KR20100015773A - Ｃ５ 항원 및 그의 용도 - Google Patents

Ｃ５ 항원 및 그의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20100015773A
KR20100015773A KR1020097021990A KR20097021990A KR20100015773A KR 20100015773 A KR20100015773 A KR 20100015773A KR 1020097021990 A KR1020097021990 A KR 1020097021990A KR 20097021990 A KR20097021990 A KR 20097021990A KR 20100015773 A KR20100015773 A KR 20100015773A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
binding
binding molecule
protein
human
Prior art date
Application number
KR1020097021990A
Other languages
English (en)
Inventor
브레이든 찰스 길드
마크 테일러 키팅
마리우즈 밀리크
드미트리 미카일로프
마이클 로저스카
이고르 스플라우스키
케하오 짜오
Original Assignee
노파르티스 아게
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 노파르티스 아게 filed Critical 노파르티스 아게
Publication of KR20100015773A publication Critical patent/KR20100015773A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/04—Artificial tears; Irrigation solutions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4716—Complement proteins, e.g. anaphylatoxin, C3a, C5a
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/16—Ophthalmology

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)

Abstract

본 발명은 안과 장애를 치료하는 방법에 있어서의 보체 성분 C5 억제제의 용도 및 안과 장애를 치료하기 위한 약물을 제조하는 데에 있어서의 보체 성분 C5 억제제의 용도에 관한 것이다.
C5 항원, 항-C5 항체, 황반 변성, 안과 장애, 대체 보체 경로 억제제

