BR112014020427B1 - Polipeptídeo de ligação de c5, composto de ligação de c5 e combinação - Google Patents

Polipeptídeo de ligação de c5, composto de ligação de c5 e combinação Download PDF

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Abstract

POLIPEPTÍDEOS QUE SE LIGAM AO COMPLEMENTO HUMANO C5. A presente invenção diz respeito aos polipeptídeos de ligação de C5, que compreendem um motivo de ligação de C5, BM, motivo este que consiste de uma sequência de aminoácido selecionada de i) EX2X3X4A X6X7EID X11LPNL X16X17X18QW X21AFIX25 X26LX28D, e ii) uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 86 °/) de identidade com a sequência definida em i), em que o polipeptídeo liga-se à C5. A presente invenção além disso diz respeito aos polipeptídeos de ligação de C5 para o uso em terapia, tal como para o uso no tratamento de uma condição relacionada com C5, e aos métodos de tratamento.

Description

Campo Técnico
[0001] A presente divulgação diz respeito aos polipeptídeos que se ligam ao componente 5 de complemento humano (C5) e ao uso de tais polipeptídeos em terapia.
Fundamentos
[0002] A proteína de complemento C5 é um componente central do sistema de complemento; uma parte chave do sistema imune inato. O sistema de complemento é um sistema de sobrevivência imune intrincado com numerosas tarefas nos diversos processos firmemente controlados. Uma destas funções é como defesa de primeira linha do hospedeiro contra infecção por outros organismos pela discriminação dos tecidos hospedeiros saudáveis dos fragmentos celulares e células apoptóticas e necróticas. Além disso, a mesma está envolvida na depuração de complexos imunes, regulagem da resposta imune adaptiva, promoção da regeneração de tecido, angiogênese, mobilização das células tronco e desenvolvimento do sistema nervoso central (Woodruff et al. Mol Immunol 2011, 48 (14): 1631-1642); Ricklin et al. Nat Immunol 2010, 11(9): 785-795). Qualquer deflagrador, por exemplo, a ativação errônea ou irrestrita ou regulagem insuficiente, que perturbe o equilíbrio fino da ativação e regulagem de complemento pode levar às condições patológicas que incluem auto-ataque das células do hospedeiro levando ao dano de tecido extensivo.
[0003] O sistema de complemento consiste de cerca de 30 proteínas. Existem três caminhos para iniciar a imunidade de complemento; o caminho clássico que utiliza C1q para reconhecer complexos imunes na superfície das células, o caminho da lectina que é iniciado quando a lectina que liga manose (MBL) reconhece certos açúcares e o caminho alternativo que é iniciado espontaneamente pela hidrólise do fator de complemento 3 (C3), um processo suprimido por certas moléculas de superfície da célula de mamífero não presente nos patógenos invasores. O caminho alternativo também atua como uma alça de amplificação para o sistema de complemento. Todos os três caminhos convergem ao nível de C3. A clivagem de C3 em C3a e C3b leva à formação de uma convertase que por sua vez cliva o fator de complemento 5 (C5) em C5a e C5b. C5a é um atraente muito potente de várias células imunes enquanto C5b oligomeriza com C6-9 para formar um poro conhecido como o complexo de ataque à membrana (MAC) ou algumas vezes o complexo de complemento de terminal (TCC). A ativação do sistema de complemento leva a vários mecanismos com o propósito de neutralizar o patógeno; formação de MAC na superfície de uma célula tal como uma bactéria invasora leva à lise, os produtos da deposição de C3 e clivagem de C4 C3b e C4b ajudam na opsonização levando à fagocitose do patógeno pelos macrófagos e as anafilatoxinas tais como C3a e C5a atraem monócitos e neutrófilos para o sítio de ativação, supra regula os marcadores de superfície levando à susceptibilidade imunológica aumentada e à liberação de citocinas.
[0004] C5 é uma glicoproteína de 190 kDa compreendida de 2 cadeias de polipeptídeo ligadas por dissulfeto, alfa e beta, com uma massa molecular de 115 e 75 kDa, respectivamente (Tack et al. Biochem 1979, 18: 1490-1497). Haviland et al. (J Immun 1991, 146: 362-368) construíram a sequência de cDNA completa do complemento humano pro-C5, que é prognosticada codificar uma pró-molécula de 1.676 aminoácidos que contém um peptídeo líder de 18 aminoácidos e um ligador de 4 aminoácidos que separa as cadeias beta e alfa. O bloqueio da clivagem C5 em C5a e C5b impede a formação de MAC e formação do C5a pró-inflamatório mas deixa o sistema efetor de complemento a montante intacto permitindo a opsonização mediada por C3/C4.
[0005] O papel chave do sistema de complemento na defesa contra patógenos no geral o torna um alvo interessante para a intervenção farmacêutica. Isto é enfatizado pelo fato de que muitas mutações ou regulagens prejudicadas de complemento estão envolvidas em várias doenças e condições. Estas incluem susceptibilidade aumentada para doenças autoimunes tais como Lupo eritematoso sistêmico (SLE) onde a deposição de complexos imunes deflagra o caminho clássico (Manderson et al. Annu Rev Immunol 2004, 22: 431-456). Além disso, as mutações da proteína de complementos C1 a C5 frequentemente resultam em SLE ou sintomas iguais a SLE. Outras doenças autoimunes com um envolvimento forte do sistema de complemento são artrite reumatóide (RA) onde os complexos imunes podem ativar complemento na junta RA, síndrome de Sjogren, dermatomiosite e outras doenças induzidas pelo autoanticorpo tais como síndrome de Guillain-Barré (GBS), síndrome de Fisher (Kaida et al. J. Neuroimmun 2010, 223: 5-12) tipos diferentes de vasculite, esclerose sistêmica, membrana de base anti-glomerular (anti-GBM) e síndrome anti-fosfolipídeo (APS) (Chen et al. J Autoimmun 2010, 34: J276-J286).
[0006] O sistema de complemento, além disso, está envolvido em distúrbios neurodegenerativos tais como doença de Alzheimer (AD) onde as placas de Aβ diretamente ativam o sistema de complemento levando ao recrutamento mediado por C5a da microglia. Isto foi confirmado ainda quando um antagonista de C5aR foi mostrado ser neuroprotetivo em um modelo de camundongo de AD (Fonseca et al. J Immunol 2009, 183: 1375-1383). Os auto-anticorpos contra o receptor de acetilcolina e ativação de complemento subsequente é a causa mais comum da miastenia grave, uma doença que afeta a junção neuromuscular (Toyka e Gold, Schweizer Archive Neurol Psych 2007, 158: 309-321). A formação de MAC está envolvida na fisiopatologia da esclerose múltipla (MS) (Oh et al. Immunol Res 2008, 40: 224-234). Também na doença de Parkinson, doença de Huntington e doenças priônicas tais como doença de Creutzfeld-Jacob, ativação de complemento é uma parte da patologia (Bonifati e Kishore, Mol Immunol 2007, 44: 999-1010). Na cicatrização de ferimentos, as respostas inflamatórias são componente chave para restaurar a homeostase de tecido e o sistema de complemento está envolvido no reconhecimento inicial do tecido danificado. Entretanto, em modelos de ferimentos crônicos e queimaduras graves, por exemplo, a inibição de complemento, por exemplo, pelo inibidor de C1 resultou em cicatrização melhorada e dano ao tecido diminuído sugerindo que o complemento. Além disso, várias deficiências de complemento, tais como exemplificadas pelo camundongo silenciado em C4, foram descobertas serem protetivas contra o dano ao tecido de longa duração que resulta de ferimentos (revisado em Cazender et al. Clinical and Developmental Immunology 2012, publicação on line). Recentemente foi mostrado que o crescimento e proliferação de tumor são facilitados pela ativação de complemento, em particular pelo C5a, e que o bloqueio do receptor de C5a retarda este processo. Além disso, os camundongos que carecem de C3 demonstram crescimento de tumor significantemente mais lento do que os parceiros do tipo selvagem (Markiewski et al. Nat Immunol 2008, 9: 1225-1235).
[0007] A regulagem de complemento disfuncional é a causa de várias condições raras a ultra-raras, tal como hemoglobinuria noturna paroxismal (PNH) e síndrome urêmica hemolítica atípica (aHUS), onde a hemólise é uma característica chave na patologia. Em PNH, um clone de células tronco hematopoéticas com o gene PIG-A mutado que codifica a subunidade A da fosfatidilinositol N-acetilglucosaminil- transferase leva à reunião das células sanguíneas. Esta mutação leva à perda de proteínas ancoradas ao GPI tal como os reguladores de complemento CD55 e CD59. As células sanguíneas vermelhas que carecem de CD55 e CD59 sobre a superfície são expostas para a lise mediada por complemento pelo MAC. Clinicamente, PNH é manifestado pela hemólise que leva à anemia, trombose e insuficiência da medula óssea. A HUS atípica é causada pelas mutações nas proteínas reguladoras principalmente do caminho alternativo, tal como pelas mutações no fator H.
[0008] O olho é fortemente indicado como um sítio para a patologia induzida por complemento. A causa mais comum da perda visual é a degeneração macular relacionada com a idade (AMD) onde, na sua forma mais severa (AMD exudativa ou úmida), as membranas neurovasculares coroidais patológicas desenvolvem-se sob a retina. Nos EUA, cerca de 10 % da população nas idades de 65 a 74 apresentam sinais da degeneração macular e tanto quanto 5 % têm deterioração visual como um resultado para AMD. Estes números aumentam dramaticamente com a idade, mas existem também fatores genéticos. Entre os genes mais fortes associados com AMD estão o fator de complemento H, fator B e C3 e o inibidor C1 (Bradley et al. Eye 2011, 25: 683-693). Além disso, vários estudos e testes clínicos usando várias moléculas que bloqueiam complemento têm se mostrado benéficas, sugerindo que uma molécula que bloqueia C5 ajudaria estes grupos de pacientes. Entretanto, os tratamentos correntes de AMD avançada visam na inibição da vascularização induzida pelo fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) pelas injeções intravítreas de, por exemplo, Ranibizumab (um fragmento de anticorpo monoclonal) e Bevacizumab (anticorpo monoclonal). Nos modelos de animal de uveíte, a inflamação do olho devido às respostas imunes aos antígenos oculares, os anticorpos de bloqueio contra o fator B do caminho alternativo (Manickam et al. J Biol Chem 2011, 286: 8472-8480) assim como contra C5 (Copland et al. Clin Exp Immunol 2009, 159: 303-314), melhoraram o estado de doença.
[0009] No transplante de órgãos sólidos, existem dois caminhos mecanísticos maiores que levam à rejeição ou função demorada/prejudicada do enxerto: 1) as barreiras imunológicas entre doador e receptor com respeito ao grupo sanguíneo (ABO) e classes MCH assim como o grau de pré-sensibilização do receptor contra o doador, isto é, a ocorrência de anticorpos específicos de doador (DSA) que leva à rejeição mediada por anticorpo aguda (AMR); e 2) a condição do órgão transplantado assim como o período de tempo ele foi mantido sem perfusão de sangue constante, isto é o grau de dano isquêmico ou lesão de reperfusão na isquemia (IRI) do enxerto. Tanto na AMR quanto na IRI, o sistema de complemento está atacando o órgão reconhecido como estranho e, portanto, uma entidade que deve ser rejeitada. Na AMR, os anticorpos anti-doador pré-existentes rapidamente formam complexos imunes na superfície do órgão estranho levando ao reconhecimento pelo C1q e ativação subsequente do sistema de complemento por intermédio do caminho clássico. Este processo, conhecido como rejeição hiper-aguda acontece dentro de minutos e, portanto o transplante moderno de órgãos que não combinam inclui a eliminação de DSA antes do transplante pela plasmaferese ou troca de plasma e IgG intravenoso combinado com imunossupressores diferentes. Novos tratamentos também incluem o esgotamento de célula B por intermédio do uso do anticorpo anti- CD20 Rituximab (Genberg et al. Transplant 2008, 85: 1745-1754). Estes protocolos têm vastamente eliminado a ocorrência da rejeição hiper-aguda mas ainda, em pacientes altamente sensibilizados, a incidência de AMR aguda (semanas-meses) é tão alta quanto 40 % (Burns et al. Am J Transplant 2008, 6: 2684-2694; Stegall et al. Am J Transplant 2011, publicação on line inicial). Com respeito à IRI, a maioria das evidências apontam no caminho terminal com formação de MAC subsequente e lise como a causa principal de dano ao tecido. Assim, um polipeptídeo que bloqueia C5 seria protetivo contra a rejeição independente da causa ser AMR, IRI ou, como frequentemente acontece, uma combinação tanto de AMR quanto de IRI. Como esperado, os órgãos altamente perfundidos, tais como o fígado (Qin et al. Cell Mol Immunol 2006, 3: 333-340), o coração e os rins são particularmente susceptíveis ao dano mediado pelo complemento.
[0010] A colocação central da proteína C5; que conecta as partes proximais e as terminais da cascata de complemento, a torna um alvo atraente para a intervenção farmacêutica. Visto que C5 é comum a todos os caminhos da ativação de complemento, o bloqueio de C5 interromperá a progressão da cascata independente dos estímulos e deste modo impedirá as propriedades deletérias de ativação de complemento terminal enquanto deixa as funções imunoprotetivas e imunorreguladoras da cascata de complemento proximal intactas.
[0011] Os anticorpos alvejados ao complemento humano C5 são conhecidos, por exemplo, da WO 95/29697; WO 02/30985; e WO 2004/007553. Eculizumab (Soliris®) é um anticorpo monoclonal humanizado direcionado contra a proteína C5 e impede a clivagem de C5 em C5a e C5b. Eculizumab foi mostrado ser eficaz no tratamento de PNH, uma doença rara e algumas vezes potencialmente letal do sangue caracterizada pela anemia hemolítica intravascular, trombofilia e insuficiência da medula óssea, e é aprovado para esta indicação. Eculizumab também foi recentemente aprovado pelo FDA para o tratamento da síndrome hemolítica atípica (aHUS), uma doença rara mas potencialmente letal causada pela perda de controle do caminho de complemento alternativo que leva à ativação excessiva manifestada como microangiopatia trombótica (TMA) que leva ao risco constante de dano aos órgãos vitais tais como rim, coração e o cérebro. Na aHUS, o transplante do órgão danificado apenas temporariamente ajuda o paciente visto que o fígado continua a produzir a forma mutada de proteína de controle (mais frequentemente o fator de complemento H ou outras proteínas do caminho alternativo). Uma doença relacionada com uma fisiopatologia aguda transitória é HUS causada pela infecção de E. coli positiva na toxina Shiga (STEC-HUS) e existem dados clínicos promissores que sugerem a eficácia também para esta condição (Lapeyraque et al, N Engl J Med 2011, 364: 2561-2563). Finalmente, o anticorpo que bloqueia C5 Eculizumab tem se mostrado eficaz na prevenção da AMR em receptores de rins que altamente não combinam (Stegall, M. D. et al. Am J Transplant 2011, 11: 2405-2413).
[0012] Além dos anticorpos de tamanho natural, os fragmentos variáveis de cadeia única (scFV), minicorpos e aptâmeros que alvejam C5 são descritos na literatura. Estes inibidores C5 podem ligar-se aos sítios diferentes (epítopos) na molécula C5 e podem ter modos diferentes de ação. Por exemplo, ao passo que Eculizumab interage com C5 em alguma distância do sítio de clivagem da convertase, o minicorpo Mubodina® interage com o sítio de clivagem de C5. A proteína inibidora de C5 do Inibidor de Complemento de Ornithodoros moubata (OmCI, Nunn, M. A. et al. J Immunol 2005, 174: 2084-2091) do carrapato mole Ornithodoros moubata foi deduzido ligar-se à extremidade distal do superdomínio CUB-C5d-MG8, que está próximo ao sítio de clivagem da convertase (Fredslund et al. Nat Immunol 2008, 9 (7): 753-760). Ao contrário destas três proteínas mencionadas acima que inibem a clivagem de C5, o anticorpo monoclonal TNX-558 liga-se a um epítopo C5a presente tanto no C5 intacto quanto no C5a liberado sem inibir a clivagem de C5. (Fung et al. Clin Exp Immunol 2003, 133 (2): 160-169).
[0013] Os anticorpos com a sua estrutura grande, de multidomínio, 12 pontes de dissulfeto intra-cadeia e 4 inter-cadeia e os padrões de glicosilação complexas, têm várias desvantagens intrínsecas relacionadas com a sua estrutura molecular. Por exemplo, o tamanho de Eculizumab é de cerca de 148 kDa. A concentração de C5 no sangue humano é de cerca de 400 nM e de modo a bloquear a atividade de C5 totalmente, a concentração do inibidor deve ser pelo menos igual ou mais alto do que aquela. Portanto, o regime de tratamento de longa vida padrão de PNH usando Soliris® é de infusões intravenosas de 900 mg de proteína a cada segunda semana, um tratamento que principalmente ocorre na clínica levando a maior inconveniência para o paciente e custo para a sociedade. Soliris® também foi relatado causar dor no peito, febre, calafrios, coceira, urticárias, rubores da face, brotoeja, vertigem, respiração agitada, ou inchaço da face, língua, e garganta, embora as razões para estes efeitos colaterais não sejam claras. Além disso, Eculizumab não é ativo em nenhum modelo de animal testado, incluindo primatas, tornando os estudos em animal com medicamento ativo impossíveis. Como mencionado acima, os tratamentos correntes de AMD também são dependentes de anticorpo e, assim, os tratamentos com base nas injeções ou outras vias de administração com moléculas de peso molecular mais baixo, são altamente requeridos.
[0014] Além disso, a produção de anticorpo é mais difícil e mais cara do que a produção de proteínas pequenas (Kenanova et al. Expert Opin Drug Deliv 2006, 3 (1): 53-70). Outras desvantagens no geral relacionadas com os anticorpos são listadas por Reilly et al. (Clin Pharmacokinet 1995, 28: 126-142), tais como reatividade cruzada e ligação não específica aos tecidos normais, metabolismo aumentado de anticorpos injetados e formação de anticorpos anti-ser humano humanos (HAMA) causando diminuição ou perda do efeeito terapêutico.
[0015] Assim, o fornecimento continuado de agentes com atividade de bloqueio de C5 comparável permanece uma questão de interesse substancial dentro do campo. Em particular, existe uma necessidade contínua para moléculas que previnam a cascata de complemento de terminal assim como a formação da molécula pró- inflamatória C5a. Também é de grande interesse um fornecimento de usos de tais moléculas no tratamento de doença.
Descrição
[0016] É um objetivo da invenção fornecer novos agentes de ligação de C5. Além disso, é um objetivo da invenção fornecer novos agentes de ligação de C5 para o uso em aplicações terapêuticas.
[0017] Em um aspecto, é fornecido um polipeptídeo de ligação de C5, que compreende um motivo de ligação de C5, BM, motivo este que consiste da sequência de aminoácido selecionado de
[0018] i. EX2X3X4A X6X7EID X11LPNL X16X17X18QW X21AFIX25 X26LX28D,
[0019] em que, independentemente um do outro,
[0020] X2 é selecionado de H, Q, S, T e V;
[0021] X3 é selecionado de I, L, M e V;
[0022] X4 é selecionado de A, D, E, H, K, L, N, Q, R, S, T e Y;
[0023] X6 é selecionado de N e W;
[0024] X7 é selecionado de A, D, E, H, N, Q, R, S e T;
[0025] X11 é selecionado de A, E, G, H, K, L, Q, R, S, T e Y;
[0026] X16 é selecionado de N e T;
[0027] X17 é selecionado de I, L e V;
[0028] X18 é selecionado de A, D, E, H, K, N, Q, R, S e T;
[0029] X21 é selecionado de I, L e V;
[0030] X25 é selecionado de D, E, G, H, N, S e T;
[0031] X26 é selecionado de K e S;
[0032] X28 é selecionado de A, D, E, H, N, Q, S, T e Y;
[0033] e
[0034] ii) uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 86 % de identidade com a sequência definida em i), em que o polipeptídeo se liga a C5.
[0035] A classe definida acima de polipeptídeos relacionados com a sequência tendo uma afinidade de ligação para C5 é derivada de uma sequência de polipeptídeo precursora comum. Mais especificamente, a definição da classe está fundamentada em uma análise de um grande número de variantes de polipeptídeo aleatórias do polipeptídeo precursor que foram selecionadas quanto à sua interação com C5 em experimentos de seleção. O motivo de ligação de C5 identificado, ou “BM”, corresponde à região de ligação alvo do esqueleto precursor, região esta que constitui duas hélices alfa dentro de um domínio de proteína de feixe de três hélices. No esqueleto precursor, os resíduos de aminoácido variados das duas hélices BM constituem uma superfície de ligação para a interação com a parte Fc constante de anticorpos. Pela variação aleatória de resíduos de superfícies de ligação e seleção subsequente de variantes, a capacidade de interação de Fc da superfície de ligação foi substituída com uma capacidade para interação com C5.
[0036] Como esclarecido nos Exemplos que seguem, a seleção de polipeptídeo de ligação de variantes C5, por exemplo, pode ser obtido pela demonstração de fago para a seleção de variantes ingênuas de um esqueleto de proteína opcionalmente seguido pela maturação de afinidade e demonstração de célula para seleção de variantes de ligação C5 maturadas por afinidade. É, entretanto entendido que qualquer sistema de seleção, seja com base em fago, com base em bactéria, com base em célula ou outro, pode ser usado para a seleção de polipeptídeos de ligação de C5.
