CN115515637A

CN115515637A - 使用il-20拮抗剂和免疫检查点抑制剂的混合式治疗

Info

Publication number: CN115515637A
Application number: CN202180030190.XA
Authority: CN
Inventors: 张明熙
Original assignee: Yongfu Biotechnology Co ltd
Current assignee: Yongfu Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-04-22
Filing date: 2021-04-19
Publication date: 2022-12-23
Also published as: EP4168050A1; TW202202171A; US11661450B2; EP4168050A4; WO2021216418A1; US20210332121A1

Abstract

本发明提供与使用IL20拮抗剂及免疫检查点抑制剂的混合式治疗相关的方法及组合物。

Description

使用IL-20拮抗剂和免疫检查点抑制剂的混合式治疗

本申请要求与2020年4月22日提交的美国临时专利申请第16/855,637号的优先权和权益，发明名称为“使用IL-20拮抗剂和免疫检查点抑制剂的混合式治疗”，通过引用将其全部内容并入本文。

技术领域

本发明是关于用于包含IL20拮抗剂及免疫检查点抑制剂的混合式治疗的方法及组合物；更特定言之，本发明是关于用于治疗和/或预防癌症或纤维化的方法。

背景技术

程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)结合至程序性细胞死亡配位体1(PD-L1)且其结合相互作用在调节免疫系统功能(包括免疫性及自身耐受性)中起作用。PD-L1在肿瘤中表达，且PD-L1的上调可以允许癌症避开宿主免疫系统。因此，经由PD-L1:PD-1路径干扰抑制信号为用于增强抗肿瘤免疫性的治疗选择方案。已发现阻断程序性细胞死亡1(PD-1)受体活化的抗体可有效地改良靶向癌细胞的免疫细胞，然而，仅在一小部分经免疫疗法治疗的患者中观测到持久的反应。

介白素IL-20(IL-20)为IL-10家族的成员，该家族包括IL-10、IL-19、IL-20、IL-22、IL-24及IL-26。Blumberg等人,2001,Cell 104:9-19；Pestka等人,2004,Annu RevImmunol 22:929-979。IL-20在单核球、上皮细胞及内皮细胞中表达且藉由活化IL-20R1/IL-20R2或IL-22R1/IL-20R2的杂二聚体受体复合物而作用于多种细胞类型。(Dumoutier等人,2001，J Immunol 167:3545-3549)。发现IL-20涉及各种发炎性疾病，诸如牛皮癣(Blumberg等人,2001；Sa等人,2007,JImmunol 178:2229-2240；及Wei等人,2005,ClinImmunol 117:65-72)、类风湿性关节炎(Hsu等人,2006,Arthritis Rheum 54:2722-2733)、动脉粥样硬化(Caligiuri等人,2006,Arterioscler Thromb Vasc Biol 26:1929-1930；及Chen等人,2006，Arterioscler Thromb Vasc Biol 26:2090-2095)、缺血性中风(Chen等人,2009,J Immunol 182:5003-5012)及肾衰竭(Li等人,2008,Genes Immun 9:395-404)。亦参见Wei等人,2006,JBiomed Sci 13:601-612。

仍需要提高肿瘤学治疗的功效。

发明内容

本发明是基于以下出人意料的结果：抗IL-20抗体与免疫检查点抑制剂的组合成功地抑制了肿瘤生长及延长了存活率。此外，抗人类IL-20抗体与免疫检查点抑制剂的组合在治疗或预防或逆转组织纤维化方面具有出人意料的功效。

因此，本发明的一个态样是关于一种用于治疗个体的癌症或纤维化或延迟癌症或纤维化发作的方法，该方法包含向需要治疗的个体投予有效量的包含IL-20拮抗剂及免疫检查点抑制剂的组合。

本发明的另一态样是关于一种用于治疗或预防组织纤维化的方法，该方法包含向有需要的个体投予有效量的包含IL-20拮抗剂及免疫检查点抑制剂的组合。

在一些实施例中，IL-20拮抗剂可以为结合至IL-20或IL-20受体的抗体，藉此抑制由IL-20介导的信号传导路径。举例而言，此类抗体可结合至IL-20蛋白质(例如人类IL-20)或可结合至IL-20受体(例如人类IL-20受体，诸如IL-20的R1次单元)。本文所描述的方法中使用的例示性抗体中的任一者可以为全长抗体或其抗原结合片段。可替代地，该抗体可以为人类抗体、人类化抗体、嵌合抗体或单链抗体。

在一个态样中，结合本文所用的人类IL-20的例示性抗体可以为单株抗体mAb7E、其抗原结合片段或其功能变异体。在一个实例中，mAb7E的功能变异体包含与mAb7E相同的互补决定区(CDR)。在另一实例中，功能变异体为mAb7E的人类化抗体。此类人类化抗体可以包含重链可变区(V_H)及轻链可变区(V_L)，该重链可变区包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的氨基酸序列。

在一个态样中，根据本文所描述的方法涵盖的例示性免疫检查点抑制剂可以包括例如抗CTLA-4抗体、抗-PD-1抗体或抗PD-L1抗体。免疫检查点抑制剂的某些实施例包括派姆单抗(pembrolizumab)、皮立珠单抗(pidilizumab)、纳武单抗(nivolumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、特瑞普利单抗(toripalimab)、信迪利单抗(sintilimab)、卡瑞利珠单抗(camrelizumab)及MIHI。

本文所描述的方法中待治疗的个体可以为患有或疑似患有癌症的患者(例如人类患者)。在一些实例中，个体为患有或疑似患有癌症的人类患者。

藉由本文所描述的方法实施例治疗的例示性癌症包括胰脏癌、神经胶母细胞瘤、肝癌、大肠直肠癌、神经胶母细胞瘤、胃癌、大肠直肠癌、食道癌、肺癌、肾细胞癌、良性前列腺增生、前列腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、乳癌、慢性淋巴球性白血病(CLL)、梅克尔细胞癌(Merkel cell carcinoma)、非霍奇金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin lymphoma)、急性骨髓白血病(AML)、胆囊癌、胆管癌、膀胱癌及子宫癌。在一个实施例中，胰脏癌为胰脏腺癌或非腺癌。

待藉由本文所描述的方法治疗的纤维化的范例包括肺纤维化、特发性肺纤维化、杜普宜特朗氏病(Dupuytren disease)、非酒精性脂肪变性肝炎、门静脉高血压、全身性硬化症、肾纤维化、心脏纤维化及皮肤纤维化。

本发明的范畴亦涵盖(a)用于治疗个体的癌症或延迟癌症或组织纤维化发作的组合，例示性组合可以包含本文所描述的IL-20拮抗剂中的一或多者及一或多种免疫检查点抑制剂；及(b)本文所描述的组合在制造用于治疗癌症或延迟癌症发作的药剂中的用途。

本发明的一或多个实施例的细节阐述于以下说明中。本发明的其他特征或优点自以下图式及若干实施例的具体实施方式以及随附申请专利范围将显而易见。

附图说明

当结合后续具体实施方式考虑时，可参考随附图式获得对本发明的更完整理解。图式中所说明的实施例仅意欲举例说明本发明且不应视为将本发明限于所说明的实施例。

主题专利申请文件含有至少一个彩制图。在请求且支付必要费用后，专利局将提供具有一或多个彩色图式的本专利或专利申请公开案的复本。

图1展示7E及PD1抗体混合式治疗如何缓解PDAC的原位模型中的肿瘤进展。

图2展示IL-20及PD1的组合阻断抑制PDAC原位模型的鼠类胰脏肿瘤块。

具体实施方式

本发明报导以下出人意料的结果：能够干扰IL-20信号传导路径(例如抗IL-20抗体，诸如mAb7E)与免疫检查点抑制剂的组合的抗体成功地抑制了肿瘤生长及延长了存活率。因此，本发明是关于使用有效量的IL-20拮抗剂与有效量的免疫检查点抑制剂的组合来治疗个体的癌症(例如缓解癌症或延迟癌症发作)的方法。

