BR112020024512A2 - anticorpo anti-interleucina-17a, composição farmacêutica, e, uso dos mesmos - Google Patents

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Abstract

SENSOR DE RECUPERAÇÃO DE ÓLEO. A presente divulgação se refere a sistemas e métodos para medir o conteúdo de óleo-água em misturas de óleo-água, independentemente da salinidade da mistura. O conteúdo de óleo é medido usando um sensor dielétrico. É determinado se o conteúdo de óleo está acima ou abaixo de um limiar. Se o conteúdo de óleo estiver acima do limiar, o conteúdo de óleo é relatado usando a medição do sensor dielétrico. Se o conteúdo de óleo estiver abaixo do limiar, o conteúdo de óleo é relatado usando a medição do sensor de corrente parasita.

Description

ANTICORPO ANTI-INTERLEUCINA-17A, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, USO DOS MESMOS
CAMPO TÉCNICO
[001]A presente invenção pertence ao campo de imunologia molecular, e refere-se a um anticorpo anti-interleucina-17A, a uma composição farmacêutica do mesmo e ao uso dos mesmos. Em particular, a presente invenção refere-se a um anticorpo monoclonal anti-interleucina-17A.
FUNDAMENTO TÉCNICO
[002]Interleucina-17A (abreviada como IL-17A ou IL 17A) é um membro da família de citocinas IL-17 que tem 6 membros, isto é, IL-17A (a IL-17A foi descoberta primeiro e é também chamada IL-17), IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E (também denominadas como IL-25) e IL-17F (Shi Peiqing et al., Chinese Journal of Cell Biology 33: 345-357 (2011)). IL-17F compartilha cerca de 50% de homologia com IL-17A, e seus genes codificantes estão localizados no mesmo segmento de cromossoma 6p12 (Gaffen et al., Nat Rev Immunol 9:556-67 (2009)). IL-17A e IL-17F podem existir na forma homodímeros como IL-17A/IL-17A e IL-17F/IL-17F, assim como o heterodímero IL-17A/IL-17F. IL-17A e IL-17F exibem efeitos biológicos para ligação a receptores (Wright et al., J Immunol 181: 2799-805 (2008)).
[003]A família de receptor de IL-17 (IL-17R) consiste em 5 membros, isto é, IL-17RA, IL-17RB, IL-17RC, IL-17RD, e IL- 17RE. Membros da família do receptor de IL-17 podem formar diferentes complexos de receptores, em que IL-17RA, a maior molécula descoberta até agora nesta família, é uma subunidade comum que transmite sinais para pelo menos quatro ligantes, e exibe efeitos biológicos principais (Gaffen et al., Nat
Rev Immunol 9: 556-67 (2009)). O complexo IL-17RA e IL-17RC medeia as respostas celulares para IL-17A e IL-17F (Toy et al., J Immunol 177: 36-9 (2006)).
[004]IL-17A é mais crítica do que IL-17F na resposta inflamatória autoimune, a razão chave sendo que IL17RA tem uma afinidade cem vezes maior com IL-17A do que para IL-17F (Ely et al., Nat Immunol 10 1245-51 (2009)), a resposta de uma célula a IL-17A é 10 vezes mais forte do que a para IL- 17F (Dubin et al., Immunity 30: 9-11 (2009)). Um anticorpo anti-IL-17A ou um anticorpo de receptor de anti-IL-17 pode ser usado para bloquear a ligação da IL-17A ao receptor do mesmo, assim bloqueando a atividade biológica de IL-17A.
[005]IL-17A desempenha um papel importante em várias doenças autoimunes (por exemplo psoríase, artrite psoriática, artrite reumatoide, espondilite anquilosante, lúpus eritematoso sistêmico, etc.). O anticorpo monoclonal anti-IL-17A Secukinumab é aprovado pela agência Food and Drug Administration (FDA) e a agência European Medicines Agency (EMA) para o tratamento de psoríase de placas moderada a grave, artrite psoriática e espondilite anquilosante.
[006]Psoríase, também conhecida como psora, é uma doença da pele autoimune crônica. As características histológicas da pele da mesma são hiperproliferações de ceratinócitos epidérmicos, angiogênese, assim como célula dendrítica, macrófago, neutrófilo, e infiltrações de células T. (Nestle et al., N Engl J Med, 361: 496-509 (2009)). Psoríase tem várias manifestações, entre as quais a psoríase em placas é o tipo mais comum, representando mais de 90% de todos os pacientes com psoríase. Artrite psoriática (PsA) é um tipo especial de psoríase, que causa erupção cutânea de psoríase,
bem como dor, inchaço, sensibilidade, rigidez e discinesia nas articulações e tecidos moles circundantes. Alguns pacientes podem ter sacroiliíte e (ou) espondilite com curso prolongado, recidiva fácil e rigidez articular em estágio avançado, levando à incapacidade. A existência de psoríase é uma diferença importante entre a artrite psoriática e outras doenças inflamatórias das articulações, e a gravidade das lesões da pele não está diretamente relacionada com o grau de inflamações das articulações (Tan Zhen et al., Chinese Journal of Rheumatology 20:354-357 (2016)).
[007]A expressão de IL-17A é significativamente aumentou nos tecidos patogênicos da pele psoriásica, e esse aumento está intimamente relacionado à atividade da doença da psoríase (Johansen et al., Brit J Dermatol, 160:319-24 (2009); Lowes et al. J Invest Dermatol 128:1207-11 (2008)). Dentre os pacientes com psoríase, o anticorpo monoclonal anti-IL-17A Secukinumab mostrou excelente eficácia, o que pode aliviar significativamente a atividade da doença em pacientes com psoríase e reduzir a área das placas de psoríase (Langley et al., N Engl J Med, 371:326-38 (2014)); Secukinumab também pode reduzir significativamente os sintomas de artrite e melhorar significativamente as funções das articulações de pacientes com artrite psoriática (Gottlieb et al., J Drugs Dermatol, 14821-33 (2015)). Secukinumab é aprovado pela FDA para o tratamento de psoríase em placas moderada a grave e artrite psoriática.
[008]Artrite reumatoide (RA) é principalmente caracterizada por proliferação de fibroblastos sinoviais inflamatória nas articulações, lesões nas articulações e cartilagem, infiltrações de células T auxiliares CD4+ e células plasmáticas produtoras de autoanticorpos. A IL-17A pode causar tanto inflamação como lesões nos ossos na artrite reumatoide. IL-17A é altamente expressa em monócitos sinoviais reumatoides de pacientes com artrite reumatoide em relação a pessoas saudáveis ou pacientes com osteoartrite (Sarkar et al., Clin Exp Immunol. 177: 652-61 (2014)), estudos citológicos sugerem que IL-17A pode estimular a reabsorção óssea e destruição do colágeno (Kitami et al., Biochimie. 92: 398-404 (2010)). IL-17A pode induzir a cartilagem, células sinoviais, macrófagos e osteoblastos a secretar citocinas pró-inflamatórias, como TNFa, IL-1b e IL- 6, e exercem efeitos biológicos. Essas citocinas pró- inflamatórias causam o início súbito de artrite reumatoide e podem manter o número de células TH17 por meio de IL-6 induzida por IL-17A, formando, assim, uma realimentação positiva e atuando sinergicamente para amplificar seus efeitos inflamatórios e estabelecer um estado inflamatório crônico (Ogura et al., Immunity 29: 628-36 (2008)). Antagonizar IL-17A pode efetivamente aliviar os sintomas de artrite reumatoide. Em um modelo de camundongo com artrite induzida por colágeno, neutralizar IL-17A ou o receptor do mesmo pode resolver os sintomas de artrite reumatoide (Chao et al., Autoimmunity. 2011 May; 44 (3):243-52); a deficiência de IL-17 pode proteger camundongo hospedeiro da artrite induzida por colágeno (Nakae et al., J Immunol, 171: 6173-7 (2003)) enquanto a super-expressão de IL-17A pode agravar tais condições (Lubberts et al., Inflamm Res 51: 102-4 (2002)).
[009]Espondilite anquilosante (AS) é uma doença autoimune crônica. As primeiras características patológicas da AS são inflamações agudas ou crônicas nos pontos de fixação óssea das articulações sacroilíacas, tendões e ligamentos, que podem evoluir para discite e artrite facetária em um estágio posterior; e ocorre um fenômeno de densidade óssea diminuída em todos os pacientes com AS. Estudos demonstraram que tanto o número de células Th17 que secretam IL-17A no sangue periférico como a concentração de IL-17A de pacientes com AS são significativamente elevados do que em pessoas saudáveis (Gracey et al., Arthritis Rheumatol. 68: 679- 89. (2016)). IL-17A pode ativar uma variedade de células, como macrófagos, células dendríticas, células endoteliais, fibroblastos, condrócitos e osteoblastos, que podem produzir um grande número de fatores destrutivos inflamatórios (Ogura et al., Immunity 29: 628- 36 (2008)). Em tecidos ósseos, IL-17A induz osteoblastos para expressar ativador do receptor de ligante de fator- B nuclear (RANKL), ativa osteoclastos, assim induzindo a reabsorção óssea, cumulativamente exacerbando a perda óssea e causando destruição óssea diretamente ou indiretamente (Gaffen, Curr Rheumatol Rep 11:365-370 (2009)). Dentre os pacientes com AS, o anticorpo monoclonal anti-IL-17A Secukinumab mostrou excelente eficácia, que pode reduzir significativamente os sintomas e sinais de espondilite anquilosante (Baeten et al., N Engl J Med, 373:2534-48 (2015)). Com base nestes resultados, Secukinumab foi aprovado pela FDA para o tratamento de espondilite anquilosante.
[0010]Lúpus eritematoso sistêmico (SLE) é uma doença autoimune que afeta sistemas múltiplos. Especificamente, anticorpos contra autoantígenos aparecem nos corpos dos pacientes, que atacam vários tecidos ou órgãos diretamente ou indiretamente, e as áreas mais comumente afetadas incluem pele, articulações e rins. Estudos demonstraram que IL-17A desempenha um papel em SLE. A razão de células produtoras de IL-17A no sangue periférico de pacientes com SLE está aumentada, e o nível de IL-17A no soro de pacientes é anormalmente elevado (Chen et al., J Clin Immunol, 30: 221- 5 (2010)). Células mononucleares do sangue periférico de pacientes com SLE acompanhadas de lesão renal podem produzir mais IgG total, IgG anti-dsDNA e IL-6, quando cultivadas com IL-17, indicando que IL-17 pode participar na ativação de células B (Dong et al., Chin Med J (Engl), 116: 543-8 (2003)). Também foi verificado recentemente que IL-17A pode cooperar com BAFF (fator de ativação de células B) para proteger células B de apoptose, aumentando, assim, o número de células produzindo autoanticorpos (Onishi et al., Immunology 129: 311-21 (2010)).
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0011]Após um estudo intensivo e esforço criativo, os inventores usaram sistemas de expressão de células de mamíferos para expressar IL-17A recombinante (24-155) como um antígeno para imunizar camundongos, e obtiveram um grande número de amostras de células de hibridoma por fusão de células do baço e células de mieloma de camundongo. Os inventores obtiveram as seguintes duas linhagens de células de hibridoma separadamente por triagem de um grande número das amostras: linhagem de células de hibridoma LT006 (IL-17A-13E9), que foi depositada junto ao China Center for Type Culture Collection (CCTCC) em 12 de setembro de 2017 com um número de acesso de CCTCC NO: C2017102; e linhagem de células de hibridoma LT007 (IL-17A-2G2), que foi depositada junto ao China Center for Type Culture Collection (CCTCC) em 12 de setembro de 2017 com um número de acesso de CCTCC NO: C2017165.
[0012]Os inventores verificaram de modo surpreendente que: a linhagem de células de hibridoma LT006 pode secretar e produzir um anticorpo monoclonal específico (denominado como 13E9) que especificamente se liga a IL-17A, e o anticorpo monoclonal pode bloquear a ligação de IL-17A a IL- 17RA muito efetivamente; a linhagem de células de hibridoma LT007 pode secretar e produzir um anticorpo monoclonal específico (denominado como 2G2) que especificamente se liga a IL-17A, e o anticorpo monoclonal pode bloquear a ligação de IL-17A a IL-17RA muito efetivamente; além disso, os inventores prepararam criativamente anticorpos humanizados anti-IL-17A (denominado como 13E9 H1L1, 13E9 H2L2, 13E9 H3L2; e 2G2 H1L1, 2G2 H2L2, 2G2 H3L3, respectivamente), todos podendo se ligar a IL-17A humana efetivamente, bloquear ligação de IL-17A a receptores de IL- 17A, e inibir a ativação de vias de sinalização a jusante dos receptores de IL-17A; o anticorpo da presente invenção tem o potencial de produzir fármacos para prevenir e/ou tratar doenças autoimunes como psoríase, artrite reumatoide, artrite psoriática, espondilite anquilosante, e lúpus eritematoso sistêmico.
[0013]A seguinte invenção é assim apresentada:
um aspecto da presente invenção refere-se a um anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que, a região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal compreende: HCDR1-HCDR3 com as sequências de aminoácido mostradas em SEQ ID NOs: 31-33 respectivamente, ou HCDR1-HCDR3 com as sequências de aminoácido mostradas em SEQ ID NOs: 37-39 respectivamente; e a região variável de cadeia leve (VL) do anticorpo monoclonal compreende: LCDR1-LCDR3 com as sequências de aminoácido mostradas em SEQ ID NOs: 34-36 respectivamente, ou LCDR1-LCDR3 com as sequências de aminoácido mostradas em SEQ ID NOs: 40-42 respectivamente.
[0014]As regiões variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada determinam a ligação do antígeno; a região variável de cada cadeia contém três regiões hipervariáveis, ou seja, regiões determinantes de complementariedade (CDRs) (as CDRs da cadeia pesada (H) incluem HCDR1, HCDR2, HCDR3, e as CDRs da cadeia leve (L) incluem LCDR1, LCDR2, LCDR3; definido por Kabat et al., Ver, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª. ed. (1991), Volumes 1-3, NIH Publication 91- 3242, Bethesda Md).
[0015]As sequências de aminoácido das regiões de CDR do anticorpo monoclonal em (1) a (2) acima são analisadas por meios técnicos bem conhecidos dos versados na técnica, por exemplo, por um banco de dados VBASE2: os anticorpos 13E9, 13E9 H1L1, 13E9 H2L2, e 13E9 H3L2 da presente invenção têm as mesmas CDRs: as sequências de aminoácido das três regiões de CDR da região variável de cadeia pesada são como a seguir:
HCDR1: SYSFTSDYA (SEQ ID NO: 31), HCDR2: ITYSGVT (SEQ ID NO: 32), HCDR3: ARADYDSYYTMDY (SEQ ID NO: 33); e as sequências de aminoácido das três regiões de CDR da região variável de cadeia leve são como a seguir: LCDR1: QSLVHSNGNTY (SEQ ID NO: 34), LCDR2: KVS (SEQ ID NO: 35), LCDR3: SQSTHFWT (SEQ ID NO: 36).