Description

Ｃ５ 항원 및 그의 용도 {C5 ANTIGENS AND USES THEREOF}
황반 변성은 노인에게서 주로 발견되는 의학적 질환인데, 망막의 황반부로서 공지된 안구의 내층 중앙이 얇아지고, 위축되며 몇몇 경우에는 출혈을 보인다. 이로써, 중심 시력이 저하되어 세부 사항을 볼 수 없거나, 책을 읽을 수 없거나, 또는 얼굴을 인식할 수 없게 된다. 새로운 맥락막 혈관 형성의 발병 기전은 불분명한 부분이 많지만, 염증, 허혈증, 및 혈관형성성 인자의 국소적 생성과 같은 요인들이 중요한 것으로 여겨진다.
보체 시스템 단백질에 대한 유전자가 사람에게서 황반 변성 발생 위험과 상당한 연관이 있는 것으로 결정되었다. 보체 시스템은 미생물 감염증에 대항한 선천 면역에 있어 중요한 성분이고, 불활성 상태로 혈청 내에 통상 존재하는 단백질 군을 포함한다. 이들 단백질은 3가지 활성화 경로로 구성된다: 전통적 경로, 렉틴 경로 및 대체 경로. 미생물 표면 상의 분자는 이들 경로를 활성화시켜 C3-전환 효소로서 공지된 프로테아제 복합체를 형성시킬 수 있다. 전통적인 경로는 칼슘/마그네슘-의존적 케스케이드인데, 이는 항원-항체 복합체 형성에 의해 통상적으로 활성화된다. 이는 또한, 리간드와 복합체를 형성한 C-반응성 단백질의 결합에 의해, 그리고 그램 음성 세균을 포함한 많은 병원체에 의해 항체-비의존적 방식으로 활성화될 수 있다. 대체 경로는 마그네슘-의존적 케스케이드인데, 이는 특정의 감수성 표면 (예를 들어, 효모 및 세균의 세포벽 다당류, 및 특정의 생물 중합체 물질) 상에서의 C3의 축적 및 활성화에 의해 활성화된다.
대체 경로는 전통적 경로와 렉틴 경로의 활성을 증폭시키는 데에 참여한다. 보체 경로가 활성화되면 보체 단백질의 생물학적 활성 단편, 예를 들어 C3a, C4a 및 C5a 아나필라톡신 (anaphylatoxin) 및 C5b-9 막 공격 복합체 (MAC)가 형성되는데, 이는 백혈구 화학주성, 대식 세포, 호중구, 혈소판, 비만 세포 및 내피 세포의 활성화, 혈관 침투성 증가, 세포 용해 및 조직 손상의 연루를 통하여 염증 반응을 매개한다.
보체 성분 C5는 보체 케스케이드에서 렉틴, 전통적 및 대체 경로에 대해 공통적인 최종 경로의 주요 성분이다. 대체 및 전통적 경로의 C5 전환 효소에 의해 C5가 절단되면 C5b 단편과 C5a 단편이 산출된다. C5a와 C5b 둘 다는 프로-염증성 분자이다. C5a는 강력한 아나필로톡신이다. C5a는 C5a 수용체 (C5aR)와 결합하고 인간 백혈구로부터 프로-염증성 사이토킨, 예를 들어 TNF-α, IL-1β, IL-6 및 IL-8의 합성 및 방출을 자극한다. C5b는 용해성 이하 농도에서는 프로-염증성 세포 활성화에 기여할 수 있는 반면, 용해성 농도에서는 세포 사멸을 유도시키는, 공극을 형성하는 세포 막을 침투하는 막 공격 복합체 (MAC) 또는 말단 보체 복합체로서 공지되기도 한 C5b-9 (C5b, C6, C7, C8 및 C9) 어셈블리에 대한 핵화 부위로서 제공된다. AMD에 일조하는 염증 반응을 억제하기 위해서는, C5b-9 (MAC)의 형성과 C5a의 발생을 저하시킬 필요가 있다. 대체 및 전통적 경로의 C5 전환 효소에 의해 촉매되는 C5의 절단을 억제하는 것이 AMD를 치료적으로 처치하는 데에 중요할 수 있다.
전통적 또는 대체 보체 경로와 연관된 질병 및 장애, 특히 AMD를 치료하기 위한 현재의 치료 선택권에도 불구하고, 유효하고 널리 관용되는 치료를 제공해 주는 특이적 표적을 발견하는 것이 여전히 필요하다.
발명의 요약
본 발명은 서열 1 내지 6으로 이루어진 군 중에서 선택된 서열을 포함한 C5 단백질, 그의 단편, 및 상기 단백질의 제조 또는 사용 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, C5 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 포함하는 벡터 및 재조합 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 측면은 C5 보체 성분 활성을 조정하는 시험 작용제를 확인하는 방법 및 C5 항원의 결합 파트너를 확인하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 단리된 C5 단백질의 유용성은 보체 활성의 조절이상, 구체적으로 언급하면 황반 변성과 연관된 생물학적 활성에 관여하는 C5의 특이적 에피토프의 발견에 기초한다.
본 발명은 보체 경로 활성의 조절이상과 관련된 질병 또는 장애를 예방, 치료 및/또는 지연시키기 위한, 서열 1 내지 6으로 이루어진 군 중에서 선택된 C5의 하나 이상의 에피토프와 결합하는 결합 분자를 생성시키기 위한 면역원으로서의 C5 단백질 또는 그의 단편의 용도를 제공한다.
기타 측면에서, 본 발명은 대체 보체 경로의 한 가지 이상 성분을 억제하는 결합 분자를 제공하고, 안과 질병 또는 장애, 예를 들어 AMD를 예방, 치료 및/또는 지연시키기 위해 상기 결합 분자를 사용하거나 이를 제조하는 방법을 포괄한다.
특정의 기타 측면에서, 본 발명은 C5의 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 결합하는 유효량의 항체를 투여함으로써, 이를 필요로 하는 대상체의 보체 경로 시스템에서 C5 단백질 기능을 억제하는 것을 포함하는, 안과 질병 또는 장애를 치료 또는 예방하거나, 또는 그의 진행을 지연시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 보체 C5 기능의 단백질 억제제, C6에 대한 C5b 결합의 단백질 억제제 또는 그의 제약상 허용가능한 염을, 그에 대한 하나 이상의 제약상 허용가능한 희석제 또는 담체와 함께 포함하는, 치료적 처치 또는 예방적 처치 방법에 사용하기 위한 제약 조성물이 제공된다.
본 발명은 추가로, 안과 질병 또는 장애를 치료하거나 또는 그의 진행을 지연시키기 위한 의약을 제조하는 데에 있어서 대체 보체 경로를 억제할 수 있는 결합 분자의 용도를 제공하는데, 이러한 분자는 MAC 복합체의 생성 또는 C5 단백질 기능을 억제할 수 있다.
본 발명은 또한, 샘플을 C5 에피토프 또는 폴리펩티드 (예: 항체)를 코딩하는 핵산과 특이적으로 결합하는 결합 분자와 접촉시키고, 존재하는 경우 복합체 형성을 검출함으로써, 상기 샘플 중에서 C5 에피토프 또는 이를 코딩하는 핵산을 확인하는 방법을 제공한다. 또한, C5 에피토프를 특정 화합물과 접촉시키고, C5 단백질 활성이 변형되는지를 결정함으로써, C5 단백질의 활성을 조정하는 화합물 또는 결합 분자를 확인하는 방법이 제공된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체로부터 샘플을 제공하는 단계; 및 이러한 대상체 샘플 중에서 C5 단백질의 양을 측정하는 단계를 포함하는, 상기 대상체 에서 보체 경로 조절이상과 연관된 장애의 존재 또는 소인을 결정하는 방법을 제공한다. 이어서, 대상체 샘플 중에서 특별한 단백질 또는 억제의 양을 대조군 샘플 중에서의 해당 단백질 또는 억제의 양과 비교한다. 대조군 샘플은 매치된 개체, 즉 유사한 연령, 성별 또는 기타 일반적 상태지만, 보체 경로 관련 질환이 있는 것으로 추정되지 않는 개체로부터 취한 것이 바람직하다. 또 다른 한편, 대조군 샘플은 대상체가 보체 경로 조절이상과 연관된 질환이 있는 것으로 추정되지 않는 시점에 대상체로부터 취할 수 있다. 몇몇 측면에서, 관심있는 화합물 또는 결합 분자는 본원에 기재된 바와 같은 결합 분자, 구체적으로 언급하면 항체를 사용하여 검출한다.
본 발명의 추가 측면에서는, 샘플 중의 항체와 공지된 양의 본 발명의 항체 (항-C5) 또는 그의 기능적 등가 변이체 또는 단편 간을 경쟁적으로 결합시키는 단계 및 공지된 항체의 양을 측정하는 단계를 포함하는, 혈청 샘플 중에서 C5 단백질 결합을 알아보기 위한 스크리닝 방법이 제공된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 화합물 또는 결합 분자와 담체를 적합한 패키징으로 포함하는, 보체 경로 조절이상과 연관된 장애를 검출하기 위한 진단 키트에 관한 것이다. 이러한 키트는 바람직하게, C5 에피토프의 존재를 검출하기 위해 항체를 사용하는 것에 관한 지시 사항을 함유하고 있다. 바람직하게 담체는 제약상 허용가능하다.
본원에 사용된 바와 같은 "화합물" 또는 "본 발명의 화합물"은 펩티드를 포함한 단백질, 올리고뉴클레오티드, 펩티드 모방체, 상동체, 유사체, 및 그의 변형되거나 유도된 형태를 의미한다. 본 발명의 화합물에는 바람직하게, 서열 2, 4 및 6으로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산 서열, 그의 단편 및 유도체가 포함된다. 본 발명에는 또한, 그의 염기 모두가 상응하는 서열 2, 4 및 6으로부터 변화될 수 있지만, 여전히 단백질, 바람직하게 서열 1, 3 및 5로 이루어진 군 중에서 선택된 항원성 단백질을 코딩하는 돌연변이체 또는 변이체 서열이 포함된다.
"결합 분자"는 본 발명의 화합물, 바람직하게 서열 1 내지 6 중에서 선택된 화합물과 결합하는 항체, 유기 분자, 펩티드를 포함한 단백질, 올리고뉴클레오티드, 펩티드 모방체, 상동체, 유사체, 및 그의 변형되거나 유도된 형태를 의미한다.
본 발명의 화합물 및 결합 분자의 유도체 또는 유사체에는 동일한 크기의 핵산 또는 아미노산 서열에 걸쳐 또는 당해 분야에 공지된 컴퓨터 상동성 프로그램에 의해 정렬시킨 서열에 비해 각종 양태에서 본원에 기재된 핵산 또는 단백질과 약 70％, 80％ 또는 95％ 이상의 동일성 (바람직한 동일성은 80 내지 95％이다)을 나타낼 정도로 실질적으로 상동성이거나, 또는 그의 코딩 핵산이 엄격한, 적당한 수준으로 엄격한, 또는 낮은 수준으로 엄격한 조건 [참고: Ausubel et al., 1987] 하에 전술된 단백질을 코딩하는 서열의 보체와 혼성화할 수 있는 영역을 포함하는 분자가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 C5 단백질의 항원성 에피토프, 선형 또는 비선형 에피토프와 특이적으로 결합하는 결합 분자, 이러한 항원성 에피토프 및 결합 분자의 제조 및 사용 방법을 제공한다. 본 발명자들은 보체 경로 조절이상과 연관된 장애, 바람직하게는 안과 질병 및 장애를 예방, 치료 또는 개선시키기 위해 조정될 수 있는 서열 1 내지 6 중에서 선택된 서열을 갖는 C5의 에피토프를 처음으로 기재하고 있다.
본 발명에 의해 치료 또는 예방될 수 있는 특정의 안과 질병 및 장애는 적어도 안구 일부의 염증 및/또는 신생혈관증식을 포함한다. 본원에 제공된 방법에 의해 치료 또는 예방될 수 있는 특정의 비제한적 질병 및 장애에는 황반 변성, 당뇨병성 안과 질병 및 장애, 안구 부종, 허혈성 망막병증, 시신경염, 포낭 모양 황반 부종, 망막 질병 및 장애, 병리학적 근시, 미숙아 망막병증, 혈관화, 거부성 또는 기타 염증성 각막 (각막 수술 또는 이식을 수반하거나 수반하지 않음), 건성 각막결막염 또는 안구 건조증이 포함된다. 특정의 측면에서, 본 발명의 화합물, 결합 분자 및 방법에 의해 치료 및 예방하기에 적합한 바람직한 안과 질병 및 장애에는 연령 관련 황반 변성, 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 황반 부종, 및 미숙아 망막병증이 포함된다. 이러한 치료적 접근 방식을 잠재적으로 받을 수 있는 기타 안과 질병에는 내부 및 외부 안구 염증 장애, 예를 들어 포도막염, 공막염, 상공막염, 결막염, 각막염, 안와 연조직염, 안구 근육염, 갑상선 안와질환, 눈물샘 또는 눈꺼풀 염증이 포함된다.
본원에 정의된 바와 같은 "안과 질병 또는 장애"에는 당뇨병성 안과 질병 또는 장애, 안구 부종, 신생혈관증식을 수반한 허혈성 망막병증, 시신경염, 포낭 모양 황반 부종 (CME), 망막 질병 또는 장애, 예를 들어 신생혈관성 병리학적 근시, 미숙아 망막병증 (ROP), 혈관화, 거부성 또는 기타 염증성 각막 (각막 수술 또는 이식을 수반하거나 수반하지 않음), 건성 각막결막염 또는 안구 건조증이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 치료적 접근 방식을 잠재적으로 받을 수 있는 기타 안과 질병에는 내부 및 외부 안구 염증 장애, 예를 들어 포도막염, 공막염, 상공막염, 결막염, 각막염, 안와 연조직염, 안구 근육염, 갑상선 안와질환, 눈물샘 또는 눈꺼풀 염증이 포함된다.
본원에 정의된 바와 같은 "당뇨병성 안과 질병 또는 장애"에는 당뇨병성 망막병증 (DR), 당뇨병성 황반 부종 (DME), 증식성 당뇨병성 망막병증 (PDR)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 특별한 항원성 에피토프는 서열 1 내지 6 및 그의 보체에 의해 코딩된다.
특별한 항원성 에피토프는 서열 1, 3 및 6과 85％ 이상, 바람직하게 90％, 보다 바람직하게 95％ 동일한 아미노산 서열을 갖고 있다.
3가지 표면 노출된 항원성 에피토프가 C5 단백질 상에서 확인된다. 이러한 에피토프는 다음을 포함한, 결합을 위한 항원성 부위로서 3개의 선형 아미노산 서열에 기초하는데, 2개는 보체 성분 C5의 알파 쇄 상에 있고 1개는 베타 쇄 상에 있다:
1). 뉴클레오티드 서열 TGCGTTAATAATGATGAAACCTGTGAGCAG (서열 2)에 의해 코딩된, C5 알파 쇄 상에 CVNNDETCEQ (서열 1)을 포함하는 아미노산 서열;
2). 뉴클레오티드 서열 CAGGATATTGAAGCATCCCACTACAGAGGCTACGGAAACTCTGAT (서열 4)에 의해 코딩된, C5 알파 쇄 상에 QDIEASHYRGYGNSD (서열 3)을 포함하는 아미노산 서열;
3). 뉴클레오티드 서열 ACTTAAAAGATGATCAAAAAGAAATG (서열 6)에 의해 코딩된, C5 베타 쇄 상에 DLKDDQKEM (서열 5)을 포함하는 아미노산 서열.
폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드
본 발명의 단리된 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 당해 분야에 공지된 적합한 모든 방법에 의해 생성시킬 수 있다. 이러한 방법에는 직접적인 단백질 합성 방법에서부터 단리된 폴리펩티드 서열을 코딩하는 DNA 서열을 구축하고 이들 서열을 적합한 형질전환된 숙주에서 발현시키는 방법까지 다양하다.
표준 시험관내 단백질 합성 방법을 적용하여 관심있는 단리된 폴리펩티드 서열을 합성할 수 있다.
재조합 방법의 한 측면에서는, 관심있는 야생형 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 단리 또는 합성함으로써 DNA 서열을 구축한다. 임의로, 서열을 부위 특이적 돌연변이 유발에 의해 돌연변이 유발시켜 그의 기능적 유사체를 제공하거나, 또는 기타 모든 수단, 예를 들어 또 다른 유전자 서열과 융합시켜 융합 단백질을 생성시키거나 또는 유전자 서열의 특이적 부분을 결실시켜 야생형 형태와 비교해서 특이적 부분이 결여된 단백질이 발현되도록 함으로써 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 막관통 (transmembrane) 도메인을 결실시킬 수 있는데, 이로써 그의 본래 상태에서는 막 고정되는 분비된 단백질 버전이 창출된다.
관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 구축하는 또 다른 방법은 올리고뉴클레오티드 합성기를 이용하는 화학적 합성에 의해서일 것이다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 바람직하게, 목적하는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 기초하고, 바람직하게는 관심있는 재조합 폴리펩티드가 생성될 숙주 세포에서 선호되는 코돈의 선별에 기초하여 설계할 수 있다. 예를 들어, 서열 1, 3 및 5의 에피토프를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 올리고머를 합성할 수 있다. 한 가지 특징에서, 이들 에피토프의 일부를 코딩하는 몇 가지 소형 올리고뉴클레오티드를 합성한 다음, 연결할 수 있다. 개개의 올리고뉴클레오티드는 전형적으로, 상보적 어셈블리를 위한 5' 또는 3' 오버행 (overhang)을 함유한다. 완전한 아미노산을 사용하여 역해독된 유전자를 구축할 수 있다.
일단 어셈블리되면 (합성, 폴리머라제 연쇄 반응, 부위 지정 돌연변이 유발 또는 기타 모든 방법에 의해 이루어짐), 관심있는 특별한 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 돌연변이체 DNA 서열을 발현 벡터 내로 삽입하고, 목적하는 숙주 내에서 단백질을 발현시키기에 적당한 발현 제어 서열과 작동가능하게 연결시킬 것이다. 적당한 어셈블리는 뉴클레오티드 서열 분석, 제한 맵핑, 및 적합한 숙주 내에서의 생물학적 활성 폴리펩티드의 발현에 의해 확증할 수 있다. 당해 분야에 널리 공지된 바와 같이, 숙주 내에서 고 발현 수준의 형질감염된 유전자를 획득하기 위해서는, 유전자를 상기 벡터에 의해 형질전환된 선택된 발현 숙주에서 기능성인 전사 및 번역 발현 제어 서열과 작동가능하게 연결시켜야만 한다.
발현 제어 서열 및 발현 벡터의 선택은 상응하는 숙주 선택에 좌우될 것이다. 광범위한 발현 숙주/벡터 조합을 이용할 수 있다. 진핵 숙주에 유용한 발현 벡터에는, 예를 들어 SV40, 소 유두종 바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 시토메갈로바이러스로부터의 발현 제어 서열을 포함하는 벡터가 포함된다. 세균성 숙주에 유용한 발현 벡터에는 공지된 세균성 플라스미드, 예를 들어 에스케리챠 콜라이 (Escherichia coli)로부터의 플라스미드, 예를 들면 pCRI, pBR322, pMB9 및 그의 유도체, 보다 광범위한 숙주 범위 플라스미드, 예를 들어 M13 및 섬유상 단일 가닥 DNA 파아지 (phage)가 포함된다. 바람직한 이. 콜라이 (E. coli) 벡터에는 람다 파아지 pL 프로모터를 함유하는 pL 벡터 [참고: 미국 특허 제4,874,702호], T7 폴리머라제 프로모터를 함유하는 pET 벡터 및 pSP72 벡터가 포함된다. 효모 세포에 유용한 발현 벡터에는, 예를 들어 2 g 및 동원체 (centromere) 플라스미드가 포함된다.
추가로, 각 특이적 발현 벡터 내에서, 이들 DNA 서열을 삽입하기 위한 각종 부위를 선별할 수 있다. 이들 부위는 통상적으로, 이들을 절단시키는 제한 엔도뉴클레아제에 의해 지정된다. 이는 당업자에게 널리 인식되어 있다. 본 발명에 유용한 소정의 발현 벡터는 선택된 DNA 단편을 삽입하기 위한 제한 엔도뉴클레아제 부위를 가질 필요가 없다는 것을 인지해야 할 것이다. 대신, 벡터는 대체 수단에 의해 단편에 연결될 수 있다.
발현 벡터, 및 선별된 DNA 단편을 삽입하고 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결시키기 위해 선택된 부위는 각종 요인, 예를 들어 특별한 제한 효소에 대해 감수성인 부위 수, 폴리펩티드의 크기, 폴리펩티드가 어떻게 용이하게 단백질 분해적으로 분해되는지 등에 의해 결정된다. 소정의 DNA에 대한 삽입 부위 및 벡터의 선택은 이들 요인의 밸런스에 의해 결정된다.
본 발명의 재조합 구조물을 적당히 전사시키기 위해서는, 적합한 프로모터/인핸서 서열을 재조합 벡터 내로 혼입시키는 것이 바람직할 수 있는데, 단 이러한 프로모터/발현 제어 서열은 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전사를 구동시킬 수 있어야 한다. 광범위한 모든 발현 제어 서열을 이들 벡터에 사용할 수 있다. 이러한 유용한 발현 제어 서열에는 앞서 언급한 발현 벡터의 구조적 유전자와 연관된 발현 제어 서열이 포함된다. 유용한 발현 제어 서열의 예에는, 예를 들어 SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, 파아지 람다, 예를 들어 pL의 주요 작동인자 및 프로모터 영역, fd 외피 단백질의 제어 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 기타 당분해 효소에 대한 프로모터, 산 포스파타제의 프로모터, 예를 들어 Pho5, 효모 α-교배 시스템의 프로모터 및 원핵 또는 진핵 세포 및 그의 바이러스의 유전자 발현을 제어하는 것으로 공지된 기타 서열, 및 그의 각종 조합이 포함된다. 언급된 많은 벡터가 시판되고 있다.
적합한 모든 숙주를 사용하여 본 발명의 단리된 화합물을 일정 량으로 생성시킬 수 있는데, 이러한 숙주에는 세균, 진균 (효모 포함), 식물, 곤충, 포유류, 또는 기타 적당한 동물 세포 또는 세포주 뿐만 아니라 트랜스제닉 (transgenic) 동물 또는 식물이 포함된다. 보다 특히, 이들 숙주에는 널리 공지된 진핵 및 원핵 숙주, 예를 들어 이. 콜라이, 슈도모나스 (Pseudomonas), 바실루스 (Bacillus), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 진균, 효모 [예: 한세눌라 (Hansenula)], 곤충 세포, 예를 들어 스포도프테라 피루기페르다 [Spodoptera firugiperda (SF9)], 및 HIGH FIVE, 동물 세포, 예를 들어 중국산 햄스터 난소 (CHO), 마우스 세포, 예를 들어 NS/O 세포, 아프리카 그린 원숭이 세포, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40, 및 BMT 10, 및 인간 세포 뿐만 아니라 식물 세포가 포함될 수 있다.
진핵 세포에서 폴리펩티드의 발현을 제어하기 위해 사용될 수 있는 프모모터에는 SV40 초기 프로모터 영역, 라우스 (Rous) 육종 바이러스의 3' 장 말단 반복 서열 내에 함유된 프로모터, 헤르페스 티미딘 키나제 프로모터, 메탈로티오닌 유전자의 조절성 서열이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
폴리펩티드를 식물에서 발현시키는 경우에는, 노팔린 합성 효소 프로모터 영역 또는 콜리플라워 모자이크 (cauliflower mosaic) 바이러스 35S RNA 프로모터 및 광합성 효소 리불로스 바이포스페이트-카복실라제에 대한 프로모터를 포함하는 식물 발현 벡터를 사용해야 한다.
폴리펩티드를 효모 또는 기타 진균에서 발현시키는 경우에는, Gal 4 프로모터, ADC (알코올 데히드로게나제) 프로모터, PGK (포스포글리세롤키나제) 프로모터, 알칼리성 포스파타제 프로모터 등의 프로모터 요소를 선택해야 한다.
폴리펩티드를 트랜스제닉 동물에서 발현시키는 경우에는, 조직 특이성을 나타내고 트랜스제닉 동물에서 활용된 바 있는, 다음 동물 전사 제어 영역을 사용할 수 있다: 췌장 세포에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 제어 영역; 췌장 세포에서 활성인 프로모터에 대한 인슐린 유전자 인핸서; 림프계 세포에서 활성인 면역글로불린 유전자 인핸서 또는 프로모터; 시토메갈로바이러스 초기 프로모터 및 인핸서 영역; 고환, 유방, 림프계 및 비만 세포에서 활성인 마우스 유방 종양 바이러스 제어 영역; 간에서 활성인 알부민 유전자 제어 영역; 간에서 활성인 알파-태아단백질 유전자 제어 영역; 간에서 활성인 α-항트립신 유전자 제어 영역; 골수성 세포에서 활성인 β-글로빈 유전자 제어 영역; 뇌 중의 희돌기아교세포에서 활성인 미엘린 염기성 단백질 유전자 제어 영역; 골격근에서 활성인 미오신 경쇄-2 유전자 제어 영역; 및 시상하부에서 활성인 성선자극성 방출 호르몬 유전자 제어 영역.
DNA 서열을 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결시키는 것에는 이러한 DNA 서열의 정확한 리딩 프레임 상류에 번역 출발 신호를 제공하는 것이 포함된다. 발현되는 특별한 DNA 서열이 메티오닌과 함께 시작하지 않는 경우에는, 출발 신호로 인해 생성물의 N-말단에 위치하는 부가의 아미노산 (메티오닌)이 생성될 것이다. 소수성 부분을 N-말단 메티오닐-함유 단백질에 연결시켜야 하는 경우에는, 단백질을 본 발명의 조성물에 직접 이용할 수 있다. 그러나, 그들과 함께 발현된 폴리펩티드로부터 N-말단 메티오닌을 제거하는 방법이 당해 분야에서 이용되기도 한다. 예를 들어, 특정의 숙주와 발효 조건을 이용하여 실질적으로 모든 생체내 N-말단 메티오닌을 제거할 수 있다.
반드시 모든 벡터 및 발현 제어 서열이 소정의 단리된 폴리펩티드를 발현하기 위해 동등한 수준으로 잘 기능하지는 않다는 것을 인지해야 한다. 모든 숙주가 반드시 동일한 발현 시스템과 함께 동등한 수준으로 잘 기능하지도 않을 것이다. 그러나, 당업자는 과도한 실험없이도 이들 벡터, 발현 제어 시스템 및 숙주 중에서 선별할 수 있다.
이들 폴리뉴클레오티드 구조물을 소정의 발현 벡터 내로 성공적으로 혼입하는 것은 3가지 일반적 접근 방식에 의해 확인할 수 있다: (a) DNA-DNA 혼성화, (b) "마커" 유전자 기능의 존재 또는 부재, 및 (c) 삽입된 서열의 발현. 제1 접근 방식에서는, 삽입된 유전자와 상동성인 서열을 포함하는 프로브를 사용하여 DNA-DNA 혼성화함으로써, 발현 벡터 내에 삽입된 유전자의 존재를 검출할 수 있다. 제2 접근 방식에서는, 외래 유전자를 벡터 내에 삽입함으로써 유발된 특정의 "마커" 유전자 기능 (예를 들어, 티미딘 키나제 활성, 항생제, 예를 들어 G418에 대한 내성, 형질전환 표현형, 바쿨로바이러스에서의 봉입체 형성 등)의 존재 또는 부재에 근거하여 재조합 벡터/숙주 시스템을 확인 및 선별할 수 있다. 예를 들어, 벡터의 마커 유전자 서열을 일시 중단시키도록 폴리뉴클레오티드를 삽입하는 경우에는, 이러한 삽입물을 함유하는 재조합체는 마커 유전자 기능의 부재에 의해 확인할 수 있다. 제3 접근 방식에서는, 재조합 벡터에 의해 발현된 외래 유전자 생성물을 검정함으로써 재조합 발현 벡터를 확인할 수 있다. 이러한 검정은, 예를 들어 생물학적 검정 시스템에서 유전자 생성물의 물리적 또는 기능적 특성에 기초할 수 있다.
변형된 단백질 치료제를 코딩하는 재조합 핵산 분자는 당해 분야에 공지된 방법 [참고: Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.]에 의해 수득할 수 있거나, 또는 공개적으로 입수가능한 클론으로부터 수득할 수 있다. 변형에는 결실, 삽입, 점 돌연변이, 기타 폴리펩티드와의 융합이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 몇몇 양태에서, 합성 힌지 (hinge) 영역을 수반한 정확한 리딩 프레임 내에 관심있는 치료제를 코딩하는 서열을 수용하는 재조합 벡터 시스템을 창출시킬 수 있다. 부가적으로, 재조합 벡터 시스템의 일부로서, RNA 절단/폴리아데닐화 부위 및 하류 서열을 포함한 면역글로불린 유전자의 3' 플랭킹 영역에 상응하는 핵산을 포함하는 것이 요망될 수 있다. 더우기, 재조합 벡터로 형질전환시킨 세포로부터 단백질 치료제의 분비를 촉진시키기 위해 변형된 단백질 치료제의 신호 서열 상류를 공학 처리시키는 것이 요망될 수 있다. 이는 통상적으로, 막-결합된 단백질이, 대신 분비되는 방식으로 변형되는 경우에는 특히 흥미롭다.
형질전환된 숙주에 의해 생성된 단백질은 적합한 모든 방법에 따라서 정제할 수 있다. 이러한 표준 방법에는 크로마토그래피 (예: 이온 교환, 친화, 및 사이징 칼럼 크로마토그래피), 원심분리, 시차 용해도, 또는 단백질 정제를 위한 기타 모든 표준 기술이 포함된다. 면역친화 크로마토그래피하는 경우에는, 관심있는 단백질 또는 교차 반응성 단백질에 대항하여 생성되었고 고정된 지지체에 고착된 항체를 포함하는 친화 칼럼에 결합시켜 실질적으로 순수한 단백질을 수득함으로써, 관심있는 단백질을 단리시킬 수 있다. 용어 "실질적으로 순수한"이란 단백질에 이와 천연적으로 연합된 불순물이 없다는 것을 의미한다. 실질적 순도는 전기영동에 의한 단일 밴드에 의해 입증될 수 있다. 단리된 단백질은 단백질 용해, 핵 자기 공명, 및 X-선 결정학과 같은 기술을 이용하여 물리적으로 성상 확인할 수도 있다.
안티센스 , 리보자임 , 삼중 나선 RNA 간섭 및 앱타머 기술
본 발명의 또 다른 측면은 화합물 및/또는 변형된 화합물의 치료제로서의 용도에 관한 것이다. 몇몇 측면에서, 핵산은 유전자 전이 벡터를 통하여 세포 내부에서 생성된다. 기타 측면에서, 이들 핵산은 생체내 포유류 대상체에게 직접 투여하는데, 예를 들어 다음에 기재된 4가지 상이한 기술이 포함된다: 안티센스, 리보자임, RNA 간섭 및 앱타머.
본 발명의 안티센스 RNA 및 DNA, 리보자임, 및 삼중 나선 분자는 DNA 및 RNA 분자를 합성하는 것으로 당해 분야에 공지된 모든 방법에 의해 제조할 수 있다. 이에는 당해 분야에 널리 공지된 올리고데옥시리보뉴클레오티드 및 올리고리보뉴클레오티드를 화학적으로 합성하기 위한 기술, 예를 들어 고체 상 포스포르아미다이트 화학적 합성이 포함된다. 또 다른 한편, RNA 분자는 안티센스 RNA 분자를 코딩하는 DNA 서열을 시험관내 및 생체내 전사함으로써 생성시킬 수 있다. 이러한 DNA 서열은 적합한 RNA 폴리머라제 프로모터, 예를 들어 T7 또는 SP6 폴리머라제 프로모터가 혼입된 광범위한 벡터 내로 혼입시킬 수 있다. 또 다른 한편으론, 사용된 프로모터에 따라서, 안티센스 RNA를 구성적으로 또는 유도적으로 합성하는 안티센스 cDNA 구조물을 세포주 내로 안정적으로 도입할 수 있다.
더우기, 핵산 분자에 대한 각종의 널리 공지된 변형을 세포내 안정성과 반감기를 증가시키기 위한 수단으로서 도입할 수 있다. 가능한 변형에는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드의 플랭킹 서열을 해당 분자의 5' 및/또는 3' 말단에 부가하거나, 또는 올리고데옥시리보뉴클레오티드 주쇄 내의 포스포디에스테라제 연쇄가 아닌 2' O-메틸 또는 포스포로티오에이트를 사용하는 것이 포함되는데, 이에 제한되지 않는다.
안티센스
본원에 사용된 바와 같은 "안티센스" 요법은, 예를 들어 C5 단백질의 전사 및/또는 번역을 억제함으로써 C5의 발현 또는 활성화를 억제하도록 C5의 하나 이상의 에피토프를 코딩하는 게놈 DNA 및/또는 세포내 mRNA와 세포내 조건 하에 특이적으로 혼성화하는 (예를 들어, 결합하는) 올리고뉴클레오티드 분자 또는 그의 유도체를 투여하거나 계내 생성시키는 것을 지칭한다. 이러한 결합은 통상적인 염기 쌍 상보성에 의해서일 수 있거나, 또는 예를 들어, DNA 이중체와 결합하는 경우에는, 이중 나선의 주요 홈에서의 특이적 상호 작용을 통해서일 수 있다. 일반적으로, "안티센스" 요법은 당해 분야에서 일반적으로 이용되고 있는 범위의 기술을 지칭하고, 이에는 올리고뉴클레오티드 서열에 대한 특이적 결합에 의존하는 모든 요법이 포함된다.
본 발명의 안티센스 구조물은, 예를 들어 세포 내에서 전사되는 경우에 C5 항원성 단백질을 코딩하는 세포내 mRNA의 서열에 대해 상보적인 RNA를 생성시키는 발현 플라스미드로서 전달될 수 있다. 또 다른 한편, 안티센스 구조물은 생체외에서 생성되고, 세포 내로 도입되는 경우에 C5 폴리뉴클레오티드의 mRNA 및/또는 게놈 서열과 혼성화함으로써 발현 억제를 유발시키는 올리고뉴클레오티드 프로브이다. 이러한 올리고뉴클레오티드 프로브는 내인성 뉴클레아제, 예를 들어 엑소뉴클레아제 및/또는 엔도뉴클레아제에 대해 저항성이므로, 생체 내에서 안정한 변형된 올리고뉴클레오티드가 바람직하다. 안티센스 올리고뉴클레오티드로서 사용하기 위해 예시되는 핵산 분자는 DNA의 포스포르아미데이트, 포스포티오에이트 및 메틸포스포네이트 유사체이다 [참고: 미국 특허 제5,176,996호; 제5,264,564호; 및 제5,256,775호]. 안티센스 DNA와 관련하여, 서열 2, 4 및 6 중에서 선택된 서열로부터 유래된 올리고데옥시리보뉴클레오티드가 바람직하다.
안티센스 접근 방식은 C5 단백질의 에피토프를 코딩하는 mRNA에 대해 상보적인 올리고뉴클레오티드 (DNA 또는 RNA)를 설계하는 것을 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 mRNA 전사체와 결합하여 번역을 방지시킬 것이다. 절대 상보성이 바람직하긴 하지만, 반드시 요구되는 것은 아니다. 이중 가닥 안티센스 핵산의 경우에는, 이중체 DNA의 단일 가닥을 시험할 수 있거나 또는 삼중체 형성을 검정할 수 있다. 혼성화할 수 있는 능력은 상보성 정도와 안티센스 핵산의 길이 둘 다에 좌우될 것이다. 일반적으로, 혼성화되는 핵산이 더 길수록, 안정한 이중체 (또는 경우에 따라, 삼중체)를 함유할 수 있고 여전히 이를 형성할 수 있는, RNA와의 염기 미스매치가 더 많아진다. 당업자는 혼성화된 복합체의 융점을 결정하기 위한 표준 과정을 사용함으로써 관용 가능한 정도의 미스매치를 확인할 수 있다.
mRNA의 5' 말단, 예를 들어 AUG 개시 코돈 까지 및 이를 포함하는 5' 비번역 서열에 대해 상보적인 올리고뉴클레오티드는 번역을 억제하는 데에 있어서 가장 효율적으로 작동해야 한다. mRNA의 3' 비번역 서열에 대해 상보적인 서열은 또한, mRNA의 번역을 억제하는 데에 있어서 유효한 것으로 밝혀졌다. 따라서, 유전자의 5' 또는 3' 비번역, 비-코딩 영역에 대해 상보적인 올리고뉴클레오티드를 안티센스 접근 방식에 사용하여 mRNA의 번역을 억제할 수 있었다. mRNA의 5' 비번역 영역에 대해 상보적인 올리고뉴클레오티드는 AUG 출발 코돈의 보체를 포함해야 한다. mRNA 코딩 영역에 대해 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드는 덜 효율적인 번역 억제제이지만, 본 발명에 따라서 사용할 수도 있었다. mRNA의 5', 3' 또는 코딩 영역과 혼성화되도록 설계되었든지 간에, 안티센스 핵산은 길이가 6개 이상 뉴클레오티드여야 하고, 길이가 바람직하게 약 100개 미만, 보다 바람직하게 약 50, 25, 17 또는 10개 미만 뉴클레오티드이다.
표적 서열의 선택에 상관없이, 유전자 발현을 억제시킬 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 능력을 정량화하는 시험관내 연구를 먼저 수행하는 것이 바람직하다. 이들 연구는 올리고뉴클레오티드의 비특이적 생물학적 효과와 안티센스 유전자 억제 간을 구별시켜 주는 대조군을 활용하는 것이 바람직하다. 이들 연구가 표적 RNA 또는 단백질의 수준을 내부 대조군 RNA 또는 단백질의 수준과 비교하는 것이 또한 바람직하다. 부가적으로, 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하여 수득된 결과를 대조군 올리고뉴클레오티드를 사용하여 수득된 결과와 비교하는 것이 고려된다. 대조군 올리고뉴클레오티드가 시험 올리고뉴클레오티드와 대략 동일한 길이이고, 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 표적 서열과의 특이적 혼성화를 방지시키기에 필요한 정도로만 안티센스 서열과 상이한 것이 바람직하다.
올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥의 DNA 또는 RNA 또는 그의 키메라 혼합물 또는 유도체 또는 변형된 버전일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어 해당 분자의 안정성, 혼성화 등을 개선시키기 위해, 염기 부분, 당 부분 또는 포스페이트 주쇄에서 변형시킬 수 있다. 올리고뉴클레오티드에는 기타 첨부 기, 예를 들어 펩티드 (예를 들면, 숙주 세포 수용체를 표적화하기 위함), 또는 세포 막 [참고: PCT 공개공보 WO88/09810] 또는 혈액-뇌 장벽 [참고: 예를 들어, PCT 공개공보 WO89/10134]을 가로지르는 수송을 촉진시켜 주는 작용제, 혼성화-촉발된 절단제 또는 삽입제가 포함될 수 있다. 이를 위하여, 올리고뉴클레오티드를 또 다른 분자, 예를 들어 펩티드, 혼성화 촉발된 가교 결합제, 수송제, 혼성화 촉발된 절단제 등과 접합시킬 수 있다.
안티세느 올리고뉴클레오티드는 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 히포크산틴, 크산틴, 4-아세틸시토신, 5-(카복시히드록시트리에틸) 우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카복시메틸아미노메틸우라실, 디히드로우라실, β-D-갈락토실퀘오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실; β-D-만노실퀘오신, 5'-메톡시카복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 (v), 와이부톡소신 (wybutoxosine), 슈도우라실, 퀘오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸 에스테르, 우라실-5-옥시아세트산 (v), 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카복시프로필) 우라실, (acp3)w, 및 2,6-디아미노퓨린을 포함하지만, 그에 제한되지 않는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 변형된 염기 부분을 포함할 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드는 아라비노스, 2-플루오로아라비노스, 크실룰로스 및 헥소스를 포함하지만, 그에 제한되지 않는 군 중에서 선택된 하나 이상의 변형된 당 부분을 포함할 수도 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드는 중성 펩티드-유사 주쇄를 함유할 수도 있다. 이러한 분자는 펩티드 핵산 (PNA)-올리고머로 명명된다. PNA 올리고머의 한 가지 이점은 DNA의 중성 주쇄로 인해 배지의 이온 강도와 본질적으로 무관하게 상보적 DNA와 결합할 수 있는 능력이다. 또 다른 양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미도티오에이트, 포스포르아미데이트, 포스포르디아미데이트, 메틸포스포네이트, 알킬 포스포트리에스테르, 및 포름아세탈 또는 그의 유사체로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 변형된 포스페이트 주쇄를 포함한다.
추가의 측면에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 아노머성 올리고뉴클레오티드이다. 아노머성 올리고뉴클레오티드는 통상적인 단위와는 달리, 가닥들이 서로 나란히 진행되는 상보적 RNA와 특이적 이중 가닥 하이브리드를 형성한다. 올리고뉴클레오티드는 2'-O-메틸리보뉴클레오티드, 또는 키메라 RNA-DNA 유사체이다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 당해 분야에 공지된 표준 방법, 예를 들어 자동화 DNA 합성기 (예를 들어, Biosearch, Applied Biosystems 등으로부터 시판되고 있다)를 사용함으로써 합성할 수 있다. 예로서, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 당해 분야에 공지된 방법에 의해 합성할 수 있고, 메틸포스포네이트 올리고뉴클레오티드는 제어 공극 유리 중합체 지지체를 사용함으로써 제조할 수 있다.
mRNA 서열의 코딩 영역에 대해 상보적인 안티센스 뉴클레오티드를 사용할 수 있지만, 전사된 비번역 영역에 대해 상보적인 안티센스 뉴클레오티드 및 개시 메티오닌을 포함하는 영역에 대해 상보적인 안티센스 뉴클레오티드가 가장 바람직하다.
C5 단백질을 생체 내에서 발현하는 세포에 안티센스 분자를 전달할 수 있다. 안티센스 DNA 또는 RNA를 세포에 전달하기 위한 수 많은 방법이 개발되었는데; 예를 들어, 안티센스 분자를 조직 부위에 직접 주사할 수 있거나, 또는 목적하는 세포를 표적으로 하도록 설계된 변형된 안티센스 분자 (예를 들어, 표적 세포 표면 상에 발현된 항원 또는 수용체와 특이적으로 결합하는 항체 또는 펩티드와 연결된 안티센스)를 전신 투여할 수 있다.
