TW200924795A - Molecules and methods for modulating complement component - Google Patents

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200924795 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於抗原結合分子、由彼等分子結合之ne〇抗 原決定基及使用該等分子之方法。 【先前技術】 年齡相關黃斑退化（AMD)為一種進行性疾病且為年齡65 歲及65歲以上美國人之視力損失及失明之主要原因。amd 主要影響黃斑；亦即負責閱讀或駕驶所需之高視覺銳度之 視網膜的部分。大多數AMD患者遭受特徵為存在稱為脈絡 膜小疲之細胞外視網膜沈積物之疾病早期階段。脈絡膜小 疲為細胞碎片、發炎性介體及細胞外基質成份之細胞外視 網膜沈積物。AMD晚期表現為乾燥形式或濕潤形式，其均 與視力損失相關。乾燥型AMD ’亦稱為地圖狀萎縮，其在 檢眼鏡檢查時’表現為相應於視網膜色素上皮（RPE)損失 之局部區域之界限分明區域。濕潤型AMD與脈絡膜之新血 管形成相關’引起Bruch氏膜之完整性損失及視網膜中之 血管生長’在視網膜中其可常常出血。該滲漏引起對視網 膜細胞之永久性損傷，該等視網膜細胞相繼死亡且在中心 視覺中產生盲點。 先天人類系統包含補體路徑。補體路徑用以防禦化膿性 細菌感染’從而連接先天及適應免疫性；且處理掉免疫複 合物及發炎性損傷之產物。補體為具有超過30種參與血漿 及細胞表面中之級聯反應之蛋白質的系統。補體系統及其 補體成份參與各種免疫過程。舉例而言，補體C5b-9複合 135468.doc 200924795 物，亦稱為未端複合物或膜攻擊複合物（MAC)，其藉由誘 導膜透過性損傷而在細胞死亡中起重要作用。 近期工作已證明，補體成份C3及C5為患有AMD之患者 中之脈絡膜小疣的主要組分。Mulling, R.F.等人（2000) FASEB J 14, 83 5-46。已推測在覆蓋脈絡膜小疣之RPE細胞 中，其存在以及膜攻擊複合物（MAC)C5b-9及其他急性期 反應物蛋白質之存在參與可觸發補體活化及MAC形成之過 程。Johnson，L 等人（2001)Exp Eye Res 73，887-896。因 此，漸增之跡象表明，補體成份並非僅僅只為具有先天免 疫性之介體。 已指定營養介入以抑制乾燥型AMD向濕潤型AMD之進 程。目前，用於濕潤型AMD之唯一經FDA批准之治療包括 光動力療法（PDT)、抗-VEGF適體（諸如哌加他尼 (pegaptanib))及抗-VEGF 抗體蘭尼單抗（ranibizumab)。通 常將該等藥物或療法投予已遭受實質視力損失之患者。 對開發用於AMD之有效治療仍存在需要以替代或補充當 前治療。特定而言，對可提供視力損失之早期偵測、預防 或恢復之治療存在需要。 【發明内容】 本發明係關於補體成份C3b之抗原決定基、C3b結合分 子及製造及使用該等分子之方法。本發明進一步提供與 C3b結合之分子（亦即，C3b結合分子），尤其結合人類C3b 抗原決定基之抗體及其部分及調控至少一種由替代及/或 典型補體路徑介導之補體蛋白質或細胞活性之彼等分子。 135468.doc 200924795 在整個本說明書中，提及"補體路徑"或”補體"指示替代 補體路徑或典型補體路徑中之任一者或兩者。 在一態樣中，含量欲經調控之補體成份蛋白質為過敏毒 素、因子H、因子P、因子B、C3或C5轉化酶；C3裂解產 物，諸如C3a、C3b、iC3b及C3d，C5裂解產物C5a及C5b ; MAC及補體副產物之MAC依賴性產生。 在另一態樣中，本發明之結合分子調控補體蛋白質之酶 促活性。在一些方法中，欲調控之酶促活性為C3及/或C5 轉化酶活性、C3向C3a及C3b之轉化、C5向C5a及C5b之轉 化及C5b-9之形成。 在另一態樣中，本發明以調控受檢者中之補體蛋白質產 生量之方法為特徵。該方法包括向受檢者投予C3b結合分 子，該C3b結合分子緩和以下生物學活性中之一或多者： (a)對與C3轉化酶結合之因子P之抑制；（b)對與C3b結合之 因子B之抑制；（c)對C3或C5轉化酶之蛋白質水解活性之競 爭性或非競爭性抑制；（d)抑制C3b與C3轉化酶之結合，進 而抑制C5轉化酶之形成；（e)對C3裂解產物C3a、C3b、 iC3b及C3d之形成之抑制；（f)對C5裂解產物C5a及C5b之形 成之抑制；（g)對MAC形成之抑制及（h)對包括C6、叢集蛋 白（clusterin)、結合球蛋白（haptoglobin)、Ig κ鏈、Ig λ鏈 或Ig γ鏈之補體副產物之MAC依賴性產生的抑制。一些方 法進一步包含彳貞測來自受檢者之尿、血襞、血清、全血或 眼睛液體中之補體蛋白質之含量。 因此，在一態樣中，本發明提供與C3b neo抗原決定基 135468.doc 200924795 結合之C3b結合分子，包括其抗原結合部分，其中抗原結 合部分與選自下文表1中所列出之胺基酸之群的neo抗原決 定基結合。 在另一態樣中，C3b結合分子已在其對效應物配位體之 親和力方面經改變。本發明之抗C3b抗體較佳在位置234及 235處具有白胺酸向丙胺酸之突變以消除FcRy結合且減弱 效應功能。 特定而言，本發明提供包含與C3b neo抗原決定基結合 (例如特異性結合）之抗體之抗原結合部分的經分離C3b結 合分子，其中抗原結合部分與以下C3b neo抗原決定基中 之一者内或重疊以下C3b neo抗原決定基中之一者的人類 C3b之neo抗原決定基結合：（a) GEDTVQSLTQG(胺基酸 393-403，Seq ID No: 1) ; (b) DEDIIAEENIVSRSEF(胺基酸 752-767，Seq ID No: 2) ; (c) IRMNKTVAVRT(胺基酸936-946，Seq ID No. 3) ； (d) SDQVPDTESET(胺基酸 968-978，Seq ID No: 4) ; (e) VAQMTED(胺基酸987-993，Seq ID NO: 5)，（f) FVKRAP(胺基酸 1069-1074，Seq ID No: 6) ; (g) KDKNRWEDPGKQLYN(胺基酸 1215-1229，Seq ID No: 7) ; (h) CTRYRGDQDATMS(胺基酸 1389-1401，Seq ID No: 8) ; (i) GFAPDTDDLKQLANGV(胺基酸 1410-1425， Seq ID No: 9) o 在另一態樣中，本發明提供與連接.於第二或第三分子之 C3b neo抗原決定基結合（例如特異性結合）之經分離C3b結 合分子，包括結合分子之抗原結合部分。第二或第三分子 135468.doc -10- 200924795 可為游離的或連接在諸如雙鍵體或三鏈體之複合物中。該 第二或第三分子可選自由⑶、C3bBb、⑽、C4b2a、因 子P、因子H、因子B或其部分組成之群。 在各種L樣中，抗原結合部分與下文表丨中所列之胺基 酸中之-或多者内或重疊下文h巾所狀胺基酸中之一 或多者的人類C3b之neo抗原決定基特異性結合。在各種態 樣中，結合分子為抗體或分子，其以可結合線性或非線性 抗原決定基之抗體的方式起作用。在一態樣中，其中c3b 分子與包括本文中表it以0抗原決定基中之一或多者的非 線性抗原決定基結合，neo抗原決定基關於與ne〇抗原決定 基中之一或多個抗原部分相互作用之結合分子應經構型排 列以大體上產生所要生物功能。線性及非線性ne〇抗原決 定基包括以下線性抗原決定基中之每一者之至少一部分： (a) SEQ ID NO: 4之胺基酸 968-978 ;及（b) SEQ ID NO: 2之 胺基酸752-762。在另一實例中，抗原結合部分與非線性 neo抗原決定基結合’該非線性neo抗原決定基包括以下線 性neo抗原決定基中之每一者之至少一部分或由以下線性 neo抗原決定基中之每一者之至少一部分組成：（a) SEQ ID NO: 3之胺基酸936-946 ;及（b) SEQ ID NO: 8之胺基酸 1389· 1401。非線性neo抗原決定基之任何組合可由該結合 分子結合以調控至少一種由補體路徑介導之補體蛋白質或 細胞活性。 在其他態樣中，C3b結合分子可與非人類靈長類動物（例 如食蟹猴（cynomolgus monkey)或恆河猴（rhesus monkey)) 135468.doc 200924795 之C3b交叉反應。在各種態樣中，抗原結合部分可與齧齒 動物物種之C3b(例如鼠類C3b、大鼠C3b、兔C3b)交又反 應。 在一態樣中，本發明之結合分子以等於或小於1 nM(例 如，0.01 ηΜ、0·1 nM、0.25 nM、0.5 nM)之解離常數（KD) 與C3b結合。 在另一態樣中，C3b結合分子以與人類C3b結合之KD的 5-10倍内之KD與非人類靈長類動物（例如食蟹猴或恆河猴） 之C3b neo抗原決定基結合。 在一實施例中，本發明之結合分子以等於或小於5 nM或 與人類C3b結合之KD之100倍内的KD與小鼠C3b neo抗原決 定基結合。 在一態樣中，結合分子為嵌合（例如人化）抗體或人類抗 體。 在另一態樣中，結合分子為單株抗體或多株抗體。 C3b結合分子包括（例如）抗體之Fab片段、FalV片段、 F(ab丨)2或Fv片段。 在一態樣中，C3b結合分子為人類抗體。 在一態樣中，C3b結合分子包括單鏈Fv。 在一態樣中，C3b結合分子包括雙功能抗體（例如，單鏈 雙功能抗體或具有兩條多肽鏈之雙功能抗體）。在其他態 樣中，抗體之抗原結合部分係來源於以下同型中之一者之 抗體：IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。在另一態樣中，抗體之 抗原結合部分係來源於IgA或IgE同型之抗體。 135468.doc 12 200924795 在另一態樣中，本發明提供用於在將組合物投予動物 時，引出與C3b neo抗原決定基特異性結合之抗體的組合 物。組合物包括（例如）本文中表丨中所列出之肽令之一或多 者；其具有小於5個胺基酸改變之肽；或其片段（例如，含 有2 3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個胺基酸之片 • ^ )。可（例如）藉由使C3b neo抗原決定基或其片段與載體 . 蛋白偶合來改質組合物以增強抗原性。 φ 在另一態樣中，本發明以降低細胞中之MAC產生之方法 為特徵。在一實例中，MAC產生或抑制可藉由使用標準 CH50及AH50溶血檢定，諸如抑制來自小雞、兔或人類之 紅血球之溶血作用來量測。如本文中所進一步提供檢定 方法包括使紅血球與C3b結合分子接觸，進而抑制紅血球 上之MAC形成。 在本發明之一些方法中’結合分子調控回應於活化補體 系統或由活化補體系統介導之細胞活性。在一些方法中， φ 欲調控之細胞活性為細胞溶解。一些方法進一步包含藉由 (例如）溶血檢定偵測細胞活性。在一些方法中，偵測來自 又檢者之尿、血漿、血清' 全血或眼睛液體中之細胞活 ' 性。 • 本發明亦提供包含本文中所述之一或多種C3b結合分子 之醫藥組合物。在一實施例中，本發明提供一種醫藥組合 物’其包含與選自由以下抗原決定基組成之群之C3b neo 抗原決定基中之一者内或重疊選自由以下抗原決定基組成 之群之C3b neo抗原決定基中之一者的人類C3b抗原決定基 135468.doc •13· 200924795 結合之C3b結合分子（例如，抗體或其抗原結合片段）：（a) GEDTVQSLTQG(胺基酸 393-403，Seq ID No: 1) ； (b) DEDIIAEENIVSRSEF(胺基酸 752-767，Seq ID No: 2) ; (c) IRMNKTVAVRT(胺基酸 936-946，Seq ID No. 3) ； (d) SDQVPDTESET(胺基酸 968-978，Seq ID No: 4) ； (e) VAQMTED(胺基酸 987-993 ，Seq ID NO: 5) ，(f) FVKRAP(胺基酸 1069-1074，Seq ID No: 6) ； (g) KDKNRWEDPGKQLYN(胺基酸 1215-1229，Seq ID No: 7) ; (h) CTRYRGDQDATMS(胺基酸 1389-1401，Seq ID No: 8) ; (i) GFAPDTDDLKQLANGV(胺基酸 1410-1425，Seq ID No: 9);及醫藥學上可接受之載劑。 在另一實施例中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含 與包含以下線性抗原決定基中之每一者之至少一部分的人 類C3b neo抗原決定基結合之C3b結合分子（例如，抗體或 其抗原結合片段）：（a) SEQ ID NO: 4之胺基酸968-978 ;及 (b) SEQ ID NO: 2之胺基酸752-762 ;及醫藥學上可接受之 載劑。在一實施例中，C3b結合分子與線性C3b neo抗原決 定基結合。在另一實施例中，C3b結合分子與非線性C3b neo抗原決定基結合。 在另一實施例中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含 與人類C3b非線性neo抗原決定基結合之C3b結合分子（例 如，抗體或其抗原結合片段），該人類C3b非線性neo抗原 決定基包含以下線性抗原決定基中之每一者之至少一部分 或由以下線性抗原決定基中之每一者之至少一部分組成： 135468.doc -14- 200924795 (a) SEQ ID N〇: 3之胺基酸 936·946 ;及㈨ seq ι〇 n〇:仏 胺基酸1389-1401 ;及醫藥學上可接受之載劑。 在另-態樣中，本發明以治療或預防受檢者之視力損失 之方法為特徵。如本文中所使用，術語"治療"係指對受檢 者之病症或疾病之任何治療，且包括（但$限於），在可能 易患病症或疾病，但還未診斷為患有病症或疾病之受檢者 • 中預防病症或疾病發生；抑制病症或疾病，例如阻止病症 ❹ 或疾病之發展：減輕病症或疾病，例如使病症或疾病好 轉，或減輕由疾病或病症引起之病狀，例如終止或改善疾 病或病症之症狀。如本文中所使用，與受檢者之疾病或病 症相關之術語"預防"意謂疾病或病症還未發生時無疾病或 病症發展，或病症或疾病已發展時，無進一步之病症或疾 病發展。該方法包括向受檢者投予有效調控至少一種補體 蛋白質之活性或含量或由補體路徑介導之細胞活性之量的 包括本文中所述之C3b結合分子之醫藥組合物。在一些方 〇 法中，欠檢者具有與黃斑退化相關之病狀或病症》在其他 方法中，受檢者處於發展與黃斑退化相關之病症之風險 中。在一些方法中，受檢者未患除黃斑退化相關病症外之 補體相關疾病。詳言之，所調控之補體蛋白質為受檢者之 - C3轉化酶或C5轉化酶酶促活性。 可向受檢者投予之量為有效抑制MAC、C5a產生或（^裂 解產物（諸如C3a ' C3b、iC3b)形成之量。詳言之，補體活 化產物（包括（但不限於）C3a及/或C5a)之濃度在受檢者之血 液中相對於在投予醫藥組合物前之基線含量可降低至少 I35468.doc 200924795 5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%或 75%。 可用本發明之方法治療之其他疾病或病症包括（但不限 於），年齡相關黃斑病症、北卡羅來納黃斑營養不良（North

Carolina macular dystrophy)、Sorsby 眼底營養不良、 Stargardt氏病、圖案營養不良（pattern dystrophy)、Best氏 * 病、顯性脈絡膜小庞及放射狀玻璃膜小疲（malattia 為 leventinese)、視網膜脫離、脈絡膜網退化、視網膜退化、 感光器退化、RPE退化、黏多酷病（muc〇p〇iysaccharid〇ses)、 ® 視桿-視錐營養不良、視錐-視桿營養不良、視錐退化、絲

球體腎炎、陣發性夜間血紅素尿症（PNH)、降低與體外循 環相關之免疫及止血系統之功能障礙、神經病症、多發性 硬化症、中風、Guillain Barre症候群、創傷性腦損傷、帕 金森氏病（Parkinson’s disease)、具有不當或不良補體活化 之病症、血液透析併發症、超急性同種異體移植排斥、異 種移植排斥、在IL-2療法期間介白素_2誘發之毒性、發炎 〇 性病症、自體免疫疾病之炎症、克羅恩氏病（Crohn'S disease)、成人呼吸窘迫症候群、包括灼傷或凍傷之溫度 損傷、缺血性再灌注後病狀、心肌梗塞、氣球血管成形 . 術、心肺旁路或腎旁路中之泵後症候群（post_pump - Syndr〇me)、血液透析、腎缺血、無脈重建後之腸系膜動 脈再灌注、傳染性疾病或敗血症、免疫複合物病症及自體 免疫疾病、類風濕性關節炎、全身性紅斑狼瘡（sle) ' 腎炎、增生性腎炎、溶血性貧血及重症肌無力。另外，其 他已知補體相關疾病為肺部疾病及病症，諸如呼吸困難、 135468.doc •16. 200924795 咳企、ARDS、哮喘、慢性阻塞性肺病（c〇pD)、肺氣腫、 肺。卩栓塞及梗塞、肺炎、纖維發生性塵病、惰性粉塵及礦 物質（例如，矽、煤粉、鈹及石棉）、肺纖維化、有機塵 病、化學品損傷（歸因於刺激性氣體及化學品，例如氣、 光氣、二氧化硫、硫化氫、二氧化氮、氨及鹽酸）、煙霧 損傷、溫度損傷（例如灼傷、冷凍）、哮喘、過敏症、支氣 管收縮、過敏性肺炎、寄生疾病、G〇〇dpasture氏症候群、 肺血管炎、免疫複合物相關之炎症、自體免疫心臟病、多 發性硬化症、發炎性腸病、局部缺血再灌注損傷、 BarraqUer-Simons症候群、血液透析、全身性狼瘡、紅斑 狼瘡、牛皮癖、多發性硬化症、移植、中樞神經系統疾病 (諸如阿茲海默氏病（Alzheimer,s disease)及其他神經退化 性病狀）、aHUS、大皰性類天疱瘡或MpGN π。 本發明之醫藥組合物可經由此項技術中已知之路線投 予，例如皮下投予、靜脈内投予或包括玻璃體内投予之眼 内投予。 本發明之一或多個特徵之細節陳述於下文隨附圖示及描 述中。本發明之其他特徵、目標及優點將自描述及圖示及 申凊專利範圍而明顯β 【實施方式】 在典型及替代補體路徑中，本發明者均已發現識別且結 合C3b neo抗原決定基、調控⑺及/或以轉化酶之生物活性 及MAC產生之結合分子。該等結合分子可用於預防及，或 治療與典型及/或替代補體路徑之異常活性相關之疾病， 135468.doc 200924795 諸如’如本文中所述之眼睛病症、與黃斑退化相關之病狀 及非眼睛病症。 因此’本發明提供與C3b neo抗原決定基結合之分子， 諸如人類抗體及其片段’其調控補體蛋白質及/或由補體 路徑介導之細胞活性^ C3b之Neo抗原決定基及製造及使 用該等neo抗原決定基之方法亦提供於本文中。 如本文中所使用’ "neo抗原決定基"或"neo抗原"可互換 ©使用’且為在使C3蛋白水解裂解後存在於C3b上之蛋白質 之抗原部分。在還未裂解之⑺上該等neo抗原決定基不可 接近。 術語"與黃斑退化相關之病狀或病症"係指許多病狀中之 任何病狀’在該等病狀中視網膜黃斑（例如）由於黃斑細胞 生長降低、黃斑細胞（例如RPE細胞）之死亡或重排增加、 喪失正常生物功能或該等事件之組合而退化或變得功能異 常。黃斑退化造成正常黃斑喪失細胞及/或細胞外基質之 Φ 組織架構完整性及/或黃斑細胞喪失功能。黃斑退化相關 病症之實例包括AMD、北卡羅來納黃斑營養不良、s〇rsby 眼底營養不良、Stargardt氏病、圖案營養不良、Best氏 病、顯性脈絡膜小疲及放射狀玻璃膜小疲（徑向脈絡膜小 * 疣該術語亦涵蓋在黃斑功能異常及/或退化之前或之後

