TW200848076A - C5 antigens and uses thereof - Google Patents
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Description
200848076 九、發明說明: 【先前技術】 、頁斑退化為主要見於老年人中之醫學病狀,#中眼睛内 襯之中心(稱為視網膜之黃斑區域)遭受減薄、萎縮及在某 些:況下出血。此可引起中心視力喪失,其必然導致不能 看清精微細節’不能閱讀或不能辨識面容。新脈絡臈血管 形成之發病機制尚不甚瞭冑,但據信諸如#炎、局部缺血 及血官生成因子之區域性產生的因素為重要的。 已判定補體系統i自質之基因與個人發展黃斑退化之風 險密切相關。補體系統為抵抗微生物感染之先天免疫性的 關鍵組份且包含通常以非活性狀態存在於血清中的蛋白質 群組。此等蛋白質以三種活化途徑來組織:經典途徑、凝 集素途徑及替代途徑。微生物表面上之分子可活化此等途 裎,從而導致形成稱為C3-轉化酶之蛋白酶複合物。經典 途徑為鈣/鎂依賴性級聯反應,其通常由抗原抗體複合物 之形成而活化。其亦可以與抗體無關的方式藉由與配位體 複合之c-反應性蛋白質之結合及包括革蘭氏陰性細菌之許 多病原體而活化。替代途徑為鎂依賴性級聯反應,其藉由 C3在某些易感表面(例如酵母及細菌之細胞壁多醣及某些 生物聚合物材料)上之沈積及活化而活化。 替代途徑參與經典途徑及凝集素途徑之活性的擴增。補 體途徑之活化產生補體蛋白質之生物學活性片段(例如 C3a、CMa及C5a過敏毒素及C5b_9攻膜複合物(MAC)),其 經由牽涉白血球趨化性,活化巨噬細胞、嗜中性白血球、 129562.doc 200848076 血小板、肥大細胞及内皮細胞,增加血管通透性,細胞溶 解及組織損傷而介導發炎性反應。 補體組份C5為在補體級聯反應中凝集素途徑、經典途徑 及替代途徑所共有之最終途徑之主要組份。替代及經典途 徑之C5轉化酶使C5裂解,從而產生C5b及C5a片段。及 C5b皆為前發炎性分子。C5a為強力過敏毒素。結合 C5a 受體(C5aR)且刺激諸如 TNF-a、IL_ip、之前 發炎性細胞激素之合成及其自人類白血球中之釋放。 充當亦稱為末端補體複合物或攻膜複合物(mac)之^卜 9(C5b、C6、C7、C8及C9)之組裝的成核位點,該複合物 穿透細胞膜,從而形成孔隙,該複合物在亞溶解濃度下可 造成前發炎性細胞活化,而在溶解濃度下其導致細胞死 亡。降低C5b-9(MAC)之形成及(^化之產生可能為抑制造成 AMD之發乂性反應所需要。抑制由替代及經典途徑之^$ 轉化酶所催化之C5之裂解對於AMD之治療性治療可為關 鍵性的。 儘管當前存在治療與經典或替代組份途徑相關之疾病及 病症(尤其AMD)之治療選擇方案,仍存在對於尋求導致有 效且良好耐受之治療的特異性標靶的需要。 【發明内容】 本發明係關於包括選自由SEQ ID 1β6組成之群之序列的 C5蛋白質、其片段及製造或使用該等蛋白質之方法。本發 月亦係關於包含C5聚核苷酸及多肽之載體及重組宿主細 胞本發明之另一態樣為提供用於識別調節C5補體組份活 129562.doc 200848076 性之測試劑及用於 、口日另j C5抗原之結合搭配物的。 明之經分離C5| 6⑽ 本發 M , 貝之效用係基於發現C5之特異性抗 決疋基涉及與補體 原 相關之生物活性。之調…(具體而言,黃斑退化) 、C5蛋白質或其片段作為免疫原以產生結合分 子的用該等結合分子與選自由SEQ : C5的至少一個杆店、ι 、且风 < 鮮之 ^ ^几μ,、疋基結合,以預防、治療及/或延緩 涉及補體輕料之調節w病或病症。u 在”他心樣中’本發明提供抑制替代補 種組份的結合分早 „ ^ ν ~ 防、户療及… 包涵製造或使用該等結合分子以預 V广緩諸如amd之眼睛疾病或病症的方法。 广,其他態樣中’本發明提供-種治療或預防眼睛疾 病或病症或延緩1、虑 、 Μ兮 ,、絲的方法,該方法包含投與有效量之 机體,該抗體盥. y /、5之—或多個抗原決定基特異性地結合, :能:制需要該治療之個體之補體途徑系統中的C5蛋白質 二療方t :之3恕樣中’提供—種用於治療性或預防性 =方法中之醫藥組合物,該組合物包含補體U功能 白貝抑制劑、C5b與C6社人之|厶所 w拉心 、口 "之蛋白貝抑制劑或其醫藥學上 又之鹽以及其一或多種醫蘸 劑。 X夕檀w柰學上可接受之稀釋劑或載 本發明另外提供能夠抑制替 诰供、、Λ # 制$代補體途徑之結合分子在製 、余、眼目月疾病或病症或延緩其病程用之藥物中的用 …4白質能夠抑制C5蛋白質功能或霞複合物之產 129562.doc 200848076 生
C c; 本發明亦提供識別試樣中之⑽原決定基或編竭其之 馱的方法,其係藉由使該試樣與特異性地結合該抗原決6 基或編碼該多肽(例如抗體)之核酸的結合分子接觸且= 稷合物形成(若存在)來識別。亦提供識別調節C5蛋白質之 活性的化合物或結合分子的方法,其係藉由使C5抗原= 2與該化合物接觸且判扣蛋白質活性是否被改變來 在另-態樣中’本發明提供—種判定個體是否存在與補 體途徑調節異常相關之病症或其素質的m包含提供 獲自該個體之試樣且量測個體試樣中。5蛋白質之量的步 驟°隨後將個體試樣中之特定蛋白質或抑制之量與對照試 樣中之彼蛋白質或抑制之量相比較。對照試 個體獲取,、亦即具有類似年齡、性別或其他—般條件但不己 疑似心有補體途徑相關病狀的個體。或者,對照試樣可在 當該個體不疑似患有與補體途徑調節異常相關之病狀時自 該個體獲取。在某些態樣中’所關注之化合物或結合分子 使用如本文中描述之結合分子、尤其抗體來偵測。 在本毛月之$恶樣中,提供一種結合血清試樣中之〇 蛋白質的篩選方法’其包含使試樣中之抗體與已知量之本 發明之抗體(抗C5)或其功能等效變異體或片段之間競爭性 結合且量測已知抗體之量的步驟。 在另匕、樣中,本發明係關於一種偵測與補體途徑調節 異常相關之病症的診斷套組’其包含在合適封裝中之本發 129562.doc 200848076
日月之化合物或結合分子及載劑。該套組較佳含有使用抗體 以偵測C5抗原決定基之存在的用法說明書。較佳地,該载 劑為醫藥學上可接受者。 X 【實施方式】 如本文中所用,,化合物I,或"本發明之化合物”意謂包括 狀、寡核苦酸、肽模擬物、同源物、類似物及其修飾或衍 生形式的蛋白質。本發明之化合物較佳包括選自由SEQID 胸2、4及6組成之群之核酸序列、其片段及衍生物。本發 明亦包括突變或變異序列,其驗基中之任—者可自相應 SEQ ID No 2 ' 4及6變化,同時仍編碼蛋白質、較佳選自 由SEQ ID No 1、3及5組成之群之抗原性蛋白質。 "結合分子,,意謂與本發明之化合物、較佳選自卿⑴ No W之化合物結合的抗體、有機分子、包括敗、寡核普 酸、肽模擬物、同源物、類似物及其修飾或衍生形式的蛋 白質。 本發明之化合物及結合分子之衍生物或類似物包括(但 ;)I 3在相同大小之核酸或胺基酸序列上或當與比 對序列相比較(其中比對藉由在此項技術中已知之電腦同 源!生私式來進行)時在各種實施例中以至少約·、襲或 95% -致性(較佳_致性為8()·95%)與本文中揭示之核酸或 蛋白質大體上同源之區域的分子’或其編石馬核酸能夠在嚴 格、中4嚴格或嚴格性較低之條件下與編碼上述蛋白質之 序歹】之互補序列雜交的分子(Ausubel等人,丨987)。 本毛月提仏C5蛋白質之抗原性抗原決定基、與線性或非 129562.doc -10- 200848076 線性抗原決定基特異性地結合之結合分子,製造及使用該 等抗原性抗原決定基及結合分子之方法。本發明者最先描 述具有選自SEQ ID No 1-6之序列的C5之抗原決定基,其 可經凋節用以預防、治療或改善與補體途徑調節異常相關 之病症、較佳眼睛疾病及病症。 可由本發明治療或預防之某些眼睛疾病及病症包含眼睛 之至)一部分的發炎及/或新血管生成。可使用本文中提 供之方法治療或預防之某些非限制性疾病及病症包括黃斑 退化’糖尿病性眼睛疾病及病症,眼睛水腫,缺血性視網 膜病,,視神經炎,囊樣黃斑水腫,視網膜疾病及病症,病 理ί·生近視’早產兒視網膜病,血管化、排斥或其他方式之 角膜發炎(在進行或不進行角膜手術或移植之情況下),乾 燥性角膜結膜炎或乾眼病。在某些態樣中,適於由本發明 Ο 二:t::結合分子及方法治療或預防的較佳眼睛疾病及 广丙二彼專選自年齡相關之黃斑退化、糖尿病性視網膜 病、糖尿病性黃斑水腫及早產兒視網膜病者。ί他潛在地 :療!:法之眼睛疾病包括内部及外部眼睛發炎性 病膜炎、輩膜炎、輩膜表層炎、結膜炎、角 膜火、眶蜂窩織炎、眼睛肌炎、 、 瞼發炎。 ”大腺眼眶病、淚腺或眼 如本_請案中所定義之,,眼 於胸病性眼睛疾病或病症,眼症,,包含(但不限 成之缺企性視網臈病,視神經炎 具有新血官生 視網膜疾病或病症(諸 理水腫(CME), f病理性近視、早產兒視 129562.doc 200848076 網膜病(ROP)),血管化、排斥或其他方式之角膜發炎(在 進行或不進行角膜手術或移植之情況下),乾燥性角膜結 膜炎或乾眼病。其他潛在地順應該治療性方法之眼睛疾病 包括内部及外部眼睛發炎性病症,諸如葡萄膜炎、鞏膜 炎、鞏膜表層炎、結膜炎、角膜炎、眶蜂窩織炎、眼睛肌 炎、甲狀腺眼眶病、淚腺或眼瞼發炎。 如本申請案中所定義之”糖尿病性眼睛疾病或病症”包含 (但不限於)糖尿病性視網膜病(DR)、糖尿病性黃斑水腫 (DME)、增生性糖尿病性視網膜病(PDR)。 本發明之特定抗原性抗原決定基由SEQ ID No 1至6及其 互補序列來編碼。 特定抗原性抗原決定基具有與SEQ ID 1、3及6至少 85%、較佳地90%、更佳地95%—致的胺基酸序列。 三種表面暴露之抗原性抗原決定基在C5蛋白質上得以識 別。該等抗原決定基係基於三個包括以下各者之線性胺基 酸序列(兩者在補體組份C5之α鏈上且一者在β鏈上)作為抗 原性結合位點: 1) C5 α 鏈上之包含 CVNNDETCEQ(SEQ ID No. 1)之胺基 酸序歹,其由核苷酸序列TGCGTTAATAATGATGAAACCT GTGAGCAG(SEQ ID NO. 2)編碼; 2) C5 α 鏈上之包含 QDIEASHYRGYGNSD(SEQ ID No 3) 之胺基酸序列,其由核苷酸序列CAGGATATTGAAGC ATCCCACTACAGAGGCTACGGAAACTCTGAT(SEQ ID No, 4)編碼; 129562.doc -12- 200848076
3)C5 P鏈上之包含DLKDDQKEM(SEQ ID No 5)之胺基酸 苦酸序歹,J ACTTAAAAGATGATCAAAAA gaAAtg(SEQIDn〇 6)編碼。 聚核苷酸及多肽 本發明之經分離多肽及聚核苷酸可由此項技術中已知之 任何合適方法產生。該等方法之範圍為直接蛋白質合成方 去至構建、、扁碼經分離之多肽序列的序列及在合適轉型 宿主中表現彼等序列。 可使用活體外蛋白質合成之標準方法將標準方法應用於 合成所關注之經分離多肽序列。 在重組方法之一態樣中,DNA序列藉由分離或合成編碼 所關庄之野生型蛋白質之DNA序列來構建。視情況地,該
質。例如,跨膜域可缺失, “曰冗罕父缺乏特定部分的蛋白 由此建置在其初始狀態下經膜
構建編碼所關注之多肽之DNA序列的另一
129562.doc 13 200848076 抗原決定基之部分 .乂 的右干較小募核苷酸,且隨後將JL拯 合。個別募核苷酸通當八古田 一接 ^ ^ 、吊5有用於互補組裝之5,或3, _忝 物。完整胺基酸皮α m 〜丈 -序歹j可用以構建反轉譯之基因。 衣(藉由合成、聚合酶鏈反應、定點誘變或藉由 任何其他方法),目丨t /古# ▲ )則使、、扁碼所關注之特定經分離多肽的突 欠DNA序列插人表現載體中^可操作地與適於在所需宿主 蛋白貝的表現控制序列連接。適當組裝可由核苷酸 疋序、限制定位及在合適宿主中表現生物學活性多肽來確 ,。如:項技術中所熟知,為在宿主中獲得轉染基因之較 门表見畺基因必須可操作地與在由該載體轉型之所選表 現伯主中起作用之轉錄及轉譯表現控制序列連接。 表現控制序列及表現載體之選擇視相應宿主之選擇而 疋叮使用夕種表現宿主/載體組合。真核宿主之適用表 現載體包括例如包含獲自SV4〇、牛乳頭瘤病毒、反轉錄病 毒、腺病毒及巨細胞病毒之表現控制序列的載體。細菌性 宿主之適用表現載體包括已知細菌性質體,諸如獲自大腸 桿菌之質體,包括pCRI、pBR322、pMB9及其衍生物;更 寬宿主範圍之質體,諸如Ml 3及絲狀單鏈DNA噬菌體。較 佳大腸桿菌載體包括含有λ噬菌體pL啟動子之pL載體(美國 專利第4,874,702號)、含有T7聚合酶啟動子之PET載體及 pSP72載體。酵母細胞之適用表現載體例如包括2 g及著絲 點質體。 另外,在每一特異性表現載體内,可選擇各種位點以插 入此等DNA序列。此等位點通常由將其剪切之限制性内切 129562.doc 14 200848076 核酸酶來指定。其由熟習此項技術者很好地辨識。應瞭解 適用於本發明中之給定表現載體不需要具有限制性内切核 酸酶位點以插入所選DNA片段。實情為,載體可藉由替代 方法由該片段來接合。 表現載體及經選擇用於插入所選DNA片段且與表現控制 序列之可操作地連接之位點由諸如以下之多種因素來確 定·易受特定限制酶影響之位點之數目、多肽之大小、多 肽以蛋白水解方式降解之容易程度及其類似因素。給定 DNA之載體及插入位點之選擇藉由權衡此等因素來確定。 為提供本發明之重組構築體之適當轉錄,可較佳地將合 適啟動子/增強子序列併入重組載體中,其限制條件為啟 動子/表現控制序列能夠驅動編碼所關注多肽的核苷酸序 歹J之轉錄。夕種表現控制序列中之任一者可用於此等載體 中。該等適用表現控制序列包括與上述表現載體之結構基 因相關之表現控制序列。適用表現控制序列之實例包括例 如SV40或腺病毒之早期及晚期啟動子、lac系統、〖卬系 統、TAC或TRC系統、例如pL之噬菌體人之主要操作子及 啟動子區域、fd鞘蛋白之控制區域、3_磷酸甘油酸激酶或 其他糖解酶之啟動子、例如Ph〇5之酸性磷酸酶之啟動子、 酵母α交配系統之啟動子及已知控制原核或真核細胞及其 病毒之基因之表現的其他序列,及其不同組合。許多所述 載體為可購得的。 任何口適俏主可用以大量產生本發明之經分離化合物, 包括細菌、真菌(包括酵母)、植物、昆蟲、哺乳動物或其 129562.doc 15 200848076 他合適動物細胞或細胞株,以及轉殖基因動物或植物。更 特定而言,此等宿主可包括熟知真核及原核宿主,諸如大 腸桿菌、假單胞菌、芽胞桿菌、鏈黴菌、真菌、酵母(例 :漢森酵母(—))之菌株;昆蟲細胞,諸如草地黏 蟲(SP〇d〇ptera firUgiperda)(SF9)及 HIGH πνΕ ;動物細 胞’諸如中國倉鼠卵巢細胞(CHO);小鼠細胞,諸如ns/〇 細胞;非洲綠猴細胞,cos 1 COS 7、BSC 1、BSC 40及
C BMT 1 ο ;及人類細胞;以及植物細胞。 可用以控制多肽在真核細胞中之表現的啟動子包括(但 不限於)SV40早期啟動子區域、含於勞斯(R〇us)肉瘤病毒 之3’長末端重複序列中之啟動子、轉料激酶啟動子、 金屬硫蛋白基因之調節序列。 倘若多肽表現於植物中,應使用包含胭脂驗合成酶啟動 子區域或花椰菜嵌紋病毒35S RNA啟動子及光合成酶核酮 糖磷酸氫鹽-羧化酶之啟動子的植物表現載體。 倘若多肽表現於酵母或其他真菌中,應選擇諸如^^丨* 啟動子、ADC(醇脫氫酶)啟動子、PGK(磷酸甘油激酶)啟 動子、鹼性鱗酸酶啟動子之啟動子元件。 倘若多肽表現於轉殖基因動物中,可使用展現組織特異 性且已用於轉殖基因動物中之以下動物轉錄控制區域:在 胰腺細胞中具有活性之彈性蛋白酶1基因控制區域;在胰 腺細胞中具有活性之啟動子之胰島素基因增強子;在淋巴 樣細胞中具有活性之免疫球蛋白基因增強子或啟動子;巨 細胞病毒早期啟動子及增強子區域;在睾丸、乳房、淋巴 129562.doc •16- 200848076 及肥大細胞中具有活性之小鼠 、孔脲腫瘤病t控制區域丨在 肝臟中具有活性之白蛋白其田讼 曰贪白基因控制區域;在肝臟中具有活 性之(X胎蛋白基因控制區域 ,在肝臟中具有活性之α_抗胰 蛋白酶基因控制區域;扃辱# 和L A,在月鈿細胞中具有活性之卜球蛋白 基因控制區域、在大腦中之寡樹突神經膠f細胞中具有活 性之髓磷脂鹼性蛋白基因控制區域;在骨骼肌中具有活性 之肌凝蛋白輕鏈-2基因控制區域;及在下丘腦中具有活性
之促性腺釋放激素基因控制區域。 DNA序歹,J與表現控制序列之可操作連接包括在職序列 上游之正確閱讀框架中提供轉譯起始信號。若所表現之特 定DNA序列不以甲硫胺酸開始,則起始信號將導致額外胺 基酸(甲硫胺酸)位於產物之N末端處。若疏水性部分與含 有N末端甲硫胺醯基之蛋白質連接,則蛋白質可直接用於 本發明之組合物中。然而’在此項技術中可利用自所表現 的具有N末端曱硫胺酸之多肽中移除N末端甲硫胺酸之方 法。例如,某些宿主及醱酵條件允許活體内移除大體上所 有N末端甲硫胺酸。 應瞭解並非所有載體及表現控制序列均同等良好地起作 用以表現給定之經分離多肽。亦非所有宿主均與相同表現 系統一起同等良好地起作用。然而,熟習此項技術者可無 需進行過度實驗之情況下在此等載體、表現控制系統及宿 主之中進行選擇。 此等聚核苷酸構築體於給定表現載體中之成功併入可由 三種通用方法來識別:(a)DNA-DNA雜交,(b)”標記”基因 129562.doc -17- 200848076 功月匕之存在與否,及⑷所插人序列之表現。在第—種方法 中,插入表現載體中之基因之存在可藉由使用包含盘所插 入,基因同源之序列的探針來進行DNA_DNA雜交而谓測。 在弟二種方法中,重組載體/宿主系統可基於由在載體中 插入外來基因所引起之某些”標記”基因功能(例如胸芽激酶 主對於諸如0418之抗生素的抗性、轉型表型、桿狀病 :中之包涵體形成等)之存在與否來識別及選擇。例如, 若插入聚核芽酸以便甲斷載體之標記基因序列,則含有插 物之重、、且體可藉由缺乏標記基因功能來識別。在第三種 中重、、且表現載體可藉由檢定重組載體所表現之外來 基因產物而識別。該等檢定可基於例如生物檢定系統中之 基因產物之物理或功能性質。 編碼經修飾之蛋白質治療劑之重組核酸分子可由在此項 技術中已知之任何方法獲得(Manhis等人,1982, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.)或自公開可用 之純系獲得。修飾包含(但不限於)缺失、插入、點突變、 與其他多肽融合。在本發明之某些實施例卜可建置重組 載體系統以將編碼所關注治療劑的序列容納於具有合成鉸 鏈區之正確閱讀框架中。額外地,可能需要包括作為重組 載體系統之邓刀的核酸,其與包括RNa裂解/多聚腺嘌呤 位點及下游序列的免疫球蛋白基因之3,側接區域對應。此 外’可能需要將經修飾之蛋白質治療劑上游之信號序列工 程化以有助於自經重組载體轉型之細胞分泌蛋白質治療 129562.doc 200848076 劑。當通常膜έ士人i & μ 以分泌的方式 联、、、口 口蛋白質以使其替代性地得 來修飾時’此舉尤其受關注。 由,轉:之宿主產生之蛋白質可根據任何合適方法來純 4等私準方法包括層析(例如離子交換 析及尺寸訂定管杈屏把、^ 親和層 才層析)、離心、差示溶解或蛋白質純 之任何其他標準技術。對於免疫親和層析,所關注之蛋 質:藉由使其與包含針對該蛋白質或交又反應性蛋白質而 培月且固定至穩態支撐物之抗體的親和管柱結合來分離以 給出大體上純之蛋白f。術語,,大體上純,,意謂蛋白質不含 與其天然相關之雜質。大體上純可藉由電泳由單一條帶: 證明。經分離之蛋白質亦可使用諸如蛋白水解、核磁共振 及X-射線晶體學之技術而在物理上表徵。 反義、核酶、三重螺旋RNA干擾及適體技術 本發明之另一態樣係關於化合物及/或經修飾之化合物 作為治療劑之用途。在某一態樣中,核酸經由基因轉移載 體在細胞内部產生。在其他態樣中,將此等核酸直接投與 甫乳動物個體活體内,包括例如如下所述之四種不同技 術·反義、核酶、RNA干擾及適體。 本發明之反義RNA及DNA、核酶及三重螺旋分子可藉由 此項技術中已知用於合成DNA及RNA分子之任何方法來製 備。此等方法包括在此項技術中熟知之化學合成寡脫氧核 糖核苷酸及募核糠核苷酸之技術,例如固相亞磷醯胺化學 合成。或者,RNA分子可由編碼反義RNA分子之DNA序列 之活體外及活體内轉錄來產生。該等DNA序列可併入多種 129562.doc -19- 200848076 。併有諸如T7或SP6聚合酶啟動子之合適RNA聚合酶啟動 子的載體中。或者,可將視所用啟動子而定地原構性地或 誘導ϋ地合成反義RNA之反義eDNA構築體穩定地引入細 胞株中。 此外,可引人各種對核酸分子之熟知修飾作為增加細胞 内穩定性及半衰期之方法。可能修飾包括(但不限於)將核 糖核普酸或脫氧核糖核普酸之側接序列添加至分子之5,及/
