WO2005090405A1 - インターロイキン－６受容体に対するヒト型化抗体のサブタイプ - Google Patents

インターロイキン－６受容体に対するヒト型化抗体のサブタイプ Download PDF

Info

Publication number
WO2005090405A1
WO2005090405A1 PCT/JP2005/006229 JP2005006229W WO2005090405A1 WO 2005090405 A1 WO2005090405 A1 WO 2005090405A1 JP 2005006229 W JP2005006229 W JP 2005006229W WO 2005090405 A1 WO2005090405 A1 WO 2005090405A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
subtype
humanized
shows
slslsp
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/006229
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Katsuhiro Kano
Isamu Terashima
Original Assignee
Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=34993643&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=WO2005090405(A1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha filed Critical Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority to US10/593,786 priority Critical patent/US8398980B2/en
Priority to EP05727379A priority patent/EP1728801A4/en
Priority to JP2006511350A priority patent/JPWO2005090405A1/ja
Priority to EP20180347.5A priority patent/EP3736295A1/en
Publication of WO2005090405A1 publication Critical patent/WO2005090405A1/ja
Priority to US13/722,919 priority patent/US8734800B2/en
Priority to US14/252,648 priority patent/US20140377254A1/en
Priority to US14/836,813 priority patent/US9902777B2/en
Priority to US15/868,892 priority patent/US20180230222A1/en
Priority to US16/439,349 priority patent/US20200148775A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • the present invention relates to a novel subtype of a humanized PM-1 antibody which is a type of an antibody against interleukin-6 receptor (IL-6R).
  • IL-6R interleukin-6 receptor
  • the protein produced by genetic recombination should theoretically have the amino acid sequence deduced from the gene sequence, but in reality, various mutants may be produced. This is due to known or new in vivo (post-transcriptional) modifications or spontaneous (non-enzymatic) proteolysis (R, J. Harris, J. Chromatogr. A 705 ( 1995) 129-134). Proteins used as components of pharmaceuticals are produced by genetic recombination using biosynthetic processes in living organisms, and therefore have the potential to produce subtypes with different molecular structures. Since the type and content of the subtype determine the quality of the drug, it is important to characterize the subtype profile and ensure its usefulness as a drug or composition.
  • IL-6 is a site-powered insulin also called B-cell stimulating factor 2 (BSF2) or interferon 2.
  • BSF2 B-cell stimulating factor 2
  • IL-6 was discovered as a differentiation factor involved in the activation of B-lymphocyte Itoda cysts (Hirano, T. et al., Nature (1986) 324, 73-76). It was revealed that it is a multifunctional site that affects function (Akira, S. et al., Adv. In Immunology (1993) 54, pp. 78). I6 has been reported to induce the maturation of T lymphocyte cells (Lotz, M. et al., J. Exp. Med. (1988) 167, 1253-1258).
  • IL-6 transmits its biological activity on cells via two proteins.
  • One is the IL-6 receptor (IL-6R), a ligand-binding protein with a molecular weight of about 80 kD to which IL-6 binds (Taga, T. et al., J. Exp. Med.
  • IL-6R exists as a soluble IL-6R mainly consisting of its extracellular region, in addition to a membrane-bound type expressed through the cell membrane and expressed on the cell membrane.
  • Patent Document 1 920 92/19759
  • Patent Document 2 Japanese Unexamined Patent Publication No. 8-99902
  • Patent Document 3 French Patent Application Publication No. FR 2694767
  • Patent Document 4 US Patent No. US 521628
  • Non-Patent Document 1 R.J.Harris, J. Chromatogr. A 705 (1995) 1 29-134
  • Non-patent document 2 Hirano, T. et al., Nature (1986) 324, 73-76
  • Non-patent document 3 Akira, S. et al., Adv. In Immunology (1993 ) 54, 1-78
  • Non-Patent Document 4 Lotz, M. et al., J. Exp.Med. (.1988) 167 1253-1258
  • Non-Patent Document 5 Taga, T. et al., J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981
  • Non-Patent Document 6 Yamasaki, K. et al., Science (1987) 241, 8 25-828
  • Non-Patent Document 7 Novick, D. et al., Hybridoma (1991) 10, 13-7-146
  • Non-Patent Document 8 Huang, Y. W. et al., Hybridoma (1993) 12, 621-630
  • Non-Patent Document 9 Hirata, Y. et al., J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906 Disclosure of the Invention
  • the present invention provides a novel subtype of a humanized PM-1 antibody, and a pharmaceutical composition comprising the subtype.
  • the present inventors have found that the C-terminus of the constant region constituting the heavy chain of the humanized PM-1 antibody (position 448 ), A molecular species in which Gly is deleted and Pro at position 447 is amidated, and only one of the two heavy chains constituting the antibody is amidated. It was found that there was an antibody subtype (referred to as subtype 2) in which both were amidated. Furthermore, the present inventors have found that any of the above subtypes has the same antigen binding and cell growth inhibitory activity as a native antibody having a C-terminal Gly (448), and completed the present invention. .
  • the present invention relates to the interleukin-6 receptor (IL-6R).
  • IL-6R interleukin-6 receptor
  • a subtype of humanized PM-1 antibody one of which has a C-terminal heavy chain of Pro-NH 2 (447), an antibody subtype (1), and an interleukin-6 receptor (IL- 6R), which is a subtype of the humanized PM-1 antibody to the antibody subtype (2) in which both heavy chain C-termini are Pro-NH 2 (447).
  • the native heavy chain C-terminus of the humanized PM-1 antibody corresponding to both subtypes is Gly (448).
  • the native heavy chain corresponding to the aminated heavy chain subtype has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the glutamine (Gin) at the N-terminus of the heavy chain has been changed to pyroglutamic acid (pGlu).
  • the light chain constituting the antibody subtype of the present invention has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the present invention also provides the above subtype (1) or subtype ( 2) or a subtype (1) and a pharmaceutical composition comprising both (2).
  • Figure 1 shows the results of liquid chromatography (LC) -mass spectrometry (MS) of the peptide fragment SLSLSP.
  • the upper row shows the chromatogram detected with ultraviolet light at 215 nm, and the lower row shows the base peak chromatogram. Is shown.
  • FIG. 2 shows the mass spectrum of the peptide fragment SLSLSP in liquid chromatography (LC) -mass spectrometry (MS).
  • FIG. 3 shows a zoom scan vector of the peptide fragment SLSLSP by liquid chromatography (LC) -mass spectrometry (MS).
  • Figure 4 is a peptide fragment SLSLSP- NH 2 of performance liquid Roma chromatograph (LC) - shows the results of liquid chroma preparative chromatography in mass spectrometry (MS), the upper The lower row shows the chromatogram detected with 215 nm ultraviolet light, and the lower row shows the basespeak chromatogram.
  • LC liquid Roma chromatograph
  • FIG. 5 shows a mass spectrum of the peptide fragment SLSLSP-NH 2 by liquid chromatography (LC) -mass spectrometry (MS).
  • FIG. 6 shows a zoom spectrum of the peptide fragment SLSLSP-NH 2 by liquid chromatography (LC) -mass spectrometry (MS).
  • FIG. 8 shows the peak mass spectrum at a retention time of 44 minutes in FIG.
  • FIG. 9 shows the mass spectrum of the peak at a retention time of 51 minutes in FIG.
  • A shows a peptide map of a peptide obtained by reducing / potentioxymethylating humanized PM-1 antibody (Main) and digesting with trypsin; in B, SLSLSPG (m / z 660.3 ⁇ SLSLSP-NH 2 (selective monitoring at m / z 602.3 ⁇ 0.5) at C, SLSLSP (m / z 603. 3 shows an MS chromatogram of the molecular weight of (selective monitoring at ⁇ 0.5).
  • Figure 11 shows the results of LC-MS / MS analysis of a peptide obtained by reducing / carboxyloxymethylating the humanized PM-1 antibody (Main) and digesting with trypsin, and the upper part was detected with 215 nm ultraviolet light.
  • the chromatogram is shown, and the lower row shows the base peak chromatogram.
  • FIG. 12 shows the mass spectrum of the peak at a retention time of 50 minutes in FIG.
  • FIG. 13 shows the same zoom scan spectrum of the same peak as FIG.
  • A shows a peptide map of a peptide obtained by subjecting the humanized PM-1 antibody subtype 1 to trypsin digestion and reducing / reducing lipoxymethylation; in B, SLSLSPG (m / z 660 3 Selective monitoring at 0.5), SLSLSP_NH 2 at C (selective monitoring at m / z 602.3 ⁇ 0.5) and D at SLSLSP (m / z 603 ⁇ ).
  • the MS chromatogram for the molecular weight of 3 ⁇ 0 • 5 is shown.
  • Figure 15 shows the results of liquid chromatography (LC) in LC-MS / MS analysis of tryptic digested peptides obtained by reducing / carboxyloxymethylation of humanized PM-1 antibody subtype 1.
  • the upper row shows the chromatogram detected with ultraviolet light of 215 nm, and the lower row shows the base peak chromatogram.
  • FIG. 16 shows the mass spectrum of the peak at a retention time of 48 minutes in FIG.
  • FIG. 17 shows a zoom scan spectrum of the same peaks as in FIG. Figure 18 shows the results of liquid chromatography (LC) for LC-MS / MS analysis of tryptic digested peptides obtained by reducing / carboxymethylating humanized PM-1 antibody subtype 1.
  • the upper part shows the chromatogram detected with ultraviolet light at 215 nm, and the lower part shows the base peak chromatogram.
  • FIG. 19 shows the peak mass spectrum at a retention time of 46 minutes in FIG.
  • FIG. 20 shows a zoom scan spectrum with the same peaks as in FIG.
  • A shows the peptide map of the peptide obtained by reducing / potentioxylating the humanized PM-1 antibody subtype 2 and digesting with trypsin; in B, SLSLSPG (m / z 660. Selective mode at 3 ⁇ 0.5 SLSLSP—NH 2 (selective monitoring at m / z 602.3 ⁇ 0.5) in C and SLSLSP (m / z 603.3 in soil D). 5 shows the MS chromatogram of the molecular weight of (selective monitoring in 5).
  • Figure 22 shows the results of liquid chromatography (LC) in LC-MS / MS analysis of tryptic digested peptides obtained by reducing / reducing lipoxymethylation of humanized PM-1 antibody subtype 2.
  • the upper row shows the chromatogram detected with 215 nm ultraviolet light, and the lower row shows the base peak chromatogram.
  • FIG. 23 shows the mass spectrum of the peak at a retention time of 45 minutes in FIG.
  • FIG. 24 shows a zoom scan vector of the same peak as FIG. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the native humanized PM-1 antibody corresponding to the antibody subtype of the present invention is a heavy chain (H chain) and light chain (L chain) of a mouse monoclonal antibody designated PM-1 against IL-6R. ) In which the complementarity determining region (CDR) in the variable region (V region) is replaced by the corresponding CDR region of the human antibody V region.
  • CDR complementarity determining region
  • the framework region (FR) of the V region of the L chain of the humanized PM-1 antibody is preferably derived from the human antibody REI, and its amino acid sequence is shown in Table 2 of International Publication W092 / 19759. RE1, FR2, FR3, and ER4.
  • the above-mentioned humanized PM-1 antibody H-chain V region frame The work region (FR) is preferably derived from the human antibody NEW, and its amino acid sequence is described in FR1, FR2, FR3 and FR4 in the NEW row of Table 3 of International Publication W092 / 19759. I have.
  • the FR region may be variously modified in order to improve antigen binding and neutralizing activity.
  • the L chain V region is described in FR1, FR2, FR3, and FR4 in Table 2 of International Publication W092 / 19759 and row Rb (referred to as purge ion a and purge ion b).
  • the H chain V region it is described in RV H A ⁇ RV H line of f FR1, FR2, FR3 and FR4 of International Publication W0 92/19759 Table 3 (Pajiyo down a ⁇ Pajiyo F)).
  • the L chain of the humanized PM-1 antibody is composed of the above-described L chain V region and the constant region (C region) of the human antibody L chain, and the H chain of the humanized PM-1 antibody. Consists of the H chain V region described above and the constant region (C region) of the human antibody H chain.
  • a human ⁇ / —IC region is preferable, and as the C region constituting the H chain, a human cC region is preferable.
  • the glutamine of the N-terminal amino acid of the monoclonal antibody undergoes pyroglutamylation, and the subtypes 1 and 2 of the humanized PM-1 antibody of the present invention bind to the N-terminal of the heavy chain.
  • Glutamine may be pyroglutamylated. That is, the subtypes 1 and 2 of the humanized PM-1 antibody of the present invention may be antibody subtypes in which glutamine (Gin) at the N-terminal of the heavy chain is glutamic acid (pGlu).
  • E. coli DH5 pPM-k3 containing plasmid pPM-k3 containing DNA coding for the L chain V region of the monoclonal antibody PM-1 is referred to as NCIMB 40366.
  • E. coli DH5a pPM-hl containing plasmid pPM-hi comprising DNA encoding the H chain V region of PM-1 was identified as NCIMB 40362 on February 12, 1991 by Natio It has been deposited internationally under the Budapest Treaty with the National Coalitions of Industrial and Marine Bacteria Limited (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB 219YA, United Kingdom).
  • the hybridoma PM1 which produces the monoclonal antibody PM-1, was designated as FERM BP-2998 on July 12, 1989, by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary (Tsukuba, Ibaraki Prefecture).
  • the obtained DNA is ligated with DNA encoding the C region of a human antibody, then inserted into an expression vector, and introduced into a host to produce it (European Patent Application Publication No. EP 23940). 0, see International Patent Application Publication Number W0 92-19759).
  • Human antibody FRs linked via CDRs are selected so that the complementarity-determining regions form a favorable antigen-binding site. If necessary, the amino acid in the framework region of the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen-binding site. (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).
  • a human antibody C region is used for a humanized antibody.
  • the human antibody C region includes Cy, and for example, 1, Cy2, Cy3 or C ⁇ 4 can be used.
  • the antibody gene constructed as described above can be expressed and obtained by a known method.
  • it can be expressed by a useful useful promoter commonly used, an antibody gene to be expressed, a DNA having a polyA signal functionally linked to its 3 ′ downstream, or a vector containing the same.
  • the promoter / enhancer may be the human cytomegalovirus immediate early promoter / enhancer.
  • virus promoters such as retrovirus, poliomavirus, adenowinores, and simian virus 40 (SV40).
  • SV40 simian virus 40
  • a mammalian cell-derived promoter Z enhancer such as the human chromosomal factor 1 (HEF1a), may be used.
  • the method of Mulligan et al. (Mulligan, RC et al., Nature (1979) 277, 108-114), or when using the HEFlo; promoter Z enhancer, It can be easily carried out according to the method of Mizushima et al. (Mizushima, S. and Nagata, S. Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322).
  • expression can be performed by operably linking a useful promoter commonly used, a signal sequence for antibody secretion, and an antibody gene to be expressed.
  • a useful promoter commonly used, a signal sequence for antibody secretion, and an antibody gene to be expressed.
  • lacZ promoter As a promoter, lacZ promoter And the araB promoter.
  • the lacZ promoter the method of Ward et al. (Ward, ES et al., Nature (1989) 341, 544-546; Ward, ES et al. FASEB J. (1992) 6, 242 2-2427)
  • the method of Better et al. (Better, M. et al. Science (1988) 240, 1041-1043) may be used.
  • the pelB signal sequence (Lei, SP et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383) can be used for production in E. coli periplasm. Good. After isolating the antibody produced in the periplasm, the antibody structure is appropriately refolded and used (see, for example, W096 / 30394).
  • the expression vectors are selected as selectable markers, such as aminoglycoside phosphotransferase (APH) gene, thymidine kinase (TK) gene, Escherichia coli xanthinguanine phosphorolibosyltransferase (Ecogpt).
  • APH aminoglycoside phosphotransferase
  • TK thymidine kinase
  • Engpt Escherichia coli xanthinguanine phosphorolibosyltransferase
  • Any production system can be used for producing the antibody used in the present invention, which can contain a gene, a dihydrofolate reductase (dhfr) gene, and the like.
  • Production systems for producing antibodies include in vitro and in vivo production systems. Examples of the in vitro production system include a production
  • animal cells When eukaryotic cells are used, there are production systems using animal cells, plant cells, or fungal cells.
  • animal cells include (1) mammalian cells, for example, CH0, COS, myeloma, BHK (baby hamster kidney), He, Vero, etc., and (2) amphibian cells, for example, poma, African oocyte Or (3) insect cells such as sf9, sf21, and Tn5 are known.
  • plant cells cells derived from Nicotiana 'tapacum (Nicotiana ta bacum) are known, and these may be cultured in callus.
  • Fungal cells include yeast, for example, the genus Saccharomyces, for example, Saccharomyces cerevisiae, and filamentous fungi, for example, the genus Aspergillus, for example, Aspergillus niger. ) Such as power S is known.
  • bacterial cells When prokaryotic cells are used, there are production systems using bacterial cells.
  • Known bacterial cells include E. coli and E. coli.
  • An antibody can be obtained by introducing a desired antibody gene into these cells by transformation, and culturing the transformed cells in vitro. Culture is performed according to a known method. For example, DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM can be used as a culture solution, and a serum supplement such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination.
  • FCS fetal calf serum
  • antibodies may be produced in vivo by transferring cells into which the antibody gene has been introduced into the peritoneal cavity of animals.
  • examples of in vivo production systems include production systems using animals and production systems using plants. When using animals, there are production systems using mammals and insects.
  • An antibody gene is introduced into these animals or plants, and the antibodies are produced in the animals or plants and collected.