그러나, 특정의 경우에는 내인성 mRNA 상에서의 번역을 저해시키기에 충분한 안티센스의 세포내 농도를 달성하는 것이 곤란할 수 있다. 따라서, 바람직한 접근 방식은 안티센스 올리고뉴클레오티드를 강력한 pol m 또는 pol II 프로모터의 제어 하에 놓아두는 재조합 DNA 구조물을 활용한다. 환자에게서 표적 세포를 형질감염시키기 위해 상기 구조물을 사용하게 되면 충분한 양의 단일 가닥 RNA가 전사되는데, 이는 내인성 헷지호그 (hedgehog) 신호 전달 전사체와 상보적 염기 쌍을 형성함으로써 번역을 방지시킬 것이다. 예를 들어, 벡터를 생체내 도입하여 이것이 세포에 의해 흡수되어 안티센스 RNA의 전사를 지시하도록 할 수 있다. 이러한 벡터는 목적하는 안티센스 RNA를 생성시키도록 전사될 수 있는 한은, 에피솜성을 유지할 수 있거나 염색체 통합될 수 있다. 이러한 벡터는 당해 분야에서 표준인 재조합 DNA 기술 방법에 의해 구축할 수 있다. 벡터는 플라스미드, 바이러스성, 또는 포유류 세포에서 복제 및 발현을 위해 사용되어 온 것으로 당해 분야에 공지된 기타일 수 있다. 안티센스 RNA를 코딩하는 서열의 발현은 포유류, 바람직하게 인간 세포에서 작용하는 것으로 당해 분야에 공지된 모든 프로모터에 의해서일 수 있다. 이러한 프로모터는 유도성 또는 구성성일 수 있다. 상기 프로모터에는 SV40 초기 프로모터 영역, 라우스 육종 바이러스의 3' 장 말단 반복 서열 내에 함유된 프로모터, 헤르페스 티미딘 키나제 프로모터, 메탈로티오닌 유전자의 조절성 서열 등이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다 [참고: Brinster et al, 1982, Nature 296:3942]. 모든 유형의 플라스미드, 코스미드, YAC 또는 바이러스성 벡터를 사용하여 조직 부위 내로 직접 도입할 수 있는 재조합 DNA 구조물을 제조할 수 있다. 또 다른 한편, 목적 조직을 선택적으로 감염시키는 바이러스성 벡터를 사용할 수 있는데, 이러한 경우에는 또 다른 경로 (예를 들어, 전신)에 의해 투여를 수행할 수 있다.
리보자임
C5 mRNA 전사체를 촉매적으로 절단하도록 설계된 리보자임 분자를 사용하여 mRNA의 번역을 방지시킬 수도 있다 [참고: 예를 들어, PCT 국제공개공보 W090/11364 (1990년 10월 4일자로 공개됨); 미국 특허 제5,093,246호]. mRNA를 부위 특이적 인식 서열에서 절단시키는 리보자임을 사용하여 특별한 mRNA를 붕괴시킬 수 있지만, 해머헤드 (hammerhead) 리보자임을 사용하는 것이 바람직하다. 해머헤드 리보자임은 표적 mRNA와 상보적 염기 쌍을 형성하는 플랭킹 영역에 의해 지시된 위치에서 mRNA를 절단시킨다. 유일한 요구 사항은 표적 mRNA가 다음 2개 염기 서열을 가져야 한다는 것이다: 5'-UG-3'.
본 발명의 리보자임에는 또한, RNA 엔도리보뉴클레아제 ["케치 (Cech)-유형 리보자임"으로 후술됨], 예를 들어 테트라히메나 더모필라 (Tetrahymena thermophila)에서 천연적으로 발생하고 (IVS, 또는 L-19 IVS RNA로서 공지됨) 국제공개공보 WO88/04300에 공개된 것이 포함된다. 케치-유형 리보자임은 표적 RNA 서열과 혼성화되는 8개 염기 쌍 활성 부위를 갖고 있는데, 그 후에 표적 RNA의 절단이 일어난다. 본 발명은 8개 염기 쌍 활성 부위 서열을 표적으로 하는 케치-유형 리보자임을 포괄한다.
안티센스 접근 방식에서와 같이, 리보자임은 변형된 올리고뉴클레오티드로 구성될 수 있고 (예를 들어, 개선된 안정성, 표적화 등을 위함), 생체 내에서 C5 단백질을 발현하는 세포로 전달해야 한다. 바람직한 전달 방법은 강력한 구성성 pol III 또는 pol II 프로모터의 제어 하에 리보자임을 "코딩하는" DNA 구조물을 사용하여, 형질감염된 세포가 표적화된 메시지를 붕괴시키고 번역을 억제시키기에 충분한 양의 리보자임을 생성시킬 수 있도록 하는 것을 포함한다. 리보자임은 안티센스 분자와는 달리 촉매적이기 때문에, 보다 낮은 세포내 농도가 효율적으로 요구된다.
삼중 나선 형성
또 다른 한편, 내인성 C5 유전자 발현은 체내 표적 세포에서 유전자의 전사를 방지시키는 삼중 나선 구조물을 형성하는 유전자의 조절성 영역 (즉, 프로모터 및/또는 인핸서)에 대해 상보적인 데옥시리보뉴클레오티드 서열을 표적화함으로써 저하시킬 수 있다.
전사 억제를 위해 삼중 나선 형성에 사용될 핵산 분자는 바람직하게 단일 가닥이고 데옥시리보뉴클레오티드로 구성된다. 이들 올리고뉴클레오티드의 염기 조성은 일반적으로 이중체의 한 가닥 상에 존재할 퓨린 또는 피리미딘의 꽤 큰 연장물을 요구하는, 훅스틴 (Hoogsteen) 염기 쌍 형성 법칙을 통하여 삼중 나선 형성을 증진시켜야 한다. 뉴클레오티드 서열은 피리미딘에 의거할 수 있는데, 이로써 생성되는 삼중 나선의 3개 연합 가닥을 가로질러 TAT 및 CGC 삼중자가 생성될 것이다. 피리미딘이 풍부한 분자는 해당 가닥과 나란한 배향으로 이중체의 단일 가닥의 퓨린 풍부 영역에 대한 염기 상보성을 제공한다. 또한, 예를 들어 G 잔기 연장물을 함유하는 퓨린 풍부한 핵산 분자를 선택할 수 있다. 이들 분자는 GC 쌍이 풍부한 DNA 이중체와 삼중 나선을 형성할 것이며, 대다수의 퓨린 잔기는 표적화 이중체의 단일 가닥 상에 위치하여 삼중체 내의 3개 가닥에 걸처 CGC 삼중자가 생성된다.
또 다른 한편, 삼중 나선 형성을 표적으로 할 수 있는 잠재적 서열은 소위 "스위치백 (switchback)" 핵산 분자를 창출시킴으로써 증가시킬 수 있다. 스위치백 분자는 교대 5'-3', 3'-5' 방식으로 합성하여, 이들이 먼저 이중체의 한 가닥과 염기 쌍을 형성한 다음, 다른 가닥과 염기 쌍을 형성하도록 하여 퓨린 또는 피리미딘의 꽤 큰 연장물이 이중체의 한 가닥 상에 존재해야 하는 필요성을 없애준다.
RNA 간섭
RNA 간섭 (RNAi)이 유전자를 억제하는 편재성 기전인 것으로 보인다는 발견은 유전자 발현을 저하시키는 또 다른 신규 접근 방식을 제안하는데, 이는 상기 언급된 기타 접근 방식의 한계점을 극복시켜 줄 수 있다. 소분자 간섭 RNA (siRNA)는 RNAi의 중심에 있다. siRNA의 안티센스 가닥은 RNAi 억제성 복합체에 의해 사용되어 상보적 mRNA 분자의 절단을 유도시키므로, 상응하는 유전자의 발현을 억제시킨다.
따라서, RNAi에게 영향을 주는 본 발명은 접근 방식과 유효성 면에서 기타 핵산에 의거한 전략 (안티센스 및 리보자임 방법)과 상이한데: (a) 안티센스 전략에 비해 RNAi는 촉매적 공정에 영향을 주는데, 즉 소량의 siRNA는 표적 세포 내에서 표적 유전자 mRNA의 농도를 감소시킬 수 있다. 안티센스는 화학량론적 공정에 기초하기 때문에, 훨씬 더 많은 농도의 효과기 분자가 표적 세포 내에서 요구되는데, 즉 내인성 mRNA의 농도와 등가이거나 이 보다 더 많은 농도가 요구된다. 따라서, RNAi는 촉매적 공정이기 때문에, 치료 효과를 매개하기 위해서는 보다 적은 양의 효과기 분자 (즉, siRNA)면 충분하다. (b) 리보자임 (이는 또한 촉매적 기능을 갖는다)에 비해, RNAi는 보다 융통성 있는 전략인 것으로 보이는데, 이는 보다 광범위한 표적 서열을 표적화함으로써 구조물 설계에 있어 보다 융통성을 제공해준다. 더우기, RNAi 구조물의 설계는 신속하고 편리한데, 이는 당업자가 RNAi 표적 유전자의 서열 정보에 기초하여 이들 구조물을 설계할 수 있기 때문이다. 리보자임을 이용하는 경우에는, 보다 시행 착오적 실험과 보다 정교한 설계 알고리즘이 요구되는데, 이는 리보자임이 사실상 보다 복잡하기 때문이다. 마지막으로, (c) RNAi는 리보자임에 비해 생체 내에서 더 효능이 있는데, 이는 RNAi가 편재성, 내인성 세포 기구에 영향을 주기 때문이다.
본 발명은 또한, 단백질에 의거한 전략과도 상이한데, 이는 RNAi가 비-내인성 단백질 (예: 인공 전사 인자)의 발현을 요구하지 않으므로, 의도하지 않은 면역 반응 위험을 저하시키기 때문이다.
요약하면, 유전자 발현의 RNAi 매개된 하향 조절은 기존의 유전자 발현 하향 조절 접근 방식에 비해 명백한 이점을 지닌 신규한 기전이다.
RNAi 구조물은 표적 유전자의 발현을 특이적으로 차단시킬 수 있는 이중 가닥 RNA를 포함한다. 따라서, RNAi 구조물은 특별한 유전자의 발현을 특이적으로 차단시킴으로써 길항제로서 작용할 수 있다. "RNA 간섭" 또는 "RNAi"는 초기에는, 식물 및 벌레에서 관찰된 현상에 적용된 용어인데, 여기서는 이중 가닥 RNA (dsRNA)가 특이적이고도 전사 후 방식으로 유전자 발현을 차단시켜 준다. 특정 이론에 얽매이지 않을 경우, RNAi는 mRNA 분해에 관여하는 것으로 여겨지지만, 생화학적 기전은 현재 연구가 왕성한 분야이다. 작용 기전에 관한 몇몇 의문점에도 불구하고, RNAi는 시험관내 또는 생체 내에서 유전자 발현을 억제하는 유용한 방법을 제공해준다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "dsRNA"는 siRNA 분자, 또는 이중 가닥 특징을 포함하고 세포 내에서 siRNA로 프로세싱될 수 있는 기타 RNA 분자, 예를 들어 헤어핀 (hairpin) RNA 부분을 지칭한다.
용어 "기능 상실"은 이것이 대상 RNAi 방법에 의해 억제된 유전자를 지칭하기 때문에, RNAi 구조물의 부재 하에서의 수준과 비교한 경우에 유전자의 발현 수준 상의 감소를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "RNAi를 매개하는"이란 RNA가 RNAi 공정에 의해 분해되어야 한다는 것, 예를 들어 분해가 서열-비의존적 dsRNA 반응 (예: PKR 반응)에 의해서가 아니라 서열 특이적 방식으로 일어난다는 것을 특징지울 수 있는 능력을 지칭 (지시)한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "RNAi 구조물"은 소분자 간섭 RNA (siRNA), 헤어핀 RNA, 및 siRNA를 형성시키기 위해 생체 내에서 절단될 수 있는 기타 RNA 종을 포함하기 위해 명세서 전반에 걸쳐 사용된 총칭적 용어이다. 본원에서의 RNAi 구조물에는 또한, 세포 내에서 dsRNA 또는 헤어핀 RNA를 형성하는 전사체, 및/또는 생체 내에서 siRNA를 생성시킬 수 있는 전사체를 야기시킬 수 있는 발현 벡터 (RNAi 발현 벡터로서 지칭되기도 함)가 포함된다.
"RNAi 발현 벡터" (본원에서 "dsRNA-코딩 플라스미드"로서 지칭되기도 함)는 해당 구조물이 발현되는 세포에서 siRNA 부분을 생성시키는 RNA를 발현 (전사)하기 위해 사용된 복제 가능한 핵산 구조물을 지칭한다. 이러한 벡터에는 이중 가닥 RNA (siRNA로 프로세싱될 수 있는 단일 헤어핀 RNA, 또는 siRNA를 형성하기 위해 세포에서 어닐링되는 2개의 RNA 부분)를 생성하도록 전사되는 "코딩" 서열 (2)과 작동가능하게 연결된, 유전자 발현에 있어 조절 역할을 하는 유전 요소(들) (1), 예를 들어 프로모터, 작동인자, 또는 인핸서와, 적당한 전사 개시 및 종결 서열 (3)의 어셈블리를 포함하는 전사 단위가 포함된다. 프로모터 및 기타 조절성 요소의 선택은 일반적으로, 의도된 숙주 세포에 따라서 다양하다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에 활용되는 발현 벡터는 종종 "플라스미드" 형태인데, 이는 그의 벡터 형태에서는 염색체와 결합되지 않는 환상 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 본 명세서에서, "플라스미드"와 "벡터"는 상호 교환적으로 사용되는데, 이는 플라스미드가 가장 흔히 사용되고 있는 형태의 벡터이기 때문이다. 그러나, 본 발명은 등가의 기능을 제공하고 당해 분야에서 후속 공지되는 기타 형태의 발현 벡터도 포함한다.
RNAi 구조물은 세포의 생리적 조건 하에서, 억제시키고자 하는 유전자 (즉, "표적" 유전자)에 대한 mRNA 전사체의 적어도 일부의 뉴클레오티드 서열과 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 이중 가닥 RNA는 RNAi를 매개할 수 있는 능력을 지니고 있는 천연 RNA와 단지 충분히 유사하기만 하면 된다. 따라서, 본 발명은 유전자 돌연변이, 균주 다형증 또는 진화적 분기로 인해 예상될 수도 있는 서열 변이를 관용할 수 있는 이점을 지니고 있다. 표적 서열과 RNAi 구조물 서열 간의 관용된 뉴클레오티드 미스매치 수는 5개 염기쌍 중의 단지 1개, 또는 10개 염기쌍 중의 1개, 또는 20개 염기쌍 중의 1개, 또는 50개 염기쌍 중의 1개이다.
siRNA 이중체의 중앙에 있는 미스매치가 가장 결정적이고, 이는 본질적으로 표적 RNA의 절단을 없앨 수 있다. 이와는 달리, 표적 RNA에 대해 상보적인 siRNA 가닥의 3' 말단에 있는 뉴클레오티드는 표적 인식 특이성에 상당히 기여하지 않는다.
서열 동일성은 당해 분야에 공지된 서열 비교 및 정렬 알고리즘을 사용하고 [참고: Gribskov and Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press, 1991], 디폴트 파라미터를 이용하는 BESTFIT 소프트웨어 프로그램 (공급처: 예를 들어, University of Wisconsin Genetic Computing Group)으로 이행된 바와 같은 스미스-워터맨 (Smith-Waterman) 알고리즘에 의해 뉴클레오티드 서열 간의 상이율을 계산함으로써 최적화할 수 있다. 억제성 RNA와 표적 유전자 일부 간의 서열 동일성이 90％ 초과, 또는 심지어 100％인 것이 바람직하다. 또 다른 한편, RNA의 이중체 영역은 표적 유전자 전사체의 일부와 혼성화할 수 있는 (예를 들어, 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6.4, 1 mM EDTA, 50℃ 또는 70℃. 12 내지 16시간 동안 혼성화한 후, 세척함) 뉴클레오티드 서열로서 기능적으로 규정될 수 있다.
RNAi 구조물의 생성은 화학적 합성 방법 또는 재조합 핵산 기술에 의해 수행할 수 있다. 처리된 세포의 내인성 RNA 폴리머라제는 생체 내에서 전사를 매개할 수 있거나, 또는 클로닝된 RNA 폴리머라제는 시험관 내에서 전사에 사용될 수 있다. RNAi 구조물에는, 예를 들어 세포내 뉴클레아제에 대한 감수성을 저하시키고/시키거나, 생체내 이용 효율을 개선시키고/시키거나, 제형 특징을 개선시키고/시키거나 기타 약동학적 특성을 변화시키기 위한, 포스페이트-당 주쇄 또는 뉴클레오시드에 대한 변형이 포함될 수 있다. 예를 들어, 천연 RNA의 포스포디에스테르 연쇄가 하나 이상의 질소 또는 황 헤테로 원자를 포함하도록 이를 변형시킬 수 있다. RNA 구조 상의 변형으로 인해, dsRNA에 대한 일반적인 반응을 피하면서도 특이적인 유전적 억제가 허용될 수 있다. 마찬가지로, 아데노신 데아미나제의 활성을 차단시키기 위해 염기를 변형시킬 수 있다. RNAi 구조물은 효소적으로 생성시킬 수 있거나 또는 부분/완전 유기 합성에 의해 생성시킬 수 있으며, 변형된 모든 리보뉴클레오티드는 시험관내 효소적 또는 유기 합성에 의해 도입할 수 있다.
RNA 분자를 화학적으로 변형시키는 방법은 RNAi 구조물을 변형시키도록 적응시킬 수 있다. 단지 예시로서, RNAi 구조물의 주쇄를 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 포스포디티오에이트, 키메라 메틸포스포네이트-포스포디에스테르, 펩티드 핵산, 5-프로피닐-피리미딘 함유 올리고머 또는 당 변형물 (예: 2'-치환된 리보뉴클레오시드, a-입체 배치)로 변형시킬 수 있다.
이중 가닥 구조는 단일 자기-상보적 RNA 가닥 또는 2개의 상보적 RNA 가닥에 의해 형성될 수 있다. RNA 이중체 형성은 세포 내부 또는 외부에서 개시될 수 있다. RNA는 세포당 1개 이상 카피를 전달시켜 줄 수 있는 양으로 도입할 수 있다. 보다 고 용량 (예를 들어, 세포당 5, 10, 100, 500 또는 1000개 이상 카피)의 이중 가닥 물질이 보다 유효한 억제를 야기시킬 수 있는 반면, 보다 저 용량은 특이적 적용 분야에 유용할 수도 있다. 억제는 RNA의 이중체 영역에 상응하는 뉴클레오티드 서열이 유전적 억제를 목표로 하고 있다는 점에서 서열 특이적이다.
특정의 양태에서, 대상 RNAi 구조물은 "소분자 간섭 RNA" 또는 "siRNA"이다. 이들 핵산은 길이가 대략 19 내지 30개 뉴클레오티드이고, 보다 더 바람직하게는 길이가 21 내지 23개 뉴클레오티드인데, 예를 들어 보다 긴 이중 가닥 RNA를 뉴클레아제 "다이싱 (dicing)"함으로써 생성된 단편 길이에 상응한다. siRNA는 뉴클레아제 복합체를 동원하고, 특이적 서열과 짝짓기함으로써 복합체를 표적 mRNA로 유도하는 것으로 이해된다. 그 결과, 표적 mRNA는 단백질 복합체 내의 뉴클레아제에 의해 분해된다. 특별한 양태에서, siRNA 분자의 21 내지 23개 뉴클레오티드는 3' 히드록실 기를 포함한다.
본 발명의 siRNA 분자는 당업자에게 공지된 수 많은 기술을 이용하여 수득할 수 있다. 예를 들어, siRNA는 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성하거나 재조합적으로 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 소분자 센스 및 안티센스 RNA 올리고머를 합성 및 어닐링하여 각 말단에 2-뉴클레오티드 오버행을 수반한 이중 가닥 RNA 구조를 형성시킬 수 있다. 이어서, 이들 이중 가닥 siRNA 구조를 수동적 흡수 또는 선택된 전달 시스템에 의해 세포에 직접 도입할 수 있다.
특정의 측면에서, siRNA 구조물은, 예를 들어 효소 다이서 (dicer)의 존재 하에 보다 긴 이중 가닥 RNA를 프로세싱함으로써 생성시킬 수 있다. 한 양태에서, 드로소필라 (Drosophila) 시험관내 시스템을 사용한다. 이러한 양태에서는, dsRNA를 드로소필라 배아로부터 유래된 가용성 추출물과 합함으로써, 조합물을 생성시킨다. 이러한 조합물은 dsRNA가 약 21 내지 약 23개 뉴클레오티드의 RNA 분자가 되도록 프로세싱하는 조건 하에 유지시킨다.
siRNA 분자는 당업자에게 공지된 수 많은 기술을 사용하여 정제할 수 있다. 예를 들어, 겔 전기영동을 사용하여 siRNA를 정제할 수 있다. 또 다른 한편, 비-변성 방법, 예를 들어 비-변성 칼럼 크로마토그래피를 사용하여 siRNA를 정제할 수 있다. 또한, 크로마토그래피 (예: 크기 배제 크로마토그래피), 글리세롤 구배 원심분리, 항체를 이용한 친화 정제를 사용하여 siRNA를 정제할 수 있다.
특정의 바람직한 특징에서, siRNA 분자의 적어도 1개 가닥은 길이가 약 1 내지 약 6개 뉴클레오티드인 3' 오버행을 가질 수 있지만, 길이가 2 내지 4개 뉴클레오티드일 수 있다. 보다 바람직하게, 3' 오버행은 길이가 1 내지 3개 뉴클레오티드이다. 특정의 양태에서, 1개 가닥은 3' 오버행을 갖고 있고 다른 가닥은 평활 말단 또는 오버행을 갖고 있다. 오버행의 길이는 각 가닥에 대해 동일하거나 상이할 수 있다. siRNA의 안정성을 추가로 증강시키기 위해, 3' 오버행을 분해에 대항하여 안정화시킬 수 있다. 한 측면에서는, 퓨린 뉴클레오티드, 예를 들어 아데노신 또는 구아노신 뉴클레오티드를 포함시킴으로써 RNA를 안정화시킨다. 또 다른 한편, 피리미딘 뉴클레오티드를 변형된 유사체에 의해 치환시키는 것, 예를 들어 우리딘 뉴클레오티드 3' 오버행을 2'-데옥시티미딘에 의해 치환시키는 것이 관용되고 RNAi의 효율에 영향을 미치지 않는다. 2'히드록실의 부재가 조직 배양 배지 내에서 오버행의 뉴클레아제 저항성을 상당히 증강시켜 주고, 이는 생체 내에서 유리할 수 있다.
기타 특징에서, RNAi 구조물은 장 이중 가닥 RNA의 형태이다. 특정의 양태에서, RNAi 구조물은 25, 50, 100, 200, 300 또는 400개 이상 염기이다. 특정의 양태에서, RNAi 구조물은 길이가 400 내지 800개 염기이다. 이중 가닥 RNA는 세포내적으로 분해하여, 예를 들어 세포 내에 siRNA 서열을 생성시킨다. 그러나, 생체 내에서 장 이중 가닥 RNA를 사용하는 것이 항상 실제적이지 않은데, 이는 서열-비의존적 dsRNA 반응에 의해 야기될 수 있는 해로운 효과 때문인 것으로 추정된다. 이러한 양태에서는, 인터페론 또는 PKR의 효과를 저하시키는 국소 전달 시스템 및/또는 작용제를 사용하는 것이 바람직하다.
특정의 측면에서, RNAi 구조물은 헤어핀 구조 형태이다 (헤어핀 RNA로서 명명됨). 헤어핀 RNA는 외적으로 합성할 수 있거나 또는 생체 내에서 RNA 폴리머라제 III 프로모터로부터 전사함으로써 형성될 수 있다. 바람직하게, 이러한 헤어핀 RNA는 세포 또는 동물 내에서 공학 처리하여 목적하는 유전자의 지속적이고도 안정적인 저해를 보장한다. siRNA는 세포 내에서 헤어핀 RNA를 프로세싱함으로써 생성될 수 있는 것으로 공지되어 있다.
기타 측면에서는, 플라스미드를 사용하여 이중 가닥 RNA를, 예를 들어 전사 생성물로서 전달한다. 이러한 특징에서는, RNAi 구조물의 센스 및 안티센스 가닥 각각에 대한 "코딩 서열"을 포함하는 플라스미드를 설계한다. 코딩 서열은 역위된 프로모터에 의해 플랭킹된 동일한 서열일 수 있거나, 또는 각각 별개의 프로모터의 전사 제어 하의 2개의 별개 서열일 수 있다. 코딩 서열이 전사된 후, 상보적 RNA 전사체는 염기 쌍을 형성하여 이중 가닥 RNA를 형성한다.
PCT 공개공보 WO01/77350에는 진핵 세포에서 동일한 트랜스-유전자 (transgene)의 센스 및 안티센스 RNA 전사체 둘 다를 산출하기 위하여 트랜스-유전자를 쌍방향으로 전사하기 위해 예시되는 벡터가 기재되어 있다. 따라서, 특정의 측면에서 본 발명은 다음 독특한 특징을 지닌 재조합 벡터를 제공한다: 반대 배향으로 배열된 2개의 중복 전사 단위를 갖고 있고 관심있는 RNAi 구조물에 대한 트랜스-유전자를 플랭킹하는 바이러스성 레플리콘 (replicon) 포함하는데, 이러한 2개의 중복 전사 단위는 숙주 세포에서 동일한 트랜스-유전자 단편으로부터 센스 및 안티센스 RNA 전사체를 산출시킨다.
RNAi 구조물은 표적 핵산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 이중 가닥 RNA의 장 (long) 연장물 또는 표적 핵산 서열의 단지 특정 영역하고만 동일하거나 실질적으로 동일한 이중 가닥 RNA의 단 (short) 연장물을 포함할 수 있다. 장 또는 단 RNAi 구조물을 제조 및 전달하는 방법의 예가 WO01/68836 및 WO01/75164에 보고되었다.
특별한 유전자, 또는 특별한 유전자 계열을 특이적으로 인식하는 것으로 예시되는 RNAi 구조물은 안티센스 올리고뉴클레오티드의 선별과 관련하여 상기 상세히 기재된 방법론을 사용하여 선별할 수 있다. 유사하게, RNAi 구조물의 전달 방법에는 상기 상세된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 전달하는 방법이 포함된다. 일반적으로, 전술된 방법 모두는 C5 단백질 또는 활성의 존재 또는 번역을 저하시키는 것으로 예상된다.
RNAi 발현 카세트의 설계가 본 발명의 범위를 제한하지는 않는다. RNAi 발현 카세트를 설계하기 위한 상이한 전략을 적용할 수 있고, 상이한 설계에 기초한 RNAi 발현 카세트는 생체 내에서 RNA 간섭을 유도시킬 것이다. (RNAi 발현 카세트의 설계가 본 발명의 범위를 제한하지는 않지만, 몇몇 RNAi 발현 카세트 설계가 본 발명의 상세한 설명 및 다음에 포함된다).
모든 RNAi 발현 카세트에 대해 공통적인 특징은 이들 카세트가 단독으로 RNA 간섭을 유도시킬 수 있거나 또는 분자내적 또는 분자간적으로 이중 가닥 RNA 복합체를 형성함으로써 또 다른 RNA 분자와 조합하여 RNA 간섭을 유도시킬 수 있는 RNA 분자를 코딩하는 RNA 코딩 영역을 포함한다는 것이다.
상이한 설계 원리를 이용하여 동일한 목표를 달성할 수 있고 이는 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, RNAi 발현 카세트는 하나 이상의 RNA 분자를 코딩할 수 있다. RNAi 발현 카세트로부터 RNA 발현시킨 후 또는 발현시키는 동안, 단일 자기-상보적 RNA 분자 또는 2개의 상보적 RNA 분자에 의해 이중 가닥 RNA 복합체가 형성될 수 있다. dsRNA 복합체의 형성은 핵 내부 또는 외부에서 개시될 수 있다.
RNAi 표적 유전자가 본 발명의 범위를 제한하지 않으며 이는 C5 활성 또는 발현에 참여하는 모든 유전자일 수 있다. 따라서, RNAi 표적 유전자의 선택은 본 발명에 있어서 제한적이지 않다. 당업자는 관심있는 모든 RNAi 표적 유전자의 유전자 발현을 하향 조절하기 위해 RNAi 발현 카세트를 설계하는 방식을 알고 있을 것이다. 특별한 RNAi 표적 유전자와 전달 방법에 따라서, 상기 과정은 RNAi 표적 유전자에 대한 부분적 또는 완전한 기능 상실을 제공할 수 있다.
앱타머
앱타머는 표적에 대해 바람직한 작용을 나타내는 비-천연 발생적 핵산이다. 바람직한 작용에는 표적의 결합 작용, 표적을 촉매적으로 변화시키는 작용, 표적 또는 표적의 기능적 활성을 변형/변경시키는 방식으로 표적과 반응하는 작용, 자살 억제제에서와 같이 표적에 공유적으로 부착되는 작용, 표적과 또 다른 분자 간의 반응을 촉진시키는 작용이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 경우에는 표적이 헷지호그 신호 전달 경로의 성분이다.
앱타머는 SELEX 공정에 기초하여 확인한다 [참고: Gold, et al., PNAS 94:59-64, 1997]. 그의 가장 기본적 형태에서, SELEX 공정은 다음의 일련의 단계에 의해 규정될 수 있다:
상이한 핵산 서열의 후보 혼합물을 제조한다. 이러한 후보 혼합물에는 일반적으로, 고정 서열 영역 (즉, 후보 혼합물 구성원 각각은 동일한 위치에 있는 동일한 서열을 함유한다) 및 무작위화 서열 영역이 포함된다. (a) 다음에 기재된 증폭 단계를 도와주거나, (b) 표적과 결합하는 것으로 공지된 서열을 모방하거나, 또는 (c) 후보 혼합물 중의 핵산의 소정의 구조적 배열 농도를 증강시켜 주는 고정 서열 영역을 선별한다. 무작위화 서열은 전적으로 무작위적이거나 (즉, 모든 위치에서 특정 염기를 발견할 확률은 1/4이다) 또는 단지 부분적으로 무작위적일 수 있다 (예를 들어, 모든 위치에서 특정 염기를 발견할 확률은 0 내지 100％일 수 있다).
후보 혼합물은 이러한 후보 혼합물의 구성원과 표적 간의 결합에 선호되는 조건 하에 상기 선별된 표적과 접촉시킨다. 이들 상황 하에서, 후보 혼합물의 핵산과 표적 간의 상호 작용은 표적에 대해 가장 강력한 친화도를 나타내는 핵산과 표적 간에 핵산-표적 쌍이 형성되는 것으로서 간주될 수 있다.
표적에 대한 가장 높은 친화도를 나타내는 핵산은 표적에 대해 보다 낮은 친화도를 나타내는 핵산으로부터 분할시킨다. 가장 높은 친화도 핵산에 상응하는 극히 소수의 서열 만이 (가능하게는, 단지 1개의 핵산 분자) 후보 혼합물 내에 존재하기 때문에, 후보 혼합물 중의 상당량의 핵산 (대략 5 내지 50％)이 분할 동안에 유지되도록 분할 기준을 설정하는 것이 일반적으로 바람직하다.
이어서, 표적에 대해 비교적 보다 높은 친화도를 나타내는 것으로서 분할 동안에 선별된 핵산을 증폭시켜 표적에 대해 비교적 높은 친화도를 나타내는 핵산이 강화된 새로운 후보 혼합물을 창출시킨다.
상기 분할 단계와 증폭 단계를 반복함으로써, 새로이 형성된 후보 혼합물은 보다 적은 수의 서열과 보다 적은 수의 약하게 결합하는 서열을 함유하고, 표적에 대한 핵산의 평균 친화도는 일반적으로 증가할 것이다. 극단적으로, SELEX 공정은 표적 분자에 대한 가장 높은 친화도를 나타내는 본래의 후보 혼합물로부터의 핵산을 나타내는 독특한 핵산을 1개 또는 소수로 함유하는 후보 혼합물을 산출시킬 것이다.
제약으로서 사용하기에 바람직한 핵산을 생성시키기 위해서는, 핵산 리간드가 (1) 표적에 대해 목적하는 효과를 달성할 수 있는 방식으로 표적과 결합하고; (2) 목적하는 효과를 획득하기 위해 가능한 한 작으며; (3) 가능한 한 안정적이고; (4) 선택된 표적에 대해 특이적 리간드인 것이 바람직하다. 대부분의 상황 하에서는, 핵산 리간드가 표적에 대해 가능한 가장 높은 친화도를 나타내는 것이 바람직하다.
SELEX 특허 출원에는 상기 공정이 보다 상세히 기재 및 설명되어 있다. 이에는 상기 공정에 사용될 수 있는 표적; 후보 혼합물 내의 핵산을 분할시키는 방법; 및 분할된 핵산을 증폭시켜 강화된 후보 혼합물을 생성시키는 방법이 포함된다. SELEX 특허 출원에는 또한, 단백질이 핵산 결합 단백질인 단백질 표적과 단백질이 핵산 결합 단백질이 아닌 표적 둘 다를 포함한, 수 많은 표적 종에 대해 수득된 리간드가 기재되어 있다. SELEX 방법은 추가로, 1995년 5월 4일자로 "핵산 리간드 복합체"란 발명의 명칭으로 출원된 미국 특허원 제08/434,465호에 기재된 바와 같은 진단적 또는 치료적 복합체 중의 친지성 또는 비면역원성 고분자량 화합물을 상기 선별된 핵산 리간드와 합하는 것을 포괄한다.
본 발명의 특정 측면에서는, 비-면역원성 고분자량 화합물 또는 친지성 화합물과 공유적으로 연결된 C5 단백질의 성분에 대한 하나 이상의 핵산 리간드를 포함하는 복합체를 제공하는 것이 바람직하다. 비-면역원성 고분자량 화합물은 전형적으로 면역원성 반응을 발생시키지 않는, 대략 100 Da 내지 1,000,000 Da, 보다 바람직하게 대략 1000 Da 내지 500,000 Da, 가장 바람직하게 대략 1000 Da 내지 200,000 Da이다. 본 발명의 목적상, 면역원성 반응은 유기체가 항체 단백질을 만들도록 하는 것이다. 본 발명의 한 가지 바람직한 양태에서, 비-면역원성 고분자량 화합물은 폴리알킬렌 글리콜이다. 가장 바람직한 양태에서, 폴리알킬렌 글리콜은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이다. 보다 바람직하게, PEG는 분자량이 약 10 내지 80 K이다. 가장 바람직하게, PEG는 분자량이 약 20 내지 45 K이다. 본 발명의 특정 양태에서, 비-면역원성 고분자량 화합물은 또한, 핵산 리간드일 수 있다.
항체
구체적인 특징으로, 본 발명의 화합물은 보체 경로 기능을 억제하는 결합 분자를 확인하는 데에 유용하다.
본 발명의 화합물 (즉, C5의 에피토프) (그의 일부 또는 단편 포함)을 면역원으로서 사용하여 폴리클로날 및 모노클로날 항체 제제에 대한 표준 기술을 사용하여 C5 폴리펩티드와 결합하는 결합 분자, 바람직하게는 항체를 생성시킬 수 있다. 본 발명의 화합물은 서열 1, 3 및 5에 제시된 아미노산 서열의 4개 이상 아미노산 잔기를 포함하고, 선형 및 비선형 에피토프를 포괄하여 결합 분자가 특이적 면역 복합체를 형성하는 방식으로 C5 펩티드의 항원성 부분과 결합하도록 한다. 바람직하게, 화합물은 6, 8, 10, 15, 20, 또는 30개 이상 아미노산 잔기를 포함한다. 당업자에게 널리 공지된 방법 및 용도에 따라서, 보다 긴 펩티드가 보다 짧은 펩티드에 비해 종종 바람직하다.
전형적으로, 펩티드를 사용하여, 적합한 대상체 (예: 토끼, 염소, 마우스, 또는 기타 포유류)를 면역원으로 면역시킴으로써 항체를 제조한다. 적당한 면역원성 제제는, 예를 들어 재조합 대체 경로 성분, 예를 들어 C5 단백질, 또는 그의 일부 또는 단편, 또는 화학적으로 합성된 대체 경로 성분, 예를 들어 C5 펩티드 또는 길항제를 함유할 수 있다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제5,460,959호, 제5,601,826호, 제5,994,127호, 제6,048,729호, 제6,083,725호; 이들 각각은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다]. 상기 제제는 아주반트 (adjuvant), 예를 들어 프로인트 (Freund) 완전 또는 불완전 아주반트, 또는 유사한 면역자극제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 대상체를 면역원성 대체 경로 성분, 예를 들어 C5 또는 그의 일부 또는 단편으로 면역시키면 폴리클로날 항체 반응이 유도된다.
독립적으로 제안된 에피토프 서열인 서열 1, 3, 5 각각의 경우에, 항체 인식 부위의 일부로서 확인된 아미노산 잔기의 전부 또는 확인된 아미노산 잔기의 일부와 결합하는 항체(들)는 대체 또는 전통적 경로의 C5 전환효소에 의해 단백질 분해되는 C5의 알파 쇄 및/또는 베타 쇄 상의 절단 부위와 아주 근접한 것으로 예측될 것이다. 따라서, C5 알파 또는 베타 절단 부위와 근접한 에피토프와 결합함으로써, 상기 항체가 입체 장애를 통하여 절단 부위의 단백질 분해를 기능적으로 억제함으로써 C5의 절단을 억제시킬 수 있는 잠재력을 갖는 것으로 제안된다.
인간 보체 성분과 결합하거나 또는 인간 보체 성분의 생성 및/또는 활성을 차단시키는 결합 분자가 고려된다. 따라서, 결합 분자는 본원에서 C5a의 생성 및/또는 C5b와 연합된 막 공격 복합체 (MAC)의 어셈블리를 방지 또는 억제하는 데에 유용하다. 본 발명의 몇몇 결합 분자에는 보체 성분 C5와 연합된 것이 포함되므로, 이것이 C5a 및 C5b로 전환되어 MAC 복합체의 어셈블리를 야기시키는 것을 억제한다.
관심있는 항원, 예를 들어 C5 폴리펩티드 항원과 "결합하는" 결합 분자는 이러한 결합 분자가 항원을 발현하는 세포 또는 조직을 표적화하는 데에 있어서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하기에 충분한 친화도로 항원과 결합하고, 기타 단백질과 실재적으로 교차 반응하지 않는 것이다. 한 측면에서, "비-표적" 단백질에 대한 항체의 결합 정도는 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 분석 또는 방사성 면역침전 (RIA)에 의해 결정된 바와 같이 그의 특별한 표적 단백질에 대한 항체의 결합도의 약 10％ 미만일 것이다. 표적 분자에 대한 항체의 결합과 관련해서, 특별한 폴리펩티드 또는 특별한 폴리펩티드 표적 상의 에피토프와의 "특이적 결합성" 또는 이와 "특이적으로 결합하거나" 또는 "특이적"이란 비-특이적 상호 작용과 측정 가능한 수준으로 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합성은, 예를 들어 대조군 분자 (이는 일반적으로, 결합 활성을 지니지 않은 유사한 구조의 분자이다)의 결합성과 비교해서 특정 분자의 결합성을 결정함으로써 측정할 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합성은 표적, 예를 들어 과량의 비-표지된 표적과 유사한 대조군 분자와의 경쟁에 의해 결정할 수 있다. 이러한 경우, 탐침에 대한 표지된 표적의 결합이 과량의 비-표지된 표적에 의해 경쟁적으로 억제된다면 이는 특이적 선택성을 표시한다. 본원에 사용된 바와 같은, 특별한 폴리펩티드 또는 특별한 폴리펩티드 표적 상의 에피토프와의 "특이적 결합성" 또는 이와 "특이적으로 결합하거나" 또는 "특이적"이란 표적에 대한 Kd가 약 10-4 M 이상, 또 다른 한편 약 10-5 M 이상, 또 다른 한편 약 10-6 M 이상, 또 다른 한편 약 10-7 M 이상, 또 다른 한편 약 10-8 M 이상, 또 다른 한편 약 10-9 M 이상, 또 다른 한편 약 10-10 M 이상, 또 다른 한편 약 10-11 M 이상, 또 다른 한편 약 10-12 M 이상인 분자로써 나타낼 수 있다. 한 측면에서, 용어 "특이적 결합성"은 특정 화합물이 기타 모든 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프와는 실질적으로 결합하지 않으면서 특별한 폴리펩티드 또는 특별한 폴리펩티드 상의 에피토프와 결합하는 결합을 지칭한다.
본원에서 사용하기에 특히 유용한 결합 분자는 보체 성분 C5가 보체 성분 C5a 및 C5b로 전환되는 것을 직접 또는 간접적으로 저하시키는 항체이다. 한 가지 부류의 유용한 항체는 하나 이상의 항체-항원 결합 부위를 갖고 있고 인간 보체 성분 C5에 대한 특이적 결합성을 나타내는 항체인데, 이러한 특이적 결합성은 인간 보체 성분 C5의 알파 쇄를 표적으로 한다. 보다 특히, 모노클로날 항체 (mAb)를 사용할 수 있다. 이러한 항체는 1) 인간 체액 내에서의 보체 활성화를 억제시키고/시키거나; 2) 인간 보체 성분 C3 또는 인간 보체 성분 C4에 대한 정제된 인간 보체 성분 C5의 결합을 억제시키고/시키거나; 3) C5a에 대한 인간 보체 활성화 생성물과 특이적으로 결합하지 않는다. 특히 유용한 보체 억제제는 C5a 및/또는 C5b-9의 생성을 C5a ELISA 또는 용혈성 검정에 의해 측정된 바와 같이 약 30％, 40％ 또는 50％ 초과하여 저하시키는 화합물이다.
기능적으로, 적합한 항체는 C5의 절단을 억제하는데, 이는 강력한 프로-염증성 분자 C5a 및 C5b-9 (말단 보체 복합체)의 생성을 차단시켜 준다. 보체 경로 조절이상과 연관된 장애, 바람직하게는 본원에 따르는 안과 질병을 치료하기 위해 사용되는 바람직한 항-C5 항체는 C5 또는 그의 단편, 예를 들어 C5a 또는 C5b와 결합한다. 바람직하게, 항-C5 항체는 정제된 인간 보체 성분 C5의 알파 및/또는 베타 쇄 상의 에피토프에 대항하여 면역반응성이고 C5가 C5 전환효소에 의해 C5a 및 C5b로 전환되는 것을 차단시킬 수 있다. 이러한 능력은 문헌 [참고: Wurzner, et al., Complement lnflamm 8:328-340, 1991]에 기재된 기술을 사용하여 측정할 수 있다.
특히 유용한 측면에서, 항-C5 항체는 정제된 인간 보체 성분 C5의 베타 쇄 상의 에피토프 및/또는 정제된 인간 보체 성분 C5의 알파 쇄 내의 에피토프, 바람직하게 서열 1, 3 및 5로 이루어진 군 중에서 선택된 에피토프에 대항하여 면역반응성이다. 이러한 측면에서, 상기 항체는 C5가 C5 전환효소에 의해 C5a 및 C5b로 전환되는 것을 차단시킬 수도 있다. 알파 쇄 내에서, 가장 바람직한 항체는 아미노-말단 영역과 결합하지만, 자유 C5a와는 결합하지 않는다.
본 발명의 또 다른 측면은 C5와 결합하고 대체 경로의 C5 전환효소 (C3bBbC3b)에 의해서만 그의 절단이 억제되는 치료적 항체의 생성 및 용도이다. 이러한 항체는 전통적인 보체 경로의 C5 전환효소 (C3bC4bC2a)의 정상적인 기능은 방해하지 않으면서 대체 경로의 조절이상을 야기시는 다형증으로부터 비롯되는 보체 활성화를 억제하는 것으로 예상된다.
본원에 기재된 항-C5 항체에는 인간 모노클로날 항체가 포함된다. 몇몇 측면에서, C3b와 결합하는 항체의 항원 결합 부분 (예를 들어, VH 및 VL 쇄)을 "혼합 및 매칭"하여 기타 항-C5 결합 분자를 창출시킨다. 이러한 "혼합 및 매칭된" 항체의 결합성은 전술된 결합 검정 (예: ELISA)을 이용하여 시험할 수 있다. 특별한 VL 서열과 혼합 및 매칭하기 위한 VH를 선별하는 경우에는, 전형적으로 특정 VH와 구조적으로 유사한 VH를 선별하는데, 이는 VL과의 짝짓기에서 대체된다. 마찬가지로, 특별한 완전한 길이의 중쇄/완전한 길이의 경쇄 짝짓기로부터의 완전한 길이의 중쇄 서열을 일반적으로, 구조적으로 유사한 완전한 길이의 중쇄 서열로 대체시킨다. 마찬가지로, 특별한 VH/VL 짝짓기로부터의 VL 서열을 구조적으로 유사한 VL 서열로 대체시켜야 한다. 또한, 특별한 완전한 길이의 중쇄/완전한 길이의 경쇄 짝짓기로부터의 완전한 길이의 경쇄 서열을 구조적으로 유사한 완전한 길이의 경쇄 서열로 대체시켜야 한다. 이러한 맥락에서 구조적 유사성을 확인하는 것은 당해 분야에 널리 공지된 공정이다.