發生之黃斑外改變。因此，術語”黃斑退化相關病症"亦廣 泛地包括改變或損害黃斑之完整性或功能（例如，對RPE或 Bruch膜之損害）之任何病狀。舉例而言，該術語涵蓋視網 膜脫離、脈絡膜網退化、視網膜退化、感光器退化、rPE 135468.doc -18- 200924795 退化、黏多醣病、視桿_視錐營養不良、視錐-視桿營養不 良及視錐退化。 術語"補體成份"、"補體蛋白質"或"補體成份蛋白質"係 指補體系統之活化中所涉及之分子。典型路徑成份包括 (例如）Clq、Clr、Cls、C4、C2、C3、C5、C6、C7、 C8、C9及C5b-9複合物（膜攻擊複合物：MAC)。替代路徑 成份包括（例如）因子B、因子D、備解素（properdin)、Η及 I ° ® 術語”調控（modu丨ation)"或”調控（m〇dulate)"在本文中可 互換使用以指活性或生物過程（例如，補體過程）之上調（亦 即’活化或刺激（例如，藉由促效（ag〇nizing)或強化））及下 調（亦即，抑制或抑止（例如，藉由對抗、降低或抑制。 "調控"欲描述使過程上調或下調。藉由某些刺激劑上調之 過程可藉由彼刺激劑之拮抗劑來抑制。相反地，藉由某些 改質劑下調之過程可藉由彼改質劑之促效劑來抑制。 〇 術語"補體路徑相關之分子"、"補體路徑分子"及”補體路 桎相關之蛋白質"可互換使用且係指在補體活化及由經活 化補體系統介導、回應於經活化補體系統或由經活化補體 系統觸發之下游細胞活性中起作用的各種分子。其包括補 . 體路徑之引發劑（亦即，直接或間接觸發補體系統活化之 分子）、在補體活化期間產生或在補體活化中起作用之分 子（例如，補體蛋白質/酶，諸如C3、C5、C5b_9、因子B、 因子D、MASP-1及MASP-2)、補體受體或抑制劑（例如’ 叢集蛋白、玻璃連結蛋白（vitronectin)、CR1或CD59)及由 135468.doc • 19- 200924795 經活化補體系統調節或觸發之分子（例如，膜攻擊複合物_ 抑制因子’ MACIF ;參見（例如）’ Sugita等人’ J Biochem， 106:589-92，1989) »因此，除本文中所註明之補體蛋白質 外’補體路徑相關之分子亦包括（例如）C3/C5轉化酶調節 劑（RCA) ’諸如1型補體受體（亦稱為CR1或CD35)、2型補 體受體（亦稱為CR2或CD21)、膜輔因子蛋白質（MCP或 CD46)及C4bBP ; MAC調節劑，諸如玻璃連結蛋白、叢集 蛋白（亦稱為”SP40、40")、CRP、CD59及同源限制因子 (HRF);免疫球蛋白鏈，諸如IgK、IgX或；C1抑制劑； 及其他蛋白質，諸如CR3、CR4(CD11 b/18)及 DAF(CD55)。 術語"受補體路徑調節之細胞活性"包括因C5b-9攻擊複 合物、血管滲透性改變、平滑肌細胞之收縮及遷移、T細 胞增殖、免疫黏附、樹突狀細胞、單核細胞、粒細胞及血 小板之凝集、呑噬作用、嗜中性白血球（PMN)及巨噬細胞 之遷移及活化產生之細胞損傷。 另外’補體路徑之活化使得由補體路徑内之副產物導致 之促發炎反應增加。與補體路徑之活化相關之病症包括腎 炎、哮喘、再灌注損傷、血液透析、類風濕性關節炎、全 身性狼瘡、牛皮癖、多發性硬化症、移植、阿茲海默氏 病、aHUS、MPGN II或任何其他補體介導之疾病。與黃斑 退化相關之病症包括AMD、北卡羅來納黃斑營養不良、 Sorsby眼底營養不良、Stargardt氏病、圖案營養不良、 Best氏病、顯性脈絡膜小疣及放射狀玻璃膜小疣（徑向脈絡 135468.doc •20- 200924795 膜小疣）、在黃斑之功能異常及/或退化之前或之後發生的 黃斑外改變、視網膜脫離、脈絡膜網退化、視網膜退化、 感光器退化、RPE退化、黏多醣病、視桿_視錐營養不良、 視錐-視桿營養不良及視錐退化。 如本文中所使用，術語"受檢者”包括任何人類或非人類 動物。 術語"非人類動物"包括所有非人類脊椎動物，例如哺乳 動物及非哺乳動物，諸如非人類靈長類動物、齧齒動物、 兔、綿羊、犬、貓、馬、母牛、鳥、兩棲動物、爬蟲動物 等。 如本文中所使用之術語"抗體"係指完整抗體或其抗原結 合片段（亦即抗原結合部分"）或單鏈（亦即，輕鍵或重 鏈）或模擬物。完整抗體為包含由二硫鍵相互連接之至少 兩條重鏈（H)及兩條輕鏈（L)之醣蛋白。各重鏈包含重鏈可 變區（本文中縮寫為Vh)及重鍵恒定區。重鍵怪定區包含3 個域，CH1、CH2及CH3。各輕鍵包含輕鍵可變區（本文甲 縮寫為VL)及輕鏈怪定區。輕鏈丨亙定區包含1個域Cl。Vh及 VL區可進一步再分成具有高變性之區域，稱為互補判定區 (CDR)，其間雜有更保守之區域，稱為構架區（FR)。各％ 及Vl包含3個CDR及4個FR，其自胺基末端至叛基末端以以 下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CIDR3、 FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用之結合 域。抗體之恆定區可介導免疫球蛋白與包括免疫系統之各 種細胞（例如效應細胞）及典型補體系統之第一成份（Clq)的 13S468.doc •21 · 200924795 宿主組織或因子之結合。 如本文中所使用之術語抗體之"抗原結合部分"或"結合 域"係指保留與給定抗原（例如C3b)特異性結合之能力的完 整抗體之一或多個片段。抗體之抗原結合功能可藉由完整 抗體之片段執行。涵蓋於術語抗體之„抗原結合部分"内之 結合片段的實例包括Fab片段，其為由VL、Vh、Cl^CH1 域組成之單價片段；F(ab)2片段，其為包含兩個由位於鉸 鏈區之二硫橋鍵連接之Fab片段（通常一個來自重鏈且一個 來自輕鏈）的二價片段；由VH及CH1域組成之Fd片段；由 抗體單臂之VL及VH域組成之Fv片段；單域抗體（dAb)片段 (Ward等人，1989 Nature 341:544-546)，其由組成； 及經分離互補判定區（CDR)。 此外’儘管Fv片段之2個域（VL及VH)由獨立基因編碼， 但其可使用重組方法藉由人工肽連接子接合，該連接子能 夠使其製造成VL及VH區配對以形成單價分子之單蛋白質鏈 (稱為單鏈Fv(scFv);參見（例如），Bird等人，1988 Science 242:423-426 ;及 Huston 等人，1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5 879-5883)。該等單鏈抗體包括抗體之一或多個"抗原 結合部分"。該等抗體片段係使用熟習此項技術者已知之 習知技術來獲得，且以與完整抗體相同之方式關於效用對 片段加以篩選。 抗原結合部分亦可併入單域抗體、最大抗體 (maxibody)、微型抗體（minib〇dy)、胞内抗體（intrabody)、 雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、v-NAR及雙-scFv 135468.doc -22· 200924795 中（參見（例如），Hollinger 及 Hudson，2005, Nature Biotechnology，23, 9，1126-1136)。可將抗體之抗原結合部 分接枝至基於諸如III型纖維結合蛋白（Fn3)之多肽之骨架 中（參見美國專利第6,703，199號’其描述纖維結合蛋白多 肽單株抗體）。 抗原結合部分可併入包含一對串聯Fv區段（vh-CH1-Vh-CH1)之單鏈分子中，該等Fv區段連同互補輕鏈多肽形成一 對抗原結合區（Zapata等人 ’ 1995 Protein Eng. 8(10):1057-1062 ;及美國專利第5,641，870號）。 如本文中所使用之"經分離C3b結合分子"係指大體上不 含對除C3b外之抗原具有抗原特異性之分子的結合分子（例 如，特異性結合C3b之經分離抗體大體上不含特異性結合 除C3b外之抗原（諸如C3)之抗艎）。然而，特異性結合C3b 之經分離結合分子可具有對諸如來自其他物種之C3b分子 之其他抗原的交叉反應性。若經分離結合分子大體上不含 細胞物質，則其為”經純化的，，。 如本文中所使用之術語”單株抗體組合物"係指具有單一 分子組成之柷體分子之製劑。單株抗體組合物顯示對特定 抗原決定基之單一結合特異性及親和力。 如本文中所使用之術語"人類抗體"欲包括具有構架區及 CDR區均來源於具有人類起源之序列的可變區之抗體。此 外，若抗體含有恆定區，則恆定區亦來源於該等人類序 列，例如，人類生殖系序列或人類生殖系序列之突變型 式。本發明之人類抗體可包括並非由人類序列編碼之胺基 135468.doc -23 - ❹ ❹ 200924795 :二(例如’藉由活體外隨機或定點突變誘發或藉由活 ::細胞突變引入之突變)。然而，如本文中所使用之 術：人類抗體”並不欲包括來源於另一哺乳動物物種(諸如 小鼠）之生殖系的CDR序列已接枝至人類構架彳列上之抗 體。 術語"人類單株抗體"係指顯示單一結合特異性之抗體， 其具有構架區及CDR區係來源於人類序列之可變區。在一 態樣中’人類單株抗體係由融合瘤產生，該融合瘤包括與 永生化細胞融合的自轉殖基因非人類動物（例如，具有包 含人類重鏈轉殖基因及輕鏈轉殖基因之基因組之轉殖基因 小鼠）獲得之B細胞。 如本文中所使用之術語"重組人類抗體"包括藉由重組方 式製備、表現、產生或分離之任何人類抗體，諸如自人類 免疫球蛋白基因之轉殖基因或轉染色體動物（例如小鼠）或 自其製備之融合瘤分離之抗體；自經轉型以表現人類抗體 之宿主細胞（例如，自轉染瘤）分離之抗體；自重組組合人 類抗體集合庫分離之抗體；及藉由涉及所有或一部分人類 免疫球蛋白基因序列與另一 DNA序列煎接之任何其他方式 製備、表現、產生或分離之抗體。該等重組人類抗體具有 構架區及CDR區係來源於人類生殖系免疫球蛋白序列之可 變區。然而’在某些態樣中’可使該等重組人類抗體經受 活體外突變誘發（或，當使用人類Ig序列之轉基因動物時， 則為活體内體細胞突變誘發）且因此，重組抗體之VH及 區之胺基酸序列為當來源於人類生殖系Vh及VL序列且與人 135468.doc -24· 200924795 類生殖系vh&Vl序列相關時，可不天然存在於人類之人類 抗體生殖系全套内之序列。 如本文中所使用，"同型"係指由重鏈恆定區基因編碼之 抗體種類（例如，IgM、IgE、IgG，諸如igGl或igG4)。 短語"識別抗原之抗體"或”對抗原具有特異性之抗體"在 本文中可與術語"與抗原特異性結合之抗體，，互換使用。 如本文中所使用’當提及IgG抗體時，術語"高親和力” 指示對標無抗原具有1 〇·9 Μ或1 〇·9 Μ以下之KD之抗體。 如本文中所使用，"與C3b特異性結合，，之C3b結合分子 (例如’抗體或其抗原結合部分）欲指以1χ10-7Μ41χ1〇.7Μ 以下之KD與C3b結合之C3b結合分子。本發明之較佳結合 分子以等於或小於1 nM(例如，〇.〇1 nM、0.1 nM、0.25 nM、0.5 nM)之KD與C3b neo抗原決定基結合。 與抗原交又反應之C3b結合分子（例如，抗體）係指以i χ 1〇·6 Μ或1χ1〇_6 Μ以下之KD結合彼抗原之C3b結合分子。 在一特定實施例中，C3b結合分子以與人類C3b結合之KD 的5-10倍内之KD與非人類靈長類動物（例如食蟹猴）之C3b neo抗原決定_基結合。在另一特定實施例中，C3b結合分子 以等於與人類之100倍或在與人類之100倍内的Kd與小鼠 C3b neo抗原決定基結合。 不與給定抗原交又反應之C3b結合分子（例如，抗體）係 指不與給定抗原可彳貞測結合，或不以1X1 (Γ5 Μ或更大之KD 結合之C3b結合分子。在某些態樣中’不與抗原交又反應 之該等結合分子在標準結合檢定中’針對該等蛋白質展現 135468.doc -25- 200924795 基本上不可偵測之結合。 C3b結合分子 本發明之結合分子與具有與以下neo抗原決定基中之一 或多者至少90%—致之胺基酸序列的C3b之neo抗原決定基 結合： 表1

C3b鏈 序列 胺基酸# (胺基酸#1 為起始Μ (甲硫胺酸)） 胺基酸序列 SEQ ID NO β 393 GEDTVQSLTQG 1 α 752 DEDIIAEENIVSRSEF 2 α 936 IRMNKTVAVRT 3 α 968 SDQVPDTESET 4 α 987 VAQMTED 5 α 1069 FVKRAP 6 α 1215 KDKNRWEDPGKQLYN 7 α 1388 CTRYRGDQDATMS δ α 1410 GFAPDTDDLKQLANGV 9 β 178 DSLSSQNQLGVL 10 β 292 PIEDGSGEVVLSRK 11 β 310 GVQNPRAEDLVG 12 β 380 DGSPAYR 13 β 392 QGEDTVQSL 14 β 428 KQELSEAE 15 β 507 VREPGQDLVVLP 16 β 564 WKSGQSEDRQPVPG 17 α 775 VEDLKEPPKN 18 α 852 YNYRQNQELKVR 19 135468.doc -26- 200924795 α 876 ATTKRRHQQT 20 α 919 HFISDGVRKSLK 21 α 968 SDQVPDTESET 22 α 1006 TPSGCGEQN 23 α 1047 ELIKKGYT 24 α 1110 EKQKPDGVFQED 25 α 1133 LRNNNEKDM 26 α 1212 TTAKDKNRWEDPGKQ 27 α 1388 CTRYRGDQDATMS 28 α 1410 GFAPDTDDLKQLANGV 29 α 1453 HSEDDCLAFK 30 α 1571 SGSDEVQVGQQR 31 α 1607 LSSDFWGEKPNL 32 α 1634 EDECQDEENQKQCQD 33 β 94 NREFKSEKG 34 β 404 QNL 35 α 1368 ETEKRPQDA 36 α 1517 SD 37 表1之胺基酸係根據SwissProt資料庫（www.expasy.org)中之 C03_HUMAN登錄（entry)中所說明之準則來編號。 C3b結合分子可與線性或非線性抗原決定基特異性結 合，包括選自表1之neo抗原決定基。本發明中包括與調控 C3b生物活性之非線性抗原決定基結合之結合分子。 C3b結合分子包括（例如）與C3b neo抗原決定基結合之抗 體（呈游離或複合形式），及包括該等抗體之抗原結合部分 之多肽。C3b結合分子亦包括結合部分並非來源於抗體之 分子，例如，來源於具有類免疫球蛋白摺疊之多肽之C3b 結合分子；及抗原結合部分經由隨機化、選擇及親和力成 135468.doc -27- 200924795 熟加以遺傳工程處理，以結合C3b neo抗原決定基之分 子。較佳C3b結合分子包括抗體、其片段或包含抗體或其 片段之人工構築體或經設計以模擬抗體或其片段之結合之 人工構築體。 本發明亦以不為抗體之C3b結合分子為特徵。該等C3b 結合分子包括C3b結合域，其具有與來源於非抗體多肽之 類免疫球蛋白（類Ig)摺疊之胺基酸至少60%、65%、75%、 80%、85%或90% —致之胺基酸序列，該非抗體多肽係諸 如以下各物中之一者：固生蛋白（tenascin)、N-約黏附蛋白 (N-cadherin)、E-Ι弓黏附蛋白、ICAM、肌聯蛋白（titin)、 GCSF受體、細胞激素受體、糖苷酶抑制劑、抗生素色蛋 白、髓鞘膜黏附分子P〇、CD8、CD4、CD2、I類MHC、T 細胞抗原受體、CD1、C2及VCAM-1之I組域、肌球蛋白結 合蛋白C之I組免疫球蛋白域、肌球蛋白結合蛋白Η之I組免 疫球蛋白域、端蛋白（telokin)之I組免疫球蛋白域、 NCAM、顫搐蛋白（twitchin)、神經膠質蛋白（neuroglian)、 生長激素受體、紅血球生成素受體、促乳素（prolactin)受 體、干擾素-γ受體、β-半乳糖苷酶/葡糖醛酸酶、α-葡糖醛 酸酶、轉麩胺酸酶、Τ細胞抗原受體、過氧化物歧化酶、 組織因子域、細胞色素F、綠色螢光蛋白、GroEL或祝馬 丁（thaumatin)。一般而言，C3b結合域之胺基酸序列相對 於類免疫球蛋白摺疊之胺基酸序列經改變，以使得C3b結 合域與C3b neo抗原決定基特異性結合（亦即，其中類免疫 球蛋白摺疊不與C3特異性結合）。 135468.doc • 28 - 200924795 C3b結合域之胺基酸序列與纖維結合蛋白、細胞激素受 體或鈣黏附蛋白之類免疫球蛋白摺疊之胺基酸序列至少 60%—致（例如，至少 65%、75°/〇、80%、85% 或 90%— 致）。 C3b結合分子特異性結合及調控C3b之許多生物活性中 之一或多者。因此，本發明以抑制備解素、因子Η、因子 Β、因子I、膜輔因子及/或其複合物之C3b結合之C3b結合 分子為特徵。C3b結合分子亦相對於對照（例如，相對於在 C3b結合分子不存在情況下之結合）抑制MAC之C3b形成至 少 5°/。、10%、15%、25%或 50%。 本發明之C3b結合分子抑制C3b與C3轉化酶（例如，雙分 子複合物C3bBb)之結合以阻斷在替代路徑中形成C5轉化 酶（例如，C3bBbC3b，一種三分子複合物）。在另一態樣 中，C3b結合分子抑制C3b與C3轉化酶（例如，雙分子複合 物C4bC2a)之結合以阻斷在典型路徑中形成C5轉化酶（例 如，三分子複合物C3bC4bC2a)。該等生物學活性係由在涉 及C3蛋白質裂解之反饋迴路中之競爭性結合機制產生。因 此，C3b結合分子相對於對照（例如，相對於在C3b結合分 子不存在情況下之活性）抑制C3裂解至少5%、10%、 15%、25%或 50%。 如根據此項技術中已知且本文中所述之方法所測定，應 瞭解，抑制或調控C3b生物活性中之一或多者（例如，由於 補體路徑活化產生之生物化學活性、細胞活性、生理學活 性或其他生物學活性）之C3b結合分子，相對於在C3b結合 135468.doc -29- 200924795 分子不存在情況下（例如，在具有不相關特異性之對照分 子存在之情況下）所見之特定功能特性而言，產生特定功 能特性之統計學顯著降低。調控C3b生物活性之C3b結合 分子實現所量測參數之至少5%之該統計學顯著降低。在 某些態樣中，C3b結合分子與對照相比，可使所選功能特 性降低至少10°/〇、20%、30%或50%。 此項技術中已知評估分子與各種物種之C3b及C3b之特 定抗原決定基結合的能力之標準檢定，包括（例如）ELISA 及西方墨點法（Western blot)。可使用肽抗原決定基競爭檢 定確定C3b結合分子是否與C3b之特定抗原決定基結合。 舉例而言，在肽之飽和濃度下，用相應於所關注C3b抗原 決定基之肽培養C3b結合分子。（例如）藉由Biacore®分析測 試預培養C3b結合分子與經固定C3b之結合。用肽預培養 對C3b結合之抑制表明C3b結合分子與肽抗原決定基結合 (參見（例如）美國專利公開案20070072797)。結合動力學亦 可藉由此項技術中已知之標準檢定，諸如藉由Biacore®分 析來評估。評估C3b結合分子對C3b之功能特性之影響的 檢定進一步詳細描述於下文中。 可藉由量測（例如）：（a)在活體外檢定中患者血清阻斷紅 血球溶血之能力；（b)血清C3a或C5a含量；（c)血漿、組織 及或諸如眼睛物質或成份之其他生物成份中之可溶性MAC 含量來測定C3b抑制。在C3b結合分子存在下C5a、C3a或 C5b-9含量之降低表明C3b結合分子抑制C3b及/或其生物活 性0 135468.doc -30- 200924795 對於偵測可使用來自受檢者之各種生物樣本’例如，自 任何器官、組織或細胞以及血液、尿或其他體液（例如， 眼睛液體）獲得之樣本。對一些診斷方法而言，一較佳樣 本為眼睛液體。對一些其他方法而言，一較佳組織樣本為 全血及自其獲得之產物，諸如血漿及血清。血液樣本可自 取自（例如）Guthrie卡之血點獲得。組織樣本之其他來源為 皮膚、毛髮、尿、唾液、精液、糞便、汗、奶、羊水、 肝、心臟、肌肉、腎及其他身體器官。組織之其他來源為 由受檢者之初級細胞繁殖之細胞系。組織樣本通常經溶解 以釋放樣本内細胞之蛋白質及/或核酸内含物。可隨後在 分析¥』’使來自該等粗溶胞物之蛋白質部分經受部分或完 全純化。 可供以本發明之C3b結合分子治療之其他受檢者包括除 黃斑退化相關病症外’無已知補體相關疾病之個體。此項 技術中已描述補體相關疾病或病症，例如，描述於美國專 利第6，169,068號中。已知補體相關疾病之實例包括：神經 學病症、多發性硬化症、中風、Guillain Barre症候群、創 傷性腦損傷、帕金森氏病、具有不當或不良補體活化之病 症、血液透析併發症、超急性同種異體移植排斥、異種移 植排斥、在IL-2療法期間介白素-2誘發之毒性、發炎性病 症、自體免疫疾病之炎症、克羅恩氏病、成人呼吸窘迫症 候群、包括灼傷或凍傷之溫度損傷、缺血性再灌注後病 狀、心肌梗塞、氣球血管成形術、心肺旁路或腎旁路中之 栗後症候群、血液透析、腎缺血、無脈重建後之腸系膜動 135468.doc -31 · 200924795 脈再灌注、傳染性疾病或敗血症、免疫複合物病症及自禮 免疫疾病、類風濕性關節炎、全身性紅斑狼瘡（Sle)、SLE 腎炎、增生性腎炎、溶血性貧血及重症肌無力。另外，其 他已知補體相關疾病為肺部疾病及病症，諸如呼吸困難、 咳血、ARDS、哮喘、慢性阻塞性肺病（c〇pD)、肺氣腫、 • 肺栓塞及梗塞、肺炎、纖維發生性塵病、惰性粉塵及礦物 質（例如，石夕、煤粉、鈹及石棉）、肺纖維化、有機塵病、 化學品損傷（歸因於刺激性氣體及化學品，例如氣、光 氣、二氧化硫、硫化氫、二氧化氮、氨及鹽酸）、煙霧損 傷、溫度損傷（例如灼傷、冷凍）、哮喘、過敏症、支氣管 收縮、過敏性肺炎、寄生疾病、G〇〇dpasture氏症候群、肺 血管炎及免疫複合物相關之炎症。 亦可用治療與黃斑退化相關之病狀之已知方法，諸如如 美國專利第6,218,368號中所述之抗生素治療，向欲用本發 明之治療劑治療之受檢者投予其他治療劑。在其他治療 ❿ 中，諸如環孢素（cyclosporine)之免疫抑制劑為能夠抑制免 疫反應之藥劑。該等藥劑包括細胞毒性藥物、皮質類固 醇、非類固醇消炎藥（NSAID)、特異性τ淋巴細胞免疫抑 制劑及其抗體或片段（參見Physicians，Desk Reference，第

