CN112424224B - 抗白细胞介素-17a抗体、其药物组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于自身免疫疾病治疗和分子免疫学领域，涉及一种抗IL‑17A抗体、其药物组合物及其用途。具体地，本发明涉及一种单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体的重链可变区包含：氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:31－33所示的HCDR1－HCDR3或氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:37－39所示的HCDR1－HCDR3，和所述单克隆抗体的轻链可变区包含：氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:34－36所示的LCDR1－LCDR3或氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:40－42所示的LCDR1－LCDR3。本发明的单克隆抗体能够很好地特异性与IL‑17A结合，特异拮抗IL‑17A与其配体的结合，抑制IL‑17A对成纤维细胞的激活。

Description

抗白细胞介素-17A抗体、其药物组合物及其用途
技术领域
本发明属于分子免疫学领域，涉及一种抗白介素-17A抗体、其药物组合物及其用途。具体地，本发明涉及一种抗白介素-17A的单克隆抗体。
背景技术
白细胞介素-17A(Interleukin 17A，缩写为IL-17A或IL 17A)是IL-17细胞因子家族的成员，该家族共有6个成员即IL-17A(IL-17A为最先发现的，也被称为IL-17)、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E(亦命名为IL-25)和IL-17F(施沛青等人，Chinese Journal ofCell Biology 33：345-357(2011))。IL-17F与IL-17A有约50％同源性，而且其编码基因定位于染色体的同一区段6p12(Gaffen等人，Nat Rev Immunol 9：556-67(2009))。IL-17A和IL-17F可以以IL-17A/IL-17A和IL-17F/IL-17F这样的同源二聚体形式存在，也可以以IL-17A/IL-17F。IL-17A及IL-17F通过与受体结合发挥生物学效应(Wright等人，J Immunol181：2799-805(2008))。
IL-17受体(IL-17R)家族由五个成员组成，即IL-17RA、IL-17RB、IL-17RC、IL-17RD和IL-17RE。IL-17受体家族成员之间可组合为不同的受体复合物，其中IL-17RA作为这个家族里迄今发现的最大的分子，是至少四个配体的传递信号的通用亚基，发挥了主要的生物学效应(Gaffen等人，Nat Rev Immunol 9：556-67(2009))。IL-17RA与IL-17RC复合体介导细胞对IL-17A与IL-17F的反应(Toy等人，J Immunol 177：36-9(2006))。
IL-17A比IL-17F在自身免疫炎症反应中更为关键，关键的原因为IL17RA对IL-17A的亲和力百倍于IL-17F(Ely等人，Nat Immunol 10 1245-51(2009))，细胞对IL-17A的反应强度10倍于其对IL-17F的反应(Dubin等人，Immunity 30：9-11(2009))。运用抗IL-17A的抗体或者抗IL-17受体的抗体，阻断IL-17A与其受体的结合，可以阻断IL-17A的生物学效应。
IL-17A在几种自身免疫性疾病(例如银屑病、银屑病性关节炎、类风湿关节炎、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮等)中发挥着重要作用。抗IL-17A单克隆抗体Secukinumab被FDA及欧盟批准用于治疗中至重度斑块性银屑病、银屑病性关节炎以及强直性脊柱炎。
银屑病又称为牛皮癣，是慢性自身免疫性皮肤病，皮肤的组织学特征是表皮角质化细胞过度增殖、血管增生以及树突状细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、T细胞浸润(Nestle等人，N Engl J Med，361：496-509(2009))。银屑病疾病表现多样，其中其中斑块型银屑病最为常见的类型，约占所有银屑病发病患者的90％以上。银屑病性关节炎(psoriaticarthritis，PsA)是银屑病的一种特殊类型，具有银屑病皮疹并导致关节和周围软组织疼痛、肿、压痛、僵硬和运动障碍，部分患者可有骶髂关节炎和(或)脊柱炎，病程迁延、易复发、晚期可关节强直，导致残疾。存在银屑病是银屑病性关节炎与其他炎性关节病的重要区别，皮肤病变严重性和关节炎症程度无直接关系(谭震等人，中华风湿病学杂志20：：354-357(2016))。
在银屑病的病变皮肤组织中，IL-17A的表达显著增高，这种增高与银屑病疾病活动密切相关(Johansen等人，Brit J Dermatol，160：319-24(2009)；Lowes等人，J InvestDermatol 128：1207-11(2008))。在银屑病患者中，抗IL-17A的单克隆抗体Secukinumab展现出了优异的疗效，可显著缓解银屑病患者的疾病活动，减少银屑病斑块的面积(Langley等人，N Engl J Med，371：326-38(2014))；Secukinumab还可以显著改善银屑病性关节炎患者的减轻关节炎症状，显著改善关节功能(Gottlieb等人，J Drugs Dermatol，14821-33(2015))。Secukinumab被FDA批准用于治疗中至重度斑块型银屑病以及银屑病性关节炎。
类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)的主要特征是炎症关节内滑膜成纤维细胞增生、关节和软骨损坏，CD4+辅助性T细胞与产生自身抗体的浆细胞浸润。IL-17A在类风湿性关节炎中既能导致炎症又能造成骨损坏。相对于健康人或骨关节炎患者IL-17A在类风湿性关节炎病人的类风湿样滑膜单核细胞中高表达(Sarkar等人，Clin ExpImmunol.177：652-61(2014))，细胞学研究提示IL-17A可刺激骨吸收和胶原毁坏(Kitami等人Biochimie.92：398-404(2010))。IL-17A可以诱导软骨、滑膜细胞、巨噬细胞和骨细胞分泌TNFa、IL-1b与IL-6等促炎症细胞因子并发挥，这些促炎症因子导致类风湿性关节炎突然发作并能通过IL-17A诱导的IL-6维持TH17细胞数量，从而形成正反馈发挥协同作用放大其炎症效应，确立一种慢性炎症状态(Ogura等人，Immunity 29：628-36(2008))。拮抗IL-17A可有效地缓解类风湿性关节炎症状。在胶原诱导的关节炎小鼠模型中，中和IL-17A或其受体可消退类风湿性关节炎的症状(Chao等人，Autoimmunity.2011May；44(3)：243-52)；IL-17缺陷可保护宿主小鼠免受胶原诱导的关节炎的侵害(Nakae等人，J Immunol，171：6173-7(2003))，而IL-17A过表达可加重病情(Lubberts等人，Inflamm Res 51：102-4(2002))。
强直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis，AS)是一种慢性自身免疫性疾病。AS的早期病理特征是骶髂关节和肌腱、韧带的骨附着点处呈急性或慢性炎症，后期则进展为椎间盘炎和椎小关节炎；且AS患者均存在骨密度下降的现象。研究显示，AS患者外周血中分泌IL-17A的Th17细胞数量及IL-17A的浓度均较健康者显著升高(Gracey等人，ArthritisRheumatol.68：679-89.(2016))。IL-17A能激活巨噬细胞、树突状细胞、内皮细胞、成纤维细胞、软骨细胞以及成骨细胞等多种细胞，这些细胞将生成数量众多的致炎破坏性因子(Ogura等人，Immunity 29：628-36(2008))。在骨组织中，IL-17A诱导成骨细胞表达细胞核因子κb受体活化因子配体(RANKL)，激活破骨细胞，从而诱发骨吸收，累积性地加剧骨丢失，直接或间接地导致骨质破坏(Gaffen，Curr Rheumatol Rep 11：365-370(2009))。在AS患者中，抗IL-17A的单克隆抗体Secukinumab展现出了优异的疗效，可显著降低强直性脊柱炎的症状和体征(Baeten等人，N Engl J Med，373：2534-48(2015))。基于此，Secukinumab被FDA批准用于治疗强直性脊柱炎。
系统性红斑狼疮(system lupus erythematosus，SLE)是一个影响多个系统的自身免疫性疾病，患者的体内出现针对自身抗原的抗体，直接或间接攻击身体各种组织或器官，最常影响的部位包括皮肤、关节及肾脏。研究表明IL-17A在SLE中发挥作用。在SLE病人的外周血中产生IL-17A的细胞比率增加，病人血清中的IL-17A水平也异常高(Chen等人，JClin Immunol，30：221-5(2010))。罹患SLE伴随肾损害的病人的外周血单核细胞在加入IL-17培养时会产生更多的总IgG、抗dsDNA的IgG及IL-6，这说明IL-17能参与B细胞的激活(Dong等人，Chin Med J(Engl)，116：543-8(2003))。近来还发现，IL-17A可以协同BAFF(B-cell activating factor)保护B细胞免于凋亡，从而增加了产生自身抗体的细胞数量(Onishi等人，Immunology 129：311-21(2010))。
发明内容
本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，利用哺乳动物细胞表达系统分别表达出重组的IL-17A(24-155)作为抗原免疫小鼠，经小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合获得大量杂交瘤细胞样本。发明人通过进行对大量样本的筛选，分别得到了如下的两个杂交瘤细胞株：
杂交瘤细胞株LT006(IL17A-13E9)，其于2017年9月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：C2017102；
