KR20100067681A

KR20100067681A - 보체 성분을 조정하기 위한 분자 및 방법

Info

Publication number: KR20100067681A
Application number: KR1020107009602A
Authority: KR
Inventors: 비잔 에테마드-길버트슨; 브라이던 찰스 길드; 마크 테일러 키에팅; 용-인 김; 로이드 비. 클릭스테인; 드미트리 미하일로프; 마리우즈 밀리크; 마이클 로구스카; 이고르 스프라브스키; 케하오 자오
Original assignee: 노파르티스 아게
Priority date: 2007-11-02
Filing date: 2008-10-31
Publication date: 2010-06-21
Also published as: MA31795B1; TW200924795A; EA201000717A1; CO6270341A2; IL204722A0; CN101848937A; ZA201002335B; EP2207807A2; JP2011503024A; US20090175875A1; CR11361A; CA2703911A1; WO2009056631A2; AR069130A1; CL2008003241A1; SV2010003556A; PE20091388A1; TN2010000169A1; AU2008320820A1; WO2009056631A3

Abstract

본원에는 C3b 에피토프와 결합하는 조성물 및 이러한 조성물의 사용 방법이 기재되어 있다.

Description

보체 성분을 조정하기 위한 분자 및 방법 {Molecules and Methods for Modulating Complement Component}

본 발명은 항원 결합 분자, 이러한 분자에 의해 결합된 네오 (neo)-에피토프, 및 상기 분자의 사용 방법에 관한 것이다.

연령 관련 황반 변성 (AMD)은 진행성 질환이고, 65세 이상 미국인에게서 시력 상실과 실명을 유발시키는 주요 원인이다. AMD는 주로, 글을 읽거나 운전을 하는 데 필요한 고 시력에 대해 책임이 있는 망막 부분인 황반에 악영향을 미친다. 대다수의 AMD 환자는 드루젠 (drusen)으로 지칭되는 세포외 망막 침전물이 존재하는 것을 특징으로 하는 질병 초기 단계로 인해 고통받고 있다. 드루젠은 세포 부스러기, 염증성 매개인자, 및 세포외 매트릭스 성분의 세포외 망막 침전물이다. AMD의 후기 단계는 건식 형태 또는 습식 형태로서 그 징후가 나타나는데, 둘 다 시력 상실과 연관이 있다. 지도형 위축 (geographic atrophy)으로서 공지되기도 한 건식 AMD는 검안경 조사시 망막 색소화 상피 (RPE) 상실의 국소 부위에 상응하는, 명백하게 경계 지워진 영역으로서 나타난다. 습식 AMD는 맥락막의 신생혈관증식과 연관이 있는데, 이는 망막의 혈관 성장과 브루크막 (Bruch's membrane)의 원형 상실을 유발시키고 망막에서 종종 출혈이 있을 수 있다. 이러한 혈관 누출은 망막 세포에 대한 영구적인 손상을 유발시켜 세포가 하나 하나씩 죽어가고 중심 시력에 맹점 (blind spot)이 생겨난다.

선천적 인간 시스템은 보체 경로로 구성된다. 이러한 보체 경로는 선천 면역과 적응 면역을 가교시켜 주고 염증 손상과 면역 복합체의 생성물을 없애 주는, 화농성 세균 감염에 대항하여 방어하는 작용을 한다. 보체는 혈장 및 세포 표면 내의 케스케이드 (cascade) 반응에 관여하고 있는 30개 초과의 단백질 시스템이다. 보체 시스템 및 그의 보체 성분은 각종 면역 과정에 관여하고 있다. 예를 들어, 말단 복합체 또는 막 공격 복합체 (MAC)로 지칭되기도 하는 보체 C5b-9 복합체는 막 투과성 손상을 유도시킴으로써 세포 사멸에 있어 중요한 역할을 한다.

최근의 연구 결과, 보체 성분 C3 및 C5가 AMD 환자의 드루젠의 주요 구성분이란 사실이 입증되었다 [참고: Mulling, R. F. et al. (2000) FASEB J 14, 835-46]. 이들의 존재 뿐만 아니라 막 공격 복합체 (MAC) C5b-9 및 드루젠을 덮고 있는 RPE 세포 내의 기타 급성 기 반응물 단백질의 존재가 보체 활성화 및 MAC의 형성을 촉발시킬 수 있는 과정에 관여하는 것으로 추측되었다 [참고: Johnson, L et al. (2001) Exp Eye Res 73, 887-896]. 따라서, 보체 성분이 단순한 선천 면역 매개인자 그 이상이라는 명백한 증거가 점차 증가하고 있다.

영양학적 개입이 건식 AMD가 습식 AMD로 진행되는 것을 억제하는 것으로 처방되어 왔다. 현재, FDA가 습식 AMD 치료법으로 승인하고 있는 것으로는 광선 역학요법 (PDT), 항-VEGF 앱타머 (aptamer) [예: 페갑타니브 (pegaptanib)], 및 항-VEGF 항체 [라니비주마브 (ranibizumab)]가 있다. 이들 약물 또는 요법은 전형적으로, 이미 상당한 시력 상실로 인해 고통받고 있는 환자에게 투여한다.

현 치료법을 대체 또는 보충할 수 있는 유효한 AMD 치료법을 개발해야 할 필요성은 여전히 대두되고 있다. 특히, 시력 상실의 조기 검진, 예방 또는 복원을 제공할 수 있는 치료법이 필요하다.

<발명의 요약>

본 발명은 보체 성분 C3b의 에피토프, C3b 결합 분자, 및 이러한 분자의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, C3b와 결합하는 분자 (즉, C3b 결합 분자), 특히 인간 C3b 에피토프와 결합하는 항체 및 그의 일부, 및 대체 및/또는 전통적 보체 경로에 의해 매개된 세포 활성 또는 한 가지 이상 보체 단백질을 조정하는 항체 및 그의 일부를 제공한다.

본 명세서 전반에 걸쳐, "보체 경로" 또는 "보체"에 대한 언급은 대체 보체 경로 또는 전통적 보체 경로 중의 어느 한 가지 또는 둘 다를 나타낸다.

한 국면에서, 그의 수준을 조정해야 하는 보체 성분 단백질은 아나필로톡신 (anaphylotoxin), 인자 H, 인자 P, 인자 B, C3 또는 C5 전환효소; C3 절단 생성물, 예를 들어 C3a, C3b, iC3b 및 C3d, C5 절단 생성물 C5a 및 C5b; MAC, 및 보체 부산물의 MAC-의존성 생성이다.

또 다른 국면에서, 본 발명의 결합 분자는 보체 단백질의 효소적 활성을 조정한다. 몇몇 방법에서, 조정시켜야 하는 효소적 활성은 C3 및/또는 C5 전환효소 활성, C3의 C3a 및 C3b로의 전환, C5의 C5a 및 C5b로의 전환, 및 C5b-9의 형성이다.

또 다른 국면에서, 본 발명은 대상체에서 보체 단백질 생성 수준을 조정하는 방법을 특징으로 한다. 이러한 방법은 다음 생물학적 활성 중의 한 가지 이상을 조정하는 C3b 결합 분자를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다: (a) 인자 P가 C3 전환효소와 결합하는 것을 억제하는 활성; (b) 인자 B가 C3b와 결합하는 것을 억제하는 활성; (c) C3 또는 C5 전환효소의 단백질 분해 활성을 경쟁적 또는 비-경쟁적으로 억제하는 활성; (d) C3b가 C3 전환효소와 결합하는 것을 억제함으로써, C5 전환효소의 형성을 억제하는 활성; (e) C3 절단 생성물 C3a, C3b, iC3b 및 C3d의 형성을 억제하는 활성; (f) C5 절단 생성물 C5a 및 C5b의 형성을 억제하는 활성; (g) MAC 형성을 억제하는 활성, 및 (h) C6, 클러스테린 (clusterin), 합토글로빈 (haptoglobin), Ig 카파 쇄, Ig 람다 쇄, 또는 Ig 감마 쇄를 포함한 보체 부산물의 MAC-의존성 생성을 억제하는 활성. 몇몇 방법은 대상체로부터의 뇨, 혈액 혈장, 혈청, 전혈 또는 안구 유체 중에서의 보체 단백질 수준을 탐지하는 단계를 추가로 포함한다.

따라서, 한 국면에서 본 발명은 C3b 네오-에피토프와 결합하는 C3b 결합 분자 (그의 항원 결합 부분 포함)를 제공하는데, 항원 결합 부분은 다음 표 1에 열거된 아미노산 군 중에서 선택된 네오-에피토프와 결합한다.

또 다른 국면에서, C3b 결합 분자는 효과기 리간드에 대한 그의 친화도가 변경되었다. 본 발명의 항-C3b 항체는 바람직하게, 위치 234 및 235에서의 루이신을 알라닌으로 돌연변이시켜 FcRγ 결합을 폐기시키고 효과기 기능을 약화시켜 준다.

특히, 본 발명은 C3b 네오-에피토프와 결합하는 (예를 들어, 특이적으로 결합하는) 항체의 항원 결합 부분을 포함하는 단리된 C3b 결합 분자를 제공하는데, 이러한 항원 결합 부분은 다음 C3b 네오-에피토프 중의 하나 내에 있거나 이와 중복되는 인간 C3b의 네오-에피토프와 결합한다: (a) GEDTVQSLTQG (아미노산 393-403, 서열 1); (b) DEDIIAEENIVSRSEF (아미노산 752-767, 서열 2); (c) IRMNKTVAVRT (아미노산 936-946, 서열 3); (d) SDQVPDTESET (아미노산 968-978, 서열 4); (e) VAQMTED (아미노산 987-993, 서열 5), (f) FVKRAP (아미노산 1069-1074, 서열 6); (g) KDKNRWEDPGKQLYN (아미노산 1215-1229, 서열 7); (h) CTRYRGDQDATMS (아미노산 1389-1401, 서열 8); (i) GFAPDTDDLKQLANGV (아미노산 1410-1425, 서열 9).

또 다른 국면에서, 본 발명은 제2 또는 제3 분자와 연결된 C3b 네오-에피토프와 결합하는 (예를 들어, 특이적으로 결합하는) 결합 분자의 항원 결합 부분을 포함하는 단리된 C3b 결합 분자를 제공한다. 제2 또는 제3 분자는 자유 형태이거나 또는 복합체, 예를 들어 이중체 또는 삼중체 내에 부착될 수 있다. 이러한 제2 또는 제3 분자는 C3b, C3bBb, C4b, C4b2a, 인자 P, 인자 H, 인자 B 또는 그의 일부로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.

각종 국면에서, 항원 결합 부분은 다음 표 1에 열거된 하나 이상의 아미노산 내에 있거나 이와 중복되는 인간 C3b의 네오-에피토프와 특이적으로 결합한다. 각종 국면에서, 결합 분자는 선형 또는 비선형 에피토프와 결합할 수 있는 항체의 방식으로 기능하는 분자 또는 항체이다. 한 국면에서, C3b 분자가 본원의 표 1의 하나 이상의 네오-에피토프를 포함하는 비선형 에피토프와 결합하는 경우, 이러한 네오-에피토프는 결합 분자가 네오-에피토프의 하나 이상의 항원성 부분과 상호 작용하도록 입체 형태적으로 배열되어 목적하는 생물학적 기능을 실질적으로 가져다 주어야 한다. 선형 및 비선형 네오-에피토프에는 다음 선형 에피토프 각각의 하나 이상의 부분을 포함한다: (a) 서열 4의 아미노산 968-978; 및 (b) 서열 2의 아미노산 752-762. 또 다른 예에서, 항원 결합 부분은 다음 선형 네오-에피토프 각각의 하나 이상의 부분을 포함하거나 이로 이루어진 비선형 네오-에피토프와 결합한다: (a) 서열 3의 아미노산 936-946; 및 (b) 서열 8의 아미노산 1389-1401. 비선형 네오-에피토프의 어떠한 조합물도 이러한 결합 분자에 의해 결합되어 보체 경로에 의해 매개된 한 가지 이상의 보체 단백질 또는 세포 활성을 조정할 수 있다.

기타 국면에서, C3b 결합 분자는 비-인간 영장류 [예: 시노몰구스 (cynomolgus) 원숭이, 또는 붉은털 원숭이 (rhesus monkey)]의 C3b와 교차 반응성이다. 각종 국면에서, 항원 결합 부분은 설치류 종의 C3b (예: 뮤린 C3b, 랫트 C3b, 토끼 C3b)와 교차 반응성이다.

한 국면에서, 본 발명의 결합 분자는 C3b와 1 nM 이하 (예: 0.01 nM, 0.1 nM, 0.25 nM, 0.5 nM)의 해리 상수 (K_D)로 결합한다.

또 다른 국면에서, C3b 결합 분자는 비-인간 영장류 (예: 시노몰구스 원숭이 또는 붉은털 원숭이)의 C3b 네오-에피토프와, 인간 C3b와 결합하기 위한 K_D의 5 내지 10배 이내의 K_D로 결합한다.

한 양태에서, 본 발명의 결합 분자는 마우스 C3b 네오-에피토프와, 5 nM 이하 또는 인간 C3b와 결합하기 위한 K_D의 100배 이내의 K_D로 결합한다.

한 국면에서, 결합 분자는 키메라 (예: 인간화) 항체 또는 인간 항체이다.

또 다른 국면에서, 결합 분자는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체이다.

C3b 결합 분자에는, 예를 들어 항체의 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')₂, 또는 Fv 단편이 포함된다.

한 국면에서, C3b 결합 분자는 인간 항체이다.

한 국면에서, C3b 결합 분자에는 단일 쇄 Fv가 포함된다.

한 국면에서, C3b 결합 분자에는 디아보디 (diabody) (예: 단일 쇄 디아보디, 또는 2개의 폴리펩티드 쇄를 갖는 디아보디)가 포함된다. 기타 국면에서, 항체의 항원 결합 부분은 다음 이소형 중의 하나의 항체로부터 유래된다: IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4. 또 다른 국면에서, 항체의 항원 결합 부분은 IgA 또는 IgE 이소형의 항체로부터 유래된다.

또 다른 국면에서, 본 발명은 동물에게 투여한 경우에, C3b 네오-에피토프와 특이적으로 결합하는 항체를 유도시키기 위한 조성물을 제공한다. 이러한 조성물에는, 예를 들어 본원의 표 1에 열거된 펩티드; 5개 미만 아미노산 변화를 수반한 그의 펩티드; 또는 그의 단편 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개 아미노산을 함유하는 단편) 중의 하나 이상이 포함된다. 조성물은, 예를 들어 C3b 네오-에피토프 또는 그의 단편을 캐리어 단백질과 커플링시킴으로써 항원성을 증가시키도록 변형시킬 수 있다.

또 다른 국면에서, 본 발명은 세포에서 MAC 생성을 감소시키는 방법을 특징으로 한다. 한 예에서, MAC 생성 또는 억제는 표준 CH50 및 AH50 용혈 검정, 예를 들어 치킨, 토끼 또는 인간으로부터의 적혈구 세포의 용혈 억제를 이용함으로써 측정할 수 있다. 이러한 검정 방법은 적혈구 세포를 C3b 결합 분자와 접촉시킴으로써, 본원에 추가로 제공된 바와 같이 적혈구 세포 상의 MAC 형성을 억제시키는 것을 포함한다.

본 발명의 몇몇 방법에서, 결합 분자는 활성화 보체 시스템에 반응하여 또는 이러한 시스템에 의해 매개된 세포 활성을 조정한다. 몇몇 방법에서, 조정하고자 하는 세포 활성은 세포 용해이다. 몇몇 방법은, 예를 들어 용혈 검정에 의해 세포 활성을 탐지하는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 방법에서, 세포 활성은 대상체로부터의 뇨, 혈액 혈장, 혈청, 전혈 또는 안구 유체에서 탐지한다.

본 발명은 또한, 본원에 기재된 하나 이상의 C3b 결합 분자를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 다음으로 이루어진 군 중에서 선택된 C3b 네오-에피토프 중의 하나 내에 있거나 이와 중복되는 인간 C3b 에피토프와 결합하는 C3b 결합 분자 (예: 항체 또는 그의 항원 결합 단편); 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다: (a) GEDTVQSLTQG (아미노산 393-403, 서열 1); (b) DEDIIAEENIVSRSEF (아미노산 752-767, 서열 2); (C) IRMNKTVAVRT (아미노산 936-946, 서열 3); (d) SDQVPDTESET (아미노산 968-978, 서열 4); (e) VAQMTED (아미노산 987-993, 서열 5), (f) FVKRAP (아미노산 1069-1074, 서열 6); (g) KDKNRWEDPGKQLYN (아미노산 1215-1229, 서열 7); (h) CTRYRGDQDATMS (아미노산 1389-1401, 서열 8); (i) GFAPDTDDLKQLANGV (아미노산 1410-1425, 서열 9).

또 다른 양태에서, 본 발명은 다음 선형 에피토프 각각의 하나 이상의 부분을 포함하는 인간 C3b 네오-에피토프와 결합하는 C3b 결합 분자 (예: 항체 또는 그의 항원 결합 단편); 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다: (a) 서열 4의 아미노산 968-978; 및 (b) 서열 2의 아미노산 752-762. 한 양태에서, C3b 결합 분자는 선형 C3b 네오-에피토프와 결합한다. 또 다른 양태에서, C3b 결합 분자는 비선형 C3b 네오-에피토프와 결합한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 다음 선형 에피토프 각각의 하나 이상의 부분을 포함하거나 이로 이루어진 인간 C3b 비선형 네오-에피토프와 결합하는 C3b 결합 분자 (예: 항체 또는 그의 항원 결합 단편); 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다: (a) 서열 3의 아미노산 936-946; 및 (b) 서열 8의 아미노산 1389-1401.

또 다른 국면에서, 본 발명은 대상체에서 시력 상실을 치료 또는 예방하는 방법을 특징으로 한다. 본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "치료하다" 또는 "치료"는 대상체에서의 장애 또는 질병의 모든 치료를 지칭하고, 이에는 장애 또는 질병에 걸리기 쉬울 수 있지만, 아직까지는 이러한 장애 또는 질병이 있는 것으로 진단되지 않은 대상체에서 상기 장애 또는 질병이 발생하지 못하게 하는 것; 장애 또는 질병을 억제시키는 것, 예를 들어 이러한 장애 또는 질병의 발생을 저지하는 것; 장애 또는 질병을 경감시키는 것, 예를 들어 이러한 장애 또는 질병의 퇴행을 유발시키는 것; 또는 질병 또는 장애에 의해 유발된 질환을 경감시키는 것, 예를 들어 이러한 질병 또는 장애 증상을 중지 또는 회복시키는 것이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 대상체에서 질병 또는 장애와 관련하여 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "예방하다" 또는 "예방"은 아무것도 발생하지 않았다면 질병 또는 장애 발생이 전혀 없거나, 또는 이미 장애 또는 질병 발생이 있었다 하드라도 추가의 장애 또는 질병 발생이 없는 것을 의미한다. 상기 방법은 본원에 기재된 C3b 결합 분자를 포함하는 제약 조성물을, 한 가지 이상의 보체 단백질의 활성 또는 수준, 또는 보체 경로에 의해 매개된 세포 활성을 조정하기에 유효한 양으로 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 몇몇 방법에서, 이러한 대상체에게는 황반 변성과 연관된 질환 또는 장애가 있다. 기타 방법에서, 대상체는 황반 변성과 연관된 장애의 발생 위험에 노출되어 있다. 몇몇 방법에서, 대상체는 황반 변성 관련 장애 이외의 보체 관련 질병이 없다. 특히, 조정되는 보체 단백질은 대상체에서의 C3 전환효소 또는 C5 전환효소 효소적 활성이다.

대상체에게 투여될 수 있는 양은 MAC, C5a 생성, 또는 C3 붕괴 생성물 (예: C3a, C3b, iC3b)의 형성을 억제시키는 데에 유효한 양이다. 특히, 보체 활성화 생성물 (이에는 C3a 및/또는 C5a가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다)의 농도는 대상체의 혈액 중에서, 제약 조성물의 투여 이전의 기준선 수준과 비교해서 5％, 10％, 15％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％ 또는 75％ 이상 감소될 수 있다.

본 발명의 방법을 이용하여 치료할 수 있는 기타 질병 또는 장애에는 연령 관련 황반 장애, 노스 캐롤라이나 (North Carolina) 황반 이영양증, 소르스비 안저 이영양증 (Sorsby's fundus dystrophy), 슈타르가르츠병 (Stargardt's disease), 무늬 이영양증, 베스트병 (Best disease), 우성 드루젠, 및 말라티아 레벤티네스 (malattia leventinese), 망막 박리, 맥락망막 변성, 망막 변성, 광수용체 변성, RPE 변성, 점액다당류증, 간체-추체 (rod-cone) 이영양증, 추체-간체 이영양증, 추체 변성, 사구체신염, 발작성 야간 혈색소뇨증 (PNH), 체외 순환과 연관된 면역계 및 지혈계의 기능 장애 저하, 신경 장애, 다발성 경화증, 뇌졸증, 길랑 바레 (Guillain Barre) 증후군, 외상성 뇌 손상, 파킨슨병 (Parkinson's disease), 부적당하거나 바람직하지 못한 보체 활성화 장애, 혈액투석 합병증, 초급성 동종이식편 거부, 이종이식편 거부, IL-2 요법 동안 인터루킨-2 유도된 독성, 염증 장애, 자가면역 질환의 염증, 크론병 (Crohn's disease), 성인 호흡 곤란 증후군, 화상 또는 동상을 포함한 열 손상, 허혈 후 재관류 질환, 심근 경색, 풍선 혈관확장술, 심폐 우회로 또는 신장 우회로에서의 펌프 후 증후군, 혈액투석, 신 허혈증, 피부선 재구축 후 장간막 동맥 재관류, 감염성 질환 또는 패혈증, 면역 복합체병 및 자가면역 질환, 류마티스성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), SLE 신염, 증식성 신염, 용혈성 빈혈 및 중증 근무력증이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 또한, 기타 공지된 보체 관련 질환에는 폐 질환 및 장애, 예를 들어 호흡곤란, 객혈, ARDS, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 폐기종, 폐 색전증 및 경색증, 폐렴, 섬유형성 먼지병, 불활성 먼지 및 광물 (예: 실리콘, 석탄 먼지, 베릴륨 및 석면), 폐 섬유증, 유기 먼지병, 화학적 손상 (자극제 기체 및 화학물질, 예를 들어 염소, 포스겐, 이산화황, 황화수소, 이산화질소, 암모니아 및 염산에 기인함), 흡연 손상, 열 손상 (예: 화상, 동상), 천식, 알레르기, 기관지 수축, 과민성 폐렴, 기생충병, 구드패스츄어 (Goodpasture) 증후군, 폐 혈관염, 면역 복합체 관련 염증, 자가면역성 심장 질환, 다발성 경화증, 염증성 장 질환, 허혈증-재관류 손상, 바라쿠어-시몬스 (Barraquer-Simons) 증후군, 혈액투석, 전신성 루푸스, 홍반성 루푸스, 건선, 다발성 경화증, 이식, 중추 신경계 질환, 예를 들어 알츠하이머병 (Alzheimer's disease) 및 기타 신경변성 질환, aHUS, 수포성 유사천포창 또는 MPGN II이다.

본 발명의 제약 조성물은 당해 분야에 공지된 경로, 예를 들어 피하, 정맥내 또는 안내 (유리질내 포함) 경로를 통하여 투여할 수 있다.

본 발명의 한 가지 이상 특징의 상세 내역이 첨부된 도면과 다음 설명에 제시된다. 본 발명의 기타 특징, 목적 및 이점이 설명, 도면 및 특허청구범위로부터 명백할 것이다.

<발명의 상세한 설명>

전통적 및 대체 보체 경로 둘 다에서, 본 발명자들은 C3b 네오-에피토프를 인식하고 이와 결합하며, C3 및/또는 C5 전환효소의 생물학적 활성 및 MAC의 생성을 조정하는 결합 분자를 밝혀내었다. 이러한 결합 분자는 전통적 및/또는 대체 보체 경로의 비정상적인 활성과 연관된 질병, 예를 들어 안과 장애, 황반 변성과 연관된 질환, 및 본원에 기재된 바와 같은 비-안과 장애를 예방 및/또는 치료하는 데에 사용할 수 있다.

따라서, 본 발명은 보체 경로에 의해 매개된 세포 활성 및/또는 보체 단백질을 조정하는, C3b 네오-에피토프와 결합하는 분자, 예를 들어 인간 항체 및 그의 단편을 제공한다. C3b의 네오-에피토프 및 이들 네오-에피토프의 제조 및 사용 방법이 또한 본원에 제공된다.