或3’末端或在募脫氧核糖核皆酸主鏈内使料代填酸醋或 2’〇-甲基而非磷酸二酯酶鍵聯。 反義 本文中所用’ &義”療法係指投與或原位產生寡核苷 酸分子或其衍生物,其在細胞條件下特異性地與編碼^之 -或多個抗原決定基的細胞mRNAw或染色體組屬雜交 (例如結合)以便例如藉由抑制C5蛋白質之轉錄及/或轉譯來 抑制C5之表現或活化。該結合可藉由習知鹼基對互補,或 例如在與DNA雙鏈體結合之情況下,經由雙螺旋之大溝中 :二!:1目互作用進行。通常’"反義”療法係指通常用於 之一系列技術,1包括依賴與寡核《序列之 特異性結合的任何療法。 告㈣_可^如表現質體之形式來輸送, :二二體在細胞中轉錄時,其產生與編奶抗原性蛋白 :心:Γ:Α之序列互補的RNA。或者,反義構築體為 养核苷S文採針’其係離體產生且 與C5聚核芽酸之mRNAee九 寻"引入細胞中時藉由 夂之^财及/或染色體組序列雜交而引起抑制 129562.doc -20- 200848076 表現。該等寡核苷酸探針較佳為對例如核酸外切酶及/或 核酸内切酶之内源性核酸酶具有抗性的經修飾之寡核苷 酸,且因此其在活體内為穩定的。適用作反義募核苷酸之 例示性核酸分子為DNA之胺基磷酸酯、硫代磷酸酯及甲基 膦酸酯類似物(亦參見美國專利第5,176,996號;第5,264,564 號及弟5,256,775號)。關於反義DNA,由選自SEQ ID 2、4 或6之序列衍生之募脫氧核糖核苷酸為較佳者。 反義方法涉及設計與編碼C5蛋白質之抗原決定基之 mRNA互補的寡核苷酸(DNA或RNA)。反義寡核苷酸將與 mRNA轉錄物結合且防止轉譯。絕對互補雖然較佳,但是 並非必需。在雙鏈反義核酸之情況下,可由此測試雙鏈體 DNA之單鏈,或可檢定三鏈體形成。雜交能力將取決於互 補之程度及反義核酸之長度。通常,雜交核酸越長,其可 含有之與RN A錯配之鹼基越多且仍形成穩定雙鏈體(或可 視情況形成三鏈體)。熟習此項技術者可藉由使用測定雜 交複合物之熔點的標準程序來確定容許錯配程度。 與mRNA之5,末端(例如直至且包括AUG起始密碼子之5, 未轉譯序列)互補的募核苷酸應在抑制轉譯方面最有效地 起作用。亦已展示與mRNA之3,未轉譯序列互補的序列在 抑制mRNA之轉譯方面有效。因此,與基因之5»或3,未轉譯 之非編碼區域互補的寡核苷酸可用於反義方法中以抑制彼 mRNA之轉譯。與mRNA之5,未轉譯區域互補的募核苦酸應 包括AUG起始密碼子之互補序列。與mRNA編碼區域互補 的反義秦核苷酸為有效性較小之轉譯抑制劑,但亦可根據 129562.doc -21 - 200848076 本發明來使用。無論是否經設計以與mRNA之5,、3,或編碼 區域雜交’反義核酸之長度應為至少六個核苷酸且較佳小 於約100個且更佳小於約5〇、25、17或10個核苷酸。 與標靶序列之選擇無關,較佳首先執行活體外研究以量 化反義募核苦酸抑制基因表現之能力。較佳地,此等研究 利用區分募核苷酸之反義基因抑制與非特異性生物效應的 對照。亦較佳地,此等研究將標靶RNA或蛋白質之含量與
内部對照RNA或蛋白質之含量加以比較。額外地,設想將 使用反義寡核苷酸獲得之結果與使用對照募核苷酸獲得之 彼等結果加以比較。較佳地,對照募核苷酸具有與測試寡 核皆酸大致相同之長度,且募核苦酸之核苦酸序列與反義 序列之差異不超過防止與標靶序列特異性雜交之必要限 制。 、寡核《可為單鏈或雙鏈的DNA或RNA或其礙合混合物 或何生物或經修飾之變體。募核苷酸可在鹼基部分、糖部 分或鱗酸_主鏈處經修❹例如改良分子穩定性、雜交 等。募核㈣可包括其他附屬基團,諸如肽(例如用於輕 :宿主細胞受體);或有助於橫穿細胞膜(參見PC 丁公開案 第W088/09810號)咬企聪M 立… 飞 細屏Ρ早(參見例如PCT公開案第 W089/10134號)運輸的劑·私_々 ” J,雜交觸發裂解劑或插入劑。為 此目的,募核苷酸可與另一人 刀子、、、口 a ,遠另一分子例如為 肽、雜交觸發交聯劑、iS私 — 運輪劑、雜交觸發裂解劑等。 反義券核苦酸可包含$小 々* 夕一個選自包括(但不限於)以下 各邛分之群的經修飾之鹼基 土口1刀· 5 -鼠尿嘴口定、5 _溴尿口密 129562.doc -22- 200848076 :胞5二尿㈣、—。定、次黃〜黃嘴吟、4-乙 曱基-2:广(竣基經基二乙基)尿嘧啶、5_羧基甲基胺基 核苷、5·麟甲基絲甲基尿錢、二氯㈣ 半乳糖Q料、崎、队異戊埽基“呤、 :Γ:二-甲基…。-二甲基“呤、”基腺, 二基鳥怜3-甲基崎、%甲基胞,定、队腺
二甲Γ基鳥嗓彳、5_甲基胺基甲基尿㈣、5·甲氧基 二土-2-硫尿嘧啶;p_D_甘露糖Q核#、5,_甲氧基羧基 Z尿Μ、5.甲氧基尿㈣、2_甲硫基抓異戊稀基腺 '下\、尿嘧啶-5-氧基乙酸⑺、wybut〇x〇sine、假尿嘧啶、 Q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基_2_硫尿嘧啶、2_硫尿嘧啶、 4=尿哺咬、5_甲基尿定、尿^定:氧基乙酸甲醋、尿 山疋5-氧基乙酸(v)、5 -甲基-2-硫尿口密咬、3_(3-胺基- 3-N -2_羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w,及2,6-二胺基嘌呤。 反義寡核苷酸亦可包含至少一個選自包括(但不限於)阿 拉伯糖、2·氟阿拉伯糖、木_糖及己_之群的經修飾之糖 部分。 反義寡核苷酸亦可含有中性類肽主鏈。該等分子稱為肽 核酸(PNA)寡聚物。PNA寡聚物之一優點為由於dna之中 性主鏈其能夠基本上與介質之離子強度無關地與互補DNA 結合。在另一實施例中,反義募核苦酸包含至少一個選自 由以下各物組成之群的經修飾之填酸酯主鏈:硫代鱗酸 酯、二硫代磷酸酯、硫代胺基磷酸酯、胺基磷酸酯、二胺 基磷酸酯、甲基膦酸酯、烷基磷酸三酯及甲縮醛或其類似 129562.doc -23- 200848076 物。 在另一態樣中,反義募核苷酸為變旋異構寡核苷酸。變 旋異構寡核苷酸與互補RNA形成特定雙鏈雜化物,其中與 常見單位相反’各鏈彼此平行延伸。寡核苷酸為2’_〇_甲基 核糖核苷酸或嵌合RNA-DNA類似物。 本發明之寡核苷酸可藉由此項技術中已知之標準方法, 例如藉由使用自動化DNA合成器(諸如可購自Biosearch, Applied Biosystems等)來合成。作為實例,硫代磷酸酯募 核芽酸可藉由此項技術中已知之方法合成,曱基膦酸酯寡 核苷酸可藉由使用可控孔度玻璃聚合物支撐物來製備。 雖然可使用與mRNA序列之編碼區域互補的反義核苷 酸’但是與經轉錄之未轉譯區域及包含起始甲硫胺酸之區 域互補的彼等者為最佳的。 可將反義分子輸送至活體内表現C5蛋白質之細胞。已開 發出用於將反義DNA或RNA輸送至細胞的許多方法,例如 可將反義分子直接注射至組織位點中,或可系統性地投與 經設計以乾向所需細胞的經修飾之反義分子(例如與特定 異性結合標靶細胞表面上所表現之受體或抗原之肽或抗體 連接的反義分子)。 然而,在某些情況下,可能難以達成足以抑制對於内源 性mRNA之轉譯作用的反義分子之細胞内濃度。因此,較 ;方法利用重組DNA構築體,其中將反義募核苷酸置於強 P〇l m或ρο1 η啟動子之控制下。使用該構築體來轉染患者 中之標靶細胞將導致轉錄足夠量之單鏈RNA,其將與内源 129562.doc -24- 200848076 I"生刺*月(hedgehog)#说轉導轉錄物形成互補鹼基對且藉此 防止轉譯。例如’可將載體引入活體内以使得其由細胞吸 ,且引導反義RNA之轉錄。只要該載體可經轉錄以產生所 而反義RNA ’則丨可保持游離型或變得與染色體整合。該 等載體可藉由此項技術中之重組驗技術方法標準來構 建載體可為用於在哺礼動物細胞中複製及表現的質體、 病毒或此項技術中已知之其他載體。編碼反義RNA之序列 之表現可藉由在哺乳動物、較佳人類細胞中起作用之此項 技術中已知之任何啟動子進行。料啟動子可為誘導性的 或原構性的。該等啟動子包括(但不限於)SV4〇早期啟動子 區域、含於勞斯肉瘤病毒之3,長末端重複序列中之啟動 子、疱疹胸苷激酶啟動子、金屬硫蛋白基因之調節序列 (Brinster等人,1982,Nature 296:3942)等。任何類型之質 體、黏質體、YAC或病毒載體均可用於製備可直接引入組 織位點中之重組DNA構築體。或者,可使用選擇性地感染 所需組織之病毒載體,在該情況下,投藥可藉由另一路徑 (例如系統性地)實現。 核酶 經設計以催化性地裂解C5 mRNA轉錄物之核酶分子亦可 用以防止mRNA之轉譯(參見例如1990年1 〇月4日公開之 PCT國際公開案WO 90/11364;美國專利第5,〇93,246號)。 雖然在定點識別序列處裂解mRNA之核酶可用於破壞特定 mRNA,但是較佳使用錘頭狀核酶。錘頭狀核酶在由與標 靶mRNA形成互補鹼基對之側接區域所限定之位置處裂解 129562.doc -25- 200848076 mRNA。唯一要求為標靶mRNA具有以下兩個鹼基之序 列:5,-UG-3,。 本發明之核酶亦包括RNA核糖核酸内切酶(在下文中, nCech型核酶π),諸如天然存在於嗜熱四膜蟲(Tetrahymena thermophila)中之者(稱為IVS或L-19 IVS RNA)且其已在國 際專利申睛案W0 88/04300中公開。Cech型核酶具有與標 靶RNA序列雜交而後發生標靶RNA之裂解的八鹼基對活性
Ο 位點。本發明包涵彼等鞋向八驗基對活性位點序列之 型核酶。 如在反義方法中,核酶可由經修飾之募核苷酸(例如用 於改良穩定性、靶向等)組成且應輸送至活體内表現〇蛋 白質之細胞。較佳輸送方法涉及使用在強原構性㈧丨ιπ* Ρ〇ΐ π啟動子之控制下”編碼”核酶之DNA構築體,以使得經 轉染之細胞將產生足夠數量之核酶以破壞所靶向之信使且 抑制轉譯。因為核酶不同於反義分子而具有催化性,所以 需要較低細胞内濃度以達成有效性。 三重螺旋形成 或者,内源性C5基因表現可藉由靶向與基因之調節區域 (亦即啟動子及/或增強子)互補的脫氧核糖核苦酸序列以形 成防止基因在體内㈣細胞中轉錄的三重螺旋結構來降 低。 付用於抑制轉 似吸力、于敉佳為單 的且由脫氧核糖核《組成。此等募核苦酸之驗基組成 將經由H〇〇gSteen鹼基配對規則促進三重螺旋形成,其通 129562.doc •26- 200848076 察需要大小相當之嘌呤或嘧啶段存在於雙鏈體之一個鏈 上。核苷酸序列可基於嘧啶,其將橫穿所得三重螺旋之三 個相關鏈產生TAT及CGC三聯體。富含嘧啶之分子提供與 又鏈體之單鏈之虽含嘌呤之區域的呈與彼鏈平行取向的鹼 基互補性。另外,可選擇例如含有一段G殘基的富含嘌呤 之核酸分子。此等分子將與富含GC對的DNA雙鏈體形成 一重螺旋,其中大多數嘌呤殘基位於標靶雙鏈體之單鏈 (' 上,橫穿三鏈體中之三個鏈產生CGC三聯體。 或者,可設為標靶以用於三重螺旋形成的潛在序列可藉 由建置所謂’’轉向”核酸分子來增加。轉向分子以交替5,_ 3、方式合成,以使得其與雙鏈體之第一個鏈且隨後 與另一鏈鹼基配對,從而消除對存在於雙鏈體之一個鏈上 之大小相當之嘌呤或嘧啶段的需要。 RNA干擾 R N A干擾(R N A i)似乎是使基因沉默之普遍存在的機制的 U 發現提出減少基因表現之替代新穎方法,其能夠克服以上 概述之其他方法之限制。短干擾RNA(siRNA)為RNAi之核 , 心。SlRNA之反義鏈由RNAi沉默複合物用來引導互補 niRNA分子之裂解,由此使相應基因之表現沉默。 • 藉由利用RNAi,本發明由此在方法及有效性方面皆不 同於其他基於核酸之策略(反義及核酶方法):(幻與反義策 略相比車乂 RNAi利用催化過程,亦即少量仙财能夠降低 標靶細胞内之標靶基因mRNA之濃度。因為反義基於化學 計量過程,所以在標靶細胞内需要濃度大得多之效應分 129562.doc -27- 200848076 子’亦即需要等於或大於内源性mRNA之濃度的濃度。由 此,因為RNAi為催化過程,所以較低量之效應分子(亦即 S1RNA)足以介導治療效應。⑻與核酶(其亦具有催化功能) 相比較,RNAi似乎是更靈活的策略,其允許乾向更多種 類之標靶序列且由此提供構築體設計之更多靈活性。此 外,因為熟習此項技術者可基KRNAi標靶基因之序列資 訊來設計RNAi構築體,所以RNAi構築體之設計為快速且 便利的。對於核酶,因為核酶在性質上更複雜,所以需要 更多試誤實驗及更複雜的設計演算法。最後,(勾因為 RNAi利用’日’遍存在的内源性細胞機構,所以RNAi與核酶 相比車父在活體内更有效。 因為RNAi不需要表現非内源性蛋白質(諸如人工轉錄因 子),由此降低非預料之免疫反應之風險,所以本發明亦 不同於基於蛋白質之策略。 總而言之,RNAi介導之基因表現之下調為具有優於現 有基因表現下調方法之明確優點的新穎機制。 RNAi構築體包含可特異性地阻斷標靶基因之表現的雙 鏈RNA。因此,RNAi構築體可藉由特異性地阻斷特定基 因之表現而充當拮抗劑。” RNA干擾,,或”RNAi,,為起初適用 於在植物及蠕蟲中觀察到的雙鏈RNA(dsRNA)以特異性及 後轉錄方式阻斷基因表現之現象的術語。在不受理論約束 之情況下,RNAi似乎涉及mRNA降解,然而,當前生物化 學機制為現行研究領域。儘管關於作用機制存在一些神秘 之處,但RNAi提供活體外或活體内抑制基因表現之適用 129562.doc -28· 200848076 方法。 如本文中所用,術語"dsRNA”係指siRNA分子或其他包 括雙鏈特徵且能在細胞中處理成siRNA之RNA分子,諸如 髮夾RNA部分。 術語’’功能喪失,,,當其對由本發明之RNAi方法抑制之基 因提及時,係指當與不存在RNAi構築體之表現量相比較 時基因之表現量減少。 如本文中所用,片語”介導RNAi”係指(指示)區別哪些 RNA由RNAi過程降解之能力,例如降解以序列特異性方 式而非由與序列無關的dsRNA反應(例如PKR反應)發生。 如本文中所用,術語” RNAi構築體,,為遍及本說明書使用 之通用術語,其包括小干擾RNA(siRNA)、髮夾RNA及其 他可在活體内裂解以形成siRNA之RNA物質。本文中之 RNAi構築體亦包括能夠產生在細胞中形成“以^^或髮夾 RNA之轉錄物及/或可在活體内產生siRNA之轉錄物的表現 載體(亦稱為RNAi表現載體)。 RNAi表現載體”(在本文中亦稱為’,編碼dsRNA之質體,,) 係指可複製之核酸構築體,其用以在表現構築體之細胞中 表現(轉錄)產生siRNA部分之RNA。該等载體包括轉錄單 位,該轉錄單位包含以下各物之組裝件⑴例如啟動子、操 作子或增強子之在基因表現中具有調節作用之遺傳元件, 其可操作地連接至(2)經轉錄以產生雙鏈RNA(在細胞中黏 接以形成siRNA或可處理成siRNA之單一髮夾⑽八的兩個 RNA部分)之”編碼”序列,及(3)適當轉錄起始及終止序 129562.doc -29- 200848076 列啟動子及其他调節元件之選擇通常根據預定宿主細胞 而k化。通常,用於重組DNA技術中之表現載體常常呈 貝體之形式,其係指在其載體形式下不與染色體結合之 環狀雙鏈DNA環。在本說明書中,因為質體為最常用形式 之載體,所以”質體,,及”載體,,可互換使用。然而,本發明 意欲包括發揮等效功能且在本案之後為此項技術所知之該 荨其他形式之表現載體。 RNAi構築體含有在細胞之生理條件下與待抑制之基因 (亦即ff標靶’’基因)之!nRNA轉錄物之至少一部分的核苦酸 序列雜交的核苷酸序列。雙鏈RNA僅需要與具有介導 RNAi之能力的天然RNA充分類似。因此,本發明具有能 夠容許可預期之歸因於遺傳突變、菌株多態性或進化趨異 之序列變化的優點。標靶序列與RNAi構築體序列之間之 谷许核苦酸錯配的數目不超過5個驗基對中之1者,或1 〇個 鹼基對中之1者,或20個鹼基對中之1者,或50個鹼基對中 之1者。 siRNA雙鏈體中心中之錯配為最關鍵性的且可基本上消 除標靶RNA之裂解。相比之下,與標tRNA互補之siRNA 鏈之3’末端處之核苷酸不顯著有助於標靶識別之特異性。 序列一致性可藉由此項技術中已知之序列比較及比對演 算法(參見 Gribskov及 Devereux,Sequence Analysis Primer, Stockton Press, 1991)且藉由例如以BESTFIT軟體程式使用 預設參數實施之Smith-Waterman演算法(例如university 〇f Wisconsin Genetic Computing Group)來計算核普酸序列之 129562.doc -30- 200848076 間之百分比差異來優化。抑制性RNA與標乾基因之八 卩刀之 間之序列一致性大於90%或甚至1 00%為較佳的。 或者, RNA之雙鏈體區域可在功能上定義為能夠與標美 土 轉錄
物之一部分雜交之核苷酸序列(例如4〇〇 mM N