通用技术

除非另外指明，否则本发明的实践将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学及免疫学的已知技术，其完全处于熟习此项技术者的范围内。此类技术在以下文献中充分解释，诸如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版(Sambrook等人,1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编,1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology:ALaboratory Notebook(J.E.Cellis编,1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编,1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather及P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths及D.G.Newell编,1993-8)J.Wiley and Sons；Methods inEnzymology(Academic Press,Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir及C.C.Blackwell编)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller及M.P.Calos编,1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编,1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人编,1994)；Current Protocolsin Immunology(J.E.Coligan等人编,1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway及P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:a practical approach(D.Catty.编,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal antibodies:a practical approach(P.Shepherd及C.Dean编,OxfordUniversity Press,2000)；Using antibodies:a laboratory manual(E.Harlow及D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti及J.D.Capra编,Harwood Academic Publishers,1995)。

IL-20拮抗剂

例示性IL-20可以包括属于IL-10细胞介素家族的促发炎细胞介素。本文所描述的IL-20是指介白素-20及其变异体，其保留IL-20活性的至少一部分。如本文所用，IL-20包括天然序列IL-20的所有哺乳动物物种，包括人类、犬、猫、马或牛。在一个实例中，IL-20为人类IL-20(GenBank寄存编号NP_061194.2)。

IL-20经由结合至IL-20受体活化IL-20信号传导路径，IL-20受体为二聚体复合物，含有次单元IL-20R1及IL-20R2(亦称为RA及RB)。此类IL-20受体由三种功能上不同的细胞介素，亦即IL-19、IL-20及IL-24共享，表明此受体取决于与特异性细胞介素的结合而介导不同信号传导路径。IL-20亦能够结合至含有IL-20R2及IL-22R1的二聚体复合物。本文所公开的IL-20受体是指能够结合至IL-20且由IL-20活化的一或多种多肽。本文所公开的IL-20受体包括任何哺乳动物物种的IL-20R1、IL-20R2及IL-22R1，包括(但不限于)人类、犬、猫、马、灵长类动物或牛。人类IL-20受体的实例包括hIL-20R1(GenBank寄存编号NM_014432.2)、hIL-20R2(GenBank寄存编号NM_144717.2)及hIL-22R1(NM_181309.1)。已描述人类IL-20受体的序列；例如美国专利第6,610,286号；第7,122,632号；第7,393,684号；及第7,537,761号；及美国专利申请公开案第2006/0263850A1号；第2006/0263851A1号；第2008/0247945A1号；及第2009/0074661A1号。

待用于本文所描述的方法中的IL-20拮抗剂为阻断、抑制或减少(包括显著地)IL-20的生物活性的分子，该生物活性包括由IL-20信号传导介导的下游路径，诸如受体结合和/或诱发对IL-20的细胞反应。参见US2011/0064731，其以全文引用的方式并入本文中。术语“拮抗剂”意指没有任何特定的生物作用机制，且视为明确包括及涵盖与IL-20直接或间接的所有可能的药理学、生理及生物化学相互作用。出于本发明的目的，应明确理解，术语“拮抗剂”涵盖所有先前识别的术语、标题及功能状态及特征，其中IL-20自身(例如人类IL-20)、IL-20生物活性(包括(但不限于)其介导胰脏癌的任何态样的能力)或生物活性的结果基本上失效、减少或中和至任何有意义的程度，例如至少20％、50％、70％、85％、90％、100％、150％、200％、300％或500％，或10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍或10⁴倍。

例示性IL-20拮抗剂包括(但不限于)抗IL-20抗体、关于IL-20的反义核酸分子(包括关于编码IL-20的核酸的反义核酸)、关于IL-20核酸的短小干扰RNA(siRNA)、关于IL-20核酸的微小RNA、IL-20抑制性化合物、抗IL-20R抗体(例如特异性结合IL-20R1、IL-20R2或由此形成的二聚体复合物的抗体)、关于IL-20受体的次单元的反义核酸分子、关于编码IL-20受体的次单元的核酸的微小RNA、或IL-20R抑制性化合物。在一些实施例中，IL-20拮抗剂结合IL-20或IL-20受体且防止形成IL-20-IL-20R复合物，藉此抑制IL-20信号传导路径。在其他实施例中，IL-20拮抗剂抑制或减少IL-20合成和/或产生(释放)。此类拮抗剂包括反义分子、siRNA及微小RNA。

能够干扰IL-20信号传导路径的抗体

抗体(可以复数形式互换使用)为能够经由位于免疫球蛋白分子的可变区的至少一个抗原识别位点特异性结合至诸如碳水化合物、聚核苷酸、脂质、多肽等目标的免疫球蛋白分子。如本文所用，术语“抗体”不仅涵盖完整(亦即全长)多株或单株抗体，而且涵盖其抗原结合片段(诸如Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv)、单链(scFv)、其突变体、包含抗体部分的融合蛋白、人类化抗体、嵌合抗体、双功能抗体、线性抗体、单链抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)及包含具所要特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他经修饰组态，包括抗体的糖基化变异体、抗体的氨基酸序列变异体及经共价修饰的抗体。抗体包括任何类别的抗体，诸如IgD、IgE、IgG、IgA或IgM(或其子类)，且该抗体无需属于任何特定类别。免疫球蛋白可以取决于其重链的恒定域的抗体氨基酸序列而归为不同类别。存在五种主要类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等类别中的若干类别可进一步分为亚类(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ及μ。不同类别的免疫球蛋白的次单元结构及三维组态为已熟知的。

本文所描述的方法中使用的抗体可以为鼠类、大鼠、人类或任何其他来源(包括嵌合或人类化抗体)。在一些实例中，抗体包含经修饰的恒定区，诸如免疫惰性，例如不触发补体介导的溶解或不刺激抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的恒定区。ADCC活性可以使用美国专利第5,500,362号中所公开的方法评估。在其他实施例中，如Eur.J.Immunol.,1999,29:2613-2624；PCT申请案第PCT/GB99/01441号；和/或英国专利申请案第9809951.8号中所描述来修饰恒定区。

本文所描述的任一种抗体可以为单株抗体或多株抗体。“单株抗体”是指均质抗体群体且“多株抗体”是指异质抗体群体。此等两个术语并不限制抗体来源或制造其的方式。

在一个实施例中，本文所描述的方法中使用的抗体为人类化抗体。人类化抗体是指非人类(例如鼠类)抗体形式，其为含有来源于非人类免疫球蛋白的最小序列的特异性嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其抗原结合片段。在很大程度上，人类化抗体为人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基由具有所要特异性、亲和力及能力的来自诸如小鼠、大鼠或兔的非人类物种(供体抗体)的CDR的残基置换。在一些情况下，人类免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基被置换为对应非人类残基。此外，人类化抗体可包含以下残基：既不存在于受体抗体中亦不存在于所导入的CDR或构架序列中，但包括该等残基以进一步改进且优化抗体效能。一般而言，人类化抗体将包含基本上所有至少一个及典型地两个可变域，其中所有或基本上所有CDR区域与非人类免疫球蛋白的彼等区域对应且所有或基本上所有FR区域为人类免疫球蛋白共有序列的彼等区域。人类化抗体最佳亦将包含至少一部分免疫球蛋白恒定区或域(Fc)，通常人类免疫球蛋白的恒定区或域。抗体可具有如WO 99/58572中所描述的经修饰的Fc区。人类化抗体的其他形式具有一或多个相对于原始抗体改变的CDR(一个、两个、三个、四个、五个、六个)，亦称为一或多个“来源于”来自原始抗体的一或多个CDR的CDR。人类化抗体亦可涉及亲和力成熟。