본원에서 사용된 바와 같은 "네오-에피토프" 또는 "네오-항원"은 상호 교환적으로 사용되고, C3의 단백질 분해적 절단 후 C3b 상에 존재하는 단백질의 항원성 부분이다. 이들 네오-에피토프는 절단되지 않은 C3 상에서는 접근 가능하지 않다.

용어 "황반 변성과 연관된 질환 또는 장애"는, 예를 들어 황반 세포의 성장 저하, 황반 세포 (예: RPE 세포)의 재배열 또는 사멸 증가, 정상적인 생물학적 기능 상실, 또는 이들 현상의 조합에 따른 결과로서, 망막 황반이 변성되거나 기능 장애가 생기는 수 많은 모든 질환을 지칭한다. 황반 변성으로 인해, 정상 황반의 세포외 매트릭스 및/또는 세포의 조직구조 완전성이 상실되고/되거나 황반 세포의 기능이 상실된다. 황반 변성 관련 장애의 예에는 AMD, 노스 캐롤라이나 황반 이영양증, 소르스비 안저 이영양증, 슈타르가르츠병, 무늬 이영양증, 베스트병, 우성 드루젠, 및 말라티아 레벤티네스 (방사상 드루젠)가 포함된다. 상기 용어에는 또한, 황반의 변성 및/또는 기능장애 이전 또는 이후에 일어나는 황반외적 변화가 포괄된다. 따라서, 용어 "황반 변성 관련 장애"에는 또한 광범위하게, 황반의 완전성 또는 기능을 변경시키거나 이에 손상을 가하는 (예를 들어, RPE 또는 브루크 막에 대한 손상) 모든 질환이 포함된다. 예를 들어, 상기 용어에는 망막 박리, 맥락망막 변성, 망막 변성, 광수용체 변성, RPE 변성, 점액다당류증, 간체-추체 이영양증, 추체-간체 이영양증 및 추체 변성이 포괄된다.

용어 "보체 성분", "보체 단백질" 또는 "보체 성분 단백질"은 보체 시스템의 활성화에 관여하는 분자를 지칭한다. 전통적 경로 성분에는, 예를 들어 C1q, C1r, C1s, C4, C2, C3, C5, C6, C7, C8, C9, 및 C5b-9 복합체 (막 공격 복합체: MAC)가 포함된다. 대체 경로 성분에는, 예를 들어 인자 B, 인자 D, 프로페르딘 (Properdin), H 및 I가 포함된다.

용어 "조정" 또는 "조정하다"는 활성 또는 생물학적 과정 (예: 보체 과정)의 상향 조절 (즉, 예를 들어 작동 또는 증강에 의한 활성화 또는 자극)과 하향 조절 (즉, 예를 들어 길항, 저하 또는 억제에 의한 억제 또는 저해) 둘 다를 지칭하기 위해 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. "조정하다"는 특정 과정의 상향 조절과 하향 조절 둘 다를 기재하기 위한 것이다. 특정 자극인자에 의해 상향 조절되는 과정은 이러한 자극인자에 대한 길항제에 의해 억제될 수 있다. 역으로 언급하면, 특정 변성제에 의해 하향 조절되는 과정은 이러한 변성제에 대한 작동제에 의해 억제될 수 있다.

용어 "보체 경로 관련 분자", "보체 경로 분자" 및 "보체 경로 관련 단백질"은 상호 교환적으로 사용되고, 보체 활성화와, 이와 같이 활성화된 보체 시스템에 의해 매개되거나, 이에 대해 반응성이거나 또는 이에 의해 촉발되는 하류 세포 활성에 있어 일정 역할을 하는 각종 분자를 지칭한다. 이에는 보체 경로의 개시인자 (즉, 보체 시스템의 활성화를 직접 또는 간접적으로 촉발시키는 분자), 보체 활성화 동안 생성되거나 일정 역할을 하는 분자 (예: 보체 단백질/효소, 예를 들어 C3, C5, C5b-9, 인자 B, 인자 D, MASP-1, 및 MASP-2), 보체 수용체 또는 억제제 [예: 클러스테린, 비트로넥틴 (vitronectin), CR1, 또는 CD59], 및 활성화 보체 시스템에 의해 조절되거나 촉발된 분자 [예: 막 공격 복합체-억제성 인자, MACIF; 참고 (예를 들어, Sugita et al., J Biochem, 106:589-92, 1989)]가 포함된다. 따라서, 본원에서 언급된 보체 단백질 이외에도, 보체 경로 관련 분자에는 또한, 예를 들어 C3/C5 전환효소 조절제 (RCA), 예를 들면 보체 수용체 유형 1 (CR1 또는 CD35로 명명되기도 함), 보체 수용체 유형 2 (CR2 또는 CD21로 명명되기도 함), 막 조인자 단백질 (MCP 또는 CD46), 및 C4bBP; MAC 조절제, 예를 들면 비트로넥틴, 클러스테린 ("SP40, 40"으로 명명되기도 함), CRP, CD59, 및 상동성 제한 인자 (HRF); 면역글로불린 쇄, 예를 들면 Ig 카파, Ig 람다, 또는 Ig 감마); C1 억제제; 및 기타 단백질, 예를 들면 CR3, CR4 (CD11b/18), 및 DAF (CD55)가 포함된다.

용어 "보체 경로에 의해 조절된 세포 활성"에는 C5b-9 공격 복합체로부터 비롯되는 세포 손상, 혈관 투과성 변화, 평활근 세포의 수축 및 유주, T 세포 증식, 면역 부착, 수지상 세포, 단구, 과립구 및 혈소판의 응집, 포식작용, 호중구 (PMN) 및 대식 세포의 유주 및 활성화가 포함된다.

추가로, 보체 경로를 활성화시키면 보체 경로 내의 부산물로 인한 프로-염증성 반응이 증가하게 된다. 보체 경로의 활성화와 연관된 장애에는 신염, 천식, 재관류 손상, 혈액투석, 류마티스성 관절염, 전신성 루푸스, 건선, 다발성 경화증, 이식, 알츠하이머병, aHUS, MPGN II, 또는 기타 모든 보체-매개된 질병이 포함된다. 황반 변성과 연관된 장애에는 AMD, 노스 캐롤라이나 황반 이영양증, 소르스비 안저 이영양증, 슈타르가르츠병, 무늬 이영양증, 베스트병, 우성 드루젠, 및 말라티아 레벤티네스 (방사상 드루젠), 황반의 변성 및/또는 기능장애 이전 또는 이후에 일어나는 황반외적 변화, 망막 박리, 맥락망막 변성, 망막 변성, 광수용체 변성, RPE 변성, 점액다당류증, 간체-추체 이영양증, 추체-간체 이영양증 및 추체 변성이 포함된다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "대상체"에는 모든 인간 또는 비-인간 동물이 포함된다.

용어 "비-인간 동물"에는 모든 비-인간 척추동물, 예를 들어 포유류 및 비-포유류, 예를 들어 비-인간 영장류, 설치류, 토끼, 양, 개, 고양이, 말, 암소, 조류, 양서류, 파충류 등이 포함된다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 본래의 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (즉, "항원 결합 부분") 또는 단일 쇄 (즉, 경쇄 또는 중쇄) 또는 유사작용제를 지칭한다. 본래의 항체는 디설파이드 결합에 의해 내부-연결된 적어도 2개의 중쇄 (H)와 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 당단백질이다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 V_H로서 약칭됨)과 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, 즉 CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 V_L로서 약칭됨)과 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 1개 도메인, 즉 C_L로 구성된다. V_H 및 V_L 영역은 골격 영역 (FR)으로 명명되고 보다 보존되는 영역이 산재된, 상보성 결정 영역 (CDR)으로 명명된 초가변성 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각 V_H 및 V_L은 3개의 CDR과 4개의 FR로 구성되는데, 이들은 아미노 말단에서부터 카복시 말단까지 다음 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호 작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 숙주 조직 또는 인자, 예를 들어 면역계의 각종 세포 (예: 효과기 세포) 및 전통적인 보체 시스템의 제1 성분 (Clq)에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같은, 항체의 "항원 결합 부분" 또는 "결합 도메인"은 소정의 항원 (예: C3b)과 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있는 본래 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능은 본래 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다. 항체의 "항원 결합 부분" 내에 포괄된 결합 단편의 예에는 V_L, V_H, C_L 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; 힌지 (hinge) 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편 (일반적으로, 1개는 중쇄로부터 유래되고 다른 1개는 경쇄로부터 유래된다)을 포함하는 2가 단편인 F(ab)₂ 단편; V_H 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; 항체의 단일 암 (arm)의 V_L 및 V_H 도메인으로 이루어진 Fv 단편; V_H 도메인으로 이루어진 단일 도메인 항체 (dAb) 단편 [참고: Ward et al., 1989 Nature 341:544-546]; 및 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)이 포함된다.

더우기, Fv 단편의 두 도메인 V_L 및 V_H가 별개의 유전자에 의해 암호화되긴 하지만, V_L 영역과 V_H 영역이 짝짓기하여 1가 분자 [단일 쇄 Fv (scFv)로서 공지됨]를 형성하는 단일 단백질 쇄로서 만들어질 수 있도록 해주는 인공 펩티드 링커에 의해 재조합 방법을 사용하여 상기 두 도메인을 연결시킬 수 있다 [참고: 예를 들어, Bird et al., 1988 Science 242:423-426; 및 Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883]. 이러한 단일 쇄 항체에는 항체의 하나 이상의 "항원 결합 부분"이 포함된다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수득하고, 이 단편을 대상으로 하여 본래의 항체와 동일한 방식으로 활용하는 것에 관해 스크리닝한다.

항원 결합 부분은 또한, 단일 도메인 항체, 맥시보디 (maxibody), 미니보디 (minibody), 인트라보디 (intrabody), 디아보디, 트리아보디, 테트라보디, v-NAR 및 비스-scFv 내로 혼입시킬 수 있다 [참고: 예를 들어, Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136]. 항체의 항원 결합 부분은 피브로넥틴 유형 III (Fn3)과 같은 폴리펩티드에 기초하여 스캐폴드 (scaffold) 내로 이식할 수 있다 [참고: 피브로넥틴 폴리펩티드 모노보디를 기재하고 있는 미국 특허 제6,703,199호].

항원 결합 부분은 상보적 경쇄 폴리펩티드와 함께, 항원 결합 영역 쌍을 형성하는 직렬식 Fv 절편 쌍 (V_H-CH1-V_H-CH1)을 포함하는 단일 쇄 분자 내로 혼입할 수 있다 [참고: Zapata et al., 1995 Protein Eng. 8(10):1057-1062; 및 미국 특허 제5,641,870호].

본원에서 사용된 바와 같은 "단리된 C3b 결합 분자"는 C3b 이외의 항원에 대한 항원 특이성을 지닌 분자가 실질적으로 없는 결합 분자를 지칭한다 (예를 들어, C3b와 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 C3b 이외의 항원, 예를 들어 C3과 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다). 그러나, C3b와 특이적으로 결합하는 단리된 결합 분자는 기타 항원, 예를 들어 기타 종으로부터의 C3b 분자에 대한 교차 반응성을 지닐 수 있다. 단리된 결합 분자는 세포성 물질이 실질적으로 없는 경우에, 이는 "정제된" 것이다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체 조성물"은 단일 분자성 조성물의 항체 분자 제제를 지칭한다. 모노클로날 항체 조성물은 특별한 에피토프에 대한 단일 결합 특이성과 친화성을 표시한다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "인간 항체"에는 골격 영역과 CDR 영역 둘 다가 인간 기원의 서열로부터 유래되는 가변 영역을 갖는 항체가 포함된다. 더우기, 항체가 불변 영역을 함유하는 경우, 이러한 불변 영역은 또한 상기 인간 서열, 예를 들어 인간 생식세포계 서열, 또는 인간 생식세포계 서열의 돌연변이된 버전으로부터 유래된다. 본 발명의 인간 항체에는 인간 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관 내에서 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이 유발, 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이물)가 포함될 수 있다. 그러나, 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "인간 항체"에는 또 다른 포유류 종 (예: 마우스)의 생식세포계로부터 유래된 CDR 서열을 인간 골격 서열 상으로 이식시킨 항체가 포함되지 않는다.

용어 "인간 모노클로날 항체"는 골격 영역과 CDR 영역 둘 다가 인간 서열로부터 유래되는 가변 영역을 갖는 단일 결합 특이성을 표시하는 항체를 지칭한다. 한 국면에서, 인간 모노클로날 항체는 불멸화 세포와 융합된 트랜스제닉 (transgenic) 비-인간 동물 [예를 들어, 인간 중쇄 트랜스-유전자 (transgene) 및 경쇄 트랜스-유전자를 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 마우스]로부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생성된다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "재조합 인간 항체"에는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 창출 또는 단리되는 모든 인간 항체, 예를 들어 인간 면역글로불린 유전자에 대한 트랜스제닉 또는 트랜스-염색체성인 동물 (예: 마우스)로부터 단리된 항체 또는 이로부터 제조된 하이브리도마; 예를 들어, 형질감염 세포로부터 인간 항체를 발현하도록 형질전환시킨 숙주 세포로부터 단리된 항체; 재조합의 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체; 및 인간 면역글로불린 유전자 서열의 전부 또는 일부를 또 다른 DNA 서열에 스플라이싱하는 것을 포함하는 기타 모든 수단에 의해 제조, 발현, 창출 또는 단리된 항체가 포함된다. 이러한 재조합 인간 항체는 골격 영역과 CDR 영역이 인간 생식세포계 면역글로불린 서열로부터 유래되는 가변 영역을 갖는다. 그러나, 특정 국면에서는 상기 재조합 인간 항체를 대상으로 하여 시험관내 돌연변이 유발시킬 수 있으므로 (또는 인간 Ig 서열에 대해 트랜스제닉인 동물을 사용하는 경우에는, 생체내 체세포 돌연변이 유발시킨다), 재조합 항체의 V_H 및 V_L 영역의 아미노산 서열은, 인간 생식세포계 V_H 및 V_L 서열로부터 유래되고 이와 관련되면서도, 인간에서의 인간 항체 생식세포계 레퍼토리 (repertoire) 내에 천연상 존재하지 않을 수 있는 서열이다.

본원에서 사용된 바와 같은 "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 암호화되는 항체 부류 (예: IgM, IgE, IgG, 예를 들어 IgG1 또는 IgG4)를 지칭한다.

"항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 대해 특이적인 항체"란 표현은 본원에서 "항원과 특이적으로 결합하는 항체"란 표현과 상호 교환적으로 사용된다.

본원에서 사용된 바와 같은, IgG 항체를 지칭하는 경우의 용어 "고 친화성"은 이러한 항체의 표적 항원에 대한 K_D가 10^-9 M 이하라는 것을 표시한다.

본원에서 사용된 바와 같은, "C3b와 특이적으로 결합하는" C3b 결합 분자 (예를 들어, 항체 또는 그의 항원 결합 부분)는 C3b와 1 x 10^-7 M 이하의 K_D로 결합하는 C3b 결합 분자를 지칭한다. 본 발명의 바람직한 결합 분자는 C3b 네오-에피토프와 1 nM 이하 (예: 0.01 nM, 0.1 nM, 0.25 nM, 0.5 nM)의 K_D로 결합한다.

항원과 교차 반응하는 C3b 결합 분자 (예: 항체)는 이러한 항원과 1 x 10^-6 M 이하의 K_D로 결합하는 C3b 결합 분자를 지칭한다. 구체적 양태에서, C3b 결합 분자는 비-인간 영장류 (예: 시노몰구스 원숭이)의 C3b 네오-에피토프와, 인간에 대한 K_D의 5 내지 10배 이내의 K_D로 결합한다. 또 다른 구체적 양태에서, C3b 결합 분자는 마우스 C3b 네오-에피토프와, 인간에 대한 K_D와 동일하거나 100배 이내의 K_D로 결합한다.

소정의 항원과 교차 반응하지 않는 C3b 결합 분자 (예: 항체)는 소정의 항원과 탐지 가능한 수준으로 결합하지 않거나, 또는 1 x 10^-5 M 이상의 K_D로 결합하는 C3b 결합 분자를 지칭한다. 특정 국면에서, 항원과 교차 반응하지 않는 상기 결합 분자는 본질적으로, 표준 결합 검정에서 이들 단백질에 대항하여 탐지 가능하지 않은 결합을 나타낸다.

C3b 결합 분자

본 발명의 결합 분자는 다음 네오-에피토프 중의 하나 이상과 90％ 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 C3b의 네오-에피토프와 결합한다:

표 1의 아미노산은 SwissProt 데이터베이스 내의 CO3_HUMAN 엔트리 (entry)에 예시된 지침에 따라서 넘버링된다 (www.expasy.org).

C3b 결합 분자는 표 1 중에서 선택된 네오-에피토프를 포함한 선형 또는 비선형 에피토프와 특이적으로 결합할 수 있다. 본 발명에는 C3b 생체 활성을 조정하는 비선형 에피토프와 결합하는 결합 분자가 포함된다.

C3b 결합 분자에는, 예를 들어 C3b 네오-에피토프와 결합하는 항체 (자유 형태 또는 복합체 형성 형태), 및 이러한 항체의 항원 결합 부분을 포함하는 폴리펩티드가 포함된다. C3b 결합 분자에는 또한, 결합 부분이 항체로부터 유래되지 않는 분자, 예를 들어 면역글로불린-유사 폴드를 갖는 폴리펩티드로부터 유래된 C3b 결합 분자, 및 항원 결합 부분이 무작위화, 선별, 및 친화성 성숙을 통하여 C3b 네오-에피토프와 결합하도록 공학 처리시킨 분자가 포함된다. 바람직한 C3b 결합 분자에는 항체, 그의 단편, 또는 항체 또는 그의 단편을 포함하는 인공 구조물, 또는 항체 또는 그의 단편의 결합을 모방하도록 설계된 인공 구조물이 포함된다.

본 발명은 또한, 항체가 아닌 C3b 결합 분자를 특징으로 한다. 이러한 C3b 결합 분자에는 비-항체 폴리펩티드, 예를 들어 다음 중의 하나의 면역글로불린-유사 (Ig-유사) 폴드로부터 유래된 아미노산과 60％, 65％, 75％, 80％, 85％, 또는 90％ 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 C3b 결합 도메인이 포함된다: 테나신 (tenascin), N-캐드헤린 (cadherin), E-캐드헤린, ICAM, 티틴, GCSF-수용체, 사이토킨 수용체, 글리코시다제 억제제, 항생제 색소단백질, 미엘린 막 부착 분자 PO, CD8, CD4, CD2, 부류 I MHC, T-세포 항원 수용체, CD1, C2 및 VCAM-1의 I-세트 도메인, 미오신-결합 단백질 C의 I-세트 면역글로불린 도메인, 미오신 결합 단백질 H의 I-세트 면역글로불린 도메인, 텔로킨의 I-세트 면역글로불린 도메인, NCAM, 트위친 (twitchin), 뉴로글리안 (neuroglian), 성장 호르몬 수용체, 에리트로포이에틴 수용체, 프롤락틴 수용체, 인터페론-감마 수용체, β-갈락토시다제/글루쿠로니다제, α-글루쿠로니다제, 트랜스글루타미나제, T-세포 항원 수용체, 슈퍼옥사이드 디스무타제, 조직 인자 도메인, 시토크롬 F, 그린 형광성 단백질, GroEL, 및 타우마틴 (thaumatin). 일반적으로, C3b 결합 분자의 아미노산 서열은 면역글로불린-유사 폴드의 아미노산 서열과 비교해서 변경되는데, 이로써 C3b 결합 도메인이 C3b 네오-에피토프와 특이적으로 결합한다 (즉, 면역글로불린-유사 폴드는 C3b와 특이적으로 결합하지 않는다).

C3b 결합 도메인의 아미노산 서열은 피브로넥틴, 사이토킨 수용체, 또는 캐드헤린의 면역글로불린-유사 폴드의 아미노산 서열과 60％ 이상 동일하다 (예를 들어, 65％, 75％, 80％, 85％, 또는 90％ 이상 동일하다).

C3b 결합 분자는 C3b와 특이적으로 결합하고, 이의 수 많은 생체 활성 중의 한 가지 이상을 조정한다. 따라서, 본 발명은 프로페르딘, 인자 H, 인자 B, 인자 I, 막 조인자, 및/또는 그의 복합체의 C3b 결합을 억제하는 C3b 결합 분자를 특징으로 한다. C3b 결합 분자는 MAC의 C3b 형성을 대조군과 비교해서 (예를 들어, C3b 결합 분자의 부재 하에서의 결합과 비교해서) 5％, 10％, 15％, 25％, 또는 50％ 이상 억제시키기도 한다.

본 발명의 C3b 결합 분자는 대체 경로에서 C3b가 C3 전환효소 (예: 이분자 복합체 C3bBb)와 결합하는 것을 억제시켜 C5 전환효소 (예: 삼분자 복합체 C3bBbC3b)의 형성을 차단시킨다. 또 다른 국면에서, C3b 결합 분자는 전통적 경로에서 C3b가 C3 전환효소 (예: 이분자 복합체 C4bC2a)와 결합하는 것을 억제시켜 C5 전환효소 (예: 삼분자 복합체 C3bC4bC2a)의 형성을 차단시킨다. 이들 생물학적 활성은 C3 단백질 절단과 관련된 피드백 루프 내의 경쟁적 결합 기전에 의해 생성된다. 따라서, C3b 결합 분자는 C3 절단을 대조군과 비교해서 (예를 들어, C3b 결합 분자의 부재 하에서의 활성과 비교해서) 5％, 10％, 15％, 25％, 또는 50％ 이상 억제시킨다.

당해 분야에 공지되어 있고 본원에 기재된 방법론에 따라서 결정된 바와 같은 C3b 생체 활성 (예를 들어, 보체 경로 활성화에 따른 결과로서의 생화학적, 세포성, 생리학적 또는 기타 생물학적 활성) 중의 한 가지 이상을 억제 또는 조정하는 C3b 결합 분자는 C3b 결합 분자의 부재시에 관찰된 것과 비교해서 (예를 들어, 무관한 특이성의 대조군 분자가 존재하는 경우) 특별한 기능적 특성에 있어서의 통계상 유의적 감소를 가져다 주는 것으로 이해될 것이다. C3b 생체 활성을 조정하는 C3b 결합 분자는, 측정된 파라미터의 5％ 이상으로 이러한 통계상 유의적 감소를 가져다 준다. 특정 국면에서, C3b 결합 분자는 선별된 기능적 특성에 있어서 대조군과 비교해서 10％, 20％, 30％, 또는 50％ 이상의 감소를 가져다 줄 수 있다.

분자가 각종 종의 C3b, 및 C3b의 특별한 에피토프와 결합할 수 있는 능력을 평가하기 위한 표준 검정은 당해 분야에 공지되어 있는데, 이에는 예를 들어, ELISA 및 웨스턴 블롯 (Western blot)이 포함된다. C3b 결합 분자가 C3b의 특이적 에피토프와 결합하는 지의 여부를 결정하는 것은 펩티드 에피토프 경쟁 검정을 이용할 수 있다. 예를 들어, C3b 결합 분자를 펩티드의 포화 농도에서 관심있는 C3b 에피토프에 상응하는 펩티드와 함께 항온 배양한다. 예비-항온 배양한 C3b 결합 분자를 대상으로 하여, 예를 들어 비아코어 (Biacore^®) 분석에 의해 고정화 C3b와의 결합에 관하여 시험한다. C3b 결합이 상기 펩티드와의 예비-항온 배양에 의해 억제된다는 것은 C3b 결합 분자가 이러한 펩티드 에피토프와 결합한다는 지표이다 [참고: 예를 들어, 미국 공개특허공보 제20070072797호]. 결합 역학은 또한, 당해 분야에 공지된 표준 검정, 예를 들어 비아코어^® 분석에 의해 평가할 수 있다. C3b의 기능적 특성에 대한 C3b 결합 분자의 효과를 평가하기 위한 검정이 다음에 추가로 상세히 기재되어 있다.

C3b 억제는, 예를 들어 (a) 시험관내 검정에서 적혈구 세포 용혈을 차단시킬 수 있는 환자 혈청의 능력; (b) 혈청 C3a 또는 C5a 수준; (c) 혈장, 조직 및/또는 기타 생물학적 성분, 예를 들어 안과 물질 또는 성분 중의 가용성 MAC 수준을 측정함으로써 결정할 수 있다. C3b 결합 분자의 존재 하에서 C5a, C3a 또는 C5b-9 수준이 감소한다는 것은 C3b 결합 분자가 C3b 및/또는 그의 생체 활성을 억제한다는 지표이다.