[0016]Os anticorpos 2G2, 2G2 H1L1, 2G2 H2L2, e 2G2 H3L3 da presente invenção têm as mesmas CDRs: as sequências de aminoácido as três regiões de CDR da região variável de cadeia pesada são como a seguir: HCDR1: SEVFPIAD (SEQ ID NO: 37), HCDR2: ILPSFGRT (SEQ ID NO: 38), HCDR3: ARGNYGFAY (SEQ ID NO: 39); e as sequências de aminoácido das três regiões de CDR da região variável de cadeia leve são como a seguir: LCDR1: QSLLNSDGKTY (SEQ ID NO: 40), LCDR2: LVS (SEQ ID NO: 41), LCDR3: WQGSHFPQT (SEQ ID NO: 42).
[0017]Em uma ou mais modalidades da presente invenção, o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que, a região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal compreende HCDR1-HCDR3 com as sequências de aminoácido mostradas em SEQ ID NOs: 31-33 respectivamente, e a região variável de cadeia leve (VL) do anticorpo monoclonal compreende LCDR1-LCDR3 com as sequências de aminoácido mostradas em SEQ ID NOs: 34-36 respectivamente.
[0018]Em uma ou mais modalidades da presente invenção, o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que, a região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal compreende HCDR1-HCDR3 com as sequências de aminoácido mostradas em SEQ ID NOs: 37-39 respectivamente, e a região variável de cadeia leve (VL) do anticorpo monoclonal compreende LCDR1-LCDR3 com as sequências de aminoácido mostradas em SEQ ID NOs: 40-42 respectivamente.
[0019]Em uma ou mais modalidades da presente invenção, o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que, a sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada é selecionada dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 24, e SEQ ID NO: 28; e a sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve é selecionada dentre SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, e SEQ ID NO: 30.
[0020]Em uma ou mais modalidades da presente invenção, o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que, a sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada é selecionada dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, e SEQ ID NO: 14, e a sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve é selecionada dentre SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, e SEQ ID NO: 12;
ou a sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada é selecionada dentre SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 24, e SEQ ID NO: 28, e a sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve é selecionada dentre SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, e SEQ ID NO: 30.
[0021]Em uma ou mais modalidades da presente invenção, o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que a região variável de cadeia pesada e região variável de cadeia leve são selecionadas dentre qualquer uma das seguintes (1) a (8): (1) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 2, e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 4; (2) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 6, e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 8; (3) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 10, e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 12; (4) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 14, e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 12; (5) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 16, e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 18; (6) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 20, e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 22; (7) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 24, e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 26; e (8) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 28, e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 30.
[0022]Em uma ou mais modalidades da presente invenção, o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é selecionado dentre um Fab, um Fab', um F(ab')2, um Fd, um Fv, um dAb, um fragmento de região determinante de complementariedade, um anticorpo de cadeia única, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico e um diacorpo.
[0023]Em uma ou mais modalidades da presente invenção, o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que, o anticorpo monoclonal se liga proteína IL-17A com um EC50 de menos do que cerca de 100 nM, como menos do que cerca de 10 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2,5 nM, 2 nM, ou menos; preferivelmente, a EC50 é medida por um método ELISA competitivo.
[0024]Em algumas modalidades da presente invenção, o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anticorpo monoclonal se liga à proteína IL-17A com um KD de menos do que cerca de 10-5 M, como menos do que cerca de 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, ou menos; preferivelmente, o KD é medido por um instrumento de interação molecular Fortebio.
[0025]Em algumas modalidades da presente invenção, o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anticorpo monoclonal se liga à proteína IL-17A com um EC50 de menos do que cerca de 100 nM, como menos do que cerca de 10 nM, 1 nM, 0,9 nM, 0,8 nM, 0,7 nM, 0,6 nM, 0,5 nM, 0,4 nM, 0,3 nM, 0,2 nM, 0,1 nM, ou menos; em particular, a EC50 é medida por um método ELISA indireto.
[0026]Em uma ou mais modalidades da presente invenção, o anticorpo monoclonal compreende regiões não CDR, e as regiões não CDR são de espécie diferente de murino, como de um anticorpo humano.
[0027]Em algumas modalidades da presente invenção, a região constante da imunoglobulina é humanizada, por exemplo, as regiões constantes de cadeia pesada usam região de cadeia C Ig gama-1, ACESSO: P01857; e as regiões constantes de cadeia leve usam região C de cadeia Ig kappa, ACESSO: P01834.
[0028]Em uma ou mais modalidades da presente invenção, o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que: o anticorpo monoclonal é produzido pela linhagem de células de hibridoma LT006, que foi depositada junto ao China Center for Type Culture Collection (CCTCC) com um número de acesso de CCTCC NO: C2017102; ou o anticorpo monoclonal é produzido pela linhagem de células de hibridoma LT007, que foi depositada junto ao China Center for Type Culture Collection (CCTCC) com um número de acesso de CCTCC NO: C2017165.
[0029]Em uma ou mais modalidades da presente invenção, o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é usado para prevenir e/ou tratar tumores ou doenças autoimunes, ou para diagnosticar doenças autoimunes; preferivelmente, a doença autoimune é selecionada dentre psoríase, artrite reumatoide, artrite psoriática, espondilite anquilosante, e lúpus eritematoso sistêmico; preferivelmente, a psoríase é psoríase de placas moderada a grave.
[0030]Em uma ou mais modalidades da presente invenção, o anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é usado para: bloquear a ligação de IL-17A a IL-17RA, regular (por exemplo, regular para baixo) atividade ou nível de IL-17A, ou inibir expressão de IL-6 em células.
[0031]Outro aspecto da presente invenção refere-se a uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo sequências de nucleotídeo codificando a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos monoclonais descritos na presente invenção.
[0032]Em uma ou mais modalidades da presente invenção, a molécula de ácido nucleico isolada compreende sequências de nucleotídeo selecionadas dentre qualquer uma das seguintes (1) a (8): (1) SEQ ID NO: 1 ID NO: 3; (2) SEQ ID NO: 5 ID NO: 7;
(3) SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 11; (4) SEQ ID NO: 13 ID NO: 11; (5) SEQ ID NO: 15 ID NO: 17; (6) SEQ ID NO: 19 ID NO: 21; (7) SEQ ID NO: 23 ID NO: 25; e (8) SEQ ID NO: 27 ID NO: 29.
[0033]Outro aspecto da presente invenção refere-se a um vetor recombinante compreendendo a molécula de ácido nucleico isolada da presente invenção. Preferivelmente, o vetor recombinante é um vetor de expressão recombinante, como um vetor de expressão procariótico recombinante ou um vetor de expressão eucariótico recombinante.
[0034]Outro aspecto da presente invenção refere-se a uma célula hospedeira compreendendo o vetor recombinante da presente invenção.
[0035]Outro aspecto da presente invenção refere-se a um método para preparar qualquer um dos anticorpos monoclonais ou dos fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos descritos na presente invenção, compreendendo as etapas de cultivar a célula hospedeira na presente invenção sob condições apropriadas e isolar o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo das culturas celulares.
[0036]Outro aspecto da presente invenção refere-se a uma linhagem de células de hibridoma selecionada dentre: a linhagem de células de hibridoma LT006, que foi depositada junto ao China Center for Type Culture Collection (CCTCC) com um número de acesso de CCTCC NO: C2017102; e a linhagem de células de hibridoma LT007, que foi depositada junto ao China Center for Type Culture Collection (CCTCC) com um número de acesso de CCTCC NO: C2017165.
[0037]Outro aspecto da presente invenção refere-se a um conjugado compreendendo um anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e uma porção conjugada, em que o anticorpo monoclonal é qualquer um dos anticorpos monoclonais ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos descritos na presente invenção, a porção conjugada é um marcador detectável; preferivelmente, o marcador detectável é um isótopo radioativo, uma substância luminescente como uma substância fluorescente, uma substância colorida, ou uma enzima.
[0038]Outro aspecto da presente invenção refere-se a um kit compreendendo qualquer um dos anticorpos monoclonais ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, descritos na presente invenção ou compreendendo o conjugado da presente invenção; preferivelmente, o kit compreende adicionalmente um segundo anticorpo que especificamente reconhece o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; opcionalmente, o segundo anticorpo compreende adicionalmente um marcador detectável; preferivelmente, o marcador detectável é um isótopo radioativo, uma substância luminescente como uma substância fluorescente, uma substância colorida, ou uma enzima.
[0039]Outro aspecto da presente invenção refere-se ao uso de qualquer um dos anticorpos monoclonais ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos descritos na presente invenção ou do conjugado da presente invenção na preparação de um kit para detecção qualitativa ou quantitativa para IL- 17A. A detecção qualitativa refere-se à detecção da presença de IL-17A na amostra a ser testada, e a detecção quantitativa refere-se à detecção da concentração ou teor de IL-17A na amostra a ser testada.
[0040]Outro aspecto da presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo qualquer um dos anticorpos monoclonais ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos descritos na presente invenção ou do conjugado da presente invenção; opcionalmente, a composição farmacêutica compreende adicionalmente carreadores ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
[0041]Outro aspecto da presente invenção refere-se ao uso de qualquer um dos anticorpos monoclonais ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos descritos na presente invenção ou do conjugado da presente invenção na preparação de um fármaco para prevenir e/ou tratar tumores ou doenças autoimunes, ou ao uso na preparação de um fármaco para diagnosticar doenças autoimunes; preferivelmente, a doença autoimune é selecionada dentre psoríase, artrite reumatoide, artrite psoriática, espondilite anquilosante, e lúpus eritematoso sistêmico; preferivelmente, a psoríase é psoríase de placas moderada a grave.
[0042]Em particular, os inventores verificaram, a partir de experimentos com animais (Exemplo 11), que 13E9H3L2 pode inibir efetivamente o aumento em espessura epidérmica de um modelo de camundongo C57BL/6 com psoríase, em que é mostrado como um fármaco de anticorpo 13E9H3L2 pode inibir de modo significativo o aumento da espessura epidérmica do camundongo causada por IL-17A e injeção subcutânea, tendo uma eficácia um equivalente ao fármaco de anticorpo monoclonal comercializado como Secukinumab para o mesmo alvo.
[0043]Em algumas modalidades da presente invenção, as doenças autoimunes (por exemplo, psoríase como psoríase de placas moderada a grave, artrite reumatoide, artrite psoriática, espondilite anquilosante ou lúpus eritematoso sistêmico) são causadas por um nível elevado de expressão de IL-17A. O nível elevado de expressão descrito aqui refere- se ao nível de expressão maior do que o de pessoas saudáveis e que alcançaram um nível patogênico.
[0044]Outro aspecto da presente invenção refere-se a uso de qualquer um dos anticorpos monoclonais ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos descritos na presente invenção ou do conjugado da presente invenção na preparação dos seguintes fármacos: fármacos para bloquear a ligação de IL-17A a IL-17RA, fármacos para regular (por exemplo, regular para baixo) a atividade ou nível de IL-17A, ou fármacos para inibir a expressão de IL-6 em células.
[0045]Outro aspecto da presente invenção refere-se a um método in vivo ou in vitro compreendendo a etapa de administrar a uma célula ou a um indivíduo em necessidade de uma quantidade eficaz de qualquer um dos anticorpos monoclonais ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos descritos na presente invenção ou do conjugado da presente invenção, e o método é selecionada dentre os seguintes: métodos para bloquear a ligação de IL-17A a IL-17RA, métodos para regular (por exemplo, regular para baixo) a atividade ou nível de IL-17A, ou métodos para inibir a expressão de IL-6 em fibroblastos.
[0046]Em uma modalidade específica da presente invenção, o método in vitro é não terapêutico e/ou não diagnóstico.
[0047]Interleucina 6 (abreviada como IL-6 ou IL 6) pode ser produzida por fibroblastos, monócitos/macrófagos, linfócitos T, linfócitos B, células epiteliais, ceratinócitos, e várias células de tumor. Interleucina 6 é um fator importante para regular a resposta imune, e IL-6 e IL-1 podem promover sinergisticamente a proliferação de células T, estimular a diferenciação de células B, e participar nas respostas inflamatórias do corpo (Schoenborn et al. Advances in Immunology 96: 41-101 (2007)). O experimento in vitro (Exemplo 10) da presente invenção mostra que o anticorpo anti-IL-17A pode reduzir de modo significativo a secreção de IL-6 e inibir a resposta imune mediada por IL-6-.
[0048]Outro aspecto da presente invenção refere-se a um método para tratar e/ou prevenir tumores ou doenças autoimunes, e o método compreende a etapa de administrar a um indivíduo em necessidade de uma quantidade eficaz de qualquer um dos anticorpos monoclonais ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos descritos na presente invenção ou do conjugado da presente invenção; preferivelmente, a doença autoimune é selecionada dentre psoríase, artrite reumatoide, artrite psoriática, espondilite anquilosante, e lúpus eritematoso sistêmico; preferivelmente, a psoríase é psoríase de placas moderada a grave.
[0049]Outro aspecto da presente invenção refere-se a um método para diagnosticar doenças autoimunes, e o método compreende a etapa de aplicar uma amostra a ser testada (como um amostra de tecido, uma amostra de célula, ou um a amostra de sangue) ou administrar a um indivíduo em necessidade de uma quantidade eficaz de qualquer um dos anticorpos monoclonais ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos descritos na presente invenção ou o conjugado da presente invenção; preferivelmente, a doença autoimune é selecionada dentre psoríase, artrite reumatoide, artrite psoriática, espondilite anquilosante, e lúpus eritematoso sistêmico; preferivelmente, a psoríase é psoríase de placas moderada a grave.
[0050]Em algumas modalidades da presente invenção, considerando que doenças autoimunes (por exemplo, psoríase, como psoríase em placas moderada a grave, artrite reumatoide, artrite psoriática, espondilite anquilosante ou lúpus eritematoso sistêmico) são causadas por um nível de expressão de IL-17A elevado, assim o diagnóstico pode ser realizado por detecção do nível de expressão de IL-17A usando qualquer um dos anticorpos monoclonais ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos descritos na presente invenção ou o conjugado da presente invenção. Se o nível de expressão de IL-17A é maior do que o de pessoas saudáveis e alcançou o nível patogênico, o diagnóstico é um resultado positivo; de outra forma, o diagnóstico é um resultado negativo.
[0051]Na presente invenção, salvo definido de outra forma, os termos científicos e técnicos usados aqui têm os significados geralmente compreendidos pelos versados na técnica. Além disso, as operações laboratoriais de cultura celular, genética molecular, química de ácido nucleico e imunologia aqui usadas são as operações de rotina amplamente usadas nos campos correspondentes. No entanto, a fim de melhor compreender a presente invenção, as definições e explicações dos termos relevantes são apresentadas abaixo.
[0052]Como usado aqui, quando a sequência de aminoácido da proteína IL-17A (interleucina-17A) é mencionada, ela inclui o comprimento completo da proteína IL-17A; também uma proteína de fusão de IL-17A, como um fragmento fusionado a um fragmento de proteína de IgG de camundongo ou humano (mFc ou hFc). No entanto, os versados na técnica irão entender que na sequência de aminoácido da proteína IL-17A, mutações ou variações (incluindo, mas não limitadas a, substituições, deleções e/ou adições) podem ser geradas naturalmente ou introduzidas artificialmente sem afetar as funções biológicas das mesmas. Assim, na presente invenção, o termo "proteína IL-17A" deve incluir todas estas sequências, incluindo suas variantes naturais ou artificiais. Além disso, quando o fragmento de sequência da proteína IL-17A é descrito, a proteína IL-17A também inclui os fragmentos de sequência correspondentes em variantes naturais ou artificiais dos mesmos.