[0037] Os termos “ligação de C5” e ”afinidade de ligação para C5” como usado neste relatório descritivo refere-se a uma propriedade de um polipeptídeo que pode ser testado, por exemplo, pelo uso da tecnologia de ressonância de plásmon de superfície, tal como em um instrumento Biacore (GE Healthcare). A afinidade de ligação de C5, por exemplo, pode ser testada em um experimento em que C5 é imobilizado em um chip sensor de um instrumento Biacore, e a amostra que contém o polipeptídeo a ser testado é passado no chip. Alternativamente, o polipeptídeo a ser testado é imobilizado em um chip sensor do instrumento, e uma amostra que contém C5, ou fragmento do mesmo, é passado no chip. A pessoa habilitada pode depois interpretar os resultados obtidos por tais experimentos para estabelecer uma medida pelo menos qualitativa da ligação do polipeptídeo para C5. Se uma medida quantitativa é desejada, por exemplo, para determinar a constante de dissociação no equilíbrio aparente KD para a interação, os métodos de ressonância de plásmon de superfície também pode ser usado. Os valores de ligação, por exemplo, podem ser definidos em um instrumento Biacore 2000 (GE Healthcare). C5 é imobilizado em um chip sensor da medição, e as amostras do polipeptídeo cuja afinidade deva ser determinada são preparadas pela diluição em série e injetado no chip. Os valores KD podem ser depois calculados a partir dos resultados usando, por exemplo, o modelo de ligação de Langmuir 1:1 do software BIAevaluation fornecido pelo fabricante do instrumento. O C5 ou fragmento do mesmo usado na determinação de KD, por exemplo, pode compreender a sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 760.
[0038] Em uma forma de realização do polipeptídeo de ligação de C5 de acordo com a presente invenção, o polipeptídeo de ligação de C5 liga-se a C5 tal que o valor KD da interação é no máximo de 1 x 10-6 M, tal como no máximo 1 x 10-7 M, 1 x 10-8 M, ou 1 x 10-9 M.
[0039] Um polipeptídeo de ligação de C5 de acordo com a presente invenção pode ser usado como uma alternativa para os anticorpos convencionais ou substâncias de peso molecular baixo em várias aplicações médicas, veterinárias e de diagnóstico. Em particular, o polipeptídeo de ligação de C5 pode ser útil em qualquer método que requeira afinidade para C5 de um reagente. Consequentemente, o polipeptídeo de ligação de C5 pode ser usado como um reagente de detecção, um reagente de captura, um reagente de separação, um agente de diagnóstico ou um agente terapêutico em tais métodos.
[0040] Como a pessoa habilitada constatará, a função de qualquer polipeptídeo, tal como a capacidade de ligação de C5 dos polipeptídeos como aqui definida, é dependente da estrutura terciária do polipeptídeo. É, portanto possível realizar mudanças menores para a sequência de aminoácido de um polipeptídeo sem afetar amplamente a estrutura terciária e a sua função. Assim, em uma forma de realização, o polipeptídeo compreende variantes modificadas de BM de i), que são tais que a sequência resultante é pelo menos 89 % idêntica a uma sequência que pertence à classe definida por i), tal como pelo menos 93 % idêntica, tal como pelo menos 96 % idêntica a uma sequência que pertence à classe definida por i). Por exemplo, é possível que um resíduo de aminoácido que pertence a um certo agrupamento funcional de resíduos de aminoácido (por exemplo hidrofóbico, hidrofílico, polar, etc) seja trocado por outro resíduo de aminoácido do mesmo grupo funcional.
[0041] Em outra forma de realização do polipeptídeo de ligação de C5 como definido acima, a sequência de aminoácido é selecionada de i) como definido acima, e iii) uma sequência de aminoácido que nas 13 posições variáveis como indicado por Xn, em que n é 2-4, 6-7, 11, 16-18, 21, 25-26 e 28, tem pelo menos 84 % de identidade com a sequência definida em i), e que nas posições 1, 5, 8-10, 12-15, 19-20, 22-24, 27 e 29 tem pelo menos 87 % de identidade com a sequência definida em i).
[0042] Em uma forma de realização do polipeptídeo de acordo com a presente invenção, X2 é selecionado de H, T e V. Em outra forma de realização, X2 é selecionado de T e V. Já em outra forma de realização, X2 é V.
[0043] Em uma forma de realização do polipeptídeo de acordo com a presente invenção, X3 é selecionado de I, L e V. Em outra forma de realização, X3 é selecionado de I e L. Já em outra forma de realização, X3 é I. Em uma forma de realização alternativa, X3 é L.
[0044] Em uma forma de realização do polipeptídeo de acordo com a presente invenção, X4 é selecionado de A, D, E, K, L, Q e R. Em outra forma de realização, X4 é selecionado de A, D, E, K e R. Ainda em outra forma de realização relacionada, X4 é selecionado de D e E.
[0045] Em uma forma de realização do polipeptídeo de acordo com a presente invenção, X6 é W.
[0046] Em uma forma de realização do polipeptídeo de acordo com a presente invenção, X7 é selecionado de A, D, N e T. Em outra forma de realização, X7 é selecionado de D e N. Ainda em outra forma de realização relacionada, X7 é D. Em uma forma de realização alternativa, X7 é N.
[0047] Em uma forma de realização do polipeptídeo de acordo com a presente invenção, X11 é selecionado de A, H, K, Q, R e S. Em outra forma de realização, X11 é selecionado de A, H, K e R. Ainda em outra forma de realização relacionada, X11 é selecionado de A, K e R. Ainda em outra forma de realização relacionada, X11 é selecionado de K e R.
[0048] Em uma forma de realização do polipeptídeo de acordo com a presente invenção, X16 é T.
[0049] Em uma forma de realização do polipeptídeo de acordo com a presente invenção, X17 é selecionado de I e L. Em outra forma de realização, X17 é I. Em uma forma de realização alternativa, X17 é L.
[0050] Em uma forma de realização do polipeptídeo de acordo com a presente invenção, X18 é selecionado de A, D, E, N, Q, S e T. Em outra forma de realização, X18 é selecionado de A, D, E, Q e S. Ainda em outra forma de realização relacionada, X18 é selecionado de D, E e Q. Ainda em outra forma de realização relacionada, X18 é selecionado de D e E. Ainda em outra forma de realização relacionada, X18 é D. Em uma forma de realização alternativa, X18 é E.
[0051] Em uma forma de realização do polipeptídeo de acordo com a presente invenção, X21 é selecionado de I e L. Em outra forma de realização, X21 é I. Em uma forma de realização alternativa, X21 é L.
[0052] Em uma forma de realização do polipeptídeo de acordo com a presente invenção, X25 é selecionado de E, H, N e T. Em outra forma de realização, X25 é selecionado de E e N. Ainda em outra forma de realização relacionada, X25é N.
[0053] Em uma forma de realização do polipeptídeo de acordo com a presente invenção, X26 é K.
[0054] Em uma forma de realização do polipeptídeo de acordo com a presente invenção, X28 é selecionado de A, D, E, H, N, Q e S. Em outra forma de realização do polipeptídeo divulgado acima, X28 é selecionado de A, D, E e S. Ainda em outra forma de realização relacionada, X28 é selecionado de A, D e E. Ainda em outra forma de realização relacionada, X28 é selecionado de D e E. Ainda em outra forma de realização relacionada, X28 é D.
[0055] Em uma forma de realização do polipeptídeo de acordo com a presente invenção, X3X4 é selecionado de LE e LD.
[0056] Em uma forma de realização do polipeptídeo de acordo com a presente invenção, X17X18 é selecionado de IE e LD.
[0057] Nas formas de realização acima do primeiro aspecto, os exemplos de polipeptídeos de ligação de C5 que caem dentro da classe dos polipeptídeos são identificados. É considerado que as formas de realização individuais acima podem ser combinadas em todos os modos concebíveis e ainda caem dentro do escopo da presente invenção. Tais combinações de formas de realização individuais definem uma sequência de aminoácidos restrita, em uma ou mais das posições X2-X28, quando comparada com a definição de aminoácidos em i).
[0058] As formas de realização acima de um polipeptídeo de ligação de C5, por exemplo, podem ser combinadas tal que o aminoácido i) satisfaça pelo menos quatro das oito condições de I a VIII que seguem: i .X2 é V; ii .X3 é selecionado de I e L; iii .X6 é W; iv .X7 é selecionado de D e N; v .X17 é selecionado de I e L; vi .X21 é L; vii .X25 é N; viii .X28 é D.
[0059] Em alguns exemplos de um polipeptídeo de ligação de C5 de acordo com o primeiro aspecto, a sequência de aminoácido i) satisfaz pelo menos cinco das oito condições de I a VIII. Mais especificamente, a sequência de aminoácido i) pode satisfazer pelo menos seis das oito condições de I a VIII, tal como pelo menos sete das oito condições de I a VIII, tal como todas as oito condições de I a VIII.
[0060] Como descrito nos Exemplos que seguem, a seleção de variantes de ligação de C5 tem levado à identificação de sequências individuais de motivo de ligação de C5 (BM). Estas sequências constituem formas de realização individuais de polipeptídeos de ligação de C5 de acordo com este aspecto. As sequências de motivos de ligação de C5 individuais são apresentadas na Figura 1 e como SEQ ID NO: 1 a 248. Em algumas formas de realização deste aspecto, a sequência de BM i) é selecionada de qualquer uma das SEQ ID NO: 1 a 12, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23 a 24, SEQ ID NO: 26 a 28, SEQ ID NO: 32 a 35, SEQ ID NO: 38 a 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 56 a 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 78 a 79, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 215 e SEQ ID NO: 243. Mais especificamente, A sequência de BM i) é selecionada de qualquer uma das SEQ ID NO: 1 a 12, tal como da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5. Em particular, a sequência BM i) pode ser selecionada da SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 4.
[0061] Em formas de realização particulares, o motivo de ligação de C5 (BM) forma parte de um domínio de proteína de feixe de hélice tripla. Por exemplo, o BM pode essencialmente constituir duas hélices alfa com uma alça de interconexão, dentro do dito domínio de proteína de feixe de hélice tripla.
[0062] O domínio de proteína de feixe de hélice tripla é, em outra forma de realização, selecionado de domínios de proteínas receptoras bacteriana. Os exemplos não limitantes de tais domínios são os cinco domínios helicoidais triplos diferentes da Proteína A de Staphilococcus aureus, tal como o domínio B, e seus derivados. Em algumas formas de realização, o domínio de proteína de feixe de hélice tripla é uma variante da proteína Z, que é derivada do dito domínio B da Proteína A estafilocócica.
[0063] Em formas de realização onde o polipeptídeo de ligação de C5 da invenção forma parte de um domínio de proteína de feixe de hélice tripla, o polipeptídeo de ligação de C5 pode compreender uma sequência de aminoácido selecionada de:
[0064] i) K-[BM]-DPSQS XaXbLLXc EAKKL NDXdQ;
[0065] em que
[0066] [BM] é um motivo de ligação de C5 como definido acima;
[0067] Xa é selecionado de A e S;
[0068] Xb é selecionado de N e E;
[0069] Xc é selecionado de A, S e C;
[0070] Xd é selecionado de A e S;
[0071] e
[0072] ii) uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 79 % de identidade com qualquer uma das sequências definidas acima. A dita sequência de aminoácido pode ter pelo menos 81 %, tal como pelo menos 83 %, tal como pelo menos 85 %, tal como pelo menos 87 %, tal como pelo menos 89 %, tal como pelo menos 91 %, tal como pelo menos 93 %, tal como pelo menos 95 %, tal como pelo menos 97 % de identidade com qualquer uma das sequências definidas acima.
[0073] Em uma forma de realização do polipeptídeo de ligação de C5 como definido acima, Xa é A. Em uma forma de realização alternativa do polipeptídeo de ligação de C5 como definido acima, Xa é S.
[0074] Em uma forma de realização do polipeptídeo de ligação de C5 como definido acima, Xb é N. Em uma forma de realização alternativa, Xb é E.
[0075] Em uma forma de realização do polipeptídeo de ligação de C5 como definido acima, Xc é A. Em uma forma de realização alternativa, Xc é S. Ainda em outra forma de realização alternativa, Xc é C.
[0076] Em uma forma de realização do polipeptídeo de ligação de C5 como definido acima, Xd é A. Em uma forma de realização alternativa, Xd é S.
[0077] Em uma forma de realização do polipeptídeo de ligação de C5 como definido acima, Xa é A; Xb é N; Xc é A e Xd é A.
[0078] Em outra forma de realização do polipeptídeo de ligação de C5 como definido acima, Xa é A; Xb é N; Xc é C e Xd é A.
[0079] Em outra forma de realização do polipeptídeo de ligação de C5 como definido acima, Xa é S; Xb é E; Xc é S e Xd é S.
[0080] Em outra forma de realização do polipeptídeo de ligação de C5 como definido acima, Xa é S; Xb é E; Xc é C e Xd é S.
[0081] Ainda em outra forma de realização, a sequência de aminoácido do polipeptídeo de ligação de C5 como definido acima é selecionada da SEQ ID NO: 249 a 496, em particular da SEQ ID NO: 249 a 260, SEQ ID NO: 268, SEQ ID NO: 271 a 272, SEQ ID NO: 274 a 276, SEQ ID NO: 280 a 283, SEQ ID NO: 286 a 287, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 304 a 305, SEQ ID NO: 307, SEQ ID NO: 314, SEQ ID NO: 326 a 327, SEQ ID NO: 335, SEQ ID NO: 340, SEQ ID NO: 354, SEQ ID NO: 358, SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 389, SEQ ID NO: 399, SEQ ID NO: 409, SEQ ID NO: 414, SEQ ID NO: 435, SEQ ID NO: 445, SEQ ID NO: 451, SEQ ID NO: 453, SEQ ID NO: 463 e SEQ ID NO: 491, tal como da SEQ ID NO: 249 a 260. Em outra forma de realização, a sequência de aminoácido é selecionada da SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 252 e SEQ ID NO: 253, tal como da SEQ ID NO: 249 e SEQ ID NO: 252.
[0082] Assim, em outra forma de realização, é fornecido um polipeptídeo de ligação de C5 que compreende uma sequência de aminoácido selecionada de:
[0083] i) YAK-[BM]-DPSQS SELLXc EAKKL NDSQA P;
[0084] em que [BM] é um motivo de ligação de C5 como definido acima e
[0085] Xc é selecionado de S e C; e
[0086] ii) uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 81 % de identidade com qualquer uma das sequências definidas em i) acima.
[0087] Alternativamente, é fornecido um polipeptídeo de ligação de C5 que compreende uma sequência de aminoácido selecionada de:
[0088] i) FNK-[BM]-DPSQS ANLLXc EAKKL NDAQA P;
[0089] em que [BM] é um motivo de ligação de C5 como definido acima e
[0090] Xc é selecionado de A e C; e
[0091] ii) uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 81 % de identidade com qualquer uma das sequências definidas em i) acima.
[0092] Como debatido acima, os polipeptídeos que compreendem mudanças menores quando comparados com as sequências de aminoácido acima sem afetar amplamente a estrutura terciária e a sua função também está dentro do escopo do presente pedido. Assim, em algumas formas de realização, os polipeptídeos de ligação de C5 como definidos acima, por exemplo, podem ter uma sequência que é pelo menos 83 %, pelo menos 84 %, pelo menos 86 %, pelo menos 88 %, pelo menos 90 %, pelo menos 92 %, pelo menos 94 %, pelo menos 96 % ou pelo menos 98 % idêntica com a sequência definida em i).
[0093] Em algumas formas de realização e como divulgado nos Exemplos abaixo, o motivo de ligação de C5 pode formar parte de um polipeptídeo de 58 ou 60 aminoácidos. Tal polipeptídeo pode, por exemplo, compreender uma sequência selecionada de qualquer uma das SEQ ID NO: 497 a 757, em particular uma sequência selecionada de qualquer uma das SEQ ID NO: 497 a 508, SEQ ID NO: 516, SEQ ID NO: 519 a 520, SEQ ID NO: 522 a 524, SEQ ID NO: 528 a 531, SEQ ID NO: 534 a 535, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 542, SEQ ID NO: 545, SEQ ID NO: 552 a 553, SEQ ID NO: 555, SEQ ID NO: 562, SEQ ID NO: 574 a 575, SEQ ID NO: 583, SEQ ID NO: 588, SEQ ID NO: 602, SEQ ID NO: 606, SEQ ID NO: 615, SEQ ID NO: 621, SEQ ID NO: 637, SEQ ID NO: 647, SEQ ID NO: 657, SEQ ID NO: 662, SEQ ID NO: 683, SEQ ID NO: 693, SEQ ID NO: 699, SEQ ID NO: 701, SEQ ID NO: 711, SEQ ID NO: 739 e SEQ ID NO: 745 a 757, tal como uma sequência selecionada da SEQ ID NO: 497 a 508 e SEQ ID NO: 745 a 757. Em outra forma de realização, a sequência de aminoácido é selecionada da SEQ ID NO: 497, SEQ ID NO: 498, SEQ ID NO: 499, SEQ ID NO: 500, SEQ ID NO: 501 , SEQ ID NO: 746, SEQ ID NO: 747, SEQ ID NO: 748, SEQ ID NO: 750 e SEQ ID NO: 753, tal como de qualquer uma da SEQ ID NO: 497, SEQ ID NO: 500, SEQ ID NO: 748 e SEQ ID NO: 753.
[0094] A ligação de uma molécula a C5 não necessariamente inibe a clivagem de C5. A inibição é dependente do sítio de ligação, e visto que não está totalmente claro o que afeta a interação com as regiões específicas que C5 tem, algumas moléculas de ligação de C5 podem interagir com C5 sem inibir a sua clivagem em C5a e C5b. Em uma forma de realização da presente invenção, o polipeptídeo de ligação de C5, quando, por exemplo, administrado a um indivíduo mamífero, inibe a clivagem de C5. O polipeptídeo de ligação de C5 de acordo com a invenção pode mais especificamente inibir a clivagem de C5 humano quando administrado a um indivíduo a humano.
[0095] A estrutura de C5 difere um pouco entre as espécies, e assim, um Ligador de C5 descoberto ligar C5 de uma espécie pode ser inativo em outra espécie. O anticorpo humanizado Eculizumab, por exemplo, liga-se a um domínio de C5 frequentemente aludido como MG7. Esta região é altamente variável entre as espécies e, portanto, a ligação de Eculizumab é restrita ao C5 humano. O polipeptídeo de ligação de C5 da presente invenção, entretanto, não é restrito ao C5 humano mas também exibe atividade em modelos de animal, como demonstrado nos Exemplos anexos.
[0096] A pessoa habilitada entenderá que várias modificações e/ou adições podem ser feitas a um polipeptídeo de ligação de C5 de acordo com qualquer aspecto aqui divulgado de modo a adaptar o polipeptídeo a uma aplicação específica sem divergir do escopo da presente invenção. Por exemplo, um polipeptídeo de ligação de C5 de acordo com qualquer aspecto pode compreender ainda aminoácidos de terminal C e/ou terminal N. Tal polipeptídeo deve ser compreendido como um polipeptídeo tendo resíduos de aminoácido adicionais na primeira e/ou na última posições na cadeia de polipeptídeo, isto é no terminal N e/ou C. Assim, um polipeptídeo de ligação de C5 pode compreender qualquer número adequado de resíduos de aminoácido adicionais, por exemplo, pelo menos um resíduo de aminoácido adicional. Cada resíduo de aminoácido adicional pode individual ou coletivamente ser adicionado de modo a, por exemplo, melhorar a produção, purificação, estabilização in vivo ou in vitro, ligação, ou detecção do polipeptídeo. Tais resíduos de aminoácido adicionais podem compreender um ou mais resíduos de aminoácido adicionados com o propósito de ligação química. Um exemplo disto é a adição de um resíduo de cisteína. Tais resíduos de aminoácido adicionais também podem fornecer um “rótulo” para a purificação ou detecção do polipeptídeo, tal como um rótulo His6 ou um rótulo ”myc” (c-myc) ou um rótulo “FLAG” para a interação com anticorpos específicos para o rótulo ou cromatografia de afinidade a metal imobilizado (IMAC) no caso do rótulo His6.
[0097] Os outros aminoácidos como debatido acima podem ser ligados ao polipeptídeo de ligação de C5 por meio de conjugação química (usando métodos da química orgânica conhecidos) ou por quaisquer outros meios, tal como expressão do polipeptídeo de ligação de C5 como uma proteína de fusão.
[0098] Os outros aminoácidos como debatidos acima podem, por exemplo, compreender um ou mais domínio(s) de polipeptídeo. Outro domínio de polipeptídeo pode fornecer o polipeptídeo de ligação de C5 com outra função, tal como, por exemplo, outra função de ligação, ou uma função enzimática, ou uma função tóxica (por exemplo uma imunotoxina), ou uma função de sinalização fluorescente, ou suas combinações.
[0099] Outro domínio de polipeptídeo pode, além disso, fornecer o polipeptídeo de ligação de C5 com a mesma função de ligação. Assim, em outra forma de realização, é fornecido um polipeptídeo de ligação de C5 que compreende pelo menos duas unidades monoméricas de polipeptídeo de ligação de C5, as sequências de aminoácido das quais podem ser as mesmas ou diferentes. As formas multiméricas dos polipeptídeos podem compreender um número adequado de domínios, cada um tendo um motivo de ligação de C5, e cada um formando um “monômero” dentro do multímero. Estes domínios podem todos ter a mesma sequência de aminoácido, mas alternativamente, eles podem ter sequências de aminoácido diferentes. Em particular, o polipeptídeo de ligação de C5 da invenção pode formar homo- ou heterodímeros.
[0100] O(s) outro(s) domínio(s) de polipeptídeo como descrito(s) acima pode(m) ser unido(s) ao polipeptídeo de ligação de C5 pela ligação covalente usando métodos da química orgânica conhecidos. Alternativamente, o polipeptídeo de ligação de C5 que compreende o(s) outro(s) domínio(s) de polipeptídeo pode(m) ser expressado(s) como um ou mais polipeptídeos de fusão, por exemplo, em um sistema para a expressão recombinante de polipeptídeos, ou unidos em qualquer outra maneira, diretamente ou por intermédio de um ligador, por exemplo, um ligador de aminoácido.