53版，Medical Economics Company Inc，M〇ntvale，NJ (1999))。免疫抑制治療通常以一定時間間隔持續一週、一 個月、3個月、6個月或一年之時期。在一些患者中，投予 治療歷時至多患者之餘生。 抗艘 135468.doc -32- 200924795 本文中所述之抗C3b抗體包括人類單株抗體。在一些態 樣中，與C3b結合之抗體之抗原結合部分（例如，VH及VL 鏈）"經混合且匹配”以產生其他抗C3b結合分子。該等"經 混合且匹配”抗體之結合可使用上述結合檢定（例如ELISA) 來測試。當選擇與特定VL序列混合且匹配之VH時，通常選 擇在結構上與其在與彼VL配對中置換之VH相似之VH。同 樣地，來自特定全長重鏈/全長輕鏈對之全長重鏈序列通 常以結構上相似之全長重鏈序列置換。同樣地，來自特定 VH/VL對之VL序列應以結構上相似之VL序列置換。同樣 地，來自特定全長重鏈/全長輕鏈對之全長輕鏈序列應以 結構上相似之全長輕鏈序列置換。在該情況下鑑別結構相 似性為此項技術中熟知之方法。 在其他態樣中，本發明提供包含呈各種組合形式之一或 多種C3b結合抗體之重鏈及輕鏈CDR1、CDR2及CDR3之抗 體。假定該等抗體中之每一者可與C3b結合且抗原結合特 異性主要由CDR1、2及3區提供，那麼VH CDR1、2及3序 列及Vl CDR1、2及3序列可"經混合且匹配"（亦即，來自不 同抗體之CDR可經混合且匹配）。該等’'經混合且匹配''抗體 之C3b結合可使用本文中所述之結合檢定（例如ELISA)來測 試。當VH CDR序列經混合且匹配時，來自特定VH序列之 CDR1、CDR2及/或CDR3序列應以結構上相似之CDR序列 置換。同樣地，當VL CDR序列經混合且匹配時，來自特 定VL序列之CDR1、CDR2及/或CDR3序列應以結構上相似 之CDR序列置換。在該情況下鑑別結構相似性為此項技術 135468.doc -33· 200924795 中熟知之方法。 如本文中所使用，人類抗體包含重鏈或輕鏈可變區或全 長重鏈或輕鏈，若抗體之可變區或全長鏈係自使用人類生 殖系免疫球蛋白基因作為序列來源之系統獲得，則該等重 鏈或輕鏈可變區或全長重鏈或輕鏈為特定生殖系序列之 ”產物"或"來源於"特定生殖系序列。在一個該系統中，人 類抗體係在帶有人類免疫球蛋白基因之轉殖基因小鼠中產 生。用所關注抗原（例如，本文中所述之C3b之neo抗原決 定基）使轉殖基因小鼠免疫。或者，藉由提供在噬菌體上 呈現之人類免疫球蛋白基因集合庫且以所關注抗原（例 如，本文中所述之C3b或C3b neo抗原決定基）篩選集合庫 來鑑別人類抗體。 為人類生殖系免疫球蛋白序列之"產物"或”來源於"人類 生殖系免疫球蛋白序列之人類抗體可因而藉由將該人類抗 體之胺基酸序列與人類生殖系免疫球蛋白之胺基酸序列相 比較，及選擇序列最接近（亦即最大一致性百分比）該人類 抗體之序列的人類生殖系免疫球蛋白序列來鑑別。為特定 人類生殖系免疫球蛋白序列之"產物”或"來源於”特定人類 生殖系免疫球蛋白序列之人類抗體與編碼生殖系的序列相 比較，可含有胺基酸差異，其歸因於（例如）天然存在之體 細胞突變或人工定點突變。然而，所選人類抗體通常具有 與由人類生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列至少 90%—致之胺基酸序列，且含有當與其他物種之生殖系免 疫球蛋白胺基酸序列（例如’鼠類生殖系序列）相比較時使 135468.doc -34- 200924795 該人類抗體鑑別為人類抗體的胺基酸殘基。在某些狀^兄 下，人類抗體之胺基酸序列可與由生殖系免疫球蛋白基因 編碼之胺基酸序列至少60%、70%、80%、90 %或至少 95%，或甚至至少96%、97%、98%或99%—致。 兩條序列之間的一致性百分比為該等序列所共有之相同 位置數的函數（亦即，一致性百分比=相同位置數/位置總數 X 100) ’其考慮到為兩條序列之最佳對準所需要引入的間 隙數及各間隙之長度。可使用已併入ALIGN程式（2.0版）中 ® 之E. Meyers及 W. Miller(l988 Comput. Appl. Biosci.，4:11 _ 17)之算法，使用PAM120加權殘基表、間隙長度罰分12及 間隙罰分4來測定兩條序列之間的序列比較及一致性百分 比之確定。 通常，來源於特定人類生殖系序列之人類抗體之Vh或 Vl與由人類生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列將顯 示不超過10個胺基酸的差異》在某些狀況下，人類抗體之 ❿ VH或Vl與由生殖系免疫球蛋白基因編瑪之胺基酸序列可顯 示不超過5個，甚至不超過4、3、2或1個胺基酸的差異。 絡熬抗艘（Camelid antibody) 自駱駝及單峰駱駝（雙峰駝（Cawe/wj 及單峰 駝办⑽家族之成員，包括諸如美洲駝 (llama)物種（小羊駝%cc〇5)、原駝《化所幻及南 美駝馬Wc叹似)）之新世界成員所獲得之抗體蛋白質 已就尺f、結構複雜性及對人類受檢者之抗原性加以表 徵。在該哺礼動物家族令天然存在之某些妙抗體缺乏輕 135468.doc •35- 200924795 鏈，且因此在結構上不同於對來自其他動物之抗體而言典 型之具有兩條重鏈及兩條輕鏈的四鏈四級結構。參見wo 94/04678 ° 已鑑別為VHH之小型單一可變域之駱駝抗體的區域可藉 由遺傳工程得到，以產生對標靶具有高親和力之小蛋白 質，產生稱為"駱駝奈米抗體"之低分子量抗體衍生蛋白 質。參見美國專利第5,759,808號；亦參見，Stijlemans等 人，2004 J. Biol. Chem. 279: 1256-1261 ; Dumoulin等人， ❹ 2003 Nature 424: 783-788 ; Pleschberger 等人，2003

Bioconjugate Chem. 14: 440-448 ; Cortez-Retamozo 等人， 2002 Int. J. Cancer 89: 456-62 ;及 Lauwereys.等人，1998 EMBO J. 17: 3 512-3 520。駱駝抗體及抗體片段之經遺傳工 程處理之集合庫可購自（例如）比利時Ghent市Ablynx公司。 如同其他非人類起源之抗體，駱駝抗體之胺基酸序列可經 重組改變，以獲得更接近類似人類序列之序列，亦即，奈 ^ 米抗體可經"人化"。因此，可進一步降低駱駝抗體對人類 φ 之天然低抗原性。 駱駝奈米抗體的分子量為人類IgG分子分子量之約十分 之一，且蛋白質之物理直徑僅幾奈米。小尺寸結果之一為 • 駱駝奈米抗體有能力與功能上被較大抗體蛋白質遮蔽之抗 原位點結合，亦即，駱駝奈米抗體適用作偵測本來無法使 用典型免疫學技術偵測之抗原之試劑，及用作可能的治療 劑。因此，小尺寸之另一結果為駱駝奈米抗體可基於與標 靶蛋白質之凹槽或狹窄間隙中之特定位點的結合來抑制， 135468.doc -36- 200924795 且因此可提供比典型抗體具有更接近類似典型低分子量藥 物之功能的能力。 低分子量及緊致尺寸進一步產生極具熱穩定性、對極端 pH且對蛋白水解消化穩定且抗原性低之駱駝奈米抗體。另 一結果為’路秘奈米抗體容易自循環系統移動至組織中， 且甚至穿過血腦障壁’且可治療影響神經組織之病症。奈 米抗體可另外促進藥物跨越血腦障壁進行輸送。參見2〇〇4 年8月19曰公開之美國專利公開案第2〇〇4〇161738號。與在 ® 人類中之低抗原性組合之該等特徵表明極大治療潛力。另 外，該等分子可在諸如大腸桿菌（五c〇/〇之原核細胞中充 分表現。 因此’本發明之特徵為對C3b具有高親和力之駱駝抗體 或路馬它奈米抗體。在本文中之某些態樣中，駱駝抗體或奈 米抗體係在駱駝動物中天然產生，亦即，使用本文中關於 其他抗體所述之技術’由駱駝在經C3b或其肽片段免疫後 ❽ 產生。或者’將抗C3b駱駝奈米抗體進行遺傳工程處理， 亦即’藉由（例如）使用以本文中所述之C3b或C3b neo抗原 決定基作為標靶之淘選程序，自呈現經適當突變之駱駝奈 ' 米抗體蛋白質之噬菌體集合庫選擇來產生。經遺傳工程處 • 理之奈米抗體可進一步藉由遺傳工程處理定製以使在受體 受檢者中之半衰期自45分鐘增加至2週。 雙功能抗體 雙功能抗體為二價、雙特異性分子，其中^及Vl域表 現於單一多肽鏈上’由過短以致同一鏈上之兩個域之間不 135468.doc •37- 200924795 允許配對的連接子連接。vH及vL域與另一鏈之互補域配 對，進而產生兩個抗原結合位點（參見（例如），Holliger等 人，1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 ； Poljak 等人，1994 Structure 2:1121-1123)。雙功能抗體可藉由在 相同細胞内表現兩條具有結構VHA-VLB及VHB-VLA(VH-VL構 型）或VLA-VHB及VLB-VHA(VL-VH構型）之多肽鏈來產生。其 中大多數可在細菌中以可溶形式表現。 單鏈雙功能抗體（scDb)係藉由用具有約15個胺基酸殘基 之連接子將兩條形成雙功能抗體之多肽鏈加以連接來產生 (參見 Holliger及 Winter，1997 Cancer Immunol. Immunother·， 45(3-4):128-30 ; Wu等人，1996 Immunotechnology，2(1): 21-3 6)。scDb可在細菌中以可溶活性單體形式表現（參見 Holliger 及 Winter， 1997 Cancer Immunol. Immunother.， 45(34):128-30 ; Wu等人，1996 Immunotechnology，2(1): 21-36 ; Pluckthun 及 Pack, 1997 Immunotechnology，3(2): 83-105 ; Ridgway等人，1 996 Protein Eng.，9(7):617-21)。 可將雙功能抗體與Fc融合以產生"雙-雙功能抗體"（參見 Lu等人，2004 J. Biol. Chem·，279(4):2856-65)。 遺傳工程處理及經修飾抗體 本發明之抗體可使用具有一或多個Vh及/或VL序列之抗 體作為遺傳工程處理之經修飾抗體之起始物質來製備，該 經修飾抗體可具有與起始抗體相比經改變之性質。抗體可 藉由修飾一或兩個可變區（亦即，Vh及/或Vl)中，例如一 或多個CDR區中及/或一或多個構架區中之一或多個殘基 135468.doc -38- 200924795 進行遺傳工程處理。另外或其他，抗體可藉由修飾恆定區 中之殘基來進行遺傳工程處理（例如）以改變抗體之效應功 能。 可執行之可變區遺傳工程處理之一種類型為CDR接枝。 抗體主要經由位於6個重鍵及輕鍵CDR中之胺基酸殘基與 標把抗原相互作用。出於該原因，在個別抗體之間，CDR 内之胺基酸序列與CDR外之序列相比更具多樣性。因為 CDR序列負責大多數抗體-抗原相互作用，所以有可能藉 由建構包括來自特定天然存在抗體的接枝至來自具有不同 性質之不同抗體的構架序列上之CDR序列的表現載體來表 現模擬特定天然存在抗體之性質之重組抗體（參見（例如）， Riechmann等人，1998 Nature 332:323-327 ; Jones等人， 1986 Nature 321:522-525 ; Queen等人，1989 Proc. Natl. Acad。參見 U.S.A. 86:10029-10033 ;美國專利第 5,225,539 號及美國專利第5,530,101號；第5,585,089號；第 5,693,762號及第 6，180,370號）》 構架序列可自公共DNA資料庫或包括生殖系抗體基因序 列之公開參考文獻獲得。舉例而言’人類重鏈及輕鏈可變 區基因之生殖系DNA序列可見於"VBase"人類生殖系序列 資料庫中（可以www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase在網際網路上 得到），以及見於 Kabat 等人 ’ 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版，U.S. Department of Health and Human Services，NIH 公開案第 91-3242 號； Tomlinson等人 ’ 1992 J. Mol. Biol. 227:776-798 ;及 Cox等 135468.doc •39· 200924795 人，1994 Eur. J，Immunol 24:827 836中；該等文獻每一者 之内容明確地以引用之方式併入本文中。 可將VH CDR1、2及3序列及Vl CDR1、2及3序列接枝至 具有與構架序列所來源之生殖系免疫球蛋白基因中所見的 彼序列一致之序列的構架區上，或者可將CDR序列接枝至 與生殖系序列相比含有一或多個突變之構架區上。舉例而 言’已發現在某些情況下，使構架區内之殘基突變以維持 或增強抗體之抗原結合能力為有益的（參見（例如），美國專 利第 5,530，101 號；第 5,585,089 號；第 5,693,762 號及第 6,180,370號）° 亦可將CDR接枝至除免疫球蛋白域外之多肽之構架區 中。適當骨架形成呈現所接枝殘基之構型穩定構架以使得 其形成形成局部化表面且結合所關注之標把（例如C3b抗 原）。舉例而言，可將CDR接枝至構架區係基於以下各物 之骨架上：纖維結合蛋白、人錫蛋白（ankyrin)、脂質運載 蛋白（lipocalin)、新制癌菌素（neocarzinostain)、細胞色素 b、CP1鋅指、PST1、捲曲螺旋、LACI-D1、Z域或 tendramisat(參見（例如），Nygren 及 Uhlen，1997 Current Opinion in Structural Biology，7，463-469) 〇 另一類型之可變區修飾為使Vh及/或Vl CDR1、CDR2及/ 或CDR3區内之胺基酸殘基突變以進而改良所關注抗體之 一或多種結合性質（例如親和力）’稱為"親和力成熟"。可 執行定點突變誘發或PCR介導之突變誘發來引入突變’且 可以如本文中所述之活體外或活體内檢定評估對抗體結合 135468.doc -40- 200924795 或所關注之其他功能性質之影響。可引入保守性修飾。突 變可為胺基酸取代、添加或缺失。此外，通常改變CDR區 内之不超過1、2、3、4或5個殘基。 本發明之經遺傳工程處理之抗體包括已對Vh及/或&内 之構架殘基進行修飾（例如，以改良抗體之性質）之彼等抗 • 體。通常，進行該等構架修飾以降低抗體之免疫原性。舉 例而5 ，一種方法為使一或多個構架殘基"回復突變 (baCklnUtate)"成相應生殖系序列。更具體而言，已經歷體 細胞突變之抗體可含有不同於該抗體所來源之生殖系序列 之構架殘基《該等殘基可藉由將抗艎構架序列與該抗體所 來源之生殖系序列相比較來鑑別。為使構架區序列恢復為 其生殖系構型，可藉由（例如）定點突變誘發或1>(：11介導之 突變誘發來使體細胞突變"回復突變"成生殖系序列。該等 ”回復突變"抗體亦意欲由本發明涵蓋。 另一類型之構架修飾涉及使構架區内或甚至一或多個 φ CDR區内之一或多個殘基突變以移除τ細胞抗原決定基， 以進而降低抗體之潛在免疫原性。該方法亦稱為"去免疫,，， 且進一步詳細描述於Carr等人之美國專利公開案第 ' 20030153043號中。 • 除在構架區或CDR區内進行之修飾以外，或替代該修 飾，本發明之抗體亦可經遺傳工程處理，以包括以區内之 修飾’通常以改變抗體之一或多種功能性質，諸如血清半 衰期、補體固I Fc受體結合及/或抗原依賴性細胞毒 性。此外，本發明之抗體可經化學修飾（例如，可將一或 135468.doc -41 - 200924795 多個化學部分與抗體連接）或經修飾以改變其糖基化，再 改變抗體之一或多種功能性質。 在一態樣中，CH1之鉸鏈區經修飾以使得鉸鏈區中之半 胱胺酸殘基數被改變’例如增加或減少。該方法進一步描 述於Bodmer等人之美國專利第5,677 425號中。cm之鉸鏈 區中之半胱胺酸殘基數經改變以（例如）促進輕鏈及重鏈之 裝配或增加或降低抗體之穩定性。 在另一態樣中，抗體之Fc鉸鏈區經突變以減少抗體之生 物半衰期。更具體而言，將一或多個胺基酸突變引入以鉸 鏈片段之CH2-CH3域界面區中，以使得抗體具有相對於天 然Fc鉸鏈域SpA結合而言削弱的葡萄球菌蛋白a (Staphylococcyl protein A，SpA)結合。該方法進一步詳細 描述於Ward等人之美國專利第6，165,745號中。 在另一態樣中，抗體經修飾以增加其生物半衰期。各種 方法均可能。舉例而言，美國專利第6,277,375號描述增加 其活體内半衰期之在IgG中之以下突變：T252L、T254S、 T256F。或者，為增加生物半衰期，抗體可在CH1區或CL 區内經改變以含有取自IgG之Fc區之CH2域的兩個環之救 助受體結合抗原決定基，如Presta等人之美國專利第 5,869,046號及第6，121，022號中所述。 在其他態樣中，藉由以不同胺基酸殘基置換至少一個胺 基酸殘基來改變Fc區以改變抗體之效應功能《親和力經改 變之效應物配位體可為（例如）Fc受體或補體之C1成份。舉 例而言，可將一或多個胺基酸用不同胺基酸殘基置換，以 135468.doc 42- 200924795 使得抗體具有經改變的對效應物配位體之親和力，但保留 親本抗體之抗原結合能力。例示性胺基酸突變發生在選自 234 、 235 、 236 、 237 、 252 、 254 、 256 、 297 、 309 、 311 、 315、318、320、322、433及/或434之位置中。本發明之 C3b結合分子明確涵蓋根據本發明之教示製備及使用之一 致Fc抗體域。較佳抗C3b抗體包括在選自234及/或235之位 置處之Fc突變。該方法詳細描述於Winter等人之美國專利 第 5,624,821 號及第 5,648,260號中。 在另一態樣中，可以不同胺基酸殘基置換選自胺基酸殘 基之一或多個胺基酸，以使得抗體具有經改變之Clq結合 及/或降低或消除之補體依賴性細胞毒性（CDC)。該方法進 一步詳細描述於Idusogie等人之美國專利第6，194,551號 中。 在另一態樣中，可改變一或多個胺基酸殘基以進而改變 抗體固定補體之能力。該方法進一步描述於Bodmer等人之 WO 94/29351 中。 在另一態樣中’修飾Fc區以增強抗體介導抗體依賴性細 胞毒性（ADCC)之能力及/或藉由修飾一或多個胺基酸來增 加抗體對Fey受體之親和力。該方法進一步描述於Presta之 WO 00/42072 中。此外，人類 lgG1 上 FcyRI、FcyRn、