[0053]A sequência de comprimento completo (155aa) de IL- 17A é como a seguir, em que a sequência do peptídeo sinal (23aa) é sublinhada.
MTPGKTSLVSLLLLLSLEAIVKAGITIPRNPGCPNSEDKNFPRTVMVNLNIHNRN
TNTNPKRSSDYYNRSTSPWNLHRNEDPERYPSVIWEAKCRHLGCINADGNVDYHMNSVP IQQEILVLRREPPHCPNSFRLEKILVSVGCTCVTPIVHHVA (SEQ ID NO: 43)
[0054]Como usado aqui, salvo definido de outra forma, a IL-17R é IL-17RA; a sequência da proteína específica da mesma é uma sequência conhecida na técnica anterior, e referência pode ser feita à sequência divulgada na literatura existente ou GenBank. Por exemplo, IL-17RA (CD217, NCBI Gene ID: NP_055154.3).
[0055]Como usado aqui, o termo EC50 refere-se à concentração para 50% de efeito máximo, isto é, a concentração que pode causar 50% do efeito máximo.
[0056]Como usado aqui, o termo "anticorpo" refere-se a uma molécula de imunoglobulina que geralmente consiste em dois pares de cadeias de polipeptídeo (cada par com uma cadeia "leve" (L) e uma cadeia "pesada" (H)). Em um sentido geral, a cadeia pesada pode ser interpretada como uma cadeia de polipeptídeo com um peso molecular maior em um anticorpo, e a cadeia leve refere-se a uma cadeia de polipeptídeo com um peso molecular menor em um anticorpo. As cadeias leves são classificadas como cadeias leves e As cadeias pesadas são geralmente classificadas como ou e isotipos de anticorpos são definidos como IgM, IgD, IgG, IgA, e IgE, respectivamente. Em cadeias leves e cadeias pesadas, a região variável e a região constante são ligadas por uma região "J" de cerca de 12 ou mais aminoácidos, e a cadeia pesada também compreende uma região "D" de cerca de 3 ou mais aminoácidos. Cada cadeia pesada consiste em uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região constante de cadeia pesada (CH). A região constante de cadeia pesada consiste em 3 domínios (CH1, CH2 e CH3). Cada cadeia leve consiste em uma região variável de cadeia leve (VL) e um região constante de cadeia leve (CL). A região constante de cadeia leve consiste em um domínio CL. A região constante do anticorpo pode mediar a ligação de imunoglobulinas para os tecidos ou fatores hospedeiros, incluindo a ligação de várias células do sistema imune (por exemplo, células efetoras) do primeiro componente (C1q) de sistema de complemento clássico. As regiões VH e VL podem ser subdivididas adicionalmente em regiões altamente variáveis (chamadas regiões determinantes de complementariedade (CDRs)), e entre as quais as regiões conservativas, chamadas regiões de framework (FRs) são distribuídas. Cada VH e VL consiste em 3 CDRs e 4 FRs dispostas a partir do término amino para o término carboxila na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis (VH e VL) de cada par de cadeia pesada/cadeia leve formam um sítio de ligação ao anticorpo, respectivamente. A projeção de aminoácidos para cada região ou domínio segue a definição de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 e 1991)), ou Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al. (1989) Nature 342:878-883. Em particular, a cadeia pesada também pode compreender mais do que 3 CDRs, como 6, 9, ou 12. Por exemplo, no anticorpo biespecífico da presente invenção, a cadeia pesada pode ser um ScFv com o C-término da cadeia pesada de anticorpo IgG ligado a outro anticorpo e, neste caso, a cadeia pesada compreende 9 CDRs. O termo "anticorpo" não é limitado por qualquer método específico para produzir anticorpo. Por exemplo, o anticorpo inclui, em particular, um anticorpo recombinante, um anticorpo monoclonal ou um anticorpo policlonal. Anticorpos podem ser de diferentes isotipos, como anticorpos IgG (por exemplo, subtipos IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4), IgA1, IgA2, IgD, IgE ou IgM.
[0057]Como usado aqui, o termo "fragmento de ligação ao antígeno" refere-se ao polipeptídeo compreendendo o fragmento de um anticorpo de comprimento completo, que mantém a capacidade para especificamente se ligar ao mesmo antígeno ao qual o anticorpo de comprimento completo se liga, e/ou competir com o anticorpo de comprimento completo para a ligação específica ao antígeno, que é também conhecido como
"porção de ligação ao antígeno". Ver, geralmente, Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2a. ed., Raven Press, N.Y. (1989), que é incorporado aqui por referência em sua totalidade para todos os fins. Fragmento de ligação ao antígeno do anticorpo pode ser produzido por tecnologia de DNA recombinante ou por clivagem enzimática ou química de anticorpos intactos. Em alguns casos, o fragmento de ligação ao antígeno inclui um Fab, um Fab', um F (ab')2, um Fd, um Fv, um dAb, um fragmento de região determinante de complementariedade (CDR), um fragmento de anticorpo de cadeia única (por exemplo, scFv), um anticorpo quimérico, um diacorpo e tal polipeptídeo, que compreende pelo menos uma porção do anticorpo suficiente para conferir capacidade de ligação ao antígeno específica para um polipeptídeo.
[0058]Como usado aqui, o termo "fragmento Fd" refere-se a um fragmento de anticorpo consistindo em domínios VH e CH1; o termo "fragmento Fv" refere-se a um fragmento de anticorpo consistindo em domínios VL e VH de um braço único de um anticorpo; o termo "fragmento dAb" refere-se a um fragmento de anticorpo consistindo em um domínio VH (Ward et al., Nature 341:544-546 (1989)); o termo "fragmento Fab" refere- se a um fragmento de anticorpo consistindo em domínios VL, VH, CL, e CH1; e o termo " fragmento F (ab')2" refere-se a um fragmento de anticorpo compreendendo dois fragmentos Fab ligados pela ponte dissulfeto em uma região de dobradiça.
[0059]Em alguns casos, o fragmento de ligação ao antígeno do anticorpo é um anticorpo de cadeia única (por exemplo, scFv) em que os domínios VL e VH são pareados para formar uma molécula monovalente por meio de um ligador que permite aos mesmos produzir uma cadeia única de polipeptídeo (ver, por exemplo, Bird et al., Science 242:423-426 (1988) e Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988)). Tais moléculas de scFv podem ter uma estrutura geral: NH2-VL- ligador-VH-COOH ou NH2-VH-ligador-VL-COOH. Um ligador apropriado da técnica anterior consiste em uma sequência de aminoácido GGGGS de repetição ou uma variante das mesmas. Por exemplo, um ligador tendo a sequência de aminoácido (GGGGS)4 pode ser usado, mas variantes do mesmo também podem ser usados (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448). Outros ligadores que podem ser usados na presente invenção são descritos por Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8:725-731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31: 94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56:3055-3061, Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56 e Roovers et al. (2001), Cancer Immunol.
[0060]Em alguns casos, o fragmento de ligação ao antígeno do anticorpo é um diacorpo, isto é, um anticorpo bivalente, em que os domínios VH e VL são expressados em uma cadeia única de polipeptídeo. No entanto, o ligador usado é muito curto para permitir o pareamento dos dois domínios na mesma cadeia, assim os domínios são forçados a parear com os domínios complementares na outra cadeia e dois sítios de ligação ao antígeno são gerados (ver, por exemplo, Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993), e Poljak RJ et al., Structure 2:1121-1123 (1994)).
[0061]Fragmentos de ligação ao antígeno (por exemplo, fragmentos de anticorpos acima mencionados) de anticorpos podem ser obtidos a partir de dados anticorpos usando técnicas convencionais conhecidas dos versados na técnica (por exemplo, tecnologia de DNA recombinante ou clivagem enzimática ou química), e os fragmentos de ligação ao antígeno dos anticorpos são triados para especificidade do mesmo modo como para os anticorpos intactos.
[0062]Como usado aqui, salvo de outra forma claramente definido no contexto, quando se referindo ao termo "anticorpo", ele inclui não somente anticorpos intactos, mas também fragmentos de ligação ao antígeno de anticorpos.
[0063]Como usado aqui, os termos "mAb" e "anticorpo monoclonal" referem-se a um anticorpo ou um fragmento de um anticorpo que é derivado do grupo de anticorpos altamente homólogos, isto é, de um grupo de moléculas de anticorpo idênticas, exceto por mutações naturais que podem ocorrer espontaneamente. O anticorpo monoclonal tem uma elevada especificidade para um único epítopo em um antígeno. O anticorpo policlonal, relativo ao anticorpo monoclonal, geralmente compreende pelo menos dois ou mais diferentes anticorpos que geralmente reconhecem diferentes epítopos em um antígeno. Anticorpos monoclonais podem ser geralmente obtidos por tecnologia de hibridoma primeiro relatada por Kohler et al. (Nature, 256:495, 1975), mas também podem ser obtidos por tecnologia de DNA recombinante (por exemplo, ver Patente US 4.816.567).
[0064]Como usado aqui, o termo "anticorpo quimérico" refere-se a um anticorpo do qual uma parte das cadeias leve e/ou pesada é derivada de um anticorpo (que pode ser derivado de uma espécie específica ou pertence a uma classe ou subclasse específica do anticorpo), e a outra parte das cadeias leve e/ou pesada é derivada de outro anticorpo (que pode ser derivado da mesma ou diferente espécie ou pertencer à mesma ou diferente classe ou subclasse de anticorpo). Mas,
em qualquer caso, ele retém a atividade de ligação para o antígeno alvo (Patente US 4.816.567 para Cabilly et al.; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 6855 (1984)).
[0065]Como usado aqui, o termo "anticorpo humanizado" refere-se a um anticorpo ou fragmento de anticorpo obtido quando toda ou uma parte de regiões de CDR de uma imunoglobulina humana (anticorpo receptor) é substituída pelas regiões de CDR de um anticorpo não humano (anticorpo doador), em que o anticorpo doador pode ser um anticorpo não humano (por exemplo, camundongo, rato ou coelho) tendo a especificidade, afinidade ou reatividade esperada. Além disso, alguns resíduos de aminoácido nas regiões de framework (FRs) do anticorpo receptor também podem ser substituídos pelos resíduos de aminoácido de anticorpos não humanos correspondentes ou pelos resíduos de aminoácido de outros anticorpos para ainda melhorar ou otimizar o desempenho do anticorpo. Para maiores detalhes sobre anticorpos humanizados, ver, por exemplo, Jones et al., Nature, 321:522 525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323 329 (1988); Presta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593 596 (1992); e Clark, Immunol. Today 21: 397 402 (2000).
[0066]Como usado aqui, o termo "epítopo" refere-se a um sítio no antígeno ao qual uma imunoglobulina ou anticorpo especificamente se liga. "Epítopo" é também chamado na técnica como um "determinante antigênico". O epítopo ou determinante antigênico geralmente consiste em grupos quimicamente ativos na superfície de uma molécula como aminoácidos ou carboidratos ou cadeias laterais de açúcar, e geralmente tem características estruturais tridimensionais específicas e características de carga específicas. Por exemplo, o epítopo geralmente inclui pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou 15 aminoácidos consecutivos ou não consecutivos em uma conformação espacial única, que pode ser "linear" ou "conformacional". Ver, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996). Em um epítopo linear, todos os pontos de interação entre uma proteína e uma molécula de interação (por exemplo, um anticorpo) existem linearmente ao longo da sequência primária de aminoácido da proteína. Em um epítopo conformacional, os pontos de interação existem através dos resíduos de aminoácido da proteína que são separados um de cada outro.
[0067]Como aqui usado, o termo "isolado" refere-se ao obtido por meios artificiais do estado natural. Se uma determinada substância ou componente "isolado" aparece na natureza, isto pode ser devido à mudança em seu ambiente natural, ou está isolado do ambiente natural, ou ambos. Por exemplo, um certo polinucleotídeo ou polipeptídeo não isolado existe naturalmente em um determinado animal vivo, e o mesmo polinucleotídeo ou polipeptídeo com uma pureza elevada isolado de tal estado natural é chamado polinucleotídeo ou polipeptídeo isolado. O termo "isolado" não exclui a existência de substâncias artificiais ou sintéticas ou outras impurezas que não afetam a atividade da substância.
[0068]Como usado aqui, o termo "sistema de expressão de E. coli” refere-se a um sistema de expressão consistindo em E. coli (cepa) e um vetor, em que a E. coli (cepa) é derivada de uma cepa comercialmente disponível, como, mas não limitada a, GI698, ER2566, BL21 (DE3), B834 (DE3), e BLR (DE3).
[0069]Como usado aqui, o termo "vetor" refere-se a um veículo de ácido nucleico em que um polinucleotídeo pode ser inserido. Quando o vetor permite a expressão da proteína codificada pelo polinucleotídeo inserido, o vetor é denominado vetor de expressão. Um vetor pode ser introduzido em uma célula hospedeira por transformação, transdução ou transfecção, de modo que os elementos da substância genética carregados pelo vetor possam ser expressos na célula hospedeira. Vetores são bem conhecidos dos versados na técnica, incluindo, mas não limitados a: plasmídeos; fagemídeos; cosmídeos; cromossomos artificiais, tais como cromossomos artificiais de levedura (YAC), cromossomos artificiais bacterianos (BAC) ou cromossomos artificiais derivados de P1 (PAC); fagos tais como fagos lambda ou fagos M13 e vírus de animais, etc. Os vírus animais que podem ser usados como vetores incluem, mas não são limitados a, retrovírus (incluindo lentivírus), adenovírus, vírus adeno- associados, vírus herpes (como vírus herpes simplex), poxvírus, baculovírus, papilomavírus e papovavírus (como o SV40). Um vetor pode conter uma variedade de elementos que controlam a expressão, incluindo, mas não limitados a, sequências de promotor, sequências de iniciação de transcrição, sequências de intensificador, elementos de seleção e genes repórter. Além disso, o vetor pode conter adicionalmente um sítio de início de replicação.
[0070]Como usado aqui, o termo "célula hospedeira" refere-se a células que podem ser usadas para introduzir vetores, incluindo, mas não limitadas a, células procarióticas como E. coli ou bacillus subtilis, células fúngicas como células de leveduras ou aspergillus, células de insetos como células de drosófilas S2 ou Sf9, ou células animais como fibroblastos, células CHO, células COS, células NSO, células HeLa, células BHK, células HEK 293, ou células humanas.
[0071]Como usado aqui, o termo "KD" refere-se a uma constante de equilíbrio de dissociação para uma interação específica anticorpo-antígeno, que é usada para descrever a de afinidade de ligação entre o anticorpo e o antígeno. Quanto menor a constante de equilíbrio de dissociação, mais firme a ligação anticorpo-antígeno, e maior a afinidade entre o anticorpo e o antígeno. Geralmente, anticorpos se ligam a antígenos com uma constante de equilíbrio de dissociação (KD) de menos do que cerca de 10-5 M, como menos do que cerca de 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, ou menos, e a constante de equilíbrio de dissociação pode ser medida por, por exemplo, usando um instrumento de interação molecular Fortebio.