以及杂交瘤细胞株LT007(IL17A-2G2)，其于2017年9月12保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：C2017165。
本发明人惊奇地发现：
杂交瘤细胞株LT006能够分泌产生与IL-17A特异性结合的特异性单克隆抗体(命名为13E9)，并且该单克隆抗体能够十分有效地阻断IL-17A与IL-17RA的结合；
杂交瘤细胞株LT007能够分泌产生与IL-17A特异性结合的特异性单克隆抗体(命名为2G2)，并且该单克隆抗体能够十分有效地阻断IL-17A与IL-17RA的结合；
进一步地，本发明人创造性地制得了抗IL-17A的人源化抗体(分别命名为13E9H1L1，13E9 H2L2，13E9 H3L2；以及2G2 H1L1，2G2 H2L2，2G2 H3L3)，其均能有效地结合人IL-17A，阻断IL-17A与IL-17A受体的结合，抑制IL-17A受体下游信号通路的激活；
本发明的抗体具有用于制备防治银屑病，类风湿关节炎，银屑病性关节炎，强直性脊柱炎，系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病的药物的潜力。
由此提供了下述发明：
本发明的一个方面涉及单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，
所述单克隆抗体的重链可变区(VH)包含：氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：31-33所示的HCDR1-HCDR3或氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：37-39所示的HCDR1-HCDR3，和
所述单克隆抗体的轻链可变区(VL)包含：氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：34-36所示的LCDR1-LCDR3或氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：40-42所示的LCDR1-LCDR3。
轻链和重链的可变区决定抗原的结合；每条链的可变区均含有三个高变区，称互补决定区(CDR)(重链(H)的CDR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，轻链(L)的CDR包含LCDR1、LCDR2、LCDR3；其由Kabat等人命名，见Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition(1991)，第1-3卷，NIH Publication 91-3242，Bethesda Md)。
通过本领域技术人员所熟知的技术手段，例如通过VBASE2数据库分析上面的(1)-(2)项中的单克隆抗体序列的CDR区的氨基酸序列：
本发明中的抗体13E9，13E9 H1L1，13E9 H2L2，13E9 H3L2具有相同的CDR：
其重链可变区的3个CDR区的氨基酸序列如下：
HCDR1：SYSFTSDYA(SEQ ID NO：31)，
HCDR2：ITYSGVT(SEQ ID NO：32)，
HCDR3：ARADYDSYYTMDY(SEQ ID NO：33)；
其轻链可变区的3个CDR区的氨基酸序列如下：
LCDR1：QSLVHSNGNTY(SEQ ID NO：34)，
LCDR2：KVS(SEQ ID NO：35)，
LCDR3：SQSTHFWT(SEQ ID NO：36)。
本发明的抗体2G2，2G2 H1L1，2G2 H2L2，2G2 H3L3具有相同的CDR：
其重链可变区的3个CDR区的氨基酸序列如下：
HCDR1：SEVFPIAD(SEQ ID NO：37)，
HCDR2：ILPSFGRT(SEQ ID NO：38)，
HCDR3：ARGNYGFAY(SEQ ID NO：39)；
其轻链可变区的3个CDR区的氨基酸序列如下：
LCDR1：QSLLNSDGKTY(SEQ ID NO：40)，
LCDR2：LVS(SEQ ID NO：41)，
LCDR3：WQGSHFPQT(SEQ ID NO：42)。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，
所述单克隆抗体的重链可变区(VH)包含：氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：31-33所示的HCDR1-HCDR3，和
所述单克隆抗体的轻链可变区(VL)包含：氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：34-36所示的LCDR1-LCDR3。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，
所述单克隆抗体的重链可变区(VH)包含：氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：37-39所示的HCDR1-HCDR3，和
所述单克隆抗体的轻链可变区(VL)包含：氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：40-42所示的LCDR1-LCDR3。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，
所述重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：28，
并且
所述轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：30。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，
所述重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14，并且所述轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：12；
或者
所述重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：28，并且所述轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：30。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述重链可变区和轻链可变区选自如下的(1)-(8)中的任一项：
(1)重链可变区，其包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，和
轻链可变区，其包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；
(2)重链可变区，其包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，和
轻链可变区，其包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列；
(3)重链可变区，其包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，和
轻链可变区，其包含SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列；
(4)重链可变区，其包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，和
轻链可变区，其包含SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列；
(5)重链可变区，其包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列，和
轻链可变区，其包含SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列；
(6)重链可变区，其包含SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列，和
轻链可变区，其包含SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列；
(7)重链可变区，其包含SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列，和
轻链可变区，其包含SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列；以及
(8)重链可变区，其包含SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列，和
轻链可变区，其包含SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段选自Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体、人源化抗体、嵌合抗体或双抗体。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，其中，所述的单克隆抗体以小于大约100nM，例如小于大约10nM、5nM、4nM、3nM、2.5nM、2nM或更小的EC50结合IL-17A蛋白；优选地，所述EC50通过竞争ELISA方法测得。
在本发明的一些实施方式中，所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述的单克隆抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的KD结合IL-17A蛋白；优选地，所述KD通过Fortebio分子相互作用仪测得。
在本发明的一些实施方式中，所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述的单克隆抗体以小于大约100nM，例如小于大约10nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM或更小的EC50结合IL-17A蛋白；具体地，所述EC50通过间接ELISA方法测得。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述的单克隆抗体包括非-CDR区，且所述非-CDR区来自不是鼠类的物种，例如来自人抗体。