기타 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 C5-결합 항체의 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 각종 조합으로 포함하는 항체를 제공한다. 이들 항체 각각이 C5와 결합할 수 있고, 항원 결합 특이성이 주로 CDR1, 2 및 3 영역에 의해 제공된다면, VH CDR1, 2 및 3 서열과 VL CDR1, 2 및 3 서열을 "혼합 및 매칭"할 수 있다 (즉, 상이한 항체로부터의 CDR을 혼합 및 매칭할 수 있다). 이러한 "혼합 및 매칭된" 항체의 C5 결합성은 본원에 기재된 결합 검정 (예: ELISA)을 사용하여 시험할 수 있다. VH CDR 서열을 혼합 및 매칭하는 경우에는, 특별한 VH 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열을 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체시켜야 한다. 마찬가지로, VL CDR 서열을 혼합 및 매칭하는 경우에는, 특별한 VL 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열을 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체시켜야 한다. 이러한 맥락에서 구조적 유사성을 확인하는 것은 당해 분야에 널리 공지된 공정이다.
본원에 사용된 바와 같은 인간 항체는 이러한 항체의 가변 영역 또는 완전한 길이의 쇄가 서열 공급원으로서 인간 생식세포계 면역글로불린 유전자를 이용하는 시스템으로부터 수득되는 경우에, 특별한 생식세포계 서열의 "생성물이거나" 또는 "이로부터 유래되는" 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 또는 완전한 길이의 중쇄 또는 경쇄를 포함한다. 이러한 하나의 시스템에서는, 인간 항체가 인간 면역글로불린 유전자를 보유하고 있는 트랜스제닉 마우스에서 생성된다. 트랜스제닉 마우스는 관심있는 항원 (예를 들어, C5의 에피토프 및 다음에 추가로 기재된 것)으로 면역시킨다. 또 다른 한편, 인간 항체는 파아지 상에 디스플레이된 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리를 제공하고 관심있는 항원 (예: C5 단백질 또는 에피토프)을 이용하여 상기 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인한다.
인간 생식세포계 면역글로불린 서열의 "생성물이거나" 또는 "이로부터 유래되는" 인간 항체는 인간 항체의 아미노산 서열을 인간 생식세포계 면역글로불린의 아미노산 서열 서열과 비교하고, 인간 항체의 서열에 가장 근접한 서열 [즉, 가장 큰 동일성(％)을 나타냄]인 인간 생식세포계 면역글로불린 서열을 선별함으로써 그 자체로서 확인할 수 있다. 특별한 인간 생식세포계 면역글로불린 서열의 "생성물이거나" 또는 "이로부터 유래되는" 인간 항체는, 예를 들어 천연 발생적 체세포 돌연변이, 또는 인공적인 부위 지정 돌연변이로 인해, 생식세포계-코딩된 서열과 비교해서 아미노산 차이를 함유할 수 있다. 그러나, 선별된 인간 항체는 전형적으로, 인간 생식세포계 면역글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과의 아미노산 서열 동일성이 90％ 이상이고, 기타 종의 생식세포계 면역글로불린 아미노산 서열 (예: 뮤린 생식세포계 서열)과 비교해서 상기 인간 항체를 인간으로서 확인시켜 주는 아미노산 잔기를 함유하고 있다. 특정한 경우, 인간 항체는 생식세포계 면역글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과의 아미노산 서열 동일성이 60％, 70％, 80％, 90％, 또는 95％ 이상, 또는 심지어 96％, 97％, 98％, 또는 99％ 이상일 수 있다.
두 서열 간의 동일성(％)은 두 서열을 최적으로 정렬시키기 위해 도입될 필요가 있는 각 갭의 길이와 갭의 수를 고려하여, 해당 서열을 공유하는 동일한 위치 수의 함수이다 (즉, 동일성(％) = 동일한 위치 수/총 위치 수 x 100). 서열을 비교하고, 두 서열 간의 동일성을 결정하는 것은 PAM120 중량 잔기 표, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 사용하여, ALIGN 프로그램 (버전 2.0) 내로 혼입시킨 알고리즘 [참고: E. Meyers and W. Miller (1988 Comput. Appl. Biosci., 4:11-17)]을 사용하여 결정한다.
전형적으로, 특별한 인간 생식세포계 서열로부터 유래된 인간 항체의 VH 또는 VL은 인간 생식세포계 면역글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과 10개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 것이다. 특정한 경우, 인간 항체의 VH 또는 VL은 생식세포계 면역글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과 5개 이하, 또는 심지어 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 수 있다.
카멜리드 (camelid) 항체
신세계 구성원, 예를 들어 라마 종 [라마 파코스 (Lama paccos), 라마 글라마 (Lama glama) 및 라마 비쿠그나 (Lama vicugna)]를 포함한, 카멜 및 단봉 낙타 계열의 구성원 [카멜루스 박트리아누스 (Camelus bactrianus) 및 칼레루스 드로마데리우스 (Calelus dromaderius)]로부터 수득된 항체 단백질을 대상으로 하여, 인간 대상체에서 크기, 구조적 복합도 및 항원성에 관하여 성상 확인하였다. 천연상 발견되는 이러한 계열의 포유류에서의 특정의 IgG 항체는 경쇄가 결여되므로, 기타 동물로부터의 항체에 대해 특징적인 2개의 중쇄와 2개의 경쇄를 갖는 4개 쇄 4차 구조와 구조상 별개이다 [참고: WO 94/04678].
VHH로서 확인된 소형 단일 가변 도메인인 카멜리드 항체 영역은 유전 공학 처리함으로써 표적에 대해 고 친화성을 지닌 소형 단백질을 수득하여, "카멜리드 나노보디"로서 공지된 저 분자량 항체-유래된 단백질을 생성시킴으로써 수득할 수 있다 [참고: 미국 특허 제5,759,808호; Stijlemans et al., 2004 J. Biol. Chem. 279: 1256-1261; Dumoulin et al., 2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger et al., 2003 Bioconjugate Chem. 14: 440-448; Cortez-Retamozo et al., 2002 Int. J. Cancer 89: 456-62; and Lauwereys et al., 1998 EMBO J. 17: 3512-3520]. 카멜리드 항체 및 항체 단편의 공학 처리시킨 라이브러리가, 예를 들어 다음 공급처로부터 시판되고 있다 [공급처: Ablynx, Ghent, Belgium]. 비-인간 기원의 기타 항체와 같이, 카멜리드 항체의 아미노산 서열을 재조합적으로 변경시켜 인간 서열과 보다 근접하게 유사한 서열을 수득할 수 있는데, 즉 나노보디를 인간화시킬 수 있다. 따라서, 인간에 대한 카멜리드 항체의 천연상 낮은 항원성을 추가로 저하시킬 수 있다.
카멜리드 나노보디는 분자량이 인간 IgG 분자의 대략 1/10이고, 상기 단백질은 단지 수 나노미터의 물리적 직경을 갖는다. 이와 같이 작은 크기에 따른 한 가지 결과로서는, 카멜리드 나노보디가 보다 큰 항체 단백질에는 기능적으로 보이지 않는 항원성 부위와 결합할 수 있는 능력이 있다는 것인데, 즉 카멜리드 나노보디는 전통적인 면역학적 기술을 사용하여 잠적해 있는 항원을 검출하기 위한 시약으로서 유용하고, 또한 가능한 치료제로서 유용하다. 따라서, 작은 크기에 따른 또 다른 결과로서, 카멜리드 나노보디는 표적 단백질의 작은 홈 또는 협소한 갈라진 틈 내의 특이적 부위와 결합함으로써 이를 억제할 수 있으므로, 전통적인 항체 보다 전통적인 저 분자량 약물의 기능과 보다 밀접하게 유사한 능력으로 제공될 수 있다.
이러한 저 분자량과 조밀한 크기로 인해, 극도로 열 안정적이고, 극한 pH에 대해 안정적이며 단백질 분해적 분해에 대해서도 안정적이고, 낮은 항원성을 지닌 카멜리드 나노보디가 생성된다. 또 다른 결과는 카멜리드 나노보디가 순환 시스템으로부터 조직 내로 보다 용이하게 이동하고, 심지어는 혈액-뇌 장벽을 가로질러 가므로, 신경 조직에 악영향을 미치는 장애를 치료할 수 있다. 나노보디는 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 약물 수송을 추가로 촉진시킬 수 있다 [참고: 미국 공개특허공보 제20040161738호 (2004년 8월 19일자로 공개됨)]. 이들 특징을 인간에 대한 낮은 항원성과 조합하면, 이는 치료적으로 큰 잠재력을 나타낸다. 추가로, 이들 분자는 원핵 세포, 예를 들어 이. 콜라이에서 완전히 발현될 수 있다.
따라서, 본 발명의 특징은 C5에 대한 고 친화성을 지닌 카멜리드 항체 또는 카멜리드 나노보디이다. 본원의 특정 측면에서, 카멜리드 항체 또는 나노보디는 카멜리드 동물에게서 천연상 생성되는데, 즉 기타 항체에 대해 본원에 기재된 기술을 사용하여 C5 또는 그의 펩티드 단편으로 면역시킨 후 카멜리드에 의해 생성된다. 또 다른 한편, 항-C5 카멜리드 나노보디를 공학 처리시키는데, 즉 이는 표적으로서 본원에 기재된 C5 또는 C5 에피토프를 이용한 패닝 과정을 사용하여, 적당하게 돌연변이 유발시킨 카멜리드 나노보디 단백질을 디스플레이하는 파아지의 라이브러리로부터 선별함으로써 생성된다. 공학 처리시킨 나노보디는 수용자 대상체에서의 반감기가 45분에서 2주로 증가되도록 유전 공학 처리함으로써 추가로 설계할 수 있다.
디아보디 (diabody)
디아보디는 VH 도메인과 VL 도메인이 동일한 쇄 상에서 이들 두 도메인 간에 짝짓기를 허용하기에는 너무 짧은 링커에 연결되어, 단일 폴리펩티드 쇄 상에 발현되는 2가의 이중-특이적 분자이다. VH 도메인과 VL 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 짝짓기 함으로써, 2개의 항원 결합 부위를 창출시킨다 [참고: 예를 들어, Holliger et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak et al., 1994 Structure 2:1121-1123]. 디아보디는 동일한 세포 내에서 구조 VHA-VLB 및 VHB-VLA (VH-VL 입체 배치), 또는 VLA-VHB 및 VLB-VHA (VL-VH 입체 배치)를 수반한 2개의 폴리펩티드 쇄를 발현함으로써 생성될 수 있다. 이들 대부분은 세균 내에서 가용성 형태로 발현될 수 있다.
단일 쇄 디아보디 (scDb)는 대략 15개 아미노산 잔기의 링커를 이용하여 2개의 디아보디-형성성 폴리펩티드 쇄를 연결함으로써 생성시킨다 [참고: Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(3-4): 128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36]. scDb는 세균 내에서 가용성 활성 단량체 형태로 발현될 수 있다 [참고: Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(34): 128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36; Pluckthun and Pack, 1997 Immunotechnology, 3(2): 83-105; Ridgway et al., 1996 Protein Eng., 9(7):617-21]. 디아보디를 Fc와 융합시켜 "디-디아보디"를 생성시킬 수 있다 [참고: Lu et al., 2004 J. Biol. Chem., 279(4):2856-65].
공학 처리되고 변형시킨 항체
본 발명의 항체는 변형시킨 항체를 공학 처리하기 위해 출발 물질로서 하나 이상의 VH 및/또는 VL 서열을 갖는 항체를 사용하여 제조할 수 있는데, 상기 변형시킨 항체는 출발 항체로부터 변경된 특성을 지닐 수 있다. 항체는 가변 영역 중의 하나 또는 둘 다 (즉, VH 및/또는 VL) 내의 하나 이상의 잔기, 예를 들어 하나 이상의 CDR 영역 및/또는 하나 이상의 프레임워크 영역 내의 하나 이상의 잔기를 변형시킴으로써 공학 처리시킬 수 있다. 부가적으로, 또는 또 다른 한편, 항체는 불변 영역 내의 잔기를 변형시킴으로써 공학 처리하여, 예를 들어 이러한 항체의 효과기 기능(들)을 변경시킬 수 있다.
수행될 수 있는 가변 영역 공학 처리의 한 가지 유형은 CDR 이식화이다. 항체는 주로 6개의 중쇄 및 경쇄 CDR 내에 위치하는 아미노산 잔기를 통하여 표적 항원과 상호 작용한다. 이러한 이유로 인해, CDR 내의 아미노산 서열은 CDR 외부의 서열 보다 개개 항체들 간에 보다 다양하다. CDR 서열은 대부분의 항체-항원 상호 작용에 책임이 있기 때문에, 상이한 특성을 지닌 상이한 항체로부터의 프레임워크 서열 상으로 이식된 특이적 천연 발생적 항체로부터의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구축함으로써 특이적 천연 발생적 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현시킬 수 있다 [참고: 예를 들어, Riechmann et al., 1998 Nature 332:323-327; Jones et al., 1986 Nature 321:522-525; Queen et al., 1989 Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033; 미국 특허 제5,225,539호, 및 미국 특허 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,693,762호 및 제6,180,370호].
프레임워크 서열은 생식세포계 항체 유전자 서열을 포함하는 공개된 참고 문헌 또는 공개 DNA 데이터베이스로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 생식세포계 DNA 서열은 "VBase" 인간 생식세포계 서열 데이터베이스 (인터넷 www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase로부터 입수 가능함)에서 발견할 수 있을 뿐만 아니라 문헌 [참고: Kabat et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson et al., 1992 J. Mol. Biol. 227:776-798; and Cox et al., 1994 Eur. J. Immunol. 24:827-836; 각각의 전문이 본원에 참고로 도입된다]에 보고되었다.
VH CDR1, 2 및 3 서열, 및 VL CDR1, 2 및 3 서열을, 프레임워크 서열이 유래되는 생식세포계 면역글로불린 유전자에서 발견되는 바와 동일한 서열을 갖는 프레임워크 영역 상으로 이식시킬 수 있거나, 또는 CDR 서열을 생식세포계 서열과 비교해서 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 프레임워크 영역 상으로 이식시킬 수 있다. 예를 들어, 특정의 경우에는 프레임워크 영역 내의 잔기를 돌연변이시켜 항체의 항원 결합 능력을 유지 또는 증강시키는 것이 유리한 것으로 밝혀졌다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,693,762호 및 제6,180,370호].
CDR을 또한, 면역글로불린 도메인 이외의 폴리펩티드의 프레임워크 영역 내로 이식시킬 수 있다. 적당한 스캐폴드 (scaffold)는 이식된 잔기를 디스플레이하는 입체 형태적으로 안정한 프레임워크를 형성하므로, 이들은 국재 표면을 형성하고 관심있는 표적 (예: C5 항원)과 결합한다. 예를 들어, CDR을 스캐폴드 상으로 이식할 수 있는데, 여기서는 프레임워크 영역이 피브로넥틴, 안키린 (ankyrin), 리포칼린 (lipocalin), 네오카르지노스타인 (neocarzinostain), 시토크롬 (cytochrome) b, CP1 아연 핑거, PST1, 코일드 코일 (coiled coil), LACI-D1, Z 도메인 또는 텐드라미새트 (tendramisat)에 기초한다 [참고: 예를 들어, Nygren and Uhlen, 1997 Current Opinion in Structural Biology, 7, 463-469].
또 다른 유형의 가변 영역 변형은 VH 및/또는 VL CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내의 아미노산 잔기를 돌연변이시킴으로써, 관심있는 항체의 한 가지 이상 결합 특성 (예: 친화성)을 개선시키는 것이다 ("친화 돌연변이"로서 공지됨). 부위 지정 돌연변이 유발 또는 PCR 매개된 돌연변이 유발을 수행하여 상기 돌연변이를 도입할 수 있고, 항체 결합성에 대한 효과, 또는 관심있는 기타 기능적 특성은 본원에 기재된 바와 같은 시험관내 또는 생체내 검정에서 평가할 수 있다. 보존적 변형을 도입할 수 있다. 돌연변이는 아미노산 치환, 부가 또는 결실일 수 있다. 더우기, 전형적으로 CDR 영역 내의 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 이하 잔기를 변경시킨다.
본 발명의 공학 처리시킨 항체에는 VH 및/또는 VL 내의 프레임워크 잔기에 대해 변형이 이루어져서, 예를 들어 항체의 특성을 개선시킨 것이 포함된다. 전형적으로, 이러한 프레임워크 변형은 항체의 면역원성을 저하시키기 위해 이루어진다. 예를 들어, 한 가지 접근방식은 1개 이상의 프레임워크 잔기를 상응하는 생식세포계 서열로 "역돌연변이"시키는 것이다. 보다 구체적으로 언급하면, 체세포 돌연변이를 진행한 항체는 이러한 항체가 유래되는 생식세포계 서열과는 상이한 프레임워크 잔기를 함유할 수 있다. 이러한 잔기는 항체 프레임워크 서열을 해당 항체가 유래되는 생식세포계 서열과 비교함으로써 확인할 수 있다. 프레임워크 영역 서열을 그들의 생식세포계 형상으로 복귀시키기 위해서는, 체세포 돌연변이물을, 예를 들어 부위 지정 돌연변이 유발 또는 PCR 매개된 돌연변이 유발에 의해 생식세포계 서열로 "역돌연변이"시킬 수 있다. 이러한 "역돌연변이된" 항체가 또한 본 발명에 포괄된다.
또 다른 유형의 프레임워크 변형은 프레임워크 영역 내의 1개 이상의 잔기, 또는 심지어 하나 이상의 CDR 영역 내의 1개 이상의 잔기를 돌연변이시켜 T 세포-에피토프를 제거함으로써, 항체의 잠재적 면역원성을 저하시키는 것을 포함한다. 이러한 접근방식은 "탈면역"으로서 지칭되기도 하고, 미국 공개특허공보 제20030153043호 (Carr et al)에 추가로 상세히 기재되어 있다.
프레임워크 또는 CDR 영역 내에서 이루어진 변형 이외에도 또는 변형에 대한 대안으로서, 본 발명의 항체가 Fc 영역 내에서의 변형을 포함하도록, 전형적으로 항체의 한 가지 이상 기능적 특성, 예를 들면 혈청 반감기, 보체 고정화, Fc 수용체 결합성, 및/또는 항원-의존적 세포성 세포독성을 변경시키도록 본 발명의 항체를 공학 처리할 수 있다. 더우기, 본 발명의 항체를 화학적으로 변형시킬 수 있거나 (예를 들어, 하나 이상의 화학적 부분을 항체에 부착시킬 수 있다), 또는 그의 글리코실화를 변경시켜 항체의 한 가지 이상 기능적 특성을 변경시키도록 변형시킬 수 있다.
한 측면에서, CH1의 힌지 영역은 이러한 힌지 영역 내의 시스테인 잔기 수가 변경되도록, 예를 들어 증가되거나 감소되도록 변형시킨다. 이러한 접근 방식은 미국 특허 제5,677,425호 (Bodmer et al)에 추가로 기재되어 있다. CH1의 힌지 영역 내의 시스테인 잔기 수는, 예를 들어 경쇄 및 중쇄의 어셈블리를 촉진시키거나또는 항체의 안정성을 증가 또는 저하시키도록 변경시킨다.
또 다른 측면에서, 항체의 Fc 힌지 영역은 항체의 생물학적 반감기를 감소시키도록 돌연변이시킨다. 보다 구체적으로 언급하면, 1개 이상의 아미노산 돌연변이를 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 계면 영역 내로 도입하여, 항체가 천연 Fc-힌지 도메인 스타필로코실 (Staphylococcyl) 단백질 A (SpA) 결합성과 비교해서 손상된 SpA 결합성을 지니도록 한다. 이러한 접근 방식은 미국 특허 제6,165,745호 (Ward et al)에 추가로 상세히 기재되어 있다.
또 다른 측면에서, 항체는 그의 생물학적 반감기를 증가시키도록 변형시킨다. 각종 접근 방식이 가능하다. 예를 들어, 미국 특허 제6,277,375호에는 생체 내에서 그의 반감기를 증가시키는, IgG 내에서의 다음 돌연변이가 기재되어 있다: T252L, T254S, T256F. 또 다른 한편 생물학적 반감기를 증가시키기 위해, 항체를 CH1 또는 CL 영역 내에서 변경시켜, IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개 루프로부터 취한 재이용 수용체 결합 에피토프를 함유하도록 할 수 있다 [미국 특허 제5,869,046호 및 제6,121,022호 (Presta et al)에 기재된 바와 같음].
기타 측면에서, Fc 영역은 1개 이상의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체시켜 항체의 효과기 기능을 변경시킴으로써 변경시킨다. 예를 들어, 항체가 효과기 리간드에 대한 변경된 친화성을 지니긴 하지만 모 항체의 항원-결합 능력을 보유하도록, 1개 이상의 아미노산을 상이한 아미노산 잔기로 대체시킬 수 있다. 친화성을 변경시킨 효과기 리간드는, 예를 들어 Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분일 수 있다. 이러한 접근 방식은 미국 특허 제5,624,821호 및 제5,648,260호 (Winter et al)에 추가로 상세히 기재되어 있다.
또 다른 측면에서, 항체가 변경된 Clq 결합 및/또는 저하되거나 제거된 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 지니도록, 아미노산 잔기 중에서 선택된 1개 이상의 아미노산을 상이한 아미노산 잔기로 대체시킬 수 있다. 이러한 접근 방식은 미국 특허 제6,194,551호 (Idusogie et al)에 추가로 상세히 기재되어 있다.
또 다른 측면에서, 1개 이상의 아미노산 잔기를 변경시킴으로써 보체를 고정시킬 수 있는 항체의 능력을 변경시킨다. 이러한 접근 방식은 WO 94/29351에 추가로 상세히 기재되어 있다.
또 다른 측면에서, Fc 영역은 1개 이상의 아미노산을 변형시킴으로써 Fcγ 수용체에 대한 항체의 친화성을 증가시키고/시키거나 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 매개할 수 있는 항체의 능력을 증가시키도록 변형시킨다. 이러한 접근 방식은 WO 00/42072 (Presta)에 추가로 기재되어 있다. 더우기, FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 인간 IgG1 상의 결합 부위를 맵핑하였고 개선된 결합성을 지닌 변이체가 보고되었다 [참고: Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chem. 276:6591-6604].
또 다른 측면에서, 항체의 글리코실화를 변형시킨다. 예를 들어, 비글리코실화 항체를 만들 수 있다 (즉, 항체에 글리코실화가 결여됨). 글리코실화는, 예를 들어 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시키도록 변경시킬 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어 항체 서열 내의 하나 이상의 글리코실화 부위를 변경시킴으로써 수행할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위를 제거시킴으로써, 이 부위에서의 글리코실화를 제거시켜 주는 1개 이상의 아미노산 치환을 만들 수 있다. 이러한 비글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시킬 수 있다. 상기 접근 방식은 미국 특허 제5,714,350호 및 제6,350,861호에 추가로 상세히 기재되어 있다.
부가적으로, 또는 또 다른 한편, 변경된 유형의 글리코실화를 나타내는 항체, 예를 들어 푸코실 잔기 량이 감소된 저푸코실화 항체 또는 이등분 GlcNac 구조가 증가된 항체를 만들 수 있다. 이와 같이 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증되었다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어 변경된 글리코실화 기구를 수반하는 숙주 세포에서 해당 항체를 발현시킴으로써 수행할 수 있다. 변경된 글리코실화 기구를 수반한 세포는 당해 분야에 보고된 바 있고, 본 발명의 재조합 항체를 발현시킴으로써 변경된 글리코실화를 나타내는 항체를 생성시키는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, EP 1,176,195 (Hang et al)에는 푸코실 트랜스퍼라제를 코딩하는, 기능상 붕괴된 FUT8 유전자를 수반한 세포주가 기재되어 있는데, 이로써 상기 세포주에서 발현된 항체는 저푸코실화를 나타낸다. PCT 공개공보 WO 03/035835 (Presta)에는 Asn(297)-연결된 탄수화물에 푸코스를 부착시킬 수 있는 능력이 저하된 변이체 CHO 세포주 Lec13 세포가 기재되어 있는데, 이러한 숙주 세포에서 발현된 항체는 저푸코실화되기도 한다 [참고: Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740]. WO 99/54342 (Umana et al.)에는 당단백질 조절성 글리코실 트랜스퍼라제 [예: 베타(l,4)-N 아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII)]를 발현하도록 공학 처리시킨 세포주가 기재되어 있는데, 이와 같이 공학 처리시킨 세포주에서 발현된 항체는 증가된 이등분 GlcNac 구조를 나타내어 항체의 ADCC 활성이 증가된다 [참고: Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180].
본 발명에 고려되는 본원의 항체의 또 다른 변형은 PEG화이다. 항체는, 예를 들어 항체의 생물학적 (예: 혈청) 반감기를 증가시키도록 PEG화할 수 있다. 항체를 PEG화하기 위해서는, 이러한 항체 또는 그의 단편을 전형적으로, 1개 이상의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 부분이 항체 또는 항체 단편에 부착되도록 하는 조건 하에 PEG, 예를 들어 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 반응시킨다. PEG화는 반응성 PEG 분자 (또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 알킬화 반응 또는 아실화 반응에 의해 수행할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 기타 단백질, 예를 들어 모노 (C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 유도체화하기 위해 사용되어 온 모든 형태의 PEG를 포괄한다. 특정 측면에서, PEG화되는 항체는 비글리코실화 항체이다. 단백질을 PEG화하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 이를 본 발명의 항체에 적용할 수 있다 [참고: 예를 들어, EP 0 154 316 (Nishimura et al) and EP 0 401 384 (Ishikawa et al)].
또한, PEG화는 비천연 아미노산을 도입함으로써 본 발명의 C5 결합 폴리펩티드의 어느 부분에서도 달성될 수 있다. 특정의 비천연 아미노산은 다음 문헌에 기재된 기술에 의해 도입할 수 있다 [참고: Deiters et al., J Am Chem Soc 125:11782-11783, 2003; Wang and Schultz, Science 301:964-967, 2003; Wang et al., Science 292:498-500, 2001; Zhang et al., Science 303:371-373, 2004 또는 미국 특허 제7,083,970호]. 간략하게 설명하면, 몇몇 이들 발현 시스템은 논센스 코돈, 예를 들어 앰버 (amber) TAG를 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 개방 리딩 프레임 내로 도입하기 위한 부위 지정 돌연변이 유발을 포함한다. 이어서, 이러한 발현 벡터를, 도입된 논센스 코돈에 대해 특이적이고 선택되는 비천연 아미노산이 충전된 tRNA를 활용할 수 있는 숙주 내로 도입한다. 부분들을 본 발명의 폴리펩티드와 접합시키는 데에 유리한 특별한 비천연 아미노산에는 아세틸렌 및 아지도 측쇄를 갖는 아미노산이 포함된다. 이어서, 이들 신규 아미노산을 함유하는 폴리펩티드를 해당 단백질 내의 이들 선택된 부위에서 PEG화할 수 있다.
항체를 공학 처리하는 방법
상기 논의된 바와 같이, 항-C5 항체를 사용하여, 완전한 길이의 중쇄 및/또는 경쇄 서열, VH 및/또는 VL 서열, 또는 이에 부착된 불변 영역(들)을 변형시킴으로써 신규한 항-C5 항체를 창출시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체의 하나 이상의 CDR 영역을 공지된 프레임워크 영역 및/또는 기타 CDR과 재조합적으로 조합시켜, 재조합적으로 공학 처리시킨 신규한 항-C5 항체를 창출시킬 수 있다. 기타 유형의 변형에는 앞서 섹션에 기재된 것들이 포함된다. 공학 처리 방법을 위한 출발 물질은 VH 및/또는 VL 서열 중의 하나 이상, 또는 그의 하나 이상의 CDR 영역이다. 공학 처리시킨 항체를 창출시키기 위해서는, VH 및/또는 VL 서열 중의 하나 이상, 또는 그의 하나 이상의 CDR 영역을 갖는 항체를 실제적으로 제조 (즉, 단백질로서 발현)할 필요는 없다. 오히려, 이들 서열 내에 함유된 정보를 출발 물질로서 사용하여 본래의 서열(들)로부터 유래된 "차세대" 서열을 창출시킨 다음, 이러한 "차세대" 서열(들)을 단백질로서 제조 및 발현시킨다.
표준 분자 생물학 기술을 사용하여 변경된 항체 서열을 제조 및 발현할 수 있다. 이와 같이 변경된 항체 서열(들)에 의해 코딩된 항체는 이로부터 유래되는 항-C5 항체의 기능적 특성 중의 한 가지 특성, 몇 가지 특성 또는 전부를 보유하고 있는 것인데, 기능적 특성에는 본원에 기재된 C5 활성이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 변경된 항체의 기능적 특성은 당해 분야에서 이용 가능하고/하거나 본원에 기재된 표준 검정 (예: ELISA)을 사용하여 평가할 수 있다.
본 발명의 항체를 공학 처리하는 방법의 특정 측면에서는, 돌연변이를 항-C5 항체 코딩 서열의 전부 또는 일부를 따라 무작위 또는 선택적으로 도입할 수 있고, 이로써 생성되는 변형된 항-C5 항체를 대상으로 하여 결합 활성 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 기타 기능적 특성 (예를 들어, MAC 형성 억제, 보체 경로 조절이상 조정)에 관하여 스크리닝할 수 있다. 돌연변이 방법은 당해 분야에 보고되었다. 예를 들어, PCT 공개공보 WO 02/092780 (Short)에는 포화 돌연변이 유발, 합성 연결 어셈블리, 또는 이들의 조합을 이용하여 항체 돌연변이물을 창출 및 스크리닝하는 방법이 기재되어 있다. 또 다른 한편, WO 03/074679 (Lazar et al)에는 항체의 물리화학적 특성을 최적화하기 위한 연산처리 스크리닝 방법을 사용하는 방법이 기재되어 있다.
뉴클레오티드 서열은 이것이 생산 세포 또는 유기체, 일반적으로 진핵 세포, 예를 들어 효소 [예: 피치아 (Pichia)] 세포, 곤충 세포, 포유류 세포, 예를 들면 중국산 햄스터 난소 세포 (CHO) 또는 인간 세포에서 바람직한 코돈을 사용하여 아미노산 서열을 코딩하도록 변경된 경우에는 이를 "최적화"시킨 것으로 간주된다. 이와 같이 최적화된 뉴클레오티드 서열은, "모" 서열로서 공지되기도 하는 본래의 출발 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열과 동일하거나 거의 동일한 아미노산 서열을 코딩도록 공학 처리시킨다.
비-항체 C5 결합 분자
본 발명은 추가로, 항체의 기능적 특성을 나타내긴 하지만, 기타 폴리펩티드 (예를 들어, 생체 내에서 항체 유전자의 재조합에 의해 생성되거나 항체 유전자에 의해 코딩된 것 이외의 폴리펩티드)로부터 그의 프레임워크 및 항원 결합 부분을 유도시키는 C5 결합 분자를 제공한다. 이들 결합 분자의 항원 결합 도메인 (예를 들어, 본 발명의 C5 결합 도메인 또는 에피토프)은 유도된 진화 공정을 통하여 생성된다 [참고: 미국 특허 제7,115,396호]. 항체의 가변 도메인과 유사한 전반적인 폴드 ("면역글로불린-유사" 폴드)를 갖는 분자가 적당한 스캐폴드 단백질이다. 항원 결합 분자를 유도시키는 데에 적합한 스캐폴드 단백질에는 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 이량체, 테나신 (tenascin), N-캐드헤린 (cadherin), E-캐드헤린, ICAM, 티틴, GCSF-수용체, 사이토킨 수용체, 글리코시다제 억제제, 항생제 색소단백질, 미엘린 막 부착 분자 PO, CD8, CD4, CD2, 부류 I MHC, T-세포 항원 수용체, CD1, C2 및 VCAM-1의 l-세트 도메인, 미오신-결합 단백질 C의 l-세트 면역글로불린 도메인, 미오신 결합 단백질 H의 l-세트 면역글로불린 도메인, 텔로킨의 l-세트 면역글로불린 도메인, NCAM, 트위친 (twitchin), 뉴로글리안 (neuroglian), 성장 호르몬 수용체, 에리트로포이에틴 수용체, 프롤락틴 수용체, 인터페론-감마 수용체, β-갈락토시다제/글루쿠로니다제, β-글루쿠로니다제, 트랜스글루타미나제, T-세포 항원 수용체, 슈퍼옥사이드 디스무타제, 조직 인자 도메인, 시토크롬 F, 그린 형광성 단백질, GroEL, 및 타우마틴 (thaumatin)이 포함된다.
비-항체 결합 분자의 항원 결합 도메인 (예: 면역글로불린-유사 폴드)는 분자량이 10 kD 미만 또는 7.5 kD 초과 (예를 들어, 7.5 내지 10 kD의 분자량)이다. 항원 결합 도메인을 유도시키기 위해 사용된 단백질은 천연 발생적 포유류 단백질 (예: 인간 단백질)이고, 항원 결합 도메인에는 이것이 유래되는 단백질의 면역글로불린-유사 폴드와 비교해서 돌연변이된 아미노산을 50％ 이하 (예를 들어, 34％, 25％, 20％, 또는 15％ 이하) 포함한다. 면역글로불린-유사 폴드를 갖는 도메인은 일반적으로 50 내지 150개 아미노산 (예를 들어, 40 내지 60개 아미노산)으로 이루어진다.
비-항체 결합 분자를 생성시키기 위해, 항원 결합 표면을 형성하는 스캐폴드 단백질 영역 (예를 들어, 항체 가변 도메인 면역글로불린 폴드의 CDR과 위치 및 구조 면에서 유사한 영역) 내의 서열을 무작위화시킨 클론 라이브러리를 창출시킨다. 라이브러리 클론을 대상으로 하여, 관심있는 에피토프 (예: C5)에 대한 특이적 결합과 기타 기능 (예를 들어, C5 활성의 억제)에 관하여 시험한다. 선별된 클론을 추가의 무작위화 및 선별을 위한 기준으로서 사용하여 항원에 대한 보다 고 친화성인 유도체를 생성시킬 수 있다.
예를 들어, 스캐폴드로서 피브로넥틴 III의 10번째 모듈 (10Fn3)을 사용하여, 고 친화성 결합 분자를 생성시킨다. 잔기 23-29, 52-55, 및 78-87에서 10Fn3의 3개 CDR-유사 루프 각각에 대한 라이브러리를 구축한다. 각 라이브러리를 구축하기 위해, 각 CDR-유사 영역과 중복되는 서열을 코딩하는 DNA 절편을 올리고뉴클레오티드 합성에 의해 무작위화한다. 선별 가능한 10Fn3 라이브러리를 생성시키기 위한 기술이 문헌 [참고: 미국 특허 제6,818,418호 및 제7,115,396호; Roberts and Szostak, 1997 Proc. Natl. Acad. Sci USA 94:12297; 미국 특허 제6,261,804호; 미국 특허 제6,258,558호; and Szostak et al. WO98/31700]에 기재되어 있다.
비-항체 결합 분자를 표적 항원에 대한 결합 활성도를 증가시키기 위한 이량체 또는 다량체로서 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 항원 결합 도메인이 Fc-Fc 이량체를 형성하는 항체의 불변 영역 (Fc)과의 융합물로서 발현된다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제7,115,396호].
본 발명의 항체를 코딩하는 핵산 분자
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 C5 결합 분자를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 이러한 핵산은 전세포, 세포 용해물에 제시될 수 있거나, 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 정제된 형태의 핵산일 수 있다. 핵산은 표준 기술, 예를 들어 알칼리성/SDS 처리, CsCl 밴드 형성, 칼럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 당해 분야에 공지된 기타 기술에 의해 기타 세포 성분 또는 기타 오염물질, 예를 들어 기타 세포내 핵산 또는 단백질로부터 정제 제거되는 경우에 "단리"되거나 "실질적으로 순수하게 된다" [참고: F. Ausubel, et al., ed. 1987 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York]. 본 발명의 핵산은, 예를 들어 DNA 또는 RNA일 수 있고, 인트론성 서열을 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. 특정 측면에서는, 핵산이 cDNA 분자이다. 핵산은 벡터 [예: 파아지 디스플레이 (phage display) 벡터], 또는 재조합 플라스미드 벡터에 제시될 수 있다.
결합 분자의 핵산 서열은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 수득할 수 있다. 하이브리도마 (예를 들어, 다음에 추가로 기재되는 바와 같은 인간 면역글로불린 유전자를 보유하고 있는 트랜스제닉 마우스로부터 제조된 하이브리도마)에 의해 발현된 항체의 경우에는, 이러한 하이브리도마에 의해 생성된 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 cDNA를 표준 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝 기술에 의해 수득할 수 있다. 면역글로불린 유전자 라이브러리로부터 수득한 항체의 경우에는 (예를 들어, 파아지 디스플레이 기술을 사용하는 경우), 이러한 항체를 코딩하는 핵산을 상기 라이브러리의 구성원인 각종 파아지 클론으로부터 회수할 수 있다.
일단 VH 및 VL 절편을 코딩하는 DNA 단편을 수득하게 되면, 이들 DNA 단편을 표준 재조합 DNA 기술에 의해 추가로 조작하여, 예를 들어 가변 영역 유전자를 완전한 길이의 항체 쇄 유전자, Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자로 전환시킬 수 있다. 이들 조작에서는, VL- 또는 VH-코딩 DNA 단편을 또 다른 DNA 분자와 작동가능하게 연결시키거나, 또는 또 다른 단백질, 예를 들어 항체 불변 영역 또는 가요성 링커를 코딩하는 단편과 작동가능하게 연결시킨다. 이러한 맥락에서 사용된 바와 같은 용어 "작동가능하게 연결된"이란 2개 DNA 단편을 기능적 방식으로 연결시켜, 예를 들어 이러한 2개 DNA 단편에 의해 코딩된 아미노산 서열이 동일 프레임 내에서 유지되도록 하거나 또는 단백질이 목적하는 프로모터의 제어 하에 발현되도록 하는 것을 의미한다.