1 刊mM PIPES pH 6·4 ’ 1 mM EDTA,5(TC 或 70°C 雜交 12]6小時· • 繼之以洗滌)。 ' RNAl構築體之產生可藉由化學合成方法或藉由重組核 、 酸技術來執行。經處理之細胞之内源RNA聚合酶可介導活 體内之轉錄,或純系rNA聚合酶可用於活體外之轉錄。 RNAi構築體可包括磷酸酯_糖主鏈或核苷之修飾,例如以 降低對細胞核酸酶的敏感性、改良生物可用性、改良調配 特性及/或改變其他藥物動力學性質。例如,天然rna之 磷酸二酯鍵聯可經修飾以包括氮或硫雜原子之至少一者。 R N A結構中之修飾可經定製以允許特異性遺傳抑制同時避 免對於dsRNA之一般反應。同樣,鹼基可經修飾以阻斷腺 〇 苷脫胺酶之活性。RNAi構築體可以酶促方式或藉由部分/ 70王有機合成來產生,任何經修飾之核糖核苷酸可藉由活 體外酶促或有機合成來引入。 化學修飾RNA分子之方法可適合於修飾RNAi構築體。 僅為忒明,RNAi構築體之主鏈可以硫代磷酸酯、胺基磷 酸酯、二硫代磷酸酯、嵌合甲基膦酸酯-磷酸二酯、肽核 敲、含有5-丙炔基-嘧啶之募聚物或糖修飾(例如2,_取代之 核糖核苷,a-構型)來修飾。 又鏈結構可由單一自補RNA鏈或兩個互補RNA鏈來形 129562.doc -31 - 200848076 成。RNA雙鏈體形+ 4 瓶仏成了在細胞内部或外部起始。rna可以 允許每個細胞輸送至少—個複本之量來引人。較高劑量 (例如每個細胞至少5、1〇、1〇〇、5〇〇或1〇〇〇個複本)之雙鍵 材料可產生更有效之抑制,同時較低劑量亦可適用於特定 應用抑制為序列特異性的,因為將與RNA之雙鏈體區域 • 對應之核苦酸序列設為標靶以進行遺傳抑制。 在某些實施例中,本發明之RNAi構築體為”小干擾RNa” 或SlRNA”。此等核酸之長度為約19-30個核苷酸,且甚至 更佳21-23個料酸,例如在長度上相應於由更長之雙鍵 RNA之核酸酶”切割”所產生之片段。據認為siRNA募集核 酉文酶複合物且藉由與特定序列配對而將複合物引導至標靶 mRNA因此,標乾mRNA由蛋白質複合物中之核酸酶降 解。在持定實施例中,21-23個核苷酸之siRNA分子包含3, 經基。 本發明之siRNA分子可使用熟習此項技術者已知之許多 〇 技術來獲得。例如,siRNA可使用此項技術中已知之方法 化學合成或重組產生。例如,短有義及反義RNA募聚物可 合成且黏接以形成在每一末端處具有2-核苷酸懸垂物的雙 鏈RNA結構。此等雙鏈siRNA結構可隨後藉由被動吸收或 所遥之輸送糸統直接引入細胞。 在某些態樣中,siRNA構築體可藉由例如在切割酶存在 下處理更長雙鏈RN A來產生。在一實施例中,使用果绳活 體外系統。在此實施例中,dsRNA與由果蠅胚體得到之可 溶性提取物組合,藉此產生組合。將該組合保持在將 129562.doc -32- 200848076 dsRNA處理成約21至約23個核苷酸之RNA分子的條件下。 siRNA分子可使用熟習此項技術者已知之許多技術純 化。例如,可使用凝膠電泳純化siRNAs。或者,可使用非 變性方法,諸如非變性管柱層析,純化siRNA。另外,可 使用層析(例如大小排斥層析)、甘油梯度離心、藉由抗體 之親和力純化來純化siRNAs。 在某些較佳特徵中,siRNA分子之至少一鏈具有3,懸垂 物(overhang)長度約1至約6個核苷酸,然而長度可為2至4 個核苷酸。更佳地,3,懸垂物之長度為1-3個核苷酸。在某 些κ施例中,一鏈具有3 ’懸垂物,另一鏈為鈍端或亦具有 懸垂物。每一鏈之懸垂物之長度可相同或不同。為進一步 增強siRNA之穩定性,可穩定3’懸垂物以免於降解。在一 悲樣中,RNA藉由包括諸如腺苷或鳥苷核苷酸之嘌呤核苷 酸而穩定。或者,容許嘧啶核苷酸由經修飾之類似物取 代’例如尿苷核苷酸3’懸垂物由2’-脫氧胸苷取代,且不影 響RNAi之有效性。2,羥基之缺乏顯著增強懸垂物在組織培 養基中之核酸酶抗性,且在活體内可為有利。 在其他特徵中,RNAi構築體係呈長雙鏈RNA之形式。 在某些實施例中,RNAi構築體為至少25、5〇、100、 200、3 00或400個鹼基。在某些實施例中,RNAi構築體之 長度為400-800個鹼基。雙鏈RNAs經細胞内消化,例如在 細胞中產生slRNA序列。然而,在活體内使用長雙鏈 並非總是可行,可能因為與序列無關的dsRNA反應所引起 之有害效應。在該等實施例中,使用局部輸送系統及/或 129562.doc -33 - 200848076 降低干擾素或PKR效應之劑為較佳。 在某些態樣中,RNAi構築體係呈髮夾結構之形式(名為 髮夾RNA)。髮央舰8可外源地合成或可在活體内由RNA 聚合酶職動子轉錄形成。較佳地,該等髮夾rnas在細 胞中或在動物中工程化以確保連續且穩定抑制所欲基因。 在此項技術中已知siRNAs可藉由在細胞中處理髮夾rna產 生。 在其他態樣中,使用質體輸送雙鏈RNA,例如呈轉錄產 物形式。在該等特徵中,質體經設計以包括議構築體 之各有義及反義鏈之”編碼序列”。該等編碼序列可為例如 由反相啟動子側接之相同序列或可為各自在獨立啟動子之 轉錄控制下之兩個獨立序列。在轉錄編碼序列之後,互補 rna轉錄物鹼基配對以形成雙鏈rNA。 PCT申請案woo i /773 50描述用於轉殖基因之雙向轉錄以 在真核細胞中產1同一轉殖基因之有義及反義RNA轉錄物 的例示性載體。因& ’在某些態樣中,本發明提供一種具 有以下獨有特性之重組載體:其包含病毒複製子,該病毒 钹製子具有以相反取向配置且側接所關注之RNAi構築體 之轉殖基因的兩個重疊轉錄單位’其中該兩個重疊轉錄單 位在宿主細胞中自同一轉殖基因片段產生有義及反義魏 轉錄物。 RNAi構築體可包含與標靶核酸序列一致或大體上一致 之長雙鏈RNA段或僅與標靶核酸序列之區域一致或大體上 致之紐雙鏈rna段。製造及輸送長或短RNAi構築體之 129562.doc -34- 200848076 例示性方法可例如見於WOO 1/68836及WOO 1/75 164中。 特異性地辨識特定基因或特定基因家族的例示性RNAi 構築體可使用以上關於反義寡核苷酸之選擇所詳細概述之 方法來選擇。類似地,輸送RNAi構築體之方法包括以上 詳細概述之輸送反義寡核苷酸之方法。通常,預期上述方 ’ 法中之任一者減少C5蛋白質之存在或轉譯或活性。 , RNAi表現卡匣之設計不限制本發明之範疇。設計RNAi 表現卡匣之不同策略均可適用,且基於不同設計之RNAi f ' 表現卡匣將能誘導活體内RNA干擾。(雖然RNAi表現卡匣 之設計不限制本發明之範疇,但是一些RNAi表現卡匣設 計包括於本發明及以下之詳細描述中。) 所有RNAi表現卡匣之共同特徵為其包含編碼RNA分子 之RNA編碼區域,該RNA分子能夠單獨或與另一 RNA分子 組合藉由以分子内或分子間之方式形成雙鏈RNA複合物來 誘導RNA干擾。 不同設計原則可用於實現彼同一目標且為熟習此項技術 κ * 者已知。例如,RNAi表現卡匣可編碼一或多種RNA分 子。在自RNAi表現卡匣進行RNA表現之後或在其期間,
^ 雙鏈RNA複合物可藉由單一自補RNA分子或兩個互補RNA • 分子來形成。dsRNA複合物之形成可在核内部或外部起 始。 RNAi標靶基因不限制本發明之範疇且可為參與C5活性 或表現之任何基因。因此,RNAi標靶基因之選擇對於本 發明不具有限制性:熟習此項技術者知道如何設計RNAi 129562.doc -35- 200848076 表現卡厘以下調所闕注之任何RNAi標靶基 現。視特定RNAi標靶基因及輸送方法而定二 供RNAi標靶基因之功能的部分或完全喪失。 適艘
適體為對於餘具有合意料之非天❹生之核酸。人 意作用包括(但不限於)結合標乾、催化性改變標乾、以: 飾/變更㈣或㈣之功能活性之方式與㈣反應、如二 自殺抑制劑之形式共價連接於標乾、促進標㈣另一分子 之間之反應。在本發明之情況下,標無為刺頌信號轉導途 徑之組份。 基於 SELEX法(Gold 等人,pna S ^ t 八 WAS 94:59-64,1997)來識別 適體。在其最基本形式中, τ SELEX法可由以下系列之步驟 來定義: 製備不同序列之核酸之備選混合物。該備選混合物通常 包括固定序列之區域(亦即,備選混合物之各成員在相同 Ο 因之基因表 該程序可提 位置中έ有相同序列)及隨機化序列之區士或。固定序列區 域經遠擇·⑷以輔助如下所述之擴增步驟,⑻以模擬已 知14杌靶結合之序列,或(c)以增加給定結構配置之核酸在 備選混合物中之濃度。隨機化序列可完全隨機化(亦即鹼 基見於任位置處之概率為四分之一)或僅部分隨機化(例 士鹼基見於任一位置處之概率可在〇與1 〇〇百分比之間之任 何水準處選擇)。 備遠混合物係在有利於標革巴與備選混合物之成員之間之 、、、口 口的“件下與所選擇之標靶接觸。在此等情況下,標靶 129562.doc -36 - 200848076 與備選混合物之核酸之間之相互作用τ視為在標靶與對於 標靶具有最強親和力之彼等核酸之間形成核酸-標靶對。 將對於標靶具有最高親和力之核酸與對於標靶具有較小 親和力之彼等核酸分隔。因為僅極少數的與最高親和力核 酸對應之序列(且可能僅一個核酸分子)存在於備選混合物 中,所以通常需要設定分隔標準以使得備選混合物甲之大 量核酸(大致5-50%)在分隔期間得以保留。
ί. 隨後使在分隔期間所選擇之對於躲具有相對較高親和 力的彼等核酸擴增以建置新備選混合物,#富含對於標革巴 具有相對較鬲親和力之核酸。 藉由重複以上分隔及擴增步驟,新形成之備選混合物含 有=來越少之弱結合序列,且核酸對於標靶之平均親和力 通:會增加。最終,SELEX&將產生含有代表來自初始備 選一物的對於標靶分子具有最高親和力之彼等核酸的一 個或少量獨特核酸的備選混合物。 為產生適用作醫藥品之合意核酸,較佳地,核酸配位體 ⑴:能夠達成對於標靶之所需效應之方式與標靶結合; ⑺儘可能小以獲得所需效應;(3)儘可能穩定;及⑷為所 選標乾之特異性配位體。在大多數情況中,較佳地,核酸 配位體對於標靶具有儘可能最高之親和力。 口 SELEX專利巾請案非料細地描述且闡述此方法。包括 可用於该方法之標無;分隔備選混合物内之核酸之方法; 及擴增所分隔之核酸以產生富集之備選混合物的方法。 SELEX專利巾請案亦描述對於許多㈣物質(包括蛋白質 129562.doc -37- 200848076 為核酸結合蛋白質之蛋白質標靶與蛋白質並非核酸結合蛋 白質之蛋白質標靶)所獲得之配位體。如1995年5月4曰申 否月之標題為’’Nucleic Acid Ligand Complexes”之美國專利申 請案第08/434,465號中所述,SELEX方法進一步包涵將所 選擇之核酸配位體與親脂或非免疫原性高分子量化合物組 合成診斷或治療複合物。 • 在本發明之某些態樣中,需要提供包含一或多種與非免 f 疫原性、高分子量化合物或親脂化合物共價連接之針對C5 蛋白質之組份之核酸配位體的複合物。非免疫原性、高分 子量化合物為大致100 Da至1,000,000 Da、更佳地大致 1000 Da 至 500,000 Da’ 且最佳地大致 1〇〇〇 Da 至 20〇,〇〇〇
Da之化合物,其通常不產生免疫原性反應。出於本發明之 目的,免疫原性反應為導致生物體產生抗體蛋白質之反 應。在本發明之一較佳實施例中,非免疫原性、高分子量 化合物為聚伸烷二醇。在最佳實施例中,聚伸烷二醇為聚 ^ 乙二醇(PEG)。更佳地,PEG具有約1〇-8队之分子量。最 佳地,PEG具有約20-45K之分子量。在本發明之某些實施 例中,非免疫原性、高分子量化合物亦可為核酸配位體。 抗體 在特定特徵中’本發明之化合物適用於識別抑制補體途 徑功能之結合分子。 本發明之化合物(亦即C5之抗原決定基,包括其部分或 片段)可用作免疫原以使用多株及單株抗體製備之標準技 術來產生與C5多肽結合之結合分子,較佳為抗體。本發明 129562.doc -38- 200848076 之化合物包含展示於SEQ ID N〇卜3及5中之胺基酸序列 之至少4個胺基酸殘基且包涵線性及非線性抗原決定基, 以使得、纟。a刀子以形成特定免疫複合物之方式與C5肽之抗 原性部分結合。較佳地,化合物包含至少6、8、ι〇、Η、 20或30個胺基酸殘基。視用途而定且根據熟習此項技術者 所熟知之方法,較長肽與較短肽相比有時為較佳者。 通常,藉由以免疫原來使合適個體(例如兔、山羊、小 鼠或其他哺乳動物)免疫來將肽用於製備抗體。適當免疫 原性製劑可含有例如重組替代途徑組份,例如^蛋白質或 其部分或片段;或化學合成之替代途徑组份,例如c5肽或 拮抗劑。參見例如美國專利第5,46〇,959號、第5,6〇1,826 號、第 5,994,127號、第 6,048,729號、第 6,〇83,725 號,其 每一者全部以引用方式明確地併入本文中。製劑可另外包 括諸如傳氏(Freund,S)完全或不完全佐劑之佐劑或類似免 疫刺激劑。以例如C5或其部分或片段之免疫原性替代途徑 組份使合適個體免疫誘導多株抗體反應。 對於獨立提出之抗原決定基序列(SEq ID No 1、3、5)之 每一者’將預期與作為抗體辨識位點之部分的所有經識別 之胺基酸殘基或一部分經識別之胺基酸殘基結合之抗體與 C5之α鏈及/或β鏈上之裂解位點(其由替代或經典途徑之以 轉化酶來蛋白水解)緊密鄰近。因此,提出藉由與c5 ^或p 裂解位點之鄰近範圍内之抗原決定基結合,該等抗^將具 有藉由位阻來在功能上抑制裂解位點之蛋白水解二而抑 制C5之裂解的潛能。 129562.doc •39- 200848076 设想與人類補體組份結合或以其他方式阻斷人類補體組 份之產生及/或活性的結合分子。因此,結合分子在本文 中適用於防止或抑制C5a之產生及/或與C5b相關之攻膜複 合物(MAC)之組裝。本發明之一些結合分子包括與補體組 份C5相關聯,因此抑制其轉化成C5a及Cb5(其導致MAC複 合物之組裝)的彼等結合分子。 ’’結合’’所關注之抗原(例如C5多肽抗原)之結合分子為以 足以使得该結合分子在靶向表現該抗原之細胞或組織中適 用作診斷及/或治療劑的親和力結合該抗原且不與其他蛋 白質顯著交又反應的結合分子。在一態樣中,如藉由螢光 活化細胞揀選(FACS)分析或放射免疫沈澱(RIA)所測定, 例如抗體與”非標靶,,蛋白質之結合之程度為抗體與其特定 標靶蛋白質之結合之約丨〇%以下。關於抗體與標靶分子之 結合,術語”特異性結合,,或,,特異性地結合至,,或,,特異性針 對”特定多肽或特定多肽標靶上之抗原決定基意謂可量測 地不同於非特異性相互作用之結合。特異性結合可例如藉 由與通常為不具有結合活性之類似結構之分子的對照分子 之結合相比較而測定分子之結合來量測。例如,特異性結 合可藉由與類似於標靶之對照分子(例如過量之未標記標 革巴)之競爭來測定。在此情況下,若經標記之標乾與探針 之釔合由過里未標記之標靶競爭性地抑制,則指示特異性 結合。如本文中所用之術語,,特異性結合”或”特異性地結 合至”或”特異性針對”特定多肽或特定多肽標乾上之抗原 決定基可例如由對於標靶具有以下Kd的分子來展現:至少 129562.doc 200848076 約Hr4 Μ、或者至少約10-5 M、或者至少約1〇-6 Μ、或者至 少約10 7 Μ、或者至少約丨〇-8 Μ、或者至少約i 〇-9 Μ、或者 至少約ΙΟ·10 Μ、或者至少約10-π Μ、或者至少約1〇-】2 Μ 或以上。在一態樣中,術語’,特異性結合,,係指化合物與特 定多狀或特定多肽上之抗原決定基結合而大體上不與任何 其他多肽或多肽抗原決定基結合的結合。 本文中使用之尤其適用之結合分子為直接或間接降低補 ( 體組份C5變成補體組份C5a及C5b之轉化率的抗體。一類 適用抗體為具有至少一個抗體-抗原結合位點且展現與人 類補體組份C5之特異性結合的彼等抗體,其中特異性結合 係靶向人類補體組份C5之α鏈。更特定而言,可使用單株 抗體(mAb)。該抗體丨)抑制人類體液中之補體活化;2)抑 制經純化之人類補體組份C5與人類補體組份C3或人類補 體組份C4之結合;及/或3)不與C5a之人類補體活化產物特 異性地結合。尤其適用補體抑制劑為如由C5a ELISA或由 〇 溶血檢定所量測使C5a及/或C5b_9之產生降低約30%、4〇% 或50%以上之化合物。 在功能上,合適抗體抑制C5之裂解,其阻斷有效前發炎 性分子C5a及C5b-9(末端補體複合物)之產生。根據此揭示 . 案用以治療與補體途徑調節異常相關之病症、較佳為眼睛 疾病的較佳抗C5抗體與C5或其片段(例如C5a或C5b)結合。 較佳地,抗C5抗體具有針對經純化之人類補體組份^之^ 及/或β鏈上之抗原決定基的免疫反應性且能夠阻斷C5經由 C5轉化酶變成C5a及C5b之轉化。此能力可使用描述於 129562.doc 41 200848076
Wurzner等人,Complement Inflamm 8:328-340,1991 中之 技術來量測。 在尤其適用之態樣中,抗C5抗體具有針對β鏈上之抗原 決定基及/或經純化之人類補體組份(^之^鏈内之抗原決定 基、較佳選自由SEQ ID No 1、3及5組成之群之抗原決定 基的免疫反應性。在此態樣中,抗體亦能夠阻斷C5經由 C5轉化酶變成C5a&C5b之轉化。在α鏈内,最佳抗體與胺 厂 基末端區域結合,然而,其並不與游離C5a結合。 本么明之另一悲樣為結合C 5且抑制其僅經由替代途徑 (C3bBbC3b)之C5轉化酶的裂解之治療抗體的產生及用 返。將預期该等抗體抑制由多態現象引起的導致替代途徑 之調節異常的補體活化而不干擾補體經典途徑之C5轉化酶 (C3bC4bC2a)之正常功能。 本文中描述之抗C5抗體包括人類單株抗體。在某些態樣 中,與C3b結合之抗體之抗原結合部分(例如VH及VL鏈)”經 〇 混合及匹配,,以建置其他抗C5結合分子。該等”經混合及匹 ^ >體之、° a可使用上述結合檢定(例如ELIS A)來測試。 田k擇VH以與特定vL序列混合及匹配時,通常選擇在與彼 Vl配對中與其置換之Vh在結構上類似之VH。同樣,來自 • 特定全長重鏈/全長輕鏈對之全長重鏈序列通常經在結構 上類似之王長重鏈序列置換。同樣,來自特定對之 VL序列將Μ在結構上類似之\序列置換。㈣,來自特定 全長重鏈/全長輕鏈對之全長輕鏈序列將經在結構上類似 之王長幸工鏈序列置換。在此情況中,識別結構類似性為在 129562.doc -42- 200848076 此項技術中熟知之方法。 在其他態樣中,本發明提供包含呈不同組合之一或多種 C5結合抗體之重鏈及輕鏈CDR1、CDR2及CDR3之抗體。 假定此等抗體之每一者均可與C5結合且抗原結合特異性主 要由 CDR1、CDR2及 CDR3 區域提供,則 CDR1、CDR2 及CDR3序列及vL CDR1、CDR2及CDR3序列可,,經混合及 匹配"(亦即來自不同抗體之CDR可經混合及匹配)。該等 ’’經混合及匹配,,抗體之C5結合可使用本文中描述之檢定 (例如ELISA)來測試。當CDR序列經混合及匹配時,來 自特定VH序列之CDR1、Cdr2及/或CDR3序列將經在結構 上類似之CDR序列置換。同樣,當Vl CDR序列經混合及 匹配時’來自特定VL序列之CDR1、CDR2及/或CDR3序列 將經在結構上類似之CDR序列置換。在此情況中,識別結 構類似性為在此項技術中熟知之方法。 如本文中所用,人類抗體包含作為特定生殖系序列,,之 產物,或’,由其衍生”之重或輕鏈可變區或全長重或輕鏈, 其前提條件為抗體之可變區或全長鏈係獲自將人類生殖系 免疫球蛋白基因用作序列之來源的系統。在一種如此之系 統中,人類抗體在載有人類免疫球蛋白基因之轉殖基因小 鼠中培育。轉殖基因小鼠以所關注之抗原(例如C5之抗原 決定基且其在下文進一步描述)免疫。或者,人類抗體由 提供噬菌體上呈現之人類免疫球蛋白基因庫且以所關注之 抗原(例如C5蛋白質或抗原決定基)篩選該庫來識別。 作為人類生殖系免疫球蛋白序列”之產物,,或”由其衍生” 129562.doc -43- 200848076