在另一实施例中，本文所描述的抗体为嵌合抗体，其可以包括来自人类抗体的重链恒定区及轻链恒定区。嵌合抗体是指具有来自第一物种的可变区或可变区的一部分及来自第二物种的恒定区的抗体。通常，在此等嵌合抗体中，轻链与重链二者的可变区模拟来源于一种哺乳动物物种(例如非人类哺乳动物，诸如小鼠、兔及大鼠)的抗体的可变区，而恒定部分与来源于另一哺乳动物(诸如人类)的抗体中的序列同源。在一些实施例中，可以在可变区和/或恒定区中进行氨基酸修饰。

在其他实施例中，本文所公开的抗体特异性结合目标抗原，诸如人类IL-20或人类IL-20受体的两个次单元中的一者(例如IL-20R1)。“特异性结合”(在本文中可互换使用)至目标或抗原决定基的抗体为此项技术中熟知的术语，且测定此类特异性结合的方法亦为此项技术中熟知的。若分子与特定目标抗原的反应或缔合比其与替代性目标的反应更频繁、更快速、持续时间更长和/或亲和力更大，则称其展现“特异性结合”。若抗体与目标抗原的结合比其与其他物质的结合的亲和力、亲合力更大、更容易和/或持续时间更长，则其“特异性结合”至目标抗原。举例而言，特异性或优先结合至IL-20抗原决定基的抗体为结合此IL-20抗原决定基比结合至其他IL-20抗原决定基或非IL-20抗原决定基而言亲和力、亲合力更大、更容易和/或持续时间更长的抗体。藉由阅读此定义亦应理解，例如特异性结合于第一目标抗原的抗体可或可不特异性或优先结合至第二目标抗原。因此，“特异性结合”或“优先结合”不一定需要(尽管其可包括)独占式结合。一般而言，但不一定，提及结合意味优先结合。

能够干扰IL-20信号传导路径的抗体可以为结合IL-20(例如人类IL-20)且抑制IL-20生物活性和/或由IL-20介导的下游路径的抗体。可替代地，此类抗体可以为结合IL-20受体(IL-20R)，例如结合至IL-20受体的次单元中的一或两者且遏制由IL-20触发的受体介导的下游信号传导路径的抗体。

(i)抗IL-20抗体

抗IL-20抗体为能够结合至IL-20且抑制IL-20生物活性和/或由IL-20信号传导介导的下游路径的抗体。在一些实例中，本文所描述的方法中使用的抗IL-20抗体抑制IL-20信号传导路径至少20％、至少40％、至少50％、至少75％、至少90％、至少100％，或至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍或至少1000倍。抗IL-20抗体的实例包括(但不限于)美国专利第7,435,800号；第7,115,714号；第7,119,175号；第7,151,166号；及第7,393,684号；及PCT公开案WO2007/081465；WO 99/27103；WO 2004/085475；及WO2005052000中公开的彼等抗体。

抗IL-20抗体对IL-20(诸如人类IL-20)的结合亲和力可以小于约100nM、约50nM、约10nM、约1nM、约500pM、约100pM或约50pM至约2pM中的任一者。结合亲和力可由K_D或解离常数表示，且结合亲和力增加与K_D减少相对应。一种测定抗体对IL-20的结合亲和力的方式为量测抗体的单功能Fab片段的结合亲和力。为获得单功能Fab片段，抗体(例如IgG)可以用番木瓜蛋白酶裂解或重组表达。抗体的抗IL-20Fab片段的亲和力可以藉由表面电浆子共振(BIAcore3000.TM.表面电浆子共振(SPR)系统,BIAcore,INC,Piscaway N.J.)测定。获得动力学缔合速率(k_合)及解离速率(k_离)(通常在25℃下量测)；且平衡解离常数(K_D)值计算为k_离/k_合。

在一些实施例中，抗体结合人类IL-20，且不显著结合来自另一哺乳动物物种的IL-20。在一些实施例中，抗体结合人类IL-20以及一或多个来自另一哺乳动物物种的IL-20。在又其他实施例中，抗体结合IL-20且不与其他细胞介素(诸如相关细胞介素IL-10、IL-17A、IL-19、IL-22、IL-24及IL-26)发生显著交叉反应。由抗体结合的一或多个抗原决定基可以为连续的或非连续的。

在一些实施例中，本文所描述的抗IL-20抗体为抗IL-20抗体7E，其是指单株抗体mAb 7E及其功能变异体。MAb 7E藉由存放在美国典型培养物保藏中心(10801UniversityBoulevard,Manassas,Va.20110-2209,U.S.A.)的融合瘤细胞株制备，且分配存放编号PTA-8687。此融合瘤细胞株将在美国专利授予本申请案后不可撤消且无限制/条件下释放至公众，且将在ATCC中维持自存放日期至少30年的时间、专利有效期或最近日期的后5年的时间。亦参见美国专利第8,206,712号及第7,611,705号，其各自的相关公开内容以引用的方式并入本文中。

mAb7E的重链可变区(V_H)及轻链可变区(V_L)的氨基酸序列及编码核苷酸序列产生于下文。mAb 7E重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)及氨基酸序列(SEQ ID NO:2)

mAb 7E轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)及氨基酸序列(SEQ ID NO:4)

mAb7E的功能变异体(等效物)与mAb7E具有基本上相同的抗原决定基结合特异性，且展现相对于mAb7E至少20％(例如30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大)的中和由IL-20介导的信号传导路径的活性。在一些实施例中，mAb7E的功能变异体含有与mAb7E相同的负责抗原结合的区域/残基，诸如CDR或整个CDR中相同的特异性决定残基。

另外，抗体中CDR区的测定完全属于此项技术的技能范围内。测定CDR的技术至少有两种：(1)基于交叉物种序列变化性的方法(亦即Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,(第5版,1991,美国国家卫生研究院(National Institutes ofHealth),BethesdaMd.))；及(2)基于抗原-抗体复合物的结晶学研究的方法(科西亚等人,(1989)Nature 342:877；Al-lazikani等人,(1997)J.Molec.Biol.273:927-948))。如本文所用，CDR可指由任一种方法或由两种方法的组合定义的CDR。

在一些实例中，mAb7E的功能变异体包含包括与mAb7E的对应V_H CDR至少75％(例如80％、85％、90％、95％或98％)一致的V_H CDR1、V_H CDR2及V_H CDR3的V_H链，及包括与mAb7E的对应V_H CDR至少75％(例如80％、85％、90％、95％或98％)一致的V_L CDR1、V_L CDR2及V_LCDR3的V_L链。

可替代地，mAb7E的功能变异体包含与mAb7E的V_H链(成熟或前驱体)至少75％(例如80％、85％、90％、95％或98％)一致的VH链及与mAb7E的V_L链(成熟或前驱体)至少75％(例如80％、85％、90％、95％或98％)一致的V_L链。

使用如在Karlin及Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-77,1993中经修饰的Karlin及Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-68,1990的算法来测定两种氨基酸序列的“一致性百分比”。此类算法并入至Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-10,1990的NBLAST及XBLAST程序(版本2.0)中。可以用分数＝50、字长＝3的XBLAST程序进行BLAST蛋白质检索以获得与相关蛋白分子同源的氨基酸序列。当两个序列之间存在间隙时，可如Altschul等人,Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402,1997中所描述利用GappedBLAST。当利用BLAST及间隙式BLAST程序时，可使用各别程序(例如XBLAST及NBLAST)的预设参数。

