK;
ADNKFNK EX2X3X4AX6X7EIX10 X11LPNLX16X17X18QX20 X21AFIX25X26LX28X29X30 PX32QSX35X36LLX39E AKKLX45X46X47Q APK;
VDNKFNK EX2X3X4AX6X7EIX10 X11LPNLX16X17X18QX20 X21AFIX25X26LX28X29X30 PX32QSX35X36LLX39E AKKLX45X46X47Q APK;
VDAKYAK EX2X3X4AX6X7EIX10 X11LPNLX16X17X18QX20 X21AFIX25X26LX28X29X30 PX32QSX35X36LLX39E AKKLX45X46X47Q APK; 및
AEAKYAK EX2X3X4AX6X7EIX10 X11LPNLX16X17X18QX20 X21AFIX25X26LX28X29X30 PX32QSX35X36LLX39E AKKLX45X46X47Q APK;
여기서 각각의 Xy는 항목 1 내지 22 중 어느 한 항목에서 정의되는 바와 같다.
33. 항목 1 내지 32 중 어느 한 항목에 있어서, 기결정된 표적물에 대해 친화성을 갖는 폴리펩티드로서, 상기 표적물이 ABD, HER2, TNFα, EGFR, IGF1R, IgG, PDGFRβ, HER3, C5, FcRn, CAIX, 아밀로이드 β, CD4, IL8, IL6 및 인슐린으로 이루어진 그룹 중에서 임의로 선택되는 폴리펩티드.
34. 모이어티로서 항목 1 내지 33 중 어느 한 항목에 따른 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드.
35. 항목 1 내지 34 중 어느 한 항목에 있어서, 추가로 표지를 포함하는 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드.
36. 항목 1 내지 35 중 어느 한 항목에 있어서, 추가로 치료제를 포함하는 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드.
37. 검출제, 포획제 또는 분리제로서 항목 1 내지 36 중 어느 한 항목에 따른 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드의 용도.
38. 항목 1 내지 36 중 어느 한 항목에 있어서, 치료의 용도를 위한 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드.
39. 항목 1 내지 36 중 어느 한 항목에 있어서, 진단제로서의 용도를 위한 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드.
40. 항목 1 내지 34 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
41. 군 내의 각 폴리펩티드가 하기 중에서 선택된 아미노산을 포함하는, 공지된 스캐폴드에 기반한 폴리펩티드 변이체 군:
i)
EX2X3X4AX6X7EIX10 X11LPNLX16X17X18QX20 X21AFIX25X26LX28X29X30 PX32QSX35X36LLX39E AKKLX45X46X47Q,
ii) i)에서 정의된 서열과 적어도 91 % 동일성을 갖고, 단 X45가 N일 때 X46은 D가 아닌, 아미노산 서열;
여기서, 각각의 X2, X3, X4, X6, X7, X10, X11, X17, X18, X20, X21, X25 및 X28은 독립적으로 임의의 아미노산 잔기에 해당하고;
서로 독립적으로,
X16은 N 및 T 중에서 선택되고;
X26은 K 및 S 중에서 선택되고;
X29X30PX32는 DDPS 및 RQPE 중에서 선택되고;
X35는 A 및 S 중에서 선택되고;
X36은 E 및 N 중에서 선택되고;
X39는 A, C 및 S 중에서 선택되고;
X45는 E, N 및 S 중에서 선택되고;
X46은 D, E 및 S 중에서 선택되고, 단 X45가 N일 때 X46은 D가 아니고;
X47은 A 및 S 중에서 선택된다.
42. 항목 41에 있어서, 적어도 1 x 104개의 독특한 폴리펩티드 분자를 포함하는 군.
43. 항목 42에 있어서, 적어도 1 x 106 개의 독특한 폴리펩티드 분자를 포함하는 군.
44. 항목 43에 있어서, 적어도 1 x 108개의 독특한 폴리펩티드 분자를 포함하는 군.
45. 항목 44에 있어서, 적어도 1 x 1010개의 독특한 폴리펩티드 분자를 포함하는 군.
46. 항목 45에 있어서, 적어도 1 x 1012개의 독특한 폴리펩티드 분자를 ㅍ포함하는 군.
47. 항목 46에 있어서, 적어도 1 x 1014개의 독특한 폴리펩티드 분자를 ㅍ포함하는 군.