대상체로부터의 각종 생물학적 샘플, 예를 들어 모든 기관, 조직 또는 세포 뿐만 아니라 혈액, 뇨 또는 기타 체액 (예: 안구 유체)으로부터 수득한 샘플을 탐지에 사용할 수 있다. 몇몇 진단 방법의 경우에 바람직한 샘플은 안구 유체이다. 몇몇 기타 방법의 경우에 바람직한 조직 샘플은 전혈 및 이로부터 유래된 생성물, 예를 들어 혈장 및 혈청이다. 혈액 샘플은, 예를 들어 귀트리에 카드 (Guthrie card)로부터 취한 혈액-반점으로부터 수득할 수 있다. 조직 샘플의 기타 공급원은 피부, 모발, 뇨, 타액, 정액, 대변, 땀, 유즙, 양수, 간, 심장, 근육, 신장 및 기타 신체 기관이다. 조직의 기타 공급원은 대상체로부터의 일차 세포로부터 증식된 세포주이다. 조직 샘플은 전형적으로 용해시켜 샘플 내의 세포의 단백질 및/또는 핵산 내용물을 방출시킨다. 이어서, 이러한 조 용해물로부터의 단백질 분획을 분석 전에 부분적으로 또는 완전히 정제할 수 있다.

본 발명의 C3b 결합 분자를 이용하여 치료할 수 있는 기타 대상체에는 황반 변성 관련 장애 이외의 공지된 보체 관련 질병이 없는 개체가 포함된다. 보체 관련 질병 또는 장애는 당해 분야, 예를 들어 미국 특허 제6,169,068호에 보고되었다. 공지된 보체 관련 질병의 예에는 신경 장애, 다발성 경화증, 뇌졸증, 길랑 바레 증후군, 외상성 뇌 손상, 파킨슨병, 부적당하거나 바람직하지 못한 보체 활성화 장애, 혈액투석 합병증, 초급성 동종이식편 거부, 이종이식편 거부, IL-2 요법 동안 인터루킨-2 유도된 독성, 염증 장애, 자가면역 질환의 염증, 크론병, 성인 호흡 곤란 증후군, 화상 또는 동상을 포함한 열 손상, 허혈 후 재관류 질환, 심근 경색, 풍선 혈관확장술, 심폐 우회로 또는 신장 우회로에서의 펌프 후 증후군, 혈액투석, 신 허혈증, 피부선 재구축 후 장간막 동맥 재관류, 감염성 질환 또는 패혈증, 면역 복합체병 및 자가면역 질환, 류마티스성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), SLE 신염, 증식성 신염, 용혈성 빈혈 및 중증 근무력증이 포함된다. 또한, 기타 공지된 보체 관련 질환은 폐 질환 및 장애, 예를 들어 호흡곤란, 객혈, ARDS, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 폐기종, 폐 색전증 및 경색증, 폐렴, 섬유형성 먼지병, 불활성 먼지 및 광물 (예: 실리콘, 석탄 먼지, 베릴륨 및 석면), 폐 섬유증, 유기 먼지병, 화학적 손상 (자극제 기체 및 화학물질, 예를 들어 염소, 포스겐, 이산화황, 황화수소, 이산화질소, 암모니아 및 염산에 기인함), 흡연 손상, 열 손상 (예: 화상, 동상), 천식, 알레르기, 기관지 수축, 과민성 폐렴, 기생충병, 구드패스츄어 증후군, 폐 혈관염, 및 면역 복합체 관련 염증이다.

본 발명의 치료제를 이용하여 치료하고자 하는 대상체에게, 황반 변성과 연관된 질환을 치료하는 것으로 공지된 방법, 예를 들어 미국 특허 제6,218,368호에 기재된 바와 같은 항생체 치료를 이용하여 기타 치료제를 투여할 수도 있다. 기타 치료법에서는, 시클로스포린과 같은 면역억제제가 면역 반응을 억제시킬 수 있는 작용제이다. 이들 작용제에는 세포독성 약물, 코르티코스테로이드, 비스테로이드계 소염 약물 (NSAID), 특이적 T-림프구 면역억제제, 및 항체 또는 그의 단편이 포함된다 [참고: Physicians' Desk Reference, 53rd edition, Medical Economics Company Inc., Montvale, N.J. (1999)]. 면역억제 치료는 전형적으로, 1주, 1개월, 3개월, 6개월 또는 1년 간격으로 지속한다. 몇몇 환자에서는, 환자의 나머지 일생 동안 치료제를 투여한다.

항체

본원에 기재된 항-C3b 항체에는 인간 모노클로날 항체가 포함된다. 몇몇 국면에서, C3b와 결합하는 항체의 항원 결합 부분 (예를 들어, V_H 및 V_L 쇄)을 "혼합 및 매칭"하여 기타 항-C3b 결합 분자를 창출시킨다. 이러한 "혼합 및 매칭된" 항체의 결합은 전술된 결합 검정 (예: ELISA)을 이용하여 시험할 수 있다. 특별한 V_L 서열과 혼합 및 매칭하기 위한 V_H를 선별하는 경우에는, 전형적으로 이러한 V_H와 구조적으로 유사한 V_H를 선별하는데, 이는 상기 특별한 V_L과의 짝짓기에서 대체된다. 마찬가지로, 특별한 완전한 길이의 중쇄/완전한 길이의 경쇄 짝짓기로부터의 완전한 길이의 중쇄 서열을 일반적으로, 구조적으로 유사한 완전한 길이의 중쇄 서열로 대체시킨다. 마찬가지로, 특별한 V_H/V_L 짝짓기로부터의 V_L 서열을 구조적으로 유사한 V_L 서열로 대체시켜야 한다. 또한, 특별한 완전한 길이의 중쇄/완전한 길이의 경쇄 짝짓기로부터의 완전한 길이의 경쇄 서열을 구조적으로 유사한 완전한 길이의 경쇄 서열로 대체시켜야 한다. 이러한 맥락에서 구조적 유사성을 확인하는 것은 당해 분야에 널리 공지된 공정이다.

기타 국면에서, 본 발명은 하나 이상의 C3b-결합 항체의 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 각종 조합으로 포함하는 항체를 제공한다. 이들 항체 각각이 C3b와 결합할 수 있고, 항원 결합 특이성이 주로 CDR1, 2 및 3 영역에 의해 제공된다면, V_H CDR1, 2 및 3 서열과 V_L CDR1, 2 및 3 서열을 "혼합 및 매칭"할 수 있다 (즉, 상이한 항체로부터의 CDR을 혼합 및 매칭할 수 있다). 이러한 "혼합 및 매칭된" 항체의 C3b 결합은 본원에 기재된 결합 검정 (예: ELISA)을 사용하여 시험할 수 있다. V_H CDR 서열을 혼합 및 매칭하는 경우에는, 특별한 V_H 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열을 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체시켜야 한다. 마찬가지로, V_L CDR 서열을 혼합 및 매칭하는 경우에는, 특별한 V_L 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열을 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체시켜야 한다. 이러한 맥락에서 구조적 유사성을 확인하는 것은 당해 분야에 널리 공지된 공정이다.

본원에서 사용된 바와 같은 인간 항체는 이러한 항체의 가변 영역 또는 완전한 길이의 쇄가 서열 공급원으로서 인간 생식세포계 면역글로불린 유전자를 이용하는 시스템으로부터 수득되는 경우에, 특별한 생식세포계 서열의 "생성물이거나" 또는 "이로부터 유래되는" 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 또는 완전한 길이의 중쇄 또는 경쇄를 포함한다. 이러한 하나의 시스템에서는, 인간 항체가 인간 면역글로불린 유전자를 보유하고 있는 트랜스제닉 마우스에서 생성된다. 트랜스제닉 마우스는 관심있는 항원 (예를 들어, 본원에 기재된 C3b의 네오-에피토프)으로 면역시킨다. 또 다른 한편, 인간 항체는 파아지 상에 디스플레이된 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리를 제공하고 관심있는 항원 (예: 본원에 기재된 C3b 또는 C3b 네오-에피토프)을 이용하여 상기 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인한다.

인간 생식세포계 면역글로불린 서열의 "생성물이거나" 또는 "이로부터 유래되는" 인간 항체는 인간 항체의 아미노산 서열을 인간 생식세포계 면역글로불린의 아미노산 서열과 비교하고, 인간 항체의 서열에 가장 근접한 서열 [즉, 가장 큰 동일률(％)을 나타냄]인 인간 생식세포계 면역글로불린 서열을 선별함으로써 그 자체로서 확인할 수 있다. 특별한 인간 생식세포계 면역글로불린 서열의 "생성물이거나" 또는 "이로부터 유래되는" 인간 항체는, 예를 들어 천연 발생적 체세포 돌연변이, 또는 인공적인 부위 지시된 돌연변이로 인해, 생식세포계-암호화된 서열과 비교해서 아미노산 차이를 함유할 수 있다. 그러나, 선별된 인간 항체는 전형적으로, 인간 생식세포계 면역글로불린 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열과의 동일률이 90％ 이상인 아미노산 서열을 갖고, 기타 종의 생식세포계 면역글로불린 아미노산 서열 (예: 뮤린 생식세포계 서열)과 비교해서 상기 인간 항체를 인간으로서 확인시켜 주는 아미노산 잔기를 함유하고 있다. 특정한 경우, 인간 항체는 생식세포계 면역글로불린 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열과의 아미노산 서열 동일률이 60％, 70％, 80％, 90％, 또는 95％ 이상, 또는 심지어 96％, 97％, 98％, 또는 99％ 이상일 수 있다.

두 서열 간의 동일률(％)은 두 서열을 최적으로 정렬시키기 위해 도입될 필요가 있는 각 갭의 길이와 갭의 수를 고려하여, 해당 서열을 공유하는 동일한 위치 수의 함수이다 (즉, 동일률(％) = 동일한 위치 수/총 위치 수 x 100). 서열을 비교하고, 두 서열 간의 동일률을 결정하는 것은 PAM120 중량 잔기 표, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 사용하여, ALIGN 프로그램 (버전 2.0) 내로 혼입시킨 알고리즘 [참고: E. Meyers and W. Miller (1988 Comput. Appl. Biosci., 4:11-17)]을 사용하여 결정한다.

전형적으로, 특별한 인간 생식세포계 서열로부터 유래된 인간 항체의 V_H 또는 V_L은 인간 생식세포계 면역글로불린 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열과 10개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 것이다. 특정한 경우, 인간 항체의 V_H 또는 V_L은 생식세포계 면역글로불린 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열과 5개 이하, 또는 심지어 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 수 있다.

카멜리드 (camelid) 항체

신세계 구성원, 예를 들어 라마 종 [라마 파코스 (Lama paccos), 라마 글라마 (Lama glama) 및 라마 비쿠그나 (Lama vicugna)]를 포함한, 카멜 및 단봉 낙타 계열의 구성원 [카멜루스 박트리아누스 (Camelus bactrianus) 및 칼레루스 드로마데리우스 (Calelus dromaderius)]로부터 수득된 항체 단백질을 대상으로 하여, 그 크기, 구조적 복합도 및 인간 대상체에 대한 항원성에 관하여 명확히 규명하였다. 이러한 계열의 포유류에서 천연상 발견되는 특정의 IgG 항체는 경쇄가 결여되므로, 기타 동물로부터의 항체에 대해 전형적인 2개의 중쇄와 2개의 경쇄를 갖는 4개 쇄 4차 구조와 구조상 별개이다 [참고: WO 94/04678].

V_HH로서 확인된 소형 단일 가변 도메인인 카멜리드 항체 영역은 유전 공학 처리함으로써 표적에 대해 고 친화성을 지닌 소형 단백질을 수득하여, "카멜리드 나노보디"로서 공지된 저 분자량 항체-유래된 단백질을 생성시킴으로써 수득할 수 있다 [참고: 미국 특허 제5,759,808호; Stijlemans et al., 2004 J. Biol. Chem. 279: 1256-1261; Dumoulin et al., 2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger et al., 2003 Bioconjugate Chem. 14: 440-448; Cortez-Retamozo et al., 2002 Int. J. Cancer 89: 456-62; 및 Lauwereys et al., 1998 EMBO J. 17: 3512-3520]. 카멜리드 항체 및 항체 단편의 공학 처리시킨 라이브러리는, 예를 들어 다음 공급처로부터 시판되고 있다 [공급처: Ablynx, Ghent, Belgium]. 비-인간 기원의 기타 항체와 같이, 카멜리드 항체의 아미노산 서열을 재조합적으로 변경시켜 인간 서열과 보다 근접하게 유사한 서열을 수득할 수 있는데, 즉 나노보디를 "인간화"시킬 수 있다. 따라서, 인간에 대한 카멜리드 항체의 천연상 낮은 항원성을 추가로 저하시킬 수 있다.

카멜리드 나노보디는 분자량이 인간 IgG 분자의 대략 1/10이고, 상기 단백질은 단지 수 나노미터의 물리적 직경을 갖는다. 이와 같이 작은 크기에 따른 한 가지 결과로서는, 카멜리드 나노보디가 보다 큰 항체 단백질에는 기능적으로 보이지 않는 항원성 부위와 결합할 수 있는 능력이 있다는 것인데, 즉 카멜리드 나노보디는 전통적인 면역학적 기술을 사용한 경우에는 드러나지 않았던 항원을 탐지하기 위한 시약으로서 유용하고, 또한 가능한 치료제로서 유용하다. 따라서, 작은 크기에 따른 또 다른 결과로서, 카멜리드 나노보디는 표적 단백질의 작은 홈 또는 협소한 갈라진 틈 내의 특이적 부위와 결합함으로써 이를 억제할 수 있으므로, 전통적인 항체 보다 전통적인 저 분자량 약물의 기능과 보다 밀접하게 유사한 능력으로 제공될 수 있다.

이러한 저 분자량과 조밀한 크기로 인해, 극도로 열 안정적이고, 극한 pH에 대해 안정적이며 단백질 분해적 분해에 대해서도 안정적이고, 낮은 항원성을 지닌 카멜리드 나노보디가 생성된다. 또 다른 결과는 카멜리드 나노보디가 순환계로부터 조직 내로 용이하게 이동하고, 심지어는 혈액-뇌 장벽을 가로질러 가므로, 신경 조직에 악영향을 미치는 장애를 치료할 수 있다. 나노보디는 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 약물 수송을 추가로 촉진시킬 수 있다 [참고: 미국 공개특허공보 제20040161738호 (2004년 8월 19일자로 공개됨)]. 이들 특징을 인간에 대한 낮은 항원성과 조합하면, 이는 치료적으로 큰 잠재력을 나타낸다. 추가로, 이들 분자는 원핵 세포, 예를 들어 이. 콜라이 (E. coli)에서 완전히 발현될 수 있다.

따라서, 본 발명의 특징은 C3b에 대한 고 친화성을 지닌 카멜리드 항체 또는 카멜리드 나노보디이다. 본원의 특정 국면에서, 카멜리드 항체 또는 나노보디는 카멜리드 동물에게서 천연상 생성되는데, 즉 기타 항체에 대해 본원에 기재된 기술을 사용하여 C3b 또는 그의 펩티드 단편으로 면역시킨 후 카멜리드에 의해 생성된다. 또 다른 한편, 항-C3b 카멜리드 나노보디를 공학 처리시키는데, 즉 이는 표적으로서 본원에 기재된 C3b 또는 C3b 네오-에피토프를 이용한 패닝 과정을 사용하여, 적당하게 돌연변이 유발시킨 카멜리드 나노보디 단백질을 디스플레이하는 파아지의 라이브러리로부터 선별함으로써 생성된다. 공학 처리시킨 나노보디는 수용자 대상체에서의 반감기가 45분에서 2주로 증가되도록 유전 공학 처리함으로써 추가로 설계할 수 있다.

디아보디

디아보디는 V_H 도메인과 V_L 도메인이 동일한 쇄 상에서 이들 두 도메인 간에 짝짓기를 허용하기에는 너무 짧은 링커에 의해 연결되어, 단일 폴리펩티드 쇄 상에 발현되는 2가의 이중-특이적 분자이다. V_H 도메인과 V_L 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 짝짓기 함으로써, 2개의 항원 결합 부위를 창출시킨다 [참고: 예를 들어, Holliger et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak et al., 1994 Structure 2:1121-1123]. 디아보디는 동일한 세포 내에서 구조 V_HA-V_LB 및 V_HB-V_LA (V_H-V_L 입체 배치), 또는 V_LA-V_HB 및 V_LB-V_HA (V_L-V_H 입체 배치)를 수반한 2개의 폴리펩티드 쇄를 발현함으로써 생성될 수 있다. 이들 대부분은 세균 내에서 가용성 형태로 발현될 수 있다.

단일 쇄 디아보디 (scDb)는 대략 15개 아미노산 잔기의 링커를 이용하여 2개의 디아보디-형성성 폴리펩티드 쇄를 연결함으로써 생성시킨다 [참고: Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(3-4): 128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36]. scDb는 세균 내에서 가용성 활성 단량체 형태로 발현될 수 있다 [참고: Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(34): 128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36; Pluckthun and Pack, 1997 Immunotechnology, 3(2): 83-105; Ridgway et al., 1996 Protein Eng., 9(7):617-21].

디아보디를 Fc와 융합시켜 "디-디아보디"를 생성시킬 수 있다 [참고: Lu et al., 2004 J. Biol. Chem., 279(4):2856-65].

공학 처리되고 변형시킨 항체

본 발명의 항체는 변형시킨 항체를 공학 처리하기 위해 출발 물질로서 하나 이상의 V_H 및/또는 V_L 서열을 갖는 항체를 사용하여 제조할 수 있는데, 상기 변형시킨 항체는 출발 항체로부터 변경된 특성을 지닐 수 있다. 항체는 가변 영역 중의 하나 또는 둘 다 (즉, V_H 및/또는 V_L) 내의 하나 이상의 잔기, 예를 들어 하나 이상의 CDR 영역 및/또는 하나 이상의 골격 영역 내의 하나 이상의 잔기를 변형시킴으로써 공학 처리시킬 수 있다. 부가적으로, 또는 또 다른 한편, 항체는 불변 영역(들) 내의 잔기를 변형시킴으로써 공학 처리하여, 예를 들어 이러한 항체의 효과기 기능(들)을 변경시킬 수 있다.

수행될 수 있는 가변 영역 공학 처리의 한 가지 유형은 CDR 이식화이다. 항체는 주로 6개의 중쇄 및 경쇄 CDR 내에 위치하는 아미노산 잔기를 통하여 표적 항원과 상호 작용한다. 이러한 이유로 인해, CDR 내의 아미노산 서열은 CDR 외부의 서열 보다 개개 항체들 간에 보다 다양하다. CDR 서열은 대부분의 항체-항원 상호 작용에 책임이 있기 때문에, 상이한 특성을 지닌 상이한 항체로부터의 골격 서열 상으로 이식된 특이적 천연 발생적 항체로부터의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구축함으로써 특이적 천연 발생적 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현시킬 수 있다 [참고: 예를 들어, Riechmann et al., 1998 Nature 332:323-327; Jones et al., 1986 Nature 321:522-525; Queen et al., 1989 Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033; 미국 특허 제5,225,539호, 및 미국 특허 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,693,762호 및 제6,180,370호].

골격 서열은 생식세포계 항체 유전자 서열을 포함하는 공개된 참고 문헌 또는 공개 DNA 데이터베이스로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 생식세포계 DNA 서열은 "VBase" 인간 생식세포계 서열 데이터베이스 (인터넷 www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase로부터 입수 가능함)에서 발견할 수 있을 뿐만 아니라 문헌 [참고: Kabat et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson et al., 1992 J. Mol. Biol. 227:776-798; 및 Cox et al., 1994 Eur. J. Immunol. 24:827-836; 각각의 전문이 본원에 참고로 도입된다]에 보고되었다.

V_H CDR1, 2 및 3 서열, 및 V_L CDR1, 2 및 3 서열을, 골격 서열이 유래되는 생식세포계 면역글로불린 유전자에서 발견되는 바와 동일한 서열을 갖는 골격 영역 상으로 이식시킬 수 있거나, 또는 CDR 서열을 생식세포계 서열과 비교해서 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 골격 영역 상으로 이식시킬 수 있다. 예를 들어, 특정의 경우에는 골격 영역 내의 잔기를 돌연변이시켜 항체의 항원 결합 능력을 유지 또는 증강시키는 것이 유리한 것으로 밝혀졌다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,693,762호 및 제6,180,370호].

CDR을 또한, 면역글로불린 도메인 이외의 폴리펩티드의 골격 영역 내로 이식시킬 수 있다. 적당한 스캐폴드는 이식된 잔기를 디스플레이하는 입체 형태적으로 안정한 골격을 형성하므로, 이들은 국소 표면을 형성하고 관심있는 표적 (예: C3b 항원)과 결합한다. 예를 들어, CDR을 스캐폴드 상으로 이식할 수 있는데, 여기서는 골격 영역이 피브로넥틴, 안키린 (ankyrin), 리포칼린 (lipocalin), 네오카르지노스타인 (neocarzinostain), 시토크롬 b, CP1 아연 핑거, PST1, 코일드 코일 (coiled coil), LACI-D1, Z 도메인 또는 텐드라미새트 (tendramisat)에 기초한다 [참고: 예를 들어, Nygren and Uhlen, 1997 Current Opinion in Structural Biology, 7, 463-469].

또 다른 유형의 가변 영역 변형은 V_H 및/또는 V_L CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내의 아미노산 잔기를 돌연변이시킴으로써, 관심있는 항체의 한 가지 이상 결합 특성 (예: 친화성)을 개선시키는 것이다 ("친화 돌연변이"로서 공지됨). 부위 지시된 돌연변이 유발 또는 PCR 매개된 돌연변이 유발을 수행하여 상기 돌연변이(들)를 도입할 수 있고, 항체 결합에 대한 효과, 또는 관심있는 기타 기능적 특성은 본원에 기재된 바와 같은 시험관내 또는 생체내 검정에서 평가할 수 있다. 보존적 변형을 도입할 수 있다. 돌연변이는 아미노산 치환, 부가 또는 결실일 수 있다. 더우기, 전형적으로 CDR 영역 내의 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 이하 잔기를 변경시킨다.

본 발명의 공학 처리시킨 항체에는 V_H 및/또는 V_L 내의 골격 잔기에 대한 변형이 이루어져서, 예를 들어 항체의 특성을 개선시킨 것이 포함된다. 전형적으로, 이러한 골격 변형은 항체의 면역원성을 저하시키기 위해 이루어진다. 예를 들어, 한 가지 접근 방식은 1개 이상의 골격 잔기를 상응하는 생식세포계 서열로 "역돌연변이"시키는 것이다. 보다 구체적으로 언급하면, 체세포 돌연변이를 진행하는 항체는 이러한 항체가 유래되는 생식세포계 서열과는 상이한 골격 잔기를 함유할 수 있다. 이러한 잔기는 항체 골격 서열을 해당 항체가 유래되는 생식세포계 서열과 비교함으로써 확인할 수 있다. 골격 영역 서열을 그들의 생식세포계 형상으로 복귀시키기 위해서는, 체세포 돌연변이물을, 예를 들어 부위 지시된 돌연변이 유발 또는 PCR 매개된 돌연변이 유발에 의해 생식세포계 서열로 "역돌연변이"시킬 수 있다. 이러한 "역돌연변이된" 항체가 또한 본 발명에 포괄된다.

또 다른 유형의 골격 변형은 골격 영역 내의 1개 이상의 잔기, 또는 심지어 하나 이상의 CDR 영역 내의 1개 이상의 잔기를 돌연변이시켜 T 세포-에피토프를 제거함으로써, 항체의 잠재적 면역원성을 저하시키는 것을 포함한다. 이러한 접근 방식은 "탈면역"으로서 지칭되기도 하고, 미국 공개특허공보 제20030153043호 (Carr et al.)에 추가로 상세히 기재되어 있다.

골격 또는 CDR 영역 내에서 이루어진 변형 이외에도 또는 변형에 대한 대안으로서, 본 발명의 항체가 Fc 영역 내에서의 변형을 포함하도록, 전형적으로 항체의 한 가지 이상 기능적 특성, 예를 들면 혈청 반감기, 보체 고정화, Fc 수용체 결합, 및/또는 항원-의존적 세포성 세포독성을 변경시키도록 본 발명의 항체를 공학 처리할 수 있다. 더우기, 본 발명의 항체를 화학적으로 변형시킬 수 있거나 (예를 들어, 하나 이상의 화학적 부분을 항체에 부착시킬 수 있다), 또는 그의 글리코실화를 변경시켜 항체의 한 가지 이상 기능적 특성을 다시 변경시키도록 변형시킬 수 있다.