在其他实例中，mAb7E的功能变异体包含：V_H链，其在该等V_H CDR区(V_H CDR1、CDR2和/或CDR3)中与mAb7E的V_H CDR相比包括至多5个(例如1个、2个、3个、4个或5个)氨基酸残基变异体；和/或V_L链，其在该等V_L CDR区(V_L CDR1、CDR2和/或CDR3)中与mAb7E的V_H CDR相比包括至多5个(例如1个、2个、3个、4个或5个)氨基酸残基变异体。

mAb7E的功能变异体亦公开于美国专利第7,611,705号及US2011/0064731中，其两者以引用的方式并入本文中。

在一个实例中，mAb7E的功能变异体为来源于mAb7E的人类化抗体。下文提供例示性人类化mAb7E抗体HL1及HL2；亦参见美国专利第8,597,647号，其中的相关公开内容以引用的方式并入。

人类化抗IL-20抗体HL1及HL2的V_H链的氨基酸序列及编码核苷酸序列：

带下划线区域是指信号肽，且加粗/斜体区域是CDR。SEQ ID NO:8及7分别表示成熟V_H氨基酸序列(缺乏信号肽)及其编码核苷酸序列。

人类化抗IL-20抗体HL2的V_L链(VL2)的氨基酸序列及编码核苷酸序列：

带下划线区域是指信号肽，且加粗/斜体区域是CDR。SEQ ID NO:12及11分别表示成熟V_L氨基酸序列(缺乏信号肽)及其编码核苷酸序列。

人类化抗体HL1包含与HL2相同的V_H链及在其他方面与HL2的V_L相同的V_L链(SEQ IDNO:13；成熟形式)，其不同之处在于HL2的成熟V_L的位置2处的I残基经F置换。

本文亦公开上述人类化抗体HL1及HL2的功能变异体。此类功能变异体可包含：VH链，其包含与HL1及HL2的V_H(前驱体或成熟形式；分别为SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:8)至少85％(例如90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)一致的氨基酸序列；及VL链，其具有与HL2的V_L(前驱体或成熟形式；分别为SEQ ID NO:10及SEQ ID NO:12)至少85％(例如90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)一致的氨基酸序列。此等变异体能够结合至IL-20分子，尤其人类IL-20分子。在一些实例中，变异体相对于上文所描述的例示性人类化抗体具有类似抗原结合亲和力(例如K_d<4¹⁰)。

(c)抗体制备

能够干扰如本文所描述的IL-20信号传导路径的抗体可以藉由此项技术中已知的任何方法制得。参见例如Harlow及Lane,(1988)Antibodies:A Laboratory Manual，纽约冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory,New York)。

在一些实施例中，特异性针对目标抗原(例如人类IL-20或IL-20R1)的抗体可以藉由已知融合瘤技术制得。视情况偶合至载体蛋白(诸如KLH)的全长目标抗原或其片段可以用于使宿主动物免疫以产生结合至该抗原的抗体。如本文中进一步所描述，宿主动物的免疫接种的路径及时程一般与已建立及已知用于抗体刺激及产生的技术一致。用于生产小鼠、人类化及人类抗体的通用技术为此项技术中已知的和/或描述于本文中。经考虑可以操纵任何哺乳动物(包括人类)个体或自其产生细胞的抗体来充当产生哺乳动物(包括人类)融合瘤细胞株的基础。通常，宿主动物经腹膜内、肌内、经口、皮下、足底内和/或皮内接种一定量的免疫原，包括如本文所描述的免疫原。

融合瘤可以由淋巴细胞及永生化骨髓瘤细胞，使用Kohler,B.及Milstein,C.(1975)Nature 256:495-497的一般体细胞杂交技术或如Buck,D.W.等人,In Vitro,18:377-381(1982)的修改来制备。杂交可使用可获得的骨髓瘤株，包括(但不限于)X63-Ag8.653及得自Salk Institute,Cell Distribution Center,San Diego,Calif.,USA的彼等。一般而言，技术涉及使用诸如聚乙二醇的促融剂或藉由熟习此项技术者熟知的电学方式使骨髓瘤细胞与淋巴细胞融合。融合之后，将细胞自融合培养基分离，且在诸如次黄嘌呤-胺基喋呤-胸苷(HAT)培养基的选择性生长培养基中生长，以除去未杂交的母体细胞。本文所描述的补充有血清或无血清的培养基中的任一者可以用于培养分泌单株抗体的融合瘤。作为细胞融合技术的另一替代方案，EBV永生化B细胞可用于产生本发明的抗IL-20单株抗体。必要时，对融合瘤进行扩增及次克隆，且藉由已知免疫分析程序(例如放射免疫分析、酶免疫分析或荧光免疫分析)来分析上清液的抗免疫原活性。

可用作抗体来源的融合瘤涵盖产生能够干扰IL-20信号传导路径的单株抗体的亲本融合瘤的所有衍生物、子代细胞。可使用已知程序使产生该等抗体的融合瘤在活体外或活体内生长。若需要，可藉由诸如硫酸铵沉淀、凝胶电泳、透析、层析及超过滤的已知免疫球蛋白纯化程序，自培养基或主体流体分离单株抗体。可以例如藉由在由附接至固相的免疫原制成的吸附剂上操作制备且自免疫原溶离或释放出所要抗体，移除非所要活性(若存在)。用使用双功能或衍生剂(例如顺丁烯二酰亚胺基苯甲酰基磺酸基丁二酰亚胺酯(经由半胱胺酸残基结合)、N-羟基丁二酰亚胺(经由离胺酸残基)、戊二醛、丁二酸酐、SOCl或R1N＝C＝NR，其中R及R1为不同烷基)结合至在待免疫的物种中具有免疫原性的蛋白质(例如匙孔螺血氰蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)的目标抗原或含有目标氨基酸序列的片段，对宿主动物进行免疫接种，可以产生抗体(例如单株抗体)群体。

若需要，可对相关(例如产自于融合瘤)抗体(单株或多株)进行测序且随后可将聚核苷酸序列克隆至载体中以便表达或繁殖。编码相关抗体的序列可在宿主细胞中、在载体中维持且宿主细胞随后可以扩增及冷冻供将来使用。在一个替代方案中，聚核苷酸序列可用于基因操纵以使抗体“人类化”或改良抗体的亲和力(亲和力成熟)或其他特征。举例而言，若抗体用于人类的临床试验及治疗，则恒定区可经工程改造以更类似于人类恒定区，从而避免免疫反应。可能需要基因操纵抗体序列以获得对目标抗原更大的亲和力及在抑制由IL-20介导的信号传导路径方面更大的疗效。熟习此项技术者将显而易见，可以对抗体进行一或多个聚核苷酸改变且仍维持其对目标抗原的结合特异性。

在其他实施例中，全人类抗体可以藉由使用已经工程改造以表达特定人类免疫球蛋白的市售小鼠获得。亦可使用经设计以产生更合乎需要(例如完全人类抗体)或更稳固的免疫反应的转殖基因动物产生人类化或人类抗体。此类技术的实例为得自Amgen,Inc.(Fremont,Calif.)的Xenomouse^RTM及得自Medarex,Inc.(Princeton,N.J.)的HuMAb-Mouse^RTM及TC Mouse^TM。在另一替代方案中，抗体可藉由噬菌体呈现技术以重组方式制得。参见例如美国专利第5,565,332号；第5,580,717号；第5,733,743号；及第6,265,150号；及Winter等人,(1994)Annu.Rev.Immunol.12:433-455。可替代地，可使用噬菌体呈现技术(McCafferty等人,(1990)Nature 348:552-553)，利用来自未免疫供者的免疫球蛋白可变(V)域基因谱是活体外产生人类抗体及抗体片段。

完整抗体(全长抗体)的抗原结合片段可以经由常规方法制备。举例而言，F(ab')2片段可以藉由胃蛋白酶消化抗体分子来产生，且Fab片段可以藉由将F(ab')2片段的二硫桥键还原来产生。