[0101] Em algumas formas de realização, o(s) outro(s) domínio(s) de polipeptídeo pode(m) compreender uma porção de prolongamento da meia-vida que aumenta a meia vida do polipeptídeo de ligação de C5 in vivo. Como entendido pela pessoa habilitada, aumentada, ou prolongada, meia vida significada depuração mais lenta de uma molécula particular do sangue. Existem várias estratégias conhecidas para prolongar a meia vida de um polipeptídeo particular in vivo, tal como ligação ao domínio Fc de um anticorpo (conjugação Fc) ou ligação à albumina. Outro exemplo é a ligação a uma porção que prolonga a meia vida, por exemplo, um peptídeo ou proteína, que associar-se-á à albumina sérica in vivo. Em particular, a porção que prolonga a meia vida pode ser uma porção de ligação de albumina. Uma porção de ligação de albumina pode, por exemplo, consistir de um polipeptídeo que ocorre naturalmente, ou um fragmento que liga albumina do mesmo, ou um polipeptídeo engendrado. Um polipeptídeo engendrado pode ser derivado de um polipeptídeo de partida que ocorre naturalmente através da submissão do mesmo às técnicas de engendramento de proteína, tais como mutações e alterações em um método direcionado ao sítio ou randomizado, com uma vista para criar propriedades novas ou realçadas, tais como afinidade de ligação para uma molécula tal como albumina. Tal polipeptídeo que liga albumina engendrado, por exemplo, pode ser uma variante de uma armação de proteína, variante esta que foi selecionada quanto à sua afinidade de ligação específica à albumina. Em uma forma de realização específica, a armação de proteína pode ser selecionada de domínios da Proteína G estreptocócica ou seus derivados, tais como, por exemplo, domínio GA1, domínio GA2 e domínio GA3 da Proteína G da cepa de Streptococcus G148, em particular o domínio GA3.
[0102] Consequentemente, em uma forma de realização do polipeptídeo de ligação de C5, os outros aminoácidos melhoram a estabilização in vivo ou in vitro e compreendem um domínio de ligação de albumina (ABD) da proteína G estreptocócica, ou um derivado da mesma. Um exemplo de um domínio de ligação de albumina que pode ser compreendido como outro domínio de polipeptídeo no polipeptídeo de ligação de C5 da invenção é apresentado na SEQ ID NO: 759. Outros exemplos de domínios de ligação de albumina adequados são divulgados na WO 2009/016043 e WO 2012/004384. Tal polipeptídeo prolongado em ABD liga-se à albumina sérica in vivo, e beneficia-se da sua meia vida mais longa, que aumenta a meia vida líquida do próprio polipeptídeo (ver, por exemplo, a WO 91/01743). O perfil farmacocinético de um polipeptídeo de ligação de C5 que compreende uma porção de ligação de albumina como definida acima parece assim aquele da albumina sérica quando administrado, por exemplo, a um indivíduo mamífero. ABD e seus derivados ligam-se muito fortemente à albumina sérica humana (HSA) assim como à albumina sérica de outras espécies, tais como camundongo e rato.
[0103] O ABD da proteína G estreptocócica tem 46 aminoácidos no comprimento, e assim quando um polipeptídeo de ligação de C5 de acordo com a invenção compreende uma porção do ABD ou um derivado do mesmo, o tamanho global do polipeptídeo de ligação de C5 é relativamente pequeno. Quando administrado, por exemplo, a um indivíduo mamífero, tal como um indivíduo humano, a parte que liga albumina do polipeptídeo de ligação de C5 associar-se-á de modo não covalente com a albumina sérica e o polipeptídeo pode deste modo beneficiar-se da depuração renal diminuída e recirculação aumentada nas células epiteliais. A penetração no tecido pode, entretanto, ser ainda rápida devido às propriedades de extravasação da albumina sérica. Além disso, um polipeptídeo de ligação de C5 que compreende uma porção que prolonga a meia vida pode não apenas demonstrar uma meia vida prolongada in vivo, mas também uma resposta imunológica reduzida in vivo, quando comparado com um polipeptídeo que carece de uma porção que prolonga a meia vida correspondente (ver, por exemplo, a WO 2005/097202).
[0104] Em um aspecto relacionado, é fornecido um composto de ligação de C5, que compreende pelo menos um polipeptídeo de ligação de C5 de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes; pelo menos um domínio de ligação de albumina da proteína G estreptocócica, ou um derivado da mesma, e pelo menos uma porção de ligação para ligar o dito pelo menos um domínio ou derivado do mesmo aos terminais C ou N do dito pelo menos um polipeptídeo de ligação de C5. Tal composto de ligação de C5 tem alta afinidade para C5 assim como para a albumina sérica in vivo, quando administrado, por exemplo, a um indivíduo mamífero, e a ligação à albumina sérica não interfere com a interação com C5, como demonstrado nos Exemplos que seguem.
[0105] Em uma forma de realização, o composto de ligação de C5 tem uma estrutura selecionada de
[0106] [CBP1]-[L1]-[ALBD];
[0107] [CBP1]-[CBP2]-[L1]-[ALBD];
[0108] [CBP1]-[L1]-[ALBD]-[L2]-[CBP2];
[0109] [ALBD]-[L1]-[CBP1];
[0110] [ALBD]-[L1]- [CBP1]-[CBP2];
[0111] [CBP1]-[L1]- [CBP2]-[L2]-[ALBD]; e
[0112] [ALBD]-[L1]- [CBP1]- [L2]- [CBP2]
[0113] em que, independentemente um do outro,
[0114] [CBP1] e [CBP2] são polipeptídeos de ligação de C5 que podem ser os mesmos ou diferentes;
[0115] [L1] e [L2] são porções de ligação que podem ser as mesmas ou diferentes; e
[0116] [ALBD] é um domínio de ligação de albumina da proteína G estreptocócica, ou derivado da mesma.
[0117] Os compostos de ligação de C5 preferidos têm uma estrutura selecionada de
[0118] [CBP1]-[CBP2]-[L1]-[ALBD];
[0119] [CBP1]-[L1]-[ALBD]-[L2]-[CBP2]; e o mais preferivelmente,
[0120] [CBP1]-[L1]-[ALBD].
[0121] Os exemplos de porções de ligação que podem ser usados em tais compostos de ligação de C5 são selecionados de G, GS; [G2S]n; [G3S]n; [G4S]n; GS[G4S]n, em que n é de 0 a 7 (preferivelmente, n é de 0 a 2); [S2G]m; [S3G]m ;[S4G]m; em que m é de 0 a 7, e VDGS. Os ligadores preferidos são GS e GS[G4S]2.
[0122] Os exemplos de domínios de ligação de albumina ou seus derivados que podem ser compreendidos em um composto de ligação de C5 são como descritos acima. Em particular, um exemplo de um domínio de ligação de albumina é apresentado na SEQ ID NO: 759.
[0123] Particularmente os compostos de ligação de C5 preferidos têm a estrutura [CBP1]-[L1]-[ALBD], em que [CBP1] é um polipeptídeo selecionado da SEQ ID NO: 748 e SEQ ID NO: 753, [L1] é GS, e [ALBD] é um polipeptídeo mostrado como a SEQ ID NO: 759.
[0124] O(s) polipeptídeo(s) de ligação de C5 compreendido(s) em um polipeptídeo de ligação de C5 é/são, em uma forma de realização, independentemente selecionado(s) de polipeptídeos de ligação de C5 de 58-mer ou 60-mer como anteriormente descrito. Em particular, o composto de ligação de C5 pode compreender um ou mais polipeptídeos de ligação de C5 independentemente selecionados de qualquer uma das SEQ ID NO: 497 a 508, SEQ ID NO: 516, SEQ ID NO: 519 a 520, SEQ ID NO: 522 a 524, SEQ ID NO: 528 a 531, SEQ ID NO: 534 a 535, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 542, SEQ ID NO: 545, SEQ ID NO: 552 a 553, SEQ ID NO: 555, SEQ ID NO: 562, SEQ ID NO: 574 a 575, SEQ ID NO: 583, SEQ ID NO: 588, SEQ ID NO: 602, SEQ ID NO: 606, SEQ ID NO: 615, SEQ ID NO: 621, SEQ ID NO: 637, SEQ ID NO: 647, SEQ ID NO: 657, SEQ ID NO: 662, SEQ ID NO: 683, SEQ ID NO: 693, SEQ ID NO: 699, SEQ ID NO: 701, SEQ ID NO: 711, SEQ ID NO: 739 e SEQ ID NO: 746 a 757, tal como uma sequência selecionada da SEQ ID NO: 497 a 508 e SEQ ID NO: 746 a 757. Em outra forma de realização, a sequência de aminoácido é selecionada da SEQ ID NO: 497, SEQ ID NO: 498, SEQ ID NO: 499, SEQ ID NO: 500, SEQ ID NO: 501, SEQ ID NO: 746, SEQ ID NO: 747, SEQ ID NO: 748, SEQ ID NO: 750 e SEQ ID NO: 753, tal como de qualquer uma da SEQ ID NO: 497, SEQ ID NO: 500, SEQ ID NO: 748 e SEQ ID NO: 753.
[0125] Em outro aspecto, é fornecido um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de ligação de C5 ou um composto como descrito acima. Um vetor de expressão que compreende Tal polinucleotídeo pode possibilitar a produção de um polipeptídeo de ligação de C5 ou um composto de ligação de C5, por exemplo, pela expressão em uma célula hospedeira.
[0126] Deve ser entendido que o polipeptídeo de ligação de C5 de acordo com a presente invenção pode ser útil como um agente terapêutico ou de diagnóstico por si só ou como um meio para alvejar outros agentes terapêuticos ou de diagnóstico, com, por exemplo, efeitos diretos ou indiretos sobre a proteína de complemento C5. Um efeito terapêutico direto, por exemplo, pode ser realizado pela inibição da clivagem de C5. Em uma forma de realização, é assim fornecida uma combinação de um polipeptídeo de ligação de C5 ou um composto de ligação de C5 de acordo com a invenção com um agente terapêutico. Os exemplos não limitantes de agentes terapêuticos que podem mostrar serem úteis em tal combinação são os agentes imunoestimulantes e radionuclídeos.
[0127] Assim, o polipeptídeo de ligação de C5 como tal, ou como compreendido em um composto de ligação de C5 ou uma combinação de acordo com a invenção, é em uma forma de realização fornecido para o uso em terapia, por exemplo, para o tratamento de uma condição relacionada com C5, tal como uma condição relacionada com C5 em um mamífero, tal como um indivíduo humano. Em uma forma de realização, a dita condição relacionada com C5 é selecionada de doença inflamatória, tal como artrite induzida por antígeno, septicemia, inflamação sinovial, vasculite e asma; doença autoimune, tal como Lupo eritematoso sistêmico (SLE), doença da aglutinina fria, artrite reumatóide, esclerose múltipla (MS), síndrome de Sjogren, dermatomiosite, miastenia grave e outras doenças induzidas por autoanticorpo tal como a síndrome de Guillain-Barré (GBS), síndrome de Fisher, esclerose sistêmica, anti-membrana de base glomerular (anti-GBM) e síndrome anti-fosfolipídeo (APS); doença infecciosa, tal como síndrome hemolítica-urêmica (HUS), infecções virais, infecções bacterianas e infecções fúngicas; doença cardiovascular, tal como infartação do miocárdio (aguda) (que passa pela revascularização pela fibrinólise ou intervenção coronária percutânea (PCI)); distúrbios neurodegenerativos tais como doença de Alzheimer (AD), doença de Huntington, doença de Creutzfeld-Jacob e doença de Parkinson; cânceres; ferimentos; lesão de enxerto, tal como lesão de reperfusão na isquemia (IRI) e rejeição mediada por anticorpo aguda (AMR); doença ocular, tal como degeneração macular relacionada com a idade (AMD), uveíte, doenças e distúrbios oculares diabéticos, e retinopatia de prematuridade; doença renal, tal como glomerulonefrite membranosa, nefrite membranosa, nefropatia de imunoglobulina A, nefrite de Lupo, síndrome de Goodpasture e glomerulonefrite pós- estreptocócica; doenças pulmonares, tais como síndrome da angústia respiratória do adulto, doença pulmonar obstrutiva crônica e fibrose cística; doenças hematológicas; tais como anemia hemolítica, hemoglobinuria fria paroxismal, síndrome urêmica hemolítica atípica (aHUS) e hemoglobinuria noturna paroxismal (PNH); doenças alérgica, tal como choque anafilático, alergia e asma; e doenças dermatológicas, tais como pênfigo, penfigóide bolhoso, reações fototóxicas e psoríase. Em uma forma de realização mais particular, o polipeptídeo de ligação de C5, composto ou combinação de acordo com a invenção são usados para o tratamento da hemoglobinuria noturna paroxismal (PNH).
[0128] Como mencionado quando do debate do transplante de órgão na seção relativa acima, diferenças entre doador e receptor (por exemplo, classes ABO e MCH) assim como a condição do órgão transplantado pode levar ao funcionamento retardado ou mesmo à rejeição do órgão transplantado. O tratamento pode assim ser necessário para eliminar anticorpos anti-doador a despeito de uma compatibilidade de doador-receptor positiva ou para eliminar anticorpos ABO quando o transplante ocorre contra a barreira ABO. Tal tratamento tipicamente inclui imunoadsorção, por exemplo, pelo uso de técnicas de cromatografia de afinidade, antes assim como depois do transplante ou plasmaferese. Tais procedimentos, entretanto, correm o risco de eliminar quase todos os anticorpos presentes na circulação, incluindo assim os anticorpos terapêuticos. Os polipeptídeos de ligação de C5 ou compostos da invenção, entretanto, não são afetados por nenhum dos procedimentos de remoção de anticorpo, e assim podem ser explorados nestes tratamentos.
[0129] Em algumas condições relacionadas com C5 onde uma patologia mais local aguda em tecidos facilmente acessíveis, tais como no pulmão e na corrente sanguínea, domina ao invés das patologias sistêmicas, um medicamento com uma meia-vida muito curta seria vantajoso em relação a um com uma eliminação lenta. Assim, em tais condições relacionadas com C5, um polipeptídeo de ligação de C5 sem uma porção de prolongamento da meia-vida pode ser benéfico. Como anteriormente explicado, um polipeptídeo de ligação de C5 de acordo com a invenção, devido ao seu tamanho relativamente pequeno, exibirá um perfil farmacocinético relativamente rápido quando administrado a um mamífero tal como um ser humano. O polipeptídeo de ligação de C5 de acordo com a invenção pode ser potencialmente ativo no tratamento das condições relacionadas com C5 tais como asma (Zhang et al. Expert Rev Clin Immunol 2010, 6: 269-277), septicemia (Ward et al. The Sci World J 2010, 10: 2395-2402), e síndrome da hipersensibilidade que inclui a pseudoalergia relacionada com a ativação de C (CARPA, uma reação a certos lipossomas terapêuticos e medicamentos com base em excipiente de lipídeo que em casos raros pode levar à angústia cardiopulmonar potencialmente letal (Szebeni et al. Adv Drug Delivery Rev 2011, 63: 1020-1030). Além disso, um polipeptídeo de ligação de C5 de acordo com a invenção pode ser usado para inibição de complemento quando um receptor da transfusão de sangue recebeu sangue de um tipo incompatível (uma situação que ocorre em cerca de 1:14000 unidades de transfusão nos US que está associada com alta mortalidade, Goodnough et al. Lancet 2003, 361: 161-169).
[0130] Em um aspecto relacionado, é fornecido um método de tratamento de uma condição relacionada com C5, que compreende a administração de um polipeptídeo de ligação de C5, ou combinação como descrito acima a um indivíduo mamífero em necessidade do mesmo. Consequentemente, no método de tratamento, o indivíduo é tratado com um polipeptídeo de ligação de C5, um composto de ligação de C5 ou uma combinação de acordo com a invenção. Em uma forma de realização mais específica do dito método, a ligação do polipeptídeo de ligação de C5 ou a combinação, a um C5 expressado em uma superfície celular no indivíduo inibe a clivagem de C5. Em uma forma de realização do método de tratamento, a condição relacionada com C5 é selecionada de doença inflamatória; doença autoimune; doença infecciosa; doença cardiovascular; distúrbios neurodegenerativos; cânceres; ferimentos; lesão de enxerto; doença ocular; doença renal; doenças pulmonares; doenças hematológicas; doenças alérgicas e doenças dermatológicas. Em particular a condição relacionada com C5 pode ser como definida acima em relação ao uso terapêutico de um polipeptídeo de ligação de C5, composto ou combinação de acordo com a invenção. A condição relacionada com C5, por exemplo, pode ser hemoglobinuria noturna paroxismal (PNH). Em uma forma de realização do método de tratamento, o dito polipeptídeo de ligação de C5 é administrado intravenosa, subcutaneamente, por inalação, nasal, oral, intravitreal, ou topicamente.
[0131] A invenção será agora ilustrada ainda pelos exemplos não limitantes que seguem.
Descrição Resumida das Figuras
[0132] A Figura 1 é uma lista das sequências de aminoácido dos exemplos de motivos de ligação de C5 compreendidos nos polipeptídeos de ligação de C5 da invenção (SEQ ID NO: 1 a 248), exemplos de polipeptídeos de ligação de C5 de 49- mer de acordo com a invenção (SEQ ID NO: 249 a 496), exemplos de polipeptídeos de ligação de C5 de 58-mer de acordo com a invenção (SEQ ID NO: 497 a 744) e exemplos de polipeptídeos de ligação de C5 de 60-mer de acordo com a invenção (SEQ ID NO: 745 a 757), assim como as sequências da proteína Z (SEQ ID NO: 758), um domínio de ligação de albumina (ABD094, SEQ ID NO: 759), a entrada da Swiss- Prot P01031 de C5 humano (resíduo de aminoácidos de 1 a 1676, SEQ ID NO: 760; dos quais a cadeia α corresponde aos resíduos de aminoácido de 678 a 1676 e a cadeia β corresponde aos resíduos de aminoácido de 19 a 673), a sequência da proteína de carrapato OmCI rotulada com His6 aqui usada (SEQ ID NO: 761) e C5 de cinomolgo (SEQ ID NO: 762) derivado da sequência genômica (publicada on line em www.ebi.ac.uk/ena; Ebeling et al. (2001) Genome Res. 21(10): 1746-1756) usando C5 humano como padrão. A sequência contém dois aminoácidos “X” nas posições 63 e 1346.
[0133] A Figura 2 mostra o resultado de uma análise de ligação típica realizada em um instrumento Biacore como descrito no Exemplo 2. Os sensorgramas foram obtidos pela injeção de C5 humano (hC5; curva sólida preta), C5 de cinomolgo (cC5; curva tracejada curta preta), C5 de rato (rC5; curva tracejada longa preta), domínio de MG7 humano (hMG7; curva pontilhada cinza), e imunoglobulina G humana (hIgG; curva sólida cinza), respectivamente, em uma variante Z dimérica imobilizada (Z05477, SEQ ID NO: 509).
[0134] A Figura 3 é um gráfico de coluna que mostra a resposta em ELISA contra hC5 e rC5, respectivamente, para as variantes Z maturadas selecionadas. As colunas pretas correspondem à absorbância a 450 nm obtida usando 0,05 μg/ml de hC5 (coluna esquerda em cada grupo) e à absorbância a 450 nm obtida usando 4 μg/ml de rC5 para cada variante Z (coluna direita em cada grupo), como descrito no Exemplo 4. As respostas para a variante Z Z05363 (SEQ ID NO: 510) são plotadas como um controle positivo.
[0135] A Figura 4 esquematicamente mostra construções diferentes que abrangem uma ou várias variantes Z que ligam C5 selecionadas da SEQ ID NO: 745 a 757, opcionalmente ligadas a ABD094 (SEQ ID NO: 759).
[0136] A Figura 5 mostra a análise de SDS-PAGE de variantes Z que ligam C5 purificadas (condição reduzida) visualizada pelo Instant Blue, como descrito no Exemplo 6. A) representa um exemplo de Z-Z-ABD dimérico (linha 1 onde Z é igual à SEQ ID NO: 745 e ABD é igual à SEQ ID NO: 759) comparada com proteínas de fusão Z-ABD diferentes (onde Z é igual à SEQ ID NO: 745 (linha 2), SEQ ID NO: 748 a 757 (linhas 4 a 13) fundidas a ABD094 (SEQ ID NO: 759) por um ligador GS); B) representa uma variante Z que liga C5 (SEQ ID NO: 753) em construções diferentes, e C) representa duas variantes Z que ligam C5 diferentes (SEQ ID NO: 748, linhas 2 a 3 e 6 e SEQ ID NO: 753, linhas 4 a 5 e 7), na forma monomérica (linhas 6 a 7) e na fusão com ABD094 (SEQ ID NO: 759) por intermédio de um ligador GS(G4S)2 (linhas 2 a 5).
[0137] As Figuras 6A e B são diagramas que mostram dados exemplares de caracterização de dose-resposta da potência de variantes Z que ligam C5 diferentes para inibir a ativação de complemento como observado em um ensaio hemolítico, descrito no Exemplo 6. O soro deficiente em C5 foi diluído 63 vezes e suplementado com hC5 0,1 nM. A) mostra o efeito de proteínas de fusão Z-ABD diferentes (variantes Z que correspondem à SEQ ID NO: 745, SEQ ID NO: 748 a 753 e SEQ ID NO: 756 fundido a ABD094 (SEQ ID NO: 759) por um ligador GS) para hC5, ao passo que B) mostra o efeito de construções de ligação de C5 diferentes que compreendem a mesma variante Z que liga C5 (Z06175a, SEQ ID NO: 753) como monômero ou dímero, na fusão com ABD094 (SEQ ID NO: 759), ou como fornecido com um rótulo His6 (seis resíduos de histidina), comparado com a proteína de carrapato OmCI que liga C5 (SEQ ID NO: 761).