在本发明的一些实施方案中，所述免疫球蛋白的恒定区是人源化的，例如，重链恒定区均采用Ig gamma-1 chain C region，ACCESSION：P01857；轻链恒定区均采用Ig kappachain C region，ACCESSION：P01834。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中：
所述单克隆抗体是由杂交瘤细胞株LT006产生的单克隆抗体，所述杂交瘤细胞株LT006保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：C2017102；或者
所述单克隆抗体是由杂交瘤细胞株LT007产生的单克隆抗体，所述杂交瘤细胞株LT007保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：C2017165。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其用于预防和/或治疗肿瘤或者自身免疫性疾病，或者用于诊断自身免疫性疾病；优选地，所述自身免疫性疾病选自银屑病、类风湿关节炎、银屑病性关节炎、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮；优选地，所述银屑病为中度至重度斑块性银屑病。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其用于：
阻断IL-17A与IL17RA结合，
调节(例如下调)IL-17A活性或水平，或者
抑制细胞中IL-6的表达。
本发明的另一方面涉及一种分离的核酸分子，其包含编码本发明中任一项所述的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的核酸序列。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述的分离的核酸分子，其包含选自如下的(1)-(8)中任一项的核酸序列：
(1)SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3；
(2)SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7；
(3)SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：11；
(4)SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：11；
(5)SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：17；
(6)SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：21；
(7)SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：25；
(8)SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：29。
本发明的再一方面涉及一种重组载体，其包含本发明的分离的核酸分子；优选地，所述重组载体为重组表达载体，例如重组原核表达载体或重组真核表达载体。
本发明的再一方面涉及一种宿主细胞，其包含本发明的重组载体。
本发明的再一方面涉及一种制备本发明中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在合适的条件下培养本发明的宿主细胞，以及从细胞培养物中回收所述单克隆抗体或其抗原结合片段的步骤。
本发明的再一方面涉及选自如下的杂交瘤细胞株：
杂交瘤细胞株LT006，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：C2017102；或者
杂交瘤细胞株LT007，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：C2017165。
本发明的再一方面涉及一种偶联物，其包括单克隆抗体或其抗原结合片段以及偶联部分，其中，所述单克隆抗体为本发明中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述偶联部分为可检测的标记物；优选地，所述可检测的标记物为放射性同位素、发光物质例如荧光物质、有色物质或酶。
本发明的再一方面涉及一种试剂盒，其包括本发明中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，或者包括本发明的偶联物；
优选地，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别所述单克隆抗体或其抗原结合片段；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记物；优选地，所述可检测的标记物为放射性同位素、发光物质例如荧光物质、有色物质或酶。
本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或者本发明的偶联物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于IL-17A的定性检测或定量检测。所述定性检测是指检测待测样本中是否存在IL-17A，所述定量检测是指检测待测样本中的IL-17A的浓度或者含量。
本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其包含本发明中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或者本发明的偶联物；可选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或者本发明的偶联物在制备预防和/或治疗肿瘤或者自身免疫性疾病的药物中的用途，或者用于制备诊断自身免疫性疾病的药物中的用途；优选地，所述自身免疫性疾病选自银屑病、类风湿关节炎、银屑病性关节炎、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮；优选地，所述银屑病为中度至重度斑块性银屑病。
特别地，本发明人通过动物实验(实施例11)发现，13E9H3L2能够有效地抑制C57BL/6小鼠银屑病模型的表皮厚度的增加，表现为给予抗体药13E9H3L2可显著抑制IL-17A、皮下注射所引起的小鼠表皮厚度的增加，与已上市同靶点药物Secukinumab单抗药效相当。
在本发明的一些实施方式中，所述自身免疫性疾病(例如银屑病如中度至重度斑块性银屑病、类风湿关节炎、银屑病性关节炎、强直性脊柱炎或系统性红斑狼疮)是由IL-17A表达水平升高所致。这里所述的表达水平升高是指表达水平高于正常人，且达到了致病的水平。
本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或者本发明的偶联物在制备如下药物中的用途：
阻断IL-17A与IL-17RA结合的药物，
调节(例如下调)IL-17A活性或水平的药物，或者
抑制细胞中IL-6表达的药物。
本发明的再一方面涉及一种在体内或在体外的方法，包括给予细胞或者有需求的受试者以有效量的本发明中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或者本发明的偶联物的步骤，所述方法选自如下：
阻断IL-17A与IL-17RA结合的方法，
调节(例如下调)IL-17A活性或水平的方法，或者
抑制成纤维细胞中IL-6表达的方法。
在本发明的一个具体的实施方案中，所述在体外的方法是非治疗目的的和/或非诊断目的的。
白细胞介素-6(interleukin 6，缩写为IL-6或IL 6)，可由纤维母细胞、单核/巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、上皮细胞、角质细胞、以及多种瘤细胞所产生。白介素6是调控免疫应答的重要因子，IL-6与IL-1一起可协同地促进T细胞增殖，促使B细胞的分化，参与机体炎症反应(Schoenborn等人，Advances in Immunology 96：41-101(2007))。本发明的体外实验(实施例10)显示，抗IL-17A抗体能显著降低IL-6的分泌，抑制IL-6介导的免疫反应。
本发明的再一方面涉及一种治疗和/或预防肿瘤或者自身免疫性疾病的方法，包括给予有需求的受试者以有效量的本发明中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或者本发明的偶联物的步骤；优选地，所述自身免疫性疾病选自银屑病、类风湿关节炎、银屑病性关节炎、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮；优选地，所述银屑病为中度至重度斑块性银屑病。
本发明的再一方面涉及一种诊断自身免疫性疾病的方法，包括施加待测样品(例如组织样品、细胞样品或血液样品)或者给予有需求的受试者以有效量的本发明中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或者本发明的偶联物的步骤；优选地，所述自身免疫性疾病选自银屑病、类风湿关节炎、银屑病性关节炎、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮；优选地，所述银屑病为中度至重度斑块性银屑病。
在本发明的一些实施方式中，考虑到自身免疫性疾病(例如银屑病如中度至重度斑块性银屑病、类风湿关节炎、银屑病性关节炎、强直性脊柱炎或系统性红斑狼疮)是由IL-17A表达水平升高所致，可以通过发明中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或者本发明的偶联物检测IL-17A表达水平来进行诊断。如果IL-17A表达水平高于正常人，且达到了致病的水平，诊断为阳性结果；反之，诊断为阴性结果。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，当提及IL-17A蛋白(interleukin-17A)的氨基酸序列时，其包括IL-17A蛋白的全长；还包括IL-17A的融合蛋白，例如与小鼠或人IgG的Fc蛋白片段(mFc或hFc)进行融合的片段。然而，本领域技术人员理解，在IL-17A蛋白的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于置换，缺失和/或添加)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“IL-17A蛋白”应包括所有此类序列，包括其天然或人工的变体。并且，当描述IL-17A蛋白的序列片段时，其还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。