한 국면에서, CH1의 힌지 영역은 이러한 힌지 영역 내의 시스테인 잔기 수가 변경되도록, 예를 들어 증가되거나 감소되도록 변형시킨다. 이러한 접근 방식은 미국 특허 제5,677,425호 (Bodmer et al.)에 추가로 기재되어 있다. CH1의 힌지 영역 내의 시스테인 잔기 수는, 예를 들어 경쇄 및 중쇄의 어셈블리를 촉진시키거나 또는 항체의 안정성을 증가 또는 저하시키도록 변경시킨다.

또 다른 국면에서, 항체의 Fc 힌지 영역은 항체의 생물학적 반감기를 감소시키도록 돌연변이시킨다. 보다 구체적으로 언급하면, 1개 이상의 아미노산 돌연변이를 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 계면 영역 내로 도입하여, 항체가 천연 Fc-힌지 도메인 스타필로코실 (Staphylococcyl) 단백질 A (SpA) 결합과 비교해서 손상된 SpA 결합을 지니도록 한다. 이러한 접근 방식은 미국 특허 제6,165,745호 (Ward et al.)에 추가로 상세히 기재되어 있다.

또 다른 국면에서, 항체는 그의 생물학적 반감기를 증가시키도록 변형시킨다. 각종 접근 방식이 가능하다. 예를 들어, 미국 특허 제6,277,375호에는 그의 생체내 반감기를 증가시키는, IgG 내에서의 다음 돌연변이가 기재되어 있다: T252L, T254S, T256F. 또 다른 한편 생물학적 반감기를 증가시키기 위해, 항체를 CH1 또는 CL 영역 내에서 변경시켜, IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개 루프로부터 취한 재이용 (salvage) 수용체 결합 에피토프를 함유하도록 할 수 있다 [미국 특허 제5,869,046호 및 제6,121,022호 (Presta et al.)에 기재된 바와 같음].

기타 국면에서, Fc 영역은 1개 이상의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체시켜 항체의 효과기 기능을 변경시킴으로써 변경시킨다. 친화성을 변경시킨 효과기 리간드는, 예를 들어 Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분일 수 있다. 예를 들어, 항체가 효과기 리간드에 대한 변경된 친화성을 지니긴 하지만 모 항체의 항원-결합 능력을 보유하도록, 1개 이상의 아미노산을 상이한 아미노산 잔기로 대체시킬 수 있다. 예시되는 아미노산 돌연변이는 234, 235, 236, 237, 252, 254, 256, 297, 309, 311, 315, 318, 320, 322, 433 및/또는 434 중에서 선택된 위치에서 일어난다. 본 발명의 C3b 결합 분자에는 구체적으로, 본 발명의 교시에 따라서 제조되고 사용된 컨센서스 Fc 항체 도메인이 포괄된다. 바람직한 항-C3b 항체에는 234 및/또는 235 중에서 선택된 위치에서의 Fc 돌연변이가 포함된다. 이러한 접근 방식은 미국 특허 제5,624,821호 및 제5,648,260호 (Winter et al.)에 추가로 상세히 기재되어 있다.

또 다른 국면에서, 항체가 변경된 Clq 결합 및/또는 저하되거나 제거된 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 지니도록, 아미노산 잔기 중에서 선택된 1개 이상의 아미노산을 상이한 아미노산 잔기로 대체시킬 수 있다. 이러한 접근 방식은 미국 특허 제6,194,551호 (Idusogie et al.)에 추가로 상세히 기재되어 있다.

또 다른 국면에서, 1개 이상의 아미노산 잔기를 변경시킴으로써 보체를 고정시킬 수 있는 항체의 능력을 변경시킨다. 이러한 접근 방식은 WO 94/29351 (Bodmer et al.)에 추가로 상세히 기재되어 있다.

또 다른 국면에서, Fc 영역은 1개 이상의 아미노산을 변형시킴으로써 Fcγ 수용체에 대한 항체의 친화성을 증가시키고/시키거나 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 매개할 수 있는 항체의 능력을 증가시키도록 변형시킨다. 이러한 접근 방식은 WO 00/42072 (Presta)에 추가로 기재되어 있다. 더우기, FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 인간 IgG1 상의 결합 부위를 지도화하였고, 결합이 개선된 변이체가 보고되었다 [참고: Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chem. 276:6591-6604].

또 다른 국면에서, 항체의 글리코실화를 변형시킨다. 예를 들어, 비글리코실화 항체를 만들 수 있다 (즉, 항체에 글리코실화가 결여됨). 글리코실화는, 예를 들어 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시키도록 변경시킬 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어 항체 서열 내의 하나 이상의 글리코실화 부위를 변경시킴으로써 수행할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역 골격 글리코실화 부위를 제거시킴으로써, 이 부위에서의 글리코실화를 제거시켜 주는 1개 이상의 아미노산 치환을 만들 수 있다. 이러한 비글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시킬 수 있다. 상기 접근 방식은 미국 특허 제5,714,350호 및 제6,350,861호 (Co et al.)에 추가로 상세히 기재되어 있다.

부가적으로, 또는 또 다른 한편, 변경된 유형의 글리코실화를 나타내는 항체, 예를 들어 푸코실 잔기 량이 감소된 저푸코실화 항체 또는 이등분 GlcNac 구조가 증가된 항체를 만들 수 있다. 이와 같이 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증되었다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어 변경된 글리코실화 기구를 수반하는 숙주 세포에서 해당 항체를 발현시킴으로써 수행할 수 있다. 변경된 글리코실화 기구를 수반한 세포는 당해 분야에 보고된 바 있고, 이는 본 발명의 재조합 항체를 발현시킴으로써 변경된 글리코실화를 나타내는 항체를 생성시키는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, EP 1,176,195 (Hang et al.)에는 푸코실 트랜스퍼라제를 암호화하는, 기능상 붕괴된 FUT8 유전자를 수반한 세포주가 기재되어 있는데, 이로써 상기 세포주에서 발현된 항체는 저푸코실화를 나타낸다. PCT 공개공보 WO 03/035835 (Presta)에는 Asn(297)-연결된 탄수화물에 푸코스를 부착시킬 수 있는 능력이 저하된 변이체 CHO 세포주 Lecl3 세포가 기재되어 있는데, 이러한 숙주 세포에서 발현된 항체는 저푸코실화되기도 한다 [참고: Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740]. WO 99/54342 (Umana et al.)에는 당단백질 조절성 글리코실 트랜스퍼라제 [예: 베타(1,4)-N 아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII)]를 발현하도록 공학 처리시킨 세포주가 기재되어 있는데, 이와 같이 공학 처리시킨 세포주에서 발현된 항체는 증가된 이등분 GlcNac 구조를 나타내어 항체의 ADCC 활성이 증가된다 [참고: Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180].

본 발명에 고려되는 본원의 항체의 또 다른 변형은 PEG화이다. 항체는, 예를 들어 항체의 생물학적 (예: 혈청) 반감기를 증가시키도록 PEG화할 수 있다. 항체를 PEG화하기 위해서는, 이러한 항체 또는 그의 단편을 전형적으로, 1개 이상의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 부분이 항체 또는 항체 단편에 부착되도록 하는 조건 하에 PEG, 예를 들어 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 반응시킨다. PEG화는 반응성 PEG 분자 (또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 알킬화 반응 또는 아실화 반응에 의해 수행할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 기타 단백질, 예를 들어 모노 (C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 유도체화하기 위해 사용되어 온 모든 형태의 PEG를 포괄한다. 특정 국면에서, PEG화되는 항체는 비글리코실화 항체이다. 단백질을 PEG화하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 이를 본 발명의 항체에 적용할 수 있다 [참고: 예를 들어, EP 0 154 316 (Nishimura et al.) 및 EP 0 401 384 (Ishikawa et al.)].

또한, PEG화는 비천연 아미노산을 도입함으로써 본 발명의 C3b 결합 폴리펩티드의 어느 부분에서도 달성될 수 있다. 특정의 비천연 아미노산은 다음 문헌에 기재된 기술에 의해 도입할 수 있다 [참고: Deiters et al., J Am Chem Soc 125:11782-11783, 2003; Wang and Schultz, Science 301:964-967, 2003; Wang et al., Science 292:498-500, 2001; Zhang et al., Science 303:371-373, 2004 또는 미국 특허 제7,083,970호]. 간략하게 설명하면, 몇몇 이들 발현 시스템은 논센스 코돈, 예를 들어 앰버 (amber) TAG를 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 개방 판독 프레임 내로 도입하기 위한 부위 지시된 돌연변이 유발을 포함한다. 이어서, 이러한 발현 벡터를, 도입된 논센스 코돈에 대해 특이적인 tRNA를 활용할 수 있는 숙주 내로 도입하고, 선택되는 비천연 아미노산을 충전시킨다. 부분들을 본 발명의 폴리펩티드와 접합시키는 데에 유리한 특별한 비천연 아미노산에는 아세틸렌 및 아지도 측쇄를 갖는 아미노산이 포함된다. 이어서, 이들 신규 아미노산을 함유하는 폴리펩티드를 해당 단백질 내의 이들 선택된 부위에서 PEG화할 수 있다.

항체를 공학 처리하는 방법

상기 논의된 바와 같이, 항-C3b 항체를 사용하여, 완전한 길이의 중쇄 및/또는 경쇄 서열, V_H 및/또는 V_L 서열, 또는 이에 부착된 불변 영역(들)을 변형시킴으로써 신규한 항-C3b 항체를 창출시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체의 하나 이상의 CDR 영역을 공지된 골격 영역 및/또는 기타 CDR과 재조합적으로 조합시켜, 재조합적으로 공학 처리시킨 신규한 항-C3b 항체를 창출시킬 수 있다. 기타 유형의 변형에는 앞서 섹션에 기재된 것들이 포함된다. 공학 처리 방법을 위한 출발 물질은 V_H 및/또는 V_L 서열 중의 하나 이상, 또는 그의 하나 이상의 CDR 영역이다. 공학 처리시킨 항체를 창출시키기 위해서는, V_H 및/또는 V_L 서열 중의 하나 이상, 또는 그의 하나 이상의 CDR 영역을 갖는 항체를 실제적으로 제조 (즉, 단백질로서 발현)할 필요는 없다. 오히려, 이들 서열 내에 함유된 정보를 출발 물질로서 사용하여 본래의 서열(들)로부터 유래된 "차세대" 서열을 창출시킨 다음, 이러한 "차세대" 서열(들)을 단백질로서 제조 및 발현시킨다.

표준 분자 생물학 기술을 사용하여 변경된 항체 서열을 제조 및 발현할 수 있다. 이와 같이 변경된 항체 서열(들)에 의해 암호화된 항체는 이로부터 유래되는 항-C3b 항체의 기능적 특성 중의 한 가지 특성, 몇 가지 특성 또는 전부를 보유하고 있는 것인데, 기능적 특성에는 C3b와 특이적으로 결합하는 특성, C3b 복합체의 형성을 억제하는 특성, C3 전환효소 활성화를 억제하는 특성, C5 전환효소 활성화를 억제하는 특성, MAC의 형성을 억제하는 특성이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 변경된 항체의 기능적 특성은 당해 분야에서 이용 가능하고/하거나 본원에 기재된 표준 검정 (예: ELISA)을 사용하여 평가할 수 있다.

본 발명의 항체를 공학 처리하는 방법의 특정 국면에서는, 돌연변이를 항-C3b 항체 암호화 서열의 전부 또는 일부를 따라 무작위 또는 선택적으로 도입할 수 있고, 이로써 생성되는 변형된 항-C3b 항체를 대상으로 하여 결합 활성 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 기타 기능적 특성 (예를 들어, C3 또는 C5 전환효소 활성 억제, MAC 형성 억제, 보체 경로 조절이상 조정)에 관하여 스크리닝할 수 있다. 돌연변이 방법은 당해 분야에 보고되었다. 예를 들어, PCT 공개공보 WO 02/092780 (Short)에는 포화 돌연변이 유발, 합성 연결 어셈블리, 또는 이들의 조합을 이용하여 항체 돌연변이물을 창출 및 스크리닝하는 방법이 기재되어 있다. 또 다른 한편, WO 03/074679 (Lazar et al.)에는 항체의 물리화학적 특성을 최적화하기 위한 연산처리 스크리닝 방법을 사용하는 방법이 기재되어 있다.

뉴클레오티드 서열은 이것이 생산 세포 또는 유기체, 일반적으로 진핵 세포, 예를 들어 효모 [예: 피치아 (Pichia)] 세포, 곤충 세포, 포유류 세포, 예를 들면 중국산 햄스터 난소 세포 (CHO) 또는 인간 세포에서 선호되는 코돈을 사용하여 아미노산 서열을 암호화하도록 변경된 경우에는 이를 "최적화"시킨 것으로 간주된다. 이와 같이 최적화된 뉴클레오티드 서열은, "모" 서열로서 공지되기도 하는 본래의 출발 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열과 동일하거나 거의 동일한 아미노산 서열을 암호화도록 공학 처리시킨다.

비-항체 C3b 결합 분자

본 발명은 추가로, 항체의 기능적 특성을 나타내긴 하지만, 기타 폴리펩티드 (예를 들어, 생체 내에서 항체 유전자의 재조합에 의해 생성되거나 항체 유전자에 의해 암호화된 것 이외의 폴리펩티드)로부터 그의 골격 및 항원 결합 부분을 유도시키는 C3b 결합 분자를 제공한다. 이들 결합 분자의 항원 결합 도메인 (예를 들어, C3b 결합 도메인)은 유도된 진화 공정을 통하여 생성된다 [참고: 미국 특허 제7,115,396호]. 항체의 가변 도메인과 유사한 전반적인 폴드 ("면역글로불린-유사" 폴드)를 갖는 분자가 적당한 스캐폴드 단백질이다. 항원 결합 분자를 유도시키는 데에 적합한 스캐폴드 단백질에는 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 이량체, 테나신, N-캐드헤린, E-캐드헤린, ICAM, 티틴, GCSF-수용체, 사이토킨 수용체, 글리코시다제 억제제, 항생제 색소단백질, 미엘린 막 부착 분자 PO, CD8, CD4, CD2, 부류 I MHC, T-세포 항원 수용체, CD1, C2 및 VCAM-1의 I-세트 도메인, 미오신-결합 단백질 C의 I-세트 면역글로불린 도메인, 미오신 결합 단백질 H의 I-세트 면역글로불린 도메인, 텔로킨의 I-세트 면역글로불린 도메인, NCAM, 트위친, 뉴로글리안, 성장 호르몬 수용체, 에리트로포이에틴 수용체, 프롤락틴 수용체, 인터페론-감마 수용체, β-갈락토시다제/글루쿠로니다제, α-글루쿠로니다제, 트랜스글루타미나제, T-세포 항원 수용체, 슈퍼옥사이드 디스무타제, 조직 인자 도메인, 시토크롬 F, 그린 형광성 단백질, GroEL, 및 타우마틴이 포함된다.

비-항체 결합 분자의 항원 결합 도메인 (예: 면역글로불린-유사 폴드)은 분자량이 10 kD 미만 또는 7.5 kD 초과 (예를 들어, 7.5 내지 10 kD의 분자량)일 수 있다. 항원 결합 도메인을 유도시키기 위해 사용된 단백질은 천연 발생적 포유류 단백질 (예: 인간 단백질)이고, 항원 결합 도메인에는 이것이 유래되는 단백질의 면역글로불린-유사 폴드와 비교해서 돌연변이된 아미노산을 50％ 이하 (예를 들어, 34％, 25％, 20％, 또는 15％ 이하) 포함한다. 면역글로불린-유사 폴드를 갖는 도메인은 일반적으로 50 내지 150개 아미노산 (예를 들어, 40 내지 60개 아미노산)으로 이루어진다.

비-항체 결합 분자를 생성시키기 위해, 항원 결합 표면을 형성하는 스캐폴드 단백질 영역 (예를 들어, 항체 가변 도메인 면역글로불린 폴드의 CDR과 위치 및 구조 면에서 유사한 영역) 내의 서열을 무작위화시킨 클론 라이브러리를 창출시킨다. 라이브러리 클론을 대상으로 하여, 관심있는 항원 (예: C3b)에 대한 특이적 결합과 기타 기능 (예를 들어, C3b의 생물학적 활성의 억제)에 관하여 시험한다. 선별된 클론을 추가의 무작위화 및 선별을 위한 기준으로서 사용하여 항원에 대한 보다 고 친화성인 유도체를 생성시킬 수 있다.

예를 들어, 스캐폴드로서 피브로넥틴 III의 10번째 모듈 (¹⁰Fn3)을 사용하여, 고 친화성 결합 분자를 생성시킨다. 잔기 23-29, 52-55, 및 78-87에서 ¹⁰Fn3의 3개 CDR-유사 루프 각각에 대한 라이브러리를 구축한다. 각 라이브러리를 구축하기 위해, 각 CDR-유사 영역과 중복되는 서열을 암호화하는 DNA 절편을 올리고뉴클레오티드 합성에 의해 무작위화한다. 선별 가능한 ¹⁰Fn3 라이브러리를 생성시키기 위한 기술이 문헌 [참고: 미국 특허 제6,818,418호 및 제7,115,396호; Roberts and Szostak, 1997 Proc. Natl. Acad. Sci USA 94:12297; 미국 특허 제6,261,804호; 미국 특허 제6,258,558호; 및 Szostak et al. WO98/31700]에 기재되어 있다.

비-항체 결합 분자를 표적 항원에 대한 결합 활성도를 증가시키기 위한 이량체 또는 다량체로서 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 항원 결합 도메인이 Fc-Fc 이량체를 형성하는 항체의 불변 영역 (Fc)과의 융합물로서 발현된다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제7,115,396호].

본 발명의 항체를 암호화하는 핵산 분자

본 발명의 또 다른 국면은 본 발명의 C3b 결합 분자를 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다. 이러한 핵산은 완전 세포, 세포 용해물에 제시될 수 있거나, 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 정제된 형태의 핵산일 수 있다. 핵산은 표준 기술, 예를 들어 알칼리성/SDS 처리, CsCl 밴드 형성, 칼럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 당해 분야에 공지된 기타 기술에 의해 기타 세포성 성분 또는 기타 오염물질, 예를 들어 기타 세포성 핵산 또는 단백질로부터 정제 제거되는 경우에 "단리"되거나 "실질적으로 순수하게 된다" [참고: F. Ausubel, et al., ed. 1987 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York]. 본 발명의 핵산은, 예를 들어 DNA 또는 RNA일 수 있고, 인트론성 서열을 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. 특정 국면에서는, 핵산이 cDNA 분자이다. 핵산은 벡터 [예: 파아지 디스플레이 벡터], 또는 재조합 플라스미드 벡터에 제시될 수 있다.

본 발명의 핵산은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 수득할 수 있다. 하이브리도마 (예를 들어, 다음에 추가로 기재되는 바와 같은 인간 면역글로불린 유전자를 보유하고 있는 트랜스제닉 마우스로부터 제조된 하이브리도마)에 의해 발현된 항체의 경우에는, 이러한 하이브리도마에 의해 생성된 항체의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 cDNA를 표준 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝 기술에 의해 수득할 수 있다. 면역글로불린 유전자 라이브러리로부터 수득한 항체의 경우에는 (예를 들어, 파아지 디스플레이 기술을 사용하는 경우), 이러한 항체를 암호화하는 핵산을 상기 라이브러리의 구성원인 각종 파아지 클론으로부터 회수할 수 있다.

일단 V_H 및 V_L 절편을 암호화하는 DNA 단편을 수득하게 되면, 이들 DNA 단편을 표준 재조합 DNA 기술에 의해 추가로 조작하여, 예를 들어 가변 영역 유전자를 완전한 길이의 항체 쇄 유전자, Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자로 전환시킬 수 있다. 이들 조작에서는, V_L- 또는 V_H-암호화 DNA 단편을 또 다른 DNA 분자와 작동적으로 연결시키거나, 또는 또 다른 단백질, 예를 들어 항체 불변 영역 또는 가요성 링커를 암호화하는 단편과 작동적으로 연결시킨다. 이러한 맥락에서 사용된 바와 같은 용어 "작동적으로 연결된"이란 2개 DNA 단편을 기능적 방식으로 연결시켜, 예를 들어 이러한 2개 DNA 단편에 의해 암호화된 아미노산 서열이 동일 프레임 내에서 유지되도록 하거나 또는 단백질이 목적하는 프로모터의 제어 하에 발현되도록 하는 것을 의미한다.

V_H 영역을 암호화하는 단리된 DNA는 중쇄 불변 영역 (CH1, CH2 및 CH3)을 암호화하는 또 다른 DNA 분자에 V_H-암호화 DNA를 작동적으로 연결시킴으로써 완전한 길이의 중쇄 유전자로 전환시킬 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당해 분야에 공지되어 있고 [참고: 예를 들어, Kabat et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242], 이들 영역을 포괄하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있다. Fab 단편 중쇄 유전자의 경우, V_H-암호화 DNA는 단지 중쇄 CH1 불변 영역 만을 암호화하는 또 다른 DNA 분자와 작동적으로 연결시킬 수 있다.

V_L 영역을 암호화하는 단리된 DNA는 경쇄 불변 영역 CL을 암호화하는 또 다른 DNA 분자에 V_L-암호화 DNA를 작동적으로 연결시킴으로써 완전한 길이의 경쇄 유전자 (뿐만 아니라 Fab 경쇄 유전자)로 전환시킬 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당해 분야에 공지되어 있고 [참고: 예를 들어, Kabat et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242], 이들 영역을 포괄하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다.

scFv 유전자를 창출하기 위해서는, V_H- 및 V_L-암호화 DNA 단편을 가요성 링커, 예를 들어 아미노산 서열 (Gly4-Ser)₃을 암호화하는 또 다른 단편과 작동적으로 연결시켜, V_H 및 V_L 서열이 연속되는 단일 쇄 단백질로서 발현될 수 있도록 하는데, V_L 영역과 V_H 영역은 가요성 링커에 의해 연결된다 [참고: 예를 들어, Bird et al., 1988 Science 242:423-426; Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., 1990 Nature 348:552-554].

모노클로날 항체 생성

모노클로날 항체 (mAb)는 통상적인 모노클로날 항체 방법론을 포함한 각종 기술, 예를 들어 문헌 [참고: Kohler and Milstein, 1975 Nature 256:495]의 표준 체세포 혼성화 기술, 또는 라이브러리 디스플레이 방법, 예를 들어 파아지 디스플레이를 사용하여 생성될 수 있다

하이브리도마를 제조하기 위한 동물 시스템은 뮤린 시스템이다. 마우스에서 하이브리도마를 생성시키는 것은 널리 확립된 과정이다. 면역 프로토콜 및 융합을 위해 면역시킨 비장 세포를 단리하는 기술은 당해 분야에 공지되어 있다. 융합 파트너 (예: 뮤린 골수종 세포) 및 융합 과정 또한 공지되어 있다.

본 발명의 키메라 또는 인간화 항체는 상기 언급된 바와 같이 제조된 뮤린 모노클로날 항체의 서열을 기준으로 하여 제조할 수 있다. 중쇄 및 경쇄 면역글로불린을 암호화하는 DNA는 관심있는 뮤린 하이브리도마로부터 수득할 수 있고, 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 비-뮤린 (예: 인간) 면역글로불린 서열을 함유하도록 공학 처리할 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체를 창출하기 위해서는, 뮤린 가변 영역을 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 인간 불변 영역에 연결시킬 수 있다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 (Cabilly et al.)]. 인간화 항체를 창출하기 위해서는, 뮤린 CDR 영역을 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 인간 골격 내로 삽입할 수 있다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제5,225,539호, 및 미국 특허 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,693,762호 및 제6,180,370호].

특정 국면에서, 본 발명의 항체는 인간 모노클로날 항체이다. C3b 에피토프에 대항하여 유도된 인간 모노클로날 항체는 마우스 시스템 보다는 오히려 인간 면역계의 일부를 수반하고 있는 트랜스제닉 또는 트랜스-염색체성 마우스를 사용하여 생성시킬 수 있다. 이들 트랜스제닉 및 트랜스-염색체성 마우스에는 본원에서 HuMAb 마우스 및 KM 마우스로서 각각 지칭된 마우스가 포함되고, 이는 본원에서 집합적으로 "인간 Ig 마우스"로서 지칭된다.