[0138] As Figuras 7A e B são diagramas que mostram dados exemplares de ligação de equilíbrio com base na técnica ECL de deslocamento descrita no Exemplo 6. A Fig. 7A mostra ligação a C5 de variantes Z diferentes (SEQ ID NO: 745, SEQ ID NO: 748 a 757) na fusão com ABD094 (SEQ ID NO: 759) comparada com a ligação a C5 da proteína de carrapato OmCI (SEQ ID NO: 761). A Fig. 7B mostra a ligação de construções de ligação a C5 diferentes que compreendem a mesma variante Z que liga C5 (SEQ ID NO: 753) como monômero ou dímero, na fusão com ABD094 (SEQ ID NO: 759) ou como fornecido com um rótulo His6.
[0139] As Figuras 8A e 8B mostram interações entre variantes Z-ABD e albumina sérica humana (HSA) estudadas como descrito no Exemplo 7. A) Cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) onde Z-ABD (Z06175a (SEQ ID NO: 753) fundido a ABD094 (SEQ ID NO: 759) por um ligador GS) foi pré-incubado com quantidades equimolares de HSA (1). Como uma comparação, os cromatogramas para HSA sozinho (2) e Z-ABD sozinho (3) também são mostrados no gráfico. B) Sensorgramas Biacore de Z-ABD e Z-ABD-Z (Z06175a (SEQ ID NO: 753) fundido a ABD094 (SEQ ID NO: 759) pelos ligadores especificados na Figura 4, na construção 2 e construção 5, respectivamente) injetado em uma superfície revestida com HSA. Cada uma das duas construções foi injetada em uma concentração de 25, 100 e 400 nM.
[0140] A Figura 9 é um diagrama que mostram os perfis farmacocinéticos para os compostos de ligação de C5 Z-ABD e Z-ABD-Z (Z06175a, SEQ ID NO: 753) fundidos a ABD094 (SEQ ID NO: 759) pelos ligadores especificados na Figura 4, na construção 2 e construção 5, respectivamente) nos ratos Sprague Dawley machos com o tempo depois da administração intravenosa (i.v., 0,25 μ mol/kg) e subcutânea (s.c., 0,5 μ mol/kg), como descrito no Exemplo 8. Cada ponto de dados representa uma média de três animais individuais em um ponto de tempo específico que varia de cinco minutos a duas semanas depois da dosagem para os animais dosados i.v e de 15 minutos a duas semanas para os animais dosados s.c.
[0141] A Figura 10 mostra a hemólise ex vivo nos eritrócitos de ovelha depois da exposição ao soro diluído 1:5 de amostras de animal tiradas de ratos Sprague Dawley depois da administração intravenosa (i.v.; 0,25 μmol/kg) de Z-ABD (Z06175a (SEQ ID NO: 753) fundido a ABD094 (SEQ ID NO: 759) por um ligador GS), como descrito no Exemplo 8. Cada ponto representa um animal individual em um ponto de tempo específico que varia de cinco minutos a duas semanas depois da dosagem.
[0142] A Figura 11 mostra hemólise ex vivo em eritrócitos de ovelha depois da exposição ao soro diluído 1:5 de amostras de animal tiradas de ratos Sprague Dawley depois da administração subcutânea (s.c.; 0,5 μmol/kg) de Z-ABD (Z06175a (SEQ ID NO: 753) fundidos a ABD094 (SEQ ID NO: 759) por um ligador GS), como descrito no Exemplo 8. Cada ponto representa um animal individual em um ponto de tempo específico que varia de 15 minutos a duas semanas.
[0143] A Figura 12 mostra a hemólise versus concentração sérica de Z-ABD (Z06175a (SEQ ID NO: 753) fundido a ABD094 (SEQ ID NO: 759) por um ligador GS) a seguir da administração i.v. e s.c. aos ratos Sprague Dawley machos, como descrito no Exemplo 8.
[0144] A Figura 13 mostra a hemólise em eritrócitos de ovelha versus a concentração sérica de Z-ABD-Z (Z06175a (SEQ ID NO: 753) fundidos a ABD094 (SEQ ID NO: 759) pelos ligadores especificados na Figura 4, construção 5) a seguir da administração i.v. e s.c. aos ratos Sprague Dawley machos, como descrito no Exemplo 8.
[0145] A Figura 14 mostra a exposição sérica de Z-ABD (Z06175a (SEQ ID NO: 753) fundidos a ABD094 (SEQ ID NO: 759) por um ligador GS) a seguir da administração i.v. (415 nmol/kg) e s.c. (1250 nmol/kg) em macacos Cynomolgus machos, como descrito no Exemplo 9. Cada ponto de dado representa a média de três animais individuais.
[0146] A Figura 15 é um diagrama que mostra o efeito (concentração de C5a na lavagem) da molécula pró-inflamatória zymosan (40 mg/kg i.p.) sozinha e em combinação com uma molécula de fusão Z-ABD que liga C5 (Z06175a (SEQ ID NO: 753) fundidos a ABD094 (SEQ ID NO: 759) por um ligador GS)) ou OmCI (SEQ ID NO: 761) analisado como descrito no Exemplo 10. Z-ABD foi administrado a 20 nmol/kg (LD), 100 nmol/kg (MD) e 500 nmol/kg (HD) s.c. 18 h antes da indução com zymosan. OmCI (30 nmol/kg) foi administrado i.p. 1 h antes do tratamento com zymosan e as amostras foram tiradas 1 h depois da indução com zymosan.
[0147] As Figuras 16A e 16B mostram o perfil farmacocinético de Z-ABD (Z06175a (SEQ ID NO: 753) fundido a ABD094 (SEQ ID NO: 759) por um ligador GS) a seguir da administração intratraqueal de 500 nmol/kg em camundongos C57bl fêmeas, como descrito no Exemplo 11. A) concentração sérica em cada animal (n = 3 para cada ponto no tempo, 27 animais no total) e B) hemólise em eritrócitos de ovelha expostos a estas amostras de soro diluídas 1:5.
Exemplos
[0148] Os materiais que seguem foram usados por todo este trabalho exceto onde de outro modo mencionado. • Escherichia coli cepa RR1ΔM15 (Rüther, Nucleic Acids Res 10: 57655772, 1982). • Escherichia coli cepa XL1-Blue (Agilent Technologies, cat. no. 200268). • Proteína de complemento humana C5 (hC5). A pró-proteína de 1676 aminoácidos completa tem número de acesso ao GenBank: NP_001726 (SEQ ID NO: 760) em que os aminoácidos de 19 a 673 é a cadeia beta e os aminoácidos de 678 a 1676 é a cadeia alfa. A C5 humana aqui usada foi adquirida da Quidel (cat. no. A403) • Proteína de complemento C5 de Cinomolgo (cC5; SEQ ID NO: 762). A sequência de cC5 foi derivada da sequência genômica de Cynomolgus (Macaca fascicularis) (www.ebi.ac.uk/ena; Ebeling et al. (2001) Genome Res. 21(10): 1746-1756). A região codificadora de C5 humana foi recuperada da www.ensembl.org, e o gene C5 foi localizado no cromossoma 15. A região que contém o gene é de aproximadamente 110.000 bases de comprimento e está contida nos contigs CAEC01154150 a CAEC01154178. Os contigs foram manualmente unidos a um arquivo único e usado como um contexto genômico para o software sim4 para alinhar a região codificadora da C5 humana com o material genômico de Cinomolgo bruto. A C5 de Cinomolgo aqui usada foi purificada “em casa” a partir do soro usando um procedimento de três etapas; precipitação com PEG6000, troca de íon e cromatografia de afinidade de OmCI. • Proteína de complemento C5 de rato (rC5; número de acesso no GenBank: XP_001079130) a C5 de rato aqui usada foi purificada “em casa” a partir de soro usando um procedimento de três etapas; precipitação com PEG6000, troca de íon e cromatografia de afinidade de OmCI. • Domínio de MG7 humana (hMG7) da proteína de complemento C5, que corresponde aos resíduos de aminoácido 822 a 931 da C5 humana (SEQ ID NO: 760; Fredslund et al. (2008) Nature Immunology 9: 753760) produzida “em casa” em células Freestile HEK293. • Proteína de ligação de hMG7. • OmCI (AF2999, Nunn, M. A. et al. supra) de OmCI do carrapato mole Ornithodoros moubata com um rótulo His6 no terminal C (SEQ ID NO: 761) foi produzida “em casa” na cepa da E. coli Origami(DE3) e purificada em uma coluna HisTrap1.
Exemplo 1: Seleção e triagem de polipeptídeos de ligação da proteína de complemento C5 Materiais e métodos
[0149] Biotinilação da proteína alvo hC5: hC5 foi biotinilada de acordo com as recomendações do fabricante na temperatura ambiente (RT) por 40 min usando NoWeigh EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce, cat. no. 21327) em um excesso molar de dez vezes (10x). A Troca de tampão subsequente para PBS (10 mM de fosfato, 137 mM de NaCl, 2,68 mM de KCl, pH 7,4) foi realizada usando Colunas Giratórias de Dessalinização de Proteína (Pierce, cat. no. 89849) de acordo com as instruções do fabricante.
[0150] Seleção de demonstração de fago de polipeptídeos que ligam C5: Bibliotecas de variantes aleatórias de proteína Z demonstradas no bacteriofago, construídas em fagomídeo pAffi1/pAY00065/ pAY02947/pAY02592 essencialmente como descrito em Gronwall et al. J Biotechnol 2007, 128: 162-183), foram usadas para selecionar polipeptídeos de ligação de C5. Três vetores de biblioteca diferentes foram usados. Dois destes utilizam um domínio de ligação de albumina (ABD, GA3 da proteína G da cepa de Streptococcus G148) como parceiro de fusão para as variantes Z gerando as bibliotecas Zlib003Naive.I e Zlib006Naive.II. A terceira biblioteca, Zlib004Naive.I utiliza a molécula de ligação Z03639 da Taq DNA polimerase (designado ZTaqS1-1 em Gunneriusson et al. Protein Eng 1999, 12: 873-878) como parceiro de fusão. As bibliotecas tiveram os tamanhos reais que seguem: 3 x 109 (Zlib003Naive.I); 1,5 x 1010 (Zlib006Naive.II ); e 1,4 x 1010 (Zlib004Naive.I), o número referindo-se à quantidade de variantes.
[0151] Os estoques de fago foram preparados em frascos agitados (Zlib003Naive.I) como descrito em Gronwall et al. supra ou em um fermentador de 20 l (Zlib006Naive.II e Zlib004Naive.I). As células de um estoque de glicerol que contém a biblioteca de fagomídeo Zlib004Naive.I foram inoculadas em 20 l de TSB-YE (Caldo de Soja Tríptico-Extrato de Levedura; 30 g/l de TSB, 5 g/l de Extrato de Levedura) suplementado com 2 % de glicose e 100 μg/ml de ampicilina. As células de um estoque de glicerol que contém a biblioteca de fagomídeo Zlib006Naive.II foram inoculadas em 20 l de um meio isento de prolina definido [hidrogeno fosfato de dipotássio 7 g/l, citrato de trissódio diidratado 1 g/l, uracila 0,02 g/l, YNB (Difco® Base Nitrogenada de Levedura sem aminoácidos, Becton Dickinson) 6,7 g/l, glicose monoidratado 5,5 g/l, L-alanina 0,3 g/l, monocloridreto de L-arginina 0,24 g/l, L- asparagina monoidratada 0,11 g/l, L-cisteína 0,1 g/l, Ácido L-glutâmico 0,3 g/l, L- glutamina 0,1 g/l, glicina 0,2 g/l, L-histidina 0,05 g/l, L-isoleucina 0,1 g/l, L-leucina 0,1 g/l, monocloridreto de L-lisina 0,25 g/l, L-metionina 0,1 g/l, L-fenilalanina 0,2 g/l, L-serina 0,3 g/l, L-treonina 0,2 g/l, L-triptofano 0,1 g/l, L-tirosina 0,05 g/l, L-valina 0,1 g/l] suplementado com 100 μg/ml de ampicilina. Os cultivos foram desenvolvidos a 37 °C em um fermentador (Belach Bioteknik, BR20). Quando as células atingiram uma densidade óptica (OD) de 0,7 a 0,8, aproximadamente 2,6 l do cultivo foi infectado usando um excesso molar de 10x de fago auxiliar M13K07 (New England Biolabs #N0315S). As células foram incubadas por 30 minutos, em consequência do que o fermentador foi enchido até 20 l com TSB-YE suplementado com 100 μM de IPTG (isopropil-β-D-1-tiogalactopiranosideo, para a indução da expressão), 25 μg/ml de canamicina e 12,5 μg/ml de carbenicilina e cultivadas a 30 °C por 22 h. As células no cultivo foram peletizadas pela centrifugação a 15.900 g e as partículas de fago que permaneceram no meio foram depois disso precipitadas duas vezes em PEG/NaCl (polietileno glicol/cloreto de sódio), filtrada e dissolvida em PBS e glicerol como descrito em Gronwall et al. supra. Os estoques de fago foram armazenados a -80 °C antes do uso.
[0152] As seleções foram realizadas em quatro ciclos contra hC5 biotinilada. A preparação do estoque de fago, procedimento de seleção e amplificação de fago entre ciclos de seleção foram realizados essencialmente como descrito na WO 2009/077175. PBS suplementado com 3 % de albumina sérica bovina (BSA) e 0,1 % de Tween20 foi usado como tampão de seleção e os complexos de fago alvejados foram diretamente capturados pela Estreptavidina Dynabeads® M-280 (Dynal, cat. no. 112,06). 1 mg de pérolas por 10 μg de proteína de complemento C5 foi usado. A cepa RR1ΔM15 da E. coli foi usada para amplificação de fago. No ciclo 1 das seleções, 100 nM de hC5 foram usados e duas lavagens com PBST 0,1 % (PBS suplementado com 0,1 % de Tween-20) foram realizadas. Uma severidade aumentada, usando uma concentração alvo reduzida e um número aumentado de lavagens, foram aplicadas nos três ciclos subsequentes. Nos ciclos 2, 3 e 4; 50 ou 33 nM de hC5, 25 ou 11 nM de hC5 e 12,5 ou 3,7 nM de hC5 foram usados. No ciclo 2, 3 e 4; 4, 6 e 8 lavagens foram realizadas, usando PBST 0,1 % em todos os ciclos ou PBST 0,2 %, 0,3 % e 0,4 % nos ciclos 2, 3 e 4.
[0153] Triagem pelo ELISA de variantes Z: Para testar se as moléculas da variante Z selecionadas de fato interagiriam com a proteína de complemento humana C5, os ensaios de ELISA foram realizados. As variantes Z foram produzidas pela inoculação de colônias únicas das seleções em 1 ml de meio de TSB-YE suplementado com 100 μg/ml de ampicilina e 0,1 mM de IPTG em placas de reservatório profundo (Nunc, cat. no. 278752). As placas foram incubadas por 18 a 24 h a 37 °C. As células foram peletizadas pela centrifugação, recolocadas em suspensão em 300 μl de PBST 0,05 % e congeladas a -80 °C para liberar a fração periplásmica das células. As amostras congeladas foram descongeladas em um banho de água e as células foram peletizadas pela centrifugação. O sobrenadante periplásmico conteve as variantes Z como fusões a um domínio de ligação de albumina (GA3 da proteína G da cepa de Streptococcus G148), expressadas como AQHDEALE-[Z#####]-VDYV-[ABD]-YVPG (Gronwall et al, supra), ou à molécula de ligação da Taq DNA polimerase Z03639, expressada como AQHDEALE-[Z#####]-VDYV-[Z03639]-YVPG. Z##### refere-se às variantes Z individuais de 58 resíduos de aminoácido.
[0154] Placas de ELISA de 96 reservatórios de meia-área (Costar, cat. no. 3690) foram revestidas com 50 μl/reservat0rio de tampão de revestimento (50 mM de carbonato de sódio, pH 9,6) que contém 4 μg/ml de um anticorpo específico para as variantes Z (Affibody, cat. no. 20,1000,01,0005) e incubadas durante a noite a 4 °C. A solução de anticorpo foi vertida fora e os reservatórios foram bloqueados com 100 μl de PBSC (PBS suplementado com 0,5 % de caseína (Sigma, cat. no. C8654) por 1 a 2 h na temperatura ambiente. A solução de bloqueio foi descartada e 50 μl de solução periplásmica foram adicionados aos reservatórios e incubados por 1 h na temperatura ambiente sob agitação lenta. Os sobrenadantes foram vertidos fora e os reservatórios foram lavados 4 vezes com PBST 0,05 %. Depois 50 μl de proteína de complemento hC5 biotinilada, em uma concentração de 5 μg/ml em PBSC, foram adicionado a cada reservatório. As placas foram incubadas por 1,5 h na temperatura ambiente seguido pelas lavagens como descrito acima. Estreptavidina-HRP (Peroxidase de rábano; Dako, cat. no. P0397) foi diluída 1:10.000 em PBSC, adicionada aos reservatórios que foram depois incubados por 45 min. Depois de lavar como descrito acima, 50 μl de substrato ImmunoPure TMB (Thermo Scientific, cat. no. 34021) foram adicionados aos reservatórios e as placas foram tratadas de acordo com as recomendações do fabricante. A absorbância dos reservatórios foi medida a 450 nm usando uma leitora de placa de reservatórios múltiplos, Victor3 (Perkin Elmer).
[0155] Como controle positivo, uma fração periplásmica que também contém a molécula de ligação de PSMA Z03938 expressada como aqhdeale-[Z03938]-vdyv- [Z03639]-yvpg foi ensaiada contra 5 μg/ml de proteína de PSMA biotinilada. Como controle negativo; a mesma preparação periplásmica foi ensaiada contra a proteína de complemento hC5. O sequenciamento foi realizado para os clones com valores de absorbância positiva contra hC5.
[0156] O sequenciamento: Os fragmentos de PCR foram amplificados a partir de colônias únicas usando um programa de PCR padrão e os iniciadores AFFI-21 (5’- tgcttccggctcgtatgttgtgtg) e AFFI-22 (5’-cggaaccagagccaccaccgg). O sequenciamento de fragmentos amplificados foi realizado usando o oligonucleotídeo biotinilado AFFI- 72 (5’-biotina-cggaaccagagccaccaccgg) e um Kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems), usado de acordo com o protocolo do fabricante. As reações de sequenciamento foram purificadas pela ligação às pérolas magnéticas revestidas com estreptavidina (Detach Streptavidin Beads, Nordiag, cat. no. 2012-01) usando um Magnatrix 8000 (Biossolução Magnética), e analisado no Analisador Genético ABI PRISM® 3100 (PE Applied Biosystems).
[0157] ELISA de Bloqueio: Os clones descobertos positivos para hC5 na triagem por ELISA foram submetidos a um ensaio de bloqueio de ELISA de modo a elucidar se a sua ligação alvo foi afetada pela presença das proteínas de ligação de hC5, as proteínas de ligação OmCI e/ou hMG7. O ELISA de bloqueio foi conduzido usando variantes Z expressadas em frações periplásmicas como descrito na seção para a triagem de ELISA acima, mas ajustando para culturas de 5 ml em tubos de fundo redondo de 12 ml e usando 2 ml de PBST 0,05 % para pelotizar a dissolução. O ensaio de bloqueio de ELISA foi conduzido como o ensaio de triagem de ELISA, com uma modificação de protocolo introduzida na etapa alvo; as proteínas de ligação OmCI ou hMG7 foram misturadas com a proteína alvo antes da adição à placa de ensaio. 5 μg/ml de hC5 biotinilada foi misturada com excesso molar de 5 vezes ou 20 vezes das proteínas de ligação OmCI ou hMG7, respectivamente, depois incubadas 1 h na temperatura ambiente para permitir a formação de complexo antes da adição à placa. For cada clone, uma resposta/sinal de referência (1), uma de controle negativo (2) e uma de fundo (3), respectivamente, foram obtidas como segue: na etapa alvo, apenas hC5 foi adicionada às variantes Z (como no ELISA de triagem) (1); a proteína PSMA irrelevante (produzida “em casa”) foi adicionado à proteína de complemento hC5, ao invés das proteínas de ligação OmCI ou hMG7 (2); apenas tampão foi adicionado às variantes Z (3).
Resultados
[0158] Seleção de demonstração de fago de polipeptídeos de ligação da proteína de complemento C5: Clones individuais foram obtidos depois de dois a quatro ciclos das seleções de demonstração de fago contra hC5 biotinilada.
[0159] Triagem de ELISA de variantes Z: Os clones obtidos depois de quatro ciclos de seleção foram produzidos em placas de 96 reservatórios e triados quanto à atividade de ligação da proteína de complemento C5 no ELISA. No total, quase 400 clones foram triados. As medições de absorbância mostraram muitos clones de claramente positivos em hC5. O resultado de uma seleção de clones é demonstrada na Tabela 1; a variante Z05363 (SEQ ID NO: 510) é rotulada com ABD, ao passo que as outras variantes Z listadas são rotuladas com a molécula de ligação Taq Z03639 como descrito na seção de métodos. A molécula específica de PSMA Z03938 usada como um controle negativo deu um sinal positivo para PSMA, ao passo que nenhum sinal foi obtido contra hC5.
[0160] ELISA de bloqueio: Clones positivos para hC5 foram submetidos a um ensaio de bloqueio usando as proteínas de ligação de hC5, as proteína de ligação OmCI e hMG7. Para cinco clones, o sinal de ligação à proteína de complemento C5 foi completamente extinguido pela presença de OmCI, que atinge o mesmo nível como o fundo (Tabela 1). Um destes clones, a saber a variante Z05363 (SEQ ID NO: 510), também foi testado quanto a sua capacidade para ligar hC5 na presença da proteína de ligação hMG7. A proteína de ligação hMG7 não inibiu a ligação de Z05363 à hC5. Tabela 1. Resposta no ELISA ao alvo, com ou sem molécula de bloqueio para várias variantes Z.
