CN118525034A - 犬白介素-31受体αI的犬源化抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供针对犬IL‑31受体α的犬源化小鼠抗体，其对犬IL‑31受体α具有高结合亲和力，并且能够阻断犬IL‑31与犬IL‑31受体α的结合。本发明还提供了所述抗体用于治疗狗的特应性皮炎的用途。
Description
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相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2022年5月13日提交的美国临时申请No.63/341，443，2021年12月16日提交的美国临时申请No.63/290，259和2021年12月16日提交的美国临时申请No.63/290，256的优先权。其主题内容通过引用整体并入本文。
发明领域
本发明涉及犬IL-31受体α的抗体，其对犬IL-31受体α具有高结合亲和力，并且能够阻断犬IL-31与犬IL-31受体α的结合。本发明还涉及本发明的抗体在治疗狗的特应性皮炎中的用途。
发明背景
免疫系统包括常驻和再循环特化细胞的网络，其协同作用以保护宿主抵抗感染性疾病和癌症。免疫系统执行这种功能的能力在很大程度上取决于由白细胞分泌的一组蛋白质的生物活性，这些蛋白质统称为白细胞介素。在充分研究的白介素中，有四种重要的分子被鉴定为白介素-31(IL-31)、白介素-4(IL-4)、白介素-13(IL-13)和白介素-22(IL-22)。尽管IL4、IL-13、IL-22和IL-31是产生针对细胞外病原体(例如，组织或腔居留寄生虫)的保护所需的免疫应答的关键细胞因子，但这些细胞因子也涉及人和动物中的过敏性疾病(包括特应性皮炎)的发病机理。
特应性皮炎(AD)是复发性瘙痒和慢性炎性皮肤病，其特征在于人的免疫系统失调和表皮屏障异常。特应性皮炎的病理学和免疫学属性已经成为广泛研究的主题[综述于Rahman et al.Inflammation&Allergy-drug target 10:486-496(2011)和Harskamp etal.,Seminar in Cutaneous Medicine and Surgery 32:132-139(2013)]。特应性皮炎也是伴侣动物(尤其是狗，其中估计其患病率为犬科动物群体的约10-15％)的常见病症。狗和猫的特应性皮炎的发病机理[综述于Nuttall et al.,Veterinary Records 172(8):201-207(2013)]显示与人的特应性皮炎的显著相似性，包括多种免疫细胞的皮肤浸润和CD4+Th2极化的包括IL-31、IL-4和IL-13占优势的细胞因子环境。此外，IL-22涉及过度上皮增殖，导致特应性皮炎特有的表皮增生。
例如，针对犬IL-31的抗体已显示对犬的与特应性皮炎相关的瘙痒具有作用[US8，790，651B2；US10，093，731B2]。此外，已经测试了针对人IL-31受体α(IL-31RA)的抗体，并且发现其对人的与特应性皮炎相关的瘙痒具有作用[Ruzicka,et al.,New England Journalof Medicine,376(9),826–835(2017)]。
已经证明有助于治疗特应性皮炎和/或已经显示出这样做的前景的药物包括：Janus激酶(JAK)抑制剂[参见例如U.S.8，133，899；U.S.8，987，283；WO 2018/108969]，脾酪氨酸激酶(SYK)抑制剂[参见例如U.S.8，759，366]和TH2细胞上表达的趋化性受体同源分子的拮抗剂[参见例如U.S.7，696，222、U.S.8，546，422、U.S.8，637，541和U.S.8，546，422]。
然而，尽管最近在治疗特应性皮炎方面取得了一些成功，但仍需要设计可解决犬特应性皮炎的一种或多种症状的替代性和/或更好的疗法。
本文中任何参考文献的引用不应被解释为承认此类参考文献可作为本申请的“现有技术”获得。
发明内容
本发明提供了针对来自犬的IL-31受体α(IL-31RA)的新的哺乳动物抗体，包括犬源化的鼠抗体。在某些实施方案中，针对犬IL-31受体α(cIL-31RA)的哺乳动物抗体是分离的抗体。在优选的实施方案中，哺乳动物抗体或其抗原结合片段结合犬IL-31RA。在更具体的实施方案中，哺乳动物抗体或抗原结合片段还阻断犬IL-31RA与犬白介素-31的结合。在某些实施方案中，哺乳动物抗体是针对犬IL-31RA的抗体。在更具体的实施方案中，哺乳动物抗体是犬源化抗体。在甚至更具体的实施方案中，犬源化抗体是针对犬IL-31RA的犬源化鼠抗体。
因此，本发明提供了一种结合犬IL-31RA的哺乳动物抗体(包括犬源化的抗体)或其抗原结合片段，其中所述抗体包含重链和轻链，所述重链和轻链共同包含六个互补决定区(CDR)的集合，其中三个是重链CDR：CDR重链1(HCDR1)、CDR重链2(HCDR2)和CDR重链3(HCDR3)，且其中三个是轻链CDR：CDR轻链1(LCDR1)、CDR轻链2(LCDR2)和CDR轻链3(LCDR3)。
在特定的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR1，含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HCDR2和含有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的HCDR3。在此类特定实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段还包含含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的LCDR1，含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的LCDR2和含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LCDR3。在更特定实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段在与犬IL-31RA结合时与SEQ ID NO:106的氨基酸序列所包含的表位结合。在其他实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段在与犬IL-31RA结合时与SEQ ID NO:108的氨基酸序列所包含的表位结合。在其他实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段在与犬IL-31RA结合时与SEQ ID NO:106的氨基酸序列和SEQ ID NO:108的氨基酸序列所包含的表位结合。
在替代性的实施方案中，哺乳动物抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HCDR1，含有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的HCDR2和含有SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HCDR3。在这种类型的具体的实施方案中，哺乳动物抗体或其抗原结合片段还包含含有SEQ ID NO：32的氨基酸序列的LCDR1，含有SEQ ID NO：41的氨基酸序列的LCDR2和含有SEQ ID NO：47的氨基酸序列的LCDR3。在更具体的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段在与犬IL-31RA结合时与SEQ ID NO:98的氨基酸序列所包含的表位结合。在其他的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段在与犬IL-31RA结合时与SEQ IDNO:100的氨基酸序列所包含的表位结合。在其他的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段在与犬IL-31RA结合时与SEQ ID NO:98的氨基酸序列和SEQ ID NO:100的氨基酸序列所包含的表位结合。
在其他实施方案中，哺乳动物抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的HCDR1，含有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的HCDR2和含有SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HCDR3。在这种类型的具体的实施方案中，哺乳动物抗体或其抗原结合片段还包含含有SEQ ID NO：32的氨基酸序列的LCDR1，含有SEQ ID NO：42的氨基酸序列的LCDR2和含有SEQ ID NO：48的氨基酸序列的LCDR3。在更具体的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段在与犬IL-31RA结合时与SEQ ID NO:98的氨基酸序列所包含的表位结合。在其他的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段在与犬IL-31RA结合时与SEQ ID NO:101的氨基酸序列所包含的表位结合。在其他的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段在与犬IL-31RA结合时与SEQ ID NO:98的氨基酸序列和SEQ ID NO:101的氨基酸序列所包含的表位结合。
在其他实施方案中，哺乳动物抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的HCDR1，含有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的HCDR2和含有SEQ ID NO：27的氨基酸序列的HCDR3。在这种类型的具体的实施方案中，哺乳动物抗体或其抗原结合片段还包含含有SEQ ID NO：34的氨基酸序列的LCDR1，含有SEQ ID NO：37的氨基酸序列的LCDR2和含有SEQ ID NO：50的氨基酸序列的LCDR3。在更具体的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段在与犬IL-31RA结合时与SEQ ID NO:106的氨基酸序列所包含的表位结合。在其他的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段在与犬IL-31RA结合时与SEQ ID NO:107的氨基酸序列所包含的表位结合。在其他的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段在与犬IL-31RA结合时与SEQ ID NO:106的氨基酸序列和SEQ ID NO:107的氨基酸序列所包含的表位结合。
在其他实施方案中，哺乳动物抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的HCDR1，含有SEQ ID NO：18的氨基酸序列的HCDR2和含有SEQ ID NO：28的氨基酸序列的HCDR3。在这种类型的具体的实施方案中，哺乳动物抗体或其抗原结合片段还包含含有SEQ ID NO：35的氨基酸序列的LCDR1，含有SEQ ID NO：43的氨基酸序列的LCDR2和含有SEQ ID NO：51的氨基酸序列的LCDR3。在更具体的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段在与犬IL-31RA结合时与SEQ ID NO:104的氨基酸序列所包含的表位结合。在其他的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段在与犬IL-31RA结合时与SEQ ID NO:105的氨基酸序列所包含的表位结合。在其他的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段在与犬IL-31RA结合时与SEQ ID NO:104的氨基酸序列和SEQ ID NO:105的氨基酸序列所包含的表位结合。
在其他实施方案中，哺乳动物抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HCDR1，含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的HCDR2和含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HCDR3。在这种类型的特定实施方案中，哺乳动物抗体或其抗原结合片段还包含含有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的LCDR1，含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LCDR2和含有SEQID NO:49的氨基酸序列的LCDR3。在更特定的实施方案中，哺乳动物抗体或其抗原结合片段在与犬IL-31RA结合时与SEQ ID NO:109的氨基酸序列所包含的表位结合。
在优选的实施方案中，抗体及其抗原结合片段结合犬IL-31RA并阻断犬IL-31RA与犬白介素-31的结合。在具体的实施方案中，针对犬IL-31RA的哺乳动物抗体是鼠抗体。在特定实施方案中，针对犬IL-31RA的哺乳动物抗体是犬源化抗体。在更具体的实施方案中，针对犬IL-31RA的犬源化抗体是犬源化鼠抗体。
本发明的犬源化抗体包含犬片段可结晶区(cFc)。本发明的犬源化抗体还包含犬轻链恒定区。在特定的实施方案中，犬轻链恒定区是κ犬轻链恒定区。在更具体的实施方案中，κ犬轻链恒定区包含SEQ ID NO：127的氨基酸序列。
此外，犬源化抗体或其抗原结合片段可包含含有cFc区和铰链区的重链。铰链区优选为犬铰链区。犬铰链区可包含天然存在的：IgG-A铰链区，IgG-B铰链区，IgG-C铰链区，或IgG-D铰链区。或者，铰链区是相应的修饰的犬铰链区。在特定的实施方案中，铰链区是包含含有与SEQ ID NO：112的氨基酸序列至少90％、95％或100％同一性的氨基酸序列的IgG-A铰链区。在其他实施方案中，铰链区是包含含有与SEQ ID NO：113的氨基酸序列至少90％、95％或100％同一性的氨基酸序列的IgG-B铰链区。在其他实施方案中，铰链区是包含含有与SEQ ID NO：114的氨基酸序列至少90％、95％或100％同一性的氨基酸序列的IgG-C铰链区。在其他实施方案中，铰链区是包含SEQ ID NO：115的氨基酸序列的修饰的IgG-D铰链区。
类似地，犬Fc区可以是IgG-A，IgG-B，IgG-C，IgG-D或其修饰物。在特定的实施方案中，犬源化抗体或其抗原结合片段包含IgG-Bm。在某些实施方案中，犬源化抗体或其抗原结合片段包含IgG-A，所述IgG-A包含含有与SEQ ID NO：116的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在其他实施方案中，犬源化抗体或其抗原结合片段包含IgG-B，所述IgG-B包含含有与SEQ ID NO：110的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在其他实施方案中，犬源化抗体或其抗原结合片段包含含有与SEQ ID NO：117的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的IgG-C。在其他实施方案中，犬源化抗体或其抗原结合片段包含含有与SEQ ID NO：118的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的IgG-D。在其他实施方案中，犬源化抗体或其抗原结合片段包含含有与SEQ ID NO：111的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的IgG-Bm，其中SEQ ID NO：110的位置31处的天冬氨酸残基(D)和SEQ ID NO：110的位置63处的天冬酰胺残基(N)均保持被IgG-Bm序列中的丙氨酸残基(A)取代。
在特定的实施方案中，犬源化抗体或其抗原结合片段包含犬IgG-D，但天然存在的IgG-D铰链区被包含含有与SEQ ID NO：112的氨基酸序列至少90％、95％或100％同一性的氨基酸序列的铰链区取代。在其他实施方案中，犬源化抗体包含含有IgG-D的重链，但天然存在的IgG-D铰链区被含有包含与SEQ ID NO：113的氨基酸序列至少90％、95％或100％同一性的氨基酸序列的铰链区取代。在其他实施方案中，犬源化抗体包含含有IgG-D的重链，但天然存在的IgG-D铰链区被含有包含与SEQ ID NO：114的氨基酸序列至少90％、95％或100％同一性的氨基酸序列的铰链区取代。在其他实施方案中，犬源化抗体包含含有IgG-D的重链，但天然存在的IgG-D铰链区被含有SEQ ID NO：115的氨基酸序列的铰链区取代。
在某些实施方案中，针对犬IL-31RA的犬源化抗体或其抗原结合片段包含含有SEQID NO:93的氨基酸序列的重链可变区。在其他实施方案中，针对犬IL-31RA的犬源化抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:94的氨基酸序列的重链可变区。在其他实施方案中，针对犬IL-31RA的犬源化抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的重链可变区。在又其他实施方案中，针对犬IL-31RA的犬源化抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:96的氨基酸序列的重链可变区。所有这些重链可变区还可以包含上文所述的犬铰链区和/或cFc。
在相关实施方案中，针对犬IL-31RA的犬源化抗体或其抗原结合片段包含含有SEQID NO:128的氨基酸序列的轻链可变区。在其他实施方案中，针对犬IL-31RA的犬源化抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:129的氨基酸序列的轻链可变区。在又其他实施方案中，针对犬IL-31RA的犬源化抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:130的氨基酸序列的轻链可变区。在其他实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO：93的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO：128的氨基酸序列的轻链可变区。在其他实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO：93的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO：129的氨基酸序列的轻链可变区。在其他实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO：93的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO：130的氨基酸序列的轻链可变区。
在其他实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO：94的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO：128的氨基酸序列的轻链可变区。在其他实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO：94的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO：129的氨基酸序列的轻链可变区。在其他实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO：94的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO：130的氨基酸序列的轻链可变区。