VH 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 중쇄 불변 영역 (CH1, CH2 및 CH3)을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 VH-코딩 DNA를 작동가능하게 연결시킴으로써 완전한 길이의 중쇄 유전자로 전환시킬 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당해 분야에 공지되어 있고 [참고: 예를 들어, Kabat el al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242], 이들 영역을 포괄하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있다. Fab 단편 중쇄 유전자의 경우, VH-코딩 DNA는 단지 중쇄 CH1 불변 영역 만을 코딩하는 또 다른 DNA 분자와 작동가능하게 연결시킬 수 있다.
VL 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 경쇄 불변 영역 CL을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 VL-코딩 DNA를 작동가능하게 연결시킴으로써 완전한 길이의 경쇄 유전자 (뿐만 아니라 Fab 경쇄 유전자)로 전환시킬 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당해 분야에 공지되어 있고 [참고: 예를 들어, Kabat el al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242], 이들 영역을 포괄하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다.
scFv 유전자를 창출하기 위해서는, VH- 및 VL-코딩 DNA 단편을 가요성 링커, 예를 들어 아미노산 서열 (Gly4-Ser)3을 코딩하는 또 다른 단편과 작동가능하게 연결시켜, VH 및 VL 서열이 연속되는 단일 쇄 단백질로서 발현될 수 있도록 하는데, VL 영역과 VH 영역은 가요성 링커에 의해 연결된다 [참고: 예를 들어, Bird et al., 1988 Science 242:423-426; Huston et at, 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., 1990 Nature 348:552-554].
모노클로날 항체 생성
모노클로날 항체 (mAb)는 통상적인 모노클로날 항체 방법론을 포함한 각종 기술, 예를 들어 문헌 [참고: Kohler and Milstein, 1975 Nature 256: 495]의 표준 체세포 혼성화 기술, 또는 라이브러리 디스플레이 방법, 예를 들어 파아지 디스플레이를 사용하여 생성될 수 있다
하이브리도마를 제조하기 위한 동물 시스템은 뮤린 시스템이다. 마우스에서 하이브리도마를 생성시키는 것은 널리 확립된 과정이다. 면역 프로토콜 및 융합을 위해 면역시킨 비장 세포를 단리하는 기술은 당해 분야에 공지되어 있다. 융합 파트너 (예: 뮤린 골수종 세포) 및 융합 과정 또한 공지되어 있다.
본 발명의 키메라 또는 인간화 항체는 상기 언급된 바와 같이 제조된 뮤린 모노클로날 항체의 서열을 기준으로 하여 제조할 수 있다. 중쇄 및 경쇄 면역글로불린을 코딩하는 DNA는 관심있는 뮤린 하이브리도마로부터 수득할 수 있고, 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 비-뮤린 (예: 인간) 면역글로불린 서열을 함유하도록 공학 처리할 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체를 창출하기 위해서는, 뮤린 가변 영역을 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 인간 불변 영역에 연결시킬 수 있다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 (Cabilly et al.)]. 인간화 항체를 창출하기 위해서는, 뮤린 CDR 영역을 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 인간 프레임워크 내로 삽입할 수 있다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제5,225,539호, 및 미국 특허 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,693,762호 및 제6,180,370호].
특정 측면에서, 본 발명의 항체는 인간 모노클로날 항체이다. C5 에피토프에 대항하여 유도된 인간 모노클로날 항체는 마우스 시스템 보다는 오히려 인간 면역계의 일부를 수반하고 있는 트랜스제닉 또는 트랜스-염색체성 마우스를 사용하여 생성시킬 수 있다. 이들 트랜스제닉 및 트랜스-염색체성 마우스에는 본원에서 HuMAb 마우스 및 KM 마우스로서 각각 지칭된 마우스가 포함되고, 이는 본원에서 집합적으로 "인간 Ig 마우스"로서 지칭된다.
HuMAb 마우스® (공급처: Medarex, Inc.)는 내인성 μ 및 κ 쇄 유전자자리를 불활성화시키는 표적화 돌연변이와 함께, 재배열되지 않은 인간 중쇄 (μ 및 γ) 및 κ 경쇄 면역글로불린 서열을 코딩하는 인간 면역글로불린 유전자 미니자리를 함유한다 [참고: 예를 들어, Lonberg et al., 1994 Nature 368(6474): 856-859]. 따라서, 마우스는 마우스 IgM 또는 κ의 발현 저하를 나타내고, 면역에 반응하여 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스-유전자는 부류 전환과 체세포 돌연변이를 진행하여 고 친화성 인간 IgGκ 모노클로날을 생성시킨다 [참고: Lonberg, N. et al., 1994 상기 참고; Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol.13: 65-93, and Harding, F. and Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546]. HuMAb 마우스의 제조 및 용도, 및 이러한 마우스에 의해 수반된 게놈 변형이 다음 문헌에 추가로 기재되어 있다 [참고: Taylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al., 1993 International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724; Choi et al., 1993 Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al., 1994 J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al., 1994 International Immunology 579-591; and Fishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851 (이들 모두의 전문이 본원에 참고로 도입된다)]. 또한 추가로, 미국 특허 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,789,650호; 제5,877,397호; 제5,661,016호; 제5,814,318호; 제5,874,299호; 및 제5,770,429호 (Lonberg and Kay); 미국 특허 제5,545,807호 (Surani et al); PCT 공개공보 WO 92103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97113852, WO 98/24884 및 WO 99/45962 (Lonberg and Kay); 및 PCT 공개공보 WO 01/14424 (Korman et al)를 참고할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 인간 항체는 트랜스-유전자 및 트랜스-염색체 상에 인간 면역글로불린 서열을 보유하고 있는 마우스, 예를 들어 인간 중쇄 트랜스-유전자 및 인간 경쇄 트랜스-염색체를 보유하고 있는 마우스를 사용하여 생성시킬 수 있다. 이러한 마우스는 본원에서 "KM 마우스"로서 지칭되고, WO 02/43478에 상세히 기재되어 있다.
인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 추가의 또 다른 트랜스제닉 동물 시스템이 당해 분야에서 입수 가능하고, 이를 사용하여 본 발명의 항-C5 항체를 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 제노마우스 [Xenomouse® (공급처: Abgenix, Inc.)]로서 지칭된 또 다른 트랜스제닉 시스템을 사용할 수 있다. 이러한 마우스는, 예를 들어 미국 특허 제5,939,598호; 제6,075,181호; 제6,114,598호; 제6,150,584호 및 제6,162,963호 (Kucherlapati et al)에 기재되어 있다.
더우기, 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 또 다른 트랜스-염색체 동물 시스템이 당해 분야에서 입수 가능하고, 이를 사용하여 본 발명의 항-C5 항체를 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 트랜스-염색체와 인간 경쇄 트랜스-염색체 둘 다를 보유하고 있는 마우스 ("TC 마우스"로서 지칭됨)를 사용할 수 있고; 이러한 마우스는 문헌 [참고: Tomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727]에 기재되어 있다. 더우기, 인간 중쇄 트랜스-염색체와 인간 경쇄 트랜스-염색체를 보유하고 있는 암소가 당해 분야에 보고되었고 [참고: Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology 20:889-894], 이를 사용하여 본 발명의 항-C5 항체를 생성시킬 수 있다.
본 발명의 인간 모노클로날 항체는 인간 면역글로불린 유전자의 라이브러리를 스크리닝하기 위한 파아지 디스플레이 방법을 사용하여 제조할 수도 있다. 이와 같이 인간 항체를 단리하기 위한 파아지 디스플레이 방법은 당해 분야에 확립되어 있다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제5,223,409호; 제5,403,484호 및 제5,571,698호 (Ladner et al.); 미국 특허 제5,427,908호 및 제5,580,717호 (Dower et al.); 미국 특허 제5,969,108호 및 제6,172,197호 (McCafferty et al.); 및 미국 특허 제5,885,793호; 제6,521,404호; 제6,544,731호; 제6,555,313호; 제6,582,915호 및 제6,593,081호 (Griffiths et al.)]. 라이브러리를 대상으로 하여, 완전한 길이의 C5 항원 또는 서열 1, 3 및 5의 특별한 C5 에피토프에 대한 결합에 관하여 스크리닝할 수 있다.
본 발명의 인간 모노클로날 항체는, 인간 면역 세포를 재구성시킨 바 있는 SCID 마우스를 사용하여 제조할 수도 있는데, 이로써 면역시 인간 항체 반응이 발생할 수 있다. 이러한 마우스는, 예를 들어 미국 특허 제5,476,996호 및 제5,698,767호 (Wilson et al)에 기재되어 있다.
인간 Ig 마우스에서 인간 모노클로날 항체의 생성
원핵 세포 (예를 들어, 이. 콜라이) 또는 진핵 세포 (예를 들어, 포유류 세포, 예를 들면 HEK293 세포)에서 발현된 정제된 재조합 인간 C5를 항원으로서 사용할 수 있다. 단백질을 캐리어, 예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH)과 접합시킬 수 있다.
C-5 neo-에피토프에 대한 완전한 인간 모노클로날 항체는 HuMab 트랜스제닉 마우스의 HCo7, HCo12 및 HCo17 균주 및 트랜스제닉 트랜스-염색체성 마우스의 KM 균주 (이들 각각은 인간 항체 유전자를 발현한다)를 사용하여 제조한다. 이들 마우스 균주 각각에서는, 내인성 마우스 카파 경쇄 유전자를 문헌 [참고: Chen et al., 1993 EMBO J. 12:811-820]에 기재된 바와 같이 동형 접합적으로 붕괴시킬 수 있고, 내인성 마우스 중쇄 유전자를 WO 01109187의 실시예 1에 기재된 바와 같이 동형 접합적으로 붕괴시킬 수 있다. 이들 마우스 균주 각각은 문헌 [참고: Fishwild et al., 1996 Nature Biotechnology 14:845-851]에 기재된 바와 같이, 인간 카파 경쇄 트랜스-유전자인 KCo5를 수반한다. HCo7 균주는 미국 특허 제5,545,806호; 제5,625,825호; 및 제5,545,807호에 기재된 바와 같이 HCo7 인간 중쇄 트랜스-유전자를 수반한다. HCo12 균주는 WO 01/09187의 실시예 2에 기재된 바와 같은 HCo12 인간 중쇄 트랜스-유전자를 수반한다. HCo17 균주는 HCo17 인간 중쇄 트랜스-유전자를 수반한다. KNM 균주는 WO 02/43478에 기재된 바와 같은 SC20 트랜스-염색체를 함유한다.
C5 에피토프에 대한 완전한 인간 모노클로날 항체를 생성시키기 위해, HuMab 마우스 및 KM 마우스를 항원으로서 정제된 재조합 C5, C5 단편, 또는 그의 접합체 (C5-KLH)를 이용하여 면역시킨다. HuMab 마우스에 대한 일반적인 면역 도식이 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Lonberg, N. et al., 1994 Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14:845-851 및 WO 98/24884]. 상기 마우스는 항원을 처음 주입할 때 6 내지 16주생이다. 항원의 정제된 재조합 제제 (5-50 ㎍)를 사용하여 HuMab 마우스 및 KM 마우스를 복강내, 피하 (Sc) 면역시키거나 또는 발바닥에 주입함으로써 면역시킨다.
트랜스제닉 마우스에게 완전 프로인트 아주반트 또는 리비 (Ribi) 아주반트 중의 항원을 복강내 (IP), 피하 (Sc) 투여하거나 또는 발바닥 (FP)에 주입하여 2회 면역시킨 다음, 3일 내지 21일 후 불완전 프로인트 또는 리비 아주반트 중의 항원을 이용하여 IP, Sc 또는 FP 면역시킨다 (총 11회 정도 면역시킴). 눈뒤 출혈을 관찰함으로써 면역 반응을 모니터링한다. 혈장을 ELISA에 의해 스크리닝하고, 충분한 역가의 항-C5 인간 면역글로불린을 수반한 마우스를 융합에 사용한다. 희생시키고 비장을 꺼내기 3일 및 2일 전에 마우스에게 항원을 정맥내 주입함으로써 추가면역시켰다. 전형적으로, 각 항원에 대한 10 내지 35회 융합을 수행한다. 각 항원에 대해 수 십마리의 마우스를 면역시킨다. 총 82마리의 HCo7, HCo12, HCo17 및 KM 마우스 균주를 C5 항원으로 면역시킨다.
C5 에피토프와 결합한 항체를 생산하는 HuMab 또는 KM 마우스를 선별하기 위해, 면역시킨 마우스로부터의 혈청을 대상으로 하여 문헌 [참고: Fishwild, D. et al., 1996]에 기재된 바와 같이 ELISA에 의해 시험할 수 있다. 간략하게 언급하면, 미세역가 플레이트를 정제된 재조합 C5로 PBS 중의 1 내지 2 ㎍/ml로 피복하고, 웰당 50 ㎕을 4℃ 하에 밤새 인큐베이션한 다음, PBS/Tween (0.05％) 중의 200 ㎕/웰의 5％ 닭 혈청으로 차단시킨다. C5-면역시킨 마우스로부터의 혈청 희석액을 각 웰에 가하고 주위 온도 하에 1 내지 2시간 동안 인큐베이션한다. 플레이트를 PBS/Tween으로 세척한 다음, 실온 하에 1시간 동안 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)와 접합된 염소-항-인간 IgG Fc 폴리클로날 항체와 함께 인큐베이션한다. 세척 후, 상기 플레이트를 ABTS 기질 (공급처: Sigma, A-1888, 0.22 mg/ml)으로 전개하고, 분광광도계를 이용하여 OD 415-495으로 분석한다. 가장 높은 항-C5 항체 역가를 발생한 마우스의 비장 세포를 융합에 사용한다. 융합을 수행하고, 하이브리도마 상등액을 대상으로 하여 ELISA에 의해 항-C5 활성을 시험한다.
HuMab 마우스 및 KM 마우스로부터 단리된 마우스 비장 세포를, PEG를 사용하는 표준 프로토콜에 기초하여 마우스 골수종 세포주와 융합시킨다. 이어서, 이로써 생성되는 하이브리도마를 대상으로 하여, 항원-특이적 항체의 생성에 관하여 스크리닝한다. 면역시킨 마우스로부터의 비장 림프구의 단일 세포 현탁액을, 50％ PEG (공급처: Sigma)를 이용하여 SP2/0 비분비성 마우스 골수종 세포 (공급처: ATCC, CRL 1581) 수의 1/4과 융합시킨다. 세포를 평저 미세역가 플레이트 내에 대략 1x105/웰로 도말한 다음, 10％ 태아 소 혈청, 10％ P388D1 (공급처: ATCC, CRL TIB-63) 적응용 배지, DMEM (공급처: Mediatech, CRL 10013, 고 글루코스, L-글루타민 및 나트륨 피루베이트 수반) 중의 3-5％ 오리젠 (Origen®) (IGEN) + 5 mM HEPES, 0.055 mM 2-머캅토에탄올, 50 mg/ml 젠타마이신 및 1x HAT (공급처: Sigma, CRL P-7185)를 함유하는 선택적 배지에서 약 2주 동안 인큐베이션한다. 1 내지 2주 후, HAT를 HT로 대체시킨 배지에서 세포를 배양한다. 이어서, 개개의 웰을 대상으로 하여 인간 항-C5 모노클로날 IgG 항체에 관하여 알아보기 위해 ELISA에 의해 스크리닝한다. 일단 광범위한 하이브리도마 성장이 이루어지면, 통상 10 내지 14일 후에 배지를 모니터링한다. 항체 분비성 하이브리도마를 재도말하고, 다시 스크리닝하며, 인간 IgG에 대해 여전히 양성인 경우에는, 항-C5 모노클로날 항체를 제한 희석함으로써 적어도 2회 서브클로닝한다. 이어서, 안정한 서브클론을 시험관 내에서 배양하여 조직 배양 배지 중에 소량의 항체를 생성시켜, 이를 추가의 성상 확인에 사용한다.
인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성
본 발명의 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성시키기 위해, 면역시킨 마우스로부터의 비장 세포 및/또는 림프절 세포를 단리하고, 이를 적당한 불멸화 세포주, 예를 들어 마우스 골수종 세포주와 융합시킨다. 이로써 생성되는 하이브리도마를 대상으로 하여, 항원 특이적 항체 생산에 관하여 스크리닝한다. 예를 들어, 면역시킨 마우스로부터의 비장 림프구의 단일 세포 현탁액을, 50％ PEG를 이용하여 P3X63-Ag8.653 비분비성 마우스 골수종 세포 (공급처: ATCC, CRL 1580) 수의 1/6과 융합시킬 수 있다. 세포를 평저 미세역가 플레이트 내에서 대략 2 x 145로 도말한 다음, 20％ 태아 클론 혈청, 18％ "653" 적응용 배지, 5％ 오리젠 (Origen®) (IGEN), 4 mM L-글루타민, 1 mM 나트륨 피루베이트, 5 mM HEPES, 0.055 mM 2-머캅토에탄올, 50 단위/ml 페니실린, 50 ㎍/ml 스트렙토마이신, 50 ㎍/ml 젠타마이신 및 1x HAT (공급처: Sigma; HAT는 융합시킨지 24시간 후에 가한다)를 함유하는 선택적 배지에서 2주 동안 인큐베이션한다. 대략 2주 후, HAT를 HT로 대체시킨 배지에서 세포를 배양한다. 이어서, 개개의 웰을 대상으로 하여 인간 모노클로날 IgM 및 IgG 항체에 관하여 알아보기 위해 ELISA에 의해 스크리닝할 수 있다. 일단 광범위한 하이브리도마 성장이 이루어지면, 통상 10 내지 14일 후에 배지를 관찰할 수 있다. 항체 분비성 하이브리도마를 재도말하고, 다시 스크리닝하며, 인간 IgG에 대해 여전히 양성인 경우에는, 모노클로날 항체를 제한 희석함으로써 적어도 2회 서브클로닝할 수 있다. 이어서, 안정한 서브클론을 시험관 내에서 배양하여 조직 배양 배지 중에 소량의 항체를 생성시켜, 이를 추가의 성상 확인에 사용할 수 있다.
인간 모노클로날 항체를 정제하기 위해, 선별된 하이브리도마를 모노크로날 항체 정제를 위해 2 리터의 스피너-플라스크에서 성장시킬 수 있다. 상등액을 여과시키고, 단백질 A-세파로스 (공급처: Pharmacia, Piscataway, N.J.)로 친화 크로마토그래피하기 전에 농축시킬 수 있다. 용출된 IgG을 겔 전기영동 및 고 성능 액체 크로마토그래피에 의해 검사하여 순도를 보장할 수 있다. 완충 용액을 PBS로 교환시키고, 흡광 계수 1.43을 사용하여 OD280에 의해 농도를 결정할 수 있다. 모노클로날 항체를 등분하고 -80℃ 하에 저장할 수 있다.
모노클로날 항체를 생산하는 형질감염 세포의 생성
본 발명의 항체는 또한, 당해 분야에 널리 공지된 바와 같은 재조합 DNA 기술과 유전자 형질감염 방법을 병용 사용하여 숙주 세포 형질감염 세포에서 생성시킬 수 있다 [참고: 예를 들어, Morrison, 1985 Science 229:1202].
예를 들어, 항체 또는 그의 항체 단편을 발현시키기 위해, 부분 또는 완전한 길이의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA를 표준 분자 생물학 기술 (예를 들어, 관심있는 항체를 발현하는 하이브리도마를 사용하는 cDNA 클로닝 또는 PCR 증폭)에 의해 수득할 수 있고, 이러한 DNA를 발현 벡터 내로 삽입하여 해당 유전자가 전사 및 번역 제어 서열과 작동가능하게 연결되도록 한다. 이러한 맥락에서, 용어 "작동가능하게 연결된"이란 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 그들의 의도한 기능을 제공하도록 항체 유전자가 벡터 내로 연결되는 것을 의미한다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용된 발현 숙주 세포와 화합성이 되도록 선택한다. 항체 경쇄 유전자와 항체 중쇄 유전자를 별개의 벡터 내로 삽입할 수 있거나, 또는 보다 전형적으로는, 양 유전자를 동일한 발현 벡터 내로 삽입한다. 항체 유전자를 표준 방법 (예를 들어, 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보적 제한 부위의 연결, 또는 제한 부위가 전혀 존재하지 않는 경우에는 평활 말단 연결)에 의해 발현 벡터 내로 삽입한다. 본원에 기재된 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 사용하여, 이들을 이미 목적하는 이소형의 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역을 코딩하는 발현 벡터 내로 삽입함으로써 모든 항체 이소형의 완전한 길이의 항체 유전자를 창출시켜 VH 절편이 벡터 내의 CH 절편(들)과 작동가능하게 연결되고 VL 절편이 벡터 내의 CL 절편과 작동가능하게 연결되도록 한다. 부가적으로, 또는 또 다른 한편, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 항체 쇄의 분비를 촉진시켜 주는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 항체 쇄 유전자는 신호 펩티드가 동일 프레임 내에서 항체 쇄 유전자의 아미노 말단과 연결되도록 벡터 내로 클로닝할 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드 (즉, 비-면역글로불린 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다.
항체 쇄 유전자 이외에도, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서의 항체 쇄 유전자의 발현을 제어하는 조절성 서열을 보유하고 있다. 용어 "조절성 서열"에는 프로모터, 인핸서, 및 항체 쇄 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 기타 발현 제어 요소 (예: 폴리아데닐화 신호)가 포함된다. 이러한 조절성 서열은, 예를 들어 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Goeddel, Gene Expression Technology. 1990 Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA]. 조절성 서열의 선별을 포함한, 발현 벡터의 설계는 형질전환시키고자 하는 숙주 세포의 선택, 목적하는 단백질의 발현 수준 등의 요인에 좌우될 수 있다는 것을 당업자는 인지할 것이다. 포유류 숙주 세포 발현을 위한 조절성 서열에는 포유류 세포에서 고 수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스성 요소, 예를 들어 시토메갈로바이러스 (CMV), 원숭이 바이러스 40 (SV40), 아데노바이러스 [예: 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (AdMLP)], 및 폴리오마로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서가 포함된다. 또 다른 한편, 비-바이러스성 조절성 서열, 예를 들어 우비퀴틴 프로모터 또는 P-글로빈 프로모터를 사용할 수 있다. 또한 추가로, SV40 초기 프로모터 및 인간 T 세포 백혈병 바이러스 유형 1의 장 말단 반복 서열로부터의 서열을 함유하는, 상이한 공급원 (예: SRa 프로모터 시스템)으로부터의 서열로 구성된 조절성 요소를 사용할 수 있다 [참고: Takebe et al., 1988 Mol. Cell. Biol. 8:466-472].
항체 쇄 유전자 및 조절성 서열 이외에도, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 부가의 서열, 예를 들어 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열 (예: 복제 기점) 및 선별성 마커 유전자를 수반할 수 있다. 선별성 마커 유전자는 벡터를 도입시킨 숙주 세포의 선별을 용이하게 해준다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제4,399,216호, 제4,634,665호 및 제5,179,017호 (Axel et al.)]. 예를 들어, 전형적으로 선별성 마커 유전자는 벡터를 도입시킨 숙주 세포 상에서 약물 (예를 들어, G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트)에 대한 내성을 부여해준다. 선별성 마커 유전자에는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선별/증폭을 이용하여 dhfr- 숙주 세포에서 사용하기 위함) 및 neo 유전자 (G418 선별하기 위함)가 포함된다.
경쇄 및 중쇄를 발현시키기 위해서는, 이러한 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 발현 벡터(들)를 표준 기술에 의해 숙주 세포 내로 형질감염시킨다. 각종 형태의 용어 "형질감염"은 외인성 DNA를 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내로 도입하기 위해 흔히 사용되고 있는 광범위한 기술, 예를 들어 전기천공, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포괄한다. 본 발명의 항체를 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 발현시키는 것이 이론상 가능하다. 항체를 진핵 세포, 특히 포유류 숙주 세포에서 발현시키는 것이 논의되는데, 이는 이러한 진핵 세포, 특히 포유류 세포가 적절하게 폴딩되고 면역학적으로 활성인 항체를 어셈블리하고 분비시키는 데에 원핵 세포 보다 더 적합하기 때문이다. 항체 유전자의 원핵성 발현은 활성 항체를 고 수율로 생성시키는 데에 비효과적인 것으로 보고되었다 [참고: Boss and Wood, 1985 Immunology Today 6:12-13].
본 발명의 재조합 항체를 발현시키기 위한 포유류 숙주 세포에는, 예를 들어 문헌 [참고: Kaufman and Sharp, 1982 Mol. Biol. 159:601-621]에 기재된 바와 같이, DHFR 선별성 마커와 함께 사용된 중국산 햄스터 난소 세포 (CHO 세포) [문헌 (참고: Urlaub and Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220)에 기재된 dhfr- CHO 세포 포함], NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포가 포함된다. 특히, NSO 골수종 세포와 함께 사용하는 경우, 또 다른 발현 시스템은 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 338,841에 제시된 GS 유전자 발현 시스템이다. 항체 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터를 포유류 숙주 세포 내로 도입하는 경우에는, 항체를 숙주 세포가 성장하는 배양 배지 내로 분비시키거나 항체를 숙주 세포에서 발현시키기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 항체를 생성시킨다. 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 항체를 배양 배지로부터 회수할 수 있다.
이중-특이적 분자
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 C5 결합 분자 (예: 항-C5 항체 또는 그의 단편)을 포함하는 이중-특이적 분자를 특징으로 한다. 본 발명의 C5 결합 분자를 또 다른 기능성 분자, 예를 들어 또 다른 펩티드 또는 단백질 (예: 또 다른 항체 또는 수용체에 대한 리간드)로 유도체화하거나 이와 연결시켜 2개 이상의 상이한 결합 부위 또는 표적 분자와 결합하는 이중-특이적 분자를 생성시킬 수 있다. 본 발명의 C5 결합 분자를 사실상, 하나 이상의 기타 기능성 분자로 유도체화하거나 이와 연결시켜 둘 이상의 상이한 결합 부위 및/또는 표적 분자와 결합하는 다중-특이적 분자를 생성시킬 수 있는데; 이러한 다중-특이적 분자는 본원에 사용된 바와 같은 용어 "이중-특이적 분자"에 포괄된다. 본 발명의 이중-특이적 분자를 창출시키기 위해, 본 발명의 항체를 하나 이상의 기타 결합 분자, 예를 들어 또 다른 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 결합 유사작용제와 기능적으로 연결시켜 (예를 들어, 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유적 연합 등에 의함) 이중-특이적 분자가 생성되도록 할 수 있다.
따라서, 본 발명은 C5 에피토프에 대한 하나 이상의 제1 결합 특이성과, 제2 표적 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 이중-특이적 분자를 포함한다.
한 측면에서, 본 발명의 이중-특이적 분자는 결합 특이성으로서 하나 이상의 항체, 또는 그의 항체 단편 [이에는, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 단일 쇄 Fv가 포함된다]을 포함한다. 항체는 또한, 경쇄 또는 중쇄 이량체, 또는 그의 모든 최소 단편, 예를 들어 Fv 또는 단일 쇄 구조물일 수도 있다 [참고: 미국 특허 제4,946,778호 (Ladner et al); 그의 전문이 본원에 참고로 도입된다].
본 발명의 이중-특이적 분자는 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 구성분 결합 특이성을 접합시킴으로써 제조할 수 있다. 예를 들어, 이중-특이적 분자의 각 결합 특이성은 개별적으로 생성시킨 다음, 서로 접합시킬 수 있다. 결합 특이성이 단백질 또는 펩티드인 경우에는, 공유 접합을 위한 각종 커플링제 또는 가교 결합제를 사용할 수 있다. 가교 결합제의 예에는 단백질 A, 카보디이미드, N-석신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트 (SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산) (DTNB), o-페닐렌디말레이미드 (oPDM), N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP), 및 설포석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카복실레이트 (설포-SMCC)가 포함된다 [참고: 예를 들어, Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686; Liu et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648]. 기타 방법에는 다음 문헌에 기재된 방법이 포함된다 [참고: Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78,118-132; Brennan et al., 1985 Science 229:81-83, and Glennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375]. 접합제는 SATA 및 설포-SMCC [둘 다 Pierce Chemical Co. (Rockford, IL)로부터 입수 가능하다]이다.
결합 특이성이 항체인 경우에는, 이들을 두 중쇄의 C-말단 힌지 영역을 설프히드릴 결합시킴으로써 접합시킬 수 있다. 특별한 측면에서, 힌지 영역은 접합 이전에 홀수의 설프히드릴 잔기, 예를 들어 1개의 설프히드릴 잔기를 함유하도록 변형시킨다.
또 다른 한편, 양 결합 특이성을 동일한 벡터에서 코딩할 수 있고, 동일한 숙주 세포에서 발현 및 어셈블리할 수 있다. 이 방법은 이중-특이적 분자가 mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 또는 리간드 x Fab 융합 단백질인 경우에 특히 유용하다. 본 발명의 이중-특이적 분자는 하나의 단일 쇄 항체와 결합 결정기를 포함하는 단일 쇄 분자, 또는 2개의 결합 결정기를 포함하는 단일 쇄 이중-특이적 분자일 수 있다. 이중-특이적 분자는 2개 이상의 단일 쇄 분자를 포함할 수 있다. 이중-특이적 분자의 제조 방법은, 예를 들어 미국 특허 제5,260,203호; 제5,455,030호; 제4,881,175호; 제5,132,405호; 제5,091,513호; 제5,476,786호; 제5,013,653호; 제5,258,498호; 및 제5,482,858호에 기재되어 있다.
그들의 특이적 표적에 대한 이중-특이적 분자의 결합성은, 예를 들어 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA), 방사성 면역검정 (REA), FACS 분석, 생물학적 검정 (예: 성장 억제) 또는 웨스턴 블롯 (Western Blot) 검정에 의해 확증할 수 있다. 이들 검정 각각은 일반적으로, 관심있는 복합체에 대해 특이적인 표지된 시약 (예: 항체)를 이용함으로써 특별히 관심있는 단백질-항체 복합체의 존재를 검출한다.
보체 활성화 측정
보체 경로 분자의 존재 및 보체 시스템의 활성화를 측정하는 각종 방법을 사용할 수 있다 [참고; 예를 들어, 미국 특허 제6,087,120호; 및 Newell et al., J Lab Clin Med, 100:437-44, 1982]. 예를 들어, 보체 활성은 (i) 적혈구의 보체 매개된 용해 (용혈)의 억제 측정; (ii) C3 또는 C5의 절단을 억제할 수 있는 능력 측정; 및 (iii) 대체 경로 매개된 용혈의 억제 측정에 의해 모니터링할 수 있다.
가장 흔히 사용되고 있는 2가지 기술은 용혈 검정 [참고: 예를 들어, Baatrup et al., Ann Rheum Dis, 51:892-7, 1992] 및 면역학적 검정 [참고: 예를 들어, Auda et al., Rheumatol Int, 10:185-9, 1990]이다. 용혈 기술은 전체 서열 - 전통적 또는 대체 경로의 기능적 능력을 측정한다. 면역학적 기술은 특이적 보체 성분 또는 분열 생성물의 단백질 농도를 측정한다. 본 발명의 방법에서 보체 활성화를 검출하거나 보체 성분의 활성을 측정하기 위해 이용될 수 있는 기타 검정에는, 예를 들어 T 세포 증식 검정 [참고: Chain et al., J Immunol Methods, 99:221-8, 1987], 및 지연형 과민증 (DTH) 검정 [참고: Forstrom et al., 1983, Nature 303:627-629; Hallidayet al., 1982, in Assessment of Immune Status by the Leukocyte Adherence Inhibition Test, Academic, New York pp. 1-26; Koppi et al., 1982, Cell. Immunol. 66:394-406; 및 미국 특허 제5,843,449호]이 포함된다.
용혈 기술에서는, 보체 성분 모두가 존재해야 하고 기능적이어야만 한다. 따라서, 용혈 기술은 보체 시스템의 기능적 완전성과 결핍 둘 다를 스크리닝할 수 있다 [참고: 예를 들어, Dijk et al., J Immunol Methods 36: 29-39, 1980; Minh et al., Clin Lab Haematol. 5:23-34 1983; and Tanaka et al., J Immunol 86: 161-170, 1986]. 전통적 경로의 기능적 능력을 측정하기 위해, 헤모리신 [양 (sheep) 적혈구에 대한 토끼 IgG]으로 피복된 양 적혈구를 표적 세포 (감작 세포)로서 사용한다. 이들 Ag-Ab 복합체는 전통적 경로를 활성화시키고, 성분들이 기능적이고 적당한 농도로 존재하는 경우에는 표적 세포를 용해시킨다. 대체 경로의 기능적 능력을 결정하기 위해, 토끼 적혈구를 표적 세포로서 사용한다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제6,087,120호].
용혈 보체 측정은, 예를 들어 대상체의 혈액 내에서 보체 단백질의 결핍증과 기능적 장애를 검출하는 데에 적용 가능한데, 이는 완전한 범위의 기능적 보체 단백질을 요구하는 세포 용해를 유도시키는 보체 기능을 기초로 하기 때문이다. 전통적 경로 활성화를 결정하는 소위 CH50 방법, 및 대체 경로에 대한 AP50 방법은 완전 혈청 대신 분리된 특이적 보체 단백질을 사용함으로써 연장될 수 있는 반면, 고도로 희석된 시험 샘플은 공지되지 않은 농도의 제한 보체 성분을 함유하고 있다. 이러한 방법에 의해, 보체 시스템을 보다 상세하게 측정할 수 있는데, 이는 성분이 결핍되어 있다는 것을 표시한다.
면역학적 기술은 각종 보체 성분 (예를 들어, C3, C4 및 C5)의 상이한 에피토프에 대항한 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 이용하여, 예를 들어 보체 성분의 분열 생성물을 검출한다 [참고: 예를 들어, Hugli et al., Immunoassays Clinical Laboratory Techniques 443-460, 1980; Gorski et al., J Immunol Meth 47: 61-73, 1981; Linder et al., J Immunol Meth 47: 49-59, 1981; and Burger et al., J Immunol 141: 553-558, 1988]. 이어서, 항체가 공지된 농도의 표지된 분열 생성물과 경쟁하여 분열 생성물과 결합하는 정도를 측정할 수 있다. 각종 검정, 예를 들어 방사성 면역검정, ELISA 및 방사상 확산 검정이 보체 분열 생성물을 검출하는 데에 이용 가능하다.
