ES2708657T3 - Composición y método para afectar la unión de polipéptidos de unión a antígeno a antígenos - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende i) un polipéptido que comprende calmodulina y dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas, en el que dichos dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas están unidos a través de dicha calmodulina, ii) una molécula de unión a la calmodulina; iii) los iones que se unen al sitio de unión de Ca2+ de la calmodulina, en la que la unión de dicha molécula de unión a la calmodulina y de dichos iones a dicho sitio de unión de Ca2+ de la calmodulina afecta la unión de dicho polipéptido a un antígeno para estar unidos por dicho polipéptido.

Description

DESCRIPCION

Composicion y metodo para afectar la union de polipeptidos de union a antigeno a antigenos

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere al campo de la modulacion de union de polipeptidos de union a antigeno, en particular a un sistema basado en enlazador de calmodulina para dicha modulacion.

Antecedentes de la invencion

Los polipeptidos de union a antigeno tales como fragmentos variables de cadena sencilla (scFv) comprenden los dominios variables de la cadena ligera (V^l) y pesada (V^h) de un anticuerpo correspondiente de longitud completa. Una arquitectura similar tambien se ha aplicado a los receptores de celulas T estructuralmente similares (scTv), asf como a los fragmentos scFab. En tales constructos, ambas cadenas estan conectadas normalmente por un enlazador que es flexible y no muestra ninguna tendencia a interferir con el plegamiento de los dominios de inmunoglobulina individuales. En muchos casos, estos enlazadores contienen ensamblajes o variaciones de repeticiones (Gly4Ser), inspiradas en los enlazadores no estructurados que conectan los dominios de la protema III de la capa menor del bacteriofago filamentoso.

Los fragmentos de anticuerpos ScFv se usan ampliamente en una variedad de aplicaciones, tales como para investigacion, propositos de diagnostico e incluso como agentes terapeuticos. Las inmunotoxinas, que se utilizan para terapia del cancer, a menudo se basan en un fragmento de cadena sencilla fusionado con una toxina bacteriana para mediar en la destruccion selectiva. Otro enfoque se basa en los anticuerpos biespedficos (BiTE, promotores de celulas T biespedficas) que activan y redirigen las celulas T citotoxicas contra las celulas cancerosas. La terapia con celulas T con CAR (receptor de antfgeno quimerico) tambien se basa en scFv espedficos para celulas malignas. Es esencial para todas estas aplicaciones la extraordinaria especificidad, selectividad y afinidad de los paratopes de anticuerpos. Estas propiedades tambien senan muy utiles para la purificacion de biomateriales, en particular protemas, vacunas o celulas. Sin embargo, la afinidad generalmente muy alta de los anticuerpos requiere condiciones de elucion severas, que normalmente afectan el plegamiento, la integridad o la viabilidad de los materiales eluidos. Por lo tanto, los anticuerpos que conservan su excelente especificidad mientras se ajustan con respecto a su afinidad sin requerir condiciones severas para este ajuste senan ventajosos para la purificacion de protemas, la separacion celular y el analisis celular. Incluso la introduccion de un anticuerpo ajustable por afinidad para la terapia se puede prever, por ejemplo, como un mecanismo de seguridad adicional en la terapia con celulas T con CAR.

Kobatake, E. et al. (2012, Biotechnol Lett 34, 1019-23) divulgan un anticuerpo de afinidad que puede ser cambiada en respuesta al calcio. El sistema se basa en un peptido de fusion que comprende scFv, calmodulina de tipo silvestre (TS) y un peptido de union a calmodulina. El cambio se genera por la adicion de calcio al sistema. Una desventaja es que la solucion debe estar libre de calcio antes del cambio deseado.

Meister, G. E. y Joshi, N. S. (2013, Chembiochem 14, 1460-7) divulgan una enzima conmutable que se basa en la interaccion de la calmodulina de TS y el peptido M13 soluble. En la forma unida a peptido, la enzima exhibe una actividad catalttica hasta 120 veces mayor en comparacion con el estado inactivo (no unido a peptido).

El documento WO2002014371A1 divulga constructos de Fv que tienen una afinidad que puede ser influenciada para que una sustancia se enlace, en la que los constructos de Fv tienen peptidos unidos a las regiones variables y que contienen sitios de union para moleculas efectoras. Las moleculas efectoras son iones o anticuerpos.

Guntas, G. et al., (2004, Chem Biol 11, 1483-7) y el documento WO2003078575A2 divulgan la creacion de un interruptor molecular de la enzima TEM1 p-lactamasa al permutar circularmente el gen que codifica la enzima TEM1 p-lactamasa y luego insertarlo en el gen que codifica protema de union a maltosa de E. Coli que funciona como el enlazador.

El documento WO2005/072392A2 divulga interruptores moleculares, por ejemplo, con una actividad de cambio mayor que la demostrada anteriormente, o con reconocimiento y union de ligandos alterados, y metodos para elaborar estas moleculas que implican la permutacion circular de secuencias de acido nucleico o de aminoacidos. Los interruptores moleculares se han creado mediante la recombinacion de genes no homologos in vitro y el sometimiento de los genes a la presion evolutiva utilizando tecnicas combinatorias. El enfoque se concibe como el "rodamiento" de dos protemas a traves de las superficies de cada una y fusionandolas en los puntos donde sus superficies se encuentran. El enfoque permite la recombinacion y la prueba de numeros maximos de configuraciones geometricas entre los dos dominios. Se proporcionan bibliotecas que comprenden vastas cantidades de tales moleculas fusionadas a partir de las cuales se pueden aislar interruptores moleculares con caractensticas optimas.

Megeed, Z. et al., (2006, Biomacromolecules 7, 999-1004) divulgan un peptido de fusion de scFv con elastina como enlazador que da como resultado una afinidad dependiente de la temperatura del dominio de union al antfgeno con el antfgeno.

Miyawaki, A. y col. (1997, Nature 388, 882-887) divulgan un polipeptido que comprende una protema fluorescente, en el que sus dominios estan unidos por un peptido M13 de calmodulina. Baird et al. (1999, PNAS 96: 11241-11246) demostro que varios reordenamientos de GFP, en los que las porciones amino y carboxilo se intercambian y se vuelven a unir con un espaciador corto que conecta los terminales originales, todavfa proporcionan fluorescencia. Estas permutaciones circulares han alterado los valores de pKa y las orientaciones del cromoforo con respecto a un companero de fusion. Ademas, ciertas ubicaciones dentro de la GFP toleran la insercion de protemas completas, y los cambios conformacionales en el inserto pueden tener efectos profundos en la fluorescencia. Por ejemplo, las inserciones de calmodulina o un dominio de dedo de zinc en lugar de Tyr-145 de un mutante amarillo (protema fluorescente amarilla mejorada) de GFP dan como resultado protemas indicadoras cuya fluorescencia se puede mejorar varias veces tras la union del metal. El injerto de calmodulina en una protema fluorescente amarilla mejorada puede controlar el Ca2+ citosolico en celulas de mairnfero individuales.

Nagai et al. (2001, PNAS 98: 3197-3202) mostro mediante el uso de una protema fluorescente verde permutada circularmente (cpGFP), en la que las porciones de amino y carboxilo se hadan intercambiado y reconectado mediante un espaciador corto entre los extremos originales que podfan visualizar las interacciones protema-protema dependientes de Ca2+ en celulas vivas mediante lecturas de fluorescencia. La cpGFP se fusiono con la calmodulina y su peptido derivado del ligando, M13. La protema quimerica era fluorescente y sus propiedades espectrales cambiaron reversiblemente con la cantidad de Ca2+.

La calmodulina (CaM) experimenta grandes cambios conformacionales, dependiendo de la presencia de calcio y peptidos de union a calmodulina (CBP). En una forma no unida de calcio y peptido, adopta una conformacion cerrada (Kuboniwa, H. et al., 1995, Nat Struct Biol 2, 768-776). La distancia entre el extremo terminal N y C es maxima en la forma abierta unida al calcio (Chattopadhyaya, R. et al., 1992, J Mol Biol 228, 1177-1192), mientras que los extremos terminales se aproximan entre sf cuando la calmodulina se une a un ligando, o un fragmento adecuado del mismo, como el peptido M13 (Ikura, M. et al., 1992, Science 256, 632-638).

Montigiani et al. (1996, J. Mol. Biol. 258: 6-13) y Hultschig et al. (2004, J. Mol. Biol. 343: 559-568) identificaron mutantes de alta afinidad del peptido de union a CaM "M13" que se deriva de la quinasa de cadena ligera de la miosina de conejo.

Existe una necesidad en la tecnica de una composicion alternativa o mejorada y/o un metodo para afectar la union de polipeptidos de union a antfgeno a sus antfgenos respectivos.

Sumario de la invencion

Sorprendentemente, los inventores demostraron que un polipeptido que comprende calmodulina (CaM) y dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas, en el que dichos dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas estan unidos a traves de dicha calmodulina (un "enlazador de calmodulina"), se puede usar para afectar en ambas direcciones la union de dicho polipeptido a su antfgeno al poner en contacto dicho polipeptido con una molecula de union a la calmodulina y los iones que se unen al sitio de union de Ca2+ de la calmodulina. La union concertada de dicha molecula de union a calmodulina y de dichos iones a dicho sitio de union de Ca2+ de la calmodulina conduce a cambios conformacionales e influye en la union de dicho polipeptido para que un antfgeno se una a dicho polipeptido. El sistema (o composicion) que comprende las tres partes i) el polipeptido con CaM como enlazador entre los dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas, ii) la molecula de union a CaM, tal como un peptido de union a CaM (por ejemplo, peptido M13), y iii) los iones que se unen al sitio de union de Ca2+ de CaM, tal como Ca2+, es superior en comparacion con los sistemas conocidos en la tecnica: no es un requisito previo para que un sistema funcional elimine los iones de calcio de la solucion que comprende dicho polipeptido antes de cambiar la union del polipeptido a su antfgeno. El cambio solo se logra mediante la adicion de moleculas de union a CaM solubles, tales como el peptido M13, a la solucion en presencia de iones que se unen al sitio de union de Ca2+ de CaM. Esto es superior en comparacion con los sistemas conocidos en la tecnica, en particular para el uso en organismos vivos, por ejemplo cuando se usa para modular la afinidad de un CAR en una celula T u otra celula efectora adecuada, como en esta situacion, la concentracion de Ca2+ puede no ser suficientemente ajustable.

Incluso mas sorprendentemente, se encontro que una permutacion del componente enlazador, es decir, la calmodulina, daba como resultado un cambio aun mas fuerte de la union del polipeptido de la invencion a su antfgeno en comparacion con el uso del CaM de TS descrito como enlazador, al menos por un factor de 2, como se muestra en el Ejemplo 5 (vease tambien las FIG. 5B, C, D). Regularmente, en la tecnica se ha usado una permutacion en sistemas comparables (polipeptidos con dominios de union a antfgeno) solo con respecto a la parte no enlazadora.

Tambien inesperadamente el uso de variantes del peptido M13 normalmente usado o el uso de otros peptidos que no sean el peptido M13 en el sistema (o las composiciones) divulgados en este documento dio como resultado un cambio mas fuerte de union del polipeptido como se divulga en este documento a su antfgeno en comparacion con el uso del peptido M13 mismo.

Los mejores resultados con respecto a una modulacion de enlace conmutable se logran cuando se combina CaM permutada con variantes del peptido M13 u otros peptidos distintos del peptido M13, algunas combinaciones espedficas de las CaM permutadas definidas los peptidos de union definidos a CaM son especialmente preferidos como se divulga en este documento.

Sorprendentemente, el cambio en la union de los dominios de union a antigeno del polipeptido desencadenado por la union de una molecula de union a CaM y los iones al enlazador de calmodulina del polipeptido puede resultar en una union mejorada o en una union reducida del polipeptido a su antigeno.