  • a gene encoding an antibody gene encoding a protein that is specifically produced in milk such as goat casein
  • a fusion gene A DNA fragment containing the fusion gene into which the antibody gene has been inserted is injected into a goat embryo, and the embryo is introduced into a female goat.
  • a desired antibody is obtained from milk produced by a transgenic goat born from a goat that has received the embryo or a progeny thereof. Hormones may be used in transgenic goats as appropriate to increase the amount of milk containing the desired antibody produced from transgenic goats (Ebert, KM et al., Bio / Technology (1994) 12 , 699-702).
  • the silkworm When a silkworm is used, the silkworm is infected with a paculovirus into which the antibody gene of interest is inserted, and a desired antibody is obtained from the body fluid of the silkworm (Maeda, S. et al., Nature (1985) 315, 592- 594) to 0 is found, when tobacco is used, the desired antibody gene is inserted into an expression vector for plants, for example Romyuomikuron'nyu 530, introducing the base click coater to Pakuteria as Agrobacterium tumefa ciens.
  • the bacterium is infected with tobacco, for example, Nicotiana tabacum, to obtain the desired antibody from the leaves of this octopus (Julian, K.-Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131 -138).
  • the DNA encoding the antibody heavy chain (H chain) or light chain (L chain) is separately incorporated into an expression vector to prepare the host.
  • the host may be transformed by co-transformation or by incorporating the DNAs encoding the H and L chains into a single expression vector (see International Patent Application Publication No. WO 94-11523).
  • cultured cells of an animal are used as a host and cultured in an animal cell culture medium.
  • an animal cell culture medium is preferred.
  • a medium containing peptone which is a protein hydrolyzate, is preferable, and Peptones derived from meat, soy, rice, fish, etc. are used.
  • peptone derived from animals has a high expression effect
  • the use of peptone derived from fish meat eg, Katsuo
  • the antibody produced and expressed as described above can be separated from the host inside and outside the cell and from the host and purified to homogeneity. Separation and purification of the antibody used in the present invention can be performed by affinity chromatography.
  • a column used for affinity chromatography include a protein A column and a protein G column.
  • Carriers used for the protein A column include, for example, Hyper D, P0R0S, Sepharose F.F., and the like.
  • separation and purification methods used for ordinary proteins may be used, and there is no limitation.
  • Chromatography other than the above affinity chromatography for example, general column chromatography, for example, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, hydroxyapatite chromatography, gel filtration chromatography This can be done by a combination of photography and the like.
  • the antibody used in the present invention can be separated and purified by appropriately selecting and combining a filter, ultrafiltration, salting out, dialysis and the like. . These chromatographies can be applied to FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography or High Performance Liquid Chromatography (HPLC)), or reverse phase HPLC (reverse phase HPLC) may be used.
  • FPLC Fast Protein Liquid Chromatography or High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
  • HPLC reverse phase HPLC
  • the concentration of the antibody obtained above can be measured by measuring absorbance or ELISA. That is, when absorbance measurement is, PB S (-) was appropriately diluted with, by measuring the absorbance at 280 nm, calculated by the 1 m g / mL to about 1.35 0D.
  • ELISA it can be measured as follows. That is, 100 / zL of goat anti-human IgG (manufactured by TAG) diluted to 1 ⁇ g / mL with 0.1 M bicarbonate buffer (pH 9.6) was added to a 96-well plate (manufactured by Nunc), and the mixture was added at 4 ° C. Incubate to solidify the antibody. After blocking, add appropriately diluted samples containing the antibody or antibody used in the present invention or human IgG (CAPPEL) 100 / L as a standard, and incubate at room temperature for 1 hour. .
  • the native humanized PM-1 antibody of the present invention has substantially the same antigen binding properties as the native humanized PM-1 antibody, the native humanized PM-1 antibody Similarly, it can be used for the treatment or prevention of various diseases associated with IL-6.
  • IL-6-related diseases include acute, chronic inflammatory diseases, autoimmune diseases such as nephritis, mesangial proliferative nephritis, Crohn's disease, ulcerative colitis, knee inflammation, pediatric chronic arthritis, or systemic juveniles Idiopathic arthritis, vasculitis, Kawasaki disease, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, psoriasis, siddaren syndrome, adult stye / les disease; Oncological diseases, eg, multiple myeloma, Castleman's disease, malignant lymphoma, renal cancer; Infectious diseases, eg, HIV infection, EBV infection; Cachexia; Other, plasma cytosis And
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally systemically or locally.
  • intravenous injection such as infusion, intramuscular injection, intrathoracic injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, suppository, enema, oral enteral solvent, etc.
  • a suitable administration method can be selected. Effective doses range from 0.01 mg to 100 mg per kg body weight per dose. Alternatively, a dose of 1-1000 mg, preferably 5-50 mg per patient can be chosen.
  • a preferable dose and administration method is, for example, in the case of an anti-IL-6 receptor antibody, an effective dose is such that a free antibody is present in the blood.
  • Intravenous injection such as infusion, subcutaneous injection, etc., in the administration schedule of once / four weeks, etc.
  • the dosing schedule should be 2 times / week or 1 time / week to 1 time Z while observing the disease condition and observing trends in blood test values.
  • the dose interval should be 2 weeks, 1/3 weeks, 1/4 weeks. It is also possible to make adjustments, such as extending it.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be a pharmaceutically acceptable carrier depending on the administration route. And additives may be included together.
  • examples of such carriers and additives include water, pharmaceutically acceptable inorganic salts, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, and canolepoxivini.
  • Norepolymer canolepox methinoresenolol sodium, poly (sodium acrylate), sodium alginate, water-soluble dextran, carboxymethyl starch sodium, lectin, methinolate Senorelose, etinoresenorelose, xanthan gum, gum arabic, casein, gelatin, agar, diglycerin, propylene glycol, polyethylene glycol cornole, vaseline, paraffin
  • Example 1 Expression of an antibody composition comprising native humanized PM-1 antibody / subtype 1 / subtype 2
  • Sepharose 4B (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, manufactured by Pharmacia, Inc.) in which the anti-IL-6R antibody MT18 prepared by the method of Hirata et al. (J. Immunol., 143: 2900-2906, 1989) was activated by CNBr. N-6) and purified according to the attached protocol to purify IL-6R (Yamasaki et al., Science 241: 825-828,1988).
  • the human myeloma cell line U266 was transformed with 1 mM digitonin (Wako Chemicals), 10 mM triethanolamine (pH 7.8), and ImM p-paraaminophenol methanesulfonyl fluoride containing 10 mM NaCl.
  • the resultant was solubilized with dehydrochloride (manufactured by Wako Chemicals) (digitonin buffer) and mixed with MT18 antibody bound to Sepharose 4B beads. Thereafter, the beads were washed six times with digitonin buffer to obtain partially purified I-6R used for immunization.
  • mice were immunized four times every 10 days with the above partially purified IL-6R obtained from 3 ⁇ 10 9 U266 cells, and then a hybridoma was prepared by a conventional method.
  • the binding activity to IL-6R of the hybridoma culture supernatant from the growth-positive well was examined by the following method. 5X10 7 U266 cells were labeled with 35S-methionine (2.5 mCi), and the solubilized U266 cells solubilized with the above digitonin buffer were mixed with an MT18 antibody bound to 0.04 mL of Sephylose 4B beads.
  • the plate was washed six times with digitonin buffer, and 35S-methionine-labeled IL-6R was eluted with 0.25 mL of digitonin buffer (pH 3.4), and 0.025 mL of 1 M Tris (pH 7,4) Neutralized with.
  • 0.05 mL of the hybridoma culture supernatant was mixed with 0.01 mL of Protein G Sepharose (Pharmacia).
  • the IL-6R antibody PM-1 produced from the hybridoma PM-1 has an IgG1 ⁇ subtype.
  • the activity of the antibody produced by Hypridoma PM-1 to inhibit the binding of IL-6 to human IL-6R was examined using a human myeloma cell line U266.
  • Group of people Recombinant IL-6 was prepared from Escherichia coli (Hirano et al., Immunol. Lett., 17:41, 1988), and was treated with a bonoretone-one reagent (New England Nuclear, Boston, MA). 1 2 5 and I-labeled (Taga et al., J. Exp Med 166:.. 967, 1987).
  • the expressing cells were cultured in a commercially available serum-free medium or its modified medium. Culture conditions were generally performed in an environment suitable for culturing CH0 cells. Various additives could be added to the medium to increase the expression of the target antibody. Therefore, various peptones are generally widely used. Beef, pork, dogs: Peptones derived from S, rice, fish, etc. are widely marketed, but their effectiveness is Depends on compatibility with cell line. Generally, expression is high with animal-derived peptides. In the process of examining the effects of various peptones, it was found that using peptone derived from fish meat (Katsuo) had an effect on the expression level.
  • Purification of the expressed antibody can be performed by general column chromatography, such as affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, hydroxyapatite chromatography, gel filtration chromatography, etc. The combination was performed.
  • the samples were the native form of humanized PM-1 antibody (sometimes referred to as Main), the subtypes 1 and 2 of the antibody, and the humanized form of the reference peptide.
  • Peptide Ser-Leu- Ser- Leu- Ser-Pro present at the C-terminus of the PM-1 antibody and from which the G-y at the C-terminus has been removed, and its C-terminal Pro has been amidated using peptide SLSLSP-NH 2.
  • Peptide SLSLSP and amidated peptide SLSLSP-NH 2 were chemically synthesized.
  • the humanized PM-1 antibody Main, subtype 1 and subtype 2 of the antibody were obtained by converting the humanized PM-1 antibody obtained in Example 1 into a column chromatography by the following method. It was obtained by further fractionation and purification.
  • Poly CAT A (100 x 4.6 mm) manufactured by Poly LC was used as a column, and Poly CAT A Javelin guard (10 x 4.0 mm) manufactured by Poly LC was used as a guard column.
  • mobile phase A 2 5 mM 2- [N- Moruho Li Roh] ethanesulfonic acid buffer pH 6. 1 containing 0. 05% NaN 3) and mobile phase B (2 A 25 mM 2- [N_morpholino] ethanesulfonic acid buffer (pH 6.1.1) containing 50 mM sodium acetate and 0.05% NaN 3 was used.
  • the gradient conditions were as follows: mobile phase B ratio was 0 min / 35%, 5 min / 35%, 59 min / 60%, 60 min / 100%.
  • the flow rate was 1 mL / min, and detection was performed by UV-visible absorbance at 280 nm.
  • a DTT solution denaturant solution containing 162 mM dithiothreitol
  • the head space was replaced with N 2
  • the solution was allowed to stand at 37 ° C for 1 hour in a constant temperature block.
  • 45 ⁇ l of an IAA solution 0.2 N sodium hydroxide solution containing 417 mM rhodoacetic acid
  • the reaction solution was collected, and each sample was subjected to a Tris-HC1 buffer solution (100 mM 2-amino-2-hydroxymethylxmethyl-1 containing 2 M urea, pH 8.0) using a dialysis tube.
  • trypsin solution dissolve trypsin in Tris-HCl buffer (same composition as above)
  • Tryptic substances and comparative standard peptides The trypsin-treated sample 40 / zL as described above was subjected to liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS / MS) measurement.
  • Standard peptide solution i.e., the SLSLSP solution (dissolved in water and 4 ⁇ ⁇ SLSLSP) and SLSLSP- ⁇ 2 solvent solution (a SLSLSP-NH 2 and was dissolved in water 4 ⁇ ) are liquid 50 mu Mouth chromatography-Mass spectrometry.
  • the liquid chromatography conditions were as follows. That is, YMC-Pack 0DS (250 ⁇ 2.0 mm, 5 m, 300 A) manufactured by EMC Corporation was used as a column. As the mobile phase, mobile phase A (5% acetonitrile solution containing 0.1% trifluoroacetic acid) and mobile phase ⁇ (95% acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid) Solution) was used. The gradient conditions were as follows: mobile phase ratio: 0 min / 0%, 10 min / 0%, 120 min / 35%, 140 min / 35%. At a flow rate of 0.2 mL / min, detection was performed by UV-visible absorbance at 215 nm.
  • FIG. 1 to 3 show the results of liquid chromatography (LC) -mass spectrometry (MS) of the peptide fragment SLSLSP.
  • LC liquid chromatography
  • MS mass spectrometry
  • Fig. 4 shows a chromatogram detected with 215 nm ultraviolet light, and the lower part shows a base peak chromatogram.
  • Figure 5 shows the mass spectrum, and Figure 6 shows the zoom scanner. Indicates the spectrum. The obtained molecular weight (601.2) almost coincided with the theoretical value (601.3; monoisotopic molecular weight) (FIGS. 5 and 6).
  • FIG. 7 to 9 peptide of the mixed solution of de fragments SLSLSP and SLSLSP- NH 2, liquids click Roma chromatograph (LC) - shows mass spectrometry (MS) results.
  • the upper part of Fig. 7 shows a chromatogram detected with 215 nm ultraviolet light, and the lower part shows a base peak chromatogram.
  • FIG. 8 shows the mass spectrum of the peak at the retention time of 44 minutes in FIG. 7
  • FIG. 9 shows the mass spectrum of the peak at the retention time of 51 minutes in FIG. Both peptide fragments were completely separated under the conditions of liquid chromatography described above.
  • Fig. 10A shows a peptide map of a peptide obtained by reducing and / or lipoxymethylating humanized PM-1 antibody (Main) and digesting with trypsin.
  • SLSLSPG of (m / z 6 60. selective monitoring of 3 ⁇ 0. 5)
  • SLS LSP -NH 2 in C of FIG. 10 (m / MS chromatograms for the molecular weight of zSL (selective monitoring at 602.3 ⁇ 0.5) and SLSLSP (selective monitoring at m / z 603.3 soil 0.5) in Fig. 10D. Show.
  • a peak corresponding to SLSLSPG was detected at 49.7 minutes, but no peptide fragment having the molecular weight of SLSLSP-NH 2 or SLSLSP was present.
  • FIG. 11 to Fig. 13 show the results of LC-MS / MS analysis of tryptic digested peptides obtained by reducing / carboxoxylating humanized PM-1 antibody (Main).
  • the upper part of FIG. 11 shows a chromatogram detected with 215 nm ultraviolet light, and the lower part shows a base peak chromatogram.
  • FIG. 12 shows the mass spectrum of the pic at a retention time of 50 minutes in FIG. 11, and FIG. 13 shows the zoom spectrum of the same peak as FIG. these The results indicated that the detected peak had the amino acid sequence SLSLSPG. Therefore, it was shown that the C-terminals of both H chains of the humanized PM-1 antibody (Main) had -SLSLSPG sequence.
  • FIG. 14A shows humanized PM-1 antibody subtype 1 reduced / activated by lipoxymethylation and digestion with trypsin The peptide map of the obtained peptide is shown.
  • SLSLSPG of (m / z 660. 3 selective monitoring of soil 0. 5)
  • SLSLSP_NH 2 (m / z 602 ⁇ Te C smell 14
  • the MS chromatograms of the molecular weight of the selective monitoring at 3 ⁇ 0.5 and the molecular weight of SLSLSP (m / z 603.3 ⁇ 0.5) at D in FIG. 14 are shown.
  • a peak corresponding to SLSLSP G was detected at 47.7 min, and a peak corresponding to SLSLSP_NH 2 was also detected at 46.2 min. (In Fig. 14, D, a peak with a molecular weight of 603.3 was observed around 46 min, but it was not SLS LSP due to the retention time.)
  • Figures 15 to 17 show the results of LC-MS / MS analysis of trypsin-digested peptides obtained by reducing / carboxylmethylating humanized PM-1 antibody subtype 1.
  • FIG. 15 shows a chromatogram detected with a 215 nm ultraviolet ray, and the lower part shows a base peak chromatogram.
  • FIG. 16 shows the mass spectrum of the peak at a retention time of 48 minutes in FIG. 15, and
  • FIG. 17 shows the zoom scan spectrum of the same peak as in FIG.
  • Figures 18 to 20 show the results of LC-MS / MS analysis of tryptic digested peptides obtained by reducing / carboxmethylating humanized PM-1 antibody subtype 1.
  • FIG. 18 shows a chromatogram detected with an ultraviolet ray of 215 nm, and the lower part shows a base peak chromatogram.
  • Figure 19 shows the peak map at a retention time of 46 minutes in Figure 18.
  • FIG. 20 shows the zoom spectrum with the same peaks as in FIG.
  • FIG. 21A shows reduction / carboxymethylation of humanized PM-1 antibody subtype 2 and trypsin digestion.
  • the peptide map of the peptide is shown.
  • the SLSLSPG selective monitoring at m / z 660.3 ⁇ 0.5
  • the SLSLSP-NH 2 m / z MS chromatograms for the molecular weight of z 602.3, selective monitoring at 0.5, and for SLSLSP (m / z 603.3 ⁇ 0.5, selective monitoring) at D in Figure 21. Show.
  • FIG. 22 to FIG. 24 show the results of LC-MS / MS analysis of tryptic digested peptides obtained by reducing / carboxymethylating humanized PM-1 antibody subtype 2.
  • the upper part of FIG. 22 shows a chromatogram detected with ultraviolet light of 215 nm, and the lower part shows a base peak chromatogram.
  • FIG. 23 shows the mass spectrum of the peak at a retention time of 45 minutes in FIG. 22, and
  • FIG. 24 shows the zoom scan spectrum of the same peak as in FIG. From these results, the detected peak was shown to have a Amino acid sequence SLSLSP-NH 2. Therefore, human-type PM - H chain C-terminus of both the 1 antibody subtype 2 was shown to have a -SLSLSP- NH 2 sequence.
  • Example 3 Measurement of Biological Activity of Humanized PM_1 Antibody Subtype 1 and Subtype 2
  • the measurement was performed according to the following steps.
  • the measurement was performed according to the following steps.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