FcyRIII及FcRn之結合位點已經定位且具有經改良結合之 變異體已經描述（參見Shields，R.L.等人，2001 J. Biol. Chem· 276:6591-6604) ° 在另一態樣中’修飾抗體之糖基化。舉例而言，可製得 135468.doc • 43· 200924795 去糖基化（aglycoslated)抗體（亦即該抗體缺乏糖基化）。可 改變糖基化作用以（例如）增加抗體對抗原之親和力。該等 碳水化合物修飾可藉由（例如）改變抗體序列内之一或多個 位點糖基化來完成。舉例而言，可進行使得一或多個可變 區構架糖基化位點經消除之一或多個胺基酸取代，以進而 消除在彼位點處之糖基化。該去糖基化可增加抗體對抗原 之親和力。該方法進一步詳細描述於Co等人之美國專利第 5,714,350 號及第 6,350,861 號中。 另外或其他，可製得具有經改變糖基化類型之抗體，諸 如具有降低量之海藻糖基殘基之低海藻糖基化抗體或具有 增加之二分GlcNac結構之抗體。已證明該等經改變之糖基 化模式增強抗體之ADCC能力。該等碳水化合物修飾可藉 由（例如）使抗體在具有經改變糖基化機制之宿主細胞中表 現來完成。具有經改變糖基化機制之細胞已描述於此項技 術中且可用作表現本發明之重組抗體之宿主細胞以進而產 生具有經改變糖基化之抗體。舉例而言，Hang等人之EP 1，176，195描述編碼海藻糖基轉移酶之？11丁8基因經功能破 壞的細胞系，以使得在該細胞系中表現之抗體展現低海藻 糖基化。？“31&之？(：丁公開案買〇 03/03 5835描述變異型 CH0細胞系、Lecl3細胞，其具有降低的使海藻糖連接於 Asn(297)-鍵聯型碳水化合物之能力，亦產生在彼宿主細胞 中表現之抗體之低海藻糖基化（亦參見Shields, R.L.等人， 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740)。Umana等人之WO 99/54342描述經遺傳工程處理，以表現修飾醣蛋白之糖基 135468.doc 200924795 轉移酶（例如，β(丨，4)_N乙醯基葡糖胺基轉移酶III(GnTm)) 的細胞系’則吏得在該經遺傳工程處理之細胞系中表現之 抗體展現增加之二分GleNae結構，該增加之二分結 構使得抗體之ADCC活性增強（亦參見Umana等人，1999

Nat. Biotech· 17:176-180)。 本發明所涵蓋之本文中之抗體的另一修飾為聚乙二醇 化抗體可經聚乙一醇化以（例如）增加抗體之生物（例如血_ ^ )半衰期。為使抗體聚乙二醇化，通常使抗體或其片段 與聚乙二醇（PEG)，諸如PEG之反應性酯或醛衍生物在使 或多個PEG部分與抗體或抗體片段連接之條件下反應。 聚乙二醇化可藉由與反應性PEG分子（或類似之反應性水溶 性聚合物）之醯化反應或烧基化反應來進行。如本文中所 用，術語"聚乙二醇”意欲涵蓋已用以使其他蛋白質衍生化 之任何形式之PEG ’諸如單（Cl-C10)烷氧基聚乙二醇或單 (Cl-C10)芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇_順丁二醯亞胺。在某 些態樣中’欲經聚乙二醇化之抗體為去糖基化抗體。用於 使蛋白質聚乙二醇化之方法在此項技術中已知且可應用於 本發明之抗體。參見（例如），Nishimura等人之EP 0 1 54 316 及 Ishikawa 等人之 EP 0 401 384。 另外，聚乙二醇化可藉由引入非天然胺基酸而在本發明 之C3b結合多肽之任何部分中達成。某些非天然胺基酸可 藉由 Deiters 等人，J Am Chem Soc 125:11782-11783, 2003 ; Wang及 Schultz, Science 3 01:964-967, 2003 ； Wang 等人，Science 292:498-500，2001 ; Zhang等人，Science 135468.doc • 45- 200924795 303·371·373，20〇4或美國專利第7,〇83,97〇號中所述之技術 來引入。簡言之，一些該等表現系統涉及將諸如琥珀TAG 之無義密碼子引入編碼本發明多肽的開放閱讀構架中之定 點犬變誘發。隨後，將該等表現載體引入可利用對所引入 無義密碼子具特異性之tRNA之宿主中，且用所選非天然 胺基酸來負載。就將部分與本發明之多肽接合之目的而言 有益之特定非天然胺基酸包括具有乙炔及疊氮基側鏈之彼 等胺基酸。可隨後在蛋白質中之該等所選位點將含有該等 新穎胺基酸之多肽聚乙二醇化。 抗想進行遣傳工程處理之方法 如上文所討論，抗C3b抗體可用於藉由修飾全長重鏈及/ 或輕鍵序列、VH及/或VL序列或與其連接之怪定區來產生 新穎抗C3b抗體。舉例而言，可將抗體之一或多個CDR區 與已知構架區及/或其他C D R重組組合以產生新穎的重組 遺傳工程處理之抗C3b抗體。其他類型之修飾包括先前部 〇 分中所述之彼等修飾。遺傳工程方法之起始物質為VH序列 及/或VL序列中之一或多者，或其一或多個CDRg。為產 生經遺傳工程處理之抗體，並非必需實際上製備（亦即， 表現為蛋白質）具有Vh序列及/或VL序列中之一或多者或其 . 一或多個(：0尺區之抗體。相反地，使用序列中所含之資訊 作為起始物質以產生來源於原始序列之"第二代"序列，且 隨後製備"第二代"序列且將其表現為蛋白質。 可使用標準分子生物學技術來製備及表現經改變抗體序 列。由經改變抗體序列編碼之抗體為保留該抗體所來源之 135468.doc -46- 200924795 抗C3b抗體之一種、一些或所有功能性質之抗體，該等功 月b性質包括（但不限於）與C3b特異性結合、抑制複合物 之形成、抑制C3轉化酶活化、抑制C5轉化酶活化、抑制 MAC之形成。經改變抗體之功能性質可使用此項技術中可 用及/或本文中所述之標準檢定（例如eLISA)來評估。 在本發明之將抗體進行遺傳工程之方法的某些態樣中， 可沿所有或部分抗C3b抗體編碼序列隨機或選擇性地引入 突變’且可對所得經修飾抗C3b抗體就如本文中所述之結 合活性及/或其他功能性質（例如，抑制C3或C5轉化酶活 性、抑制MAC形成、調控補體路徑失調）方面進行篩選。 犬·變方法已在此項技術中描述。舉例而言，Sh〇rt之PCT公 開案WO 02/092780描述使用飽和突變誘發、合成連接組合 件或其組合來產生及篩選抗體突變之方法。或者，Lazar 等人之WO 03/074679描述使用計算篩選方法來優化抗體之 生理化學特性之方法。 若核苷酸序列已經改變以使用在產生細胞或生物體（通 常為真核細胞，例如，諸如畢赤酵母（pz_c/„.a)之酵母細 胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞，諸如中國倉鼠卵巢細胞 (CHO)或人類細胞）中優選之密碼子來編碼胺基酸序列，則 稱該核苷酸序列"經優化"。使經優化核苷酸序列經遺傳工 程處理，以編碼與由原始起始核苷酸序列編碼之胺基酸序 列一致或幾乎一致之胺基酸序列，該原始起始核苷酸序列 亦稱為"親本"序列。 非抗ttC3b結合分子 135468.doc •47- 200924795 本發明進一步提供展現抗體之功能性質但構架及抗原結 合部分係來源於其他多肽（例如，不同於由抗體基因編碼 或藉由活體内抗體基因重組產生之彼等多肽之多肽）之C3b 結合分子。該等結合分子之抗原結合域（例如C3b結合域） 係經由定向演化方法產生。參見美國專利第7，115,396號。 具有與抗體可變域之彼摺疊相似的總體摺疊（"類免疫球蛋 白"摺疊）的分子為適當骨架蛋白質。適於衍生抗原結合分 子之骨架蛋白質包括纖維結合蛋白或纖維結合蛋白二聚 體、固生蛋白、N-鈣黏附蛋白、E-鈣黏附蛋白、ICam、

肌聯蛋白、GCSF受體、細胞激素受體、糖苷酶抑制劑、 抗生素色蛋白、髓鞘臈黏附分子p〇、CD8、cD4、cD2、；[ 類河狀' T細胞抗原受體、CD1、C2及VCAM-1之I組域、 肌球蛋白結合蛋白c之I組免疫球蛋白域、肌球蛋白結合蛋 白Η之I組免疫球蛋白域、端蛋白之丨組免疫球蛋白域、 NCAM、顫搐蛋白、神經膠質蛋白、生長激素受體、紅叙 球生成素受體、促乳素受體、干擾素、受體、卜半 酶/葡糖藤酸酶、(3-葡糖駿酸酶、轉麩胺酸酶、Τ細胞抗原 受體、過氧化物歧化酶、組織因子域、細胞色素F、 螢光蛋白質、GroEL或祝馬丁。 m結合分子之抗原結合域（例如，類免疫球蛋白指 叠）可具有小於10 kD或大於7.5⑽之分子質量（例如，在 7.5-10 kD之間的分子質| _ 在 質為天鈇；Ty* £ 以衍生抗原結合域之蛋白 ^ 、存在之哺乳動物蛋白質（例如，人類蛋白質）’且 抗原結合域與該抗原結合 厅果源之蛋白質之類免疫球蛋 135468.doc -48- 200924795 白摺疊相比，包括至多50%(例如，至多34%、25%、2〇0/〇 或15 /〇)之突變型胺基酸.具有類免疫球蛋白摺疊之域通常 由50-150個胺基酸（例如，4〇_6〇個胺基酸）組成。 為產生非抗體結合分子，產生純系之集合庫，其中形成 抗原結合表面之骨架蛋白質之區域（例如，在位置及結構 方面類似於抗體可變域免疫球蛋白摺疊之CDR之區域）的 序列經隨機化。測試集合庫純系與所關注抗原（例如C3b) 之特異性結合及其他功能（例如，對C3b之生物活性之抑 制）。所選純系可用作進一步隨機化及選擇之基礎以產生 對抗原具有較高親和力之衍生物。

高親和力結合分子係（例如）使用纖維結合蛋白m之第十 模組（〇Fn3)作為骨架來產生。對於殘基23_29、52_55及78· 87處之1GFN3之3個類CDR環中的每一者建構集合庫。為建 構各集合庫’藉由寡核苷酸合成將重疊各個類Cdr區之 DNA區段編碼序列隨機化。用於產生可選擇i〇Fn3集合庫 之技術描述於美國專利第6,818,41 8號及第7,1 15,396號； Roberts 及 Szostak, 1997 Proc. Natl. Acad. Sci USA 94:12297 ;美國專利第6,261，804號；美國專利第6,258,558 號；及 Szostak等人 W098/31700 中。 非抗體結合分子可以二聚體或多聚體形式產生以增強對 標靶抗原之活性。舉例而言，使抗原結合域表現為與形成 Fc-Fc二聚體之抗體之恆定區（Fc)的融合物。參見（例如）美 國專利第7，115,396號。 編碼本發明抗體之核酸分子 135468.doc -49- 200924795 本發明之另一態樣係關於編碼本發明之C3b結合分子之 核酸分子。核酸可存在於完整細胞中，存在於細胞溶胞物 中’或可為呈部分純化或大體上純形式之核酸。當藉由標 準技術（包括鹼/SDS處理、CsCl連續梯度離心純化 (banding)、管柱層析、瓊脂糖凝膠電泳及此項技術中熟知 的其他標準技術）來使核酸與其他細胞成份或其他污染物 (例如其他細胞核酸或蛋白質）分離純化時，該核酸為"經分 離的"或”使其大體上純"。參見，F Ausubel等人編。1987 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience，New York» 本發明之核酸可為（例 如）DNA或RNA，且可含有或可不含有内含子序列◊在一 態樣中’核酸為cDNA分子。核酸可存在於諸如噬菌體呈 現載體之載體中’或存在於重組質體載體中。 本發明之核酸可使用標準分子生物學技術獲得。對於由 融合瘤（例如，如下文進一步描述自帶有人類免疫球蛋白 Q 基因之轉殖基因小鼠製備的融合瘤）表現之抗體而言，編 碼由融合瘤製備之抗體之輕鏈及重鏈的cDNA可藉由標準 PCR擴増或cDNA選殖技術獲得。對於自免疫球蛋白基因 集合庫（例如使用噬菌體呈現技術）獲得之抗體而言，編碼 ' 抗體之核酸可自為集合庫成員之各種噬菌體純系回收。 一旦獲得編碼VH及VL區段之DNA片段，該等DNA片段 即可進一步藉由標準重組DNA技術操作（例如）以使可變區 基因轉化成全長抗體鏈基因，轉化成Fab片段基因或轉化 成scFv基因。在該等操作中，將編碼Vl4Vh之DNA片段可 135468.doc •50· 200924795 操作性連接於另一 DNA分子或連接於編碼另一蛋白質之片 段（諸如抗體恆定區或可撓性連接子）。當在該情況下使用 時’術語"可操作性連接"欲意謂兩個DNA片段以功能性方 式接合，（例如）以使得由該兩個DNA片段編碼之胺基酸序 列仍保持同框，或以使得該蛋白質在所要啟動子控制下表 現。 可藉由將編碼VH之DNA可操作性連接於編碼重鏈恆定區 (CHI、CH2及CH3)之另一 DNA分子而將編碼VH區之經分 ® 離DNA轉化成全長重鏈基因。此項技術中已知人類重鏈恆 定區基因之序列（參見（例如），Kabat等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版，U.S. Department of Health and Human Services, NIH公開案第 91-3242號）且包涵該等區域之DNA片段可藉由標準PCR擴 增來獲得。重鏈恆定區可為IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、

IgA、IgE、IgM或IgD恆定區。對Fab片段重鏈基因而言， _ 可將編碼VH之DNA可操作性連接於僅編碼重鏈CH1恆定區 之另一DNA分子。 可藉由將編碼VL之DNA可操作性連接於編碼輕鏈恆定區 CL之另一 DNA分子而將編碼VL區之經分離DNA轉化成全 . 長輕鏈基因（以及轉化成Fab輕鏈基因）。此項技術中已知人

類輕鏈恨定區基因之序列（參見（例如），Kabat等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest » 第 5版， U.S. Department of Health and Human Services, NIH公開案 第9卜3242號）且包涵該等區域之DNA片段可藉由標準PCR 135468.doc 51 200924795 擴增來獲得。輕鏈恆定區可為K或λ恆定區。 為產生scFv基因，使編碼νΗ之DNA片段及編碼vL之 DNA片段與編碼可撓性連接子（例如編碼胺基酸序列（〇1丫4_ Serb)之另一片段可操作性連接，以使得Vh序列及％序列 可表現為相鄰單鏈蛋白質’其中VL及VH區係由可撓性連接 子接合（參見（例如）Bird等人，1988 Science 242:423-426;

Huston等人，1988 Proc. Natl. Acad· Sci. USA 85:5879-5883 ; McCafferty等人 ’ 1990 Nature 348:552-554)。 單株抗體產生 單株抗體（mAb)可藉由多種技術產生，該等技術包括習 知單株抗體方法，例如Kohler及Milstein(1975 Nature， 256:495)之標準體細胞雜交技術，或使用諸如噬菌體呈現 之集合庫呈現方法。 用於製備融合瘤之動物系統為鼠類系統。小鼠中之融合 瘤產生為充分確立之程序。此項技術中已知免疫方案及用 ❹ 於分離供融合之經免疫脾細胞之技術。亦已知融合搭配物 (例如’鼠類骨趙瘤細胞）及融合程序。 本發明之嵌合抗體或人化抗體可基於如上所述製備之鼠 類單株抗體的序列來製備。編碼重鏈及輕鏈免疫球蛋白之 ’ DNA可使用標準分子生物學技術自所關注之鼠類融合瘤獲 得且可經遺傳工程處理，以含有非鼠類（例如人類）免疫球 蛋白序列。舉例而言’為產生嵌合抗體，可使用此項技術 中已知之方法將鼠類可變區與人類恆定區連接（參見（例 如）CabUly等人之美國專利第4,816,567號）。為產生人化抗 135468.doc •52- 200924795 體，可使用此項技術中已知之方法將鼠類⑽區插人人類 構架中。參見（例如）美國專利第5,225,539號及美國專利第 5’530，101 冑；帛 5,585，_ 號；第 Μ%，·號及第 6，180,370號。 在某一態樣中，本發明之抗體為人類單株抗體。可使用 帶有部分人類免疫系統而非小鼠系統之轉殖基因或轉染色 體小鼠來產生針對C3b抗原決定基之該等人類單株抗體。 該等轉殖基因及轉染色體小鼠包括在本文中分別稱為 D HuMAb小鼠及KM小鼠之小鼠，且在本文中統稱為"人類Ig 小鼠"。

HuMAb小鼠®(Medarex，Inc.)含有編碼未重排人類重鏈（μ 及γ)及κ輕鏈免疫球蛋白序列之人類免疫球蛋白基因小基 因座（minilocus) ’連同使内源κ鏈基因座失活之靶向突 變（參見（例如）Lonberg等人，1994 Nature 368(6474): 856-859)。因此’小鼠展現降低之小鼠IgM或κ表現，且回應於 g 免疫，所引入之人類重鏈及輕鏈轉殖基因經歷類別轉換及 體細胞突變以產生高親和力人類IgGK單株抗體（Lonberg， N.等人，1994 同上；回顧於 Lonberg，N.，1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101 中；Lonberg，N.及 Huszar，D.，1995 Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93，及 Harding，F·及[〇11561§，]^.，1995 八1111.>«1.丫.八。&£1.8(^· 764:53 6-546)。HuMAb小鼠之製備及用途及由該等小鼠攜 帶之基因組修飾進一步描述於Taylor, L.等人，1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295 ; Chen，J.等人，1993 135468.doc 53- 200924795