在其他实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:128的氨基酸序列的轻链可变区。在其他实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:129的氨基酸序列的轻链可变区。在其他实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:130的氨基酸序列的轻链可变区。
在其他实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:96的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:128的氨基酸序列的轻链可变区。在其他实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:96的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:129的氨基酸序列的轻链可变区。在其他实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:96的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:130的氨基酸序列的轻链可变区。
在相关实施方案中，针对犬IL-31RA的犬源化抗体或其抗原结合片段包含含有SEQID NO:90的氨基酸序列的轻链。在其他实施方案中，针对犬IL-31RA的犬源化抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的轻链。在其他实施方案中，针对犬IL-31RA的犬源化抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的轻链。
在其他实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:93的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链可变区。在其他实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:93的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的轻链可变区。在其他实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:93的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的轻链可变区。
在其他实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:94的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链可变区。在其他实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:94的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的轻链可变区。在其他实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:94的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的轻链可变区。
在其他实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链可变区。在其他实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的轻链可变区。在其他实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的轻链可变区。
在其他实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:96的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链可变区。在其他实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:96的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的轻链可变区。在其他实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:96的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的轻链可变区。
在某些实施方案中，针对犬IL-31RA的犬源化抗体或其抗原结合片段包含含有SEQID NO:86的氨基酸序列的重链。在其他实施方案中，针对犬IL-31RA的犬源化抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的重链。在其他实施方案中，针对犬IL-31RA的犬源化抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的重链。在其他实施方案中，针对犬IL-31RA的犬源化抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的重链。
在其他实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:86的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链可变区。在其他实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:86的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的轻链可变区。在其他实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:86的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的轻链可变区。
在其他实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链可变区。在其他实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的轻链可变区。在其他实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的轻链可变区。
在其他实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链可变区。在其他实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的轻链可变区。在其他实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的轻链可变区。
在其他实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链可变区。在其他实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的轻链可变区。在其他实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的轻链可变区。
在某些实施方案中，针对犬IL-31RA的犬源化抗体或其抗原结合片段包含含有SEQID NO:72的氨基酸序列的重链。在其他实施方案中，针对犬IL-31RA的犬源化抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的重链。在其他实施方案中，针对犬IL-31RA的犬源化抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的重链。在其他实施方案中，针对犬IL-31RA的犬源化抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的重链。
在相关实施方案中，针对犬IL-31RA的犬源化抗体或其抗原结合片段包含含有SEQID NO:76的氨基酸序列的轻链。在其他实施方案中，针对犬IL-31RA的犬源化抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的轻链。在其他实施方案中，针对犬IL-31RA的犬源化抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的轻链。
在其他的实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的轻链可变区。在其他实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的轻链可变区。在其他实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的轻链可变区。
在其他的实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的轻链可变区。在其他实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的轻链可变区。在其他实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的轻链可变区。
在其他的实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的轻链可变区。在其他实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的轻链可变区。在其他实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的轻链可变区。
在其他的实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的轻链可变区。在其他实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的轻链可变区。在其他实施方案中，犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的轻链可变区。
本发明进一步提供犬或犬源化抗体或其抗原结合片段，其与犬白介素-31受体α(犬IL-31RA)结合并阻断犬IL-31RA与犬IL-31的结合，并且当与犬IL-31RA结合时，所述抗体与以下的氨基酸序列所包含的表位结合：SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ IDNO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109或其任何组合。
在具体的实施方案中，当与犬IL-31RA结合时，哺乳动物抗体(例如犬源化抗体)结合以下氨基酸序列所包含的表位：SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：105，或SEQ ID NO：104和SEQ ID NO：105两者；或SEQ ID NO：98或SEQ ID NO：100，或SEQ ID NO：98和SEQ ID NO：100两者；或SEQ ID NO：106或SEQ ID NO：108，或SEQ ID NO：106和SEQ ID NO：108两者。表位的鉴定可基于化学交联和质谱检测。在相关的实施方案中，当与犬IL-31RA结合时，哺乳动物抗体结合SEQ ID NO：104的氨基酸序列内或SEQ ID NO：105内，或SEQ ID NO：104和SEQ IDNO：105二者；或SEQ ID NO：98或SEQ ID NO：100，或SEQ ID NO：98和SEQ ID NO：100二者；或SEQ ID NO：106或SEQ ID NO：108，或SEQ ID NO：106和SEQ ID NO：108二者的氨基酸序列内的至少一个氨基酸残基，优选1-3个氨基酸残基，更优选2-5个氨基酸残基，和/或更优选3-8个氨基酸残基或更多。
在更具体的实施方案中，结合SEQ ID NO：104的哺乳动物抗体结合SEQ ID NO.2的225位的精氨酸残基，即R225。在其他实施方案中，结合SEQ ID NO：104的哺乳动物抗体结合SEQ ID NO.2的236位苏氨酸残基，即T236。在其他实施方案中，结合SEQ ID NO：105的哺乳动物抗体结合SEQ ID NO.2的298位精氨酸残基，即R298。在其他实施方案中，结合SEQ ID NO：105的哺乳动物抗体结合SEQ ID NO.2的305位的赖氨酸残基，即K305。在其他实施方案中，结合SEQ ID NO：105的哺乳动物抗体结合SEQ ID NO.2的306位的苏氨酸残基，即T306。在其他实施方案中，哺乳动物抗体与来自以下中的至少两个氨基酸残基结合：SEQ ID NO:102的R225和/或T236和/或R298和/或K305和/或T306。在这种类型的特定实施方案中，哺乳动物抗体与SEQ ID NO:102的R225、T236、R298、K305和T306结合。本发明进一步提供了这些哺乳动物抗体的抗原结合片段。
在替代性的实施方案中，与SEQ ID NO:98结合的哺乳动物抗体与SEQ ID NO.2的102位的赖氨酸残基结合，即K102。在其他实施方案中，与SEQ ID NO:98结合的哺乳动物抗体与SEQ ID NO.2的110位的丝氨酸残基结合，即S110。在其他实施方案中，与SEQ ID NO:98结合的哺乳动物抗体与SEQ ID NO.2的112位的赖氨酸残基结合，即K112。在其他实施方案中，与SEQ ID NO:98结合的哺乳动物抗体与SEQ ID NO.2的118位的赖氨酸残基结合，即K118。在其他实施方案中，与SEQ ID NO:98结合的哺乳动物抗体与SEQ ID NO.2的119位的精氨酸残基结合，即R119。在其他实施方案中，与SEQ ID NO:100结合的哺乳动物抗体与SEQ ID NO.2的176位的苏氨酸残基结合，即T176。在其他实施方案中，与SEQ ID NO:100结合的哺乳动物抗体与SEQ ID NO.2的178位的酪氨酸残基结合，即Y178。在其他实施方案中，与SEQ ID NO:100结合的哺乳动物抗体与SEQ ID NO.2的189位的丝氨酸残基结合，即S189。在其他实施方案中，哺乳动物抗体与来自以下中的至少两个氨基酸残基结合：SEQ ID NO:102的K102和/或S110和/或K112和/或K118和/或R119和/或T176和/或Y178和/或S189。在特定实施方案中，哺乳动物抗体与SEQ ID NO.2的K102、S110、K112、K118、R119、T176、Y178和S189结合。本发明进一步提供了这些哺乳动物抗体的抗原结合片段。
在其他替代性实施方案中，与SEQ ID NO:106结合的哺乳动物抗体与SEQ ID NO.2的430位的精氨酸残基结合，即R430。在其他实施方案中，与SEQ ID NO:106结合的哺乳动物抗体与SEQ ID NO.2的435位的赖氨酸残基结合，即K435。在其他实施方案中，与SEQ ID NO:106结合的哺乳动物抗体与SEQ ID NO.2的438位的苏氨酸残基结合，即T438。在其他实施方案中，与SEQ ID NO:106结合的哺乳动物抗体与SEQ ID NO.2的441位置的酪氨酸残基结合，即Y441。在其他实施方案中，与SEQ ID NO:108结合的哺乳动物抗体与SEQ ID NO.2的472位的丝氨酸残基结合，即S472。在其他实施方案中，与SEQ ID NO:108结合的哺乳动物抗体与SEQ ID NO.2的479位的苏氨酸残基结合，即T479。在其他实施方案中，与SEQ ID NO:108结合的哺乳动物抗体与SEQ ID NO.2的487位的苏氨酸残基结合，即T487。
在其他实施方案中，哺乳动物抗体与来自以下中的至少两个氨基酸残基结合：SEQID NO:102的R430和/或K435和/或T438和/或Y441和/或S472和/或T479和/或T487。在特定实施方案中，哺乳动物抗体与SEQ ID NO.2的R430、K435、T438、Y441、S472、T479和T487结合。本发明进一步提供了这些哺乳动物抗体的抗原结合片段。
本发明还提供了编码以下任何的核酸，包括分离的核酸：3个HCDR或3个LCDR的组；犬源化抗体或其抗原结合片段的重链可变区；犬源化抗体或其抗原结合片段的重链，犬源化抗体或其抗原结合片段的轻链可变区，和/或犬源化抗体或其抗原结合片段的轻链。本发明还提供了一对核酸，其中该对核酸中的一个包含编码本发明的任一种抗体的特异性犬源化抗体的轻链的核苷酸序列，且该对核酸中的另一个包含编码该(所述)特异性犬源化抗体的重链的核苷酸序列。本发明还提供了包含这样的核酸对或本发明的单个核酸的表达载体。此外，本发明提供了表达载体对，其中所述表达载体对中的一个包含含有编码本发明抗体中的任一种的特异性犬源化抗体的轻链的核苷酸序列的核酸，并且所述表达载体对中的另一个包含含有编码该(所述)特异性犬源化抗体的重链的核苷酸序列的核酸。
因此，本发明提供了编码本发明的哺乳动物抗体(包括犬源化抗体)的一组三个重链互补决定区(CDR)，CDR重链1(HCDR1)，CDR重链2(HCDR2)和CDR重链3(HCDR3)的核酸，编码本发明的哺乳动物抗体(包括犬源化抗体的)或其抗原结合片段的一组三个轻链互补决定区(CDR)，CDR轻链1(LCDR1)，CDR轻链2(LCDR2)和CDR轻链3(LCDR3)的核酸，或这种轻链和重链CDR的对。
在某些实施方案中，核酸编码包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQID NO:14的氨基酸序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的HCDR3。在相关实施方案中，核酸编码包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LCDR3。本发明进一步提供了成对的编码该组三个重链CDR的核酸和编码该组三个轻链CDR的核酸。本发明还提供了包含该对两个核酸的试剂盒。在某些实施方案中，编码该组三个重链CDR的核酸编码犬源化抗体的重链，并且编码该组三个轻链CDR的相应核酸编码该犬源化抗体的轻链。
在其他实施方案中，核酸编码包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQID NO:15的氨基酸序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的HCDR3。在相关实施方案中，核酸编码包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的LCDR3。本发明还提供成对的编码该组三个重链CDR的核酸和编码该组三个轻链CDR的核酸。本发明还提供了包含该对两个核酸的试剂盒。在某些实施方案中，编码该组三个重链CDR的核酸编码犬源化抗体的重链，并且编码该组三个轻链CDR的相应核酸编码该犬源化抗体的轻链。
在其他实施方案中，核酸编码包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQID NO:16的氨基酸序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的HCDR3。在相关实施方案中，核酸编码包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的LCDR3。本发明还提供成对的编码该组三个重链CDR的核酸和编码该组三个轻链CDR的核酸。本发明还提供了包含该对两个核酸的试剂盒。在某些实施方案中，编码该组三个重链CDR的核酸编码犬源化抗体的重链，并且编码该组三个轻链CDR的相应核酸编码该犬源化抗体的轻链。