U 之人類抗體可藉由將人類抗體之胺基酸序列與人類生殖系 免疫球蛋白之胺基酸序列相比較且選擇在序列上與人類抗 體之序列最接近(亦即最大。/〇 —致性)之人類生殖系免疫球 蛋白序列來如此識別。作為特定人類生殖系免疫球蛋白序 列”之產物”或”由其衍生”之人類抗體可含有與生殖系編碼 序列相比之胺基酸差異,該胺基酸差異歸因於例如天然產 生之體細胞犬變或人工定點突變。然而,所選擇之人類抗 體通常具有與由人類生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸 序列至少90%—致之胺基酸序列且含有當與其他物種之生 殖系免疫球蛋白胺基酸序列(例如鼠類生殖系序列)相比較 時將人類抗體識別為人類者之胺基酸殘基。在某些情況 下,人類抗體可在胺基酸序列方面與由生殖系免疫球蛋白 基因編碼之胺基酸序列至少6〇%、7〇%、8〇%、9〇%或至少 95%或甚至至少96%、97%、98%或99%—致。 兩個序列之間之一致性百分比為在顧及為最佳比對兩個 序列而需要引入之間隙數目及每一間隙長度之情況下由序 列共有之一致性位置之數目的函數(亦即,%一致性=一致 I·生位置之數目/位i之總數x i00)。兩個序列之間之序列比 較及百分比一致性之測定係使用已併入align程式(版本 2.〇)中之E. Meyei^w. MiUer之演算法ο· APPl. Biosci.,4:11_17)使用pAMl2〇殘重表、i2之間隙長度 罰分及4之間隙罰分來測定。 ^ ^由特疋人類生殖系序列衍生之人類抗體之VH或
Vl將呈現與由人澳石古金& 、生殖糸免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序 129562.doc -44- 200848076 列有不超過ίο個胺基酸差異。在某些情況下,人類抗體之 νΗ或乂!^可呈現與由生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序 列有不超過5個或甚至不超過4、3、2或1個胺基酸差異。 駱駝類抗體 獲自駱駆及單峰駱.15 (雙峰騎(C麵⑽S)及單 峰駝(CWw办omaAWw))家族之成員(包括諸如美洲駝物 種(羊馬匕paccos)、原馬它(上及痩|它 v/cwgM))之新大陸成員)的抗體蛋白質已關於尺寸、結構 複雜性及對於人類個體之抗原性來表徵。實際上在此家族 之哺乳動物中見到之某些IgG抗體缺乏輕鏈,且因此在結 構上不同於其他動物之抗體特有之具有兩個重鏈及兩個輕 鏈的四鏈四級結構。參見WO 94/04678。 識別為VHH之路駝類抗體之作為較小單一可變域之區域 可藉由运傳工程化獲得以產生對於標乾具有高親和力的較 小蛋白質,產生稱為’’駱駝奈米抗體”之低分子量之抗體衍 生蛋白質。參見美國專利第5,759,808號;亦參見 Stijlemans等人,2004 J· Biol. Chem. 279: 1256-1261 ; Dumoulin等人,2003 Nature 424: 783-788 ; Pleschberger等 人 ’ 2003 Bioconjugate Chem. 14: 440-448 ; Cortez·
Retamozo 等人,2002 Int. J· Cancer 89: 456-62 ;及 Lauwereys等人,1998 EMBO J. 17: 3512-3520。駱駝類抗 體及抗體片段之工程化庫可例如購自Ablynx、Ghent、 Belgium。如同非人類來源之其他抗體一樣,駱駝類抗體 之胺基酸序列可經重組性改變以獲得更密切地類似於人類 129562.doc -45- 200848076 序列之序列,亦即,奈米抗體可經”人類化,,。由此,可進 一步降低駱駝類抗體對於人類之天然較低之抗原性。 駱駝類奈米抗體具有大致為人類IgG分子之十分之一的 分子量,且該蛋白質具有僅數奈米之實體直徑。小尺寸之 一結果為駱駝類奈米抗體能夠結合在功能上不可被較大抗 體蛋白質發現之抗原性位點m㈣奈米抗體適用作 镇測在另外使用經典免疫技術之情況下具有隱蔽性之抗原
Ο 的試劑,且適用作可能之治療劑。因此,小尺寸之另一結 果為隸類奈米抗體可由於與_蛋白質之溝槽或窄裂隙 中之特異性位點結合而進行抑制,且由此可以與經典抗體 相比更密切地類似於經典低分子量藥物之功能的能力來起 作用。 低分子量及緻密尺寸進—步使得駱㈣奈米抗體極具敎 穩定性,對於極端PH值穩定且對於蛋白水解消化穩定且具 有不良抗原性。另—結果騎㈣奈米抗體容易自循環系 ㈣i i織t ’且甚至穿過血腦屏障且可治療影響神經 組織之病症。奈米抗體可另外有助於藥物橫穿金腦屏障運 輸。參見2004年8月19 B八叫 , 月 曰么開之美國專利公開案第 200401 6 1738號。此等特徵牡人 一 c 又、、σ σ人類體内之較低抗原性指 不巨大的治療潛能。另外, 力卜此專分子可完全表現於諸如大 腸才干囷之原核細胞中。 因此’本發明之特徵為對 ^ ^ ^ ^ 、 5 /、有回親和力之駱駝類抗 體或駱駝類奈米抗體。在本 矽式太水> A 甲之某些恶樣中,駱駝類抗 體或不未抗體係在駱駝類動物 勒物中天然地產生,亦即由駱駝 129562.doc -46 - 200848076 類在使用本文中對於其他抗體描述之技術以C5或其肽片段 免疫之後而產生。或者,抗C5駱駝類奈米抗體經工程化, 亦即藉由例如自呈現使用以本文中描述之C5或C5抗原決 疋基作為標乾之淘選程序而適當誘變之駱騎類奈米抗體蛋 白質的噬菌體庫中選擇來產生。工程化奈米抗體可另外經 遺傳工程化來定製以將在接收個體中之半衰期自45分鐘增 加至兩週。 雙功能抗體 雙功能抗體為二價雙特異性分子,其中\^及Vl域表現 在單一多肽鏈上,該等域由太短而不允許兩個域在同一鏈 上配對的連接子連接。V Η及V L域與另一鏈之互補域配對, 藉此建置兩個抗原結合位點(參見例如Holliger等人,1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 ; Poljak 等人, 1994 Structure 2:1121-1123)。雙功能抗體可藉由在同一細 胞内表現具有結構VHA-VLB及VHB_VLA(VH_VL構型)或VLA-Vhb及VLB-VHA(VL-VH構型)的兩個多肽鏈來產生。其中大 多數可以可溶形式表現於細菌中。 單鏈雙功能抗體(scDb)藉由以大致15個胺基酸殘基之連 接子連接兩個雙功能抗體形成多肽鏈來產生(參見Holliger 及 Winter,1997 Cancer Immunol. Immunother·,45(3-4):128-30; Wu等人,1996 Immunotechnology,2(1):21-36)。scDb 可以可溶、活性單體形式表現於細菌中(參見Holliger及 Winter,1997 Cancer Immunol. Immunother·, 45(34): 128-30 ; Wu 等人,1996 Immunotechnology,2(1):21-36 ; 129562.doc -47- 200848076
Pluckthun及 Pack,1997 Immunotechnology,3(2): 83-105 ; Ridgway 等人,1996 Protein Eng.,9(7):617-21)。雙功能抗 體可與Fc融合以產生”二重雙功能抗體”(參見Lu等人, 2004 J. Biol· Chem·,279(4):2856-65)。 經工程化及修飾之抗體 本發明之抗體可使用具有一或多個VH及/或VL序列之抗 體作為起始材料以將經修飾之抗體工程化來製備,該經修 飾之抗體可具有自起始抗體改變之性質。抗體可藉由修飾 處於一或兩個可變區(亦即VH及/或VL)内、例如處於一或 多個CDR區域及/或一或多個構架區域内之一或多個殘基 來工程化。另外或其他,抗體可藉由修飾恆定區内之殘基 例如以改變抗體之效應功能來工程化。 可執行之一類可變區工程化為CDR接枝。抗體主要經由 位於六個重及輕鏈CDR中之胺基酸殘基來與標靶抗原相互 作用。為此原因,在個別抗體之間,CDR内之胺基酸序列 與CDR外之序列相比,更具多樣性。因為CDR序列決定著 大多數抗體-抗原相互作用,所以可藉由構建包括接枝於 來自具有不同性質之不同抗體之構架序列上之來自特異性 天然產生之抗體之CDR序列的表現載體來表現模擬特異性 天然產生之抗體之性質的重組抗體(參見例如Riechmann等 人,1998 Nature 332:323-327 ; Jones等人,1986 Nature 321:522-525,Queen等人,1989 Proc· Natl. Acad。參見 U.S.A· 86:10029-10033;美國專利第5,225,539號及美國專 利第 5,530,101 號、第 5,585,089 號、第 5,693,762 號及第 129562.doc -48- 200848076 6,1 80,370號)。 構架序列可獲自包括生殖系抗體基因序列之公用DNΑ資 料庫或公開參考文獻。例如,人類重及輕鏈可變區基因之 生殖系DNA序列可見於"VBase”人類生殖系序列資料庫(在 網際網路上可獲於www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase處)以及 Kabat 等人 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,美國健康與人類服務部(u s
Department of Health and Human Services),NIH公開案第 91-3242號;Tomlinson等人,1992 J· Mol· Biol· 227:776-798 ;及 Cox等人,1994 Eur· J. Immunol. 24:827-836 ;該 等文獻中之每一者之内容均以引用的方式明確併入本文 中〇 VH CDR1、CDR2 及 CDR3 序列及 CDR1、CDR2 及 CDR3序列可接枝於具有與構架序列自其衍生之生殖系免 疫球蛋白基因中所見者一致之序列的構架區上,或CDR序 列可接枝於與生殖系序列相比含有一或多個突變之構架區 上。例如’已發現在某些情況中使構架區内之殘基突變有 益於保持或增加抗體之抗原結合能力(參見例如美國專利 第 5,530,101 號、第 5,585,089 號、第 5,693,762 號及第 6,180,370號)。 CDR亦可接枝於除免疫球蛋白域以外的多肽之構架區 中。適當骨架形成構形穩定之構架,其呈現接枝殘基以使 得接枝殘基形成定域表面且結合所關注之標靶(例如C5抗 原)。例如,CDR可接枝於一骨架上,其中構架區基於纖 129562.doc -49- 200848076 連蛋白、銷蛋白、脂質運載蛋白、新制癌菌素、細胞色素 b、CP1鋅手指、PST1、捲曲螺旋、LACI-D1、z域或澱粉 酶抑肽(參見例如 Nygren 及 Uhlen,1997 Current Opinion in Structural Biology,7, 463-469) 〇 另一類型之可變區修飾為使\^及/或VL CDR1、CDR2及/ 或CDR3區域内之胺基酸殘基突變以藉此改良所關注之抗 體之一或多種結合性質(例如親和力),其稱為”親和力成熟,,。 可執行定點誘變或PCR介導之誘變以引入突變,且對於抗 體結合之效應或所關注之其他功能性質可在如本文中描述 之活體外或活體内檢定中評估。可引入保守修飾。突變可 為胺基酸取代、添加或缺失。此外,通常改變CDR區域内 之不超過一個、兩個、三個、四個或五個殘基。 本發明之工程化抗體包括已對丨㈠及/或%内之構架殘基 進行修飾以例如改良抗體之性質的彼等抗體。通常,進行 該等構架修飾以降低抗體之免疫原性。例如,一種方法為 將一或多個構架殘基”回復突變”至相應生殖系序列。更特 定而言,已經受體細胞突變之抗體可含有不同於抗體自其 衍生之生殖系序列的構架殘基。該等殘基可由將抗體構架 序列與抗體自其衍生之生殖系序列比較來識別。為將構架 區序列復原至其生殖系構型,可藉由例如定點誘變或pcR 介導之誘變將體細胞突變”回復突變”至生殖系序列。該等 "回復突變"抗體亦意欲由本發明涵蓋。 Λ 另一類型之構架修飾涉及使構架區内或甚至一或多個 CDR區域内之-或多個殘基突變以移Μ細胞抗原決定 129562.doc -50- 200848076 3此方法亦稱為"去免 之美國專利公開案第 基’藉此降低抗體之潛在免疫原性 疫化”且進一步詳細描述於Carr等人 20030153043號中。
除在構架或CDR區域内進行之修飾之外或替代該等修 飾’本發明之抗體可經工程化以包括在Fc區域内之修飾: 通常用以改變抗體之一或多種功能性質,諸如血清半衰 期、補體結合、Fc受體結合及/或抗原依賴性細胞毒性: 此外,本發明之抗體可經化學修飾(例如一或多種化學部 分可與抗體連接)或經修飾以改變其糖基化,從而改變抗 體之一或多種功能性質。 在-態樣中’ CH1之鉸鏈區經修飾以便改變(例如增加或 減少)鉸鏈區中之半胱胺酸殘基之數目。此方法進一步描 述於Bod贿等人之美國專利第5,677,425號中。cm之= 區中之半胱胺酸殘基之數目經改變以例如有助於輕鏈及重 鍵之組裝或增加或降低抗體之穩定性。 在2 一態樣中,抗體之Fc鉸鏈區經突變以降低抗體之生 物半农期。更特定而言,將一或多個胺基酸突變引入 鼓鏈片段之CH2_CH3域界面區中以使得抗體相對於原生 FC_欽鍵域SM結合具有削弱之葡萄球菌蛋白質A(SpA)結 口。此方法進-步詳細描述於Ward等人之美國專利第 6,165,745號中。 在另-態樣中,抗體經修飾以增加其生物半衰期。各種 方法均為可能的。例如’美國專利第6,277,375號描述IgG 中之、加其活體内半衰期的以下突變:”52l、丁“a、 129562.doc 51 200848076 T2 5 6F。或者,如presta等人之美國專利第5,869,〇46號及 第6,121,022號中所述,為增加生物半衰期,抗體可在chi 或CL區域内改變以含有自igG之Fc區域之CH2域之兩個環 獲取之補救受體結合抗原決定基。 在其他態樣中,F c區域藉由以不同胺基酸殘基置換至少 一個胺基酸殘基來改變,以改變抗體之效應功能。例如, 一或多個胺基酸可經不同胺基酸殘基置換以使得抗體具有 經改變之對於效應配位體之親和力但保留親本抗體之抗原 結合能力。親和力改變之效應配位體可例如為;pc受體或補 體之ci組份。此方法進一步詳細描述於Winter等人之美國 專利第5,624,821號及第5,648,260號中。 在另一態樣中,選自胺基酸殘基之一或多個胺基酸可經 不同胺基酸殘基置換以使得抗體具有經改變之Clq結合及/ 或降低或消除之補體依賴性細胞毒性(CDC)。此方法進一 步詳細描述於IdUSOgie等人之美國專利第6,194,551號中。 在另一態樣中,一或多個胺基酸殘基經改變以藉此改變 抗體固定補體之能力。該方法進一步描述於W〇 94/29351 中。 在另一態樣中,Fc區域經修飾以藉由修飾一或多個胺基 酸來增加抗體介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)之能力及/ 或增加抗體對於Fογ受體之親和力。此方法進一步描述於
Presta之WO 00/42072中。此外,已將人類IgGl上之對於 、FcyRII、FcyRIII及FcRn之結合位點定位且已描述 具有改良之結合的變異體(參見Shields,R.L等人,2001 J. 129562.doc -52- 200848076
Biol. Chem. 276:6591-6604)。 在另一態樣中,抗體之糖基化經修飾。例如,可製得非 糖基化抗體(亦即抗體缺乏糖基化)。糖基化可經改變以例 如增加抗體對於抗原之親和力。該等碳水化合物修飾可藉 由例如改變抗體序列内之一或多個糖基化位點來實現。例 如,可進行一或多個胺基酸取代,其導致消除一或多個可 k區構架糖基化位點,藉此消除彼位點之糖基化。該非糖 基化可增加抗體對於抗原之親和力。該方法進一步詳細描 述於美國專利第5,714,350號及第6,350,861號中。 另外或其他,可製得具有改變類型之糖基化之抗體,諸 如具有降低量之岩藻糖基殘基之低岩藻糖基化抗體,或具 有增加之二等分GlcNac結構之抗體。已證明該等經改變之 糖基化模式增加抗體之ADCC能力。該等碳水化合物修飾 可藉由例如在具有經改變之糖基化機構之宿主細胞中表現 抗體來實現。具有經改變之糖基化機構之細胞已描述於此 項技術中且可用作表現本發明之重組抗體以藉此產生具有 經改變之糖基化之抗體的宿主細胞。例如,Hang等人之EP 1,1 7 6,1 9 5描述具有編碼岩藻糖基轉移酶之功能上受破壞之 FUT8基因的細胞株,以使得表現於該細胞株中之抗體展 現低岩藻糖基化。?!^1&之?(:丁公開案\¥〇 03/035 83 5描述 變異體CHO細胞株Lecl3細胞,其將岩藻糖連接至與 Asn(297)連接之碳水化合物之能力降低,其亦導致表現於 彼宿主細胞中之抗體之低岩藻糖基化(亦參見Shields,R.L 等人,2002 J. Biol. Chem· 277··26733-26740)。Umana等人 129562.doc -53 - 200848076 之WO 99/54342描述經工程化以表現醣蛋白修飾葡糖基轉 移酶(例如β(1,4)-Ν乙醯基葡糖胺基轉移酶III(GnTIII))之細 胞株,以使得表現於經工程化之細胞株中之抗體展現增加 之二等分GlcNac結構,其導致抗體之ADCC活性增加(亦參 見 Umana等人,1999 Nat· Biotech. 17:176-180)。 本文中由本發明涵蓋之抗體之另一修飾為聚乙二醇化。 抗體可經聚乙二醇化以例如增加抗體之生物(例如血清)半 衰期。為使抗體聚乙二醇化,通常使抗體或其片段與諸如 peg之反應性酯或醛衍生物之聚乙二醇(peg)在一或多個 PEG部分變得與抗體或抗體片段連接之條件下反應。聚乙 一醇化可由與反應性PEG分子(或類似的反應性水溶性聚合 物)之醯化反應或烧化反應來進行。如本文中所用,術語 t乙一醇’意欲涵盍已用以衍生其他蛋白質之任何形式之 PEG,諸如單(Cl-C10)烷氧基-聚乙二醇或芳氧基-聚乙二 醇或1乙《一酵-馬來酿亞胺。在某些態樣中,待聚乙二醇 化之抗體為非糖基化抗體。將蛋白質聚乙二醇化之方法在 此項技術中已知且可應用於本發明之抗體。參看例如