Los polipeptidos como se divulga en el presente documento pueden liberarse del antigeno de union mediante la adicion de moleculas de union a CaM, tales como el peptido M13 y iones, tales como Ca2+, sin condiciones adversas.

La aplicabilidad general de una secuencia de calmodulina como un enlazador universal para regular la union de un polipeptido que comprende dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas se ha demostrado aqu en primer lugar para diferentes scFv, incluyendo uno espedfico para la lisozima, y en segundo lugar, otros scFv con afinidades bastante diferentes y clases de antigenos, incluyendo protemas y haptenos.

En el presente documento se divulgan composiciones que comprenden los componentes mencionados anteriormente, metodos para afectar la union de los polipeptidos y el uso de los polipeptidos para afectar la union de los polipeptidos a sus antigenos.

Breve descripcion de los dibujos

Figura 1: Clonacion de variantes de calmodulina permutadas circularmente.

Figura 2: Identificacion de variantes de calmodulina-scFv anti-lisozima intercambiables por ELISA competitivo.

Figura 3: Analisis del comportamiento de union dependiente del peptido M13 de las variantes de calmodulina anti-scFv de lisozima mediante ELlSA competitivo (A) y ELISA de liberacion (B).

Figura 4: Evaluacion de la disminucion espedfica dependiente del peptido M13 de la senal de union por ELISA de titulacion (A, B, C, D, E, F, G, H).

Figura 5: Identificacion de fusiones de calmodulina-scFv anti-CD14, anti-biotina y anti-CD4 conmutables mediante tincion competitiva de PBMC y analisis por citometna de flujo (A). Comparacion de la extension de las propiedades moduladoras de la union de diferentes variantes del enlazador de calmodulina en scFv anti-CD14 (B), scFv anti-biotina (C) y scFv anti-CD4 (D).

Figura 6: Vision general de otros peptidos de union a calmodulina con propiedades moduladoras de union (A, B). Figura 7: Identificacion de peptidos de union a calmodulina adicionales con propiedades moduladoras de union -peptidos mas prometedores (A, B, C).

Descripcion detallada de la invencion

En un primer aspecto, la invencion proporciona una composicion (un sistema, un conjunto o un kit) que comprende i) un polipeptido que comprende calmodulina y dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas, en el que dichos dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas estan unidos a traves de dicha calmodulina; y

ii) una molecula de union a la calmodulina; y

iii) los iones que se unen al sitio de union de Ca2+ de la calmodulina,

en la que la union de dicha molecula de union a la calmodulina y de dichos iones afecta la union de dicho polipeptido a un antfgeno que se une a dicho polipeptido.

La calmodulina es una secuencia de enlace entre los dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas y sirve como un regulador alosterico universal de estos dos dominios. La CaM (o la secuencia de CaM) puede ser cualquier secuencia o parte de una secuencia de CaM que mantiene las caractensticas de la protema calmodulina de TS para unirse tanto a iones en el sitio de union de Ca2+ como a una molecula de union a calmodulina, y por lo tanto cambiando su conformacion. Esto incluye una calmodulina o una secuencia de calmodulina con una identidad de secuencia de al menos el 70%, o al menos el 75%, o al menos el 80%, o al menos el 85%, o al menos el 90%, o al menos el 95%, o al menos el 97%, o al menos el 98%, o al menos el 99% a nivel de la secuencia de aminoacidos con la calmodulina de tipo silvestre.

La secuencia de calmodulina tambien puede ser un fragmento funcional de la protema de calmodulina de longitud completa (por ejemplo, una protema truncada de calmodulina) o un fragmento de la protema calmodulina de longitud completa que tiene una identidad de secuencia de al menos el 70%, o al menos el 75%, o al menos el 80%, o al menos el 85%, o al menos el 90%, o al menos el 95%, o al menos el 97%, o al menos el 98%, o al menos el 99% al nivel de secuencia de aminoacidos con la parte correspondiente de dicha calmodulina de longitud completa.

En general, todas las variaciones de aminoacidos (es decir, sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoacidos de la calmodulina) estan incluidas en esta definicion, que no conducen a la perdida de las caractensticas descritas de la calmodulina para proporcionar el cambio alosterico o un fragmento funcional de la misma para unir tanto iones en el lado de union de Ca2+ como una molecula de union a calmodulina, y por lo tanto cambiar su conformacion.

La composicion como se divulgo anteriormente, en la que dicha union de dicha molecula de union a calmodulina y de dichos iones al sitio de union de Ca2+ de la calmodulina potencia o reduce la union de dicho polipeptido a dicho antigeno.

Dicha molecula de union a calmodulina puede ser un peptido de union a calmodulina. Dicho peptido de union a la calmodulina puede seleccionarse y derivarse del grupo de ligandos de calmodulina naturales que consisten en la quinasa de la cadena ligera de miosina, caldesmona, calspermina, fosfofructoquinasa, calcineurina, ATPasa de calcio, espectrina, receptor de glutamato, oxidasa mtrica sintasa, protema serina/treonina fosfatasa, receptor del factor de necrosis tumoral, receptor de estrogeno, subunidades de los canales de calcio y protemas quinasas dependientes de calcio/calmodulina. Dicho peptido de union a CaM puede ser un peptido M13 derivado de la quinasa de cadena ligera de miosina de conejo o una variante de la misma.

Dicho peptido de union a calmodulina puede seleccionarse del grupo de peptidos que consiste en la SEQ ID NO: 1 a la SEQ iD NO: 65. Preferentemente, dicho peptido de union a calmodulina puede seleccionarse del grupo de peptidos que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 53.

Pero en general, se puede usar cualquier peptido o polipeptido que pueda unirse a CaM y, por lo tanto, proporcione el cambio alosterico.

Estructuras tridimensionales de calmodulina en complejo con sustratos peptfdicos de alta afinidad estan disponibles (Montigiani et al., 996, J. Mol. Biol. 258: 6-13). Estos peptidos corresponden a las regiones de union a la calmodulina de diferentes protemas quinasas. Alternativamente, los metodos tales como la presentacion en fagos peptfdicos, la presentacion en ribosomas u otros sistemas de seleccion combinatoria establecidos bien conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Ullman CG et al. Brief Funct Genomics, mayo de 2011; 10 (3): 125-34 o Galan A et al. Mol Biosyst, 16 de junio de 2016 [publicacion electronica antes de la impresion]) puede usarse para identificar variantes de secuencias naturales o secuencias sinteticas que pueden unirse a la calmodulina.

Dichos iones que se unen al sitio de union de Ca2+ de la calmodulina pueden ser cualquier ion que pueda unirse mediante el sitio de union de Ca2+ de la calmodulina, lo que resulta en un cambio conformacional de la CaM en presencia de una molecula de union a CaM, preferiblemente, dichos iones son iones de calcio (Ca2+).

Dicha calmodulina puede ser una calmodulina permutada. En general, se puede generar una CaM permutada, por ejemplo, mediante permutacion circular, un metodo general para permutar protemas que es bien conocido en la tecnica (vease, por ejemplo, " Circular Permutation of Proteins" en "Protein Engineering Handbook" (Ed.: Stefan Lutz, Uwe T. Bornscheuer) Wiley-VCH 2009), y como se describe en el presente documento.

Alternativamente, una CaM permutada puede generarse sinteticamente a nivel de acido nucleico o aminoacido, especialmente puede generarse sinteticamente cuando la secuencia que se pretende usar para la generacion del polipeptido como se divulga en el presente documento que comprende la CaM permutada es conocida y puede generarse a proposito.

Como se demuestra en el presente documento, la gran mayona de las calmodulinas permutadas generadas y utilizadas en este documento inducen una regulacion de la union de los polipeptidos como se divulga en este documento (FIG. 2) mediante la adicion de diferentes moleculas de union a CaM y iones tales como Ca2+, en donde la regulacion de la union es mas distinta que la regulacion por la CaM de tipo silvestre (FIG. 5B, C, D).

Dicho polipeptido de dicha composicion que comprende dicha calmodulina permutada y dichos dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas, en el que dichos dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas estan unidos a traves de dicha calmodulina permutada se puede obtener, por ejemplo, por el metodo que comprende

a) Creacion de al menos una secuencia de acido nucleico de insercion que codifica una calmodulina permutada

b) Creacion de una secuencia de acido nucleico aceptor que codifica un polipeptido que comprende dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas

c) Insertar al menos una secuencia de insercion de a) en la secuencia aceptora de b), en la que se inserta una secuencia de insercion de a) entre las partes de la secuencia aceptora b) que codifican los dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas de b)

d) Transformar un huesped con las secuencias de acido nucleico de c)

e) Seleccion de los huespedes transformados que albergan la secuencia o secuencias de c)

f) Deteccion de los huespedes transformados que expresan polipeptidos que comprenden dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas unidos a traves de calmodulina permutada exponiendo los polipeptidos producidos por los huespedes transformados a dicha molecula de union a calmodulina e identificando los huespedes transformados que albergan polipeptidos que impactan la union de dichos polipeptidos al antfgeno en la presencia de iones que se unen al sitio de union de Ca2+ de la calmodulina.

La calmodulina permutada de la composicion como se describio anteriormente puede seleccionarse del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 67 a la s Eq ID NO: 123. Preferiblemente, la calmodulina permutada de la composicion como se describio anteriormente se puede seleccionar del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 67 a la SEQ ID NO: 72. Lo mas preferible es que la calmodulina permutada se pueda seleccionar del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 67, la SEQ ID NO: 68, la SEQ ID NO: 71 y la SEQ ID NO: 72.

Una composicion preferida como se divulga en el presente documento puede comprender

i) un polipeptido que comprende calmodulina y dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas, en el que dichos dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas estan unidos a traves de dicha calmodulina; y

ii) una molecula de union a la calmodulina; y

iii) los iones que se unen al sitio de union de Ca2+ de la calmodulina,

en donde la union de dicha molecula de union a la calmodulina y de dichos iones afecta la union de dicho polipeptido a un antfgeno que se une a dicho polipeptido,

en donde dicha calmodulina permutada tiene la secuencia seleccionada del grupo que consiste en las secuencias SEQ ID NO: 67 y SEQ ID NO: 68 y dicho peptido de union a la calmodulina tiene la secuencia seleccionada del grupo que consiste en las secuencias SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 46, o en donde dicha calmodulina permutada tiene la secuencia SEQ ID NO: 68 y dicho peptido de union a calmodulina tiene la secuencia SEQ ID NO: 53, o en donde dicha calmodulina permutada tiene la secuencia seleccionada del grupo que consiste en las secuencias SEQ ID NO: 71 y SEQ ID NO: 72 y dicho peptido de union a la calmodulina tiene la secuencia seleccionada del grupo que consiste en las secuencias SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 53.

Dicha composicion, en donde dicho polipeptido puede ser un Fv de cadena sencilla (scFv) que comprende la calmodulina y una region variable de una cadena pesada de una inmunoglobulina (V^h) y una region variable de una cadena ligera de una inmunoglobulina (V^l).

Se prefiere especialmente una composicion como se describio anteriormente, en la que el polipeptido que comprende un scFv espedfico para el antfgeno CD14 y una CaM permutada tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 124 y dicho peptido de union a la CaM tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 9, o dicho polipeptido tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 125 y dicho peptido de union a CaM tiene la secuencia de la SEQ iD NO: 1 o SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 9 o SeQ iD NO: 53, o dicho polipeptido tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 126 y dicho peptido de union a CaM tiene la secuencia de la SEQ iD NO: 1 o SEQ ID NO: 47, o dicho polipeptido tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 127 y dicho peptido de union a CaM tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 47 o la SEQ ID NO: 53.