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[0161] O sequenciamento: O sequenciamento foi realizado para os clones com valores de absorbância positiva contra proteína de complemento C5 na triagem pelo ELISA. A cada variante foi dado um único número de identificação #####, e as variantes individuais são aludidas como Z#####. As sequências de aminoácido das variantes Z de 58 resíduos de aminoácido de comprimento são listados na Figura 1 e na listagem de sequência como SEQ ID NO: 509 a 513. Os motivos de ligação da proteína de complemento C5 deduzida destas variantes Z são listadas na Figura 1 e na listagem de sequência como SEQ ID NO: 13 a 17. As sequências de aminoácido dos polipeptídeos de 49 resíduos de aminoácido de comprimento prognosticadas constituir o feixe de três hélices completo dentro de cada uma destas variantes Z são listadas na Figura 1 e na listagem de sequência como SEQ ID NO: 261 a 265.
Exemplo 2: Produção e caracterização de variantes Z Materiais e métodos Subclonagem de variantes Z, expressão e purificação de proteína:
[0162] Cinco variantes Z que ligam a proteína de complemento C5 (Z05363 (SEQ ID NO: 510); Z05477 (SEQ ID NO: 509); Z05483 (SEQ ID NO: 511); Z05538 (SEQ ID NO: 512) e Z05692 (SEQ ID NO: 513)) foram amplificadas a partir de vetores da biblioteca pAffi1/pAY00065/ pAY02947. Uma estratégia de subclonagem para a construção de moléculas de Affibody diméricas com rótulos His6 de terminal N foi aplicada usando técnicas da biologia molecular padrão e como descrito em detalhe na WO 2009/077175. Os fragmentos de gene Z foram subclonados no vetor de expressão pAY01448 que resulta na sequência codificada MGSSHHHHHHLQ- [Z#####][Z#####]-VD.
[0163] As variantes Z subclonadas foram transformadas na E. coli BL21(DE3) e expressada no sistema de multifermentador Greta (Belach Bioteknik). Em resumo, as culturas foram cultivadas a 37 °C em 800 ml de meio TSB-YE que contém 50 μg/ml de canamicina. Em uma DO600 de ~1, as culturas foram induzidas através da adição automática de IPTG a uma concentração final de 0,05 mM. As culturas foram esfriadas até aproximadamente 10 °C depois de 5 h de indução, e colhida pela centrifugação (20 min, 15.900 g). Os sobrenadantes foram descartados e as pelotas de célula foram coletadas e armazenadas a -20 °C até outro uso. Os níveis de expressão e o grau de solubilidade foram estimados pela análise de SDS-PAGE nos géis de NuPAGE® de 4 a 12 % (Invitrogen) usando tingimento com Azul de Coomassie.
[0164] Para as variantes Z expressadas principalmente como proteína solúvel, as pelotas de célula foram recolocadas em suspensão em tampão de ligação (20 mM de fosfato de sódio, 0,5 M de NaCl, 20 mM de imidazol, pH 7,4) com uma adição de 1000 U de Benzonase® (Merck, cat. no. 1,01654,001) e rompidos pela ultrassonificação. Para cada uma das variantes Z, a suspensão sonificada foi clarificada pela centrifugação (40 min, 25.000 g, 4 °C) e o sobrenadante foi carregado em uma coluna His GraviTrap® de 1 ml (GE Healthcare). A coluna foi lavada com tampão de lavagem (20 mM de fosfato de sódio, 0,5 M de NaCl, 60 mM de imidazol, pH 7,4), antes de eluir as variantes Z com 3 ml de tampão de elução (20 mM de fosfato de sódio, 0,5 M de NaCl, 0,5 M de imidazol, pH 7,4). As variantes Z que expressaram principalmente como proteína insolúvel foram purificadas do mesmo modo, mas 8 M de uréia foi incluída na ligação e tampão de lavagem. Se requerido, as variantes Z foram purificadas ainda pela cromatografia de fase reversa (RPC) em colunas Resource® de 1 ml (GE Healthcare) usando água incluindo 0,1 % de TFA (ácido trifluoroacético) como fase móvel e elução com um gradiente apropriado (tipicamente de 0 a 50 % em 20 volumes de coluna) de acetonitrila que inclui 0,1 % de TFA.
[0165] O tampão foi trocado para PBS usando colunas PD-10 (GE Healthcare).
[0166] Caracterização de proteína: A concentração das variantes Z purificadas foi determinada pelas medições de absorbância a 280 nm usando coeficientes de extinção teórica. A pureza foi estimada pela análise de SDS-PAGE nos géis de NuPAGE® de 4 a 12 % (Invitrogen) usando tingimento com Azul de Coomassie. Para verificar a identidade e para determinar os pesos moleculares de variantes Z purificadas, as análises de LC/MS foram realizadas em um sistema Agilent 1100 LC/MSD (Agilent Technologies).
[0167] Análise de CD: As variantes Z purificadas foram diluídas para 0,5 mg/ml em PBS. Para cada variante Z diluída, um espectro de CD foi registrado entre 250 e 195 nm em uma temperatura de 20 °C. Além disso, uma medição de temperatura variável (VTM) foi realizada para determinar a temperatura de fusão (Tm). Na VTM, a absorbância foi medida a 221 nm enquanto a temperatura foi elevada de 20 para 90 °C, com uma rampa de temperatura de 5 °C/min. A capacidade da variante Z para redobrar foi avaliada pela coleta de um espectro de CD adicional de 250 a 195 nm depois de esfriar até 20 °C. As medições de CD foram realizadas em um espectropolarímetro Jasco J-810 (Jasco Scandinavia AB) usando uma célula com um comprimento de percurso óptico de 1 mm.
[0168] Análise de ligação Biacore: As interações das cinco variantes Z que ligam hC5 diméricas rotuladas com His6 subclonadas com hC5, cC5, rC5, hMG7 e hIgG (Sigma, cat. no. G4386) foram analisadas em um instrumento Biacore (GE Healthcare). As variantes Z foram imobilizadas em células de fluxo diferentes na camada de dextrano carboxilado de várias superfícies de chip CM5 (GE Healthcare). A imobilização foi realizada usando a química da ligação de amina de acordo com o protocolo do fabricante. Uma superfície de célula de fluxo em cada chip foi ativada e desativada para o uso como branco durante injeções de análito. Os análitos, diluídos em tampão contínuo HBS-EP (GE Healthcare) até uma concentração final de 100 nM, foram injetados a uma taxa de fluxo de 10 μl/min por 1 min. Depois de 2 min de dissociação, as superfícies foram regeneradas com uma injeção de 10 mM de HCl. Os resultados foram analisados no software BiaEvaluation (GE Healthcare). As curvas da superfície em branco foram subtraídas das curvas das superfícies de ligando.
Resultados
[0169] Subclonagem de variantes Z: Cinco clones únicos selecionados (Z05477 (SEQ ID NO: 509), Z05363 (SEQ ID NO: 510), Z05483 (SEQ ID NO: 511), Z05538 (SEQ ID NO: 512) e Z05692 (SEQ ID NO: 513)) foram escolhidos para a subclonagem como dímeros no vetor de expressão pAY01448 e foram subsequentemente verificados pelo sequenciamento.
[0170] Produção de proteína: As variantes Z diméricas rotuladas com histidina produziram níveis de expressão aceitáveis de produto de gene solúvel. A pureza dos lotes produzidos foi estimada exceder os 90 % como avaliado pela análise de SDS- PAGE. A análise de LC/MS verificou o peso molecular correto para todas as moléculas de variante Z.
[0171] Análise de CD: As temperaturas de fusão (Tm) das diferentes variantes Z foram calculadas pela determinação do ponto intermediário da transição no sinal CD vs. a plotagem da temperatura. Os resultados para várias variantes Z reversivelmente dobradas estão resumidas na Tabela 2 abaixo. Tabela 2. Temperaturas de fusão para várias variantes Z.
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[0172] Análise de ligação de Biacore: A ligação das cinco variantes Z diméricas subclonadas às diferentes espécies de C5 e MG7, um subdomínio de hC5, assim como o fundo que se liga ao IgG foi testada em um instrumento Biacore pela injeção das proteínas diferentes sobre as superfícies que contém as variantes Z. Os níveis de imobilização de ligando para as diferentes variantes Z sobre as superfícies foram: Z05363:2080 RU, Z05477:2180 RU, Z05483:2010 RU, Z05538:2570 RU e Z05692:3270 RU. As diferentes variantes Z foram testadas quanto à ligação aos conjuntos diferentes de proteínas injetados nas concentrações de 100 nM, ver a Tabela 3. O resultado para as variantes Z testadas é demonstrado na tabela como um resultado +/- para cada proteína. Como um exemplo da análise de ligação de Biacore, a Figura 2 mostra os sensorgramas obtidos da Z05477 dimérica imobilizada ensaiada contra hC5, cC5, rC5, hMG7 e hIgG. Tabela 3. Resposta Biacore de variantes Z diferentes contra C5 a partir de várias espécies e proteínas de fundo selecionado relevante.
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Exemplo 3: Planejamento e construção de uma biblioteca maturada de variantes Z que ligam a proteína de complemento C5
[0173] Neste Exemplo, uma biblioteca maturada foi construída. A biblioteca foi usada para seleções de polipeptídeos que ligam hC5. As seleções das bibliotecas maturadas são usualmente esperadas resultar em aglutinantes com afinidade aumentada (Orlova et al. Cancer Res 2006, 66(8): 4339-48). Neste estudo, ligadores de filamento duplo randomizados foram gerados pela tecnologia Slonomics® que possibilita a incorporação de conjuntos randomizados de blocos de construção de trinucleotídeo usando ligações e restrições do DNA de filamento duplo subsequentemente formado.
Materiais e métodos
[0174] Planejamento a biblioteca: A biblioteca foi fundamentada em uma seleção de sequências das variantes Z que ligam hC5 descritas nos Exemplos 1 e 2. Na nova biblioteca, 13 posições variáveis na armação da molécula Z foram induzidas para certos resíduos de aminoácido, de acordo com uma estratégia com base nas sequências da variante Z definidas na SEQ ID NO: 509 a 513 (Z05477, Z05363, Z05483, Z05538, Z05692). Uma biblioteca SlonoMax® de DNA de filamento duplo, que contém os 147 pares de base das hélices 1 e 2 parcialmente randomizada da sequência de aminoácido 5’-AA ATA AAT CTC GAG GTA GAT GCC AAA TAC GCC AAA GAA/GAG NNN NNN NNN GCA/GCC NNN NNN GAG/GAA ATC/ATT NNN NNN TTA/CTG CCT AAC TTA ACC/ACT NNN NNN CAA/CAG TGG NNN GCC/GCG TTC ATC/ATT NNN AAA/AAG TTA/CTG NNN GAT/GAC GAC CCA AGC CAG AGC TCA TTA TTT A-3’ (os códons randomizados são ilustrados como NNN) flanqueados com os sítios de restrição XhoI e SacI, foi encomendada da Sloning BioTechnology GmbH (Pucheim, Alemanha). As distribuições teóricas de resíduos de aminoácido na nova biblioteca finalmente incluindo 12 posições da variável Z são dadas na Tabela 4. Tabela 4: Planejamento de Biblioteca.
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[0175] Construção da Biblioteca: A biblioteca foi amplificada usando AmpliTaq Gold polimerase (Applied Biosystems, cat. no. 4311816) durante 12 ciclos de PCR e os produtos reunidos foram purificados com o Kit de Purificação pela PCR QIAquick (QIAGEN, cat. no. 28106) de acordo com as recomendações do fornecedor. O agrupamento purificado de fragmentos da biblioteca randomizados foi digerido com as enzimas de restrição XhoI e SacI (New England Biolabs, cat. no. R01460L, e cat. no. R0156L) e purificado uma vez mais com o Kit de Purificação pela PCR. Subsequentemente, o produto foi purificado usando a eletroforese em gel preparativo em um gel de agarose a 1 %.
[0176] O vetor de fagomídeo pAY02592 (essencialmente como pAffi1 descrito em Gronwall et al. supra) foi restringido com as mesmas enzimas, purificado usando a extração com fenol/clorofórmio e a precipitação com etanol. Os fragmentos restringidos e o vetor restringido foram ligados em uma razão molar de 5:1 com T4 DNA ligase (New England Biolabs, cat. no. M0202S), por 2 horas na temperatura ambiente seguido pela incubação durante a noite a 4 °C. O DNA ligado foi recuperado pela extração de fenol/clorofórmio e precipitação com etanol, seguido pela dissolução em 10 mM de Tris-HCl, pH 8,5.
[0177] As reações de ligação (aproximadamente 250 ng de DNA/transformação) foram recuperadas-eletroporadas em células RR1ΔM15 da E. coli eletrocompetentes (100 μl). Imediatamente depois da eletroporação, aproximadamente 1 ml de meio SOC (meio TSB-YE, 1 % de glicose, 50 μM de MgCl2, 50 μM de MgSO4, 50 μM de NaCl e 12,5 μM de KCl) foi adicionado. As células transformadas foram incubadas a 37 °C por 50 min. As amostras foram tiradas para titulação e para a determinação do número de transformantes. As células foram em seguida reunidas e cultivadas durante a noite a 37 °C em 7 l de meio TSB-YE, suplementado com 2 % de glicose e 100 μg/ml de ampicilina. As células foram peletizadas por 15 min a 4.000 g, recolocadas em suspensão em uma solução de PBS/glicerol (aproximadamente 40 % de glicerol). As células foram aliquotadas e armazenadas a -80 °C. Os clones da biblioteca de variantes Z foram sequenciados de modo a verificar o teor e avaliar o resultado da biblioteca construída vis-à-vis o planejamento de biblioteca. O sequenciamento foi realizado como descrito no Exemplo 1 e a distribuição de aminoácido foi verificada.
[0178] Preparação de estoque de fago: As células do estoque de glicerol que contém a biblioteca de fagomídeo de C5 foram inoculadas em 20 l de um meio definido isento de prolina (descrito no Exemplo 1) suplementado com 100 μg/ml de ampicilina, e cultivadas a 37 °C em um fermentador (Belach Bioteknik, BR20). Todas as etapas foram realizadas como descrito no Exemplo 1 para a biblioteca Zlib006Naive.II. Depois do cultivo, as células foram peletizadas pela centrifugação a 15.900 g e as partículas de fago que permanecem no meio foram em seguida precipitadas duas vezes em PEG/NaCl, filtradas e dissolvidas em PBS e glicerol como descrito no Exemplo 1. Os estoques de fago foram armazenados a -80 °C até o uso em seleção.
Resultados
[0179] Construção da Biblioteca: A nova biblioteca foi planejada com base em um conjunto de variantes Z que ligam C5 bloqueadas com OmCI com as propriedades de ligação verificadas (Exemplos 1 e 2). O tamanho teórico da biblioteca planejada foi de 6,7 x 109 variantes Z. O tamanho real da biblioteca, determinado pela titulação depois da transformação para células RR1ΔM15 da E. coli., foi de 1,4 x 109 transformantes.
[0180] A qualidade da biblioteca foi testada pelo sequenciamento de 64 transformantes e pela comparação das suas sequências reais com o planejamento teórico. Os conteúdos da biblioteca real comparada com a biblioteca planejada foram mostrados ser satisfatórios. A posição trancada na sequência de aminoácido planejada (W na posição 27) foi refletida na sequência real em que apenas o aminoácido esperado ocorreu nesta posição. Uma biblioteca maturada de polipeptídeos de ligação de hC5 foi assim construída com êxito.
Exemplo 4: Seleção, triagem e caracterização de variantes Z de uma biblioteca maturada Materiais e métodos
[0181] Seleção de demonstração de fago de polipeptídeos de ligação da proteína de complemento C5: A proteína alvo hC5 foi biotinilada como descrito no Exemplo 1. As seleções de demonstração de fago foram realizadas contra hC5 essencialmente como descrito no Exemplo 1 usando a nova biblioteca de moléculas da variante Z descrita no Exemplo 3. A E. coli XL1-Blue foi usada para a amplificação de fago. A seleção foi inicialmente realizada em duas trilhas paralelas. Em uma trilha, o tempo de seleção foi de 2 h, enquanto que na outra trilha, tempos de seleção mais curtos foram usados: 20 min no primeiro ciclo e 10 min para os ciclos 2 a 4 subsequente. Estas duas trilhas (1 e 2) foram divididas ainda no segundo ciclo, resultando no total de seis trilhas (1a-c e 2a-c, que diferem na concentração alvo e condições de lavagem). A seleção foi realizada em um total de quatro ciclos. No ciclo 1 das seleções, 25 nM de proteína de complemento C5 foram usados e cinco lavagens com PBST 0,1 % foram realizadas. Uma severidade aumentada, usando uma concentração alvo reduzida e um número aumentado de lavagens, foi aplicada nos três ciclos subsequentes. No ciclo 2, 3 e 4; 10, 5 ou 2,5 nM de proteína de complemento C5, 4, 1 ou 0,25 nM de proteína de complemento C5 e 1,6, 0,2 ou 0,05 nM de proteína de complemento C5 foram usados. No ciclo 2, 3 e 4; 10, 15 e 20 lavagens foram realizadas usando PBST 0,1 %. Além disso, a penúltima lavagem foi prolongada para 3 h com um excesso de 50x de hC5 não biotinilado na solução de lavagem para duas das trilhas (1c e 2c).
[0182] O sequenciamento de ligadores potenciais: Clones individuais das trilhas de seleção diferentes foram escolhidas para o sequenciamento. Todos os clones conduzidos na triagem pelo ELISA foram sequenciados. A amplificação de fragmentos de gene e análise de sequência de fragmentos de gene foram realizados como descrito no Exemplo 1.
[0183] Triagem pelo ELISA de variantes Z: As colônias únicas que contêm variantes Z foram aleatoriamente escolhidas a partir dos clones selecionados da biblioteca maturada de proteína de complemento C5 e cultivadas em cultivos de 1 ml como descrito no Exemplo 1. As proteínas periplásmicas foram liberadas pelos 8 ciclos de congelamento-descongelamento repetidos. As triagens pelo ELISA foram realizadas essencialmente como descrito no Exemplo 1 com as exceções que seguem. Placas de ELISA de 96 reservatórios de meia-área foram revestidas com 2 μg/ml de um anticorpo de cabra específico de ABD (produzidos “em casa”) diluídos em tampão de revestimento. hC5 biotinilada foi usada em uma concentração de 0,15 μg/ml e a incubação realizada por 1,5 a 2 h. HRP conjugado à estreptavidina foi obtido da Thermo Scientific (cat. no. N100). A variante Z Z05363 (SEQ ID NO: 510) que se origina das seleções primárias (Exemplo 1) foi usada como um controle positivo assim como um controle negativo omitindo hC5.
[0184] As variantes Z maturadas selecionadas foram submetidas a uma segunda triagem contra hC5 em uma concentração mais baixa e comparada com rC5. O ensaio foi essencialmente realizado como descrito acima. hC5 e rC5 foi usado em uma concentração de 0,05 μg/ml e 4 μg/ml, respectivamente. A variante Z Z05363 (SEQ ID NO: 510) também foi usada como um controle positivo neste experimento. Como um controle negativo, uma variante Z que se liga ao PDGF-Rβ (Z01977; descrito na WO 2009/077175) foi ensaiada contra hC5 ou rC5 biotiniladas.
[0185] Na análise de sequência profunda de variantes Z selecionadas e correlação de aminoácidos nas 13 posições randomizadas com temperaturas de fusão e valores IC50 medidos para a C5 humana e C5 de camundongo no ensaio de hemólise (descrito no Exemplo 6) sugeriram uma variante Z favorável não identificada entre os 558 clones sequenciados. Com base na variante Z Z05998 (SEQ ID No: 499), um único aminoácido, Ile na posição 10 foi substituído com Leu usando tecnologia convencional para a mutagênese loco dirigida. A nova variante é aludida como Z08044 (SEQ ID NO: 498). O motivo de ligação da proteína de complemento C5 deduzido desta variante Z é listado na Figura 1 e na listagem de sequência como SEQ ID NO: 2. As sequências de aminoácido do polipeptídeo de 49 resíduos de aminoácido de comprimento prognosticadas constituir o feixe de três hélices completo dentro desta variante Z são listadas na Figura 1 e na listagem de sequência como SEQ ID NO: 250.
Resultados
[0186] Seleção de demonstração de fago de polipeptídeos de ligação da proteína de complemento C5: A seleção foi realizada em seis trilhas paralelas no total que contêm quatro ciclos cada. As trilhas de seleção diferentes diferiram na concentração alvo e condições de lavagem como segue: 1a) tempo de seleção de 2 horas, concentração alta, lavagem padrão, 1b) tempo de seleção de 2 horas, concentração baixa, lavagem padrão, 1c) tempo de seleção de 2 horas, concentração média, lavagem longa, 2a) tempo de seleção de 10 min, concentração alta, lavagem padrão, 2b) tempo de seleção de 10 min, concentração baixa, lavagem padrão, e 2c) tempo de seleção de 10 min, concentração média, lavagem longa. Para cada ciclo de seleção, a concentração alvo foi diminuída e as condições de lavagem foram mais severas. Todas as trilhas deram em cada rodada quantidades suficientes de partículas de fago no eluído. A maioria das partículas de fago foram encontradas nas trilhas 1a e 2a, que representam a concentração alvo mais alta e condições de lavagem mais brandas.
[0187] Sequenciamento: Os clones aleatoriamente escolhidos (558) foram sequenciados. A cada variante Z individual foi dada um número de identificação, Z#####, como descrito no Exemplo 1. No total, 242 novas moléculas da variante Z únicas foram identificadas. As sequências de aminoácido das variantes Z de 58 resíduos de aminoácido de comprimento estão listadas na Figura 1 e na listagem de sequência como SEQ ID NO: 497, SEQ ID NO: 499 a 508 e SEQ ID NO: 514 a 744. Os motivos de ligação da proteína de complemento C5 deduzidos destas variantes Z são listadas na Figura 1 e na listagem de sequência como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 a 12 e SEQ ID NO: 18 a 248. As sequências de aminoácido dos polipeptídeos de 49 resíduos de aminoácido de comprimento prognosticadas constituir o feixe de três hélices completo dentro de cada uma destas variantes Z são listadas na Figura 1 e na listagem de sequência como SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 251 a 260 e SEQ ID NO: 266 a 496. Entre os clones sequenciados, 63 sequências ocorreram duas ou mais vezes.