Nishimura 等人之 EP 0 154 316 及 Ishikawa 等人之 EP 〇 401 384 ° 另外,聚乙二醇化可在本發明之C5結合多肽之任何部分 中藉由引入非天然胺基酸達成。某些非天然胺基酸可藉由 描述於 Deiters等人,J Am Chem Soc 125:11782-11783 2003 ; Wang及 Schultz,Science 301:964-967,2003 ; Wang 等人 ’ Science 292:498-500, 2001 ; Zhang等人,以‘“ 129562.doc -54- 200848076 3 03:371-373,2004或美國專利第7,〇83,97〇號中之技術引 入。簡言之,此等表現系統中之一些涉及定點誘變以將諸 如琥珀TAG之無意義密碼子引入編碼本發明之多肽之開放 閱項框架中。隨後將該等表現載體引入可利用對於所引入 之無意義密碼子具有特異性之tRNA的宿主中且以所選之 非天然胺基酸裝填。有益於使部分與本發明之多肽結合之 目的的特定非天然胺基酸包括具有乙炔及疊氮基側鏈之彼 等胺基酸。含有此等新穎胺基酸之多肽隨後可在蛋白質中 之此專所選位點處經聚乙二醇化。 使抗艘工程化之方法 如以上所讨論,抗C 5抗體可用於藉由修飾全長重鍵及/ 或輕鏈序列VH及/或VL序列或與其連接之恆定區來建置新 抗C5抗體。例如,抗體之一或多個CDR區域可與已知構架 區及/或其他CDR重組性組合以建置新的經重組性工程化 之抗C5抗體。其他類型之修飾包括彼等描述於上述章節中 者。工私化方法之起始材料為Vh及/或Vl序列之一或多者 或其一或多個CDR區域。為建置工程化抗體,不需要事實 上製備(亦即表現為蛋白質)具有VH及/*VL序列之一或多 者或其一或多個CDR區域的抗體。實際上,含於序列中之 資訊用作建置由初始序列衍生之”第二代,,序列的起始材料 且隨後製備,,第二代”序列且將其表現為蛋白質。 標準分子生物學技術可用於製備及表現經改變之抗體序 列。由經改變之抗體序列編碼之抗體為保留該抗體自其衍 生之抗C 5抗體之功能性質之一者、一些或全部的抗體,該 129562.doc -55- 200848076 等功能性質包括(但不限於)本文中描述之C5活性。經改變 之抗體之功能性質可使用此項技術中可用及/或本文中描 述之標準檢定(例如ELISA)來評估。 在將本發明之抗體工程化之方法之某些態樣中,可隨機 或選擇性地沿抗C5抗體編碼序列之全部或一部分引入突變 且可對於如本文中描述之結合活性及/或其他功能性質(例 如抑制MAC形成、調節補體途徑調節異常)來篩選所得經 修飾之抗C5抗體。突變方法已描述於此項技術中。例如, Short之PCT公開案W0 02/092780描述使用飽和誘變、合成 接合組裝或其組合來建置且篩選抗體突變之方法。或者, Lazar等人之WO 03/074679描述使用計算篩選方法以優化 抗體之生理化學性質的方法。 若核苷酸序列已經改變以使用在產生細胞或生物體中較 佳之密碼子編碼胺基酸序列,則其據信為,,優化的,,,該細 胞或生物體通常為真核細胞,例如諸如畢赤酵母 之酵母細胞、昆蟲細胞、諸如中國倉鼠卵巢細胞(Ch〇)之 哺乳動物細胞或人類細胞。優化核苷酸序列經工程化以編 碼與由初始起始核苷酸序列(其亦稱為”親本,,序列)編碼之 胺基酸序列一致或幾乎一致之胺基酸序列。 非抗體C5結合分子 本發明另外提供展現抗體之功能性質但自其他多肽(例 如除彼等由抗體基因編碼者或由抗體基因在活體内重组所 產生者以外的多肽)衍生其構架及抗原結合部分的C5結合 分子。此等結合分子之抗原結合域(例如本發明之C5結合 129562.doc -56- 200848076 域或抗原決定基)經由定向進化過程來產生。參見美國專 利第7,1 15,396號。具有與抗體之可變域類似之總摺疊(”免 疫球蛋白狀,’摺疊)之分子為適當骨架蛋白質。適合於衍生 抗原結合分子之骨架蛋白質包括纖連蛋白或纖連蛋白二聚 體,腱生蛋白,N-鈣黏著蛋白,E_鈣黏著蛋白,ICAM, 肌聯蛋白,GCSF-受體,細胞激素受體,糖苷酶抑制劑, 抗生素色蛋白,髓磷脂膜黏著分子P〇、CD8、CD4、 CD2,I類MHC,T細胞抗原受體,vcaM- 1之CD1、C2及I_ 型域,肌凝蛋白-結合蛋白質(:之:!-型免疫球蛋白域,肌凝 蛋白-結合蛋白質11之1-型免疫球蛋白域,“丨仏化之〗·型免 疫球蛋白域,NCAM,線蟲肌肉蛋白質,神經膠質蛋白, 生長激素受體,紅血球生成素受體,促乳素受體,γ干擾 素受體’ β-半乳糖苦酶/葡糖醛酸酶,^葡糖醛酸酶,轉麵 醯胺酸酶,T細胞抗原受體,過氧化物歧化酶,組織因子 域,細胞色素F,綠色螢光蛋白質,GroEL及祝馬丁 (thaumatin) °
非抗體結合分子之抗原結合域(例如免疫球蛋白狀摺疊) 可具有小於10 kD或大於7.5 kD之分子質量(例如7.5-1〇 kD 之間之分子質量)。用以衍生抗原結合域之蛋白質為天然 產生之哺乳動物蛋白質(例如人類蛋白質),且抗原結合域 包括。與該域自其衍生之蛋白質之免疫球蛋白狀摺疊相比多 至(例如夕至34%、25〇/。、20%或15%)之突變胺基酸。 具有免疫球蛋白狀摺疊之域通常由5〇_15〇個胺基酸(例如 40-60個胺基酸)組成。 129562.doc -57- 200848076 為產生非抗體結合分子,建置其中形成抗原結合表面之 骨架蛋白質之區域(例如在位置及結構上與抗體可變域免 疫球蛋白摺疊之CDR類似之區域)中之序列經隨機化的純 系庫。對於與所關注之抗原決定基(例如C5)之特異性結合 • 且對於其他功能(例如C5活性之抑制)來測試庫純系。所選 擇之純系可用作產生對於抗原具有較高親和力之衍生物的 • 進一步隨機化及選擇的基礎。 例如使用纖連蛋白111之第十模組(1〇Fn3)作為骨架來產生 高親和力結合分子。針對i〇FN3之處於殘基23-29、52_55及 7 8 87處之二個CDR狀環來構建庫。為構建各庫,編碼與 各CDR狀區域重疊之序列的DNA區段由募核苷酸合成來隨 機化。產生可選10Fn3庫之技術描述於美國專利第 6,818,418 就及弟 7,1 15,396 號;Roberts 及 Szostak,1997 Proc· Natl. Acad· Sci USA 94:12297 ;美國專利第 ό,261,804 號’美國專利弟6,258,558號及Szostak等人WO 98/3 1700 非抗體結合分子可以二聚體或多聚體形式產生以增加對 於私靶抗原之親和力。例如,抗原結合域以與抗體之恆定 區(Fc)融合之方式來表現,從而形成Fc_Fc二聚體。參見例 • 如美國專利第7,1 15,396號。 編碼本發明之抗趙之核酸分子 本發明之另一態樣係關於編碼本發明之C5結合分子的核 酸分子。核酸可存在於完整細胞中、細胞溶胞產物中,或 可為呈部分經純化或大體上純形式之核酸。當藉由包括驗 129562.doc •58- 200848076 性/SDS處理、CsCl純化、管柱層析、瓊脂糖凝膠電泳及此 項技術中熟知之其他技術之標準技術來純化脫除其他細胞 組份或其他污染物(例如其他細胞核酸或蛋白質)時,核酸 為”經分離的”或,,變得大體上純,,。參見F· Ausubel等人編 • 1987 Current Protocols in Molecular Biology, Greene • Publishing and Interscience,New Y〇rk。本發明之核 • 酸可例如為DNA或RNA且可能含有或可能不含有内含子序 列。在一態樣中,核酸為cDNA分子。核酸可存在於諸如 噬菌體呈現載體之載體中或存在於重組質體載體中。 結合分子之核酸序列可使用標準分子生物學技術來獲 得。對於由融合瘤(例如如下文進一步描述自載有人類免 疫球蛋白基因之轉殖基因小鼠製備之融合瘤)表現之抗 體,編碼由融合瘤製備之抗體之輕鏈及重鏈的〇〇1^八可藉 由標準PCR擴增或CDNA選殖技術來獲得。對於(例如使用 货菌體呈現技術)自免疫球蛋白基因庫中獲得之抗體,編 y 碼抗體之核酸可自作為庫成員之各種噬菌體純系中回收。 旦獲得編碼VH及VL區段之DNA片段,此等dna片段 可進一步藉由標準重組DNA技術來處理,以例如將可變區 基因轉化成全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。 . 在該等處理中,編碼VL4VH之DNA片段與另一DNA分子 或與編碼另一蛋白質(諸如抗體恆定區或可撓性連接子)之 片段可操作地連接。如在此情況中所使用之術語”可操作 地連接”意欲意謂兩個DNA片段以功能方式接合,以使得 例如由兩個DNA片段編碼之胺基酸序列保持同框,或使得 129562.doc -59- 200848076 蛋白質在所需啟動子控制之下表現。 編碼Vh區域之經分離DNA可藉由將編碼vHiDNA與另 一編碼重鏈恆定區(CH1、CH2及CH3)之DNA分子可操作地 連接而轉化為全長重鏈基因。人類重鏈恆定區基因之序列 在此項技術中已知(參見例如Kabat等人,1991 Sequences of Proteins Of immun〇i〇gical Interest,第五版,美國健康 與人類服務部,NIH公開案第91_3242號)且包涵此等區域 之DNA片^又可由標準pcr擴增來獲得。重鏈恆定區可為
IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM 或 IgD 恆定 區。對於Fab片段重鏈基因,編碼vHiDNA可與另一僅編 碼重鏈CH1恆定區之Dna分子可操作地連接。 編碼VL區域之經分離DNA可藉由將編碼Vl2Dna與另 一編碼輕鏈恆定區(CL)i DNA分子可操作地連接而轉化為 全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人類輕鏈恆定區基因之 序歹j在此項技術中已知(參見例如Kabat等人,1991 SeqUences of Pr〇teins 〇f Immun〇1〇gical ,第五 版,美國健康與人類服務部,NIH公開案第91_3242號)且 包涵此等區域之DNA片段可由標準pcR擴增來獲得。輕鏈 十亙定區可為κ或λ恒定區。 為建置scFv基因,使編碼Vh& Vl2DNA片段與另一編碼 可撓性連接子(例如編碼胺基酸序列(Gly4_Ser)3)之片段可 2作地連接,以使得Vh&Vl序列可表現為鄰接的單鏈蛋白 質,且vL與vH區域由可撓性連接子接合(參見例如別“等 人,1988 Science 242:423-426 ; Hust〇n等人,1988 ⑽· 129562.doc -60- 200848076
Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 ; McCafferty等人, 1990 Nature 348:552-554)。 單株抗體產生 單株抗體(mAb)可由多種技術來產生,包括習知單株抗 體方法,例如Kohler及Milstein之標準體細胞雜交技術 (1975 Nature,256:495),或使用諸如噬菌體呈現之庫呈現 方法。 用於製備融合瘤之動物系統為鼠類系統。小鼠中之融合 瘤產生為完全確立之程序。分離經免疫之脾細胞以便融合 的免疫協定及技術在此項技術中已知。融合搭配物(例如 鼠類骨髓瘤細胞)及融合程序亦已知。 本發明之嵌合或人類化抗體可基於如上所述製備之鼠類 單株抗體之序列來製備。編碼重及輕鏈免疫球蛋白之DN A 可自所關注之鼠類融合瘤中獲得且使用標準分子生物學技 術經工程化以含有非鼠類(例如人類)免疫球蛋白序列。例 如’為建置肷合抗體’可使用此項技術中已知之方法將鼠 類可變區與人類恆定區連接(參見例如Cabilly等人之美國 專利第4,816,567號)。為建置人類化抗體,可使用此項技 術中已知之方法將鼠類CDR區域插入人類構架中。參見例 如美國專利第5,225,539號及美國專利第5,53〇,1〇1號、第 5,585,089號、第 5,693,762 號及第 6,180,370 號。 在某一態樣中,本發明之抗體為人類單株抗體。該等針 對C5抗原決定基之人類單株抗體可使用載有人類免疫系統 而非小鼠系統之部分的轉殖基因或轉染色體小鼠來產生。 129562.doc -61 · 200848076 此等轉殖基因及轉染色體小鼠包括在本文中分別稱為 HuMAb小鼠及KM小鼠之小鼠,且在本文中共同稱為”人類 Ig小鼠’’。
HuMAb小鼠®(Medarex,Inc.)含有編碼未重排之人類重鏈 (μ及γ)及/C輕鏈免疫球蛋白序列之人類免疫球蛋白基因微 基因座(m i n i 1 〇 c i),以及使内源性μ及/C鍵基因座不活化之 標靶突變(參見例如Lonberg等人,1994 Nature 368 (6474): 8 5 6-85 9)。因此,小鼠顯示小鼠IgM或/c之表現降低,且 對於免疫作用反應,所引入之人類重及輕鏈轉殖基因進行 類別轉換及體細胞突變,產生高親和力人類IgG /C單株抗 體(Lonberg,N.等人,1994 前述;評述於 Lonberg,N·,1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101 ; Lonberg,N.及 Huszar,D.,1 995 Intern. Rev· Immunol· 1 3 : 65-93 ;及 Harding,F.及 Lonberg, N.,1995 Ann· Ν· Y. Acad· Sci· 764:53 6-546)。HuMAb小鼠之製備及使用及該等小鼠 所攜帶之染色體組修飾進一步描述於Taylor,L.等人,1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295 ; Chen, J.等人,1993 International Immunology 5: 647-656 ; Tuaillon等人,1993 Proc. Natl· Acad. Sci· USA 94:3720-3724 ; Choi等人,1993 Nature Genetics 4:117-123 ; Chen,J·等人,1993 EMBO J· 12: 821-830; Tuaillon 等人,1994 J. Immunol· 152:2912-2920 ; Taylor,L.等人,1994 International Immunology 579-591 ;及Fishwild,D.等人,1996 Nature Biotechnology 14: 845-85 1中,該等文獻之所有内容全部以引用的方式特 129562.doc -62- 200848076 定地併入本文中。另外參見皆頒予Lonberg及Kay之美國專 利第 5,545,806 號、第 5,569,825 號、第 5,625,126 號、第 5,633,425 號、第 5,789,650 號、第 5,877,397 號、第 5,661,016 號、第 5,814,318 號、第 5,874,299 號及第 5,770,429號;Surani等人之美國專利第5,545,807號;皆頒 予1^〇1^6^及1<^7之?€丁公開案第\^0 92103 918號、第\¥0 93/12227號、第 WO 94/25585號、第 WO 971 13852號、第 WO 98/24884 號及第 WO 99/45962 號;及 Korman 等人之 PC丁公開案第WO 01/14424號。 在另一態樣中,本發明之人類抗體可使用在轉殖基因及 轉染色體上載有人類免疫球蛋白序列之小鼠,諸如載有人 類重鏈轉殖基因及人類輕鏈轉染色體之小鼠來培育。本文 中稱為ΠΚΜ小鼠π之小鼠詳細描述於w〇 02/43478中。 另外,表現人類免疫球蛋白基因之替代轉殖基因動物系 統在此項技術中可得且可用於培育本發明之抗C5抗體。例 如,可使用稱作Xenomouse®(Abgenix,Inc·)之替代轉殖基 因系統。該等小鼠描述於例如Kucherlapati等人之美國專 利第 5,93 9,5 98 號、第 6,075,181 號、第 6,1 14,598 號、第 6,150,584 號及第 6,162,963 號中。 此外,表現人類免疫球蛋白基因之替代轉染色體動物系 統在此項技術中可得且可用於培育本發明之抗C5抗體。例 如,可使用稱作’’TC小鼠’’之載有人類重鏈轉染色體及人類 輕鏈轉^色體之小鼠,該等小鼠描述於T〇mizuka等人, 2000 Proc· Natl. Acad· Sci· USA 97:722-727 中。此外,載 129562.doc -63- 200848076 有人類重鏈及輕鏈轉染色體之牛已描述於此項技術中 (Kuroiwa專人,2002 Nature Biotechnology 20:889-894)且 可用於培育本發明之抗C5抗體。 本發明之人類單株抗體亦可使用噬菌體呈現方法來筛選 人類免疫球蛋白基因之庫而製備。分離人類抗體之該等嗟 菌體呈現方法在此項技術中已確立。參看例如:Ladner等 人之美國專利第5,223,4〇9號第5,4〇3,484號及第5,571,698 號;Dower等人之美國專利第5,427,908號及第5,580,717 號;McCafferty等人之美國專利第5,969,1〇8號及第 6,172,197號;及Griffiths等人之美國專利第5,885,793號、 第 6,521,404 號、第 6,544,73 1 號、第 6,555,3 13 號、第 6,582,915號及第6,593,081號。可針對與全長C5抗原或與 SEQ ID 1、3、5之特定C5抗原決定基的結合對庫進行篩 選。 本發明之人類單株抗體亦可使用其中已經重構使得可在 免疫之後產生人類抗體反應之人類免疫細胞的SCID小鼠來 製備。該等小鼠描述於例如Wilson等人之美國專利第 5,476,996號及第 5,698,767號中。 人類Ig小鼠中之人類單株抗體之產生 表現於原核細胞(例如大腸桿菌)或真核細胞(例如哺乳動 物細胞,例如HEK293細胞)中之經純化之重組人類C5可用 作抗原。蛋白質可與諸如匙孔螺血氰蛋白(KLH)之載劑結 合。 C5新抗原決定基之全人單株抗體使用HuMab轉殖基因小 -64- 129562.doc 200848076 鼠之HCo7、HCol2及HCol7品系及轉殖基因轉染色體小鼠 之KM品系(其每一者表現人類抗體基因)來製備。在此等小 鼠品系之每一者中,内源性小鼠κ輕鏈基因可如Chen等 人’ 1993 EMBO J· 12:81 1-820中所述以同型結合之方式來 破壞且内源性小鼠重鏈基因可如w〇 〇丨丨〇9丨87之實例1中 所述以同型結合之方式來破壞。如Fishwiid等人,1996