インターロイキン-６受容体（IL-6R）に対するヒト型化PM-1抗体のサブタイプであって、片方の重鎖C末端がPro-NH2（447）である抗体サブタイプ（１）、及びインターロイキン-６受容体（IL-6R）に対するヒト型化PM-1抗体のサブタイプであって、両方の重鎖C末端がPro-NH2（447）である抗体サブタイプ（２）、並びにこれらを含んで成る医薬組成物。

Description

インターロイキン _ 6受容体に対するヒ ト型化抗体のサブタイプ
技術分野
本発明は、 インターロイキン— 6受容体 （IL-6R) に対する抗体 の一種であるヒ ト型化 PM-1抗体の新規なサブタイプに関する。
明 田
背景技術
食曰
遺伝子組換えにより生産されたタンパク質は、 理論上は、 遺伝子 配列から推定されるアミノ酸配列を有するはずであるが、 実隙上は 、 種々の変異体が生産される場合がある。 これは、 既知の又 fま新規 な生体内 （転写後） 修飾 （modification) や自然発生の （非酵素的 な） タンパク分解によるものである （R, J. Harris, J. Chromatogr . A 705 (1995) 129-134) 。 医薬品の成分として使用されるタンパ ク質は、 生体による生合成過程を利用する遺伝子組換え法によ り生 産されるため、 分子構造が異なるサブタイプが生産される可倉 性が ある。 サブタイプの種類や含有量は医薬品の品質を規定するあので あるので、 サブタイプのプロファイルを特性解析し、 医薬品,钮成物 と しての有用性を担保することが重要である。
IL-6は B細胞刺激因子 2 (BSF2) あるいはイ ンターフェロ ン 2 とも呼称されたサイ ト力イ ンである。 IL- 6は、 B リ ンパ球系糸田胞の 活性化に関与する分化因子として発見され （Hirano, T. et al. ,Na ture (1986) 324, 73-76 ) 、 その後、 種々の細胞の機能に影響を 及ぼす多機能サイ ト力インであることが明らかになった （ Aki ra， S . et al. , Adv. in Immunology (1993) 54, 卜 78) 。 Iい 6は、 T ジ ンパ球系細胞の成熟化を誘導することが報告されている （Lotz， M. et al.， J. Exp. Med. (1988) 167, 1253-1258) 。
IL-6は、 細胞上で二種の蛋白質を介してその生物学的活性を伝達 する。 一つは、 IL- 6が結合する分子量約 80kDのリガンド結合性蛋白 質の IL-6受容体 （IL- 6R) である （Taga， T. et al. , J. Exp. Med.
(1987) 166, 967-981, Yamasaki, K. et al. , Science (1987) 24 1， 825-828)。 IL- 6Rは、 細胞膜を貫通して細胞膜上に発現する膜結 合型の他に、 主にその細胞外領域からなる可溶性 IL-6Rとしても存 在する。
抗 IL- 6R抗体に関しては、 いくつかの報告がある （Novick, D. et al.， Hybridoma (1991) 10， 137-146 、 Huang, Y. W. et al. , Hy bridoma (1993) 12， 621-630 、 国際特許出願公開番号 WO 95-09873 、 フランス特許出願公開番号 FR 2694767、 米国特許番号 US 521628 ) 。 その一つであるマウス抗体 PM-1 (Hirata, Y. et al.， J. I mm unol. (1989) 143, 2900 - 2906) の相捕性決定領域 (CDR; compleme ntarity determining region ) をヒ 卜抗体へ移植することによ り 得られたヒ ト型化 PM-1抗体が知られている （国際特許出願公開番号 W0 92-19759 ) 。
しかしながら、 ヒ ト型化 PM-1抗体のサブタイプについては知られ ていない。
特許文献 1 ： Ψ0 92/19759
特許文献 2 ： 特開平 8- 99902合公報
特許文献 3 ： フランス特許出願公開番号 FR 2694767
特許文献 4 ： 米国特許番号 US 521628
非特許文献 1 ： R.J. Harris, J. Chromatogr. A 705 (1995) 1 29-134
非特許文献 2 ： Hirano, T. et al. , Nature (1986) 324, 73-76 非特許文献 3 ： Akira, S. et al.， Adv. in Immunology (1993 ) 54, 1-78
非特許文献 4 Lotz, M. et al. , J. Exp. Med. (.1988) 167 1253-1258
非特許文献 5 ： Taga, T. et al.， J. Exp. Med. (1987) 166， 967-981
非特許文献 6 ： Yamasaki, K. et al. , Science (1987) 241, 8 25-828
非特許文献 7 ： Novick, D. et al. , Hybridoma (1991) 10， 13 7-146
非特許文献 8 ： Huang, Y. W. et al. , Hybridoma (1993) 12, 621-630
非特許文献 9 ： Hirata, Y. et al. , J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906 発明の開示
従って、 本発明はヒ ト型化 PM-1抗体の新規なサブタイプ、 及び当 該サブタイプを含んで成る医薬組成物を提供するものである。
本発明者は、 組換え生産されたヒ ト型化 PM - 1抗体を精密に分離し た結果、 ヒ ト型化 PM-1抗体の重鎖を構成する定常領域の C-末端 （44 8位） の Glyが欠落して 447位の Proがアミ ド化された分子種が存在し 、 且つ、 抗体を構成する 2本の重鎖の内、 一方のみがアミ ド化され ている抗体サブタイプ （サブタイプ 1 と称する） と両方がアミ ド化 されている抗体サブタイプ (サブタイプ 2 と称する） が存在するこ とを見出した。 更に、 本発明者は、 上記いずれのサブタイプも、 C- 末端が Gly (448) である生来型抗体と同等の抗原結合性及び細胞増 殖阻害活性を有することを見出し、 本発明を完成した。
従って、 本発明は、 インターロイキン- 6受容体 （IL-6R) に対す るヒ ト型化 PM-1抗体のサブタイプであって、 片方の重鎖 C末端が Pr o-NH2 ( 447) である抗体サブタイプ （ 1 ) 、 及びインターロイキ ン - 6受容体 （IL-6R) に対するヒ ト型化 PM-1抗体のサブタイプであ つて、 両方の重鎖 C末端が Pro-NH2 ( 447) である抗体サブタイプ （ 2 ) を提供する。 上記の両サブタイプに対応するヒ ト型化 PM- 1抗体 の生来型の重鎖 C末端は Gly ( 448) である。 好ましい態様において 、 アミ ド化された重鎖サブタイプに対応する生来の重鎖は、 配列番 号 ： 1 に記載のアミ ノ酸配列を有する。 好ましい一つの態様におい て、 重鎖 N末端のグルタミ ン （Gin) がピログルタミン酸 （pGlu) に 変っている。 また、 好ましい態様において、 本発明の抗体サブタイ プを構成する軽鎖は、 配列番号 ： 2に記載のアミ ノ酸配列を有する 本発明はまた、 上記のサブタイプ （ 1 ) もしく はサブタイプ （ 2 ) 又はサブタイプ （ 1 ) 及び （ 2 ) の両者を含んで成る医薬組成物 を提供する。 図面の簡単な説明
図 1 は、 ペプチド断片 SLSLSPの液体クロマ トグラフ （LC) - 質量 分析 （MS) における液体クロマ トグラフィーの結果を示し、 上段は 215nmの紫外線で検出したク ロマ トグラムを示し、 下段はベースピ ークク ロマ トグラムを示す。
図 2は、 ペプチド断片 SLSLSPの液体クロマ トグラフ （LC) - 質量 分析 ( MS) におけるマススぺク トルを示す。
図 3は、 ペプチド断片 SLSLSPの液体クロマ トグラフ （LC) - 質量 分析 ( MS) におけるズームスキャ ンスぺク トルを示す。
図 4は、 ペプチド断片 SLSLSP- NH2の液体ク ロマ トグラフ （LC) - 質量分析 （MS) における液体クロマ トグラフィーの結果を示し、 上 段は 215nmの紫外線で検出したク口マ トグラムを示し、 下段はべ一 スピークク ロマ トグラムを示す。
図 5は、 ペプチド断片 SLSLSP- NH2の液体クロマ トグラフ （LC) - 質量分析 （MS) におけるマススペク トルを示す。
図 6は、 ペプチド断片 SLSLSP- NH2の液体クロマ トグラフ （LC) - 質量分析 （MS) におけるズームスキャ ンスペク トルを示す。
図 7は、 ペプチド断片 SLSLSPと SLSLSP- NH2の混合溶液の、 液体ク 口マ トグラフ （LC) - 質量分析 （MS) における液体クロマ トグラフ ィ一の結果を示し、 上段は 215nmの紫外線で検出したクロマ トダラ ムを示し、 下段はベースピーククロマ トグラムを示す。
図 8は、 図 7における保持時間 44分でのピークのマススぺク トル を示す。
図 9は、 図 7における保持時間 51分でのピークのマススぺク トル を示す。
図 10において、 Aは、 ヒ ト型化 PM-1抗体 ( Main) を還元/力ルポ キシメチル化しト リ プシン消化したべプチドのぺプチドマップを示 し ； Bにおいて SLSLSPG ( m/z 660. 3 ± 0. 5における選択的モニタ リ ング） の、 Cにおいて SLSLSP- NH2 ( m/z 602. 3 ± 0. 5における選択的 モニタリ ング） の、 そして Dにおレヽて SLSLSP ( m/z 603. 3 ± 0. 5にお ける選択的モニタ リ ング） の分子量についての MSクロマトグラムを 示す。
図 11は、 ヒ ト型化 PM- 1抗体 ( Ma i n) を還元/力ルポキシメチル化 し ト リ ブシン消化したぺプチドの LC- MS/MS分析の結果を示し、 上段 は 215nmの紫外線で検出したクロマ トグラムを示し、 下段はベース ピークク ロマ トグラムを示す。
図 12は、 図 11における保持時間 50分でのピークのマススぺク トル を示す。 図 13は、 図 11と同じピークのズームスキャンスぺク トルを示す。 図 14において、 Aは、 ヒ ト型化 PM-1抗体サブタイプ 1 を ト リ プシ ン消化し、 還元/力ルポキシメチル化したべプチ ドのぺプチ ドマッ プを示し ； Bにおいて SLSLSPG ( m/z 660. 3土 0. 5における選択的モ ニタ リ ング） の、 Cにおいて SLSLSP_NH2 ( m/z 602. 3 ± 0. 5における 選択的モニタ リ ング） の、 そして Dにおいて SLSLSP ( m/z 603· 3 ± 0 • 5における選択的モニタ リ ング） の分子量についての MSク ロマ トグ ラムを示す。
図 15は、 ヒ ト型化 PM-1抗体サブタイプ 1 を還元/力ルポキシメチ ル化し ト リ プシン消化したべプチ ドの LC-MS/MS分析における液体ク 口マ トグラフィー ( LC) の結果 (図 17の Bのピークについて） を示 し、 の上段は 215nmの紫外線で検出したク ロマ トグラムを示し、 下 段はベースピーク ク ロマ トグラムを示す。
図 16は、 図 15における保持時間 48分でのピークのマススぺク トル を示す。
図 17は、 図 16と同じピークのズ一ムスキャンスぺク トルを示す。 図 18は、 ヒ ト型化 PM-1抗体サブタイプ 1 を還元/カルボキシメチ ル化し、 ト リ プシン消化したぺプチ ドの LC-MS/MS分析における液体 ク ロマ トグラフィー ( LC) の結果 (図 17の Cのピークについて） を 示し、 上段は 215nmの紫外線で検出したク ロマ トグラムを示し、 下 段はベースピーク ク ロマ トグラムを示す。
図 19は、 図 18における保持時間 46分でのピークのマススぺク トル を示す。
図 20は、 図 19と同じピークのズームスキャンスぺク トルを示す。 図 21において、 Aは、 ヒ ト型化 PM-1抗体サブタイプ 2 を還元/力 ルポキシメチル化し、 ト リ プシン消化したぺプチ ドのぺプチ ドマツ プを示し ； Bにおいて SLSLSPG ( m/z 660. 3 ± 0. 5における選択的モ ニタ リ ング） の、 Cにおレ、て SLSLSP— NH2 ( m/z 602. 3 ± 0· 5における 選択的モニタ リ ング） の、 そして Dにおいて SLSLSP ( m/z 603. 3土 0 . 5における選択的モニタ リ ング） の分子量についての MSクロマ トグ ラムを示す。
図 22は、 ヒ ト型化 PM - 1抗体サブタイプ 2を還元/力ルポキシメチ ルイ匕し、 ト リ プシン消化したぺプチ ドの LC-MS/MS分析における液体 クロマ トグラフィー （LC) の結果を示し、 上段は 215nmの紫外線で 検出したクロマ トグラムを示し、 下段はベースピーククロマ トダラ ムを示す。
図 23は、 図 22における保持時間 45分でのピークのマススぺク トル を示す。
図 24は、 図 23と同じピークのズームスキャ ンスぺク トルを示す。 発明を実施するための最良の形態
本発明の抗体サブタイプに対応する生来のヒ ト型化 PM- 1抗体は、 I L-6Rに対する、 PM-1と称するマウスモノ ク ローナル抗体の重鎖 （ H鎮） 及び軽鎖 （L鎖） を構成する可変領域 （V領域） 中の相補性 決定領域 （CDR) を、 ヒ ト抗体 V領域の対応する CDR領域と置き換え たものである。 前記マウス抗 I L-6R抗体の L鎖 V領域の CDRのァミノ 酸酉己列は、 国際公開 W0 92/19759の表 2の LV PM-1の行の CDR1、 CDR2 及び CDR3に記載されており、 また、 前記マウス抗 Iい 6R抗体の H鎖 V領域の CDRのアミ ノ酸配列は、 国際公開 W0 92/19759の表 3の HV P Μ - 1の行の CDR1、 CDR2及び CDR3に記載されている。
上記ヒ ト型化 PM-1抗体の L鎖 V領域のフ レームワーク領域 （FR) は、 ヒ ト抗体 RE I由来のものが好ましく、 そのアミノ酸配列は、 国 際公開 W0 92/19759の表 2の RE Iの行の FR1、 FR2、 FR3及び ER4に記載 されている。 また、 上記ヒ ト型化 PM - 1抗体の H鎖 V領域のフ レーム ワーク領域 （FR) は、 ヒ ト抗体 NEW由来のものが好ましく、 そのァ ミ ノ酸配列は、 国際公開 W0 92/19759の表 3の NEWの行の FR1、 FR2、 FR3及び FR4に記載されている。