Ademas, se prefiere especialmente una composicion como la descrita anteriormente, en la que el polipeptido que comprende un scFv espedfico para biotina y una CaM permutada tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 128 y dicho peptido de union a la CaM tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 46, o dicho polipeptido tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 129 y dicho peptido de union a CaM tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 46, o dicho polipeptido tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 130 y dicho peptido de union a CaM tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 53.

Ademas, se prefiere especialmente una composicion como la descrita anteriormente, en la que el polipeptido que comprende un scFv espedfico para el antfgeno CD4 y una CaM permutada tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 131 y dicho peptido de union a la CaM tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 46, o dicho polipeptido tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 132 y dicho peptido de union a CaM tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 46, o dicho polipeptido tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 133 y dicho peptido de union a CaM tiene la secuencia de la SEQ ID n O: 1 o SEQ ID NO: 51 o SEQ ID NO: 53, o dicho polipeptido tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 134 y dicho peptido de union a CaM tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 51 o SEQ ID NO: 53.

Como es evidente por la Figura 7A, B y C (o el Ejemplo 6), dichas combinaciones de secuencias espedficas de CaM permutada y peptidos de union a CaM muestran los cambios mas fuertes en la union entre dichos polipeptidos y sus antfgenos, respectivamente.

Dicha composicion, en la que dicho polipeptido es parte de un dominio de union a antfgeno de un receptor de antfgeno quimerico (CAR). Dicho CAR puede comprender un dominio de union a antfgeno, un dominio transmembrana y un dominio o dominios de senalizacion citoplasmatica.

En un aspecto adicional, la invencion proporciona un metodo para afectar la union de un polipeptido a un antfgeno que se va a unir, en el que dicho polipeptido comprende una calmodulina y dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas en el que dichos dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas estan unidos a traves de dicha calmodulina, comprendiendo el metodo la etapa de poner en contacto dicho polipeptido con una molecula de union a calmodulina en presencia de iones que se unen al sitio de union de Ca2+ de la calmodulina, afectando asf la union de dicho polipeptido al antigeno.

Preferentemente, la CaM es una CaM permutada como se describio anteriormente.

Preferentemente, la molecula de union a CaM es un peptido de union a CaM como se describio anteriormente.

Dicho metodo para afectar la union de un polipeptido, en el que antes de dicho contacto de dicha molecula de union a calmodulina con dicha calmodulina, dicho polipeptido se pone en contacto con el antfgeno que se une mediante dicho polipeptido, y en el que dicho contacto de dicha molecula de union a calmodulina a dicha calmodulina en la presencia de iones que se unen al sitio de union de Ca2+ de la calmodulina afecta la union de dicho polipeptido al antfgeno. Dicha afectacion de la union puede ser una reduccion (disminucion) de la union, liberando asf el polipeptido del antigeno. Alternativamente, dicha afectacion de la union puede ser una mejora (un aumento) de la union, mejorando asf la union entre dicho polipeptido y el antigeno. La mejora de dicha union puede ser de interes cuando la union de dicho polipeptido al antigeno es debil o no se produce en ausencia de dicha molecula de union de CaM y dichos iones que se unen al sitio de union de Ca2+ de CaM.

Dicha afectacion de la union puede ser un cambio de una o ambas propiedades cineticas de la reaccion de union (las constantes de velocidad de asociacion y disociacion, o la constante de asociacion y la constante de disociacion) mientras que la afinidad general puede cambiarse (afectando la afinidad) en este proceso o permanecera igual (afectando a la cinetica de union pero no a la afinidad de equilibrio), cambiando asf la cinetica de la interaccion del polipeptido con el antigeno.

Dicha afectacion de la union puede ser un cambio alosterico inducido dentro del antigeno.

En otro aspecto, la invencion proporciona el uso de un polipeptido (como se describio anteriormente) que comprende una calmodulina, preferiblemente una calmodulina permutada, y dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas, en donde dichos dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas estan unidos a traves de dicha calmodulina, preferiblemente dicha calmodulina permutada, para afectar en presencia de una molecula de union a calmodulina y iones que se unen al sitio de union de Ca2+ de la calmodulina, la union de dicho polipeptido a un antigeno a unirse mediante dicho polipeptido.

Realizaciones

En una realizacion de la invencion, la composicion comprende

i) un polipeptido tal como un scFv, por ejemplo, el scFv D1.3 de union a lisozima, que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 135, que comprende calmodulina tal como CaM permutada, por ejemplo, que tiene la secuencia del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 67 a la SEQ ID NO: 123 y dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas, tales como una region variable de una cadena pesada de una inmunoglobulina (V^h) y una region variable de una cadena ligera de una inmunoglobulina (V^l), en el que dichos dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas estan unidos a traves de dicha calmodulina; y

ii) una molecula de union a la calmodulina, tal como el peptido M13; y

iii) los iones que se unen al sitio de union de Ca2+ de la calmodulina tal como Ca2+,

en donde la union de dicha molecula de union a la calmodulina y de dichos iones a dicho sitio de union de Ca2+ de la calmodulina afecta la union de dicho polipeptido a un antfgeno tal como lisozima reduciendo dicha afinidad.

En una realizacion de la invencion, la composicion se puede usar para el enriquecimiento (por ejemplo, seleccion positiva) de celulas que expresan en la superficie celular el antfgeno reconocido por el polipeptido, por ejemplo, como se divulga en el presente documento. Los metodos adecuados para el enriquecimiento son bien conocidos en la tecnica e incluyen, entre otros, citometna de flujo, como la clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS) o la separacion de celulas magneticas, tal como MACS® (Miltenyi Biotec GmbH).

A modo de ejemplo, se describe en este documento el principio de la separacion de MACS® (Miltenyi Biotec GmbH, Alemania): el polipeptido como se divulga en el presente documento, espedfico para un antfgeno, se puede usar para la marcacion magnetica directa o indirecta de celulas que expresan dicho antfgeno en su superficie celular en una muestra que comprende dichas celulas y otras celulas (que no expresan dicho antfgeno). Primero, las celulas que expresan antfgeno se marcan magneticamente con MicroBeads (partfculas magneticas) conjugadas con dicho polipeptido. Luego, la muestra de celulas se carga en una columna MACS® que se coloca en el campo magnetico de un separador MACS®. Las celulas que expresan antfgeno marcadas magneticamente se retienen en la columna. Las celulas sin marcar corren a traves de la misma. La adicion de una solucion de "elucion" que comprende una molecula de union a CaM tal como el peptido M13 y, por ejemplo, los iones Ca2+ permiten reducir la union del polipeptido al antfgeno, liberando asf la celula que expresa dicho antfgeno del polipeptido inmovilizado conjugado con la partfcula magnetica, es dedr, la celula se puede eluir de la columna sin necesidad de eliminar el campo magnetico.

En una realizacion de la invencion, la composicion puede usarse para el enriquecimiento (es decir, la purificacion) de protemas fusionadas con un antigeno reconocido por el polipeptido que comprende un scFv que comprende calmodulina, preferiblemente una CaM permutada, y una region variable de una cadena pesada de una inmunoglobulina y una region variable de una cadena ligera de una inmunoglobulina, en la que dichas regiones variables estan unidas a traves de dicha calmodulina, preferiblemente CaM permutada. La invencion de polipeptidos como se describe en el presente documento puede inmovilizarse, por ejemplo, sobre una resina. A continuacion, la protema objetivo (es decir, la protema que debe ser purificada) que contiene material se incuba con la resina acoplada al polipeptido para permitir la union del polipeptido a la protema objetivo fusionada con un antfgeno reconocido por el polipeptido de la invencion. El material no unido se elimina mediante lavado del material de resina. La adicion de una solucion de "elucion" que comprende una molecula de union a CaM tal como el peptido M13 y, por ejemplo, los iones Ca2+ permiten reducir la union del polipeptido a la protema objetivo que comprende el antfgeno, liberando asf la protema objetivo sin la necesidad de condiciones de elucion severas.

En una realizacion de la invencion, el polipeptido es un scFv que comprende la calmodulina, preferiblemente una CaM permutada, y una region variable de una cadena pesada de una inmunoglobulina y una region variable de una cadena ligera de una inmunoglobulina, en la que dichas regiones variables estan enlazadas a traves de dicha calmodulina, preferiblemente CaM permutada, y en la que dicho scFv es el dominio de union a antfgeno (o parte del dominio de union a antfgeno) de un receptor de antfgeno quimerico (CAR). El CAR puede comprender dicho dominio de union a antfgeno, un dominio transmembrana y dominios de senalizacion citoplasmatica. Dicho CAR puede liberarse de un antfgeno unido a dicho CAR poniendo en contacto dicho CAR con una molecula de union a CaM y iones que se unen al sitio de union de Ca2+ de CaM, si dicho contacto da como resultado una reduccion de la union del dominio de union al antfgeno con el antfgeno. Alternativamente, dicho CAR puede unirse suficientemente fuerte al antfgeno para inducir o activar la senalizacion en la celula que expresa dicho CAR, no hasta que una molecula de union a CaM y los iones que se unen al sitio de enlace de Ca2+ de CaM se pongan en contacto con dicho CAR, si dicho contacto da como resultado un aumento de la union del dominio de union al antfgeno con el antfgeno. Estos procedimientos permiten un control de las interacciones entre las celulas que expresan dicho CAR y el antfgeno al proporcionar un peptido pequeno, ya que el calcio puede estar presente en cantidades fisiologicas suficientes. Esto puede ayudar a reducir o prevenir los efectos secundarios graves en un paciente si las celulas que expresan dicho CAR se usan en una inmunoterapia celular, por ejemplo, para combatir celulas cancerosas en un paciente.

En una realizacion de la invencion, la composicion es una composicion que comprende

i) un polipeptido que comprende una calmodulina permutada y dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas, en el que dichos dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas se enlazan a traves de dicha calmodulina,

ii) una molecula de union a calmodulina; y

iii) iones que se unen al sitio de union de Ca2+ de calmodulina,

en la que la union de dicha molecula de union a calmodulina y de dichos iones afecta la union de dicho polipeptido a un antfgeno que se une por dicho polipeptido, y en la que dicho polipeptido es obtenible por el metodo que comprende las etapas de

a) a) crear una biblioteca de secuencias de acidos nucleicos de insercion, en la que dicha secuencia de insercion comprende una secuencia que codifica dicha calmodulina permutada que comprende las etapas de:

i) obtener una secuencia de acido nucleico de insercion que codifica calmodulina que se une a una molecula de union a calmodulina y iones que se unen al sitio de union de Ca2+ de la calmodulina;

ii) ligar dicha secuencia de acido nucleico de insercion para circularizar dicha secuencia de acido nucleico de insercion;

iii) crear pares de oligonucleotidos que permitan la amplificacion de dicha secuencia de acido nucleico de insercion permutada mediante la reaccion en cadena de la polimerasa utilizando la secuencia de acido nucleico de insercion circularizada de ii) como plantilla y que ademas comprenden salientes de acido nucleico con secuencias de reconocimiento de enzimas de restriccion

iv) realizar una reaccion en cadena de la polimerasa utilizando la secuencia de acido nucleico de insercion circularizada de ii) y los pares de oligonucleotidos de iii) para permitir la amplificacion de dicha secuencia de acido nucleico de insercion permutada;

v) digerir dicha secuencia de acido nucleico de insercion permutada de iv) con enzimas de restriccion que reconocen dichas secuencias de reconocimiento para permitir la introduccion espedfica de la secuencia de acido nucleico de insercion digerida en la secuencia de acido nucleico aceptor;

b) crear una secuencia de acido nucleico aceptor, en la que dicha secuencia de acido nucleico aceptor comprende una secuencia que codifica dichos dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas, que comprende las etapas de:

i) obtener dicha secuencia de acido nucleico aceptor que comprende las mismas secuencias de reconocimiento de las enzimas de restriccion de a) iii) entre las secuencias que codifican dichos dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas;

ii) digerir dicha secuencia de acido nucleico aceptor de i) con dichas enzimas de restriccion que reconocen dichas secuencias de reconocimiento que permiten la introduccion de la secuencia de acido nucleico de insercion permutada de a) v) entre los dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas de dicha secuencia de acido nucleico aceptor; c) ligar los acidos nucleicos de a) v) y b) ii) de modo que una secuencia de acido nucleico de insercion se inserte en la secuencia de acido nucleico aceptor digerida;

d) transformar un huesped con uno o una biblioteca de las secuencias ligadas de c);

e) seleccionar los huespedes transformados que albergan las secuencias de acido nucleico ligado;

f) detectar los huespedes transformados que expresan polipeptidos que comprenden dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulina unidos a traves de calmodulina exponiendo los polipeptidos producidos por los huespedes transformados a dicha molecula de union de calmodulina e identificar los huespedes transformados que albergan polipeptidos que impactan la union de dichos polipeptidos al antfgeno en presencia de iones que se unen al sitio de union de Ca2+ de la calmodulina; o

