CN113024672B

CN113024672B - 一种抗Dig的抗体及其在测序中的应用

Info

Publication number: CN113024672B
Application number: CN201911348785.0A
Authority: CN
Inventors: 马旭妍; 王佑富; 李静; 张维; 曹琴; 郑越; 董宇亮; 章文蔚; 徐崇钧
Original assignee: BGI Shenzhen Co Ltd
Current assignee: BGI Shenzhen Co Ltd
Priority date: 2019-12-24
Filing date: 2019-12-24
Publication date: 2022-05-31
Anticipated expiration: 2039-12-24
Also published as: CN113024672A

Abstract

本发明公开了一种抗Dig的抗体及其在测序中的应用，本发明的抗体包括选自SEQ ID NO:1‑4的重链可变区氨基酸序列和选自SEQ ID NO:9‑12的轻链可变区氨基酸序列。本发明的单克隆抗体能够特异性识别Dig抗原，将其与多个荧光素酶Nluc经化学偶联制备的Nluc‑Ab‑Dig能够特异性识别Dig‑dNTP上的Dig分子，当加入Nluc底物后，通过捕获Nluc的荧光信号来完成测序。本发明的单克隆抗体能够用作测序仪的重要测序酶原材料。本发明首次采用荧光素酶Nluc化学偶联标记Anti‑Dig，可提高测序结果的特异性和灵敏度，并首次将其用于测序仪的测序试剂盒。

Description

一种抗Dig的抗体及其在测序中的应用

技术领域

本发明涉及测序技术领域，尤其涉及一种抗Dig的抗体及其在测序中的应用。

背景技术

核酸探针是指带有标记物的已知序列的核酸片段，它能和与其互补的核酸序列杂交，形成双链，所以核酸探针可用于待测核酸样品中特定基因序列的检测。每一种病原体都具有独特的核酸片段，通过分离和标记这些片段就可制备探针，可用于疾病的诊断等研究。

核酸探针按标记物划分有放射性标记探针和非放射性标记探针两大类。放射性标记探针是用放射性同位素作为标记物，是最早使用，也是目前应用最广泛的探针标记物，常用的同位素有32P、3H、35S。其优点是灵敏度高，可以检测到Pg级；缺点是易造成放射性污染，同位素半衰期短、不稳定、成本高等。因此，放射性标记的探针不能实现商品化。目前，许多实验室都致力于发展非放射性标记的探针。目前应用较多的非放射性标记物是生物素(Biotin)和地高辛(digoxigenin，Dig)，二者都是半抗原。非放射性标记法可将生物素、地高辛连接在dNTP上，然后像放射性标记一样用酶促聚合法掺入到核酸链中制备标记探针。也可让生物素、地高辛等直接与核酸进行化学反应而连接上核酸链。

生物素是一种小分子水溶性维生素，对亲和素有独特的亲和力，两者能形成稳定的复合物，通过连接在亲和素或抗生物素蛋白上的显色物质(如酶、荧光素等)进行检测。地高辛是一种从洋地黄类植物中提取的类固醇半抗体物质，在医学上可用于治疗各种急性和慢性心功能不全以及室上性心动过速、心房颤动和扑动等疾病。利用其抗体进行免疫检测，原理类似于生物素的检测。但由于洋地黄植物的花和叶片是地高辛在自然界中的唯一来源，因此抗地高辛的抗体不会与其他的生物物质结合，从而可以满足特异性标记的需要。这一点，正是地高辛胜于生物素的地方——同样是小分子标记物，生物素广泛存在于各种组织中，对于灵敏度很高的标记检测实验来说，样品自身含有的内源生物素，就会对结果产生干扰。地高辛就能够很好地避免这个问题。可地高辛标记核酸探针的检测灵敏度可与放射性同位素标记的相当，而特异性优于生物素标记，其应用日趋广泛。

1967年通过免疫动物首次成功制备抗地高辛抗体以来，已相继制成了地高辛特异的血清多克隆抗体、杂交瘤单克隆抗体等。目前市场上相关的产品主要包括抗地高辛多克隆、单克隆抗体及各种标记的抗体，如HRP-Anti-Dig，FITC-Anti-Dig等。广泛应用于抗原决定簇的抗原性分析鉴定，各种抗原、抗体的定量、定向及定位分析测定等。