48. 폴리뉴클레오티드 군의 각 구성원이 항목 41 내지 47에 따른 폴리펩티드 군의 구성원을 코딩하는것으로 특징지어지는 폴리뉴클레오티드 군.
49. 항목 41 내지 47 중 어느 한 항목에 따른 폴리펩티드 군과 항목 48에 따른 폴리뉴클레오티드 군의 배합물로서, 상기 폴리펩티드 군의 각 구성원이 유전자형-표현형 커플링을 위한 수단을 통해 구성원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 물리적으로 또는 공간적으로 연합되는 배합물.
50. 항목 49에 있어서, 상기 유전자형-표현형 커플링을 위한 수단이 파지 디스플레이 시스템을 포함하는 배합물.
51. 항목 49에 있어서, 상기 유전자형-표현형 커플링을 위한 수단이 세포 표면 선별 디스플레이 시스템을 포함하는 배합물.
52. 항목 51에 있어서, 상기 세포 표면 디스플레이 시스템이 원핵 세포를 포함하는 배합물.
53. 항목 52에 있어서, 상기 원핵 세포가 그람-양성 세포인 배합물.
54. 항목 51에 있어서, 상기 세포 표면 디스플레이 시스템이 진핵 세포를 포함하는 배합물.
55. 항목 54에 있어서, 상기 진핵 세포가 효모 세포인 배합물.
56. 항목 49에 있어서, 상기 유전자형-표현형 커플링을 위한 수단이 세포 유리 디스플레이 시스템을 포함하는 배합물.
57. 항목 56에 있어서, 상기 세포 유리 디스플레이 시스템이 리보솜 디스플레이 시스템을 포함하는 배합물.
58. 항목 56에 있어서, 상기 세포 유리 디스플레이 시스템이 시험관 내 구역화 디스플레이 시스템을 초함하는 배합물.
59. 항목 56에 있어서, 상기 세포 유리 디스플레이 시스템이 시스 디스플레이를 위한 시스템을 포함하는 배합물.
60. 항목 56에 있어서, 상기 세포 유리 디스플레이 시스템이 마이크로비드 디스플레이 시스템을 포함하는 배합물.
61. 항목 49에 있어서, 상기 유전자형-표현형 커플링을 위한 수단이 비-디스플레이 시스템을 포함하는 배합물.
62. 항목 61에 있어서, 상기 비-디스플레이 시스템이 단백질-단편 상보성 검정인 배합물.
63. 하기의 단계를 포함하는, 폴리펩티드 군으로부터 기결정된 표적물에 대해 친화성을 갖는 목적하는 폴리펩티드를 선별하기 위한 방법:
(a) 항목 41 내지 47 중 어느 한 항목에 따른 폴리펩티드 군을 제공하는 단계;
(b) 표적물 및 표적물에 대해 친화성을 갖는 적어도 하나의 목적하는 폴리펩티드 간의 특이적인 상호작용을 가능하게 하는 조건하에서, 폴리펩티드 군을 기결정된 표적물과 접촉시키는 단계; 및
(c) 상기 특이적인 상호작용에 기반하여, 남아있는 폴리펩티드 군으로부터 적어도 하나의 목적하는 폴리펩티드를 선별하는 단계.
64. 항목 63에 있어서, 단계 (a)가 항목 48에 따른 폴리뉴클레오티드 군을 제공하고 상기 폴리뉴클레오티드 군을 발현시켜 상기 폴리펩티드 군을 수득하는 준비 단계를 포함하는 방법.
65. 항목 64에 있어서, 상기 폴리펩티드 군의 각 구성원이 유전자형-표현형 커플링을 위한 수단을 통해 구성원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 물리적으로 또는 공간적으로 연합되는 방법.
66. 항목 65에 있어서, 상기 유전자형-표현형 커플링을 위한 수단이 항목 50 내지 62 중 한 항목에 정의되는 바와 같은 방법.
67. 하기의 단계를 포함하는, 상기 목적하는 폴리펩티드 및 기결정된 표적물에 대해 친화성을 갖는 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 선별하는 단계; 및
- 이에 따라 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 단리하는 단계.
68. 하기의 단계를 포함하는, 기결정된 표적물에 대해 친화성을 갖는 목적하는 폴리펩티드를 동정하기 위한 방법:
- 항목 67에 따른 방법을 사용하는 상기 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 단리하는 단계; 및
- 폴리뉴클레오티드를 시퀀싱하여 상기 목적하는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 연역에 의해 규정하는 단계.