[0072]Como usado aqui, os termos " anticorpo monoclonal " e "mAb" têm os mesmos significados e podem ser usados de modo intercambiável; os termos "anticorpo policlonal " e "PcAb" têm os mesmos significados e podem ser usados de modo intercambiável; os termos "polipeptídeo" e "proteína" têm os mesmos significados e podem ser usados de modo intercambiável. E, na presente invenção, aminoácidos são geralmente representados por abreviações de letra única e de três letras conhecidos na técnica. Por exemplo, alanina pode ser representada por A ou Ala.
[0073]Como usado aqui, os termos "hibridoma" e "linhagem de células de hibridoma" podem ser usados de modo intercambiável, e quando se referindo aos termos "hibridoma" e "linhagem de células de hibridoma", eles também incluem subclones e células da progênie do hibridoma. Por exemplo, quando se referindo a linhagem de células de hibridoma LT006 ou LT007, também se refere a subclones e células da progênie da linhagem de células de hibridoma LT006 ou LT007.
[0074]Como usado aqui, o termo "carreador e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável" refere-se a um carreador e/ou excipiente que é farmacologicamente e/ou fisiologicamente compatível com o indivíduo e o ingrediente ativo, o que é bem conhecido na técnica (ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences. Editado por Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995), e inclui, mas não é limitado a, reguladores do pH, tensoativos, adjuvantes, e intensificadores da força iônica. Por exemplo, os reguladores de pH incluem, mas não são limitados a, tampão fosfato, os tensoativos incluem, mas não são limitados a, tensoativos catiônicos, aniônicos, ou não iônicos, como Tween-80; e os intensificadores de força iônica incluem, mas não são limitados a, cloreto de sódio.
[0075]Como usado aqui, o termo "adjuvante" refere-se a um intensificador imune não específico, que pode intensificar a resposta imune do corpo aos antígenos ou mudar o tipo de resposta imune quando entregue no corpo junto com os antígenos ou entregue no corpo antes. Existem vários adjuvantes, incluindo, mas não limitados a, adjuvante de alumínio (por exemplo, hidróxido de alumínio), adjuvante de Freund (por exemplo, adjuvante de Freund completo e adjuvante de Freund incompleto), corynebacterium parvum, lipopolissacarídeo, citocina, etc. O adjuvante de Freund é o adjuvante mais comumente usado em experimentos com animal. O adjuvante de hidróxido de alumínio é mais usado em experimentos clínicos.
[0076]Como usado aqui, o termo "quantidade eficaz" refere-se a uma quantidade suficiente para obter, ou obter pelo menos parcialmente, o efeito desejado. Por exemplo, a quantidade eficaz para prevenir doenças (por exemplo, doenças relacionadas com a ligação de IL-17A ao receptor de IL-17A ou atividade excessiva de IL-17A, como doenças autoimunes) é uma quantidade suficiente para evitar, parar ou retardar o início de doenças (por exemplo, doenças relacionadas com a ligação de IL-17A ao receptor de IL-17A ou atividade excessiva de IL-17A, como doenças autoimunes); uma quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade suficiente para curar ou pelo menos parar parcialmente uma doença e suas complicações em pacientes que já tiveram a doença. Está bem de acordo com a capacidade dos versados na técnica determinar uma tal quantidade eficaz. Por exemplo, a quantidade eficaz para uso terapêutico irá depender da gravidade da doença a ser tratada, o estado geral do próprio sistema imune do paciente, a condição geral do paciente como idade, peso e gênero, o modo da administração do fármaco, e outros tratamentos administrados de modo conjunto, etc. Os efeitos benéficos da invenção
[0077]A presente invenção alcança pelo menos um dos seguintes efeitos técnicos: (1) os anticorpos monoclonais da presente invenção como 13E9 H1L1, 13E9 H2L2, 13E9 H3L2, e 2G2 H1L1, 2G2 H2L2, 2G2 H3L3 podem se ligar, todos, especificamente a IL-17A muito bem, e podem efetivamente bloquear a ligação de IL-17A ao ligante IL-17A e especificamente reduzir a secreção de IL-6 nos fibroblastos mediados por IL-17A; (2) os anticorpos monoclonais da presente invenção, especialmente 13E9 H2L2, tem o mesmo efeito como o fármaco comercializado Secukinumab para o mesmo alvo na inibição da secreção de IL-6; (3) os anticorpos monoclonais da presente invenção apresentam o potencial de serem aplicados no tratamento e/ou prevenção de doenças anti-autoimunes como psoríase, artrite reumatoide, artrite psoriática, espondilite anquilosante ou lúpus eritematoso sistêmico.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0078]Figura 1: resultados da detecção SDS-PAGE do anticorpo monoclonal murino 13E9. As amostras das quatro trilhas da esquerda para direita e suas respectivas quantidades de carga são: anticorpo em tampão de carga de eletroforese da proteína não redutora, 1 µg; anticorpo em tampão de carga de eletroforese da proteína redutora, 1 µg; Marcador, 5 BSA, 1 µg.
[0079]Figura 2: resultados da detecção SDS-PAGE do anticorpo monoclonal murino 2G2. As amostras das quatro trilhas da esquerda para direita e suas respectivas quantidades de carga são: anticorpo em tampão de carga de eletroforese da proteína não redutora, 1 µg; anticorpo em tampão de carga de eletroforese da proteína redutora, 1 µg; Marcador, 5 BSA, 1 µg.
[0080]Figura 3: resultados da detecção SDS-PAGE de anticorpo monoclonal humanizado 13E9 H3L2. As amostras das três trilhas da esquerda para direita e suas cargas respectivas são: BSA, 1 µg; Marcador, 5 µl; anticorpo em tampão de carga de eletroforese da proteína redutora, 1 µg; anticorpo em tampão de carga de eletroforese da proteína não redutora, 1 µg.
[0081]Figura 4: resultados da detecção dos parâmetros cinéticos característicos de anticorpo 13E9 H1L1. Na figura, ordenada é valor de sinal com nm como unidade; abscissa é tempo com segundos como unidade.
[0082]Figura 5: resultados da detecção dos parâmetros cinéticos característicos de anticorpo 13E9 H2L2. Na figura, ordenada é valor de sinal com nm como unidade; abscissa é tempo com segundos como unidade.
[0083]Figura 6: resultados da detecção dos parâmetros cinéticos característicos de anticorpo 13E9 H3L2. Na figura, ordenada é valor de sinal com nm como unidade; abscissa é tempo com segundos como unidade.
[0084]Figura 7: resultados da detecção dos parâmetros cinéticos característicos de anticorpo Secukinumab. Na figura, ordenada é valor de sinal com nm como unidade; abscissa é tempo com segundos como unidade.
[0085]Figura 8: resultados da detecção dos parâmetros cinéticos característicos de anticorpo 2G2 H1L1. Na figura, ordenada é valor de sinal com nm como unidade; abscissa é tempo com segundos como unidade.
[0086]Figura 9: resultados da detecção dos parâmetros cinéticos característicos de anticorpo 2G2 H2L2. Na figura, ordenada é valor de sinal com nm como unidade; abscissa é tempo com segundos como unidade.
[0087]Figura 10: resultados da detecção dos parâmetros cinéticos característicos de anticorpo 2G2 H3L3. Na figura, ordenada é valor de sinal com nm como unidade; abscissa é tempo com segundos como unidade.
[0088]Figura 11: resultados da detecção dos parâmetros cinéticos característicos de anticorpo Secukinumab. Na figura, ordenada é valor de sinal com nm como unidade; abscissa é tempo com segundos como unidade.
[0089]Figura 12: detecção da atividade de ligação de anticorpos 13E9 H1L1 e 13E9 H2L2 para antígeno IL17A-His com um método ELISA indireto. O fármaco comercializado Secukinumab é usado como um controle positivo.
[0090]Figura 13: detecção da atividade de ligação de anticorpo 13E9 H3L2 para antígeno IL17A-His por método ELISA indireto. O fármaco comercializado Secukinumab é usado como um controle positivo.
[0091]Figura 14: detecção da atividade de anticorpos 13E9 H1L1 e 13E9 H2L2 competindo com receptor IL17RA-His (biotina) para ligação por método ELISA competitivo. O fármaco comercializado Secukinumab é usado como um controle positivo.
[0092]Figura 15: detecção da atividade de anticorpo 13E9 H3L2 competindo com receptor IL17RA-His (biotina) para ligação por método ELISA competitivo. O fármaco comercializado Secukinumab é usado como um controle positivo.
[0093]Figura 16: detecção da atividade de ligação de anticorpos 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 e 2G2 H3L3 para antígeno IL17A- His por método ELISA indireto. O fármaco comercializado Secukinumab é usado como um controle positivo.
[0094]Figura 17: detecção da atividade de anticorpos 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 e 2G2 H3L3 competindo com o receptor IL17A- His (biotina) para ligação ao antígeno IL17A-His por método
ELISA competitivo. O fármaco comercializado Secukinumab é usado como um controle positivo.
[0095]Figura 18: efeito de anticorpos 13E9 H1L1, 13E9 H2L2 e 13E9 H3L2, assim como 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 e 2G2 H3L3 sobre a secreção de citocina IL-6 por linfócitos misturados.
[0096]Figura 19: efeito do fármaco de anticorpo 13E9 H3L2 sobre a espessura epidérmica do modelo de camundongo C57BL/6 com psoríase.
[0097]Notas sobre a conservação de materiais biológicos: linhagem de células de hibridoma LT006 (IL17A-13E9), que foi depositada junto ao China Center for Type Culture Collection (CCTCC) em 12 de setembro de 2017 com um número de acesso de CCTCC NO: C2017102, na Wuhan University, Wuhan, China, 430072. linhagem de células de hibridoma LT007 (IL17A-2G2), que foi depositada junto ao China Center for Type Culture Collection (CCTCC) em 12 de setembro de 2017 com um número de acesso de CCTCC NO: C2017165, na Wuhan University, Wuhan, China, 430072.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0098]As modalidades da presente invenção serão descritas em detalhes abaixo com referência aos exemplos. Os versados na técnica irão compreender que os seguintes exemplos são usados apenas para ilustrar a presente invenção e não devem ser considerados como limitando o escopo da presente invenção. Um exemplo é realizado de acordo com as tecnologias ou condições descritas na literatura na técnica (por exemplo, ver, Guide to Molecular Cloning Experiments, de autoria de J. Sambrook et al., e traduzido por Huang Peitang et al., 3ª, edição, Science Press) ou de acordo com o manual do produto se tecnologias ou condições específicas não estiverem especificadas no mesmo. Reagentes ou instrumentos usados são todos produtos convencionais disponíveis comercialmente, caso seus fabricantes não sejam especificados.
[0099]Nos seguintes exemplos, os camundongos BALB/C usados foram adquiridos do Guangdong Medical Laboratory Animal Center; os camundongos C57BL/6 usados foram do Nanjing Galaxy Biopharma Co., Ltd.; as células MRC5 usadas foram do Shanghai Fudan IBS Cell Center; o anticorpo monoclonal Secukinumab (Cosentyx®) usado adquirido da Novartis Corporation. Exemplo 1: Preparação de anticorpos anti-IL-17A 13E9 e 2G2
1. Preparação das linhagens de células de hibridoma LT006 e LT007
[00100]Antígeno IL17A (24-155)-his usado para gerar o anticorpo anti-IL-17A é a proteína de fusão de peptídeo maduro de IL-17A humana (GenBank ID: Q16552) e a etiqueta His. Células de baço dos camundongos BALB/C imunizados (adquiridas do Guangdong Medical Laboratory Animal Center) e células de mieloma do camundongo foram fusionadas em células de hibridoma, e métodos estabelecidos (por exemplo, “Monoclonal antibody Production”, em Basic Methods in Antibody Production and Characterization, Eds. G.C. Howard e D.R. Bethell, Boca Raton: CRC Press, 2000) foram consultados para operações específicas.
[00101]A proteína de fusão IL17A-His foi digerida por enzima com TEV protease e purificada por coluna para obter proteína IL-17A (24-155). Triagem ELISA indireta foi realizada em microplacas revestidas com a proteína IL-17A
(24-155) como o antígeno para obter células hibridoma que secretaram novos anticorpos especificamente ligados a IL-17A (24-155).
[00102]Células de hibridoma obtidas por triagem ELISA indireta foram triadas por ELISA competitivo para obter linhagens de células de hibridoma capazes de secretar um anticorpo monoclonal que competiu com o receptor IL-17RA (CD217, NCBI Gene ID: NP_055154.3) para ligação a IL-17A, e duas linhagens de células estáveis de hibridoma foram obtidas por diluição limitada.
[00103]Linhagem de célula de hibridoma LT006 (IL17A- 13E9) foi depositada junto ao China Center for Type Culture Collection (CCTCC) no sábado, dia 12 de setembro de 2015 com um número de acesso de CCTCC NO: C2017102, em Wuhan University, Wuhan, China, 430072. O anticorpo monoclonal secretado por linhagem de células de hibridoma LT006 foi denominado como 13E9.
[00104]Linhagem de célula de hibridoma LT007 (IL17A-2G2) foi depositada junto ao China Center for Type Culture Collection (CCTCC) em 12 de setembro de 2017, com um número de acesso de CCTCC NO: C2017165, em Wuhan University, Wuhan, China, 430072. O anticorpo monoclonal secretado por linhagem de células de hibridoma LT007 foi denominado como 2G2.
2. Preparação de anticorpo anti-IL-17A 13E9
[00105]A linhagem de célula LT006 preparada acima foi cultivada (1 × 105 células por cavidade) com meio livre de soro de hibridoma (contendo 1% penicilina-estreptomicina e 4% Glutamax, cultivada em um incubador de células a 37°C com 5% CO2), e o sobrenadante de cultura celular foi coletado quando a taxa de sobrevivência estava em torno de 20% após
7 dias de cultivo, que foi então submetido a centrifugação em alta velocidade, filtração a vácuo através de uma membrana microporosa, e purificação através de uma coluna HP de proteína HiTrap para obter anticorpo 13E9. As amostras de 13E9 purificadas foram detectadas por eletroforese SDS-PAGE, e os resultados são mostradas em Figura 1.
3. Preparação de anticorpo anti-IL-17A 2G2
[00106]A linhagem de célula LT007 preparada acima foi cultivada (1 × 105 células por cavidade) com meio livre de soro de hibridoma (contendo 1% penicilina-estreptomicina e 4% Glutamax, cultivada em um incubador de células a 37°C com 5% CO2), e o sobrenadante de cultura celular foi coletado quando a taxa de sobrevivência estava em torno de 20% após 7 dias de cultivo, que foi então submetido a centrifugação em alta velocidade, filtração a vácuo através de uma membrana microporosa, e purificação através de uma coluna HP de proteína HiTrap para obter anticorpo 2G2. As amostras de 2G2 purificadas foram detectadas por eletroforese SDS-PAGE, e os resultados são mostradas em Figura 2. Exemplo 2: Análise da sequência de anticorpo 13E9
[00107]Células LT006 foram cultivadas de acordo com o método em etapa 2 de Exemplo 1.