IL-17A的全长序列(155aa)如下，其中下划线标出的为信号肽序列(23aa)。
Figure GPA0000297012210000131
如本文中所使用的，如果没有特别说明，所述IL-17R为IL-17RA；其具体蛋白序列为现有技术中已知序列，可以参考现有文献或者GenBank中公开的序列。例如，IL-17RA(CD217，NCBI Gene ID：NP_055154.3)。
如本文中所使用的，术语EC50是指半最大效应浓度(concentration for 50％ofmaximal effect)，是指能引起50％最大效应的浓度。
如本文中所使用的，术语“抗体”是指，是指通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。从一般意义上，重链可以理解为抗体中分子量较大的多肽链，轻链是指抗体中分子量较小的多肽链。轻链可分类为κ和λ轻链。重链通常可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Kabat Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987 and 1991))，或Chothia& Lesk(1987)J.Mol.Biol.196：901-917；Chothia等人(1989)Nature 342：878-883的定义。特别地，重链还可以包含3个以上CDR，例如6、9、或12个。例如在本发明的双功能抗体中，重链可以是IgG抗体的重链的C端连接另一个抗体的ScFv，这种情况下重链含有9个CDR。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。
如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，Fundamental Immunology，Ch.7(Paul，W.，ed.，第2版，Raven Press，N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。在一些情况下，抗原结合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。
如本文中所使用的，术语“Fd片段”意指由VH和CH1结构域组成的抗体片段；术语“Fv片段”意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段；术语“dAb片段”意指由VH结构域组成的抗体片段(Ward等人，Nature 341：544-546(1989))；术语“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段；术语“F(ab′)2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段。
在一些情况下，抗体的抗原结合片段是单链抗体(例如，scFv)，其中VL和VH结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子(参见，例如，Bird等人，Science 242：423-426(1988)和Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883(1988))。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头，但也可使用其变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8：725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31：94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56：3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293：41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。
在一些情况下，抗体的抗原结合片段是双抗体，即，双价抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如，Holliger P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)，和Poljak R.J.等人，Structure 2：1121-1123(1994))。
可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体获得抗体的抗原结合片段(例如，上述抗体片段)，并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。
在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。
如本文中所使用的，术语“单抗”和“单克隆抗体”是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片断，也即除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(Nature，256：495，1975)，但也可采用重组DNA技术获得(如参见U.S.P 4,816,567)。
如本文中所使用的，术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其轻链或/和重链的一部分源自一个抗体(其可以源自某一特定物种或属于某一特定抗体类或亚类)，且轻链或/和重链的另一部分源自另一个抗体(其可以源自相同或不同的物种或属于相同或不同的抗体类或亚类)，但无论如何，其仍保留对目标抗原的结合活性(U.S.P 4,816,567 to Cabilly etal.；Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：68516855(1984))。
如本文中所使用的，术语“人源化抗体”是指，人源免疫球蛋白(受体抗体)的全部或部分CDR区被一非人源抗体(供体抗体)的CDR区替换后得到的抗体或抗体片段，其中的供体抗体可以是具有预期特异性、亲和性或反应性的非人源(例如，小鼠、大鼠或兔)抗体。此外，受体抗体的构架区(FR)的一些氨基酸残基也可被相应的非人源抗体的氨基酸残基替换，或被其他抗体的氨基酸残基替换，以进一步完善或优化抗体的性能。关于人源化抗体的更多详细内容，可参见例如，Jones et al.，Nature，321：522 525(1986)；Reichmann etal.，Nature，332：323 329(1988)；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593 596(1992)；和Clark，Immunol.Today 21：397 402(2000)。
如本文中所使用的，术语“表位”是指，抗原上被免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。“表位”在本领域内也称为“抗原决定簇”。表位或抗原决定簇通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链组成并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个连续或非连续的氨基酸，其可以是“线性的”或“构象的”。参见，例如，EpitopeMapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用的点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中，相互作用的点跨越彼此分开的蛋白质氨基酸残基而存在。
如本文中所使用的，术语“分离的”或“被分离的”指的是，从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”或“被分离的”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。
如本文中所使用的，术语“大肠杆菌表达系统”是指由大肠杆菌(菌株)与载体组成的表达系统，其中大肠杆菌(菌株)来源于市场上可得到的菌株，例如但不限于：GI698，ER2566，BL21(DE3)，B834(DE3)，BLR(DE3)。
如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。
如本文中所使用的，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10- 9M或10-10M或更小的解离平衡常数(KD)结合抗原，所述解离平衡常数可以通过，例如，使用Fortebio分子相互作用仪测得。
如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”和“单抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多克隆抗体”和“多抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
如本文中所使用的，术语“杂交瘤”和“杂交瘤细胞株”可互换使用，并且当提及术语“杂交瘤”和“杂交瘤细胞株”时，其还包括杂交瘤的亚克隆和后代细胞。例如，当提及杂交瘤细胞株LT006或LT007时，其还指杂交瘤细胞株LT006或LT007的亚克隆和后代细胞。
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR，19thed.Pennsylvania：Mack Publishing Company，1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