69. 하기의 단계를 포함하는, 폴리펩티드 군으로부터 기결정된 표적물에 대해 친화성을 갖는 목적하는 폴리펩티드를 선별 및 동정하기 위한 방법:
(a) 별도의 캐리어 또는 비드 상에 항목 41 내지 47 중 어느 한 항목에 따른 폴리ㅍ베티드 군의 각 구성원을 합성하는 단계;
(b) 폴리펩티드와 기결정된 표적물과의 상호작용에 기반하는 캐리어 또는 비드를 선별하거나 농축시키는 단계; 및
(c) 단백질 특성화 절차에 의해 폴리펩티드를 동정하는 단계.
70. 항목 69에 있어서, 단계 (c)에서 사용되는 단백질 특성화 절차가 질량 분광계 분석인 방법.
71. 하기의 단계를 포함하는, 기결정된 표적물에 대해 친화성을 갖는 목적하는 폴리펩티드의 생산 방법:
- 항목 68에 따른 방법을 사용하는 목적하는 폴리펩티드를 단리 및 동정하는 단계 또는 항목 69 및 70 중 어느 한 항목에 따른 방법을 사용하는 목적하는 폴리페비드를 선별 및 동정하는 단계; 및
- 상기 목적하는 폴리펩티드를 생산하는 단계.
72. 항목 71에 있어서, 상기 생산이 목적하는 폴리펩티드의 데노보 화학적 합성을 사용하여 수행되는 방법.
73. 항목 71에 있어서, 상기 생산이 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 재조합 발현을 사용하여 수행되는 방법.
74. 하기의 단계를 포함하는, 기결정된 표적물에 대해 친화성을 갖는 목적하는 폴리펩티드의 생산 방법:
(a1) 항목 68에 따른 방법을 사용하는 상기 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 단리하는 단계; 또는
(a2) 항목 69 및 70에 중 어느 한 항목에 따른 선별 및 동정 방법을 사용하여 동정된 폴리펩티드를 역번역하는 단계; 및
(b) 단계 (a1) 또는 (a2) 후에, 이에 따라 단리된 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 상기 목적하는 폴리펩티드를 생산하는 단계.
SEQUENCE LISTING
<110> AFFIBODY AB
<120> BINDING POLYPEPTIDES HAVING A MUTATED SCAFFOLD
<130> IPA160076-SE
<150> EP13182022.7
<151> 2013-08-28
<160> 54
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 108
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL SEQUENCE
<220>
<223> Engineered C5 binding Z variant
<400> 1
Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Val Leu Glu Ala Trp Asp Glu Ile
1 5 10 15
Asp Arg Leu Pro Asn Leu Thr Ile Glu Gln Trp Leu Ala Phe Ile Asn
20 25 30
Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Val Asp Gly Ser Leu Ala
50 55 60
Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly Val Ser
65 70 75 80
Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu Gly Val
85 90 95
Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro
100 105
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<211> 46
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL SEQUENCE
<220>
<223> Engineered albumin binding polypeptide
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Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu
20 25 30
Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
<210> 3
<211> 1676
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 3
Met Gly Leu Leu Gly Ile Leu Cys Phe Leu Ile Phe Leu Gly Lys Thr
1 5 10 15
Trp Gly Gln Glu Gln Thr Tyr Val Ile Ser Ala Pro Lys Ile Phe Arg
20 25 30
Val Gly Ala Ser Glu Asn Ile Val Ile Gln Val Tyr Gly Tyr Thr Glu
35 40 45
Ala Phe Asp Ala Thr Ile Ser Ile Lys Ser Tyr Pro Asp Lys Lys Phe
50 55 60
Ser Tyr Ser Ser Gly His Val His Leu Ser Ser Glu Asn Lys Phe Gln
65 70 75 80
Asn Ser Ala Ile Leu Thr Ile Gln Pro Lys Gln Leu Pro Gly Gly Gln
85 90 95
Asn Pro Val Ser Tyr Val Tyr Leu Glu Val Val Ser Lys His Phe Ser
100 105 110
Lys Ser Lys Arg Met Pro Ile Thr Tyr Asp Asn Gly Phe Leu Phe Ile
115 120 125