[0188] Triagem pelo ELISA de variantes Z: Os clones obtidos depois de quatro ciclos de seleção foram produzidos em placas de 96 reservatórios e triadas quanto a atividade de ligação de hC5 usando ELISA. Todos os clones aleatoriamente escolhidos foram analisados. 229 das 242 variantes Z únicas foram descobertas dar uma resposta mais alta (0,3 a 3,1 AU) contra hC5 em uma concentração de 0,15 μg/ml comparada com o clone de controle positivo Z05363 (SEQ ID NO: 510; um sinal de absorbância médio de 0,3 AU), obtido das seleções primárias (Exemplo 1). Os clones de todas as trilhas de seleção mostraram sinais positivos. Os controles negativos tiveram uma absorbância de aproximadamente 0,1 AU.
[0189] As variantes Z foram selecionadas com base no seu desempenho na triagem pelo ELISA contra hC5 e a frequência de ocorrência. 43 variantes Z únicas foram ensaiadas contra uma concentração mais baixa de hC5 (0,05 μg/ml) assim como rC5 (4 μg/ml). Um resultado positivo contra rC5 foi obtido por 40 das variantes Z testadas, definido como 2x o sinal para o controle negativo (0,4 AU). Os resultados para todas as variantes Z testadas contra a concentração mais baixa de hC5 assim como contra rC5 são mostrados na Figura 3.
Exemplo 5: Subclonagem, produção e caracterização de um subconjunto de variantes Z que ligam a proteína de complemento C5 Materiais e métodos
[0190] Subclonagem de moléculas da variante Z em vetores de expressão: Com base na análise de sequência e o desempenho no ELISA contra a proteína de complemento C5 de ser humano e rato, 45 clones foram selecionados para subclonagem no vetor de expressão pAY01448. Os fragmentos da variante Z monomérica foram amplificados a partir do vetor de fagomídeo pAY02592 e a subclonagem em pAY01448 foi realizada como descrito no Exemplo 2, resultando em um vetor que codifica a sequência de proteína MGSSHHHHHHLQ-[Z#####]-VD.
[0191] Expressão e purificação de proteína: As 45 variantes Z no formato His6- (Z#####), foram expressadas em um sistema de multifermentador automatizado como descrito no Exemplo 2 ou similarmente em uma montagem em pequena escala de culturas de 100 ml em frascos agitadores induzidos manualmente com IPTG a uma concentração final de 0,4 mM. A purificação foi realizada usando colunas HisGraviTrap® de 1 ml essencialmente como descrito no Exemplo 2 ou em uma escala menor usando His SpinTrap de 0,1 ml (GE Healthcare, cat. no. 28-4013-53). O tampão foi trocado para PBS usando colunas PD-10 ou PD SpinTrap G-25 (GE Healthcare, cat. no. 28-9180-04) de acordo com as instruções do fabricante. A concentração de variantes Z purificadas foi determinada pelas medições de absorbância a 280 nm e a pureza e identidade foram avaliadas pela SDS-PAGE e LC/MS como descrito no Exemplo 2. As amostras foram aliquotadas e armazenadas a -80 °C até outro uso.
[0192] Análise de CD: A análise de CD para a determinação das temperaturas de fusão e reversibilidade de dobra foi realizada como descrito no Exemplo 2.
Resultados
[0193] Expressão e purificação de proteína: Todas as 45 variantes Z subclonadas podem ser expressadas e a solubilidade in vitro para todas as variantes purificadas foi boa. A pureza foi estimada pela LC/MS para exceder 90 % para todas as variantes. Os pesos moleculares corretos foram verificadas pela LC-MS.
[0194] Análise de CD: As medições do espectro de CD realizadas a 20 °C confirmaram a estrutura α-helicoidal das variantes Z nesta temperatura. Uma sobreposição dos espectros obtidos depois das medições de temperatura variáveis (aquecendo a 90 °C seguido pelo resfriamento para 20 °C) nos espectros obtidos antes da medição de temperatura variável mostrou que todas as variantes Z dobram de volta completamente, ou quase completamente, para as suas estruturas de hélice α depois de aquecer a 90 °C (Resultados não mostrados). As temperaturas de fusão para um conjunto de variantes Z foram determinados a partir das medições de temperatura variáveis e são mostrados na Tabela 5. Tabela 5. Temperaturas de fusão de variantes Z maturadas com um rótulo de histidina fundido diretamente ao terminal amino da SEQ ID NO: 497 e SEQ ID NO: 499 a 508.
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Exemplo 6: Caracterização in vitro de variantes Z que ligam C5 Materiais e métodos
[0195] Clonagem e produção de proteína: O DNA que codifica um subconjunto de variantes Z que ligam C5 (SEQ ID NO: 745-757) onde o códon da E. coli é otimizado e sintetizado pela GeneArt, GmbH. Os genes sintéticos que representam as variantes Z que ligam C5 foram subclonados e expressados na E. coli. Os vetores de expressão que codificam as construções de monômeros ou dímeros das variantes Z opcionalmente ligadas a um domínio de ligação de albumina (ABD094, SEQ ID NO: 759) são esquematicamente ilustradas na Figura 4.
[0196] As variantes Z intracelularmente expressadas foram purificadas usando métodos de cromatografia convencionais. A homogeneização e clarificação foram realizadas pela sonificação seguida pela centrifugação e filtração. A cromatografia de troca de ânion foi usada como etapa de captura. Outra purificação foi obtida pela cromatografia de interação hidrofóbica. As purificações foram executadas nas condições ácidas (pH 5,5). O polimento e a troca de tampão foi realizada pela cromatografia de exclusão de tamanho. Antes da concentração até o teor de proteína final, o nível de endotoxina foi reduzido pela cromatografia de afinidade com a polimixina B. Proteínas produzidas foram analisadas pela MALDI-TOF MS e no SDS- PAGE.
[0197] Além disso, a proteína OmCI recombinantemente expressada (SEQ ID NO: 761) foi usada como uma molécula de referência nos estudos in vitro.
[0198] Inibição da hemólise: Para os estudos da função do caminho de complemento clássico e inibição do mesmo pelos polipeptídeos de ligação de C5, eritrócitos de ovelha foram preparados a partir de sangue integral de ovelha fresco em solução de Alsever (Swedish National Veterinary Institute) e depois disso tratado com antissoro de eritrócito de coelho anti-ovelha (Sigma) para tornar-se eritrócito de ovelha sensibilizado pelo anticorpo (EA). O processo inteiro foi conduzido sob condições assépticas. Todos os outros reagentes foram de fontes comerciais.
[0199] O ensaio in vitro foi conduzido em placa microtituladora na forma de U de 96 reservatórios pelas adições consecutivas de uma proteína de teste, um soro de complemento e suspensão de EA. As concentrações finais de todos os reagentes, em um volume de reação total de 50 μl por reservatório e no pH 7,3 a 7,4, foram: 0,15 mM de CaCl2; 0,5 mM de MgCl2; 3 mM de NaN3; 138 mM de NaCl; 0,1 % de gelatina; 1,8 mM de barbital sódico; 3,1 mM de ácido barbitúrico; 5 milhões de EA; soro da proteína de complemento C5 na diluição adequada, e variante Z que liga C5 nas concentrações desejadas. Espécies diferentes de soros de complemento foram usados no ensaio para definir potências de espécies cruzadas das variantes Z. Para soro de camundongo, um soro humano esgotado em C5 (C5D da Quidel cat. no. A501) teve que ser suplementado em uma quantidade igual.
[0200] As variantes Z foram pré-incubadas com o soro de complemento acima descrito por 20 min em gelo antes de começar a reação pela adição da suspensão de EA. A reação hemolítica foi deixada prosseguir a 37 °C durante agitação por 45 min e foi depois opcionalmente terminada pela adição de 100 μl de solução salina gelada contendo 0,02 % de Tween 20. As células foram centrifugadas até o fundo e a porção superior, que corresponde a 100 μl de sobrenadante, foi transferida para uma microplaca transparente tendo reservatórios de meia-área e fundo chato. Os resultados da reação foram analisados como densidade óptica usando uma leitora de placa multitituladora em um comprimento de onda de 415 nm.
[0201] Em todas as ocasiões de teste, controles, veículo e OmCI (SEQ ID NO: 761), foram incluídos em cada placa para definir os valores das reações não inibidas e totalmente inibidas, respectivamente. Estes valores foram usados para calcular a % de inibição da hemólise de complemento em qualquer concentração de amostra dada. As potências inibidoras (valores IC50) das variantes Z testadas foram definidas pela aplicação do mesmo ensaio na presença de uma concentração controlada de C5 humana adicionada ao soro esgotado de C5. Quanto aos inibidores altamente potentes (nanomolar baixo para sub-nanomolar), uma concentração de C5 final da mistura de reação foi controlada a 0,1 nM, que foi opcionalmente estabilizada pelo uso de soros esgotados ou deficientes em C5.
[0202] Cinéticas in vitro e afinidade de variantes Z que ligam C5 para hC5 imobilizada: A afinidade de ligação de várias variantes Z que ligam C5 (SEQ ID NO: 748 a 757) para hC5 foi analisada usando um instrumento Biacore T200 (GE Healthcare). C5 humana (A403, Quidel Corporation) foi ligada a um chip sensor CM5 (900 RU) usando a química da ligação de amina de acordo com o protocolo do fabricante. A ligação foi realizada pela injeção de hC5 em uma concentração de 7,5 μg/ml em 10 mM de tampão de Na-acetato pH 5 (GE Healthcare). A célula de referência foi tratada com os mesmos reagentes mas sem injeção de C5 humana.
[0203] Todos os experimentos foram realizados em 10 mM de HEPES pH 7,4, 150 mM de NaCl, 3 mM de EDTA, 0,005 % de Tensoativo P20 (tampão HBS-EP, GE Healthcare). Para as análises cinéticas, a taxa de fluxo foi de 30 μl/min e os dados foram coletados a 25 °C. Os dados da célula de referência foram subtraídos para compensar quanto às mudanças em massa do índice refrativo. Na maioria dos casos, uma injeção de HBS-EP também foi incluída como controle de modo que os sensorgramas fossem de duplo branco. As superfícies foram regeneradas em tampão HBS-EP.
[0204] A ligação de variantes Z à hC5 imobilizada foi estudada com o método de cinéticas de ciclo único, em que cinco concentrações de amostra são injetadas uma depois da outra no mesmo ciclo sem regeneração entre as injeções. As constantes cinéticas foram calculadas a partir dos sensorgramas usando o modelo de Langmuir 1:1 ou análito bivalente do Software Biacore T200 Evaluation versão 1.0.
[0205] As cinéticas in vitro e afinidade das moléculas Z-ABD que ligam C5 à hC5 imobilizada: A ligação de moléculas Z-ABD (SEQ ID NO: 748 a 757 fundidas a ABD094 (SEQ ID NO: 759) por um ligador GS), à hC5 imobilizada foi avaliada usando um instrumento Biacore T200 (GE Healthcare).
[0206] As construções de Z-ABD onde Z06175a (SEQ ID NO: 753) como um monômero ou dímero foi fundido a ABD094 (SEQ ID NO: 759) no terminal N ou no terminal C por intermédio de ligadores diferentes como especificados na Figura 4 (construções 2, 7, 5 e 4) foram também pré-incubadas com albumina humana recombinante (Cell Prime rAlbumin AF-G, 9301, Novozymes), diluídas e depois injetadas na C5 humana imobilizada de acordo com o método das cinéticas de ciclo único como descrito acima. Como uma comparação, as mesmas construções foram injetadas na ausência de HSA. Duas construções, Z06175a-GS (Figura 4, construção 1) e Z06175a-GSGGGGSGGGGS-ABD094 (Figura 4, construção 3) foram testadas apenas na ausência de HSA.
[0207] A ligação em estado constante de variantes Z que ligam C5 às placas ECL revestidas com C5: A afinidade de várias construções que ligam C5 que compreendem variantes Z (SEQ ID NO: 745, SEQ ID NO: 748 a 757 opcionalmente fundidas a ABD094 (SEQ ID NO: 759) em construções como especificadas na Figura 4) para a C5 humana foi medida pelo deslocamento de uma variante de Z-ABD que liga C5 rotulada com rutênio (SEQ ID NO: 748 fundida à SEQ ID NO: 759 por um ligador GS).
[0208] A variante Z-ABD (SEQ ID NO: 748 fundida à SEQ ID NO: 759 por um ligador de GS) a ser usado como traçador foi rotulado em uma razão molar de 1:12 a 1:20 (proteína:SULFO-TAG NHS-Éster, Meso Scale Discovery, cat. no. R91AN-1). A reação de rotulação foi realizada em gelo por duas horas. SULFO-TAG não ligado foi removido usando uma coluna de dessalinização giratória Zeba® (Thermo Scientific, cat no. 89889) e a concentração de proteína final foi medida pelo uso de reagente de Bradford (Bradford, M. M., Anal. Biochem. 72: 248-254, 1976). A afinidade (constante de dissociação, KD) da variante Z-ABD rotulada com SULFO-TAG foi determinada pela análise de ligação na saturação de concentrações crescentes da variante Z-ABD rotulada aos reservatórios de eletroquimioluminescência revestidos com C5 (ECL, Meso Scale Discovery). A variante Z-ABD rotulada foi analisada ainda pela LC/MS de modo a determinar a distribuição de moléculas de SULFO-TAG na variante Z-ABD.
[0209] O deslocamento foi realizado pelo revestimento de ECL, placas de arranjo múltiplo de 96 reservatórios alta ligação, não revestidas (Meso Scale Discovery, cat. no. L15XB) com 50 fmol/reservatório de hC5 durante a noite a 4 °C. Subsequentemente, sítios não específicos foram bloqueados com PBS com 1 % de caseína por duas horas na temperatura ambiente. Variantes Z diferentes opcionalmente fundidas com ABD094 (SEQ ID NO: 759) (ver Figura 4) foram incubadas em concentrações diferentes junto com aproximadamente 100 pM da variante Z-ABD que liga C5 rotulado com SULFO-TAG em PBS com 1 % de Caseína. A incubação durou três horas na temperatura ambiente enquanto agitando a placa a 300 rpm. Finalmente, a incubação foi terminada pela lavagem 3 vezes com 150 μ l de PBS-Tween20 gelado. Imediatamente depois da lavagem final, 150 μl de 2x tampão de leitura (4x tampão de leitura T, Meso Scale Discovery cat. no. R92TC-3 diluído 1:1 em H2O ultrapura) foi adicionado a cada um dos reservatórios e o sinal foi detectado usando uma leitora de placa (SECTOR Imager 2400, Meso Scale Discovery). A proteína de ligação de C5 que ocorre naturalmente OmCI (Nunn et al. supra, SEQ ID NO: 761) foi incluída no ensaio de deslocamento como um controle positivo. A afinidade de ligação das construções que ligam C5 competidoras e controles à C5 foi determinada pela análise da regressão não linear usando plugin Excel XLfit5 e GraphPad Prism 4.
[0210] Seletividade de Z-ABD que se liga à C5 em relação a C3, C4 e IgG: A ligação de uma variante Z-ABD (SEQ ID NO: 748 fundida a SEQ ID NO: 759 por um ligador GS) às proteínas de complemento C3 e C4 intimamente relacionada de ser humano assim como que se ligam à IgG humano (desde que a origem do domínio Z, a proteína estafilocócica A, seja uma proteína de ligação de IgG) foi tratada pela ressonância de plásmon de superfície (SPR) usando um instrumento Biacore 2000 (GE Healthcare). A construção Z-ABD foi imobilizada em um chip CM5 (GE- Healthcare) usando a ligação de amina (70 RU). 40 nM e 400 nM de cada uma de C3 (A401, Quidel), C4 (A402, Quidel) e IgG (I2511, Sigma) humanas diluídas em tampão HBS-P (GE Healthcare) foram injetados na superfície. Cada injeção foi seguida por um ciclo de regeneração com 20 mM de NaOH injetado por 30 s. C5 humana nas mesmas concentrações foi conduzida em paralelo como um controle positivo.
Resultados
[0211] Clonagem e produção de proteína: As variantes de proteína produzidas como esquematicamente descrito na Figura 4 onde “Z” pode ser representado pela SEQ ID NO: 745 e SEQ ID NO: 748 a 757 foram analisadas pela MALDI-TOF MS e on SDS-PAGE. (Figura 5)
[0212] Inibição da hemólise: Um subconjunto de variantes Z que ligam C5 foi ensaiado quanto à atividade de ligação de C5 in vitro e inibição da hemólise em eritrócitos de ovelha. A concentração da variante Z que resulta em 50 % de inibição da hemólise (IC50) ou 50 % de inibição do traçador que se liga à C5 humana foi calculada. As curvas de concentração-resposta representativas para as variantes Z mostradas como SEQ ID NO: 745 e SEQ ID NO: 748 a 757 inibem a hemólise como descrito na seção métodos são mostradas nas Figuras 6A e 6B. O resultado para as diferentes variantes Z fundidas a ABD094 (SEQ ID NO: 759) por intermédio de um ligador GS curto é mostrado na Figura 6A.
[0213] A variante Z precursora Z05477a (SEQ ID NO: 745) fundida a ABD094 (SEQ ID NO: 759) separada por um ligador GS curto exibiu um valor IC50 de cerca de 100 nM, ao passo que as variantes Z-ABD que se ligam à C5 de segunda geração testadas tipicamente inibiram a hemólise com valores IC50 em torno ou abaixo de 1 nM. Isto sugere um aumento de mais do que 100 vezes na potência para as variantes Z que ligam C5 identificadas na seleção por maturação e triagem subsequente.
[0214] Na Figura 6B, a ligação à C5 é mostrada para várias combinações de uma variante Z representativa (Z06175a; SEQ ID NO: 753) sozinha, como um dímero e em fusão com ABD094 (SEQ ID NO: 759) no terminal N ou no terminal C por intermédio de ligadores diferentes como especificado na figura. As combinações que ligam C5 exibiram valores IC50 que variam de 86 pM a 12 nM com soro humano como medido usando o ensaio descrito acima. O valor correspondente para a proteína de carrapato OmCI foi tipicamente de 300 a 500 pM.
[0215] Cinéticas in vitro: Os estudos da cinética de características de ligação para várias variantes Z (SEQ ID NO: 748 a 757) opcionalmente fundidas a ABD094 (SEQ ID NO: 759), à hC5 imobilizada, assim como à C5 na presença de albumina humana, foram realizadas usando o instrumento Biacore T200.
[0216] Os dados para dez variantes Z diferentes fundidas a ABD094 por intermédio de um ligador GS são apresentados na Tabela 6. Tabela 6. Características da ligação de C5 humana para fusões de Z-ABD diferentes
Figure img0006
[0217] ligação da mesma variante Z (SEQ ID NO: 753) mas em construções diferentes; isto é com/sem ABD e ligadores diferentes, também foi analisada usando Biacore T200. Além disso, o efeito da albumina sobre algumas das fusões Z-ABD também foi avaliado pela execução da mesma análise na ausência e na presença de albumina humana. Estes dados são apresentados abaixo na Tabela 7. Tabela 7. Características da ligação de C5 humana para uma variante de fusão Z- ABD Z06175a (SEQ ID NO: 753, abreviada Z) compreendida em construções diferentes.
Figure img0007
[0218] Efeitos surpreendentemente pequenos podem ser observados quando da comparação das afinidades das construções para hC5 (SEQ ID NO: 760) na presença e ausência de albumina. Isto sugere que simultaneamente a ligação de albumina à porção do ABD das construções não interfere com a interação de C5.
[0219] A ligação em estado constante de variantes Z que ligam C5 às placas ECL revestidas com C5: A ligação em estado constante de construções que ligam C5 compostas de variantes Z diferentes (SEQ ID NO: 745 e 748 a 757), opcionalmente fundidas a ABD094 (SEQ ID NO: 759) em construções como especificadas na Figura 4, à hC5 foi avaliada em um ensaio de competição. Pela competição quanto à ligação de C5 revestida nas placas ECL com uma das variantes Z que ligam C5 rotuladas com SULFO-TAG (SEQ ID NO: 748) fundida a ABD (SEQ ID NO: 759), a ligação em estado constante das construções C5 foi avaliada. Como uma comparação a proteína de carrapato OmCI (SEQ ID NO: 761) também foi incluída. A variante Z-ABD rotulada que contém a SEQ ID NO: 748 teve uma afinidade (Kd) de 0,9 nM para hC5. Esta variante Z-ABD rotulada foi descoberto ainda ligar-se a um anticorpo específico para a região constante das variantes Z em uma maneira dependente da concentração com um Kd de 0,34 nM.
[0220] As variantes Z que ligam C5 (SEQ ID NO: 748 a 757) fundidas no terminal carbóxi a ABD094 (SEQ ID NO: 759) por um ligador GS foram descoberto deslocar 200 pM de variante Z-ABD rotulada com SULFO-TAG com valores de IC50 que variam de cerca de 300 pM a 1 nM (Figura 7A), ao passo que a construção correspondente que contém a variante Z precursora Z05477a (SEQ ID NO: 745) exibiram um valor IC50 de afinidade de cerca de 30 nM. Ao contrário, a proteína de ligação de C5 que ocorre naturalmente OmCI foi descoberta ligar hC5 com um IC50 de 1,5 nM (Figura 7A). Assim, todas as variantes Z de segunda geração testado (SEQ ID NO: 748-757) exibiram uma afinidade de ligação mais alta para C5 humana do que a variante Z precursora Z05477a (SEQ ID NO: 745). Além disso, as afinidades foram mais altas do que aquelas de OmCI que se liga à C5 humana usando o mesmo método.