International Immunology 5: 647-656 ; Tuaillon等人，1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724 ; Choi等人，1993 Nature Genetics 4:117-123 ; Chen，J.等人，1993 EMBO J. 12: 821-830 ； Tuaillon等人，1994 J. Immunol. 152:2912-2920 ； Taylor, L.等人，1994 International Immunology 579-591 ;及Fishwild，D.等人，1996 Nature Biotechnology 14: 845-851中，所有文獻之内容在此明確地以引用之方式 全部併入本文中。另外參見全部屬於Lonberg及Kay之美國 © 專利第 5,545,806號；第 5,569,825號；第 5,625，126號；第 5,633,425 號；第 5,789,650 號；第 5,877,397 號；第 5,661，016 號；第 5,814,318 號；第 5,874,299 號；及第 5,770,429號；Surani等人之美國專利第5,545,807號；全部 屬於Lonberg及Kay之PCT公開案第WO 92103918號、第WO 93/12227號、第 WO 94/25585號、第 WO 97113852號、第 WO 98/24884 號及第 WO 99/45962 號；及 Korman 等人之 ▲ PCT公開案第WO 01/14424號。 〇 在另一態樣中，本發明之人類抗體可使用在轉殖基因及 轉染色體上帶有人類免疫球蛋白序列之小鼠，諸如帶有人 類重鏈轉殖基因及人類輕鏈轉染色體之小鼠來產生。在本 文中稱為"KM小鼠"之該等小鼠詳細描述於WO 02/43478 中〇 另外，表現人類免疫球蛋白基因之替代轉殖基因動物系 統在此項技術中可得且可用以產生本發明之抗C3b抗體。 舉例而言，可使用稱為Xenomouse®(Abgenix，Inc.)之替代 135468.doc -54- 200924795 轉殖基因系統。該等小鼠描述於（例如）Kucherlapati等人之 美國專利第 5,939,598 號；第 6,075，181 號；第 6,114,598 號；第6，150,584號及第6，162,963號中。 此外’表現人類免疫球蛋白基因之替代轉染色體動物系 統在此項技術中可得且可用以產生本發明之抗C3b抗體。 舉例而言，可使用帶有人類重鏈轉染色體及人類輕鏈轉染 色體之稱為"TC小鼠"之小鼠；該等小鼠描述於Tomizuka等 人，2000 Proc, Natl. Acad, Sci. USA 97:722-727 中。此 外，此項技術已描述帶有人類重鏈及輕鏈轉染色體之母牛 (Kuroiwa等人 » 2002 Nature Biotechnology 20:889-894)且 其可用於產生本發明之抗C3b抗體。 本發明之人類單株抗體亦可使用用於篩選人類免疫球蛋 白基因之集合庫之噬菌體呈現方法來製備。用於分離人類 抗體之該等噬菌體呈現方法在此項技術中已確立。參見 (例如）：Ladner等人之美國專利第5,223,4〇9號；第 5,403,484號；及第5,571，698號；Dower等人之美國專利第 5,427,908號及第5,580,717號；McCafferty等人之美國專利 第5,969，108號及第6，172，197號；及Griffiths等人之美國專 利第 5,885,793 號；第 6,521，404 號；第 6,544,731 號；第 6,555,3 13號；第6,582,915號及第6,593,081號。可就與全 長C3b抗原或與特定C3b neo抗原決定基之結合來篩選集合 庫。 本發明之人類單株抗體亦可使用人類免疫細胞已重構於 其中以使得可在免疫後產生人類抗體反應之SCID小鼠來製 135468.doc -55- 200924795 備。該等小鼠描述於（例如）WiIson等人之美國專利第 5,476,996號及第 5,698,767號中。 在人類Ig小鼠中產生人類單株抗體 在原核細胞（例如大腸桿菌）或真核細胞（例如哺乳動物細 胞’例如HEK293細胞）中表現之經純化重組人類C3b可用 作抗原。可將蛋白質接合於諸如匙孔螺血氰蛋白（keyh〇ie limpet hemocyanin，KLH)之載體 針對C3b neo抗原決定基之完全人類單株抗體係使用 ® HuMab轉殖基因小鼠之HCo7、HCol2及HCol7品系及轉瘦 基因轉染色體小鼠之KM品系來製備，各品系表現人類抗 體基因。在該等小鼠品系中之每一者中，内源小鼠κ輕鏈 基因可如Chen等人’ 1993 EMBO J. 12:811-820中所述經同 型接合破壞’且内源小鼠重鏈基因可如WO 01109187之實 例1中所述經同型接合破壞。如Fishwild等人，1996 Nature Biotechnology 14:845-851中所述，該等小鼠品系中之每一 _ 者帶有人類κ輕鏈轉殖基因KCo5。如美國專利第5,545,806 號；第5,625,825號；及第5,545,807號中所述，HCo7品系 帶有HCo7人類重鏈轉殖基因。如WO 01/09187之實例2中 所述’ HCol2品系帶有HCol2人類重鏈轉殖基因。HCol7 染色品系帶有HCo 17人類重鏈轉殖基因。如w〇 02/43478 中所述，KNM品系含有SC20轉染色體。 為產生針對C3b neo抗原決定基之完全人類單株抗體， 用經純化重組C3b、C3b片段或其共軛物（例如C3b-KLH)作 為抗原使HuMab小鼠及KM小鼠免疫。用於HuMab小鼠之 135468.doc -56- 200924795 通用免疫流程描述於Lonberg，N.等人，1994 Nature 368(6474): 856-859 ; Fishwild，D.等人，1996 Nature Biotechnology 14:845-851 及 WO 98/24884 中。在第一次注 入抗原時’小鼠為6-16週齡。使用抗原之經純化重組製劑 (5-50 Mg)來於腹膜腔中、皮下（Sc)或藉由足墊注射使 v HuMab小鼠及KM小鼠免疫。 使用於完全弗氏佐劑（Freund’s adjuvant)或Ribi佐劑中之 抗原’於腹膜腔（IP)中、皮下（Sc)或藉由足塾（ρρ)將轉殖基 ® 因小鼠免疫兩次’接著使用於不完全弗氏佐劑或Ribi佐劑 中之抗原的3-21天IP、Sc或FP免疫（至多總共11次免疫）。 藉由眶後放血監測免疫反應。藉由ELISA篩選血漿，且將 具有足夠效價之抗C3b人類免疫球蛋白之小鼠用於融合。 在處死及移除脾之前3天及2天，用抗原靜脈内加強小鼠。 通常’對各抗原執行10-35次融合。對於各抗原，使若干 小鼠免疫。用C3b抗原免疫總共82隻HCo7、HCol2、 0 HCo 17及KM小鼠品系之小鼠。 為選擇產生結合C3b neo抗原決定基之抗體之HuMab或 KM小鼠’可如由Fishwild，D·等人，1996所述藉由ELISA ’ 來測試來自經免疫小鼠之血清。簡言之，以每孔50 μΐ，用 1-2 pg/ml於PBS中之經純化重組C3b塗佈微量滴定板，在 4°C下培養隔夜，隨後用每孔200 μΐ於PBS/Tween(0.050/〇)中 之5%雞血清阻斷。將來自經C3b免疫小鼠之血漿之稀釋液 添加至各孔中且在環境溫度下培養1_2小時。用PBS/Tween 洗滌板，且隨後在室溫下，用與辣根過氧化物酶 135468.doc -57- 200924795 (horseradish peroxidase，HRP)接合之山羊抗人類 IgG Fc 多 株抗體培養1小時。洗滌後，用ABTS受質（3丨§11^，八-1888，0.22 mg/ml)使板顯色，且藉由分光光度計在OD 415-495下分析*將發展最高效價之抗C3b抗體之小鼠脾細 胞用於融合。執行融合且藉由ELISA測試融合瘤上清液之 . 抗C3b活性。 基於標準方案，使用PEG使自HuMab小鼠及KM小鼠分 離之小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞系融合。隨後根據抗原 © 特異性抗體之產生篩選所得融合瘤。使用50% PEG(Sigma) 使來自經免疫小鼠之脾淋巴細胞之單細胞懸浮液與四分之 一數量之SP2/0非分泌小鼠骨髓瘤細胞（ATCC，CRL 1581) 融合。以約1X105/孔將細胞塗鋪於平底微量滴定板，接著 在於DMEM(Mediatech，CRL 10013，具有高葡萄糖、L-麩 胺酿胺及丙酮酸鈉）中含有以下各物之選擇培養基中培養 約 2週：10%胎牛血清、10% P388D 1(ATCC，CRL TIB-63) 條件培養基、3-5% Origen®(IGEN)，加5 mM HEPES、 0.055 mM 2-疏基乙醇、50 pg/mH建他黴素（gentamycin)及1 xHAT(Sigma，CRLP-7185)。1-2週後，在以HT置換HAT之 培養基中培養細胞。隨後藉由ELISA根據人類抗C3b單株 . IgG抗體篩選個別孔。發生廣泛融合瘤生長後，通常在1〇_ 14曰後監測培養基。重塗、再次篩選分泌抗體之融合瘤， 且若對於人類IgG而言仍為陽性，則藉由有限稀釋將抗C3b 單株抗體次選殖至少兩次。隨後活體外培養穩定子純系以 在組織培養基中產生少量抗體用於進一步表徵。 135468.doc • 58- 200924795 產生人類軍株抗通之敲合瘤之產生 為產生產生本發明之人類單株抗體之融合瘤，可將來自 經免疫小鼠之脾細胞及/或淋巴結細胞分離且與諸如小鼠 骨趙瘤細胞系之適當永生化細胞系融合。可根據抗原特異 性抗體之產生篩選所得融合瘤。舉例而言，使用5〇% PEG 使來自經免疫小鼠之脾淋巴細胞之單細胞懸浮液與六分之 一數量之P3X63-Ag8.653非分泌小鼠骨髓瘤細胞（ATCC， CRL 1580)融合。以約2x145將細胞塗鋪於平底微量滴定 板’接著在含有以下各物之選擇培養基中培養2週：2〇% 胎純系血清、18% "653”條件培養基、5% Origen® (IGEN)、4 mM L-麩胺醯胺、1 mM丙酮酸鈉、5 mM HEPES、0:055 mM 2-巯基乙醇、50單位/毫升盤尼西林 (penicillin)、50 pg/ml鏈黴素、50 pg/ml健他黴素及 1χ HAT(Sigrna;在融合後24小時添加HAT)。約2週後，可在 以HT置換HAT之培養基中培養細胞。隨後藉由ELIS A根據 人類單株IgM及IgG抗體篩選個別孔。發生廣泛融合瘤生長 後’可通常在10-14日後觀察培養基。可重塗、再次筛選 分泌抗體之融合瘤，且若對於人類IgG仍為陽性，則可藉 由有限稀釋將單株抗體次選殖至少兩次。可隨後活體外培 養穩定子純系以在組織培養基中產生少量抗體用於表徵。 為純化人類單株抗體，可使所選融合瘤在2公升旋轉燒 瓶中生長以供單株抗體純化。可將上清液過濾且濃縮，隨 後用蛋白質A-瓊脂糖（Pharmacia，Piscataway，N.J.)進行親 和力層析。經溶離之IgG可藉由凝膠電泳及高效液相層析 135468.doc -59- 200924795 檢查以確保純度。可將緩衝溶液交換為PBS，且可使用 1.43之消光係數藉由定濃度。可將單株抗體等分且 在-80 °C下儲存。 產生單株抗«之轉染瘤之產生 本發明之抗體亦可使用（例如）此項技術中熟知之重組 DNA技術及基因轉染方法之組合在宿主細胞轉染瘤中產生 (例如，Morrison, 1985 Science 229:1202)。 舉例而言，為表現抗體或其抗體片段，編碼部分或全長 輕鏈及重鏈之DNA可藉由標準分子生物學技術（例如，pcR 擴增或cDNA選殖，使用表現所關注抗體之融合瘤）獲得， 且可將該等DNA插入表現載體中以使得該等基因與轉錄及 轉譯控制序列可操作性連接。在該情況下，術語"可操作 性連接"欲意謂將抗體基因連接至載體中以使得載體内之 轉錄及轉譯控制序列發揮其調節抗體基因轉錄及轉譯之預 定功能。表現載體及表現控制序列經選擇以與所用表現宿 主細胞相容。抗體輕鍵基因及抗體重鏈基因可插入單獨載 體中，或更通常將兩種基因插入同一表現載體中。該等抗 體基因藉由標準方法（例如抗體基因片段及載體上之互補 限制位點的連接，或若不存在限制位點則為鈍端接合）插 入表現載體中。本文中所述之抗體之輕鍵及重鏈可變區可 藉由將任何抗體同型之全長抗體基因插入已編碼所要同型 之重鍵恆定區及輕鏈怪定區之表現載體中，以使得將VH區 段與載體内之CH區段可操作性連接且將Vl區段與載體内 之CL區段可操作性連接來用於產生任何抗體同型之全長抗 135468.doc -60- 200924795 體基因。另外或其他，重組表現載體可編瑪促進抗體鍵自 宿主細胞分泌之信號肽。可將抗體鍵基因選殖至載體中， 以使得信號肽與抗體鍵基因之胺基末端同框連接。信號肽 可為免疫球蛋白信號肽或異源信號狀（亦即，來自非免疫 球蛋白蛋白質之信號肽）。 除抗體鏈基因外，本發明之重組表現載體亦帶有控制抗 體鏈基因在宿主細胞中之表現之調節序列。術語"調節序 列"意欲包括啟動子、強化子及控制抗體鏈基因轉錄或轉 譯之其他表現控制元件（例如，聚腺苷酸化信號）。該等調 節序列描述於（例如）Goeddel(Gene Expression Technology-1990 Methods in Enzymology 185， Academic Press， San

Diego，CA)中。熟習此項技術者應瞭解，包括調節序列之 選擇之表現載體的設計可視諸如欲轉型宿主細胞之選擇、 所要蛋白質之表現量等之因素而定。用於哺乳動物宿主細 胞表現之調節序列包括在哺乳動物細胞中指導高含量蛋白 質表現之病毒元件’諸如來源於細胞巨大病毒（CMV)、猿 病毒40(SV40)、腺病毒（例如’旅病毒主要晚期啟動子 (AdMLP))及/或多形瘤之啟動子及/或強化子。或者，可使 用非病毒調節序列，諸如泛素啟動子或p_血球蛋白啟動 子。另外，調節元件包含來自不同來源之序列，諸如SRa 啟動子系統，其含有來自SV40早期啟動子之序列及i型人 類τ細胞白血病病毒之長末端重複序列（Takebe等人，1988

Mol. Cell. Biol. 8:466-472)。 除抗體鍵基因及調節序列外’本發明之重組表現載體亦 135468.doc •61 - 200924795 可帶有額外序列，諸如調節載體在宿主細胞中之複製之序 列（例如，複製起點）及可選擇性標記基因。可選擇性標記 基因利於引入載體之宿主細胞的選擇（參見（例如），全部屬 於Axel等人之美國專利第4,399 216號；第4,634,665號；及 第5,1 79’017號）。舉例而言，通常可選擇性標記基因對引 入載體之宿主細胞賦予對諸如G418、潮黴素（hygr〇mycin) 或曱胺喋呤（methotrexate)之藥物之抗性。可選擇性標記基 因包括二氫葉酸鹽還原酶（dhfr)基因（適用於用甲胺喋呤選 擇/擴增之dhfr-宿主細胞）及ne〇基因（用於G418選擇）。 對表現輕鏈及/或重鏈而言，藉由標準技術將編碼重鏈 及輕鍵之表現載體轉染至宿主細胞中。術語"轉染"之各種 形式意欲涵蓋常用於將外源DNA引入原核或真梭宿主細胞 中之多種技術’例如電穿孔、構酸約沈殿、DEAE-葡聚糖 轉染及其類似技術。在理論上可能在原核或真核宿主細胞 中表現本發明之抗體。已討論抗體在真核細胞（尤其哺乳 動物宿主細胞）中之表現，因為該等真核細胞且尤其哺乳 動物細胞比原核細胞更可能裝配及分泌經適當摺疊且具免 疫活性之抗體。已報導抗體基因之原核表現對產生高產量 之活性抗體而言無效（Boss及Wood, 1985 Immunology Today 6:12-13)。 用於表現本發明之重組抗體之哺乳動物宿主細胞包括中 國倉鼠卵巢（CHO細胞）（包括dhfr-CHO細胞，描述於Urlaub 及 Chasin，1980 Proc. Natl· Acad. Sci. USA 77:4216-4220 中，其與DH FR可選擇性標記一起使用，例如，如 135468.doc -62- 200924795

Kaufman及 Sharp, 1982 Mol. Biol. 159:601-621 中所述）、 NSO骨髓瘤細胞、COS細胞及SP2細胞》詳言之，對供 NSO骨髓瘤細胞使用而言，另一表現系統為WO 87/04462、WO 89/01036 及 EP 33 8,841 中所展示之 GS 基因 表現系統。當將編碼抗體基因之重組表現載體引入哺乳動 物宿主細胞中時，藉由將宿主細胞培養足以允許在宿主細 胞中表現抗體或將抗體分泌至宿主細胞所生長之培養基中 之時期來產生抗體。抗體可使用標準蛋白質純化方法自培 養基中回收。 雙特異性分子 在另一態樣中，本發明以包含本發明之C3b結合分子（例 如抗C3b抗體或其片段）之雙特異性分子為特徵。本發明之 C3b結合分子可經衍生成另一功能分子（例如另一肽或蛋白 質（例如受體之另一抗體或配位體））或與其連接以產生與至

少兩個不同結合位點或標靶分子結合之雙特異性分子。事 實上，本發明之C3b結合分子可經衍生成或連接於一個以 上其他功能分子以產生結合兩個以上不同結合位點及/或 帖靶刀子之多特異性分子；如本文所用之術語"雙特異性 分子"亦欲涵蓋該等多特異性分子。為產生本發明之雙特 異性分子，可使本發明之抗體與諸如另一抗體、抗體片 段、狀或結合模擬物之一或多個其他結合分子功能性連接 (例如’藉由化學偶合、遺傳融合、非共㈣合或以其他 方式），以使得產生雙特異性分子。 因此’本發明包括包含至少一種針對⑶狀。抗原決定 135468.doc • 63 - 200924795 基之第一結合特異性及針對諸如因子B、因子D、備解 素、因子H、因子ϊ或參與MAC產生之補體蛋白質/酶（諸如 C5、C6、C7、C8及C9)之第二縣抗原決定基之第二結合 特異性的雙特異性分子。 在-態樣中’本發明之雙特異性分子包含作為結合特異 性之至少一種抗體或其抗體片段，包括（例如斤吐、F^，、 F(ab’)2、Fv或單鏈Fv。抗體亦可為輕鏈或重鏈二聚體或其 任何最小片段（諸如Fv)或單鏈構築體，如Ladner等人美國 專利第4,946,778號（其内容明確地以引用之方式併入本文 中）中所述。 本發明之雙特異性分子可使用此項技術中已知之方法， 藉由接合組分結合特異性來製備。舉例而言，雙特異性分 子之各結合特異性可單獨產生且隨後彼此接合。當結合特 異性為蛋白質或肽時’多種偶合或交聯劑可用於共價接 合。交聯劑之實例包括蛋白A、碳化二醯亞胺、N-琥珀醯 亞胺基-S-乙醯基-硫代乙酸酯（SATA)、5,5，-二硫基雙（2-硝 基苯甲酸）(DTNB)、鄰伸苯基二順丁二醯亞胺（〇pdm)、N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基）丙酸酯（SPDP)及4-(N-順 丁二醯亞胺基甲基）環己烷-1-羧酸磺酸基琥珀醯亞胺酯（磺 酸基-SMCC)(參見（例如），Karpovsky 等人，1984 J. Exp. Med. 160:1686 ; Liu等人，1985 Proc. Natl. Acad. Sci· USA 82:8648)。其他方法包括 Paulus，1985 Behring Ins. Mitt. No. 78，118-132 ; Brennan等人，1985 Science 229:81-83) ’ 及 Glennie等人，1987 J· Immunol· 139: 2367-2375)中所述 135468.doc -64· 200924795 之彼等方法。接合劑為SATA及磺酸基-SMCC，兩者均可 購自 Pierce Chemical Co.(Rockf〇rd，IL) » 當結合特異性為抗體時，其可藉由兩條重鏈之c末端鉸 鏈區之硫氫基鍵結來接合。在一特定態樣中，鉸鏈區在接 合之前經修飾以含有奇數個硫氫基殘基，例如1個。 或者’兩種結合特異性可在同一載體中編碼且在同一宿 主細胞中表現及裝配。在雙特異性分子為mAbxmAb、mAb xFab、FabxF(ab’）2或配位體xFab融合蛋白之情況下，該方 法尤其適用。本發明之雙特異性分子可為包含一個單鏈抗 體及一個結合決定子的單鏈分子，或包含兩個結合決定子 的單鍵雙特異性分子。雙特異性分子可包含至少兩個單鍵 分子。用於製備雙特異性分子之方法描述於（例如）美國專 利第 5,260,203 號；第 5,455,030 號；第 4,881，175 號；第 5，132,405 號；第 5,091，513 號；第 5,476,786 號；第 5,013,653號；第 5,258,498號；及第 5,482,858號中。 雙特異性分子與其特異性標乾之結合可藉由（例如）酶聯 免疫吸附檢定（ELISA)、放射免疫檢定（reA)、FACS分 析、生物檢定（例如生長抑制）或西方墨點檢定來確認。該 等檢定中之每一者通常藉由使用對所關注複合物具有特異 性之經標記試劑（例如，抗體）來偵測受特定關注之蛋白質_ 抗體複合物的存在。 篩選及檢定 補體活化檢定 可於活體外及活體内測試C3b結合分子之功能特徵。舉 135468.doc •65- 200924795 例而言，可測試結合分子抑制C3b及諸如備解素、因子 Η、因子B、因子I、膜輔因子及/或其複合物之補體蛋白質 之相互作用的能力。另外，可根據Wiesmann, C ’等人 (2006). Nature 444，217-220來測試結合分子抑制C3及/或 C5轉化酶活性之能力。 可採用各種方法量測補體路徑分子之活性及補體系統之 活化（參見（例如）美國專利第6,087，120號；及Newell等人’ J Lab Clin Med, 100:437-44，1982)。舉例而言，可藉由⑴ 量測對紅血球之補體介導溶胞作用（溶血作用）之抑制性； (ii)量測抑制C3或C5裂解之能力；及（iii)對典型及/或替代 路徑介導之溶血作用之抑制性，來監測補體活性。 兩種最常用技術為溶血檢定（參見（例如），Baatrup等 人，Ann Rheum Dis，51:892-7，1992)及免疫學檢定（參見 (例如），Auda等人，Rheumatol Int, 10:185-9，1990)。溶血 技術量測整個序列（典型或替代路徑）之功能性能力。免疫 學技術量測特定補體成份或分裂產物之蛋白質濃度。可用 以在本發明之方法中偵測補體活化或量測補體成份活性的 其他檢定包括（例如）T細胞增殖檢定（Chain等人，J Immunol Methods, 99:221-8, 1987)及延遲型過敏性（DTH) 檢定（Forstrom 等人，1983, Nature 303:627-629 ； Halliday 等人，1982, in Assessment of Immune Status by the