[00108]Usando o kit de extração de RNA total de célula/bactéria (Tiangen, número do artigo DP430), mRNA foi extraído das células cultivadas LT006 de acordo com o método no manual do kit.
[00109]cDNA foi sintetizado de acordo com o manual do kit do SuperScript® III First-Strand Synthesis System de Invitrogen para RT-PCR, e amplificado por PCR.
[00110]Os produtos amplificados por PCR foram diretamente clonados em TA, e o manual do kit do pEASY-T1 Cloning Kit (Transgen CT101) foi consultado para as operações específicas.
[00111]Os produtos clonados em TA foram diretamente sequenciados, e os resultados do sequenciamento são como a seguir: sequência de nucleotídeo da região variável de cadeia pesada: (360 bp)
GAAGTAAAGCTGCAGGAGTCGGGACCTGGCCTGGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGT CCCTCACCTGCACTGTCACTAGCTACTCATTCACCAGTGATTATGCCTGGAGCTGGATC CGGCAGTTTCCAGGAATCAAACTGGAGTGGATGGGCTACATAACCTACAGTGGTGTCAC TAGCTACAACCCCTCTCTCAAAAGTCGAATCTCTATCACTCGAGACACATCCAAGAACC AGTTCTTCCTACAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACGGCCACATATTACTGTGCA
AGGGCAGACTATGATAGCTACTATACTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCAC CGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 1) sua sequência de aminoácido codificada: (120 aa)
EVKLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTSYSFTSDYAWSWIRQFPGIKLEWMGYITYS
GVTSYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCARADYDSYYTMDYWGQGT SVTVSS (SEQ ID NO: 2) sequência de nucleotídeo da região variável de cadeia leve: (333 bp)
GACATCCAGCTGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAG CCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTA CATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAGGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAA CCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACAC
TCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACA CATTTTTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATAAAA (SEQ ID NO: 3) sua sequência de aminoácido codificada: (111 aa)
DIQLTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPRLLIYK VSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHFWTFGGGTKLEIK
(SEQ ID NO: 4)
[00112]As regiões sublinhadas são as regiões de CDR. Exemplo 3: Projeto, preparação e detecção de anticorpos anti- IL-17A humanizados 13E9 H1L1, 13E9 H2L2 e 13E9 H3L2
1. Projeto das sequências de cadeia leve e cadeia pesada de anticorpos anti-IL-17A humanizados 13E9 H1L1, 13E9 H2L2 e 13E9 H3L2
[00113]Com base na estrutura cristalina tridimensional da proteína IL-17A (EMBO J. (2001) 20 p: 5332-41) e da sequência do anticorpo 13E9 obtida em Exemplo 2, o modelo de anticorpo foi simulado por computador, e mutações foram projetadas de acordo com o modelo para obter as sequências de região variável de anticorpos 13E9 H1L1, 13E9 H2L2 e 13E9 H3L2 (sequências de região constante de anticorpo são do banco de dados NCBI, em que a região constante de cadeia pesada é região C de cadeia Ig gama-1, ACESSO: P01857, e a região constante de cadeia leve é região C de cadeia Ig kappa, ACESSO: P01834).
[00114]As sequências de região variável projetadas são como a seguir: (1) sequências de cadeia pesada e cadeia leve de anticorpo monoclonal humanizado 13E9 H1L1 sequência de nucleotídeo da região variável de cadeia pesada: (360 bp)
GATGTGCAGCTGCAGGAAAGCGGACCAGGACTGGTGAAGCCTAGCCAGACCCTGA GCCTGACTTGCACCGTGTCCAGCTACAGCTTCACCAGCGACTACGCTTGGTCTTGGATC AGACAGTTCCCAGGAATTGGCCTCGAGTGGATGGGCTACATCACCTACAGCGGCGTGAC CAGCTACAACCCCAGCCTGAAGAGCAGGATCACCATCAGCCGGGACACCAGCAAGAACC AGTTCTTCCTGCAGCTGAACAGCGTGACAGCAGCCGATACCGCAGTGTACTATTGCGCC AGGGCCGACTACGACAGCTACTACACCATGGACTATTGGGGCCAGGGAACCAGCGTGAC
AGTGTCTAGC (SEQ ID NO: 5) sua sequência de aminoácido codificada: (120 aa)
DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSSYSFTSDYAWSWIRQFPGIGLEWMGYITYS
GVTSYNPSLKSRITISRDTSKNQFFLQLNSVTAADTAVYYCARADYDSYYTMDYWGQGT SVTVSS (SEQ ID NO: 6)
[00115]As regiões sublinhadas são as regiões de CDR. sequência de nucleotídeo da região variável de cadeia leve: (333 bp)
GATGTCGTGATGACCCAGACCCCTCTGTCTCTGCCAGTGACACTGGGACAGCAGG CTAGCATCTCTTGCAGAAGCAGCCAGAGCCTGGTGCACAGCAACGGCAACACCTACCTG CATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCTAGACTGCTGATCTACAAGGTGTCCAA CCGGTTCAGCGGCGTGCCAGATAGATTCAGCGGAAGCGGAAGCGGCACCGACTTCACCC
TGAAGATCAGCAGAGTGGAGGCCGAGGATCTGGGAGTGTACTTCTGCAGCCAGAGCACC CACTTTTGGACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAGATCAAG (SEQ ID NO: 7) sua sequência de aminoácido codificada: (111 aa)
DVVMTQTPLSLPVTLGQQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPRLLIYK
VSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHFWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 8)
[00116]As regiões sublinhadas são as regiões de CDR. (2) sequências de cadeia pesada e cadeia leve de anticorpo monoclonal humanizado 13E9 H2L2 sequência de nucleotídeo da região variável de cadeia pesada: (360 bp)
GATGTGCAGCTGCAGGAAAGCGGACCAGGACTGGTGAAGCCTAGCCAGACCCTGA GCCTGACTTGCACCGTGTCCAGCTACAGCTTCACCAGCGACTACGCTTGGTCTTGGATC AGACAGCCACCAGGAAAGGGACTCGAGTGGATCGGCTACATCACCTACAGCGGCGTGAC CAGCTACAACCCCAGCCTGAAGAGCAGGATCACCATCAGCCGGGACACCAGCAAGAACC AGTTCTTCCTGCAGCTGTCTAGCGTGACAGCAGCCGATACCGCAGTGTACTATTGCGCC
AGGGCCGACTACGACAGCTACTACACCATGGACTATTGGGGCCAGGGAACCAGCGTGAC AGTGTCTAGC (SEQ ID NO: 9)
sua sequência de aminoácido codificada: (120 aa)
DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSSYSFTSDYAWSWIRQPPGKGLEWIGYITYS
GVTSYNPSLKSRITISRDTSKNQFFLQLSSVTAADTAVYYCARADYDSYYTMDYWGQGT SVTVSS (SEQ ID NO: 10)
[00117]As regiões sublinhadas são as regiões de CDR. sequência de nucleotídeo da região variável de cadeia leve: (333 bp)
GATGTCGTGATGACCCAGACCCCTCTGTCTCTGCCAGTGACACTGGGACAGCCAG CTAGCATCTCTTGCAGAAGCAGCCAGAGCCTGGTGCACAGCAACGGCAACACCTACCTG CATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCTAGACTGCTGATCTACAAGGTGTCCAA CCGGTTCAGCGGCGTGCCAGATAGATTCAGCGGAAGCGGAAGCGGCACCGACTTCACCC
TGAAGATCAGCAGAGTGGAGGCCGAGGATCTGGGAGTGTACTACTGCAGCCAGAGCACC CACTTTTGGACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAGATCAAG (SEQ ID NO: 11) sua sequência de aminoácido codificada: (111 aa)
DVVMTQTPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPRLLIYK
VSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCSQSTHFWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 12)
[00118]As regiões sublinhadas são as regiões de CDR. (3) sequências de cadeia pesada e cadeia leve de anticorpo monoclonal humanizado 13E9 H3L2 sequência de nucleotídeo da região variável de cadeia pesada: (360 bp)
GATGTGCAGCTGCAGGAAAGCGGACCAGGACTGGTGAAGCCTAGCCAGACCCTGA GCCTGACTTGCACCGTGTCCAGCTACAGCTTCACCAGCGACTACGCTTGGTCTTGGATC AGACAGCCACCAGGAAAGGGACTCGAGTGGATCGGCTACATCACCTACAGCGGCGTGAC CAGCTACAACCCTAGCCTGAAGAGCCGCGTGACCATTAGCGTGGACACCAGCAAGAACC AGTTCTCCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACAGCCGCCGATACAGCAGTGTACTATTGCGCC
CGGGCCGATTACGACAGCTACTACACCATGGACTATTGGGGCCAGGGAACCAGCGTGAC AGTGTCTAGC (SEQ ID NO: 13) sua sequência de aminoácido codificada: (120 aa)
DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSSYSFTSDYAWSWIRQPPGKGLEWIGYITYS
GVTSYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARADYDSYYTMDYWGQGT SVTVSS (SEQ ID NO: 14)
[00119]As regiões sublinhadas são as regiões de CDR.
[00120]A sequência de nucleotídeo da região variável de cadeia leve é a mesma que a sequência de nucleotídeo da região variável de cadeia leve de 13E9 H2L2, como mostrado em SEQ ID NO: 11.
[00121]Sua sequência de aminoácido codificada é também a mesma como a sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve de 13E9 H2L2, como mostrado em SEQ ID NO: 12.
2. Preparação de anticorpos humanizados 13E9 H1L1, 13E9 H2L2 e 13E9 H3L2
[00122]Regiões constantes de cadeia pesada usam, todas, região C de cadeia Ig gama-1, ACESSO: P01857; as regiões constantes de cadeia leve usam região C de cadeia Ig kappa, ACESSO: P01834.
[00123]cDNA de cadeia pesada e cDNA de cadeia leve de 13E9 H1L1, cDNA de cadeia pesada e cDNA de cadeia leve de 13E9 H2L2, e cDNA de cadeia pesada e cDNA de cadeia leve de 13E9 H3L2 foram clonados em vetores pUC57simple (fornecido por Genscript), respectivamente, para obter pUC57simple- 13E9H1, pUC57simple-13E9L1, pUC57simple-13E9H2, pUC57simple-13E9L2 e pUC57simple-13E9H3, respectivamente, e fragmentos contendo cadeias pesadas correspondentes e fragmentos contendo cadeias leves correspondentes foram subclonados em vetores pcDNA3.1, respectivamente, para obter plasmídeos recombinantes pcDNA3.1 -13E9H1, pcDNA3.1-13E9L1, pcDNA3.1-13E9H2, pcDNA3.1-13E9L2, pcDNA3.1-13E9H3 e pcDNA3.1-13E9L2. Então, os plasmídeos recombinantes de cadeia leve e plasmídeos recombinantes de cadeia pesada correspondentes (pcDNA3.1-13E9H1 e pcDNA3.1-13E9L1; pcDNA3.1-13E9H2 e pcDNA3.1-13E9L2; pcDNA3.1-13E9H3 e pcDNA3.1-13E9L2) foram co-transfectados em células 293F, a cultura de célula foi coletada e purificada para obter anticorpos humanizados 13E9 H1L1, 13E9 H2L2, e 13E9 H3L2 respectivamente. A amostra 13E9 H3L2 purificada foi detectada por eletroforese SDS-PAGE, e os resultados são mostradas em Figura 3. Exemplo 4: Análise de sequência de anticorpo 2G2
[00124]Células LT007 foram cultivadas de acordo com o método em etapa 3 de Exemplo 1.
[00125]Usando o kit de extração de RNA total de célula/bactéria (Tiangen, número do artigo DP430), mRNA foi extraído das células cultivadas LT007 de acordo com o método no manual do kit.
[00126]cDNA foi sintetizado de acordo com o manual do kit do SuperScript® III First-Strand Synthesis System de Invitrogen para RT-PCR, e amplificado por PCR.
[00127]Os produtos amplificados por PCR foram diretamente clonados em TA, e o manual do kit do pEASY-T1 Cloning Kit (Transgen CT101) foi consultado para as operações específicas.