在其他实施方案中，核酸编码包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQID NO:17的氨基酸序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的HCDR3。在相关实施方案中，核酸编码包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的LCDR3。本发明还提供成对的编码该组三个重链CDR的核酸和编码该组三个轻链CDR的核酸。本发明还提供了包含该对两个核酸的试剂盒。在某些实施方案中，编码该组三个重链CDR的核酸编码犬源化抗体的重链，并且编码该组三个轻链CDR的相应核酸编码该犬源化抗体的轻链。
在其他实施方案中，核酸编码包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQID NO:18的氨基酸序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的HCDR3。在相关实施方案中，核酸编码包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的LCDR3。本发明还提供成对的编码该组三个重链CDR的核酸和编码该组三个轻链CDR的核酸。本发明还提供了包含该对两个核酸的试剂盒。在某些实施方案中，编码该组三个重链CDR的核酸编码犬源化抗体的重链，并且编码该组三个轻链CDR的相应核酸编码该犬源化抗体的轻链。
在其他实施方案中，核酸编码包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQID NO:19的氨基酸序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HCDR3。在相关实施方案中，核酸编码包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的LCDR3。本发明还提供成对的编码该组三个重链CDR的核酸和编码该组三个轻链CDR的核酸。本发明还提供了包含该对两个核酸的试剂盒。在某些实施方案中，编码该组三个重链CDR的核酸编码犬源化抗体的重链，并且编码该组三个轻链CDR的相应核酸编码该犬源化抗体的轻链。
本发明还提供了编码本发明的哺乳动物抗体(包括犬源化抗体)或其抗原结合片段的重链可变区的核酸。本发明进一步提供了编码本发明的哺乳动物抗体(包括犬源化抗体)或其抗原结合片段的重链的核酸。本发明还提供了编码本发明的哺乳动物抗体(包括犬源化抗体)或其抗原结合片段的轻链的核酸。本发明进一步提供了成对的编码该组三个重链CDR的核酸和编码该组三个轻链CDR的核酸。本发明还提供了包含该对两个核酸的试剂盒。在某些实施方案中，编码该组三个重链CDR的核酸编码犬源化抗体的重链，并且编码该组三个轻链CDR的相应核酸编码该犬源化抗体的轻链。
在具体实施方案中，本发明的核酸编码犬源化抗体或其抗原结合片段的重链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列。在相关实施方案中，核酸编码犬源化抗体或其抗原结合片段的轻链可变区，其中轻链可变区包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列。本发明还提供核酸对，其中该对核酸中的一个包含编码包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的重链可变区的核苷酸序列，该对核酸中的另一个包含编码包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的轻链可变区的核苷酸序列。本发明还提供包含该对两个核酸的试剂盒。
在其他具体实施方案中，本发明的核酸编码犬源化抗体或其抗原结合片段的重链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列。在相关实施方案中，核酸编码犬源化抗体或其抗原结合片段的轻链可变区，其中轻链可变区包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列。本发明还提供核酸对，其中该对核酸中的一个包含编码包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的重链可变区的核苷酸序列，该对核酸中的另一个包含编码包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列的轻链可变区的核苷酸序列。本发明还提供包含该对两个核酸的试剂盒。
在其他具体实施方案中，本发明的核酸编码犬源化抗体或其抗原结合片段的重链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列。在相关实施方案中，核酸编码犬源化抗体或其抗原结合片段的轻链可变区，其中轻链可变区包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列。本发明还提供核酸对，其中该对核酸中的一个包含编码包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的重链可变区的核苷酸序列，该对核酸中的另一个包含编码包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的轻链可变区的核苷酸序列。本发明还提供包含该对两个核酸的试剂盒。
在其他具体实施方案中，本发明的核酸编码犬源化抗体或其抗原结合片段的重链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列。在相关实施方案中，核酸编码犬源化抗体或其抗原结合片段的轻链可变区，其中轻链可变区包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列。本发明还提供核酸对，其中该对核酸中的一个包含编码包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的重链可变区的核苷酸序列，该对核酸中的另一个包含编码包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列的轻链可变区的核苷酸序列。本发明还提供包含该对两个核酸的试剂盒。
在具体实施方案中，本发明的核酸编码犬源化抗体或其抗原结合片段的重链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列。在相关实施方案中，核酸编码犬源化抗体或其抗原结合片段的轻链可变区，其中轻链可变区包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列。本发明还提供核酸对，其中该对核酸中的一个包含编码包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的重链可变区的核苷酸序列，该对核酸中的另一个包含编码包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的轻链可变区的核苷酸序列。本发明还提供包含该对两个核酸的试剂盒。
在其他具体实施方案中，本发明的核酸编码犬源化抗体或其抗原结合片段的重链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列。在相关实施方案中，核酸编码犬源化抗体或其抗原结合片段的轻链可变区，其中轻链可变区包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列。本发明还提供核酸对，其中该对核酸中的一个包含编码包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的重链可变区的核苷酸序列，该对核酸中的另一个包含编码包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的轻链可变区的核苷酸序列。本发明还提供包含该对两个核酸的试剂盒。
在其他具体实施方案中，本发明的核酸编码犬源化抗体或其抗原结合片段的重链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列。在相关实施方案中，核酸编码犬源化抗体或其抗原结合片段的轻链可变区，其中轻链可变区包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列。本发明还提供核酸对，其中该对核酸中的一个包含编码包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的重链可变区的核苷酸序列，该对核酸中的另一个包含编码包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的轻链可变区的核苷酸序列。本发明还提供包含该对两个核酸的试剂盒。
在其他特定实施方案中，本发明的核酸编码犬源化抗体或其抗原结合片段的重链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列。在相关实施方案中，核酸编码犬源化抗体或其抗原结合片段的轻链可变区，其中轻链可变区包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列。本发明还提供核酸对，其中该对核酸中的一个包含编码包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的重链可变区的核苷酸序列，该对核酸中的另一个包含编码包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的轻链可变区的核苷酸序列。本发明还提供包含该对两个核酸的试剂盒。
因此，本发明还提供了包含该对两个核酸的试剂盒。在某些实施方案中，编码该组三个重链CDR的核酸编码犬源化抗体的重链，并且编码该组三个轻链CDR的相应核酸编码该犬源化抗体的轻链。
此外，本发明提供了包含表达本发明的一种或多种核酸的本发明的一种或多种核酸的表达载体，以及这些表达载体的对。在某些实施方案中，该对表达载体中的一个表达本发明的犬源化抗体的重链，并且另一个表达该犬源化抗体的轻链。还提供了包含本发明的表达载体的宿主细胞，包括这种表达载体的对。
本发明还提供了包含本发明的犬源化抗体及其抗原结合片段以及药学上可接受的载体和/或稀释剂的药物组合物。本发明还提供了药物组合物，其包含本发明的核酸以及药学上可接受的载体和/或稀释剂，和/或包含一种或多种本发明的核酸以及药学上可接受的载体和/或稀释剂的表达载体。
本发明还提供了治疗特应性皮炎的方法，其包括向患有特应性皮炎的动物受试者施用上述药物组合物中的一种。在特定实施方案中，动物对象是犬科动物。本发明还提供了在动物受试者中帮助阻断与特应性皮炎相关的瘙痒的方法，包括向有此需要的动物受试者施用治疗有效量的本发明的药物组合物。在特定实施方案中，动物对象是犬科动物。
此外，本发明提供了产生结合犬IL-31RA的犬源化抗体或其抗原结合片段的方法。在特定实施方案中，该方法包括在表达核酸的条件下在培养基中培养包含编码和表达本发明的犬源化抗体的轻链和该犬源化抗体的重链的一种或多种表达载体的宿主细胞，从而产生包含本发明的犬源化抗体的轻链和/或该犬源化抗体的重链的多肽。然后从宿主细胞或培养基中回收多肽。在某些实施方案中，包含本发明的犬源化抗体的轻链的多肽和包含该犬源化抗体的重链的多肽各自在有益于形成犬源化抗体的条件下组合。
通过参考以下附图的简要描述和详细描述，将更好地理解本发明的这些和其他方面。
附图说明
图1显示IL-31与IL-31RA的结合。测试犬IL-31RA的细胞外结构域(ECD)结合犬IL-31的能力。结果表明IL-31RA ECD以剂量依赖性方式与生物素化的犬IL-31结合，EC50为0.55ng/ml。
图2A-2B显示xIL-31RA单克隆抗体(mABS)与IL-31RA的结合。测试所选小鼠mAb对犬IL-31RA的反应性。结果表明所选择的小鼠mAb以剂量依赖性方式结合犬IL-31RA。所有10种小鼠单克隆抗体对犬IL-31RA具有强结合反应性。图2A描述小鼠mAb：51F8(·)，74H10(∠)，100H8(_)，209G5224G3(◆)和Iso对照(o)。图2B描述小鼠mAb：55B3(·)，65G9(∠)，85C10(_)，218D9227E7(◆)和Iso对照(o)。
图3显示通过单克隆抗体(mABS)与IL-31RA结合阻断IL-31与IL-31RA的结合。通过流式细胞术测试选择的小鼠mAb(抗犬IL-31RA)阻断IL-31与IL-31RA/OSMR结合的能力。FACS结果表明10种小鼠mAb可阻断IL-31与CHO-IL-31RA/OSMR细胞上存在的IL-31RA/OSMR复合物的结合。抗体51F8，74H10，100H8，209G5和218D9表现出优异的阻断活性。
图4显示通过IL-31诱导STAT-3磷酸化。测试表达IL-31受体复合物的Ba/f3-OI细胞的IL-31诱导的STAT-3磷酸化。结果表明，STAT-3磷酸化以剂量依赖性方式由Baf3-OI细胞(∠)中的IL-31诱导，暗示：(i)所述犬IL-31受体复合物在所述细胞表面上成功表达；(ii)犬IL-31与IL-31受体的结合可刺激内源性STAT3磷酸化；和(iii)然后启动其下游信号传导途径。将Ba/f3细胞(o)用作对照。
图5A-5B显示所选择的xIL-31RA抗体对Ba/f3-OI细胞中IL-31介导的STAT-3磷酸化的抑制。结果表明所选择的mAb在Ba/f3-OI细胞中以剂量依赖性方式抑制IL-31介导的STAT-3磷酸化。图5A描述了小鼠mAb209G5(∠)，218D9(_)，85C10和IL-31蛋白(◆)。图5B描绘小鼠mAb100H874H10(∠)，85C10(_)，51F8和cIL-31蛋白(◆)。
图6A-6E分别提供了犬IL-31RA上针对抗体100H8，51F8，218D9，85C10和224G3的表位。图6A描绘了针对100H8的表位；表位分别包含SEQ ID NO：97(在SEQ ID NO：119内)和SEQID NO：103(在SEQ ID NO：120内)的氨基酸序列。图6B描绘了针对51F8的表位；表位包括SEQID NO：98(在SEQ ID NO：121内)和SEQ ID NO：100(在SEQ ID NO：122内)的氨基酸序列。图6C描绘了针对218D9的表位；表位分别包含SEQ ID NO：104(在SEQ ID NO：123内)和SEQ IDNO：105(在SEQ ID NO：124内)的氨基酸序列。图6D描绘了针对85C10的表位；表位分别包含SEQ ID NO：106(在SEQ ID NO：125内)和SEQ ID NO：108(在SEQ ID NO：126内)的氨基酸序列。图6E描绘了针对224G3的表位；该表位包含SEQ ID NO：109(也在SEQ ID NO：126内)的氨基酸序列。还显示了SEQ ID NO：2的氨基酸序列与cIL-31R ECD抗原上各个表位的结合残基的位置。
图7A-7E提供了鉴定的鼠-犬嵌合抗体或犬源化抗体与犬IL-31RA的结合活性的图。结果表明犬源化抗体具有与其相应亲本抗体相似的结合亲和力(如鼠-犬嵌合抗体所示)。图7A描绘了单克隆51F8抗体的结合图：嵌合51F8(·)c51F8VH3VL6(∠)，c51F8VH3VL7(_)，c51F8VH4VL6和c51F8VH4VL7(◆)；和iso对照(o)。图7B描述了单克隆100H8抗体的结合图：嵌合100H8(·)，c100H8VH5VL4(∠)和c100H8VH7VL4(_)。图7C描绘单克隆85C10抗体的结合图：嵌合85C10(·)，c85C10VH3VL2(∠)和c85C10VH1VL2(_)。图7D描绘单克隆218D9抗体的结合图：嵌合218D9(·)，c218D9VH3VL2(∠)，c218D9VH3VL3(_)，c218D9VH4VL2和c218D9VH4VL3(◆)；和iso对照(o)。图7E描绘单克隆224G3抗体的结合图：m224G3Chim(·)，c224G3VH2VL2(∠)和c224G3VH2VL3(_)。
抗体编号前的术语“嵌合”表示抗体是鼠-犬嵌合抗体，例如，嵌合218D9或嵌合51F8。此外，抗体编号前接“m”后跟“Chim”表示所述抗体是鼠-犬嵌合抗体，例如，m224G3Chim。抗体编号前的小写字母“c”表示其为犬源化抗体，例如，c218D9VH4VL2。
图8显示通过抑制Ba/f3-OI细胞中IL-31介导的STAT-3磷酸化来阻断IL-31与IL-31RA的结合。结果表明犬化的218D9抗体可以在Ba/f3-OI细胞中以剂量依赖性方式抑制IL-31介导的STAT-3磷酸化，并且构建体c218D9VH3VL3和c218D9VH4VL3具有与亲本小鼠-犬嵌合218D9抗体相同的抑制活性：嵌合218D9(·)，c218D9VH3VL2(∠)，c218D9VH3VL3(_)，c218D9VH4VL2和c218D9VH4VL3(◆)；和IL-31仅对照(o)。
具体实施方式
响应于对特应性皮炎的更好疗法的需要，本发明提供可对与特应性皮炎相关的皮肤炎症实现显著效果的制剂和方法。
缩写
在本发明的具体实施方式和实施例中，将使用以下缩写：
ADCC 抗体依赖性细胞毒性
CDC 补体依赖性细胞毒性
CDR 免疫球蛋白可变区中的互补性决定区，使用Kabat编号系统定义
EC50 导致50％功效或结合的浓度
ELISA 酶联免疫吸附测定
FR 抗体框架区：不包括CDR区的免疫球蛋白可变区
IC50 导致50％抑制的浓度
IgG 免疫球蛋白G
Kabat 由Elvin A.Kabat开创的免疫球蛋白比对和编号系统[Sequences ofProteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1991)]
mAb 单克隆抗体(也Mab或MAb)
V区 不同抗体之间序列可变的IgG链片段。
VH 免疫球蛋白重链可变区
VL 免疫球蛋白轻链可变区
定义
为了更容易理解本发明，下面具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文件的其他地方明确定义，否则本文使用的所有其他技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。
如本文(包括所附权利要求书)中所使用，词语的单数形式(例如“一个”，“一种”和“所述”)包括其对应的复数引用，除非上下文另有明确规定。
“施用”和“治疗/处理”，当其应用于动物，例如犬科动物受试者，细胞，组织，器官或生物流体时，是指外源药物，治疗剂，诊断剂或组合物与动物，例如犬科动物受试者，细胞，组织，器官或生物流体的接触。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中流体与细胞接触。
“施用”和“治疗/处理”也意指例如通过试剂，诊断剂，结合化合物或通过另一细胞对细胞进行的体外和离体治疗。术语“受试者”包括任何生物体，优选动物，更优选哺乳动物(例如，犬科动物或猫科动物)，最优选犬科动物。
“治疗/处理”是指将治疗剂诸如含有本发明的任何抗体的组合物内部或外部施用至例如患有一种或多种症状或怀疑患有所述药剂具有治疗活性的病状的犬科动物受试者或患者。通常，以有效减轻和/或改善所治疗的受试者或群体中的一种或多种疾病/病症症状的量施用药剂，无论是通过任何临床上可测量的程度诱导此类症状的消退还是抑制此类症状的进展。有效减轻任何特定疾病/病症症状的治疗剂的量(也称为“治疗有效量”)可根据诸如患者(例如犬科动物)的疾病/病症状态，年龄和体重以及药物组合物在受试者中引起所需反应的能力等因素而变化。疾病/病症症状是否已经减轻或改善可以通过兽医或其他有经验的健康护理提供者通常使用的任何临床测量评估该症状的严重性或进展状态来评估。虽然本发明的实施方案(例如，治疗方法或制品)在减轻每个受试者中的目标疾病/病症症状中可能不是都有效的，但是其应当减轻统计学显著数量的受试者中的目标疾病/病症症状，如通过本领域已知的任何统计学检验确定的，例如Student's t-检验，chi2-检验，根据Mann和Whitney的U-检验，Kruskal-Wallis检验(H-检验)，Jonckheere-Terpstra-检验和Wilcoxon-检验。
“治疗/处理”，当其应用于人，兽医(例如，犬科动物)或研究对象时，是指治疗性处理以及研究和诊断性应用。当应用于人，兽医(例如，犬科动物)或研究受试者或细胞，组织或器官时，“处理”包括使本发明的抗体与例如犬科动物或其他动物受试者，细胞，组织，生理区室或生理流体接触。
除非另有说明，本文所用的术语“犬/犬科动物”包括所有家养犬，藏獒(Canislupus familiaris)或家犬(家犬)。