р) a) crear una biblioteca de secuencias de acidos nucleicos de insercion, en la que dicha secuencia de insercion comprende una secuencia que codifica dicha calmodulina permutada que comprende las etapas de:

i) obtener una secuencia de acido nucleico de insercion que codifica calmodulina que se une a una molecula de union a calmodulina y iones que se unen al sitio de union de Ca2+ de calmodulina;

ii) ligar dicha secuencia de acido nucleico de insercion para circularizar dicha secuencia de acido nucleico de insercion; iii) digerir la secuencia de acido nucleico de insercion de ii) para introducir aleatoriamente una unica ruptura de doble cadena para la creacion de una biblioteca de secuencias de acido nucleico de insercion;

b) crear una secuencia de acido nucleico aceptor, en la que dicha secuencia de acido nucleico aceptor comprende una secuencia que codifica dichos dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas, que comprende las etapas de:

i) obtener dicha secuencia de acido nucleico aceptor;

ii) digerir dicha secuencia de acido nucleico aceptor de i) con enzimas de restriccion que reconocen secuencias de reconocimiento que permiten la introduccion de la biblioteca de secuencias de acido nucleico de insercion entre los dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulina de dicha secuencia de acido nucleico aceptor; opcionalmente iii) Volver roma dicha secuencia aceptadora si dichas enzimas de restriccion producen extremos pegajosos с) ligar los acidos nucleicos de la biblioteca de a) iii) y b) ii), opcionalmente b) iii) de modo que una secuencia de acido nucleico de insercion se inserte en la secuencia de acido nucleico aceptor digerida;

d) transformar un huesped con la biblioteca de las secuencias ligadas de c);

e) seleccionar los huespedes transformados que albergan las secuencias de acido nucleico ligado;

f) detectar los huespedes transformados que expresan polipeptidos que comprenden dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulina unidos a traves de calmodulina exponiendo los polipeptidos producidos por los huespedes transformados a dicha molecula de union a calmodulina e identificar los huespedes transformados que albergan polipeptidos que impactan la union de dichos polipeptidos al antfgeno en presencia de iones que se unen al sitio de union de Ca2+ de la calmodulina; o

Y) a) crear una secuencia de acido nucleico de insercion o una biblioteca de secuencias que codifica dicha calmodulina permutada que comprende las etapas de:

i) generar sinteticamente dicha secuencia de acido nucleico de dicha calmodulina permutada que comprende salientes de acido nucleico con secuencias de reconocimiento de enzimas de restriccion;

ii) digerir dicha secuencia de acido nucleico de insercion permutada de i) con enzimas de restriccion que reconocen dichas secuencias de reconocimiento para permitir la introduccion espedfica de la secuencia de acido nucleico de insercion digerida en la secuencia de acido nucleico aceptor;

b) crear una secuencia de acido nucleico aceptor, en la que dicha secuencia de acido nucleico aceptor comprende una secuencia que codifica dichos dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas, que comprende las etapas de:

i) obtener dicha secuencia de acido nucleico aceptor que comprende las mismas secuencias de reconocimiento de enzimas de restriccion de a) i) entre las secuencias que codifican dichos dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulina;

ii) digerir dicha secuencia de acido nucleico aceptor de i) con dichas enzimas de restriccion que reconocen dichas secuencias de reconocimiento que permiten la introduccion de la secuencia de acido nucleico de insercion permutada de a) ii) entre los dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulina de dicha secuencia de acido nucleico aceptor;

c) ligar los acidos nucleicos de a) ii) y b) ii) de modo que una secuencia de acido nucleico de insercion se inserte en la secuencia de acido nucleico aceptor digerida;

d) transformar un huesped con uno o una biblioteca de las secuencias ligadas de c);

e) seleccionar los huespedes transformados que albergan las secuencias de acido nucleico ligado;

f) detectar los huespedes transformados que expresan polipeptidos que comprenden dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulina unidos a traves de calmodulina mediante la exposicion de los polipeptidos producidos por los huespedes transformados a dicha molecula de union a calmodulina e identificar los huespedes transformados que albergan polipeptidos que afectan la union de dichos polipeptidos al antfgeno en presencia de iones que se unen al sitio de union de Ca2+ de la calmodulina; o

8) a) crear las secuencias de acido nucleico que codifican dicho polipeptido que comprende dicha calmodulina permutada mediante la creacion sintetica de dichas secuencias de acido nucleico

b) transformar un huesped con una o una biblioteca de las secuencias de a);

c) seleccionar los huespedes transformados que albergan las secuencias de acido nucleico;

d) detectar huespedes transformados que expresan polipeptidos que comprenden dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulina unidos a traves de calmodulina exponiendo los polipeptidos producidos por los huespedes transformados a dicha molecula de union a calmodulina e identificar los huespedes transformados que albergan polipeptidos que impactan la union de dichos polipeptidos al antfgeno en presencia de iones que se unen al sitio de union de Ca2+ de la calmodulina.

Definiciones

A menos que se defina lo contrario, los terminos tecnicos y cientfficos usados en este documento tienen el mismo significado que entiende comunmente un experto en la tecnica a la que pertenece esta invencion.

El termino "calmodulina" o "secuencia de calmodulina" como se usa en el presente documento se refiere a una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 70%, o al menos el 75%, o al menos el 80%, o al menos el 85%, o al menos el 90%, o al menos el 95%, o al menos el 97%, o al menos el 98%, o al menos el 99% a nivel de la secuencia de aminoacidos de la calmodulina de tipo silvestre (SEQ ID NO: 66) si la calmodulina no experimento una permutacion. En este contexto, la "identidad de secuencia" puede determinarse utilizando alineamientos de pares usando programas de alineamientos para secuencias de aminoacidos bien conocidas en la tecnica.

La secuencia de calmodulina tambien puede ser un fragmento funcional de la protema calmodulina de longitud completa (por ejemplo, una protema truncada de calmodulina) o un fragmento de la protema calmodulina de longitud completa que tiene una identidad de secuencia de al menos el 70%, o al menos el 75%, o al menos el 80%, o al menos el 85%, o al menos el 90%, o al menos el 95%, o al menos el 97%, o al menos el 98%, o al menos el 99% a nivel de la secuencia de aminoacidos con la secuencia correspondiente de dicha calmodulina de longitud completa si esta parte de la secuencia de calmodulina no experimento una permutacion.

En general, todas las variaciones de aminoacidos (es decir, sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoacidos de la calmodulina) se incluyen en esta definicion, que no conducen a la perdida de la funcion de la calmodulina o un fragmento funcional de la misma para proporcionar el cambio de su conformacion.

La calmodulina o un fragmento funcional de la misma (en todas sus variantes como se describio anteriormente) tambien puede ser una calmodulina permutada o un fragmento funcional de la misma. Aunque el orden de secuencia se puede cambiar en una calmodulina permutada, mantiene las caractensticas de la calmodulina de TS para unirse tanto a, los iones en el sitio de union de Ca2+ como a una molecula de union a calmodulina, y por lo tanto cambiando su conformacion (es decir, el fragmento de la calmodulina permanece funcional). Se puede generar una CaM permutada, por ejemplo, por un metodo que utiliza permutacion circular. Una permutacion circular es una relacion entre protemas en la que las protemas tienen un orden cambiado de aminoacidos en su secuencia peptfdica. El resultado es una estructura de protemas con diferente conectividad, pero en general con una forma tridimensional similar (3D).

La permutacion circular puede ocurrir como resultado de eventos evolutivos naturales, modificaciones postraduccionales o mutaciones creadas artificialmente.

Debido a esto, a menudo es posible disenar permutaciones circulares de protemas. Hoy en dfa, las permutaciones circulares se generan de forma rutinaria en el laboratorio utilizando tecnicas geneticas estandar (vease, por ejemplo, "Circular Permutation of Proteins" en "Protein Engineering Handbook" (Ed.: Stefan Lutz, Uwe T. Bornscheuer) Wiley-VCH 2009).

Una calmodulina permutada como se usa en el presente documento tambien puede tener algunos residuos de aminoacidos adicionales en su secuencia. Esto puede ser el resultado de la generacion de una CaM permutada debido a, por ejemplo, adicion de secuencias de reconocimiento de enzimas de restriccion a nivel de la secuencia de acido nucleico de dicha calmodulina. La secuencia adicional puede ser cualquier secuencia, preferiblemente la secuencia puede ser una secuencia que no de lugar a cambios conformacionales mayores (o cualquier cambio) cuando la posicion de dicha secuencia adicional cambia dentro del polipeptido, por ejemplo, debido al proceso de permutacion de CaM que incluye dicha secuencia adicional. En este contexto, una secuencia adicional bien adecuada puede ser la secuencia de aminoacidos GGSG dentro de la CaM permutada como el resultado de la secuencia de acido nucleico reconocida por la enzima de restriccion BamHI, que puede usarse en los extremos de la secuencia de acido nucleico de CaM, resultando en la secuencia adicional a nivel de aminoacidos de GGSG despues de la digestion de la secuencia de acido nucleico con BamHI y posterior circularizacion de la secuencia y traduccion en un polipeptido. Esta secuencia adicional conduce a cambios conformacionales menores o no, independientemente de la posicion dentro de la CaM permutada y no afecta la union del polipeptido como se divulga en este documento con su antfgeno.

En general, la permutacion del enlazador de calmodulina como se divulga en el presente documento puede estar en cualquier posicion de la secuencia de calmodulina, preferiblemente las calmodulinas permutadas (los enlazadores de calmodulina permutados) son variantes permutadas en el extremo C terminal o aquellas permutadas en el medio del gen que codifica la calmodulina anterior.

Aunque algunos sitios de permutacion evitan que la protema se pliegue correctamente, se han creado muchos permutantes con una funcion casi identica a la protema original.

El termino "calmodulina permutada", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier secuencia de aminoacidos derivada de calmodulina que tiene un orden alterado de aminoacidos en su secuencia peptfdica en comparacion con la secuencia de calmodulina de TS, pero guarda las caractensticas de CaM para cambiar su conformacion cuando la secuencia alterada de CaM se une a una molecula de union a CaM y los iones que se unen al sitio de union de Ca2+ de la CaM, en la que dicho cambio conformacional afecta la union del polipeptido como se divulga en este documento a su antfgeno.