[00128]Os produtos clonados em TA foram diretamente sequenciados, e os resultados do sequenciamento são como a seguir: sequência de nucleotídeo da região variável de cadeia pesada: (351 bp)
GAGGTTCAGCTGGAGCAGTCTGGTTCTGAACTGAGGAGTCCTGGATCTTCAGTAA AGCTTTCATGCAAGGATTTTGATTCAGAAGTCTTCCCTATTGCTGATATGAGTTGGGTT AGGCAGAAGCCTGGGCATGGATTTGAATGGATTGGAGACATACTCCCAAGTTTTGGTAG AACAATCTATGGAGAGAAGTTTGAGGACAAAGCCAAAGTGGATGCAGACACAGTGTCCA ACACAGCCTACTTGGAACTCAACAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCTATCTACTACTGT
GCAAGGGGTAACTACGGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGC A (SEQ ID NO: 15) sua sequência de aminoácido codificada: (117 aa)
[00129]EVQLEQSGSELRSPGSSVKLSCKDFDSEVFPIADMSWVRQKPGHGFEW
IGDILPSFGRTIYGEKFEDKAKVDADTVSNTAYLELNSLTSEDSAIYYCARGNYGFAYW GQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 16)
[00130]As regiões sublinhadas são as regiões de CDR. sequência de nucleotídeo da região variável de cadeia leve: (336 bp)
GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCACTTTGTCGGTTATCATTGGACAACCAG CCTCCATCTCTTGCAAGCCAAGTCAGAGCCTCTTAAATAGTGATGGAAAGACATATTTG AATTGGTTGTTGCAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAA ACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACAC
TGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTATTGCTGGCAAGGTTCA CATTTTCCTCAGACGTTCGGTGGAGGCACAAAGTTGGAAATAAAA (SEQ ID NO: 17) sua sequência de aminoácido codificada: (112 aa)
DVLMTQTPLTLSVIIGQPASISCKPSQSLLNSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYL
VSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGSHFPQTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 18)
[00131]As regiões sublinhadas são as regiões de CDR. Exemplo 5: Projeto, preparação e detecção de anticorpos anti- IL-17A humanizados 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 e 2G2 H3L3 (1) sequências de cadeia pesada e cadeia leve de anticorpo monoclonal humanizado 2G2 H1L1 sequência de nucleotídeo da região variável de cadeia pesada: (348 bp)
GTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAAGCGAACTGAGAAAGCCAGGCTCCAGCGTGAAGC TGTCTTGCAAGGACTTCGACAGCGAGGTGTTCCCCATCGCCGATATGTCTTGGGTCCGA CAGGCTCCAGGCCAGGGATTCGAGTGGATCGGTGACATTCTGCCCAGCTTCGGAAGAAC CAACTACGCCCAGAAGTTCGAGGGCAAGGCCAAGGTGGACGCAGACAAGAGCACCAACA CCGCCTACCTGGAGCTGAACAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGCCATCTACTATTGCGCC
AGGGGCAACTACGGATTCGCCTATTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCCGCC (SEQ ID NO: 19) sua sequência de aminoácido codificada: (116 aa)
VQLVQSGSELRKPGSSVKLSCKDFDSEVFPIADMSWVRQAPGQGFEWIGDILPSF
GRTNYAQKFEGKAKVDADKSTNTAYLELNSLRSEDTAIYYCARGNYGFAYWGQGTLVTV SA (SEQ ID NO: 20)
[00132]As regiões sublinhadas são as regiões de CDR. sequência de nucleotídeo da região variável de cadeia leve: (336 bp)
GATGTCGTGATGACCCAGACCCCTCTGTCTCTGAGCGTGACACTGGGACAGCCAG CTAGCATCAGCTGCAGAAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACAGCGACGGCAAGACCTACCTG AATTGGCTGCTGCAGAGACCAGGCCAGTCTCCTAGAAGGCTGATCTACCTGGTGTCCAA GCTGGACAGCGGCGTGCCAGATAGATTCAGCGGAAGCGGAAGCGGCACCGACTTCACCC
TGAAGATCAGCAGAGTGGAGGCCGAGGATCTGGGAGTGTACTACTGTTGGCAGGGCAGC CACTTCCCTCAGACATTCGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAG (SEQ ID NO: 21) sua sequência de aminoácido codificada: (112 aa)
DVVMTQTPLSLSVTLGQPASISCRSSQSLLNSDGKTYLNWLLQRPGQSPRRLIYL
VSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGSHFPQTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 22)
[00133]As regiões sublinhadas são as regiões de CDR. (2) sequências de cadeia pesada e cadeia leve de anticorpo monoclonal humanizado 2G2 H2L2 sequência de nucleotídeo da região variável de cadeia pesada: (348 bp)
GTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCAGAAGTGAAGAAGCCAGGCTCCAGCGTGAAGC TGTCTTGCAAGGACTTCGACAGCGAGGTGTTCCCCATCGCCGATATGTCTTGGGTCCGA CAGGCTCCAGGCCAGGGATTCGAGTGGATCGGTGACATTCTGCCCAGCTTCGGGAGAAC CAATTACGCCCAGAAGTTCCAGGGCAGAGTGACCGTGACCGCAGACAAGAGCACCAACA CCGCCTACCTGGAGCTGAACAGCCTGAGGAGCGAGGATACCGCCGTGTACTATTGCGCC
AGGGGCAACTACGGCTTCGCCTATTGGGGACAGGGAACACTGGTGACAGTGTCCGCC (SEQ ID NO: 23) sua sequência de aminoácido codificada: (116 aa)
VQLVQSGAEVKKPGSSVKLSCKDFDSEVFPIADMSWVRQAPGQGFEWIGDILPSF
GRTNYAQKFQGRVTVTADKSTNTAYLELNSLRSEDTAVYYCARGNYGFAYWGQGTLVTV SA (SEQ ID NO: 24)
[00134]As regiões sublinhadas são as regiões de CDR. sequência de nucleotídeo da região variável de cadeia leve: (336 bp)
GATGTCGTGATGACCCAGACCCCTCTGTCTCTGAGCGTGACACTGGGACAGCCAG CTAGCATCAGCTGCAGAAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACAGCGACGGCAAGACCTACCTG AATTGGCTGCTGCAGAGACCAGGCCAGTCTCCTAGAAGGCTGATCTACCTGGTGTCCAA CCTGGACAGCGGCGTGCCAGATAGATTCAGCGGAAGCGGAAGCGGCACCGACTTCACCC
TGAAGATCAGCAGAGTGGAAGCCGAGGACGTGGGAGTGTACTACTGTTGGCAGGGCAGC CACTTCCCTCAGACATTCGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAG (SEQ ID NO: 25) sua sequência de aminoácido codificada: (112 aa)
DVVMTQTPLSLSVTLGQPASISCRSSQSLLNSDGKTYLNWLLQRPGQSPRRLIYL
VSNLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGSHFPQTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 26)
[00135]As regiões sublinhadas são as regiões de CDR. (3) sequências de cadeia pesada e cadeia leve de anticorpo monoclonal humanizado 2G2 H3L3 sequência de nucleotídeo da região variável de cadeia pesada: (348 bp)
GTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCAGAAGTGAAGAAGCCAGGCAGCAGCGTGAAGG TGTCTTGCAAGGACTTCAGCAGCGAGGTGTTCCCCATCGCCGATATGTCTTGGGTCCGA CAGGCTCCAGGCCAGGGACTGGAGTGGATCGGTGACATTCTGCCCAGCTTCGGGAGAAC CAATTACGCCCAGAAGTTCCAGGGCAGAGTGACCGTGACCGCAGACAAGAGCACCAACA CCGCCTACCTGGAGCTGTCTAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGCC
AGGGGCAACTACGGCTTCGCCTATTGGGGACAGGGAACACTGGTGACAGTGTCCGCC (SEQ ID NO: 27) sua sequência de aminoácido codificada: (116 aa)
VQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKDFSSEVFPIADMSWVRQAPGQGLEWIGDILPSF
GRTNYAQKFQGRVTVTADKSTNTAYLELSSLRSEDTAVYYCARGNYGFAYWGQGTLVTV SA (SEQ ID NO: 28)
[00136]As regiões sublinhadas são as regiões de CDR. sequência de nucleotídeo da região variável de cadeia leve: (336 bp)
GATGTCGTGATGACCCAGACCCCTCTGTCTCTGAGCGTGACACTGGGACAGCCAG CTAGCATCAGCTGCAGAAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACAGCGACGGCAAGACCTACCTG AATTGGTTCCTGCAGAGACCAGGCCAGTCTCCTAGAAGGCTGATCTACCTGGTGTCCAA CCTGGACAGCGGCGTGCCAGATAGATTCAGCGGAAGCGGAAGCGGCACCGACTTCACCC
TGAAGATCAGCAGAGTGGAAGCCGAGGACGTGGGAGTGTACTACTGTTGGCAGGGCAGC CACTTCCCTCAGACATTCGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAG (SEQ ID NO: 29) sua sequência de aminoácido codificada: (112 aa)
DVVMTQTPLSLSVTLGQPASISCRSSQSLLNSDGKTYLNWFLQRPGQSPRRLIYL
VSNLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGSHFPQTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 30)
[00137]As regiões sublinhadas são as regiões de CDR.
2. Preparação e detecção de eletroforese SDS-PAGE de anticorpos 2G2 humanizados H1L1, 2G2 H2L2 e 2G2 H3L3
[00138]Regiões constantes de cadeia pesada usado região C de cadeia Ig gama-1, ACESSO: P01857; as regiões constantes de cadeia leve usaram região C de cadeia Ig kappa, ACESSO: P01834.
[00139]cDNA de cadeia pesada e cDNA de cadeia leve de 2G2 H1L1, cDNA de cadeia pesada e cDNA de cadeia leve de 2G2 H2L2, e cDNA de cadeia pesada e cDNA de cadeia leve de 2G2 H3L3 foram clonados em vetores pUC57simple (fornecido por Genscript), respectivamente, para obter pUC57simple-2G2H1, pUC57simple-2G2L1; pUC57simple-2G2H2, pUC57simple-2G2L2; e pUC57simple-2G2H3, pUC57simple-2G2L3, respectivamente. Fragmentos de nucleotídeos contendo cadeias pesadas correspondentes e fragmentos de nucleotídeos contendo cadeias leves correspondentes foram então subclonados em vetores pcDNA3.1, respectivamente, para obter plasmídeos recombinantes pcDNA3.1-2G2H1, pcDNA3.1-2G2L1, pcDNA3.1- 2G2H2, pcDNA3.1-2G2L2, pcDNA3.1-2G2H3 e pcDNA3.1-2G2L3. Então, os plasmídeos recombinantes de cadeia leve e os plasmídeos recombinantes de cadeia pesada correspondentes (pcDNA3.1-2G2H1 e pcDNA3.1-2G2L1; pcDNA3.1-2G2H2 e pcDNA3.1- 2G2L2; pcDNA3.1-2G2H3 e pcDNA3.1-2G2L3) foram co- transfectados em células 293F, a cultura celular foi coletada e purificada para obter anticorpos humanizados 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 e 2G2 H3L3, respectivamente. As amostras purificadas foram detectadas por Eletroforese SDS-PAGE. Exemplo 6: Medição de parâmetros cinéticos para a ligação de 13E9 H1L1, 13E9 H2L2 e 13E9 H3L2 à proteína de antígeno IL- 17A (24-155)
[00140]Os parâmetros cinéticos para a ligação de anticorpos humanizados 13E9 H1L1, 13E9 H2L2 e 13E9 H3L2 ao antígeno IL-17A (24-155) foram medidos usando um instrumento de interação molecular Fortebio.
[00141]O sensor AR2G foi ativado por EDC/NHS, e o anticorpo foi fixado no sensor AR2G ativado por acoplamento de amina, e o sensor foi bloqueado com etanolamina 1 M (pH 8,5). Após o sensor ser equilibrado em PBST durante 300 s, o anticorpo fixado no sensor se ligou à proteína antígeno IL-17A (24-155) (mesmo que o antígeno usado em Exemplo 1), em que a concentração de antígeno foi 6,25-400 nM (diluição de gradiente duplo) e o tempo de ligação foi 420 s, e o antígeno e o anticorpo foram dissociados em PBST por 600 s.
[00142]Os parâmetros cinéticos de anticorpos 13E9 H1L1, 13E9 H2L2, 13E9 H3L2 e Secukinumab são mostradas em Tabela 1, e os resultados da detecção dos parâmetros cinéticos característicos são mostrados em Figura 4, Figura 5, Figura 6 e Figura 7, respectivamente. Tabela 1: Os parâmetros cinéticos de anticorpo humanizado13E9 Kon Kdis Erro Anticorpo KD (M) Erro Kon Rmax (nm) (1/Ms) (1/s) Kdis 0,0858- 13E9 H1L1 9,72E-10 1,34E+05 2,60E+03 1,31E-04 9,06E-06 0,3326 0,0546- 13E9 H2L2 1,03E-09 9,86E+04 1,51E+03 1,01E-04 7,57E-06 0,3049 0,1457- 13E9 H3L2 5,08E-10 2,90E+05 8,22E+03 1,47E-04 1,02E-05 0,3546 0,0379- Secukinumab 6,74E-10 9,28E+04 3,03E+03 6,26E-05 1,57E-05 0,2064 KD é constante de afinidade; Kon é taxa de ligação de antígeno e anticorpo; Kdis é taxa de dissociação de antígeno e anticorpo; KD = Kdis/Kon.
[00143]Os resultados mostram que 13E9 H1L1, 13E9 H2L2, e 13E9 H3L2 apresentam, todos, boa afinidade para o antígeno IL-17A (24-155), e a afinidade é equivalente à do anticorpo de controle Secukinumab. Exemplo 7: Medição de parâmetros cinéticos para a ligação de
2G2 H1L1, 2G2 H2L2, e 2G2 H3L3 ao antígeno IL-17A (24-155)
[00144]Os parâmetros cinéticos para a ligação de anticorpos humanizados 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 e 2G2 H3L3 ao antígeno IL-17A (24-155) foram medidos usando um instrumento de interação molecular Fortebio.
[00145]O sensor AR2G foi ativado por EDC/NHS, e o anticorpo foi fixado ao sensor AR2G ativado por acoplamento de amina, e o sensor foi bloqueado com etanolamina 1 M (pH 8,5). Após o sensor ser equilibrado em PBST durante 300 s, o anticorpo fixado no sensor se ligou ao antígeno IL-17A (24-155), em que a da concentração do antígeno foi 6,25-400 nM (diluição de gradiente duplo) e o tempo de ligação foi 420 s, e o antígeno e o anticorpo foram dissociados em PBST por 600 s.
[00146]Os parâmetros cinéticos de anticorpos 2G2 H1L1, 2G2 H2L2, 2G2 H3L3, e Secukinumab são mostrados em Tabela 2, e resultados da detecção dos parâmetros cinéticos característicos são mostrados em Figura 8, Figura 9, Figura 10 e figura 11, respectivamente. Tabela 2: Os parâmetros cinéticos de 2G2 H1L1, 2G2 H2L2, 2G2 H3L3 e Secukinumab Kdis Erro Anticorpo KD (M) Kon(1/Ms) Erro Kon Rmax(nm) (1/s) Kdis 0,0035- 2G2 H1L1 1,53E-09 1,46E+05 3,15E+03 2,24E-04 9,67E-06 0,2192 0,0444- 2G2 H2L2 8,43E-10 1,42E+05 2,18E+03 1,20E-04 6,73E-06 0,2732 2G2 H3L3 1,54E-09 1,98E+05 5,30E+03 3,06E-04 1,08E-05 0,011-0,2109 0,0118- Secukinumab 1,08E-09 1,33E+05 2,38E+03 1,43E-04 8,09E-06 0,2584 KD é constante de afinidade; Kon é taxa de ligação de antígeno e anticorpo; Kdis é taxa de dissociação de antígeno e anticorpo; KD = Kdis/Kon.
[00147]Os resultados mostram que comparado com o anticorpo de controle Secukinumab, 2G2 H2L2 tem uma afinidade maior para o antígeno IL-17A (24-155); a afinidade de 2G2 H1L1 e 2G2 H3L3 é equivalente à do anticorpo de controle Secukinumab. Exemplo 8: Detecção da atividade de ligação dos anticorpos 13E9 H1L1, 13E9 H2L2 e 13E9 H3L2 ao antígeno com um método ELISA
[00148]1. A atividade de ligação dos anticorpos 13E9 H1L1, 13E9 H2L2 e 13E9 H3L2 para o antígeno IL17A-His foi detectada com um ELISA indireto e comparada com o fármaco comercializado Secukinumab para o mesmo alvo.
[00149]IL17A-His pode ser preparada por referência às sequências publicadas e meios técnicos convencionais na técnica, ou por referência às seguintes etapas: Preparação de IL17A-His: a sequência de proteína de comprimento completo de IL-17A humana foi encontrada no banco de dados de proteína NCBI, e fusionada com etiqueta de purificação de His*6. Genscript em Nanjing foi encarregado de sintetizar o ácido nucleico codificando a proteína de fusão, e por referência às tecnologias padrão introduzidas no Guide to Molecular Cloning Experiments (2ª. ed.) e usando tecnologias de clonagem molecular padrão como PCR, digestão de enzima, recuperação em gel, transformação de ligação, PCR colônia ou identificação de digestão de enzima, o gene alvo foi subclonado em vetores de expressão de célula de mamífero, e o gene alvo com o vetor de expressão recombinantes foi ainda sequenciado e analisados. Depois da sequência ser verificada como estando correta, uma quantidade média e grande de plasmídeos de expressão livres de endotoxina foi preparada, e células HEK293 transientemente transfectadas para expressão de proteína. Após 7 dias de cultura, o fluido de cultura celular foi coletado e purificado por afinidade usando uma coluna Ni Sepharose (GE), e a qualidade das amostras de proteína resultantes foi determinada usando técnicas de análise padrão SDS-PAGE e SEC-HPLC para estar de acordo com o padrão.