Nature Biotechnology 14:845-851中所述,此等小鼠品系之 每一者均載有人類κ輕鏈轉殖基因KCo5。如美國專利第 5,545,806 號、第 5,625,825 號及第 5,545,807 號中所述, HCo7品系載有HCo7人類重鏈轉殖基因。如w〇 01/09187 之實例2中所述,HCo 12品系載有HCo 12人類重鏈轉殖基 因。HCol7品系載有HC〇17人類重鏈轉殖基因。如w〇 02/43478中所述,KNM品系含有SC20轉染色體。 為產生C5抗原決定基之全人單株抗體,HuMab小鼠及 KM小鼠以經純化之重組C5、C5片段或其結合物(例如C5-KLH)作為抗原來免疫^ HuMab小鼠之一般免疫方案描述 於 Lonberg,N·專人 ’ 1994 Nature 368(6474): 856-859 ; Fishwild,D.荨人 ’ 1996 Nature Biotechnology 14:845-85 1 及WO 98/248 84中。在第一次輸注抗原時,小鼠為6-1 6週 齡。抗原之經純化之重組製劑(5-50 pg)用以在腹膜腔中、 皮下(Sc)或藉由足墊注射來對HuMab小鼠及KM小鼠免疫。 轉殖基因小鼠以完全弗氏佐劑或Ribi佐劑中之抗原在腹 膜腔(IP)中、皮下(Sc)或藉由足塾(ρρ)免疫兩次,繼之以不 完全弗氏或Ribi佐劑中之抗原IP、Sc*Fp免疫3_21曰(多至 129562.doc -65- 200848076 總共11次免疫)。免疫反應藉由眶後採血來監控。血漿藉 由ELISA篩選,且具有抗C5人類免疫球蛋白之足夠效價之 小鼠用於融合。在處死且移除脾臟之前3天及前2天,將小 鼠以抗原靜脈内補強。通常,對於每一抗原執行1〇_35次 融合。對於每一抗原,將數十隻小鼠免疫。總共82隻 HC〇7、HC〇12、HCol7及KM小鼠品系之小鼠以(^抗原免 疫。 為選擇產生結合C5抗原決定基之抗體的HuMab或KM小 鼠’來自經免疫小鼠之血清可藉由如Fishwild,D·等人, 1996所描述之ELISA來測試。簡言之,將微量滴定板以5〇 微升/孔之濃度為1-2 pg/ml之溶於PBS中之經純化之重組C5 塗佈,在4它下培育隔夜,隨後以200微升/孔之於pBS/吐 溫(0.05%)中之5%雞血清來阻斷。將獲自經C5免疫之小鼠 之血漿之稀釋液添加至各孔中且在環境溫度下培育小 時。將板以PBS/吐溫洗滌且隨後在室溫下與經辣根過氧化 物酶(HRP)結合之山羊抗人類IgG Fc多株抗體一起培育丄小 犄。在洗滌之後,將板以ABTS受質(Sigma,A-1888,〇 22 mg/ml)顯影且由分光光度計於〇d 415-495下分析。將顯現 抗C5抗體之最高效價之小鼠的脾細胞用於融合。執行融人 且藉由ELISA測試融合瘤上清液之抗^活性。 基於標準協定,用PEG使自HuMab小鼠&KM小氣分離 之小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞株融合。隨後針對抗原特 異性抗體之產生,對所得融合瘤進行篩選。用Μ。〆 PEG(Sigma)使獲自經免疫小鼠之脾臟淋巴細胞之 卞、、、田跑懸 129562.doc -66- 200848076 浮液與四分之一數目之SP2/0非分泌小鼠骨髓瘤細胞 (ATCC,CRL 1581)融合。將細胞以大致ΐχΐ〇5/孑匕塗覆於平 底微量滴定板中’繼之以在含有DMEM(Mediatech,CRL 10013,具有高葡萄糖、L-麩胺醯胺及丙酮酸鈉)中之ι〇〇/0 胎牛血清、10% P388D 1(ATCC,CRL TIB-63)改良性培養 基、3-5% Origen'IGEN)加 5 mM HEPES、0.055 mM 2-疏 基乙醇、50 mg/ml慶大黴素(gentamycin)及 lx HAT(Sigma, CRL P-71 85)之選擇性培養基中培育約兩週。在ι_2週之 後,將細胞在HAT經HT置換之培養基中培養。隨後藉由 ELISA針對人類抗C5單株IgG抗體,對個別孔進行篩選。 一旦出現大範圍的融合瘤生長,通常在1〇-14日之後監控 培養基。重新塗覆抗體分泌性融合瘤,再次筛選且若對於 人類IgG仍呈陽性,則藉由限制稀釋法將抗C5單株抗體次 選殖至少兩次。隨後將穩定次純系在活體外培養以在組織 培養基中產生少量抗體用於進一步表徵^ ί. 產生人類單株抗想之融合瘤之產生 為產生可產生本發明之人類單株抗體之融合瘤,可將庐 自經免疫小鼠之脾細胞及/或淋巴結細胞分離且與諸如= 鼠骨髓瘤細胞株之適當永生化細胞株融合。可針對抗原特 異性抗體之產生,對所得融合瘤進行筛選。例如,可用 50% PEG使獲自經免疫小鼠之脾臟淋巴細胞之單細胞懸浮 =與六分之—數目之P3X63_Ag8 653非分泌小鼠骨趙瘤細 匕(ATCC,CRL 1580)融合。將細胞以大致“丨^塗覆於
底微量滴定板中’繼之以在含有2G%胎純系血清㈤U 129562.doc -67- 200848076
Clone Serum)、18% ”653”改良性培養基、5% 〇rigen® (IGEN)、4 mM L-麵胺醯胺、1 mM丙酮酸鈉、5 mM HEPES、0:05 5 mM 2-巯基乙醇、50單位/毫升青黴素、5〇 gg/ml鏈黴素、50 pg/ml慶大黴素及lx HAT(Sigma ;在融 合之後24小時添加HAT)之選擇性培養基中培育兩週。在大 致兩週之後,可將細胞在HAT經HT置換之培養基中培養。 P过後可藉由ELIS A針對人類單株lg]y[及IgG抗體,對個別孔 進行師選。一旦出現大範圍的融合瘤生長,通常可在1〇一 14曰之後觀察培養基。可重新塗覆抗體分泌性融合瘤,再 次篩選且若對於人類IgG仍呈陽性,則可藉由限制稀釋法 將單株抗體次選殖至少兩次。隨後可將穩定之次純系在活 體外培養以在組織培養基中產生少量抗體用於表 徵。 為純化人類單株抗體,可使所選擇之融合瘤在兩公升旋 轉燒瓶中生長以便進行單株抗體純化。可將上清液過濾且 7辰 Ifg ’ P过後以蛋白質 A- ί复脂糖(Pharmacia,Piscataway, N.J·)進行親和層析。經溶離之IgG可藉由凝膠電泳及高效 液相層析核對以確保純度。緩衝溶液可交換至PB S中且濃 度可使用1.43之消光係數由〇D28〇確定。可將單株抗體等分 且儲存於-80°C下。 產生單株抗體之轉染瘤之產生 本發明之抗體亦可使用例如如此項技術中所熟知之重組 DNA技術及基因轉染方法之組合(例如M〇rrison,1985 Science 229:1202)在宿主細胞轉染瘤中產生。 129562.doc -68- 200848076 例如’為表現抗體或其抗體片段,編碼部分戍全長輕鍵 及重鏈之DNA可藉由標準分子生物學技術(例如 使用表現所關注之抗體之融合瘤的cDNA選殖)來獲得^可 將DNA插入表現載體中以使得基因與轉錄及轉譯序列 可操作地連接。在此情況中,術語”可操作地連接,,意欲意 謂抗體基因接合至載體中以使得载體内之轉錄及轉譯控制 序列發揮其調節抗體基因之轉錄及轉譯的預期功能。表現 載體及表現控制序列經選擇以與所使用之表現宿主細胞相 容。抗體輕鏈基因及抗體重鏈基因可插入獨立载體中,或 更通常兩種基因插入同一表現載體中。抗體基因藉由標準 方法(例如抗體基因片段及載體上之互補限制酶切位點之 接合,或若不存在限制酶切位點則鈍端接合)插入表現載 體中。本文中描述之抗體之輕及重鏈可變區可用於建置任 何抗體同型之全長抗體基因,其係藉由將抗體之輕及重鏈 可變區插入已編碼所需同型之重鏈恆定區及輕鏈恆定區之 表現載體中’以使得VH區段與載體内之CH區段可操作地 連接且VL區段與載體内之cl區段可操作地連接來建置。 另外或其他,重組表現載體可編碼信號肽以促進抗體鏈自 宿主細胞分泌。抗體鏈基因可經選殖至載體中以使得信號 肽以同框方式與抗體鏈基因之胺基末端連接。信號肽可為 免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(亦即來自非免疫球蛋白 蛋白質之信號肽)。 除抗體鏈基因之外,本發明之重組表現載體載有調節序 列以控制抗體鏈基因在宿主細胞中之表現。術語,,調節序 129562.doc -69- 200848076 列π意欲包括啟動子、強化子及其他控制抗體鏈基因之轉 錄或轉譯之表現控制元件(例如多聚腺嘌呤信號)。該等調 卽序歹J 例如描述於 Goeddel(Gene Expression Technology. 1990 Methods in Enzymology i85? Academic Press, San Diego,CA)中。熟習此項技術者應瞭解包括選擇調節序列 之表現載體之設計可視諸如待轉型之宿主細胞之選擇、所 需蛋白質之表現量等因素而定。哺乳動物宿主細胞表現之 調節序列包括引導哺乳動物細胞中高蛋白質表現量之病毒 元件,諸如由巨細胞病毒(CMV)、猿猴病毒4〇(sV4〇)、腺 病毒(例如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLp))及多形瘤衍生 之啟動子及/或強化子。或者,可使用非病毒調節序列, 諸如泛素啟動子或P-球蛋白啟動子。另外,調節元件由來 自不同來源之序列組成,諸如SRa啟動子系統,其含有來 自SV40早期啟動子之序列及人類τ細胞白血病病毒i型之 長末端重複序列(Takebe等人,1988 Mol· Cell. Biol. 8:466-472) 〇 除抗體鏈基因及調節序列之外,本發明之重組性表現載 體可載有其他序列’諸如調節載體在宿主細胞中之複製的 序列(例如複製起點)及可選擇的標記基因。可選擇的標記 基因有助於選擇載體已引入其中之宿主細胞(參見例如皆 ㈣等人之美國專利第4,399,216號、第4,634,665號及 第5,179,017號)。例如,通常,可選擇的標記基因將對於 諸如G418、濕黴素(hyg_yein)或甲胺嗓呤(細⑽觀⑷ 之藥物之抗性賦予載體已引人其中之宿主細胞。可選擇的 I29562.doc -70- 200848076 八己基口包括一氲葉酸還原_ (DHFR)基因(用於經甲胺嗓 呤選擇/擴增之dhfr-宿主細胞中)及ne〇基因(用於以以選 擇)。 對於輕鏈及重鏈之表現而言,編碼該等重鏈及輕鏈之表 見載體、、、玉由;f示準技術轉染至宿主細胞中。多種形式之術語 π轉染’’意欲涵蓋通常用於將外源性DN A引入原核或真核宿 主細胞中之多種技術,例如電穿孔、磷酸鈣沈澱、DEAE-葡聚糖轉染及其類似技術。理論上可在原核或真核宿主細 胞中表現本發明之抗體。討論抗體在真核細胞、尤其哺乳 動物彳s主細胞中之表現,此歸因於該等真核細胞且尤其哺 乳動物細胞與原核細胞相比更可能組裝及分泌適當摺疊且 具免疫活性之抗體。已報導抗體基因之原核表現對於產生 高產率之活性抗體而言無效(B〇ss及Wood, 1985
Immunology Today 6:12-13) ° 用於表現本發明之重組抗體之哺乳動物宿主細胞包括中 國倉鼠卵巢(CHO細胞)(包括dhfr-CHO細胞,Urlaub及 Chasin,1980 Proc· Natl· Acad· Sci· USA 77:4216-4220 中所 述,與DHFR可選擇之標記一起使用,例如如Kaufman及 Sharp,1982 Mol· Biol· 159:601-621 中所述)、NSO 骨髓瘤 細胞、COS細胞及SP2細胞。特定而言,為與NSO骨髓瘤 細胞一起使用,另一表現系統為展示於WO 87/04462、WO 8 9 / 0 10 3 6及E P 3 3 8,8 4 1中之G S基因表現系統。當將編碼抗 體基因之重組表現載體引入哺乳動物宿主細胞中時,該等 抗體係藉由將該等宿主細胞培養一段足以允許該抗體在宿 129562.doc 200848076 主細胞中表現或該抗體分泌至該等宿主細胞在其中生長之 培養基中的時間來產生。抗體可使用標準蛋白質純化方法 自培養基中回收。 雙特異性分子 在另一態樣中,本發明提供包含本發明之以結合分子 (例如抗C5抗體或其片段)之雙特異性分子。本發明之^結 合分子可衍生化或與例如另一肽或蛋白質之另一功能分子 (例如另一抗體或受體之配位體)連接以產生與至少兩個不 同結合位點或標靶分子結合之雙特異性分子。本發明之以 結合分子可實際上經衍生化或與—種以上其他功能分子連 接以產生與兩個以上不同結合位點及/或標靶分子結合之 多特異性分子;該等多特異性分子亦意欲由如本文中所用 之術語"雙特異性分子”涵蓋。為建置本發明之雙特異性分 子,本發明之抗體可與一或多種其他結合分子(諸如另1 抗體、抗體片&、肽或結合模擬物)在功能上連接(例如藉 Ο 由化學偶合、遺傳融合、非共價締合或以其他方式二 便產生雙特異性分子。 因此’本發明包括包含至少—種對於。抗原決定基之第 -結合特異性及對於第二標乾抗原決定基之第二結合特里 性的雙特異性分子。 ' 〃 在一態樣中,本發明之雙特異性分 刀卞包含作為結合特昱 性之至少一種抗體或其抗體片段,盆 ” 门千又其包括例如Fab、Fab,、 F(ab’)2、Fv或單鏈Fv。抗體亦可為輕 鍵或重鏈二聚體或其 任何袁小片段’諸如F v或單鏈構筚, 舟+體,如Ladner等人美國 129562.doc -72- 200848076 專利第4,946,778號中所述’該案内容以引用的方式明確地 併入。 本發明之雙特異性分子可藉由使用此項技術中已知之方 法結合组份結合特異性來製備。舉例而言,雙特異性分子 之各結合特異性可分別產生且隨後相互結合。當纟士人特異 性為蛋白質或肽時,可使用多種偶合劑或交聯劑進行共價 結合。交聯劑之實例包括蛋白質A、碳化二醯亞胺、n-號 ί白醯亞胺基-S-乙酿基-硫代乙酸酷(S ΑΤΑ)、5,5,-二硫代雙 (2-硝基苯甲酸)(DTNB)、鄰伸苯基二馬來醯亞胺(〇pDM)、 N-琥ίό醢亞胺基-3-(2-吼σ定基二硫基)丙酸醋(spDp)及續基 琥珀醯亞胺基4-(Ν-馬來醯亞胺曱基)環己烷_丨-曱酸醋(石黃
基-SMCC)(參見例如 Karpovsky等人,1984 J. Exp. Med. 160:1686 ; Liii 等人,1985 Pr〇c· Natl· Acad· Sci· USA 82:8648)。其他方法包括彼等描述於Paulus,1985 BehHng
Ins. Mitt·第 78, 1 18-132號;Brennan等人,1985 Science 229:81-83 及 Glennie 等人,1987 J. Immunol. 139: 2367-2375)中者。結合劑為皆可購自pierce chemicai Co.(Rockford,IL)之 SATA 及磺基-SMCC。 當結合特異性為抗體時,其可藉由兩個重鏈之C末端鉸 鏈區之氫硫基鍵來結合。在特定態樣中,在結合之前,鉸 鏈區經修飾以含有奇數個(例如一個)氫硫基殘基。 或者’兩種結合特異性可在同一載體中編碼且表現及組 裝於同一宿主細胞中。當雙特異性分子為mAbxmAb、 mAbxFab、FabxF(ab’)2或配位體xFab融合蛋白質時,此方 129562.doc -73- 200848076 法尤其適用。本發明之雙特異性分子可為包含一單鏈抗體 及結合決定子之單鏈分子或包含兩個結合決定子之單鏈雙 特異性分子。雙特異性分子可包含至少兩個單鏈分子。製 備雙特異性分子之方法例如描述於美國專利第5,260,203 號、第 5,455,030號、第 4,881,175號、第 5,132,405 號、第 5,091,513 號、第 5,476,786 號、第 5,013,653 號、第 5,258,498號及第 5,482,858號中。 雙特異性分子與其特定標把之結合可由例如酶聯免疫吸 附檢定(ELISA)、放射免疫檢定(REA)、FACS分析、生物 檢定(例如生長抑制)或西方墨點檢定確認。該等檢定之每 一者通常藉由採用對所關注之複合物具有特異性之經標記 試劑(例如抗體)偵測特別關注之蛋白質-抗體複合物是否存 在。 量測補艘活化
可使用各種方法來量測補體途徑分子之存在及補體系統 之活化(參見例如美國專利第6,0 8 7,1 20號及Newe 11等人,J
Lab Clin Med,100:43 7-44,1982)。例如,補體活性可藉由 以下方法來監控:(i)量測補體介導之紅血球溶胞(溶血作 用)之抑制;(ii)量測抑制C3或C5裂解之能力;及(iii)抑制 替代途徑介導之溶血作用。 兩種隶常用之技術為溶血檢定(參見例如BaatrUp等人,
Ann Rheum Dis,51:892-7, 1992)及免疫檢定(參見例如 Auda 等人,Rheumatol Int,10:185-9, 1990)。溶血技術量測整個 序列經典途徑或替代途徑之功能能力。免疫技術量測特定 129562.doc •74· 200848076 補體組份或分裂產物之蛋白質濃度。在本發明之方法中可 用於偵測補體活化或量測補體組份之活性之其他檢定包括 例如T細胞增殖檢定(Chain等人,J Immunol Methods, 99:221-8,1987)及遲發型超敏反應(DTH)檢定(Forstrom等 人,1983,Nature 303:627-629 ; Halliday等人,1982,in
Assessment of Immune Status by the Leukocyte Adherence Inhibition Test,Academic, New York,第 1-26 頁;Koppi 等 人,1982,Cell. Immunol. 66:394-406 ;及美國專利第 5,843,449號)° 在溶血技術中,全部補體組份必須均存在且起作用。因 此,溶血技術可篩選補體系統之功能完整性及缺陷(參見 例如 Dijk等人,J Immunol Methods 36: 29-39,1980 ; Minh 等人,Clin Lab Haematol· 5:23-34 1983 ;及 Tanaka等人,J Immunol 86: 161-170,1986)。為量測經典途徑之功能能 力,將以溶血素(綿羊紅金球之兔IgG)塗佈之綿羊紅血球 用作標靶細胞(致敏細胞)。當組份起作用且以適當濃度存 在時,此等Ag-Ab複合物活化經典途徑且導致標乾細胞之 溶胞。為測定替代途徑之功能能力,將兔紅血球用作標靶 細胞(參見例如美國專利第6,087,120號)。 溶血補體量測適用於偵測例如在個體之血液中之補體蛋 白質之缺陷及功能性障礙,此歸因於其基於補體誘導細胞 溶胞之功能,該功能需要完整範圍之功能性補體蛋白質。 測定經典途徑活化之所謂CH50方法及替代途徑之AP50方 法已藉由在高度稀釋之試樣含有未知濃度之限制性補體組 129562.doc -75- 200848076 份的同時使用特定經分離之補體蛋白質代替全血清而擴 展。藉由此方法可執行補體系統之更詳細量測,其指示哪 一組份為有缺陷的。 免疫技術採用針對各種補體組份(例如C3、C4及C5)之不 同抗原決定基的多株或單株抗體以偵測例如補體組份之分 裂產物(參見例如Hugli等人,Immunoassays Clinical