His Thr Asp Lys Pro Val Tyr Thr Pro Asp Gln Ser Val Lys Val Arg
130 135 140
Val Tyr Ser Leu Asn Asp Asp Leu Lys Pro Ala Lys Arg Glu Thr Val
145 150 155 160
Leu Thr Phe Ile Asp Pro Glu Gly Ser Glu Val Asp Met Val Glu Glu
165 170 175
Ile Asp His Ile Gly Ile Ile Ser Phe Pro Asp Phe Lys Ile Pro Ser
180 185 190
Asn Pro Arg Tyr Gly Met Trp Thr Ile Lys Ala Lys Tyr Lys Glu Asp
195 200 205
Phe Ser Thr Thr Gly Thr Ala Tyr Phe Glu Val Lys Glu Tyr Val Leu
210 215 220
Pro His Phe Ser Val Ser Ile Glu Pro Glu Tyr Asn Phe Ile Gly Tyr
225 230 235 240
Lys Asn Phe Lys Asn Phe Glu Ile Thr Ile Lys Ala Arg Tyr Phe Tyr
245 250 255
Asn Lys Val Val Thr Glu Ala Asp Val Tyr Ile Thr Phe Gly Ile Arg
260 265 270
Glu Asp Leu Lys Asp Asp Gln Lys Glu Met Met Gln Thr Ala Met Gln
275 280 285
Asn Thr Met Leu Ile Asn Gly Ile Ala Gln Val Thr Phe Asp Ser Glu
290 295 300
Thr Ala Val Lys Glu Leu Ser Tyr Tyr Ser Leu Glu Asp Leu Asn Asn
305 310 315 320
Lys Tyr Leu Tyr Ile Ala Val Thr Val Ile Glu Ser Thr Gly Gly Phe
325 330 335
Ser Glu Glu Ala Glu Ile Pro Gly Ile Lys Tyr Val Leu Ser Pro Tyr
340 345 350
Lys Leu Asn Leu Val Ala Thr Pro Leu Phe Leu Lys Pro Gly Ile Pro
355 360 365
Tyr Pro Ile Lys Val Gln Val Lys Asp Ser Leu Asp Gln Leu Val Gly
370 375 380
Gly Val Pro Val Thr Leu Asn Ala Gln Thr Ile Asp Val Asn Gln Glu
385 390 395 400
Thr Ser Asp Leu Asp Pro Ser Lys Ser Val Thr Arg Val Asp Asp Gly
405 410 415
Val Ala Ser Phe Val Leu Asn Leu Pro Ser Gly Val Thr Val Leu Glu
420 425 430
Phe Asn Val Lys Thr Asp Ala Pro Asp Leu Pro Glu Glu Asn Gln Ala
435 440 445
Arg Glu Gly Tyr Arg Ala Ile Ala Tyr Ser Ser Leu Ser Gln Ser Tyr
450 455 460
Leu Tyr Ile Asp Trp Thr Asp Asn His Lys Ala Leu Leu Val Gly Glu
465 470 475 480
His Leu Asn Ile Ile Val Thr Pro Lys Ser Pro Tyr Ile Asp Lys Ile
485 490 495
Thr His Tyr Asn Tyr Leu Ile Leu Ser Lys Gly Lys Ile Ile His Phe
500 505 510
Gly Thr Arg Glu Lys Phe Ser Asp Ala Ser Tyr Gln Ser Ile Asn Ile
515 520 525
Pro Val Thr Gln Asn Met Val Pro Ser Ser Arg Leu Leu Val Tyr Tyr
530 535 540
Ile Val Thr Gly Glu Gln Thr Ala Glu Leu Val Ser Asp Ser Val Trp
545 550 555 560
Leu Asn Ile Glu Glu Lys Cys Gly Asn Gln Leu Gln Val His Leu Ser
565 570 575
Pro Asp Ala Asp Ala Tyr Ser Pro Gly Gln Thr Val Ser Leu Asn Met
580 585 590
Ala Thr Gly Met Asp Ser Trp Val Ala Leu Ala Ala Val Asp Ser Ala
595 600 605
Val Tyr Gly Val Gln Arg Gly Ala Lys Lys Pro Leu Glu Arg Val Phe
610 615 620
Gln Phe Leu Glu Lys Ser Asp Leu Gly Cys Gly Ala Gly Gly Gly Leu
625 630 635 640
Asn Asn Ala Asn Val Phe His Leu Ala Gly Leu Thr Phe Leu Thr Asn
645 650 655
Ala Asn Ala Asp Asp Ser Gln Glu Asn Asp Glu Pro Cys Lys Glu Ile
660 665 670
Leu Arg Pro Arg Arg Thr Leu Gln Lys Lys Ile Glu Glu Ile Ala Ala
675 680 685
Lys Tyr Lys His Ser Val Val Lys Lys Cys Cys Tyr Asp Gly Ala Cys
690 695 700
Val Asn Asn Asp Glu Thr Cys Glu Gln Arg Ala Ala Arg Ile Ser Leu