면역학적 기술은 보체 활성화를 검출할 수 있는 고 감도를 제공하는데, 이는 황반 변성 관련 장애가 있거나 없는 시험 대상체 및 대조군 대상체로부터의 혈액에서 분열 생성물 형성을 측정할 수 있기 때문이다. 따라서, 본 발명의 몇몇 방법에서, 안과 장애와 연관된 장애의 진단은 시험 대상체로부터의 혈장 중의 보체 성분 (예를 들어, C3a, C4a, C5a, 및 C5b-9 말단 복합체)의 가용성 분열 생성물의 정량화를 통하여 비정상적인 보체 활성화를 측정함으로써 이루어진다. 이러한 측정은 문헌 [참고: 예를 들어, Chenoweth et al., N Engl J Med 304: 497-502, 1981; and Bhakdi et al., Biochim Biophys Acta 737: 343-372, 1983]에 기재된 바와 같이 수행할 수 있다. 바람직하게는, 생체 내에서 형성된 보체 활성화만을 측정한다. 이는 보체 시스템의 억제제를 함유하는 배지에 해당 대상체로부터의 생물학적 샘플 (예: 혈청)을 수집한 다음, 이러한 샘플에서 보체 활성화를 측정함으로써 (예를 들어, 분열 생성물를 정량화함) 달성할 수 있다.
안과 질병 또는 장애와 연관된 장애가 있는 환자를 임상적으로 진단 또는 모니터링하는 데에 있어서, 정상 대상체로부터의 상응하는 생물학적 샘플 중에서의 수준과 비교해서 보체 단백질이 검출된다는 것은 환자가 황반 변성과 연관된 장애가 있다는 지표이다.
생체내 진단 또는 영상화가 US2006/0067935에 기재되어 있다. 간략하게 언급하면, 이들 방법은 일반적으로, 비-침습성 방법에 의해 검출가능한 마커 또는 표지에 작동적으로 부착되는 C5 결합 분자의 진단적 유효량을 환자에게 투여 또는 도입하는 것을 포함한다. 항체-마커 접합체는 보체 단백질을 안구 내에 국재시키고 결합시키는 데에 충분한 시간 동안 둔다. 이어서, 환자를 검출 기구에 노출시켜 검출가능한 마커를 확인하는데, 이로써 환자의 안구 내에 C5 결합 분자의 위치 영상이 형성된다. C5 결합 분자 또는 그의 복합체의 존재는 항체-마커가 안구 성분과 결합하는 지를 결정함으로써 검출한다. AMD 질병이 없는 정상 개체와 비교해서 선별된 보체 단백질 또는 단백질 조합물 수준 상의 증가가 검출된다는 것은 황반 변성과 연관된 장애에 대한 소인 및/또는 장애 발병의 지표이다. 본 발명의 이들 측면은 안구 조영법 및 복합 혈관형성성 진단 및 치료 방법에 사용하는 데에 바람직하기도 하다.
또 다른 측면에서, 세포 무함유 검정에서는 C5 단백질 또는 에피토프를 C5 단백질과 결합하는 공지된 결합 분자와 접촉시켜 검정 혼합물을 형성시킨 다음, 이러한 검정 혼합물을 시험 화합물 또는 결합 분자와 접촉시켜 공지된 화합물에 비해 C5 단백질과 상호 작용할 수 있는 시험 화합물 또는 결합 분자의 능력을 결정할 수 있다.
트랜스제닉 동물
트랜스제닉 동물은 본 발명의 화합물 또는 결합 분자를 사용하여 형성시킬 수 있다. 특히, 트랜스제닉 비-인간 동물은 야생형 또는 돌연변이체 핵산 분자를 숙주 동물의 세포 내로 삽입함으로써 형성시킬 수 있다. 핵산 분자를 숙주 동물 세포 내로 삽입하는 것은 형질감염, 입자 충격, 전기천공 및 미소주사를 포함하지만, 그에 제한되지 않는 각종 방법에 의해 일어날 수 있다. 삽입은 생식세포계, 배아 또는 성숙한 성체 숙주 동물 세포 내로 이루어질 수 있다.
예를 들어, 한 측면에서는 본 발명의 숙주 세포가 C5 단백질-코딩 서열을 도입시킨 수정 난모세포 또는 배아 줄기 세포이다. 이어서, 이러한 숙주 세포를 사용하여, 내인성 C5 서열을 변경시킨 상동성 재조합 동물이나 그들의 게놈 내로 외인성 C5 핵산 서열을 도입시킨 비-인간 트랜스제닉 동물을 창출시킬 수 있다. 이러한 동물은 C5 단백질의 기능 및/또는 활성을 연구하는 데에 유용하고, C5 단백질 활성의 조정제를 확인 및/또는 평가하는 데에 유용하다. 본원에 사용된 바와 같은 "트랜스제닉 동물"은 비-인간 동물, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 설치류 (예를 들어, 랫트 또는 마우스)인데, 이러한 동물 세포 중의 하나 이상이 트랜스-유전자를 포함한다. 트랜스제닉 동물의 기타 예에는 비-인간 영장류, 양, 개, 암소, 염소, 닭, 양서류 등이 포함된다.
트랜스-유전자는 그로부터 트랜스제닉 동물이 발생되고 성숙한 동물의 게놈 내에 유지되는 세포의 게놈 내로 통합됨으로써, 트랜스제닉 동물의 한 가지 이상 세포 유형 (예를 들어, 간) 또는 조직에 코딩된 유전자 생성물의 발현을 지시하는 외인성 DNA이다. 본원에 사용된 바와 같은 "상동성 재조합 동물"은 이러한 동물을 발생시키기에 앞서 동물의 특정 세포, 예를 들어 동물의 배아 세포 내로 도입된 외인성 DNA 분자와 내인성 유전자 간의 상동 재조합에 의해 내인성 C5 단백질 유전자를 변경시킨 비-인간 동물, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 마우스이다.
본 발명의 트랜스제닉 동물은 C5 단백질-코딩 핵산을, 예를 들어 미소주사, 레트로바이러스성 감염에 의해 수정 난모세포의 남성 전핵 내로 도입하고, 난모세포가 거짓임신 암컷 양육 동물에서 발생할 수 있도록 함으로써 창출시킬 수 있다. C5 단백질 DNA 서열, 예를 들어 서열 2, 4 또는 5 중의 하나를 트랜스-유전자로서 비-인간 동물의 게놈 내로 도입할 수 있다. 또 다른 한편으론, C5 단백질 유전자의 비-인간 상동체, 예를 들어 마우스 C5 단백질 유전자를 인간 유전자 DNA와의 혼성화에 기초하여 단리시킬 수 있고, 이를 트랜스-유전자로서 사용할 수 있다. 인트론성 서열과 폴리아데닐화 부위를 또한 트랜스-유전자 내에 포함시켜 트랜스-유전자의 발현 효율을 증가시킬 수 있다. 조직-특이적 조절성 서열(들)을 C5 단백질 트랜스-유전자와 작동가능하게 연결시켜 이러한 단백질의 발현이 특별한 세포, 예를 들어 간 세포를 향하도록 지시할 수 있다. 배아 조작 및 미소주사를 통하여 트랜스제닉 동물, 특히 마우스와 같은 동물을 생성시키는 방법은 당해 분야에서 통상적인 것이 되었고 이는, 예를 들어 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: 미국 특허 제4,736,866호; 제4,870,009호; 및 제4,873,191호; and Hogan, 1986. In: MANIPULATING THE MOUSE EMBRYO, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y]. 기타 트랜스제닉 동물을 생성시키기 위해 유사한 방법을 사용한다.
비-인간 트랜스제닉 동물의 클론은 문헌 [참고: Wilmut, et al., 1997. Nature 385: 810-813]에 기재된 방법에 따라서 생성시킬 수도 있다. 간략하게 언급하면, 트랜스제닉 동물로부터 특정 세포 (예: 체세포)를 단리시키고, 이것이 성장 주기로부터 나와 Go 상으로 들어가도록 유도시킬 수 있다. 이어서, 정지기 세포를, 예를 들어 전기적 펄스 사용을 통하여, 이러한 정지기 세포를 단리시킨 동일한 동물 종으로부터의 핵이 없는 난모세포와 융합시킬 수 있다. 그 다음, 이와 같이 재구성된 난모세포는 이것이 상실배 (morula) 또는 미분화 배아세포가 되도록 배양한 후, 거짓임신 암컷 양육 동물에 옮긴다. 이러한 암컷 양육 동물의 자손이 상기 세포 (예: 체세포)가 단리된 동물의 클론일 것이다.
진단 검정
본원에서 확인된 에피토프 서열 (및 상응하는 완전 유전자 서열)을 폴리뉴클레오티드 시약으로서 수 많은 방식에 사용할 수 있다. 제한없이 예를 들자면, 이들 서열을 사용하여, (i) 그들 각각의 유전자를 염색체 상에 맵핑함으로써, 유전적 질병과 연관된 유전자 영역을 위치시키며; (ii) 미세한 생물학적 샘플로부터 개체를 확인하며 (조직 형별 검사); (iii) 생물학적 샘플의 법의학적 확인을 도와줄 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 생물학적 샘플 (예: 혈액, 혈청, 세포, 조직) 맥락에서, 또는 특정 질병이나 장애를 앓고 있거나 또는 AMD와 연관된 장애가 발생할 위험에 놓인 개체로부터 C5 단백질 및/또는 핵산 발현 뿐만 아니라 C5 단백질 기능을 결정하기 위한 진단 검정을 포괄한다.
진단 검정, 예를 들어 경쟁적 검정은 표지된 유사체 ("추적자")가 공통의 결합 파트너 상의 제한된 수의 결합 부위를 놓고 시험 샘플 분석물과 경쟁할 수 있는 능력에 좌우된다. 결합 파트너는 일반적으로, 경쟁 전 또는 후에 불용화시킨 다음, 결합 파트너와 결합된 추적자 및 분석물은 결합되지 않은 추적자 및 분석물로부터 분리시킨다. 이러한 분리는 경사 제거하거나 (결합 파트너가 예비-불용화된 경우) 또는 원심분리시킴으로써 (결합 파트너가 경쟁 반응 후에 침전된 경우) 수행한다. 시험 샘플 분석물의 양은 마커 물질의 양으로써 측정된 바와 같이 결합된 추적자의 양과 반비례한다. 공지된 양의 분석물을 이용한 용량-반응 곡선을 제조하고, 이를 시험 결과와 비교하여 시험 샘플 중에 존재하는 분석물의 양을 정량적으로 결정한다. 이들 검정은 효소를 검출가능한 마커로서 사용하는 경우에 ELISA 시스템으로 지칭된다. 이러한 형태의 검정에서는, 항체와 항-C5 항체 간의 경쟁적 결합으로 인해, 결합된 C5 단백질, 바람직하게 본 발명의 C5 에피토프가 생성되는데, 이는 혈청 샘플 중의 항체, 가장 특히 혈청 샘플 중의 중화 항체의 측정 기준이 된다.
상기 검정의 실재적 이점은 중화 항체 (즉, C5 단백질, 구체적으로는 에피토프의 결합을 방해하는 항체)를 직접 측정하는 것이다. 특히 ELISA 시험 형태의 검정은 임상 환경과 통상적인 혈액 스크리닝에 있어서 상당한 정도로 적용되고 있다.
본 발명은 또한, 진단 검정, 예후 검정, 약리게놈학 및 임상 시험 모니터링을 예후 (예측) 목적으로 사용함으로써 개체를 예방적으로 처치하는 예측 의학 분야에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 개체가 보체 경로 활성의 조절이상과 연관된 장애 발병 위험에 놓여있는지를 결정하기 위한 예후 (또는 예측) 검정을 제공한다. 예를 들어, C5 유전자 내에서의 돌연변이를 생물학적 샘플에서 검정할 수 있다. 이러한 검정을 예후 또는 예측 목적으로 사용함으로써, C5 단백질, 핵산 발현 또는 활성과 연관되거나 이를 특징으로 하는 장애의 발병에 앞서 개체를 예방적으로 처치할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 개체에게서 C5 핵산 발현 또는 C5 단백질 활성을 결정함으로써 이러한 개체에 대한 적당한 치료제 또는 예방제를 선별하기 위한 방법을 제공한다 (본원에서 "약리게놈학"으로서 지칭됨). 약리게놈학은 개체의 유전자형 (예를 들어, 개체가 특별한 작용제에 대해 반응할 수 있는 능력을 결정하기 위해 조사된 개체의 유전자형)에 기초하여 개체를 치료적 또는 예방적 처치하기 위한 작용제 (예: 약물)을 선별할 수 있게 해준다.
본 발명의 또 다른 측면은 임상 시험에서 C5 단백질의 발현 또는 활성에 대한 작용제 (예: 약물)의 영향력을 모니터링하는 것에 관한 것이다.
C5 핵산 및 단백질을 이들 방법에 사용하는 것 이외에도, 항-C5 결합 분자를 상기 언급된 바와 같이 사용하여, 본 발명에 따라서 상기 언급된 바와 같은 염증, 신생혈관증식과 관련이 있는 것이 밝혀진 장애 및 질병을 치료할 수 있다.
제약 조성물
본 발명의 화합물 및 결합 분자는 자유 형태 또는 제약상 허용가능한 염 형태, 담체, 부형제 및 안정화제로 투여할 수 있다. 이러한 조성물은 통상적인 방식으로 제조할 수 있고, 자유 화합물과 동일한 차수의 활성을 나타낸다 [참고: Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)].
상기 명시된 바와 같이, 예를 들어 염증성 또는 신생혈관성 증상과 관련된 안과 질병 및 장애를 치료하는 데에 있어서의 항-C5 항체 또는 항-C5 항체 단편의 유용성은 후술되는 방법에 따라서 임상에서 뿐만 아니라 동물 시험 방법에서도 입증될 수 있다.
본 발명에 따라서, 본 발명의 화합물 및 결합 분자를 통상적인 모든 경로, 특히 경장적, 예를 들어 정제 또는 캅셀제 형태로 경구 투여할 수 있거나, 예를 들어 주사 가능한 용제 또는 현탁제 형태로 비경구 [바람직하게, 피하, 정맥내, 또는 방내, 유리체내 또는 결막하 또는 서브테논 (subtenon)] 투여할 수 있거나, 예를 들어 용제, 젤, 연고 또는 크림 형태, 또는 비내, 경피 패치 또는 좌제 형태로 국소 (바람직하게, 안구에 투여된 안과용 용제) 투여할 수 있다.
하나 이상의 제약상 허용가능한 담체 또는 희석제와 연합하여, 자유 형태 또는 제약상 허용가능한 염 형태로 본 발명의 화합물 및 결합 분자를 포함하는 제약 조성물은 제약상 허용가능한 담체 또는 희석제와 혼합함으로써 통상적인 방식으로 제조할 수 있다. 경구 투여용 단위 투여 형태는, 예를 들어 약 0.1 mg 내지 약 500 mg의 활성 물질을 함유한다.
바람직하게, 본 발명의 화합물 및 결합 분자, 예를 들어 항-C5 항체 또는 그의 단편은, 예를 들어 안구 표면에 국소적으로 투여하거나, 또는 비경구적, 예를 들어 정맥내, 유리체내, 방내, 결막하 또는 서브테온, 또는 피하 투여한다.
본 발명의 방법을 실시하는 데에 요구되는 1일 투여량은, 예를 들어 사용된 화합물 또는 결합 분자, 숙주, 투여 방식, 치료하고자 하는 질환의 중증도에 따라서 다양할 것이다.
본원에 기재된 스크리닝 검정에 의해 확인된 화합물 또는 결합 분자는 당해 분야에 널리 공지된 표준 기술을 사용하여 유사한 방식으로 제형화할 수 있다.
제조품
본 발명의 또 다른 특징에서는, 상기 언급된 장애를 진단 또는 치료하는 데에 유용한 물질 (예를 들어, 본 발명의 화합물 또는 결합 분자를 포함함)을 함유하는 제조품이 제공된다. 이러한 제조품은 용기와 지시 사항을 포함한다. 적합한 용기에는, 예를 들어 병, 바이알, 주사기 및 시험 튜브가 포함된다. 용기는 각종 재료, 예를 들어 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 해당 질환을 진단 또는 치료하는 데에 유효한 조성물을 보유하고 있고, 멸균성 유입 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 상기 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용제 봉지 또는 바이알일 수 있다). 조성물 내의 활성제는 통상적으로, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드이다. 용기 상에 있거나 이와 연합된 지시 사항 또는 표지는 해당 조성물이 선택 질환을 진단 또는 치료하는 데에 사용된다는 것을 표시한다. 본 발명의 제조품은 제약상 허용가능한 완충제, 예를 들어 인산염 완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상업적 및 사용자 측면에서 바람직한 기타 재료, 예를 들어 기타 완충제, 희석제, 충전제, 바늘, 주사기, 및 지시 사항을 수반한 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명이 상세히 기재되긴 하였지만, 이는 다음 실시예 및 청구의 범위에 의해 추가로 예시되며, 이는 예시적이며 본 발명을 추가로 제한하지 않는다. 당업자는 단지 통상적인 실험을 이용하여 본원에 기재된 구체적 과정에 대한 수 많은 등가 양태를 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가 양태는 본 발명 및 청구의 범위 내에 있다. 본원 전반에 걸쳐 인용된, 허여된 특허 및 공개 특허공보를 포함한 모든 참고 문헌의 전문이 본원에 참고로 도입된다.
실시예 1
대부분의 경우, 마우스와 인간 간의 C5 단백질 서열 보존성이 낮기 때문에, 인간 C5에 대항하여 생성된 항체는 마우스 C5와의 결합을 나타내지 않는다. 따라서, 기능적 검정에서 활성을 보유하고 있는 키메라 C5 단백질 (인간 단백질 서열과 마우스 단백질 서열을 함유함)을 사용하여 항-인간 항-C5 항체의 에피토프를 결정할 수 있다.
인간 알파 쇄/마우스 베타 쇄, 또는 마우스 알파/인간 베타 쇄를 발현하는 DNA 구조물을 사용하여 인간 알파 또는 베타 쇄 상의 에피토프에 대해 항체를 맵핑할 수 있다. 플라스미드 형태의 키메라 인간/마우스 C5 구조물에 대한 DNA는 공급처 (GeneArt)로부터 수득한다. 쇄 내의 에피토프는 인간 C5 단백질 서열 내로 이식된 100개 아미노산 마우스 단백질 서열 연장물을 발현하는 키메라 구조물을 사용하여 정밀하게 맵핑하여 그들 각각의 인간 서열을 치환시켰다. 각 키메라 단백질은 친화성 정제를 위해 그의 C-말단에 히스티딘 연장물을 함유한다.
플라스미드로부터 키메라 단백질을 코딩하는 삽입물은 표준 기술 [참고: Sambrook, Maniatis 등]을 사용하여 단리하고 포유류 발현 벡터 (예: pCDNA3.1) 내로 클로닝하여 코딩된 단백질을 생성하였다. 간략하게 설명하면, 293T 세포를, 페니실린-스트렙토마이신을 수반하지 않은 10％ FBS (Hyclone SH30070.03), DMEM (Gibco 11995-073) 중에서 6 x 106개 세포/100 mm 플레이트로 도말하였다. 연속해서, 최종적으로 750 ㎕의 OPTI-MEM (Gibco 51985-034)에 혼합된 키메라 인간/마우스 단백질 코딩 서열을 함유하는 10 ㎍의 플라스미드 구조물을 사용하여 형질감염을 달성한다. 형질감염 혼합물은 10개 100 mm 플레이트에 대해 설정되었다. 30 ㎕ 리포펙타민 (Lipofectamine) 2000 (Invitrogen 11668-019)을 100 mm 플레이트당 720 ㎕ OPTI-MEM과 혼합하였다. 형질감염시킨지 24시간 후, 플레이트를 IS GRO 배지 (Irvine Scientific 91103)로 세척하고, 6 ml의 새로운 IS GRO 배지를 각 플레이트에 가한 다음, 24 내지 48시간 동안 인큐베이션하였다. 이로써 생성된 상등액을 수거하였다. 새로운 IS GRO 배지를 각 플레이트에 가하고, 세포를 또 다른 수거를 위해 24 내지 48시간 동안 인큐베이션하였다. 종종 동일한 공정을 수행하여 상등액을 세 번째로 수거하였다.
상등액을 0.2 마이크론 필터를 통하여 여과하고 추가로 정제하였다 (또 다른 한편으로, 상등액을 정제할 때까지 80℃ 하에 저장할 수 있다). 통상적인 정제 공정을 사용할 수 있다. 간략하게 설명하면, EDTA-무함유 프로테아제 억제제 칵테일 정제 (공급처: Roche)를 상등액에 가하고, NaOH를 이용하여 pH를 8로 조정하였다. Ni-NTA 수지를 PBS, 10 mM 이미다졸, pH 7.4 및 프로테아제 억제제로 평형시켰다. 상등액을 1시간 동안 수지 (1.5 ml BV)에 결합시키고, 중력 유동 칼럼에 적용하였다. 이 칼럼을 세척하고, PBS, 300 mM 이미다졸, pH 7.4 및 프로테아제 억제제의 용액으로 단백질을 용출시켰다. 분획을 전기영동 겔 상에서 시험하였다. 분획을 풀링하고 PBS pH 7.4에서 투석하여 이미다졸을 제거하였다. 단백질을 대상으로 하여 순도 및 활성에 관하여 시험하였다.
C5 항원성 에피토프의 확인
항-C5 항체 단편 (Fab) 및 완전한 길이의 IgG의 에피토프 맵핑은 경쟁적 ELISA 검정을 사용함으로써 연구 조사하였다. 5G1.1 [알파 쇄 결합제; 참고: Thomas TC et al, Molecular Immunology, 33, 1389-1401, (1996)] 항체 및 N19/8 [베타 쇄 결합제; 참고: Evans MJ et al, Molecular Immunology, 332 1183-1195, (1995)] 항체에 대항한 경쟁을 또한 연구 조사하였다. 몇 가지 ELISA 검정을 다음에 추가로 기재되는 바와 같이 사용할 수 있다. 한 가지 검정은 천연 C5를 사용하는 플레이트 상에 피복된 5G1.1 또는 N19/8을 사용하고 이들 항체의 결합을 검출한다. C5의 베타 쇄가 마우스 기원이고 알파 쇄가 인간 기원인 키메라 C5 단백질, 또는 상기 언급된 바와 같은 기타 키메라 C5 단백질을 사용한다. 또 다른 검정은 Fab 또는 IgG를 바이오틴-C5와 10배 몰 이상의 과량으로 예비-인큐베이션한 다음, 항-C5 Fab 또는 항체로 피복된 플레이트에 가하고 스트렙타비딘-HRP로 검출하는 용액 상 경쟁을 포함한다. 이들 실험으로부터의 결과는 항체 후보가 5G1.1, N19/8 또는 선별된 기타 항체 후보와 동일한 결합 부위를 놓고 경쟁하는지를 표시한다. 그 결과는 또한, 시험 항체가 인간 C5 단백질의 알파 또는 베타 쇄와 결합하는지를 표시한다.
5G1.1과 키메라 인간/마우스 C5의 경쟁
플레이트 (Maxisorp Plate Nunc. 442404)을 100 ㎕/웰 용적의 탄산염 완충제 (Pierce 28382) pH 9.6 중의 4 ㎍/ml으로 항-인간 C5 정제된 Fab 및 Mab로 피복하였다. 플레이트를 밀봉시키고 4℃ 하에 밤새 놓아두었다. 이어서, 플레이트를 흡인시키고 PBS/0.5％ Tween20 (PBST) 300 ㎕/웰 용적으로 3회 세척하였다. 플레이트를 300 ㎕/웰 신블록 (SynBlock) (공급처: AbD Serotec BUF034C)으로 차단시키고, 실온 하에 2시간 동안 인큐베이션한 다음, PBST 300 ㎕/웰 용적으로 1회 세척하였다. 마우스/인간 키메라 C5 단백질로 형질감염시킨 293T 세포로부터의 상등액을 희석액 [2％ BSA 분획 V (Fisher ICN 16006980), 0.1％ Tween20 (Sigma P1379), 0.1％ 트리톤-x-100 (Sigma P234729), PBS] 중에서 1:8로 희석시키고, 100 ㎕/웰을 가하거나 또는 정제된 인간 C5 (Quidel A403)을 희석제 중에서 1 ㎍/ml이 되도록 희석시키며, 100 ㎕/웰을 플레이트에 가하였다. 플레이트를 실온 하에 1시간 동안 인큐베이션하고 PBST 300 ㎕/웰 용적으로 3회 세척하였다. 5G1.1 IgG를 희석제 중에서 1 ㎍/ml이 되도록 희석시키며, 100 ㎕/웰을 플레이트에 가하였다. 플레이트를 실온 하에 1시간 동안 인큐베이션하고 PBST로 3회 세척하였다. 검출 항체 항-인간 IgG Fc-HRP (Pierce 31125)를 1:5000으로 희석시키고 100 ㎕/웰을 플레이트에 가하였다. 플레이트를 실온 하에 1시간 동안 인큐베이션하고 PBST로 4회 세척하였다. 이어서, TMB 기질 (Pierce 34028)을 100 ㎕/웰로 가하였다. 플레이트를 실온 하에 10분 ± 2분 동안 인큐베이션하고, 정지 용액 (2N H2SO4)을 50 ㎕/웰로 가하였다. 흡광도는 스펙트라맥스 (Spectramax) 450 nm - 570 nm에서 판독하였다.
바이오티닐화 인간 C5와의 경쟁
플레이트 (Maxisorp Plate Nunc. 442404)을 50 ㎕/웰 용적의 탄산염 완충제 (Pierce 28382) pH 9.6 중의 5 ㎍/ml으로 정제된 항-인간 C5 Fab 및 IgG로 피복하였다. 플레이트를 밀봉시키고 진탕기 상에서 실온 하에 4시간 동안 놓아두었다. 이어서, 플레이트를 흡인시키고 PBST로 3회 세척하였다. 플레이트를 300 ㎕/웰 슈퍼블록 (SuperBlock) PBS (Pierce 37515)로 차단시키고, 실온 하에 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 PBST로 1회 세척하였다. 항-인간 C5 Fab/Mab를 0.25 ㎍/ml의 농도로 바이오티닐화 C5 (Morphosys)와 함께 슈퍼블록에서 희석시켜 5 ㎍/ml의 농도가 되도록 하고 1시간 동안 인큐베이션한 후, 50 ㎕/웰을 플레이트에 가하였다. 플레이트를 실온 하에 1시간 동안 인큐베이션하고 PBST 300 ㎕/웰 용적으로 3회 세척하였다. 폴리-스트렙타비딘-HRP (Endogen N200)을 슈퍼블록에서 1:5000으로 희석시키고 100 ㎕/웰을 플레이트에 가하였다. 플레이트를 실온 하에 30분 동안 인큐베이션하고 PBST로 3회 세척하였다. 이어서, TMB 기질 (Pierce 34028)을 100 ㎕/웰로 가하였다. 플레이트를 실온 하에 10분 ± 2분 동안 인큐베이션하고, 정지 용액 (2N H2SO4)을 50 ㎕/웰로 가하였다. 흡광도는 스펙트라맥스 450 nm - 570 nm에서 판독하였다.
5G1.1 및 N19/9와의 경쟁 검정
플레이트 (Maxisorp Plate Nunc. 442404)을 100 ㎕/웰 용적의 탄산염 완충제 (Pierce 28382) pH 9.6 중의 5 ㎍/ml으로 항-인간 C5 IgG 5G1.1 또는 N19/8로 피복하였다. 플레이트를 밀봉시키고 4℃ 하에 밤새 놓아두었다. 이어서, 플레이트를 흡인시키고 PBST로 3회 세척하였다. 플레이트를 300 ㎕/웰 희석제/블록 [4％ BSA 분획 V (Sigma A403),0.1％ Tween20 (Sigma P1379), 0.1％ 트리톤-x-100 (Sigma P234729), PBS]으로 차단시키고, 실온 하에 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 PBST로 1회 세척하였다. 항-인간 C5 Fab/Mab를 0.5 ㎍/ml 농도의 정제된 C5 (Quidel A403)과 함께 희석액 중에서 2.5 ㎍/ml 농도가 되도록 희석시키고 30분 동안 인큐베이션한 후, 100 ㎕/웰을 플레이트에 가하였다. 플레이트를 실온 하에 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 3회 세척하였다. 항-his (Roche 11965085001)를 희석액 중에서 200 mU/ml로 희석시키거나 또는 염소 항-마우스 Ig-HRP (BD Pharmingen 554002)를 1:5000으로 희석시키고, 플레이트에 100 ㎕/웰을 가하였다. 플레이트를 실온 하에 1시간 동안 인큐베이션하고 PBST로 3회 세척하였다. 이어서, TMB 기질 (Pierce 34028)을 100 ㎕/웰로 가하였다. 플레이트를 실온 하에 5 내지 10분 동안 인큐베이션하고, 정지 용액 (2N H2SO4)을 50 ㎕/웰로 가하였다. 흡광도는 스펙트라맥스 450 nm - 570 nm에서 판독하였다.
실시예 2 파아지 디스플레이에 의한 인간 항체의 생성
C5에 대항한 항체를 생성하기 위하여, 모르포시스 (MorphoSys) HuCAL GOLD® 파아지 디스플레이 라이브러리를 이용한 선별을 수행하였다. HuCAL GOLD는 6개 모든 CDR이 다양화되고 Fab 단편을 파아지 표면에 연결시키기 위한 CYSDISPLAY 기술을 이용하는 HuCAL 개념에 근거한 Fab 라이브러리이다 [참고: Knappik et al., 2000 J. Mol. Biol. 296:57-86; Krebs et al., 2001 J Immunol. Methods 254:67-84; Rauchenberger et al., 2003 J Biol Chem. 278(40):38194-38205; WO 01/05950, Lohning, 2001].
파아지미드 구제 (rescue), 파아지 증폭 및 정제
HuCAL GOLD 라이브러리를 34 ㎍/ml 클로람페니콜 및 1％ 글루코스를 함유하는 2xYT 배지 (2xYT-CG)에서 증폭시켰다. VCSM13 헬퍼 (helper) 파아지를 이용하여 OD600nm 0.5로 감염시킨 후 (진탕시키지 않으면서 37℃ 하에 30분; 250 rpm으로 진탕시키면서 37℃ 하에 30분), 세포를 침강시키고 (4120 g; 5분; 4℃), 2xYT/34 ㎍/ml 클로람페니콜/50 ㎍/ml 카나마이신/0.25 mM IPTG에 재현탁시키며, 22℃ 하에 밤새 성장시켰다. 파아지를 상등액으로부터 2회 PEG-침전시키고, PBS/20％ 글리세롤 중에서 재현탁시킨 다음, -80℃ 하에 저장하였다.
패닝 두 회전 간의 파아지 증폭을 다음과 같이 수행하였다: 중간-log 상 이. 콜라이 TG1 세포를 용출된 파아지로 감염시키고, 1％ 글루코스 및 34 ㎍/ml 클로람페니콜을 보충시킨 LB 한천 플레이트 (LB-CG 플레이트) 상으로 도말하였다. 30℃ 하에 밤새 인큐베이션한 후, TG1 집락을 한천 플레이트로부터 스크랩핑하고, 이를 사용하여 OD600nm이 0.5에 도달할 때까지 2xYT-CG를 접종하고, 상기 언급된 바와 같이 감염시키기 위해 VCSM13 헬퍼 파아지를 가하였다.
HuCAL GOLD를 이용한 패닝
C5를 인식하는 항체를 선별하기 위하여, 2가지 상이한 패닝 전략을 적용하였다. 요약하면, HuCAL GOLD 파아지-항체를 VH 마스터 유전자의 상이한 조합을 포함하는 4개 풀로 나누었다 (풀 1: VH1/5 λκ, 풀 2: VH3 λκ, 풀 3: VH2/4/6 λκ, 풀 4: VH1-6 λκ). 이들 풀을 대상으로 하여 개별적으로, 맥시소르프 플레이트에 직접 피복된 인간 C5 상에서 고체 상 패닝 3회전을 수행하고, 또한 바이오티닐화 C5 항원 상에서 용액 패닝 3회전을 수행하였다.
제1 패닝 변이체는 C5에 대항한 고체 상 패닝이다: 맥시소르프 플레이트 (F96 Nunc-lmmunoplate) 상의 2개 웰을 300 ㎕의 5 ㎍/ml C5로 피복시켰다 (각각 4℃ 하에 밤새 수행함). 이와 같이 피복된 웰을 350 ㎕ PBS로 2회 세척하고, 미세역가 플레이트 진탕기 상에서 실온 하에 2시간 동안 350 ㎕ 5％ MPBS로 차단시켰다. 각 패닝에 대해, 약 1013개 HuCAL GOLD 파아지-항체를 실온 하에 2시간 동안 등 용적의 PBST/5％ MP로 차단시켰다. 차단 후, 이와 같이 피복된 웰을 350 ㎕ PBS로 2회 세척하였다. 300 ㎕의 예비-차단된 HuCAL GOLD® 파아지-항체를 피복된 각 웰에 가하고, 진탕기 상에서 실온 하에 2시간 동안 인큐베이션하였다. 350 ㎕ PBS/0.05％ Tween을 5회 가한 다음, PBS로 4회 더 세척함으로써 세척을 수행하였다. 플레이트로부터 파아지를 용출시키는 것은 웰당 10 mM 트리스/HCl pH 8 중의 300 ㎕ 20 mM DTT를 이용하여 10분 동안 수행하였다. 이러한 DTT 파아지 용출액을 14 ml의 이. 콜라이 TG1에 가하였는데, 이는 2YT 배지 중에서 37℃ 하에 OD600 0.6 내지 0.8이 되도록 성장시키고, 파아지 감염을 위해 진탕시키지 않으면서 37℃ 하에 45분 동안 50 ml 플라스틱 튜브에서 인큐베이션하였다. 10분 동안 5000 rpm으로 원심분리시킨 후, 세균성 펠릿을 500 ㎕ 2xYT 배지에 각각 재현탁시키고, 2xYT-CG 한천 플레이트 상에 도말한 다음, 30℃ 하에 밤새 인큐베이션하였다. 이어서, 집락을 플레이트로부터 스크랩핑하고, 파아지를 상기 언급된 바와 같이 구제 및 증 폭시켰다. 직접적으로 피복된 C5 항원 상에서 고체 상 패닝의 제2 및 제3 회전은 세척 과정에서의 엄격도를 증가시키는 것을 제외하고는, 제1 회전의 프로토콜에 따라서 수행하였다.
제2 패닝 변이체는 바이오티닐화 인간 C5 항원에 대항한 용액 패닝이다: 용액 패닝을 위해, 다이나비드 (Dynabeads) M-280 (Dynal)과 커플링된 바이오티닐화 C5 항원을 사용하여 다음 프로토콜을 적용하였다: 1.5 ml 에펜도르프 (Eppendorf) 튜브를 4℃ 하에 밤새 PBS로 1:1로 희석시킨 1.5 ml 2x 케미블로커 (Chemiblocker)로 차단시켰다. 200 ㎕ 스트렙타비딘 피복된 자기 다이나비드 M-280 (Dynal)을 200 ㎕ PBS로 1회 세척하고, 200 ㎕ 1x 케미블로커 (1x PBS에 희석됨)에 재현탁시켰다. 비드 차단은 4℃ 하에 밤새 예비-차단된 튜브에서 수행하였다. 각 패닝 조건에 대해 500 ㎕ PBS에서 희석된 파아지를 실온 하에 1시간 동안 500 ㎕ 2x케미블로커/0.1％ Tween과 혼합하였다 (회전자). 파아지의 예비-흡수를 2회 수행하였다: 50 ㎕의 차단된 스트렙타비딘 자기 비드를 상기 차단된 파아지에 가하고 회전자 상에서 실온 하에 30분 동안 인큐베이션하였다. 자기 장치 (Dynal MPC-E)를 통하여 비드를 분리시킨 후, 파아지 상등액 (약 1 ml)를 새로이 차단된 튜브에 옮기고, 예비-흡수를 50 ㎕ 차단된 비드 상에서 30분 동안 반복하였다. 이어서, 200 nM 바이오티닐화 C5를 새로이 차단된 1.5 ml 튜브 중의 차단된 파아지에 가하고, 회전자 상에서 실온 하에 1시간 동안 인큐베이션하였다. 100 ㎕의 차단된 스트렙타비딘 자기 비드를 각 패닝 파아지 풀에 가하고 회전자 상에서 실온 하에 10분 동안 인큐베이션하였다. 바이오티닐화 C5와 결합된 파아지를 자기 비드에 고정화시키고, 자 기 입자 분리기 (Dynal MPC-E)로 수집하였다. 이어서, 비드를 회전자를 이용하여 PBS/0.05％ Tween 중에서 7회 세척한 다음, PBS로 3회 더 세척하였다. 다이나비드로부터의 파아지 용출은 10 mM 트리스/HCl pH 8 중의 300 ㎕ 20 mM DTT를 각 튜브에 10분 동안 가함으로써 수행하였다. 다이나비드를 자기 입자 분리기에 의해 제거하고, OD600nm 0.6 내지 0.8으로 성장된 이. 콜라이 TG-1 배양물 14 ml에 상등액을 가하였다. 이어서, 비드를 200 ㎕ PBS로 1회 세척하고, 부가적으로 제거된 파아지와 함께 상기 PBS를 14 ml의 이. 콜라이 TG-1 배양물에 가하였다. 파아지 감염을 위해, 배양물을 진탕시키지 않으면서 37℃ 하에 45분 동안 50 ml 플라스틱 튜브에서 인큐베이션하였다. 10분 동안 5000 rpm으로 원심분리시킨 후, 세균성 펠릿을 500 ㎕ 2xYT 배지에 각각 재현탁시키고, 2xYT-CG 한천 플레이트 상에 도말한 다음, 30℃ 하에 밤새 인큐베이션하였다. 이어서, 집락을 플레이트로부터 스크랩핑하고, 파아지를 상기 언급된 바와 같이 구제 및 증폭시켰다.
바이오티닐화 C5 항원 상에서 용액 패닝의 제2 및 제3 회전은 세척 과정에서의 엄격도를 증가시키는 것을 제외하고는, 제1 회전의 프로토콜에 따라서 수행하였다.
가용성 Fab 단편의 서브클로닝 및 발현
선별된 HuCAL GOLD® 파아지미드의 Fab-코딩 삽입물을 발현 벡터 pMORPH®X9_Fab_FH 내로 서브클로닝하여 가용성 Fab의 신속하고도 효율적인 발현을 촉진시켰다. 이를 위하여, 상기 선별된 클론의 플라스미드 DNA를 XbaI 및 EcoRI로 분해 시킴으로써 Fab-코딩 삽입물을 절제하고 (ompA-VLCL 및 phoA-Fd), XbaI/EcoRI-분해된 발현 벡터 pMORPH®X9_Fab_FH 내로 클로닝하였다. 이러한 벡터로부터 발현된 Fab는 검출와 정제 둘 다를 위한 2개의 C-말단 태그 (각각 FLAG™ 및 6xHis)를 수반하고 있다.
이. 콜라이에서의 HuCAL GOLD® Fab 항체의 미소발현
선별된 Fab를 pMORPH®X9_Fab_FH 발현 벡터 내로 서브클로닝한 후 수득된 클로람페니콜-내성 단일 집락을 사용하여, 웰당 100 ㎕ 2xYT-CG 배지를 함유하는 멸균성 96-웰 미세역가 플레이트의 웰을 접종하고 이를 37℃ 하에 밤새 성장시켰다. 5 ㎕의 각 이. 콜라이 TG-1 배양물을 웰당 34 ㎍/ml 클로람페니콜 및 0.1％ 글루코스를 보충시킨 100 ㎕ 2xYT-CG 배지로 예비-충전시킨 신선한 멸균성 96-웰 미세역가 플레이트에 옮겼다. 이러한 미세역가 플레이트를 배양물이 OD600nm 약 0.5로 약간 혼탁해질 때까지 (약 2 내지 4시간) 미세플레이트 진탕기 상에서 30℃ 하에 400 rpm으로 진탕시키면서 인큐베이션하였다.
이들 발현 플레이트에, 34 ㎍/ml 클로람페니콜 및 3 mM IPTG (이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드)를 보충시킨 20 ㎕ 2xYT 배지를 웰당 가하고 (최종 농도 0.5 mM IPTG), 미세역가 플레이트를 기체-투과성 테이프로 밀봉시키며, 플레이트를 400 rpm으로 30℃ 진탕시키면서 밤새 인큐베이션하였다.
전세포 용해물 (BEL 추출물)의 생성: 발현 플레이트의 각 웰에, 2.5 mg/ml 라이소자임을 함유하는 40 ㎕ BEL 완충액 (2xBBS/EDTA: 24.7 g/l 붕산, 18.7 g NaCl/l, 1.49 g EDTA/l, pH 8.0)를 가하고, 미세역가 플레이트 진탕기 (400 rpm) 상에서 22℃ 하에 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이러한 BEL 추출물은 ELISA 또는 바이오베리스 (BioVeris) M-시리즈® 384 분석기에 의해 결합 분석하기 위해 사용하였다.
효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA) 기술
PBS 중의 5 ㎍/ml의 인간 재조합 C5 항원을 4℃ 하에 밤새 384 웰 맥시소르프 플레이트 (Nunc-lmmunoplate) 상으로 피복하였다. 피복 후, 웰을 PBS/0.05 ％ Tween (PBS-T)로 1회 세척하고 PBS로 2회 세척하였다. 이어서, 웰을 실온 하에 2시간 동안 2％ BSA를 수반한 PBS-T로 차단시켰다. 이와 병행해서, 15 ㎕ BEL 추출물 및 2％ BSA를 수반한 15 ㎕ PBS-T를 실온 하에 2시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 차단된 맥시소르프 플레이트를 PBS-T로 3회 세척한 후, 10 ㎕의 차단된 BEL 추출물을 웰에 가하고 실온 하에 1시간 동안 인큐베이션하였다. 일차 Fab 항체를 검출하기 위하여, 다음 이차 항체를 적용하였다: 알칼리성 포스파타제 (AP)-접합된 애피니퓨어 (AffiniPure) F(ab')2 단편, 염소 항-인간, -항-마우스 또는 -항-양 IgG (공급처: Jackson lmmuno Research). AP-접합체를 검출하기 위해서는, 형광발생 기질 [예: AttoPhos (공급처: Roche)]을 제조업자의 지시에 따라서 사용하였다. 모든 인큐베이션 단계 사이에, 이차 항체와 함께 최종 인큐베이션한 후 미세역가 플레이트 웰을 PBS-T로 3회 세척하였다. TECAN 스펙트라플루오르 (Spectrafluor) 플레이트 판독기에서 형광을 측정할 수 있다.
이. 콜라이에서의 HuCAL GOLD® Fab 항체의 발현 및 정제
TG-1 세포 중에서 pMORPH®X9_Fab_FH에 의해 코딩된 Fab 단편의 발현은 34 ㎍/ml 클로람페니콜을 보충시킨 750 ml의 2xYT 배지를 사용하여 진탕기 플라스크 배양물에서 수행하였다. OD600nm가 0.5에 도달할 때까지 배양물을 30℃ 하에 진탕시켰다. 0.75 mM IPTG를 30℃ 하에 20시간 동안 부가함으로써 발현을 유도시켰다. 라이소자임을 사용하여 세포를 붕괴시키고, Fab 단편을 Ni-NTA 크로마토그래피 (공급처: Qiagen, Hilden, Germany)에 의해 단리시켰다. 단백질 농도를 UV-분광광도법으로 결정할 수 있다 [참고: Krebs et al. J Immunol Methods 254, 67-84 (2001)].
SEQUENCE LISTING <110> Novartis AG Guild, Braydon C. Keating, Mark T. Milik, Marius Mikhailov, Dmitri Ruguska, Michael Splawski, Igor Zhao, Kehao <120> Method for Treating Ocular Diseases <130> 50608-WO-PCT <140> PCT/EP2008/053321 <141> 2008-03-19 <150> 60/896408 <151> 2007-03-22 <160> 6 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 1 Cys Val Asn Asn Asp Glu Thr Cys Glu Gln 1 5 10 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 2 tgcgttaata atgatgaaac ctgtgagcag 30 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 3 Gln Asp Ile Glu Ala Ser His Tyr Arg Gly Tyr Gly Asn Ser Asp 1 5 10 15 <210> 4 <211> 45 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 4 caggatattg aagcatccca ctacagaggc tacggaaact ctgat 45 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 5 Asp Leu Lys Asp Asp Gln Lys Glu Met 1 5 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 6 acttaaaaga tgatcaaaaa gaaatg 26