El termino "dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas" en el contexto de "un polipeptido que comprende calmodulina y dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas" como se usa en el presente documento se refiere al uso de dos dominios asociados con la superfamilia de inmunoglobulinas dentro de dicho polipeptido. En general, todas las variaciones de aminoacidos (es decir, sustituciones, adiciones o eliminaciones) de aminoacidos de un dominio de la superfamilia de inmunoglobulinas estan incluidas en esta definicion, que no conducen a la perdida de la funcion del dominio que contribuye a la union del antfgeno. La superfamilia de inmunoglobulinas es un gran grupo de protemas de la superfine celular y solubles que participan principalmente en los procesos de reconocimiento, union o adhesion de las celulas. Moleculas categorizadas como miembros de esta superfamilia basadas en caractensticas estructurales compartidas con inmunoglobulinas; todas ellas poseen un dominio conocido como dominio de inmunoglobulina o pliegue. Los miembros de la superfamilia de inmunoglobulinas incluyen receptores de antfgenos de la superficie celular, moleculas correceptores y coestimuladoras del sistema inmunitario, moleculas involucradas en la presentacion de antfgenos a linfocitos, moleculas de adhesion celular, ciertos receptores de citoquinas y protemas musculares intracelulares. Un ejemplo espedfico de los "dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas" es un fragmento Fv de una inmunoglobulina, que comprende una region variable de una cadena pesada de una inmunoglobulina y una region variable de una cadena ligera de una inmunoglobulina.

Un fragmento variable de una sola cadena (scFv) es una protema de fusion de las regiones variables de las cadenas pesada (V^h) y ligera (V^l) de las inmunoglobulinas, normalmente conectadas con un peptido enlazador corto de hasta aproximadamente 25 aminoacidos. El enlazador a menudo es rico en glicina para la flexibilidad, asf como serina o treonina para la solubilidad, y puede conectar el extremo terminal N de la V^h con el extremo terminal C de la V^l, o viceversa. Esta protema conserva la especificidad de la inmunoglobulina original, a pesar de la eliminacion de las regiones constantes y la introduccion del enlazador. En la presente invencion, el enlazador se reemplaza por la secuencia de calmodulina. Otro ejemplo espedfico de los "dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas" son las cadenas variables de los receptores de celulas T, que comparten propiedades estructurales generales muy similares al fragmento Fv, y constituyen un scTv que contiene la secuencia de calmodulina como un enlazador. Estos scTv pueden incluir las regiones variables de las cadenas a y p o las regiones variables de las cadenas y y 8.

Como se usa en el presente documento, el termino "antigeno" pretende incluir sustancias que se unen o evocan la produccion de uno o mas anticuerpos o se unen a los scFv, scTv o entidades de union analogas mencionadas anteriormente compuestas por dos miembros de la superfamilia de inmunoglobulinas. Cada anticuerpo se une a un antigeno espedfico mediante una interaccion similar al ajuste entre una cerradura y una llave. La sustancia puede ser del ambiente externo o formada dentro del cuerpo. El termino "antigeno" comprende, pero no se limita a, protemas, peptidos, polipeptidos, oligopeptidos, lfpidos, carbohidratos, haptenos, vitaminas, hormonas, moleculas sinteticas y combinaciones de los mismos, por ejemplo, una protema glicosilada, un glicolfpido o una vitamina biotinilada. Un antfgeno puede estar en la superficie celular o dentro de la celula. Preferiblemente, un antfgeno esta en la superficie celular de una celula. En otra realizacion, el antfgeno esta en solucion en una mezcla compleja de otras sustancias, como en el sobrenadante de cultivo de un biorreactor o una fraccion derivada del mismo. En otra realizacion, el antigeno esta en solucion en una mezcla compleja de otras protemas, como plasma sangumeo u otros fluidos corporales o un sobrenadante del medio de cultivo del biorreactor.

El area del anticuerpo que se localiza hacia el antfgeno e incluye cadenas laterales de aminoacidos que forman enlaces qmmicos como enlaces de hidrogeno, enlaces electrostaticos o interacciones hidrofobas con el antfgeno, se denomina "paratopo". Es un efecto lograr mediante la presente invencion influir en la estructura de este paratopo de manera que su union al antfgeno se vea influida por la alteracion de la posicion, orientacion, distancia o energfa de union de una o varias de dichas cadenas laterales de aminoacidos o de todo el dominio V al antfgeno.

Los terminos "se une espedficamente a" o "espedfico para" con respecto a un dominio de union a antfgeno de un anticuerpo o fragmento del mismo (por ejemplo, un scFv o scTv) se refieren a un dominio de union a antfgeno que reconoce y se une a un antfgeno espedfico, pero no reconoce o se une sustancialmente a otros antfgenos en una muestra. Un dominio de union a antfgeno que se une espedficamente a un antfgeno de una especie puede unirse tambien al antfgeno homologo de otra especie. Esta reactividad de especies cruzadas es tfpica de muchos anticuerpos y, por lo tanto, no es contraria a la definicion de ese dominio de union a antfgeno como espedfico. Un dominio de union a antfgeno que se une espedficamente a un antfgeno tambien puede unirse a diferentes formas alelicas del antfgeno (variantes alelicas, variantes de empalme, isoformas, etc.) o variantes homologas de este antfgeno de la misma familia de genes. Estas reactividades cruzadas son tfpicas de muchos anticuerpos y, por lo tanto, no son contrarias a la definicion de ese dominio de union a antfgeno como espedfico. Un dominio de union a antfgeno que se une espedficamente a un antfgeno tambien puede unirse a un numero limitado de estructuras completamente diferentes, conocidas como mimotopos (vease, por ejemplo, Reineke U. et al., J. Immunol Methods. septiembre 1 de 2002; 267 (1): 37-51; Keitel T. et al., Cell., diciembre12 de 1997; 91 (6): 811-20). Esta reactividad es tfpica de muchos anticuerpos y, por lo tanto, no es contraria a la definicion de ese dominio de union a antfgeno como espedfico.

El termino "que afecta a la union" como se usa en el presente documento se refiere a un cambio de una o ambas propiedades cineticas de la reaccion de union (las constantes de velocidad de asociacion y disociacion) mientras que la afinidad general puede cambiarse (afectando la afinidad de equilibrio) en este proceso o permanecera igual (afectando a la cinetica de union pero no a la afinidad), cambiando asf la cinetica de la interaccion del polipeptido como se divulga en el presente documento con el antfgeno.

El termino "afinidad" se refiere a la fuerza de la suma total de las interacciones no covalentes entre un unico sitio de union de una molecula (por ejemplo, el dominio o dominios de union a antfgeno de un polipeptido tal como los dominios variables de una cadena ligera y pesada de inmunoglobulinas en un scFv) y su companero de union (por ejemplo, un antfgeno). A menos que se indique lo contrario, como se usa en este documento, "afinidad de union" se refiere a la afinidad de union intrmseca que refleja una interaccion 1:1 entre los miembros de un par de union (por ejemplo, un polipeptido de union a antfgeno y su antfgeno). La afinidad de una molecula X por su companero Y generalmente puede representarse por la constante de disociacion en equilibrio (K^d). La afinidad se puede medir por metodos comunes conocidos en la tecnica (por ejemplo, medicion de BiacoreMR y calculada a partir de las constantes de asociacion y disociacion).

Los terminos "regulacion", "modulacion", "que afecta" "influencia" y "cambio" en el contexto de la regulacion/modulacion/que afecta/influencia/cambio de la union del polipeptido como se divulga en el presente documento a su antfgeno se pueden usar indistintamente. La regulacion de la union como se usa en este documento significa un cambio de conformacion o entropfa en el enlazador de calmodulina del polipeptido entre los dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas, por ejemplo, las regiones V^h y V^l de un fragmento scFv, desencadenadas por el contacto del enlace de calmodulina con una molecula de union a calmodulina y iones que se unen al sitio de union de Ca2+ de CaM que afectan la conformacion del sitio de union de antfgeno, lo que resulta en un cambio (medible) de la union. El cambio de la union puede ser una reduccion (disminucion) de la union o una mejora (un aumento) de la union o un cambio de las constantes de la velocidad de disociacion o asociacion del polipeptido como se divulga en este documento a su antfgeno.

La union de i) una molecula de union a la calmodulina y ii) los iones que se unen al sitio de union de Ca2+ de la calmodulina como se usa en este documento tiene que ser una union concertada, es decir, ambos componentes tienen que estar unidos a la CaM del polipeptido para afectar la modulacion de dicha union. En una realizacion de la invencion, los iones que se unen al sitio de union de Ca2+ de la calmodulina y el polipeptido de la invencion pueden estar presentes en la misma solucion (que no es suficiente para inducir la modulacion de dicha union) pero no antes de la adicion de una molecula de union a CaM conducira a la modulacion de la union del polipeptido como se divulga en el presente documento (como ahora una union concertada de ambas, una molecula de union a calmodulina y la union de iones al sitio de union de Ca2+ de la calmodulina a dicho polipeptido es posible).

El termino "polipeptido que comprende calmodulina y dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas, en el que dichos dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas se enlazan a traves de dicha calmodulina" como se usa en este documento se refiere a un polipeptido que tiene los siguientes dominios en el orden de: un primer dominio de superfamilia de inmunoglobulinas, calmodulina, un segundo dominio de la superfamilia de inmunoglobulinas. Preferiblemente, el enlace entre todas estas secuencias parciales (o dominios) es a traves de enlaces peptfdicos que dan como resultado una secuencia continua de aminoacidos del polipeptido. Alternativamente, el polipeptido puede ser un polipeptido que tiene dichos dominios (peptidos) en el orden mencionado anteriormente, pero la conexion entre uno, mas o todos estos dominios (peptidos) puede ser por enlaces covalentes o no covalentes distintos del enlace peptfdico, por ejemplo, un puente disulfuro (enlace S-S) entre dos dominios, como un primer puente disulfuro entre un dominio Vh y la calmodulina y un segundo puente disulfuro entre un dominio Vl y la calmodulina. El polipeptido que comprende calmodulina y dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas tambien se puede ensamblar en parte o completamente mediante metodos de ensamblaje de protemas utilizando Sortasa, Peptido Ligasa, empalme de protemas u otros metodos bien conocidos en la tecnica para conectar dominios de protemas en base a secuencias de reconocimiento adecuadas o etiquetas (vease, por ejemplo, van Vught R et al.,, Comput Struct Biotechnol J., febrero 14 de 2014; 9: e201402001). El polipeptido que comprende calmodulina y dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas tambien se puede ensamblar en parte o completamente mediante enlaces qmmicos formados por qmmica CLICK despues de la insercion recombinante de aminoacidos no naturales en dichos dominios de protemas usando metodos bien conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Maruani A et al., Org Biomol Chem., julio 14 de 2016; 14 (26): 6165-78). En una realizacion, el enlace se puede lograr produciendo un polipeptido a partir de un gen ensamblado usando sistemas de produccion recombinantes apropiados. En una realizacion, esta produccion se puede lograr transformando celulas bacterianas o eucariotas con un vector de expresion apropiado. En otra realizacion, el enlace se puede lograr formando uno o mas enlaces covalentes adecuados entre uno o ambos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas y la calmodulina. En este caso, los dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas y la calmodulina pueden producirse mediante diferentes metodos conocidos y enlazarse despues de la produccion. En una realizacion, esta produccion se puede lograr transformando celulas bacterianas o eucariotas con vectores de expresion apropiados para producir los fragmentos separados. En una realizacion, esta produccion se puede lograr mediante smtesis de peptidos.

El termino "molecula de union a la calmodulina", como se usa en este documento, se refiere a cualquier molecula que puede unirse a la calmodulina y que puede desencadenar un cambio conformacional o de estabilidad en presencia de iones que se unen al sitio de union de Ca2+ de CaM lo que resulta en la modulacion de la union del polipeptido como se divulga en el presente documento. Dicha molecula de union a CaM no es parte del polipeptido como se divulga en el presente documento, es una molecula libre que puede unirse a dicho polipeptido a traves de los sitios de union de la calmodulina a dicha molecula de union a CaM. Dicha molecula de union a calmodulina puede ser un peptido de union a calmodulina. Dicho peptido de union a CaM puede ser un peptido M13 derivado de la quinasa de cadena ligera de la miosina o una variante de la misma. Alternativamente, dicho peptido de union a CaM puede ser otro peptido diferente al peptido M13, or ejemplo, otro peptido de origen natural o peptido generado sinteticamente. Dicho peptido de union a calmodulina puede seleccionarse del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 a la SEQ ID NO: 65. Preferiblemente, dicho peptido de union a calmodulina puede seleccionarse del grupo de peptidos que consiste en las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51 y ID SEC NO: 53.