705 710 715 720
Gly Pro Arg Cys Ile Lys Ala Phe Thr Glu Cys Cys Val Val Ala Ser
725 730 735
Gln Leu Arg Ala Asn Ile Ser His Lys Asp Met Gln Leu Gly Arg Leu
740 745 750
His Met Lys Thr Leu Leu Pro Val Ser Lys Pro Glu Ile Arg Ser Tyr
755 760 765
Phe Pro Glu Ser Trp Leu Trp Glu Val His Leu Val Pro Arg Arg Lys
770 775 780
Gln Leu Gln Phe Ala Leu Pro Asp Ser Leu Thr Thr Trp Glu Ile Gln
785 790 795 800
Gly Val Gly Ile Ser Asn Thr Gly Ile Cys Val Ala Asp Thr Val Lys
805 810 815
Ala Lys Val Phe Lys Asp Val Phe Leu Glu Met Asn Ile Pro Tyr Ser
820 825 830
Val Val Arg Gly Glu Gln Ile Gln Leu Lys Gly Thr Val Tyr Asn Tyr
835 840 845
Arg Thr Ser Gly Met Gln Phe Cys Val Lys Met Ser Ala Val Glu Gly
850 855 860
Ile Cys Thr Ser Glu Ser Pro Val Ile Asp His Gln Gly Thr Lys Ser
865 870 875 880
Ser Lys Cys Val Arg Gln Lys Val Glu Gly Ser Ser Ser His Leu Val
885 890 895
Thr Phe Thr Val Leu Pro Leu Glu Ile Gly Leu His Asn Ile Asn Phe
900 905 910
Ser Leu Glu Thr Trp Phe Gly Lys Glu Ile Leu Val Lys Thr Leu Arg
915 920 925
Val Val Pro Glu Gly Val Lys Arg Glu Ser Tyr Ser Gly Val Thr Leu
930 935 940
Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Gly Thr Ile Ser Arg Arg Lys Glu Phe Pro
945 950 955 960
Tyr Arg Ile Pro Leu Asp Leu Val Pro Lys Thr Glu Ile Lys Arg Ile
965 970 975
Leu Ser Val Lys Gly Leu Leu Val Gly Glu Ile Leu Ser Ala Val Leu
980 985 990
Ser Gln Glu Gly Ile Asn Ile Leu Thr His Leu Pro Lys Gly Ser Ala
995 1000 1005
Glu Ala Glu Leu Met Ser Val Val Pro Val Phe Tyr Val Phe His
1010 1015 1020
Tyr Leu Glu Thr Gly Asn His Trp Asn Ile Phe His Ser Asp Pro
1025 1030 1035
Leu Ile Glu Lys Gln Lys Leu Lys Lys Lys Leu Lys Glu Gly Met
1040 1045 1050
Leu Ser Ile Met Ser Tyr Arg Asn Ala Asp Tyr Ser Tyr Ser Val
1055 1060 1065
Trp Lys Gly Gly Ser Ala Ser Thr Trp Leu Thr Ala Phe Ala Leu
1070 1075 1080
Arg Val Leu Gly Gln Val Asn Lys Tyr Val Glu Gln Asn Gln Asn
1085 1090 1095
Ser Ile Cys Asn Ser Leu Leu Trp Leu Val Glu Asn Tyr Gln Leu
1100 1105 1110
Asp Asn Gly Ser Phe Lys Glu Asn Ser Gln Tyr Gln Pro Ile Lys
1115 1120 1125
Leu Gln Gly Thr Leu Pro Val Glu Ala Arg Glu Asn Ser Leu Tyr
1130 1135 1140
Leu Thr Ala Phe Thr Val Ile Gly Ile Arg Lys Ala Phe Asp Ile
1145 1150 1155
Cys Pro Leu Val Lys Ile Asp Thr Ala Leu Ile Lys Ala Asp Asn
1160 1165 1170
Phe Leu Leu Glu Asn Thr Leu Pro Ala Gln Ser Thr Phe Thr Leu
1175 1180 1185
Ala Ile Ser Ala Tyr Ala Leu Ser Leu Gly Asp Lys Thr His Pro
1190 1195 1200
Gln Phe Arg Ser Ile Val Ser Ala Leu Lys Arg Glu Ala Leu Val
1205 1210 1215
Lys Gly Asn Pro Pro Ile Tyr Arg Phe Trp Lys Asp Asn Leu Gln
1220 1225 1230
His Lys Asp Ser Ser Val Pro Asn Thr Gly Thr Ala Arg Met Val
1235 1240 1245
Glu Thr Thr Ala Tyr Ala Leu Leu Thr Ser Leu Asn Leu Lys Asp
1250 1255 1260
Ile Asn Tyr Val Asn Pro Val Ile Lys Trp Leu Ser Glu Glu Gln
1265 1270 1275