[00150]ELISA: IL17A-His foi adicionada à microplaca e incubada a 4°C durante a noite; após bloqueio com 1% BSA em PBS a 37°C durante 2 h, anticorpos foram adicionados respectivamente, e incubados a 37°C durante 30 min; e IgG anti-humano de cabra (H + L)-HRP (Jackson, 109-035-088) foi adicionado e incubado a 37°C durante 30 min; e, então, a reação colorida foi realizada com TMB (Neogen, 308177) durante 5 min, e a absorbância a 450 nm foi detectada em um leitor de microplaca. Os dados experimentais obtidos foram analisados e processados com software SoftMax Pro 6.2.1, e a curva ajustada de 4 parâmetros foi traçada para análise com a concentração de anticorpo como a abscissa e o valor de absorbância como a ordenada.
[00151]Os resultados experimentais são mostrados em Figura 12, Figura 13, e Tabela 3 e Tabela 4 abaixo. Tabela 3: Resultados da detecção da atividade de ligação de 13E9 H1L1 e 13E9 H2L2 para o antígeno IL17A-His Concentração Antígeno de revestimento: IL17A-His, 1 de anticorpo/ gradiente 13E9 H1L1 13E9 H2L2 Secukinumab 1 2,726 2,731 2,804 2,737 2,184 2,227 1:3 2,875 2,852 2,832 2,873 2,595 2,505 1:9 2,858 2,815 2,717 2,712 2,297 2,364 1:27 2,564 2,494 2,479 2,481 2,049 2,064 1:81 1,934 1,925 1,891 1,834 1,372 1,314 1:243 1,159 1,116 1,097 1,062 0,672 0,697
1:729 0,522 0,537 0,514 0,511 0,313 0,309 0 0,047 0,048 0,048 0,048 0,046 0,046 EC50 (nM) 0,044 0,048 0,082 Tabela 4: Resultados da detecção da atividade de ligação de 13E9 H3L2 para o antígeno IL17A-His Concentração Antígeno de revestimento: IL17A-His: 1 de anticorpo/ gradiente 13E9 H3L2 Secukinumab 0,5 3,074 3,068 2,929 2,929 1:3 3,175 3,026 2,924 2,885 1:9 2,944 2,895 2,660 2,666 1:27 2,472 2,393 1,947 1,862 1:81 1,610 1,617 1,140 1,092 1:243 0,786 0,783 0,521 0,522 1:729 0,343 0,348 0,252 0,253 0 0,091 0,084 0,087 0,087 EC50 (nM) 0,043 0,078
[00152]Os resultados experimentais mostram que os anticorpos 13E9 H1L1, 13E9 H2L2 e 13E9 H3L2 podem, todos, se ligar efetivamente ao antígeno IL17A-His, e sua eficiência de ligação é dependente da dose. Sob as mesmas condições experimentais, a ligação EC50 de 13E9 H1L1 é 0,044 nM, a ligação EC50 de 13E9 H2L2 é 0,048 nM, e a EC50 do fármaco comercializado Secukinumab para o mesmo alvo é 0,082 nM (Figura 12, Tabela 3); sob as mesmas condições experimentais, a ligação EC50 de 13E9 H3L2 é 0,043 nM, e a EC50 do fármaco comercializado Secukinumab para o mesmo alvo é 0,078 nM (Figura 13, Tabela 4).
[00153]Os resultados experimentais acima mostram que sob as mesmas condições experimentais, os valores de EC50 de 13E9 H1L1, 13E9 H2L2 e 13E9 H3L2 são, todos, menores do que os do fármaco de controle positivo Secukinumab para o mesmo alvo, indicando que a atividade de ligação de 13E9 H1L1, 13E9 H2L2 e 13E9 H3L2 para IL17A-His é melhor do que a do fármaco de controle comercializado Secukinumab para o mesmo alvo.
[00154]2. A atividade de anticorpos 13E9 H1L1, 13E9 H2L2 e 13E9 H3L2 bloqueando a ligação de IL17RA-His (biotina) para o antígeno IL17A-His é detectada com um ELISA competitivo.
[00155]IL17RA-His (biotina) pode ser preparada por referência às sequências publicadas e meios técnicos convencionais na técnica, ou por referência às seguintes etapas: Preparação de IL17RA-His (biotina): a sequência de domínio extracelular de IL-17RA humana foi encontrada no banco de dados de proteína NCBI, e fusionada com etiqueta de purificação His*6. Genscript em Nanjing foi encarregado de sintetizar o ácido nucleico codificando a proteína de fusão, e por referência às tecnologias padrão introduzidas no Guide to Molecular Cloning Experiments (2ª. ed.) e usando tecnologias de clonagem molecular padrão como PCR, digestão de enzima, recuperação em gel, transformação de ligação, PCR colônia ou identificação de digestão de enzima, o gene alvo foi subclonado em vetores de expressão de célula de mamífero, e o gene alvo com o vetor de expressão recombinantes foi ainda sequenciado e analisado. Depois da sequência ser verificada como estando correta, uma quantidade média e grande de plasmídeos de expressão livres de endotoxina foi preparada, e células HEK293 transientemente transfectadas para expressão de proteína. Após 7 dias de cultura, a cultura celular foi coletada e purificada por afinidade usando uma coluna Ni Sepharose (GE), e a qualidade das amostras de proteína resultantes foi determinada usando técnicas de análise padrão SDS-PAGE e SEC-HPLC para estar de acordo com o padrão. Após a determinação da qualidade estar completa, as amostras de proteína IL-17RA-His humana biotinilada foram marcadas e obtidas com o kit comercial EZ-Link®Sulfo-NHS-LC- Biotinylation de Thermo scientific, e o método de preparação específico foi realizado de acordo com o manual do kit.
[00156]ELISA: IL17A-His foi adicionada à microplaca e incubada a 4°C durante a noite; após bloqueio com 1% BSA em PBST a 37°C durante 2 h, anticorpos são adicionados respectivamente, e o antígeno e o anticorpo reagidos em temperatura ambiente durante 10 min; então, o receptor IL17RA-His (biotina) foi adicionado que foi bem misturado com o anticorpo a uma razão de volume de 1:1 e incubados a 37°C durante 30 min; e SA-HRP (KPL, 14-30-00) foi adicionado e incubado a 37°C durante 30 min; e, então, a reação colorida foi realizada com TMB (Neogen, 308177) durante 5 min, e a absorbância a 450 nm foi detectada em um leitor de microplaca. Os dados experimentais obtidos foram analisados e processados com software SoftMax Pro 6.2.1, e a curva ajustada de 4 parâmetros foi traçada para análise com a concentração de anticorpo como a abscissa e o valor de absorbância como a ordenada. Os resultados experimentais são mostrados em Figura 14, Figura 15, e Tabela 5 e Tabela 6 abaixo. Tabela 5: Resultados da detecção da atividade de 13E9 H1L1 e 13E9 H2L2 competindo com o receptor IL17RA-His (biotina) para ligação ao antígeno IL17A-His Concen- Revestimento de antígeno: IL17A-His (20150213) 0,5 tração de anticorpo/ gradiente 13E9 H1L1 13E9 H2L2 Secukinumab 10 0,273 0,249 0,274 0,290 0,402 0,392 1:3 0,299 0,220 0,313 0,339 0,469 0,502
1:9 0,418 0,379 0,431 0,379 0,642 0,708 1:27 0,673 0,610 0,646 0,636 0,842 0,855 1:81 0,986 1,008 1,011 1,069 1,169 1,201 1:243 1,342 1,362 1,428 1,331 1,418 1,468 1:729 1,363 1,375 1,447 1,519 1,467 1,657 0 1,495 1,406 1,429 1,561 1,610 1,495 Receptor IL17RA-His(bio) 0,1 1,437 1,281 1,807 EC50 (nM) Tabela 6: Resultados da detecção da atividade de 13E9 H3L2 competindo com o receptor IL17RA-His (biotina) para ligação ao antígeno IL17A-His Concentração Revestimento de antígeno: IL17A-His 0,5 de anticorpo/ gradiente 13E9 H3L2 Secukinumab 10 0,193 0,182 0,263 0,282 1:3 0,231 0,206 0,318 0,327 1:9 0,265 0,267 0,419 0,462 1:27 0,424 0,415 0,630 0,663 1:81 0,725 0,627 0,813 0,859 1:243 1,069 1,018 1,120 1,182 1:729 1,218 1,095 1,133 1,250 0 1,184 1,334 1,182 1,232 Receptor IL17RA-His(bio) 0,1 EC50 (nM) 0,805 1,580
[00157]Os resultados experimentais mostram que os anticorpos 13E9 H1L1, 13E9 H2L2 e 13E9 H3L2 podem, todos, bloquear efetivamente a ligação do receptor IL17RA-His (biotina) ao antígeno IL17A-His, e a eficiência do bloqueio é dependente da dose. Sob as mesmas condições experimentais, a EC50 de 13E9 H1L1 competindo com IL17AR-His (biotina) para ligação a IL17A-His é 1,437 nM, a EC50 de 13E9 H2L2 competindo com IL17AR-His (biotina) para ligação a IL17A-His é 1,281 nM, e a EC50 do fármaco de controle positivo Secukinumab para o mesmo alvo competindo com IL17AR-His (biotina) para ligação a IL17A-His é 1,807 nM (Tabela 5, Figura 14); a EC50 de 13E9
H3L2 competindo com IL17AR-His (biotina) para ligação a IL17A-His é 0,805 nM, e a EC50 do fármaco comercializado Secukinumab para o mesmo alvo competindo com IL17AR-His (biotina) para ligação a IL17A-His é 1,580 nM (Tabela 6, Figura 15).
[00158]Os resultados experimentais acima mostram que, sob as mesmas condições experimentais, os valores EC50 de 13E9 H1L1, 13E9 H2L2 e 13E9 H3L2 competindo com IL17AR-His (biotina) para ligação a IL17A-His são, todos, menores do que os do fármaco de controle comercializado Secukinumab para o mesmo alvo, indicando a atividade de 13E9 H1L1, 13E9 H2L2 e 13E9 H3L2 competindo com IL17AR-His (biotina) para ligação a IL17A-His é melhor do que do fármaco comercializado Secukinumab para o mesmo alvo. Exemplo 9: Detecção da atividade de ligação dos anticorpos 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 e 2G2 H3L3 ao antígeno com um método ELISA
[00159]1. A atividade de ligação dos anticorpos 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 e 2G2 H3L3 para o antígeno IL17A-His é detectada com um ELISA indireto.
[00160]Etapas experimentais: IL17A-His foi adicionada à microplaca e incubada a 4°C durante a noite; após bloqueio com 1% BSA em PBS a 37°C durante 2 h, anticorpos foram adicionados respectivamente, e incubados a 37°C durante 30 min; e IgG anti-humano de cabra (H + L)-HRP (Jackson, 109- 035-088) foi adicionada e incubada a 37°C durante 30 min; e, então, a reação colorida foi realizada com TMB (Neogen, 308177) durante 5 min, e a absorbância a 450 nm foi detectada em um leitor de microplaca. Os dados experimentais obtidos foram analisados e processados com software SoftMax Pro
6.2.1, e a curva ajustada de 4 parâmetros foi traçada para análise com a concentração de anticorpo como a abscissa e o valor de absorbância como a ordenada.
[00161]Os resultados experimentais são mostrados em Figura 16 e Tabela 7 abaixo. Em que, a ligação EC50 de 2G2 H1L1 é 0,177 nM, a ligação EC50 de 2G2 H2L2 é 0,372 nM, e a ligação 50 de 2G2 H3L3 é 0,421 nM. Tabela 7: Resultados da detecção da ligação de 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 e 2G2 H3L3 ao antígeno IL17A-His Concentração Revestimento de antígeno: IL17A-His, 1 de anticorpo/gra- 2G2 H1L1 2G2 H2L2 2G2 H3L3 Secukinumab diente 1 3,220 3,135 3,030 2,960 2,485 2,384 3,448 3,448 1:3 3,284 3,149 2,899 2,886 2,311 2,314 3,477 3,478 1:9 2,820 2,747 2,199 2,126 1,693 1,703 3,320 3,331 1:27 2,020 1,969 1,348 1,328 0,982 1,002 2,768 2,764 1:81 1,113 1,075 0,638 0,624 0,439 0,440 1,761 1,689 1:243 0,469 0,426 0,261 0,350 0,188 0,186 0,807 0,806 1:729 0,224 0,188 0,131 0,148 0,113 0,102 0,337 0,326 0 0,061 0,057 0,058 0,068 0,063 0,060 0,062 0,060 EC50 (nM) 0,177 0,372 0,421 0,090
[00162]Os resultados experimentais mostram que os anticorpos 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 e 2G2 H3L3 podem, todos, se ligar efetivamente ao antígeno IL17A-His, e sua eficiência de ligação é dependente da dose.
[00163]2. A atividade de anticorpos 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 e 2G2 H3L3 competindo com o receptor IL17A-His (biotina) para ligação ao antígeno IL17A-His foi detectada por ELISA competitivo.
[00164]Etapas experimentais: IL17A-His foi adicionada à microplaca e incubada a 4°C durante a noite; após bloqueio com 1% BSA em PBST a 37°C durante 2 h, anticorpos foram adicionados respectivamente, e o antígeno e o anticorpo reagidos em temperatura ambiente durante 10 min; então, o receptor IL17RA-His (biotina) foi adicionado que é bem misturado com o anticorpo a uma razão em volume de 1:1 e incubado a 37°C durante 30 min; e SA-HRP (KPL, 14-30-00) foi adicionado e incubado a 37°C durante 30 min; e, então, a reação colorida foi realizada com TMB (Neogen, 308177) durante 5 min, e a absorbância a 450 nm foi detectada em um leitor de microplaca. Os dados experimentais obtidos foram analisados e processados com software SoftMax Pro 6.2.1, e a curva ajustada de 4 parâmetros foi traçada para análise com a concentração de anticorpo como a abscissa e o valor de absorbância como a ordenada.
[00165]Os resultados experimentais são mostrados em Figura 17 e Tabela 8 abaixo. Aqui, o bloqueio EC50 de 2G2 H1L1 é 2,264 nM, o bloqueio EC50 de 2G2 H2L2 é 5,408 nM, e o bloqueio EC50 de 2G2 H3L3 é 5,911 nM (Figura 17, Tabela 8). Tabela 8: Resultados da detecção da atividade de 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 e 2G2 H3L3 competindo com o receptor IL17RA-His (biotina) para ligação ao antígeno IL17A-His Concen- Revestimento de antígeno: IL17A-His 0,5 tração de anticorpo/ 2G2 H1L1 2G2 H2L2 2G2 H3L3 Secukinumab gradiente 10 0,285 0,272 0,337 0,366 0,680 0,718 0,247 0,267 1:3 0,417 0,485 0,500 0,623 0,971 0,876 0,333 0,361 1:9 0,506 0,502 0,785 0,751 0,971 0,954 0,478 0,507 1:27 0,891 0,763 1,087 1,038 1,242 1,178 0,758 0,784 1:81 1,162 1,167 1,286 1,309 1,246 1,312 1,088 1,135 1:243 1,231 1,281 1,423 1,402 1,398 1,466 1,272 1,184 1:729 1,453 1,472 1,464 1,596 1,607 1,466 1,392 1,324 0 1,455 1,425 1,494 1,424 1,470 1,340 1,170 1,230 Receptor IL17RA-His (biotina) :0,1 EC50 (nM) 2,264 5,408 5,911 2,749
[00166]Os resultados experimentais mostram que os anticorpos 2G2 H1L1, 2G2 H2L2, e 2G2 H3L3 podem, todos, bloquear efetivamente a ligação do receptor IL17RA-His (biotina) ao antígeno IL17A-His, e a eficiência do bloqueio é dependente da dose.
Exemplo 10: Reação de fibroblastos embrionários humanos misturados: secreção de citocina IL-6
[00167]Células MRC 5 (adquiridas do Cell Center of the Chinese Academy of Sciences) foram colocadas em placas de 96 cavidades com 5000 células/cavidade e cultivadas durante a noite. Uma mistura de IL-17 e anticorpo (hIgG como um controle) incubados a 37°C durante 20 min foi adicionada às células MRC 5 e cultivadas durante 48 h. Após 48 h de cultivo, o sobrenadante de células foi coletado, e a quantidade de IL-6 secretada foi detectada por um kit ELISA (adquirido de Dakewe Corporation).
[00168]As células MRC 5 foram misturadas e cultivadas com 13E9 H1L1, 13E9 H2L2, 13E9 H3L2, 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 ou 2G2 H3L3 (1 nM, 10 nM, 100 nM) e Secukinumab (1 nM, 10 nM, 100 nM), respectivamente, e os resultados da detecção de IL- 6 secretada são mostrados em Figura 18.
[00169]Pode ser visto a partir da Figura 18 que 13E9 H1L1, 13E9 H2L2, 13E9 H3L2, e 2G2 H2L2 podem, todos, efetivamente reduzir a secreção de IL-6 de células MRC 5 induzida por IL-17, em que: o efeito de anticorpo 13E9 H1L1 na inibição de secreção de IL-6 a uma concentração de 100 nM é melhor do que a do anticorpo de controle Secukinumab na mesma dose, e o efeito inibidor sobre a secreção de IL-6 a uma concentração de 10 nM é equivalente à do anticorpo de controle Secukinumab a uma concentração de 100 nM; os efeitos de anticorpo 13E9 H2L2 na inibição de secreção de IL-6 a concentrações de1 nM, 10 nM e 100 nM são, todos, equivalentes aos do anticorpo de controle Secukinumab na mesma dose;
os efeitos inibidores de anticorpo 13E9 H3L2 na secreção de IL-6 em concentrações de 10 nM e 100 nM são, todos, melhores do que os do anticorpo de controle Secukinumab na mesma dose, e o efeito a uma concentração de 1 nM é equivalente à do anticorpo de controle Secukinumab; os efeitos de anticorpo 2G2 H2L2 na inibição de secreção de IL-6 em concentrações de 1 nM e 100 nM são, todos, equivalentes aos do anticorpo de controle Secukinumab; o efeito de 2G2 H3L3 na inibição de secreção de IL-6 a uma concentração de 1 nM é melhor do que a do anticorpo de controle Secukinumab na mesma dose.
[00170]Os resultados acima mostram que, em uma reação in vitro de fibroblasto embrionário humano misturado, a atividade biológica dos anticorpos da presente invenção em bloqueio da secreção mediada por IL-17A de IL-6 é melhor do que ou pelo menos equivalente à do fármaco comercializado Secukinumab para o mesmo alvo. Exemplo 11: Efeito do fármaco de anticorpo 13E9 H3L2 sobre a espessura epidérmica do modelo de psoríase de camundongo C57BL/6
[00171]Camundongos C57BL/6 foram divididos em 5 grupos com 8 camundongos em cada. (1) Modelagem: Grupo normal, C57BL/6 camundongos foram injetados intradermicamente com solução salina normal no dorso liso durante 6 dias consecutivos a partir do dia 1 até dia 6, 25 µL/camundongo; Os grupos restantes de camundongos foram injetados intradermicamente com uma IL-17A humana recombinante a partir do dia 1 até dia 4, 2 e foram injetados intradermicamente com a IL-17A humana recombinante a partir do dia 5 até dia 6, 5 (2) Agrupamento específico e administração: Grupo normal: solução salina normal, administrada a uma dose de 0 mg/kg, 3 vezes por uma semana durante um total de 3 vezes; Grupo de modelo: controle de isotipo negativo, administrado a uma dose de 50 mg/kg, 3 vezes por uma semana durante um total de 3 vezes; Grupo Secukinumab: Secukinumab, administrado a uma dose de 50 mg/kg, 3 vezes por uma semana durante um total de 3 vezes; Grupo de alta dose de 13E9 H3L2: administrado a uma dose de 50 mg/kg, 3 vezes por uma semana durante um total de 3 vezes; Grupo de baixa dose de 13E9 H3L2: administrado a uma dose de 10 mg/kg, 3 vezes por uma semana durante um total de 3 vezes.
[00172]Cada grupo foi administrado subcutaneamente 3 vezes, ou seja, 1 dias antes da modelagem, dia de modelagem 3 e dia de modelagem 6, respectivamente.
[00173]No dia 7, as peles dos sítios de injeção nos dorsos dos camundongos foram fixadas para obter seções patológicas e medir a espessura epidérmica.
[00174]Os resultados experimentais são mostrados em Figura 19.
[00175]Os resultados mostram que, estatisticamente, a espessura epidérmica do grupo Secukinumab (50 mg/kg), do grupo de dose elevada 13E9 H3L2 (50 mg/kg) e do grupo de dose baixa 13E9 H3L2 (10 mg/kg) foi significativamente menor do que a do grupo de modelo (P < 0,01).
[00176]Os resultados mostram que o anticorpo 13E9 H3L2 (50 mg/kg) mostra um efeito inibidor estatisticamente significativo sobre a espessura epidérmica em um modelo de psoríase de camundongo C57BL/6, e apresenta a mesma eficácia como Secukinumab (50 mg/kg); o efeito inibidor de 13E9 H3L2 (10 mg/kg) sobre a espessura epidérmica é também estatisticamente significativo.
[00177]Embora modalidades específicas da presente invenção tenham sido descritas em detalhes, os versados na técnica irão entender que várias modificações e substituições podem ser feitas nesses detalhes de acordo com todos os ensinamentos que foram divulgados, e essas mudanças estão, todas, dentro do escopo de proteção da presente invenção. O escopo completo da presente invenção é dado pelas reivindicações em anexo e qualquer equivalente das mesmas.

Claims (26)

REIVINDICAÇÕES
1. Anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que uma região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal compreende: HCDR1-HCDR3 com sequências de aminoácido especificadas em SEQ ID NOs: 31-33 respectivamente, ou HCDR1-HCDR3 com sequências de aminoácido especificadas em SEQ ID NOs: 37-39 respectivamente, e uma região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal compreende: LCDR1-LCDR3 com sequências de aminoácido especificadas em SEQ ID NOs: 34-36 respectivamente, ou LCDR1-LCDR3 com sequências de aminoácido especificadas em SEQ ID NOs: 40-42 respectivamente.
2. Anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal compreende HCDR1-HCDR3 com sequências de aminoácido especificadas em SEQ ID NOs: 31-33 respectivamente, e a região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal compreende LCDR1-LCDR3 com sequências de aminoácido especificadas em SEQ ID NOs: 34-36 respectivamente; ou a região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal compreende HCDR1-HCDR3 com sequências de aminoácido especificadas em SEQ ID NOs: 37-39 respectivamente, e a região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal compreende LCDR1-LCDR3 com sequências de aminoácido especificadas em SEQ ID NOs: 40-42 respectivamente.
3. Anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada é selecionada dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 24 e SEQ ID NO: 28, e a sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve é selecionada dentre SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 30.
4. Anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada é selecionada dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, e SEQ ID NO: 14, e a sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve é selecionada dentre SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, e SEQ ID NO: 12; ou a sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada é selecionada dentre SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 24 e SEQ ID NO: 28, e a sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve é selecionada dentre SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 30.
5. Anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve são selecionadas dentre qualquer uma das (1)- (8) abaixo: (1) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido especificada em SEQ ID NO: 2, e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido especificada em SEQ ID NO: 4; (2) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido especificada em SEQ ID NO: 6, e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido especificada em SEQ ID NO: 8; (3) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido especificada em SEQ ID NO: 10, e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido especificada em SEQ ID NO: 12; (4) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido especificada em SEQ ID NO: 14, e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido especificada em SEQ ID NO: 12; (5) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido especificada em SEQ ID NO: 16, e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido especificada em SEQ ID NO: 18; (6) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido especificada em SEQ ID NO: 20, e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido especificada em SEQ ID NO: 22; (7) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido especificada em SEQ ID NO: 24, e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido especificada em SEQ ID NO: 26; e (8) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido especificada em SEQ ID NO: 28, e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido especificada em SEQ ID NO: 30.
6. Anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é selecionado dentre um Fab, um Fab', um F(ab')2, um Fd, um Fv, um dAb, um fragmento de região determinante de complementariedade, um anticorpo de cadeia única, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, e um diacorpo.
7. Anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal se liga a IL-17A com um EC50 de menos do que cerca de 100 nM, como menos do que cerca de 10 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2,5 nM, 2 nM, ou menos; preferivelmente, o EC50 é medido por ELISA competitivo.
8. Anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal compreende uma região não CDR derivada de espécie diferente de murino, como de um anticorpo humano.
9. Anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que: o anticorpo monoclonal é um anticorpo monoclonal produzido por linhagem de células de hibridoma LT006, que foi depositada junto ao China Center for Type Culture Collection (CCTCC) com o número de acesso de CCTCC NO: C2017102; ou o anticorpo monoclonal é um anticorpo monoclonal produzido por linhagem de células de hibridoma LT007, que foi depositada junto ao China Center for Type Culture Collection (CCTCC) com o número de acesso de CCTCC NO: C2017165.
10. Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada pelo fato de que compreende um ácido nucleico codificando a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.
11. Molécula de ácido nucleico isolada, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico codificando a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve é selecionado dentre qualquer um de (1)-(8) abaixo: (1) SEQ ID NO: 1 ID NO: 3; (2) SEQ ID NO: 5 ID NO: 7; (3) SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 11; (4) SEQ ID NO: 13 ID NO: 11; (5) SEQ ID NO: 15 ID NO: 17; (6) SEQ ID NO: 19 ID NO: 21; (7) SEQ ID NO: 23 ID NO: 25; e (8) SEQ ID NO: 27 ID NO: 29.
12. Vetor recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico isolada, conforme definida na reivindicação 10 ou 11, em que, preferivelmente, o vetor recombinante é um vetor de expressão recombinante, como um vetor de expressão procariótico recombinante ou um vetor de expressão eucariótico recombinante.
13. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor recombinante, conforme definido na reivindicação 12.
14. Método para preparar o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a célula hospedeira, conforme definida na reivindicação 13, sob condições apropriadas e isolar o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo a partir das culturas celulares.
15. Linhagem de células de hibridoma, caracterizada pelo fato de ser selecionada dentre: linhagem de células de hibridoma LT006, que foi depositada junto ao China Center for Type Culture Collection (CCTCC) com o número de acesso de CCTCC NO: C2017102; e linhagem de células de hibridoma LT007, que foi depositada junto ao China Center for Type Culture Collection (CCTCC) com o número de acesso de CCTCC NO: C2017165.
16. Conjugado, caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, e uma porção conjugada, em que a porção conjugada é um marcador detectável; preferivelmente, o marcador detectável é um isótopo radioativo, uma substância luminescente como uma substância fluorescente, uma substância colorida, ou uma enzima.
17. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, ou o conjugado, conforme definido com a reivindicação 16, em que: preferivelmente, o kit compreende adicionalmente um segundo anticorpo que especificamente reconhece o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; opcionalmente, o segundo anticorpo compreende adicionalmente um marcador detectável; preferivelmente, o marcador detectável é um isótopo radioativo, uma substância luminescente como uma substância fluorescente, uma substância colorida, ou uma enzima.
18. Uso do anticorpo monoclonal ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, ou o conjugado, conforme definido na reivindicação 16, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um kit para detecção qualitativa ou quantitativa de IL-17A.
19. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, ou o conjugado conforme definido na reivindicação 16, em que, opcionalmente, a composição farmacêutica compreende adicionalmente carreadores ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
20. Uso do anticorpo monoclonal ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, ou o conjugado, conforme definido na reivindicação 16, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um fármaco para prevenir e/ou tratar tumores ou doenças autoimunes, ou na preparação de um fármaco para diagnosticar doenças autoimunes, em que, preferivelmente, a doença autoimune é selecionada dentre psoríase, artrite reumatoide, artrite psoriática, espondilite anquilosante e lúpus eritematoso sistêmico; preferivelmente, a psoríase é uma psoríase em placas moderada a grave.
21. Uso do anticorpo monoclonal ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 ou o conjugado, conforme definido com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de ser na preparação de: um fármaco para bloquear a ligação de IL-17A a IL17RA, um fármaco para regular (por exemplo, regular para baixo) atividade ou nível de IL-17A, ou um fármaco para inibir a expressão de IL-6 em células.
22. Método in vivo ou in vitro, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a uma célula ou a um indivíduo em necessidade de uma quantidade eficaz do anticorpo monoclonal ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, ou do conjugado, conforme definido na reivindicação 16, em que o método é selecionado dentre: um método para bloquear a ligação de IL-17A a IL17RA, um método para regular (por exemplo, regular para baixo) atividade ou nível de IL-17A, ou um método para inibir expressão de IL-6 em fibroblastos.
23. Método para tratar e/ou prevenir tumores ou doenças autoimunes, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um indivíduo em necessidade de uma quantidade eficaz do anticorpo monoclonal ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, ou o conjugado, conforme definido na reivindicação 16, em que, preferivelmente, a doença autoimune é selecionada dentre psoríase, artrite reumatoide, artrite psoriática, espondilite anquilosante, e lúpus eritematoso sistêmico; preferivelmente, a psoríase é uma psoríase em placas moderada a grave.
24. Anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de ser usado para prevenir e/ou tratar tumores ou doenças autoimunes, ou para diagnosticar doenças autoimunes, em que, preferivelmente, a doença autoimune é selecionada dentre psoríase, artrite reumatoide, artrite psoriática, espondilite anquilosante, e lúpus eritematoso sistêmico; preferivelmente, a psoríase é uma psoríase em placas moderada a grave.
25. Anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de ser usado para: bloquear a ligação de IL-17A a IL-17RA, regular (por exemplo, regular para baixo) atividade ou nível de IL-17A, ou inibir expressão de IL-6 em células.
26. Método para diagnosticar doenças autoimunes,
caracterizado pelo fato de que compreende administrar a uma amostra a ser testada (como uma amostra de tecido, uma amostra de célula, ou uma amostra de sangue) ou um indivíduo em necessidade de uma quantidade eficaz do anticorpo monoclonal ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, ou o conjugado, conforme definido na reivindicação 16, em que, preferivelmente, a doença autoimune é selecionada dentre psoríase, artrite reumatoide, artrite psoriática, espondilite anquilosante, e lúpus eritematoso sistêmico; preferivelmente, a psoríase é uma psoríase em placas moderada a grave; preferivelmente, se o nível de expressão de IL-17A medido é maior do que em indivíduos saudáveis e alcança um nível patogênico, o resultado do diagnóstico é positivo; de outra forma, o resultado do diagnóstico é negativo.
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