更に、 上記の、 ヒ ト抗体の FRとマウス PM - 1抗体の CDRから構成さ れる V鎖の内、 FR領域は、 抗原結合性や中和活性の改善のため、 種 々改変されていても良く、 例えば、 L鎖 V領域については、 国際公 開 W0 92/19759の表 2の 及び R bの行の FR1、 FR2、 FR3及び FR4 に記載されている （パージヨ ン a及びパージヨ ン b と称する） 、 ま た、 H鎖 V領域については、 国際公開 W0 92/19759の表 3の RVH a〜R VH fの行の FR1、 FR2、 FR3及び FR4に記載されている （パージヨ ン a 〜パージヨ ン f と称する） 。
ヒ ト型化 PM - 1抗体の L鎖は、 上に記載した L鎖 V領域とヒ ト抗体 L鎖の定常領域 （C領域） とから成り、 またヒ ト型化 PM-1抗体の H 鎖は、 上に記載した H鎖 V領域とヒ ト抗体 H鎖の定常領域 （C領域 ) とから成る。 L鎖を構成する C領域と しては、 ヒ ト τ/— I C領域が 好ましく、 また H鎖を構成する C領域と しては、 ヒ ト c C領域が好 ま しい。
モノク ローナル抗体の N末端ァミ ノ酸のグルタミンはピログルタ ミル化することが知られており、 本発明のヒ ト型化 PM- 1抗体のサブ タイプ 1及び 2は、 その重鎖の N末端のグルタミ ンがピログルタ ミ ル化されたものであってもよい。 すなわち、 本発明のヒ ト型化 PM-1 抗体のサブタイプ 1及び 2は、 重鎖 N末端のグルタミン （Gin) がピ 口 グルタ ミ ン酸 （pGlu) である抗体サプタイプであってもよい。
こ う して構成されるヒ ト型化 PM-1抗体の L鎖及び H鎖と しては上 記の如く、 FR領域の改変によ り種々のパージヨ ンが存在するが、 特 に好ましい例と して、 配列番号 ： 1 に示すアミ ノ酸配列を有する H 鎖、 及び配列番号 ： 2に示すアミ ノ酸配列を有する L鎖が挙げられ る。
なお、 モノク ローナル抗体 PM- 1の L鎖 V領域をコ一ドする DNAを 含んで成るプラスミ ド pPM- k3を含む大腸菌 E. coli DH5 pPM - k3 は NCIMB 40366と して、 またモノ ク ローナル抗体 PM-1の H鎖 V領域 をコー ドする DNAを含んで成るプラスミ ド pPM- hiを含む大腸菌 E. co li DH5 a pPM-hlは NCIMB 40362と して、 1991年 2月 12日に、 Natio nal Co丄 lections of Industrial and Marine Bacteria Limited ( Ferguson Building, Craibstone Estate , Bucksburn , Aberdeen AB 21 9YA, United Kingdom) にブタペス ト条約に基づき国際寄託され ている。 また、 モノ ク ローナル抗体 PM-1を産生するハイブリ ドーマ PM1は、 FERM BP-2998と して、 1989年 7月 12日に、 独立行政法人産 業技術総合研究所特許生物寄託センター （茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1中央第 6 ) にプタぺス ト条約に基づき国際寄託されている 上記の如きァミ ノ酸配列を有する L鎖又は H鎖をコ一ドする DNA は、 常法に従って構築することが出来る。 具体的には、 マウス抗体 の CDR とヒ ト抗体のフレームワーク領域 (FR; framework region) を連結するように設計した DNA 配列を、 末端部にオーバーラップす る部分を有するよ うに作製した数個のオリ ゴヌクレオチドから PCR 法により合成する。 得られた DNA をヒ ト抗体 C 領域をコ一ドする DN A と連結し、 次いで発現ベクターに組み込んで、 これを宿主に導入 し産生させることによ り得られる （欧州特許出願公開番号 EP 23940 0 、 国際特許出願公開番号 W0 92-19759 参照） 。
CDR を介して連結される ヒ ト抗体の FRは、 相補性決定領域が良好 な抗原結合部位を形成するものが選択される。 必要に応じ、 再構成 ヒ ト抗体の相補 '性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するよ うに 抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミ ノ酸を置換してもよい (Sato, K. et al. , Cancer Res. (1993) 53, 851 - 856) 。 ヒ ト型化抗体には、 ヒ ト抗体 C 領域が使用される。 ヒ ト抗体 C 領 域と しては、 Cyが挙げられ、 例えば、 1、 Cy 2, C y 3 又は C γ 4 を使用することができる。
前記のように構築した抗体遺伝子は、 公知の方法により発現させ 、 取得することができる。 哺乳類細胞の場合、 常用される有用なプ 口モーター、 発現される抗体遺伝子、 その 3'側下流にポリ A シグナ ルを機能的に結合させた DNA あるいはそれを含むベクターにより発 現させることができる。 例えばプロモーター/ェンハンサ一と して は、 ヒ トサイ トメガロ ウィルス前期プロモーター Zェンハンサー （ human cytomegalovirus immediate ear丄 y promoter/ enhancer ) を 挙げることができる。
また、 その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモ ータ一ノェンハンサーとして、 レ トロウイノレス、 ポリオ一マウィル ス、 アデノ ウイノレス、 シミ アンウィルス 40 (SV 40)等のウィルスプ 口モーター Zェンハンサーゃヒ トェロ ンゲーシヨ ンファクター 1 ひ (HEF1 a ) などの哺乳類細胞由来のプロモーター Zェンハンサーを 用いればよい。
例えば、 SV 40 プロモーター/ェンハンサーを使用する場合、 Mu lliganらの方法 (Mulligan, R. C. et al. , Nature (1979) 277, 1 08-114) 、 また、 HEFlo;プロモーター Zェンハンサーを使用する場 合、 Mizushima らの方法 (Mizushima , S. and Nagata , S. Nucleic Acids Res. (1990) 18， 5322 ) に従えば容易に実施することがで きる。
大腸菌の場合、 常用される有用なプロモーター、 抗体分泌のため のシグナル配列、 発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて発現 させることができる。 例えばプロモーターと しては、 lacZプロモ一 ター、 araBプロモーターを挙げるこ とができる。 lacZプロモータ一 を使用する場合、 Wardらの方法 （Ward, E. S. et al. , Nature (19 89) 341, 544-546； Ward, E. S. et al. FASEB J. (1992) 6， 242 2-2427 ) 、 araBプロモーターを使用する場合、 Betterらの方法 （B etter, M. et al. Science (1988) 240, 1041-1043 ) に従えばよ レ、。
抗体分泌のためのシグナル配列と しては、 大腸菌のペリ ブラズム に産生させる場合、 pelBシグナル酉己列 （Lei， S. P. et al J. Bact eriol. (1987) 169, 4379-4383) を使用すればよい。 ペリ プラズム に産生された抗体を分離した後、 抗体の構造を適切にリ フォールド (refold) して使用する （例えば、 W096/30394を参照） 。
複製起源と しては、 SV 40 、 ポリ オ一マウィルス、 アデノ ウィル ス、 ゥシパピローマウィルス （BPV)等の由来のものを用いるこ とが でき、 さらに、 宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、 発現べク タ一は選択マーカーと して、 アミ ノ グリ コシ ドホスホ ト ランスフエ ラーゼ （APH ) 遺伝子、 チミジンキナーゼ （TK) 遺伝子、 大腸菌キ サンチングァニンホスホリ ボシル卜 ランスフェラ一ゼ （Ecogpt) 遺 伝子、 ジヒ ドロ葉酸還元酵素 （dhfr) 遺伝子等を含むこ とができる 本発明で使用される抗体の製造のために、 任意の産生系を使用す ることができる。 抗体製造のための産生系は、 in vitroおよび in V ivo の産生系がある。 in vitroの産生系と しては、 真核細胞を使用 する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
真核細胞を使用する場合、 動物細胞、 植物細胞、 又は真菌細胞を 用いる産生系がある。 動物細胞と しては、 （1) 哺乳類細胞、 例えば 、 CH0 、 COS 、 ミエローマ、 BHK (baby hamster kidney) 、 He 、 Veroなど、 （2) 両生類細胞、 例え ίま、、 アフ リ カッメガエル卵母細胞 、 あるいは（3) 昆虫細胞、 例えば、 sf9 、 sf21、 Tn5 などが知られ ている。 植物細胞としては、 ニコチアナ ' タパクム （Nicotiana ta bacum)由来の細胞が知られており、 これをカルス培養すればよい。 真菌細胞としては、 酵母、 例えば、 サッカロ ミ セス （Saccharomyce s)属、 例えばサッカロミセス · セレビシェ (Saccharomyces cerevi siae) 、 糸状菌、 例えばァスペルギノレス属 （Aspergillus)属、 例え ばアスペスレギノレス · 二ガー (Aspergillus niger ) など力 S知られて いる。
原核細胞を使用する場合、 細菌細胞を用いる産生系がある。 細菌 細胞と しては、 大腸菌 （E. coli)、 拈草菌が知られている。
これらの細胞に、 目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し 、 形質転換された細胞を in vitroで培養することによ り抗体が得ら れる。 培養は、 公知の方法に従い行う 。 例えば、 培養液と して、 DM EM、 MEM 、 RPMI1640, IMDMを使用する こ とができ、 牛胎児血清 （FC S ) 等の血清補液を併用することもできる。 また、 抗体遺伝子を導 入した細胞を動物の腹腔等へ移すこと によ り、 in vivo にて抗体を 産生してもよい。
一方、 in vivo の産生系と しては、 動物を使用する産生系や植物 を使用する産生系が挙げられる。 動物を使用する場合、 哺乳類動物 、 昆虫を用いる産生系などがある。
哺乳類動物としては、 ャギ、 ブタ、 ヒッジ、 マウス、 ゥシなどを 用いることができる （Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology App lications, 1993)。 また、 昆虫と しては、 カイコを用いることがで きる。 植物を使用する場合、 例えばタバコを用いることができる。
これらの動物又は植物に抗体遺伝子を導入し、 動物又は植物の体 内で抗体を産生させ、 回収する。 例えば、 抗体遺伝子をャギ カゼ イ ンのよ うな乳汁中に固有に産生される蛋白質をコー ドする遺伝子 の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。 抗体遺伝子が挿入さ れた融合遺伝子を含む DNA 断片をャギの胚へ注入し、 この胚を雌の ャギへ導入する。 胚を受容したャギから生まれる ト ラ ンスジェニッ クャギ又はその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。 トラン スジ ニックャギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加さ せるために、 適宜ホルモンを トランスジエニックャギに使用しても よい （Ebert, K. M. et al. , Bio/Technology (1994) 12， 699 - 702 ) 。
また、 カイコを用いる場合、 目的の抗体遺伝子を挿入したパキュ ロウィルスをカイコに感染させ、 このカイコの体液よ り所望の抗体 を得る (Maeda, S. et al. , Nature (1985) 315， 592-594) 0 さ ら に、 タバコを用いる場合、 目的の抗体遺伝子を植物発現用ベクター 、 例えば ρΜΟΝ 530に挿入し、 このべク ターを Agrobacterium tumefa ciens のようなパクテリアに導入する。 このパクテリ アをタバコ、 例えば Nicotiana tabacum に感染させ、 本タノ コの葉よ り所望の抗 体を得る (Julian, K. - Ma et al. , Eur. J. Immunol. (1994) 2 4, 131-138) 。
上述のように in vitro又は in vivo の産生系にて抗体を産生する 場合、 抗体重鎖 （H鎖） 又は軽鎖 （L鎖） をコー ドする DNA を別々 に発現べクターに組み込んで宿主を同時形質転換させてもよいし、 あるいは H鎖および L鎖をコードする DNA を単一の発現ベクターに 組み込んで、 宿主を形質転換させてもよい （国際特許出願公開番号 W0 94-11523 参照） 。
本発明のヒ ト型化 PM-1抗体のサブタイプ 1及び 2を製造するには 、 宿主として動物の培養細胞、 特に好ましく は CH0細胞を使用し、 それを動物細胞培養用培地で培養するのが好ましい。 また、 タ ンパ ク質の加水分解物であるペプトンを含む培地が好ましく、 牛肉、 豚 肉、 大豆、 米、 魚肉などに由来するペプトンが使用される。 一般に 動物由来ペプトンで発現効果が高く、 また魚肉 （例えば、 カツォ） に由来するペプトンを用いると発現量に効果がある。 この場合、 哺 乳動物性ぺプトンを含む培地を用いてヒ ト型化 PM-1抗体を製造する 場合、 サブタイプ 1及び 2の生成が殆ど見られず、 魚肉由来ぺプト ンゃ植物性ぺプトンなどを含む培地を用いてヒ ト型ィ匕 PM- 1抗体を製 造する場合、 サブタイプ 1及び 2の比率が高くなる。 従って、 本発 明のヒ ト型化 PM-1抗体のサブタイプ 1又は 2を製造するには、 宿主 として動物の培養細胞、 特に好ましくは CH0細胞を使用し、 それを 魚肉由来ペプトンや植物由来ペプトンを含む培地で培養するのが特 に好ましい。