Arg Tyr Gly Gly Gly Phe Tyr Ser Thr Gln Asp Thr Ile Asn Ala
1280 1285 1290
Ile Glu Gly Leu Thr Glu Tyr Ser Leu Leu Val Lys Gln Leu Arg
1295 1300 1305
Leu Ser Met Asp Ile Asp Val Ser Tyr Lys His Lys Gly Ala Leu
1310 1315 1320
His Asn Tyr Lys Met Thr Asp Lys Asn Phe Leu Gly Arg Pro Val
1325 1330 1335
Glu Val Leu Leu Asn Asp Asp Leu Ile Val Ser Thr Gly Phe Gly
1340 1345 1350
Ser Gly Leu Ala Thr Val His Val Thr Thr Val Val His Lys Thr
1355 1360 1365
Ser Thr Ser Glu Glu Val Cys Ser Phe Tyr Leu Lys Ile Asp Thr
1370 1375 1380
Gln Asp Ile Glu Ala Ser His Tyr Arg Gly Tyr Gly Asn Ser Asp
1385 1390 1395
Tyr Lys Arg Ile Val Ala Cys Ala Ser Tyr Lys Pro Ser Arg Glu
1400 1405 1410
Glu Ser Ser Ser Gly Ser Ser His Ala Val Met Asp Ile Ser Leu
1415 1420 1425
Pro Thr Gly Ile Ser Ala Asn Glu Glu Asp Leu Lys Ala Leu Val
1430 1435 1440
Glu Gly Val Asp Gln Leu Phe Thr Asp Tyr Gln Ile Lys Asp Gly
1445 1450 1455
His Val Ile Leu Gln Leu Asn Ser Ile Pro Ser Ser Asp Phe Leu
1460 1465 1470
Cys Val Arg Phe Arg Ile Phe Glu Leu Phe Glu Val Gly Phe Leu
1475 1480 1485
Ser Pro Ala Thr Phe Thr Val Tyr Glu Tyr His Arg Pro Asp Lys
1490 1495 1500
Gln Cys Thr Met Phe Tyr Ser Thr Ser Asn Ile Lys Ile Gln Lys
1505 1510 1515
Val Cys Glu Gly Ala Ala Cys Lys Cys Val Glu Ala Asp Cys Gly
1520 1525 1530
Gln Met Gln Glu Glu Leu Asp Leu Thr Ile Ser Ala Glu Thr Arg
1535 1540 1545
Lys Gln Thr Ala Cys Lys Pro Glu Ile Ala Tyr Ala Tyr Lys Val
1550 1555 1560
Ser Ile Thr Ser Ile Thr Val Glu Asn Val Phe Val Lys Tyr Lys
1565 1570 1575
Ala Thr Leu Leu Asp Ile Tyr Lys Thr Gly Glu Ala Val Ala Glu
1580 1585 1590
Lys Asp Ser Glu Ile Thr Phe Ile Lys Lys Val Thr Cys Thr Asn
1595 1600 1605
Ala Glu Leu Val Lys Gly Arg Gln Tyr Leu Ile Met Gly Lys Glu
1610 1615 1620
Ala Leu Gln Ile Lys Tyr Asn Phe Ser Phe Arg Tyr Ile Tyr Pro
1625 1630 1635
Leu Asp Ser Leu Thr Trp Ile Glu Tyr Trp Pro Arg Asp Thr Thr
1640 1645 1650
Cys Ser Ser Cys Gln Ala Phe Leu Ala Asn Leu Asp Glu Phe Ala
1655 1660 1665
Glu Asp Ile Phe Leu Asn Gly Cys
1670 1675
<210> 4
<211> 108
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL SEQUENCE
<220>
<223> Engineered C5 binding Z variant
<400> 4
Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Val Leu Glu Ala Trp Asp Glu Ile
1 5 10 15
Asp Arg Leu Pro Asn Leu Thr Ile Glu Gln Trp Leu Ala Phe Ile Asn
20 25 30
Lys Leu Asp Arg Gln Pro Glu Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Val Asp Gly Ser Leu Ala
50 55 60
Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly Val Ser
65 70 75 80
Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu Gly Val
85 90 95
Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro
100 105
<210> 5
<211> 108
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL SEQUENCE
<220>
<223> Engineered C5 binding Z variant
<400> 5
Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Val Leu Glu Ala Trp Asp Glu Ile