Laboratory Techniques 443-460,1980 ; Gorski 等人,J Immimol Meth 47: 61_73,1981 ; Linder等人,J lmmun〇l Meth 47· 49_59,1981 ;及 Burger 等人,J Immunol 141: 553-558,1988)。隨後可量測在與已知濃度之經標記分裂 產物之競爭下抗體與分裂產物之結合。諸如放射免疫檢 定、ELISA及徑向擴散檢定之各種檢定可用以偵測補體分 裂產物。 免疫技術提供偵測補體活化之高靈敏度,因為其允許量 測患有或未患與黃斑退化有關之病症之測試個體及對照個 體之血液中之分裂產物形成。因此,在本發明之一些方法 中’與眼睛病症相關之病症之診斷藉由經由量化獲自測試 個體之血漿中之補體組份(例如C3a、C4a、C5a及C5b-9末 端複合物)之可溶性分裂產物量測異常補體活化來獲得。 ϊ 測可如例如 Chenoweth等人,N Engl J Med 304: 497-502,1981 ,及 Bhakdi 等人,Biochim Biophys Acta 737: 343-372,1983中描述來執行。較佳地,僅量測在活體内形 成之補體活化。此可藉由將獲自個體之生物試樣(例如血 >月)收集於含有補體系統之抑制劑的培養基中且隨後量測 129562.doc -76- 200848076 試樣中之補體活化(例如量化分裂產物)來實現。 斷 相 病 在〜有’、眼目月疾病或病症相關之病症之患者的臨床診 〆皿控中與獲自正常個體之相應生物試樣中之含量 比,偵測到補體蛋白質指示患者患有與黃斑退化相關之 症0
Ο '舌體内0斷或成像描述於US2006/0067935中。簡言之, 此等方法通㈢包含將診斷有效量之與可藉由非侵入性方法 偵測之標1己或標籤可操作地連接之〇5結合分子投與或引入 患者體内。允許抗體_標記結合物歷經足夠時間以定位且 與眼睛内之補體蛋白質結合。隨後將患者暴露於彳貞測裝置 以識別可偵測標記,由此形成患者眼睛中之C5結合分子之 位置之影像。C5結合分子或其複合物之存在藉由判定抗 體-標記是否與眼睛之組份結合來偵測。與未患amd疾病 之正常個體相比,偵測到所選擇之補體蛋白質或蛋白質組 合之含量增加指示與黃斑退化相關之病症之素質及/或發 作。本發明之此等態樣較佳亦用於眼睛成像方法及組合之 血管生成診斷及治療方法中。 在另一態樣中,在無細胞檢定中,可使C5蛋白質或抗原 決定基與結合C5蛋白質之已知結合分子接觸以形成檢定混 合物,隨後使該檢定混合物與測試化合物或結合分子接 觸’以測定測試化合物或結合分子與C5蛋白質相互作用勝 過與已知化合物相互作用之能力。 轉殖基因動物 可使用本發明之化合物或結合分子形成轉殖基因動物。 129562.doc -77- 200848076 特定而言,轉殖基因非人類動物可藉由將野生型或突變核 酸分子插入伯主動物之細胞中來形成。核酸分子插入宿主 動物細胞中可藉由包括(但不限於)轉染、粒子轟擊、電穿 孔及微注射之多種方法來發生。插入可進行至生殖系、胚 胎或成熟個體伯主動物細胞中。 例如,在恕樣中,本發明之宿主細胞為C5蛋白質編碼 序列已引入其中之叉精印或胚胎幹細胞。隨後可使用此等 宿主細胞建置外源性C5核酸序列已引入其基因組中之非人 類轉殖基因動物或其中内源性。序列已改變之同源重組動 物。該等動物適用於研究以蛋白質之功能及/或活性及用 於識別及/或評估蛋白質活性之調節劑。如本文中所用, 轉殖基因動物"為非人類動物,較佳為哺乳動物,更佳為 諸如大鼠或小鼠之餐齒動物,其中動物之一或多種細胞包 括轉殖基因。轉殖其闵私私廿 得歹直基因動物之其他實例包括非人 類、錦羊、狗、牛、山羊、雞、兩棲動物等。、 ^直^為外源性罐,其經整合至轉殖基因動物由其 之基因組中且保持於成熟動物之基因組令,夢 所編碼之基因產物在轉殖基因動物之-或多種細二 類型(例如肝臟或組織)中之表現。如本 一"'、匕 ,、,動物為非人類動物,較佳為哺乳動物 其中在動物於言夕义一、 尺1主马小取, 基因i引入動物,:源、性C5蛋白質基因已藉由内源性 引入動物細胞(例如動物之胚細胞)中之外…
分子之間之同源重組而改變。 卜源性DNA 本發明之轉殖基因動物 释田將C5蛋白質編碼核酸引入 129562.doc -78- 200848076
因DNA雜交而分離且用作轉殖基因。 。或者,C5蛋白質基因 基因)可基於與人類基 。内含子序列及多聚腺 嗓吟信號亦可包括於轉殖基因中以增加轉殖基因之表現之 有效性。組織特異性調節序列可與C5蛋白質轉殖基因可操 作地連接以引導蛋白質表現至例如肝細胞之特定細胞中^ 經由胚處理及微量注射產生轉殖基因動物、尤其諸如小鼠 之動物之方法在此項技術中已習知且例如描述於美國專利 第 4,736,866號、第 4,870,009號及第 4,873,191 號;及H〇gan, 1986 之 MANIPULATING THE MOUSE EMBRYO,Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 中。類似方法用於產生其他轉殖基因動物。 非人類轉殖基因動物之純系亦可根據Wilmut等人, 1997· Nature 385: 810-813中描述之方法來產生。簡言之, 獲自轉殖基因動物之細胞(例如體細胞)可經分離且誘導以 退出生長週期且進入G0期。隨後休眠細胞可例如經由使用 電脈衝與休眠細胞自其分離之同一動物物種的去核卵細胞 融合。隨後將經重建之卵細胞培養以使其發育成桑椹胚或 胚細胞且隨後轉移至假孕雌性寄養動物中。此雌性寄養動 物生育之後代將為細胞(例如體細胞)自其分離之動物之純 系。 129562.doc -79- 200848076 診斷檢定 在本文中硪別之抗原決定基序列(及相應完整基因序列) 可以夕種方式用作聚核苷酸試劑。舉例而言,且不欲限 制’此等序列可用於:⑴將其各別基因在染色體上定位; 且由此定位與遺傳疾病相關之基因區域;(ii)自細微生物 試樣(組織分型)識別個體;及(iii)輔助生物試樣之法醫識 別。 在怨樣中,本發明涵蓋在生物試樣(例如血液、血 ’月、細胞、組織)之情況下或自罹患疾病或病症或處於發 展與AMD相關之病症之危險中之個體,測定C5蛋白質及/ 或核酸表現以及C5蛋白質功能的診斷檢定。 、 諸如肌爭檢定之診斷檢定依賴經標記之類似物示蹤劑,,) 與試樣分析物競爭共同結合搭配物上之有限數目之結合位 點的能力。通常在競爭之前或之後使結合搭配物變得不可 溶解且隨後使與結合搭配物結合之示蹤劑及分析物與未結 合的示蹤劑及分析物分離。此分離藉由傾析(其中預先= 結合搭配物變得不可溶解)或藉由離心(其中結合搭配物在 競爭反應之後沈澱)來實現。試樣分析物之量與如標記物 貝之里所篁測之結合示蹤劑之量成反比。製作已知量之分 析物之劑里-反應曲線且將其與測試結果相比較以便定量 確定存在於試樣中之分析物之量。當酶用作可偵測標記 時,此等檢定稱作ELISA系統。在此形式之檢定中,抗體 與抗C5抗體之間之競爭性結合導致結合之C5蛋白質、較 佳本發明之C5抗原決定基成為血清試樣中之抗體、更特定 129562.doc -80 - 200848076 言之血清試樣中之中和抗體之度量。 该檢定之顯著優點為直接進行中和抗體(亦即干擾c5蛋 白質、尤其抗原決定基之結合之彼等抗體)之量測。尤其 呈ELISA測試形式之該檢定在臨床環境及常規血液篩查中 具有相當多的應用。 本發明亦係關於預測醫學領域,其中診斷檢定、預後檢 • 定、藥物基因組學及監控臨床試驗用於預後(預測)目的以 藉此預防性地治療個體。 ζ% V 本發明亦提供測定個體是否處於發展與補體途徑活性之 调即異常相關之病症的危險中之預後(或預測)檢定。例 如,可在生物試樣中檢定C5基因中之突變。該等檢定可用 於預後或預測目的以藉此在WC5蛋白質、核酸表現或活性 為特徵或與其相關之病症發作之前預防性地治療個體。 本發明之另一態樣提供測定個體中之C5核酸表現或C5 蛋白貝活性以藉此選擇彼個體之適當治療劑或預防劑之方 法(在本文中稱為’,藥物基因組學’,)。藥物基因組學允許基 於個體之基因型(例如經檢查以測定個體對特定藥劑作出 • 反應之能力的個體之基因型)來選擇治療性或預防性治療 個體之藥劑(例如藥物)。 Λ月之另恶樣係關於在臨床試驗中監控藥劑(例如 藥物)對於C5蛋白質之表現或活性的影響。 除在此等方法中使用C5核酸及蛋白質以外,可如上所述 5、、、σ合分子以便治療如上所述之根據本發明已經發 現涉及新血管生成、發炎之病症及疾病。 129562.doc -81 - 200848076 醫藥組合物 可投與游離形式或醫藥學上可接受之鹽形式之本發明之 化合物及結合分子、載劑、賦形劑及穩定劑。該等組合物 可以習知方式製備且展現與游離化合物相同之活性等級。 (Remington’s Pharmaceutical 8仏臟3第16版,〇s〇i,a 編 [1980]) 〇 抗C5抗體或抗C5抗體片段例如在治療如上文指定之涉 及發炎性或新血管事件之眼科疾病及病症中之效用可在動 物試驗方法中以及例如根據在下文描述之方法在臨床中證 明。 根據本發明,本發明之化合物及結合分子可藉由任何習 知路徑投與,尤其例如呈錠劑或膠囊之形式經腸(例如經 口)技與,或例如呈可注射溶液或懸浮液之形式非經腸(較 佳經皮下、靜脈内或眼内、玻璃體内或結膜下 (subconjuncUvaUyh^ 結膜下(subten〇n,s))投與例如呈溶 液、凝膠劑、膏劑或乳膏之形式或以經鼻、經皮貼片或栓 劑形式局部投與(較佳以投與眼睛之眼用溶液形式)。 包含呈游離形式或呈醫藥學上可接受之鹽形式之本發明 之化合物及結合分子以及至少一種醫藥可接受之載劑或稀 釋劑的商藥組合物可以習知方式藉由與醫藥學上可接受之 載劑或稀釋劑混合來製造。經口投藥之單位劑型含有例如 約〇· 1 mg至約500 mg之活性物質。 較佳地,本發明之化合物及結合分子(諸如抗以抗體或 其片段)經局部例如向眼睛之表面投與,或例如經靜脈 129562.doc -82- 200848076 内、玻璃體内、眼内、結膜下或皮下非經腸投與。 在實踐本發明之方法中所要求之每曰劑量將視(例如)所 二化合物或結合分子、宿主、投藥方式、待治療之病症的 嚴重程度而變化。 由本文中揭示之筛選檢定所識別之化合物或結合分子可 使用此項技術中熟知之標準技術以類似方式來調配。 製品
L 在本I明之另一特徵中,提供含有適用於診斷或治療如 上所述之病症之材料(例如包含本發明之化合物或結合分 子)的製品。_製品包含一容器及一用法說明書。合適之 容器包括(例如)瓶、小瓶、注射器及試管。該等容器可由 諸如玻璃或塑膠之多種材料形成。容器容納對診斷或治療 病狀有效之組合物且可具有無菌入口孔(例如容器可為具 有可由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈内溶液袋或小瓶 組合物中之活性劑通常為本發明之多肽或抗體。容器上或 與容器相關聯之用法說明書或標籤指示該組合物用於診斷 或治療所選之病狀。該製品可另外包含一包含醫藥學上可 接叉之緩衝液(諸如磷酸鹽緩衝鹽水、林葛爾氏溶液 (Ringer’s solution)及/或右旋糖溶液)的第二容器。其可另 外包括其他由商業及使用者觀點出發所需之物質,包括其 他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針、注射器及具有使用說明 之藥品說明書。 已充分描述之本發明進一步由以下實例及申請專利範圍 來說明,該等實例及申請專利範圍係說明性的且並非意欲 129562.doc -83 - 200848076 進行進-步限制。熟習此項技術者將 用常規實驗來確定本文中所述^4僅僅使 嗲笼望w 1 义之特疋紅序的許多等效物。 ㈣專效物處於本” W請專㈣圍之 :申請案所引用之包括已頒予之專利及已公開之專:: 案的所有參考文獻之内容以引料方式併人本文中 實例 又〒 實例1 在大多數情況下,歸因於小鼠與人類之間之C5蛋白質序 列之較低保守性,針對人類C5培育之抗體並不展示與小鼠 C5結合。由此’在功能性檢定中保留活性之嵌合。蛋白 質(含有人類及小氣蛋白質序列)可用於測定抗人類抗⑽ 體之抗原決定基。 表現人類α鏈/小鼠β鏈;或小鼠α/人類β鍵之dna構築體 可用於將抗體定位至人類…鏈上之抗原決定基。呈質體 形式之嵌合人類/小鼠C5構築體之DNA獲自GeneArt。使用 表現接枝於人類C5蛋白質序列中以取代其各別人類序列之 1 〇 〇個胺基酸小鼠蛋白質序列段的欲合構築體來將鍵内之 抗原決定基精細定位。各嵌合蛋白在其#端處含有組胺 酸段以便親和純化。 使用標準技術(參見Sambrook,Maniatis等)將編碼來自質 體之肷合蛋白質之插入物分離、選殖至哺乳動物表現載體 (例如PCDNA3.1)中以產生經編碼之蛋白質。簡言之,將 293T細胞以6xl06個細胞/1〇〇毫米板而塗覆於不具有青黴 素-鏈黴素之 DMEM(Gibco 1 1995-073)、10% FBS(HyCl〇ne 129562.doc -84- 200848076 SH30070.03)中。P遺後,使用混合於 750 μΐ iOPTI-MEM(Gibco 5 1985-034)最終物中之10 pg之含有嵌合人類/ 小鼠蛋白質編碼序列之質體構築體達成轉染。設置用於十 個100 mm板之轉染混合物。將30 μΐ Lipofectamine 2000 (Invitrogen 1 1668-019)與 720 μΐ OPTI-MEM(每 100 mm板) 混合。轉染之後24小時,將板以IS GRO培養基(Irvine Scientific 91103)洗滌,將6 ml之新IS GRO培養基添加至各 板中且培育24-48小時。收穫所得上清液。將新IS GRO培 養基添加至各板中且將細胞培育24-48小時以便再次收 穫。通常,執行相同過程以第三次收穫上清液。 將上清液經0.2微米過濾器過濾且進一步純化(或者上清 液可儲存於80°C下直至純化)。可使用習知純化方法。簡 言之,將無EDTA之蛋白酶抑制劑混合物旋劑(Roche)添加 至上清液中且將pH值以NaOH調整至8。將Ni-NTA樹脂以 PB S、1 0 mM味嗤(pH值7.4)及蛋白酶抑制劑來平衡。將上 清液與樹脂(1 · 5 mL BV)結合1小時且施加於重力流動管 柱。將管柱洗滌且將蛋白質以PBS、300 mM咪唑(pH值 7.4)及蛋白酶抑制劑之溶液來溶離。將溶離份在電泳凝膠 上測試。將溶離份彙集且在PBS(pH值7.4)中滲析以移除咪 峻。測試蛋白質之純度及活性。 C5抗原性抗原決定基之識別 藉由使用競爭性ELIS A檢定研究抗C5抗體片段(Fab)及全 長IgG之抗原決定基定位。亦研究對抗5Gl.l(a鏈結合物, Thomas TC 等人,Molecular Immunology,33,1 389-140 1, 129562.doc -85 - 200848076 (1996))抗體及Νΐ9/8(β鏈結合物,Evans MJ等人, Molecular Immunology,332 1 1 83-1 195,(1995))抗體之競 爭。如下文進一步描述,可使用若干ELISA檢定。一種檢 定使用塗佈於板上之5G1.1或N19/8,使用原生C5且偵測抗 體之結合。使用C5之β鏈具有小鼠來源且α鏈具有人類來源 之嵌合C5蛋白質或如上所述之其他嵌合以蛋白質。另一 檢定涉及溶液相競爭,其中Fab或IgG以至少10倍莫耳過量 與生物素-C5—起預培育,隨後添加至以抗C5 Fab或抗體 塗佈之板中且以抗生蛋白鏈菌素-HRP偵測。此等實驗之結 果指示抗體候選物是否競爭與5G1.1、N19/8或所選擇之其 他抗體候選物相同之結合位點。結果亦指示測試抗體是否 結合人類C5蛋白質之α或β鏈。 5G1.1與嵌合人類/小鼠C5競爭 將Maxisorp Plate Nunc. 442404以100微升/孔體積以濃度 為4 pg/ml之處於碳酸鹽緩衝液(Pierce 28382)(pH值9.6)中 之抗人類C5純化Fab及Mab塗佈。將板密封且置於4°C下隔 夜。隨後將板抽吸且以300微升/孔體積之卩88/0.5%吐溫 20(PBST)洗滌三次。將板以300微升/孔SynBlock(AbD Serotec BUF034C)阻斷且在室溫下培育兩小時,隨後以 300微升/孔體積之PBST洗滌一次。將來自經小鼠/人類嵌 合C5蛋白質轉染之293T細胞的上清液於稀釋劑(2% BSA Fraction V(Fisher ICN16006980)、0.1% 吐溫 20(Sigma P1379)、0.1% Triton-x-100(Sigma P234729)、PBS)中 1:8稀 釋且以100微升/孔添加,或將純化之人類C5(Quidel A403) 129562.doc -86- 200848076 於稀釋劑中稀釋至1 pg/ml且以100微升/孔添加至該板中。 將板在室溫下培育一小時且以300微升/孔體積之PBST洗滌 三次。將5G1.1 IgG以1 pg/ml稀釋於稀釋劑中,且以100微 升/孔添加至該板中。將板在室溫下培育一小時且於PBST 中洗滌三次。將偵測抗體抗人類IgG Fc-HRP(Pierce 3 1125) 以1:5000稀釋且以100微升/孔添加至該板中。將板在室溫 下培育一小時且以PBST洗滌四次。隨後以100微升/孔添加 TMB受質(Pierce 34028)。將板在室溫下培育10分鐘+/-2分 鐘且以50微升/孔添加停止溶液(2 N H2S04)。在Spectramax 45 0 nm-5 70 nm中讀取吸收率。 與生物素化之人類C5之競爭 將Maxisorp Plate Nunc. 442404以5 0微升/孔體積以濃度 為5 pg/ml之處於碳酸鹽緩衝液(Pierce 28382)(pH值9.6)中 之經純化之抗人類C5 Fab及IgG塗佈。將板密封且在室溫 下置於震盪器上4小時。隨後將板抽吸且以PBST洗滌三 次。將板以 300 微升 / 孔 SuperBlock PBS(Pierce 375 15)阻斷 且在室溫下培育兩小時。隨後將板以PBST洗滌一次。將 抗人類C5 Fab/Mab經濃度為0.25 pg/ml之生物素化之C5 (Morphosys)在Superblock中稀釋至濃度為5 pg/ml且培育一 小時,隨後以50微升/孔添加至板中。將板在室温下培育 一小時且以300微升/孔體積之PBST洗滌三次。