前記のように産生、 発現された抗体は、 細胞内外、 宿主から分離 し均一にまで精製することができる。 本発明で使用される抗体の分 離、 精製はァフィ二ティークロマ トグラフィーによ り 行う ことがで きる。 ァフィ二ティークロマ トグラフィ一に用いる力 ラムと しては 、 例えば、 プロテイン A カラム、 プロテイ ン G カラムが挙げられる 。 プロテイン A カラムに用いる担体として、 例えば、 Hype r D 、 P0 R0S 、 Sepharo s e F. F.等が挙げられる。 その他、 通常のタンパク質 で使用されている分離、 精製方法を使用すればよく、 何ら限定され るものではない。
また、 上記ァフィ二ティークロマ トグラフィー以外のク ロマ トグ ラ フィー、 例えば、 一般のカラムク ロマトグラフィー、 例えばィォ ン交換クロマ トグラフィー、 疎水クロマ トグラフィー、 ヒ ドロキシ ァパタイ トクロマ トグラフィー、 ゲルろ過クロマ トグラフィーなど の組み合わせによって行う ことが出来る。
更に、 フィルター、 限外濾過、 塩析、 透析等を適宜選択、 組み合 わせれば、 本発明で使用される抗体を分離、 精製する ことができる 。 これらのクロマ 卜グラフィーは FPLC (Fast protein liquid chro matography 或は HPLC (High performance liquid chromatography ) に適用し得る。 また、 逆相 HPLC (reverse phase HPLC) を用いて もよい。
上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又は ELISA 等によ り行う ことができる。 すなわち、 吸光度の測定による場合には、 PB S (-)で適当に希釈した後、 280 nmの吸光度を測定し、 1 mg/mL を約 1.35 0D と して算出する。 また、 ELISA による場合は以下のよ うに 測定することができる。 すなわち、 0.1M重炭酸緩衝液 （pH9.6 ) で 1 μ g /mLに希釈したャギ抗ヒ ト IgG (TAG製） 100/zLを 96穴プレー ト （Nunc製） に加え、 4 °Cでー晚イ ンキュベーショ ンし、 抗体を固 相化する。 ブロ ッキングの後、 適宜希釈した本発明で使用される抗 体又は抗体を含むサンプル、 あるいは標品と してヒ ト IgG (CAPPEL 製） 100 / Lを添加し、 室温にて 1時間ィンキュベーショ ンする 。
洗浄後、 5000倍希釈したアル力リ フォスファターゼ標識抗ヒ ト Ig G (BIO SOURCE製） lOO/zLを加え、 室温にて 1時間イ ンキュベー トする。 洗浄後、 基質溶液を加えイ ンキュベーショ ンの後、 MICR0P LATE READER Model 3550 (Bio - Rad 製） を用レヽて 405mn での吸光度 を測定し、 目的の抗体の濃度を算出する。
本願発明のヒ ト型化 PM-1抗体のサブタイプは、 生来のヒ ト型化 P M-1抗体と実質的に同じ抗原結合性を有するため、 生来のヒ ト 型化 P M-1抗体と同様に IL-6が関連する各種の疾患の治療または予防のた めに用いることが出来る。 IL- 6関連疾患の例としては、 急性、 慢性 炎症性疾患、 自己免疫疾患、 例えば、 腎炎、 メサンギユウム増殖性 腎炎、 クローン病、 潰瘍性大腸炎、 膝炎、 小児慢性関節炎、 または 全身型若年性特発性関節炎、 血管炎、 川崎病、 関節リ ウマチ、 全身 性エリテマ トーデス、 乾癬、 シヱーダレン症候群、 成人スチ /レ病 ； 腫瘍性疾患、 例えば、 多発性骨髄腫、 キヤ ッスルマン病、 悪性リ ン パ腫、 腎癌 ； 感染症、 例えば、 HIV感染症、 EBV感染症 ；悪液質 ； そ の他、 プラズマサイ ト一シス、 高ィムノグロブリ ン症、 貧血などが あげられ、 好ましくは、 慢性関節リ ウマチ、 プラズマサイ ト一シス 、 高ィ ムノグロプリ ン症、 貧血、 腎炎、 悪液質、 多発性骨髄腫、 キ ャッスルマン病、 メサンギユウム増殖性腎炎、 全身性エリテマトー デス、 ク ローン病、 膝炎、 乾癬、 小児慢性関節炎、 または全身型若 年性突発性関節炎である。
本発明の医薬組成物は、 経口的にまたは非経口的に全身あるいは 局所的に投与することができる。 例えば、 点滴などの静脈内注射、 筋肉内注射、 胸腔内注射、 腹腔内注射、 皮下注射、 坐薬、 注腸、 経 口性腸溶剤などを選択するこ とができ、 患者の年齢、 症状により適 宜投与方法を選択することができる。 有効投与量は、 一回につき体 重 1 kgあたり 0. 01 mg から 100 mgの範囲で選ばれる。 あるいは、 患 者あたり 1 〜1000 mg 、 好ましく は 5〜50mg の投与量を選ぶこと ができる。
好ましい投与量、 投与方法は、 たとえば抗 IL- 6レセプター抗体の 場合には、 血中にフ リ一の抗体が存在する程度の量が有効投与量で あり、 具体的な例と しては、 体重 1 kgあたり 1 ヶ月 （ 4週間） に 0. 5 mgから 40mg、 好ましくは 1 mgから 20mgを 1 回から数回に分けて、 例えば 2回/週、 1回/週、 1回 Z 2週、 1回 / 4週などの投与ス ケジュールで点滴などの静脈内注射、 皮下注射などの方法で、 投与 する方法などである。 投与スケジュールは、 病状の観察および血液 検査値の動向を観察しながら 2回/週あるいは 1回/週から 1回 Z 2週、 1 回 / 3週、 1回 / 4週のよ うに投与間隔を延ばしていくな ど調整することも可能である。
本発明の医薬組成物は、 投与経路次第で医薬的に許容される担体 や添加物を共に含むものであってもよい。 このような担体および添 加物の例と して、 水、 医薬的に許容される無機塩、 医薬的に許容さ れる有機溶媒、 コラーゲン、 ポリ ビュルアルコール、 ポリ ビュルピ ロ リ ドン、 カノレポキシビニノレポリ マー、 カノレポキシメチノレセノレロー スナ ト リ ウム、 ポリ アク リル酸ナ ト リ ウム、 アルギン酸ナ ト リ ウム 、 水溶性デキス トラン、 カルボキシメチルスターチナト リ ゥム、 ぺ クチン、 メ チノレセノレロース、 ェチノレセノレロース、 キサンタンガム、 アラ ビアゴム、 カゼイ ン、 ゼラチン、 寒天、 ジグリ セ リ ン、 プロ ピ レングリ コ一ノレ、 ポリ エチレングリ コーノレ、 ワセ リ ン、 パラフィ ン
、 ステア リ ルアルコール、 ステア リ ン酸、 ヒ ト血清アルブミ ン （HS A ) 、 マンニ トール、 ソルビ トール、 ラク トース、 医薬添加物と し て許容される界面活性剤などが挙げられる。 使用される添加物は、 剤型に応じて上記の中から適宜あるいは組合せて選択されるが、 こ れらに限定されるものではない。 実施例
以下、 実施例および参考例によ り本発明を具体的に説明するが、. 本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例 1. 生来のヒ ト型化 PM-1抗体/サブタイプ 1 /サブタイプ 2を含む抗体組成物の発現
発現細胞の構築
( 1 ) ヒ ト IL - 6レセプター抗体 PM - 1の調製
Hirataらの方法 （J. Immunol.， 143： 2900-2906， 1989) によ り作成 した抗 IL- 6R抗体 MT18を CNBrによ り活性化させたセファ ロース 4B (P harmacia Fine Chemicals製、 Piscataway,NJ) と添付の処方にした がって結合させ、 IL - 6R (Yamasakiら、 Science 241:825-828,1988 ) を精製した。 すなわち、 ヒ ト ミエロ一マ細胞株 U266を 1 %ジギトニン （Wako C hemicals製） 、 10 mMト リエタノールァミ ン （pH 7.8) および 0.15 M NaClを含む I mM p—パラアミ ノ フエ二ルメ タ ンスルフォニルフ ルォライ ドハイ ドロクロ リ ド （Wako Chemicals製） （ジギトニン緩 衝液） で可溶化し、 セファロース 4 Bビーズと結合させた MT18抗体 と混合した。 その後、 ビーズをジギトニン緩衝液で 6回洗浄し、 免 疫に用いる部分精製 Iい 6Rと した。
BALB/cマゥスを 3X109個の U266細胞から得た上記部分精製 IL- 6R で 10日おきに 4回免疫し、 その後常法によりハイブイ ドーマを作成 した。 成長陽性ゥエルからのハイプリ ドーマ培養上清を下記の方法 にて IL-6Rへの結合活性を調べた。 5X107個の U266細胞を 35S—メチ ォニン （2.5 mCi) で標識し、 上記ジギトニン緩衝液で可溶化した 可溶化した U266細胞を 0.04mL容量のセフ了ロース 4Bビーズと結合 させた MT18抗体と混合し、 その後、 ジギトニン緩衝液で 6回洗浄し 、 0.25 mLのジギトニン緩衝液 （pH 3.4) により 3 5 S—メチォ- ン標識 IL-6Rを流出させ、 0.025 mLの 1M Tris (pH 7,4) で中和した 。 0.05 mLのハイブリ ドーマ培養上清を 0.01 mLの ProteinGセファ ロ ース （Phramacia製） と混合した。
洗浄した後、 セファロースを上記で調製した 0.005 mLの35 S標識 I L-6R溶液と ともにィンキュベー トした。 免疫沈降物質を SDS-PAGEで 分析し、 Iい 6Rと反応するハイプリ ドーマ培養上清を調べた。 その 結果、 反応陽性ハイブリ ドーマクローン PM-1を樹立した。 ハイプリ ドーマ PM-1から産生される IL- 6R抗体 PM-1は、 IgGl κ型のサブタイ プを有する。
ハイプリ ドーマ PM-1が産生する抗体のヒ ト IL-6Rに対する IL-6の 結合阻害活性をヒ ト ミエロ一マ細胞株 U266を用いて調べた。 ヒ ト組 換え型 IL- 6を大腸菌より調製し （Hiranoら、 Immuno l . Let t. , 17 : 41 , 1988) 、 ボノレ ト ン一ノヽンター試薬 ( New England Nucl ear , Bos t on. M A) によ り 1 2 5 I標識した （Tagaら、 J. Exp. Med. 166： 967， 1987) 。 4 X 105個の U266細胞を、 100倍量の過剰な非標識 I L- 6の存在下で室温 にて、 1時間、 70 % (v/v) のハイプリ ドーマ PM- 1の培養 清及び 1 4000CPM の1 2 5 I標識 IL - 6と ともに培養した。 70 /z Lのサン °ノレを 400 μ Lのマイク口フュージポリエチレンチューブに入れた 300 /I Lの FCS 上に重層し、 遠心の後、 細胞上の放射活性を測定した。 その結果、 ハイプリ ドーマ ΡΜ- 1が産生する抗体は、 IL-6の IL- 6Rに対 1 "る結合 を阻害することが明らかとなった。
( 2 ) ヒ ト型化抗体 hPM-1の作成
国際特許出願公開番号 W092/19759号公報の実施例 10に記纖された ヒ トェロンゲーシヨ ンファクター I ひプロモーターを利用 I、 特開 平 8- 99902号公報の参考例 2に記載された方法に準じて、 し 鎖およ び Η鎖両遺伝子を含む単一の発現べクターを作成し、 この 現ベタ ターを CH0細胞に挿入することによ り作製したヒ ト型化 ΡΜ- 1抗体 （ 抗ヒ ト IL- 6レセプター抗体） を産生する CH0細胞株を用い 試験し た。 得られたヒ ト型化抗体のヒ ト Iい 6Rへの結合能は ELI SA &こて確認 した。 さらに、 hPM - 1はマウス抗体およびキメラ抗体と同擴に、 ヒ ト IL-6のヒ ト IL-6Rへの結合を阻害した。
細胞培養とヒ ト型化 PM-1抗体の発現
大量のヒ ト型化 PM-1抗体を得るために、 発現細胞を市販 無血清 培地またはその改変培地で培養した。 培養条件は、 一般に CH0細胞 の培養に適した環境で行った。 培地中には目的抗体の発現 Λを増や すため、 種々の添加物を加えることが可能であった。 その で、 各 種ペプトンは一般に広く用いられている。 牛肉、 豚肉、 犬: S、 米、 魚肉などに由来するペプトンが広く市販されているが、 そ 効果は 細胞株との相性による。 一般に動物由来ぺプト ンで発現効果が高い 。 各種ペプトンによる効果を調べる過程で、 魚肉 （カツォ） に由来 するペプトンを用いると発現量に効果があることがわかった。
発現された抗体の精製は、 一般的なカラムク 口マ トグラフィ ー、 例えばァフィ二ティークロマ トグラフィー、 イオン交換クロマ トグ ラフィー、 疎水ク ロマ トグラフィー、 ヒ ドロキシアパタイ トクロマ トグラフィー、 ゲルろ過クロマ トグラフィーなどの組み合わせによ つて行った。 魚肉に由来するぺプトンを用いて CH0細胞を培養して 発現されたヒ ト型化 PM-1抗体の分子種に、 牛肉由来ペプ ト ンを用い た時には僅かしか見られない分子種が見られた。 この分子種は、 植 物由来ペプトンを用いた場合にも見られた。
実施例 2 . ヒ ト型化 PM-1抗体サブタイプ 1及びサブタイプ 2の 分析
材料および方法
試料と して、 ヒ ト型化 PM - 1抗体の生来型 （Mainと称する場合があ る） 、 当該抗体のサブタイプ 1及びサブタイプ 2、 並びに比較標準 ペプチ ドと して、 ヒ ト型化 PM-1抗体の C-末端に存在し、 C-末端の G1 yが除去されたペプチド Ser- Leu- Ser- Leu- Ser- Pro ( SLSLSP) 及びそ の C-末端 Proがアミ ド化されたペプチド SLSLSP-NH2を使用した。 ぺ プチド SLSLSP及びアミ ド化ペプチド SLSLSP- NH2は化学合成した。 ヒ ト型化 PM- 1抗体 Ma in, 当該抗体のサブタイプ 1及びサブタイプ 2 は、 実施例 1で得たヒ ト型化 PM-1抗体を、 下記の方法で、 カラムク 口マ トグラフィ一によ り分取、 精製することによ り得た。
カラムとして Po ly LC 製 Po ly CAT A ( 100 X 4. 6 mm) , ガードカ ラムと して Po ly LC 製 Po ly CAT A Jave l in guard ( 10 X 4. 0 mm)を 使用した。 移動相として、 移動相 A ( 0. 05% NaN3を含む pH 6. 1の 2 5 mM 2- [N-モルホ リ ノ ]エタンスルホン酸緩衝液） 及び移動相 B ( 2 50 mM 酢酸ナト リ ウムと 0. 05% NaN3を含む pH 6.. 1の 25 mM 2- [N_モ ルホリ ノ ]エタンスルホン酸緩衝液） を使用した。 グラジェント条 件は、 移動相 Bの比率を、 0分/ 35%、 5分/ 35 %、 59分/ 60 %、 60 分/ 100%とした。 流速を l mL/分と し、 280nmにおける紫外可視吸光 度により検出した。
ヒ ト型化 PM- 1抗体 Main、 サブタイプ 1及びサブタイプ 2 の酵素 消化