经基因工程改造的抗体(诸如人类化抗体、嵌合抗体、单链抗体及双特异性抗体)可以经由例如已知重组技术产生。在一个实例中，编码对目标抗原具特异性的单株抗体的DNA可以容易使用已知程序(例如藉由使用能够特异性结合至编码单株抗体的重链及轻链的基因的寡核苷酸探针)分离及测序。融合瘤细胞充当此类DNA的较佳来源。DNA一经分离，则可置放于一或多种表达载体中，该等表达载体接着转染至宿主细胞(诸如大肠杆菌(E.coli)细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)中(否则不产生免疫球蛋白)，以在重组宿主细胞中达成单株抗体的合成。参见例如，PCT公开案第WO 87/04462号。随后可以修饰DNA，例如藉由用人类重链及轻链恒定域编码序列替换同源鼠类序列(Morrison等人,(1984)Proc.Nat.Acad.Sci.81:6851)或藉由将非免疫球蛋白多肽编码序列的全部或一部分与免疫球蛋白编码序列共价连接。以此方式可以制备具有目标抗原的结合特异性的基因工程改造抗体，诸如“嵌合”或“融合”抗体。

为制备“嵌合抗体”所开发的技术在此项技术中已熟知。参见例如Morrison等人.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81,6851；Neuberger等人.(1984)Nature 312,604；及Takeda等人.(1984)Nature314:452。

用于构建人类化抗体的方法为此项技术中所熟知的。参见例如Queen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:10029-10033(1989)。在一个实例中，亲本非人类抗体的V_H及V_L的可变区经受遵循此项技术中已知的方法的三维分子模型化分析。随后，使用相同分子模型化分析识别预测对于正确CDR结构的形成至关重要的构架氨基酸残基。同时，使用亲本V_H及V_L序列作为搜寻查询自任何抗体基因数据库识别具有与亲本非人类抗体的氨基酸序列同源的氨基酸序列的人类V_H及V_L链。随后选择人类V_H及V_L受体基因。

所选人类受体基因内的CDR区可以用来自亲本非人类抗体或其功能变异体的CDR区置换。必要时，可以使用在与CDR区相互作用时预测为至关重要的母链的构架区内的残基(参见上文描述)以取代人类受体基因中的对应残基。

单链抗体可以经由重组技术藉由连接编码重链可变区的核苷酸序列及编码轻链可变区的核苷酸序列来制备。较佳地，可挠性连接子并入两个可变区之间。

遵循此项技术中已知及本文所描述的方法获得的抗体可以使用此项技术中熟知的方法表征。举例而言，一种方法为识别抗原所结合的抗原决定基，或“抗原决定基定位”。此项技术中已知许多对蛋白质上的抗原决定基位置进行定位及表征的方法，包括求解抗体-抗原错合物的晶体结构、竞争分析、基因片段表达分析及基于合成肽的分析，如例如Harlow及Lane,Using Antibodies,a Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1999的第11章中所描述。在额外实例中，抗原决定基定位可以用于测定抗体所结合的序列。抗原决定基可以为线性抗原决定基，亦即包含于单区段氨基酸中，或藉由可不一定包含于单区段(初级结构线性序列)中的氨基酸的三维相互作用形成的构形抗原决定基。不同长度(例如至少4至6个氨基酸长)的肽可以经分离或合成(例如以重组方式)且用于抗体的结合分析。在另一实例中，抗体所结合的抗原决定基可以在系统性筛选中藉由使用来源于目标抗原序列的重叠肽且测定抗体的结合来测定。根据基因片段表达分析，编码目标抗原的开放阅读框架可随机地或依据特定遗传构造加以片段化，且测定抗原的所表达片段与待测试的抗体的反应性。基因片段可例如藉由PCR产生，且随后在放射性氨基酸存在下活体外转录且转译成蛋白质。随后藉由免疫沉淀及凝胶电泳测定抗体与放射性标记的抗原片段的结合。某些抗原决定基亦可以藉由使用噬菌体颗粒表面上所呈现的随机肽序列的大型文库(噬菌体文库)来识别。可替代地，可以在简单结合分析中测试重叠肽片段的所定义库与测试抗体的结合。在额外实例中，可以进行抗原结合域的突变诱发、域交换实验及丙氨酸扫描突变诱发以识别抗原决定基结合所要、足够和/或需要的残基。举例而言，域交换实验可以使用目标抗原突变体进行，其中IL-20多肽的各种片段已经来自紧密相关、但抗原性不同的蛋白质(诸如神经营养蛋白家族的另一成员)的序列置换(交换)。藉由评估抗体与突变IL-20的结合，可以评估特定抗原片段对抗体结合的重要性。

可替代地，可以使用已知结合于相同抗原的其他抗体进行竞争分析，以确定抗体是否与其他抗体结合于相同抗原决定基。竞争分析已为熟习此项技术者所熟知的。

其他IL-20拮抗剂

如上文所描述的能够干扰IL-20信号传导路径的抗体以外的IL-20拮抗剂可以用于本文所描述的方法中。

在本发明的一些实施例中，IL-20拮抗剂包含至少一个能够阻断或减少功能性IL-20(例如人类IL-20)或IL-20受体的次单元(例如IL-20R1)的表达的反义核酸分子。IL-20及IL-20受体次单元的核苷酸序列为已知的且可容易地获自公开可用的数据库。参见以上公开内容。常规制备将特异性结合目标mRNA而不与其他聚核苷酸交叉反应的反义寡核苷酸分子。靶向的例示性位点包括(但不限于)起始密码子、5'调节区、编码序列及3'未转译区。在一些实施例中，寡核苷酸的长度为约10至100个核苷酸、长度为约15至50个核苷酸、长度为约18至25个核苷酸或更多。寡核苷酸可以包含主链修饰物，诸如硫代磷酸酯键，及此项技术中熟知的2'-0糖修饰物。

可替代地，IL-20/IL-20R表达和/或释放可以使用基因表达阻断、啉基寡核苷酸、短小干扰RNA(siRNA或RNAi)、微小RNA或核糖核酸酶、此项技术中熟知的方法来降低。RNA干扰(RNAi)为dsRNA引导信使RNA的同源序列特异性降级的方法。在哺乳动物细胞中，RNAi可以由短小干扰RNA(siRNA)的21-核苷酸双螺旋体触发而不活化宿主干扰素反应。本文所公开的方法中所用的dsRNA可以为siRNA(含有两个独立且互补的RNA链)或短发夹RNA(亦即形成紧密发夹结构的RNA链)，其两者均可以基于目标基因的序列进行设计。可替代地，所述dsRNA可以为微小RNA。

视情况，待用于本文所描述的方法中的核酸分子(例如，反义核酸、短小干扰RNA或微小RNA)含有非天然存在的核碱基、糖或共价核苷间键(主链)。此类经修饰的寡核苷酸赋予所需特性，诸如增强的细胞吸收、改良的对目标核酸的亲和力及增加的活体内稳定性。

在一个实例中，核酸具有经修饰主链，包括保留磷原子者(参见例如美国专利3,687,808；4,469,863；5,321,131；5,399,676；及5,625,050)及不具有磷原子者(参见例如美国专利5,034,506；5,166,315；及5,792,608)。经含磷修饰的主链的实例包括(但不限于)硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基-磷酸三酯、甲基及其他烷基膦酸酯，包括3'-伸烷基膦酸酯、5'-伸烷基膦酸酯及手性膦酸酯、亚膦酸酯、包括3'-氨基磷酸酯及氨基烷基氨基磷酸酯的氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯及具有3'-5'键或2'-5'键的硒代磷酸酯及硼烷磷酸酯。此类主链亦包括具有反向极性的彼等主链，亦即，3'至3'键、5'至5'键或2'至2'键。不包括磷原子的经修饰的主链具有由短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子及烷基或环烷基核苷间键，或一或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的主链。此类主链包括具有(啉基)键(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷主链；硫基、亚砜及砜主链；甲酰基及硫代甲酰基主链；亚甲基甲酰基及硫代甲酰基主链；核乙酰基主链；含有烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基及亚甲基肼基主链；磺酸酯及磺酰胺主链；酰胺主链；及具有混合N、O、S及CH₂组成部分的其他主链。