如本文所用，术语“猫科动物”是指猫科的任何成员。该家族的成员包括野生的，动物园的和家养的成员，包括家养的猫，纯种和/或杂种伴侣猫，展示猫，实验室猫，克隆猫和野猫或野生猫。
本文所用的术语“犬框架”是指除本文定义为CDR残基的高变区残基以外的犬抗体的重链和轻链的氨基酸序列。关于犬源化抗体，在大多数实施方案中，天然犬CDR的氨基酸序列被两条链中相应的外源CDR(例如来自小鼠或大鼠抗体的那些)替代。任选地，犬抗体的重链和/或轻链可以含有一些外源非CDR残基，例如，以便在犬源化抗体内保持外源CDR的构象，和/或修饰Fc功能，如以下举例说明的和/或在U.S.10，106，607B2中公开的，在此将其全文引入作为参考。
缩写为“Fc”的“片段可结晶区”或可互换使用的“Fc区”对应于与称为Fc受体的细胞表面受体相互作用的抗体的CH3-CH2部分。Tang等首先描述了四种犬IgG中每一种的犬片段可结晶区(cFc)[Vet.Immunol.Immunopathol.80:259-270(2001)；还参见,Bergeron etal.,Vet.Immunol.Immunopathol.157:31-41(2014)和U.S.10,106,607B2]。
本文所用的犬Fc(cFc)“IgG-Bm”是包含两个(2)氨基酸残基取代D31A和N63A的犬IgG-B Fc，如在IgG-B的SEQ ID NO：111的氨基酸序列中(见下文)，且不含C-末端赖氨酸(“K”)。在IgG-Bm中，SEQ ID NO：110的位置31处的天冬氨酸残基(D)和SEQ ID NO：110的位置63处的天冬酰胺残基(N)都被丙氨酸残基(A)置换。这两个氨基酸残基取代用于显著减少天然存在的犬IgG-B的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)[参见U.S.10，106，607B2，其内容通过引用整体并入本文]。IgG-B的氨基酸序列SEQ ID NO：110是：
下面提供了IgG-Bm的氨基酸序列SEQ ID NO：111。
如本文所用，例如用抗体的氨基酸序列中的另一个氨基酸残基“取代氨基酸残基”等同于用另一个氨基酸残基“替换氨基酸残基”，并且表示氨基酸序列中的特定位置处的特定氨基酸残基已被不同的氨基酸残基替换(或取代)。这种取代可以特别设计，即通过例如重组DNA技术有目的地在氨基酸序列的特定位置用丝氨酸取代丙氨酸。或者，抗体的特定氨基酸残基或氨基酸残基串可以通过更天然的选择方法被一个或多个氨基酸残基替换，例如，基于细胞产生的抗体结合该抗原上的给定区域的能力，例如，含有表位或其部分的区域，和/或对于包含特定CDR的抗体，该CDR保留与其所替换的CDR相同的规范结构。这样的取代/替换可以导致“变体”CDR和/或变体抗体。
本文所用的术语“抗体”是指表现出所需生物活性的任何形式的抗体。抗体可以是单体，二聚体或更大的多聚体。因此，其以最广泛的意义使用并且具体地涵盖但不限于单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)，多克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)，犬源化抗体，全犬源化抗体，嵌合抗体和骆驼源化单结构域抗体。“亲本抗体”是在修饰抗体以用于预期用途之前通过将免疫系统暴露于抗原而获得的抗体，如用作犬治疗性抗体的抗体的犬源化。
如本文所用，本发明的抗体“阻断”例如犬受体与其结合伴侣(配体)的结合，是阻断(部分或完全)犬受体与其犬配体结合的抗体，反之亦然，如在标准结合测定(例如ELISA或流式细胞术)中所测定。
典型地，当活性以摩尔为基础表达时，本发明的抗体或抗原结合片段保留至少10％的犬抗原结合活性(与亲本抗体相比时)。优选地，本发明的抗体或抗原结合片段保留作为亲本抗体的犬抗原结合亲和力的至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更多。本发明的抗体或抗原结合片段还旨在包括基本上不改变其生物学活性的保守或非保守氨基酸置换(称为抗体的“保守变体”或“功能保守变体”)。
“分离的抗体”是指纯化状态，在这种情况下指分子基本上不含其他生物分子如核酸，蛋白质，脂质，碳水化合物或其他材料如细胞碎片和生长培养基。通常，术语“分离的”不意指完全不存在这种物质或不存在水，缓冲剂或盐，除非它们以实质上干扰本文所述的结合化合物的实验或治疗用途的量存在。
如本文所用，如果抗体与包含犬IL-31RA氨基酸序列的部分的多肽结合，但不与缺乏犬IL-31RA序列的部分的其他犬蛋白结合，则称所述抗体与包含给定抗原序列(在这种情况下是犬IL-31RA氨基酸序列的一部分)的多肽特异性结合。例如，特异性结合包含犬IL-31RA的多肽的抗体可结合标记形式的犬IL-31RA，但不结合其他标记的犬蛋白。
如本文所用，除非另外指明，否则“抗体片段”或“抗原结合片段”是指抗体的抗原结合片段，即保留特异性结合由全长抗体结合的抗原(例如犬IL-31RA)的能力的抗体片段，例如保留一个或多个CDR区的片段。抗原结合片段的实例包括但不限于Fab，Fab'，F(ab')2和Fv片段；二聚抗体(diabody)；线性抗体；单链抗体分子，如sc-Fv；由抗体片段形成的纳米抗体和多特异性抗体。
当抗体或衍生自抗体的抗原结合位点的结合化合物对犬抗原或其变体或突变蛋白的亲和力比其对所测试的任何其他犬抗原的亲和力大至少10倍，更优选大至少20倍，甚至更优选大至少100倍时，所述抗体或衍生自抗体的抗原结合位点的结合化合物“特异性”结合犬抗原或其变体或突变蛋白。
如本文所用，“嵌合抗体”是具有来自第一抗体的可变结构域和来自第二抗体的恒定结构域的抗体，其中第一和第二抗体来自不同物种。[U.S.4，816，567；和Morrison etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984)]。典型地，可变结构域获自来自实验动物(“亲本抗体”)，例如啮齿动物的抗体，恒定结构域序列获自动物受试者抗体，例如人或犬，使得所得嵌合抗体比亲本(例如，啮齿动物)抗体更不可能分别在人或犬受试者中引发不良免疫应答。
如本文所用，术语“犬源化抗体”是指含有来自犬和非犬(例如小鼠)抗体的序列的抗体形式。一般而言，犬源化抗体将包含基本上所有的至少一个或多个，通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的高变环对应于非犬免疫球蛋白的高变环(例如，包含如下示例的6个CDR)，并且所有或基本上所有的框架(FR)区(并且通常所有或基本上所有的剩余框架)是犬免疫球蛋白序列的那些。如本文举例说明的，犬源化抗体包含来自鼠(小鼠)抗犬抗原抗体的三个重链CDR和三个轻链CDR以及犬框架或修饰的犬框架。修饰的犬框架包含如本文示例的一个或多个氨基酸改变，其进一步优化犬源化抗体的效力，例如增加其与其犬抗原的结合和/或其阻断该犬抗原与犬抗原的天然结合伴侣结合的能力。
每个轻链/重链对的可变区形成抗体结合位点。因此，通常完整抗体具有两个结合位点。除了在双功能或双特异性抗体中，两个结合位点通常是相同的。通常，重链和轻链的可变区都包含三个高变区，也称为互补决定区(CDR)，位于相对保守的框架区(FR)内。CDR通常与框架区对齐，使得能够结合特异性表位。通常，从N-末端到C-末端，轻链和重链可变结构域都包含FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4。将氨基酸分配给每个结构域通常是根据以下的定义Sequences of Proteins of Immunological Interest,Kabat,et al.；National Institutes of Health,Bethesda,Md.；5th ed.；NIH Publ.No.91-3242(1991)；Kabat,Adv.Prot.Chem.32:1-75(1978)；Kabat,et al.,J.Biol.Chem.252:6609-6616(1977)；Chothia,et al.,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)or Chothia,et al.,Nature342:878-883(1989)]。
本文所用的术语“高变区”是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”(即轻链可变结构域中的LCDR1，LCDR2和LCDR3以及重链可变结构域中的HCDR1，HCDR2和HCDR3)的氨基酸残基。[Kabat et al.Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991)，通过序列定义抗体的CDR区；另见Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)，通过结构来定义抗体的CDR区]。本文所用的术语“框架”或“FR”残基是指除本文定义为CDR残基的高变区残基之外的那些可变结构域残基。
有四种已知的犬IgG的IgG重链亚型，它们被称为IgG-A，IgG-B，IgG-C和IgG-D。两种已知的轻链亚型称为λ和κ。在本发明的具体实施方案中，除了结合犬IL-31RA之外，本发明的针对其抗原的犬或犬源化抗体最佳地具有两个属性：
1)缺乏效应子功能，例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)
2)使用工业标准技术如基于蛋白A层析的技术易于大规模纯化。
天然存在的犬IgG同种型都不满足这两个标准。例如，IgG-B可以使用蛋白A纯化，但具有高水平的ADCC活性。另一方面，IgG-A与蛋白A结合较弱，但也显示ADCC活性。此外，IgG-C和IgG-D都不能在蛋白A柱上纯化，尽管IgG-D不显示ADCC活性。(IgG-C具有相当大的ADCC活性)。在某些实施方案中，本发明解决这些问题的一种方式是通过提供对本发明的抗原具有特异性的本发明的修饰的犬IgG-B抗体，其缺乏效应子功能如ADCC，并且可以使用工业标准蛋白A层析容易地纯化。
本文所用的“止痒剂”是倾向于抑制，缓解和/或预防瘙痒的化合物，大分子和/或制剂。止痒剂通俗地称为止痒药。
本文所用的“抗瘙痒抗体”是可在动物，包括哺乳动物如人，犬和/或猫中充当抗瘙痒剂的抗体，特别是就特应性皮炎而言。在具体的实施方案中，抗瘙痒抗体结合IL-31信号传导途径中的特异性蛋白，例如IL-31或其受体IL-31RA。抗瘙痒抗体与其相应抗原(例如IL-31或IL-31RA)的结合抑制例如IL-31与IL-31RA的结合，并干扰和/或阻止该途径的成功信号传导，从而抑制，缓解和/或阻止由IL-31信号传导途径引起的瘙痒。
本文所用的“同源性”是指当两个多核苷酸序列或两个多肽序列最佳比对时它们之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸残基占据时，例如，如果两个DNA分子中的每一个中的位置被腺嘌呤占据，则该分子在该位置是同源的。同源性百分比为两序列共有的同源位置数除以比对位置总数×100。例如，如果当序列最佳比对时，两个序列中10个位置中的6个是匹配的或同源的，则两个序列是60％同源的。通常，当两个序列被比对以给出最大百分比同源性时进行比较。
序列同一性是指当两个序列最佳比对时，两个多肽的氨基酸在等同位置相同的程度。如本文所用，当两个序列的氨基酸残基相同时，一个氨基酸序列与第二个氨基酸序列100％“相同”。因此，当两个氨基酸序列的50％的氨基酸残基相同时，氨基酸序列与第二个氨基酸序列50％“相同”。对给定蛋白质(例如蛋白质或被比较的多肽的一部分)所包含的氨基酸残基的连续块进行序列比较。在特定的实施方案中，考虑了可改变两个氨基酸序列之间的对应性的所选缺失或插入。
序列相似性包括相同的残基和不相同的，生物化学相关的氨基酸。具有相似性质且可互换的生物化学相关氨基酸。
“保守修饰的变体”或“保守置换”是指用具有类似特征(例如电荷，侧链大小，疏水性/亲水性，主链构象和刚性等)的其他氨基酸置换蛋白质中的氨基酸，使得可频繁地进行改变而不改变蛋白质的生物活性。本领域技术人员认识到，一般而言，多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不改变生物活性[参见例如Watson et al.,Molecular Biologyof the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,p.224(4th Ed.；1987)]。此外，结构或功能相似的氨基酸的取代不太可能破坏生物活性。示例性的保守列于下表A中。
表A
示例性保守氨基酸置换
本发明还考虑了本发明抗体的功能保守变体。本文所用的“功能保守性变体”是指其中一个或多个氨基酸残基已被改变而不改变所需性质(例如抗原亲和力和/或特异性)的抗体或片段。这样的变体包括但不限于用具有类似性质的氨基酸替换氨基酸，例如上表A的保守氨基酸置换。
“分离的核酸分子”是指基因组，mRNA，cDNA或合成来源的DNA或RNA或其一些组合，其不与分离的多核苷酸在自然界中发现的多核苷酸的全部或部分相关联，或与其在自然界中未与之相连的多核苷酸相连。为了本公开的目的，应当理解“包含特定核苷酸序列的核酸分子”不包括完整的染色体。分离的核酸分子“包含”特定的核酸序列，除了特定的序列外，还可以包括多达10个或甚至多达20个或更多个其他蛋白质或其部分或片段的编码序列，或可以包括控制所述核酸序列的编码区表达的可操作地连接的调控序列，和/或可以包括载体序列。
本发明提供了本发明的分离的犬源化抗体，使用所述抗体治疗疾病的方法，例如治疗犬的特应性皮炎。在犬科动物中，有4种IgG重链，称为A、B、C和D。这些重链代表犬IgG的四个不同亚类，它们被称为IgG-A(或IgGA)，IgG-B(或IgGB)，IgG-C(或IgGC)和IgG-D(或IgGD)。两条重链各自由一个可变结构域(VH)和三个恒定结构域组成，称为CH-1、CH-2和CH-3。CH-1结构域通过称为“铰链”或“铰链区”的氨基酸序列与CH-2结构域连接。
这四种重链的核酸和氨基酸序列首先由Tang等鉴定[Vet.Immunol.Immunopathol.80:259-270(2001)]。这些重链的氨基酸和核酸序列也可从GenBank数据库获得。例如，IgGA重链的氨基酸序列具有登录号AAL35301.1，IgGB具有登录号AAL35302.1，IgGC具有登录号AAL35303.1，IgGD具有登录号(AAL35304.1)。犬抗体还含有两种类型的轻链，κ和λ。这些轻链的DNA和氨基酸序列可以从GenBank数据库获得。例如，κ轻链氨基酸序列的登录号为ABY57289.1，λ轻链的登录号为ABY55569.1。
四种未修饰的犬IgG的已知氨基酸序列是：
cIgG-A[SEQ ID NO:116]
cIgG-B[SEQ ID NO:110]
cIgG-C[SEQ ID NO:117]
cIgG-D[SEQ ID NO:118]
κ犬轻链恒定区的氨基酸序列是：
[SEQ ID NO:127]
在本发明中，四种犬IgG Fc片段中每一种的氨基酸序列是基于由Tang等(同上)确定的CH1和CH2结构域的确定边界。结合犬IL-31RA的犬源化小鼠抗犬抗体包括但不限于：包含犬IgG-A，IgG-B，IgG-C和IgG-D重链和/或犬κ或λ轻链以及小鼠抗犬IL-31RA CDR的本发明的抗体。因此，本发明提供本发明的犬源化小鼠抗犬抗体，包括分离的犬源化小鼠抗犬抗体，其结合犬IL-31RA并且优选地还阻断该犬IL-31RA与犬IL-31的结合。
因此，本发明进一步提供犬源化小鼠抗体和使用本发明的抗体治疗疾病例如治疗犬科动物的特应性皮炎的方法。
本发明进一步提供全长的犬源化重链，其可以与相应的轻链配对以制备犬源化抗体。因此，本发明进一步提供本发明的犬源化小鼠抗犬抗原抗体(包括分离的犬源化小鼠抗犬抗体)和使用本发明的抗体治疗病症(例如治疗犬中的特应性皮炎)的方法。
本发明还提供了包含犬片段可结晶区(cFc区)的本发明抗体，其中cFc已被遗传修饰以增强，降低或消除一种或多种效应子功能。在本发明的一个方面，遗传修饰的cFc降低或消除一种或多种效应子功能。在本发明的另一方面，遗传修饰的cFc增强一种或多种效应子功能。在某些实施方案中，遗传修饰的cFc区是遗传修饰的犬IgGB Fc区。在另一个这样的实施方案中，遗传修饰的cFc区是遗传修饰的犬IgGC Fc区。在一个具体实施方案中，效应子功能是抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，其被增强，降低或消除。在另一个实施方案中，效应子功能是补体依赖性细胞毒性(CDC)，其被增强，降低或消除。在另一个实施方案中，cFc区已被遗传修饰以增强，降低或消除ADCC和CDC。
为了产生缺乏效应子功能的犬IgG变体，产生了许多突变的犬IgGB重链。这些变体可在重链氨基酸序列的Fc部分中包括一个或多个下列单个或组合取代：P4A，D31A，N63A，G64P，T65A，A93G，和P95A。将变体重链(即，含有这样的氨基酸置换)克隆到表达质粒中，并与含有编码轻链的基因的质粒一起转染到HEK293细胞中。完整抗体从HEK293细胞中表达和纯化，然后可以评价与FcγRI和C1q的结合，以评价它们介导免疫效应子功能的潜力。[参见U.S.10，106，607B2，其内容通过引用整体并入本文。]
本发明还提供了修饰的犬IgG-D，其代替其天然IgG-D铰链区，它们包含来自以下的铰链区：
IgG-A:FNECRCTDTPPCPVPEP SEQ ID NO:112
IgG-B:PKRENGRVPRPPDCPKCPAPEM SEQ ID NO:113；或
IgG-C:AKECECKCNCNNCPCPGCGL SEQ ID NO:114。
或者，可以通过用脯氨酸残基替代丝氨酸残基，即，SEQ ID NO:115(用带下划线和粗体的脯氨酸残基(P)替代天然存在的丝氨酸残基)遗传修饰IgG-D铰链区。这种修饰可导致犬IgG-D缺乏fab臂交换。可以使用重组DNA技术的标准方法构建修饰的犬IgG-D[例如，Maniatis et al.,MolecularCloning,A Laboratory Manual(1982)]。为了构建这些变体，可以修饰编码犬IgG-D氨基酸序列的核酸，使其编码修饰的IgG-D。然后将修饰的核酸序列克隆到表达质粒中用于蛋白表达。
如本文所述的犬源化小鼠抗犬抗体的六个互补决定区(CDR)可包含含有小鼠轻链LCDR1，LCDR2和LCDR3的犬抗体κ(k)或λ(l)轻链和含有小鼠重链HCDR1，HCDR2和HCDR3的犬抗体重链IgG。
核酸
本发明还包括编码本发明抗体的核酸(参见例如下面的实施例)。
本发明还包括编码免疫球蛋白多肽的核酸，当用BLAST算法进行比较时，除了不改变的CDR之外，所述免疫球蛋白多肽包含与本文提供的犬源化抗体的氨基酸序列至少约70％相同，优选至少约80％相同，更优选至少约90％相同且最优选至少约95％相同(例如，95％、96％、97％、98％、99％、100％)的氨基酸序列，其中选择算法的参数以在相应参考序列的全长上给出相应序列之间的最大匹配。本发明还提供了编码免疫球蛋白多肽的核酸，当用BLAST算法进行比较时，所述免疫球蛋白多肽包含与任何参考氨基酸序列至少约70％相似，优选至少约80％相似，更优选至少约90％相似，最优选至少约95％相似(例如，95％、96％、97％、98％、99％、100％)的氨基酸序列，其中选择算法的参数以在相应参考序列的全长上给出相应序列之间的最大匹配，所述核酸也包括在本发明中。
如本文所用，核苷酸和氨基酸序列同一性百分比可使用C,MacVector(MacVector,Inc.Cary,NC 27519),Vector NTI(Informax,Inc.MD),Oxford Molecular Group PLC(1996)和具有比对默认参数和同一性默认参数的Clustal W算法来测定。这些商业上可获得的程序也可用于使用相同或相似的默认参数确定序列相似性。或者，可以使用默认过滤条件下的高级BLAST搜索，例如使用GCG(Genetics Computer Group,Program Manual forthe GCG Package,Version 7,Madison,Wisconsin)pileup程序，使用默认参数。