200 / g相当量のヒ ト型化 PM- 1抗体 Main、 サブタイプ 1及びサブ タイプ 2を、 それぞれ簡易限外濾過カー トリ ッジ （ミニセン ト， 東 ソー製） に入れ、 変性剤溶液 ( 7 M グァニジン、 1 mM エチレンジ ァミ ン四酢酸を含む pH 8. 3の 100 mM 2-ァ ミ ノ - 2-ヒ ドロ キシメチ ル- 1，3-プロパンジオール -塩酸緩衝液） を加えて液量を 500 と した。 カート リ ッジを 5°Cで遠心し、 液量を約 50 At Lと した。 マイ クロチューブに試料を回収し、 変性剤溶液 （前記と同一組成） を加 え全量を 300 μ Lと した。
各溶液に DTT溶液 （162 mMジチオス レィ トールを含む変性剤溶液） 50 Lを加えへッ ドスペースを N2置換し、 恒温ブロ ック中 37°Cで 1時 間放置した。 さらに、 IAA溶液 （417 mMョー ド酢酸を含む 0. 2 N水酸 化ナト リ ウム溶液） 45 μ ίを加え、 遮光下 37°Cで 30分間放置した。 反応液を回収し、 それぞれの試料について、 透析チューブを用いて Tr i s- HC1緩衝液 （ 2 M尿素を含む pH 8. 0の 100 mM 2-ァミ ノ - 2-ヒ ド 口キシメチル- 1，3 -プ口パンジオール -塩酸緩衝液） 500 mLに対し 、 5°Cで約 20時間透析 （透析膜 ： m. w. = 8000, スペク ト ラム製） を 行なった。 透析した試料を回収し、 それぞれに ト リ プシン溶液 （ト リ ブシンを Tr is-HCl緩衝液 （前記と同じ組成） に溶解し 250 ng/ μ L とする） を 20 /z L加え、 37 °Cで 16時間放置した。
ト リ プシ 理物及び比較標準べプチ ド^析 上記の通り ト リ プシン処理した試料 40 /zLを液体クロマ トグラフ - 質量分析 （LC- MS/MS) 測定に供した。 標準ペプチド溶液、 即ち、 SLSLSP溶液 （SLSLSPを水に溶解し 4 μ Μとする） 及び SLSLSP- ΝΗ2溶 液 （SLSLSP-NH2を水に溶解し 4 μΜとする） については、 50 μ を 液体ク口マ トグラフ -質量分析に供した。
液体クロマ トグラフ条件は次の通り と した。 即ち、 カラムとして ヮイエムシィ製 YMC- Pack 0DS (250X2.0 mm、 5 m、 300A )を使用 した。 移動相と して、 移動相 A (0· 1%ト リ フルォロ酢酸を含む 5%ァ セ トニ ト リ ル溶液） 及び移動相 Β (0.1%ト リ フルォロ酢酸を含む 95 %ァセ トニ ト リ ル溶液） を使用した。 グラジェン ト条件は、 移動相 Βの比率を、 0分/ 0 %、 10分/ 0 %、 120分/ 35%、 140分/ 35%と し た。 流速を 0.2 mL/分とし、 215 nmにおける紫外可視吸光度によ り 検出を行なった。
ト リ プシン処理物及び比較標準ぺプチドの分析結果
( 1 ) 比較標準ペプチド断片の測定
( a ) ペプチド断片 SLSLSPの測定
図 1〜図 3は、 ぺプチド断片 SLSLSPの液体ク 口マ トグラフ (LC) -質量分析 （MS) 結果を示す。 図 1の上段は 215nmの紫外線で検出 したクロマ トグラムを示し、 下段はベースピーククロマトグラムを 示す。 図 2はマススぺク トルを示し、 そして図 3はズームスキャ ン スペク トルを示す。 得られた分子量 （602.2) は、 理論値 （602.3 ; モノアイ ソ ト ピック分子量） とほぼ一致した （図 2及び図 3 ) 。
( b ) ペプチ ド断片 SLSLSP- NH2の測定
図 4〜 6は、 ぺプチ ド断片 SLSLSP- NH2の液体ク 口マ トグラフ (LC ) -質量分析 （MS) 結果を示す。 図 4の上段は 215nmの紫外線で検 出したクロマ トグラムを示し、 下段はベースピーククロマ トグラム を示す。 図 5はマススぺク トルを示し、 そして図 6はズームスキヤ ンスぺク トルを示す。 得られた分子量 （601. 2) は、 理論値 （601. 3 ； モノアイ ソ トピック分子量） とほぼ一致した （図 5及び図 6 ) 。
( c ) ペプチド断片 SLSLSPと SLSLSP- NH2の混合の測定
図 7〜 9は、 ペプチ ド断片 SLSLSPと SLSLSP- NH2の混合溶液の、 液 体ク ロマ トグラフ （LC) -質量分析 （MS) 結果を示す。 図 7の上段 は 215nmの紫外線で検出したクロマ トグラムを示し、 下段はベース ピークク ロマ トグラムを示す。 図 8は、 図 7における保持時間 44分 でのピークのマススぺク トルを示し、 そして図 9は、 図 7における 保持時間 51分でのピークのマススぺク トルを示す。 両ペプチド断片 は上記の液体クロマ トグラフィーの条件で完全に分離された。
( 2 ) ヒ ト型化 PM- 1抗体の H鎖 C末端構造の解析
( a ) ヒ ト型化 PM- 1抗体 （Main) の H鎖 C末端構造の解析
図 10の Aにヒ ト型化 PM - 1抗体 （Main) を還元/力ルポキシメチル 化し、 ト リ プシン消化したペプチドのペプチ ドマップを示す。 H鎖 C末端断片の構造を調べるため、 図 10の Bにおいて SLSLSPG (m/z 6 60. 3 ± 0. 5における選択的モニタリ ング） の、 図 10の Cにおいて SLS LSP-NH2 (m/z 602. 3 ± 0. 5における選択的モニタリ ング） の、 そし て図 10の Dにおいて SLSLSP (m/z 603. 3土 0· 5における選択的モニタ リ ング） の分子量についての MSクロマ トグラムを示す。 SLSLSPGに 相当するピークが 49. 7 分に検出されたが、 SLSLSP-NH2及び SLSLSP の分子量を持つぺプチ ドフラグメ ントは存在しなかった。
図 11〜図 13は、 ヒ ト型化 PM- 1抗体 （Main) を還元/力ルポキシメ チル化し、 ト リ プシン消化したぺプチドの LC- MS/MS分析の結果を示 す。 図 11の上段は 215nmの紫外線で検出したクロマ トグラムを示し 、 下段はベースピーククロマ トグラムを示す。 図 12は、 図 11におけ る保持時間 50分でのピ クのマススぺク トルを示し、 そして図 13は 、 図 11と同じピークのズームスキャ ンスペク トルを示す。 これらの 結果から、 検出されたピークはァミノ酸配列 SLSLSPGを持つ事が示 された。 従って、 ヒ ト型化 PM- 1抗体 （Main) の両方の H鎖 C末端 は -SLSLSPG酉己列を持つ事が示された。
( b ) ヒ ト型化 PM- 1抗体サブタイプ 1の H鎖 C末端構造の解析 図 14の Aにヒ ト型化 PM-1抗体サブタイプ 1 を還元/力ルポキシメ チル化し、 ト リ プシン消化したぺプチドのぺプチドマップを示す。 H鎖 C末端断片の構造を調べるため、 図 14の Bにおいて SLSLSPG (m /z 660. 3土 0. 5における選択的モニタリ ング） の、 図 14の Cにおい て SLSLSP_NH2 ( m/z 602· 3 ± 0· 5における選択的モニタ リ ング） の、 そして図 14の Dにおいて SLSLSP (m/z 603. 3 ± 0. 5における選択的モ ニタ リ ング） の分子量についての MSクロマ トグラムを示す。 SLSLSP Gに相当するピークが 47. 7 minに検出されたのに加え、 SLSLSP_NH2 に相当するピークも 46. 2 minに認められた。 （図 14の Dにおいて分 子量 603. 3のピークが 46 min付近に認められたが、 保持時間から SLS LSPではない。 ）
図 15〜図 17は、 ヒ ト型化 PM-1抗体サブタイプ 1 を還元/力ルポキ シメチル化し、 ト リ プシン消化したぺプチドの LC-MS/MS分析の結果
(図 14の Bのピークについて） を示す。 図 15の上段は 215nmの紫外 線で検出したク ロマ トグラムを示し、 下段はベースピーククロマ ト グラムを示す。 図 16は、 図 15における保持時間 48分でのピークのマ ススぺク トルを示し、 そして図 17は、 図 16と同じピークのズームス キャンスぺク トルを示す。
図 18〜図 20は、 ヒ ト型化 PM- 1抗体サブタイプ 1 を還元/力ルボキ シメチル化し、 ト リ プシン消化したべプチ ドの LC-MS/MS分析の結果
(図 14の Cのピークについて） を示す。 図 18の上段は 215nmの紫外 線で検出したク ロマ トグラムを示し、 下段はベースピーククロマ ト グラムを示す。 図 19は、 図 18における保持時間 46分でのピークのマ ススぺク トルを示し、 そして図 20は、 図 19と同じピークのズームス キャンスぺク トルを示す。
これらの結果から、 検出されたピークはァミ ノ酸配列 SLSLSPG及 び SLSLSP-NH2を持つ事が示された。 従って、 ヒ ト型化 PM - 1抗体サブ タイプ 1の H鎖 C末端の一方は- SLSLSPG、 もう一方は- SLSLSP-腿 2 配列を持つ事が示された。
( c ) ヒ ト型化 PM-1抗体サブタイプ 2の H鎖 C末端構造の解析 図 21の Aにヒ ト型化 PM - 1抗体サブタイプ 2を還元/カルボキシメ チル化し、 ト リ プシン消化したべプチ ドのぺプチドマップを示す。 H鎖 C末端断片の構造を調べるため、 図 21の Bにおいて SLSLSPG ( m /z 660. 3 ± 0· 5における選択的モニタ リ ング） の、 図 21の Cにおい て SLSLSP-NH2 ( m/z 602. 3土 0. 5における選択的モニタリ ング） の、 そして図 21の Dにおいて SLSLSP ( m/z 603. 3 ± 0. 5における選択的モ ユタ リ ング） の分子量についての MSクロマ トグラムを示す。 SLSLSP Gに相当するピークが僅かに検出されたが、 SLSLSP- NH2に相当する ピークがよ り強く検出された。 （図 26の Dにおいて分子量 603. 3の ピークが 45分付近に認められたが、 保持時間から考えて SLSLSPでは ない。 ）
図 22〜図 24は、 ヒ ト型化 PM-1抗体サブタイプ 2を還元/カルボキ シメチル化し、 ト リ プシン消化したべプチドの LC-MS/MS分析の結果 を示す。 図 22の上段は 215nmの紫外線で検出したクロマ トグラムを 示し、 下段はベースピーククロマ トグラムを示す。 図 23は、 図 22に おける保持時間 45分でのピークのマススぺク トルを示し、 そして図 24は、 図 23と同じピークのズームスキャンスペク トルを示す。 これ らの結果から、 検出されたピークはァミノ酸配列 SLSLSP-NH2を持つ 事が示された。 従って、 ヒ ト型化 PM - 1抗体サブタイプ 2の両方の H 鎖 C末端は -SLSLSP- NH2配列を持つ事が示された。 実施例 3. ヒ ト型化 PM_1抗体サブタイプ 1及びサブタイプ 2の 生物活性の測定
( 1 ) IL-6受容体結合活性の測定
( a ) 測定方法
測定方法は、 下記の工程によ り行なった。
1) pH 9.6の炭酸ナト リ ゥム緩衝液を用いて 5
Figure imgf000028_0001
に希釈した 抗 IL - 6 レセプター抗体を， ィ ムノ プレー トの各ゥエルに 100 /zLず つ添加し， 1晚以上冷所で放置する。
2) 各ゥエルを 0.05%ポリ ソルベート 20を含むリ ン酸緩衝生理食塩 水 （以後 RB) 300 / Lで 3回洗浄する。
3) 各ゥエルに 1%の牛血清アルブミ ンを含む pH 8.1のト リス塩酸 緩衝液 （以後 DB) 200 しを加え， 室温で 2時間以上放置する。
4) ゥエル内の溶液を捨てた後， DBを用いて 0.1 g/mLに希釈し た可溶性 IL-6受容体 100 しを各ゥエルに添加し， 室温で 2時間放置 する。
5) 各ゥエルを RB 300 しで 3回洗浄する。
6) 一定のピオチン化 MRAを含む DBを用いて段階希釈した試料溶液 100 iiLを各ゥエルに添加し， 室温で 1時間放置する。
7) 各ゥエルを RB 300 ずつで 3回洗浄する。
8) DBを用いて 0.5 μ g/mLに希釈したアルカ リ フォスファターゼ 標識ス ト レプ トアビジン 100 を各ゥエルに添加し， 室温で 1時間 放置する。
9) ィ ムノ プレー トの各ゥエルを RB 300 Lで 5回洗浄する。
10) 発色試薬 （SIGMA FAST p-Nitrophenyl Phosphate) を水で溶 解し， 各ゥエルに 100 し添加し， 室温で 30分間放置する。
11) 各ゥエルの反応液の 405 nmにおける吸光度と 655nmにおける 吸収度の差を求める。 12) 得られた吸光度から， 平行線検定法 （3+3) によ り各試料溶 液の結合活性を算出する。
( b ) .
結果を下記の表 1 に示す。
表 1
ヒ ト型化 PM-1抗体サブタイプの抗原結合性
Figure imgf000029_0001
表 1の結果から、 ヒ ト型化 PM-1抗体 （Main) 、 サブタイプ 1、 お よびサブタイプ 2は、 実質的に同じ抗原結合性をしめすことが明ら かである。
( 2 ) KT- 3細胞増殖阻害
( a ) 測定方法
測定方法は下記の工程によ り行なった。
1) マイクロプレートの各ゥエルに， RPMI培地で 2 ng/mLに希釈し た IL- 6溶液 50 しを添加した後， RPMI培地で段階希釈した試料溶液 を 50 加える。 なお， ブランクのゥエルには RPMI培地 50 を加 える。
2) 更に， 各ゥエルに RPMI培地を用いて 5X104 cells/mUこ調整し た KT-3細胞浮遊液を 100 /^L添加し， C02インキュベーター内で 3日 間培養する。
3) 各ゥエルに， RPMI培地で適当に希釈した3 H-チミ ジン溶液 50 iLを添加し， C02ィンキュベータ一内で 6時間培養する。
4) マイクロプレー ト内の細胞を， セルハーべスターを用いてガ ラスフィルター上に捕集する。 5 ) ガラスフィルターを電子レンジを用いて 10分間乾燥した後， ホッ トプレー ト等で加熱しながら固形シンチレーターをガラスフィ ルターに染み込ませる。
6 ) 液体シンチレーシヨ ンカウンターを用いて放射活性 （cpm) を 測定する。
7 ) 得られた放射活性から， 平行線検定法 （4+4) によ り各試料溶 液の生物活性を算出する。
結果を下記の表 2に示す。
表 2
ヒ ト型化 PM-1抗体サブタイプの細胞増殖阻害活性
Figure imgf000030_0001
表 2の結果から、 ヒ ト型化 PM-1抗体 （Main) 、 サブタイプ 1、 お よびサブタイプ 2は、 実質的に同じ細胞増殖阻害活性を示すことが 明らかである。