1 5 10 15
Asp Arg Leu Pro Asn Leu Thr Ile Glu Gln Trp Leu Ala Phe Ile Asn
20 25 30
Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Ser Glu Ser Gln Ala Pro Lys Val Asp Gly Ser Leu Ala
50 55 60
Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly Val Ser
65 70 75 80
Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu Gly Val
85 90 95
Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro
100 105
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<212> PRT
<213> ARTIFICIAL SEQUENCE
<220>
<223> Engineered C5 binding Z variant
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Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Val Leu Glu Ala Trp Asp Glu Ile
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Asp Arg Leu Pro Asn Leu Thr Ile Glu Gln Trp Leu Ala Phe Ile Asn
20 25 30
Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Val Asp Gly Ser Leu Ala
50 55 60
Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser
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Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asn Lys Ala Lys Thr Val Glu Gly Val
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Glu Ala Leu Lys Leu His Ile Leu Ala Ala Leu Pro
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<212> PRT
<213> ARTIFICIAL SEQUENCE
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<223> Engineered C5 binding Z variant
<400> 7
Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Val Leu Glu Ala Trp Ser Glu Ile
1 5 10 15
Asp Arg Leu Pro Asn Leu Thr Ile Glu Gln Trp Leu Ala Phe Ile Asn
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Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Val Asp Gly Ser Leu Ala
50 55 60
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35 40 45
Claims (16)
- 하기 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩티드:
i) EX2X3X4AX6X7EIX10 X11LPNLX16X17X18QX20 X21AFIX25X26LX28X29X30 PX32QSX35X36LLX39E AKKLX45X46X47Q; 및
ii) i)에서 정의된 서열과 적어도 91 % 동일성을 갖고, 단 X45가 N일 때 X46은 D가 아닌, 아미노산 서열.
여기서, 각각의 X2, X3, X4, X6, X7, X10, X11, X17, X18, X20, X21, X25 및 X28은 독립적으로 임의의 아미노산 잔기에 해당하고;
서로 독립적으로,
X16은 N 및 T 중에서 선택되고;
X26은 K 및 S 중에서 선택되고;
X29X30PX32는 DDPS 및 RQPE 중에서 선택되고;
X35는 A 및 S 중에서 선택되고;
X36은 E 및 N 중에서 선택되고;
X39는 A, C 및 S 중에서 선택되고;
X45는 E, N 및 S 중에서 선택되고;
X46은 D, E 및 S 중에서 선택되고, 단 X45가 N일 때 X46은 D가 아니고;
X47은 A 및 S 중에서 선택된다. - 제1항에 있어서,
X45가 S인, 폴리펩티드. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
X45X46이 ES 및 SE 중에서 선택되는, 폴리펩티드. - 제3항에 있어서,
X45X46이 SE인, 폴리펩티드. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
하기 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩티드:
YAK EX2X3X4AX6X7EIX10 X11LPNLX16X17X18QX20 X21AFIX25X26LX28X29X30 PX32QSX35X36LLX39E AKKLX45X46X47Q AP; 및
FNK EX2X3X4AX6X7EIX10 X11LPNLX16X17X18QX20 X21AFIX25X26LX28X29X30 PX32QSX35X36LLX39E AKKLX45X46X47Q AP.