HuMAb 마우스^® (공급처: Medarex, Inc.)는 내인성 μ 및 κ 쇄 유전자자리를 불활성화시키는 표적화 돌연변이와 함께, 재배열되지 않은 인간 중쇄 (μ 및 γ) 및 κ 경쇄 면역글로불린 서열을 암호화하는 인간 면역글로불린 유전자 미니자리를 함유한다 [참고: 예를 들어, Lonberg et al., 1994 Nature 368(6474): 856-859]. 따라서, 마우스는 마우스 IgM 또는 κ의 발현 저하를 나타내고, 면역에 반응하여 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스-유전자는 부류 전환과 체세포 돌연변이를 진행하여 고 친화성 인간 IgGκ 모노클로날을 생성시킨다 [참고: Lonberg, N. et al., 1994 상기 참고; Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol.13: 65-93, 및 Harding, F. and Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546]. HuMAb 마우스의 제조 및 용도, 및 이러한 마우스에 의해 수반된 게놈 변형이 다음 문헌에 추가로 기재되어 있다 [참고: Taylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al., 1993 International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724; Choi et al., 1993 Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al., 1994 J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al., 1994 International Immunology 579-591; 및 Fishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851 (이들 모두의 전문이 본원에 참고로 도입된다)]. 또한 추가로, 미국 특허 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,789,650호; 제5,877,397호; 제5,661,016호; 제5,814,318호; 제5,874,299호; 및 제5,770,429호 (Lonberg 및 Kay); 미국 특허 제5,545,807호 (Surani et al.); PCT 공개공보 WO 92103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97113852, WO 98/24884 및 WO 99/45962 (Lonberg 및 Kay); 및 PCT 공개공보 WO 01/14424 (Korman et al.)를 참고할 수 있다.

또 다른 국면에서, 본 발명의 인간 항체는 트랜스-유전자 및 트랜스-염색체 상에 인간 면역글로불린 서열을 보유하고 있는 마우스, 예를 들어 인간 중쇄 트랜스-유전자 및 인간 경쇄 트랜스-염색체를 보유하고 있는 마우스를 사용하여 생성시킬 수 있다. 이러한 마우스는 본원에서 "KM 마우스"로서 지칭되고, WO 02/43478에 상세히 기재되어 있다.

인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 추가의 또 다른 트랜스제닉 동물 시스템이 당해 분야에서 입수 가능하고, 이를 사용하여 본 발명의 항-C3b 항체를 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 제노마우스 [Xenomouse^® (공급처: Abgenix, Inc.)]로서 지칭된 또 다른 트랜스제닉 시스템을 사용할 수 있다. 이러한 마우스는, 예를 들어 미국 특허 제5,939,598호; 제6,075,181호; 제6,114,598호; 제6,150,584호 및 제6,162,963호 (Kucherlapati et al.)에 기재되어 있다.

더우기, 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 또 다른 트랜스-염색체성 동물 시스템이 당해 분야에서 입수 가능하고, 이를 사용하여 본 발명의 항-C3b 항체를 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 트랜스-염색체와 인간 경쇄 트랜스-염색체 둘 다를 보유하고 있는 마우스 ("TC 마우스"로서 지칭됨)를 사용할 수 있고; 이러한 마우스는 문헌 [참고: Tomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727]에 기재되어 있다. 더우기, 인간 중쇄 트랜스-염색체와 인간 경쇄 트랜스-염색체를 보유하고 있는 암소가 당해 분야에 보고되었고 [참고: Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology 20:889-894], 이를 사용하여 본 발명의 항-C3b 항체를 생성시킬 수 있다.

본 발명의 인간 모노클로날 항체는 인간 면역글로불린 유전자의 라이브러리를 스크리닝하기 위한 파아지 디스플레이 방법을 사용하여 제조할 수도 있다. 이와 같이 인간 항체를 단리하기 위한 파아지 디스플레이 방법은 당해 분야에 확립되어 있다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제5,223,409호; 제5,403,484호 및 제5,571,698호 (Ladner et al.); 미국 특허 제5,427,908호 및 제5,580,717호 (Dower et al.); 미국 특허 제5,969,108호 및 제6,172,197호 (McCafferty et al.); 및 미국 특허 제5,885,793호; 제6,521,404호; 제6,544,731호; 제6,555,313호; 제6,582,915호 및 제6,593,081호 (Griffiths et al.)]. 라이브러리를 대상으로 하여, 완전한 길이의 C3b 항원 또는 특별한 C3b 네오-에피토프에 대한 결합에 관하여 스크리닝할 수 있다.

본 발명의 인간 모노클로날 항체는, 인간 면역 세포를 재구성시킨 바 있는 SCID 마우스를 사용하여 제조할 수도 있는데, 이로써 면역시 인간 항체 반응이 발생할 수 있다. 이러한 마우스는, 예를 들어 미국 특허 제5,476,996호 및 제5,698,767호 (Wilson et al.)에 기재되어 있다.

인간 Ig 마우스에서 인간 모노클로날 항체의 생성

원핵 세포 (예를 들어, 이. 콜라이) 또는 진핵 세포 (예를 들어, 포유류 세포, 예를 들면 HEK293 세포)에서 발현된 정제된 재조합 인간 C3b를 항원으로서 사용할 수 있다. 단백질을 캐리어, 예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH)과 접합시킬 수 있다.

C3b 네오-에피토프에 대한 완전한 인간 모노클로날 항체는 HuMab 트랜스제닉 마우스의 HCo7, HCo12 및 HCo17 균주 및 트랜스제닉 트랜스-염색체성 마우스의 KM 균주 (이들 각각은 인간 항체 유전자를 발현한다)를 사용하여 제조한다. 이들 마우스 균주 각각에서는, 내인성 마우스 카파 경쇄 유전자를 문헌 [참고: Chen et al., 1993 EMBO J. 12:811-820]에 기재된 바와 같이 동형 접합적으로 붕괴시킬 수 있고, 내인성 마우스 중쇄 유전자를 WO 01109187의 실시예 1에 기재된 바와 같이 동형 접합적으로 붕괴시킬 수 있다. 이들 마우스 균주 각각은 문헌 [참고: Fishwild et al., 1996 Nature Biotechnology 14:845-851]에 기재된 바와 같이, 인간 카파 경쇄 트랜스-유전자인 KCo5를 보유하고 있다. HCo7 균주는 미국 특허 제5,545,806호; 제5,625,825호; 및 제5,545,807호에 기재된 바와 같이 HCo7 인간 중쇄 트랜스-유전자를 보유하고 있다. HCo12 균주는 WO 01/09187의 실시예 2에 기재된 바와 같은 HCo12 인간 중쇄 트랜스-유전자를 보유하고 있다. HCo17 균주는 HCo17 인간 중쇄 트랜스-유전자를 보유하고 있다. KNM 균주는 WO 02/43478에 기재된 바와 같은 SC20 트랜스-염색체를 함유한다.

C3b 네오-에피토프에 대한 완전한 인간 모노클로날 항체를 생성시키기 위해, HuMab 마우스 및 KM 마우스를 항원으로서 정제된 재조합 C3b, C3b 단편, 또는 그의 접합체 (예: C3b-KLH)를 이용하여 면역시킨다. HuMab 마우스에 대한 일반적인 면역 도식이 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Lonberg, N. et al., 1994 Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14:845-851 및 WO 98/24884]. 상기 마우스는 항원을 처음 주입할 때 6 내지 16주생이다. 항원의 정제된 재조합 제제 (5 내지 50 ㎍)를 사용하여 HuMab 마우스 및 KM 마우스를 복강내, 피하 (Sc) 면역시키거나 또는 발바닥에 주입함으로써 면역시킨다.

트랜스제닉 마우스에게 완전 프로인트 아주반트 또는 리비 (Ribi) 아주반트 중의 항원을 복강내 (IP), 피하 (Sc) 투여하거나 또는 발바닥 (FP)에 주입하여 2회 면역시킨 다음, 3일 내지 21일 후 불완전 프로인트 또는 리비 아주반트 중의 항원을 이용하여 IP, Sc 또는 FP 면역시킨다 (총 11회 정도 면역시킴). 눈뒤 출혈을 관찰함으로써 면역 반응을 모니터링한다. 혈장을 ELISA에 의해 스크리닝하고, 충분한 역가의 항-C3b 인간 면역글로불린을 수반한 마우스를 융합에 사용한다. 희생시키고 비장을 꺼내기 3일 및 2일 전에 마우스에게 항원을 정맥내 주입함으로써 추가면역시켰다. 전형적으로, 각 항원에 대한 10 내지 35회 융합을 수행한다. 각 항원에 대해 수 십마리의 마우스를 면역시킨다. 총 82마리의 HCo7, HCo12, HCo17 및 KM 마우스 균주를 C3b 항원으로 면역시킨다.

C3b 네오-에피토프와 결합한 항체를 생산하는 HuMab 또는 KM 마우스를 선별하기 위해, 면역시킨 마우스로부터의 혈청을 대상으로 하여 문헌 [참고: Fishwild, D. et al., 1996]에 기재된 바와 같이 ELISA에 의해 시험할 수 있다. 간략하게 언급하면, 미세역가 판을 정제된 재조합 C3b로 PBS 중의 1 내지 2 ㎍/ml로 피복하고, 웰당 50 ㎕을 4℃ 하에 밤새 항온 배양한 다음, PBS/Tween (0.05％) 중의 200 ㎕/웰의 5％ 치킨 혈청으로 차단시킨다. C3b-면역시킨 마우스로부터의 혈청 희석액을 각 웰에 가하고 주위 온도 하에 1 내지 2시간 동안 항온 배양한다. 판을 PBS/Tween으로 세척한 다음, 실온 하에 1시간 동안 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)와 접합된 염소-항-인간 IgG Fc 폴리클로날 항체와 함께 항온 배양한다. 세척 후, 상기 판을 ABTS 기질 (공급처: Sigma, A-1888, 0.22 mg/ml)로 전개하고, 분광광도계를 이용하여 OD 415-495으로 분석한다. 가장 높은 항-C3b 항체 역가를 발생한 마우스의 비장 세포를 융합에 사용한다. 융합을 수행하고, 하이브리도마 상등액을 대상으로 하여 ELISA에 의해 항-C3b 활성을 시험한다.

HuMab 마우스 및 KM 마우스로부터 단리된 마우스 비장 세포를, PEG를 사용하는 표준 프로토콜에 기초하여 마우스 골수종 세포주와 융합시킨다. 이어서, 이로써 생성되는 하이브리도마를 대상으로 하여, 항원-특이적 항체의 생성에 관하여 스크리닝한다. 면역시킨 마우스로부터의 비장 림프구의 단일 세포 현탁액을, 50％ PEG (공급처: Sigma)를 이용하여 SP2/0 비분비성 마우스 골수종 세포 (공급처: ATCC, CRL 1581) 수의 1/4과 융합시킨다. 세포를 평저 미세역가 판 내에 대략 1x10⁵/웰로 도말한 다음, 10％ 태아 소 혈청, 10％ P388D1 (공급처: ATCC, CRL TIB-63) 적응용 배지, DMEM (공급처: Mediatech, CRL 10013, 고 글루코스, L-글루타민 및 나트륨 피루베이트 수반) 중의 3-5％ 오리젠 (Origen^®) (IGEN) + 5 mM HEPES, 0.055 mM 2-머캅토에탄올, 50 ㎍/ml 젠타마이신 및 1x HAT (공급처: Sigma, CRL P-7185)를 함유하는 선택적 배지에서 약 2주 동안 항온 배양한다. 1 내지 2주 후, HAT를 HT로 대체시킨 배지에서 세포를 배양한다. 이어서, 개개의 웰을 대상으로 하여 인간 항-C3b 모노클로날 IgG 항체에 관하여 알아보기 위해 ELISA에 의해 스크리닝한다. 일단 광범위한 하이브리도마 성장이 이루어지면, 통상 10 내지 14일 후에 배지를 모니터링한다. 항체 분비성 하이브리도마를 재도말하고, 다시 스크리닝하며, 인간 IgG에 대해 여전히 양성인 경우에는, 항-C3b 모노클로날 항체를 제한 희석함으로써 적어도 2회 서브클로닝한다. 이어서, 안정한 서브클론을 시험관 내에서 배양하여 조직 배양 배지 중에 소량의 항체를 생성시켜, 이를 추가의 성상 확인에 사용한다.

인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성

본 발명의 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성시키기 위해, 면역시킨 마우스로부터의 비장 세포 및/또는 림프절 세포를 단리하고, 이를 적당한 불멸화 세포주, 예를 들어 마우스 골수종 세포주와 융합시킬 수 있다. 이로써 생성되는 하이브리도마를 대상으로 하여, 항원 특이적 항체 생산에 관하여 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 면역시킨 마우스로부터의 비장 림프구의 단일 세포 현탁액을, 50％ PEG를 이용하여 P3X63-Ag8.653 비분비성 마우스 골수종 세포 (공급처: ATCC, CRL 1580) 수의 1/6과 융합시킬 수 있다. 세포를 평저 미세역가 판 내에서 대략 2 x 145로 도말한 다음, 20％ 태아 클론 혈청, 18％ "653" 적응용 배지, 5％ 오리젠 (Origen^®) (IGEN), 4 mM L-글루타민, 1 mM 나트륨 피루베이트, 5 mM HEPES, 0.055 mM 2-머캅토에탄올, 50 단위/ml 페니실린, 50 ㎍/ml 스트렙토마이신, 50 ㎍/ml 젠타마이신 및 1x HAT (공급처: Sigma; HAT는 융합시킨지 24시간 후에 가한다)를 함유하는 선택적 배지에서 2주 동안 항온 배양한다. 대략 2주 후, HAT를 HT로 대체시킨 배지에서 세포를 배양할 수 있다. 이어서, 개개의 웰을 대상으로 하여 인간 모노클로날 IgM 및 IgG 항체에 관하여 알아보기 위해 ELISA에 의해 스크리닝할 수 있다. 일단 광범위한 하이브리도마 성장이 이루어지면, 통상 10 내지 14일 후에 배지를 관찰할 수 있다. 항체 분비성 하이브리도마를 재도말하고, 다시 스크리닝하며, 인간 IgG에 대해 여전히 양성인 경우에는, 모노클로날 항체를 제한 희석함으로써 적어도 2회 서브클로닝할 수 있다. 이어서, 안정한 서브클론을 시험관 내에서 배양하여 조직 배양 배지 중에 소량의 항체를 생성시켜, 이를 성상 확인에 사용할 수 있다.

인간 모노클로날 항체를 정제하기 위해, 선별된 하이브리도마를 모노크로날 항체 정제를 위해 2 리터의 스피너-플라스크 (spinner-flask)에서 성장시킬 수 있다. 상등액을 여과시키고, 단백질 A-세파로스 (공급처: Pharmacia, Piscataway, N.J.)로 친화 크로마토그래피하기 전에 농축시킬 수 있다. 용출된 IgG을 겔 전기영동 및 고 성능 액체 크로마토그래피에 의해 검사하여 순도를 보장할 수 있다. 완충 용액을 PBS로 교환시키고, 흡광 계수 1.43을 사용하여 OD₂₈₀에 의해 농도를 결정할 수 있다. 모노클로날 항체를 등분하고 -80℃ 하에 저장할 수 있다.

모노클로날 항체를 생산하는 형질감염 세포의 생성

본 발명의 항체는 또한, 당해 분야에 널리 공지된 바와 같은 재조합 DNA 기술과 유전자 형질감염 방법을 병용 사용하여 숙주 세포 형질감염 세포에서 생성시킬 수 있다 [참고: 예를 들어, Morrison, 1985 Science 229:1202].

예를 들어, 항체 또는 그의 항체 단편을 발현시키기 위해, 부분 또는 완전한 길이의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNA를 표준 분자 생물학 기술 (예를 들어, 관심있는 항체를 발현하는 하이브리도마를 사용하는 cDNA 클로닝 또는 PCR 증폭)에 의해 수득할 수 있고, 이러한 DNA를 발현 벡터 내로 삽입하여 해당 유전자가 전사 및 해독 제어 서열과 작동적으로 연결되도록 한다. 이러한 맥락에서, 용어 "작동적으로 연결된"이란 벡터 내의 전사 및 해독 제어 서열이 항체 유전자의 전사 및 해독을 조절하는 그들의 의도한 기능을 제공하도록 항체 유전자가 벡터 내로 연결되는 것을 의미한다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용된 발현 숙주 세포와 화합성이 되도록 선택한다. 항체 경쇄 유전자와 항체 중쇄 유전자를 별개의 벡터 내로 삽입할 수 있거나, 또는 보다 전형적으로는, 양 유전자를 동일한 발현 벡터 내로 삽입한다. 항체 유전자를 표준 방법 (예를 들어, 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보적 제한 부위의 연결, 또는 제한 부위가 전혀 존재하지 않는 경우에는 평활 말단 연결)에 의해 발현 벡터 내로 삽입한다. 본원에 기재된 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 사용하여, 이들을 이미 목적하는 이소형의 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역을 암호화하는 발현 벡터 내로 삽입함으로써 모든 항체 이소형의 완전한 길이의 항체 유전자를 창출시켜 V_H 절편이 벡터 내의 CH 절편(들)과 작동적으로 연결되고 V_L 절편이 벡터 내의 CL 절편과 작동적으로 연결되도록 할 수 있다. 부가적으로, 또는 또 다른 한편, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 항체 쇄의 분비를 촉진시켜 주는 신호 펩티드를 암호화할 수 있다. 항체 쇄 유전자는 신호 펩티드가 동일 프레임 내에서 항체 쇄 유전자의 아미노 말단과 연결되도록 벡터 내로 클로닝할 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드 (즉, 비-면역글로불린 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다.

항체 쇄 유전자 이외에도, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서의 항체 쇄 유전자의 발현을 제어하는 조절성 서열을 보유하고 있다. 용어 "조절성 서열"에는 프로모터, 증강인자, 및 항체 쇄 유전자의 전사 또는 해독을 제어하는 기타 발현 제어 요소 (예: 폴리아데닐화 신호)가 포함된다. 이러한 조절성 서열은, 예를 들어 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Goeddel, Gene Expression Technology. 1990 Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA]. 조절성 서열의 선별을 포함한, 발현 벡터의 설계는 형질전환시키고자 하는 숙주 세포의 선택, 목적하는 단백질의 발현 수준 등의 요인에 좌우될 수 있다는 것을 당업자는 인지할 것이다. 포유류 숙주 세포 발현을 위한 조절성 서열에는 포유류 세포에서 고 수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스성 요소, 예를 들어 시토메갈로바이러스 (CMV), 원숭이 바이러스 40 (SV40), 아데노바이러스 [예: 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (AdMLP)], 및 폴리오마로부터 유래된 프로모터 및/또는 증강인자가 포함된다. 또 다른 한편, 비-바이러스성 조절성 서열, 예를 들어 유비퀴틴 프로모터 또는 P-글로빈 프로모터를 사용할 수 있다. 또한 추가로, SV40 초기 프로모터 및 인간 T 세포 백혈병 바이러스 유형 1의 장 말단 반복 서열로부터의 서열을 함유하는, 상이한 공급원 (예: SRa 프로모터 시스템)으로부터의 서열로 구성된 조절성 요소를 사용할 수 있다 [참고: Takebe et al., 1988 Mol. Cell. Biol. 8:466-472].

항체 쇄 유전자 및 조절성 서열 이외에도, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 부가의 서열, 예를 들어 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열 (예: 복제 기점) 및 선별성 마커 유전자를 수반할 수 있다. 선별성 마커 유전자는 벡터를 도입시킨 숙주 세포의 선별을 용이하게 해준다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제4,399,216호, 제4,634,665호 및 제5,179,017호 (Axel et al.)]. 예를 들어, 전형적으로 선별성 마커 유전자는 벡터를 도입시킨 숙주 세포 상에 약물 (예를 들어, G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트)에 대한 내성을 부여해준다. 선별성 마커 유전자에는 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선별/증폭을 이용하여 dhfr- 숙주 세포에서 사용하기 위함) 및 neo 유전자 (G418 선별하기 위함)가 포함된다.

경쇄 및 중쇄를 발현시키기 위해서는, 이러한 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 발현 벡터(들)를 표준 기술에 의해 숙주 세포 내로 형질감염시킨다. 각종 형태의 용어 "형질감염"은 외인성 DNA를 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내로 도입하기 위해 흔히 사용되고 있는 광범위한 기술, 예를 들어 전기천공, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포괄한다. 본 발명의 항체를 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 발현시키는 것이 이론상 가능하다. 항체를 진핵 세포, 특히 포유류 숙주 세포에서 발현시키는 것이 논의되는데, 이는 이러한 진핵 세포, 특히 포유류 세포가 적절하게 폴딩되고 면역학적으로 활성인 항체를 어셈블리하고 분비시키는 데에 원핵 세포 보다 더 적합하기 때문이다. 항체 유전자의 원핵성 발현은 활성 항체를 고 수율로 생성시키는 데에 비효과적인 것으로 보고되었다 [참고: Boss and Wood, 1985 Immunology Today 6:12-13].

본 발명의 재조합 항체를 발현시키기 위한 포유류 숙주 세포에는, 예를 들어 문헌 [참고: Kaufman and Sharp, 1982 Mol. Biol. 159:601-621]에 기재된 바와 같이, DHFR 선별성 마커와 함께 사용된 중국산 햄스터 난소 세포 (CHO 세포) [문헌 (참고: Urlaub and Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220)에 기재된 dhfr- CHO 세포 포함], NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포가 포함된다. 특히, NSO 골수종 세포와 함께 사용하는 경우, 또 다른 발현 시스템은 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 338,841에 제시된 GS 유전자 발현 시스템이다. 항체 유전자를 암호화하는 재조합 발현 벡터를 포유류 숙주 세포 내로 도입하는 경우에는, 항체를 숙주 세포가 성장하는 배양 배지 내로 분비시키거나 항체를 숙주 세포에서 발현시키기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 항체를 생성시킨다. 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 항체를 배양 배지로부터 회수할 수 있다.

이중-특이적 분자

또 다른 국면에서, 본 발명은 본 발명의 C3b 결합 분자 (예: 항-C3b 항체 또는 그의 단편)을 포함하는 이중-특이적 분자를 특징으로 한다. 본 발명의 C3b 결합 분자를 또 다른 기능성 분자, 예를 들어 또 다른 펩티드 또는 단백질 (예: 또 다른 항체 또는 수용체에 대한 리간드)로 유도체화하거나 이와 연결시켜 2개 이상의 상이한 결합 부위 또는 표적 분자와 결합하는 이중-특이적 분자를 생성시킬 수 있다. 본 발명의 C3b 결합 분자를 사실상, 하나 이상의 기타 기능성 분자로 유도체화하거나 이와 연결시켜 2개 이상의 상이한 결합 부위 및/또는 표적 분자와 결합하는 다중-특이적 분자를 생성시킬 수 있는데; 이러한 다중-특이적 분자는 또한, 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "이중-특이적 분자"에 포괄된다. 본 발명의 이중-특이적 분자를 창출시키기 위해, 본 발명의 항체를 하나 이상의 기타 결합 분자, 예를 들어 또 다른 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 결합 유사작용제와 기능적으로 연결시켜 (예를 들어, 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유적 연합 등에 의함) 이중-특이적 분자가 생성되도록 할 수 있다.

따라서, 본 발명은 C3b 네오-에피토프에 대한 하나 이상의 제1 결합 특이성과, 제2 표적 에피토프, 예를 들어 인자 B, 인자 D, 프로페르딘, 인자 H, 인자 I 또는 MAC의 생성에 관여하는 보체 단백질/효소, 예를 들면 C5, C6, C7, C8, 및 C9에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 이중-특이적 분자를 포함한다.

한 국면에서, 본 발명의 이중-특이적 분자는 결합 특이성으로서 하나 이상의 항체, 또는 그의 항체 단편 [이에는, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, 또는 단일 쇄 Fv가 포함된다]을 포함한다. 항체는 또한, 경쇄 또는 중쇄 이량체, 또는 그의 모든 최소 단편, 예를 들어 Fv 또는 단일 쇄 구조물일 수도 있다 [참고: 미국 특허 제4,946,778호 (Ladner et al.); 그의 전문이 본원에 참고로 도입된다].

본 발명의 이중-특이적 분자는 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 구성분 결합 특이성을 접합시킴으로써 제조할 수 있다. 예를 들어, 이중-특이적 분자의 각 결합 특이성은 개별적으로 생성시킨 다음, 서로 접합시킬 수 있다. 결합 특이성이 단백질 또는 펩티드인 경우에는, 공유 접합을 위한 각종 커플링제 또는 가교 결합제를 사용할 수 있다. 가교 결합제의 예에는 단백질 A, 카보디이미드, N-석신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트 (SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산) (DTNB), o-페닐렌디말레이미드 (oPDM), N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP), 및 설포석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카복실레이트 (설포-SMCC)가 포함된다 [참고: 예를 들어, Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686; Liu et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648]. 기타 방법에는 다음 문헌에 기재된 방법이 포함된다 [참고: Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al., 1985 Science 229:81-83, 및 Glennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375]. 접합제는 SATA 및 설포-SMCC [둘 다 Pierce Chemical Co. (Rockford, IL)로부터 입수 가능하다]이다.