Pero en general, se puede usar cualquier peptido o polipeptido que pueda unirse a CaM.

Se dispone de estructuras tridimensionales de calmodulina en complejo con sustratos peptfdicos de alta afinidad (Montigiani et al., 996, J. Mol. Biol. 258: 6-13). Estos peptidos corresponden a las regiones de union a la calmodulina de diferentes protemas quinasas. Alternativamente, se pueden usar metodos tales como el despliegue en fagos peptfdicos para identificar secuencias adicionales que pueden unirse a la calmodulina y causar el cambio de conformacion.

Ejemplos

En lo sucesivo, la presente invencion se describe con mas detalle y espedficamente con referencia a los ejemplos, que, sin embargo, no pretenden limitar la presente invencion.

Ejemplo 1: Generacion de fusiones de calmodulina permutada-scFv

Para identificar la disposicion optima de la calmodulina para lograr el efecto de un cambio de conformacion que afecta la union del anticuerpo cuando se inserta entre las regiones de union a antfgeno Vh y Vl de un anticuerpo, se genero una biblioteca de genes de 152 variantes diferentes que representan todos los puntos de insercion posibles a traves de una molecula de calmodulina circularizada.

En primer lugar, el gen que codifica la calmodulina humana (SEQ ID NO: 66) se optimizo para la expresion recombinante en E. coli, se anadieron secuencias de flanqueo que codifican para sitios de reconocimiento de BamHI y se sintetizo el constructo mediante DNA2.0 (Menlo Park, EE. UU.). La permutacion circular del gen se realizo mediante reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) (Figura 1). Primero, el plasmido que porta el gen de interes se amplifico en NEB® 5-alpha de E. coli (New England Biolabs, Frankfurt a.M., Alemania) y se purifico utilizando el kit de purificacion de plasmidos de NucleoBond® Xtra Maxi (Macherey-Nagel, Duren, Alemania). A continuacion, el gen que codifica la calmodulina se elimino del plasmido por restriccion con BamHI (todas las enzimas se obtuvieron a traves de New England Biolabs, Frankfurt a.M, Alemania, si no se indica lo contrario), electroforesis en gel y extraccion del fragmento utilizando el gel NucleoSpin® y el Kit de limpieza de PCR (Macherey-Nagel, Duren, Alemania). Posteriormente, el fragmento se circularize por ligacion con ADN ligasa T4 (incubacion durante la noche a 16°C). La concentracion de ADN no supero los 2,5 ng/pL en la mezcla de reaccion para evitar la formacion de multimeros. La reaccion se detuvo mediante incubacion a 65°C durante 10 minutos y las formas circulares se aislaron mediante electroforesis en gel y extraccion con gel. El fragmento de ADN circularizado se uso como plantilla para la generacion de variantes permutadas por PCR. Se disenaron 152 pares de oligonucleotidos diferentes (obtenidos a traves de Metabion, Planegg/Steinkirchen, Alemania) para la amplificacion de todas las posibles variantes permutadas de calmodulina. Los oligonucleotidos directos conteman secuencias superpuestas que codificaban los sitios de reconocimiento de Nhel, mientras que los oligonucleotidos inversos inclrnan salientes que codificaban los sitios de restriccion de EcoRV para facilitar la clonacion de los productos de la PCR en el vector objetivo. La PCR se realizo con ADN Polimerasa Phusion® High-Fidelity como se indica en el manual del fabricante. El tamano de los productos se verifico mediante electroforesis en gel y la mezcla de reaccion restante se desalinizo utilizando el Gel NucleoSpin® y el kit de limpieza de PCR, seguido de restriccion con Nhel y EcoRV. La reaccion se detuvo mediante incubacion a 80°C durante 20 min y se utilizo directamente para ligacion en la cadena principal del vector, que se habfa tratado por igual con Nhel y EcoRV y luego se purifico mediante electroforesis en gel y extraccion. La ligadura parcial del extremo romo se realizo con ADN ligasa T4 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Despues de la incubacion durante la noche a 16°C, la reaccion se detuvo (65°C, 10 min) y se transformo directamente en la cepa de expresion E. coli W3110 utilizando protocolos estandar. Los clones positivos se identificaron mediante PCR de colonias utilizando ADN polimerasa REDTaq® (Sigma-Aldrich, Munich, Alemania) y secuenciacion (GATC Biotech, Colonia, Alemania).

De los 152 productos de PCR diferentes resultantes, 145 pudieron clonarse exitosamente como un enlazador en el scFv de union a lisozima (D1.3 scFv-TS sin enlazador de CaM: SEQ ID NO: 135).

Ejemplo 2: Identificacion de variantes de scFv-calmodulina anti-lisozima intercambiables

Se ha demostrado que la conformacion de la calmodulina cambia cuando se une al peptido M13 de union a la calmodulina (residuos 577-602 de la quinasa de cadena ligera de la miosina del musculo esqueletico). Para probar la influencia del peptido M13 en las protemas de fusion calmodulina-scFv, todos los constructos se produjeron en E. Coli en formato de placa de microtitulacion.

Las celulas que albergan el constructo deseado se cultivaron durante la noche a 37°C y 1.000 rpm en placas de polipropileno con fondo en U de 96 pozos (Greiner Bio-One, Solingen, Alemania) en 180 pL de medio YP-GK 2x (medio YP 2x [16 g L'1 de peptona de soja, 10 g L'1 de extracto de levadura, 5 g L'1 de NaCl, pH 7,0] que contiene glucosa 100 mM y 50 pg/mL de kanamicina) por pozo. Al dfa siguiente, se inocularon 170 pL de medio fresco con 5 pL de cultivo durante la noche y se agitaron a 1.000 rpm durante 6 horas a 30°C. La expresion de protemas se indujo con una concentracion final de IPTG 0,2 mM y los cultivos se incubaron durante la noche a 25°C. Las bacterias se recolectaron mediante centrifugacion (4.000 g, 20 min, 4°C) y se almacenaron a -20°C o se procesaron directamente para la deteccion del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Para la extraccion periplasmatica de la protema objetivo, los sedimentos se resuspendieron en 100 pL de reguladorTE (Tris 100 mM, e Dt A 10 mM; pH 9,0) por pozo y se agitaron durante 2 horas a 37°C y 1.000 rpm. La protema que contema el sobrenadante se separo de las celulas mediante centrifugacion (4.000 g, 20 min, temperatura ambiente) y se uso directamente para ELISA.

Se identificaron variantes de scFv-CaM D1.3 que muestran propiedades de union modificadas hacia el antfgeno (lisozima) en presencia de peptido M13 mediante ELISA competitivo. Se recubrieron 100 ng de lisozima en placas de ELISA Nunc MaxiSorp® de 96 pozos (Thermo Fisher Scientific, Dreieich, Alemania) en solucion salina 1x regulada con tris (TBS) (Tris 50 mM, NaCl 150 mM; pH 8,0) durante la noche a 4°C. Al dfa siguiente, las placas se lavaron tres veces con t BSt 1x (TBS 1x Tween® 20 al 0,05% [v/v]; pH 8,0) y luego se bloquearon con B-TBS 1x (TBS 1x albumina de suero bovino al 1% [p/v]; pH 8,0) durante al menos 1 hora a temperatura ambiente. Los lisados crudos de la expresion de la placa de microtitulacion se diluyeron 1:10 en B-TBS 1x/CaCh 5 mM (preparacion A) o B-TBS 1x/CaCl2 5 mM/ peptido M13 1 pM (Anaspec, Fremont, EE. UU.) (preparacion B). Los scFv purificados tambien se diluyeron en los reguladores mencionados a concentraciones apropiadas (0,1 pM). Los scFv diluidos se incubaron previamente en placas de polipropileno de 96 pozos (Greiner Bio-One, Solingen, Alemania) durante 1 hora a temperatura ambiente y luego se transfirieron 100 pL de la solucion de protema a las placas de ELISA bloqueadas y lavadas (tres veces con TBST 1x). Despues de la incubacion a temperatura ambiente durante 1,5 h, las placas se lavaron de nuevo (tres veces con TBST 1x) y se agrego el anticuerpo anti-His conjugado con peroxidasa de rabano picante (HRP) (diluido 1:10.000 en B-TBS 1x, 100 pL por pozo; Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania) para la deteccion de fusiones de scFv unidas. Despues de otra etapa de lavado, la visualizacion de los complejos de anticuerpos unidos se realizo mediante la adicion de 100 pL de sustrato TMB (3,3',5,5'-tetrametilbencidina) (Seramun Diagnostica, Heidesee, Alemania) por pozo. La reaccion se detuvo con 100 pL de H2SO4 0,5 M y se midio la absorbancia (450 nm) con un lector de microplacas de ELISA Versamax® (Molecular Devices, Sunnyvale, EE. UU.). Casi todos los constructos mostraron una senal de union mas baja en presencia del peptido M13 (FIG. 2; la proporcion superior a 1 correspondio a scFv que mostro una senal de union mas baja en presencia del peptido M 13), mientras que no se observaron cambios en la senal para el control de tipo silvestre (TS) ([G4S]3-enlazador). Las mayores diferencias en las intensidades de senal se observaron alrededor de tres regiones de la cadena de calmodulina: cerca del extremo terminal N o del extremo terminal C, y alrededor del aminoacido 80. Las dos fusiones de cada una de estas tres regiones de permutacion con la mayor diferencia de union ( llamadas N-1+2, M-1+2, C-1+2, respectivamente), asf como la variante de CaM no permutada (es decir, fusionadas por sus extremos terminales N/C, llamados lin) se usaron para analisis adicionales. Estos resultados confirmaron que la calmodulina insertada en la posicion del enlazador entre las regiones V del anticuerpo D1.3 puede inducir una influencia dependiente del peptido M13 en la union del antigeno. Los puntos de insercion son permisivos en varias posiciones de aminoacidos diferentes, pero se agrupan principalmente alrededor de la posicion de los extremos terminales de tipo silvestre o en la mitad del polipeptido calmodulina.

Ejemplo 3: Evaluacion de las caractensticas de liberacion dependientes del peptido M13 de las fusiones de scFv unidas

El cambio de union mediado por calmodulina observado en la deteccion inicial se logro despues de la preincubacion con el modulador M13. A continuacion, se diseno un ELISA de liberacion para probar si la union del peptido M13 a los enlazadores de calmodulina tambien puede inducir la disociacion de un complejo antigeno-anticuerpo ya establecido. Despues de una fase de union inicial de variantes de scFv en antigeno en un regulador que contiene calcio, se agrego el peptido M13, con un regulador de solo calcio utilizado para control. En paralelo, los mismos scFv se analizaron mediante el enfoque competitivo de preincubacion descrito anteriormente (comparar con el Ejemplo 2) en la misma placa para la calibracion.