以下参考文献涉及经常用于序列分析的BLAST算法：BLAST ALGORITHMS:Altschul,S.F.,et al.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)；Gish,W.,et al.,NatureGenet.3:266-272(1993)；Madden,T.L.,et al.,Meth.Enzymol.266:131-141(1996)；Altschul,S.F.,et al.,Nucleic Acids Res.25:3389-3402(1997)；Zhang,J.,et al.,Genome Res.7:649-656(1997)；Wootton,J.C.,et al.,Comput.Chem.17:149-163(1993)；Hancock,J.M.etal.,Comput.Appl.Biosci.10:67-70(1994)；ALIGNMENT SCORINGSYSTEMS:Dayhoff,M.O.,et al.,"A model of evolutionary change in proteins."inAtlas of Protein Sequence and Structure,vol.5,suppl.3.M.O.Dayhoff(ed.),pp.345-352,(1978)；Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC；Schwartz,R.M.,et al.,"Matrices for detecting distant relationships."in Atlas of Protein Sequenceand Structure,vol.5,suppl.3."(1978),M.O.Dayhoff(ed.),pp.353-358(1978),Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC；Altschul,S.F.,J.Mol.Biol.219:555-565(1991)；States,D.J.,et al.,Methods 3:66-70(1991)；Henikoff,S.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919(1992)；Altschul,S.F.,et al.,J.Mol.Evol.36:290-300(1993)；ALIGNMENT STATISTICS:Karlin,S.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268(1990)；Karlin,S.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877(1993)；Dembo,A.,et al.,Ann.Prob.22:2022-2039(1994)；and Altschul,S.F."Evaluating the statistical significance ofmultipledistinct local alignments."in Theoretical and Computational Methodsin Genome Research(S.Suhai,ed.),pp.1-14,Plenum,New York(1997)。
抗体蛋白质工程
作为实例而非限制，犬重链恒定区可来自IgGA，IgG-B，IgGC，IgGD或经修饰的cFc，如本文所用的IgG-Bm[参见，U.S.10，106，607B2，其全文以引用的方式并入本文中]，且犬轻链恒定区可来自κ或λ。
抗体可以被工程化以包括对亲本(即，小鼠)单克隆抗体的可变结构域内的犬框架和/或犬框架残基的修饰，例如,以改善抗体的特性。
犬源化抗犬IL-31受体α单克隆抗体的构建可以通过测定编码确定的犬IgG重链和轻链的DNA序列来进行。犬重链和轻链的DNA和蛋白质序列是本领域已知的，可通过检索NCBI基因和蛋白质数据库获得。如上所述，对于犬抗体，存在四种已知的IgG亚型：IgG-A，IgG-B，IgG-C和IgG-D，以及两种类型的轻链，即κ和λ。
可通过本领域已知的方法重组产生犬源化小鼠抗犬IL-31RA抗体。可用作表达本文公开的抗体或片段的宿主的哺乳动物细胞系是本领域熟知的，包括可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的许多永生化细胞系。这些细胞尤其包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，NS0，SP2细胞，HeLa细胞，幼仓鼠肾(BHK)细胞，猴肾细胞(COS)，人肝细胞癌细胞(例如，HepG2)，A549细胞，3T3细胞，HEK-293细胞和许多其他细胞系。哺乳动物宿主细胞包括人，小鼠，大鼠，狗，猴，猪，山羊，牛，马和仓鼠细胞。通过确定哪些细胞系具有高表达水平来选择特别优选的细胞系。可以使用的其他细胞系是昆虫细胞系，例如Sf9细胞，两栖动物细胞，细菌细胞，植物细胞和真菌细胞。当将编码重链或其抗原结合部分或片段，轻链和/或其抗原结合片段的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞中时，通过培养宿主细胞一段足以允许抗体在宿主细胞中表达(或更优选地，将抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中)的时间来产生抗体。
可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。此外，本发明的抗体(或其其他部分)从生产细胞系的表达可使用多种已知技术增强。例如，谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统)是在某些条件下增强表达的常用方法。GS系统整体或部分地结合欧洲专利No.0216846，No.0256055和No.0323997以及欧洲专利申请No.89303964.4进行讨论。
在某些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含重链恒定区，例如犬恒定区，如IgG-A，IgG-B，IgG-C和IgG-D犬重链恒定区或其变体。在某些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含轻链恒定区，例如犬轻链恒定区，如λ或κ犬轻链区或其变体。举例来说，但不受此限制，犬重链恒定区可以来自IgG-B，犬轻链恒定区可以来自κ。
表位作图
抗体与其同源蛋白抗原的相互作用是通过抗体的特定氨基酸(互补位)与靶抗原的特定氨基酸(表位)的结合介导的。表位是引起免疫球蛋白特异性反应的抗原决定簇。表位由抗原表面上的一组氨基酸组成。感兴趣的蛋白质可以含有几种被不同抗体识别的表位。抗体识别的表位分为线性或构象表位。线性表位通过蛋白质中氨基酸的连续序列的延伸形成，而构象表位由在一级氨基酸序列中不连续(例如，远离)但在三维蛋白质折叠时聚集在一起的氨基酸组成。
表位作图是指鉴定在其靶抗原上被抗体识别的氨基酸序列(即表位)的过程。鉴定靶抗原上单克隆抗体(mAb)识别的表位具有重要应用。例如，它可以帮助开发新的治疗剂，诊断剂和疫苗。表位作图还可以帮助选择优化的治疗性mAb并帮助阐明它们的作用机制。关于IL-31受体α的表位信息也可以阐明独特的表位并定义疫苗的保护性或致病性作用。表位鉴定也可导致基于所鉴定的肽表位与载体蛋白或其他免疫刺激剂的化学或遗传偶联开发亚单位疫苗。
表位作图可以使用多克隆或单克隆抗体进行，并且根据表位的可疑性质，使用几种方法进行表位鉴定(即线性对构象)。线性表位作图更直接，相对更容易进行。为此，用于线性表位作图的商业服务通常采用肽扫描。在这种情况下，化学合成靶蛋白的一组重叠的短肽序列并测试它们结合感兴趣的抗体的能力。该策略是快速的，高通量的，并且执行起来相对便宜。另一方面，不连续表位的作图在技术上更具挑战性，并且需要更专门的技术，例如单克隆抗体与其靶蛋白一起的X射线共晶体学，氢-氘(H/D)交换，与酶消化偶联的质谱以及本领域技术人员已知的几种其他方法。
表位结合和交叉阻断抗体
本发明的抗犬IL-31RA抗体或其抗原结合片段包括结合犬IL-31RA中与本文公开的抗体之一结合的相同的表位的任何抗体或其抗原结合片段，例如，包含SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：105，或SEQ ID NO：104和SEQ ID NO：105两者的氨基酸序列的表位的218D9抗体，或结合包含SEQ ID NO：98，SEQ ID NO：100，或SEQ ID NO：98和SEQ ID NO：100两者的氨基酸序列的表位的51F8抗体，包括交叉阻断(部分或完全)或本文讨论的抗体或片段交叉阻断(部分或完全)犬IL-31RA结合的犬源化抗体以及任何抗体或抗原结合片段；以及其任何变体。
交叉阻断抗体和抗原结合片段可以基于它们与例如218D9或51F8抗体在标准结合测定(例如，ELISA，如下例示，或流式细胞术)中交叉竞争的能力来鉴定。例如，可以使用标准ELISA测定，其中将重组犬IL-31RA蛋白固定在板上，将抗体之一荧光标记并评价非标记抗体竞争使标记抗体脱离结合的能力。另外地或可选地，分析可用于评估抗体交叉竞争的能力。测试抗体抑制例如51F8或218D9抗体与犬IL-31RA结合的能力证明测试抗体可与51F8或218D9抗体竞争结合犬IL-31RA，因此，在一些情况下，可与51F8和/或218D9抗体结合的犬IL-31RA上的相同表位结合。
与本发明的任何抗犬IL-31RA抗体或片段结合相同表位的抗体及其片段也构成本发明的一部分。
药物组合物和施用
为了制备包含本发明抗体的药物或无菌组合物，可将这些抗体与药学上可接受的载体或赋形剂混合。[参见，例如，Remington’sPharmaceutical Sciences andU.S.Pharmacopeia:National Formulary,Mack Publishing Company,Easton,PA(1984)]。
治疗剂和诊断剂的制剂可以通过与可接受的载体，赋形剂或稳定剂以例如冻干粉末，浆液，水溶液或悬浮液的形式混合来制备[参见例如Hardman,et al.(2001)Goodmanand Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,NY；Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams,and Wilkins,New York,NY；Avis,et al.(eds.)(1993)Pharmaceutical DosageForms:Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY；Lieberman,et al.(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets,Marcel Dekker,NY；Lieberman,etal.(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems,Marcel Dekker,NY；Weinerand Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dekker,Inc.,New York,NY]。在一个实施方案中，将本发明的抗体在pH5-6的乙酸钠溶液中稀释至合适的浓度，并加入NaCl或蔗糖以调节张力。可以加入另外的试剂，例如，聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80，以增强稳定性。
单独施用或与另一种药剂组合施用的抗体组合物的毒性和治疗功效可通过标准药学程序在细胞培养物或实验动物中测定，例如用于测定LD50(使群体的50％致死的剂量)和ED50(在群体的50％中治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数(LD50/ED50)。在特定方面，表现出高治疗指数的抗体是期望的。从这些细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制用于犬科动物的剂量范围。这些化合物的剂量优选在包括ED50的循环浓度范围内，而毒性很小或没有。剂量可以在该范围内变化，这取决于所用的剂型和施用途径。
施用方式可以变化。合适的施用途径包括口服，直肠，经粘膜，肠，肠胃外；肌内，皮下，皮内，髓内，鞘内，直接心室内，静脉内，腹膜内，鼻内，眼内，吸入，吹入，局部，皮肤，透皮或动脉内。在特定的实施方案中，本发明的抗体可以通过侵入性途径例如通过注射施用。在本发明的其他实施方案中，本发明的抗体或其药物组合物经静脉内，皮下，肌内，动脉内或通过吸入，气溶胶递送施用。通过非侵入性途径(例如口服；例如，在丸剂，胶囊或片剂中)施用也在本发明的范围内。
组合物可以用本领域已知的医疗装置给药。例如，本发明的药物组合物可以通过皮下注射针(包括例如预填充的注射器或自动注射器)注射施用。本文公开的药物组合物还可以用无针皮下注射装置施用；例如在美国专利号：6,620,135；6,096,002；5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4，790，824或4，596，556中公开的装置。
本文公开的药物组合物还可以通过输注施用。已知的植入物和模块形式的施用药物组合物的实例包括：美国专利号4，487，603，其公开了用于以受控速率分配药物的可植入微量输注泵；美国专利号4，447，233，其公开了一种用于以精确的输注速率输送药物的药物输注泵；美国专利号4，447，224，其公开了一种用于连续药物输送的可变流量可植入输注装置；美国专利号4，439，196，其公开了具有多室式隔室(multi-chamber compartment)的渗透药物递送系统。许多其他这样的植入物，递送系统和组件是本领域技术人员公知的。
或者，可以以局部而不是全身的方式施用本发明的抗体，通常以储库(depot)或缓释制剂的形式。
施用方案取决于几个因素，包括治疗性抗体的血清或组织周转率，症状水平，治疗性抗体的免疫原性和靶细胞在生物基质中的可及性。优选地，施用方案递送足够的治疗性抗体以实现靶疾病/病症状态的改善，同时使不期望的副作用最小化。因此，生物递送的量部分取决于特定的治疗性抗体和所治疗病症的严重程度。选择合适剂量的治疗性抗体的指导是可用的[参见，例如，Wawrzynczak Antibody Therapy,Bios Scientific Pub.Ltd,Oxfordshire,UK(1996)；Kresina(ed.)Monoclonal Antibodies,Cytokines andArthritis,Marcel Dekker,New York,NY(1991)；Bach(ed.)Monoclonal Antibodies andPeptide Therapy in Autoimmune Diseases,Marcel Dekker,New York,NY(1993)；Baert,et al.New Engl.J.Med.348:601-608(2003)；Milgrom et al.New Engl.J.Med.341:1966-1973(1999)；Slamon et al.New Engl.J.Med.344:783-792(2001)；Beniaminovitz etal.New Engl.J.Med.342:613-619(2000)；Ghosh et al.New Engl.J.Med.348:24-32(2003)；Lipsky et al.New Engl.J.Med.343:1594-1602(2000)]。
兽医确定合适的剂量，例如使用本领域已知或疑似影响治疗的参数或因素。通常，剂量以稍微小于最佳剂量的量开始，并且此后以小增量增加，直到相对于任何负面副作用实现期望的或最佳的效果。重要的诊断指标包括所述症状的那些。
本文提供的抗体可以通过连续输注或通过施用的剂量提供，例如，每天，每周1-7次，每周，每两周，每月，每两月，每季度，每半年，每年等。可以通过例如静脉内，皮下，局部，口服，经鼻，直肠，肌内，脑内，脊柱内或通过吸入提供剂量。总周剂量通常为至少0.05μg/kg体重，更通常为至少0.2μg/kg，0.5μg/kg，1μg/kg，10μg/kg，100μg/kg，0.25mg/kg，1.0mg/kg，2.0mg/kg，5.0mg/ml，10mg/kg，25mg/kg，50mg/kg或更多[参见例如Yang,et al.NewEngl.J.Med.349:427-434(2003)；Herold,et al.New Engl.J.Med.346:1692-1698(2002)；Liu,et al.J.Neurol.Neurosurg.Psych.67:451-456(1999)；Portielji,et al.CancerImmunol.Immunother.52:133-144(2003)]。也可提供剂量以实现犬血清中本发明抗体的预定目标浓度，例如0.1，0.3，1，3，10，30，100，300μg/ml或更高。在其他实施方案中，本发明的抗体以10，20，50，80，100，200，500，1000或2500mg/受试者每周，每两周，“每4周”，每月，每两月或每季度皮下或静脉内施用。
如本文所用，“抑制”或“治疗”或“处理”包括延迟与病症相关的症状的发展和/或降低此类病症的症状的严重程度。该术语还包括改善现有的不受控制的或不需要的症状，预防另外的症状，以及改善或预防这些症状的潜在原因。因此，该术语表示已对患有病症，病况和/或症状，或具有发展此类病症，疾病或症状的可能性的脊椎动物受试者(例如犬科动物)产生了有益结果。
如本文所用，术语“治疗有效量”，“治疗有效剂量”和“有效量”是指当向细胞，组织或受试者(例如犬)单独施用或与另外的治疗剂组合施用时，有效引起疾病或病状的一种或多种症状或此类疾病或病状的进展的可衡量的改善的本发明抗体的量。治疗有效剂量还指足以导致症状的至少部分改善的抗体的量，例如，相关医学病症的治疗，治愈，预防或改善，或此类病症的治疗，治愈，预防或改善的速率的增加。当应用于组合时，治疗有效剂量是指产生治疗效果的活性成分的组合量，无论是组合给药，连续给药还是同时给药。有效量的治疗剂将导致诊断指标或参数改善至少10％；通常至少20％；优选至少约30％；更优选至少40％，最优选至少50％。在使用主观指标来评估病症严重程度的情况下，有效量也可导致主观指标的改善。
实施例
实施例1
IL-31受体α
核苷酸序列
SEQ ID NO：1的核苷酸序列编码与HIS标签融合的犬IL-31受体α(cIL-31RA)的细胞外结构域。犬IL-31RA ECD HIS-标记的蛋白包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。通过化学合成制备核苷酸序列，然后将其克隆到适于在真核细胞(HEK-293或CHO细胞)中产生相应蛋白质的表达质粒中。
犬IL-31RA ECD-10His：[SEQ ID NO:1]