Leukocyte Adherence Inhibition Test, Academic, New York 第 1-26 頁；Koppi 等人，1982，Cell. Immunol. 66:394-406 ; 及美國專利第5,843,449號）。 135468.doc -66- 200924795 在溶血技術中，所有適當補體成份須存在且具功能性 (視所量測之路徑而定，所需成份可變化）。因此，溶血技 術可篩選補體系統之功能完整性及缺陷（參見（例如），Dijk 等人，J Immunol Methods 36: 29-39，1980; Minh等人， Clin Lab Haematol. 5:23-34 1983 ;及 Tanaka 等人，j

Immunol 86: 161_170, 1986)e舉例而言，為量測典型路徑 之功能性能力，使用經溶血素（hein〇lysin)(針對綿羊紅血 球之兔IgG)塗佈之綿羊紅血球（亦可使用來自其他物種之 紅血球，例如，可使用雞紅血球）作為標靶細胞（敏化細 胞）。該等Ag-Ab複合物活化典型路徑且當成份具功能性且 以足夠濃度存在時’產生標乾細胞之溶解。為測定替代路 徑之功能性能力，使用兔紅血球作為標靶細胞（參見（例 如），美國專利第6,087，120號）。 溶血補體量測可應用於偵測（例如）受檢者血液中之補體 蛋白質的缺陷及功能性障礙’因為該量測係基於補體誘導 細胞溶解之功能，_此需要完整範圍之功能性補趙蛋白質。 測定典型路徑活化之所謂CH50方法及用於替代路徑之 AP50方法已藉由使用特疋經分離補體蛋白質替代完整血清 而擴展’而經南度稀釋之測試樣本含有未知濃度之有限補 體成份。藉由該方法’可執行指示缺乏何種成份之補體系 統之更詳細量測。 免疫學技術使用針對各種補體成份（例如，C3、C4、C5) 之不同抗原決定基之多株或單株抗體以镇測（例如）補體成 份之分裂產物（參見（例如）’ Hugli等人，Immun〇assays 135468.doc -67- 200924795

Clinical Laboratory Techniques 443-460, 1980 ; Gorski 等 人，J Immunol Meth 47: 61-73, 1981 ; Linder等人，J Immunol Meth 47: 49-59, 1981 ;及 Burger等人，J Immunol 141: 553-558，1988)。可隨後量測在與已知濃度之經標記 分裂產物之競爭中，抗體與分裂產物的結合。諸如放射免 疫檢定、ELISA及徑向擴散檢定之各種檢定可用於偵測補 體分裂產物。 免疫學技術提供偵測補體活化之高靈敏度，因為其允許 量測來自測試受檢者及具有或不具有黃斑退化相關病症之 對照受檢者之血液中之分裂產物形成。因此，在本發明之 一些方法中，與黃斑退化相關之病症之診斷係藉由量測異 常補體活化，經由量化來自測試受檢者之血漿中的補體成 份之可溶分裂產物（例如，C3a、C4a、C5a及C5b-9未端複 合物）來獲得。量測可如（例如）Chenoweth等人，N Engl J Med 304: 497-502, 1981 ;及 Bhakdi等人，Biochim Biophys Acta 737: 343-372, 1983中所述來執行。較佳地，僅量測 活體内形成之補體活化。其可藉由收集來自受檢者之生物 樣本（例如血清）於含有補體系統抑制劑之培養基中，且隨 後量測樣本中之補體活化（例如，量化分裂產物）來完成。 在具有與黃斑退化相關之病症之患者的臨床診斷或監測 中，與來自正常受檢者之相應生物樣本中之含量相比較的 補體蛋白質之偵測指示患者具有與黃斑退化相關之病症。 活體内診斷或成像描述於US2006/0067935中。簡言之， 該等方法通常包含向患者投予或引入診斷有效量之C3b結 135468.doc -68 - 200924795 〇刀子，該C3b結合分子係與可藉由非侵入方法偵測之標 諸物或標記可操作性連接 '給予抗體姻物共軛物足夠 時間以在眼睛内定位及與補體蛋白質結合。隨後，使患者 暴露於偵測裝置以鑑別可偵測標誌物，因此形成c3b結合 分子在患者之眼睛中之位置之影像。⑽結合分子或其複 口物之存在藉由測定抗體·標誌物是否與眼睛之成份結合 來偵測。與不具有AMD疾病之正常個體相比較，偵測到所 選補體蛋白f或其組合含量增加指示易患與黃斑退化相關 之病症及/或該病症發作。本發明之該等態樣亦較佳用於 眼睛成像方法及組合血管生成診斷及治療方法中。 動物模型 適於測試C3b結合分子對C3b之調控之動物模型已描述 於uS2006/0067935中。已在小鼠中開發出amd之動物模 型其發展可見於人類病狀中之病理特徵。Ambati，J等 人，（2003) Nat Med 9，1390-1397。 可藉由在該等實驗動物中之標準醫藥程序（例如，用於 測定LD5〇(使群體之50%致死之劑量）及(在群體之5〇% 中治療有效之劑量））來測定C3b結合分子之毒性及治療功 效。毒性效應與治療效應之間的劑量比為治療指數且其可 表示為比率LDso/EDso。自動物研究中獲得之資料可用於 調配適用於人類之劑量範圍。劑量可在動物模型中調配以 達成包括如在細胞培養物中所測定之(亦即，達成一半 最大之症狀抑制的測試化合物之濃度）之循環金漿濃度範 圍。該等資訊可用於更精確地確定適用於人類之劑量。可 135468.doc -69· 200924795 (例如）藉由高效液相層析來量測在血 求1f之含量。 醫藥組合物及其用途 醫藥组合物 在另-態樣中，本發明提供含有連同醫藥學上可接受之 配的本發明之C3b結合分子(例如，單株抗體或 部分)中之一者或組合的組合物，例如醫藥組 人 兩種或兩種以上不同）結 ❹ :之者或組合。舉例而言，本發明之醫藥組合物 可包含與標乾抗原上之不同抗原決定基結合 性之抗體或藥劑的組合。 $ ^ 本發明之醫藥組合物亦可以組合療法，亦即與其他藥劑 組合投予。舉例而言’組合療法可包括與至少一種消炎劑 組合之抗C3b抗體。可用於組合療法中之治療劑的實例更 詳細描述於下文關於本發明藥劑之用途的部分中。 如本文中所用，”醫藥學上可接受之载劑"包括生理學上 e 彳相容之任何及所有溶劑、分散介質、塗料、抗菌劑及抗 真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及其類似物。載劑應適於非 經腸投藥（例如，藉由注射或輸液）。如本文中所使用，"非 .、經腸"投藥意謂不同於經腸及局部投藥之投藥模式’其通 • 常藉由注射投予且包括(而不限於)靜脈内、肌肉内、動脈 内、勒内、囊内、眼眶内、心内、皮内、腹膜内、經氣 管、眼内（包括玻螭體内）、皮下、表皮下、關節内、囊 下蛛網膜下、脊柱内、硬膜外及腦幹内注射及輸液。視 投藥路線而疋，C3b結合分子可經塗佈或提供於傳遞物質 135468.doc -70- 200924795 中以保護其免受可使本發明之結合分子失活t冑及其他自 然條件的作用。 本發明之醫藥化合物可包括一或多種醫藥學上可接受之 鹽。醫藥學上可接受之鹽"係指保留親本化合物之所要生 物活性且不賦予任何非所要毒物學效應的鹽（參見（例如），

Berge，S.M·等人，1977 J. Pharm· Sci. 66:1-19)。該等鹽之 實例包括酸加成鹽及鹼加成鹽。酸加成鹽包括衍生自以下 酸之彼等鹽：無毒無機酸’諸如鹽酸、硝酸、磷酸、硫 酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸及其類似物；以及無毒有機 酸，諸如脂族單羧酸及二羧酸、經苯基取代之烷酸、經基 烷酸、芳族酸、脂族磺酸及芳族磺酸，及其類似物。鹼加 成鹽包括衍生自以下鹼之鹽：鹼土金屬，諸如納、钟、 鎂、鈣及其類似物；以及無毒有機胺，諸如N，N，-二节基 己·一胺、N-甲基葡糖胺、氣普魯卡因（chloroprocaine) '膽 鹼、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因及其類似物。 本發明之醫藥組合物亦可包括醫藥學上可接受之抗氧化 劑。醫藥學上可接受之抗氧化劑之實例包括：水溶性抗氧 化劑，諸如抗壞血酸、半胱胺酸鹽酸鹽、硫酸氫鈉、焦亞 硫酸鈉、亞硫酸鈉及其類似物；油溶性抗氧化劑，諸如抗 壞血酸棕糊酸酯、丁基化經基苯甲謎（BHA)、丁基化經基 甲苯（BHT)、卵碟脂、沒食子酸丙酯、α-生育紛及其類似 物；及金屬螯合劑，諸如#檬酸、乙二胺四乙酸（EDTA)、 山梨糖醇、酒石酸、磷酸及其類似物。 可用於本發明之醫藥組合物中之適合水性及非水性載劑 135468.doc • 71 - 200924795 的實例包括水、乙醇、多元醇（諸‘ (褚如甘油、丙二醇、聚乙 二醇及其類似物），及其適合混合物，諸如撖欖油之植物 油及諸如油酸乙酿之可注射有機_。適當流動性可（例 藉由使用諸如卵磷脂之塗層物質，*八u 在分散液狀況下藉由維 持所需粒徑，及藉由使用界面活性劑來維持。 該等組合物亦可含有佐劑，諸如防腐劑、濕潤劑、乳化 劑及分散齊卜預防存在微生物可藉由滅菌程序（同上）及藉 ❹

由包含各種抗菌劑及抗真菌齊丨’例如對經基苯甲酸、氣丁 醇、苯酚山梨酸及其類似物來確保。在組合物中包括諸如 糖、氣化納及其類似物之等張劑亦可合乎需要。另外，可 注射醫藥形式之延長吸收可藉由包含延遲吸收之藥劑(諸 如單硬脂酸鋁及明膠）來產生。 醫藥學上可接受之载劑包括無菌水性溶液或分散液，及 用於臨時製備㈣可注射溶液或分散液之㈣粉末。該等 介質及藥劑用於醫藥活性物f之用途在此項技術中已知。 除非任何習知介質或藥劑不與活性化合物相容，否則涵蓋 其在本發明之醫藥組合物中之用途。補充性活性化合物亦 可併入組合物中。 治療組合物在製造及儲存條件下通常須無菌且穩定。本 發明之C3b結合分子可經調配轉液、微乳液、脂質體或 適於间藥物濃度之其他有序結構。載劑可為溶劑或分散介 質，：含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如甘油丙二醇及 聚乙一醇，及其類似物）及其合適混合物。適當流動 性可（例如）藉由使用諸如㈣脂之塗層，在分散液狀況下 I35468.doc -72- 200924795 藉由維持所需粒徑，及藉由使用界面活性劑來維 多狀況下，組合物可包括等張剤，例如糖、多-持。在許 甘露醇、山梨糖醇）或氯化鈉。可注射組合物之^醇（諸如 可藉由在該組合物中包括延遲吸收之藥劑（例如=長=收 酯及明膠）來產生。 硬脂酸 無菌可注射溶液可藉由於適當溶劑中併入 1而重之活性 ❹

化合物，需要時連同上文所牧舉成分中之—者或組合， 著滅菌微過濾來製備。一般而言，分散液係藉由將活性： 合物併入無菌媒劑中來製備，該無菌媒劑含有鹼性分散介 質及來自上文所枚舉之彼等成分之所需其他成分。在用於 製備無菌可注射溶液之無菌粉末的狀況下，製備方法為真 空乾燥及冷凍乾燥（凍乾），其產生活性成份加上來自其先 月’j經無菌過濾之溶液之任何額外所要成分的粉末。 可與載劑物質組合以產生單一劑型之活性成分之量將視 所治療之受檢者及特定投藥模式而變化。可與載劑物質組 合以產生單一劑型之活性成分之量將通常為產生治療效應 之組合物之彼量。通常，以100%計，該量將在約〇 〇1%至 約99°/❶活性成分，約0.1 %至約70%，或約1 %至約30%之與 醫藥學上可接受之載劑組合的活性成分之範圍内。 調整給藥方案以提供最佳所要反應（例如，治療反應）。 舉例而言’可投予單次快速劑量，可隨時間投予若干分開 劑量或劑量可如藉由治療情況之緊急需要所指示按比例降 低或増加。將非經腸組合物調配成易於投藥且劑量均一之 單位劑型為尤其有利的。如本文中所用之劑量單位係指適 135468.doc -73· 200924795 口作為單劑量用於欲治療之受檢者的物理離散單位；各 :位含有經計算以產生所要治療效應之預定量的與所要醫 藥載劑締合之C3b結合分子。本發明之劑量單位形式之規 格由活性化合物之獨特特徵及欲達成之特定治療效應及 在/見配該、、’ο σ刀子以供治療個體之敏感性的技術中之固有 限制來規定且直接視其而定。

為投予抗體，劑量在約〇 〇〇〇1至1〇〇毫克/公斤宿主體 重且更通|0.01至5毫克/公斤宿主趙重 而言’劑量可為0·3毫克/公斤體重、1毫克/公斤韹重、3毫 克/公斤體重、5毫克/公斤體重或1〇毫克/公斤體重或在卜 10 mg/kg之範圍内。一例示性治療方案需要每週一次、每 週欠每3週一次、每4週—次、_月—次、每3個月— 次或每3至6個月一次投藥。 本發月C3b抗體之、給藥方帛包括肖由靜脈内投予^毫克/ 厶斤體重或3毫克/公斤體重，所給定抗體使用以下給藥流 程中之一者：每4週6次劑量，隨後每3個月；每3週；一次 3毫克/公斤體重，接著每3週1毫克/公斤體重。 、’、。σ刀子之較佳投藥路線為局部應用於眼睛。眼用 組合物通常藉由一天1至4次將1至4滴無菌溶液或懸浮液， 或相田量之軟膏、凝膠或其他固體或半固體組合物應用於 感染眼睛之表面來投予至感染眼睛。調配物亦可調配為在 外科程序期間應用於感染眼睛之沖洗溶液。 C3b結合分子可根據常規程序調配為適於靜脈内、腹臈 内或玻璃體内注射之醫藥組合物。⑶結合分子係藉由靜 135468.doc -74 - 200924795 脈注射投予。大劑量靜脈内免疫球蛋白（IVIG)以及F(ab)2_ IVIG及甚至不相關人類單株抗體全部可結合C3a及C5a且 干擾其功能。Basta M.等人 F(ab)，2-mediated neutralization of C3a and C5a anaphylatoxins: a novel effector function of immunoglobulins. Nature Medicine 2003; 9:431-8。包含 . C3b結合分子之組合物可適於玻璃體内注射至眼睛。通 常’用於注射之組合物為於無菌等張水性緩衝液中之溶 液。在必要時，C3b結合分子亦可包括增溶劑及諸如利多 卡因（lignocaine)之局部麻醉劑以緩解注射位點處之疼痛。 通常，成分以單位劑型分離地或混合在一起供應，例如， 作為於指示活性劑數量之諸如安瓶或藥囊之密封容器中的 乾凍乾粕末或無水濃縮物。在欲藉由輸液投予組合物之 情況下，其可用含有無菌醫藥級水或鹽水之輸液瓶分配。 在藉由注射投予組合物之情況下，可提供具有滅菌注射用 水或鹽水之安瓶以便成分可在投藥之前混合。 G 在一實施例中，用於治療成年患者之新血管（濕潤型）年 齡相關只斑退化的適合劑量為每月一次玻璃體内注射0.5 克（5毫升）至感染眼睛中（約28天）。在結合分子注射 之⑴、。予足夠麻醉及廣效殺微生物劑。在每月注射不可行 • 之凊况下，治療可在前4次注射後減少為每3個月一次注 有效劍吾炎么

135468.doc 射。在另一實施例中，用於治療新血管黃斑退化之抗體之 同時投予具有不同結合特異性之兩種或 (例如單株抗體），在該狀況下，所投予 -75· 200924795 之各抗體之劑量在所指示之範圍内。C3b結合分子通常在 多種場合下投予。單—劑量之間的時間間隔可為（例如）每 週、每月、每3個月或每年。時間間隔亦可如量測患者中 針對C3b neo抗原決定基之結合分子的μ含量㈣^ 為無規律的nm調㈣量以達成約 Mg/m!之C3b結合分子血衆濃度且在一些方法中，為約25_ 300 pg/ml ° 或者’㈣結合分子可以持續釋放調配物形式投予，在 該狀況下’需要較低頻率之投藥。劑量及頻率視患者中 C3b結合分子之半衰期而變化。—般而言人類抗體展示 最長半衰期，接著為人化抗體、嵌合抗體及非人類抗體。 劑量及投藥頻率可視治療為預防性還是治療性而變化。在 預防性應用中，歷經長的時期，以相對不頻繁之時間間隔 投予相對低的劑量。-些患者在其餘生中持續接受治療。 在治療性應用中，有時需要以相對短之時間間隔接受相對 〇 冑的劑量直至疾病進程得以降低或終止或直至患者展示疾 病症狀部分或完全改善。其後，可投予患者預防性療法。 本發明之醫藥組合物中之活性成分的實際劑量含量可變 化，以便獲得對特定患者、組合物及投藥模式有效達成所 * I治療反應而無對患者之毒性的活性成分之量。所選劑量 含量將視多種藥物動力學因素而定，該等藥物動力學因素 包括所用本發明之特定組合物或其醋、鹽或酿胺的活性；、 投藥路線；投藥時間；所用特定化合物之排泄速率；治療 持續時間；與所用特定組合物組合使用的其他藥物、化二 135468.doc -76 - 200924795 物及/或物質；所治療患者之年齡、性別、體重、病狀、 一般健康狀況及先前醫療病史；及醫學技術中所熟知的類 似因素。 "治療有效劑量"之本發明C3b結合分子可使得疾病症狀 之嚴重性降低（例如，C3及/或C5轉化酶活性降低）、無疾 病症狀時段之頻率及持續時間增加，或預防由於罹患疾病 導致之損傷或失能。 本發明之結合分子可藉由一或多種投藥路線，使用此項 〇 技術中已知之多種方法中之一或多者來投予。如熟習此項 技術者所應瞭解’投藥路線及/或投藥模式將視所要結果 而變化。本發明C3b結合分子之投藥路線包括靜脈内、眼 内、玻璃體内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊椎或其 他非經腸投藥路線（例如藉由注射或輸液）。 或者，本發明之C3b結合分子可藉由諸如局部、表皮或 黏膜投藥路線之經腸路線，例如鼻内、經口、舌下或局部 φ 來投予。 活性化合物可用將保護該化合物免於快速釋放之載劑製 備’諸如受控釋放調配物’包括植入物、經皮貼片及微囊 • 化傳遞系、统。可使用生物可降解、生物可相容聚合物，諸 >乙烯乙酸乙烯酯 '聚酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸 醋及聚乳酸。製備該等調配物之許多方法均已申請專利或 通常為熟習技術者所已知。參「你丨. 參見（例如），Sustained及