如本文中所使用的，术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，当其与抗原一起或预先递送入机体时，其可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂有很多种，包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)、弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂)、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物试验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂则在临床实验中使用较多。
如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如IL-17A与IL-17A受体结合或者IL-17A活性过高相关的疾病如自身免疫性疾病)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如IL-17A与IL-17A受体结合或者IL-17A活性过高相关的疾病如自身免疫性疾病)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
发明的有益效果
本发明取得了下述技术效果中的至少一项：
(1)本发明的单克隆抗体例如13E9 H1L1、13E9 H2L2、13E9 H3L2，以及2G2 H1L1、2G2 H2L2、2G2 H3L3均能够很好地特异性与IL-17A结合，并且能够十分有效地阻断IL-17A与IL-17A配体的结合，特异地降低IL-17A介导的成纤维细胞中IL-6分泌；
(2)本发明的单克隆抗体特别是13E9H2L2抑制IL-6分泌的作用与同靶点已上市药物Secukinumab效果一致；
(3)本发明的单克隆抗体具有应用于治疗和/或预防抗自身免疫疾病例如抗银屑病、类风湿关节炎、银屑病性关节炎、强直性脊柱炎或系统性红斑狼疮的潜力。
附图说明
图1：单克隆鼠源抗体13E9的SDS-PAGE检测结果。从左至右的4个泳道的样品及其上样量依次为：非还原型蛋白电泳上样缓冲液样品抗体，1μg；还原型蛋白电泳上样缓冲液样品抗体，1μg；Marker，5μl；BSA，1μg。
图2：单克隆鼠源抗体2G2的SDS-PAGE检测结果。从左至右的4个泳道的样品及其上样量依次为：非还原型蛋白电泳上样缓冲液样品抗体，1μg；还原型蛋白电泳上样缓冲液样品抗体，1μg；Marker，5μl；BSA，1μg。
图3：单克隆人源化抗体13E9 H3L2的SDS-PAGE检测结果。从左至右的3个泳道的样品及其上样量依次为：BSA，1μg；Marker，5μl；还原型蛋白电泳上样缓冲液样品抗体，1μg；非还原型蛋白电泳上样缓冲液样品抗体，1μg。
图4：抗体13E9 H1L1的动力学特征参数检测结果。图中纵坐标为信号值，单位为nm；横坐标为时间，单位为sec。
图5：抗体13E9 H2L2的动力学特征参数检测结果。图中纵坐标为信号值，单位为nm；横坐标为时间，单位为sec。
图6：抗体13E9 H3L2的动力学特征参数检测结果。图中纵坐标为信号值，单位为nm；横坐标为时间，单位为sec。
图7：抗体Secukinumab的动力学特征参数检测结果。图中纵坐标为信号值，单位为nm；横坐标为时间，单位为sec。
图8：抗体2G2 H1L1的动力学特征参数检测结果。图中纵坐标为信号值，单位为nm；横坐标为时间，单位为sec。
图9：抗体2G2 H2L2的动力学特征参数检测结果。图中纵坐标为信号值，单位为nm；横坐标为时间，单位为sec。
图10：抗体2G2 H3L3的动力学特征参数检测结果。图中纵坐标为信号值，单位为nm；横坐标为时间，单位为sec。
图11：抗体Secukinumab的动力学特征参数检测结果。图中纵坐标为信号值，单位为nm；横坐标为时间，单位为sec。
图12：采用间接ELISA方法检测抗体13E9 H1L1、13E9 H2L2与抗原IL17A-His的结合活性。已上市药物Secukinumab作为阳性对照。
图13：采用间接ELISA方法检测抗体13E9 H3L2与抗原IL17A-His的结合活性。已上市药物Secukinumab作为阳性对照。
图14：采用竞争ELISA方法检测抗体13E9 H1L1、13E9 H2L2与受体IL17RA-His(biotin)竞争结合的活性。已上市药物Secukinumab作为阳性对照。
图15：采用竞争ELISA方法检测抗体13E9 H3L2与受体IL17RA-His(biotin)竞争结合的活性。已上市药物Secukinumab作为阳性对照。
图16：采用间接ELISA方法检测抗体2G2 H1L1、2G2 H2L2和2G2 H3L3与抗原IL17A-His的结合活性。已上市药物Secukinumab作为阳性对照。
图17：采用竞争ELISA方法检测抗体2G2 H1L1、2G2 H2L2和2G2 H3L3与受体IL17RA-His(biotin)竞争结合抗原IL17A-His的活性。已上市药物Secukinumab作为阳性对照。
图18：抗体13E9 H1L1、13E9 H2L2和13E9 H3L2以及2G2 H1L1、2G2 H2L2和2G2H3L3对混合淋巴细胞细胞因子IL-6分泌的影响。
图19：抗体药13E9 H3L2对C57BL/6小鼠银屑病模型的表皮厚度的影响。
关于生物材料保藏的说明：
杂交瘤细胞株LT006(IL17A-13E9)，其于2017年9月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：C2017102，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，邮编：430072。
杂交瘤细胞株LT007(IL17A-2G2)，其于2017年9月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：C2017165，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，邮编：430072。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。
在下面的实施例中，使用的BALB/C小鼠购自广东省医学实验动物中心；使用的C57BL/6小鼠来源于南京银河生物医药有限公司；使用的MRC5细胞来源于上海复旦IBS细胞资源中心；使用的Secukinumab
Figure GPA0000297012210000201
单抗购自诺华公司。
实施例1：抗IL-17A的抗体13E9和2G2的制备
1.杂交瘤细胞株LT006和LT007的制备
制备抗IL-17A抗体所用的抗原IL17A(24-155)-his是人IL-17A(GenBank ID：Q16552)成熟肽与his标签的融合蛋白。取免疫BALB/C小鼠(购自广东医学实验动物中心)的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞，具体操作参考目前已确立的方法(例如，Stewart，S.J.，“Monoclonal Antibody Production”，in Basic Methods in antibodyProduction and Characterization，Eds.G.C.Howard and D.R.Bethell，Boca Raton：CRCPress，2000)。
用TEV蛋白酶酶切融合蛋白IL17A-his，并过柱纯化获得IL-17A(24-155)蛋白。用IL-17A(24-155)蛋白作为抗原包被酶标板，进行间接ELISA法筛选，得到分泌与IL-17A(24-155)特异性结合的新的抗体的杂交瘤细胞。
对间接ELISA筛选得到的杂交瘤细胞，通过竞争ELISA筛选出能够分泌与受体IL-17RA(CD217，NCBI Gene ID：NP_055154.3)竞争结合IL-17A的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并经过有限稀释法得到两株稳定的杂交瘤细胞株。
杂交瘤细胞株LT006(IL17A-13E9)，其于2015年9月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：C2017102，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，邮编：430072。其分泌的单克隆抗体命名为13E9。
杂交瘤细胞株LT007(IL17A-2G2)，其于2017年9月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：C2017165，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，邮编：430072。其分泌的单克隆抗体命名为2G2。
2.抗IL-17A的抗体13E9的制备
用杂交瘤无血清培养基对上面制得的LT006细胞株(1x105细胞每孔)进行培养(杂交瘤无血清培养基，内含1％青链霉素，4％的Glutamax，于5％CO2，37℃细胞培养箱中进行培养)，培养7天至存活率在20％左右时收集细胞培养上清，通过高速离心、微孔滤膜抽真空过滤以及HiTrap protein A HP柱进行纯化，制得抗体13E9。纯化后13E9样品进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图1所示。
3.抗IL-17A的抗体2G2的制备
用杂交瘤无血清培养基对上面制得的LT007细胞株(1x105细胞每孔)进行培养(杂交瘤无血清培养基，内含1％青链霉素，4％的Glutamax，于5％CO2，37℃细胞培养箱中进行培养)，培养7天至存活率在20％左右时收集细胞培养上清，通过高速离心、微孔滤膜抽真空过滤以及HiTrap protein A HP柱进行纯化，制得抗体2G2。纯化后2G2样品进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图2所示。
实施例2：抗体13E9的序列分析
参照实施例1中步骤2中的方法培养LT006细胞。
使用培养细胞细菌总RNA提取试剂盒(Tiangen，货号DP430)，按照试剂盒说明书的方法，从培养的LT006细胞中提取mRNA。
按照Invitrogen
Figure GPA0000297012210000224
III First-Strand Synthesis System for RT-PCR试剂盒说明书合成cDNA，并进行PCR扩增。
PCR扩增产物直接进行TA克隆，具体操作参考pEASY-T1Cloning Kit(TransgenCT101)试剂盒说明书进行。
将TA克隆的产物直接进行测序，测序结果如下：