gtgctgcccgccaagcccgagaacatcagctgcatcttctactacgaggagaacttcacctgcacctggagccccgagaaggaggccagctacacctggtacaaggtgaagagaacctacagctacggctacaagagcgacatctgcagcaccgacaacagcaccagaggcaaccacgccagctgcagcttcctgccccccaccatcaccaaccccgacaactacaccatccaggtggaggcccagaacgccgacggcatcatgaagagcgacatcacctactggaacctggacgccatcatgaagatcgagccccccgagatcttcagcgtgaagagcgtgctgggcatcaagagaatgctgcagatcaagtggatcagacccgtgctggccccccacagcagcaccctgaagtacaccctgagattcagaaccatcaacagcgcctactggatggaggtgaacttcaccaaggaggacatcgacagagacgagacctacaacctgaccgagctgcaggccttcaccgagtacgtgatgaccctgagatgcgcccccgccgagagcatgttctggagcggctggagccaggagaaggtgggcaccaccgaggaggaggccccctacggcctggacctgtggagagtgctgaagcccgccatggtggacggcagaagacccgtgcagctgatgtggaagaaggccaccggcgcccccgtgctggagaaggccctgggctacaacatctggtacttccccgagaacaacaccaacctgaccgagaccgtgaacaccaccaaccagacccacgagctgtacctgggcggcaagacctactgggtgtacgtggtgagctacaacagcctgggcgagagccccgtggccaccctgagaatccccgccctgaacgagaagaccttccagtgcatcgaggccatgcaggcctgcctgacccaggaccagctggtggtggagtggcagagcagcgcccccgaggtggacacctggatggtggagtggttccccgacgtggacagcgagcccagcagcttcagctgggagagcgtgagccaggccagaaactggaccatccagaaggacgagctgaagcccctgtggtgctacaacatcagcgtgtaccccgtgctgagagacagagtgggccagccctacagcacccaggcctacgtgcaggagggcatccccagcgccggccccgtgacccaggccgacagcatcggcgtgaagaccgtgaccatcacctggaaggagatccccaagagcaagagaaacggcttcatcaagaactacaccatcttctaccaggccgaggacggcaaggagttcagcaagaccgtgaacagcaacatcctgcagtacagactggagagcctgaccagaagaaccagctacagcctgcaggtgatggccagcaccaacgccggcggcaccaacggcaccaagatcaacttcaagaccctgagcatcagccaccaccaccaccaccaccaccaccaccac
实施例2
IL-31受体αECD的表达和纯化
根据制造商的建议，使用电穿孔通过MaxCyte仪器将包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列的质粒转染到HEK-293或CHO细胞中。转染后几天，收获转染细胞和未转染对照的上清液，离心除去细胞碎片。按照制造商的建议，通过将来自转染细胞的澄清收获液通过镍柱，从细胞培养液中纯化具有HIS标签的IL-31RA。纯化的蛋白质通过测量它们在280nm的紫外光的吸光度来定量。
犬IL-31RA ECD-10His：[SEQ ID NO:2]
VLPAKPENISCIFYYEENFTCTWSPEKEASYTWYKVKRTYSYGYKSDICSTDNSTRGNHASCSFLPPTITNPDNYTIQVEAQNADGIMKSDITYWNLDAIMKIEPPEIFSVKSVLGIKRMLQIKWIRPVLAPHSSTLKYTLRFRTINSAYWMEVNFTKEDIDRDETYNLTELQAFTEYVMTLRCAPAESMFWSGWSQEKVGTTEEEAPYGLDLWRVLKPAMVDGRRPVQLMWKKATGAPVLEKALGYNIWYFPENNTNLTETVNTTNQTHELYLGGKTYWVYVVSYNSLGESPVATLRIPALNEKTFQCIEAMQACLTQDQLVVEWQSSAPEVDTWMVEWFPDVDSEPSSFSWESVSQARNWTIQKDELKPLWCYNISVYPVLRDRVGQPYSTQAYVQEGIPSAGPVTQADSIGVKTVTITWKEIPKSKRNGFIKNYTIFYQAEDGKEFSKTVNSNILQYRLESLTRRTSYSLQVMASTNAGGTNGTKINFKTLSISHHHHHHHHHH
表1
犬IL-31RA细胞外结构域-HIS标签
| SEQ ID NO: | 核酸 | 氨基酸 | |
| 犬IL-31RA ECD-10His | 1 | X | |
| 犬IL-31RA ECD-10His | 2 | X |
实施例3
犬IL-31RA与生物素化的犬IL-31的结合：
方案
1)通过在磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)中稀释至1μg/mL，用IL-31RA蛋白包被免疫板。加入100μL/孔。将板在2-7℃孵育过夜。
2)用275μL/孔的磷酸盐缓冲盐水溶液加TWEEN20(PBST)洗涤板3次。
3)用200μL/孔封闭缓冲液[PBST中的1％脱脂奶粉(NFDM)]在36±2℃下温和振荡(120±20RPM)封闭板30-45分钟。
4)用275μL/孔的PBST洗涤板3次。
5)在稀释板上在PBST中的1％NFDM中3倍稀释生物素化的IL-31(10μg/mL)，并以100μL/孔转移至免疫板。在36±2℃下温和振荡(120±20RPM)孵育30-45分钟。
6)用275μL/孔的PBST洗涤板3次。
7)在PBST中的1％NFDM中将辣根过氧化物酶-链霉抗生物素蛋白(HRP-链霉抗生物素蛋白)稀释至1：1000的最终稀释度。
8)向免疫板中加入100μL/孔的HRP-链霉抗生物素蛋白，并在36±2℃下温和振荡(120±20RPM)孵育30-45分钟。
9)用275μL/孔的PBST洗涤板3次。
10)在即将使用前合并等体积的预热的TMP2-组分底物。
11)将制备的3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMP)底物以100μL/孔加至免疫板，并在36±2℃下温和振荡(120±20RPM)在黑暗中孵育10至15分钟。
12)通过加入100μL/孔的1M H3PO4终止反应。
13)使用读板器以450nm的波长和540nm的参考波长读板。
测试犬IL-31RA的细胞外结构域(ECD)结合犬IL-31的能力(参见图1)。结果表明IL-31RA ECD以剂量依赖性方式与生物素化的犬IL-31结合，EC50为0.55ng/ml。
实施例4
针对犬IL-31受体α的单克隆抗体
通过用犬IL-31RA ECD多次免疫小鼠产生抗犬IL-31RA的单克隆抗体(mAb)。在第0天，第14天和第28天，用GS专有佐剂中的IL-31RA ECD通过腹膜内途径免疫小鼠3次，对于第一次免疫，每只小鼠50μg，对于随后的加强免疫，每只小鼠25μg。在第48天，用25μg抗原再次免疫小鼠，4天后将其脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞系融合以产生分泌抗体的杂交瘤。在免疫后的不同时间点，从小鼠收集血清并通过ELISA测试抗犬IL-31RA。将来自具有最高IL-31RAECD反应性的小鼠的脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞系融合以产生杂交瘤。融合后约14天，使用表达IL-31RA蛋白的细胞通过流式细胞术筛选来自生长的杂交瘤的上清液。如下通过ELISA证实杂交瘤的反应性：
ELISA方法：
1)用25μL/孔的IL-31RA(1μg/mL于PBS缓冲液中)包被96孔板。
2)将板在4℃孵育过夜。
3)用PBST(PBS+0.05％Tween20)洗涤板3次
4)用25μl/孔封闭缓冲液[含5％胎牛血清(FBS)的PBS]在室温下封闭平板30分钟。
5)将25μl/孔杂交瘤上清液转移到96孔板中，在室温下孵育60分钟。
6)用PBST洗板3次。
7)将25μl/孔1：4000稀释于封闭缓冲液中的抗小鼠HRP加至板中并在室温下孵育60分钟。
8)用PBST洗板5次。
9)向板中加入基于TMB的试剂进行比色反应2-3分钟。
10)用0.16M硫酸终止反应。
11)用读板器读板。
如图2A-2B所示，测试所选小鼠mAb对犬IL-31RA的反应性。结果表明所选择的小鼠mAb以剂量依赖性方式结合犬IL-31RA。如图2A-2B所示，获得了10种对犬IL-31RA具有强结合反应性的小鼠单克隆抗体。
下面提供了这10种小鼠单克隆抗体的重链和轻链可变区的氨基酸序列。
100H8VH[SEQ ID NO:52]
100H8VL[SEQ ID NO:53]
222E7VH[SEQ ID NO:54]
222E7VL[SEQ ID NO:55]
55B3VH[SEQ ID NO:56]
55B3VL[SEQ ID NO:57]
74H10VH[SEQ ID NO:58]
EVQLQQSGPELVKPGASMKIPCKTSGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGHINPNNGGTLYNQKFKDKATLTVDRSSNTAYMELRSLTSEDTAVYYCARWAPLLRQPYWYFDVWGTGTTVTVSS
74H10VL[SEQ ID NO:59]
DIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLNWFQQKPGKSPKTLIYRADRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYDEFPLTFGDGTKLELN
209G5VH[SEQ ID NO:60]
EVQLQQSVAELVRPGASVKLSCTASGFNIKNTYMHWVKERPEQGLEWIGRIDPANGNSKYAPKFQGKATITTDTSSNTAYLQLSSLTSEDTAIYYCARYYYVSSHFDVWGTGTTVTVSS
209G5VL[SEQ ID NO:61]
SIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQSVTNDVTWYQQKPGQSPKLLIYYASNRYTGVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFCQQDYSSPFTFGSGTKLEIK
51F8VH[SEQ ID NO:62]
EVQLQQSVAELVRPGASVKLSCTASGFNIKNTFIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNTKYAPKFQGRATLTADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAIYYCARYYYVSSYFDVWGTGTTVTVSS
51F8VL[SEQ ID NO:63]
SIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQSVTNDVTWYQQKPGQSPKLLIFSASNRYTGVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFCQQDYSSPWTFGGGTKLEIK
65G9VH[SEQ ID NO:64]
EFQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTDYGMNWLKQINGKSLEWIAIINPNYGTASSNPKFKDKATLTVDHSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARAFDGYYFYWYFDVWGTGTTVTVSS
65G9VL[SEQ ID NO:65]
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLIHTNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYFCSQSTHVPLTFGAGTKLELR
85C10VH[SEQ ID NO:66]
EFQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTDYSINWVKQSNGKSLEWIGVINPNYGTSSHNQKFKGKATMTVDQSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARALDDYYFYWYFDVWGIGTTVTVSS
85C10VL[SEQ ID NO:67]
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHTNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQTTHVPLTFGAGTKLELK
218D9VH[SEQ ID NO:68]
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTFGRGVGWIRQPSGKGLDWLTHIWWDDDKYYNPALKSRLTISKDTSKNQVFLKIANVDTADTATYYCARIAGGLRRAPYAMDSWGQGTSVTVSS
218D9VL[SEQ ID NO:69]
DIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRASENIYSSLAWYQQKQGKSPQLLVYAATNLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDSGNYYCQHFRDTPPTFGGGTKLEIK
224G3VH[SEQ ID NO:70]
EVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYGMSWVRQTPDKRLEWVATISNGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYMQMSSLKSEDTAMYYCARNEPPDYWGQGTSVTVSS
224G3VL[SEQ ID NO:71]
QIVLTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVGSSYLHWYQQKPGSSPKLWIYDTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQYHRSPYTFGGGTKLEIK
下表2提供了通过Octet动力学分析的缔合速率常数(ka)，解离速率常数(kd)和解离常数(KD)(也参见下文实施例9)。这些常数反映了单个单克隆抗体对犬IL-31RA的结合亲和力。
表2
所选抗IL-31RA抗体的结合亲和力
| mAb | KD(M) | ka(1/Ms) | kd(1/s) |
| 100H8 | 1.52E-10 | 7.88E+05 | 1.20E-04 |
| 51F8 | 2.07E-10 | 6.84E+05 | 1.41E-04 |
| 55B3 | 2.72E-10 | 5.68E+05 | 1.54E-04 |
| 65G9 | 4.51E-10 | 7.87E+05 | 3.55E-04 |
| 74H10 | 1.96E-10 | 4.63E+05 | 9.05E-05 |
| 209G5 | 1.31E-10 | 3.70E+05 | 4.87E-05 |
| 85C10 | 8.51E-10 | 4.27E+05 | 3.63E-04 |
| 218D9 | 6.98E-11 | 6.64E+05 | 4.63E-05 |
| 222E7 | 1.74E-10 | 1.62E+06 | 2.82E-04 |
| 224G3 | 9.64E-13 | 1.12E+06 | 1.08E-06 |
结果显示所选择的mAb具有范围从约0.85nM至约1pM的低纳摩尔至亚皮摩尔的结合亲和力。
上述10种单克隆抗体各自的6个CDR组提供于下表3中。此外，下表4中提供了这些CDR各自的规范结构。
表3
小鼠CDR的氨基酸序列
表4
小鼠CDR的规范结构
| L1 | L2 | L3 | H1 | H2 | H3 | |
| 100H8 | L1-2 | L2-1 | L3-1 | H1-1 | H2-2 | H3-11 |
| 85C10 | L1-4 | L2-1 | L3-1 | H1-1 | H2-2 | H3-10 |
| 51F8 | L1-2 | L2-1 | L3-1 | H1-1 | H2-2 | H3-7 |
| 222E7 | L1-2 | L2-1 | L3-1 | H1-1 | H2-2 | H3-14 |
| 55B3 | L1-2 | L2-1 | L3-1 | H1-1 | H2-2 | H3-14 |
| 209G5 | L1-2 | L2-1 | L3-1 | H1-1 | H2-2 | H3-10 |
| 65G9 | L1-4 | L2-1 | L3-1 | H1-1 | H2-2 | H3-14 |
| 218D9 | L1-2 | L2-1 | L3-1 | H1-1 | H2-4 | H3-14 |
| 224G3 | L1-2 | L2-1 | L3-1 | H1-1 | H2-4 | H3-6 |
| 74H10 | L1-2 | L2-1 | L3-1 | H1-1 | H2-2 | H3-14 |
在上表3中的这10组CDR中，结合IL-31RA的4种抗犬IL-31RA抗体的特定组被鉴定为包含惊人的氨基酸序列相似性。
重链:
轻链:
实际上，这4种抗体的组中的所有HCDR1具有相同的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)。尽管四个HCDR2不同，但它们差别不大。值得注意的是，100H8的HCDR2与其他三个HCDR2的不同之处在于在第9位具有异亮氨酸残基而不是苏氨酸残基。74H10与100H8的区别还在于在其C-末端具有天冬氨酸残基而不是甘氨酸残基。与100H8一样，其他三个HCDR2在其C-末端具有甘氨酸残基。与100H8不同，其他三个HCDR在其C-末端具有三个额外的氨基酸残基(FDV)。74H10和55B3在其第4位都具有亮氨酸，而不是缬氨酸残基，如100H8，而222E7具有谷氨酰胺残基。最后，100H8和74H10在第3位都具有脯氨酸残基，而222E7和55B3在第3位都具有谷氨酰胺残基。
这4种抗体的组中的4种LCDR1中的3种具有相同的氨基酸序列(SEQ ID NO：30)，而55B3的LCDR1共享它们的前4个氨基酸残基，其LCDR1与其他3种LCDR1在其余7个氨基酸残基上不同。100H8和74H10的LCDR2具有相同的氨基酸序列(SEQ ID NO：40)，但55B3和222E7的LCDR2与其他两种LCDR2的不同之处在于在第3位具有天冬酰胺残基而不是100H8和74H10的天冬氨酸残基。另外，222E7的LCDR2在第2位具有缬氨酸残基，而不是在其他三种抗体的LCDR2中发现的丙氨酸残基。值得注意的是，这一组四种抗体中的所有四种LCDR3具有相同的氨基酸序列(SEQ ID NO：45)。
以上详述的犬IL-31RA的其余六(6)种抗体，即65G9，85C10，224G3，51F8，209G5和218D9，可以进一步分解成在它们各自的CDR氨基酸序列中具有显著同一性的两对抗体，和作为相对异常物(outlier)的两个抗体。因此，抗体65G9的6个CDR的组与抗体85C10的6个CDR的组之间存在明显的氨基酸序列同一性(参见表3)。一致地，抗体65G9和85C10均结合IL-31RA-ECD的C-末端区域中的两个线性序列，其中一个是相同的(SEQ ID NO：106；参见表6和图6D)，并且另一个具有实质性重叠(比较SEQ ID NO：107与SEQ ID NO：108；参见表6)。值得注意的是，其中一个异常物，抗体244G3，结合在IL-31RA-ECD的C-末端区域中包含单一线性序列的表位(参见图6E)，其包含于抗体85C10的第二线性序列中(比较SEQ ID NO：109与SEQ ID NO：108；参见表6)。
第二组含有抗体51F8和209G5，它们各自的6个CDR的组之间也具有明显的氨基酸序列同一性(参见表3)。一致地，抗体51F8和209G5都结合IL-31RA-ECD的N-末端区域中的两个线性序列，其中一个是相同的(SEQ ID NO：98；参见表6和图6B)，而抗体209G5结合的IL-31RA-ECD的第二线性序列(SEQ ID NO：101)是在抗体51F8结合的IL-31RA-ECD的第二线性序列的氨基序列内(SEQ ID NO：100；参见表6)。
另一个异常物，抗体218D9结合位于IL-31RA-ECD的氨基酸序列中间部分的两个线性氨基酸序列(SEQ ID NOs：104和105；参见图6C和表6)。所述抗体被证明是IL-31RA的强结合剂和IL-31RA与IL-31结合的良好阻断剂。
实施例5
抗IL-31受体α抗体的阻断活性
在下述阻断ELISA中评价抗犬IL-31RA杂交瘤上清液阻断IL-31与IL-31RA结合的能力。