En primer lugar, las constructos scFv-CaM se produjeron en una escala de matraz de agitacion de 500 mL. Para la expresion de protemas, las celulas que albergan el constructo deseado se cultivaron durante la noche a 37°C y 250 rpm en 30 mL de medio YP-GK 2x (medio YP 2x [16 g L-1 de peptona de soja, 10 g L-1 de extracto de levadura, 5 g L-1 de NaCl, pH 7,0] que contiene 100 mM de glucosa y 50 pg/mL de kanamicina). Al dfa siguiente, se inocularon 500 mL de medio fresco hasta una OD600 de 0,1 y se agitaron en matraces de agitacion de 2 L (37°C, 250 rpm) hasta que se alcanzo una OD600 de 1,0. La expresion de la protema se indujo con una concentracion final de IPTG 0,2 mM y los cultivos se incubaron adicionalmente a 25°C durante 4 h. Las bacterias se recogieron por centrifugacion (4.000 g, 20 min, 4°C) y el sedimento bacteriano se proceso directamente o se almaceno a -20°C hasta la extraccion periplasmatica y la purificacion de protemas.

Para la purificacion de las constructos de scFv, el sedimento bacteriano se resuspendio en 10 mL de regulador TE por g de sedimento (Tris 100 mM, EDTA 10 mM; pH 9,0 o pH 7,4, dependiendo del punto isoelectrico de la fusion de scFv) y se incubo durante la noche a 37°C a 250 rpm. Al dfa siguiente, se anadio la nucleasa Benzonasa® (concentracion final: 1 U/mL; Merck, Darmstadt, Alemania) y MgCh (20 mM) para la eliminacion del ADN. Ademas, se anadio el coctel inhibidor de la proteasa HaltMR (Thermo Fisher Scientific, Dreieich, Alemania) para evitar la degradacion de la protema objetivo. La mezcla se incubo durante 1 hora a 37°C y 250 rpm. Posteriormente, la protema que contema el sobrenadante se separo de los residuos celulares mediante centrifugacion (5.000 g, 20 min, temperatura ambiente) y se preparo para la purificacion mediante la adicion de regulador de dilucion 11x (Tris 110 mM, NaCl 550 mM, Imidazol 55 mM; pH 9,0 o pH 7,4). Se equilibraron 250 pL de resina de mquel SefarosaMR 6 (GE Healthcare, Solingen, Alemania) con 10 volumenes de columna (CV) de regulador de lavado 1 (NaH2PO450 mM, NaCl 50 mM, Imidazol 5 mM; pH 9,0 o pH 7,4) en columnas de cromatograffa Poly-Prep® (Bio-Rad, Munich, Alemania) y luego se cargaron con el sobrenadante periplasmatico, seguido de lavado con 30 CV de regulador de lavado 1 y 15 CV de regulador de lavado 2 (NaH2PO450 mM, NaCl 50 mM, Imidazol 25 mM; pH 9,0 o pH 7,4). La protema se eluyo con 5 CV de regulador de elucion 1 (NaH2PO450 mM, NaCl 50 mM, imidazol 150 mM; pH 9,0 o pH 7,4) y 5 c V de regulador de elucion 2 (NaH2PO450 mM, NaCl 50 mM, imidazol 350 mM; pH 9,0 o pH 7,4). Las fracciones que conteman protema objetivo se agruparon y se dializaron a 4°C frente a 200 volumenes de solucion salina regulada con Tris 1x (TBS) (Tris 50 mM, NaCl 150 mM; pH 8,0) durante 2 h, seguido de otra dialisis contra regulador fresco (200 volumenes) durante 2 h. La dialisis final se realizo durante la noche a 4°C frente a 500 volumenes de regulador. La concentracion de protema se determino con el kit de ensayo de protema Coomassie PierceMR (Thermo Fisher Scientific, Dreieich, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y luego se utilizo para ELISA competitivo y de liberacion.

El ELISA competitivo se realizo como se divulga en el Ejemplo 2. El ELISA de liberacion difena del ELISA competitivo solo en la etapa de preincubacion y se realizo una etapa de liberacion adicional para evaluar si los fragmentos de anticuerpo ya unidos se disocian del antfgeno en presencia del peptido M13. Los scFv purificados para ambas preparaciones (preparacion A y preparacion B) se diluyeron a las concentraciones apropiadas (0,1 pM) en B-TBS 1x/ CaCl2 5 mM y se transfirieron directamente (es decir, sin etapa de preincubacion en placas de polipropileno) a las placas de ELISA bloqueadas. Despues de la union inicial de los scFv (1,5 h, temperatura ambiente), las placas se lavaron (tres veces con TBST 1x) y se anadieron diferentes reguladores de liberacion. Para el control (preparacion A), los pozos se llenaron con 100 pL de B-TBS 1x/CaCl2 5 mM, mientras que se anadio B-TBS 1x/CaCl2 5 mM/peptido M13 1 pM en la preparacion B. Despues de la incubacion durante 1 hora a temperatura ambiente, las placas fueron tratadas de manera comparable al ELISA competitivo.

La absorbancia se midio y se normalizo, donde la senal obtenida para el control de tipo silvestre (indicado por rombos negros) en un regulador que contema calcio se ajusto al 100%. Los resultados de la media de cuatro experimentos (n = 4) se muestran en la Figura 3, donde las barras de error indican la desviacion estandar. La cafda de afinidad en presencia de peptido en la preparacion de liberacion (Figura 3B) fue comparable a la cafda observada en el enfoque de preincubacion (Figura 3A). La mayor disminucion en la senal se observo para las variantes con los enlazadores de CaM permutados en el extremo terminal C (C-1, C-2) y la variante M-1. Por lo tanto, el uso de estas variantes de CaM permutadas fue ventajoso sobre el enlazador de CaM lineal (es decir, no permutado). En conjunto, estos resultados indicaron que se logro una liberacion espedfica de la fusion scFv-CaM de su antfgeno mediante la adicion del peptido M13, lo que indica una perdida de union.

Ejemplo 4: Evaluacion del comportamiento de union dependiente del peptido M13 espedfico de las fusiones scFv-CaM anti-lisozima

Para evaluar si la modulacion de la union de las variantes scFv-CaM de D1.3 es espedfica, se determino la union de una cantidad definida de scFv (0,1 j M) en funcion de las concentraciones crecientes de peptido M13 en presencia de calcio. Se realizo una titulacion de control en un regulador que contiene EDTA para evaluar cualquier efecto independiente del calcio del peptido M13.

La produccion y purificacion de diferentes fusiones de scFv se realizo como se divulga en el Ejemplo 3. El ELISA de titulacion difena del ELISA competitivo (descrito en el Ejemplo 2) solo en la composicion de regulador utilizada para la preincubacion. De la columna 11 a 2, la concentracion de peptido M13 se diluyo secuencialmente (factor de dilucion: 1: 2) en TBS 1x/CaCl25 mM (concentracion mas alta en la columna 11: 3,2 j M; concentracion mas baja en la columna 2: 6,25 nM; control en la columna 1: 0 nM). Para la evaluacion de si la interaccion entre la calmodulina y el peptido M13 depende del calcio, la valoracion se realizo adicionalmente en B-TBS 1x/EDTA 5 mM. Casi todas las variantes de scFv-CaM analizadas mostraron una disminucion dependiente del calcio en la union del antigeno al aumentar la concentracion de peptido. A una concentracion de peptido M13 0,1 j M, una relacion molar de 1:1 (indicada por flechas), no se observo una perdida adicional de la senal de union (FIG. 4B, C, E, F, G, H, triangulos sin relleno). Solo la variante M-2 no mostro esta tendencia (FIG. 4D) y se comporto de manera similar al control de tipo silvestre (FIG.

4A). La variante del extremo terminal C (FIG. 4G, H) y la M-1 (FIG. 4C) proporcionaron la disociacion mas fuerte, corroborando los resultados mostrados en la FIG. 3. En los controles con Ed Ta , el aumento de las concentraciones de peptido M13 no tuvo una influencia en la absorbancia medida (FIG. 4A, B, C, D, E, F, G, H, cuadrados rellenos). Sin embargo, la union global de antigeno/scFv-CaM se vio claramente afectada por la presencia de EDTA, ya que las senales de union obtenidas en la preparacion de EDTA fueron mucho mas bajas que las correspondientes con calcio.

En resumen, seis de las siete fusiones scFv-CaM analizadas mostraron una union al antfgeno dependiente del peptido M13, con una perdida maxima de union a una relacion molar de 1:1 de peptido M13:scFv.

Ejemplo 5: Funcion de la actividad del enlazador CaM en otros anticuerpos scFv

Para investigar si los enlazadores identificados para proporcionar la modulacion de la union en scFv D1.3 se pueden usar como un modulo "universal" para cambiar las propiedades de union en otros fragmentos scFv distintos de D1.3, las variantes caracterizadas del enlazador CaM se clonaron en otros anticuerpos scFv con diferentes especificidades. Las especificidades se eligieron de acuerdo con su utilidad en futuras aplicaciones de tincion y separacion celular, con dos scFv dirigidos contra diferentes grupos de diferenciacion humanos (CD14, CD4) y la pequena hapteno-biotina. Para identificar las variantes de scFv-CaM dependientes del peptido M13 para esas especificidades, se tineron celulas sangumeas humanas (PBMC) usando scFv purificados y se analizaron posteriormente mediante citometna de flujo. Los scFv unidos se detectaron con anticuerpos anti-His marcados con fluorescencia. Los protocolos de incubacion para el analisis de citometna de flujo fueron comparables al ELISA de preincubacion, con reguladores que incluyen y no peptido M13.

La produccion y purificacion de diferentes fusiones de scFv se realizo como se divulga en el Ejemplo 3. Todos los anticuerpos y reactivos de tincion utilizados para aplicaciones de citometna de flujo fueron de Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Alemania). Para las tinciones con variantes de scFv anti-biotina, las PBMC (celulas mononucleares de sangre periferica) se tineron previamente con los conjugados de IgG apropiados. Las tinciones se realizaron en microtubos de 1,5 mL. Se incubaron 1 x 106 PBMC por muestra en hielo durante 10 min en 110 j L de B-TBS 1x (TBS 1x albumina de suero bovino al 0,5% [p/v]) CaCl25 mM (pH 7,4) que contema anti-CD14-biotina (dilucion: 1:11). La reaccion se detuvo mediante la adicion de 1 mL de regulador y centrifugacion a 300 g durante 5 min a 4°C. El sobrenadante se elimino completamente y el sedimento se almaceno en hielo y se resuspendio en regulador inmediatamente antes de la siguiente etapa de tincion. Las siguientes tinciones se realizaron en placas de polipropileno de 96 pozos. Los scFv purificados se diluyeron a concentraciones apropiadas en 50 j L de B-TBS 1x/CaCh 5 mM (pH 7,4 [anti-biotina] o pH 8,0 [anti-CD14, anti-CD4]) por pozo. Para las pruebas de deteccion competitivas, se agrego peptido (peptido M13 [Anaspec, Fremont, EE. UU.], biblioteca de variantes de M13 y biblioteca de CBP (peptido de union a calmodulina) [Genscript, Piscataway, EE. u U.]) en exceso molar en un volumen total de 5 j L por pozo, mientras que las tinciones de control se suministraron con 5 j L de B-TBS 1x/CaCl2 5 mM. Los scFv diluidos se incubaron previamente durante 45 min a temperatura ambiente y despues se enfriaron en hielo durante 5 min. Despues de la adicion de 2 x 105 celulas (en 45 j L de B-TBS 1x/CaCl25 mM) y la incubacion durante 20 min en hielo, los pozos se llenaron con regulador hasta un volumen de 285 j L y se centrifugaron a 300 g durante 10 min a 4°C. Posteriormente, las celulas se resuspendieron en 110 j L de B-TBS 1x/CaCh 5 mM que contema anti-His-PE (ficoeritrina) (dilucion: 1:11), se incubaron en hielo durante 10 minutos, seguidas de una etapa de lavado adicional y finalmente se resuspendieron en 200 pL de regulador. El analisis se realizo en un analizador MACSQuant® 10 en modo de bastidor 96 con enfriamiento con adicion automatica de solucion de yoduro de propidio para la exclusion de celulas muertas (concentracion final: 1 pg/mL). Un total de 10.000 eventos fueron recolectados para cada muestra.