在另一实例中，用于所公开方法中的核酸包括一或多个经取代的糖部分。此类经取代的糖部分可以在其2'位置处包括以下基团中的一者：OH；F；O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-烯基、S-烯基；N-烯基、O-炔基、S-炔基、N-炔基及O-烷基-O-烷基。在此等基团中，烷基、烯基及炔基可为经取代或未经取代的C₁至C₁₀烷基或C₂至C₁₀烯基及炔基。其亦可在其2'位置包括杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷氨基、聚烷基氨基、经取代的硅烷基、RNA裂解基团、报导基团、嵌入基团、用于改良寡核苷酸的药物动力学特性的基团或用于改良寡核苷酸的药效动力学特性的基团。较佳经取代的糖部分包括具有2'-甲氧基乙氧基、2'-二甲基氨基氧基乙氧基及2'-二甲基氨基乙氧基乙氧基的糖部分。参见Martin等人,Helv.Chim.Acta,1995,78,486-504。

在另一实例中，核酸包括一或多个经修饰的天然核碱基(亦即腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶及尿嘧啶)。经修饰的核碱基包括美国专利3,687,808；The ConciseEncyclopedia Of Polymer Science And Engineering,第858页至第859页,Kroschwitz,J.I.编,John Wiley&Sons,1990；Englisch等人,Angewandte Chemie,国际版本,1991,30,613；及Sanghvi,Y.S.,第15章,Antisense Research and Applications,第289页至第302页,CRC Press,1993。某些此等核碱基尤其适用于增加反义寡核苷酸与其目标核酸的结合亲和力。此等包括5-取代嘧啶、6-氮杂嘧啶及N-2、N-6及O-6取代嘌呤(例如，2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶及5-丙炔基胞嘧啶)。参见Sanghvi等人编,Antisense Research andApplications,CRC Press,Boca Raton,1993,第276页至第278页)。

核酸中的任一者可以藉由此项技术中已知的方法合成。参见例如Caruthers等人,1992,Methods in Enzymology 211,3-19；Wincott等人,1995,Nucleic Acids Res.23,2677-2684；Wincott1997,Methods Mol.Bio.74,59；Brennan等人,1998,BiotechnolBioeng.,61,33-45；及Brennan,美国专利第6,001,311号。其亦可以自表达载体转录且使用标准技术分离。

在其他实施例中，IL-20拮抗剂包含至少一种IL-20或IL-20R抑制化合物。如本文所使用，“IL-20抑制化合物”或“IL-20R抑制化合物”是指除抗IL-20或抗IL-20R抗体之外的直接或间接降低、抑制、中和或消除IL-20/IL-20R生物活性的化合物。IL-20/IL-20R抑制化合物应呈现以下特征中的任何一或多者：(a)结合至IL-20或IL-20R且抑制其由IL-20信号传导功能介导的生物活性和/或下游路径；(b)预防、改善或治疗眼部疾病的任何态样；(c)阻断或减少IL-20受体活化；(d)提高IL-20或IL-20R的清除；(e)抑制(降低)IL-20或IL-20R合成、产生或释放。熟习此项技术者可以制备其他小分子抑制化合物。

在一些实施例中，IL-20或IL-20R抑制化合物为IL-20突变体、IL-19突变体或IL-24突变体，其可以结合至IL-20受体但无法诱发信号转导。此类突变体可阻断野生型IL-20与IL-20受体的结合，因此预防IL-20信号转导。

在其他实施例中，本文所描述的IL-20或IL-20R抑制化合物为小分子，其分子量可以为约100至20,000道尔顿(dalton)、500至15,000道尔顿或1000至10,000道尔顿中的任一者。小分子的文库为可商购的。小分子可以使用此项技术中已知的任何方式投予，包括吸入、经腹膜内、经静脉内、经肌内、经皮下、经鞘内、经脑室内、经口、经肠、非经肠、经鼻内或经皮。一般而言，当根据本发明的IL20-拮抗剂为小分子时，其将以被分成1至3次或更多次的剂量，以患者重量的0.1至300mg/kg的速率投予。对于正常体重的成年患者而言，可以投予每剂量在1mg至5g范围内的剂量。

上述小分子可以获自化合物文库。文库可以为空间可定址的并行固相或溶液相文库。参见例如Zuckermann等人,J.Med.Chem.37,2678-2685,1994；及Lam Anticancer DrugDes.12:145,1997。用于合成化合物文库的方法为此项技术中所熟知的，例如DeWitt等人,PNAS USA90:6909,1993；Erb等人,PNAS USA 91:11422,1994；Zuckermann等人,J.Med.Chem.37:2678,1994；Cho等人,Science 261:1303,1993；Carrell等人,AngewChem.Int.Ed.Engl.33:2059,1994；Carell等人,Angew Chem.Int.Ed.Engl.33:2061,1994；及Gallop等人,J.Med.Chem.37:1233,1994。化合物的文库可呈现于溶液中(例如，HoughtenBiotechniques 13:412-421,1992)，或珠粒上(Lam Nature 354:82-84,1991)、芯片上(Fodor Nature 364:555-556,1993)、细菌上(美国专利第5,223,409号)、孢子上(美国专利第5,223,409号)、质粒上(Cull等人,PNAS USA 89:1865-1869,1992)或噬菌体上(Scottand Smith Science249:386-390,1990；Devlin Science 249:404-406,1990；Cwirla等人,PNAS USA 87:6378-6382,1990；Felici J.Mol.Biol.222:301-310,1991；及美国专利第5,223,409号)。

在其他实施例中，IL-20拮抗剂可以为包含IL-20受体(诸如IL-20R1、IL-20R2或IL-22R1)的细胞外部分的多肽，其中该多肽特异性结合至11至20且阻断其与一或多种IL-20受体的相互作用。在一些实施例中，IL-20受体的细胞外部分融合至抗体的Fc域。可溶性受体的实例描述于PCT WO 01/46232中。

IL-20拮抗剂的识别

可以使用此项技术中已知的方法识别或表征IL-20拮抗剂，藉此侦测和/或量测IL-20生物活性的降低、改善或中和。举例而言，ELISA型分析可适合于藉由量测经由IL-20级联活化的蛋白质的磷酸化来定性或定量量测IL-20介导的激酶活化。实例包括JNK、ERK、AKT、p38、STAT3及TRAF6。

IL-20拮抗剂亦可以藉由将候选试剂与IL-20或IL-20R一起培育且监测以下特征中的任何一或多者来识别：(a)结合至IL-20或IL-20R且抑制其由IL-20信号传导功能介导的生物活性和/或下游路径；(b)预防、改善或治疗眼部疾病的任何态样；(c)阻断或减少IL-20受体活化；(d)提高IL-20或IL-20R清除；(e)抑制(降低)IL-20合成、产生或释放。在一些实施例中，IL-20拮抗剂藉由将候选试剂与IL-20或IL-20R一起培育且监测IL-20或IL-20R的生物活性的结合及伴随减少或中和来识别。结合分析可用一或多种经纯化的IL-20或IL-20R多肽进行，或用天然表达或经转染以表达一或多种IL-20或IL-20R多肽的细胞进行。在一个实施例中，结合分析为评估候选抗体与已知IL-20拮抗剂竞争结合IL-20或IL-20R的能力的竞争性结合分析。该分析可以包括ELISA格式的各种格式进行。在其他实施例中，IL-20拮抗剂藉由将候选试剂与IL-20或IL-20R(例如IL-20R1)一起培育且监测IL-20R1/IL-20R2复合物形成或IL-20R2/IL-22R1复合物形成的伴随抑制来识别。在初始识别之后，候选IL-20拮抗剂的活性可以藉由已知用以测试目标生物活性的生物分析进一步证实及细化。可替代地，可以使用生物分析直接筛选候选物。