方案
1)用25μL/孔的IL-31RA(1μg/mL于PBS缓冲液中)包被96孔半区板。
2)将板在4℃孵育过夜。
3)用PBST(PBS+0.05％Tween20)洗板3次
4)用封闭缓冲液(含5％FBS的PBS)以25μl/孔封闭板30分钟。
5)将25μl/孔杂交瘤上清液转移到96孔板中，在室温下孵育60分钟。
6)用PBST洗涤板3次。
7)转移25μL/孔的生物素化IL-31(0.5μg/mL于封闭缓冲液中)，在室温下孵育60分钟。
8)用PBST洗涤板3次。
9)加入25μl/孔的在封闭缓冲液中1：5000稀释的链霉抗生物素蛋白-HRP至板中，并在室温下孵育60分钟。
10)用PBST洗涤板5次。
11)向板中加入基于TMB的试剂进行比色反应2-3分钟。
12)用0.16M硫酸终止反应。
13)用读板器读板。
结果：
在最初鉴定的大约2000个杂交瘤克隆中，发现大约300个对IL-31RA具有结合亲和力，并且大约10个这样的克隆也显示出显著阻断犬IL-31与犬IL-31RA的结合(参见下面的实施例)。
实施例6
用于测试阻断针对犬IL-31-RA的单克隆抗体的活性的FACS分析
为了开发基于细胞的测定以评估抗犬IL-31RA抗体对犬IL-31的结合和阻断，通过化学合成制备带有c-末端Flag标签的犬IL-31RA和带有c-末端HA标签的OSMR的核苷酸序列，然后分别克隆到慢病毒载体Lenti-puro和Lenti-Hygro中。将从Lenti-X293T细胞制备的慢病毒Lenti-puro-IL-31RA-Flag和Lenti-Hygro-OSMR-HA共转染到CHO-k1细胞中。通过FACS用抗flag和抗HA抗体选择共表达犬IL-31RA和OSMR的CHO稳定细胞库。从稳定库中分离单细胞克隆。将开发的CHO-IL-31RA/OSMR表细胞系用于筛选抗犬IL-31RA单克隆抗体，以用其受体复合物IL-31RA/OSMR阻断IL-31。
材料
细胞系：CHO-IL-31RA/OSMR稳定细胞系
细胞生长培养基：含10％FBS，8μg/ml嘌呤霉素和200μg/ml潮霉素的F-12K培养基
重组犬IL-31-His蛋白(0.5μg/ml)
FACS缓冲液：PBS
同种型对照：小鼠IgG(Genscript，A01007)(3μg/ml)
二抗：小鼠抗His标签抗体，1μg/ml(Genscript，A01802)
流式细胞仪：BD FACSCanto
流式细胞术程序
1)CHO-IL-31RA/OSMR细胞在T75烧瓶中的生长培养基中生长。
2)胰蛋白酶消化以分离细胞，然后将细胞再悬浮于5mL新鲜生长培养基中。
3)以300g离心细胞3分钟，弃去上清液，用PBS洗涤细胞两次。
4)将细胞以2×106个细胞/mL再悬浮于PBS中。
5)将细胞以50μl/孔接种到96孔测定板中。
6)将抗IL-31RA抗体(20μg/mL)或同种型对照与IL-31(1μg/ml)混合，然后将50μl混合物转移到测定板的每个孔中。
7)在4℃下孵育40后，用150μl冷PBS洗涤细胞两次。
8)将100μl二抗(1μg/mL)加入测定板的每个孔中。
9)在4℃下孵育40min后，用150μl冷PBS洗涤细胞两次。
10)将细胞重悬于100μl/孔冷PBS中，并通过流式细胞术读取。
如图3所示，FACS结果表明10种小鼠抗犬IL-31RA mAb中的9种能显著阻断IL-31与CHO-IL-31RA/OSMR细胞上存在的IL-31RA/OSMR复合物的结合。主要抗体是51F8，74H10，100H8，209G5和218D9。
实施例7
STAT-3测定
已知Stat-3在包含IL-31的异二聚体受体的细胞中被IL-31激活。为了开发评估犬IL-31对STAT-3的激活的测定法，通过化学合成制备分别编码IL-31RA和OSMR的核苷酸序列，然后将其克隆到表达载体pcDNA3.1中。将分别含有IL-31RA和OSMR核苷酸序列的载体共转染到Ba/f3细胞中，并在抗生素选择下将表示为“Ba/f3-OI”的转染细胞作为库培养。如下测试犬IL-31诱导STAT-3激活的能力。
材料：
细胞系：Ba/f3-OI稳定库细胞
具有小鼠IL-3或具有犬IL-31(cIL-31)的生长培养基：
RPMI 16404 35ml(ThermoFisher，12633-020)
FBS50mL(SAFC cat#12003c-500mL)
2-巯基乙醇(50mM)0.5mL(Gibco31350-010)
100X Pen Strep 5mL(Gibco 15140-122Lot1734040)
200mM L-Glu 10ml(Gibco 25030-081Lot1677185)
500ng/mL Geneticin G418(来自Gibco或Sigma)
5ng/mL mIL-3或100ng/mL cIL-31
饥饿培养基：不含mIL-3和cIL-31的生长培养基
p-STAT3(Tyr705)测定试剂盒：PerkinElmer，ALSU-PST3-A-HV
程序：
细胞培养
1)解冻一小瓶Ba/f3-OI细胞，并在37℃CO2摇床中以125rpm在具有mIL-3的生长培养基中生长细胞。
2)将细胞传代2-3次以使细胞具有≥90％的活力，然后进行基于细胞的测定。
3)为了设置测定，收获细胞并将其再悬浮于饥饿培养基中至1×107活细胞/mL。
4)将细胞分配到96孔板中，50μL/孔(约5×105个细胞/孔)。
5)在稀释板中在饥饿培养基中三倍稀释cIL-31，然后将50μL系列稀释的cIL-31等分试样中的每一个转移到细胞板中。
6)在37℃CO2摇床中以125rpm孵育细胞板15-30分钟，持续1-2小时。根据制造商的说明进行AlphaLISA分析：
7)离心细胞，吸出上清液，加入50-100μL/孔的1x裂解缓冲液。在室温下以1000rpm振荡孵育10分钟。
8)将30μL细胞裂解物移入1/2面积板或冷冻并储存在-80℃下用于将来的测试。
SUREFIRE测定：
9)向细胞裂解物中加入15μL/孔受体混合物。密封并在1000rpm下搅拌板2分钟，然后在室温下孵育1-2小时。
10)向细胞裂解物中加入15μL/孔供体混合物。密封并在1000rpm下搅拌2分钟，然后在室温下孵育1-2小时(可将板在4℃下储存过夜。第二天读板前在室温下孵育1小时)
11)在Alpha读板器上在520-620nm下读板。
结果：
图4显示犬IL-31诱导STAT-3磷酸化，其以剂量依赖性方式刺激Ba/f3-OI细胞中STAT-3的活化。将Ba/f3细胞用作对照。测试表达IL-31受体复合物的Ba/f3-OI细胞的IL-31诱导的STAT-3磷酸化。结果表明，STAT-3磷酸化以剂量依赖性方式由Baf3-OI细胞中的IL-31诱导，暗示：(i)所述犬IL-31受体复合物在所述细胞表面上成功表达；(ii)犬IL-31与IL-31受体的结合可刺激内源性STAT3磷酸化；和(iii)然后启动其下游信号传导途径。
实施例8
抗犬IL-31RA抗体的生物活性
如下评估抗犬IL-31RA mAb抑制Ba/f3-OI细胞中STAT-3活化的能力：
1)解冻一小瓶Ba/f3-OI细胞，并在37℃CO2摇床中以125rpm在具有mIL-3的生长培养基中生长Ba/f3-OI细胞。
2)将细胞传代2-3次以使细胞具有≥90％的活力，然后进行基于细胞的测定。
3)为了设置测定，收获细胞并将其再悬浮于饥饿培养基中至1×107活细胞/mL。
4)将细胞分配到96孔板中，50μL/孔(约5×105个细胞/孔)。
5)将抗体在96孔板上的一排饥饿培养基中稀释3倍，起始浓度为200μg/mL。然后每孔加入5μL cIL-31至终浓度为100ng/mL。
6)将50μL稀释的抗体和cIL-31混合物转移到细胞板的每个孔中，轻轻混合。
7)将细胞板在37℃CO2摇床中以125rpm孵育15-30分钟。根据制造商的说明进行AlphaLISA分析：(参考实施例7)
如图5A中针对单克隆抗体209G5，218D9和85C10的示例，图5B中针对单克隆抗体100H8，74H10，51F8和85C10的示例，以及图8中针对218D9的各种构建体的示例，所测试的所有IL-31RA mAb抑制Ba/f3-OI细胞中犬IL-31介导的STAT-3磷酸化，而在不存在这些抗体的情况下，没有抑制(标记的IL-31)。根据图8，各种218D9抗体构建体的IC50计算为大约：嵌合抗体的2.2nM；c218D9VH3VL2的230nM；c218D9VH4VL2的8.3nM；c218D9VH4VL3的2.9nM；和c218D9VH3VL3的2.5nM。
实施例9
抗犬IL-31RA单克隆抗体与犬IL-31RA受体的体外结合
通过Octet HTX使用SA生物传感器和Data Acquisition 12.0软件进行所有动力学测量。将生物素标记的抗原(犬IL-31RA)以1μg/mL的浓度装载到预先再水合的SA生物传感器上120s。接着，将生物传感器置于Octet动力学缓冲液(PBS+0.02％Tween20，0.1％BSA)中120s用于封闭阶段。然后，对于结合阶段，将负载抗原的生物传感器置于Octet动力学缓冲液中的抗IL-31RA单克隆抗体的从100nM降至3.13nM的2倍系列稀释液中300s。最后一个孔是单独的缓冲液，该传感器用于参考传感器减除。最后，将生物传感器置于Octet动力学缓冲液中300s用于解离阶段。使用Data Acquisition 12.0软件进行分析，并使用1：1结合模型拟合曲线。
结合亲和力测量结果表明所有测试的单克隆抗体具有范围从约1.5nM至约1pM的低纳摩尔至亚皮摩尔结合亲和力(参见上表2)。两种顶部封闭抗体：51F8和218D9分别具有约0.2nM和约0.07nM的KD(参见下表5B)。
实施例10
犬源化抗体
犬重链和轻链的DNA和蛋白质序列是已知的，并且可以通过搜索NCBI基因和蛋白质数据库获得。如上所述，对于犬抗体，存在四种已知的IgG亚型：IgG-A，IgG-B，IgG-C和IgG-D，以及两种类型的轻链，即κ和λ。不受任何特定方法的束缚，产生可混合在不同组合中以产生犬源化抗犬IL-31受体αmAb的犬源化重链和轻链的方法涉及以下方案：
i)鉴定包含期望的抗IL-31受体αmAb的CDR的VH和VL结构域的DNA序列
ii)鉴定期望的抗IL-31RAmAb的H和L链CDR
iii)鉴定犬IgG的H和L链的合适序列iv)鉴定编码上述序列的犬IgG H和L链的内源CDR的DNA序列。
v)用编码所需抗IL-31RACDR的DNA序列替换编码内源性犬H
和L链CDR的DNA序列。此外，任选地用来自所需抗IL-31受体αmAb框架区的选定残基取代一些犬框架残基。
vi)合成步骤(v)的DNA，将其克隆到合适的表达质粒中，并将含有所需的犬源化H和L链的质粒转染到HEK293细胞中。
vii)从HEK293上清液纯化所表达的犬源化抗体。
vii)测试纯化的犬源化抗体与犬IL-31受体α链的结合。
应用上面概述的步骤可以产生下面提供的一组犬源化的H和L链氨基酸序列。
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c100H8VL4-cCK[SEQ ID NO:85]
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c218D9VH1-cIgGBm[SEQ ID NO:86]
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c218D9VH4-cIgGBm[SEQ ID NO:89]
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c218D9VL1-cCK[SEQ ID NO:90]
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c218D9VL3-cCK[SEQ ID NO:92]
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c218D9VH1[SEQ ID NO:93]
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c218D9VH4[SEQ ID NO:96]
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c218D9VL1[SEQ ID NO:128]
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实施例11
犬源化抗体对犬IL-31RA的反应性
如下测试犬源化抗体与犬IL-31RA的反应性：
1.将200ng/孔的IL-31RA包被在免疫板上，并将板在4℃孵育过夜。
2.用含有0.05％Tween20(PBST)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤平板3次。
3.在室温下用PBS中的0.5％牛血清白蛋白(BSA)封闭板45-60分钟。
4.用PBST洗板3次。
5.从0.3μg/mL开始，将稀释板的每列或每排中的犬源化抗体稀释3倍。
6.将稀释的犬源化抗体转移到免疫板的每列或每排中，并在室温下孵育该板45-60分钟。
7.用PBST洗板3次。
8.将1：4000稀释的辣根过氧化物酶标记的抗犬IgG Fc加入板的每个孔，然后在室温下孵育板45-60分钟。
9.用PBST洗板3次。
10.将3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物加入到板的每个孔中，并在室温下孵育板10至15分钟以显色。
11.向各孔中加入100μL 1.5M磷酸以终止反应。在450nm用540nm参考波长读板。
如图7A-7E所示，检测犬源化抗体对犬IL-31RA的反应性。结果表明犬源化抗体具有与其相应亲本抗体(由其嵌合抗体表示)相似的结合亲和力。
下表5A提供了不同犬源化抗体(EC50)相对于它们相应的小鼠-犬嵌合体抗体的相对结合亲和力(参见图7A-7E)。尽管这些只是相对数，但犬源化抗体218D9表现为具有与其亲本嵌合鼠抗体基本相同的结合亲和力的抗体。
抗体编号前的术语“嵌合”表示抗体是鼠-犬嵌合抗体，例如嵌合218D9或嵌合51F8。此外，抗体编号前接“m”后跟“Chim”表示所述抗体是鼠-犬嵌合抗体，例如m224G3Chim。抗体编号前的小写字母“c”表示其为犬源化抗体，例如，c218D9VH4VL2。
表5A
犬源化抗体的相对结合亲和力(EC50)
| 抗体 | EC50 |
| 嵌合100H8 | 2.021 |
| c100H8VH5L4 | 2.561 |
| c100H8VH7L4 | 0.581 |
| 嵌合85C10 | 2.583 |
| c85C10VH3L2 | 1.910 |
| c85C10VH1L2 | 6.002 |
| 嵌合224G3 | 0.383 |
| c224G3VH2L2 | 1.078 |
| c224G3VH2L3 | 0.699 |
| 嵌合51F8 | 3.417 |
| c51F8VH3L6 | 16.94 |
| c51F8VH3L7 | 25.02 |
| c51F8VH4L6 | 8.306 |
| c51F8VH4L7 | 11.33 |
| 嵌合218D9 | 3.153 |
| c218D9VH3L2 | 4.289 |
| c218D9VH3L3 | 3.216 |
| c218D9VH4L2 | 4.096 |
下表5B显示51F8和218D9的犬源化抗体的结合常数。结果再次表明犬化的218D9抗体具有与其亲本嵌合鼠抗体基本相同的结合亲和力，而犬源化的51F8抗体具有比其亲本嵌合鼠抗体稍弱的结合亲和力。
表5B
犬源化的51F8和218D9抗体的结合常数
实施例12
使用质谱对犬IL-31受体α表位进行作图
采用基于化学交联和质谱检测的方法来鉴定抗犬IL-31受体αmAb识别的表位[CovalX Instrument Incorporated,located at 999Broadway,Suite305,Saugus,MA01906-4510]。将该技术应用于犬IL-31受体α链的表位作图导致鉴定了下表6中所列mAb识别的表位。用本文公开的抗体对犬IL-31受体α进行表位作图的结果表明mAb识别存在于犬IL-31受体α的细胞外结构域内的特异性肽表位(参见下表6)。表6中包括的8种抗体对犬IL-31RA的表位作图的结果表明mAb识别存在于犬IL-31RA的细胞外结构域内的特异性肽表位。值得注意的是，从IL-31RA-ECD的N-末端到C-末端分布的7个表位被8种抗体结合而鉴别。抗体100H8，51F8，209G5和55B3共有针对IL-31RA-ECD的N-末端的表位，而抗体65G9，85C10和224G3共有针对IL-31RA-ECD的C-末端的表位。抗体218D9具有位于IL-31RA-ECD中部的两个独特表位。如功能结果所示，所有8种单克隆抗体都阻断IL-31介导的STAT3磷酸化，这意味着7种表位在犬IL-31RA与其配体的相互作用中是重要的。这显示犬IL-31和犬IL-31受体复合物相互作用的复杂性。测试的8种单克隆抗体中有5种是犬源化的，它们各自表位的位置和它们的被鉴别的结合的IL-31RA ECD的氨基酸残基都显示在图6A-6E中，并包括在下表6中[还参见图6A-6E，其提供了犬IL-31RA上的分别针对以下抗体的表位：100H8，51F8，218D9，85C10和224G3，以及cIL-31R ECD抗原上各自表位的SEQ ID NO：2的氨基酸序列的结合残基的位置]。
表6
抗IL-31RA单克隆抗体识别的IL-31RA表位
表7
图6A-6E中的序列
来自优先权提交的ST.25序列表
Claims (37)
1.一种结合犬白介素-31受体α(犬IL-31RA)的哺乳动物抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含重链和轻链，所述重链和轻链共同包含六个互补决定区(CDR)的集合，其中三个是重链CDR：CDR重链1(HCDR1)、CDR重链2(HCDR2)和CDR重链3(HCDR3)，且其中三个是轻链CDR：CDR轻链1(LCDR1)、CDR轻链2(LCDR2)和CDR轻链3(LCDR3)；其中每个CDR包含氨基酸序列；并且
其中所述六个CDR的集合选自由(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)和(vi)组成的集合；其中对于集合(i)：
HCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
HCDR2包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；
HCDR3包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；
LCDR1包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；
LDR2包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；并且
LCDR3包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；
其中对于集合(ii)：
HCDR1包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
HCDR2包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；
HCDR3包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列；
LCDR1包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；
LDR2包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；并且
LCDR3包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；
其中对于集合(iii)
HCDR1包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
HCDR2包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；