重链可变区的核酸序列：(360bp)
Figure GPA0000297012210000221
其编码的氨基酸序列：(120aa)
Figure GPA0000297012210000222
轻链可变区的核酸序列：(333bp)
Figure GPA0000297012210000223
Figure GPA0000297012210000231
其编码的氨基酸序列：(111aa)
Figure GPA0000297012210000232
下划线标注区域为CDR区域。
实施例3：抗IL-17A的人源化抗体13E9H1L1、13E9H2L2和13E9 H3L2的设计、制备和 检测
1.抗IL-17A人源化抗体13E9H1L1、13E9H2L2和13E9 H3L2的轻链和重链序列的设计
根据IL-17A蛋白的三维晶体结构(EMBO J.(2001)20p：5332-41)以及实施例2获得的抗体13E9的序列，通过计算机模拟抗体模型，根据模型设计突变，得到抗体13E9H1L1、13E9H2L2和13E9 H3L2的可变区序列(抗体恒定区序列，来自NCBI的数据库，重链恒定区为Ig gamma-1 chain C region，ACCESSION：P01857，轻链恒定区为Ig kappa chain Cregion，ACCESSION：P01834)。
设计的可变区序列如下：
(1)人源化单克隆抗体13E9H1L1的重链和轻链序列
重链可变区的核酸序列：(360bp)
Figure GPA0000297012210000233
其编码的氨基酸序列：(120aa)
Figure GPA0000297012210000241
下划线标注区域为CDR区域。
轻链可变区的核酸序列：(333bp)
Figure GPA0000297012210000242
其编码的氨基酸序列：(111aa)
Figure GPA0000297012210000243
下划线标注区域为CDR区域。
(2)人源化单克隆抗体13E9H2L2的重链和轻链序列
重链可变区的核酸序列：(360bp)
Figure GPA0000297012210000244
其编码的氨基酸序列：(120aa)
Figure GPA0000297012210000251
下划线标注区域为CDR区域。
轻链可变区的核酸序列：(333bp)
Figure GPA0000297012210000252
其编码的氨基酸序列：(111aa)
Figure GPA0000297012210000253
下划线标注区域为CDR区域。
(3)人源化单克隆抗体13E9H3L2的重链和轻链序列
重链可变区的核酸序列：(360bp)
Figure GPA0000297012210000254
其编码的氨基酸序列：(120aa)
Figure GPA0000297012210000261
下划线标注区域为CDR区域。
轻链可变区的核酸序列与13E9H2L2的轻链可变区的核酸序列相同，如SEQ ID NO：11所示。
其编码的氨基酸序列亦与13E9H2L2的轻链可变区的氨基酸序列相同，如SEQ IDNO：12所示。
2.人源化抗体13E9H1L1、13E9H2L2和13E9 H3L2的制备
重链恒定区均采用Ig gamma-1 chain C region，ACCESSION：P01857；轻链恒定区均采用Ig kappa chain C region，ACCESSION：P01834。
将13E9H1L1重链cDNA和轻链的cDNA、13E9H2L2的重链cDNA和轻链的cDNA、以及13E9 H3L2重链cDNA和轻链的cDNA，分别克隆到pUC57simple(金斯瑞公司提供)载体中，分别获得pUC57simple-13E9H1、pUC57simple-13E9L1、pUC57simple-13E9H2、pUC57simple-13E9L2和pUC57simple-13E9H3，并将含有相应的重链的片段和含有相应的轻链的片段分别亚克隆到pcDNA3.1载体中获得pcDNA3.1-13E9H1、pcDNA3.1-13E9L1、pcDNA3.1-13E9H2、pcDNA3.1-13E9L2、pcDNA3.1-13E9H3以及pcDNA3.1-13E9L2重组质粒。之后将相应的轻链重组质粒与重链重组质粒一起(pcDNA3.1-13E9H1与pcDNA3.1-13E9L1；pcDNA3.1-13E9H2与pcDNA3.1-13E9L2；pcDNA3.1-13E9H3与pcDNA3.1-13E9L2)分别转染293F细胞后收集培养液进行纯化获得人源化抗体13E9H1L1、13E9H2L2和13E9 H3L2。纯化后13E9 H3L2样品进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图3所示。
实施例4：抗体2G2的序列公析
参照实施例1中步骤3中的方法培养LT007细胞。
使用培养细胞细菌总RNA提取试剂盒(Tiangen，货号DP430)，按照试剂盒说明书的方法，从培养的LT007细胞中提取mRNA。
按照Invitrogen
Figure GPA0000297012210000271
III First-Strand Synthesis System for RT-PCR试剂盒说明书合成cDNA，并进行PCR扩增。
PCR扩增产物直接进行TA克隆，具体操作参考pEASY-T1 Cloning Kit(TransgenCT101)试剂盒说明书进行。
将TA克隆的产物直接进行测序，测序结果如下：
重链可变区的核酸序列：(351bp)
Figure GPA0000297012210000272
其编码的氨基酸序列：(117aa)
Figure GPA0000297012210000273
下划线标注区域为CDR区域。
轻链可变区的核酸序列：(336bp)
Figure GPA0000297012210000274
其编码的氨基酸序列：(112aa)
Figure GPA0000297012210000275
Figure GPA0000297012210000281
下划线标注区域为CDR区域。
实施例5：抗IL-17A的人源化抗体2G2 H1L1、2G2 H2L2和2G2 H3L3的设计、制备和 检测
(1)人源化单克隆抗体2G2 H1L1的重链和轻链序列
重链可变区的核酸序列：(348bp)
Figure GPA0000297012210000282
其编码的氨基酸序列：(116aa)
Figure GPA0000297012210000283
下划线标注区域为CDR区域。
轻链可变区的核酸序列：(336bp)
Figure GPA0000297012210000284
其编码的氨基酸序列：(112aa)
Figure GPA0000297012210000285
Figure GPA0000297012210000291
下划线标注区域为CDR区域。
(2)人源化单克隆抗体2G2 H2L2的重链和轻链序列
重链可变区的核酸序列：(348bp)
Figure GPA0000297012210000292
其编码的氨基酸序列：(116aa)
Figure GPA0000297012210000293
下划线标注区域为CDR区域。
轻链可变区的核酸序列：(336bp)
Figure GPA0000297012210000294
其编码的氨基酸序列：(112aa)
Figure GPA0000297012210000295
Figure GPA0000297012210000301
下划线标注区域为CDR区域。
(3)人源化单克隆抗体2G2 H3L3的重链和轻链序列
重链可变区的核酸序列：(348bp)
Figure GPA0000297012210000302
其编码的氨基酸序列：(116aa)
Figure GPA0000297012210000303
下划线标注区域为CDR区域。
轻链可变区的核酸序列：(336bp)
Figure GPA0000297012210000304
其编码的氨基酸序列：(112aa)
Figure GPA0000297012210000305
下划线标注区域为CDR区域。
2.人源化抗体2G2 H1L1，2G2 H2L2，2G2 H3L3的制备和SDS-PAGE电泳检测
重链恒定区采用Ig gamma-1chain C region，ACCESSION：P01857；轻链恒定区采用Ig kappa chain C region，ACCESSION：P01834。
将2G2 H1L1重链cDNA和轻链的cDNA、2G2 H2L2的重链cDNA和轻链的cDNA、以及2G2H3L3重链cDNA和轻链的cDNA，分别克隆到pUC57simple(金斯瑞公司提供)载体中，分别获得pUC57simple-2G2H1、pUC57simple-2G2L1；pUC57simple-2G2H2、pUC57simple-2G2L2；和pUC57simple-2G2H3、pUC57simple-2G2L3。后将将含有相应的重链的核苷酸片段和含有相应的轻链的核苷酸片段分别亚克隆到pcDNA3.1载体中获得重组质粒pcDNA3.1-2G2H1、pcDNA3.1-2G2L1、pcDNA3.1-2G2H2、pcDNA3.1-2G2L2、pcDNA3.1-2G2H3和pcDNA3.1-2G2L3。后将相应的轻链重组质粒与重链重组质粒一起(pcDNA3.1-2G2H1和pcDNA3.1-2G2L1；pcDNA3.1-2G2H2和pcDNA3.1-2G2L2；pcDNA3.1-2G2H3和pcDNA3.1-2G2L3)分别转染293F细胞后收集培养液进行纯化获得人源化抗体2G2 H1L1、2G2 H2L2和2G2 H3L3。纯化后的样品进行SDS-PAGE电泳检测。
实施例6：13E9 H1L1、13E9 H2L2、13E9 H3L2与抗原IL-17A(24-155)蛋白结合的动 力学参数的测定
使用Fortebio分子相互作用仪测定人源化抗体13E9 H1L1、13E9 H2L2、13E9 H3L2与抗原IL-17A(24-155)结合的动力学参数。
使用EDC/NHS激活AR2G传感器，采用氨基偶联的方式把抗体固定到激活的AR2G传感器上，使用1M乙醇胺，pH8.5封闭传感器。传感器在PBST中平衡300s后，固定在传感器上的抗体与抗原IL-17A(24-155)蛋白(与实施例1使用的抗原相同)结合，抗原浓度为6.25-400nM(两倍梯度稀释)，结合时间为420s，抗原抗体在PBST中解离，时间600s。
抗体13E9 H1L1、13E9 H2L2、13E9 H3L2和Secukinumab的动力学参数见表1，动力学特征参数检测结果分别如图4、图5、图6和图7所示。
表1：13E9人源化抗体动力学参数