Controlled Release Drug Delivers 8 ellvery Systems, j.r. Robinson 編，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。 135468.doc -77· 200924795 ’σ療組合物可用此項技術中已知之醫學裝置投予。舉例 而5，在-態樣中，可用無針皮下注射裝置來投予本發明 之治療組合物，該裝置諸如美國專利第5,399 163號；第 5,383,851 號，帛 5,312,335 號；帛 5,064,413 號；第 4,941,880^ ； ^ 4,790,824^^^ 4,596,556^ * 4。適用於本發明之熟知植人物及模組的實例包括：美國 專$第4,487,6Q3號，其展示-種用於以受控速率分配藥物 之可植入微輸液泵；美國專利第4,486，194號，其展示-種 用於經由皮膚投^藥物之治療裝置；美國專利第4 447,233 號，其展不-種用於以精確輸液速率傳遞藥物之藥物輸液 果’美國專利第4,447,224號，其展示—種用於連續傳遞藥 物之可變流速可植人輸液設備；美國專利第4,439，196號， 其展示-種具有多腔隔室之滲透性藥物傳遞系統；及美國 專利第4,475,196號’其展示—種滲透性藥物傳遞系統。該 等專利以引用之方式併入本文中。熟習此項技術者已知許 0 多其他此類植入物、傳遞系統及模組。 、在某些態樣中，可調配本發明之⑶結合分子以確保在 活體内適*分布。舉例而言，灰腦障壁或血液視 網膜障壁（"BRB")排除許多高度親水性化合物。為確保本 發日月之治療化合物穿過ΒΒΒ或BRB(若需要），可（例如）將 其調配在脂質體中。關於製造脂質體之方法，參見（例 如），美國專利第4,522,811號；第5,374,548號；及第 5,399,331號。脂f體可包含選擇性傳輸至㈣細胞或器 官，因此增強靶向藥物傳遞之一或多個部分(參見(例如）， 135468.doc -78- 200924795 V.V. Ranade，1989 J. Cline Pharmacol. 29:685)。例示性把 向部分包括葉酸或生物素（參見（例如），Low等人之美國專 利 5,416,016);甘露糖苷（Umezawa等人，1988 Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038);抗體（P.G· Bloeman 等 人，1995 FEBS Lett. 357:140 ; M. Owais 等人，1995 Antimicrob. Agents Chernother. 39:180);界面活性劑蛋白 質 A受體（Briscoe等人，1995 Am. J. Physiol. 1233:134); pl20(Schreier等人，1994 J. Biol. Chem. 269:9090);亦參 見 K. Keinanen ; M.L. Laukkanen， 1994 FEBSLett. 346:123 ； J.J. Killion ； I.J. Fidler, 1994 Immunomethods 4:273 ° 用途及方法 本文中所述之C3b結合分子具有活體外及活體内診斷及 治療效用。舉例而言，可將該等分子（例如）活體外或活體 内投予至培養物中之細胞，或（例如）活體内投予受檢者中 以治療、預防或診斷多種病症。C3b結合分子尤其適於治 療具有AMD或處於AMD風險中之人類患者，該AMD為一 種在約10%之狀況下與新血管生成（濕潤型AMD)、炎症及 視力損失相關之病狀。C3b結合分子亦適於治療具有諸如 以下疾病之疾病或病症之人類患者：腎炎、哮喘、再灌注 損傷、血液透析、類風濕性關節炎、全身性狼瘡、牛皮 癖、多發性硬化症、移植、阿茲海默氏病、aHUS、MPGN II或任何其他補體介導之疾病。 當C3b結合分子連同另一藥劑一起投予時，兩者可以任 135468.doc • 79- 200924795 一順序連續投予或同時投予。在一些態樣中，將C3b結合 分子投予至亦接受使用第二藥劑（例如，維替泊芬 (verteporfin))之療法之受檢者。在其他態樣中，結合外科 手術治療投予結合分子。 用於與C3b結合分子組合治療之適合藥劑包括此項技術 中已知能調控補體成份之活性之藥劑（參見（例如），美國專 利第5,808,109號）。已報導減低補體介導之活性之其他藥 劑。該等藥劑包括：胺基酸（Takada，Y.等人Immunology 1978，34，509);膦酸醋（Becker，L. Biochem. Biophy. Acta 1967，147, 289);聚陰離子物質（Conrow，R. B.等人J. Med. Chem. 1980，23，242);磺醯基氟化物（Hansch，C·; Yoshimoto，M. J. Med. Chem. 1974，17，1160，及其中引用 之參考文獻）；聚核苷酸（DeClercq，P. F·等人Biochem· Biophys. Res. Commun. 1975，67，255);海松月旨酸（pimaric acid)(Glovsky，Μ. M.等人 J. Immunol. 1969，102，1); 口卜吩 (porphine)(Lapidus, M.及 Tomasco，J. Immunopharmacol. 1981，3，137);多種消炎劑（Burge, J. J.等人 J. Immunol. 1978, 120, 1625);紛（Muller-Eberhard，H. J. 1978，in Molecular Basis of Biological Degradative Processes, Berlin, R. D.等人編。Academic Press, New York，第 65 頁）；及苯曱脒（Vogt，W.等人 Immunology 1979，36，138)。 一些該等藥劑藉由對蛋白酶及酯酶之一般性抑制來起作 用。其他藥劑對補體路徑中之任何特定中間步驟不具特異 性，但相反，抑制補體活化中一個以上之步驟。後者化合 135468.doc -80- 200924795 物之實例包括苯甲脒’其阻斷Cl、C4及C5利用（參見（例 如），Vogt 等人 Immunol. 1979，36，138) 〇 可抑制補體成份之活性之此項技術中已知之其他藥劑包 括K-76(—種來自葡萄穗黴菌（Stachybotrys)之真菌代謝 物）（Corey 等人，J. Amer. Chem· Soc. 104: 5551，1982)。已 展示K-76及Κ·76 COOH主要在C5步驟抑制補體（Hong等 人 ’ J，Immunol. 122: 2418，1979 ; Miyazaki 等人， Microbiol. Immunol. 24: 1〇91，1980)，且防止由正常人類 補體產生趨化性因子（Bumpers等人，Lab. Cline. Med. 102: 421，1983)。在K-76或K-76 COOH之高濃度下，展現一些 對C2、C3、C6、C7及C9與其各別先前中間物之反應之抑 制。亦已報導K-76或K-76 COOH抑制補體之C3b去活劑系 統（Hong等人，J. Immunol. 127: 104-108, 1981)。用於實施 本發明方法之其他適合藥劑包括灰黃黴素（griseofulvin) (Weinberg，in Principles of Medicinal Chemistry，第 2版， Foye，W. 〇.編，Lea & Febiger，Philadelphia, Pa·，第 813 頁，1981)、異潘那林（isopannarin)(Djura等人，Aust. J. Chem. 36: 1057，1983)，及穿孔海綿（Siphonodictyon coralli-phagum)之代謝物（Sullivan等人，Tetrahedron 37: 979， 1981)。 組合療法方案可相加，或其可產生協同結果（例如，對 於組合使用兩種藥劑，補體路徑活性之降低超過預期）。 在一些態樣中，使用C3b結合分子及抗血管生成劑（諸如抗 VEGF)之組合療法產生協同結果（例如，C3b生物活性之協 I35468.doc -81 - 200924795 同降低）。 由本發明之組合物及使用說明書組成之套組亦在本發明 之範疇内。套組可另外含有至少—種其他試劑，或本發明 之或多種其他抗體（例如，具有與不同於第一抗體之c3b neo抗原決定基結合之互補活性的抗體）。套組通常包括指 - 示該套組之内含物之預定用途的標籤。術語標籤包括供應 . 於該套組上或與其一起供應，或以其他方式伴隨該套組的 任何文字或記錄材料。 ❹ 本發明已經充分描述，其經由以下實例及申請專利範圍 進一步說明，該等實例及申請專利範圍為說明性的且不欲 進一步限制。熟習此項技術者應僅使用常規實驗認識到或 能夠確定本文中所述之特定程序之許多等效物。該等等效 物在本發明及申請專利範圍之範疇内。在本申請案中通篇 引用之包括所頒予專利及公開專利申請案之所有參考文獻 的内容在此以引用之方式全部併入本文中。 實例A藉由噬菌艘呈現產生人類抗艟 為產生針對C3b之抗體’進行使用MorphoSys HuCAL GOLD®噬菌體呈現集合庫之選擇，HuCAL gold®為基於 HuCAL®概念之Fab集合庫’其中所有六個cdr經多樣化且 其使用CySDiSplayTM技術以供將Fab片段連接於噬菌體表面

(Knappik等人，2000 J. Mol. Biol. 296:57-86 ; Krebs等人， 2001 J Immunol· Methods 254:67-84 ; Rauchenberger 等 人，2003 J Biol Chem. 278(40):38194-38205 ; WO 135468.doc -82- 200924795 01/05950, Ldhning, 2001) » 嗤粒援救（Phagemid rescue)、嗤菌體擴增及純化 使HuCAL GOLD®集合庫在含有34 pg/ml氣黴素 (〇111〇以111卩116111〇〇1)及1%葡萄糖（2)<丫丁-€0)之2父丫7'培養基中 擴增。在0.5之OD600nm nm下在用VCSM13辅助噬菌體感染 (30 min，37〇C 下，無搖動；30 min，37°C 下，以 250 rpm搖 動）之後，將細胞離心（4120 g ; 5 min ; 4°C)，將其再懸浮 於 2xYT/34 pg/ml 氣黴素/50 pg/ml康黴素（kanamycin)/0.25 mM IPTG中且使其在22°C下生長隔夜。將噬菌體自上清液 以PEG沈澱兩次，再懸浮於PBS/20%甘油中且在-80°C下儲 存。 在2輪淘選之間的噬菌體擴增如下進行：用經溶離噬菌 體感染中對數期大腸桿菌TG1細胞且塗鋪於補充有1%葡萄 糖及34 pg/ml氣黴素之LB瓊脂（LB-CG板）上。在30°C下培 養隔夜後，將TG1菌落刮離瓊脂板且用於接種2XYT-CG直 至達到0.5之OD6()()nm，且如上所述添加VCSM13輔助噬菌 體以供感染。 使用HuCAL GOLD®進行淘選 為選擇識別C3b neo抗原決定基之抗體，應用兩種不同 淘選策略。概括而言，將HuCAL GOLD®噬菌體-抗體分成 4個包含VH主基因之不同組合之池（池1 : VH1/5 λκ，池2 : VH3 λκ，池 3 : VH2/4/6 λκ，池4 : VH1-6 λκ)。使該等池 個別地對直接接合於磺酸基連接瓊脂糖珠粒之人類C3b及 直接塗於硫氫基結合板之C3b經受3輪固相淘選，及另外3 135468.doc • 83 - 200924795 次對生物素標記C3 b抗原之溶液淘選。

第一淘選變體為針對C3b neo抗原決定基之固相淘選： 用300 μΐ之5 pg/ml C3b塗佈硫氫基結合板（Corning)上之2 個孔-各在4°C下隔夜。用350 μΐ PBS將經塗佈孔洗滌2次， 且在RT下，在微量滴定板搖動器上，用350 μΐ 5% MPBS 阻斷2 h。對各淘選而言，將約1〇13 HuCAL GOLD®噬菌體-抗體以等體積之PBST/5%MP在室溫下阻斷2 h。阻斷之 後，用350 μΐ PBS將經塗佈孔洗滌2次。將300 μΐ經預阻斷 ® 之HuCAL GOLD®噬菌體-抗體添加至各經塗佈孔中且在RT 下在搖動器上培養2 h。藉由添加5次350 μΐ PBS/0.05% Tween執行洗滌，接著用PBS再洗滌4次。用300 μΐ於10 mM Tris/HCl pH 8中之20 mM DTT執行噬菌體自板之溶 離，每孔執行10 min。將DTT噬菌體溶離液添加至14 ml大 腸桿菌TG1中，使該等大腸桿菌在37°C下，在2YT培養基 中生長至0.6_0.8之OD6()()nm且在37。(：無搖動下，在50 ml塑 κ 膠管中培養45 min以供噬菌體感染。在5000 rpm下離心1〇 9 min後，將細菌離心塊各自再懸浮於500 μΐ 2χΥΤ培養基 中，塗鋪於2xYT-CG瓊脂板上且在30°C下培養隔夜。隨後 ’將菌落自板到離且如上所述援救及擴增噬菌體。根據第一 輪之方案對直接塗佈之C3b抗原執行第二及第三輪固相淘 選，但在洗滌程序中增加嚴格性。 第二淘選變體為針對生物素標記人類C3b抗原之溶液淘 選：對溶液淘選而言，使用與Dynabeads M-280(Dynal)偶 合之生物素標記C3b抗原，應用以下方案：在4°C下用經 I35468.doc -84- 200924795 PBS 1:1稀釋之i.5 mi 2x化學阻斷劑將1.5 ml Eppendorf管 阻斷隔夜。用200 μΐ PBS將經200 μΐ抗生蛋白鏈菌素塗佈 之磁性Dynabeads M-280(Dynal)洗滌1次，且將其再懸浮於 200 μΐ lx化學阻斷劑（稀釋於lxPBS中）中。在4°C下，在預 阻斷管中執行珠粒之阻斷。在RT下（旋轉器），將用於各淘 選條件之稀釋於500 μΐ PBS中之噬菌體與500 μΐ 2x化學阻 斷劑/0.1 % Tween混合1 h。執行兩次嗟菌體之預吸附：將 50 μΐ經阻斷抗生蛋白鏈菌素磁性珠粒添加至經阻斷噬菌體 中’且在RT下’在旋轉器上培養30 min。經由磁性裝置 (Dynal MPC-E)分離珠粒後，將噬菌體上清液（約1 ml)轉移 至新的經阻斷之管中且在50 μΐ經阻斷珠粒上重複預吸附3〇 min。隨後’將200 ηΜ生物素標記C3b添加至於新的經阻 斷1.5 ml管中之經阻斷噬菌體中且在rt下，在旋轉器上培 養1 將1〇〇 μΐ經阻斷抗生蛋白鏈菌素磁性珠粒添加至各 淘選噬菌體池中且在RT下，在旋轉器上培養1〇 min。將與 生物素標記C3b結合之噬菌體固定於磁性珠粒，且用磁性 粒子分離器（Dynal MPC-E)收集。隨後，在pbs/0.05% Tween中，使用旋轉器將珠粒洗滌7次，接著用Pbs再洗務 3次。將 300 μΐ於 10 mM Tris/HCl pH 8 中之20 mM DTT添加 至各管歷時10 min來執行喧菌體自Dynabeads之溶離。藉 由磁性粒子分離器移除Dynabeads，且將上清液添加至14 ml生長至0.6-0.8之0D_nm之大腸桿菌TG-1培養物中。隨 後，用200 μΐ PBS將珠粒洗滌一次且將PBS連同另外移除 之嗟菌體一起添加至14 ml E.coli TG-1培養物中。對嗤菌 135468.doc -85- 200924795 體感染而言，在37°C無搖動下，將培養物在50 ml塑膠管中 培養45 min。在5000 rpm下離心10 min後，將細菌離心塊 各自再懸浮於500 μΐ 2xYT培養基中，塗鋪於2xYT-CG瓊脂 板上且在30°C下培養隔夜。隨後將菌落自板到離，且如上 所述援救及擴增噬菌體。 根據第一輪之方案對生物素標記C3b抗原執行第二及第 三輪溶液淘選，其例外為在洗滌程序中增加嚴格性。 可溶性Fab片段之次選殖及表現 將所選HuCAL GOLD®噬粒之編碼Fab的插入物次選殖至 表現載體pMORPH®X9_Fab_FH中以促進可溶性Fab之快速 及有效表現。出於該目的，將所選純系之質體DNA用Xbal 及£coRI消化，進而切離編碼Fab之插入物（ompA-VLCL及 phoA-Fd)，且將其選殖至經Xbal/EcoRI消化之表現載體 pMORPH®X9_Fab_FH中。自該載體表現之Fab帶有兩個C 末端標籤（分別為FLAG™及6xHis)以供偵測及純化。

HuCAL GOLD® Fab抗體在大腸桿菌中之微表現 使用所選Fab次選殖至pMORPH®X9_Fab_FH表現載體中 後獲得之抗氣黴素單一來接種每孔含有100 μΐ 2XYT-CG培 養基之無菌96孔微量滴定板之孔，且在37°C下使其生長隔 夜。將5 μΐ各大腸桿菌TG-1培養物轉移至新鮮無菌96孔微 量滴定板中，該微量滴定板每孔經補充有34 pg/ml氣黴素 及0.1%葡萄糖之100 μΐ 2χΥΤ培養基預填充。在30°C下，在 微板搖動器上以400 rpm搖動下，培養微量滴定板直至培 養物略混濁（約2-4 hrs)，此時〇D6()()nm為約0.5。 135468.doc •86- 200924795 向該等表現板中每孔添加20 μΐ補充有34 gg/ml氣黴素及 3 mM IPTG(異丙基-β-Ε>_硫吡喃半乳糖苷）之2xYT培養基 (最終濃度為0.5 mM IPTG)，將該等微量滴定板以透氣性 膠帶密封，且將板在30°c下以400 rpm搖動下培養隔夜。 全細胞溶胞物（BEL萃取物）之產生：向表現板之各孔中 添加含有2.5 mg/ml溶菌酶之40 μΐ BEL緩衝液（2 χ BBS/EDTA ： 24.7 g/1 硼酸、18·7 g NaCl/1、1.49 g EDTA/1，pH 8.0)且在22°C下，在微量滴定板搖動器（400 ® rpm)上培養1小時。使用該等BEL萃取物供經由ELISA或

BioVeris M-series® 384分析儀之結合分析。 酶聯免疫吸附檢定（ELISA)技術 在4°C下，將於PBS中之5 Mg/ml人類重組C3b抗原塗佈於 384孔Maxisorp板（Nunc-免疫板）上隔夜。塗佈後’用 PBS/0.05% Tween(PBS-T)將孔洗滌一次且用PBS洗滌2次。 隨後，將孔用具有2% BSA之PBS-T在RT下阻斷2 h。將15 μΐ BEL萃取物及15 μΐ具有2% BSA之PBS-T在RT下平行培 參 養2 h。將經阻斷之Maxisorp板用PBS-T洗蘇3次，之後將 10 μΐ經阻斷BEL萃取物添加至孔中且在RT下培養1 h。為 • 偵測初級Fab抗體，應用以下二級抗體··鹼性磷酸酶（AP) - 接合AffiniPure F(ab')2片段、山羊抗人類、抗小鼠或抗大 鼠 IgG(Jackson Immuno Research)。為偵測AP-共輛物，根 據製造商之說明使用如AttoPhos(Roche)之螢光受質。在所 有培養步驟之間，將微量滴定板之孔用PBS-T洗滌3次且在 最後用二級抗體培養後洗蘇3次。在TEC AN Spectrafluor板 135468.doc -87· 200924795 讀取器中量測螢光。