HCDR3包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；
LCDR1包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；
LDR2包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；并且
LCDR3包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；
其中对于集合(iv)：
HCDR1包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；
HCDR2包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；
HCDR3包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；
LCDR1包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；
LDR2包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；并且
LCDR3包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；
其中对于集合(v)：
HCDR1包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；
HCDR2包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；
HCDR3包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；
LCDR1包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；
LDR2包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；并且
LCDR3包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；并且
其中对于集合(vi)
HCDR1包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；
HCDR2包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；
HCDR3包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；
LCDR1包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；
LDR2包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；并且
LCDR3包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的哺乳动物抗体或其抗原结合片段，其中哺乳动物IL-31RA抗体及其抗原结合片段结合犬IL-31RA并阻断犬IL-31RA与犬白介素-31的结合。
3.如权利要求1或权利要求2所述的哺乳动物抗体或其抗原结合片段，其中：
HCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
HCDR2包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；
HCDR3包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；
LCDR1包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；
LDR2包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；并且
LCDR3包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；或
HCDR1包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；
HCDR2包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；
HCDR3包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；
LCDR1包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；
LDR2包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；并且
LCDR3包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列。
4.如权利要求3所述的哺乳动物抗体或其抗原结合片段，当与犬IL-31RA结合时，所述抗体与选自以下的氨基酸序列所包含的表位结合：SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、SEQ IDNO:108及其任意组合。
5.如权利要求1或权利要求2所述的哺乳动物抗体或其抗原结合片段，其中
HCDR1包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
HCDR2包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；
HCDR3包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列；
LCDR1包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；
LDR2包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；并且
LCDR3包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；或者
HCDR1包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
HCDR2包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；
HCDR3包含氨基酸SEQ ID NO:26的氨基酸序列；
LCDR1包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；
LDR2包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；并且
LCDR3包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列。
6.如权利要求5所述的哺乳动物抗体或其抗原结合片段，当与犬IL-31RA结合时，所述抗体与选自以下的氨基酸序列所包含的表位结合：SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ IDNO:101及其任意组合。
7.如权利要求1或权利要求2所述的哺乳动物抗体或其抗原结合片段，其中
HCDR1包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；
HCDR2包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；
HCDR3包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；
LCDR1包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；
LDR2包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；并且
LCDR3包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列。
8.如权利要求7所述的哺乳动物抗体或其抗原结合片段，当与犬IL-31RA结合时，所述抗体与SEQ ID NO:109的氨基酸序列所包含的表位结合。
9.如权利要求1或权利要求2所述的哺乳动物抗体或其抗原结合片段，其中
HCDR1包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；
HCDR2包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；
HCDR3包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；
LCDR1包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；
LDR2包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；并且
LCDR3包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。
10.如权利要求9所述的哺乳动物抗体或其抗原结合片段，当与犬IL-31RA结合时，所述抗体与选自SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105以及SEQ ID NO:104和SEQ ID NO:105两者的氨基酸序列所包含的表位结合。
11.如权利要求1-10中任一项所述的哺乳动物抗体或其抗原结合片段，其中所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段是犬源化IL-31RA抗体或其犬源化抗原结合片段。
12.如权利要求11所述的犬源化抗体或其抗原结合片段，其包含铰链区，所述铰链区包含与选自SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114和SEQ ID NO：115的氨基酸含有至少90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。
13.如权利要求11或权利要求12所述的犬源化抗体或其抗原结合片段，其包含犬片段可结晶区(cFc)；其中所述cFc包含与选自SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：118的氨基酸序列含有至少90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
14.如权利要求11或权利要求12所述的犬源化抗体或其抗原结合片段，其包含犬片段可结晶区(cFc)；其中所述cFc包含与氨基酸序列SEQ ID NO：111含有至少90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO：110的位置31处的天冬氨酸残基(D)和SEQ ID NO：110的位置63处的天冬酰胺残基(N)两者均被丙氨酸残基(A)置换。
15.如权利要求9或10所述的哺乳动物抗体或其抗原结合片段，其中所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段是犬源化IL-31R抗体或其犬源化抗原结合片段，并且其中所述犬源化抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:96的氨基酸序列。
16.如权利要求15所述的犬源化抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:129和SEQ ID NO:130的氨基酸序列。
17.如权利要求15或16所述的犬源化抗体或其抗原结合片段，其包含轻链，所述轻链包含选自SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91和SEQ ID NO:92的氨基酸序列。
18.根据权利要求16或17所述的犬源化抗体或其抗原结合片段，其中
所述重链可变区包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列，或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列，或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列，
所述重链可变区包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列。
所述重链可变区包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列，或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列，或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列，或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列。
19.如权利要求15-18中任一项所述的犬源化抗体或其抗原结合片段，其包含铰链区，所述铰链区包含与选自SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:114和SEQ ID NO:115的氨基酸含有至少90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。
20.如权利要求15-19中任一项所述的犬源化抗体或其抗原结合片段，其包含犬片段结晶区(cFc)；其中所述cFc包含与选自SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:117和SEQID NO:118的氨基酸序列含有至少90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
21.如权利要求15-19中任一项所述的犬源化抗体或其抗原结合片段，其包含犬片段结晶区(cFc)；其中所述cFc包含与SEQ ID NO:111的氨基酸序列含有至少90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:110的位置31处的天冬氨酸残基(D)和SEQ ID NO:110的位置63处的天冬酰胺残基(N)两者均被丙氨酸残基(A)置换。
22.如权利要求1-21中任一项所述的犬源化抗体或其抗原结合片段，其中所述犬源化IL-31RA抗体包含含有选自SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91和SEQ ID NO:92的氨基酸序列的轻链；以及含有选自SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88和SEQ ID NO:89的氨基酸序列的重链。
23.如权利要求22所述的犬源化抗体或其抗原结合片段，其中
所述重链包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列且所述轻链包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列，或
所述重链包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列且所述轻链包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列，或
所述重链包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列且所述轻链包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列，或
所述重链包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列且所述轻链包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列。
24.如权利要求5或权利要求6所述的哺乳动物抗体或其抗原结合片段，其为犬源化IL-31RA抗体或其犬源化抗原结合片段，并且其中所述犬源化IL-31RA抗体包含重链，所述重链包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:75。
25.如24所述的犬源化抗体或其抗原结合片段，其中所述犬源化IL 31-RA抗体包含轻链，所述轻链包含选自SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78的氨基酸序列。
26.如权利要求25所述的犬源化抗体或其抗原结合片段，其中
所述重链包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列且所述轻链包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列，或
所述重链包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列且所述轻链包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列，或
所述重链包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列且所述轻链包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列，或
所述重链包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列且所述轻链包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列。
27.一种犬或犬源化抗体或其抗原结合片段，其与犬白介素-31受体α(犬IL-31RA)结合，并且当与犬IL-31RA结合时，所述抗体与选自以下的氨基酸序列所包含的表位结合：SEQID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、SEQ IDNO:108、SEQ ID NO:109或其任意组合；其中所述抗体与犬IL-31RA结合并阻断犬IL-31RA与犬IL-31的结合。
28.如权利要求27所述的犬或犬源化抗体或其抗原结合片段，当其与犬IL-31RA结合时，与选自SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105或其组合的氨基酸序列所包含的表位结合。
29.一种编码如权利要求11-28所述的犬源化抗体或其抗原结合片段的重链的核酸。
30.一种编码如权利要求11-28中任一项所述的犬源化抗体或其抗原结合片段的轻链的核酸。
31.核酸对，其中所述核酸对中的一个包含编码如权利要求11-28所述的抗体中的任一个的特异性犬源化抗体的重链的核苷酸序列，且所述核酸对中的另一个包含编码所述特异性犬源化抗体的轻链的核苷酸序列。
32.一种表达载体，其包含如权利要求31所述的核酸对或如权利要求29或权利要求30所述的核酸。
33.表达载体对，其中所述表达载体对中的一个包含含有编码如权利要求11-28所述的抗体中的任一个的特异性犬源化抗体的轻链的核苷酸序列的核酸，且所述表达载体对中的另一个包含含有编码所述特异性犬源化抗体的重链的核苷酸序列的核酸。
34.一种包含如权利要求32或权利要求33所述的表达载体的宿主细胞。
35.一种药物组合物，其包含如权利要求11-28中任一项所述的犬源化抗体或其抗原结合片段，和药学上可接受的载体或稀释剂。
36.一种帮助阻断犬科动物中与特应性皮炎相关的瘙痒的方法，其包括向有此需要的所述犬科动物施用治疗有效量的如权利要求35所述的药物组合物。
37.一种用于帮助阻断犬科动物中与特应性皮炎相关的瘙痒的药物组合物，其包含如权利要求11-28中任一项所述的犬源化抗体或其抗原结合片段，和药学上可接受的载体或稀释剂。
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