[0221] Várias construções diferentes que contêm o mesmo domínio de ligação de C5 como um monômero, dímero, com ou sem ABD assim como uns poucos ligadores diferentes entre os domínios diferentes foram também testadas (Figura 7B). As variantes monoméricas de Z06175a (SEQ ID NO: 753, opcionalmente fundidas a um rótulo His6 ou um ABD de terminal C) e as variantes diméricas com um ligador ABD de terminal C foram descobertos deslocar 200 pM da variante Z-ABD rotulada com SULFO-TAG com valores IC50 variando de cerca de 500 pM a 1,7 nM ao passo que a variante dimérica sem um ABD e a variante monomérica com um ABD de terminal N deslocou 200 pM de Z-ABD rotulada com SULFO-TAG com valores IC50 de 4 nM e 17 nM, respectivamente.
[0222] Seletividade: A seletividade foi tratada usando a análise SPR e a superfície com a variante Z-ABD imobilizada (SEQ ID NO: 748 fundida à SEQ ID NO: 759 por um GS-ligador) não demonstrou nenhum sinal SPR significante quando submetida a 40 e 400 nM dos parálogos de C5 humana C3 e C4 assim como IgG humana. Como uma comparação, 400 nM de C5 humana evocou uma resposta SPR de cerca de 450 RU que mostrou que a variante Z-ABD testada de fato é seletiva para C5 em relação a C3, C4 e IgG.
Exemplo 7: Estudos de interação de variantes de Z-ABD com HSA, BSA e albumina sérica de rato e camundongo. Materiais e métodos
[0223] Dois métodos diferentes, cromatografia de exclusão de tamanho e Biacore, foram usados para estudar a interação entre o domínio de ligação de albumina ABD094 fundido a uma das variantes Z que ligam C5.
[0224] A cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) foi utilizada para estudar a interação entre Z06175a-GS-ABD094 (SEQ ID NO: 753 fundida à SEQ ID NO: 759 por um ligador GS) e HSA. Em resumo, quantidades equimolares de Z06175a-GS- ABD094 e HSA recombinante (Novozymes) foram pré-incubadas em PBS na temperatura ambiente por 60 minutos e subsequentemente conduzida em uma coluna Superdex200 (GE Healthcare) usando o sistema SMART (GE Healthcare). Z06175a- GS-ABD094 e HSA também foram conduzidos separadamente como controles.
[0225] A ligação à albumina imobilizada foi estudado usando um instrumento Biacore 2000 (GE Healthcare). A albumina humana recombinante (Recombumin®, Novozymes) foi ligada a um chip sensor CM5 (385 RU) usando a química da ligação de amina como descrita pelo fabricante. A ligação foi realizada pela injeção de albumina humana em 10 mM de tampão de Na-acetato pH 4,5 (GE Healthcare). A célula de referência foi tratada com os mesmos reagentes mas sem injetar a albumina humana. A injeção de HBS-EP também foi incluída como controle de modo que os sensorgramas foram de duplo branco. Experimentos foram realizados em tampão HBS-EP, 10 mM de glicina-HCl pH 2 (GE Healthcare) foram usados para a regeneração, a taxa de fluxo foi de 30 μl/min e os dados foram coletados a 25 °C. Duas construções diferentes foram testadas, Z-ABD (Z06175a-GS-ABD094) e Z-ABD- Z (Z06175a-GS-ABD094-GSGGGGSGGGGS-Z06175a) em três concentrações diferentes; 25 nM, 100 nM e 400 nM. BIAevaluation versão 4.1.1 foi usado para a avaliação de dados de sensorgrama. Em uma maneira similar, a ligação de Z-ABD (Z06175a-GS-ABD094) às superfícies imobilizadas com albumina sérica de rato (A4538, Sigma), camundongo (A3559, Sigma), e vaca (BSA, Sigma) também foi investigada.
Resultados
[0226] Em uma coluna SEC, moléculas maiores eluem mais rápido do que as menores. Como observado na Figura 8A, o HSA+ Z06175a-GS-ABD094 co-injetados eluem mais rápido do que quando HSA é injetado sozinho sugerindo que as duas moléculas se comportam como um complexo estável sob estas condições. O Z06175a-GS-ABD094 menor elui mais lento do que o complexo ou HSA sozinho que mostra que estas proteínas sozinhas são menores do que o complexo.
[0227] Os dados de Biacore 2000 para as variantes Z-ABD e Z-ABD-Z analisadas mostram que a Z-ABD tem uma taxa de associação mais rápida do que quando ABD é flanqueado pelos domínios Z em cada um dos lados (Figura 8B). A análise da afinidade de ligação de pontos de domínios Z fundidos a ABD em uma afinidade abaixo de 1 nM para Z-ABD ao passo que a variante Z-ABD-Z liga-se à HSA imobilizada com um KD acima de 1 nM.
[0228] Z06175a-GS-ABD094 ligado à albumina sérica de rato com afinidade muito alta (KD < 100 pM) ao passo que a interação com albumina sérica de camundongo imobilizada foi mais fraca (KD de cerca de 4 nM) do que com albumina sérica tanto de ser humano quanto de rato. A interação com albumina sérica bovina não foi mensurável.
[0229] Estes dados estão bem de acordo com os dados publicados em uma variante anterior de ABD (Jonsson et al. Protein Engineering, Design & Seletion 2008, 21: 515-527) e mostram que a variante Z-ABD testada está fortemente ligada à albumina sérica no ser humano em concentrações clinicamente relevantes assim como em camundongo e rato permitindo comparações de dados farmacocinéticos entre animais e seres humanos.
Exemplo 8: Estudos Farmacocinéticos de variantes Z que ligam C5 e ratos Materiais e métodos
[0230] Fase na vida de roedor: As farmacocinéticas de duas construções que ligam C5 Z-ABD (Z06175a-GS-ABD094; SEQ ID NO: 753 fundida à SEQ ID NO: 759 por um ligador GS, Figura 4, construção 2) e Z-ABD-Z (Z06175a-GS-ABD094- GSGGGGSGGGGS-Z06175a; (SEQ ID NO: 753 fundida à SEQ ID NO: 759 por um ligador GS, seguido por um ligador GS(G4S)2 e um segundo motivo da SEQ ID NO: 753, Figura 4, construção 5) foram estudadas em ratos Sprague Dawley (SD) Machos (250 a 300 g de peso corporal) . A cada rato foi dada uma administração de dose única, i.v. (250 nmol/kg) ou s.c. (500 nmol/kg), de Z-ABD ou A-ABD-Z (n = 3 por grupo de dose). Amostras de sangue (200 μ L) foram tiradas em 5, 20, e 45 min, assim como 1,5, 4, 7, 24, 48, 72, 120, 168, 240, e 336 h a seguir da administração para o grupo i.v. e em 15 e 30 min, 1, 2, 4, 7, 24, 48, 72, 120, 168, 240, e 336 h a seguir da administração para o grupo s.c.. O sangue foi coletado em tubos e colocado na geladeira por 20 min para permitir a coagulação. O soro foi subsequentemente colhido a seguir da centrifugação a 4000 rpm por 10 minutos. As amostras de soro foram mantidas a -70 °C até a análise.
[0231] Determinação das concentrações da variante Z que liga C5 em amostras de soro de animais usando LC/LC/MS/MS: As concentrações de soro das construções administradas que ligam C5 Z-ABD e Z-ABD-Z, como descrito acima, foram determinadas pela espectrometria de massa (LC/LC/MS/MS).
[0232] As amostras de soro ou plasma (25 μl) foram diluídas com 150 μl de uma agarose de pepsina (7 mg/ml, Sigma, cat. no. P0609) colocada em suspensão em 1 M de tampão de formiato de amônio pH 3,0 em um tubo Eppendorf de 500 μl. Os tubos foram tampados e agitados em um termomisturador de Eppendorf compacto a 37 °C por 20 min. A seguir da agitação, 25 μl de uma solução de padrão interno I(13C6;15N)NKLDDDPSQSSEL (aminoácidos 31 a 44 da SEQ ID NO: 746 a 757) (Thermo Fisher Scientific GmbH), diluída a 0,5 μM em ácido trifluoroacético (TFA) a 0,1 %, foram adicionados. A seguir da adição de padrão interno, as amostras foram misturadas e filtradas através de filtros giratórios de celulose de 0,45 μm (Grace).
[0233] As amostras padrão para a calibração foram preparadas pela pesagem de 20 μl de solução de estoque de proteína com concentração de proteína conhecida (5 a 10 mg/ml) seguidos pela diluição com plasma em branco das espécies a serem analisadas. O primeiro padrão de plasma de estoque (3 μM) foi diluído ainda para 0,1 μM.
[0234] 40 μl das amostras foram injetados em um sistema de coluna ligado seguido pela espectrometria de massa em tandem com monitoramento de reação múltiplo (MRM). A primeira coluna foi uma coluna Ascentis RP-Amida empacotada com partículas de 5 μm (2,1 x 150 mm, Supelco). Uma coluna de enriquecimento; uma coluna Brownlee newgard (3,2 x 15 mm) empacotada com partículas C18 de 7 μm, foi usada para aprisionar a fração de peptídeo do análito da primeira coluna. O efluente da primeira coluna foi diluído com 1 ml/min de água bombeada pela bomba Shimadzu em um misturador de turbilhão (Lee Scientific). A última coluna foi uma coluna de fase reversa de modo misto e de troca de cátion (2,1 x 100 mm) empacotada com 5 μm de partículas Primesep 100 (SIELC Inc).
[0235] As fases móveis para a primeira coluna (RP-Amida) fornecidas em uma primeira cromatografia líquida (Acquity UPLC) foram A: 2 % de acetonitrila, 0,1 % de ácido acético, 0,1 % de TFA, e 97,8 % de água, e B: acetonitrila com 0,1 % de ácido acético e 0,02 % de TFA. O fluxo foi de 0,5 ml/min e um gradiente linear foi usado para a elução. A amostra foi eluída em condições isocráticas com 100 % de A por 1 min, seguido por 80 % de A a 7,9 min. A 8,1 min, a coluna foi lavada com 100 % de B por um minuto, seguido pelo recondicionamento com 100 % de A. O efluente da coluna foi conectado a uma válvula Valco de seis orifícios controlada a partir do software do espectrômetro de massa.
[0236] A coluna de aprisionamento (3,2 x 15 mm) foi conectada à válvula de seis orifícios no modo de retro fluxo. As fases móveis para a segunda coluna, fornecida em uma segunda cromatografia líquida (Agilent 1100), foram A: 80 % de acetonitrila, 19,9 % de água, e 0,1 % de ácido fórmico, e B: 80 % de acetonitrila, 19 % de água, 0,5 % de ácido acético e 0,5 % de TFA bombeadas por uma cromatografia líquida Agilent 1100 a 0,5 ml/min e eluídas com o gradiente que segue: 100 % de A durante os primeiros 5 minutos seguido por B gradualmente sendo elevado de 0 a 40 % de 5 a 10 minutos seguido por uma elevação para 100 % de B durante os próximos 6 segundos (10 a 10,1 minutos). B foi mantido a 100 % até 11,5 minutos seguido por uma queda para 0 % (100 % de A) durante os próximos 6 segundos (11,5 a 11,6 minutos) e mantidos a 0 % de B por todo o ciclo até interrompido em 13 minutos.
[0237] O efluente da última coluna foi conectada a um espectrômetro de massa quadripolar triplo (Sciex API 4000) equipado com uma fonte de íon de eletropulverização operada no modo de íon positivo. As transições de MRM foram 780,9>814,4 para o análito e 784,5>821,4 para o padrão interno. O desagrupamento potencial foi otimizado a 55 V e a energia de colisão a 35 V. A energia de colisão efetiva foi de 70 eV visto que o íon precursor foi duplamente carregado dando um íon de fragmento isoladamente carregado. As razões de área de pico entre o análito e o padrão interno foram usadas para a quantificação. As curvas de calibração lineares foram obtidas com uma recuperação de 85 % e um limite de quantificação de cerca de 40 nM.
[0238] Hemólise ex vivo: Um ensaio hemolítico ex vivo para a ativação de complemento foi realizado de modo a montar de modo ideal condições in vivo para as amostras de soro dos estudos in vivo descritos acima. As amostras de soro foram 5x diluídas em um volume de reação total de 25 μl/reservat0rio que compreende 5 milhões de eritrócitos de ovelha sensibilizados por anticorpo (EA). No geral, uma porção de 20 μl de suspensão de EA que contém todos os outros componentes (ver o Exemplo 6) foi misturado (agitação de 10 minutos) com 5 μl de amostra de soro para iniciar a ativação hemolítica a 37 °C. Para as amostras de soro de camundongo, tais como no Exemplo 11, entretanto, 1 μl de C5D teve que ser incluído nos 20 μl de suspensão de EA. O ensaio ex vivo foi realizado essencialmente como descrito para o ensaio in vitro do Exemplo 6.
[0239] Cálculos: A avaliação dos parâmetros farmacocinéticos foi com base nos dados da concentração sérica individual, a média (±desvio padrão) é relatada para cada grupo de dose. Os níveis abaixo do limite inferior de quantificação (LLOQ) que aparece nos pontos de amostragem terminais foram omitidos da análise farmacocinética. A concentração sérica máxima, Cmax, e o tempo para a concentração sérica máxima observada, tmax, foram obtidos diretamente dos dados da concentração sérica. Os parâmetros farmacocinéticos; área sob a curva (AUC, AUCo- e AUCo-úitimo calculada pelo método trapezoidal linear), biodisponibilidade subcutânea (F, calculada como (AUCsc/AUCiv)*(Doseiv/Dosesc)), meia vida sérica terminal (T%,z, calculada como ln 2/Àz onde a estimativa da inclinação terminal, Xz, foi com base em pelo menos 4 C = f(t) observações), o tempo de residência média (MRT, calculado como AUMC/AUC), depuração sérica (CL, calculada como Dose/AUCo- ), volume de distribuição no estado constante (Vss, calculado como CL*MRT) e volume de distribuição na fase terminal (Vz, calculado como CL/Xz) foram calculados usando o software WinNonlin versão 5.2.1 (Pharsight Corp., USA), Análise Não Compartimental.
Resultados
[0240] Os dados farmacocinéticos para Z-ABD e Z-ABD-Z a seguir da administração i.v. (250 nmol/kg) e s.c. (500 nmol/kg) são resumidos na Tabela 8. Z- ABD foi quantificável em soro até 10 a 14 dias após a dose no grupo i.v. e 14 dias no grupo s.c. ao passo que Z-ABD-Z foi quantificável em soro até 10 dias após a dose em ambos os grupos de dose (Figura 9). 14 dias foi o ponto no tempo da amostragem final.
[0241] Correlacionando a concentração sérica de polipeptídeo de ligação de C5 com a quantidade de hemólise em eritrócitos de ovelha, foi descoberto que a inibição completa da hemólise sob as condições descritas (por exemplo diluição sérica 1:5) foi obtida por Z-ABD nas concentrações séricas acima de 1 μM (Figura 12) ao passo que Z-ABD-Z atingiram inibição completa nas concentrações séricas em torno de 0,5 μM (Figura 13). Surpreendentemente, como observado na Figura 9 e Tabela 8, Z-ABD tem uma depuração sérica mais baixa, uma meia vida sérica terminal mais longa e uma biodisponibilidade mais alta do que Z-ABD-Z. Em termos de tempo isto leva à inibição completa da hemólise por cerca de três dias depois da administração de 250 nmol/kg de Z-ABD (Figura 10) i.v. ou 500 nmol/kg s.c (Figura 11) aos ratos S.D.. Tabela 8. Farmacocinéticas médias (± desvio padrão) de Z-ABD e Z-ABD-Z a seguir da administração i.v. e s.c. em ratos Sprague Dawley machos.
Figure img0008
Exemplo 9: Estudos farmacocinéticos de variantes Z que ligam C5 em macaco Materiais e métodos
[0242] O estudo na fase de vida foi realizado na Charles River, Nevada (www.criver.com), a formulação de medicamento administrado e análise de amostras de soro foram realizadas “em casa”. As farmacocinéticas de uma variante Z-ABD (Z06175a (SEQ ID NO: 753) fundidos a ABD094 (SEQ ID NO: 759) por um ligador GS) foi investigado no macaco Cinomolgo macho (n = 3) a seguir da administração i.v. (intravenosa) e s.c. (subcutânea). A avaliação dos parâmetros farmacocinéticos foi realizada de acordo com o Exemplo 8, entretanto a seguir da administração i.v. a meia- vida sérica inicial (T%α) que corresponde à inclinação inicial da curva log-linear da concentração sérica-tempo, meia vida sérica intermediária (T%β) que corresponde à inclinação da curva log-linear da concentração sérica-tempo associada com a fase secundária (intermediária) e meia vida sérica terminal (T%Y) que corresponde à inclinação terminal da curva log-linear da concentração sérica-tempo foi determinada. T% foi calculada como ln 2/À onde a estimativa da inclinação, À, foi com base em pelo menos 4 C = f(t) observações. Os dados farmacocinéticos apresentados para a administração sc são compensados para os níveis da pré-dose de Z-ABD enquanto que o gráfico que demonstra a concentração sérica versus o tempo depois da administração sc mostra as concentrações séricas reais determinadas. Os macacos foram 2 a 4 anos de idade com um peso corporal de 2,3 a 3 kg. Cada macaco recebeu uma dose i.v. única (540 nmol/kg) seguido por uma dose s.c. única (1635 nmol/kg) três semanas depois da administração i.v.. As amostras de sangue foram tiradas em 10 e 30 minutos e 1, 2, 4, 8, 24, 48, 72, 120, 168, 240, 336 e 504 horas após a dose a seguir de ambas administrações. As amostras de sangue foram deixadas coagular por 20 a 40 minutos na temperatura ambiente e depois centrifugadas de 1500 a 2200 RCF de 2 a 8 °C por 10 a 15 minutos antes que o soro fosse colhido e congelado. As amostras de soro foram armazenadas em uma temperatura abaixo de -20 °C até a análise.
[0243] As concentrações séricas de Z-ABD foram analisadas pela LC/LC/MS/MS como descrito no Exemplo 8. As concentrações séricas determinadas pelaby LC/LC/MS/MS também foram confirmadas por uma técnica de imunoensaio de enzima intercalado quantitativo. Um anticorpo policlonal específico para o compartimento Z de Z-ABD foi revestido em uma microplaca. O anticorpo policlonal não ligado foi retirado por lavagem e caseína foi adicionada como agente de bloqueio para reduzir a ligação não específica à superfície plástica. As amostras e padrões foram diluídos em PBS que contém 0,5 % de caseína e entre 1 a 5 % de soro normal de macaco. Depois de retirar por lavagem a caseína não ligada, os padrões e as amostras foram pipetados aos reservatórios deixando que qualquer Z-ABD, presumido principalmente estar associado com a albumina sérica, presente na amostra se ligue ao anticorpo imobilizado. Depois de retirar por lavagem qualquer Z-ABD não ligado, um anticorpo policlonal rotulado com HRP específico para a albumina foi adicionado para detectar o complexo Z-ABD-albumina imobilizado pelos métodos colorimétricos. O anticorpo policlonal não ligado foi retirado pela lavagem e uma solução de substrato foi adicionada aos reservatórios e a cor se desenvolve em proporção à quantidade de Z- ABD ligado. A avaliação e cálculo dos parâmetros farmacocinéticos foram realizados como descrito no Exemplo 8.
[0244] A hemólise ex vivo em soro de macacos cinomolgos dosados com a variante Z-ABD descrita acima foi monitorada usando o método descrito nos Exemplos 6 e 8 com a modificação que o soro de macaco foi diluído apenas duas vezes comparado a cinco vezes para o soro de roedor.
Resultados
[0245] Os dados sobre as farmacocinéticas médias (± desvio padrão) de cada grupo de dose são apresentados. As concentrações séricas de Z-ABD foram quantificáveis em todos os pontos no tempo a seguir da administração tanto i.v. quanto s.c. pela LC/LC/MS/MS (Figura 14). Os dados de ELISA e os dados de LC/LC/MS/MS correlacionaram-se linearmente por um coeficiente de 0,986 mas os dados de LC/LC/MS/MS foram usados para os cálculos. A seguir da administração i.v. de Z- ABD a meia vida sérica inicial foi de 9,1 (0,8) horas, a meia vida sérica intermediária foi de 84 (4) horas e a meia vida sérica terminal foi de 198 (51) horas. O tempo de residência média foi de 246 (62) horas. O volume de distribuição, Vss e Vz foi calculado para 110 (23) ml/kg e 127 (27) ml/kg respectivamente e a depuração foi estimada a 0,45 (0,02) mL/h*kg.
[0246] A seguir da administração s.c. e corrigido para os níveis séricos da pré- dose restantes da administração i.v., as concentrações séricas máximas (Cmax média 21 (3) μM) foram atingidas em 8 a 24 h depois da dose. A meia vida sérica terminal foi de 206 (40) horas e o tempo de residência médio foi de 250 (68) horas. A biodisponibilidade subcutânea foi estimada estar acima de 70 %.
[0247] O efeito farmacodinâmico da variante Z-ABD injetada (Z06175a (SEQ ID NO: 753) fundida a ABD094 (SEQ ID NO: 759) por um ligador GS) foi monitorada pela hemólise. O efeito hemolítico no macaco cinomolgo foi completamente suprimido (< 20 % da pré-dose) por pelo menos sete dias depois da administração de 5 mg/kg de Z-ABD i.v. e 15 mg/kg de Z-ABD s.c.
Exemplo 10: Estudos in vivo usando peritonite induzida por Zymosan Materiais e métodos
[0248] Administração aos camundongos: Camundongos fêmeas C57BL/6 receberam concentrações diferentes de uma molécula de fusão Z-ABD (Z06175a-GS- ABD094, SEQ ID NO: 753 fundida à SEQ ID NO: 759 por um ligador GS) ou o controle positivo OmCI intraperitonealmente (i.p.) 1 hora antes da indução com zimosano, ou subcutaneamente (s.c.) 18 horas antes da indução com zimosano.