Claims

1. イ ンターロイキン- 6受容体 （IL- 6R) に対するヒ ト型化 PM - 1 抗体のサブタイプであって、 片方の重鎖 C末端が Pro-NH2 (447) で ある抗体サブタイプ （ 1 ) 。
2. イ ンターロイキン- 6受容体 （IL-6R) に対するヒ ト型化 PM- 1 言
抗体のサブタイプであって、 両方の重鎖 C末端が Pro-NH2 (447) で ある抗体サブタイプ （ 2 ) 。
3. 請求項 1又は 2に記載のサのブタイプに対応する ヒ ト型化 PM-1 抗体の生来型の重鎖が、 配列番号 ： 1 に記載のアミノ酸配列を有す る、 請求項 1又は 2に記載の抗体サブタイ囲プ。
4. 重鎖 N末端のグルタ ミ ン （Gin) がピログルタミ ン酸 （pGlu) である、 請求項 3に記載の抗体サブタイプ。
5. 前記ヒ ト型化 PM - 1抗体サブタイプの軽鎖が、 配列番号 ：' 2に 記載のァミ ノ酸配列を有する、 請求項 1〜 4のいずれか 1項に記载 の抗体サブタイプ。
6. 請求項 1〜 5のいずれか 1項に記載の、 サブタイプ （ 1 ) も しく はサブタイプ ( 2 ) 、 又はサブタイプ ( 1 ) 及び （ 2 ) の両者 を含んで成る医薬組成物。
PCT/JP2005/006229 2004-03-24 2005-03-24 インターロイキン－６受容体に対するヒト型化抗体のサブタイプ WO2005090405A1 (ja)

Priority Applications (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10/593,786 US8398980B2 (en) 2004-03-24 2005-03-24 Subtypes of humanized antibody against interleuken-6 receptor
EP05727379A EP1728801A4 (en) 2004-03-24 2005-03-24 SUBTYP OF A HUMANIZED ANTIBODY AGAINST THE INTERLEUKIN-6 RECEPTOR
JP2006511350A JPWO2005090405A1 (ja) 2004-03-24 2005-03-24 インターロイキン−６受容体に対するヒト型化抗体のサブタイプ
EP20180347.5A EP3736295A1 (en) 2004-03-24 2005-03-24 Subtypes of humanized antibody against interleukin-6 receptor
US13/722,919 US8734800B2 (en) 2004-03-24 2012-12-20 Subtypes of humanized antibody against interleukin-6 receptor
US14/252,648 US20140377254A1 (en) 2004-03-24 2014-04-14 Subtypes of humanized antibody against interleukin-6 receptor
US14/836,813 US9902777B2 (en) 2004-03-24 2015-08-26 Methods for producing subtypes of humanized antibody against interleukin-6 receptor
US15/868,892 US20180230222A1 (en) 2004-03-24 2018-01-11 Subtypes of humanized antibody against interleukin-6 receptor
US16/439,349 US20200148775A1 (en) 2004-03-24 2019-06-12 Subtypes of humanized antibody against interleukin-6 receptor

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2004-087578 2004-03-24
JP2004087578 2004-03-24

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US10/593,786 A-371-Of-International US8398980B2 (en) 2004-03-24 2005-03-24 Subtypes of humanized antibody against interleuken-6 receptor
US13/722,919 Continuation US8734800B2 (en) 2004-03-24 2012-12-20 Subtypes of humanized antibody against interleukin-6 receptor

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2005090405A1 true WO2005090405A1 (ja) 2005-09-29

Family

ID=34993643

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2005/006229 WO2005090405A1 (ja) 2004-03-24 2005-03-24 インターロイキン－６受容体に対するヒト型化抗体のサブタイプ

Country Status (4)

Country Link
US (6) US8398980B2 (ja)
EP (3) EP3736295A1 (ja)
JP (1) JPWO2005090405A1 (ja)
WO (1) WO2005090405A1 (ja)

Cited By (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110245473A1 (en) * 2007-09-26 2011-10-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-IL-6 Receptor Antibody
US8398980B2 (en) 2004-03-24 2013-03-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Subtypes of humanized antibody against interleuken-6 receptor
US8709409B2 (en) 2003-04-28 2014-04-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for treating rheumatoid arthritis by administering an anti-IL-6 antibody and methotrexate
JP2014526884A (ja) * 2011-07-06 2014-10-09 ゲンマブ エー／エス 抗体重鎖のｃ末端の修飾による補体依存性細胞傷害の調節
US9096651B2 (en) 2007-09-26 2015-08-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in CDR
US9228017B2 (en) 2009-03-19 2016-01-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
US9688762B2 (en) 2007-09-26 2017-06-27 Chugai Sciyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant region
US9868948B2 (en) 2008-04-11 2018-01-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
US10253091B2 (en) 2009-03-19 2019-04-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
US10662245B2 (en) 2008-09-26 2020-05-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of reducing IL-6 activity for disease treatment
US10697883B2 (en) 2015-05-19 2020-06-30 National Center Of Neurology And Psychiatry Method for determining application of therapy to multiple sclerosis (MS) patient
US10774148B2 (en) 2015-02-27 2020-09-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Composition for treating IL-6-related diseases
US10782290B2 (en) 2013-06-11 2020-09-22 National Center Of Neurology And Psychiatry Method for predicting post-therapy prognosis of relapsing-remitting multiple sclerosis (RRMS) patient, and method for determining applicability of novel therapy
US11046784B2 (en) 2006-03-31 2021-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
US11046772B2 (en) 2015-03-26 2021-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Process of production with controlled copper ions
US11622969B2 (en) 2010-11-08 2023-04-11 Hoffmann-La Roche Inc. Subcutaneously administered anti-IL-6 receptor antibody
US11692037B2 (en) 2017-10-20 2023-07-04 Hyogo College Of Medicine Anti-IL-6 receptor antibody-containing medicinal composition for preventing post-surgical adhesion
US11851486B2 (en) 2017-05-02 2023-12-26 National Center Of Neurology And Psychiatry Method for predicting and evaluating therapeutic effect in diseases related to IL-6 and neutrophils
US11891434B2 (en) 2010-11-30 2024-02-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2382488T3 (es) 1997-03-21 2012-06-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Un agente preventivo o terapéutico para enfermedades mediadas por células t sensibilizadas que comprende un antagonista de il-6 como ingrediente activo
UA80091C2 (en) 2001-04-02 2007-08-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Remedies for infant chronic arthritis-relating diseases and still's disease which contain an interleukin-6 (il-6) antagonist
US20050118163A1 (en) * 2002-02-14 2005-06-02 Hidefumi Mizushima Antibody-containing solution pharmaceuticals
EP1878747A1 (en) 2006-07-11 2008-01-16 greenovation Biotech GmbH Glyco-engineered antibodies
PE20091174A1 (es) 2007-12-27 2009-08-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Formulacion liquida con contenido de alta concentracion de anticuerpo
PL2493922T3 (pl) 2009-10-26 2017-07-31 F.Hoffmann-La Roche Ag Sposób wytwarzania glikozylowanych immunoglobulin
US8822663B2 (en) 2010-08-06 2014-09-02 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
HUE058896T2 (hu) 2010-10-01 2022-09-28 Modernatx Inc N1-metil-pszeudo-uracilt tartalmazó ribonukleinsavak és azok felhasználásai
US8710200B2 (en) 2011-03-31 2014-04-29 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids encoding a modified erythropoietin and their expression
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
RS62993B1 (sr) 2011-10-03 2022-03-31 Modernatx Inc Modifikovani nukleozidi, nukleotidi, i nukleinske kiseline, i njihove upotrebe
CN104114572A (zh) 2011-12-16 2014-10-22 现代治疗公司 经修饰的核苷、核苷酸和核酸组合物
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US9303079B2 (en) 2012-04-02 2016-04-05 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
DE18200782T1 (de) 2012-04-02 2021-10-21 Modernatx, Inc. Modifizierte polynukleotide zur herstellung von proteinen im zusammenhang mit erkrankungen beim menschen
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
WO2014052462A2 (en) 2012-09-25 2014-04-03 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable antibodies that bind interleukin-6 receptor and methods of use thereof
EP4074834A1 (en) 2012-11-26 2022-10-19 ModernaTX, Inc. Terminally modified rna
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
BR112015032960B1 (pt) 2013-07-04 2021-01-05 F. Hoffmann-La Roche Ag imunoensaio suprimido por interferência para detectar anticorpos anti-fármaco em amostras de soro
EP3052106A4 (en) 2013-09-30 2017-07-19 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
MX2016004249A (es) 2013-10-03 2016-11-08 Moderna Therapeutics Inc Polinulcleotidos que codifican el receptor de lipoproteina de baja densidad.
CN107208025A (zh) 2014-11-25 2017-09-26 康宁股份有限公司 延续细胞培养基的材料和方法
US10266590B2 (en) 2015-09-04 2019-04-23 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods related to biologics
US11484591B2 (en) 2016-02-22 2022-11-01 Ohio State Innovation Foundation Chemoprevention using controlled-release formulations of anti-interleukin 6 agents, synthetic vitamin A analogues or metabolites, and estradiol metabolites
WO2017201731A1 (en) 2016-05-27 2017-11-30 Beijing Vdjbio Co., Ltd. Antibodies, composition and kits comprising same, and methods of use thereof
WO2018112237A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Progenity Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an il-6r inhibitor
US10980739B2 (en) 2016-12-14 2021-04-20 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a chemokine/chemokine receptor inhibitor
BR112019011702A2 (pt) 2016-12-14 2019-10-22 Progenity Inc tratamento de uma doença do trato gastrointestinal com um inibidor de il-12/il-23 liberado usando um dispositivo ingerível
US11033496B2 (en) 2017-03-17 2021-06-15 The Regents Of The University Of Michigan Nanoparticles for delivery of chemopreventive agents
US20210138213A1 (en) 2017-03-30 2021-05-13 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immune modulatory agent released using an ingestible device
CA3083971A1 (en) * 2017-11-30 2019-06-06 Bio-Thera Solutions, Ltd. Liquid formulation of humanized antibody for treating il-6 related diseases
WO2019246271A1 (en) 2018-06-20 2019-12-26 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an il-12/il-23 inhibitor
US20230041197A1 (en) 2018-06-20 2023-02-09 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immunomodulator
WO2019246317A1 (en) 2018-06-20 2019-12-26 Progenity, Inc. Treatment of a disease or condition in a tissue originating from the endoderm
US20220177978A1 (en) 2019-04-02 2022-06-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods of predicting and preventing cancer in patients having premalignant lesions
US20240200085A1 (en) 2022-12-15 2024-06-20 Aarhus Universitet Synthetic activation of multimeric transmembrane receptors

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05227970A (ja) * 1992-02-19 1993-09-07 Chugai Pharmaceut Co Ltd ヒトインターロイキン−６受容体に対する再構成ヒト抗体
JPH06319396A (ja) * 1993-05-07 1994-11-22 Japan Tobacco Inc 抗ウイルス抗体を産生する植物及びその作出方法
JP2002510211A (ja) * 1997-07-02 2002-04-02 ジェネンテク，インコーポレイテッド 改良抗ＩｇＥ抗体及びポリペプチドの改良方法
JP2002525104A (ja) * 1998-09-28 2002-08-13 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション Ｔｉｅ２アゴニスト抗体