결합 특이성이 항체인 경우에는, 이들을 두 중쇄의 C-말단 힌지 영역을 설프히드릴 결합시킴으로써 접합시킬 수 있다. 특별한 국면에서, 힌지 영역은 접합 이전에 홀수의 설프히드릴 잔기, 예를 들어 1개의 설프히드릴 잔기를 함유하도록 변형시킨다.

또 다른 한편, 양 결합 특이성을 동일한 벡터에서 암호화할 수 있고, 동일한 숙주 세포에서 발현 및 어셈블리할 수 있다. 이 방법은 이중-특이적 분자가 mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')₂ 또는 리간드 x Fab 융합 단백질인 경우에 특히 유용하다. 본 발명의 이중-특이적 분자는 하나의 단일 쇄 항체와 결합 결정기를 포함하는 단일 쇄 분자, 또는 2개의 결합 결정기를 포함하는 단일 쇄 이중-특이적 분자일 수 있다. 이중-특이적 분자는 2개 이상의 단일 쇄 분자를 포함할 수 있다. 이중-특이적 분자의 제조 방법은, 예를 들어 미국 특허 제5,260,203호; 제5,455,030호; 제4,881,175호; 제5,132,405호; 제5,091,513호; 제5,476,786호; 제5,013,653호; 제5,258,498호; 및 제5,482,858호에 기재되어 있다.

그들의 특이적 표적에 대한 이중-특이적 분자의 결합은, 예를 들어 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA), 방사성 면역검정 (REA), FACS 분석, 생물학적 검정 (예: 성장 억제) 또는 웨스턴 블롯 검정에 의해 확증할 수 있다. 이들 검정 각각은 일반적으로, 관심있는 복합체에 대해 특이적인 표지된 시약 (예: 항체)을 이용함으로써 특별히 관심있는 단백질-항체 복합체의 존재를 탐지한다.

스크리닝 및 검정

보체 활성화 검정

C3b 결합 분자의 기능적 특징을 시험관 및 생체 내에서 시험할 수 있다. 예를 들어, 결합 분자를 대상으로 하여, C3b와 보체 단백질, 예를 들어 프로페르딘, 인자 H, 인자 B, 인자 I, 막 조인자, 및/또는 그의 복합체의 상호 작용을 억제시킬 수 있는 능력에 관하여 시험할 수 있다. 추가의 결합 분자를 대상으로 하여, 문헌 [참고: Wiesmann, C, et al.(2006). Nature 444, 217-220]에 따라서 C3 및/또는 C5 전환효소 활성을 억제시킬 수 있는 능력에 관하여 시험할 수 있다.

각종 방법을 사용하여 보체 경로 분자의 활성과 보체 시스템의 활성화를 측정할 수 있다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제6,087,120호; 및 Newell et al., J Lab Clin Med, 100:437-44, 1982]. 예를 들어, 보체 활성은 (i) 적혈구 세포의 보체-매개된 용해 (용혈)의 억제 측정; (ii) C3 또는 C5의 절단을 억제시킬 수 있는 능력 측정; 및 (iii) 전통적 및/또는 대체 경로 매개된 용혈의 억제에 의해 모니터링할 수 있다.

가장 흔히 사용되고 있는 2가지 기술은 용혈 검정 [참고: 예를 들어, Baatrup et al., Ann Rheum Dis, 51:892-7, 1992] 및 면역학적 검정 [참고: 예를 들어, Auda et al., Rheumatol Int, 10:185-9, 1990]이다. 용혈 기술은 전체 서열-전통적 또는 대체 경로의 기능적 능력을 측정한다. 면역학적 기술은 특이적 보체 성분 또는 분열 생성물의 단백질 농도를 측정한다. 본 발명의 방법에서 보체 성분의 활성을 측정하거나 보체 활성화를 탐지하기 위해 이용될 수 있는 기타 검정에는, 예를 들어 T 세포 증식 검정 [참고: Chain et al., J Immunol Methods, 99:221-8, 1987], 및 지연형 과민반응 (DTH) 검정 [참고: Forstrom et al., 1983, Nature 303:627-629; Halliday et al., 1982, in Assessment of Immune Status by the Leukocyte Adherence Inhibition Test, Academic, New York pp. 1-26; Koppi et al., 1982, Cell. Immunol. 66:394-406; 및 미국 특허 제5,843,449호]이 있다.

용혈 기술에서는, 적당한 모든 보체 성분이 존재해야 하고 기능적이어야만 한다 (측정되는 경로에 따라서, 요구되는 성분이 다양할 수 있다). 따라서, 용혈 기술은 보체 시스템의 기능적 완전성과 결핍성 둘 다를 스크리닝할 수 있다 [참고: 예를 들어, Dijk et al., J Immunol Methods 36:29-39, 1980; Minh et al., Clin Lab Haematol. 5:23-34 1983; 및 Tanaka et al., J Immunol 86:161-170, 1986]. 예를 들어, 전통적 경로의 기능적 능력을 측정하기 위해, 용혈소 [양 (sheep) 적혈구 세포에 대한 토끼 IgG]로 피복시킨 양 적혈구 세포 (기타 종으로부터의 적혈구 세포를 또한 사용할 수 있는데, 예를 들어 치킨 적혈구 세포를 사용할 수 있다)를 표적 세포 (감작 세포)로서 사용한다. 이들 Ag-Ab 복합체는 전통적 경로를 활성화시키고, 이로 인해 성분들이 기능적이며 적당히 존재하는 경우에는 표적 세포가 용해된다. 대체 경로의 기능적 능력을 결정하기 위해, 토끼 적혈구 세포를 표적 세포로서 사용한다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제6,087,120호].

용혈성 보체 측정은, 예를 들어 대상체의 혈액 중에서 보체 단백질의 결핍성 및 기능적 장애를 탐지하는 데 적용 가능한데, 이는 기능적 보체 단백질의 완전한 범위를 요구하는, 세포 용해를 유도시키는 보체의 기능에 기초하기 때문이다. 전통적 경로 활성화를 측정하는, 소위 CH50 방법, 및 대체 경로에 대한 AP50 방법은 완전 혈청 대신 특이적 단리 보체 단백질을 사용함으로써 확장시켰지만, 고도로 희석된 시험 샘플은 공지되지 않은 농도의 제한성 보체 성분을 함유하고 있다. 이러한 방법에 의해, 보체 시스템을 보다 상세히 측정할 수 있는데, 이는 성분이 결핍성이란 지표이다.

면역학적 기술은, 예를 들어 보체 성분의 분열 생성물을 탐지하기 위해 각종 보체 성분 (예: C3, C4 및 C5)의 상이한 에피토프에 대항하는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 이용한다 [참고: 예를 들어, Hugli et al., Immunoassays Clinical Laboratory Techniques 443-460, 1980; Gorski et al., J Immunol Meth 47: 61-73, 1981; Under et al., J Immunol Meth 47:49-59, 1981; 및 Burger et al., J Immunol 141:553-558, 1988]. 이어서, 공지된 농도의 표지된 분열 생성물과 경쟁하는 분열 생성물과 항체의 결합을 측정할 수 있었다. 보체 분열 생성물을 탐지하기 위한 각종 검정, 예를 들어 방사성 면역검정, ELISA, 및 방사성 확산 검정을 이용할 수 있다.

면역학적 기술은 보체 활성화를 탐지하기 위한 고 민감성을 제공해 주는데, 이는 이러한 기술이 황반 변성 관련 장애가 있거나 없는 시험 대상체 및 대조군 대상체로부터의 혈액 내에서의 분열-생성물 형성을 측정할 수 있게 해주기 때문이다. 따라서, 본 발명의 몇몇 방법에서는, 시험 대상체로부터의 혈액 혈장 중의 보체 성분 (예: C3a, C4a, C5a, 및 C5b-9 말단 복합체)의 가용성 분열 생성물의 정량화를 통하여 비정상적인 보체 활성화를 측정함으로써, 황반 변성과 연관된 장애를 진단한다. 이러한 측정은, 예를 들어 문헌 [참고: Chenoweth et al., N Engl J Med 304: 497-502, 1981; 및 Bhakdi et al., Biochim Biophys Acta 737: 343-372, 1983]에 기재된 바와 같이 수행할 수 있다. 바람직하게는, 생체 내에서 형성된 보체 활성화 만을 측정한다. 이는 보체 시스템의 억제제를 함유하는 배지 중에서 대상체로부터의 생물학적 샘플 (예: 혈청)을 수집하고, 이러한 샘플 중에서 보체 활성화를 후속 측정함으로써 (예를 들어, 분열 생성물의 정량화) 수행할 수 있다.

황반 변성과 연관된 장애가 있는 환자를 임상적으로 진단하거나 모니터링하는 데에 있어서, 정상적인 대상체로부터의 상응하는 생물학적 샘플 중에서의 수준과 비교해서 보체 단백질이 탐지된다는 것은 황반 변성과 연관된 장애가 있는 환자라는 지표이다.

생체내 진단 또는 영상화는 US2006/0067935에 기재되어 있다. 간략하게 언급하면, 이들 방법은 일반적으로, 비-침습성 방법에 의해 탐지 가능한 마커 또는 표지에 작동적으로 부착시킨 C3b 결합 분자의 진단상 유효량을 환자에게 투여 또는 도입하는 단계를 포함한다. 이러한 항체-마커 접합체는 안구 내에 국재되어 보체 단백질과 결합하기에 충분한 시간을 허용해 준다. 이어서, 환자를 탐지 장치에 노출시켜 탐지 가능한 마커를 확인함으로써, 환자의 안구 내에서의 C3b 결합 분자의 위치 영상을 형성시킨다. C3b 결합 분자 또는 그의 복합체의 존재는 항체-마커가 안구의 보체와 결합하는 지를 결정함으로써 탐지한다. AMD 질병이 없는 정상적인 개체와 비교해서 선택된 보체 단백질 또는 그의 조합물이 탐지되거나 그의 수준이 증가된다는 것은 황반 변성과 연관된 장애에 대한 소인 및/또는 이러한 장애의 발병의 지표이다. 본 발명의 이들 국면은 또한, 안구 영상화 방법 및 조합된 혈관형성성 진단 및 치료 방법에 사용하기 바람직하다.

동물 모델

C3b 결합 분자에 의한 C3b 조정을 시험하기에 적합한 동물 모델은 US2006/0067935에 보고되었다. AMD의 동물 모델은 인간 질환에서 관찰된 병적 특징을 전개하는 마우스에서 개발하였다 [참고: Ambati, J et al, (2003) Nat Med 9, 1390-1397].

C3b 결합 분자의 독성 및 치료적 효능은, 예를 들어 LD₅₀ (집단의 50％에 대해 치사적인 용량) 및 ED₅₀ (집단의 50％에게서 치료상 유효한 용량)을 결정하기 위하여, 이들 실험 동물에서 표준 제약 과정에 의해 결정할 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 간의 용량 비가 치료 지수이고, 이는 LD_5O/ED₅₀ 비로서 표현될 수 있다. 동물 연구로부터 수득된 데이터를, 인간에게 사용하기 위한 투여량 범위를 공식화하는 데에 사용할 수 있다. 용량은 세포 배양시 결정된 바와 같은 IC50 (즉, 증상을 최대 50％ 억제시켜 주는 시험 화합물의 농도)를 포함하는 순환성 혈장 농도 범위를 달성시키도록 동물 모델에서 공식화할 수 있다. 이러한 정보를 이용하여 인간에게 유용한 용량을 보다 정확하게 결정할 수 있다. 혈장 수준은, 예를 들어 고 성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정할 수 있다.

제약 조성물 및 그의 용도

제약 조성물

또 다른 국면에서, 본 발명은 제약상 허용되는 담체와 함께 제형화시킨, 본 발명의 C3b 결합 분자 (예: 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분(들)) 중의 하나를 함유하거나 또는 조합하여 함유하는 조성물 (예: 제약 조성물)을 제공한다. 이러한 조성물은 결합 분자 중의 하나를 포함하거나 또는 조합하여 (예를 들어, 둘 이상의 상이한) 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 제약 조성물은 표적 항원 상의 상이한 에피토프와 결합하거나 또는 상보적 활성을 지닌 항체 또는 작용제의 조합물을 포함할 수 있다.

본 발명의 제약 조성물은 병용 요법으로 투여할 수도 있는데, 즉 기타 작용제와 병용해서 투여할 수 있다. 예를 들어, 병용 요법에는 항-C3b 항체를 한 가지 이상의 소염제와 병용하는 것이 포함될 수 있다. 병용 요법에 사용될 수 있는 치료제의 예가 본 발명의 작용제 용도에 관한 다음 섹션에 보다 상세히 기재되어 있다.

본원에서 사용된 바와 같은 "제약상 허용되는 담체"에는 생리학적으로 화합성인 모든 용매, 분산 매질, 피복제, 항균 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등이 포함된다. 담체는 비경구 투여 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의함)하는 데에 적합해야 한다. 본원에서 사용된 바와 같은 "비경구 투여"는 장내 및 국소 투여 이외의 투여 방식, 통상적으로 주사에 의한 투여를 의미하는데, 이에는 정맥내, 근육내, 동맥내, 수막강내, 협막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 안내 (유리질내 포함), 피하, 표피하, 관절내, 협막하, 지주막하, 척수내, 경막 및 흉골내 주사 및 주입이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 투여 경로에 따라서, C3b 결합 분자를, 본 발명의 결합 분자를 불활성화시킬 수도 있는 산의 작용 및 기타 천연 조건으로부터 상기 분자를 보호해주는 전달 물질로 피복시키거나 이에 제공할 수 있다.

본 발명의 제약 화합물에는 하나 이상의 제약상 허용되는 염이 포함될 수 있다. "제약상 허용되는 염"은 모 화합물의 목적하는 생물학적 활성을 보유하고 있고 바람직하지 못한 어떠한 독성학적 효과도 제공하지 않는 염을 지칭한다 [참고: 예를 들어, Berge, S.M., et al., 1977 J. Pharm. Sci. 66:1-19]. 이러한 염의 예에는 산 부가 염 및 염기 부가 염이 포함된다. 산 부가 염에는 무독성 무기 산, 예를 들어 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 인산 등으로부터 유래된 염 뿐만 아니라 무독성 유기 산, 예를 들어 지방족 모노- 및 디-카복실산, 페닐-치환된 알카노산, 히드록시 알카노산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 설폰산으로부터 유래된 염 등이 포함된다. 염기 부가 염에는 알칼리 토금속, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등으로부터 유래된 염 뿐만 아니라 무독성 유기 아민, 예를 들어 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등으로부터 유래된 염이 포함된다.

본 발명의 제약 조성물은 또한, 제약상 허용되는 항산화제를 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 항산화제의 예에는 수용성 항산화제, 예를 들어 아스코르브산, 시스테인 히드로클로라이드, 중황산나트륨, 나트륨 메타비설파이트, 아황산나트륨 등; 오일 가용성 항산화제, 예를 들어 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔 (BHA), 부틸화 히드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 금속 킬레이트제, 예를 들어 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 솔비톨, 타르타르산, 인산 등이 포함된다.

본 발명의 제약 조성물에 이용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예에는 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 그의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예를 들어 올리브유, 및 주사 가능한 유기 에스테르, 예를 들어 에틸 올레에이트가 포함된다. 적당한 유동성은, 예를 들어 피복 물질 (예: 레시틴)을 사용하고, 분산제의 경우에는 요구되는 입자 크기를 유지하며, 계면활성제를 사용함으로써 유지시킬 수 있다.

이들 조성물은 방부제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제를 함유할 수도 있다. 미생물이 존재하지 못하게 하는 것은 멸균 과정 (상기 참고)에 의해, 그리고 각종 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등을 봉입시킴으로써 보장할 수 있다. 등장제, 예를 들어 당, 염화나트륨 등을 조성물 내로 봉입시키는 것이 요망될 수도 있다. 또한, 주사 가능한 제약 형태를 장기간 흡수시키는 것은 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 봉입시킴으로써 수행할 수 있다.

제약상 허용되는 담체에는 멸균성 수성 용액 또는 분산액, 및 멸균성 주사용 용액 또는 분산액을 즉시 제조하기 위한 멸균성 분말이 포함된다. 제약상 활성 물질에 대해 상기 매질 및 작용제를 사용하는 것은 당해 분야에 공지되어 있다. 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 화합물과 비-화합성인 경우를 제외하고는, 본 발명의 제약 조성물에서의 그의 용도가 고려된다. 보충 활성 화합물을 본 발명의 조성물 내로 혼입시킬 수도 있다.

치료 조성물은 전형적으로, 제작 및 저장 조건 하에 멸균성이고 안정해야만 한다. 본 발명의 C3b 결합 분자는 용제, 미소에멀션, 리포솜, 또는 고 약물 농도에 적합한 기타 정렬된 구조물로서 제형화할 수 있다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예: 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적당한 유동성은, 예를 들어 피복 물질 (예: 레시틴)을 사용하고, 분산제의 경우에는 요구되는 입자 크기를 유지하며, 계면활성제를 사용함으로써 유지시킬 수 있다. 많은 경우에 있어, 상기 조성물 내에 등장제, 예를 들어 당, 다가 알코올, 예를 들어 만니톨, 솔비톨, 또는 염화나트륨을 포함시킬 수 있다. 주사 가능한 조성물을 장기간 흡수시키는 것은 조성물 내에 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 봉입시킴으로써 수행할 수 있다.

멸균성 주사 용제는 요구 량의 활성 화합물을, 필요에 따라 상기 열거된 성분들 중의 하나 또는 조합물과 함께 적당한 용매에 혼입시킨 다음, 멸균 미소여과시킴으로써 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산제는 활성 화합물을 기본 분산 매질과 상기 열거된 것 중에서 요구되는 기타 성분을 함유하는 멸균성 비히클 내로 혼입함으로써 제조한다. 멸균성 주사 용제를 제조하기 위한 멸균성 산제의 경우, 제조 방법은 진공 건조 및 냉동-건조 (동결건조)인데, 이로써 앞서 멸균-여과시킨 그의 용액으로부터 부가의 목적 성분이 활성 성분에 부가된 분말이 산출된다.

단일 투여 형태를 제조하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료받는 대상체, 및 특별한 투여 방식에 따라서 다양할 것이다. 단일 투여 형태를 제조하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로, 치료 효과를 가져다 주는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로, 이러한 활성 성분의 양은 제약상 허용되는 담체와 조합되는 활성 성분 100％를 기준으로 하여, 약 0.01％ 내지 약 99％, 약 0.1％ 내지 약 70％, 또는 약 1％ 내지 약 30％의 범위일 것이다.

투여량 섭생은 목적하는 최적의 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정한다. 예를 들어, 단일 거환을 투여할 수 있거나, 수 회분으로 나누어 일정 시간에 걸쳐 투여할 수 있거나, 또는 치료적 상황의 위급성에 비례하여 용량을 감소 또는 증가시킬 수 있다. 투여 용이성과 투여량의 균질성을 위해서는 비경구 조성물을 투여 단위 형태로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용된 바와 같은 투여 단위 형태는 치료받고자 하는 대상체에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭하고; 각 단위는 요구되는 제약 담체와 연합하여 목적하는 치료 효과를 야기시키도록 계산된 예정 량의 C3b 결합 분자를 함유한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 관한 명세서는 활성 화합물의 독특한 특징 및 달성하고자 하는 특별한 치료 효과, 및 개체에게서 민감도를 치료하기 위해 상기 결합 분자를 화합하는 분야에 내재된 제한 사항에 의해 지시되고 이에 직접적으로 좌우된다.

항체를 투여하는 경우, 투여량 범위는 숙주 체중 kg당 약 0.0001 내지 100 mg, 및 보다 통상적으로 0.01 내지 5 mg이다. 예를 들어, 투여량은 0.3 mg/체중 kg, 1 mg/체중 kg, 3 mg/체중 kg, 5 mg/체중 kg 또는 10 mg/체중 kg, 또는 1 내지 10 mg/체중 kg의 범위 내이다. 예시되는 치료 섭생은 1주 1회 투여, 2주 마다 1회 투여, 3주 마다 1회 투여, 4주 마다 1회 투여, 1개월에 1회 투여, 3개월 마다 1회 투여, 또는 3 내지 6개월 마다 1회 투여한다.

본 발명의 C3b 항체에 대한 투여량 섭생은 정맥내 투여의 경우에, 1 mg/체중 kg 또는 3 mg/체중 kg인데, 상기 항체는 다음 투여 스케줄 중의 한 가지를 이용하여 제공된다: 6회 투여량을 4주 마다 투여한 다음, 3개월 마다 투여하고; 3주 마다 투여하며; 3 mg/체중 kg을 1회 투여한 다음, 3주 마다 1 mg/체중 kg을 투여한다.

C3b 결합 분자의 바람직한 투여 경로는 안구에 대한 국소 적용이다. 안과 조성물은 전형적으로, 멸균성 용제 또는 현탁제 1 방울 내지 4 방울을 적용하거나 또는 거의 동일한 양의 연고, 젤 또는 기타 고체 또는 반고체 조성물을 병든 안구의 표면에 적용함으로써 1일 1회 내지 4회 병든 안구에 투여한다. 제형은 외과적 시술 동안 병든 안구에 적용되는 자극성 용제로서 제형화될 수도 있다.

C3b 결합 분자는 통상적인 과정에 따라서, 정맥내, 복강내 또는 유리질내 주사용으로 적응시킨 제약 조성물로서 제형화할 수 있다. C3b 결합 분자는 정맥내 주사에 의해 투여한다. 고 용량 정맥내 면역글로불린 (IVIG) 뿐만 아니라 F(ab)2-IVIG 및 심지어 무관한 인간 모노클로날 항체 모두는 C3a 및 C5a와 결합하고, 이들의 기능을 방해할 수 있다 [참고: Basta M. et al. F(ab)'2-mediated neutralization of C3a and C5a anaphylatoxins: a novel effector function of immunoglobulins. Nature Medicine 2003; 9:431-8]. C3b 결합 분자를 포함하는 조성물은 안구에 대한 유리질내 주사용으로 적응시킬 수 있다. 전형적으로, 주사용 조성물은 멸균성 등장성 수성 완충액 중의 용제이다. 필요한 경우, C3b 결합 분자는 가용화제, 및 주사 부위에서의 통증을 줄이기 위한 국소 마취제 (예: 리그노카인)을 포함할 수도 있다. 일반적으로, 성분들은 활성제의 량을 표시하는 앰풀 또는 작은 봉지 (sachette)와 같은 기밀 용기 내에서 무수 동결건조시킨 분말 또는 무수 농축물로서, 단위 투여 형태로 별개로 공급되거나 또는 함께 혼합되어 공급된다. 조성물을 주입에 의해 투여해야 하는 경우, 이는 멸균성 제약 등급수 또는 식염수를 함유하는 주입용 병으로 투약할 수 있다. 조성물을 주사에 의해 투여하는 경우, 투여에 앞서 성분들이 혼합될 수 있도록 주사용 멸균수 또는 식염수의 앰풀을 제공할 수 있다.

한 양태에서, 성인 환자에게서 신생혈관 (습식) 연령 관련 황반 변성을 치료하는 데에 적합한 용량은 0.5 밀리그램 (0.05 밀리리터)인데, 이는 1개월 (대략 28일)에 1회씩 병든 안구 내로 유리질내 주사한다. 결합 분자를 주사하기에 앞서, 적당한 마취제와 광범위한 스펙트럼의 살균제를 투여한다. 매달 주사하는 것이 실행 가능하지 않는 경우에는, 처음 4회 주사 후부터는 3개월 마다 1회 주사하는 것을 치료 횟수를 줄일 수 있다. 또 다른 양태에서, 신생혈관 황반 변성을 치료하는 데에 유효한 항체의 용량은 0.3 밀리그램인데, 이는 1개월에 1회씩 유리질내로 투여한다.

몇몇 방법에서는, 상이한 결합 특이성을 지닌 2개 이상의 결합 분자 (예: 모노클로날 항체)를 동시에 투여하는데, 이러한 경우에 투여되는 각 항체의 투여량은 지시된 범위 내에 속한다. C3b 결합 분자는 통상적으로, 여러 번 나누어 투여한다. 1회 투여 사이 간격은, 예를 들어 매주, 매달, 3개월 마다 또는 매년일 수 있다. 환자 내에서 C3b 네오-에피토프에 대한 결합 분자의 혈액 수준을 측정함으로써 나타낸 바와 같이 간격이 불규칙할 수도 있다. 몇몇 방법에서는, 약 1 내지 1000 ㎍/ml의 C3b 결합 분자의 혈장 농도를 달성하도록 투여량을 조정하고, 몇몇 방법에서는 약 25 내지 300 ㎍/ml의 C3b 결합 분자의 혈장 농도를 달성하도록 투여량을 조정한다.