Claims (43)

  1. 서열 2, 4 및 6으로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산 서열과의 핵산 서열 동일성이 95％ 이상인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  2. 서열 2, 4 및 6으로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  3. 제어 서열과 작동가능하게 연결된 제2항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  4. 제3항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  5. 서열 1, 3 및 5로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열과의 아미노산 서열 동일성이 95％ 이상인 단리된 폴리펩티드.
  6. 서열 1, 3 및 5로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드.
  7. 제4항의 숙주 세포를 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 단계; 및 세포 배양물로부터 상기 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, C5 단백질의 생성 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 C5 단백질이 서열 1, 3 및 5로 이루어진 군 중에서 선택된 에피토프를 포함하는 것인 방법.
  9. 서열 1, 3 및 5로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 내의 또는 이와 중복되는 C5 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체의 항원 결합 부분을 포함하는 단리된 C5 결합 분자.
  10. 제9항에 있어서, 항원 결합 부분이 비-인간 영장류의 C5 항원과 교차 반응성인 C5 결합 분자.
  11. 제9항에 있어서, 항원 결합 부분이 설치류 종의 C5 항원과 교차 반응성인 C5 결합 분자.
  12. 제9항에 있어서, 항원 결합 부분이 선형 에피토프와 결합하는 C5 결합 분자.
  13. 제9항에 있어서, 항원 결합 부분이 비-선형 에피토프와 결합하는 C5 결합 분자.
  14. 제9항에 있어서, 항원 결합 부분이 인간 C5 항원과 0.1 nM 이하의 KD로 결합하는 C5 결합 분자.
  15. 제9항에 있어서, 항원 결합 부분이 비-인간 영장류의 C5 항원과 0.3 nM 이하의 KD로 결합하는 C5 결합 분자.
  16. 제9항에 있어서, 항원 결합 부분이 마우스 C5 항원과 0.5 nM 이하의 KD로 결합하는 C5 결합 분자.
  17. 제9항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 부분이 인간 항체의 항원 결합 부분인 C5 결합 분자.
  18. 제9항에 있어서, 항체가 인간화 항체인 C5 결합 분자.
  19. 제9항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 부분이 모노클로날 항체의 항원 결합 부분인 C5 결합 분자.
  20. 제9항에 있어서, 항원 결합 부분이 폴리클로날 항체의 항원 결합 부분인 C5 결합 분자.
  21. 제9항에 있어서, 키메라 항체인 C5 결합 분자.
  22. 제9항에 있어서, 항체의 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 또는 Fv 단편을 포함하는 C5 결합 분자.
  23. 제9항에 있어서, 단일 쇄 Fv를 포함하는 C5 결합 분자.
  24. 제9항에 있어서, 디아보디 (diabody)를 포함하는 C5 결합 분자.
  25. 제9항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 부분이 이소형 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중의 하나의 항체로부터 유래된 것인 C5 결합 분자.
  26. 제9항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 부분이 이소형 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중의 하나의 항체로부터 유래되며, 여기서 Fc 서열은 효과기 기능을 조정하거나 Fc 수용체에 대한 결합을 변경시키기 위해 정상 서열에 비해 변경된 것인 C5 결합 분자.
  27. 제9항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 중에서의 MAC 생성을 억제하는 C5 결합 분자.
  28. 제9항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, C5가 전환효소와 결합하는 것을 억제하는 C5 결합 분자.
  29. 세포를 C5 결합 분자와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에서 MAC 합성을 억제하는 방법.
  30. 보체 시스템에 의해 매개된 세포 활성을 조정하는 C5 결합 분자를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 MAC 활성을 조정하는 방법.
  31. 서열 1, 3 및 5 중에서 선택된 에피토프와 특이적으로 결합하는 결합 분자를 유효량으로 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 안과 장애를 치료 또는 예방하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 대상체의 MAC 수준이 결합 분자를 투여하기 이전 대상체의 MAC 수준과 비교해서 5％ 이상 감소되는 방법.
  33. 제31항에 있어서, 결합 분자가 유리체내에 투여되는 방법.
  34. 제31항에 있어서, 안과 장애가 황반 변성, 당뇨병성 안과 질병 및 장애, 안구 부종, 허혈성 망막병증, 전방 허혈성 시신경병증, 시신경염, 포낭 모양 황반 부종, 망막 질병 및 장애, 병리학적 근시, 미숙아 망막병증, 혈관화, 거부성 또는 기타 염증성 각막, 건성 각막결막염, 안구 건조증, 포도막염, 공막염, 상공막염, 결막염, 각막염, 안와 연조직염, 안구 근육염, 갑상선 안와질환, 눈물샘 및 눈꺼풀 염증으로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 방법.
  35. 제31항에 있어서, 결합 분자가 모노클로날 항체인 방법.
  36. 대상체로부터 수득한 샘플 중에서 C5 단백질의 양을 측정하는 단계; 및 상기 양을 대조군 샘플과 비교하는 단계를 포함하는, AMD가 있는 것으로 추정되는 대상체의 존재 또는 소인을 결정하는 방법.
  37. 안과 질병 또는 장애의 치료 또는 그의 진행의 지연을 위한 의약을 제조하는 데에 있어서, 대체 보체 경로를 억제할 수 있는 단백질 (이 단백질은 C5 단백질 활성화를 억제할 수 있거나 또는 C5b가 C6과 결합하는 것을 억제할 수 있음)의 용도.
  38. 제37항에 있어서, 대체 보체 경로를 억제할 수 있는 단백질이 C5 상의 알파 또는 베타 쇄와 결합하는 항체 또는 항체 단편인 용도.
  39. 제37항에 있어서, C5와 결합하는 항체 또는 항체 단편이 C5 활성화를 억제할 수 있는 것인 용도.
  40. 제37항에 있어서, 항체 또는 항체 단편이 서열 1, 3 및 5로 이루어진 군 중에서 선택된 C5 에피토프와 결합하는 것인 용도.
  41. 제9항의 항체를 함유하는 용기, 및 상기 항체에 의해 결합된 C5 단백질을 검출하기 위한 지시 사항을 포함하는, C5 단백질의 존재를 검출하기 위한 키트.
  42. 제41항에 있어서, 항체가 검출가능한 표지를 추가로 포함하는 키트.
  43. 안과 질병 또는 장애의 치료 또는 억제, 또는 그의 진행의 지연을 필요로 하는 대상체에게 대체 보체 경로를 억제할 수 있는 단백질을 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 안과 질병 또는 장애의 치료 또는 억제, 또는 그의 진행의 지연을 위한 방법.
KR1020097021990A 2007-03-22 2008-03-19 Ｃ５ 항원 및 그의 용도 KR20100015773A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US89640807P 2007-03-22 2007-03-22
US60/896,408 2007-03-22