[0249] 0,8 mg/camundongo de zimosano foi administrado i.p. 1 hora mais tarde amostras de sangue orbital (em frascos de soro com ativador de coagulação) foram tirados sob anestesia com isoflurano. Os animais foram mortos pelo deslocamento cervical. Uma incisão na pele foi feita, e a parede muscular abdominal foi visualizada. Solução de PBS (incluindo 2 mM de EDTA) foi suavemente injetado dentro da cavidade abdominal. O abdômen foi massageado e uma amostra de fluido (1 a 2 ml) foi retirada. As amostras foram transferidas para tubos de teste e armazenadas em gelo seco antes da centrifugação a 600 g por 10 min. A proteína total e as concentrações de C5a no sobrenadante foram analisadas.
[0250] As amostras de sangue foram mantidas em um refrigerador por pelo menos 30 min e a centrifugação foi depois disso realizada a 2000 g. As amostras de soro foram armazenadas em congelador (-70 °C) para análise mais tarde da atividade hemolítica e níveis de Z06175a-GS-ABD094.
[0251] Análise da atividade de hemólise em amostras de soro de animais: A análise da atividade de hemólise foi realizada de acordo com o ensaio de hemólise descrito nos Exemplos 6 e 7.
[0252] Análise da concentração de C5a na lavagem de camundongos dosados com zimosano e moléculas de fusão Z-ABD que ligam C5: Para a detecção de C5a nas amostras de lavagem peritoneal de camundongo, as placas microtituladoras (MaxiSorp, Nunc) foram revestidas durante a noite a 4 °C com 100 μl/reservat0rio de anticorpo anti-C5a (cat. no. MAB21501, R&D Systems) em uma concentração de 1 μg/ml em 0,05 M de tampão de carbonato-bicarbonato de sódio, pH 9,6 (cat. no. C3041, Sigma). As placas foram lavadas três vezes com PBS que contém 0,05 % de Tween 20 (PBST, cat. no. 09-9410-100, Medicago) e bloqueados com 200 μl/reservat0rio de BSA a 1 % (cat. no. A7030, Sigma) em PBST por 1 a 1,5 h na temperatura ambiente durante agitação a 450 rpm. A placa foi mais novamente lavada três vezes com PBST e depois incubada com 100 μl/reservat0rio de padrão de C5a de camundongo recombinante (cat. no. 2150-C5, R&D Systems) em várias concentrações em PBST com 0,1 % de BSA ou amostras por 2 h na temperatura ambiente durante agitação a 450 rpm. As amostras de alta concentração também foram diluídas em PBST com 0,1 % de BSA. A placa foi mais uma vez lavada três vezes com PBST e depois incubada com 100 μl/reservat0rio de anticorpo anti-C5a biotinilado (cat. no. BAF2150, R&D Systems) em uma concentração de 0,1 μg/ml por 1,5 h na temperatura ambiente enquanto se agira a placa a 450 rpm. A seguir da lavagem de 3x com PBST, a placa foi incubada com 100 μl/reservat0rio de estreptavidina-HRP (cat. no. DY998, R&D Systems) em uma diluição de 200 vezes em tampão de bloqueio por 20 min na temperatura ambiente durante agitação a 450 rpm. Depois de três lavagens finais, a placa foi desenvolvida com 100 μl/reservat0rio de substrato de TMB (cat. no. T0440, Sigma) e lida depois de 20 a 30 min a 650 nm usando uma leitora de placa Spectramax Plus (Molecular Devices).
[0253] Uma curva padrão foi construída pela plotagem da absorbância a 650 nm para cada padrão contra a sua concentração (faixa de 0 a 4000 pg/ml).
[0254] Determinação da concentração da variante Z em amostras de soro de animais usando ECL: As concentrações séricas de Z06175a-GS-ABD094 que liga C5 administrada (SEQ ID NO: 753 fundida à SEQ ID NO: 759 por um ligador GS) e Z06175a-GS-ABD094-GSGGGGSGGGS-Z06175a (SEQ ID NO: 753 fundida à SEQ ID NO: 759 por um ligador GS, seguido por um ligador GS(G4S)2 e um segundo motivo da SEQ ID NO: 753, ver a Figura 4 para a descrição da construção) foram determinadas pela ECL. Placas de arranjo múltiplo de 96 reservatórios de alta ligação, não revestidas (Meso Scale Discovery cat. no. L15XB) foram revestidas com uma molécula Ig anti-Affibody de cabra (Affibody AB, cat. no. 20,1000,01,0005).
[0255] Em similaridade com o Exemplo 6, uma variante Z-ABD (Z06009a, SEQ ID NO: 748 fundida a ABD094, SEQ ID NO: 759). Placas de arranjo múltiplo foram revestidas com a molécula IgG anti-Affibody de cabra (Affibody AB) durante a noite a 4 °C, e subsequentemente os sítios não específicos foram bloqueados com PBS com 1 % de Caseína por duas horas na temperatura ambiente.
[0256] Entrementes, amostras de soro foram descongeladas a partir de -70 °C e diluídas em PBS com caseína em soro da mesma cepa animal. Padrões e controles foram diluídos no tampão correspondente. As amostras e padrões foram incubados por três horas na temperatura ambiente enquanto se agita a placa a 300 rpm. A incubação foi terminada pela lavagem 3x 150 μL de PBS-Tween20 gelado. Imediatamente depois da lavagem final, 150 μl 2x tampão de leitura (4x tampão de leitura T, Meso Scale Discovery cat. no. R92TC-3 diluída 1:1 em H2O ultrapura) foi adicionado a cada reservatórios e o sinal foi detectado usando uma leitora de placa (SECTOR Imager 2400, Meso Scale Discovery).
[0257] Em um experimento alternativo, as placas foram revestidas com C5 humana (SEQ ID NO: 760, 1 pmol/reservatório). Antes da adição à placa revestida, as amostras de soro e padrões, diluídos em soro ou em soro e PBS com caseína (todas as amostras e padrões foram igualados com a mesma concentração sérica), foram aquecidos a 60 °C por 30 min de modo a desnaturar C5 endógeno. Este experimento alternativo forneceu um método para a detecção exclusiva de proteínas de ligação C5, ao passo que a estratégia dependente de anticorpo descrita acima pode ser aplicada a todas as proteínas que se ligam a aquele anticorpo particular.
Resultados
[0258] Análise das concentrações séricas de Z-ABD e atividade de hemólise em amostras de soro de animais: As concentrações séricas assim como a capacidade para afetar a hemólise em eritrócitos de ovelha da molécula de fusão Z-ABD (Z06175a-GS-ABD094, SEQ ID NO: 753 fundidos à SEQ ID NO: 759 por um ligador GS)) foi avaliada depois da administração de uma dose baixa (20 nmol/kg), média (100 nmol/kg) e alta (500 nmol/kg). As concentrações séricas foram relativamente lineares com a dose, e a inibição da hemólise confirmou que as moléculas no soro foram ativas e que a inibição da hemólise de fato também foi dependente da concentração.
[0259] Análise da concentração de C5a na lavagem de camundongos dosados com zimosano e moléculas de fusão Z-ABD que ligam C5: A molécula pró-inflamatória zimosano foi administrada i.p. e na Figura 15 o efeito sobre o produto da clivagem de C5 altamente inflamatório C5a na lavagem como uma função da dosagem de zimosano sozinho e zimosano dosado depois de uma dosagem de uma variante Z que liga C5 a 20, 100 e 500 nmol/kg administrado s.c. 18 h antes do tratamento com zimosano ou administrado OmCI i.p. 1 h antes do tratamento com zimosano, é mostrado. A administração de zimosano sozinho leva a uma elevação potente de C5a na lavagem. este efeito é bloqueado em uma maneira dependente da dose pela molécula de fusão de Z-ABD que liga C5 apresentada.
Exemplo 11: Estudos de farmacocinética de proteína de ligação C5 em camundongos a seguir da administração intratraqueal Materiais e métodos
[0260] O perfil farmacocinético da construção que liga C5 Z06175a-GS-ABD094 (SEQID NO: 753 fundida à SEQ ID NO: 759 por um ligador GS) a seguir da administração intratraqueal aos camundongos C57bl fêmeas foi estudado. A temperatura, umidade relativa e iluminação foram ajustadas para manter 22 ± 1 °C, 55 ± 5 % e um ciclo de 12 h de luz - 12 h escuro e a dieta e água foram fornecidas ad libitum. Os animais foram anestesiados com isoflurano e dosados diretamente nos pulmões usando uma micropulverização com 500 nmol/kg de Z06175a-GS-ABD094. Tanto sangue quanto possível foi tirado, sob anestesia pelo isoflurano, da veia cava em 5 min, 30 min, 1 h, 3 h, 7 h, 16 h, 24 h, 48 h e 72 h (três animais/ponto no tempo) para a preparação de amostras de soro. As amostras de soro foram preparadas pela coleta do sangue em tubos e colocando os tubos na geladeira por 20 min. Subsequentemente, os tubos foram centrifugados a 4000 rpm por 10 minutos. Um mínimo de 100 μl de soro foi preparado a partir de cada amostra de sangue. As amostras de soro foram mantidas a -70 °C antes da análise. As concentrações séricas de Z06175a-GS-ABD094 em cada amostra foram determinadas pela ECL como descrito no Exemplo 10 e a capacidade das amostras de soro para afetar a hemólise em eritrócitos de ovelha foi determinada como descrito nos Exemplos 6 e 8.
Resultados
[0261] A concentração sérica em cada amostra e a capacidade correspondente para afetar a hemólise em eritrócitos de ovelha são descritas na Figura 16A e Figura 16B, respectivamente. Dentro de 30 minutos, um platô é atingido com concentrações séricas variando de 300 a 1000 nM onde a hemólise é quase completamente bloqueada. No soro amostrado nos pontos no tempo posteriores a 7 h após a administração, a hemólise é gradualmente reocorrente. No ponto no tempo final três dias depois da dosagem, a hemólise foi de cerca de 70 % do controle (Figura 16B). Estes dados claramente demonstram a absorção de Z06175a-GS-ABD094 dentro da circulação sistêmica a seguir da administração intratraqueal e que a molécula funcionalmente inibe a hemólise.
Exemplo 12: Estudos de farmacocinética de variante Z que liga C5 em olho de coelho a seguir da administração tópica e intravítrea Materiais e métodos
[0262] Coelho na fase em vida: As farmacocinéticas de uma variante Z (Z06175a, SEQ ID NO: 753 seguida pela GS (Figura 4, construção 1)) foi estudado em olho de coelho a seguir da administração intra-vítrea.
[0263] O estudo na fase em vida e dissecação dos olhos de animais dosados (coelhos pigmentado, 2 a 2,5 kg) foi realizada na Iris Pharma, La Gaude, França (www.iris-pharma.com). Os animais foram alojados individualmente a 20 ± 2 °C a 55 ± 10 % de umidade relativa com acesso a alimento e água ad lib.
[0264] Os animais foram divididos em três grupos: 1) administração intravítrea (50 μl em cada olho, n = 3, seis olhos no total) seguido pela dissecação e amostragem de soro depois de um dia, 2) administração (50 μl em cada olho, n = 3) seguido pela dissecação e amostragem de soro depois de quatro dias e 3) animais não tratados (n = 5).
[0265] Quatro compartimentos oculares distintos foram dissecados (humor aquoso, vítreo, neuro-retina e RPE-coróide) e imediatamente congelados a -80 °C. A formulação de medicamento administrado (20,2 mg/ml em 10 mM de tampão de fosfato, 145 mM de NaCl, pH 7,4) e a análise de medicamento em vários compartimentos oculares foram realizadas “em casa”.
[0266] Análise de variante Z em compartimentos oculares dissecados: Compartimentos oculares dissecados foram enviados em gelo seco e armazenados a - 80 °C até a análise. As amostras de retina e coróide foram descongeladas em 10 vezes (volume/peso) de PBS que contém 1 % de albumina sérica humana em tubos Lysing Matrix D (MP Biomedical) que contém pérolas de cerâmica e agitados na velocidade de 4 por 2 x 20 s em um homogeneizador Savant Bio 101. O homogenado foi removido das pérolas usando uma pipeta e transferido para um tubo Eppendorf de 1,5 ml e centrifugado a 900 rpm por dez minutos. As amostras de humor aquoso e vítreo foram tratadas do mesmo modo como a retina e o coróide com a exceção de que nenhuma homogeneização foi necesária. As amostras vítreas dos grupos um e dois foram diluídas 10 vezes ainda no mesmo tampão como acima. Cinco padrões foram preparados em PBS com HSA (35,8 μM, 3,58 μM, 358 nM, 35,8 nM e 17,9 nM). Subsequentemente, padrões e amostras foram submetidos à digestão com pepsina e a análise da concentração da variante Z em extratos de tecido foi determinada usando o método LC/LC/MS/MS descrito no Exemplo 8.
Resultados
[0267] As concentrações da variante Z depois da administração intravítrea foram altas em todos os compartimentos depois de um dia (6 a 200 μM) e, surpreendentemente, permaneceram altas 4 dias após a administração (1,5 a 78 μM). Em particular, a concentração da molécula Z no vítreo variou de 118 a 201 μM (média 161 μM, n = 6 olhos) um dia depois da injeção e permaneceu de 26 a 78 μM (média 46 μM, n = 6) quatro dias após a injeção, que aponta em um T1/2de vários dias. Parece haver uma relação inversa entre tamanho e eliminação de medicamentos depois da injeção intravítreo em olho de coelho descrito pelos exemplos que seguem; Moxifloxacina (PM < 0,35 kDa, T1/2 = 1,72 h, Mohan et al. Trans Am Ophthalmol Soc 2005, 103: 76-83), ESBA105 (PM = 26 kDa, T1/2 = 25 h, Ottiger et al. Investigative Ophthalmology & Visual Science 2009, 50: 779-786) e Ranibizumab (PM = 48 kDa, T1/2 = 2,88 dias, Bakri et al. American Academy of Ophthalmology 2007, 114: 21792182). A variante Z testada aqui teve um peso molecular de 7,0 kDa, sugerindo que a eliminação da molécula Z foi mais lenta do que o que seria esperado para tal molécula pequena in vítreo.

Claims (24)

1. Polipeptídeo de ligação de C5, caracterizado pelo fato de que compreende um motivo de ligação de C5, BM, motivo este que consiste de uma sequência de aminoácido EX2X3X4A X6X7EID X11LPNL X16X17X18QW X21AFIX25 X26LX28D, em que, independentemente um do outro, X2 é selecionado de H, Q, S, T e V; X3 é selecionado de I, L, M e V; X4 é selecionado de A, D, E, H, K, L, N, Q, R, S, T e Y; X6 é selecionado de N e W; X7 é selecionado de A, D, E, H, N, Q, R, S e T; X11 é selecionado de A, E, G, H, K, L, Q, R, S, T e Y; X16 é selecionado de N e T; X17 é selecionado de I, L e V; X18 é selecionado de A, D, E, H, K, N, Q, R, S e T; X21 é selecionado de I, L e V; X25 é selecionado de D, E, G, H, N, S e T; X26 é selecionado de K e S; X28 é selecionado de A, D, E, H, N, Q, S, T e Y; em que dito motivo de ligação de C5 forma parte de um domínio de proteína de feixe de três hélices, em que o polipeptídeo liga-se a C5 humano, rato e camundongo.
2. Polipeptídeo de ligação de C5 de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o aminoácido satisfaz pelo menos quatro das oito condições de I a VIII que seguem: I. X2 é V; II. X3 é selecionado de I e L; III. X6 é W; IV. X7 é selecionado de D e N; V. X17 é selecionado de I e L; VI. X21 é L; VII. X25 é N; VIII. X28 é D.
3. Polipeptídeo de ligação de C5 de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácido é selecionada de qualquer uma das SEQ ID NO: 1 a 248.
4. Polipeptídeo de ligação de C5 de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácido é selecionada de qualquer uma das SEQ ID NO: 1 a 12, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23 a 24, SEQ ID NO: 26 a 28, SEQ ID NO: 32 a 35, SEQ ID NO: 38 a 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 56 a 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 78 a 79, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 215 e SEQ ID NO: 243.
5. Polipeptídeo de ligação de C5 de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácido é selecionada de qualquer uma das SEQ ID NO: 1 a 12.
6. Polipeptídeo de ligação de C5 de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácido é SEQ ID NO: 1.
7. Polipeptídeo de ligação de C5 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácido: K-[BM]-DPSQS XaXbLLXc EAKKL NDXdQ; em que [BM] é um motivo de ligação de C5 como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8; Xa é selecionado de A e S; Xb é selecionado de N e E; Xc é selecionado de A, S e C; Xd é selecionado de A e S.
8. Polipeptídeo de ligação de C5 de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácido é selecionada de qualquer uma das SEQ ID NO: 249 a 496.
9. Polipeptídeo de ligação de C5 de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácido é selecionada de qualquer uma das SEQ ID NO: 249 a 260, SEQ ID NO: 268, SEQ ID NO: 271 a 272, SEQ ID NO: 274 a 276, SEQ ID NO: 280 a 283, SEQ ID NO: 286 a 287, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 304 a 305, SEQ ID NO: 307, SEQ ID NO: 314, SEQ ID NO: 326 a 327, SEQ ID NO: 335, SEQ ID NO: 340, SEQ ID NO: 354, SEQ ID NO: 358, SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 389, SEQ ID NO: 399, SEQ ID NO: 409, SEQ ID NO: 414, SEQ ID NO: 435, SEQ ID NO: 445, SEQ ID NO: 451, SEQ ID NO: 453, SEQ ID NO: 463 e SEQ ID NO: 491.
10. Polipeptídeo de ligação de C5 de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácido é selecionada de qualquer uma das SEQ ID NO: 249 a 260.
11. Polipeptídeo de ligação de C5 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácido é selecionada de qualquer uma das SEQ ID NO: 497 a 757.
12. Polipeptídeo de ligação de C5 de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácido é selecionada de qualquer uma das SEQ ID NO: 497 a 508, SEQ ID NO: 516, SEQ ID NO: 519 a 520, SEQ ID NO: 522 a 524, SEQ ID NO: 528 a 531, SEQ ID NO: 534 a 535, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 542, SEQ ID NO: 545, SEQ ID NO: 552 a 553, SEQ ID NO: 555, SEQ ID NO: 562, SEQ ID NO: 574 a 575, SEQ ID NO: 583, SEQ ID NO: 588, SEQ ID NO: 602, SEQ ID NO: 606, SEQ ID NO: 615, SEQ ID NO: 621, SEQ ID NO: 637, SEQ ID NO: 647, SEQ ID NO: 657, SEQ ID NO: 662, SEQ ID NO: 683, SEQ ID NO: 693, SEQ ID NO: 699, SEQ ID NO: 701, SEQ ID NO: 711, SEQ ID NO: 739 e SEQ ID NO: 746 a 757.
13. Polipeptídeo de ligação de C5 de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácido é selecionada de qualquer uma das SEQ ID NO: 497 a 508 e SEQ ID NO: 746 a 757.
14. Polipeptídeo de ligação de C5 de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácido é selecionada de qualquer uma das SEQ ID NO: 497, SEQ ID NO: 498, SEQ ID NO: 499, SEQ ID NO: 500, SEQ ID NO: 501, SEQ ID NO: 746, SEQ ID NO: 747 SEQ ID NO: 748, SEQ ID NO: 750 e SEQ ID NO: 753.
15. Polipeptídeo de ligação de C5 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que inibe a clivagem de C5.
16. Polipeptídeo de ligação de C5 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de ligação de C5 liga-se a C5 tal que o valor KD da interação é no máximo 1 x 10-6 M, tal como no máximo 1 x 10-7 M, tal como no máximo 1 x 10-8 M, tal como no máximo 1 x 10-9 M.
17. Polipeptídeo de ligação de C5 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que compreende ainda aminoácidos de terminal C e/ou terminal N que melhora a produção, purificação, estabilização in vivo ou in vitro, ligação, ou detecção do polipeptídeo.
18. Polipeptídeo de ligação de C5 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17 na forma multimérica, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos duas unidades monoméricas de polipeptídeo de ligação de C5, as sequências de aminoácido das quais podem ser as mesmas ou diferentes.
19. Composto de ligação de C5, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um polipeptídeo de ligação de C5 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18; pelo menos um domínio de ligação de albumina da proteína G estreptocócica, e pelo menos uma porção de ligação para ligar o dito pelo menos um domínio ou derivado do mesmo ao terminal C ou N do dito pelo menos um polipeptídeo de ligação de C5.
20. Composto de ligação de C5 de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que tem uma estrutura selecionada de [CBP1]-[L1]-[ALBD]; [CBP1]-[CBP2]-[L1]-[ALBD]; [CBP1]-[L1]-[ALBD]-[L2]-[CBP2]; [ALBD]-[L1]-[CBP1]; [ALBD]-[L1]- [CBP1]-[CBP2]; [CBP1]-[L1]- [CBP2]-[L2]-[ALBD]; e [ALBD]-[L1]- [CBP1]- [L2]- [CBP2] em que, independentemente um do outro, [CBP1] e [CBP2] são polipeptídeos de ligação de C5 que podem ser o mesmo ou diferente; [L1] e [L2] são porções de ligação que podem ser as mesmas ou diferentes; e [ALBD] é um domínio de ligação de albumina da proteína G estreptocócica, ou derivado da mesma.
21. Composto de ligação de C5 de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a porção de ligação é selecionada de G, GS; [G2S]n; [G3S]n; [G4S]n; GS[G4S]n, em que n é de 0 a 7; [S2G]m; [S3G]m ;[S4G]m; em que m é de 0 a 7, e VDGS.
22. Composto de ligação de C5 de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 21, caracterizado pelo fato de que o dito domínio de ligação de albumina é como apresentado na SEQ ID NO: 759.
23. Composto de ligação de C5 de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 22, caracterizado pelo fato de que cada um dos ditos polipeptídeos de ligação de C5 é independentemente selecionado de um polipeptídeo tal como definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 14.
24. Combinação, caracterizada pelo fato de que é de um polipeptídeo de ligação de C5 tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20 ou um composto de ligação de C5 tal como definido em qualquer uma das reivindicações 19 a 23 com um agente terapêutico.
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Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 19/02/2013, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF, QUE DETERMINA A ALTERACAO DO PRAZO DE CONCESSAO.