또 다른 한편, 보다 적은 횟수로 투여하는 것이 요구되는 경우에는 C3b 결합 분자를 지속 방출 제형으로서 투여할 수 있다. 투여량과 투여 횟수는 환자 내에서의 C3b 결합 분자의 반감기에 따라서 다양하다. 일반적으로, 인간 항체가 가장 긴 반감기를 나타내고, 그 다음으로 인간화 항체, 키메라 항체 및 비-인간 항체 순이다. 투여량과 투여 횟수는 수행되는 처치가 예방적인지 아니면 치료적인지에 따라서 다양할 수 있다. 예방적으로 적용하는 경우에는, 비교적 저 투여량을 장기간에 걸쳐 비교적 드문 간격으로 투여한다. 몇몇 환자는 그들의 나머지 일생 동안 지속적으로 치료받아야 한다. 치료적으로 적용하는 경우에는, 해당 질병의 진행이 저하되거나 종결될 때까지, 또는 환자가 질병 증상의 부분적 또는 완전한 개선을 나타낼 때까지 비교적 고 투여량을 비교적 짧은 간격으로 투여하는 것이 종종 요구된다. 그 후, 환자에게 예방적 섭생을 투여할 수 있다.

본 발명의 제약 조성물 중의 활성 성분의 실제 투여량 수준은 특별한 환자에 대해 목적하는 치료 반응을 달성시키기에 유효한 양의 활성 성분, 조성물 및 투여 방식을 수득하도록 다양할 수 있는데, 환자에게 독성이 없어야 한다. 선택된 투여량 수준은 각종 약동학적 요인들, 예를 들어 이용된 본 발명의 특별한 조성물, 또는 그의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 이용되는 특별한 화합물의 배출 속도, 치료 기간, 이용된 특별한 조성물과 병용해서 사용되는 기타 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료받는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 상태 및 기존의 병력, 및 의학 분야에 널리 공지된 기타 요인에 좌우될 것이다.

본 발명의 C3b 결합 분자의 "치료상 유효 투여량"은 질병 증상의 중증도를 저하시키거나 (예를 들어, C3 및/또는 C5 전환효소 활성을 저하시킨다), 질병 증상이 없는 기간과 빈도를 증가시키거나, 또는 질병 고통으로 인한 장해 또는 신체 장애를 예방시켜줄 수 있다.

본 발명의 결합 분자는 당해 분야에 공지된 각종 방법 중의 한 가지 이상을 사용하여 한 가지 이상의 투여 경로에 의해 투여할 수 있다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라서 다양할 것이다. 본 발명의 C3b 결합 분자에 대한 투여 경로에는 정맥내, 안내, 유리질내, 근육내, 피내, 복강내, 피하, 척수 또는 기타 비경구 투여 경로, 예를 들어 주사 또는 주입 경로가 포함된다.

또 다른 한편, 본 발명의 C3b 결합 분자는 비-비경구 경로, 예를 들어 국소, 표피 또는 점막 투여 경로, 예를 들면 비내, 경구, 설하 또는 국소 경로에 의해 투여할 수 있다.

활성 화합물은 이러한 화합물이 신속하게 방출되지 못하게 해주는 담체와 함께 제어 방출 제형으로서 제조될 수 있는데, 이에는 이식제, 경피 패치, 및 미소피막화 전달 시스템이 포함된다. 생분해성, 생체 적합성 중합체, 예를 들어 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산을 사용할 수 있다. 이러한 제형의 많은 제조 방법이 특허되었거나 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다 [참고: 예를 들어, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978].

치료 조성물은 당해 분야에 공지된 의료 기구를 이용하여 투여할 수 있다. 예를 들어 한 국면에서, 본 발명의 치료 조성물은 바늘이 없는 피하 주사 기구, 예를 들어 미국 특허 제5,399,163호; 제5,383,851호; 제5,312,335호; 제5,064,413호; 제4,941,880호; 제4,790,824호 또는 제4,596,556호에 제시된 기구를 이용하여 투여할 수 있다. 본 발명에 유용한 널리 공지된 이식제 및 모듈의 예에는 약물을 제어 속도로 투약하기 위한 이식성 미소-주입용 펌프를 제시하고 있는 미국 특허 제4,487,603호; 약물을 피부를 통하여 투여하기 위한 치료 기구를 제시하고 있는 미국 특허 제4,486,194호; 약물을 정확한 주입 속도로 전달하기 위한 약물 주입용 펌프를 제시하고 있는 미국 특허 제4,447,233호; 지속적인 약물 전달을 위한 가변 유동 이식성 주입 장치를 제시하고 있는 미국 특허 제4,447,224호; 다중-챔버 구획을 갖는 삼투압 약물 전달 시스템을 제시하고 있는 미국 특허 제4,439,196호; 및 삼투압 약물 전달 시스템을 제시하고 있는 미국 특허 제4,475,196호 (이들 특허는 본원에 참고로 도입된다)가 포함된다. 기타 많은 이식제, 전달 시스템 및 모듈이 당업자에게 공지되어 있다.

특정 국면에서, 본 발명의 C3b 결합 분자는 생체 내에서의 적당한 분배를 보장하도록 제형화할 수 있다. 예를 들어, 혈액-뇌 장벽 ("BBB") 또는 혈액 망막 장벽 ("BRB")은 고도로 친수성인 많은 화합물을 배제시키고 있다. 본 발명의 치료 화합물이 (경우에 따라) BBB 또는 BRB를 가로질러 가기 위해서는, 이들을 예를 들어, 리포솜에 제형화할 수 있다. 리포솜 제작 방법에 관해서는 미국 특허 제4,522,811호; 제5,374,548호; 및 제5,399,331호를 참고할 수 있다. 리포솜은 특이적 세포 또는 기관 내로 선택적으로 수송되므로, 표적화 약물 전달을 증강시켜 주는 하나 이상의 부분을 포함할 수 있다 [참고: 예를 들어, V.V. Ranade, 1989 J. Cline Pharmacol. 29:685]. 예시되는 표적화 부분에는 엽산염 또는 바이오틴 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제5,416,016호 (Low et al.)]; 만노시드 [참고: Umezawa et al., 1988 Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038]; 항체 [참고: P.G. Bloeman et al., 1995 FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al., 1995 Antimicrob. Agents Chemother. 39:180]; 계면활성제 단백질 A 수용체 [참고: Briscoe et al., 1995 Am. J. Physiol.1233: 134]; p120 [참고: Schreier et al., 1994 J. Biol. Chem. 269:9090]이 포함된다. 또한 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: K. Keinanen; M.L. Laukkanen, 1994 FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler, 1994 Immunomethods 4:273].

용도 및 방법

본원에 기재된 C3b 결합 분자는 시험관내 및 생체내 진단 및 치료적 용도를 지니고 있다. 예를 들어, 이들 분자는 배양 중인 세포, 예를 들어 시험관내 또는 생체내 세포에게 투여하거나, 또는 생체내 대상체에게 투여하여 각종 장애를 치료, 예방 또는 진단할 수 있다. C3b 결합 분자는 증례의 대략 10％가 신생혈관증식 (습식 AMD), 염증 및 시력 상실과 연관이 있는 질환인 AMD가 있거나, 또는 이러한 질환에 걸릴 위험에 놓여 있는 인간 환자를 치료하는 데에 특히 적합하다. C3b 결합 분자는 또한, 신염, 천식, 재관류 손상, 혈액투석, 류마티스성 관절염, 전신성 루푸스, 건선, 다발성 경화증, 이식, 알츠하이머병, aHUS, MPGN II, 또는 기타 모든 보체-매개된 질병과 같은 질병 또는 장애가 있는 인간 환자를 치료하는 데에 적합하다.

C3b 결합 분자를 또 다른 작용제와 함께 투여하는 경우, 이 둘은 어떠한 순서로든 순차적으로 투여하거나 동시에 투여할 수 있다. 몇몇 국면에서, C3b 결합 분자는 제2 작용제 [예: 베르테포르핀 (verteporfin)]를 이용한 요법을 받고 있는 대상체에게 투여한다. 기타 국면에서, 본 발명의 결합 분자는 외과적 처치와 연계해서 투여한다.

C3b 결합 분자와의 병용 치료에 적합한 작용제에는 보체 성분의 활성을 조정할 수 있는 것으로 당해 분야에 공지되어 있는 작용제가 포함된다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제5,808,109호]. 보체-매개된 활성을 저하시키는 기타 작용제가 보고되었다. 이러한 작용제에는 아미노산 [참고: Takada, Y. et al. Immunology 1978, 34, 509]; 포스포네이트 에스테르 [참고: Becker, L. Biochem. Biophy. Acta 1967, 147, 289]; 다가음이온성 물질 [참고: Conrow, R. B. et al. J. Med. Chem. 1980, 23, 242]; 설포닐 플루오라이드 [참고: Hansch, C.; Yoshimoto, M. J. Med. Chem. 1974, 17, 1160, 및 이에 인용된 참고 문헌]; 폴리뉴클레오티드 [참고: DeClercq, P. F. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1975, 67, 255]; 피마르산 (pimaric acid) [참고: Glovsky, M. M. et al. J. Immunol. 1969, 102, 1]; 포르핀 [참고: Lapidus, M. and Tomasco, J. Immunopharmacol. 1981, 3, 137]; 몇 가지 소염제 [참고: Burge, J. J. et al. J. Immunol. 1978, 120, 1625]; 페놀 [참고: Muller-Eberhard, H. J. 1978, in Molecular Basis of Biological Degradative Processes, Berlin, R. D. et al., eds. Academic Press, New York, p. 65]; 및 벤자미딘 [참고: Vogt, W. et al Immunology 1979, 36, 138]이 포함된다. 이들 작용제 중의 몇몇은 프로테아제 및 에스테라제의 일반적인 억제에 의해 기능한다. 기타 작용제는 보체 경로 중의 특별한 어떠한 중간 단계에 대해서도 특이적이지는 않지만, 오히려 보체 활성화의 한 가지 이상 단계를 억제시킨다. 후자 화합물의 예에는 C1, C4 및 C5 활용을 차단시키는 벤자미딘이 포함된다 [참고: 예를 들어, Vogt et al. Immunol. 1979, 36, 138].

보체 성분의 활성을 억제할 수 있는 것으로 당해 분야에 공지된 부가의 작용제에는 스타키보트리스 (Stachybotrys)로부터의 진균성 대사물인 K-76이 포함된다 [참고: Corey et al., J. Amer. Chem. Soc. 104: 5551, 1982]. K-76과 K-76 COOH 둘 다는 주로 C5 단계에서 보체를 억제하고 [참고: Hong et al., J. Immunol. 122: 2418, 1979; Miyazaki et al., Microbiol. Immunol. 24: 1091, 1980], 정상적인 인간 보체로부터의 화학주성 인자의 생성을 방지시키는 것으로 밝혀졌다 [참고: Bumpers et al., Lab. Clinc. Med. 102: 421, 1983]. 고 농도의 K-76 또는 K-76 COOH에서는, 이들 각각의 전술된 전구체와 C2, C3, C6, C7, 및 C9의 반응이 일부 억제된다. K-76 또는 K-76 COOH는 보체의 C3b 불활성인자 시스템을 억제하는 것으로 또한 보고되었다 [참고: Hong et al., J. Immunol. 127: 104-108, 1981]. 본 발명의 방법을 실시하는 데에 적합한 기타 작용제에는 그리세오풀빈 (griseofulvin) [참고: Weinberg, in Principles of Medicinal Chemistry, 2d Ed., Foye, W. O., ed., Lea & Febiger, Philadelphia, Pa., p. 813, 1981], 이소판나린 (isopannarin) [참고: Djura et al., Aust. J. Chem.36: 1057, 1983], 및 시포노딕티온 코랄리-파굼 (Siphonodictyon coralli-phagum)의 대사물 [참고: Sullivan et al., Tetrahedron 37: 979, 1981]이 포함된다.

병용 요법 섭생은 부가적일 수 있거나, 또는 상승적 결과 (예를 들어, 두 작용제를 병용해서 사용하는 경우에 예상된 것 보다 더 큰 보체 경로 활성 상의 저하)를 가져다줄 수 있다. 몇몇 국면에서, C3b 결합 분자와 항혈관형성제 (예: 항-VEGF)를 이용한 병용 요법은 상승적 결과를 가져다 준다 (예를 들어, C3b 생체 활성 상의 상승적 저하).

또한 본 발명의 범위 내에는, 본 발명의 조성물과 사용 설명서로 이루어진 키트가 포함된다. 이러한 키트는 한 가지 이상의 부가 시약, 또는 본 발명의 한 가지 이상의 부가 항체 (예를 들어, 제1 항체와 별개로 C3b 네오-에피토프와 결합하는 보충 활성을 지닌 항체)를 추가로 함유할 수 있다. 키트는 전형적으로, 키트 내용물의 의도한 용도를 표시하는 표지를 포함한다. 용어 표지에는 키트 상에 또는 키트와 함께 제공되거나 키트에 수반되는 모든 문서 또는 기록 물질이 포함된다.

본 발명이 상세히 기재되긴 하였지만, 다음 실시예 및 특허청구범위에 의해 추가로 예시되는데, 이는 단지 예시적이며 이로써 제한되지 않는다. 당업자는 단지 통상적인 실험을 사용하여, 본원에 기재된 구체적인 과정에 대한 수 많은 등가 수준을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가 수준이 본 발명 및 특허청구범위 내에 있다. 본 명세서 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고 문헌 (허여된 특허 및 공개된 특허출원 포함)의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다.

<실시예>

실시예 A: 파아지 디스플레이에 의한 인간 항체의 생성

C3b에 대항한 항체를 생성하기 위하여, 모르포시스 (MorphoSys) HuCAL GOLD^® 파아지 디스플레이 라이브러리를 이용한 선별을 수행하였다. HuCAL GOLD^®는 6개 모든 CDR이 다양화되고 Fab 단편을 파아지 표면에 연결시키기 위한 CysDisplay™ 기술을 이용하는 HuCAL^® 개념에 근거한 Fab 라이브러리이다 [참고: Knappik et al., 2000 J. Mol. Biol. 296:57-86; Krebs et al., 2001 J Immunol. Methods 254:67-84; Rauchenberger et al., 2003 J Biol Chem. 278(40):38194-38205; WO 01/05950, Lohning, 2001].

파아지미드 구제 (rescue), 파아지 증폭 및 정제

HuCAL GOLD^® 라이브러리를 34 ㎍/ml 클로람페니콜 및 1％ 글루코스를 함유하는 2xYT 배지 (2xYT-CG)에서 증폭시켰다. VCSM13 조력 (helper) 파아지를 이용하여 OD_600nm 0.5로 감염시킨 후 (진탕시키지 않으면서 37℃ 하에 30분; 250 rpm으로 진탕시키면서 37℃ 하에 30분), 세포를 침강시키고 (4120 g; 5분; 4℃), 2xYT/34 ㎍/ml 클로람페니콜/50 ㎍/ml 카나마이신/0.25 mM IPTG에 재현탁시키며, 22℃ 하에 밤새 성장시켰다. 파아지를 상등액으로부터 2회 PEG-침전시키고, PBS/20％ 글리세롤 중에서 재현탁시킨 다음, -80℃ 하에 저장하였다.

패닝 두 회전 사이의 파아지 증폭을 다음과 같이 수행하였다: 중간-log 상 이. 콜라이 TG1 세포를 용출된 파아지로 감염시키고, 1％ 글루코스 및 34 ㎍/ml 클로람페니콜을 보충시킨 LB 한천 판 (LB-CG 판) 상으로 도말하였다. 30℃ 하에 밤새 항온 배양한 후, TG1 집락을 한천 판으로부터 스크랩핑하고, 이를 사용하여 OD_600nm이 0.5에 도달할 때까지 2xYT-CG를 접종하고, 상기 언급된 바와 같이 감염시키기 위해 VCSM13 조력 파아지를 가하였다.

HuCAL GOLD^®를 이용한 패닝

C3b 네오-에피토프를 인식하는 항체를 선별하기 위하여, 2가지 상이한 패닝 전략을 적용하였다. 요약하면, HuCAL GOLD^® 파아지-항체를 VH 마스터 유전자의 상이한 조합을 포함하는 4개 풀로 나누었다 (풀 1: VH1/5 λκ, 풀 2: VH3 λκ, 풀 3: VH2/4/6 λκ, 풀 4: VH1-6 λκ). 이들 풀을 대상으로 하여 개별적으로, 설포링크 아가로스 비드와 직접 접합시킨 인간 C3b와 설프히드릴결합 판에 직접 피복시킨 C3b 둘 다에서 고체 상 패닝 3회전을 수행하고, 또한 바이오티닐화 C3b 항원 상에서 용액 패닝 3회전을 수행하였다.

제1 패닝 변이체는 C3b 네오-에피토프에 대항한 고체 상 패닝이다: 설프히드릴-결합 판 (공급처: Corning) 상의 2개 웰을 300 ㎕의 5 ㎍/ml C3b로 피복시켰다 (각각 4℃ 하에 밤새 수행함). 이와 같이 피복된 웰을 350 ㎕ PBS로 2회 세척하고, 미소역가 판 진탕기 상에서 실온 하에 2시간 동안 350 ㎕ 5％ MPBS로 차단시켰다. 각 패닝에 대해, 약 10¹³개 HuCAL GOLD^® 파아지-항체를 실온 하에 2시간 동안 등 용적의 PBST/5％ MP로 차단시켰다. 차단 후, 이와 같이 피복된 웰을 350 ㎕ PBS로 2회 세척하였다. 300 ㎕의 예비-차단된 HuCAL GOLD^® 파아지-항체를 피복된 각 웰에 가하고, 진탕기 상에서 실온 하에 2시간 동안 항온 배양하였다. 350 ㎕ PBS/0.05％ Tween을 5회 가한 다음, PBS로 4회 더 세척함으로써 세척을 수행하였다. 판으로부터 파아지를 용출시키는 것은 웰당 10 mM 트리스/HCl pH 8 중의 300 ㎕ 20 mM DTT를 이용하여 10분 동안 수행하였다. 이러한 DTT 파아지 용출액을 14 ml의 이. 콜라이 TG1에 가하였는데, 이는 2YT 배지 중에서 37℃ 하에 OD₆₀₀ 0.6 내지 0.8이 되도록 성장시키고, 파아지 감염을 위해 진탕시키지 않으면서 37℃ 하에 45분 동안 50 ml 플라스틱 튜브에서 항온 배양하였다. 10분 동안 5000 rpm으로 원심분리시킨 후, 세균성 펠릿을 500 ㎕ 2xYT 배지에 각각 재현탁시키고, 2xYT-CG 한천 판 상에 도말한 다음, 30℃ 하에 밤새 항온 배양하였다. 이어서, 집락을 판으로부터 스크랩핑하고, 파아지를 상기 언급된 바와 같이 구제 및 증폭시켰다. 직접적으로 피복된 C3b 항원 상에서의 고체 상 패닝의 제2 및 제3 회전은 세척 과정에서의 엄격도를 증가시키는 것을 제외하고는, 제1 회전의 프로토콜에 따라서 수행하였다.

제2 패닝 변이체는 바이오티닐화 인간 C3b 항원에 대항한 용액 패닝이다: 용액 패닝을 위해, 다이나비드 (Dynabeads) M-280 (Dynal)과 커플링된 바이오티닐화 C3b 항원을 사용하여 다음 프로토콜을 적용하였다: 1.5 ml 에펜도르프 (Eppendorf) 튜브를 4℃ 하에 밤새 PBS로 1:1 희석시킨 1.5 ml 2x 케미블로커 (Chemiblocker)로 차단시켰다. 200 ㎕ 스트렙타비딘 피복된 자기 다이나비드 M-280 (Dynal)을 200 ㎕ PBS로 1회 세척하고, 200 ㎕ 1x 케미블로커 (1x PBS에 희석됨)에 재현탁시켰다. 비드 차단은 4℃ 하에 밤새 예비-차단된 튜브에서 수행하였다. 각 패닝 조건에 대해 500 ㎕ PBS에서 희석된 파아지를 실온 하에 1시간 동안 500 ㎕ 2x 케미블로커/0.1％ Tween과 혼합하였다 (회전자). 파아지의 예비-흡수를 2회 수행하였다: 50 ㎕의 차단된 스트렙타비딘 자기 비드를 상기 차단된 파아지에 가하고 회전자 상에서 실온 하에 30분 동안 항온 배양하였다. 자기 장치 (Dynal MPC-E)를 통하여 비드를 분리시킨 후, 파아지 상등액 (약 1 ml)를 새로이 차단된 튜브에 옮기고, 예비-흡수를 50 ㎕ 차단된 비드 상에서 30분 동안 반복하였다. 이어서, 200 nM 바이오티닐화 C3b를 새로이 차단된 1.5 ml 튜브 중의 차단된 파아지에 가하고, 회전자 상에서 실온 하에 1시간 동안 항온 배양하였다. 100 ㎕의 차단된 스트렙타비딘 자기 비드를 각 패닝 파아지 풀에 가하고 회전자 상에서 실온 하에 10분 동안 항온 배양하였다. 바이오티닐화 C3b와 결합된 파아지를 자기 비드에 고정화시키고, 자기 입자 분리기 (Dynal MPC-E)로 수집하였다. 이어서, 비드를 회전자를 이용하여 PBS/0.05％ Tween 중에서 7회 세척한 다음, PBS로 3회 더 세척하였다. 다이나비드로부터의 파아지 용출은 10 mM 트리스/HCl pH 8 중의 300 ㎕ 20 mM DTT를 각 튜브에 10분 동안 가함으로써 수행하였다. 다이나비드를 자기 입자 분리기에 의해 제거하고, OD_600nm 0.6 내지 0.8로 성장된 이. 콜라이 TG-1 배양물 14 ml에 상등액을 가하였다. 이어서, 비드를 200 ㎕ PBS로 1회 세척하고, 부가적으로 제거된 파아지와 함께 상기 PBS를 14 ml의 이. 콜라이 TG-1 배양물에 가하였다. 파아지 감염을 위해, 배양물을 진탕시키지 않으면서 37℃ 하에 45분 동안 50 ml 플라스틱 튜브에서 항온 배양하였다. 10분 동안 5000 rpm으로 원심분리시킨 후, 세균성 펠릿을 500 ㎕ 2xYT 배지에 각각 재현탁시키고, 2xYT-CG 한천 판 상에 도말한 다음, 30℃ 하에 밤새 항온 배양하였다. 이어서, 집락을 판으로부터 스크랩핑하고, 파아지를 상기 언급된 바와 같이 구제 및 증폭시켰다.

바이오티닐화 C3b 항원 상에서의 용액 패닝의 제2 및 제3 회전은 세척 과정에서의 엄격도를 증가시키는 것을 제외하고는, 제1 회전의 프로토콜에 따라서 수행하였다.

가용성 Fab 단편의 서브클로닝 및 발현

선별된 HuCAL GOLD^® 파아지미드의 Fab-암호화 삽입물을 발현 벡터 pMORPH^®X9_Fab_FH 내로 서브클로닝하여 가용성 Fab의 신속하고도 효율적인 발현을 촉진시켰다. 이를 위하여, 상기 선별된 클론의 플라스미드 DNA를 XbaI 및 EcoRI로 분해시킴으로써 Fab-암호화 삽입물을 절제하고 (ompA-VLCL 및 phoA-Fd), XbaI/EcoRI-분해된 발현 벡터 pMORPH^®X9_Fab_FH 내로 클로닝하였다. 이러한 벡터로부터 발현된 Fab는 탐지와 정제 둘 다를 위한 2개의 C-말단 태그 (각각 FLAG™ 및 6xHis)를 수반하고 있다.

이. 콜라이에서의 HuCAL GOLD^® Fab 항체의 미소발현

선별된 Fab를 pMORPH^®X9_Fab_FH 발현 벡터 내로 서브클로닝한 후 수득된 클로람페니콜-내성 단일 집락을 사용하여, 웰당 100 ㎕ 2xYT-CG 배지를 함유하는 멸균성 96-웰 미소역가 판의 웰을 접종하고 이를 37℃ 하에 밤새 성장시켰다. 5 ㎕의 각 이. 콜라이 TG-1 배양물을 웰당 34 ㎍/ml 클로람페니콜 및 0.1％ 글루코스를 보충시킨 100 ㎕ 2xYT 배지로 예비-충전시킨 신선한 멸균성 96-웰 미소역가 판에 옮겼다. 이러한 미소역가 판을 배양물이 OD_600nm 약 0.5로 약간 혼탁해질 때까지 (약 2 내지 4시간) 미소판 진탕기 상에서 30℃ 하에 400 rpm으로 진탕시키면서 항온 배양하였다.