將聚抗生蛋 白鏈菌素-HRP(Endogen N200)在 Superblock 中 1:5000 稀釋 且以100微升/孔添加至該板中。將板在室溫下培育30分鐘 且以PBST洗滌三次。隨後以100微升/孔添加TMB受質 129562.doc -87- 200848076 (Pierce 34028)。將板在室溫下培育l〇分鐘+/·2分鐘且以50 微升/孔添加停止溶液(2 N H2S04)。在Spectramax 45 0 nm· 5 70 nm中讀取吸收率。 用5G 1.1及N1 9/9之競爭檢定 將Maxi sorp Plate Nunc. 442404以微升/孔體積以濃度 為5 pg/ml之處於碳酸鹽緩衝液(Pierce 28382)(pH值9·6)中 之抗人類C5 IgG 5G1.1或Ν19/8塗佈。將板密封且置於4°C 隔夜。隨後將板抽吸且以PBST洗滌三次。將板以300微升/ 孔稀釋劑/Block(4% BSA Fraction V(Sigma A403)、0.1%吐 溫 20(Sigma P1379)、0.1% Triton-x-l〇〇(Sigma P234729)、 PBS)阻斷且在室溫下培育兩小時。隨後將板以PBST洗滌 一次。將抗人類C5 Fab/Mab經濃度為0.5 pg/ml之純化 C5(Quidel A403)在稀釋劑中稀釋至濃度為2.5 gg/ml且培育 30分鐘,隨後以100微升/孔添加至板中。將板在室溫下培 育一小時。將板以PBST洗滌三次。將抗-his(Roche 1 1965085〇01)在稀釋劑中稀釋為20〇11111/1111或將山羊抗小 鼠 Ig-HRP(BD Pharmingen 554002)以 1:5000 稀釋,且以 1〇〇 微升/孔添加至該板中。將板在室溫下培育一小時且於 PBST中洗滌三次。隨後以100微升/孔添加TMB受質(Pierce 3 4028)。將板在室溫下培育5-10分鐘且以50微升/孔添加停 止溶液(2 N H2S〇4)。在 Spectramax 450 nm-570 nm 中讀取 吸收率。 實例2藉由噬菌體呈現來產生人類抗體 為產生針對C5之抗體,進行MorphoSys HuCAL GOLD® 129562.doc -88 - 200848076 噬菌體呈現庫之選擇。HuCAL GOLD為基於HuCAL概念之 Fab庫,其中全部六個CDR均經多樣化,且其採用 CYSDISPLAY技術以將Fab片段與噬菌體表面連接(Knappik 等人,2000 J. Mol. Biol. 296:57-86 ; Krebs 等人,2001 J Immunol. Methods 254:67-84 ; Rauchenberger等人,2003 J Biol Chem. 278(40):38194-38205 ; WO 01/05950, Lohning, 2001) 〇 噬粒救護、噬菌體擴增及純化
HuCAL GOLD庫在含有34 pg/ml氯黴素及1°/。葡萄糖之 2xYT培養基(2xYT-CG)中擴增。在0.5之OD600 nm下感染 VCSM13輔助噬菌體(37°C下歷經30分鐘,無震盪;37°C下 歷經30分鐘以250 rpm震盪)之後,使細胞旋轉減慢(4120 g ; 5分鐘;4°C),再懸浮於2xYT/34 gg/ml氯黴素/50 pg/ml 康黴素(kanamycin)/0.25 mM IPTG中且使其在22°C下生長 隔夜。使噬菌體自上清液PEG沈澱兩次,再懸浮於 PBS/20%甘油中且儲存在_80〇C下。 如下進行兩輪淘選之間之嗟菌體擴增:將中對數期大腸 桿菌TG1細胞以溶離之噬菌體感染且塗覆於補充有1%葡萄 糖及34 pg/ml氯黴素之LB·瓊脂(LB-CG板)上。在30°C下培 育隔夜之後,將TG1菌落自瓊脂板刮下且用以接種2xYT-CG直至OD6〇〇 nm達到0.5且添加VCSM13輔助噬菌體以進行 如上所述之感染。
HuCAL GOLD之淘選 為選擇辨識C5之抗體,應用兩種不同淘選策略。總而言 129562.doc -89- 200848076 之,將HuCAL GOLD噬菌體_抗體劃分成包含不同組合之 VH主宰基因之四個集合(集合i ·· vm/5 ^,集合2 ·· λκ ’集合3 : VH2/4/6 λκ,集合4 : VH1_6 λκ)。此等集合個 別地經文二輪針對直接塗覆至Maxis〇rp板之人類C5的固相 淘選及另外三輪針對生物素化〇5抗原之溶液淘選。 第一種淘選變化形式為針對C5之固相淘選:Maxis〇rp板 (F96 Nimc_Immunoplate)上之 2個孔以 3〇〇 μ1 之 $ gg/ml c5 塗 佈-各自在4t:下隔夜。將經塗佈之孔以35〇 y pBS洗滌兩 次且在室溫下在微量滴定板震盪器上以35〇卜丨5% ]^1>6§阻 斷2小時。對於各淘選,在室溫下將約1〇〗3 HuCA]l g〇ld 噬菌體-抗體以相等體積之pbst/5% MP阻斷2小時。在阻 斷之後,將經塗佈之孔以350 μ1 PBS洗滌兩次。將3〇〇 μ1 之經預阻斷之HuCAL GOLD®噬菌體-抗體添加至各經塗佈 之孔中且在室溫下在震盪器上培育2小時。藉由添加五次 350 μΐ PBS/0.05%吐溫來執行洗滌,繼之再以pBS洗滌四
次。以每孔 10 mM Tris/HCl(pH 值 8)中之300 μΐ 20 mM DTT 執行噬菌體自板溶離歷經1 〇分鐘。將DTT噬菌體溶離液添 加至14 ml之大腸桿菌TG1中,使其在37。〇下在2γτ培養基 中生長至0.6-0.8之OD^o且在不震盪的情況下在3rc下在 50 ml塑膠官中培育45分鐘以進行噬菌體感染。以5〇〇〇rpm 離心ίο分鐘之後,將細菌小球各自再懸浮於50〇 μ12χΥΤ培 養基中,塗覆於2xYT-CG瓊脂板上且在30°C下培育隔夜。 隨後將菌落自板刮落且如上所述救護且擴增噬菌體。除增 加洗滌程序之嚴格性之外,根據第一輪之協定對直接塗佈 129562.doc -90- 200848076 之C5^/u原執行弟二輪及第三輪固相淘選。 第二淘選變化形式為針對生物素化之人類C5抗原之溶液 淘選··對於溶液淘選,使用與Dynabeads M-280(Dynal)偶 合之生物素化之C抗原,應用以下協定··在4。〇下將丨·5 mi Eppendorf管以用 PBS 1:1 稀釋之 h5 ml 2xChemibl〇cker阻 斷隔夜。將經200 μΐ抗生蛋白鏈菌素塗佈之磁性Dynabeads M-280(Dynal)以200 μΐ PBS洗滌1次且使其再懸浮於200 μ1 lxChemiblocker(於PBS中稀釋1次)中。在4。〇下在預阻斷管 中執行珠粒之阻斷隔夜。在室溫下將針對每一淘選條件在 500 μΐ PBS 中稀釋之噬菌體與 500 μ1 2xChemibl〇cker/〇 1〇/〇 吐溫混合1小時(旋轉器)。將噬菌體之預吸附執行兩次:將 5 0 μΐ之經阻斷之抗生蛋白鏈菌素磁性珠粒添加至經阻斷之 嗟fe體中且在室溫下在旋轉器上培育3 〇分鐘。經由磁性裝 置(Dynal MPC-E)分離珠粒之後,將噬菌體上清液(約1 ml) 轉移至新阻斷管中且對50 μΐ阻斷珠粒重複預吸附3〇分鐘。 隨後’將200 ηΜ生物素化之C5添加至新阻斷ΐ·5 mi管中之 經阻斷之噬菌體中且在室溫下在旋轉器上培育1小時。將 1 00 μΐ之經阻斷之抗生蛋白鏈菌素磁性珠粒添加至各淘選 嗟菌體池中且在室溫下在旋轉器上培育10分鐘。將與生物 素化之C5結合之噬菌體固定至磁性珠粒且以磁性顆粒分離 器(Dynal MPC-E)收集。隨後使用旋轉器將珠粒在 PBS/0.05%吐溫中洗滌7次,繼之再以PBS洗滌三次。將1〇 mM Tris/HCl(pH值8)中之300 μΐ 20 mM DTT添加至各管中 歷經10分鐘來執行噬菌體自Dynabeads溶離。藉由磁性顆 129562.doc -91 - 200848076 粒分離器移除Dynabeads且將上清液添加至14⑺丨之大腸桿 菌丁0-1培養物中’使其生長至0.6-〇.8之01)6〇〇_。隨後將 珠粒以200 μΐ PBS洗滌一次且連同額外移除之嗟菌體一起 將PBS添加至14 ml大腸桿菌TG-1培養物中。為進行噬菌體 感染,在不震盪的情況下將培養物在37下在50ml塑膠管 中培育45分鐘。以5000 rpm離心10分鐘之後,將細菌小球 各自再懸浮於500 μΐ 2xYT培養基中,塗覆k2xYT-cg瓊脂 板上且在30°C下培育隔夜。隨後將菌落自板到落且如上所 述救護且擴增噬菌體。 除增加洗滌程序之嚴格性之外,根據第一輪之協定對生 物素化之C 5抗原執行第二輪及第三輪溶液淘選。 可溶性Fab片段之次選殖及表現 將所選擇之HuCAL GOLD®噬粒之Fab編碼插入物次選殖 至表現載體pMORPH®X9_Fab_FH中以有助於可溶性Fab之 快速及有效表現。為此目的,將所選擇之純系之質體DNA 以Zkl及五coRI消化,藉此切除Fab編碼插入物(ompA-VLCL及phoA-Fd),且選殖至X厶aI/£c〇Rj消化之表現載體 pMORPH⑧X9—FabJFH中。自此載體表現之Fab載有用於偵 測與純化之兩個C末端標記物(分別為FLAG™及6xHis)。 HuCAL GOLD® Fab抗體在大腸桿菌中之微表現 將所選擇之Fab次選殖至pMORPH®X9_Fab_FH表現載體 中之後所獲得之氯黴素抗性單一菌落用以接種每孔含有 100 μΐ 2xYT-CG培養基之無菌96孔微量滴定板之孔且在 37°C下生長隔夜。將5 μΐ之各大腸桿菌TG-1培養物轉移至 129562.doc -92- 200848076 每孔以補充有34 pg/ml氯黴素及0.1%葡萄糖之100 μΐ 2χΥΤ 培養基預填充的新無菌96孔微量滴定板中。將微量滴定板 在30°C下在微板震盪器上以400 rpm震盪而培育,直至培 養物呈微混濁(約2-4小時),OD6G() _為約0.5。 向此等表現板中,每孔添加補充有34 pg/ml氯黴素及3 mM IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)之20 μΐ 2xYT培 養基(最終濃度0.5 mM IPTG),微量滴定板以透氣膠帶密 封,且將板在30°C下以400 rpm震盪下培育隔夜。 全細胞溶胞產物(BEL提取物)之產生:向表現板之各孔 中添加含有2.5 mg/ml溶菌酶之40 μΐ BEL緩衝液 (2xBBS/EDTA : 24.7 g/1 硼酸、18.7 g NaCl/1、1.49 g EDTA/l(pH值8.0))且在22°C下在微量滴定板震盪器(400 rpm)上培育1小時。將BEL提取物用於藉由ELISA或 BioVerisM-series®384分析器之結合分析。 酶聯免疫吸附檢定(ELISA)技術 在4它下將5 pg/ml之處於PBS中之人類重組C5抗原塗佈 於384孔Maxisorp板(Nunc-Immunoplate)上隔夜。在塗佈之 後,將孔以PBS/0.05%吐溫(PBS-T)洗滌一次且以PBS洗滌 兩次。隨後將孔在室溫下以具有2 % B S A之P B S - T阻斷2小 時。並行地,在室溫下將15 μΐ BEL提取物及15 μΐ具有2% BSA之PBS-T培育2小時。將阻斷Maxisorp板以PBS-T洗滌 三次,隨後將10 μΐ之經阻斷之BEL提取物添加至孔中且在 室溫下培育1小時。為偵測一次Fab抗體,應用以下二次抗 體:鹼性磷酸酶(AP)結合之AffiniPure F(ab’)2片段、山羊 129562.doc -93- 200848076 抗人類IgG、山羊抗小鼠IgG或山羊抗綿羊IgG(Jackson Immuno Research)。為摘測AP-結合物,根據製造商之用 法說明來使用如AttoPhos(Roche)之螢光受質。在所有培育 步驟之間,將微量滴定板之孔以PBS-T洗滌三次且在最終 與二次抗體一起培育之後洗滌三次。可在TECAN Spectrafluor板讀取器中量測螢光。
HuCAL GOLD® Fab抗體在大腸桿菌中之表現及純化 由pMORPH®X9_Fab—FH編碼之Fab片段在TG-1細胞中之 表現在使用750 ml之補充有34 pg/ml氯黴素之2xYT培養基 的震盪器瓶培養物中進行。培養物在30°C下震盪直至 〇D60〇 _達到0.5。表現藉由在30°C下添加0.75 mM IPTG歷 時20小時來誘導。使用溶菌酶破壞細胞且Fab片段藉由Ni-NTA層析(Qiagen,Hilden,Germany)分離。蛋白質濃度可藉 由UV-分光光度測定法測定(Krebs等人,J Immunol Methods 254, 67-84 (2001) °
129562.doc -94-
Claims (1)
- 200848076 十、申請專利範圍: ^.一種分離之聚核苦酸,其具有與—個選自由seqidn〇 2、4及6組成之群之核酸序列至少95%核酸序列一致性。 2. —種分離之聚核苦酸,其包含一個選自由SEQmN〇2、 4及6組成之群之核酸序列。 3. -種載體,其包含如請求項2之聚核苦酸可操作地連接 於一個控制序列。 4· 一種宿主細胞,其包含如請求項3之載體。 5· —種分離之多肽,其具有與一個選自由wQmNoh) 及5組成之群之胺基酸序列至少95%胺基酸一致性。 6· —種分離之多肽,其包含一個選自由seqidn〇 i、^及^ 組成之群之胺基酸序列。 7· 一種產生C5蛋白質之方法’該方法包含如請求項#之宿 主細胞在適於表現該多肽之條件下培養及自該細胞培養 物回收該多肽。 乂 8·如請求項7之方法,其中該等C5蛋白f包含選自由剛 ID No 1、3及5組成之群之抗原決定基(eph〇pes)。 9·種刀離之C5結合分子,丨包含抗體之抗原結合部分, 該抗原結合部分與一個在選自由SEQ ID No 1、3及5組成 之群之胺基酸内或與該等胺基酸重疊之C5抗原決定基 異性結合。 女明求項9之C5結合分子,其中該抗原結合部分係與非 人類靈長類之C5抗原交又反應。 η·如請求項9之C5結合分子,其中該抗原肖合部分係與餐 129562.doc 200848076 齒動物物種之C 5抗原交叉反應。 12. 如請求項9之C5結合分子,其中該抗原結合部分與線性 抗原決定基結合。 13. 如請求項9之C5結合分子,其中該抗原結合部分與非線 性抗原決定基結合。 14. 如請求項9之C5結合分子,其中該抗原結合部分以等於 、 或小於0.1 nM之KD與人類C5抗原結合。 1 5.如請求項9之C5結合分子,其中該抗原結合部分以等於 € 或小於0.3 nM之KD與非人類靈長類之C5抗原結合。 16.如請求項9之C5結合分子,其中其該抗原結合部分以等 於或小於0.5 nM之KD與小鼠C5抗原結合。 1 7.如請求項9之C5結合分子,其中該抗原結合部分為人類 抗體之抗原結合部分。 18. 如請求項9之C5結合分子,其中該抗體為人類化抗體。 19. 如請求項9之C5結合分子,其中該抗原結合部分為單株 抗體之抗原結合部分。 1; 20. 如請求項9之C5結合分子,其中該抗原結合部分為多株 抗體之抗原結合部分。 • 21.如請求項9之C5結合分子,其中該C5結合分子為嵌合抗 - 體。 22. 如請求項9之C5結合分子,其中該C5結合分子包含該抗 體之Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2或Fv片段。 23. 如請求項9之C5結合分子,其中該C5結合分子包含單鏈 Fv 〇 129562.doc 200848076 24·如請求項9之C5結合分子,其中該C5結合分子包含雙功 月匕抗體(diabody)。 25·如請求項9之C5結合分子,其中該抗原結合部分係由以 下同型之一之抗體衍生:IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。 26·如請求項9之C5結合分子,其中該抗原結合部分係由以 下同型之一之抗體衍生:IgGl、IgG2、IgG3或IgG4,其 中Fc序列已相對於正常序列改變以調節效應功能或改變 與Fc受體之結合。 27·如請求項9iC5結合分子,其中該C5結合分子抑制細胞 中之mac產生。 28·如請求項9之以結合分子,其中該〇5結合分子抑制^與 轉化酶之結合。 29. —種抑制細胞中MAc合成之方法,該方法包含使細胞與 C 5結合分子接觸。 3〇· 一種調節補體系統所介導之細胞活性之C5結合分子的用 途’其係用於製造供調節個體MAC活性之藥物。 31· 一種與一個選自SEQ ID No 1、3及5之抗原決定基特異性 結合之結合分子的用途,其係用於製造供治療或預防個 體眼睛病症之藥物。 32. 如請求項3 1之用途,其中相對於投與該結合分子之前個 體體内之MAC含量,該個體之MAC含量降低至少5%。 33. 如請求項31之用途,其中該結合分子係經破螭體内投 與。 又 34. 如請求項3 1之用途,其中該眼睛病症係選自由以下組成 129562.doc 200848076 ’汽斑退化、糖尿病性眼睛疾病及病症,眼睛水 ’壹血性視網膜病,前部缺血性視神經病 =樣黃斑水腫,視網膜疾病及病症,病理性近夂 姓备腹見、罔膜病’血官化、排斥或其他角膜發炎,乾躁 ,:结膜炎’乾眼病,葡萄臈炎、鞏膜炎、鞏臈表層 …膜炎、角膜炎、眼眶蜂窩織炎、眼肌炎、甲狀腺 眼眶病、淚腺及眼瞼發炎。 35·如請求項31之用途’其中該結合分子為單株抗體。 %,種測定疑似患有侧之個體之存在或傾向(predisp〇- 如:)的方法,其包含測量獲自該個體之試樣中之以蛋 白貝的置及將該量與對照試樣之C5蛋白質的量比較。 37· 2能夠抑制替代補體途徑之蛋白質之用途,其係用於 製造供治療眼睛疾病或病症或延緩其病程進展之藥物, «亥蛋白質能夠抑制C5蛋白質活化或抑制CA與之处 合。 、〇 38·如凊^項37之用途,其中該能夠抑制該替代補體途握之 蛋白貝為一種與C5之α*β鏈結合之抗體或抗體片段。 39· ^ °月求項37之用途,其中該與C5結合之抗體或抗體片段 能夠抑制C 5活化。 4〇·如明求項37之用途,其中該與C5抗原決定基結合之抗體 或抗體片段選自由SEq ID No ;!、3及5組成之群。 41· 一種套組,其係用於偵測〇蛋白質之存在,該套組包含 一個含有如請求項9之抗體之容器及偵測該抗體結合之 該等蛋白質的說明書。 129562.doc 200848076 . 42.如請求項4 1之套組,其中該抗體另外包含一個可偵測標 籤。 { ♦ 129562.doc 200848076 七、指定代表圖: (一) 本案指定代表圖為:(無) (二) 本代表圖之元件符號簡單說明: 八、本案若有化學式時,請揭示最能顯示發明特徵的化學式: (無) 129562.doc
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