免疫标记技术是将一些既易测定又具有高度敏感性的物质标记到特异性抗原或抗体分子上，通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的性质与含量。由于抗体与其相应抗原具有很高的亲和力，抗体标记主要用于对抗原的定位分析，在某些情况下，也可以对混杂有大量其他分子的样本中的抗原进行定量检测，是一种理想的快速价廉的定量测定方法。根据标记物的不同，抗体标记一般可以分为：荧光色素标记、生物素标记、酶标记三种。

其中酶标记抗体是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成，其应用范围非常广泛，结果即时可见、敏感性高。与辣根过氧化物酶HRP和碱性磷酸酶相比，荧光素酶分子量更小，且与底物的结合特异性很强，检出的灵敏度高，具有在哺乳动物组织中内源性的酶活性很低等优势。另外和荧光标记相比，荧光素酶标记的抗体不存在激发光的非特异性干扰，因此信噪比较高，具有较高的灵敏度。但目前只有在相关文献中查到将Nluc与IgG进行融合表达，并没有将抗体与Nluc进行化学偶联的方法报道。

常规的标记技术存在如下缺点：常规的荧光(如FITC)标记抗体存在激发光的非特异性干扰，信噪比不高。常规的酶(如HRP)标记抗体，酶分子量通常较大，检测灵敏度有待进一步提高。

发明内容

本发明提供一种抗Dig的抗体及其在测序中的应用，该抗体能够特异性识别Dig抗原，将其与多个荧光素酶Nluc经化学偶联制备的融合蛋白(Nluc-Ab-Dig)能够特异性识别Dig-dNTP上的Dig分子，当加入Nluc底物后，通过捕获Nluc的荧光信号来完成测序。

根据本发明的第一方面，本发明提供一种抗Dig的抗体，该抗体包括重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列，它们选自如下(a)至(d)中的一项：

(a)重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO:9所示；

(b)重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO:10所示；

(c)重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO:11所示；

(d)重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO:12所示。

根据本发明的第二方面，本发明提供一种核酸序列，该核酸序列按照密码子表编码第一方面中抗Dig的抗体的重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列。

在优选实施例中，上述核酸序列包括重链可变区编码序列和轻链可变区编码序列，它们选自如下(a)至(d)中的一项：

(a)重链可变区编码序列如SEQ ID NO:5所示，轻链可变区编码序列如SEQ ID NO:13所示；

(b)重链可变区编码序列如SEQ ID NO:6所示，轻链可变区编码序列如SEQ ID NO:14所示；

(c)重链可变区编码序列如SEQ ID NO:7所示，轻链可变区编码序列如SEQ ID NO:15所示；

(d)重链可变区编码序列如SEQ ID NO:8所示，轻链可变区编码序列如SEQ ID NO:16所示。

根据本发明的第三方面，本发明提供一种重组载体质粒，该重组载体质粒上连接有第二方面的核酸序列。

根据本发明的第四方面，本发明提供一种表达抗Dig的抗体的细胞，该细胞内包含第二方面的核酸序列，或第三方面的重组载体质粒。

根据本发明的第五方面，本发明提供一种融合蛋白，该融合蛋白包含第一方面的抗Dig的抗体，以及与其化学偶联的功能蛋白。

在优选实施例中，上述融合蛋白由上述抗Dig的抗体与荧光催化酶通过化学偶联形成。

在优选实施例中，上述荧光催化酶是荧光素酶Nluc。

根据本发明的第六方面，本发明提供一种第五方面的融合蛋白在测序中的应用。

在优选实施例中，上述融合蛋白是荧光素酶Nluc与上述抗Dig的抗体通过化学偶联形成的Nluc-Ab-Dig。

本发明的单克隆抗体能够特异性识别Dig抗原，将其与多个荧光素酶Nluc经化学偶联制备的Nluc-Ab-Dig能够特异性识别Dig-dNTP上的Dig分子，当加入Nluc底物后，通过捕获Nluc的荧光信号来完成测序。本发明的单克隆抗体能够用作测序仪的重要测序酶原材料。本发明首次采用荧光素酶Nluc化学偶联标记Anti-Dig，可提高测序结果的特异性和灵敏度，并首次将其用于测序仪的测序试剂盒。