이들 발현 판에, 34 ㎍/ml 클로람페니콜 및 3 mM IPTG (이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드)를 보충시킨 20 ㎕ 2xYT 배지를 웰당 가하고 (최종 농도 0.5 mM IPTG), 미소역가 판을 기체-투과성 테이프로 밀봉시키며, 판을 400 rpm으로 30℃ 진탕시키면서 밤새 항온 배양하였다.

완전 세포 용해물 (BEL 추출물)의 생성: 발현 판의 각 웰에, 2.5 mg/ml 라이소자임을 함유하는 40 ㎕ BEL 완충액 (2xBBS/EDTA: 24.7 g/l 붕산, 18.7 g NaCl/l, 1.49 g EDTA/l, pH 8.0)을 가하고, 미소역가 판 진탕기 (400 rpm) 상에서 22℃ 하에 1시간 동안 항온 배양하였다. 이러한 BEL 추출물은 ELISA 또는 BioVeris M-시리즈^® 384 분석기에 의해 결합 분석하기 위해 사용하였다.

효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA) 기술

PBS 중의 5 ㎍/ml의 인간 재조합 C3b 항원을 4℃ 하에 밤새 384 웰 맥시소르프 판 (Nunc-lmmunoplate) 상으로 피복하였다. 피복 후, 웰을 PBS/0.05％ Tween (PBS-T)로 1회 세척하고 PBS로 2회 세척하였다. 이어서, 웰을 실온 하에 2시간 동안 2％ BSA를 수반한 PBS-T로 차단시켰다. 이와 병행해서, 15 ㎕ BEL 추출물 및 2％ BSA를 수반한 15 ㎕ PBS-T를 실온 하에 2시간 동안 항온 배양하였다. 상기 차단된 맥시소르프 판을 PBS-T로 3회 세척한 후, 10 ㎕의 차단된 BEL 추출물을 웰에 가하고 실온 하에 1시간 동안 항온 배양하였다. 일차 Fab 항체를 탐지하기 위하여, 다음 이차 항체를 적용하였다: 알칼리성 포스파타제 (AP)-접합된 애피니퓨어 (AffiniPure) F(ab')₂ 단편, 염소 항-인간, -항-마우스 또는 -항-양 IgG (공급처: Jackson lmmuno Research). AP-접합체를 탐지하기 위해서는, 형광발생 기질 [예: AttoPhos (공급처: Roche)]을 제조업자의 지시에 따라서 사용하였다. 모든 항온 배양 단계 사이에 미소역가 판의 웰을 PBS-T로 3회 세척하고, 이차 항체와 함께 최종 항온 배양한 후에 3회 세척하였다. TECAN 스펙트라플루오르 (Spectrafluor) 판 판독기에서 형광을 측정할 수 있다.

이. 콜라이에서의 HuCAL GOLD^® Fab 항체의 발현 및 정제

TG-1 세포 중에서 pMORPH^®X9_Fab_FH에 의해 암호화된 Fab 단편의 발현은 34 ㎍/ml 클로람페니콜을 보충시킨 750 ml의 2xYT 배지를 사용하여 진탕기 플라스크 배양물에서 수행하였다. OD_600nm가 0.5에 도달할 때까지 배양물을 30℃ 하에 진탕시켰다. 0.75 mM IPTG를 30℃ 하에 20시간 동안 부가함으로써 발현을 유도시켰다. 라이소자임을 사용하여 세포를 붕괴시키고, Fab 단편을 Ni-NTA 크로마토그래피 (공급처: Qiagen, Hilden, Germany)에 의해 단리시켰다. 단백질 농도를 UV-분광광도법으로 결정할 수 있다 [참고: Krebs et al. J Immunol Methods 254, 67-84 (2001)].

실시예 B: LCDR3 및 HCDR2 카셋트의 병렬식 교환에 의한 선별된 항-C3b 네오-에피토프 Fab의 친화성 성숙

친화성 성숙을 알아보기 위한 Fab 라이브러리의 생성

확인된 항-C3b 항체의 억제 활성과 친화성을 증가시키기 위해, Fab 클론을 대상으로 하여 친화성 성숙 공정을 수행하였다. 이를 위해, 트리뉴클레오티드 지시된 돌연변이 유발을 이용하는 카세트 돌연변이 유발에 의해 CDR 영역을 최적화하였다 [참고: Virnekas et al. Nucleic Acids Res. 22:5600-5607, 1994].

다음에는 성숙 라이브러리의 클로닝 및 Fab 최적화를 위해 사용될 수 있는 프로토콜이 간략하게 기재되어 있다. 발현 벡터 pMORPH^®X9_Fab_FH로부터의 Fab 단편을 파아지미드 벡터 pMORPH^®25 내로 클로닝하였다 [참고: 미국 특허 제6,753,136호]. 두 가지 상이한 전략을 나란히 적용하여 모 Fab의 친화도와 효능 둘 다를 최적화하였다.

6개 선별된 성숙 후보 ("모" 클론)의 LCDR3을 개개의 경쇄 CDR3 서열 레퍼토리로 대체시킨 파아지 항체 Fab 라이브러리를 생성시켰다. 이와 병행해서, 각 모 클론의 HCDR2 영역을 개개의 중쇄 CDR2 서열 레퍼토리로 대체시켰다. 표준 클로닝 과정 및 다양화 클론을 전기-적격한 이. 콜라이 TOP10F' 세포 (공급처: Invitogen) 내로 형질전환시킴으로써 친화성 성숙 라이브러리를 생성시켰다. Fab-제시 파아지를 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였다. 각 라이브러리에 상응하는 성숙 풀을 구축하고, 후속 선별 공정 동안 별개로 유지시켰다.

성숙 패닝 전략

4개의 항체 풀을 이용하는 패닝 과정은 각각 상기 언급된 바와 같은, 바이오티닐화 C3b에 대항한 용액 패닝 3회전 동안 용액 중에서 C3b 상에서 수행하였다. 선별 엄격도는 패닝 회전 마다 바이오티닐화 항원을 감소시키고, 세척 단계를 연장시키며, 이탈 속도 선별을 위해 비-바이오티닐화 항원을 부가함으로써 증가시켰다.

세균성 용해물에서 C3b 결합 Fab를 탐지하기 위한 전기화학발광 (BioVeris)에 의거한 결합 분석

C3b에 대한 이. 콜라이 용해물 (BEL 추출물) 중에서의 최적화 Fab 항체의 결합은 다음 분석기 [BioVeris M-SERIES^® 384 AnalyzerBioVeris, Europe, Witney, Oxforfshire, UK]에서 분석하였다. BEL 추출물을 바이오베리스 (BioVeris) 스크리닝에 사용하기 위해 검정 완충액 (PBS/0.05％ Tween20/0.5％ BSA)에서 희석시켰다. 바이오티닐화 C3b를 스트렙타비딘 피복된 상자성 비드와 커플링시켰다. 항-인간 (Fab)'₂ (Dianova)는 BV-태그™ (공급처: BioVeris Europe, Witney, Oxfordshire, UK)를 이용하여 루테늄 표지시켰다. 이러한 이차 항체는 바이오베리스 M-SERIES^® 384 분석기에서 측정하기 전에, C3b 커플링된 비드에 가하였다. 바이오베리스 스크리닝으로부터의 표적물의 서열 분석을 수행하여 Fab 클론을 확인하였다. 선별된 Fab 항체를 IgG1 포맷으로 서브클로닝하였다.

용액 평형 적정 (SET)을 이용한 피코몰 친화도의 결정

K_D 결정을 위해, Fab의 단량체 분획 (90％ 이상 단량체 함량, 분석적 SEC에 의해 분석함; Superdex75, Amersham Pharmacia)을 사용하였다. 용액 중에서 전기화학발광 (ECL)에 의거한 친화도 결정 및 데이터 평가는 본질적으로, 문헌 [참고: Haenel et al., 2005]에 기재된 바와 같이 수행할 수 있다. 일정 량의 Fab를 용액 중의 상이한 농도 (일련의 3ⁿ 희석도)의 C3b로 평형시켰다. 상자성 비드 (M-280 스트렙타비딘, Dynal)와 커플링된 바이오티닐화 C3b, 및 BV-태그™ (공급처: BioVeris Europe, Witney, Oxfordshire, UK) 표지된 항-인간 (Fab)'₂ (Dianova)를 가하고 혼합물을 30분 동안 항온 배양하였다. 연속해서, 결합되지 않은 Fab의 농도는 M-SERIES^® 384 분석기 (공급처: BioVeris Europe)를 사용하여 ECL 탐지함으로써 정량화하였다.

용액 중에서 또 다른 종 (예를 들어, 침팬지 또는 시노몰구스)의 C3b에 대한 친화도 결정은 본질적으로 상기 언급된 바와 같이 수행하여, 인간 C3b를 침팬지 또는 시노몰구스 C3b로 대체시켰다. 자유 Fab의 탐지를 위해, 상자성 비드와 커플링된 바이오티닐화 C3b를 사용하였다. 문헌 [참고: Haenel et al., 2005 Anal Biochem 339, 182-184]에 기재된 방법에 따라서 친화도를 계산하였다.

실시예 C: 용혈 검정에 의한 보체 단백질의 탐지

수성 체액 및 유리체액 표본을 연령 관련 황반 변성 환자로부터 수득하였다. 이 환자는 상기 기초 질병에 대한 수술을 받고 있으며, 표본은 안내 수술 시작시 수득한 것이다. 샘플 (100 내지 200 ㎕의 수성 체액 및 200 내지 300 ㎕의 유리체액)은 희석되지 않은 상태로 수득하고, 즉시 사용하거나 -80℃ 하에 저장하였다.

수성 체액 및 유리체액 샘플을 정상 인간 환자로부터 수득하고, 이를 정상 인간 혈청과 함께 37℃ 하에 2시간 동안 항온 배양하였다. 혼합물을 대상으로 하여 표준 CH50 및 AH50 용혈 검정을 이용하여 전통적 및 대체 보체 경로의 억제에 관하여 검정하였다. 이들 검정에서, 정상 인간 혈청은 정상의 건강한 대상체로부터 수득하고, 보체 공급원으로서 사용한 다음, -80℃ 하의 분취액에 저장하였다. 정상 인간 혈청을 또한, 당해 분야에서 통상적으로 사용된 바와 같이 겔 여과 칼럼 및 미소원심분리 후 수득된 분획으로 처리하였다. 수성 및 유리체액 중의 총 보체 활성을 또한 결정하였다.

CH50 검정

CH50 검정은 문헌 [참고: Kabat, EA. et al Experimental lmmunochemistry 1961. pp. 133-239]에 기재되어 있다. 정상 인간 혈청을 보체 공급원으로서 사용하고, 이를 -80℃ 하의 분취액에 저장하였다. 수성 및 유리체액 단독 중에서의 총 보체 활성을 또한 결정하였고, 이는 표적 세포로서 양 적혈구 (SRBC)를 활용한다 (기타 종으로부터의 적혈구 세포, 예를 들어 치킨 적혈구 세포를 사용할 수 있다). SRBC/ml을 함유하는 현탁액을 GVB²⁺ 완충액 (Ca²⁺ 및 Mg²⁺을 수반한 젤라틴/베로날-완충 식염수), pH 7.35에서 제조하였다. 용혈소 (토끼 항-양 항혈청)을 적정하여, SRBC를 감작시키기 위한 최적의 희석율을 결정하였다. 희석된 용혈소를 등 용적의 SRBC와 혼합하고, 전체를 37℃ 하에 15분 동안 항온 배양하였다. 이로써, 항체-피복된 적혈구 (EA)가 생성되었다. EA를 일련의 2배 희석율의 정상 인간 혈청 또는 유사한 희석율의 정상 인간 혈청과 시험 샘플의 혼합물과 함께 37℃ 하에 1시간 동안 항온 배양하였다. 시험 샘플은 분획화하지 않은 수성/유리체 여액으로서 규정하고, 크기 배제 칼럼 후에 수득된 마이크로 농도를 유지하였다. GVB²⁺ 완충액과 함께 항온 배양한 정상 인간 혈청을 대조군으로서 사용하였다. 배경 대조군은 EA를 완충액 단독 (혈청을 부가하지 않았다)과 함께 항온 배양함으로써 수득하고, 증류수를 EA에 부가함으로서 총 용해율 (100％ 용혈)을 결정하였다. 1.2 ml의 빙냉 0.15 M NaCl을 이용하여 상기 반응을 중지시키고, 혼합물을 방사하여 용해되지 않은 세포를 펠릿화하며, 상등액의 광밀도를 분광광도계를 이용하여 (412 nm) 결정하였다. 100％ 용해 대조군과 비교한 용혈 비율 (％)을 결정하였다.

검정 혼합물 중의 세포 50％를 용해시키는 데에 요구되는 혈청 희석율을 결정함으로써 보체 활성을 정량화하였다. 이 결과는 상기 희석율의 역수로서 표현하였다 (CH_5O 단위/혈청 ml).

AH50 검정

AH₅₀ 검정은 대체 경로의 활성화에 의한 인간 혈청에 의한 미감작화 토끼 적혈구 (Erab)의 용해에 의존하는, 문헌 [참고: Kabat, et al.]에 기재된 표준 방법을 이용하여 수행하였다. 칼슘-의존성 전통적 경로의 활성화는 칼슘 킬레이트제 에틸렌 글리콜 테트라아세트산 (EGTA)을 검정 완충액에 부가함으로써 방지시키고, 양 경로에 필수적인 마그네슘을 상기 완충액에 가하였다. 토끼 RBC의 세포 현탁액을 GVB-Mg²⁺-EGTA 완충액에서 제조하였다. 일련의 1.5배 희석율의 정상 인간 혈청 또는 유사한 희석율의 정상 인간 혈청과 시험 샘플의 혼합물을 GVB-Mg²⁺-EGTA 완충액에서 제조하고, 100 ㎕의 각 혈청 희석액을 50 ㎕의 표준화 Erab에 가하였다. GVB-Mg²⁺-EGTA 완충액과 함께 항온 배양한 정상 인간 혈청을 대조군으로서 사용하였다. 이어서, 이 혼합물을 현탁 상태의 세포를 유지하기 위해 진탕 수욕 중에서 37℃ 하에 60분 동안 항온 배양하고, 1.2 ml의 빙냉 NaCl (0.15 M)을 가하여 상기 반응을 중지시켰다. 튜브를 4℃ 하에 10분 동안 1250 g으로 방사하여 세포를 펠릿화하며, 상등액의 광밀도를 분광광도계를 이용하여 (412 nm) 결정하였다. 총 용해 대조군 튜브에서는, 100 ㎕의 증류수를 50 ㎕의 Erab 현탁액에 가하고, 100％ 용해 대조군과 비교한 용혈 비율 (％)을 결정하였다. 검정 혼합물 중의 세포 50％를 용해시키는 데에 요구되는 혈청 희석율을 결정함으로써 보체 활성을 정량화하였다. 이 결과는 상기 희석율의 역수로서 표현하였다 (AH5O 단위/혈청 ml).

SEQUENCE LISTING <110> Etemad-Gilbertson, Bijan Guild, Braydon Charles Keating, Mark Taylor Kim, Yong-In Klickstein, Lloyd B. Mikhailov, Dmitri Milik, Mariusz Roguska, Michael Splawski, Igor Zhao, Kehao Novartis AG <120> Molecules and Methods for Modulating Complement Component <130> 52320-WO-PCT <150> 60/984951 <151> 2007-11-02 <160> 37 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 1 Gly Glu Asp Thr Val Gln Ser Leu Thr Gln Gly 1 5 10 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 2 Asp Glu Asp Ile Ile Ala Glu Glu Asn Ile Val Ser Arg Ser Glu Phe 1 5 10 15 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 3 Ile Arg Met Asn Lys Thr Val Ala Val Arg Thr 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 4 Ser Asp Gln Val Pro Asp Thr Glu Ser Glu Thr 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 5 Val Ala Gln Met Thr Glu Asp 1 5 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 6 Phe Val Lys Arg Ala Pro 1 5 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 7 Lys Asp Lys Asn Arg Trp Glu Asp Pro Gly Lys Gln Leu Tyr Asn 1 5 10 15 <210> 8 <211> 13 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 8 Cys Thr Arg Tyr Arg Gly Asp Gln Asp Ala Thr Met Ser 1 5 10 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 9 Gly Phe Ala Pro Asp Thr Asp Asp Leu Lys Gln Leu Ala Asn Gly Val 1 5 10 15 <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 10 Asp Ser Leu Ser Ser Gln Asn Gln Leu Gly Val Leu 1 5 10 <210> 11 <211> 14 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 11 Pro Ile Glu Asp Gly Ser Gly Glu Val Val Leu Ser Arg Lys 1 5 10 <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 12 Gly Val Gln Asn Pro Arg Ala Glu Asp Leu Val Gly 1 5 10 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 13 Asp Gly Ser Pro Ala Tyr Arg 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 14 Gln Gly Glu Asp Thr Val Gln Ser Leu 1 5 <210> 15 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 15 Lys Gln Glu Leu Ser Glu Ala Glu 1 5 <210> 16 <211> 12 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 16 Val Arg Glu Pro Gly Gln Asp Leu Val Val Leu Pro 1 5 10 <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 17 Val Val Lys Ser Gly Gln Ser Glu Asp Arg Gln Pro Val Pro Gly 1 5 10 15 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 18 Val Glu Asp Leu Lys Glu Pro Pro Lys Asn 1 5 10 <210> 19 <211> 12 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 19 Tyr Asn Tyr Arg Gln Asn Gln Glu Leu Lys Val Arg 1 5 10 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 20 Ala Thr Thr Lys Arg Arg His Gln Gln Thr 1 5 10 <210> 21 <211> 12 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 21 His Phe Ile Ser Asp Gly Val Arg Lys Ser Leu Lys 1 5 10 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 22 Ser Asp Gln Val Pro Asp Thr Glu Ser Glu Thr 1 5 10 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 23 Thr Pro Ser Gly Cys Gly Glu Gln Asn 1 5 <210> 24 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 24 Glu Leu Ile Lys Lys Gly Tyr Thr 1 5 <210> 25 <211> 12 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 25 Glu Lys Gln Lys Pro Asp Gly Val Phe Gln Glu Asp 1 5 10 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 26 Leu Arg Asn Asn Asn Glu Lys Asp Met 1 5 <210> 27 <211> 15 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 27 Thr Thr Ala Lys Asp Lys Asn Arg Trp Glu Asp Pro Gly Lys Gln 1 5 10 15 <210> 28 <211> 13 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 28 Cys Thr Arg Tyr Arg Gly Asp Gln Asp Ala Thr Met Ser 1 5 10 <210> 29 <211> 16 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 29 Gly Phe Ala Pro Asp Thr Asp Asp Leu Lys Gln Leu Ala Asn Gly Val 1 5 10 15 <210> 30 <211> 10 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 30 His Ser Glu Asp Asp Cys Leu Ala Phe Lys 1 5 10 <210> 31 <211> 12 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 31 Ser Gly Ser Asp Glu Val Gln Val Gly Gln Gln Arg 1 5 10 <210> 32 <211> 12 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 32 Leu Ser Ser Asp Phe Trp Gly Glu Lys Pro Asn Leu 1 5 10 <210> 33 <211> 15 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 33 Glu Asp Glu Cys Gln Asp Glu Glu Asn Gln Lys Gln Cys Gln Asp 1 5 10 15 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 34 Asn Arg Glu Phe Lys Ser Glu Lys Gly 1 5 <210> 35 <211> 3 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 35 Gln Asn Leu 1 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 36 Glu Thr Glu Lys Arg Pro Gln Asp Ala 1 5 <210> 37 <211> 2 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 37 Ser Asp 1

Claims

C3b 네오-에피토프와 결합하는 항원 결합 부분을 포함하는 단리된 결합 분자.
C3b 에피토프와 특이적으로 결합하는 항원 결합 부분을 포함하며, 상기 항원 결합 부분은
(a) 서열 1의 아미노산 GEDTVQSLTQG;
(b) 서열 2의 아미노산 DEDIIAEENIVSRSEF;
(c) 서열 3의 아미노산 IRMNKTVAVRT;
(d) 서열 4의 아미노산 SDQVPDTESET;
(e) 서열 5의 아미노산 VAQMTED;
(f) 서열 6의 아미노산 FVKRAP;
(g) 서열 7의 아미노산 KDKNRWEDPGKQLYN;
(h) 서열 8의 아미노산 CTRYRGDQDATMS; 또는
(i) 서열 9의 아미노산 GFAPDTDDLKQLANGV
중 하나 내에 있거나 이와 중복되는 인간 C3b의 에피토프와 결합하는 것인, 단리된 C3b 결합 분자.
제1항 또는 제2항에 있어서, 항원 결합 부분이 비-인간 영장류의 C3b 항원과 교차 반응성인 C3b 결합 분자.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 부분이 설치류 종의 C3b 항원과 교차 반응성인 C3b 결합 분자.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 부분이 선형 에피토프와 결합하는 것인 C3b 결합 분자.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 부분이 비선형 에피토프와 결합하는 것인 C3b 결합 분자.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 부분이 인간 C3b 항원과 1 nM 이하의 K_D로 결합하는 것인 C3b 결합 분자.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 부분이 비-인간 영장류의 C3b 항원과 5 nM 이하의 K_D로 결합하는 것인 C3b 결합 분자.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 부분이 인간 항체의 항원 결합 부분인 C3b 결합 분자.
제1항에 있어서, 항체가 인간 또는 인간화 항체인 C3b 결합 분자.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 부분이 모노클로날 항체의 항원 결합 부분인 C3b 결합 분자.
제1항에 있어서, 항원 결합 부분이 폴리클로날 항체의 항원 결합 부분인 C3b 결합 분자.
제1항에 있어서, 키메라 항체인 C3b 결합 분자.
제1항에 있어서, 항체의 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')₂ 또는 Fv 단편을 포함하는 C3b 결합 분자.
제1항에 있어서, 단일 쇄 Fv를 포함하는 C3b 결합 분자.
제1항 또는 제2항에 있어서, 디아보디 (diabody)를 포함하는 C3b 결합 분자.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 부분이 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 이소형 중 하나의 항체로부터 유래된 것인 C3b 결합 분자.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 부분이, Fc 서열이 효과기 기능을 조정하거나 Fc 수용체에 대한 결합을 변경하도록 정상 서열에 비해 변경된, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 이소형 중 하나의 항체로부터 유래된 것인 C3b 결합 분자.
제18항에 있어서, Fc 서열이 아미노산 잔기 234 또는 235에서 변경된 것인 C3b 결합 분자.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 중에서의 MAC 생성을 억제하는 C3b 결합 분자.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, C3b가 전환효소와 결합하는 것을 억제하는 C3b 결합 분자.
제21항에 있어서, C3b가 C3 또는 C5 전환효소와 결합하는 것을 억제하는 C3b 결합 분자.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, C3 또는 C5 전환효소의 단백질 분해 활성을 억제하는 C3b 결합 분자.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, C3b 항원이 존재하는 조건 하에 세포 또는 프로페르딘 (properdin)과 접촉하는 경우, C3b 결합 분자의 부재 하에서의 억제와 비교하여, 세포 또는 표면 상에서의 (i) C3 또는 C5 전환효소; 또는 (ii) C5a 또는 MAC; 또는 (iii) C3a 또는 iC3b 또는 C3b의 생성을 감소시키는 C3b 결합 분자.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 C3b 결합 분자를 포함하는 제약 조성물.
세포 또는 프로페르딘을 C3b 결합 분자와 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포 중에서 MAC 합성을 억제하는 방법.
표 1 중에서 선택된 아미노산과 90％ 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어진 펩티드.
대상체에게 보체 시스템에 의해 매개되는 세포 활성을 조정하는 C3b 결합 분자를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 C3b 활성을 조정하는 방법.
안과 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제25항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 안과 장애를 치료하는 방법.
제28항에 있어서, 대상체의 MAC 수준이, 조성물 투여 이전 대상체에서의 MAC의 수준과 비교하여 5％ 이상 감소하는 방법.
제28항에 있어서, 대상체가 또한 제2 작용제를 사용하는 요법을 받고 있는 대상체인 방법.
제28항에 있어서, 대상체가 AMD를 앓고 있거나 또는 AMD에 걸릴 위험이 있는 대상체인 방법.
제32항에 있어서, 대상체가 건식 형태의 AMD를 나타내거나 또는 습식 형태의 AMD에 걸릴 위험이 있는 대상체인 방법.