HuCAL· GOLD® Fab抗體在大腸桿菌中之表現及純化 由pMORPH®X9_Fab_FH編碼之Fab片段在TG-1細胞中之 表現係在搖動器燒瓶培養物中，使用750 ml補充有34 gg/ml氣黴素之2xYT培養基來進行。在30°C下搖動培養物 . 直至OD_nm違到0.5 »藉由添加0.75 mM IPTG在30°C下誘 導表現20 h»使用溶菌酶破壞細胞且藉由Ni-NTA層析 (Qiagen，Hilden, Germany)分離Fab片段。可藉由UV分光光 ® 度測定法測定蛋白質濃度（Krebs等人J Immunol Methods 254, 67-84 (2001))。 實例B藉由LCDR3及HCDR2序列盒之平行交換進行所選抗 C3b neo抗原決定基Fab之親和力成熟 用於親和力成熟之Fab集合庫之產生 為增強所鑑別抗C3b抗體之親和力及抑制活性，使Fab純 系經受親和力成熟。出於該目的，藉由序列盒突變誘發， & 使用三核苷酸定點突變誘發將CDR區優化（Virnekas等人

Nucleic Acids Res 22, 5600-5607, 1994) ° 以下段落簡要描述可用於選殖成熟集合庫及Fab優化之 方案。將來自表現載體pMORPH®X9_Fab_FH之Fab片段選 殖至噬粒載體pMORPH®25(美國專利第6,753，Π6號）中。並 行應用兩種不同策略來優化親本Fab之親和力及功效》 產生噬菌體抗體Fab集合庫，其中六個所選成熟候選者 ("親本"純系）之LCDR3經個別輕鏈CDR3序列之全套置換。 並行地，使各親本純系之HCDR2區經個別重鏈CDR2序列 135468.doc • 88 - 200924795 之全套置換。親和力成熟集合庫係藉由標準選殖程序及使 多樣化純系轉型至電感受態大腸桿菌TOP10F'細胞 (Invitrogen)中來產生。如實例1中所述製備呈現Fab之嗟菌 體。建立相應於各集合庫之成熟池且在後續選擇過程期間 使其保持分離。 成熟淘選策略 使用4個抗體池之淘選係分別如上所述對於溶液中之C3b 執行3輪針對生物素標記C3b之溶液淘選。藉由減少各輪淘 選的生物素標記抗原，藉由延長洗滌步驟及藉由添加非生 物素標記抗原來增強選擇嚴格性以供解離速率（off-rate)選 擇。 用於偵測細菌溶胞物中C3b結合Fab之基於電化學發光 (BioVeri)之結合分析 大腸桿菌溶胞物（BEL萃取物）中經優化Fab抗體與C3b之 結合係在 BioVeris M-SERIES® 384 分析儀（BioVeris， Europe，Witney, Oxforfshire，UK)中分析。將BEL萃取物稀 釋於檢定緩衝液（PBS/0.05% Tween20/0.5°/〇 BSA)中用於 BioVeris篩選。使生物素標記C3b與經抗生蛋白鏈菌素塗佈 之順磁性珠粒偶合，使用BV-tagTM(BioVeris Europe, Witney，Oxfordshire, UK)對抗人類（Fab)’2(Dianova)進行釕 標記。將該二級抗體添加至經C3b偶合之珠粒中，之後在 BioVeris M-SERIES® 384分析儀中量測。進行來自BioVeris 篩選之採樣（hit)之序列分析以鑑別Fab純系。將所選Fab抗 體次選殖至IgGl格式中。 135468.doc -89- 200924795 使用溶液平衡滴定（SET)來測定皮莫耳親和力 對KD測定而言，使用Fab之單體溶離份（至少90%單體含 量，由分析型 SEC 分析；Superdex75， Amersham Pharmacia)。可基本上如由Haenel等人，2005所述，執行 溶液中之基於電化學發光（ECL)之親和力測定及資料評 估。用於溶液中之不同濃度（系列3n稀釋）C3b平衡恆定量之 Fab。添加與順磁性珠粒（M-280抗生蛋白鏈菌素，Dynal) 偶合之生物素標記C3b及經BV-tagTM(BioVeris Europe, Witney, Oxfordshire, UK)標記之抗人類（Fab)'2(Dianova)且 將混合物培養30 min。隨後，經由ECL偵測，使用MISERIES® 3 84分析儀（BioVeris Europe)量化未結合之Fab的 濃度。 基本上如上所述，以黑猩猩或獼猴C3b置換人類C3b， 在溶液中進行對另一物種（例如黑猩猩或獼猴）之C3b之親 和力測定。就偵測游離Fab而言，使用與順磁性珠粒偶合 之生物素標記C3b。根據Haenel等人（2005 Anal Biochem 339, 182-184)計算親和力。 實例C藉由溶血檢定偵測補體蛋白質 自具有年齡相關黃斑退化之患者獲得水狀液及玻璃體之 試樣。患者由於原發疾病（underlying disease)而經歷外科 手術，且在眼内外科手術開始時獲得試樣。獲得未經稀釋 之樣本（100-200 μΐ水狀液及200至300 μΐ玻璃體）且直接使 用或在-80°C下儲存。 自正常人類患者獲得水狀液及玻璃體樣本且在37°C下， 135468.doc -90- 200924795 用正常人類血清培養2小時。就對典型及替代補體路徑之 抑制而言，使用標準CH50及AH50溶血檢定來分析混合 物。在該等檢定中，自正常健康受檢者獲得正常人類血 清，且將其用作補體之來源且在-8(TC下以等分試樣儲 存。亦用在如此項技術中習用之微離心及凝膠過濾管柱後 獲得的溶離份處理正常人類血清。亦測定水狀液及玻璃體 中之總補體活性。 CH50檢定 CH50 檢定描述於 Kabat，EA.等人 Experimental Immunochemistry 1961，第133-239頁中。將正常人類血清 用作補體之來源且在-80。(：下以等分試樣儲存。亦測定單 獨水狀液及玻璃體中之總補體活性且利用綿羊紅血球 (SRBC)作為標靶細胞（可使用來自其他物種之紅血球，例 如雞紅血球）。在PH 7.35之GVB2+緩衝液（明膠/具有Ca2+及 Mg2+之Veronal緩衝鹽水）中製備含有SRBC/ml之懸浮液。 滴定溶血素（兔抗錦羊抗血清）以測定敏化SRBC之最佳稀釋 度。將經稀釋溶血素與等體積之SRBC混合且整體在37它 下培養15分鐘。此產生經抗體塗佈之紅血球（EA)。在m 下，用正常人類血清之連續兩倍稀釋液或正常人類血清及 測試樣本之混合物之相似稀釋液將EA培養丨小時。測試樣 本定義為在尺寸排阻管柱後獲得之微濃縮後獲得之未分級 分離水狀液/玻璃體、濾液及保留物。經GVB2+緩衝液培養 之正常人類企清用作對照。藉由單獨用緩衝液（不添加血 清）培養EA獲得背景對照、，且藉由將蒸館水添加至ea令來 135468.doc •91 - 200924795 測定總 >容解（1 〇〇〇/。溶血）。使用1 2 ml冰冷〇· 15 M NaCl終止 反應，將混合物離心以使未溶解細胞成粒，且以分光光度 法（412 nm)測定上清液之光學密度。相對於} 〇〇%溶解對照 測定溶血百分比。 藉由測定溶解檢定混合物中5〇%之細胞所需要的丘清稀 釋度來量化補體活性。結果表示為該稀釋度之倒數，以 CHw單位/血清毫升數為單位。 AH50檢定 使用Kabat等人中所述之標準方法進行ah50檢定，該方 法依賴於藉由活化替代路徑以人類血清溶解未敏化之兔紅 血球（Erab)。約依賴性典型路徑之活化藉由將的螯合劑乙 二醇四乙酸（EGTA)添加至檢定緩衝液中來防止，且將兩種 路徑所需之鎂添加至緩衝液中。在GVB-Mg2+-EGTA緩衝 液中製備兔RBC之細胞懸浮液《在GVB-Mg2+-EGTA緩衝液 中製備正常人類血清之連續1.5倍稀釋液或正常人類血清 及測試樣本之混合物之相似稀釋液，且將丨〇〇 μ1各血清稀 釋液添加至50 μΐ標準化Erab中。經GVB-Mg2+-EGTA緩衝 液培養之正常人類血清用作對照。隨後，在37。〇下，在搖 動水浴中，培養混合物60分鐘以在懸浮液中保持細胞，且 使用1.2 ml冰冷NaCl(0.15 M)來終止反應。在4°C下，以 1250 g將管離心1〇分鐘以使細胞成粒，且以分光光度法 (412 nm)測定上清液之光學密度，在總溶解對照管中，將 1 00 μΐ蒸餾水添加至50 μΐ Erab懸浮液中，且測定相對於 1 〇〇%溶解對照之溶血百分比。藉由測定溶解檢定混合物 135468.doc -92· 200924795 中50%之細胞所需要的血清稀釋度來量化補體活性。結果 表示為該稀釋度之倒數，以AH50單位/血清毫升數為單 位。

135468.doc -93- 200924795 [序列表] <110>瑞士商諾華公司 <120調控補體成份的分子及方法

<130 52320-WO-PCT <140 097142274 <141> 2008-10-31 <150〉 60/984951 <151〉 2007-11-02 <160〉 37

<17〇> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211〉 11 <212> PRT <213〉智人 <400> 1

Gly Glu Asp Thr Val Gin Ser Leu Thr Gin Gly 1 5 10 <210> 2 <211〉 16 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 2

Asp Glu Asp lie lie Ala Glu Glu Asn lie Val Ser Arg Ser Glu Phe 15 10 15 <210〉 3 <211> 11 <212> PRT <213〉智人 <400> 3 lie Arg Met Asn Lys Thr Val Ala Val Arg Thr 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 4

Ser Asp Gin Val Pro Asp 丁hr G]u Ser Glu Thr 1 5 10 <210> 5 <211〉 7 <212> PRT <213〉智人 <400> 5

Val Ala Gin Met Thr Glu Asp 1 5 135468.doc 200924795 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213〉智人 <400> 6

Phe Val Lys Arg Ala Pro <210〉 7 <211〉 15 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 7

Lys Asp Lys Asn Arg Trp Glu Asp Pro Gly Lys Gin Leu Tyr Asn 15 10 15 <210〉 8 <211〉 13 <212〉 PRT <213〉智人

<400〉 8

Cys Thr Arg Tyr Arg Gly Asp Gin Asp Ala Thr Met Ser 1 5 10 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213〉智人 <400> 9

Gly Phe Ala Pro Asp Thr Asp Asp Leu Lys Gin Leu Ala Asn Gly Val 1 5 10 15 <210> 10 <211> 12 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 10

Asp Ser Leu Ser Ser Gin Asn Gin Leu Gly Val Leu 1 5 10 ❿ <210> 11 <211> 14 <212> PRT <213〉智人 <400> 11 * Pro He Glu Asp Gly Ser Gly Glu Val Val Leu Ser Arg Lys 1 5 10 <210> 12 <21I> 12 <212> PRT <213〉智人 <400> 12

Gly Val Gin Asn Pro Arg Ala Glu Asp Leu Val Gly <2L0> 13 <211> 7 <212〉 PRT 2- 135468.doc 200924795 <213〉智人 <400> 13

Asp Gly Ser Pro Ala Tyr Arg 1 5 <210〉 14 <211> 9 <212> PRT <213〉智人 <400〉 14

Gin Gly Glu Asp Thr Val Gin Ser Leu <210〉 15 <211> 8 <212> PRT <213〉智人 <400〉 15

Lys Gin Glu Leu Ser Glu Ala Glu <210〉 16 <211> 12 <212> PRT <213〉智人 <400〉 16

Val Arg Glu Pro Gly Gin Asp Leu Val Val Leu Pro 1 5 10 <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213〉智人 <400〉 17

Val Val Lys Ser Gly Gin Ser Glu Asp Arg Gin Pro Val Pro Gly 15 10 15

<210〉 18 <211> 10 <212> PRT <213〉智人 <400〉 18

Val Glu Asp Leu Lys Glu Pro Pro Lys Asn 1 5 10 <210> 19 <211> 12 <212> PRT <213〉智人 <400> 19

Tyr Asn Tyr Arg Gin Asn Gin Glu Leu Lys Val Arg 1 5 10 <210> 20 <211> 10 <212〉 PRT <213>智人 <400> 20

Ala Thr Thr Lys Arg Arg His Gin Gin Thr 1 5 10 135468.doc 200924795 <210> 21 <211> 12 <212> PRT <213〉智人 <400> 21

His Phe lie Ser Asp Gly Val Arg Lys Ser Leu Lys 1 5 10 <210> 22 <2il> 11 <212> PRT <213〉智人 <400> 22

Ser Asp Gin Val Pro Asp Thr Glu Ser Glu Thr <210> 23 <211〉 9 <212〉 PRT <213〉智人

<400> 23

Thr Pro Ser Gly Cys Gly Glu Gin Asn <2I0> 24 <211〉 8 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 24

Glu Leu lie Lys Lys Gly Tyr Thr <210> 25 <211〉 12 <212> PRT <213〉智人 <400> 25 G]u Lys Gin Lys Pro Asp Gly Val Phe Gin Glu Asp 1 5 10 <210〉 26 <211〉 9 <212> PRT <213〉智人 φ <400> 26

Leu Arg Asn Asn Asn Glu Lys Asp Met <210〉 27 <211> 15 <212> PRT <213>智人 <400〉 27

Thr Thr Ala Lys Asp Lys Asn Arg Trp Glu Asp Pro Gly Lys Gin 15 10 15

<210> 28 <211> 13 <212> PRT 4- 135468.doc 200924795 <213〉智人 <400> 28

Cys Thr Arg Tyr Arg Gly Asp Gin Asp Ala Thr Met Ser 1 5 10 <210〉 29 <211> 16 <212> PRT <213〉智人 <400> 29

Gly Phe Ala Pro Asp Thr Asp Asp Leu Lys Gin Leu Ala Asn Gly Val 1 5 10 15 <210> 30 <211> 10 <212> PRT <213〉看人 <400> 30

His Ser Glu Asp Asp Cys Leu Ala Phe Lys 10 ❹

<210〉 31 <211〉 12 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 31

Ser Gly Ser Asp Glu Val Gin Val Gly Gin Gin Arg 1 5 10 <210> 32 <2il> 12 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 32

Leu Ser Ser Asp Phe Trp Gly Glu Lys Pro Asn Leu <210> 33 <211> 15 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 33

Glu Asp Glu Cys Gin Asp Glu Glu Asn Gin Lys Gin Cys Gin Asp 1 5 10 15 <210> 34 <211〉 9 <212> PRT <213〉智人 <400> 34

Asn Arg Glu Phe Lys Ser Glu Lys Gly <210> 35 <211〉 3 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 35 Gin Asn Leu 135468.doc 200924795 <210〉 36 <211〉 9 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 36

Glu Thr Glu Lys Arg Pro Gin Asp Ala <210〉 37 <211〉 2 <212> PRT <2i3>智人 <400> 37 Ser Asp ❹ 135468.doc

Claims (1)

1. 200924795 十、申請專利範圍： 1. 一種經分離之C3b結合分子，其包含與C3b neo抗原決定 基結合之抗原結合部分。 2. —種經分離之C3b結合分子，其包含與C3b抗原決定基特 異性結合之抗原結合部分，其中該抗原結合部分與下列 一種胺基酸内之人類C3b之抗原決定基或與下列一種胺 基酸重疊之人類C3b之抗原決定基結合： % (a) SEQ ID NO: 1之胺基酸 GEDTVQSLTQG ; O (b) SEQ ID NO: 2之胺基酸DEDIIAEENIVSRSEF ; (c) SEQ ID NO: 3之胺基酸IRMNKTVAVRT ; (d) SEQ ID NO: 4 之胺基酸 SDQVPDTESET ; (e) SEQ ID NO: 5之胺基酸 VAQMTED ; (f) SEQ ID NO: 6之胺基酸FVKRAP ; (g) SEQ ID NO: 7之胺基酸KDKNRWEDPGKQLYN ; (h) SEQ ID NO: 8之胺基酸 CTRYRGDQDATMS ;或 (i) SEQ ID NO: 9之胺基酸 GFAPDTDDLKQLANGV。 3. 如請求項1或2之C3b結合分子，其中該抗原結合部分可 與非人類靈長類動物之C3b抗原交又反應。 • 4.如請求項1或2之C3b結合分子，其中該抗原結合部分可 . 與齧齒動物物種之C3b抗原交又反應。 5. 如請求項1或2之C3b結合分子，其中該抗原結合部分與 線性抗原決定基結合。 6. 如請求項1或2中任一項之C3b結合分子，其中該抗原結 合部分與非線性抗原決定基結合。 135468.doc 200924795 7. 如請求項1或2之C3b結合分子，其中該抗原結合部分以 等於或小於1 nM之KD與人類C3b抗原結合。 8. 如請求項1或2之C3b結合分子，其中該其抗原結合部分 以等於或小於5 nM之KD與小鼠C3b抗原結合。 9. 如請求項1或2之C3b結合分子，其中該抗原結合部分為 人類抗體之抗原結合部分。 10. 如請求項1或2之C3b結合分子，其中該抗體為人化抗 體。 11. 如請求項1或2之C3b結合分子，其中該抗原結合部分為 單株抗體之抗原結合部分。 12. 如請求項1或2之C3b結合分子，其中該抗原結合部分為 多株抗體之抗原結合部分。 13. 如請求項1或2之C3b結合分子，其中該C3b結合分子為嵌 合抗體。 14. 如請求項1或2之C3b結合分子，其中該C3b結合分子包含 抗體之Fab片段、Fab·片段、F(ab')2或Fv片段。 15. 如請求項1或2之C3b結合分子，其中該C3b結合分子包含 單鍵Fv。 16. 如請求項1或2中任一項之C3b結合分子，其中該C3b結合 分子包含雙功能抗體。 17. 如請求項1或2之C3b結合分子，其中該抗原結合部分係 來源於以下同型中之一者之抗體：IgGl、IgG2、IgG3或 IgG4 〇 18. 如請求項1或2之C3b結合分子，其中該抗原結合部分係 135468.doc 200924795 來源於以下同型中之一者之抗體：IgGl、IgG2、IgG3或 IgG4，其中Fc序列相對於正常序列已改變，以調控效應 子功能或改變與Fc受體之結合。 19.如請求項18之C3b結合分子，其中該Fc序列之胺基酸殘 基234或235已改變。 . 20.如請求項1或2之C3b結合分子，其中該C3b結合分子抑制 細胞中之MAC產生。 21. 如請求項1或2之C3b結合分子，其中該C3b結合分子抑制 〇 C 3 b與轉化酶之結合。 22. 如請求項21之C3b結合分子，其中該C3b結合分子抑制C3 與C3或C5轉化酶之結合。 23·如請求項1或2之C3b結合分子，其中該C3b結合分子抑制 C3或C5轉化酶之蛋白質水解活性。 24·如請求項1或2之C3b結合分子，其中該C3b結合分子當在 存在C3b抗原之條件下與細胞接觸時，相對於在該C3b結 合分子不存在情況下之抑制作用而言，降低該細胞或表 ❹ 面上（i)C3或C5轉化酶或（ii)C5a或MAC或（iii)C3a或iC3b 或C3b之產生。 ^ 25. —種醫藥組合物，其包含如請求項1至2中任一項之C3b . 結合分子。 26· —種活體外抑制MAC合成之方法，該方法包含使細胞或 備解素（properdin)與C3b結合分子接觸。 27. —種肽，其係由與選自Seq ID NO: 1至37之胺基酸至少 90%—致之胺基酸序列組成。 135468.doc 200924795 28. 如請求項1或2之C3b結合分子，其係用於調控受檢者中 之C3b活性。 29. 如請求項1或2之C3b結合分子，其係用於治療受檢者之 眼睛病症。 30. 如請求項28之C3b結合分子，其中相對於在投予該組合 物之前受檢者中之MAC含量而言，該受檢者之MAC含量 降低至少5%。 3 1.如請求項29之C3b結合分子，其中該受檢者亦接受使用 第二藥劑之療法。 32. 如請求項29之C3b結合分子，其中該受檢者患有AMD或 處於患AMD之風險中。 33. 如請求項32之C3b結合分子，其中該受檢者展現乾燥型 AMD或處於患濕潤型AMD之風險中。 135468.doc 200924795 七、指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：（無） (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： Φ 八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： (無）

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