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20100015773A true KR20100015773A (ko) 2010-02-12

Family

ID=39672693

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020097021990A KR20100015773A (ko) 2007-03-22 2008-03-19 Ｃ５ 항원 및 그의 용도

Country Status (17)

Country Link
US (1) US20100166748A1 (ko)
EP (1) EP2129681A2 (ko)
JP (1) JP2010521194A (ko)
KR (1) KR20100015773A (ko)
CN (1) CN101679486A (ko)
AU (1) AU2008228247A1 (ko)
BR (1) BRPI0809105A2 (ko)
CA (1) CA2680760A1 (ko)
CL (1) CL2008000803A1 (ko)
EA (1) EA200901211A1 (ko)
IL (1) IL201020A0 (ko)
MA (1) MA31351B1 (ko)
MX (1) MX2009010181A (ko)
TN (1) TN2009000381A1 (ko)
TW (1) TW200848076A (ko)
WO (1) WO2008113834A2 (ko)
ZA (1) ZA200906374B (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014119969A1 (ko) * 2013-01-31 2014-08-07 서울대학교 산학협력단 보체 관련 질환의 예방 및 치료를 위한 c5 항체 및 방법

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007114319A1 (ja) 2006-03-31 2007-10-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗体の血中動態を制御する方法
PL3028716T3 (pl) 2006-10-10 2021-03-08 Regenesance B.V. Hamowanie układu dopełniacza służące do lepszej regeneracji nerwów
US8680019B2 (en) * 2007-08-10 2014-03-25 Protelica, Inc. Universal fibronectin Type III binding-domain libraries
AU2008287426B2 (en) * 2007-08-10 2014-06-26 Protelica, Inc. Universal fibronectin type III binding-domain libraries
US8470966B2 (en) 2007-08-10 2013-06-25 Protelica, Inc. Universal fibronectin type III binding-domain libraries
CN101874042B9 (zh) 2007-09-26 2019-01-01 中外制药株式会社 利用cdr的氨基酸取代来改变抗体等电点的方法
LT2708559T (lt) 2008-04-11 2018-06-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigeną surišanti molekulė, galinti pakartotinai prisijungti prie dviejų ar daugiau antigeno molekulių
CA2766565A1 (en) * 2009-06-23 2010-12-29 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Bispecific antibodies that bind to complement proteins
EP2647706B1 (en) 2010-11-30 2023-05-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
PL2551021T3 (pl) 2011-07-29 2017-02-28 Andritz S.A.S. Wirówka i człon otworu wypływowego wirówki do zmniejszenia mocy
EP2583957A1 (de) 2011-10-18 2013-04-24 LANXESS Deutschland GmbH Lineare Butene aus Isobutanol
PL2817329T3 (pl) * 2012-02-20 2019-07-31 Swedish Orphan Biovitrum Ab (Publ) Polipeptydy wiążące z c5 ludzkiego dopełniacza
US10010513B2 (en) * 2012-05-25 2018-07-03 Novartis Ag Aqueous pharmaceutical composition containing a biologic therapeutic agent and guanidine or a guanidine derivative and an injection including the composition
CA2904654C (en) 2013-03-14 2023-12-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c5 irna compositions and methods of use thereof
BR122023024819A2 (pt) 2014-06-12 2023-12-26 Ra Pharmaceuticals, Inc. Uso de um polipeptídeo para inibir a clivagem de c5 em um sistema celular
WO2016040589A1 (en) * 2014-09-12 2016-03-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotide agents targeting complement component c5 and methods of use thereof
WO2016081314A1 (en) 2014-11-17 2016-05-26 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Risk evaluation and management strategy involving patient follow-ups relating to a complement inhibitor
MY183415A (en) * 2014-12-19 2021-02-18 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-c5 antibodies and methods of use
US9937222B2 (en) 2015-01-28 2018-04-10 Ra Pharmaceuticals, Inc. Modulators of complement activity
CN108697759B (zh) 2015-12-16 2022-08-02 Ra制药公司 补体活性的调节剂
CA3005592C (en) * 2015-12-18 2024-01-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-c5 antibodies and methods of use
EP3464351A1 (en) * 2016-06-07 2019-04-10 Novartis AG Anti-c5 antibody for treating patients with complement c5 polymorphism
PE20240825A1 (es) * 2016-06-17 2024-04-18 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpos anti-c5 y metodos de uso
MX2019001448A (es) 2016-08-05 2019-09-13 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Composicion para profilaxis o tratamiento de enfermedades relacionadas con interleucina 8 (il-8).
WO2018044858A2 (en) * 2016-08-29 2018-03-08 The Cleveland Clinic Foundation C5 immunization for autologous anti-c5 antibody production
EP3551210A1 (en) 2016-12-07 2019-10-16 RA Pharmaceuticals, Inc. Modulators of complement activity
CA3055541A1 (en) * 2017-03-06 2018-09-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Anti-c5 antibodies and uses thereof
AU2018253962A1 (en) 2017-04-21 2019-10-31 Volution Immuno Pharmaceuticals Sa Coversin for the treatment of autoimmune blistering diseases
GB201706406D0 (en) 2017-04-21 2017-06-07 Volution Immuno Pharmaceuticals Sa Method of treatment
EP3846850A4 (en) 2018-09-06 2022-06-15 The Trustees of the University of Pennsylvania HUMANIZED ANTI-C5 ANTIBODIES AND THEIR USES

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6074642A (en) * 1994-05-02 2000-06-13 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Use of antibodies specific to human complement component C5 for the treatment of glomerulonephritis
US6673346B1 (en) * 1999-08-31 2004-01-06 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for the treatment of sepsis
WO2003078457A1 (en) * 2002-03-19 2003-09-25 Cincinnati Children's Hospital Medical Center MUTEINS OF THE C5a ANAPHYLATOXIN, NUCLEIC ACID MOLECULES ENCODING SUCH MUTEINS, AND PHARMACEUTICAL USES OF MUTEINS OF THE C5a ANAPHYLATOXIN
HUE050481T2 (hu) * 2004-02-12 2020-12-28 Archemix Llc Aptamer terapeutikumok, amelyek használhatók komplementtel kapcsolatos rendellenességek kezelésében
WO2007056227A2 (en) * 2005-11-04 2007-05-18 Genentech, Inc. Use of complement pathway inhibitors to treat ocular diseases

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014119969A1 (ko) * 2013-01-31 2014-08-07 서울대학교 산학협력단 보체 관련 질환의 예방 및 치료를 위한 c5 항체 및 방법

Also Published As

Publication number Publication date
CN101679486A (zh) 2010-03-24
AU2008228247A1 (en) 2008-09-25
IL201020A0 (en) 2010-05-17
BRPI0809105A2 (pt) 2019-09-10
TW200848076A (en) 2008-12-16
US20100166748A1 (en) 2010-07-01
WO2008113834A3 (en) 2009-03-05
CA2680760A1 (en) 2008-09-25
MA31351B1 (fr) 2010-05-03
TN2009000381A1 (en) 2010-12-31
EA200901211A1 (ru) 2010-04-30
MX2009010181A (es) 2009-12-04
WO2008113834A2 (en) 2008-09-25
JP2010521194A (ja) 2010-06-24
ZA200906374B (en) 2010-05-26
EP2129681A2 (en) 2009-12-09
CL2008000803A1 (es) 2008-10-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20100015773A (ko) Ｃ５ 항원 및 그의 용도
TW202208439A (zh) Ｃｃｒ８抗體及其應用
KR20100067681A (ko) 보체 성분을 조정하기 위한 분자 및 방법
JP7520893B2 (ja) ナトリウム利尿ペプチド受容体１抗体及び使用方法
TW201350130A (zh) 標靶爲補體蛋白質ｃ５之抗體之組合物及方法
JP2012525829A (ja) 補体タンパク質Ｃ３ｂを標的とする抗体の組成物および方法
KR20160021823A (ko) 렉틴-유사 산화된 ldl 수용체1 항체 및 사용 방법
CN113101364B (zh) 一种自免疫抑制剂的开发和应用
AU2018217720A1 (en) Anti-factor D antibodies and uses thereof
TW202144410A (zh) 抗介白素－３３抗體及其用途
TW201321408A (zh) 作為診斷標記之oxMIF
KR20170039711A (ko) 안지오포이에틴-유사 4 항체 및 사용 방법
CN117597364A (zh) 抗ccr8抗体、其抗原结合片段、以及试剂和组合物及其制备和使用方法
EP2731970B1 (en) Antibodies that are cross-reactive for macrophage migration inhibitory factor (mif) and d-dopachrome tautomerase (d-dt)
WO2021259160A1 (en) Antibodies specifically recognizing c5a and uses thereof
WO2024040114A2 (en) Anti-axl antibodies, antigen-binding fragments thereof and methods for making and using the same

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid