BR112021000583A2 - Anticorpo, composição, célula isolada, polinucleotídeo, métodos para supressão de uma resposta imune ou tratamento de uma doença ou distúrbio autoimune, para tratamento de câncer e para detecção da expressão de uma proteína, e, uso de um anticorpo. - Google Patents

Abstract

são providos anticorpos ou fragmentos dos mesmos tendo especificidade de ligação à proteína do ligante 13 de quimiocina humana (motivo c-x-c) (cxcl13). em vários exemplos, os anticorpos ou fragmentos dos mesmos incluem cdrs de vh e vl como aqui descritos, ou variantes dos mesmos. métodos de uso de anticorpos ou fragmentos dos mesmos para o tratamento de doenças e distúrbios autoimunes também são providos.

Description

1 / 92 ANTICORPO, COMPOSIÇÃO, CÉLULA ISOLADA, POLINUCLEOTÍDEO, MÉTODOS PARA SUPRESSÃO DE UMA

RESPOSTA IMUNE OU TRATAMENTO DE UMA DOENÇA OU DISTÚRBIO AUTOIMUNE, PARA TRATAMENTO DE CÂNCER E PARA DETECÇÃO DA EXPRESSÃO DE UMA PROTEÍNA, E, USO DE UM ANTICORPO

[001] A presente invenção reivindica a prioridade da PCT/CN2018/106158, depositada em 18 de setembro de 2018, o conteúdo da qual é aqui incorporado em sua totalidade.

FUNDAMENTOS

[002] O ligante 13 de quimiocina (motivo C-X-C) (CXCL13), também conhecido como quimioatrator de linfócitos B (BLC) ou quimiocina 1 de atração de células B (BCA-1), é um ligante de proteína que em humanos é codificado pelo gene CXCL13. O CXCL13 é uma pequena quimiocina pertencente à família das quimiocinas CXC. Como seu nome sugere, esta quimiocina é seletivamente quimiotática para células B pertencentes aos subconjuntos B-1 e B-2 e provoca seus efeitos ao interagir com o receptor de quimiocina CXCR5.

[003] CXCL13 e seu receptor CXCR5 controlam a organização das células B dentro dos folículos dos tecidos linfoides e são altamente expressos no fígado, baço, nódulos linfáticos e intestino de humanos. O gene para CXCL13 está localizado no cromossomo 4 humano em um grupo de outras quimiocinas CXC.

[004] Nos linfócitos T, a expressão de CXCL13 é pensada para refletir uma origem do centro germinativo da célula T, particularmente um subconjunto de células T chamadas células T auxiliares B foliculares (ou células TFH). Portanto, a expressão de CXCL13 em linfomas de células T, como o linfoma angioimunoblástico de células T, é pensada para refletir uma origem no centro germinativo das células T neoplásicas.

2 / 92

[005] A necessidade de terapias que alvejam as vias de sinalização mediadas por CXCL13 tem se tornado cada vez mais aparente nos últimos anos. Os mecanismos de ação para tais tratamentos incluiriam, por exemplo, o bloqueio da interação de CXCL13 com seu receptor, resultando na interferência com a migração de células B foliculares e de células T auxiliares B para tecidos inflamados e formação de centro germinativo (por exemplo, em caso de doença autoimune) e na inibição da proliferação de células cancerosas e capacidade de propagação em distúrbios oncológicos.

SUMÁRIO

[006] A presente descrição provê anticorpos ou fragmentos dos mesmos com especificidade de ligação para a proteína do ligante 13 de quimiocina humana (motivo C-X-C) (CXCL13), bem como anticorpos biespecíficos com especificidade para CXCL13 e outro antígeno, como BAFF e IFNαRI. Estes anticorpos e fragmentos são úteis no tratamento de doenças autoimunes, bem como no câncer.

[007] Uma modalidade da presente descrição provê um anticorpo ou fragmento do mesmo tendo especificidade para uma proteína do ligante 13 de quimiocina humana (motivo C-X-C) (CXCL13), em que o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada HCDR1, HCDR2 e HCDR3, e uma região variável de cadeia leve que compreende regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve LCDR1, LCDR2 e LCDR3, em que: a HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 127 (RYWMS); a HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:128 (EINPDSSTINYAPSLKD), SEQ ID NO:129 (EINPESSTINYAPSLKD), SEQ ID NO:340 (EINPEASSINYAPSLKD), SEQ ID NO:343, (EINPEAGKWNYAPSLKD), SEQ ID NO:347 (EINPETTIINYAPSLKD), SEQ ID NO:349 (EINPESTLINYAPSLKD), SEQ ID NO:351, INPESTGINYAPSLKD), SEQ

3 / 92 ID NO:354 (EINPESNFINYAPSLKD), SEQ ID NO:357 (EINPERNYINYAPSLKD), SEQ ID NO:369 (EINPEASTINYAPSLKD), ou SEQ ID NO:370 (EINPESSSINYAPSLKD); a HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:130 (QDDYEYYAMDY), SEQ ID NO:341 (QDDYSHYAMDY), SEQ ID NO:344 (QDDYTTYAMDY), SEQ ID NO:345 (QDDYLTYAMDY), SEQ ID NO:348 (QDDYRHYAMDY), SEQ ID NO:350 (QDDYRNYAMDY), SEQ ID NO:352 (QDDYWTYAMDY), SEQ ID NO:355 (QDDYSVYAMDY), SEQ ID NO:358 (QDDYDKYAMDY), SEQ ID NO:359 (QDDYEYYTMDY), SEQ ID NO:362 (QEDYEYYALDY), SEQ ID NO:365 (QDDTRYYAMDY), SEQ ID NO:366 (QDDYLYYTMDY), SEQ ID NO:367 (QDDYETYTMDY), SEQ ID NO:368 (QDDYLTYTMDY), SEQ ID NO:371 (QDDYSYYTMDY), SEQ ID NO:372 (QDDYEHYTMDY), ou SEQ ID NO:373 (QDDYSHYTMDY); a LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:131 (KASQDVNTGVA), SEQ ID NO:342 (KASQDVNTGVS), SEQ ID NO:346 (KASQDVNTAVD), SEQ ID NO:353 (KASQDVNTAVS), SEQ ID NO:356 (KASQDVNTGVT), SEQ ID NO:360 (KVSQDVNTGVA), ou SEQ ID NO:363 (KASQDVNTGVY); a LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 132 (SASYRYT); e a LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 (QQYYSTPLT), SEQ ID NO: 361 (QQYWSTPLT) ou SEQ ID NO: 364 (QQGYSTPLT).

[008] Em algumas modalidades, a HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCD2 e LCDR3 compreendem SEQ ID NO: 127, 129, 367, 360, 132 e 133, respectivamente. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 181 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 181, e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 179 ou uma sequência de

4 / 92 aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 179.

[009] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento do mesmo é humanizado e a região variável de cadeia pesada compreende uma ou mais mutações reversas selecionadas do grupo que consiste em 5Q, 47I, 48G e 85V, de acordo com a numeração de Kabat e combinações das mesmas, ou a região variável de cadeia leve compreende uma mutação 78V de acordo com a numeração de Kabat.

[0010] Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 181 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 179.

[0011] Em algumas modalidades, a HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCD2 e LCDR3 compreendem a SEQ ID NO: 127, 129, 359, 360, 132 e 133, respectivamente. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 174 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 174, e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 179 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 179.

[0012] Em algumas modalidades, a HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCD2 e LCDR3 compreendem a SEQ ID NO: 127, 129, 359, 360, 132 e 361, respectivamente. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 174 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 174, e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 175 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência

5 / 92 com a SEQ ID NO: 175.

[0013] Em algumas modalidades, a HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCD2 e LCDR3 compreendem a SEQ ID NO: 127, 129, 130, 131, 132 e 133, respectivamente. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 156 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 156, e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 138 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 138.

[0014] Em algumas modalidades, a HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCD2 e LCDR3 compreendem SEQ ID NO: 127, 128, 130, 131, 132 e 133, respectivamente. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 134 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 134, e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 138 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 138.

[0015] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento do mesmo é humanizado e a região variável de cadeia pesada compreende uma ou mais mutações reversas selecionadas do grupo que consiste em 5Q, 47I, 48G e 85V, de acordo com a numeração de Kabat e combinações das mesmas, ou a região variável de cadeia leve compreende uma mutação 78V de acordo com a numeração de Kabat.

[0016] Também é provido, em uma modalidade, um anticorpo ou fragmento do mesmo tendo especificidade para uma proteína do ligante 13 de quimiocina humana (motivo C-X-C) (CXCL13), em que o anticorpo ou fragmento do mesmo pode se ligar a um ou mais resíduos de aminoácidos

6 / 92 selecionados a partir de o grupo que consiste em F20, P22, R24 e F25 da proteína CXCL13.

[0017] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento do mesmo pode se ligar a F20 e P22, F20 e R24, F20 e F25, P22 e R24, P22 e F25, ou R24 e F25 da proteína CXCL13. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento do mesmo pode se ligar a F20, P22 e R24; F20, P22 e F25; F20, R24 e F25; ou P22, R24 e F25 da proteína CXCL13. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento do mesmo pode se ligar a F20, P22, R24 e F25 da proteína CXCL13. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento do mesmo pode ainda se ligar à proteína CXCL13 de cynomolgus.

[0018] Em uma modalidade, é provido um anticorpo biespecífico, que compreende uma primeira porção de ligação ao antígeno tendo especificidade para uma proteína do ligante 13 de quimiocina humana (motivo C-X-C) (CXCL13) e uma segunda porção de ligação ao antígeno tendo especificidade para um B- humano proteína do fator de ativação celular (BAFF), em que a primeira porção de ligação ao antígeno compreende um fragmento de anticorpo da presente descrição. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico tem um formato que compreende um anticorpo completo fundido em dois fragmentos de cadeia única (scFv) ou a dois fragmentos Fab. Em algumas modalidades, a segunda porção compreende um fragmento de ligação ao antígeno de Belimumabe.

[0019] Métodos e usos também são providos. Em uma modalidade, é provido um método para supressão de uma resposta imune ou tratamento de uma doença ou distúrbio autoimune em um paciente em necessidade, que compreende a administração ao paciente do anticorpo ou fragmento do mesmo de um anticorpo biespecífico da presente descrição.

[0020] Em uma modalidade, é provido um método de tratamento de câncer em um paciente em necessidade, que compreende a administração ao paciente do anticorpo ou fragmento do mesmo.

7 / 92

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0021] A FIG. 1 mostra que anticorpos quiméricos de anti-CXCL13 tiveram atividade potente no bloqueio do fluxo de cálcio induzido por CXCL13 em células CHO-K1-CXCR5, exceto 415A3D1.

[0022] A FIG. 2 mostra que os anticorpos anti-CXCL13, 64C10G1, 21H12D9, 329F2E1, 411A11E9, 71F4A3 e 1H3A11 podem bloquear efetivamente dependente da dose o sinal IP1 e a eficiência de inibição foi similar.

[0023] A FIG. 3 mostra que a migração de células BaF3-CXCR5 foi dependente da dose inibida por anticorpos anti-CXCL13.

[0024] A FIG. 4 mostra que todos os anticorpos anti-CXCL13 quiméricos inibiram a quimiotaxia das células da tonsila humana primária de uma maneira titulável.

[0025] A FIG. 5 mostra com um modelo in vivo que o anticorpo anti- CXCL13 64C10G1 teve eficácia potente no bloqueio - produção de anticorpo de alta afinidade específica para antígeno, troca de classe, que significa inibição da formação do centro germinativo.

[0026] A FIG. 6 mostra que o anticorpo monoclonal de camundongo 424H7F2 pode inibir, dependente da dose, a migração de esplenócitos de camundongo primário em direção a CXCL13 de camundongo.

[0027] A FIG. 7 mostra que o anticorpo anti-CXCL13 de camundongo 424H7F2 mediou a inibição da função CXCL13 na formação do centro germinativo (GC) em órgãos linfoides secundários e troca de classe de isotipo por células B virgens e produção de anticorpo de alta afinidade específico para antígeno.

[0028] A FIG. 8 mostra a identificação dos resíduos de epítopo na proteína CXCL13 humana.

[0029] A FIG. 9 mostra resultados de teste em ensaios de sinal a jusante de Fabs humanizados com mutações que removem modificações pós-

8 / 92 translatoína.

[0030] A FIG. 10 mostra que ambos os Fabs 64C10G1-VH1VL2 (D53E, D107E) e 71F4A3-VH1VL1 (Hz71F4) (D54E) poderiam bloquear dependente da dose CXCL13 humano induziu a migração de células da tonsila humana primária.

[0031] A FIG. 11 mostra as propriedades de ligação de anticorpos IgG1 de comprimento total humanizado com mutações que removem modificações pós-translatoína.

[0032] A FIG. 12 mostra que os anticorpos testados inibiram a sinalização IP1 induzida por CXCL13.

[0033] A FIG. 13 mostra que os anticorpos maturados por afinidade testados inibiram a sinalização IP1 induzida por CXCL13.

[0034] A FIG. 14 mostra que os anticorpos testados inibiram a migração de células BaF3-CXCR5 (humanas) em direção a CXCL13.

[0035] A FIG. 15 mostra que os anticorpos amadurecidos por afinidade inibiram a quimiotaxia de células da tonsila humana primária induzida por CXCL13 de uma maneira dependente da dose.

DESCRIÇÃO DETALHADA Definições

[0036] Deve-se notar que o termo “um” ou “uma” entidade se refere a uma ou mais dessa entidade; por exemplo, “um anticorpo” é entendido como representando um ou mais anticorpos. Como tal, os termos “um” (ou “uma”), “um ou mais” e “pelo menos um” podem ser usados indistintamente neste documento.

[0037] Conforme usado neste documento, um “anticorpo” ou “polipeptídeo de ligação ao antígeno” se refere a um polipeptídeo ou complexo de polipeptídeo que reconhece especificamente e se liga a um antígeno. Um anticorpo pode ser um anticorpo inteiro e qualquer fragmento de ligação ao antígeno ou uma única cadeia deste. Assim, o termo “anticorpo”

9 / 92 inclui qualquer proteína ou peptídeo contendo molécula que compreende pelo menos uma porção de uma molécula de imunoglobulina com atividade biológica de ligação ao antígeno. Exemplos de tais incluem, mas não estão limitados a uma região determinante de complementaridade (CDR) de uma cadeia pesada ou leve ou uma porção de ligação de ligante desta, uma região variável de cadeia pesada ou de cadeia leve, uma região constante de cadeia pesada ou de cadeia leve, uma estrutura (FR) região, ou qualquer porção dela, ou pelo menos uma porção de uma proteína de ligação.

[0038] Os termos “fragmento de anticorpo” ou “fragmento de ligação ao antígeno”, tal como aqui utilizados, são uma porção de um anticorpo tal como F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, Fv, scFv e similar. Independentemente da estrutura, um fragmento de anticorpo se liga ao mesmo antígeno que é reconhecido pelo anticorpo intacto. O termo “fragmento de anticorpo” inclui aptâmeros, spiegelmers e diacorpos. O termo “fragmento de anticorpo” também inclui qualquer proteína sintética ou geneticamente modificada que atua como um anticorpo ligando-se a um antígeno específico para formar um complexo.

[0039] Um “fragmento variável de cadeia única” ou “scFv” se refere a uma proteína de fusão das regiões variáveis das cadeias pesadas (VH) e leves (VL) de imunoglobulinas. Em alguns aspectos, as regiões estão conectadas a um peptídeo ligante curto de dez a cerca de 25 aminoácidos. O ligante pode ser rico em glicina para flexibilidade, bem como serina ou treonina para solubilidade, e pode conectar o terminal N do VH com o terminal C do VL ou vice-versa. Esta proteína retém a especificidade da imunoglobulina original, apesar da remoção das regiões constantes e da introdução do ligante. As moléculas de ScFv são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, na patente US 5.892.019.

[0040] O termo anticorpo abrange várias classes amplas de polipeptídeos que podem ser distinguidos bioquimicamente. Os versados na

10 / 92 técnica apreciarão que as cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta ou épsilon (, , , , ) com algumas subclasses entre elas (por exemplo,  l-4). É a natureza dessa cadeia que determina a “classe” do anticorpo como IgG, IgM, IgA IgG ou IgE, respectivamente. As subclasses de imunoglobulina (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, etc., são bem distinguidas e são conhecidas por conferir especialização funcional. Versões modificadas de cada uma dessas classes e isotipos são prontamente discerníveis para o versado na técnica em vista da presente descrição e, consequentemente, estão dentro do escopo da presente descrição. Todas as classes de imunoglobulinas estão claramente dentro do escopo da presente descrição, a discussão a seguir será geralmente direcionada à classe IgG de moléculas de imunoglobulina. No que se refere a IgG, uma molécula de imunoglobulina padrão compreende dois polipeptídeos de cadeia leve idênticos de peso molecular de aproximadamente 23.000 Daltons, e dois polipeptídeos de cadeia pesada idênticos de peso molecular de 53.000-70.000. As quatro cadeias são tipicamente unidas por ligações dissulfeto em uma configuração “Y”, em que as cadeias leves envolvem as cadeias pesadas começando na boca do “Y” e continuando através da região variável.

[0041] Anticorpos, polipeptídeos de ligação a antígeno, variantes ou derivados dos mesmos da descrição incluem, mas não estão limitados a, anticorpos policlonais, monoclonais, multiespecíficos, humanos, humanizados, primatizados ou quiméricos, anticorpos de cadeia única, fragmentos de ligação a epítopos , por exemplo, Fab, Fab 'e F (ab') 2, Fd, Fvs, Fvs de cadeia simples (scFv), anticorpos de cadeia simples, Fvs ligados por dissulfeto (sdFv), fragmentos que compreende um domínio VK ou VH, fragmentos produzido por uma biblioteca de expressão de Fab e anticorpos anti-idiotípicos (anti-Id) (incluindo, por exemplo, anticorpos anti-Id para anticorpos LIGHT aqui descritos). A imunoglobulina ou moléculas de anticorpo da descrição podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE,

11 / 92 IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2) ou subclasse de molécula de imunoglobulina.

[0042] As cadeias leves são classificadas como kappa ou lambda , ). Cada classe de cadeia pesada pode ser ligada a uma cadeia leve kappa ou lambda. Em geral, as cadeias leves e pesadas são covalentemente ligadas entre si, e as porções de “cauda” das duas cadeias pesadas são ligadas entre si por ligações dissulfeto covalentes ou ligações não covalentes quando as imunoglobulinas são geradas por hibridomas, B células ou células hospedeiras geneticamente modificadas. Na cadeia pesada, as sequências de aminoácidos vão de um terminal N nas extremidades bifurcadas da configuração Y para o terminal C na parte inferior de cada cadeia.

[0043] Ambas as cadeias leve e pesada são divididas em regiões de homologia estrutural e funcional. Os termos “constante” e “variável” são usados funcionalmente. A este respeito, será apreciado que os domínios variáveis de ambas as porções de cadeia leve (VK) e pesada (VH) determinam o reconhecimento e a especificidade do antígeno. Por outro lado, os domínios constantes da cadeia leve (CK) e da cadeia pesada (CH1, CH2 ou CH3) conferem propriedades biológicas importantes, como secreção, mobilidade transplacentária, ligação ao receptor Fc, ligação ao complemento e semelhantes. Por convenção, a numeração dos domínios da região constante aumenta à medida que se tornam mais distais do local de ligação ao antígeno ou terminal amino do anticorpo. A porção N-terminal é uma região variável e na porção C-terminal é uma região constante; os domínios CH3 e CK na verdade compreendem o terminal carbóxi da cadeia pesada e leve, respectivamente.

[0044] Como indicado acima, a região variável permite que o anticorpo reconheça seletivamente e se ligue especificamente a epítopos em antígenos. Ou seja, o domínio VK e o domínio VH, ou subconjunto das regiões determinantes de complementaridade (CDRs), de um anticorpo se

12 / 92 combinam para formar a região variável que define um local tridimensional de ligação ao antígeno. Esta estrutura de anticorpo quaternário forma o local de ligação ao antígeno presente no final de cada braço do Y. Mais especificamente, o local de ligação ao antígeno é definido por três CDRs em cada uma das cadeias VH e VK (ou seja, CDR-H1, CDR- H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3). Em alguns casos, por exemplo, certas moléculas de imunoglobulina derivadas de espécies de camelídeos ou projetadas com base em imunoglobulinas de camelídeos, uma molécula de imunoglobulina completa pode consistir em apenas cadeias pesadas, sem cadeias leves. Ver, por exemplo, Hamers-Casterman et al., Nature 363: 446- 448 (1993).

[0045] Em anticorpos de ocorrência natural, as seis “regiões determinantes de complementaridade” ou “CDRs” presentes em cada domínio de ligação ao antígeno são sequências curtas não contíguas de aminoácidos que são especificamente posicionadas para formar o domínio de ligação ao antígeno como o anticorpo assume sua configuração tridimensional em meio aquoso. O restante dos aminoácidos nos domínios de ligação ao antígeno, referidos como regiões de “estrutura”, mostram menos variabilidade inter- molecular. As regiões de estrutura adotam amplamente uma conformação de folha β e os CDRs formam laços que se conectam e, em alguns casos, fazem parte da estrutura de folha β. Assim, as regiões de estrutura atuam para formar um andaime que provê o posicionamento dos CDRs na orientação correta por interações não covalentes entre cadeias. O domínio de ligação ao antígeno formado pelas CDRs posicionadas define uma superfície complementar ao epítopo no antígeno imunorreativo. Esta superfície complementar promove a ligação não covalente do anticorpo ao seu epítopo cognato. Os aminoácidos que compreendem as CDRs e as regiões estruturais, respectivamente, podem ser prontamente identificados para qualquer dada região variável de cadeia pesada ou leve por um versado na técnica, uma vez que foram definidos com

13 / 92 precisão (ver “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” Kabat, E., et al., US Department of Health and Human Services, (1983); e Chothia e Lesk, J. MoI. Biol., 196: 901-917 (1987)).

[0046] No caso em que existem duas ou mais definições de um termo que é usado e/ou aceito na técnica, a definição do termo conforme usado neste documento se destina a incluir todos os significados, a menos que explicitamente declarado o contrário. Um exemplo específico é o uso do termo “região determinante de complementaridade” (“CDR”) para descrever os locais de combinação de antígeno não contíguo encontrados dentro da região variável de polipeptídeos de cadeia pesada e leve. Esta região particular foi descrita por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of Proteins of Immunological Interest” (1983) e por Chothia et al., J. MoI. Biol. 196: 901-917 (1987), que são incorporados aqui por referência na sua totalidade. As definições de CDR de acordo com Kabat e Chothia incluem sobreposição ou subconjuntos de resíduos de aminoácidos quando comparados uns com os outros. No entanto, a aplicação de qualquer uma das definições para se referir a uma CDR de um anticorpo ou variantes do mesmo pretende estar dentro do escopo do termo conforme definido e usado aqui. Os resíduos de aminoácidos apropriados que abrangem os CDRs conforme definidos por cada uma das referências citadas acima são apresentados na tabela abaixo como uma comparação. Os números exatos dos resíduos que abrangem uma CDR particular irão variar dependendo da sequência e do tamanho da CDR. Os versados na técnica podem determinar rotineiramente quais resíduos compreendem uma CDR particular, dada a sequência de aminoácidos da região variável do anticorpo.

[0047] Os anticorpos descritos neste documento podem ser de qualquer origem animal, incluindo pássaros e mamíferos. De preferência, os anticorpos são humanos, murinos, burros, coelhos, cabras, porquinhos-da- índia, camelos, lhama, cavalos ou anticorpos de galinha. Em outra

14 / 92 modalidade, a região variável pode ser de origem condrictoide (por exemplo, de tubarões).

[0048] Conforme usado neste documento, o termo “região constante de cadeia pesada” inclui sequências de aminoácidos derivadas de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Um polipeptídeo que compreende uma região constante de cadeia pesada compreende pelo menos um dentre: um domínio CH1, um domínio de dobradiça (por exemplo, região de dobradiça superior, média e/ou inferior), um domínio CH2, um domínio CH3 ou uma variante ou fragmento do mesmo. Por exemplo, um polipeptídeo de ligação ao antígeno para uso na descrição pode compreender uma cadeia polipeptídica que compreende um domínio CH1; uma cadeia polipeptídica que compreende um domínio CH1, pelo menos uma porção de um domínio de dobradiça e um domínio CH2; uma cadeia polipeptídica que compreende um domínio CH1 e um domínio CH3; uma cadeia polipeptídica que compreende um domínio CH1, pelo menos uma porção de um domínio dobradiça e um domínio CH3, ou uma cadeia polipeptídica que compreende um domínio CH1, pelo menos uma porção de um domínio dobradiça, um domínio CH2 e um domínio CH3. Em outra modalidade, um polipeptídeo da descrição compreende uma cadeia polipeptídica que compreende um domínio CH3. Além disso, um anticorpo para uso na descrição pode não ter pelo menos uma porção de um domínio CH2 (por exemplo, todo ou parte de um domínio CH2). Conforme estabelecido acima, será entendido por um versado na técnica que a região constante da cadeia pesada pode ser modificada de modo que varie na sequência de aminoácidos da molécula de imunoglobulina de ocorrência natural.

[0049] A região constante da cadeia pesada de um anticorpo descrito neste documento pode ser derivada de diferentes moléculas de imunoglobulina. Por exemplo, uma região constante de cadeia pesada de um polipeptídeo pode compreender um domínio CH1 derivado de uma molécula

15 / 92 de IgGl e uma região de dobradiça derivada de uma molécula de IgG3. Em outro exemplo, uma região constante de cadeia pesada pode compreender uma região de dobradiça derivada, em parte, de uma molécula de IgGl e, em parte, de uma molécula de IgG3. Em outro exemplo, uma porção de cadeia pesada pode compreender uma dobradiça quimérica derivada, em parte, de uma molécula de IgGl e, em parte, de uma molécula de IgG4.

[0050] Conforme usado neste documento, o termo “região constante da cadeia leve” inclui sequências de aminoácidos derivadas da cadeia leve do anticorpo. De preferência, a região constante da cadeia leve compreende pelo menos um de um domínio kappa constante ou domínio lambda constante.

[0051] Um “par de cadeia leve-cadeia pesada” se refere à coleção de uma cadeia leve e uma cadeia pesada que pode formar um dímero através de uma ligação dissulfeto entre o domínio CL da cadeia leve e o domínio CH1 da cadeia pesada.

[0052] Como indicado anteriormente, as estruturas de subunidades e a configuração tridimensional das regiões constantes das várias classes de imunoglobulinas são bem conhecidas. Conforme usado neste documento, o termo “domínio VH” inclui o domínio variável do terminal amino de uma cadeia pesada de imunoglobulina e o termo “domínio CH1” inclui o primeiro (mais terminal amino) domínio da região constante de uma cadeia pesada de imunoglobulina. O domínio CH1 é adjacente ao domínio VH e é amino terminal da região de dobradiça de uma molécula de cadeia pesada de imunoglobulina.

[0053] Conforme usado neste documento, o termo “domínio CH2” inclui a porção de uma molécula de cadeia pesada que se estende, por exemplo, de cerca do resíduo 244 ao resíduo 360 de um anticorpo usando esquemas de numeração convencionais (resíduos 244 a 360, sistema de numeração de Kabat; e resíduos 231-340, sistema de numeração da UE; ver Kabat et al., US Dept. of Health and Human Services, “Sequences of Proteins

16 / 92 of Immunological Interest” (1983). O domínio CH2 é único por não estar intimamente emparelhado com outro Em vez disso, duas cadeias de carboidratos ramificadas ligadas a N são interpostas entre os dois domínios CH2 de uma molécula de IgG nativa intacta. Também está bem documentado que o domínio CH3 se estende do domínio CH2 ao C-terminal da molécula de IgG e compreende aproximadamente 108 resíduos.

[0054] Conforme usado neste documento, o termo “região de dobradiça” inclui a porção de uma molécula de cadeia pesada que une o domínio CH1 ao domínio CH2. Esta região de dobradiça compreende aproximadamente 25 resíduos e é flexível, permitindo assim que as duas regiões de ligação ao antígeno N-terminal se movam independentemente. As regiões de dobradiça podem ser subdivididas em três domínios distintos: domínios de dobradiça superior, médio e inferior (Roux et al., J. Immunol 161: 4083 (1998)).

[0055] Conforme usado neste documento, o termo “ligação dissulfeto” inclui a ligação covalente formada entre dois átomos de enxofre. O aminoácido cisteína compreende um grupo tiol que pode formar uma ligação dissulfeto ou ponte com um segundo grupo tiol. Na maioria das moléculas de IgG de ocorrência natural, as regiões CH1 e CK estão ligadas por uma ligação dissulfeto e as duas cadeias pesadas estão ligadas por duas ligações dissulfeto nas posições correspondentes a 239 e 242 usando o sistema de numeração Kabat (posição 226 ou 229, sistema de numeração da UE)

[0056] Tal como aqui utilizado, o termo “anticorpo quimérico” significará qualquer anticorpo em que a região ou local imunorreativo é obtido ou derivado de uma primeira espécie e a região constante (que pode estar intacta, parcial ou modificada de acordo com a descrição instantânea) é obtida de uma segunda espécie. Em certas modalidades, a região ou local de ligação ao alvo será de uma fonte não humana (por exemplo, camundongo ou primata) e a região constante é humana.

17 / 92

[0057] Por “se liga especificamente” ou “tem especificidade para”, geralmente significa que um anticorpo se liga a um epítopo por meio de seu domínio de ligação ao antígeno e que a ligação envolve alguma complementaridade entre o domínio de ligação ao antígeno e o epítopo. De acordo com esta definição, diz-se que um anticorpo “liga-se especificamente” a um epítopo quando se liga a esse epítopo, por meio de seu domínio de ligação ao antígeno mais prontamente do que se ligaria a um epítopo aleatório não relacionado. O termo “especificidade” é usado neste documento para qualificar a afinidade relativa pela qual um determinado anticorpo se liga a um determinado epítopo. Por exemplo, o anticorpo “A” pode ser considerado como tendo uma especificidade mais alta para um determinado epítopo do que o anticorpo “B”, ou pode-se dizer que o anticorpo “A” se liga ao epítopo “C” com uma especificidade mais alta do que tem para o epítopo relacionado “D.”

[0058] Conforme usado neste documento, os termos “tratamento de” ou “tratamento” referem-se a tratamento terapêutico e medidas profiláticas ou preventivas, em que o objetivo é prevenir ou retardar (diminuir) uma alteração fisiológica ou distúrbio indesejado, como a progressão de câncer. Os resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não estão limitados a, alívio dos sintomas, diminuição da extensão da doença, estado de doença estabilizado (ou seja, sem agravamento), atraso ou desaceleração da progressão da doença, melhoria ou paliação do estado da doença, e remissão (seja parcial ou total), seja detectável ou indetectável. “Tratamento” também pode significar prolongar a sobrevida em comparação com a sobrevida esperada se não receber tratamento. Aqueles que precisam de tratamento incluem aqueles que já têm a condição ou distúrbio, bem como aqueles propensos a ter a condição ou distúrbio ou aqueles nos quais o distúrbio ou condição deve ser evitado.

[0059] Por “sujeito” ou “indivíduo” ou “animal” ou “paciente” ou

18 / 92 “mamífero”, entende-se qualquer sujeito, particularmente um sujeito mamífero, para o qual o diagnóstico, prognóstico ou terapia é desejado. Os mamíferos incluem humanos, animais domésticos, animais de fazenda e zoológico, esporte ou animais de estimação, como cães, gatos, porquinhos-da- índia, coelhos, ratos, camundongos, cavalos, gado, vacas e assim por diante.

[0060] Conforme usado neste documento, frases como “para um paciente com necessidade de tratamento” ou “um sujeito com necessidade de tratamento” incluem sujeitos, como mamíferos, que se beneficiariam da administração de um anticorpo ou composição da presente descrição usado, por exemplo, para detecção, para um procedimento diagnóstico e/ou para tratamento. Anticorpos Anti-CXCL13

[0061] A presente descrição provê anticorpos, incluindo anticorpos biespecíficos e fragmentos, que têm especificidade de ligação para a proteína de ligante 13 (CXCL13) da quimiocina humana (motivo C-X-C). Conforme demonstrado nos exemplos experimentais, numerosos anticorpos CXCL13 murinos anti-humanos foram obtidos, tendo alta afinidade de ligação para a proteína CXCL13 humana. Alguns deles também podem apresentar reação cruzada com cynomolgus e proteínas CXCL13 de camundongo.

[0062] Quatro dos clones de anticorpo murino, 21H12D9, 64C10G1, 71F4A3 e 411A11E9, foram selecionados para humanização e caracterização adicional. Os anticorpos humanizados retiveram alta atividade de ligação à proteína CXCL13, inibiram o fluxo de cálcio induzido por CXCL13, bloquearam a sinalização IP1 mediada por CXCL13, bloquearam a migração de células derivadas de CXCL13, inibiram a produção de IgG específico anti- KLH, neutralizaram CXCL13 no sangue periférico e bloquearam o centro germinativo (GC) produção de células B, troca de classe e formação de GC. Em testes in vivo, os anticorpos foram capazes de inibir a migração de esplenócitos primários em direção a CXCL13 e diminuir a população de

19 / 92 células B GC.

[0063] Curiosamente, os anticorpos que se ligam de forma cruzada CXCL13 humano e cynomolgus se ligam ao mesmo epítopo de CXCL13. O epítopo inclui os resíduos de aminoácidos F20, P22, R24 e F25 na proteína humana.

[0064] De acordo com uma modalidade da presente descrição, são providos anticorpos e seus fragmentos que incluem os domínios variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve com as regiões CDR dos anticorpos preparados nos exemplos experimentais. Os CDRs estão resumidos na Tabela A abaixo. Tabela A. Sequências de CDR dos anticorpos de camundongo Cadeia de Sequências de CDR (CDR1, CDR2, CDR3 SEQ ID anticorpos em ordem, para VH ou VL) NO: 329F2E1-VH RYWMS 127 EINPDSSTINYAPSLKD 128 QDDYDYYAMDY 191 329F2E1-VL KASQDVSTGVA 192 SASYRYT 132 HQYYTIPLT 193 348B10B1 -VH EYIMH 194 GINPDNGDTTYNQKFKG 195 GVLDY 196 348B10B1 -VL KSSQSLLDSDGKTYLN 197 LVSKLDS 198 WQGTHFPFT 199 360A3D4E3 -VH EYIMH 194 GIHPDNGDTTYNQKFTG 200 GVLDY 196 360A3D4E3 -VL KSSQSLLDSDGRTYLN 201 LVSKLDS 198 WQGTHFPFT 199 414D10F5 -VH DYYMA 142 SISYDGGDSFYRDSVKG 202 EEDYSGSFPDY 203 414D10F5 -VL KASQNINKYLN 204 DTNNLQA 205 LQHNSLYT 206 339A9E7 -VH DYAWN 207 YISYSGDTSYNPSLRS 208 GHFDY 209 339A9E7 -VL KSSQSLLDSDGETYLN 210 LVSKLDS 198 WQGTHFPYT 211 339H3E2 -VH EYIMH 194 GINPNNGGTTYNQKFKG 212 GVMDY 213 339H3E2 -VL KSSQSLLDSDGKTYLN 197 LVSKLDS 198 WQGTHFPFT 199

20 / 92 367F1C2 -VH DYAWN 207 YISYTGSSSYNPSLKS 214 GHFDY 209 367F1C2 -VL KSSQSLLDSDGKTYLN 197 QVSKLDS 215 WQGTHFPYT 211 21H12D9 -VH DYYMN 97 VINPNNGGTTYKEKFKG 98 DDYDAGY 99 21H12D9 -VL KASQNVDTAVA 100 SASHRYT 101 QQYTDFPLT 102 408E3F3 -VH TSAMVVS 216 AIDWEGDKYYNPSLES 217 MSSADSHSVLDA 218 408E3F3 -VL KASQNIHNYLN 219 NTNNLQT 220 LQHSSSLT 221 415A3D1F4 -VH DFYIN 222 FMRNKANGYTTEYNPSVKG 223 SRYNADDYYVGVMDV 224 415A3D1F4 -VL LASEDIYNNLA 225 YTNSLQD 226 LQDSEYPWT 227 348E12F12 -VH SDYAWN 228 YISYSGDTSYNPSLKS 229 GHFDY 209 348E12F12 -VL KSSQSLLDSDGKTYLN 197 LVSNLDS 230 WQGTHFPYT 211 368D6D10 -VH SDYAWN 228 YISYSGSTSYNPSLKS 231 GHFDY 209 368D6D10 -VL KSSQSLLDSDGKTYLN 197 LVSKLDS 198 WQGTHFPYT 211 1H3A11 -VH SYAMS 112 TISDGGSDTYYPDNVKG 232 DYYGSSYEDYAMDY 233 1H3A11 -VL KASQDINKYIT 234 YTSTLQP 118 LQYDNLYT 119 355A1F6 -VH SDYAWS 235 YISYSDSTSYNPSLKS 236 GHFDY 209 355A1F6 -VL KSSQSLLDSDGKTYLN 197 LVSKLDS 198 WQGTHFPYT 211 353F9C4-VH SDYAWS 235 YITYSDSTSYNPSLKS 237 GHFDY 209 353F9C4-VL KSSQSLLDSDGKTYLN 197 LVSKLDS 198 WQGTHFPYT 211 19H7E10-VH DYYMN 97 DINPNNDGTTYNQKFKD 238 LSWSFFAMDY 239 19H7E10-VL KASQDVSSGVA 240

21 / 92 SASHRHT 241 QQYYNTPWT 242 411A11E9-VH DYYMA 142 SINYDGGDTYYRDSVKG 143 EEDYDGSYVMDA 144 411A11E9-VL KASQNINKELT 145 NTNILQT 146 LQQSSLYT 147 64C10G1-VH SYAMS 112 TISDGGSDAYYPDNVKG 113 DYYGSGYEDSPMDY 115 64C10G1-VL KASQDINKYIA 117 YTSTLQP 118 LQYDNLYT 119 397C3B3-VH SDYAWN 228 YISYSGSTSYNPSLKS 231 GHFDY 209 397C3B3-VL KSSQSLLDSDGKTYLN 197 LVSKLDS 198 WQGTHFPYT 211 71F4A3-VH RYWMS 127 EINPDSSTINYAPSLKD 128 QDDYEYYAMDY 130 71F4A3-VL KASQDVNTGVA 131 SASYRYT 132 QQYYSTPLT 133 119H10D6-VH TYWIE 243 EILPGSESTDYNEKFKD 244 DYYGYYFDY 245 119H10D6-VL KASQDVSTAVV 246 SASYRYT 132 QQHYSSPRT 247 130D6G1-VH TYWIE 243 EILPGSDSTNSNEKFEG 248 DYYGFYFDY 249 130D6G1-VL KASQDVSTAVA 250 STSYRYT 251 QQHYTTPRT 252 156H3H7 -VH DYYMN 97 DINPNNGDTTYNQKFKG 253 YDEDHYAMDY 254 156H3H7 -VL KASQDVSTGVA 192 SASHRYT 101 QQYYTTPWT 255 168A2D4-VH DYYMN 97 DINPNNGDIIYNQKFKG 256 YYDPYYHAMDY 257 168A2D4-VL KASQDVSTGVA 192 SASYRYT 132 QQQYSVPLT 258 168D6F2-VH SYWMH 259 GIDPDSGATKDNEKFKT 260 GSTVVAPGDYFAMDY 261 168D6F2-VL RASESVDNYGISFMH 262 RASNLDS 263 QQSNKDPWT 264 175E3B10-VH VFGMGVG 265 HIWWDDEKYYNPALKS 266

22 / 92 IDGYYDFDY 267 175E3B10-VL RSSHSIVQDNGNTYLQ 268 KVSNRFS 269 FQGSYVPYT 270 177D2G10-VH TSGMHVG 271 HIYWDDDKRYNPSLKS 272 RGGDYDYDEGFDY 273 177D2G10-VL RSSQSLVHSNGFTYLH 274 KVSNRFS 269 SQSTHVPYT 275 178B2E8-VH TDYYMT 276 NINYDGSRTNYLDSLKS 277 DGNYHFYGMDY 278 178B2E8-VL KASQDVSTAVA 250 WASTRHT 279 QQHYSTPWT 280 178E2B3-VH NHLIE 281 VINPGSGGTKYNEKFKG 282 SSDGYYEEDYFDY 283 178E2B3-VL SASSSVNYMQ 284 DTSELAS 285 QQWSSDPIT 286 181B11G12-VH DYYMA 142 NINYDGSDTYYLDSLKS 287 DVAYDDSYAMDY 288 181B11G12-VL KASQDINKYIA 117 YTSTLQP 118 LQYDSLYT 289 184H10B5-VH VFGMGVG 265 HIWWDDEKYYNPALKS 266 IDGYYDFDY 267 184H10B5-VL RSSHSIVQDNGNTYLQ 268 KVSNRFS 269 FQGSYVPYT 270 345G1B4-VH TSNMGVG 290 HIWWDDVKRYNPALKS 291 STTLVAFDY 292 345G1B4-VL KSSQSLLNSGNQKNYLT 293 WASTRES 294 QNDYSYPT 295 396A5A1-VH TSGMGIG 296 HIWWDDIKRYNPALKS 297 STTVVAFDY 298 396A5A1-VL KSSQSLLNSGNQKNYLT 293 WASTRES 294 QNDYDYPT 299 402H2G12-VH TYGMGVG 300 NIWWDDDKYYNPSLQN 301 SELIMPYVPFDY 302 402H2G12-VL QASQDIDNHLI 303 YATNLAN 304 LQFKQYPFT 305 409G9C2-VH SSYWWT 306 IYHSGRP 307 TAAVSYWYFDL 308 409G9C2-VL QASQDIGNDLI 309 YASNLAN 310 LQFKQYPFT 305

23 / 92 410A4D10-VH SRNWWG 311 IYHSGGT 312 EFGDSVWYFDL 313 410A4D10-VL QASQDIGNDLV 314 YATNLAD 315 LQFKQYPYT 316 414G3F4-VH SSYWWI 317 IYHSGRP 307 EAGDSVWYFDL 318 414G3F4-VL QASQDIGNELI 319 YATSLAD 320 LQFKQYPFT 305 416C9H8-VH PYGMGVG 321 NIWWDDDKYYNPSLIN 322 SELVMPYVPFDY 323 416C9H8-VL QASQDIENDLV 324 YATNLAN 304 LQFKQYPYT 316 418D3H6-VH TYGMGVG 300 NIWWDDDKYYNPSLIN 322 SELVMPYVPFDF 325 418D3H6-VL QASQDIGIELI 326 YTANLAS 327 LQYKQYPFT 328 423A6H6-VH TYGMGVG 300 NIWWDDDKYYNPSLQN 301 SELIMPYVPFDY 302 423A6H6-VL QASQDIDNHLI 303 YATNLAN 304 LQFKQYPFT 305 424H7F2-VH PYGMGVG 321 NIWWDDDKYYNPSLIN 322 SELVMPYVPFDY 323 424H7F2-VL QASQDIENDLI 329 YATNLAN 304 LQFKQYPYT 316 427C4F11-VH TYGMGVG 300 NIWWDDDKYSNPSLQS 330 SELVMPYVPFDY 323 427C4F11-VL QASQDIDNHLI 303 YATNLAN 304 LQFKQYPFT 305 430D9B3-VH PYGMGVG 321 NIWWDDDKYYNPSLIN 322 SELVMPYVPFDY 323 430D9B3-VL QASQDIENDLI 329 YATNLAN 304 LQFKQYPYT 316 432C12E1-VH TYGMGVG 300 NIWWDDDKYYNPSLKN 331 SEIVMPYVPFDY 332 432C12E1-VL QASQDIGNDLI 309 YATNLAN 304 LQFKQYPFT 305 442C9H4 -VH TYGMGVG 300 NIWWDDDKYYNPSLIN 322 SELVMPYVPFDF 325 442C9H4 -VL QASQDIGIDLI 333

24 / 92 YTANLAS 327 LQYKQYPFT 328 445A6G7-VH PYGMGVG 321 NIWWDDDKYYNPSLIN 322 SELVMPYVPFDY 323 445A6G7-VL QASQDIGNDLI 309 YATNLAN 304 LQFKQYPYT 316 537C8D7-VH DYAMA 334 TVFYDGSDTFYRDSVKG 335 EGDYYSRHVYVGYNWFPH 336 537C8D7-VL LTSEDINSELA 337 NANSLQD 338 QQYNSYPLT 339

[0065] Em algumas modalidades, os CDR1, CDR2 e CDR3 de VH são selecionados a partir de qualquer conjunto de CDR1, CDR2 e CDR3 de VH mostrado na Tabela A, e os CDR1, CDR2 e CDR3 de VL são selecionados a partir de qualquer conjunto de CDR1, CDR2 e CDR3 de VL mostrados na Tabela A. Em algumas modalidades, os CDR1, CDR2 e CDR3 de VH e os CDR1, CDR2 e CDR3 de VL são selecionados daqueles derivados do mesmo anticorpo nos exemplos.

[0066] Em algumas modalidades, pelo menos um, ou dois, ou três, ou quatro, ou cinco ou seis dos CDR1, CDR2 e CDR3 de VH e os CDR1, CDR2 e CDR3 de VL do acima são modificados por adição, deleção e/ou substituição de um, dois ou três aminoácidos ou combinações das mesmas.

[0067] Em uma modalidade, o anticorpo anti-CXCL13 ou fragmento do mesmo inclui os seguintes CDRs: HCDR1: DYYMN (SEQ ID NO: 97), HCDR2: VINPNNGGTTYKEKFKG (SEQ ID NO: 98), HCDR3: DDYDAGY (SEQ ID NO: 99), LCDR1: KASQNVDTAVA (SEQ ID NO: 100), LCDR2: SASHRYT (SEQ ID NO: 101) e LCDR3: QQYTDFPLT (SEQ ID NO: 102).

[0068] Em algumas modalidades, o anticorpo é humanizado, mas com uma ou mais das seguintes mutações reversas na cadeia pesada: 12V, 20M, 48I, 68A, 70L, 72V, 77G e 112L, de acordo com a numeração de Kabat e combinações das mesmas. Em algumas modalidades, o anticorpo é humanizado, mas com uma ou mais das seguintes mutações reversas na

25 / 92 cadeia leve: 13T e 78V de acordo com a numeração de Kabat e combinações das mesmas.

[0069] Exemplos não limitativos de regiões variáveis da cadeia pesada incluem SEQ ID NO: 95 e 103-106. Exemplos não limitativos de regiões variáveis de cadeia leve incluem SEQ ID NO: 96 e 107-109.

[0070] Em uma modalidade, o anticorpo anti-CXCL13 ou fragmento do mesmo inclui os seguintes CDRs: HCDR1: SYAMS (SEQ ID NO: 112), HCDR2: TISDGGSDAYYPDNVKG (SEQ ID NO: C2), HCDR3: DYYGSGYEDSPMDY (SEQ ID NO: 115), LCDR1: KASQDINKYIA (SEQ ID NO: 117), LCDR2: YTSTLQP (SEQ ID NO: 118) e LCDR3: LQYDNLYT (SEQ ID NO: 119).

[0071] Em algumas modalidades, o anticorpo é humanizado, mas com uma ou mais das seguintes mutações reversas na cadeia leve: 49H, 58I, 71Y e 83F de acordo com a numeração de Kabat e combinações das mesmas.

[0072] Exemplos não limitativos de regiões variáveis da cadeia pesada incluem SEQ ID NO: 110 e 120. Exemplos não limitativos de regiões variáveis da cadeia leve incluem SEQ ID NO: 111 e 121-124.

[0073] Em uma modalidade, um ou mais dos resíduos de aminoácidos nas CDRs são substituídos por um aminoácido diferente para evitar a modificação pós-tradução. Um exemplo de anticorpo anti-CXCL13 ou fragmento do mesmo inclui os seguintes CDRs: HCDR1: SYAMS (SEQ ID NO: 112), HCDR2: TISEGGSDAYYPDNVKG (SEQ ID NO: 114), HCDR3: DYYGSGYEESPMDY (SEQ ID NO: 116), LCDR1: KASQ (SEQ ID NO: 117), LCDR2: YTSTLQP (SEQ ID NO: 118) e LCDR3: LQYDNLYT (SEQ ID NO: 119).

[0074] Em algumas modalidades, o anticorpo é humanizado, mas com uma ou mais das seguintes mutações reversas na cadeia leve: 49H, 58I, 71Y e 83F de acordo com a numeração de Kabat e combinações das mesmas.

[0075] Exemplos não limitativos de regiões variáveis da cadeia

26 / 92 pesada incluem SEQ ID NO: 157. Exemplos não limitativos de regiões variáveis da cadeia leve incluem SEQ ID NO: 111 e 121-124, em particular SEQ ID NO: 121.

[0076] Em uma modalidade, o anticorpo anti-CXCL13 ou fragmento do mesmo inclui os seguintes CDRs: HCDR1: RYWMS (SEQ ID NO: 127), HCDR2: EINPDSSTINYAPSLKD (SEQ ID NO: 128), HCDR3: QDDYEYYAMDY (SEQ ID NO: 130), LCDR1: KASQDVNTGVA (SEQ ID NO: 131), LCDR2: SASYRYT (SEQ ID NO: 132) e LCDR3: QQYYSTPLT (SEQ ID NO: 133).

[0077] Em uma modalidade, um ou mais dos resíduos de aminoácidos nas CDRs são substituídos por um aminoácido diferente para evitar a modificação pós-tradução. Um exemplo de anticorpo anti-CXCL13 ou fragmento do mesmo inclui os seguintes CDRs: HCDR1: RYWMS (SEQ ID NO: 127), HCDR2: EINPESSTINYAPSLKD (SEQ ID NO: 129), HCDR3: QDDYEYYAMDY (SEQ ID NO: 130), LCDR1: KASQVNT (SEQ ID NO: 131), LCDR2: SASYRYT (SEQ ID NO: 132) e LCDR3: QQYYSTPLT (SEQ ID NO: 133).

[0078] Em algumas modalidades, o anticorpo é humanizado, mas com uma ou mais das seguintes mutações reversas na cadeia pesada: 5Q, 47I, 48G e 85V de acordo com a numeração de Kabat e combinações das mesmas. Em algumas modalidades, o anticorpo é humanizado, mas com uma ou mais das seguintes mutações reversas na cadeia leve: 78V de acordo com a numeração de Kabat.

[0079] Exemplos não limitativos de regiões variáveis da cadeia pesada incluem SEQ ID NO: 125 e 134-137. Exemplos não limitativos de regiões variáveis de cadeia leve incluem SEQ ID NO: 126 e 138-139.

[0080] Após a humanização, o anticorpo 71F4A3 passou ainda por rodadas de maturação de afinidade. As sequências de CDR de várias variantes de 71F4A3 são providas na Tabela B e resumidas na Tabela C abaixo.

27 / 92

Tabela B.

Anticorpos derivados de 71F4A3 e seus CDRs Cadeia de anticorpos Sequências de CDR (CDR1, SEQ ID (SEQ ID NO :) CDR2, CDR3) NO: 71F4A3-VH (125) RYWMS 127 EINPDSSTINYAPSLKD 128 QDDYEYYAMDY 130 71F4A3-VL (126) KASQDVNTGVA 131 SASYRYT 132 QQYYSTPLT 133 71F4A3-VH1 (134) RYWMS 127 EINPDSSTINYAPSLKD 128 QDDYEYYAMDY 130 71F4A3-VH2 (135) RYWMS 127 EINPDSSTINYAPSLKD 128 QDDYEYYAMDY 130 71F4A3-VH3 (136) RYWMS 127 EINPDSSTINYAPSLKD 128 QDDYEYYAMDY 130 71F4A3-VH4 (137) RYWMS 127 EINPDSSTINYAPSLKD 128 QDDYEYYAMDY 130 71F4A3-VL1 (138) KASQDVNTGVA 131 SASYRYT 132 QQYYSTPLT 133 71F4A3-VL2 (139) KASQDVNTGVA 131 SASYRYT 132 QQYYSTPLT 133 71F4A3-VH (D54E) (156) RYWMS 127 EINPESSTINYAPSLKD 129 QDDYEYYAMDY 130 71F4A3-VL (138) KASQDVNTGVA 131 SASYRYT 132 QQYYSTPLT 133 71F4A3-BC1-VH (158) RYWMS 127 EINPEASSINYAPSLKD 340 QDDYSHYAMDY 341 71F4A3-BC1-VL (159) KASQDVNTGVS 342 SASYRYT 132 QQYYSTPLT 133 71F4A3-BC4-VH (160) RYWMS 127 EINPEAGKWNYAPSLKD 343 QDDYTTYAMDY 344 71F4A3-BC4-VL (161) KASQDVNTGVS 342 SASYRYT 132 QQYYSTPLT 133 71F4A3-BE3-VH (162) RYWMS 127 EINPESSTINYAPSLKD 129 QDDYLTYAMDY 345 71F4A3-BE3-VL (163) KASQDVNTAVD 346 SASYRYT 132 QQYYSTPLT 133 71F4A3-BD12-VH (164) RYWMS 127 EINPETTIINYAPSLKD 347 QDDYRHYAMDY 348 71F4A3-BD12-VL (165) KASQDVNTGVA 131 SASYRYT 132 QQYYSTPLT 133

28 / 92 71F4A3-4H1-VH (166) RYWMS 127 EINPESTLINYAPSLKD 349 QDDYRNYAMDY 350 71F4A3-4H1-VL (167) KASQDVNTGVS 342 SASYRYT 132 QQYYSTPLT 133 71F4A3-5A4-VH (168) RYWMS 127 EINPESTGINYAPSLKD 351 QDDYWTYAMDY 352 71F4A3-5A4-VL (169) KASQDVNTAVS 353 SASYRYT 132 QQYYSTPLT 133 71F4A3-3F12-VH (170) RYWMS 127 EINPESNFINYAPSLKD 354 QDDYSVYAMDY 355 71F4A3-3F12-VL (171) KASQDVNTGVT 356 SASYRYT 132 QQYYSTPLT 133 71F4A3-B12-VH (172) RYWMS 127 EINPERNYINYAPSLKD 357 QDDYDKYAMDY 358 71F4A3-B12-VL (173) KASQDVNTGVT 356 SASYRYT 132 QQYYSTPLT 133 71F4A3-VH (D54E) (156) RYWMS 127 EINPESSTINYAPSLKD 129 QDDYEYYAMDY 130 71F4A3-VL (138) KASQDVNTGVA 131 SASYRYT 132 QQYYSTPLT 133 005-3-18-VH (174) RYWMS 127 EINPESSTINYAPSLKD 129 QDDYEYYTMDY 359 005-3-18-VL (175) KVSQDVNTGVA 360 SASYRYT 132 QQYWSTPLT 361 005-3-23-VH (176) RYWMS 127 EINPESSTINYAPSLKD 129 QEDYEYYALDY 362 005-3-23-VL (177) KASQDVNTGVY 363 SASYRYT 132 QQGYSTPLT 364 005-2-45-VH (178) RYWMS 127 EINPESSTINYAPSLKD 129 QDDTRYYAMDY 365 005-2-45-VL (138) KASQDVNTGVA 131 SASYRYT 132 QQYYSTPLT 133 71F4-B-VH (174) RYWMS 127 EINPESSTINYAPSLKD 129 QDDYEYYTMDY 359 71F4-B-VL (179) KVSQDVNTGVA 360 SASYRYT 132 QQYYSTPLT 133 71F4-BL-VH (180) RYWMS 127 EINPESSTINYAPSLKD 129 QDDYLYYTMDY 366 71F4-BL-VL (179) KVSQDVNTGVA 360

29 / 92 SASYRYT 132 QQYYSTPLT 133 71F4-BT-VH (181) RYWMS 127 EINPESSTINYAPSLKD 129 QDDYETYTMDY 367 71F4-BT-VL (179) KVSQDVNTGVA 360 SASYRYT 132 QQYYSTPLT 133 71F4-B-LT-VH (182) RYWMS 127 EINPESSTINYAPSLKD 129 QDDYLTYTMDY 368 71F4-B-LT-VL (179) KVSQDVNTGVA 360 SASYRYT 132 QQYYSTPLT 133 71F4-BA-VH (183) RYWMS 127 EINPEASTINYAPSLKD 369 QDDYEYYTMDY 359 71F4-B-VL (179) KVSQDVNTGVA 360 SASYRYT 132 QQYYSTPLT 133 71F4-B-S1-VH (184) RYWMS 127 EINPESSSINYAPSLKD 370 QDDYEYYTMDY 359 71F4-B-S1-VL (179) KVSQDVNTGVA 360 SASYRYT 132 QQYYSTPLT 133 71F4-B-S2-VH (185) RYWMS 127 EINPESSTINYAPSLKD 129 QDDYSYYTMDY 371 71F4-B-S2-VL (179) KVSQDVNTGVA 360 SASYRYT 132 QQYYSTPLT 133 71F4-BH-VH (186) RYWMS 127 EINPESSTINYAPSLKD 129 QDDYEHYTMDY 372 71F4-BH-VL (179) KVSQDVNTGVA 360 SASYRYT 132 QQYYSTPLT 133 71F4-B-SH-VH (187) RYWMS 127 EINPESSTINYAPSLKD 129 QDDYSHYTMDY 373 71F4-B-SH-VL (179) KVSQDVNTGVA 360 SASYRYT 132 QQYYSTPLT 133 71F4-B-AS-VH (188) RYWMS 127 EINPEASSINYAPSLKD 340 QDDYEYYTMDY 359 71F4-B-AS-VL (179) KVSQDVNTGVA 360 SASYRYT 132 QQYYSTPLT 133 71F4-B-SSH-VH (189) RYWMS 127 EINPESSSINYAPSLKD 370 QDDYSHYTMDY 373 71F4-B-SSH-VL (179) KVSQDVNTGVA 360 SASYRYT 132 QQYYSTPLT 133 71F4-B-ASH-VH (190) RYWMS 127 EINPEASSINYAPSLKD 340

30 / 92 QDDYSHYTMDY 373 71F4-B-ASH-VL (179) KVSQDVNTGVA 360 SASYRYT 132 QQYYSTPLT 133 Tabela C. Sumário de CDRs de anticorpos derivados de 71F4A3 CDR Sequência (SEQ ID NO:) CDRH1 RYWMS (127) CDRH2 EINPDSSTINYAPSLKD (128) EINPESSTINYAPSLKD (129) EINPEASSINYAPSLKD (340) EINPEAGKWNYAPSLKD (343) EINPETTIINYAPSLKD (347) EINPESTLINYAPSLKD (349) EINPESTGINYAPSLKD (351) EINPESNFINYAPSLKD (354) EINPERNYINYAPSLKD (357) EINPEASTINYAPSLKD (369) EINPESSSINYAPSLKD (370) CDRH3 QDDYEYYAMDY (130) QDDYSHYAMDY (341) QDDYTTYAMDY (344) QDDYLTYAMDY (345) QDDYRHYAMDY (348) QDDYRNYAMDY (350) QDDYWTYAMDY (352) QDDYSVYAMDY (355) QDDYDKYAMDY (358) QDDYEYYTMDY (359) QEDYEYYALDY (362) QDDTRYYAMDY (365) QDDYLYYTMDY (366) QDDYETYTMDY (367) QDDYLTYTMDY (368) QDDYSYYTMDY (371) QDDYEHYTMDY (372) QDDYSHYTMDY (373) CDRL1 KASQDVNTGVA (131) KASQDVNTGVS (342) KASQDVNTAVD (346) KASQDVNTAVS (353) KASQDVNTGVT (356) KVSQDVNTGVA (360) KASQDVNTGVY (363) CDRL2 SASYRYT (132) CDRL3 QQYYSTPLT (133) QQYWSTPLT (361) QQGYSTPLT (364)

[0081] Em uma modalidade, é provido um anticorpo ou fragmento do mesmo tendo especificidade para uma proteína do ligante 13 de quimiocina humana (motivo C-X-C) (CXCL13), em que o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende sequências CDR conforme listado na Tabela B ou Tabela C.

[0082] Em uma modalidade, é provido um anticorpo ou fragmento do

31 / 92 mesmo tendo especificidade para uma proteína do ligante 13 de quimiocina humana (motivo C-X-C) (CXCL13), em que o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada HCDR1, HCDR2 e HCDR3, e uma região variável de cadeia leve que compreende regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve LCDR1, LCDR2 e LCDR3, em que: a HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 127 (RYWMS); a HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:128 (EINPDSSTINYAPSLKD), SEQ ID NO:129 (EINPESSTINYAPSLKD), SEQ ID NO:340 (EINPEASSINYAPSLKD), SEQ ID NO:343, (EINPEAGKWNYAPSLKD), SEQ ID NO:347 (EINPETTIINYAPSLKD), SEQ ID NO:349 (EINPESTLINYAPSLKD), SEQ ID NO:351, INPESTGINYAPSLKD), SEQ ID NO:354 (EINPESNFINYAPSLKD), SEQ ID NO:357 (EINPERNYINYAPSLKD), SEQ ID NO:369 (EINPEASTINYAPSLKD), ou SEQ ID NO:370 (EINPESSSINYAPSLKD); a HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:130 (QDDYEYYAMDY), SEQ ID NO:341 (QDDYSHYAMDY), SEQ ID NO:344 (QDDYTTYAMDY), SEQ ID NO:345 (QDDYLTYAMDY), SEQ ID NO:348 (QDDYRHYAMDY), SEQ ID NO:350 (QDDYRNYAMDY), SEQ ID NO:352 (QDDYWTYAMDY), SEQ ID NO:355 (QDDYSVYAMDY), SEQ ID NO:358 (QDDYDKYAMDY), SEQ ID NO:359 (QDDYEYYTMDY), SEQ ID NO:362 (QEDYEYYALDY), SEQ ID NO:365 (QDDTRYYAMDY), SEQ ID NO:366 (QDDYLYYTMDY), SEQ ID NO:367 (QDDYETYTMDY), SEQ ID NO:368 (QDDYLTYTMDY), SEQ ID NO:371 (QDDYSYYTMDY), SEQ ID NO:372 (QDDYEHYTMDY), ou SEQ ID NO:373 (QDDYSHYTMDY); a LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:131 (KASQDVNTGVA), SEQ ID NO:342 (KASQDVNTGVS), SEQ ID NO:346 (KASQDVNTAVD), SEQ ID NO:353

32 / 92 (KASQDVNTAVS), SEQ ID NO:356 (KASQDVNTGVT), SEQ ID NO:360 (KVSQDVNTGVA), ou SEQ ID NO:363 (KASQDVNTGVY); a LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 132 (SASYRYT); e a LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 (QQYYSTPLT), SEQ ID NO: 361 (QQYWSTPLT) ou SEQ ID NO: 364 (QQGYSTPLT).

[0083] Em algumas modalidades, a HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCD2 e LCDR3 compreendem SEQ ID NO: 127, 129, 367, 360, 132 e 133, respectivamente. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 181 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 181, e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 179 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 179.

[0084] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento é humanizado e a região variável de cadeia pesada compreende uma ou mais mutações reversas selecionadas do grupo que consiste em 5Q, 47I, 48G e 85V, de acordo com a numeração de Kabat e combinações das mesmas, ou a região variável de cadeia leve compreende uma mutação 78V de acordo com a numeração de Kabat.

[0085] Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 181 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 179.

[0086] Em algumas modalidades, a HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCD2 e LCDR3 compreendem SEQ ID NO: 127, 129, 359, 360, 132 e 133, respectivamente. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 174 ou uma

33 / 92 sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 174, e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 179 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 179.

[0087] Em algumas modalidades, a HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCD2 e LCDR3 compreendem a SEQ ID NO: 127, 129, 359, 360, 132 e 361, respectivamente. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 174 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 174, e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 175 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 175.

[0088] Em algumas modalidades, a HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCD2 e LCDR3 compreendem SEQ ID NO: 127, 129, 130, 131, 132 e 133, respectivamente. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 156 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 156, e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 138 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 138.

[0089] Em algumas modalidades, a HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCD2 e LCDR3 compreendem SEQ ID NO: 127, 128, 130, 131, 132 e 133, respectivamente. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 134 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 134, e a região variável de cadeia leve compreende a

34 / 92 sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 138 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 138.

[0090] Em uma modalidade, o anticorpo anti-CXCL13 ou fragmento do mesmo inclui os seguintes CDRs: HCDR1: DYYMA (SEQ ID NO: 142), HCDR2: SINYDGGDTYYRDSVKG (SEQ ID NO: 143), HCDR3: EEDYDGSYVMDA (SEQ ID NO: 144), LCDR1: KASQNINKELT (SEQ ID NO: 145), LCDR2: NTNILQT (SEQ ID NO: 146), e LCDR3: LQQSSLYT (SEQ ID NO: 147).

[0091] Em algumas modalidades, o anticorpo é humanizado, mas com uma ou mais das seguintes mutações reversas na cadeia pesada: 24V, 70V, 98T e 105A de acordo com a numeração de Kabat e combinações das mesmas. Em algumas modalidades, o anticorpo é humanizado, mas com uma ou mais das seguintes mutações reversas na cadeia leve: 58I, 71Y e 87F de acordo com a numeração de Kabat e combinações das mesmas.

[0092] Exemplos não limitativos de regiões variáveis da cadeia pesada incluem SEQ ID NO: 140 e 148-151. Exemplos não limitativos de regiões variáveis de cadeia leve incluem SEQ ID NO: 141 e 152-155.

[0093] Foi uma verificação interessante que os anticorpos que se ligam de forma cruzada às proteínas CXCL13 humanas e de cynomolgus têm como alvo um epítopo que é diferente dos anticorpos anti-CXCL13 conhecidos. Por conseguinte, em uma modalidade, é provido um anticorpo ou fragmento do mesmo tendo especificidade para uma proteína do ligante 13 de quimiocina humana (motivo C-X-C) (CXCL13), em que o anticorpo ou fragmento do mesmo pode se ligar a um ou mais resíduos de aminoácidos selecionados do grupo que consiste de F20, P22, R24 e F25 da proteína CXCL13.

[0094] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento do mesmo pode se ligar a F20 e P22, F20 e R24, F20 e F25, P22 e R24, P22 e F25, ou

35 / 92 R24 e F25 da proteína CXCL13. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento do mesmo pode se ligar a F20, P22 e R24; F20, P22 e F25; F20, R24 e F25; ou P22, R24 e F25 da proteína CXCL13.

[0095] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento do mesmo pode se ligar a F20, P22, R24 e F25 da proteína CXCL13. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento do mesmo pode ainda se ligar à proteína CXCL13 de cynomolgus.

[0096] As CDRs, regiões variáveis de cadeia pesada e regiões variáveis de cadeia leve da presente descrição podem ser modificadas adicionalmente. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada modificada ou região variável de cadeia leve retém pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade de sequência e ainda é capaz de se ligar para CXCL13.

[0097] Em algumas modalidades, a modificação é a substituição em não mais do que uma posição de ponto quente de cada um dos CDRs. Em algumas modalidades, a modificação é a substituição em uma, duas ou três dessas posições de ponto quente. Em uma modalidade, a modificação é a substituição em uma das posições de ponto quente. Essas substituições, em algumas modalidades, são substituições conservativas.

[0098] Uma “substituição conservativa de aminoácido” é aquela em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral semelhante. Famílias de resíduos de aminoácidos com cadeias laterais semelhantes foram definidas na técnica, incluindo cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares sem carga (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e

36 / 92 cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Assim, um resíduo de aminoácido não essencial em um polipeptídeo de imunoglobulina é preferencialmente substituído por outro resíduo de aminoácido da mesma família de cadeia lateral. Em outra modalidade, uma cadeia de aminoácidos pode ser substituída por uma cadeia estruturalmente semelhante que difere na ordem e/ou composição dos membros da família de cadeia lateral.

[0099] Exemplos não limitativos de substituições conservativas de aminoácidos são providos na tabela abaixo, em que uma pontuação de similaridade de 0 ou superior indica substituição conservativa entre os dois aminoácidos. Matriz de Similaridade de Aminoácidos

C G P S A T D E N Q H K R V M I L F Y W W -8 -7 -6 -2 -6 -5 -7 -7 -4 -5 -3 -3 2 -6 -4 -5 -2 0 0 17 Y 0 -5 -5 -3 -3 -3 -4 -4 -2 -4 0 -4 -5 -2 -2 -1 -1 7 10 F -4 -5 -5 -3 -4 -3 -6 -5 -4 -5 -2 -5 -4 -1 0 1 2 9 L -6 -4 -3 -3 -2 -2 -4 -3 -3 -2 -2 -3 -3 2 4 2 6 I -2 -3 -2 -1 -1 0 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 4 2 5 M -5 -3 -2 -2 -1 -1 -3 -2 0 -1 -2 0 0 2 6 V -2 -1 -1 -1 0 0 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 4 R -4 -3 0 0 -2 -1 -1 -1 0 1 2 3 6 K -5 -2 -1 0 -1 0 0 0 1 1 0 5 H -3 -2 0 -1 -1 -1 1 1 2 3 6 Q -5 -1 0 -1 0 -1 2 2 1 4 N -4 0 -1 1 0 0 2 1 2 E -5 0 -1 0 0 0 3 4 D -5 1 -1 0 0 0 4 T -2 0 0 1 1 3 A -2 1 1 1 2 S 0 1 1 1 P -3 -1 6 G -3 5 C 12 Substituições Conservadoras de Aminoácidos Para Aminoácido Substituição com Alanina D-Ala, Gly, Aib, β-Ala, L-Cys, D-Cys Arginina D-Arg, Lys, D-Lys, Orn D-Orn Asparagina D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu Gln, D-Gln Ácido Aspártico D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gln, D-Gln Cisteína D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr, L-Ser, D-Ser Glutamina D-Gln, Asn, D-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp Ácido Glutâmico D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gln, D-Gln Glicina Ala, D-Ala, Pro, D-Pro, Aib, β-Ala Isoleucina D-Ile, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met

37 / 92 Leucina Val, D-Val, Met, D-Met, D-Ile, D-Leu, Ile Lisina D-Lys, Arg, D-Arg, Orn, D-Orn Metionina D-Met, S-Me-Cys, Ile, D-Ile, Leu, D-Leu, Val, D-Val Fenilalanina D-Phe, Tyr, D-Tyr, His, D-His, Trp, D-Trp Proline D-Pro Serine D-Ser, Thr, D-Thr, allo-Thr, L-Cys, D-Cys Treonina D-Thr, Ser, D-Ser, allo-Thr, Met, D-Met, Val, D-Val Tirosina D-Tyr, Phe, D-Phe, His, D-His, Trp, D-Trp Valina D-Val, Leu, D-Leu, Ile, D-Ile, Met, D-Met

[00100] Também será entendido por um versado na técnica que os anticorpos, conforme descrito neste documento, podem ser modificados de modo que variem na sequência de aminoácidos do polipeptídeo de ligação de ocorrência natural do qual foram derivados. Por exemplo, um polipeptídeo ou sequência de aminoácidos derivada de uma proteína designada pode ser semelhante, por exemplo, ter uma certa identidade percentual com a sequência de partida, por exemplo, pode ser 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% idêntica à sequência inicial.

[00101] Em certas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos ou uma ou mais frações normalmente não associadas a um anticorpo. Modificações exemplares são descritas em mais detalhes abaixo. Por exemplo, um anticorpo da descrição pode compreender uma sequência de ligante flexível ou pode ser modificado para adicionar uma fração funcional (por exemplo, PEG, um fármaco, uma toxina ou um marcador).

[00102] Os anticorpos, variantes ou seus derivados da descrição incluem derivados que são modificados, isto é, pela ligação covalente de qualquer tipo de molécula ao anticorpo, de modo que a ligação covalente não impeça o anticorpo de se ligar ao epítopo. Por exemplo, mas não como forma de limitação, os anticorpos podem ser modificados, por exemplo, por glicosilação, acetilação, peguilação, fosforilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos de proteção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a um ligante celular ou outra proteína , etc. Qualquer uma das inúmeras modificações químicas pode ser realizada por técnicas conhecidas, incluindo, mas não se limitando a clivagem química específica,

38 / 92 acetilação, formilação, síntese metabólica de tunicamicina, etc. Além disso, os anticorpos podem conter um ou mais aminoácidos não clássicos ácidos.

[00103] Em algumas modalidades, os anticorpos podem ser conjugados a agentes terapêuticos, pró-fármacos, peptídeos, proteínas, enzimas, vírus, lipídios, modificadores de resposta biológica, agentes farmacêuticos ou PEG.

[00104] Os anticorpos podem ser conjugados ou fundidos a um agente terapêutico, que pode incluir marcadores detectáveis, tais como marcadores radioativos, um imunomodulador, um hormônio, uma enzima, um oligonucleotídeo, um agente terapêutico ou diagnóstico fotoativo, um agente citotóxico, que pode ser um fármaco ou uma toxina, um agente intensificador de ultrassom, um marcador não radioativo, uma combinação dos mesmos e outros agentes conhecidos na técnica. Moléculas Bifuncionais

[00105] Moléculas bifuncionais, como anticorpos biespecíficos, também são providas. Em uma modalidade, a molécula bifuncional tem uma primeira especificidade para CXCL13, bem como uma segunda especificidade. A segunda especificidade, em uma modalidade, é para outra citocina ou para uma célula imune.

[00106] Por exemplo, o fator de ativação de células B (BAFF), também conhecido como membro da superfamília do ligante do fator de necrose tumoral 13B, é uma citocina que pertence à família de ligantes do fator de necrose tumoral (TNF). Esta citocina é um ligante para os receptores TNFRSF13B/TACI, TNFRSF17/BCMA e TNFRSF13C/BAFF-R. Esta citocina é expressa em células da linhagem de células B e atua como um potente ativador de células B. Também foi demonstrado que desempenha um papel importante na proliferação e diferenciação de células B. A especificidade anti-BAFF pode ser derivada de um anticorpo anti-BAFF tal como Belimumabe.

[00107] Em outro exemplo, a segunda especificidade pode ser em

39 / 92 IFNαRI (cadeia alfa do receptor de interferón-alfa/beta ou IFNAR1). Os IFNs do tipo I, particularmente os IFN-αs e IFN-β, têm recebido atenção por seus papéis na patogênese das síndromes inflamatórias e autoimunes. Ao sinalizar por meio de um receptor comum (IFNAR), essas citocinas pleiotrópicas afetam quase todos os aspectos das respostas imunes inatas e adaptativas, incluindo a suprarregulação de MHC e moléculas coestimulatórias e produção de fatores de sobrevivência de células B (BAFF, abril) por células apresentadoras de antígeno, culminando no engajamento e expansão de células T e B autorreativas.

[00108] Em algumas modalidades, a célula imune é selecionada a partir do grupo que consiste em uma célula T, uma célula B, um monócito, um macrófago, um neutrófilo, uma célula dendrítica, um fagócito, uma célula assassina natural, um eosinófilo, um basófilo e um mastócito. As moléculas na célula imune que podem ser direcionadas incluem, por exemplo, CD3, CD16, CD19, CD28 e CD64. Outros exemplos incluem PD-1, CTLA-4, LAG-3 (também conhecido como CD223), CD28, CD122, 4-1BB (também conhecido como CD137), TIM3, OX-40 ou OX40L, CD40 ou CD40L, LIGHT, ICOS/ICOSL, GITR/GITRL, TIGIT, CD27, VISTA, B7H3, B7H4, HEVM ou BTLA (também conhecido como CD272), receptores semelhantes a imunoglobulinas de células assassinas (KIRs) e CD47.

[00109] A especificidade anti-CXCL13 também pode ser combinada com a especificidade para um antígeno tumoral. Um “antígeno tumoral” é uma substância antigênica produzida em células tumorais, ou seja, desencadeia uma resposta imune no hospedeiro. Os antígenos tumorais são úteis na identificação de células tumorais e são candidatos potenciais para uso na terapia do câncer. As proteínas normais do corpo não são antigênicas. Certas proteínas, no entanto, são produzidas ou superexpressas durante a tumorigênese e, portanto, parecem “estranhas” ao corpo. Isso pode incluir proteínas normais que são bem sequestradas do sistema imunológico,

40 / 92 proteínas que são normalmente produzidas em quantidades extremamente pequenas, proteínas que são normalmente produzidas apenas em determinados estágios de desenvolvimento ou proteínas cuja estrutura é modificada devido a mutação.

[00110] Uma abundância de antígenos tumorais é conhecida na técnica e novos antígenos tumorais podem ser facilmente identificados por triagem. Exemplos não limitativos de antígenos tumorais incluem EGFR, Her2, EpCAM, CD20, CD30, CD33, CD47, CD52, CD133, CD73, CEA, gpA33, Mucinas, TAG-72, CIX, PSMA, proteína de ligação ao folato, GD2, GD3, GM2, VEGF, VEGFR, Integrina, αVβ3, α5β1, ERBB2, ERBB3, MET, IGF1R, EPHA3, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP e Tenascina.

[00111] Diferentes formatos de anticorpos biespecíficos também são providos. Em algumas modalidades, cada fragmento anti-CXCL13 e o segundo fragmento são selecionados independentemente a partir de um fragmento Fab, um fragmento variável de cadeia única (scFv) ou um anticorpo de domínio único. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico inclui ainda um fragmento Fc. Polinucleotídeos que Codificam os Anticorpos e Métodos de Preparação de Anticorpos

[00112] A presente descrição também provê polinucleotídeos isolados ou moléculas de ácido nucleico que codificam os anticorpos, variantes ou derivados da descrição. Os polinucleotídeos da presente descrição podem codificar todas as regiões variáveis da cadeia pesada e leve dos polipeptídeos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados dos mesmos na mesma molécula de polinucleotídeo ou em moléculas de polinucleotídeo separadas. Além disso, os polinucleotídeos da presente descrição podem codificar porções das regiões variáveis da cadeia pesada e leve dos polipeptídeos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados dos mesmos na mesma molécula de polinucleotídeo ou em moléculas de polinucleotídeo separadas.

41 / 92

[00113] Os métodos de produção de anticorpos são bem conhecidos na técnica e aqui descritos. Em certas modalidades, as regiões variáveis e constantes dos polipeptídeos de ligação ao antígeno da presente descrição são totalmente humanas. Anticorpos totalmente humanos podem ser feitos usando técnicas descritas na técnica e conforme descrito aqui. Por exemplo, anticorpos totalmente humanos contra um antígeno específico podem ser preparados pela administração do antígeno a um animal transgênico que foi modificado para produzir tais anticorpos em resposta ao desafio antigênico, mas cujos loci endógenos foram desativados. Técnicas exemplares que podem ser usadas para fazer tais anticorpos são descritas nas patentes U.S.:

6.150.584; 6.458.592; 6.420.140 que são incorporados por referência na sua totalidade. Métodos de Tratamento e de Diagnóstico

[00114] Conforme descrito neste documento, os anticorpos, variantes ou derivados da presente descrição podem ser usados em certos métodos de tratamento e diagnóstico.

[00115] A presente descrição é ainda direcionada a terapias baseadas em anticorpos que envolvem a administração dos anticorpos da descrição a um paciente, tal como um animal, um mamífero e um humano para o tratamento de um ou mais dos distúrbios ou condições aqui descritos. Os compostos terapêuticos da descrição incluem, mas não estão limitados a, anticorpos da descrição (incluindo variantes e derivados dos mesmos, conforme descrito neste documento) e ácidos nucleicos ou polinucleotídeos que codificam anticorpos da descrição (incluindo variantes e derivados dos mesmos, conforme descrito neste documento).

[00116] Uma modalidade provê um método para supressão de uma resposta imune em um paciente em necessidade. O método envolve a administração ao paciente de um anticorpo, fragmento ou molécula bifuncional da presente descrição. Em algumas modalidades, o paciente é um

42 / 92 receptor de transplante de tecido ou órgão.

[00117] Em algumas modalidades, é provido um método de tratamento de uma doença ou distúrbio autoimune. Exemplos não limitativos de doença ou distúrbio autoimune incluem diabetes tipo 1, artrite reumatoide (AR), psoríase/artrite psoriática, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistêmico (lúpus), doença inflamatória intestinal, doença de Addison, doença de Graves, síndrome de Sjögren, tireoidite de Hashimoto, miastenia grave, vasculite, anemia perniciosa e doença celíaca.

[00118] Os anticorpos da descrição também podem ser usados para tratamento de ou inibir o câncer. Por conseguinte, em algumas modalidades, são providos métodos para o tratamento de um câncer em um paciente em necessidade. O método, em uma modalidade, envolve a administração ao paciente de uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente descrição. Exemplos não limitativos de cânceres incluem câncer de bexiga, câncer de fígado, câncer de cólon, câncer retal, câncer endometrial, leucemia, linfoma, câncer de pâncreas, câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de mama, câncer uretral, cabeça e pescoço câncer, câncer gastrointestinal, câncer de estômago, câncer de esôfago, câncer de ovário, câncer renal, melanoma, câncer de próstata e câncer de tireoide.

[00119] Doenças ou condições adicionais associadas ao aumento da sobrevivência celular, que podem ser tratadas, prevenidas, diagnosticadas e/ou prognosticadas com os anticorpos ou variantes ou seus derivados da descrição incluem, mas não estão limitados a, progressão e/ou metástases de doenças malignas e doenças relacionadas, como leucemia (incluindo leucemias agudas (por exemplo, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda (incluindo mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica e eritroleucemia)) e leucemias crônicas (por exemplo, leucemia mielocítica crônica (granulocítica) leucemia linfocítica crônica)), policitemia vera, linfomas (por exemplo, doença de Hodgkin e não doença Hodgkin),

43 / 92 mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom, doença de cadeia pesada e tumores sólidos, incluindo, mas não se limitando a, sarcomas e carcinomas, como fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, sarcoma osteogênico, cordoma, angiossarcoma, endoteliossarcoma, linfangiossarcoma, linfangio ioendoteliossarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiossarcoma, sarcoma de rabdomio, carcinoma de cólon, câncer de pâncreas, câncer de mama, câncer de tireoide, câncer de endométrio, melanoma, câncer de próstata, câncer de ovário, câncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basais, carcinoma das glândulas sudoríparas, carcinoma das glândulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogênico, carcinoma de células renais, hepatoma, carcinoma do ducto biliar, tumor coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionário, carcinoma broncogênico, carcinoma de células renais, hepatoma, carcinoma do ducto biliar, tumor coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionário, carcinoma de testículo de Wilm, carcinoma de pequenas células do pulmão, carcinoma da bexiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma e retinoblastoma.

[00120] Uma dosagem específica e regime de tratamento para qualquer paciente particular dependerá de uma variedade de fatores, incluindo os anticorpos específicos, sua variante ou derivado usado, a idade do paciente, peso corporal, saúde geral, sexo e dieta, e o tempo de administração, taxa de excreção, combinação de fármacos e a gravidade da doença particular a ser tratada. O julgamento de tais fatores por cuidadores médicos está dentro da habilidade comum na técnica. A quantidade também dependerá do paciente

44 / 92 individual a ser tratado, da via de administração, do tipo de formulação, das características do composto usado, da gravidade da doença e do efeito desejado. A quantidade usada pode ser determinada por princípios farmacológicos e farmacocinéticos bem conhecidos na técnica.

[00121] Os métodos de administração dos anticorpos, variantes ou incluem, mas não estão limitados às vias intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intranasal, epidural e oral. Os polipeptídeos ou composições de ligação ao antígeno podem ser administrados por qualquer via conveniente, por exemplo, por infusão ou injeção em bolus, por absorção através de revestimentos epiteliais ou mucocutâneos (por exemplo, mucosa oral, mucosa retal e intestinal, etc.) e podem ser administrados juntamente com outros agentes biologicamente ativos. Assim, as composições farmacêuticas contendo os polipeptídeos de ligação ao antígeno da descrição podem ser administradas por via oral, retal, parenteral, intracistêmica, intravaginal, intraperitoneal, tópica (como em pós, pomadas, gotas ou adesivo transdérmico), bucal ou como um adesivo oral ou nasal spray.

[00122] O termo “parenteral”, tal como aqui utilizado, se refere a modos de administração que incluem injeção intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intraesternal, subcutânea e intra-articular e infusão.

[00123] A administração pode ser sistêmica ou local. Além disso, pode ser desejável introduzir os anticorpos da descrição no sistema nervoso central por qualquer via adequada, incluindo injeção intraventricular e intratecal; a injeção intraventricular pode ser facilitada por um cateter intraventricular, por exemplo, conectado a um reservatório, como um reservatório de Ommaya. A administração pulmonar também pode ser empregada, por exemplo, pelo uso de um inalador ou nebulizador e formulação com um agente de aerossol.

[00124] Pode ser desejável administrar os polipeptídeos de ligação ao antígeno ou composições da descrição localmente na área que necessita de

45 / 92 tratamento; isso pode ser conseguido, por exemplo, e não por meio de limitação, infusão local durante a cirurgia, aplicação tópica, por exemplo, em conjunto com um curativo após a cirurgia, por injeção, por meio de um cateter, por meio de um supositório , ou por meio de um implante, sendo o referido implante de um material poroso, não poroso ou gelatinoso, incluindo membranas, tais como membranas sialásticas ou fibras. De preferência, ao administrar uma proteína, incluindo um anticorpo, da descrição, deve-se ter cuidado ao usar materiais para os quais a proteína não é absorvida.

[00125] Métodos de detecção da expressão de uma proteína do ligante 13 de quimiocina humana (motivo C-X-C) (CXCL13) em uma amostra também são providos, em algumas modalidades, que compreende o contato da amostra com o anticorpo ou fragmento do mesmo e a detecção da ligação que indica a expressão de CXCL13 na amostra. Composições

[00126] A presente descrição também provê composições farmacêuticas. Essas composições compreendem uma quantidade eficaz de um anticorpo e um carreador aceitável. Em algumas modalidades, a composição inclui ainda um segundo agente anticâncer (por exemplo, um inibidor de ponto de controle imunológico).

[00127] Em uma modalidade específica, o termo “farmaceuticamente aceitável” significa aprovado por uma agência reguladora do governo federal ou estadual ou listado na Farmacopeia dos EUA ou outra farmacopeia geralmente reconhecida para uso em animais e, mais particularmente, em humanos. Além disso, um “carreador farmaceuticamente aceitável” será geralmente um enchimento não tóxico sólido, semissólido ou líquido, diluente, material encapsulante ou auxiliar de formulação de qualquer tipo.

[00128] O termo “carreador” se refere a um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual a terapêutica é administrada. Esses veículos farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, como água e óleos, incluindo os de

46 / 92 petróleo, animal, vegetal ou de origem sintética, como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e semelhantes.

A água é um veículo preferido quando a composição farmacêutica é administrada por via intravenosa.

Soluções salinas e soluções aquosas de dextrose e glicerol também podem ser empregadas como veículos líquidos, particularmente para soluções injetáveis.

Excipientes farmacêuticos adequados incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, gel de sílica, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado em pó, glicerol, propileno, glicol, água, etanol e o gosto.

A composição, se desejado, também pode conter pequenas quantidades de agentes molhantes ou emulsionantes, ou agentes tamponantes de pH, tais como acetatos, citratos ou fosfatos.

Agentes antibacterianos, tais como álcool benzílico ou metil parabenos; antioxidantes, tais como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes, tais como ácido etilenodiaminotetracético; e agentes para o ajuste da tonicidade, tais como cloreto de sódio ou dextrose, também são considerados.

Estas composições podem assumir a forma de soluções, suspensões, emulsões, comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, formulações de libertação sustentada e semelhantes.

A composição pode ser formulada como um supositório, com ligantes e veículos tradicionais, como triglicerídeos.

A formulação oral pode incluir carreadores padrão, tais como graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, celulose, carbonato de magnésio, etc.

Exemplos de carreadores farmacêuticos adequados são descritos em Remington's Pharmaceutical Sciences por E.

W.

Martin, aqui incorporado por referência.

Tais composições conterão uma quantidade terapeuticamente eficaz do polipeptídeo de ligação ao antígeno, preferencialmente na forma purificada, juntamente com uma quantidade adequada de carreador de modo a prover a forma para administração adequada ao paciente.

A formulação deve ser adequada ao modo de administração.

A preparação parental pode ser

47 / 92 acondicionada em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de dose múltipla de vidro ou plástico.

[00129] Em uma modalidade, a composição é formulada de acordo com procedimentos de rotina como uma composição farmacêutica adaptada para administração intravenosa a seres humanos. Normalmente, as composições para administração intravenosa são soluções em tampão aquoso isotônico estéril. Quando necessário, a composição também pode incluir um agente solubilizante e um anestésico local, como lidocaína, para aliviar a dor no local da injeção. Geralmente, os ingredientes são providos separadamente ou misturados em forma de dosagem unitária, por exemplo, como um pó liofilizado seco ou concentrado sem água em um recipiente hermeticamente fechado, como uma ampola ou sachê indicando a quantidade de agente ativo. Quando a composição é para ser administrada por infusão, ela pode ser dispensada com um frasco de infusão contendo água estéril de grau farmacêutico ou solução salina. Quando a composição é administrada por injeção, uma ampola de água estéril para injeção ou solução salina pode ser provida para que os ingredientes possam ser misturados antes da administração.

[00130] Os compostos da descrição podem ser formulados como formas neutras ou de sal. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem aqueles formados com ânions, tais como aqueles derivados de ácidos clorídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., e aqueles formados com cátions, tais como aqueles derivados de sódio, potássio, amônio, cálcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc.

EXEMPLOS Exemplo 1. Geração de anticorpos monoclonais de camundongo contra CXCL13 humano

[00131] Este exemplo mostra a geração de anticorpos monoclonais de

48 / 92 camundongo anti-CXCL13 humano usando a tecnologia de hibridoma. Imunizações

[00132] As proteínas CXCL13 humanas recombinantes foram usadas como o imunógeno para aumentar os anticorpos CXCL13 anti-humanos. Murganhos C57BL/6, Balb/c, camundongos SJL ou ratos wistar foram primeiro imunizados por via subcutânea (s.c.). com 50 µg de imunogénio e depois imunizado intraperitonealmente (i.p.). ou s.c. quinzenalmente com 25 µg de imunógeno. A resposta imune foi monitorada por sangramentos retro- orbitais. O plasma foi rastreado por ensaio de ligação ELISA. Em suma, CXCL13 humano ou CXCL13 de camundongo ou CXCL13 de cynomolgus foi revestido a 0,5 µg/ml durante a noite e, em seguida, bloqueado por BSA a 5% em PBS. Soros diluídos em série foram incubados com o antígeno revestido por 1h em temperatura ambiente (TA). As placas resultantes foram lavadas com PBS/T e incubadas com IgG-HRP anticamundongo de cabra durante 1 hora em temperatura ambiente. As placas foram desenvolvidas com substrato TMB e paradas com HCl 1N e analisadas por espectrofotômetro em DO 450-630nm. Os camundongos com títulos elevados de imunoglobulina anti-CXCL13 foram selecionados para fusão e triagem adicional. Quatro dias antes do sacrifício e remoção dos baços, os camundongos receberam um reforço i.p. com 25 µg de antígeno. Os baços foram usados para fusão. Triagem de Fusão e Hibridoma

[00133] Os esplenócitos foram eletrofundidos com células da linha celular de mieloma de camundongo SP2/0 e semeados em placas de cultura de 96 poços. Os sobrenadantes de hibridoma foram testados por ensaio de ligação ELISA para ligantes anti-CXCL13 humano. Os sobrenadantes de clones de ligação positiva foram rastreados quanto à função no bloqueio da ligação de CXCL13 humano ao seu ligando CXCR5 por ensaio ELISA de bloqueio de receptor baseado em células. Resumidamente, 5 x 104 células CHO-K1-CXCR5 foram plaqueadas em placa de 96 poços com 100 µl de

49 / 92 meio de cultura e incubadas a 37oC durante a noite. As células foram fixadas com 100 µl de PFA a 2% em temperatura ambiente durante 1 hora após a lavagem com PBS durante 1 vez. O bloqueio foi feito com BSA a 1% em PBST por 1 hora em temperatura ambiente. Os sobrenadantes foram diluídos com PBS e pré-incubados com volume igual de 0,3 µg/ml de CXCL13 humano por 30 min em temperatura ambiente. 100 µl de complexo anticorpo- antígeno foram então transferidos para os poços de cada célula por 30 min em temperatura ambiente. As amostras foram lavadas com 1 × PBST por 3 vezes e 100 µl de 3 µg/ml de anticorpo Mab5261 humano foram adicionados a cada poço para capturar CXCL13 humano e Fc-HRP anti-humano foi usado para detectar indiretamente CXCL13 humano quando se ligou a Células CHO-K1- CXCR5. O anticorpo secundário foi revelado por 100 µl de TMB e interrompido com 100 µl de HCl 1N. A leitura foi feita a 450nM.

[00134] Os clones que mostram forte capacidade de bloqueio neste ensaio foram selecionados para subclonagem. Os sobrenadantes de subclones de uma rodada foram usados para confirmar CXCL13 humano baseado em ELISA ou CXCL13 de camundongo ou CXCL13 de cynomolgus e capacidade de bloqueio do receptor, seguido por sequenciamento e análise adicional. Após estes rastreios, 20 clones (329F2E1, 348B10B1, 360A3D4E3, 414D10F5, 339A9E7, 339H3E2, 367F1C2, 21H12D9, 408E3F3, 415A3D1F4, 348E12F12, 368D6D10, 1H3A11, 355A1F6, 353F9C4, 19H7E10, 411A11E9, 64C10G1, 397C3B3) que atravessam ligados a CXCL13 humano e CXCL13 de cynomolgus foram identificados e 14 clones (402H2G12, 409G9C2, 410A4D10, 414G3F4, 416C9H8, 418D3H6, 423A6H6, 424H7F2, 427C4F11, 430D9B3, 432C12E1, 442C9H4, 445A6G7, 537C8D7) que atravessam ligados a CXCL13 humano e CXCL13 de camundongo foram identificados, e 13 clones (119H10D6, 30D6G1, 156H3H7, 168A2D4, 168D6F2, 175E3B10, 177D2G10, 178B2E8, 178E2B3, 181B11G12, 184H10B5, 345G1B4, 396A5A1) que apenas se ligaram a

50 / 92 CXCL13 humano foram identificados.

[00135] Esses anticorpos foram purificados a partir de sobrenadantes de hibridoma por ligação com coluna de Proteína G e distinguidos por ensaios de ligação ELISA e ensaios ELISA de bloqueio baseados em células. As propriedades de ligação e bloqueio estão listadas na Tabela 1 e as sequências de todos os clones estão listadas na Tabela 2. 27 clones que se ligam apenas a huCXCL13 ou ligam-se a huCXCL13 e CXCL13 de camundongo mostraram atividade de bloqueio total ou parcial. Os clones 11/20 ligados a ambos CXCL13 humano e CXCL13 de cynomolgus pareceram bloquear completamente CXCL13 humano para CXCR5 humano. 11 bloqueadores ligados a huCXCL13 e cynoCXCL13 foram produzidos como anticorpos IgG1 humanos quiméricos para posterior caracterização. Tabela 1. Propriedades de ligação e bloqueio EC50 (ng / ml) IC50 (ug / ml) ligar a ligar a Cyno ligar ao CXCL13 de ensaios de Anticorpos huCXCL13 CXCL13 camundongo bloqueio 329F2E1 16,58 12,46 NB 0,615 348B10B1 12,36 16,57 NB N/D 360A3D4E3 6,641 17,77 NB N/D 414D10F5 10,45 18,98 NB 1,142 339A9E7 21,56 24,54 NB 13,33 339H3E2 38,76 31,9 NB N/D 367F1C2 66,79 55,71 NB N/D 21H12D9 15,64 61,85 NB 1,273 408E3F3 23,68 70,59 NB 1,493 415A3D1F4 13,23 71,14 NB 0,6983 348E12F12 63,6 76,53 NB N/D 368D6D10 86,44 139,9 NB N/D 1H3A11 63,28 144,6 NB 10,14 355A1F6 94,25 153,9 NB N/D 353F9C4 134,5 171,6 NB N/D 19H7E10 38,52 195,9 NB 2,218 411A11E9 20,14 252,4 NB 0,793 64C10G1 31,39 347 NB 0,3303 397C3B3 344,1 400,6 NB N/D 71F4A3 26,63 1013 NB 3,017 119H10D6 39,29 NB NB 0,5334 130D6G1 19,18 NB NB 1,232 156H3H7 13,44 NB NB 4,592 168A2D4 134,3 NB NB 0,2898 168D6F2 21,77 NB NB 2,093 175E3B10 32,63 NB NB 1,418 177D2G10 54,42 NB NB ~ 911,9 178B2E8 420,3 NB NB ~ 3,372e + 009 178E2B3 15,33 NB NB 0,9739

51 / 92 181B11G12 22,34 NB NB 0,7025 184H10B5 27,24 NB NB 4,85 345G1B4 13,8 NB NB 3,24 396A5A1 13,51 NB NB 1,005 402H2G12 5,777 NB 35,71 8,719 409G9C2 2266 NB 538,2 11,74 410A4D10 2139 NB 760,8 8,38 414G3F4 3662 NB 3008 26,45 416C9H8 5840 NB 1966 8,456 418D3H6 48660 NB 7492 23,33 423A6H6 1558 NB 248,2 8,959 424H7F2 10,95 NB 12,09 1,1 427C4F11 1329 NB 201,8 7,918 430D9B3 26,45 NB 54,71 3,849 432C12E1 5099 NB 744,3 12,65 433E4H11 2872 NB 700,8 14,25 442C9H4 9852 NB 2960 18,2 445A6G7 2908 NB 1228 14,88 537C8D7 12,78 NB 37,47 2,455 NB = Sem ligação, NA = Não disponível Tabela 2. Sequências de Anticorpos Selecionados a partir da Triagem Cadeia de Sequências (com peptídeo sinal) SEQ ID anticorpos NO: 329F2E1-VH MDFGLIFFIVALLKGVQCEVKLLQSGGGLVQPGGSLKLSCAA 1

SGIDFSRY WMSWVRRAPGKGLEWIGEINPDSSTINYAPSLKDKFIISRDNA KNTLYLQ

MSKVRSEDTALYYCARQDDYDYYAMDYWGQGTSVTVSS 329F2E1-VL MGIKMESQIQVFVFVFLWLSGVDGDIVMTQSHKFMSTSVGD 2

RVSITCKAS QDVSTGVAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFTGSGSR TDFTFTIS

SVQTEDPAVYYCHQYYTIPLTFGAGTELELK 348B10B1 - MGWSWIFLFLLSGTAGVLSEVQLQQSGPELVKPGASVKISCK 3

VH TSGYTFTE YIMHWVKQSHGRSLEWIGGINPDNGDTTYNQKFKGKATLTV DKSSTTAYM

ELRSLTSEDSAVYYCAGGVLDYWGQGTSVTVSS 348B10B1 - MMSPAQFLFLLVLWIRETNGDVVMTQTPLTLSVTIGQPASISC 4

VL KSSQSLL DSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGS GTDFTLKI

SRVEAEDLGVFYCWQGTHFPFTFGSGTKLEIK 360A3D4E3 MGWSWIFLFLLSGTAGVLSEVQLQQSGPELVKPGASVKISCK 5 -VH TSGYTFTE

YIMHWVKQSHERSLEWIGGIHPDNGDTTYNQKFTGKATLTV DKSSTTAYM

ELRSLTSEDSAVYYCAGGVLDYWGQGTSVTVSS 360A3D4E3 MMSPAQFLFLLVLWIRETNGDVVMTQTPLTLSVTFGQPASIS 6 -VL CKSSQSLL

DSDGRTYLNWLLQRPGQSPQRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGS GTDFTLKI SRVEAEDLGVFYCWQGTHFPFTFGSGTKLEIK

52 / 92 414D10F5 - MDIRLSLVFLVLFIKGVQCEVQLAESGGGLVQPGRSLKLSCSA 7

VH SGFTFSD YYMAWFRQAPPKGLEWVASISYDGGDSFYRDSVKGRFTISR DNAKSSLYL

QMDSLRSEDTATYYCTTEEDYSGSFPDYWGQGVMVTVSS 414D10F5 - MMAPVQLLGLLLIWLPAMRCDIQMTQSPSFLSASVGDRVTIN 8

VL CKASQNIN KYLNWYQQKLGEAPKRLIYDTNNLQAGIPSRFSGSGSGTDYT LTINSLQP

EDFATYFCLQHNSLYTFGGGTKLELK 339A9E7 - MRVLILLWLFTAFPGILSDVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVT 9

VH GYSITSD YAWNWNRQFPGNKLEWMGYISYSGDTSYNPSLRSRISITRDT SKNQFFLQ

LNSVTAEDTAKYYCVAGHFDYWGQGTTLTVSS 339A9E7 - MMSPAQFLFLLVLWIRETNGDVVMTQTPLTLSITLGQPASISC 10

VL KSSQSLL DSDGETYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGS GTDFTLKI

SRVEAEDLGVYYCWQGTHFPYTFGGGTKLEIK 339H3E2 - MGWSWIFLFLLSGTAGVLSEVQLQQSGPELVKPGASVKISCK 11

VH TSGYTFTE YIMHWVKQSHGRSLEWIGGINPNNGGTTYNQKFKGKATLTV DKSSSTAYM

ELRSLTSEDSAVYYCAGGVMDYWGQGTSVTVSS 339H3E2 - MMSPAQFLFLLVLWIRETNGDVVMTQTPLTLSVTIGQPASISC 12

VL KSSQSLL DSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGS GTDFTLKI

SRVEAEDLGVFYCWQGTHFPFTFGSGTKLEIK 367F1C2 - MRVLILLWLLTALPGILSDVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVT 13

VH GYSITSD YAWNWIRHFPGNKLEWMGYISYTGSSSYNPSLKSRISITRDTS KNQFFLQ

LNSVTSEDTATYYCVAGHFDYWGPGTTLTVSS 367F1C2 - MMSPAQFLFLLVLWIREANGDVVMTQTPLTLSVTIGQPASISC 14

VL KSSQSLL DSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYQVSKLDSGVPDRFTGSGS GTDFTLKI

SRVEAEDLGVYYCWQGTHFPYTFGGGTKLEIK 21H12D9 - MGWSWIFLFLLSGTAGVHSEVQLQQSGPVLVRPGASVKMSC 15

VH KASGYTFTD YYMNWVKQSHGKSLEWIGVINPNNGGTTYKEKFKGKATLT VDKSSGTAYM

ELNSLTSEDSAVYYCARDDYDAGYWGQGTTLTVSS 21H12D9 - MGFKMEFHTQVFVFVFLWLSGVDGDIVMTQFQKFMSTTVGD 16

VL RVSITCKAS QNVDTAVAWYQHKPGQSPKLLIYSASHRYTGVPDRFTGSGS GTDFTLTIS

NVQSEDLADYFCQQYTDFPLTFGAGTKLELK 408E3F3 - MDRLTSSILLLLVPAYVLSHVTLRESGPGVLQPSKTLSLTCSFS 17

VH GFSLST SAMVVSWIRQSSGMSLEWLAAIDWEGDKYYNPSLESRLTVS RDISDTQVF LRITSVDVADTATYYCAVMSSADSHSVLDAWGQGVSVTVSS

53 / 92 408E3F3 - MMAALQLLGVLLLWLPAMRCDIKMTQSPSFLSASVGDRVTI 18

VL NCKASQNIH NYLNWYQQKFGEAPRLLIYNTNNLQTGIPSRFSGSGSGTDFTL TISSLQP

EDVATYFCLQHSSSLTFGSGTKLEIN 415A3D1F4 MKLWLNWIFLLTLLNGIQCEVKLLESGGGLVQAGGSMRLSC 19 -VH GAFGFTVTD

FYINWIRQPAGKAPEWLGFMRNKANGYTTEYNPSVKGRFTIS RNNTQNMP YLQMNTLRTEDTAIYYCARSRYNADDYYVGVMDVWGQGAS

VTVSS 415A3D1F4 MGVPTQLLVLLLLWITDAICDIQMTQFPASLSASLGETVSIECL 20 -VL ASEDIY

NNLAWYQQKPGKSPQLLIYYTNSLQDGVPSRFSGTGSGTQYS LKINSLES

EDAATYFCLQDSEYPWTFGGGTKLKLK 348E12F12 - MRVLILLWLFTAFPGILSDVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVT 21

VH GYSITSD YAWNWIRQFPGNKLEWMGYISYSGDTSYNPSLKSRISITRDTS KNQFFLQ

LNSVTTEDTATYYCVAGHFDYWGQGTTLTVSS 348E12F12 - MMSPAQFLFLLVLWIRETNGDVVMAQTPLTLSVTIGQPASISC 22

VL KSSQSLL DSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSNLDSGVPDRFTGSGS GTDFTLKI

IRVEAEDLGLYYCWQGTHFPYTFGGGTKLEIK 368D6D10 - MRVLILLWLFTAFPGILSDVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVT 23

VH GYSITSD YAWNWIRQFPGNKLEWMGYISYSGSTSYNPSLKSRISITRDTS KNQFFLQ

LNSVTTEDTATYYCVAGHFDYWGQGTTLTVSS 368D6D10 - MMSPAQFLFLLVLWIRETNGDVVMTQTPLTLSITIGQPASISC 24

VL KSSQSLL DSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGS GTDFTLKI

SRVEAEDLGVYYCWQGTHFPYTFGGGTKLEIK 1H3A11 -VH MNFGLSLIFLVLVLKGVQCEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCA 25

ASGFTFSS YAMSWVRQTPEKRLEWVATISDGGSDTYYPDNVKGRFTISR DNAKNNLYL QMSHLKSEDTAMYYCARDYYGSSYEDYAMDYWGQGTSVT

VSS 1H3A11 -VL MRPSIQFLGLLLFWLHGAQCDIQMTQSPSSLSASLGGKVTITC 26

KASQDIN KYITWYQHKPGKGPRLLIHYTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSFS ISNLEP

EDIATYYCLQYDNLYTFGGGTKLEIK 355A1F6 - MRVLILLWLFTAFPGILSDVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVT 27

VH GYSITSD YAWSWIRQFPGNKLEWMGYISYSDSTSYNPSLKSRISITRDTS KNQFFLQ LNSVTAEDTATYYCAAGHFDYWGQGTILTVSS

54 / 92 355A1F6 - MMSPAQFLFLLVLWIREINGDVVMTQTPLTLSVTIGQPASISC 28

VL KSSQSLL DSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGS GTDFTLKI

SRVEAEDLGVYYCWQGTHFPYTFGGGTKLEIK 353F9C4-VH MRVLILLWLFTAFPGILSDVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVT 29

GYSITSD YAWSWIRQFPGNKLEWMGYITYSDSTSYNPSLKSRISITRDTS KNQFFLQ

LNSVTAEDTATYYCAAGHFDYWGQGTILTVSS 353F9C4-VL MMSPAQFLFLLVLWIREINGDVVMTQTPLTLSVTIGQPASISC 30

KSSQSLL DSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGS GTDFTLKI

SRVEAEDLGVYYCWQGTHFPYTFGGGTKLEIK 19H7E10- MGWSWIFLFLLSGTAGVLSEVQLQQSGPELVKPGASVKISCQ 31

VH ASGYAFSD YYMNWVKQSHGKRLEWIGDINPNNDGTTYNQKFKDKATLT VDKSSSTAYM

DLRSLTSEDSAVYYCARLSWSFFAMDYWGQGTSVTVSS 19H7E10-VL MGIKMESQIQVFVFVFLWVSGVDGDIVMTQSHKFMSTSVGD 32

RVSITCKAS QDVSSGVAWYQQKPGQSPKVLIYSASHRHTGVPDRFTASGS GTDFTFTIS

SVQAEDLAVYYCQQYYNTPWTFGGGTKLEIK 411A11E9- MDIRLSLGFLVLFIKGVQCEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCV 33

VH VSGFTFSD YYMAWVRQTPTKGLEWVASINYDGGDTYYRDSVKGRFTVS RNNAKSSLFL

QMDSLRSEDTATYYCKTEEDYDGSYVMDAWGQGASVIVSS 411A11E9- MMAPVQLLGLLLIWLPAMRCDIQMTQSPSFLSASVGDRVTIS 34

VL CKASQNIN KELTWYQQKLGKAPKRLIYNTNILQTGIPSRFSGSGSNTDYTL TISSLQP

EDFATYFCLQQSSLYTFGAGTKLELK 64C10G1- MNFGLSLIFLVLVLKGIQCEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCA 35

VH ASGFTFSS YAMSWVRQTPEKRLEWVATISDGGSDAYYPDNVKGRFTISR DNAKNNLYL QMSHLKSEDTAMYYCARDYYGSGYEDSPMDYWGQGTSVTV

SS 64C10G1-VL MRPSIQFLGLLLFWLHGAQCDIQMTQSPSSLSASLGGKVTITC 36

KASQDIN KYIAWYQHKPGKGPRLLIHYTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSF SISNLEP

EDFATYYCLQYDNLYTFGGGTKLEIK 397C3B3- MRVLILLWLFTAFPGILSDVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVT 37

VH GYSITSD YAWNWIRQFPGNKLEWMGYISYSGSTSYNPSLKSRISINRDTS KNQFFLQ

LNSVTTEDTATYYCVAGHFDYWGQGTTLTVSS 397C3B3-VL MMSPAQFLFLLVLWIRETNGDVVMTQTPLTLSITIGQSASISC 38

KSSQSLL DSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLISLVSKLDSGVPDRFTGSGS GTDFTLKI SRVEAEDLGVYYCWQGTHFPYTFGGGTKLEIK

55 / 92 71F4A3-VH MDFGLIFFIVALLKGVQCEVKLLQSGGGLVQPGGSLKLSCAA 39

SGIDFSRY WMSWVRRAPGKGLEWIGEINPDSSTINYAPSLKDKFIISRDNA KNTLYLQ

MSKVRSEDTALYYCARQDDYEYYAMDYWGQGTSVTVSS 71F4A3-VL MGIKMESQIQVSVFVILWLSGVDGDIVMTQSHKSMSTSVGDR 40

VSITCKAS QDVNTGVAWYRQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFTGSGS GTDFTFTIS

SVQAEDLAVYYCQQYYSTPLTFGAGTKLELK 119H10D6- MEWTWVFLFLLSVTAGVHSQVQLQQSGAELMKPGASVKISC 41

VH KATGYTFNT YWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSESTDYNEKFKDKATFTAD ISSNTAYM

QLSSLTSEDSAVYYCARDYYGYYFDYWGQGTTLTVSS 119H10D6- MGIKMESQIQVFVFVFLWLSGVDGDIVMTQSHKFMSTSVGD 42

VL RVSITCKAS QDVSTAVVWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSG TDFTFTIS

SVQAEDLAVYYCQQHYSSPRTFGGGTKLEIK 130D6G1- MEWTWVFLFLLSVTAGVHSQVQLQQSGAELMKPGASVKISC 43

VH KSTGYTFST YWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSDSTNSNEKFEGKATFTAD TSSNTAYM

QLSSLTSEDSAVYYCARDYYGFYFDYWGQGTTLTVSS 130D6G1- MGIKMESQIQVFVFVFLWLSGVDGDIVMTQSHKFMSTSVGD 44

VL RVNITCKAS QDVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSTSYRYTGVPDRFTGSGSG TDFTFTIS

NVQAEDLAVYYCQQHYTTPRTFGGGTKLEIK 156H3H7 - MGWSWIFLFLLSGTAGVLSEVQLQQSGPELVKPGASVKISCK 45

VH ASGYTFTD YYMNWVRQSHGKSLEWIGDINPNNGDTTYNQKFKGKATLT VDTSSSTVYM

ELRSLTSEDSAVYYCAGYDEDHYAMDYWGQGTSVTVSS 156H3H7 - MGIKMESQMQVFVFVFLWLSGVDGDYVMTQSHKFMSTSVG 46

VL DRVSITCKAS QDVSTGVAWYQQNPGQSPKLLIYSASHRYTGVPDRFTGSGSG TDFTFTIS

SVQAEDLAVYYCQQYYTTPWTFGGGTKLEIK 168A2D4- MGWSWIILFLVSGTAGVLSEVQLQQSGPELVKPGASVKISCK 47

VH ASGNTLTD YYMNWVKQSHGKSLEWIGDINPNNGDIIYNQKFKGKATLTV AKSSSTAYM

ELRSLTSEDSAVYYCAIYYDPYYHAMDYWGQGTSVTVSS 168A2D4- MGIKMESQIQVFVFVFLWLSGVDGDIVMTQSHKFMSTSVRD 48

VL RVSITCKAS QDVSTGVAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFTGSGSG TDFTFTIS

SVQAEDLAVYYCQQQYSVPLTFGAGTKLELK 168D6F2-VH MGWSCIMLFLAATATGVHSQVQLQQPGAELVKPGASVKLSC 49

QASGYTFTS YWMHWVKQRPGRGLEWIGGIDPDSGATKDNEKFKTKATLT VDKPSRTAYI QLSSLTSEDSAVFYCARGSTVVAPGDYFAMDYWGQGTSVTV SS

56 / 92 168D6F2-VL METDTLLLWVLLLWVPGSTGDIVLTPSPTSLAVSLGQRATMS 50

CRASESVD NYGISFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLDSGIPARFSASGSRT DFTLTIN

PVETDDVATYYCQQSNKDPWTFGGGTKLEIK 175E3B10- MGRLTSSFLLLIVPAYVLSQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFS 51

VH EFSLSV FGMGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDEKYYNPALKSRLTIS KDTSKNQVF

LKIANVDTADTATYFCARIDGYYDFDYWGQGTTLTVSS 175E3B10- MKLPVRLLVLMFWIPASSSDVLMTQTPLSLPVSLGTQASIFCR 52

VL SSHSIVQ DNGNTYLQWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSG TDFTLKIS

RVEAEDLGVYYCFQGSYVPYTFGGGTKLEIK 177D2G10- MDRLTSSFLLLIVPAYVLSQIALKESGPGILQSSQTLSLTCSFSG 53

VH FSLST SGMHVGWFRQPSGKTLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTIS KDTSRNQVF LNLTNVDTADTATYYCARRGGDYDYDEGFDYWGQGTTLTV

SS 177D2G10- MKLPVRLLVLMFWIPASSSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCR 54

VL SSQSLVH SNGFTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSG TEFTLRIS

RVEAEDLGVYFCSQSTHVPYTFGGGTKLEIK 178B2E8-VH MYFRLSSVFLVLILKGVQCEVKLVESEGGLVQPGSSMKLSCT 55

ASGFTFTD YYMTWVRQVPEKGLEWVANINYDGSRTNYLDSLKSRFIISRD NAKNILYL

QMSSLKSEDTATYYCARDGNYHFYGMDYWGQGTSVTVSS 178B2E8-VL MGIKMESQIQAFVFVFLWLSGVDGDFVLTQSHKFMSTSVGD 56

RVSITCKAS QDVSTAVAWYQQKPGQSPQLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGS GTDYTLTIS

SVQAEDLALYYCQQHYSTPWTFGGGTKLEIK 178E2B3-VH MEWSRVFIFLLSVTAGIHSQVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCK 57

ASGYAFTN HLIEWVKQRPGQGLEWIGVINPGSGGTKYNEKFKGKATVTA DKSSSTVYM

QLNSLTSEDSAVYFCARSSDGYYEEDYFDYWGQGTTLTVSS 178E2B3-VL MDFQVQIFSFLLISASVIISRGQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTC 58

SASSS VNYMQWYQQKSGTSPKRWIYDTSELASGVPDRFSGSGSGTS YSLTISSME

AEDVATYYCQQWSSDPITFGAGTKLELK 181B11G12- MYFRLSSVFLVLILKGVQCEVKLVESEGGLVQPGSSMKLSCT 59

VH ASGFTFSD YYMAWVRQVPEKGLEWVANINYDGSDTYYLDSLKSRFIISR DNAKNILYL

QMSSLKSEDTATYYCVRDVAYDDSYAMDYWGQGTSVTVSS 181B11G12- MRPSIQFLGLLLFWLHGAQCDIQMTQSPSSLSASLGGKVTITC 60

VL KASQDIN KYIAWYQHKPGKGPRLLIHYTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSF SISNLEP EDIATYYCLQYDSLYTFGGGTKLEIK

57 / 92 184H10B5- MGRLTSSFLLLIVPAYVLSQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFS 61

VH EFSLSV FGMGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDEKYYNPALKSRLTIS KDTSKNQVF

LKIANVDTADTATYYCARIDGYYDFDYWGQGTTLTVSS 184H10B5- MKLPVRLLVLMFWIPASSSDVLMTQTPLSLPVSLGTQASISCR 62

VL SSHSIVQ DNGNTYLQWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSG TDFTLKIS

RVEAEDLGVYYCFQGSYVPYTFGGGTKLEIK 345G1B4- MGRLTSSFLLLIVPAYVLSQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFS 63

VH GFSLST SNMGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDVKRYNPALKSRLTIS KDTSSSQVF

LKIASVDTADTATYYCARSTTLVAFDYWGQGTTLTVSS 345G1B4 - MESQTQVLMSLLFWVSGTCGDIVMTQSPSSLTVTAGEKVTM 64

VL SCKSSQSLL NSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGS GSGTDFTLT

ISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPTFGGGTKLEIK 396A5A1- MGRLTSSFLLLIVPAYVLSQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFS 65

VH GFSLST SGMGIGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDIKRYNPALKSRLTVS KDTSTSQVF

LNIASVDTADIATYFCARSTTVVAFDYWGQGTTLTVSS 396A5A1- MESQTQVLMSLLFWVSGTCGDILMTQSPSSLTVTAGEKVTMS 66

VL CKSSQSLL NSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGT GSGTDFTLT

ISSVQAEDLAIYYCQNDYDYPTFGGGTKLEIK 402H2G12- MDRLTSSFLLLIVPAYVLSQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCTFS 67

VH GFSLST YGMGVGWIRQPSGKGLEWLANIWWDDDKYYNPSLQNRLTI SKDTSNNQAF

LKINNVDTADTATYYCARSELIMPYVPFDYWGQGVRVTVSS 402H2G12- MDMRAHTQFLGFLLLWFPGARCDIQMTQSPSSMSASLGDRV 68

VL TITCQASQD IDNHLIWFQQKPGKSPRPMIYYATNLANGVPSRFSGSRSGSDY SLTISSL

ESEDMADYHCLQFKQYPFTFGSGTKLEIK 409G9C2- EVQLQQSGPGLVKPSGTLSLTCAVSGGSITSSYWWTWVRQPP 69

VH GKGLEWIG EIYHSGRPNYNPSLKSRATISVDKSRNQFSLNLTSVTAADTAV YYCAKTA

AVSYWYFDLWGRGTLVTVSS 409G9C2-VL DIKMNQSPSSMSASLGDRVTITCQASQDIGNDLIWFQQKPGKS 70

PRPLIYY ASNLANGVPSRFSGRRSESNYSLTISSLESEDMADYHCLQFKQ YPFTFGA

GTKLELK 410A4D10- EVQLQQSGPGLVRPSGTLSLTCAVSGGSISSRNWWGWVRQPP 71

VH GKGLEWIG EIYHSGGTNYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAV YYCAREF GDSVWYFDLWGRGTLVTVSS

58 / 92 410A4D10- DIVITQSPSSMSASLGDRVTITCQASQDIGNDLVWFQQKPGKS 72

VL PRPLIYY ATNLADGVPSRFSGRRSESKYSLTISNLESEDMADYHCLQFK QYPYTFGA

GTKLELK 414G3F4 - EVQLQQSGPGLVKPSGTLSLTCAVSGGSITSSYWWIWVRQPP 73

VH GKGLEWIG EIYHSGRPNYNPSLESRVTISVDKSKNQFSLTLSSVTAADTAV YYCAREA

GDSVWYFDLWGRGTLVTVSS 414G3F4-VL DILLTQSPSSISASLGDRVTITCQASQDIGNELIWFQQKPGKSP 74

RPMIYY ATSLADGVPSRFSGSTSGSDYSLTIGSLESEDMADYHRLQFKQ YPFTFGS

GTRLEIK 416C9H8 - QVTLKESGPEILQPSQTLSLTCTFSGFSLSPYGMGVGWIRQPS 75

VH GKGLEWL ANIWWDDDKYYNPSLINRLTISKDTSNNQAFLKITNVDTTDS ATYYCVRS

ELVMPYVPFDYWGQGVMVTVSS 416C9H8-VL DIQMTQSPSSMSASLGDRVTITCQASQDIENDLVWFQQKPGR 76

SPRPLIYY ATNLANGVPSRFSGRRSESDYSLTISSLESEDMADYHCLQFKQ YPYTFGA

GTKLELK 418D3H6- QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCTFSGFSLSTYGMGVGWIRQPS 77

VH GKGLEWL ANIWWDDDKYYNPSLINRLTISKNTSNNQAFLKITNVDAPDT ATYYCARS

ELVMPYVPFDFWGQGIMVTVSS 418D3H6- DIQMTQSPSSLSASLGDRITMTCQASQDIGIELIWFQQKPGKSP 78

VL WPVIYY TANLASGVPSRFSGSRSGSHYSLTISSLESEDMADYHCLQYKQ YPFTFGS

GTKLEIK 423A6H6- QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCTFSGFSLSTYGMGVGWIRQPS 79

VH GKGLEWL ANIWWDDDKYYNPSLQNRLTISKDTSNNQAFLKITNVDTADT ATYYCARS

ELIMPYVPFDYWGQGVRVTVSS 423A6H6- DIQMTQSPSSMSASLGDRVTITCQASQDIDNHLIWFQQKPGKS 80

VL PRPMIYY ATNLANGVPSRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDMADYHCLQFKQ YPFTFGS

GTKLEIK 424H7F2-VH MDRLTSSFLLLIVPAYVLSQVTLKESGPEILQPSQTLTLTCTFS 81

GFSLSP YGMGVGWIRQPSGKGLEWLANIWWDDDKYYNPSLINRLTIS KDTSNNQAF

LKITNVDTTDSATYYCVRSELVMPYVPFDYWGQGVMVTVSS 424H7F2-VL MDMRAHTQFLGFLLLWFPGARCDIQMTQSPSSMSASLGDRV 82

TITCQASQD IENDLIWFQQKPGKSPRPLIYYATNLANGVPSRFSGRRSESNY ALTISSL ESEDMADYHCLQFKQYPYTFGAGTKLELK

59 / 92 427C4F11- QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCTFSGFSLTTYGMGVGWIRQPS 83

VH GKGLEWL ANIWWDDDKYSNPSLQSRLTISKDTSNNQAFLTITNVDTADT ATYYCARS

ELVMPYVPFDYWGQGVRVTVSS 427C4F11- DIQMTQSPSSMSASLGDRVTITCQASQDIDNHLIWFQQKPGRS 84

VL PRPMIYY ATNLANGVPSRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDMADYHCLQFKQ YPFTFGS

GTKLEIK 430D9B3- MDRLTSSFLLLIVPAYVLSQVTLKESGPEILQPSQTLSLTCTFS 85

VH GFSLSP YGMGVGWIRQPSGKGLEWLANIWWDDDKYYNPSLINRLTIS KDTSNNQAF

LKITNVDTTDSATYYCVRSELVMPYVPFDYWGQGVMVTVSS 430D9B3-VL MDMRAHTQFLGFLLLWFPGARCDIQMTQSPSSMSASLGDRV 86

TITCQASQD IENDLIWFQQKPGKSPRPLIYYATNLANGVPSRFSGRRSESNY SLTISSL

ESEDMADYHCLQFKQYPYTFGAGTKLELK 432C12E1- QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCTFSGFSLSTYGMGVGWIRQPS 87

VH GKGLEWL ANIWWDDDKYYNPSLKNRLTISKDTSNNQAFLKITNVDTADT ATYYCARS

EIVMPYVPFDYWGQGVMVTVSS 432C12E1- DIQMTQSPSSMSASLGDRVTITCQASQDIGNDLIWFQQKPGKS 88

VL PRPMIYY ATNLANGVPSRFSGSGSGSVYSLTISSLESEDMADYHCLQFKQ YPFTFGS

GTKLEIK 442C9H4 - QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTYGMGVGWIRQPS 89

VH GKGLEWL ANIWWDDDKYYNPSLINRLTISKNTSNNQAFLKITNVDAPDT ATYYCARS

ELVMPYVPFDFWGQGIMVTVSS 442C9H4 - DIQMTQSPSSLSASLGDRITITCQASQDIGIDLIWFQQKPGKSP 90

VL WPVIYY TANLASGVPSRFSGSRSGSHYSLTISSLESEDMADYHCLQYKQ YPFTFGS

GTKLEIK 445A6G7- QVTLKESGPEILQPSQTLSLTCTFSGFSLSPYGMGVGWIRQPS 91

VH GKGLEWL ANIWWDDDKYYNPSLINRLTISKDTSNNQAFLKITNVDTTDS ATYYCVRS

ELVMPYVPFDYWGQGVMVTVSS 445A6G7- DIQMTQSPSSMSASLGDRVTITCQASQDIGNDLIWFQQKPGKS 92

VL PRPLIYY ATNLANGVPSRFSGRRSESNYSLTISSLESEDMADYHCLQFKQ YPYTFGA

GTKLELK 537C8D7- MDIRLSLVFLVLFIKGVQCEVQLVESGGGLVLPGRSLKLSCAA 93

VH SGFTFSD YAMAWVRQAPKKGLEWVATVFYDGSDTFYRDSVKGRFTIS RDNAKSTLYL QMDSLRSEDTATYYCAREGDYYSRHVYVGYNWFPHWGQGT LVTVSS

60 / 92 537C8D7-VL MGVPTHLLGLLLLWITHAMCDIRMTQSPASLSASLGETVNIE 94

CLTSEDIN SELAWYQQKPGKFPQFLIYNANSLQDGVPSRFSGSGSGTQYS LKINSLQS

EDVATYFCQQYNSYPLTFGSGTELEIK Exemplo 2. Propriedades de bloqueio de anticorpos quiméricos anti- CXCL13 em ensaio de bloqueio baseado em células

[00136] Este exemplo testou o bloqueio dos anticorpos quiméricos anti-CXCL13 para células CHO-K1-CXCR5. Resumidamente, 5x104 células CHO-K1-CXCR5 foram plaqueadas em placa de 96 poços com 100 µl de meio de cultura e incubadas a 37oC durante a noite. As células foram fixadas com 100 µl de PFA a 2% em temperatura ambiente durante 1 hora após a lavagem com PBS durante 1 vez. As amostras foram bloqueadas com BSA a 1% em PBST durante 1 hora em temperatura ambiente. Os anticorpos foram diluídos em série a partir de 50 µg/ml por 3 vezes com 1% de BSA/PBST e pré-incubados com volume igual de 0,3 µg/ml de CXCL13 humano por 30 minutos em temperatura ambiente. 100 µl de complexo anticorpo-antígeno foram transferidos para os poços de cada célula por 30 min em temperatura ambiente. As amostras foram lavadas com 1XPBST por 3 vezes e 100 µl de 3 µg/ml de anticorpo Mab5261 humano foram adicionados a cada poço para capturar CXCL13 humano e Fc-HRP anti-humano foi usado para detectar indiretamente CXCL13 humano quando se ligou a CHO-K1 Células -CXCR5.

[00137] O anticorpo secundário foi revelado por 100 µl de TMB e interrompido com 100 µl de HCl 1N. Então leia a 450nM. Os valores de IC50 foram resumidos na Tabela 3, que mostrou IC50 de propriedades de bloqueio. Entre todos os clones, 415A3D1, 64C10G1, 1H3A11, 414D10F5, 411A11E9, 21H12D9, 71F4A3, 329F2E1 mostram atividade de bloqueio completo e 408E3F3, 19H7E10, 339A6E7 pareciam ser bloqueadores parciais. Tabela 3. Propriedades de bloqueio de anticorpos quiméricos Anticorpos IC50 (µg/ml) 415A3D1 0,985 64C10G1 1,099 1H3A11 1,19 414D10F5 1,262 411A11E9 1,713

61 / 92 21H12D9 1,892 71F4A3 3,017 408E3F3 7,636 19H7E10 15,1 329F2E1 3,546 339A6E7 ~ 1,425e + 011 Exemplo 3. Propriedades de ligação de anticorpos quiméricos anti- CXCL13

[00138] Ensaio de ligação à base de Elisa. Os anticorpos que bloquearam funcionalmente CXCL13 humano foram mais completamente distinguidos quanto à ligação a huCXCL13 e cynoCXCL13. Resumidamente, 100 µl de CXCL13 humano ou CXCL13 de cynomolgus foram revestidos a 0,5 µg/ml durante a noite e depois bloqueados por 200 µl de BSA a 5% em PBS. Anticorpos diluídos em série foram incubados com o antígeno revestido por 30 min em temperatura ambiente. As placas resultantes foram lavadas com PBS/T e incubadas com IgG Fc-HRP de cabra anti-humano por 30 min RT. As placas foram desenvolvidas com substrato TMB após lavagem com 1XPBST por 5 vezes e a reação interrompida com HCl 1N e analisada por espectrofotômetro em DO 450-630nm. Os valores de EC50 são mostrados na tabela 4. Tabela 4. Propriedades de ligação de anticorpos quiméricos EC50 (ng/ml) Anticorpos hu CXCL13 cyno CXCL13 415A3D1 72,89 46,94 64C10G1 40,06 56,26 1H3A11 55,34 143,9 411A11E9 48,46 100,4 414D10F5 62,84 1190 21H12D9 53,62 48,8 71F4A3 38,06 81,44 329F2E1 51,13 41,62

[00139] Afinidade de ligação de HuCXCL13 por ressonância de plasma de superfície. 411A11E9, 415A3D1, 64C10G1, 21H12D9, 329F2E1, 71F4A3 foram selecionados para produzir Fab e testaram a afinidade de ligação. A ligação dos anticorpos a huCXCL13 foi examinada por Biacore 8K. HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, Tween-20 0,05%, pH 7,4 serviram como tampão de corrida e glicina-HCl 10 mM, pH 2,0 serviram

62 / 92 como tampão de regeneração. A proteína CXCL13 foi imobilizada no Sensor Chip CM5 usando o método de acoplamento de amina (nível de imobilização ~30RU). As concentrações em série de Fab (0-16nM) foram injetadas sobre CXCL13 imobilizado na vazão de 30 µl/min. As fases de dissociação foram 600s. Os resultados são mostrados na Tabela 5 abaixo. Exemplo 4. Propriedades de bloqueio de anticorpos quiméricos anti- CXCL13 em ensaio de sinalização

[00140] A inibição do fluxo de cálcio induzida por CXCL13 por anticorpos quiméricos anti-CXCL13. O tratamento com CXCL13 humano simula a mobilização de cálcio intracelular em células CHO-K1-CXCR5. Quando anticorpos anti-CXCL13 diluídos em série foram adicionados ao ensaio, os anticorpos inibiram de forma dependente da dose a produção de fluxo de cálcio em células CHO-K1-CXCR5. Com base no resultado de afinidade de ligação e bloqueio baseado em células, 64C10G1, 1H3A11, 411A11E9, 21H12D9, 71F4A3, 329F2E1 e 415A3D1 foram escolhidos para testar neste ensaio de fluxo de cálcio.

[00141] Células CHO-K1-CXCR5 (1,5×104 células/poço) em meio foram revestidas em uma placa de ensaio de 384 poços. No dia seguinte, eles foram incubados com 0,75 µg/ml de rhCXCL13 com ou sem anticorpos anti- CXCL13 diluídos em série em tampão de ensaio (HEPES, HBSS 20 nM) a 37°C por 30 min. O tampão de trabalho do corante de cálcio foi preparado e adicionado às células. Em seguida, transfira a mistura para as células e obtenha a intensidade de fluorescência (FI) por FLIPRTERA. As análises estatísticas foram realizadas pelo software Graphpad Prism (v5.0).

[00142] Como mostrado na Figura 1, em comparação com o fluxo de cálcio positivo FI (linha tracejada) que foi induzido por CXCL13, todos os anticorpos quiméricos de anti-CXCL13 tinham atividade potente semelhante no bloqueio do fluxo de cálcio induzido por CXCL13 em CHO-K1-CXCR5 células, exceto 415A3D1.

63 / 92

[00143] Bloqueio de sinalização IP1 mediada por CXCL13 por anticorpos quiméricos anti-CXCL13. CXCL13 ligado ao ligante CXCR5, que é um receptor acoplado à proteína G, em células CHO-K1-CXCR5 pode induzir o acúmulo de monofosfato de inositol (IP1), um metabólito estável a jusante de IP3 induzido pela ativação de uma cascata de fosfolipase C (PLC). Um kit IP1 (Cisbio) foi usado para testar a eficácia de bloqueio de anticorpos anti-CXCL13. O kit é um imunoensaio competitivo destinado a medir o acúmulo de IP1 em células pela tecnologia HTRF. O IP1 nativo produzido pelas células competiu com o IP1 marcado com d2 pela ligação ao anti-IP1- criptato. Quando as células CHO-K1-CXCR5 são estimuladas com CXCL13, o IP1 será produzido pelas células e competirá com o IP1 marcado com d2, levando ao sinal de detecção regulado para baixo em comparação a sem ser tratado com CXCL13.

[00144] 0,25 µg/ml de CXCL13 foi incubado com ou sem anticorpos anti-CXCL13 diluídos em série em meio de estimulação (meio de cultura F12 contendo LiCl 5 mM, cuja função é acumular IP1) por 20 minutos em temperatura ambiente em uma placa de ensaio de 384 poços. 5×104 células foram transferidas para cada poço. Incube a placa por 1 hora em uma incubadora de células (37ºC, umidificada, 5% de CO2). Após a incubação, a mistura de solução de trabalho IP1-d2 e anti-IP1-Criptato foi adicionada a cada poço. A placa foi vedada e incubada durante 1 hora em temperatura ambiente. Por fim, a vedação foi removida e a placa lida na leitora compatível com HTRF para obtenção do valor 665nm/615nm.

[00145] Conforme mostrado na Figura 2, a curva de IgG significa a produção de IP1 induzida por CXCL13. A linha tracejada indica o nível basal de IP1 em células CHO-K1-CXCR5 sem tratamento com CXCL13. Todos os anticorpos anti-CXCL13, 64C10G1, 21H12D9, 329F2E1, 411A11E9, 71F4A3 e 1H3A11, poderiam efetivamente bloquear de forma dependente da dose o sinal IP1 e a eficiência de inibição foi similar.

64 / 92 Exemplo 5. Bloqueio in vitro da migração de células derivadas de CXCL13 por anticorpo quimérico anti-CXCL13

[00146] Bloqueio da migração de células BaF3-CXCR5 (humanas) em direção a CXCL13. Sabe-se que CXCL13 se liga ao seu receptor CXCR5 e pode derivar a migração de células. Para avaliar a potência de inibição dos anticorpos anti-CXCL13 no ensaio de migração, foram utilizadas linha de células de superexpressão CXCR5 humana, células BaF3-CXCR5.

[00147] A mistura de 50 ng/ml CXCL13 foi incubada com ou sem anticorpos anti-CXCL13 diluídos em série em meio de diluição (solução salina balanceada de Gey + BSA 0,1%) em uma placa de cultura de 96 poços por 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, transfira a mistura de 68,5 µl/poço para o fundo da placa Transwell de 5 µm de tamanho de poro (Corning, 3387). Células BaF3-CXCR5 de 100 µl/poço (6,5×105 células) foram adicionadas à câmara superior. Além disso, poços que tinham apenas meio de quimiotaxia adicionado à placa inferior e células à câmara superior para remover o sinal de fundo. Após 3 horas de incubação em uma incubadora, a câmara foi desmontada e todo o volume foi transferido da placa de fundo para uma placa de cultura de 96 poços. 10 µl/poço de Resazurina (R&D) foram adicionados à placa de ensaio e a placa foi incubada por mais 16-24 horas em uma incubadora. A fluorescência foi medida em comprimentos de onda de 544 nm e 590 nm.

[00148] O sinal de fundo foi removido e o software GraphPad (v5.0) foi usado para obter a curva de ajuste de titulação. Na Figura 3, as linhas tracejadas indicam que o CXCL13 induziu a migração FI. Quando os anticorpos anti-CXCL13, 64C10G1, 21H12D9, 329F2E1, 411A11E9, 71F4A3 e 1H3A11, foram adicionados ao ensaio, o FI foi regulado negativamente de forma dependente da dose, o que significa que a migração das células BaF3-CXCR5 foi inibida de forma dependente da dose por Anticorpos anti-CXCL13. A potência de inibição dos anticorpos testados

65 / 92 nesta migração de células BaF3-CXCR5 foi comparável.

[00149] Inibição da migração de células primárias da tonsilas para CXCL13. Para investigar mais a função de bloqueio de anticorpos anti- CXCL13, foi usado o ensaio de migração de células da Tonsila humana primária. O efeito dos anticorpos anti-CXCL13 mencionados acima na migração de células da tonsila humana primária foi testado.

[00150] Tecidos de tonsilas humanas foram chocados com êmbolo de seringa de 1 mL e passados através de filtro de células de 70 µm. Recolher e lavar as células com PBS. Em seguida, obtenha linfócitos por Ficoll. Lavar e suspender novamente os linfócitos com meio de quimiotaxia (RPMI 1640 contendo 0,5% de BSA). Em seguida, incube 0,5 µg/ml CXCL13 com concentrações em série de anticorpos ou IgG de controle em meio de quimiotaxia em temperatura ambiente por 30 minutos. Transfira a mistura de 150 µl/poço para o fundo da placa Transwell de 96 poços com tamanho de poro de 5 µm (Corning, 3387) e adicione 50 µl/poço de células de tonsilas humanas (5 × 105 células) à câmara superior. Além disso, projete poços que apenas adicionem meio de quimiotaxia à placa inferior e células à câmara superior para remover o sinal de fundo. Após incubação de 3 horas em uma incubadora, desmonte a câmara e descarte o filtro. Adicione 1,67 µg/ml de calceína-AM (ThermoFisher) em cada poço e incube por mais 20 minutos na incubadora. Meça a fluorescência no comprimento de onda 485 nm e 520 nm.

[00151] Exclua a intensidade de fluorescência de fundo (FI) dos dados brutos e obtenha o histograma pelo software GraphPad (v5.0). Conforme mostrado na Figura 4, compare com os tratados com IgG, todos os anticorpos anti-CXCL13 inibiram a quimiotaxia das células das tonsilas humana primária de uma forma titulável. Exemplo 6. Eficácia in vivo da terapia com anticorpo anti-CXCL13 em macaco cynomolgus

[00152] Na resposta imune normal, CXCL13 e seu receptor CXCR5

66 / 92 estão envolvidos no homing de células B e na formação do centro germinativo. Macacos Cynomolgus imunizados com resposta de anticorpos dependente de células T (TDAR) de hemocianina de lapa (KLH) é um modelo de resposta imune abrangente. Neste modelo de resposta imune, podemos avaliar as interações dos linfócitos B e T, a troca de classe e a formação do centro germinativo por meio da produção de anticorpos específicos para o antígeno (ou seja, resposta de anticorpos específicos de IgM para IgG).

[00153] Macacos Cynomolgus foram randomizados em 2 grupos (3 macacos/grupo) e imunizados com 1ml 10 mg/ml KLH por injeção intramuscular no Dia 0. 30 mg/kg de anticorpo quimérico anti-CXCL13 64C10G1 foi administrado por injeção intravenosa em periféricos alternados vasos no dia -1, 4, 9. O volume igual de solução salina foi administrada ao mesmo tempo de macacos do grupo de controle. O soro foi coletado da veia cefálica ou femoral nos dias -4, -1, 4, 9 e 14 para detecção de IgG/IgM anti- KLH específico. Elisa para o nível sérico de macaco anti-KLH IgG e IgM foi realizado de acordo com as instruções do fabricante (Life Diagnostics, KLHM-3-INT e KLHG-3-INT). No dia 14, coletar o sangue total e obter as células mononucleares do sangue periférico (PBMC) por Ficoll. Analisar a população de células B (CD20+, Biolegend) e a expressão de CXCR5 (Thermofisher) na superfície das células B por citômetro de fluxo (Becton- Dickinson). A aquisição e análise de dados foram conduzidas usando o software flowjo.

[00154] Como mostrado na Figura 5A, embora houvesse a diferença individual no grupo de solução salina, pudemos ver que o tratamento com anticorpo 64C10G1 anti-CXCL13 poderia inibir a produção de IgG específico anti-KLH. O nível de IgM de KLH específico também foi ligeiramente inibido na Figura 5B. Conforme mostrado na Figura 5C, especulamos que o anticorpo 64C10G1 neutralizou o antígeno CXCL13 no sangue periférico, resultando na redução da população de células B na periferia. A redução de

67 / 92 CXCL13 no sangue periférico resultou na diminuição da ligação e internalização de seu receptor CXCR5, que por sua vez aumentou a expressão de CXCR5 na superfície das células B na Figura 5D. Os resultados deste modelo in vivo mostraram que o anticorpo anti-CXCL13 64C10G1 tinha eficácia potente no bloqueio da produção de células B GC, troca de classe, produção de anticorpos de alta afinidade específica para o antígeno, o que significava a inibição da formação do centro germinativo. Exemplo 7. Bloqueio da migração dependente de CXCL13 de esplenócitos de camundongo por anticorpo monoclonal de camundongo anti-CXCL13 substituto

[00155] Obtivemos um anticorpo anti-CXCL13 substituto 424H7F2 que poderia se ligar de forma cruzada a CXCL13 de camundongo a partir da triagem de hibridoma mencionada no Exemplo 1. Para investigar a atividade de bloqueio, testamos o efeito de 424H7F2 na migração de esplenócitos de camundongo primária induzida por rmCXCL13.

[00156] Sacrificaram-se os camundongos C57BL/6 no dia 10 que foram imunizados com o peptídeo MOG35-55 com adjuvante e obtiveram seus baços. Os baços foram quebrados no êmbolo da seringa de 1 ml e passados através de um filtro de células de 40 µm. Os glóbulos vermelhos foram lisados com tampão de lise. As células foram filtradas e lavadas com meio de quimiotaxia. 1 µg/ml rmCXCL13 (R&D) foram incubados com diferentes concentrações de anticorpo anti-CXCL13 424H7F2 ou IgG de controle em temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, transfira a mistura de 150 µl/poço para o fundo de uma placa Transwell de 0,5 µm e esplenócitos de 50 µl/poço (1 × 107/ml) para a câmara superior. Incubar a placa Transwell em uma incubadora de células por 3 horas. Finalmente, descarte o filtro e adicione 1,67 µg/ml de cálcio-am a cada poço e incube mais 20 minutos. A fluorescência é medida em comprimentos de onda de 485nm e 520nm.

68 / 92

[00157] Como o resultado na Figura 6, o anticorpo monoclonal de camundongo 424H7F2 pode inibir, dependente da dose, a migração de esplenócitos de camundongo primário em direção a CXCL13 de camundongo. Exemplo 8. Eficácia in vivo da terapia de anticorpo monoclonal de camundongo anti-CXCL13 em modelo NP-CGG de camundongo

[00158] Para determinar se o anticorpo anti-CXCL13 pode mediar a inibição da função CXCL13 na formação do centro germinativo (GC) em órgãos linfoides secundários e troca de classe de isótipo por células B virgens, camundongos C57BL/6 foram imunizados com NP-CGG (100 µg/camundongo) via injeção intraperitoneal no dia 0 e injetou 30 mg/kg de anticorpo anti-CXCL13 424H7F2 ou PBS via intraperitoneal no dia -1, 2, 5, 8, 11. No dia 14, sacrifique os camundongos e analise a população de germinais células B centrais (B220+IgD-GL7+Fas+), troca de classe (B220+IgD-GL7+IgM-IgG1+) por citometria de fluxo no baço, o nível de IgG1 específico para NP5 (NP5) de alta afinidade por Elisa no soro e GC formação por coloração IHC (IgD-PNA+) no baço.

[00159] A população de células B GC foi significativamente diminuída pelo anticorpo anti-CXCL13 tratado com 424H7F2 no baço de camundongo em comparação com o grupo de controle (Figura 7A). Na Figura 7B, a população de células B IgG1 + foi reduzida nos camundongos tratados com 424H7F2, o que indicou que a troca de classe foi prejudicada pelo anticorpo anti-CXCL13. E a redução do anticorpo IgG1 específico para NP5 no soro em camundongos tratados com 424H7F2 mostrou que a maturação de afinidade do IgG1 específico para o antígeno foi bloqueada pelo anticorpo anti- CXCL13 (Figura 7C). O resultado de IHC mostrou diretamente que a formação de GCs estava seriamente prejudicada nos camundongos com tratamento com anticorpo 424H7F2 anti-CXCL13 em comparação com o grupo de controle (Figura 7D). A combinação de todos os resultados revelou que a função CXCL13 in vivo foi efetivamente bloqueada pelo anticorpo anti-

69 / 92 CXCL13 424H7F2. Exemplo 9. Mapeamento de epítopo de anticorpo anti-CXCL13 para verificar os resíduos de ligação críticos

[00160] Os resultados de ligação de epítopo mostraram que a ligação cruzada de todos os anticorpos anti-CXCL13 a cynomolgus tinha um mesmo epítopo, incluindo 64C10G1, 21H12D9, 329F2E1, 411A11E9, 71F4A3 e 1H3A11. Usamos o 64C10G1 para fazer o mapeamento de epítopos para identificar os resíduos de ligação críticos ao antígeno CXCL13. Além disso, para a triagem, um anticorpo controle foi sintetizado de acordo com a sequência em patente publicada (WO2012/031099 A2).

[00161] As células foram transfectadas com diferentes construtos em peso ou 64C10G1 Fab mutante em que cada aminoácido era mutante para alanina, no total 87 aminoácidos. Em seguida, a ligação do Fab de teste a cada clone mutante na biblioteca de varredura de alanina foi determinada, em duplicata, por citometria de fluxo de alto rendimento. Para cada ponto, a fluorescência de fundo foi subtraída dos dados brutos, que foram então normalizados para reatividade Fab com a proteína alvo WT. Para cada clone mutante, o valor médio de ligação foi traçado como uma função da expressão (representada pela reatividade de controle). Para identificar os clones críticos primários preliminares (círculos vermelhos), foi aplicado um limite (linhas tracejadas) de> 70% em peso de ligação ao Ab controle e <20% em peso de ligação ao Fab de teste.

[00162] Como mostrado na Figura 8A, os clones mutantes no canto inferior direito (círculos vermelhos) atendem aos limites estabelecidos, cuja mutação foi negativa para ligação a Fab 64C10G1, mas positiva para ligação a Fabs de controle, incluindo F20, P22, R24 e F25 (Tabela 6), que indicou que esses resíduos eram críticos para a ligação do Fab 64C10G1. Nós desenhamos o diagrama da estrutura cristalina na Figura 8B, e os resíduos críticos para a ligação do Fab 64C10G1 foram visualizados e mostrados nesta

70 / 92 estrutura cristalina. Tabela 6: Identificação de resíduos críticos para ligação de Fab 64C10G1 Reatividade de ligação (% em peso) Mutação 64C10G1 Fab Controle Fab F20A 9,4 (2) 109,9 (1) P22A 14,8 (1) 97,4 (12) R24A -3,3 (1) 88,0 (10) F25A -3,2 (0) 127,3 (1) Exemplo 10. Humanização de mAb de camundongo e determinação de afinidade A. 21H12D9

[00163] Os genes da região variável do anticorpo de camundongo 21H12D9 foram empregados para criar um MAb humanizado. Na primeira etapa deste processo, as sequências de aminoácidos de VH e VK de 21H12D9 foram comparadas com o banco de dados disponível de sequências de genes de Ig humana para identificar as sequências gerais de genes de Ig da linha germinativa humana mais correspondentes. Para a cadeia pesada, a correspondência humana mais próxima foi o gene IGHV1-2*02. Para a cadeia leve, a melhor combinação humana foi o gene IGKV1-12*01.

[00164] Sequências de domínio variável humanizado foram então projetadas onde as sequências de CDR1-3 do VH de 21H12D9 foram enxertadas em sequências de estrutura do gene IGHV1-2*02 e a CDR1-3 da cadeia leve de 21H12D9 foram enxertadas em sequências de estrutura de gene IGKV1-12*01. E então um aceitador humano de cadeia VH do anticorpo anti-Sm pir||S49530 (VH1/DK1 ou DM1/JH4b) - humana foi selecionado para enxerto de CDR para obter VH1 humanizado. A região variável de cadeia pesada de imunoglobulina G AIT38653.1 parcial [Homo sapiens] foi selecionada para enxerto de CDR para obter VL1 humanizado. Um modelo 3D foi então gerado para determinar se havia quaisquer posições estruturais em que a substituição do aminoácido de camundongo pelo aminoácido humano pudesse afetar a ligação e/ou a conformação de CDR. No caso da cadeia pesada, K12, V20, M48, V68, M70, R72, S77 e V112 (numeração

71 / 92 Kabat) na estrutura humana foram identificados e submetidos a mutações reversas em seu aminoácido homólogo moue, ou seja: K12V, V20M, M48I, V68A, M70L, R72V, S77G e V112L. No caso da cadeia leve, A13, L78 (numeração de Kabat) na estrutura humana foi identificado e submetido a mutação reversa em seu aminoácido moue equivalente, isto é: A13T, L78V. Tabela 7. Sequências e CDRs de anticorpos de camundongo 21H12D9 Cadeia ou Sequências (CDR sublinhado e negrito) SEQ ID domínio de NO: anticorpo 21H12D9 -VH EVQLQQSGPVLVRPGASVKMSCKASGYTFT DYYMN 95

WVKQSHGKSLEWIG V INPNNGGTTYKEKFKG KATLTVDKSSGTAYMELNSLTSEDSAVYYCAR DD

YDAGY WGQGTTLTVSS 21H12D9 -VL DIVMTQFQKFMSTTVGDRVSITC KASQNVDTAVA 96

WYQHKPGQSPKLLIY S ASHRYT GVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFC QQYTDFPLT FGA

GTKLELK CDRH1 DYYMN 97 CDRH2 VINPNNGGTTYKEKFKG 98 CDRH3 DDYDAGY 99 CDRL1 KASQNVDTAVA 100 CDRL2 SASHRYT 101 CDRL3 QQYTDFPLT 102

[00165] As sequências humanizadas estão listadas na Tabela 8: 21H12D9-VH1 e 21H12D9-VL1 são sequências totalmente humanizadas e 21H12D9-VH2, 21H12D9-VH3, 21H12D9-VH4, 21H12D9-VL2, 21H12D9- VL3 são sequências com mutações reversas diferentes. Tabela 8. Sequências humanizadas Cadeia Sequências (mutações reversas em negrito e sublinhado) SE de Q anticorp ID os NO : 21H12D9 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEW 103 -VH1 MGV

INPNNGGTTYKEKFKGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDD

YDAGYWGQGTLVTVSS 21H12D9 QVQLVQSGAEV V KPGASVKVSCKAS GYTFTDYYMN 104 -VH2 WVRQAPGQGLEWMGV

INPNNGGTTYKEKFKGRVTMT V DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDD YDAGYWGQGTLVTVSS

72 / 92 21H12D9 QVQLVQSGAEV V KPGASVKVSCKAS GYTFTDYYMN 105 -VH3 WVRQAPGQGLEW I GV

INPNNGGTTYKEKFKGR A T L T V DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDD

YDAGYWGQGTLVTVSS 21H12D9 QVQLVQSGAEV V KPGASVK M SCKAS GYTFTDYYMN 106 -VH4 WVRQAPGQGLEW I GV

INPNNGGTTYKEKFKGR A T L T V DTSI G TAYMELSRLRSDDTAVYYCARDD

YDAGYWGQGTL L TVSS 21H12D9 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQNVDTAVAWYQQKPGKAPKLLIYS 107 -VL1 ASHRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYTDFPLTFGQ

GTRLEIK 21H12D9 DIQMTQSPSSVS T 108 -VL2 SVGDRVTITCKASQNVDTAVAWYQQKPGKAPKLLIYS

ASHRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYTDFPLTFGQ

GTRLEIK 21H12D9 DIQMTQSPSSVS T 109 -VL3 SVGDRVTITCKASQNVDTAVAWYQQKPGKAPKLLIYS

ASHRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS V QPEDFATYYCQQYTDFPLTFGQ

GTRLEIK B. 64C10G1

[00166] Os genes da região variável 64C10G1 do anticorpo de camundongo foram empregados para criar um MAb humanizado. No primeiro passo deste processo, as sequências de aminoácidos de VH e VK de 64C10G1 foram comparadas com a base de dados disponível de sequências de genes de Ig humana para encontrar as sequências gerais de genes de Ig da linha germinativa humana com melhor correspondência. Para a cadeia pesada, a correspondência humana mais próxima foi o gene IGHV3-7*01. Para a cadeia leve, a correspondência humana mais próxima foi o gene IGKV1-33*01. As sequências de domínio variável humanizadas foram então projetadas onde as sequências de CDR1-3 do VH de 64C10G1 foram enxertadas em sequências de estrutura do gene IGHV3-7*01 e a CDR1-3 da cadeia leve de 64C10G1 foram enxertadas em sequências de estrutura do gene IGKV1-33*01. E então um aceitador humano AAV48954.1: região variável de cadeia pesada de imunoglobulina 8B3 do anticorpo antipneumocócico, parcial [Homo sapiens] foi selecionado para enxerto de CDR para obter VH1 humanizado. ACY78416.1: região variável de cadeia leve kappa de imunoglobulina, parcial [Homo sapiens] foi selecionada para enxerto de CDR para obter VL1 humanizado. Um modelo 3D foi então gerado para determinar se havia

73 / 92 quaisquer posições estruturais em que a substituição do aminoácido de camundongo pelo aminoácido humano pudesse afetar a ligação e/ou a conformação de CDR. No caso da cadeia leve, Y49, V58, F71, I83 (numeração de Kabat) em estrutura humana foi identificado e submetido a mutação reversa em seu aminoácido homólogo moue, isto é: Y49H, V58I, F71Y, I83F. Tabela 9. Sequências de anticorpo de camundongo 64C10G1 e CDRs Cadeia ou

SEQ ID domínio de Sequências (CDR sublinhado e negrito) NO: anticorpo

EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFS SYAMS

WVRQTPEKRLEWVA T 64C10G1 -VH ISDGGSDAYYPDNVKG 110

RFTISRDNAKNNLYLQMSHLKSEDTAMYYCAR DY YGSGYEDSPMDY WGQGTSVTVSS DIQMTQSPSSLSASLGGKVTITC KASQDINKYIA

WYQHKPGKGPRLLIH Y 64C10G1 -VL TSTLQP GIPSRFSGSGSGRDYSFSISNLEPEDFATYYC 111

LQYDNLYT FGGG

TKLEIK CDRH1 SYAMS 112 CDRH2 TISDGGSDAYYPDNVKG 113 CDRH2 TISEGGSDAYYPDNVKG 114 (PTM) CDRH3 DYYGSGYEDSPMDY 115 CDRH3 DYYGSGYEESPMDY 116 (PTM) CDRL1 KASQDINKYIA 117 CDRL2 YTSTLQP 118 CDRL3 LQYDNLYT 119

[00167] As sequências humanizadas estão listadas na Tabela 10: 64C10G1-VH1 e 64C10G1-VL1 são sequências totalmente humanizadas, 64C10G1-VL2, 64C10G1-VL3 são sequências com diferentes mutações reversas. Tabela 10. Sequências humanizadas

SE Cadeia

Q de Sequências (mutações reversas em negrito e sublinhado) ID anticorp

NO os :

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEW

VAT 64C10G1 ISDGGSDAYYPDNVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR 120 -VH1

DY YGSGYEDSPMDYWGQGTLVTVSS

74 / 92

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINKYIAWYQQKPGKAPKLLIY 64C10G1 Y 121 -VL1 TSTLQPGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCLQYDNLYTFGGG

TKLEIK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINKYIAWYQQKPGKAPKLLI H

Y 64C10G1 TSTLQPGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPED F 122 -VL2

ATYYCLQYDNLYTFGGG TKLEIK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINKYIAWYQQKPGKAPKLLI H

Y 64C10G1 TSTLQPG I PSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPED F 123 -VL3

ATYYCLQYDNLYTFGGG TKLEIK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINKYIAWYQQKPGKAPKLLI H

Y 64C10G1 TSTLQPG I PSRFSGSGSGTD Y TFTISSLQPED F 124 -VL4

ATYYCLQYDNLYTFGGG

TKLEIK C. 71F4A3

[00168] Os genes da região variável do anticorpo de camundongo 71F4A3 foram empregados para criar um MAb humanizado. No primeiro passo deste processo, as sequências de aminoácidos do VH e VK de 71F4A3 foram comparadas com a base de dados disponível de sequências de genes de Ig humana para encontrar as sequências gerais de genes de Ig da linha germinativa humana que melhor correspondem. Para a cadeia pesada, a correspondência humana mais próxima foi o gene IGHV3-7*01. Para a cadeia leve, a correspondência humana mais próxima foi o gene IGKV1-33*01. As sequências de domínio variável humanizadas foram então projetadas onde as sequências de CDR1-3 do VH de 71F4A3 foram enxertadas em sequências de estrutura do gene IGHV3-7*01 e a CDR1-3 da cadeia leve de 71F4A3 foram enxertadas em sequências de estrutura gene de IGKV1-33*01. E então um aceitador humano AAA18280.1: região variável de cadeia pesada de imunoglobulina, parcial [Homo sapiens] foi selecionado para enxerto de CDR para obter VH1 humanizado. ACY78416.1: região variável de cadeia leve kappa de imunoglobulina, parcial [Homo sapiens] foi selecionada para enxerto de CDR para obter VL1 humanizado. Um modelo 3D foi então gerado para determinar se havia quaisquer posições estruturais em que a substituição do aminoácido de camundongo pelo aminoácido humano pudesse

75 / 92 afetar a ligação e/ou a conformação de CDR. No caso da cadeia pesada, E5, V47, A48, L85 (numeração de Kabat) na estrutura humana foi identificado e sujeito a mutação reversa em seu aminoácido moue homólogo, ou seja: E5Q, V47I, A48G, L85V. No caso da cadeia leve, L78 (numeração de Kabat) na estrutura humana foi identificada e submetida a mutação reversa em seu aminoácido equivalente moue, isto é: L78V. Tabela 11. Sequências de anticorpo de camundongo 71F4A3 e CDRs Cadeia ou

SEQ ID domínio de Sequências (CDR sublinhado e negrito) NO: anticorpo

EVKLLQSGGGLVQPGGSLKLSCAASGIDFS RYWMS

WVRRAPGKGLEWIG E 71F4A3 -VH INPDSSTINYAPSLKD 125

KFIISRDNAKNTLYLQMSKVRSEDTALYYCAR QD DYEYYAMDY WGQGTSVTVSS DIVMTQSHKSMSTSVGDRVSITC KASQDVNTGVA

WYRQKPGQSPKLLIY S 71F4A3 -VL ASYRYT GVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYC 126

QQYYSTPLT FGA

GTKLELK CDRH1 RYWMS 127 CDRH2 EINPDSSTINYAPSLKD 128 CDRH2 EINPESSTINYAPSLKD 129 (PTM) CDRH3 QDDYEYYAMDY 130 CDRL1 KASQDVNTGVA 131 CDRL2 SASYRYT 132 CDRL3 QQYYSTPLT 133

[00169] As sequências humanizadas estão listadas na Tabela 12: 71F4A3-VH1 e 71F4A3-VL1 são sequências totalmente humanizadas, 71F4A3-VH2, 71F4A3-VH3, 71F4A3-VH4, 71F4A3-VL2 são sequências com diferentes mutações reversas. Tabela 12 . Sequências humanizadas

SE Cadeia

Q de Sequências (mutações reversas em negrito e sublinhado) ID anticorp

NO os :

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGIDFSRYWMSWVRQAPGKGLEW

VAEI 71F4A3- NPDSSTINYAPSLKDRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQD 134 VH1

D YEYYAMDYWGQGTTVTVSS EVQLV Q SGGGLVQPGGSLRLSCAAS GIDFSRYWMS

WVRQAPGKGLEWVA EI 71F4A3- NPDSSTINYAPSLKD RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR 135 VH2

QDD YEYYAMDY WGQGTTVTVSS

76 / 92

EVQLV Q SGGGLVQPGGSLRLSCAAS GIDFSRYWMS

WVRQAPGKGLEWV G EI 71F4A3- NPDSSTINYAPSLKD RFTISRDNAKNSLYLQMNS V RAEDTAVYYCAR 136 VH3

QDD YEYYAMDY WGQGTTVTVSS EVQLV Q SGGGLVQPGGSLRLSCAAS GIDFSRYWMS

WVRQAPGKGLEW IG EI 71F4A3- NPDSSTINYAPSLKD RFTISRDNAKNSLYLQMNS V RAEDTAVYYCAR 137 VH4

QDD YEYYAMDY WGQGTTVTVSS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC KASQDVNTGVA

WYQQKPGKAPKLLIY S 71F4A3- ASYRYT GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC QQYYSTPLT 138 VL1

FGG GTKLEIK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC KASQDVNTGVA

WYQQKPGKAPKLLIY S 71F4A3- ASYRYT GVPSRFSGSGSGTDFTFTISS V QPEDIATYYC QQYYSTPLT 139 VL2

FGG

GTKLEIK D. 411A11E9

[00170] Os genes da região variável do anticorpo de camundongo 411A11E9 foram empregados para criar um MAb humanizado. No primeiro passo deste processo, as sequências de aminoácidos de VH e VK de 411A11E9 foram comparadas com a base de dados disponível de sequências de genes de Ig humana para identificar as sequências gerais de genes de Ig da linha germinativa humana com melhor correspondência. Para a cadeia pesada, a correspondência humana mais próxima foi o gene IGHV3-7*01. Para a cadeia leve, a melhor combinação humana foi o gene IGKV1-17*01.

[00171] Sequências de domínio variável humanizado foram então projetadas onde as sequências de CDR1-3 de 411A11E9 VH foram enxertadas em sequências de estrutura do gene IGHV3-7*01 e a CDR1-3 da cadeia leve de 411A11E9 foram enxertadas em sequências de estrutura de Gene IGKV1-17*01. E então um aceitador humano ACS96177.1 região variável de cadeia pesada de imunoglobulina, parcial [Homo sapiens] foi selecionado para enxerto de CDR para obter VH1 humanizado. A região variável de cadeia leve kappa da imunoglobulina AAZ09050.1, parcial [Homo sapiens] foi selecionada para enxerto de CDR para obter VL1 humanizado. Um modelo 3D foi então gerado para determinar se havia quaisquer posições estruturais em que a substituição do aminoácido de

77 / 92 camundongo pelo aminoácido humano pudesse afetar a ligação e/ou a conformação de CDR. No caso da cadeia pesada, A24, I70, R98, T105 (numeração de Kabat) na estrutura humana foi identificado e submetido a mutações reversas em seu aminoácido homólogo moue, ou seja: A24V, I70V, R98T, T105A. No caso da cadeia leve, V58, F71, Y87 (numeração de Kabat) na estrutura humana foi identificado e sujeito a mutação reversa em seu aminoácido moue homólogo, isto é: V58I, F71Y, Y87F. Tabela 13. Sequências de anticorpo de camundongo 411A11E9 e CDRs Cadeia ou

SEQ ID domínio de Sequências (CDR sublinhado e negrito) NO: anticorpo

EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCVVSGFTFS DYYMA

WVRQTPTKGLEWVA S 411A11E9 -VH INYDGGDTYYRDSVKG 140

RFTVSRNNAKSSLFLQMDSLRSEDTATYYCKT EE DYDGSYVMDA WGQGASVIVSS DIQMTQSPSFLSASVGDRVTISC KASQNINKELT

WYQQKLGKAPKRLIY N 411A11E9 -VL TNILQT GIPSRFSGSGSNTDYTLTISSLQPEDFATYFC 141

LQQSSLYT FGAG

TKLELK CDRH1 DYYMA 142 CDRH2 SINYDGGDTYYRDSVKG 143 CDRH3 EEDYDGSYVMDA 144 CDRL1 KASQNINKELT 145 CDRL2 NTNILQT 146 CDRL3 LQQSSLYT 147

[00172] As sequências de humanizados são listados na Tabela 14: 411A11E9-VH1 e 411A11E9-VL1 são totalmente humanizados sequências e 411A11E9-VH2, 411A11E9-VH3, 411A11E9-VH4, 411A11E9-VL2, 411A11E9-VL3, 411A11E9-VL4 são sequências com mutação de volta diferente. Tabela 14. Sequências humanizadas

SE Cadeia

Q de Sequências (mutações reversas em negrito e sublinhado) ID anticorpo

NO s :

78 / 92

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMAWVRQAPGKGLEWV

AS 411A11E INYDGGDTYYRDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARE 148 9 -VH1

E DYDGSYVMDAWGQGTLVTVSSGS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFSDYYMA

WVRQAPGKGLEWVA S 411A11E INYDGGDTYYRDSVKG RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCA T 149 9 -VH2

EE DYDGSYVMDA WGQGTLVTVSSGS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA V S GFTFSDYYMA

WVRQAPGKGLEWVA S 411A11E INYDGGDTYYRDSVKG RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCA T 150 9 -VH3

EE DYDGSYVMDA WGQGTLVTVSSGS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA V S GFTFSDYYMA

WVRQAPGKGLEWVA S 411A11E INYDGGDTYYRDSVKG RFT V SRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCA 151 9 -VH4

T EE DYDGSYVMDA WGQG A LVTVSSGS

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNINKELTWYQQKPGKAPKRLIYN 411A11E TNILQTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQQSSLYTFGQG 152 9-VL1

TKLEIK

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC KASQNINKELT WYQQKPGKAPKRLIY 411A11E N 153 9-VL2 TNILQT GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATY F C LQQSSLYT FGQG

TKLEIK

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC KASQNINKELT WYQQKPGKAPKRLIY 411A11E N 154 9-VL3 TNILQT G I PSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATY F C LQQSSLYT FGQG

TKLEIK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC KASQNINKELT WYQQKPGKAPKRLIY

N 411A11E TNILQT G I PSRFSGSGSGTE Y TLTISSLQPEDFATY F C LQQSSLYT 155 9-VL4

FGQG TKLEIK

[00173] Os genes VH e VL humanizados foram produzidos sinteticamente como Fab humanizado e, em seguida, respectivamente clonados em vetores contendo os domínios constantes gama 1 e kappa humano. VH e VK humanizados foram emparelhados para produzir Fabs e, em seguida, purificados para classificação de taxa de desaceleração adicional (Tabela 15) e teste de afinidade. Tabela 15. Classificação taxa de desaceleração por Biacore Fabs ka (1 / Ms) kd (1 / s) KD (M) 411A11E9-Quimérico 4050000 0,00287 7,08E-10 411A11E9-VH1VL1 12500000 0,013 1,04E-09 411A11E9-VH1VL2 78200 0,00114 1,45E-08 411A11E9-VH1VL3 523000 0,00176 3,37E-09 411A11E9-VH1VL4 346000 0,00063 1,82E-09 411A11E9-VH2VL1 2370000 0,00283 1,19E-09 411A11E9-VH2VL2 2580000 0,00271 1,05E-09 411A11E9-VH2VL3 2360000 0,00335 1,42E-09 411A11E9-VH2VL4 1660000 0,00105 6,34E-10

79 / 92 411A11E9-VH3VL1 2290000 0,00242 1,06E-09 411A11E9-VH3VL2 1780000 0,00163 9,19E-10 411A11E9-VH3VL3 2050000 0,00207 1,01E-09 411A11E9-VH3VL4 2190000 0,00109 4,98E-10 411A11E9-VH4VL1 2730000 0,00281 1,03E-09 411A11E9-VH4VL2 2080000 0,00196 9,44E-10 411A11E9-VH4VL3 2140000 0,00266 1,24E-09 411A11E9-VH4VL4 1740000 0,00107 6,11E-10 71F4A3-quimérico 3300000 0,00184 5,56E-10 71F4A3-VH3VL1 2140000 0,000987 4,62E-10 71F4A3-VH1VL1 (Hz71F4) 3200000 0,00136 4,26E-10 71F4A3-VH1VL2 2850000 0,00147 5,16E-10 71F4A3-VH2VL1 1950000 0,00108 5,54E-10 71F4A3-VH2VL2 2250000 0,00137 6,07E-10 71F4A3-VH3VL2 2500000 0,00139 5,57E-10 71F4A3-VH4VL1 1700000 0,001 5,9E-10 71F4A3-VH4VL2 2570000 0,00136 5,3E-10 21VH12D9-quimérico 1170000 0,00139 1,18E-09 21VH12D9-VH1VL2 380000 0,000757 1,99E-09 21VH12D9-VH2VL2 414000 0,000802 1,94E-09 21VH12D9-VH1VL3 584000 0,000975 1,67E-09 21VH12D9-VH2VL1 570000 0,000991 1,74E-09 21VH12D9-VH2VL3 501000 0,000992 1,98E-09 21VH12D9-VH4VL1 618000 0,00107 1,73E-09 21VH12D9-VH4VL2 742000 0,00114 1,54E-09 21VH12D9-VH4VL3 729000 0,00116 1,59E-09 21VH12D9-VH3VL1 744000 0,00131 1,76E-09 21VH12D9-VH3VL2 940000 0,00138 1,47E-09 21VH12D9-VH3VL3 1410000 0,00207 1,47E-09 21VH12D9-VH1VL1 2420000 0,00323 1,33E-09 64C10G1-quimérico 2680000 0,00218 8,14E-10 64C10G1-VH1VL3 1820000 0,00543 2,98E-09 64C10G1-VH1VL4 1940000 0,00713 3,68E-09 64C10G1-VH1VL1 4330000 0,0255 5,89E-09 64C10G1-VH1VL2 2690000 0,00515 1,92E-09

[00174] Entre todas as amostras de Fab humanizado, 71F4A3- VH2VL1, 71F4A3-VH1VL1 (Hz71F4), 71F4A3-VH1VL2, 71F4A3- VH3VL1, 411A11E9-VH1VL4, 411A11E9-VH3VL4, 411A11E9-VH2VL4, 411A11E9-VH3VL2, 411A11E9-VH1VL2, 21H12D9- VH1VL1, 21H12D9- VH2VL2, 21H12D9-VH3VL3, 21H12D9-VH1VL2, 64C10G1-VH1VL3, 64C10G1-VH1VL4, 64C10G1-VH1VL1, 64C10G1-VH1K2 foram selecionados para teste de afinidade Bia1V. HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, Tween-20 0,05%, pH 7,4 serviram como tampão de corrida e glicina-HCl 10 mM, pH 2,0 serviram como tampão de regeneração. A proteína CXCL13 foi imobilizada no Sensor Chip CM5 usando o método de acoplamento de amina (nível de imobilização ~ 250RU). As concentrações

80 / 92 em série de Fab (0-20nM) foram injetadas sobre CXCL13 imobilizado na vazão de 30 µl/min. As fases de dissociação foram 600s. Os resultados são mostrados na Tabela 16 abaixo. Tabela 16. Resultados da determinação de afinidade k a (1 / Rmax Chi² clones Fabs k d (1 / s) K D (M) Ms) (RU) (RU²) 1,70E + 71F4A3-VH2VL1 1,45E-03 8,53E-10 9 7,87E-03 06 71F4A3-VH1VL1 2,02E + 1,25E-03 6,19E-10 12 2,09E-02 (Hz71F4) 06 1,84E + 71F4A3 71F4A3-VH1VL2 1,16E-03 6,28E-10 11,1 1,80E-02 06 1,80E + 71F4A3-quimérico 1,41E-03 7,82E-10 18,5 9,61E-02 06 1,64E + 71F4A3-VH3VL1 1,53E-03 9,34E-10 11,3 1,80E-02 06 411A11E9- 2,11E + 1,56E-03 7,40E-10 29,9 3,82E-01 Quimérico 06 411A11E9- 1,86E + 1,57E-03 8,44E-10 7,3 8,06E-03 VH1VL4 06 411A11E9- 9,06E + 8,23E-04 9,08E-10 12,4 2,29E-02 VH3VL4 05 411A11E9 411A11E9- 9,53E + 8,87E-04 9,31E-10 9,5 8,33E-03 VH2VL4 05 411A11E9- 1,05E + 1,26E-03 1,20E-09 10 4,91E-03 VH3VL2 06 411A11E9- 5,70E + 1,61E-03 2,83E-09 5,4 1,76E-03 VH1VL2 05 21H12D9- 1,66E + 2,14E + 2,03E-03 1,23E-09 103,7 VH1VL1 06 00 21H12D9- 1,48E + 1,29E + 1,95E-03 1,32E-09 91,8 VH2VL2 06 00 21H12D9- 1,49E + 1,82E + 21H12D9 1,82E-03 1,22E-09 98,1 VH3VL3 06 00 21H12D9- 1,44E + 1,88E + 1,71E-03 1,19E-09 107,6 VH1VL2 06 00 21H12D9- 1,82E + 2,58E-03 1,42E-09 65,1 7,01E-01 quimérico 06 64C10G1- 2,68E + 2,18E-03 8,14E-10 16,2 1,17E-01 quimérico 06 64C10G1- 1,82E + 5,43E-03 2,98E-09 7,2 8,56E-03 VH1VL3 06 64C10G1- 1,94E + 64C10G1 7,13E-03 3,68E-09 6,5 1,06E-02 VH1VL4 06 64C10G1- 4,33E + 2,55E-02 5,89E-09 4,9 9,55E-03 VH1VL1 06 64C10G1- 2,69E + 5,15E-03 1,92E-09 6,2 1,22E-02 VH1VL2 06 Exemplo 11. Propriedades de ligação e bloqueio de Fabs humanizados anti-CXCL13

[00175] Este exemplo testou as propriedades de ligação e bloqueio em

81 / 92 ensaio de bloqueio baseado em células dos anticorpos anti-CXCL13 humanizados para proteínas CXCL13.

[00176] Para avaliar as atividades de ligação e bloqueio de Fabs humanizados, o 71F4A3H e o 64C10G1H foram submetidos ao teste de ligação ELISA e ensaios de bloqueio baseados em células. O EC50 e o IC50 estão resumidos na Tabela 17, o que demonstra que a potência da atividade de ligação para 71F4A3, 64C10G1 humanizado é melhor do que a dos anticorpos quiméricos. A potência da atividade de bloqueio, em comparação com sua contraparte quimérica, o 71F4A3 humanizado diminuiu cerca de 2 vezes, e o 64C10G1 humanizado manteve a potência de bloqueio em comparação com sua contraparte quimérica. Tabela 17. Propriedades de ligação e bloqueio para Fabs humanizados EC50 IC50 Fabs humanizados (nM) (nM) 71F4A3-quimérico (Fab) 1,488 5,073 71F4A3-VH2VL1 (Fab) 0,8186 10,46 71F4A3-VH1VL1 71F4A3 (Hz71F4) (Fab) 0,974 11,19 71F4A3-VH1VL2 (Fab) 1,178 10,73 71F4A3-VH3VL1 (Fab) 0,5745 11,27 64C10G1-quimérico (Fab) 1,7 07 7,224 64C10G1-VH1VL1 (Fab) 1,291 7,793 64C10G1 64C10G1-VH1VL2 (Fab) 1,23 7,022 64C10G1-VH1VL3 (Fab) 1,072 7,693 64C10G1-VH1VL4 (Fab) 0,7842 6,878 Exemplo 12. Propriedades funcionais de Fabs de remoção de PTM humanizado anti-CXCL13

[00177] Bloqueio de sinalização IP1 induzida por CXCL13. Para evitar envolver muitos locais de mutação e com base nos resultados de ligação Elisa e bloqueio baseado em células, escolhemos a sequência 64C10G1- VH1VL2, 64C10G1-VH1VL3, 71F4A3-VH1VL1 (Hz71F4), 71F4A3- VH1VL2 para remover PTM (Pós-tradução modificação) local, as posições mutantes de 64C10G1 foram D53E e D107E no VH, para 71F4A3, a posição mutante foi D54E no VH, e verifique ainda mais no ensaio IP1 que foi mencionado anteriormente.

[00178] Como mostrado na Figura 9A, embora a atividade de bloqueio

82 / 92 das variantes 64C10G1 humanizadas fosse menor do que o anticorpo quimérico, o anticorpo de remoção 64C10G1-VH1VL2 (D53E, D107E) PTM foi ligeiramente melhor do que outras variantes humanizadas. Na Figura 9B, a atividade de inibição de 71F4A3-VH1VL1 (Hz71F4) (D54E) é melhor do que outras variantes humanizadas e comparável com o anticorpo quimérico.

[00179] Bloqueio da migração de células da tonsila humana primária em direção a CXCL13 humana. Com base nos resultados do ensaio IP1, avaliamos o efeito de 64C10G1-VH1VL2, 64C10G1-VH1VL2 (D53E, D107E), 71F4A3-VH1VL1 (Hz71F4) e 71F4A3-VH1VL1 (Hzil71F4) (D54E) de migração de células humanas primárias.

[00180] Podemos ver na Figura 10, ambos 64C10G1-VH1VL2 (D53E, D107E) e 71F4A3-VH1VL1 (Hz71F4) (D54E) podem bloquear dependente da dose CXCL13 humana induziu a migração de células da tonsila humana primária. E a capacidade de inibição era comparável. Exemplo 13. Propriedades de ligação de IgGs humanizados de comprimento total anti-CXCL13 com remoção de PTM

[00181] Este exemplo testou as propriedades de ligação dos anticorpos anti-CXCL13 humanizados às proteínas huCXCL13 e cynoCXCL13.

[00182] Para avaliar as atividades de ligação de anticorpos humanizados, o 71F4A3-VH1VL1 (Hz71F4), 71F4A3-VH1VL2, 64C10G1- VH1VL2, 64C10G1-VH1VL3 foram produzidos sinteticamente como IgG1 humanizado de comprimento total contendo os domínios constantes de gama 1 humano e kappa humano com remoção de PTM no VH para aumentar a estabilidade do anticorpo. Para 71F4A3, a posição mutante era D54E, e para 64C10G1, as posições mutantes eram D53E, D107E. A ligação cruzada a huCXCL13 e cynoCXCL13 foi testada por ensaios de ligação ELISA. Os resultados são resumidos na Figura 11, que demonstra que a potência de ligação a huCXCL13 e cynoCXCL13 para 71F4A3-VH1VL1 humanizado (Hz71F4) (D54E) e 71F4A3-VH1VL2 (D54E) são comparáveis com o

83 / 92 quimérico 71F4A3 64C10G1, mas a potência de ligação para 64C10G1 humano -VH1VL2 (D53E, D107E) e 64C10G1-VH1VL3 (D53E, D107E) são eliminados significativamente ao comparar com sua contraparte quimérica. Exemplo 14. Potência de bloqueio de IgGs humanizados de comprimento total anti-CXCL13 com remoção de PTM

[00183] Bloqueio de sinalização IP1 induzida por CXCL13. Para avaliar a potência de bloqueio desses anticorpos humanizados, os anticorpos 71F4A3-VH1VL1 (Hz71F4), 64C10G1-VH1VL2 foram produzidos sinteticamente como IgG1 humanizado de comprimento total com a posição mutante de D54E (Tabela 18) e D53E, D107E (Tabela 18a), respectivamente. A atividade de bloqueio foi avaliada no ensaio IP1 que foi induzido por CXCL13 humano.

[00184] Os resultados estão resumidos na FIG. 12, o que demonstra que 71F4A3-VH1VL1 (Hz71F4) e 64C10G1-VH1VL2 humanizados poderiam bloquear efetivamente a sinalização IP. E a potência de bloqueio de ambos foi comparável com o quimérico 71F4A3, 64C10G1. Exemplo 15. Otimização de Afinidade dos Anticorpos Humanizados

[00185] Foi contemplado que certos resíduos de aminoácidos dentro das regiões CDR ou das regiões estruturais poderiam ser alterados para melhorar ou reter a atividade e/ou estabilidade dos anticorpos. Com uma ferramenta computacional (VectorNTI, disponível em www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalo/), no que se refere às suas propriedades estruturais, conformacionais e funcionais, as variantes foram projetadas com duas abordagens diferentes.

[00186] Na primeira abordagem, as mutações foram escolhidas para direcionar os pontos de acesso em LCDR1, HCDR2 e HCDR3. Pontos quentes em CDRs foram identificados, conforme mostrado na Tabela 18. Normalmente, CDR3 contribui mais para a ligação ao antígeno e a cadeia pesada é mais importante do que a cadeia leve para a ligação ao antígeno.

84 / 92 Além disso, LCDR1 é importante para a ligação ao antígeno. Para o primeiro ensaio, as mutações aleatórias foram direcionadas para pontos de acesso em LCDR1, HCDR2 e HCDR3. Elimine pontos de acesso que codificam para aminoácidos conservados e ocultos em CDRs. Os CDRs restantes com pontos de acesso são mutados aleatoriamente: HCDR2 (3 aminoácidos: 55S, 56S, 57T), HCDR3 (2 aminoácidos: 103E, 104Y), LCDR1 (3 aminoácidos: 32G, 34A, 36Y). Depois de terminar a construção da biblioteca de fagos, a triagem do antígeno CXCL13 foi seguida. Os aminoácidos mutados que poderiam melhorar o Kon estão listados na Tabela 19. As sequências de clones principais que têm maior Kon para CXCL13 humano estão listadas na Tabela

20. Os anticorpos dessas sequências foram gerados e o teste de afinidade foi realizado por Biacore T200. Os resultados estão listados na Tabela 21. Tabela 18. Mutações visando em pontos de acesso de 71F4A3 (com D54E) Cadeia de Sequências (CDRs sublinhados e mutações direcionadas em SEQ anticorpos negrito e sublinhado duplo) ID NO:

EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGIDFS RYWMS 71F4A3-VH WVRQA PGKGLEWVA E INPE SST INY APSLKD RFTI 156 (D54E) SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAR QD DY EY

YAMDY W GQGTTVTVSS

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC KASQDVN T G V A W Y 71F4A3-VL QQKP GKAPKLLIY S ASYRYT GVPS RFSGSGSGTD 138

FTFTISSLQP EDIATYYC QQ YYSTPLT FGG GTKLEIK Tabela 18a 64C10G1-VH1VL2 com mutações D53E e D107E Cadeia de SEQ ID NO: anticorpos Sequências (mutações em negrito e sublinhado)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQA 64C10G1 - PGKGLEWVAT VH1 IS E 157 (D53E, GGSDAYYPDNVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAV D107E) YYCARDY

YGSGYE E SPMDYWGQGTLVTVSS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINKYIAWYQQKPG

KAPKLLIYY 64C10G1- TSTLQPGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCLQYDN 121 VL1

LYTFGGG

TKLEIK Tabela 19. Mutações em 71F4A3 úteis para melhorar a ligação Resíduo Substituído por VH-55 S A, G, R ou T VH-56S K, T ou N VH-57T S, W, F, L, G, Y ou I

85 / 92 VH-103E S, T, L, R, W ou D VH-104Y H, T, N, V ou K VL-32G UMA, VL-34A S, T, D, VL-36Y S, F, Tabela 20. Clones de chumbo de 71F4A3 Cadeia de Sequências SEQ anticorpos ID NO: 71F4A3-BC1-VH EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGIDFS RYWMSWVRQA 158

PGKGLEWVAE INPEA SSI NY APSLKDRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARQD DY SH YAMDYW

GQGTTVTVSS 71F4A3-BC1-VL DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVN T G V S W S 159

QQKP GKAPKLLIYS ASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP

EDIATYYCQQ YYSTPLTFGG GTKLEIK 71F4A3-BC4-VH EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGIDFS RYWMSWVRQA 160

PGKGLEWVAE INPEA GKW NY APSLKDRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARQD DYTTYAMDYW

GQGTTVTVSS 71F4A3-BC4-VL DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVN T G V S W Y 161

QQKP GKAPKLLIYS ASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP

EDIATYYCQQ YYSTPLTFGG GTKLEIK 71F4A3-BE3-VH EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGIDFS RYWMSWVRQA 162

PGKGLEWVAE INPE SST INY APSLKDRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARQD DY LT YAMDYW

GQGTTVTVSS 71F4A3-BE3-VL DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVN T A V D W F 163

QQKP GKAPKLLIYS ASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP

EDIATYYCQQ YYSTPLTFGG GTKLEIK 71F4A3-BD12- EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGIDFS RYWMSWVRQA 164

VH PGKGLEWVAE INPE TTI INY APSLKDRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARQD DY RH YAMDYW

GQGTTVTVSS 71F4A3-BD12-VL DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVN T G V A W F 165

QQKP GKAPKLLIYS ASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP

EDIATYYCQQ YYSTPLTFGG GTKLEIK 71F4A3-4H1-VH EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGIDFS RYWMSWVRQA 166

PGKGLEWVAE INPE STL INY APSLKDRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARQD DY RN YAMDYW

GQGTTVTVSS 71F4A3-4H1-VL DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVN T G V S W F 167

QQKP GKAPKLLIYS ASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP

EDIATYYCQQ YYSTPLTFGG GTKLEIK 71F4A3-5A4-VH EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGIDFS RYWMSWVRQA 168

PGKGLEWVAE INPE STG INY APSLKDRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARQD DY WT YAMDYW GQGTTVTVSS

86 / 92 71F4A3-5A4-VL DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVN T A V S W T 169

QQKP GKAPKLLIYS ASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP

EDIATYYCQQ YYSTPLTFGG GTKLEIK 71F4A3-3F12-VH EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGIDFS RYWMSWVRQA 170

PGKGLEWVAE INPE SNF INY APSLKDRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARQD DY SV YAMDYW

GQGTTVTVSS 71F4A3-3F12-VL DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVN T G V T W F 171

QQKP GKAPKLLIYS ASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP

EDIATYYCQQ YYSTPLTFGG GTKLEIK 71F4A3-B12-VH EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGIDFS RYWMSWVRQA 172

PGKGLEWVAE INPE RNY INY APSLKDRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARQD DY DK YAMDYW

GQGTTVTVSS 71F4A3-B12-VL DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVN T G V T W Y 173

QQKP GKAPKLLIYS ASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP

EDIATYYCQQ YYSTPLTFGG GTKLEIK Tabela 21. Resultados de Kon para clones principais Amostras ka (1 / Ms) 71F4-BC1 2,09E + 06 71F4-BC4 3,62E + 05 71F4-BE3 1,03E + 06 71F4-BH2 1,44E + 06 71F4-4H1 1,64E + 07 71F4-5A4 6,58E + 06 71F4-3F12 6,30E + 06 71F4-4B12 5,36E + 06 71F4-BD12 1,90E + 06 hz71F4 3,77E + 05

[00187] Na segunda abordagem, as mutações foram realizadas por várias bibliotecas, incluindo 4 sub-bibliotecas diferentes, como bibliotecas de mutação saturada pelo deslocamento CDR para CDR L1, CDR L3, CDR H3 ou CDR L2, CDR H1, CDR H2 e mutação saturada bibliotecas por três aa mutados continuamente para CDR H3 ou CDR L3. Os CDRs foram identificados de acordo com o método AbM por abYsis 3 (http://abysis.org/), como mostrado na Tabela 22. Depois de terminar a construção das sub- bibliotecas de fago, seguiu-se a triagem do antígeno CXCL13. Os aminoácidos mutados que podem melhorar o Koff estão listados na Tabela 23. As sequências de clones principais que têm Koff inferior ao CXCL13 humano estão listadas na Tabela 24. Os anticorpos dessas sequências foram gerados, e o teste de afinidade foi realizado por Biacore T200. Os resultados estão

87 / 92 listados na Tabela 25. Para otimizar ainda mais os anticorpos, os clones principais foram então mutados de volta para sua contraparte humanizada um aa por um aa. Sequências foram geradas e sintetizadas para anticorpos. A afinidade foi testada por Biacore T200. Os resultados mostram que uma das mutações reversas de 005-3-18, a sequência foi mostrada na Tabela 26, que é 92W mutante para Y na cadeia leve e denominada 71F4-B, promove significativamente Koff, KD (<1 nM) e atividade de bloqueio em comparação com Hz71F4 e 005-3-18, os dados foram listados na Tabela 27. Tabela 22. CDRs de 71F4A3 Cadeia de Sequências (CDRs sublinhados e mutações alvejadas em negrito e SEQ ID NO: anticorpos sublinhado duplo) 71F4A3- EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGIDFS RYWMS WVRQA 156

VH PGKGLEWVA E INPESSTINY APSLKD RFTI SRDNAKNSLY (D54E) LQMNSLRAED TAVYYCAR Q D D YE YY AM DY W

GQGTTVTVSS 71F4A3- DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC K A SQDVN TGV A 138

VL WYQQKP GKAPKLLIY S ASYRYT GVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP

EDIATYYC QQ YY STPLT FGG GTKLEIK Tabela 23. Mutações em 71F4A3 úteis para melhorar Koff Resíduo Substituído por VL-25A V VL-34A Y VL-91Y G VL-92Y W VH-100D E VH-102Y T VH-103E R VH-106A T VH-107M I Tabela 24. As sequências de clones de chumbo Cadeia de Sequências SEQ ID anticorpos NO: 005-3-18- EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGIDFS RYWMSWVRQA 174

VH PGKGLEWVAE INPE SS TINY APSLKDRFTI SRDNAKNSLY

LQMNSLRAED TAVYYCARQD DYEYY T MDYW GQGTTVTVSS 005-3-18- DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKVSQDVN TGVAWYQQKP 175

VL GKAPKLLIYS ASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP

EDIATYYCQQ YWSTPLTFGG GTKLEIK 005-3-23- EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGIDFS RYWMSWVRQA 176

VH PGKGLEWVAE INPE SS TINY APSLKDRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARQ E DYEYYA L DYW GQGTTVTVSS

88 / 92 005-3-23- DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVN TGV Y WYQQKP 177

VL GKAPKLLIYS ASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP

EDIATYYCQQ G YSTPLTFGG GTKLEIK 005-2-45- EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGIDFS RYWMSWVRQA 178

VH PGKGLEWVAE INPE SS TINY APSLKDRFTI SRDNAKNSLY

LQMNSLRAED TAVYYCARQD D TR YYAMDYW GQGTTVTVSS 005-2-45- DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVN TGVAWYQQKP 138

VL GKAPKLLIYS ASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP

EDIATYYCQQ YYSTPLTFGG GTKLEIK Tabela 25. Resultados de Koff para clones principais Amostra kd (1 / s) 005-3-18 1,58E-04 005-3-23 4,03E-04 005-2-45 7,76E-04 hz71F4 1,26E-03 Tabela 26. As sequências de clones de chumbo Cadeia de Sequências (mutação reversa W92Y sublinhada e em negrito) SEQ ID anticorpos NO: 71F4-B-VH EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGIDFS RYWMSWVRQA 174

PGKGLEWVAE INPE SS TINY APSLKDRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARQD DYEYY T MDYW

GQGTTVTVSS 71F4-B - DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCK V SQDVN TGVAWYQQKP 179

VL GKAPKLLIYS ASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP

EDIATYYCQQ Y Y STPLTFGG GTKLEIK Tabela 27. Determinação de afinidade e resultados de bloqueio para 71F4-

B Bloqueio de células Amostras ka (1 / Ms) kd (1 / s) KD (M) ( taxa de IC 50 ) Hz71F4A3 2,50E + 05 6,45E-04 2,58E-09 1,0 005-3-18 1,24E + 05 1,53E-04 1,24E-09 / 71F4-B 1,83E + 05 3,57E-05 1,95E-10 0,7

[00188] Para otimização adicional de 71F4-B, cada mutação em 71F4A3 útil para melhorar a ligação (Kon) foi adicionada a 71F4-B, as sequências foram listadas na Tabela 28. Anticorpos de acordo com essas sequências foram gerados e o teste de afinidade foi realizado por Biacore T200. Os resultados mostraram que a afinidade de 71F4-B-T, 71F4-B-LT, 71F4-B-H foi aumentada quase 1 log em comparação com 71F4-B, a afinidade de clones principais foi listada na Tabela 29. Tabela 28. Sequências de clones principais Cadeia de Sequências SEQ anticorpos ID NO:

89 / 92 71F4-BL-VH EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGIDFS 180

RYWMSWVRQA PGKGLEWVAE INPE SS TINY APSLKDRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED

TAVYYCARQD DY L YY T MDYW GQGTTVTVSS 71F4-BL-VL DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCK V SQDVN 179

TGVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP

EDIATYYCQQ Y Y STPLTFGG GTKLEIK 71F4-BT-VH EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGIDFS 181

RYWMSWVRQA PGKGLEWVAE INPE SS TINY APSLKDRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED

TAVYYCARQD DYE T Y T MDYW GQGTTVTVSS 71F4-BT-VL DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCK V SQDVN 179

TGVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP

EDIATYYCQQ Y Y STPLTFGG GTKLEIK 71F4-B-LT-VH EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGIDFS 182

RYWMSWVRQA PGKGLEWVAE INPE SS TINY APSLKDRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED

TAVYYCARQD DY LT Y T MDYW GQGTTVTVSS 71F4-B-LT-VL DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCK V SQDVN 179

TGVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP

EDIATYYCQQ Y Y STPLTFGG GTKLEIK 71F4-BA-VH EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGIDFS 183

RYWMSWVRQA PGKGLEWVAE INPE AS TINY APSLKDRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED

TAVYYCARQD DYEYY T MDYW GQGTTVTVSS 71F4-B -VL DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCK V SQDVN 179

TGVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP

EDIATYYCQQ Y Y STPLTFGG GTKLEIK 71F4-B-S1-VH EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGIDFS 184

RYWMSWVRQA PGKGLEWVAE INPE SSS INY APSLKDRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED

TAVYYCARQD DYEYY T MDYW GQGTTVTVSS 71F4-B-S1-VL DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCK V SQDVN 179

TGVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP

EDIATYYCQQ Y Y STPLTFGG GTKLEIK 71F4-B-S2-VH EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGIDFS 185

RYWMSWVRQA PGKGLEWVAE INPE SS TINY APSLKDRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED

TAVYYCARQD DY S YY T MDYW GQGTTVTVSS 71F4-B-S2 -VL DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCK V SQDVN 179

TGVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP

EDIATYYCQQ Y Y STPLTFGG GTKLEIK 71F4-BH-VH EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGIDFS 186

RYWMSWVRQA PGKGLEWVAE INPE SS TINY APSLKDRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARQD DYE H Y T MDYW GQGTTVTVSS

90 / 92 71F4-BH -VL DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCK V SQDVN 179

TGVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP

EDIATYYCQQ Y Y STPLTFGG GTKLEIK 71F4-B-SH-VH EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGIDFS 187

RYWMSWVRQA PGKGLEWVAE INPE SS TINY APSLKDRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED

TAVYYCARQD DY SH Y T MDYW GQGTTVTVSS 71F4-B-SH-VL DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCK V SQDVN 179

TGVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP

EDIATYYCQQ Y Y STPLTFGG GTKLEIK 71F4-B-AS-VH EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGIDFS 188

RYWMSWVRQA PGKGLEWVAE INPE ASS INY APSLKDRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED

TAVYYCARQD DYEYY T MDYW GQGTTVTVSS 71F4-B-AS-VL DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCK V SQDVN 179

TGVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP

EDIATYYCQQ Y Y STPLTFGG GTKLEIK 71F4-B-SSH- EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGIDFS 189

VH RYWMSWVRQA PGKGLEWVAE INPE SS SINY APSLKDRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED

TAVYYCARQD DY SH Y T MDYW GQGTTVTVSS 71F4-B-SSH - DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCK V SQDVN 179

VL TGVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP

EDIATYYCQQ Y Y STPLTFGG GTKLEIK 71F4-B-ASH- EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGIDFS 190

VH RYWMSWVRQA PGKGLEWVAE INPE ASS INY APSLKDRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED

TAVYYCARQD DY SH Y T MDYW GQGTTVTVSS 71F4-B-ASH - DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCK V SQDVN 179

VL TGVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP

EDIATYYCQQ Y Y STPLTFGG GTKLEIK Tabela 29. Resultados da determinação de afinidade Amostras ka (1 / Ms) kd (1 / s) KD (M) 71F4-B 1,83E + 05 6,59E-05 3,60E-10 71F4-BL 1,94E + 05 8,58E-05 4,43E-10 71F4-BT 2,56E + 05 1,17E-05 4,56E-11 71F4-B-LT 2,35E + 05 1,02E-05 4,35E-11 71F4-BA 1,76E + 05 6,82E-05 3,88E-10 71F4-B-S1 2,29E + 05 9,26E-05 4,04E-10 71F4-B-S2 5,15E + 05 2,68E-04 5,20E-10 71F4-BH 1,97E + 05 1,27E-05 6,47E-11 71F4-B-SH 1,92E + 05 5,55E-05 2,90E-10 71F4-B-AS 2,26E + 05 7,25E-05 3,21E-10 71F4-B-SSH 2,51E + 05 9,46E-05 3,77E-10 71F4-B-ASH 1,76E + 05 9,17E-05 5,21E-10 Exemplo 16. Potência de bloqueio de anticorpos maturados por afinidade anti-CXCL13 em ensaio de sinalização

91 / 92

[00189] Inibição da sinalização IP1 mediada por CXCL13. Com base nos resultados da afinidade de ligação, selecionamos 71F4A3-B, 71F4A3-B-T, 71F4A3-B-H, 71F4A3-B-LT para investigar no ensaio de sinalização funcional IP1. Além disso, comparamos a potência de bloqueio do anti-CXCL13 interno com o anticorpo anti-CXCL13 de referência, Mab5261, que foi mencionado no exemplo 9.

[00190] Como mostrado na Figura 13, todas as variantes maturadas por afinidade 71F4A3 e Hz71F4A3 podem inibir de forma dependente da dose o sinal IP1 que foi induzido por CXCL13. A potência de bloqueio de diferentes variantes de afinidade maturadas de 71F4A3 foram comparáveis com Hz71F4A3, e a potência de 71F4A3 de variantes maturadas por afinidade foi significativamente melhor do que o anticorpo de referência. Exemplo 17. Propriedades funcionais de anticorpos maturados por afinidade anti-CXCL13 em ensaio de migração de células

[00191] Bloqueio da migração de células BaF3-CXCR5 (humanas) em direção a CXCL13. Além disso, validamos a atividade desses anticorpos maturados por afinidade e anticorpo de referência no ensaio de migração de linha celular BaF3-CXCR5 que foi mencionado no exemplo 5.

[00192] Conforme mostrado na Figura 14, as linhas tracejadas indicaram que o CXCL13 induziu o nível de migração. Quando os anticorpos anti-CXCL13, Hz71F4A3, 71F4A3-B, 71F4A3-B-T, 71F4A3-B-H e Mab6261 foram adicionados a este sistema de ensaio, a migração de células BaF3-CXCR5 foi inibida de forma dependente da dose. A atividade de inibição das variantes maturadas por afinidade de 71F4A3 foi similar a Hz71F4A3 neste ensaio de migração de linha celular. E a atividade de inibição de todas as variantes de 71F4A3 maturadas por afinidade foram dramaticamente melhores do que o anticorpo de referência Mab5261.

[00193] Inibição da migração de células primárias das tonsilas para CXCL13. Além disso, também investigamos a função de bloqueio de

92 / 92 anticorpos maturados por afinidade anti-CXCL13 em ensaio de migração de células de tonsila humana primária.

[00194] Como mostrado na Figura 15, compare a condição tratada com IgG, todos os anticorpos maturados por afinidade 71F4A3, 71F4A3-B, 71F4A3-BT, 71F4A3-BH, poderiam inibir a quimiotaxia de células das tonsilas humana primária induzida por CXCL13 em uma maneira dependente da dose. E a atividade de inibição dos anticorpos maturados por afinidade 71F4A3 foram comparáveis com Hz71F4A3 neste ensaio humano primário.

[00195] A presente descrição não deve ser limitada em escopo pelas modalidades específicas descritas que se destinam a ser ilustrações únicas de aspectos individuais da descrição, e quaisquer composições ou métodos que sejam funcionalmente equivalentes estão dentro do escopo desta descrição. Será evidente para os versados na técnica que várias modificações e variações podem ser feitas nos métodos e composições da presente descrição sem se afastar do espírito ou escopo da descrição. Assim, pretende-se que a presente descrição cubra as modificações e variações desta descrição, desde que estejam dentro do escopo das reivindicações anexas e seus equivalentes.

[00196] Todas as publicações e pedidos de patente mencionados neste relatório descritivo são aqui incorporados por referência na mesma extensão como se cada publicação individual ou pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência.

Claims (34)

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo ou fragmento do mesmo tendo especificidade para uma proteína do ligante 13 de quimiocina humana (motivo C-X-C) (CXCL13), o anticorpo ou fragmento do mesmo caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende regiões determinantes de complementaridade da cadeia pesada HCDR1, HCDR2 e HCDR3, e uma região variável de cadeia leve que compreende regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve LCDR1, LCDR2 e LCDR3, em que: a HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 127 (RYWMS); a HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:128 (EINPDSSTINYAPSLKD), SEQ ID NO:129 (EINPESSTINYAPSLKD), SEQ ID NO:340 (EINPEASSINYAPSLKD), SEQ ID NO:343, (EINPEAGKWNYAPSLKD), SEQ ID NO:347 (EINPETTIINYAPSLKD), SEQ ID NO:349 (EINPESTLINYAPSLKD), SEQ ID NO:351, INPESTGINYAPSLKD), SEQ ID NO:354 (EINPESNFINYAPSLKD), SEQ ID NO:357 (EINPERNYINYAPSLKD), SEQ ID NO:369 (EINPEASTINYAPSLKD), ou SEQ ID NO:370 (EINPESSSINYAPSLKD); a HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:130 (QDDYEYYAMDY), SEQ ID NO:341 (QDDYSHYAMDY), SEQ ID NO:344 (QDDYTTYAMDY), SEQ ID NO:345 (QDDYLTYAMDY), SEQ ID NO:348 (QDDYRHYAMDY), SEQ ID NO:350 (QDDYRNYAMDY), SEQ ID NO:352 (QDDYWTYAMDY), SEQ ID NO:355 (QDDYSVYAMDY), SEQ ID NO:358 (QDDYDKYAMDY), SEQ ID NO:359 (QDDYEYYTMDY), SEQ ID NO:362 (QEDYEYYALDY), SEQ ID NO:365 (QDDTRYYAMDY), SEQ ID NO:366 (QDDYLYYTMDY), SEQ ID NO:367 (QDDYETYTMDY), SEQ ID

NO:368 (QDDYLTYTMDY), SEQ ID NO:371 (QDDYSYYTMDY), SEQ ID NO:372 (QDDYEHYTMDY), ou SEQ ID NO:373 (QDDYSHYTMDY); a LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:131 (KASQDVNTGVA), SEQ ID NO:342 (KASQDVNTGVS), SEQ ID NO:346 (KASQDVNTAVD), SEQ ID NO:353 (KASQDVNTAVS), SEQ ID NO:356 (KASQDVNTGVT), SEQ ID NO:360 (KVSQDVNTGVA), ou SEQ ID NO:363 (KASQDVNTGVY); a LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 132 (SASYRYT); e a LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 (QQYYSTPLT), SEQ ID NO: 361 (QQYWSTPLT) ou SEQ ID NO: 364 (QQGYSTPLT).

2. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCD2 e LCDR3 compreendem SEQ ID NO: 127, 129, 367, 360, 132 e 133, respectivamente.

3. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 181 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 181, e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 179 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 179.

4. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que é humanizado e a região variável de cadeia pesada compreende uma ou mais mutações reversas selecionadas do grupo que consiste em 5Q, 47I, 48G e 85V, de acordo com a numeração de Kabat e combinações das mesmas, ou a região variável de cadeia leve compreende uma mutação 78V de acordo com a numeração de Kabat.

5. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 181, e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 179.

6. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCD2 e LCDR3 compreendem SEQ ID NO: 127, 129, 359, 360, 132 e 133, respectivamente.

7. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 174 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 174, e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 179 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 179.

8. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCD2 e LCDR3 compreendem SEQ ID NO: 127, 129, 359, 360, 132 e 361, respectivamente.

9. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 174 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 174, e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 175 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 175.

10. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCD2 e LCDR3 compreendem SEQ ID NO: 127, 129, 130, 131, 132 e 133, respectivamente.

11. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 156 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 156, e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 138 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 138.

12. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCD2 e LCDR3 compreendem SEQ ID NO: 127, 128, 130, 131, 132 e 133, respectivamente.

13. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 134 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 134, e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 138 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 138.

14. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 13, caracterizado pelo fato de que é humanizado e a região variável de cadeia pesada compreende uma ou mais mutações reversas selecionadas do grupo que consiste em 5Q, 47I, 48G e 85V, de acordo com a numeração de Kabat e combinações dos mesmos, ou a região variável de cadeia leve compreende uma mutação 78V de acordo com a numeração de Kabat.

15. Anticorpo ou fragmento do mesmo tendo especificidade para uma proteína do ligante 13 de quimiocina humana (motivo C-X-C) (CXCL13), caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende regiões determinantes de complementaridade da cadeia pesada HCDR1, HCDR2 e HCDR3, e uma região variável de cadeia leve que compreende regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve LCDR1, LCDR2 e LCDR3, em que: o conjunto de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 é selecionado da Tabela A ou B, ou conjuntos de CDR derivados da Tabela A ou B com adição, deleção e/ou substituição de um, dois ou três aminoácidos em um ou mais dos CDRs, e o conjunto de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 é selecionado da Tabela A ou B, ou conjuntos de CDR derivados da Tabela A ou B com adição, deleção e/ou substituição de um, dois ou três aminoácidos em um ou mais dos CDRs.

16. Anticorpo ou fragmento do mesmo tendo especificidade para uma proteína do ligante 13 de quimiocina humana (motivo C-X-C) (CXCL13), caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento do mesmo pode se ligar a um ou mais resíduos de aminoácidos selecionados do grupo que consiste em F20, P22, R24 e F25 da proteína CXCL13.

17. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que pode se ligar a F20 e P22, F20 e R24, F20 e F25, P22 e R24, P22 e F25, ou R24 e F25 da proteína

CXCL13.

18. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que pode se ligar a F20, P22 e R24; F20, P22 e F25; F20, R24 e F25; ou P22, R24 e F25 da proteína CXCL13.

19. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que pode se ligar a F20, P22, R24 e F25 da proteína CXCL13.

20. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que pode ainda se ligar à proteína CXCL13 de cynomolgus.

21. Anticorpo biespecífico, caracterizado pelo fato de que compreende uma primeira porção de ligação ao antígeno tendo especificidade para uma proteína do ligante 13 de quimiocina humana (motivo C-X-C) (CXCL13) e uma segunda porção de ligação ao antígeno tendo especificidade para uma proteína de fator de ativação de célula B humana (BAFF), em que a primeira porção de ligação ao antígeno compreende um fragmento de anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20.

22. Anticorpo biespecífico de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que tem um formato que compreende um anticorpo completo fundido em dois fragmentos de cadeia única (scFv) ou a dois fragmentos Fab.

23. Anticorpo biespecífico de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizado pelo fato de que a segunda porção compreende um fragmento de ligação ao antígeno de Belimumabe.

24. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo ou fragmento do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20, ou o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das reivindicações 21 a 23, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

25. Célula isolada, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais polinucleotídeos que codificam o anticorpo ou fragmento do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20, ou um anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das reivindicações 21 a 23.

26. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que codifica uma ou mais cadeias do anticorpo ou fragmento do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20, ou o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das reivindicações 21 a 23.

27. Método para supressão de uma resposta imune ou tratamento de uma doença ou distúrbio autoimune em um paciente em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao paciente do anticorpo ou fragmento do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20, ou um anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das reivindicações 21 a 23.

28. Uso de um anticorpo ou fragmento do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20 ou de um anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das reivindicações 21 a 23, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para supressão de uma resposta imune ou tratamento de uma doença ou distúrbio autoimune em um paciente em necessidade dos mesmos.

29. Método de acordo com a reivindicação 27 ou uso de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de ser para o tratamento de uma doença ou distúrbio autoimune.

30. Método de acordo com a reivindicação 27 ou uso de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio autoimune é selecionado do grupo que consiste em diabetes tipo 1, artrite reumatoide (AR), psoríase/artrite psoriática, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistêmico (lúpus), doença inflamatória intestinal, doença de

Addison, doença de Graves, síndrome de Sjögren, tireoidite de Hashimoto, miastenia grave, vasculite, anemia perniciosa e doença celíaca.

31. Método de acordo com a reivindicação 27 ou uso de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio autoimune é a síndrome de Sjögren.

32. Método para tratamento de câncer em um paciente em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao paciente do anticorpo ou fragmento do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20.

33. Uso de um anticorpo ou fragmento do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para o tratamento de câncer em um paciente em necessidade do mesmo.

34. Método para detecção da expressão de uma proteína do ligante 13 de quimiocina humana (motivo C-X-C) (CXCL13) em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende o contato da amostra com o anticorpo ou fragmento do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20, e a detecção da ligação que indica expressão de CXCL13 na amostra.