La mayor disminucion dependiente del peptido M13 en la intensidad de fluorescencia se obtuvo para las variantes de scFv-CaM anti-CD14 (Figura 5A, primera fila). En el caso de scFv anti-biotina (Figura 5A, segunda fila), dos variantes enlazadoras (M-1, M-2) dieron como resultado una alta disminucion dependiente del peptido de la senal de union, aunque se observo una ligera disminucion para el resto clones tambien (lin, N-1, N-2). Curiosamente, las variantes permutadas en el extremo terminal C (C-1, C-2) condujeron al comportamiento de cambio opuesto con un aumento en las intensidades de fluorescencia. La misma tendencia se monitorizo para tres scFv anti-CD4 (M-1, C-1, C-2), mostrando un aumento de senal aun mayor que las variantes de scFv anti-biotina (Figura 5A, tercera fila) tras la incubacion del peptido M13.

Las Figuras 5B, C y D muestran la relacion de las senales de alta union en comparacion con las senales de baja union. Las intensidades de fluorescencia modal altas se dividieron por las intensidades de fluorescencia modal bajas. Una proporcion de 1 (indicada por una lmea discontinua) correspondfa a un anticuerpo no conmutable. Estas cifras muestran que el uso de variantes de CaM permutadas dio como resultado un anticuerpo altamente conmutable en todas las especificidades. En contraste con eso, la variante lineal proporciono solo un fragmento de anticuerpo altamente conmutable (scFv anti-CD14) (FIG. 5B), ya que el scFv anti-biotina generado (FIG. 5C) solo mostro una ligera disminucion en la senal de union y el scFv anti-CD4 no mostro ningun cambio (FIG. 5D). En general, el uso de enlazadores de calmodulina permutados, preferiblemente de variantes permutadas en el extremo terminal C o permutados en el medio del gen anterior codificador de calmodulina, condujo a un cambio mayor en la senal de union que el enlazador de calmodulina lineal. Ademas, se analizaron dos especificidades adicionales de acuerdo con su comportamiento de cambio, las fusiones scFv-CaM anti-CD20 y las variantes scFv-CaM anti-FITC (isotiocianato de fluorescema). Para los scFv anti-CD20, se observo una ligera disminucion dependiente del peptido de la senal de union para todas las variantes de CaM, mientras que ninguna de las variantes de scFv-CaM anti-FITC probadas mostro un cambio en el comportamiento de union (datos no mostrados). En resumen, se ha demostrado que el mecanismo de modulacion de la union a traves de una combinacion de enlazador de calmodulina/peptido M13 podna transferirse a cuatro de las cinco especificidades de anticuerpos analizadas. Ademas, el uso de enlazadores CaM permutados fue ventajoso sobre la variante de CaM lineal.

Ejemplo 6: Identificacion de peptidos de union a calmodulina adicionales con propiedades moduladoras de union

La calmodulina se une a una variedad de companeros de union. Para investigar si otros peptidos de union a calmodulina o mutantes derivados de M13 son capaces de modular las propiedades de union de las fusiones scFv-CaM, se realizo una seleccion de peptidos. Por un lado, se analizaron 38 variantes mutadas del peptido M13, por ejemplo, mutantes de union que se sabe que tienen afinidades mas altas por calmodulina, variantes truncadas y combinaciones de los mismos. Ademas, se analizaron 29 peptidos derivados de otras protemas de union a la calmodulina como la ATPasa de calcio, la espectrina y la oxidasa sintasa mtrica con respecto a las posibles propiedades moduladoras de la union. El analisis se realizo a traves de la tincion competitiva de PBMC como en los experimentos anteriores descritos en el Ejemplo 5. La seleccion completa (es decir, de las bibliotecas de peptidos completos) se realizo con 4 variantes de enlazadores diferentes de scFv anti-CD14 (lin, M-2, N-1, C-1) y scFv anti-CD4 (lin, M-1, N-1, C-1). El tipo silvestre de cada especificidad se uso como control. Las 38 variantes mutadas del peptido M13 mostraron propiedades moduladoras de la afinidad, mientras que 24 de 29 peptidos analizados derivados de protemas de union alternativas a la calmodulina dieron como resultado un cambio en la senal de union en al menos una fusion scFv-CaM analizada (Figura 6A (variantes del peptido M13) y la Figura 6B (peptidos de union a calmodulina); solo se incluyen en la figura los peptidos que modulan al menos una variante de scFv). La mayona de los peptidos probados mostraron un efecto comparable al peptido M13 o una influencia ligeramente menor. Nos centramos en las variantes peptfdicas, que llevaron a una disminucion o aumento de la senal aun mayor que M13 y se analizaron todas las fusiones scFv-CaM de scFv anti-CD 14, anti-biotina y anti-CD4 (FIG. 7A, B, C). Para scFv anti-CD14, tres variantes diferentes del conocido mutante de alta afinidad de M13 dieron como resultado una mayor disminucion de la senal en los clones permutados en medio de CaM y el clon lineal (FIG. 7A, M13-Var5/6/7). c BP-Var8, un derivado de la espectrina, condujo a una disminucion ligeramente mayor en la variante lineal permutada en el extremo terminal C y en la variante lineal (FIG. 7A, CBP-Var8). Inesperadamente, un peptido derivado de la ATPasa transportadora de calcio (CBP-Var16) resulto en un aumento de la senal de fluorescencia en las variantes M-2 y C-2 (FIG. 7A, CBP-Var16). Se monitorizo el mismo comportamiento opuesto para los clones permutados en el extremo terminal C de scFv anti-CD4, donde el peptido M13 condujo a un aumento en la senal de union, mientras que CBP-Var16 produjo una disminucion inesperada en la intensidad de la fluorescencia (FIG. 7C, CBP-Var16). Dos fusiones scFv-CaM anti-biotina (M-1, M-2) mostraron tal comportamiento de cambio opuesto en presencia de CBP-Var6, otro derivado de la ATPasa transportadora de calcio (FIG. 7B, CBP-Var6). Sorprendentemente, CBP-Var16 tuvo un efecto cada vez mayor en el clon C-1 y no mostro un comportamiento de cambio opuesto como en las otras fusiones scFv-CaM (FIG. 7B, CBP-Var16). Lo mismo se observo para las variantes de scFv M anti-CD4, donde CBP-Var6 condujo a un aumento adicional en la intensidad de fluorescencia (FIG. 7C, CBP-Var6). Ademas, un peptido derivado de la oxidasa sintasa nftrica endotelial (CBP-Var12) tuvo el mismo efecto en las fusiones scFv-CaM anti-CD4 permutadas en el extremo terminal C (FIG. 7C, CBP-Var12). Se observo otra disminucion inesperada en la senal de union para el clon de scFv anti-CD4 lineal, desencadenado por CBP-Var10, derivado del receptor de glutamato ionotropico NMDA1, aunque el peptido M13 no tuvo ninguna influencia en absoluto (FIG. 7C, CBP-Var10). En resumen, se ha demostrado

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una composicion que comprende

i) un polipeptido que comprende calmodulina y dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas, en el que dichos dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas estan unidos a traves de dicha calmodulina,

ii) una molecula de union a la calmodulina;

iii) los iones que se unen al sitio de union de Ca2+ de la calmodulina,

en la que la union de dicha molecula de union a la calmodulina y de dichos iones a dicho sitio de union de Ca2+ de la calmodulina afecta la union de dicho polipeptido a un antfgeno para estar unidos por dicho polipeptido.

2. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que dicha union de dicha molecula de union a calmodulina y de iones a dicho sitio de union de Ca2+ de calmodulina aumenta o reduce la afinidad de dicho polipeptido a dicho antigeno.

3. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en la que dicha molecula de union a calmodulina es un peptido de union a calmodulina.

4. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicha calmodulina es una calmodulina permutada.

5. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 4, en la que dicha calmodulina permutada tiene la secuencia seleccionada del grupo que consiste en las secuencias SEQ ID NO: 67 a SEQ ID NO: 123.

6. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en la que dicho peptido de union a calmodulina tiene la secuencia seleccionada del grupo que consiste en las secuencias SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 65.

7. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 4, en la que dicha calmodulina permutada tiene la secuencia seleccionada del grupo que consiste en las secuencias SEQ ID NO: 67 y SEQ ID NO: 68 y dicho peptido de union a la calmodulina tiene la secuencia seleccionada del grupo que consiste en las secuencias SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7. SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 46, o en la que dicha calmodulina permutada tiene la secuencia SEQ ID NO: 68 y dicho peptido de union a calmodulina tiene la secuencia SEQ ID NO: 53, o en la que dicha calmodulina permutada tiene la secuencia seleccionada del grupo que consiste en las secuencias SEQ ID NO: 71 y SEQ ID NO: 72 y dicho peptido de union a la calmodulina tiene la secuencia seleccionada del grupo que consiste en las secuencias SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 53.

8. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicho polipeptido es un Fv de cadena sencilla (scFv) que comprende la calmodulina y una region variable de una cadena pesada de una inmunoglobulina y una region variable de una cadena ligera de una inmunoglobulina.

9. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicho polipeptido es parte de un dominio de union a antfgeno de un receptor de antfgeno quimerico (CAR), comprendiendo dicho CAR un dominio de union a antfgeno, un dominio transmembrana y un dominio de senalizacion citoplasmatica.

10. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 4, en la que dicho polipeptido que comprende dicha calmodulina permutada y dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas, en la que dichos dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulina estan unidos a traves de dicha calmodulina permutada, puede obtenerse mediante el metodo que comprende las etapas

a) Creacion de al menos una secuencia de acido nucleico de insercion que codifica una calmodulina permutada

b) Creacion de una secuencia de acido nucleico aceptor que codifica un polipeptido que comprende dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas

c) Insertar al menos una secuencia de insercion de a) en la secuencia aceptora de b), en la que se inserta una secuencia de insercion de a) entre las partes de la secuencia aceptora b) que codifican los dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas de b)

d) Transformar un huesped con las secuencias de acido nucleico de c)

e) Seleccion de los huespedes transformados que albergan la secuencia o secuencias de c)

f) Deteccion de los huespedes transformados que expresan polipeptidos que comprenden dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas unidos a traves de calmodulina permutada exponiendo los polipeptidos producidos por los huespedes transformados a dicha molecula de union a calmodulina e identificando los huespedes transformados que albergan polipeptidos que impactan la union de dichos polipeptidos al antfgeno en la presencia de iones que se unen al sitio de union de Ca2+ de la calmodulina.

11. Un metodo in vitro para afectar la union de un polipeptido por un antigeno que se une, en el que dicho polipeptido comprende una calmodulina y dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas en el que dichos dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas estan enlazados a traves de dicha calmodulina, comprendiendo el metodo la etapa de poner en contacto dicho polipeptido con una molecula de union a calmodulina en presencia de iones que se unen al sitio de union de Ca2+ de la calmodulina, afectando asf la union de dicho polipeptido al antigeno.

12. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 11, en el que dicho polipeptido se pone en contacto con el antfgeno que se une mediante dicho polipeptido antes de dicho contacto de dicha molecula de union a calmodulina con dicho polipeptido.

13. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 12, en el que dicha afectacion de la union es una reduccion de la union, liberando asf el polipeptido del antfgeno.

14. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en el que dicha calmodulina es una calmodulina permutada.

15. El uso in vitro de un polipeptido que comprende una calmodulina permutada y dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas, en el que dichos dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas estan enlazados a traves de dicha calmodulina permutada para afectar en presencia de una molecula de union a calmodulina y iones que se unen al sitio de union de Ca2+ de la calmodulina, la union de dicho polipeptido a un antfgeno que se unira mediante dicho polipeptido.