Figure GPA0000297012210000311
Figure GPA0000297012210000321
KD为亲和力常数；kon为抗原抗体结合速率；kdis为抗原抗体解离速率；KD＝kdis/kon。
结果表明，13E9 H1L1、13E9 H2L2、13E9 H3L2均与抗原IL-17A(24-155)有较好的亲和力，且亲和力与对照抗体Secukinumab相当。
实施例7：人源化抗体2G2 H1L1、2G2 H2L2、2G2 H3L3与抗原IL-17A(24-155)结合 的动力学参数的测定
使用Fortebio分子相互作用仪测定人源化抗体2G2 H1L1、2G2 H2L2、2G2 H3L3与抗原IL-17A(24-155)结合的动力学参数。
使用EDC/NHS激活AR2G传感器，采用氨基偶联的方式把抗体固定到激活的AR2G传感器上，使用1M乙醇胺，pH8.5封闭传感器。传感器在PBST中平衡300s后，固定在传感器上的抗体与抗原IL-17A(24-155)结合，抗原浓度为6.25-400nM(两倍梯度稀释)，结合时间为420s，抗原抗体在PBST中解离，时间600s。
抗体2G2 H1L1、2G2 H2L2、2G2 H3L3和Secukinumab的动力学参数见表2，动力学特征参数检测结果分别如图8、图9、图10和图11所示。
表2：2G2 H1L1、2G2 H2L2、2G2 H3L3和Secukinumab的动力学参数
抗体名称 K<sub>D</sub>(M) kon(1/Ms) kon误差 kdis(1/s) kdis误差 Rmax(nm)
2G2 H1L1 1.53E-09 1.46E+05 3.15E+03 2.24E-04 9.67E-06 0.0035-0.2192
2G2 H2L2 8.43E-10 1.42E+05 2.18E+03 1.20E-04 6.73E-06 0.0444-0.2732
2G2 H3L3 1.54E-09 1.98E+05 5.30E+03 3.06E-04 1.08E-05 0.011-0.2109
Secukinumab 1.08E-09 1.33E+05 2.38E+03 1.43E-04 8.09E-06 0.0118-0.2584
KD为亲和力常数；kon为抗原抗体结合速率；kdis为抗原抗体解离速率；KD＝kdis/kon。
结果表明，与对照抗体Secukinumab相比，2G2 H2L2与抗原IL-17A(24-155)具有更高亲和力；2G2 H1L1、2G2 H3L3亲和力与对照抗体Secukinumab相当。
实施例8：ELISA方法检测抗体13E9 H1L1、13E9 H2L2、13E9 H3L2与抗原的结合活 性
1.采用间接ELISA方法检测抗体13E9 H1L1、13E9 H2L2和13E9 H3L2与抗原IL17A-His的结合活性，并与同靶点已上市药物Secukinmab进行比较。
IL17A-his可以参照公开序列和本领域常规技术手段制备，也可以参考下面的步骤：
IL17A-his制备：通过NCBI蛋白质数据库查找人IL-17A的蛋白质序列，将人IL-17A全长序列与His＊6纯化标签序列进行融合设计。委托南京金斯瑞生物合成编码该融合蛋白的核酸，参照《分子克隆实验指南(第二版)》介绍的标准技术，采用PCR、酶切、胶回收、连接转化、菌落PCR或酶切鉴定等标准的分子克隆技术将目的基因亚克隆到哺乳动物细胞表达载体，并进一步对重组表达载体的目的基因进行测序分析。测序验证正确后，中大量制备去内毒素级别的表达质粒并将质粒瞬时转染HEK293细胞进行蛋白表达。培养7天后收集细胞培养液，采用Ni Sepharose柱(GE)进行亲和纯化，收获的蛋白样品使用SDS-PAGE和SEC-HPLC标准分析技术对其进行质量鉴定，结果合格。
ELISA：酶标板中加入IL17A-His孵育，4℃过夜，用1％BSA in PBS于37℃封闭2h后，分别加入抗体，37℃孵育30min，加入Goat Anti Human IgG(H+L)，HRP(Jackson，109-035-088)于37℃孵育30min，用TMB(Neogen，308177)进行显色反应5min，并在酶标仪中检测450nm波长吸光度。得到的实验数据用SoftMax Pro 6.2.1软件对数据进行分析处理，以抗体浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标进行4-parameter拟合曲线作图分析。
实验结果如图12、图13以及下面的表3和表4所示。
表3：13E9 H1L1、13E9 H2L2与抗原IL17A-His的结合活性检测结果
Figure GPA0000297012210000331
Figure GPA0000297012210000341
表4：13E9 H3L2与抗原IL17A-His的结合活性检测结果
Figure GPA0000297012210000342
实验结果显示，抗体13E9 H1L1、13E9 H2L2和13E9 H3L2均能有效地结合抗原IL17A-His，其结合效率呈剂量依赖关系。在相同实验条件下，13E9 H1L1的结合EC50为0.044nM，13E9 H2L2的结合EC50为0.048nM，同靶点已上市药物Secukinumab的EC50为0.082nM(图12，表3)；在相同实验条件下，13E9 H3L2的结合EC50为0.043nM，同靶点已上市药物Secukinumab的EC50为0.078(图13，表4)。
以上实验结果表明，在相同实验条件的情况下13E9 H1L1、13E9 H2L2和13E9 H3L2的EC50值均小于同靶点阳性对照药物Secukinumab，表明13E9 H1L1、13E9 H2L2和13E9 H3L2的与IL17A-His的结合活性优于已上市同靶点对照药物Secukinumab。
2.采用竞争ELISA方法检测抗体13E9 H1L1、13E9 H2L2、13E9 H3L2阻断IL17RA-His(biotin)与抗原IL17A-His结合的活性。
IL17RA-His(biotin)可以参照公开序列和本领域常规技术手段制备，也可以参考下面的步骤：
IL17RA-His(biotin)制备：通过NCBI蛋白质数据库查找人IL-17RA的蛋白质序列，将人IL-17RA胞外区序列与His＊6纯化标签序列进行融合设计。委托南京金斯瑞生物合成编码该融合蛋白的核酸，参照《分子克隆实验指南(第二版)》介绍的标准技术，采用PCR、酶切、胶回收、连接转化、菌落PCR或酶切鉴定等标准的分子克隆技术将目的基因亚克隆到哺乳动物细胞表达载体，并进一步对重组表达载体的目的基因进行测序分析。测序验证正确后，中大量制备去内毒素级别的表达质粒并将质粒瞬时转染HEK293细胞进行蛋白表达。培养7天后收集细胞培养液，采用Ni Sepharose柱(GE)进行亲和纯化，收获的蛋白样品使用SDS-PAGE和SEC-HPLC标准分析技术对其进行质量鉴定，结果合格。蛋白样品质量鉴定完毕后，使用Thermo scientific的商业化试剂盒
Figure GPA0000297012210000352
Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit标记获得生物素化偶联的人IL-17RA-His蛋白样品，具体制备方法参照该试剂盒的说明书进行。
ELISA：酶标板中加入IL17A-His孵育，4℃过夜，用1％BSA in PBST于37℃封闭2h后，分别加入抗体，抗原抗体室温反应10分钟，再加入受体IL17RA-His(biotin)，与抗体体积1∶1混匀后于37℃孵育30min，加入SA-HRP(KPL，14-30-00)于37℃孵育30min，用TMB(Neogen，308177)进行显色反应5min，并在酶标仪中检测450nm波长吸光度。得到的实验数据用SoftMax Pro 6.2.1软件对数据进行分析处理，以抗体浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标进行4-parameter拟合曲线作图分析。实验结果如图14、图15以及下面的表5和表6所示。
表5：13E9 H1L1、13E9 H2L2与受体IL17RA-His(biotin)竞争结合抗原IL-17A-His的活性检测结果
Figure GPA0000297012210000351
表6：13E9 H3L2与受体IL17RA-His(biotin)竞争结合抗原IL17A-His的活性检测结果
Figure GPA0000297012210000361
实验结果显示，抗体13E9 H1L1、13E9 H2L2和13E9 H3L2均能有效地阻断受体IL17RA-His(biotin)与抗原IL17A-His的结合，阻断效率呈现剂量依赖关系。在相同实验条件下，13E9 H1L1与IL17AR-His(biotin)竞争结合IL17A-His的EC50为1.437nM，13E9 H2L2与IL17AR-His(biotin)竞争结合IL17A-His的EC50为1.281nM，同靶点阳性对照药物Secukinumab与IL17AR-His(biotin)竞争结合IL17A-His的EC50为1.807nM(表5，图14)；13E9H3L2与IL17AR-His(biotin)竞争结合IL17A-His的EC50为0.805nM，同靶点已上市药物Secukinumab与IL17AR-His(biotin)竞争结合IL17A-His的EC50为1.580nM(表6，图15)。
以上实验结果表明，在相同实验条件的情况下13E9 H1L1、13E9 H2L2和13E9 H3L2与IL17AR-His(biotin)竞争结合IL17A-His的EC50值均小于同靶点已上市对照药物Secukinumab，提示13E9 H1L1、13E9 H2L2和13E9 H3L2与IL17AR-His(biotin)竞争结合IL17A-His的活性优于同靶点已上市药物Secukinumab。
实施例9：ELISA方法检测抗体2G2 H1L1、2G2 H2L2和2G2 H3L3与抗原的结合活性
1.采用间接ELISA方法检测抗体2G2 H1L1、2G2 H2L2和2G2 H3L3与抗原IL17A-His的结合活性。
实验步骤：酶标板中加入IL17A-His孵育，4℃过夜，用1％BSA in PBS于37℃封闭2h后，分别加入抗体，37℃孵育30min，加入Goat Anti Human IgG(H+L)，HRP(Jackson，109-035-088)于37℃孵育30min，用TMB(Neogen，308177)进行显色反应5min，并在酶标仪中检测450nm波长吸光度。得到的实验数据采用SoftMax Pro 6.2.1软件进行分析处理，以抗体浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标进行4-parameter拟合曲线作图分析。