여기서, 각각의 Xy는 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같다. - 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 모이어티로서 포함하는, 융합 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드를 코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
- 폴리펩티드 변이체 군 내의 각 폴리펩티드가 하기 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 공지된 스캐폴드에 기반한 폴리펩티드 변이체 군:
i) EX2X3X4AX6X7EIX10 X11LPNLX16X17X18QX20 X21AFIX25X26LX28X29X30 PX32QSX35X36LLX39E AKKLX45X46X47Q; 및
ii) i)에서 정의된 서열과 적어도 91 % 동일성을 갖고, 단 X45가 N일 때 X46은 D가 아닌, 아미노산 서열.
여기서, 각각의 X2, X3, X4, X6, X7, X10, X11, X17, X18, X20, X21, X25 및 X28은 독립적으로 임의의 아미노산 잔기에 해당하고;
서로 독립적으로,
X16은 N 및 T 중에서 선택되고;
X26은 K 및 S 중에서 선택되고;
X29X30PX32는 DDPS 및 RQPE 중에서 선택되고;
X35는 A 및 S 중에서 선택되고;
X36은 E 및 N 중에서 선택되고;
X39는 A, C 및 S 중에서 선택되고;
X45는 E, N 및 S 중에서 선택되고;
X46은 D, E 및 S 중에서 선택되고, 단 X45가 N일 때 X46은 D가 아니고;
X47은 A 및 S 중에서 선택된다. - 제8항에 있어서,
적어도 1 x 104 개의 독특한 폴리펩티드 분자를 포함하는, 폴리펩티드 변이체 군. - 폴리뉴클레오티드 군의 각 구성원이 제8항 또는 제9항에 따른 폴리펩티드 군의 구성원을 코딩하는 것으로 특징지어지는, 폴리뉴클레오티드 군.
- 제8항 또는 제9항에 따른 폴리펩티드 군과 제10항에 따른 폴리뉴클레오티드 군의 배합물로서, 상기 폴리펩티드 군의 각 구성원이 유전자형-표현형 커플링을 위한 수단을 통해 구성원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 물리적으로 또는 공간적으로(spatially) 연합되는, 배합물.
- 제11항에 있어서,
상기 유전자형-표현형 커플링을 위한 수단이 파지 디스플레이 시스템을 포함하는, 배합물. - 폴리펩티드 군으로부터 기결정된(predetermined) 표적물에 대해 친화성을 갖는 목적하는 폴리펩티드를 선별하기 위한 방법으로서,
(a) 제8항 또는 제9항에 따른 폴리펩티드 군을 제공하는 단계;
(b) 표적물과 표적물에 대해 친화성을 갖는 적어도 하나의 목적하는 폴리펩티드 간의 특이적인 상호작용을 가능하게 하는 조건하에서, 폴리펩티드 군을 기결정된 표적물과 접촉시키는 단계;
(c) 상기 특이적인 상호작용에 기반하여, 남아있는 폴리펩티드 군으로부터 적어도 하나의 목적하는 폴리펩티드를 선별하는 단계를 포함하는, 방법. - 기결정된 표적물에 대해 친화성을 갖는 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 단리하기 위한 방법으로서,
- 제13항에 따른 방법을 사용하여 폴리펩티드 군으로부터 상기 목적하는 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 선별하는 단계; 및
- 이에 따라 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 단리하는 단계를 포함하는, 방법. - 기결정된 표적물에 대해 친화성을 갖는 목적하는 폴리펩티드를 동정하기 위한 방법으로서,
- 제14항에 따른 방법을 사용하여 상기 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 단리하는 단계; 및
- 폴리뉴클레오티드를 시퀀싱하여 상기 목적하는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 연역에 의해 규정하는 단계를 포함하는, 방법. - 폴리펩티드 군으로부터 기결정된 표적물에 대해 친화성을 갖는 목적하는 폴리펩티드를 선별 및 동정하기 위한 방법으로서,
(a) 별도의 캐리어 또는 비드 상에 제8항 또는 제9항에 따른 폴리펩티드 군의 각 구성원을 합성하는 단계;
(b) 폴리펩티드와 기결정된 표적물과의 상호작용에 기반하여 캐리어 또는 비드를 선별하거나 농축시키는 단계; 및
(c) 단백질 특성화 절차(methodology)에 의해 폴리펩티드를 동정하는 단계를 포함하는, 방법.
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