下文提供的实例提供可以用于筛选候选IL-20拮抗剂的多种分析。生物分析包括(但不限于)测定在候选IL-20拮抗剂存在下IL-20与细胞的竞争性结合的流动式细胞测量术；及抑制肾上皮细胞中的IL-20诱导的细胞凋亡。另外，RT-PCR或实时PCR可以用于直接量测IL-20表达或量测由IL-20上调的基因(诸如TNFαMCP-1、IL-1β、IL-6及VEGF)的表达。

免疫检查点抑制剂

免疫检查点抑制剂可以与本文所描述的IL-20拮抗剂组合使用以刺激针对癌细胞的免疫系统且治疗癌症。适用于本发明的免疫检查点抑制剂包括抑制PD-1、PD-L1、CTLA-4、T细胞免疫球蛋白-3(TIM3)、B及T淋巴细胞衰减器(BTLA)的抑制受体的拮抗剂，T细胞活化的V域Ig抑制因子(VISTA)或淋巴细胞活化基因3(LAG3)路径，诸如抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、抗TIM-3抗体、抗BTLA抗体、抗VISTA抗体及抗LAG-3抗体。PD-1或PD-L1抑制剂的实例包括(但不限于)阻断人类PD-1的人类化抗体，诸如派姆单抗(抗PD-1Ab，商标名

)、纳武单抗(抗PD-1Ab，

)或皮立珠单抗(抗PD-1Ab，经测试，CT-011)、特瑞普利单抗(抗PD-1Ab，商标名Tuo

)、信迪利单抗(抗PD-1Ab，商标名

)、卡瑞利珠单抗(抗PD-1Ab)、

(抗PD-L1Ab，阿维鲁单抗)、

(抗PD-L1Ab，德瓦鲁单抗)及

(抗PD-L1 Ab，阿特珠单抗)；以及全人类抗体，诸如纳武单抗(抗PD-1Ab，商标名

)及西米普利单抗-rwlc(cemiplimab-rwlc)(抗PD-1Ab，商标名

)。其他PD-1抑制剂可包括可溶PD-1配位体的呈现，包括(但不限于)亦称为B7-DC-Ig或AMP-244的PD-L2 Fc融合蛋白及当前所研究和/或开发用于治疗的其他PD-1抑制剂。另外，免疫检查点抑制剂可包括(但不限于)阻断PD-L1的人类化或全人类抗体(诸如德瓦鲁单抗及MIH1)及当前所研究的其他PD-L1抑制剂。

包含IL-20拮抗剂及免疫检查点抑制剂的组合

本发明的医药组合可以单一调配物形式提供。在其他实施例中，本发明的医药组合可以单独调配物形式提供。医药组合可以适于一或多种较佳投予途径的多种形式和/或复数种形式调配。因此，医药组合可以经由一或多种已知途径投予，包括例如经口、非经肠(例如经皮内、经皮、经皮下、经肌内、经静脉内、经腹膜内等)或局部(例如经鼻内、经肺内、经乳房内、经阴道内、经子宫内、经皮内、经皮、经直肠等)。医药组合或其一部分可以投予至黏膜表面，诸如藉由投予至例如鼻黏膜或呼吸道黏膜(例如藉由喷雾剂或气雾剂)。医药组合或其一部分亦可以经由持续或延迟释放投予。

包含IL-20拮抗剂及免疫检查点抑制剂的组合用于治疗癌症的用途

用本发明的组合治疗可以治疗和/或预防癌症。癌症的实例包括(但不限于)神经胶母细胞瘤、肝癌、大肠直肠癌、神经胶母细胞瘤、胃癌、大肠直肠癌、食道癌、肺癌、胰脏癌、肾细胞癌、良性前列腺增生、前列腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、乳癌、慢性淋巴球性白血病(CLL)、梅克尔细胞癌、非霍奇金氏淋巴瘤、急性骨髓白血病(AML)、胆囊癌、胆管癌、膀胱癌及子宫癌。

包含IL-20拮抗剂及免疫检查点抑制剂的组合用于治疗纤维化的用途

用本发明的组合治疗会降低组织纤维化程度。在一个实施例中，本发明提供本文所描述的组合用于预防和/或治疗纤维化疾病。在一更特定实施例中，纤维化疾病是选自特发性肺部纤维化、杜普宜特朗氏病、非酒精性脂肪变性肝炎、门静脉高血压、全身性硬化症、肾纤维化、心脏纤维化及皮肤纤维化。在一最特定实施例中，纤维化疾病是特发性肺部纤维化。

虽然以下实例进一步提供本发明的某些态样及实施例的具体实施方式，但其应仅视为说明性的且不以任何方式限制于申请专利范围的范畴。

实施例

在C57BL/6J背景中维持的Kras^+/G12D、Trp53^flox/flox及Pdx-1-Cre(KPC)小鼠含有转译相关蛋白53基因(TP53R172H)中的条件性点突变及KRAS基因中的点突变(KRASG12D)，两者均产生非功能性蛋白。

原位肿瘤模型用于模拟胰脏癌。KPC/Luc细胞(2×10⁶)原位地(o.c.)注射至C57BL/6J WT小鼠的胰脏中。获取生物发光及荧光影像(IVIS 50；Xenogen,Caliper LifeSciences,Hopkinton,MA)以自KPC/Luc细胞侦测发光。在原位模型的此研究中，治疗在肿瘤接种之后第4天开始且在第4周结束。

为证实用7E及程序性死亡受体-1(PD1)mAb的混合式治疗的功效，将C57BL/6J小鼠随机分配至5组(每组n＝5)，且每周两次用磷酸盐缓冲盐水(PBS)、7E(6mg/kg；腹膜内注射《i.p.》)、小鼠免疫球蛋白G(mIgG；6mg/kg；腹膜内注射)、PD1 mAb(200μg/只小鼠；腹膜内注射)或7E(mIgG；6mg/Kg；腹膜内注射)加PD1 mAb(200μg/只小鼠；腹膜内注射)治疗持续时间。在接种之后四周，采集肿瘤样品并秤重。有效结果展示如下。

序列表

<110> 永福生物科技股份有限公司

<120> 使用IL-20拮抗剂和免疫检查点抑制剂的混合式治疗

<130> G4590-07700PCT

<150> US 16/855,637

<151> 2020-04-22

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多聚核苷酸

<400> 1

gaattgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcagc ctggaggatc catgaaactc 60

tcttgtgctg cctctggatt cacttttagt gacgcctgga tggactgggt ccgccagtct 120

ccagagaagg ggcttgagtg gattgctgaa attagaagca aagctaataa ttatgcaaca 180

tactttgctg agtctgtgaa agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtggt 240

gtctacctgc aaatgaacaa cttaagagct gaggacactg gcatttattt ctgtaccaag 300

ttatcactac gttactggtt cttcgatgtc tggggcgcag ggaccacggt caccgtctcc 360

tca 363

<210> 2

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 2

Glu Leu Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala

20 25 30

Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Phe Ala Glu

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Gly

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr

85 90 95

Phe Cys Thr Lys Leu Ser Leu Arg Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly

100 105 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 3

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多聚核苷酸

<400> 3

gattttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctcc 60

atctcttgca agtcaagtca gagcctcttg gatagtgatg gaaagacata tttgaattgg 120

ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaag cacctcatct atctggtgtc taaactggac 180

tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga ccgatttcac actgagaatc 240

agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattattgct ggcaaagtac acattttccg 300

tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaacgg 339

<210> 4

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 4

Asp Phe Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys His Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Ser

85 90 95

Thr His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 5

<211> 420

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码SEQ ID NO:6的氨基酸序列的核苷酸序列

<400> 5

atgtacttgg gactgaacta tgttttcatc gtttttctcc tgaatggtgt ccagagtgaa 60

gtgcagcttg tggagtctgg aggaggcttg gtgcagcctg gaggatccct gaaactctct 120

tgtgctgcct ctggattcac ttttagtgac gcctggatgg actgggtccg ccaggcttcc 180

gggaaggggc ttgagtggat tgctgaaatt agaagcaaag ctaataatta tgcaacatac 240

tttgctgagt ctgtgaaagg gaggttcacc atctcaagag atgattccaa aaacaccgcc 300

tacctgcaaa tgaacagctt aaaaaccgag gacactgccg tttattactg taccaagtta 360

tcactgcgtt actggttctt cgatgtctgg ggccagggga ccctggtcac cgtctcctca 420

<210> 6

<211> 140

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 典型人源化抗IL-20抗体HL1和HL2的前体VH链可变区的氨基酸序列

<400> 6

Met Tyr Leu Gly Leu Asn Tyr Val Phe Ile Val Phe Leu Leu Asn Gly

1 5 10 15

Val Gln Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Asp Ala Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr

65 70 75 80

Phe Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser

85 90 95

Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Lys Leu Ser Leu Arg Tyr Trp Phe Phe Asp

115 120 125

Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

130 135 140

<210> 7

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码 SEQ ID NO:8的氨基酸序列的核苷酸序列

<400> 7

gaagtgcagc ttgtggagtc tggaggaggc ttggtgcagc ctggaggatc cctgaaactc 60

tcttgtgctg cctctggatt cacttttagt gacgcctgga tggactgggt ccgccaggct 120

tccgggaagg ggcttgagtg gattgctgaa attagaagca aagctaataa ttatgcaaca 180

tactttgctg agtctgtgaa agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaaacacc 240

gcctacctgc aaatgaacag cttaaaaacc gaggacactg ccgtttatta ctgtaccaag 300

ttatcactgc gttactggtt cttcgatgtc tggggccagg ggaccctggt caccgtctcc 360

tca 363

<210> 8

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 典型人源化抗IL -20抗体HL1和HL2的成熟VH链可变区(缺乏信号肽)的氨基酸序列

<400> 8

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala

20 25 30

Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Phe Ala Glu

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Lys Leu Ser Leu Arg Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 9

<211> 396

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码SEQ ID NO:10的氨基酸序列的核苷酸序列

<400> 9

atgatgagtc ctgcccagtt cctgtttctg ttggtgctct ggattcggga aaccaacggt 60

gatatcgtga tgacccagac tccactctct ttgtccgtta cccctggaca accagcctcc 120

atctcttgca agtcaagtca gagcctcttg gatagtgatg gaaagacata tttgaattgg 180

ttgttacaga agccaggcca gtctccacag cacctcatct atctggtgtc taaactggac 240

tctggagtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggga ccgatttcac actgaaaatc 300

agcagagtgg aggctgagga tgttggagtt tattattgct ggcaaagtac acattttccc 360

tggaccttcg gtggaggcac caaggtggaa atcaaa 396

<210> 10

<211> 132

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 典型人源化抗IL -20抗体HL2的前体VL链可变区的氨基酸序列

<400> 10

Met Met Ser Pro Ala Gln Phe Leu Phe Leu Leu Val Leu Trp Ile Arg

1 5 10 15

Glu Thr Asn Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser

20 25 30

Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser

35 40 45

Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys

50 55 60

Pro Gly Gln Ser Pro Gln His Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp

65 70 75 80

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

85 90 95

Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr

100 105 110

Cys Trp Gln Ser Thr His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys

115 120 125

Val Glu Ile Lys

130

<210> 11

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码SEQ ID NO:12的氨基酸序列的核苷酸序列

<400> 11

gatatcgtga tgacccagac tccactctct ttgtccgtta cccctggaca accagcctcc 60

atctcttgca agtcaagtca gagcctcttg gatagtgatg gaaagacata tttgaattgg 120

ttgttacaga agccaggcca gtctccacag cacctcatct atctggtgtc taaactggac 180

tctggagtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggga ccgatttcac actgaaaatc 240

agcagagtgg aggctgagga tgttggagtt tattattgct ggcaaagtac acattttccc 300

tggaccttcg gtggaggcac caaggtggaa atcaaa 336

<210> 12

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 典型人源化抗IL-20抗体HL2的成熟VL链可变区(缺乏信号肽)的氨基酸序列

<400> 12

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln His Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Ser

85 90 95

Thr His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 13

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 与HL2的VL相同，只是HL2成熟VL位置2的I残基被F取代

<400> 13

Asp Phe Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln His Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Ser

85 90 95

Thr His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Claims

1.一种用于治疗个体的癌症或纤维化或延迟癌症或纤维化发作的方法，其中所述方法包含向有需要的所述个体投予有效量的包含IL-20拮抗剂及免疫检查点抑制剂的医药组合。

2.如权利要求1的方法，其中所述抗IL-20拮抗剂为结合至IL-20的抗体。

3.如权利要求1的方法，其中所述抗体为结合人类IL-20的抗体。

4.如权利要求1的方法，其中所述抗体为全长抗体或其抗原结合片段。

5.如权利要求1的方法，其中所述抗体为人类抗体、人类化抗体、嵌合抗体或单链抗体。

6.如权利要求1的方法，其中所述抗IL-20抗体结合至与单株抗体mAb7E相同的人类IL-20的抗原决定基，或与mAb7E竞争结合至人类IL20。

7.如权利要求1的方法，其中所述抗体包含与mAb7E相同的重链互补决定区(CDR)及与mAb7E相同的轻链CDR。

8.如权利要求1的方法，其中所述抗体为mAb7E的人类化抗体。

9.如权利要求1的方法，其中所述人类化抗体包含重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:12或SEQID NO:13的氨基酸序列。

10.如权利要求1的方法，其中所述免疫检查点抑制剂为抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。

11.如权利要求1的方法，其中所述免疫检查点抑制剂为派姆单抗(pembrolizumab)、皮立珠单抗(pidilizumab)、纳武单抗(nivolumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、特瑞普利单抗(toripalimab)、信迪利单抗(sintilimab)、卡瑞利珠单抗(camrelizumab)或MIHI。

12.如权利要求1的方法，其中所述IL-20拮抗剂及所述免疫检查点抑制剂是同时、分开或依序投予。

13.如权利要求1的方法，其中所述癌症为胰脏癌、神经胶母细胞瘤、肝癌、大肠直肠癌、神经胶母细胞瘤、胃癌、大肠直肠癌、食道癌、肺癌、肾细胞癌、良性前列腺增生、前列腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、乳癌、慢性淋巴球性白血病(CLL)、梅克尔细胞癌(Merkel cellcarcinoma)、非霍奇金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin lymphoma)、急性骨髓白血病(AML)、胆囊癌、胆管癌、膀胱癌及子宫癌。

14.如权利要求13的方法，其中所述胰脏癌为腺癌或非腺癌。

15.如权利要求1的方法，其中所述纤维化为肺纤维化、特发性肺纤维化、杜普宜特朗氏病(Dupuytren disease)、非酒精性脂肪变性肝炎、肝纤维化、门静脉高血压、全身性硬化症、肾纤维化、心脏纤维化及皮肤纤维化。