实验结果如图16和下面的表7所示。其中，2G2 H1L1的结合EC50为0.177nM，2G2H2L2的结合EC50为0.372nM，2G2 H3L3的结合EC50为0.421nM。
表7：2G2 H1L1、2G2 H2L2、2G2 H3L3与抗原IL17A-His的结合检测结果
Figure GPA0000297012210000371
实验结果表明，抗体2G2 H1L1、2G2 H2L2和2G2 H3L3均能有效地结合抗原IL17A-His，结合效率呈现剂量依赖关系。
2.采用竞争ELISA方法检测抗体2G2 H1L1、2G2 H2L2和2G2 H3L3与受体IL17RA-His(biotin)竞争结合抗原IL17A-His的活性。
实验步骤：酶标板中加入IL17A-His孵育，4℃过夜，用1％BSA in PBST于37℃封闭2h后，分别加入抗体，抗原抗体室温反应10分钟，再加入受体IL17RA-His(biotin)，与抗体体积1∶1混匀后于37℃孵育30min，加入SA-HRP(KPL，14-30-00)于37℃孵育30min，用TMB(Neogen，308177)进行显色反应5min，并在酶标仪中检测450nm波长吸光度。得到的实验数据用SoftMax Pro 6.2.1软件对数据进行分析处理，以抗体浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标进行4-parameter拟合曲线作图分析。
实验结果如图17和下面的表8所示。其中，2G2 H1L1的阻断EC50为2.264nM，2G2H2L2的阻断EC50为5.408nM，2G2 H3L3的阻断EC50为5.911nM(图17，表8)。
表8：2G2 H1L1、2G2 H2L2、2G2 H3L3与受体IL17RA-His(biotin)竞争结合抗原IL17A-His的活性检测结果
Figure GPA0000297012210000381
实验结果表明，抗体2G2 H1L1、2G2 H2L2和2G2 H3L3均能有效地阻断受体IL17RA-His(biotin)与抗原IL17A-His的结合，阻断效率呈现剂量依赖关系。
实施例10：混合人胚胎成纤维细胞反应：细胞因子IL-6的分泌
MRC 5(购自中国科学院细胞中心)细胞接种到96孔板，5000cell/孔，培养过夜。MRC 5细胞中加入在37摄氏度下孵育20min的IL-17和抗体混合物后(hIgG做为对照)，培养48小时。48小时培养结束后后收集细胞上清液，采用ELISA试剂盒检测IL-6(购自达科为公司)的分泌量。
MRC 5细胞分别加入13E9 H1L1、13E9 H2L2、13E9 H3L2、2G2 H1L1、2G2 H2L2或2G2H3L3(1，10，100nM)以及Secukinumab(1，10，100nM)混合培养后，分泌的IL-6检测结果如图18所示。
由图18可见，13E9 H1L1、13E9 H2L2、13E9 H3L2和2G2 H2L2均能有效地降低MRC 5细胞在IL-17诱导下的IL-6的分泌。其中：
13E9 H1L1抗体在浓度为100nM时抑制IL-6分泌的效果优于同剂量对照抗体Secukinumab，浓度为10nM时对IL-6分泌的抑制效果与对照抗体Secukinumab在100nM时相当；
13E9 H2L2抗体在浓度为1nM、10nM以及100nM水平时均与同剂量对照抗体Secukinumab抑制IL-6分泌的效果相当；
13E9 H3L2抗体对IL-6分泌的抑制效果在浓度为10nM和100nM时均优于同剂量对照抗体Secukinumab，在1nM水平与对照抗体Secukinumab相当；
2G2 H2L2在浓度为1nM、100nM时均与对照抗体Secukinumab抑制IL-6分泌的效果相当；
2G2 H3L3在浓度为1nM时抑制IL-6分泌的效果优于同剂量对照抗体Secukinumab。
以上结果表明，在体外混合人胚胎成纤维细胞反应中，本发明的抗体阻断IL-17A介导的IL-6分泌的生活学活性优于或至少相当于同靶点已上市药物Secukinumab。
实施例11：抗体药13E9 H3L2对C57BL/6小鼠银屑病模型的表皮厚度的影响
C57BL/6小鼠，分为5组，每组8只。
(1)造模：
正常组，在C57BL/6小鼠光滑的背部第1天至第6天连续6天皮内注射生理盐水，25μl/只；
其余各组小鼠第1天至第4天皮内注射重组人IL-17A，2μg/25μl/只，第5天至第6天皮内注射重组人IL-17A 5μg/25μl/只。
(2)具体分组和给药情况：
正常组：生理盐水，给药剂量0mg/kg，一周3次共给药3次；
模型组：阴性同型对照，给药剂量50mg/kg，一周3次共给药3次；
Secukinumab组：Secukinumab，给药剂量50mg/kg，一周3次共给药3次；
13E9 H3L2高剂量组：给药剂量50mg/kg，一周3次共给药3次；
13E9 H3L2低剂量组：给药剂量10mg/kg，一周3次共给药3次。
每组均给药3次，分别是在造模前1天、造模第3天、造模第6天，皮下给药。
造模第7天固定小鼠背部注射部位皮肤制作病理切片并测量表皮厚度。
实验结果如图19所示。
结果显示，Secukinumab组(50mg/kg)和13E9 H3L2高剂量组(50mg/kg)、13E9 H3L2低剂量组(10mg/kg)的表皮厚度在统计学上均显著小于模型组(P＜0.01)。
结果表明，抗体药13E9 H3L2(50mg/kg)在C57BL/6小鼠银屑病模型中显示有统计学显著意义的表皮厚度的抑制作用，与Secukinumab(50mg/kg)药效一致；抗体药13E9 H3L2(10mg/kg)的表皮厚度的抑制作用在统计学上也有显著差异。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (15)

1.抗IL-17A的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含：
a)重链可变区(VH)，其包含CDR1、CDR2和CDR3的互补决定区(CDR)，其中CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示，以及CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示；和
b)轻链可变区(VL)，其包含CDR1、CDR2和CDR3的CDR，其中CDR1的氨基酸序列如SEQ IDNO:34所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示，以及CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中：
所述VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，并且
所述VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
3.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，
所述VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，并且
所述VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
4.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中：
所述VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，和
所述VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。
5.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中：
所述VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示，和
所述VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。
6.根据权利要求1至5中任一权利要求所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、单链抗体、人源化抗体、嵌合抗体和双抗体。
7.根据权利要求1至5中任一权利要求所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述的单克隆抗体或其抗原结合片段以小于100nM的EC50结合IL-17A。
8.根据权利要求1至5中任一权利要求所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述的单克隆抗体或其抗原结合片段包括非-CDR区，且所述非-CDR区来自不是小鼠的物种。
9.分离的核酸分子，其包含编码权利要求1至5中任一权利要求所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的重链可变区和轻链可变区的核酸。
10.一种偶联物，其包括权利要求1至5中任一权利要求所述的单克隆抗体或其抗原结合片段和包含可检测的标记物的偶联部分。
11.一种试剂盒，其包括权利要求1至5中任一权利要求所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。
12.一种药物组合物，其包含权利要求1至5中任一权利要求所述的单克隆抗体或其抗原结合片段和至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。
13.权利要求1至5中任一权利要求所述的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗受试者的自身免疫性疾病的药物中的用途，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段用于以至少一种有效量给予所述受试者。
14.权利要求13所述的用途，其中所述自身免疫性疾病选自银屑病、类风湿关节炎、银屑病性关节炎、强直性脊柱炎和系统性红斑狼疮。
15.权利要求13所述的用途，其中所述自身免疫性疾病为中度至重度斑块性银屑病。
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