Family Cites Families (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US521628A (en) 1894-06-19 Housekeeping-cabinet
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US6428979B1 (en) * 1988-01-22 2002-08-06 Tadamitsu Kishimoto Receptor protein for human B cell stimulatory factor-2
CA1341152C (en) * 1988-01-22 2000-12-12 Tadamitsu Kishimoto Receptor protein for human b cell stimulatory factor-2
US5670373A (en) * 1988-01-22 1997-09-23 Kishimoto; Tadamitsu Antibody to human interleukin-6 receptor
ATE132985T1 (de) 1988-09-27 1996-01-15 Omron Tateisi Electronics Co Gerät zur ''fuzzy''-inferenz
US5126250A (en) * 1988-09-28 1992-06-30 Eli Lilly And Company Method for the reduction of heterogeneity of monoclonal antibodies
US5216128A (en) * 1989-06-01 1993-06-01 Yeda Research And Development Co., Ltd. IFN-β2/IL-6 receptor its preparation and pharmaceutical compositions containing it
AU668349B2 (en) * 1991-04-25 1996-05-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Reconstituted human antibody against human interleukin 6 receptor
FR2694767B1 (fr) 1992-08-13 1994-10-21 Innotherapie Lab Sa Anticorps monoclonaux anti-IL6R, et leurs applications.
US5648267A (en) 1992-11-13 1997-07-15 Idec Pharmaceuticals Corporation Impaired dominant selectable marker sequence and intronic insertion strategies for enhancement of expression of gene product and expression vector systems comprising same
US5888510A (en) * 1993-07-21 1999-03-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Chronic rheumatoid arthritis therapy containing IL-6 antagonist as effective component
JPH07188056A (ja) 1993-07-21 1995-07-25 Chuzo Kishimoto インターロイキン６リセプター抗体を有効成分とする骨吸収抑制剤
WO1995009873A1 (en) 1993-10-06 1995-04-13 Board Of Regents, The University Of Texas System A monoclonal anti-human il-6 receptor antibody
US8017121B2 (en) * 1994-06-30 2011-09-13 Chugai Seiyaku Kabushika Kaisha Chronic rheumatoid arthritis therapy containing IL-6 antagonist as effective component
JP3630453B2 (ja) 1994-09-30 2005-03-16 中外製薬株式会社 Ｉｌ−６レセプター抗体を有効成分とする未熟型骨髄腫細胞治療剤
WO1996012503A1 (fr) * 1994-10-21 1996-05-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Remede contre des maladies provoquees par la production d'il-6
ES2170815T5 (es) * 1994-12-29 2012-11-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Uso de un anticuerpo PM-1 o de un anticuerpo MH166 para potenciar el efecto antitumoral de cisplatino o carboplatino
ATE330629T1 (de) * 1995-02-13 2006-07-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Inhibitor des muskelproteinabbaus enthaltend einen il-6 rezeptor antikörper
US6060293A (en) 1995-03-31 2000-05-09 Prokyon Aps Resonance driven changes in chain molecule structure
JP3471195B2 (ja) * 1996-06-27 2003-11-25 中外製薬株式会社 ナイトロジェンマスタード系抗癌剤と組合わせて使用するための骨髄腫治療剤
ES2382488T3 (es) * 1997-03-21 2012-06-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Un agente preventivo o terapéutico para enfermedades mediadas por células t sensibilizadas que comprende un antagonista de il-6 como ingrediente activo
US20020187150A1 (en) * 1997-08-15 2002-12-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Preventive and/or therapeutic agent for systemic lupus erythematosus comprising anti-IL-6 receptor antibody as an active ingredient
CN101239185A (zh) * 1998-03-17 2008-08-13 中外制药株式会社 一种包含il-6拮抗剂活性成分的炎性肠道疾病的预防或治疗剂
US6537782B1 (en) * 1998-06-01 2003-03-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Media for culturing animal cells and process for producing protein by using the same
US6406909B1 (en) * 1998-07-10 2002-06-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Serum-free medium for culturing animal cells
DE69934698T2 (de) 1998-08-24 2007-10-04 Chugai Seiyaku K.K. Mittel zur vorbeugung oder behandlung von pankreatitis die anti-il-6 receptor antikörper als aktive komponente enthalten
JP3763698B2 (ja) * 1998-10-22 2006-04-05 株式会社日本自動車部品総合研究所 圧力脈動を緩和し得る燃料供給システムの設計方法
WO2002013859A1 (fr) 2000-08-10 2002-02-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methode permettant d'inhiber la coagulation ou la turbidite d'une solution contenant des anticorps
ES2477996T3 (es) * 2000-08-11 2014-07-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Preparaciones estabilizadas que contienen un anticuerpo
EP1334731B1 (en) * 2000-10-25 2008-02-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Preventives or remedies for psoriasis containing as the active ingredient il-6 antagonist
WO2002036164A1 (fr) * 2000-10-27 2002-05-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Agent abaissant le taux sanguin de vegf contenant un antagoniste de il-6 en tant que principe actif
JP4889187B2 (ja) * 2000-10-27 2012-03-07 中外製薬株式会社 Ｉｌ−６アンタゴニストを有効成分として含有する血中ｍｍｐ−３濃度低下剤
EP3088412B1 (en) * 2001-03-09 2021-05-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Protein purification method
UA80091C2 (en) * 2001-04-02 2007-08-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Remedies for infant chronic arthritis-relating diseases and still's disease which contain an interleukin-6 (il-6) antagonist
US20050118163A1 (en) * 2002-02-14 2005-06-02 Hidefumi Mizushima Antibody-containing solution pharmaceuticals
JP3822137B2 (ja) 2002-05-20 2006-09-13 中外製薬株式会社 動物細胞培養用培地の添加剤およびそれを用いたタンパク質の製造方法
ES2626268T3 (es) * 2002-09-11 2017-07-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Método de purificación de proteínas
US20060165696A1 (en) * 2003-02-24 2006-07-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Keio University Remedy for spinal injury containing interleukin-6 antagonist
GB2401040A (en) * 2003-04-28 2004-11-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method for treating interleukin-6 related diseases
SI1690550T1 (sl) * 2003-10-17 2012-12-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Terapevtska sredstva za mezoteliom
US8617550B2 (en) * 2003-12-19 2013-12-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Treatment of vasculitis with IL-6 antagonist
AR048335A1 (es) * 2004-03-24 2006-04-19 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agentes terapeuticos para trastornos del oido interno que contienen un antagonista de il- 6 como un ingrediente activo
EP3736295A1 (en) 2004-03-24 2020-11-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Subtypes of humanized antibody against interleukin-6 receptor
KR20070029733A (ko) 2004-06-04 2007-03-14 제넨테크, 인크. 다발성 경화증의 치료 방법
AU2005323643B2 (en) * 2005-01-05 2011-07-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cell culture method and utilization of the same
WO2007043641A1 (ja) * 2005-10-14 2007-04-19 Fukuoka University 膵島移植における移植膵島障害抑制剤
RU2450830C2 (ru) * 2005-10-21 2012-05-20 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Средства для лечения кардиопатии
AR057582A1 (es) * 2005-11-15 2007-12-05 Nat Hospital Organization Agentes para suprimir la induccion de linfocitos t citotoxicos
KR20080084818A (ko) * 2005-11-25 2008-09-19 각고호우징 게이오기주크 전립선암 치료제
US9084777B2 (en) * 2005-12-28 2015-07-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Stabilized antibody-containing formulations
CA2637917C (en) * 2006-01-27 2015-11-24 Keio University Therapeutic agents for diseases involving choroidal neovascularization
JP5754875B2 (ja) * 2006-04-07 2015-07-29 国立大学法人大阪大学 筋再生促進剤
JP5330829B2 (ja) 2006-08-04 2013-10-30 憲弘 西本 関節リウマチ患者の治療予後予測方法
JP2010095445A (ja) 2006-12-27 2010-04-30 Tokyo Medical & Dental Univ Ｉｌ−６アンタゴニストを有効成分とする炎症性筋疾患治療剤
CL2008000188A1 (es) * 2007-01-23 2008-07-18 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agente para suprimir la reaccion de rechazo cronica que comprende como ingrediente activo un inhibidor de il-6; y uso del inhibidor de il-6.
EP2174667B1 (en) * 2007-07-26 2017-01-04 Osaka University Agent for treatment of ophthalmia containing interleukin-6 receptor inhibitor as active ingredient
EP2206775B1 (en) * 2007-09-26 2016-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-il-6 receptor antibody
US8529895B2 (en) * 2007-10-02 2013-09-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for suppressing the development of graft-versus-host-disease by administering interleukin 6 receptor antibodies
JP2009092508A (ja) 2007-10-09 2009-04-30 Norihiro Nishimoto リウマチ治療剤の効果の予測方法
ES2532483T3 (es) * 2007-12-15 2015-03-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Ensayo de distinción
PE20091174A1 (es) * 2007-12-27 2009-08-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Formulacion liquida con contenido de alta concentracion de anticuerpo
EP2305306B1 (en) * 2008-06-05 2016-02-10 National Cancer Center Neuroinvasion inhibitor
JP5259353B2 (ja) 2008-11-20 2013-08-07 富士フイルム株式会社 投写レンズおよびこれを用いた投写型表示装置
WO2011013786A1 (ja) * 2009-07-31 2011-02-03 Maeda Shin 癌の転移抑制剤
PL2493922T3 (pl) * 2009-10-26 2017-07-31 F.Hoffmann-La Roche Ag Sposób wytwarzania glikozylowanych immunoglobulin
WO2011128096A1 (en) * 2010-04-16 2011-10-20 Roche Diagnostics Gmbh Polymorphism markers for predicting response to interleukin-6 receptor-inhibiting monoclonal antibody drug treatment
EP2578231B1 (en) 2010-05-28 2022-10-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antitumor t cell response enhancer
JP5904552B2 (ja) 2010-05-28 2016-04-13 国立研究開発法人国立がん研究センター 膵癌治療剤
EP2576824A2 (en) * 2010-06-07 2013-04-10 Roche Diagnostics GmbH Gene expression markers for predicting response to interleukin-6 receptor-inhibiting monoclonal antibody drug treatment
EP4029881A1 (en) 2010-11-08 2022-07-20 F. Hoffmann-La Roche AG Subcutaneously administered anti-il-6 receptor antibody
US8982263B2 (en) 2010-11-11 2015-03-17 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Blemish detection and notification in an image capture device

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05227970A (ja) * 1992-02-19 1993-09-07 Chugai Pharmaceut Co Ltd ヒトインターロイキン−６受容体に対する再構成ヒト抗体
JPH06319396A (ja) * 1993-05-07 1994-11-22 Japan Tobacco Inc 抗ウイルス抗体を産生する植物及びその作出方法
JP2002510211A (ja) * 1997-07-02 2002-04-02 ジェネンテク，インコーポレイテッド 改良抗ＩｇＥ抗体及びポリペプチドの改良方法
JP2002525104A (ja) * 1998-09-28 2002-08-13 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション Ｔｉｅ２アゴニスト抗体

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ADAMCZYK M. ET AL: "Complete sequencing of antivancomycin fab fragment by liquid chromatography-electrospray ion trap mass spectrometry with a combination of database searching and manual interpretation of the MS/MS spectra.", J. IMMUNOL METHODS., vol. 260, no. 1-2, 1 February 2002 (2002-02-01), pages 235 - 249, XP004332576 *
HIRATA Y. ET AL: "Characterization of IL-6 receptor expression by monoclonal and polyclonal antibodies.", J.IMMUNOL., vol. 143, no. 9, 1 November 1989 (1989-11-01), pages 2900 - 2906, XP001021888 *
MERKLER ET AL: "Recombinant type A rat 75-kDa alpha-amidating enzyme catalyzes the convertion of glycine-extended peptides to peptide amides via an alpha-hydroxyglycine intermediate.", ARCH BIOCHEM BIOPHYS., vol. 289, no. 1, 15 August 1991 (1991-08-15), pages 192 - 196, XP002994539 *
MILLER ET AL: "Characterization of a bifunctional peptidyglycine alpha-amidating enzyme expressed in Chinese hamster ovary cells.", ARCH BIOCHEM BIOPHYS., vol. 298, no. 2, 1 November 1992 (1992-11-01), pages 380 - 388, XP002994540 *
RAY ET AL: "Production of salmon calcitonin by direct expression of a glycine-extended precursor in Excherichia coli.", PROTEIN EXPR PURIF., vol. 26, no. 2, November 2002 (2002-11-01), pages 249 - 259, XP002994541 *
See also references of EP1728801A4 *

Cited By (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10744201B2 (en) 2003-04-28 2020-08-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for treating rheumatoid arthritis with a human IL-6 receptor antibody and methotrexate
US8709409B2 (en) 2003-04-28 2014-04-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for treating rheumatoid arthritis by administering an anti-IL-6 antibody and methotrexate
US8398980B2 (en) 2004-03-24 2013-03-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Subtypes of humanized antibody against interleuken-6 receptor
US8734800B2 (en) 2004-03-24 2014-05-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Subtypes of humanized antibody against interleukin-6 receptor
US9902777B2 (en) 2004-03-24 2018-02-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing subtypes of humanized antibody against interleukin-6 receptor
US11046784B2 (en) 2006-03-31 2021-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
US9828429B2 (en) 2007-09-26 2017-11-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in CDR
AU2008304756B2 (en) * 2007-09-26 2015-01-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-IL-6 receptor antibody
US20110245473A1 (en) * 2007-09-26 2011-10-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-IL-6 Receptor Antibody
US9688762B2 (en) 2007-09-26 2017-06-27 Chugai Sciyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant region
AU2008304756A8 (en) * 2007-09-26 2015-02-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-IL-6 receptor antibody
US11248053B2 (en) 2007-09-26 2022-02-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in CDR
US11332533B2 (en) 2007-09-26 2022-05-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant region
US9096651B2 (en) 2007-09-26 2015-08-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in CDR
US9890377B2 (en) 2008-04-11 2018-02-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
US9868948B2 (en) 2008-04-11 2018-01-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
US11359194B2 (en) 2008-04-11 2022-06-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding two or more antigen molecules repeatedly
US10472623B2 (en) 2008-04-11 2019-11-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding two or more antigen molecules repeatedly
US11371039B2 (en) 2008-04-11 2022-06-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
US10662245B2 (en) 2008-09-26 2020-05-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of reducing IL-6 activity for disease treatment
US10253091B2 (en) 2009-03-19 2019-04-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
US10066018B2 (en) 2009-03-19 2018-09-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
US9228017B2 (en) 2009-03-19 2016-01-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
US11667720B1 (en) 2010-11-08 2023-06-06 Hoffmann-La Roche Inc. Subcutaneously administered anti-IL-6 receptor antibody
US11622969B2 (en) 2010-11-08 2023-04-11 Hoffmann-La Roche Inc. Subcutaneously administered anti-IL-6 receptor antibody
US11891434B2 (en) 2010-11-30 2024-02-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
JP2019000116A (ja) * 2011-07-06 2019-01-10 ゲンマブ エー／エス 抗体重鎖のｃ末端の修飾による補体依存性細胞傷害の調節
JP2014526884A (ja) * 2011-07-06 2014-10-09 ゲンマブ エー／エス 抗体重鎖のｃ末端の修飾による補体依存性細胞傷害の調節
US10782290B2 (en) 2013-06-11 2020-09-22 National Center Of Neurology And Psychiatry Method for predicting post-therapy prognosis of relapsing-remitting multiple sclerosis (RRMS) patient, and method for determining applicability of novel therapy
US10774148B2 (en) 2015-02-27 2020-09-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Composition for treating IL-6-related diseases
US11046772B2 (en) 2015-03-26 2021-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Process of production with controlled copper ions
EP4219694A1 (en) 2015-03-26 2023-08-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Process of production with controlled copper ions
US10697883B2 (en) 2015-05-19 2020-06-30 National Center Of Neurology And Psychiatry Method for determining application of therapy to multiple sclerosis (MS) patient
US11851486B2 (en) 2017-05-02 2023-12-26 National Center Of Neurology And Psychiatry Method for predicting and evaluating therapeutic effect in diseases related to IL-6 and neutrophils
US11692037B2 (en) 2017-10-20 2023-07-04 Hyogo College Of Medicine Anti-IL-6 receptor antibody-containing medicinal composition for preventing post-surgical adhesion

Also Published As

Publication number Publication date
US8398980B2 (en) 2013-03-19
US20160152714A1 (en) 2016-06-02
US20180230222A1 (en) 2018-08-16
US20200148775A1 (en) 2020-05-14
US20100247523A1 (en) 2010-09-30
US8734800B2 (en) 2014-05-27
EP3269738A1 (en) 2018-01-17
JPWO2005090405A1 (ja) 2008-04-17
EP1728801A4 (en) 2009-10-21
US20140377254A1 (en) 2014-12-25
US20130209456A1 (en) 2013-08-15
EP1728801A1 (en) 2006-12-06
EP3736295A1 (en) 2020-11-11
US9902777B2 (en) 2018-02-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2005090405A1 (ja) インターロイキン－６受容体に対するヒト型化抗体のサブタイプ
JP6783886B2 (ja) 抗ｃｔｌａ４モノクローナル抗体またはその抗原結合断片、医薬組成物および使用
CN112424224B (zh) 抗白细胞介素-17a抗体、其药物组合物及其用途
EP0923941B1 (en) Remedies for myeloma to be used together with nitrogen mustard antitumor agents
EP2754671B1 (en) Anti MIF antibodies
JP7000476B2 (ja) 炎症性疾患の処置法
WO1998042377A1 (en) Preventives or remedies for sensitized t cell-related diseases containing il-6 antagonists as the active ingredient
CN102369219A (zh) 针对人tweak的抗体及其应用
JP2021519088A (ja) 抗ｃｄ２７抗体、その抗原結合フラグメント及びその医学的使用
CN114053403A (zh) 融合蛋白在制备疫苗佐剂或预防和治疗病毒感染的药物中的用途
WO2023046097A1 (zh) 抗tigit人源化抗体或其抗原结合片段及其应用
TW202305006A (zh) 與ｃｄ４７及ｐｄ—ｌ１特異性結合的雙特異性抗體
CN117447596A (zh) 一种靶向pd-1的单克隆抗体及其应用
CN110506058A (zh) 免疫激动剂的施用路径
WO2023284741A1 (zh) Pd-1抗体及其用途
CN113164601B (zh) 一种分离的抗原结合蛋白及其用途
CN113166264B (zh) 一种分离的抗原结合蛋白及其用途
CN116355096A (zh) 重组抗人tigit抗体及应用
EA046350B1 (ru) Анти-интерлейкин-17а антитело, фармацевтическая композиция и их применение

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SM SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006511350

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2005727379

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005727379

Country of ref document: EP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: DE

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2005727379

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10593786

Country of ref document: US