附图说明

图1为本发明实施例中抗Dig的单克隆抗体的制备及应用工艺流程图。

图2为本发明实施例中杂交瘤亚克隆细胞上清ELISA筛选阳性检测结果图，示出了ELISA筛选出的阳性亚克隆株(图中编号1-10)的ELISA检测OD450数值。

图3为本发明实施例中对杂交瘤细胞上清纯化获得的单克隆抗体电泳鉴定结果图，其中泳道M：marker；非还原电泳：泳道1：单克隆抗体A4；泳道2：单克隆抗体E5；泳道3：单克隆抗体H8；泳道4：单克隆抗体H10；还原电泳：泳道5：单克隆抗体A4；泳道6：单克隆抗体E5；泳道7：单克隆抗体H8；泳道8：单克隆抗体H10。

图4为本发明实施例中ELISA实验鉴定单克隆抗体的效价结果图。

图5为本发明实施例中单克隆抗体与Nluc偶联制备Nluc-Ab-Dig的电泳鉴定结果图。

图6为本发明实施例中单克隆抗体与Nluc偶联制备Nluc-Ab-Dig的酶活鉴定结果图。

图7为本发明实施例中单克隆抗体与Nluc偶联制备的Nluc-Ab-Dig的上机结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本发明能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他材料、方法所替代。

另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。

本发明的目的在于提供一种抗Dig的单克隆抗体及其在测序仪上的应用。本发明首次将得到的单克隆抗体与荧光素酶Nluc进行化学偶联制备Nluc-Ab-Dig，本发明的单克隆抗体可以特异性识别抗原Dig，即Nluc-Ab-Dig与联有Dig的dNTP作用后，加入底物，通过捕获Nluc的荧光信号，即可准确完成测序。本发明首次用于测序仪的测序试剂，为小型测序仪的测序试剂盒提供了一种重要原材料。

如图1所示，本发明通过将Dig分子作为抗原免疫小鼠，取小鼠脾脏与骨髓瘤融合后，获得杂交瘤细胞，经过活性筛选获得四株能够分泌表达特异性识别Dig分子的单克隆抗体A4、E5、H8和H10杂交瘤细胞株。接着对筛选到具有较好亲和活性的四株单克隆抗体杂交瘤细胞提取RNA，通过逆转录获得杂交瘤细胞的cDNA库。根据已知的鼠源抗体重轻链恒定区设计兼并引物，利用设计的引物对cDNA进行PCR获得单克隆抗体重链及轻链可变区序列。再将可变区序列通过克隆进入T载体，导入大肠杆菌DH5α中进行扩增，挑选单克隆，最后对挑选的单克隆扩大培养，提取重组载体质粒并对其进行测序，进而获得抗体重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:1-4)和核酸序列(SEQ ID NO:5-8)及轻链可变区氨基酸序列(SEQ IDNO:9-12)和核酸序列(SEQ ID NO:13-16)。利用亲和柱一步纯化法对收集的杂交瘤细胞上清进行纯化获得电泳纯的单克隆抗体Anti-Dig-A4、Anti-Dig-E5、Anti-Dig-H8和Anti-Dig-H10。通过检测单克隆抗体与Dig分子的亲和活性，表明该单克隆抗体能够特异性识别Dig分子。然后首次将其与荧光素酶Nluc进行化学偶联制备Nluc-Ab-Dig，且首次为测序仪的测序试剂提供重要原材料。可将其开发为小型测序仪的测序酶产品。

特别值得一提的，目前在相关文献中只有将荧光素酶Nluc与IgG进行融合表达，而并没有将抗体与Nluc进行化学偶联的方法报道。本发明首次采用荧光素酶Nluc化学偶联标记Anti-Dig，提高检测的灵敏度，并首次将其用于测序仪的测序试剂盒。

基于本发明的发现，本发明的一个实施例提供一种抗Dig的抗体，该抗体包括重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列，它们选自如下(a)至(d)中的一项：

需要说明的是，本发明只限定了抗体的重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列，并未限定重链和轻链的恒定区部分的氨基酸序列，是因为各种抗体的恒定区部分相对恒定，缺少变化，并且抗体的抗原特异性由可变区决定，因此本发明中抗体的恒定区部分与现有抗体相同。此外，本发明的抗体在存在形式上，除了可以是包含重链和轻链的可变区和恒定区的完整抗体，还可以将抗体序列改造为不同的形式，例如单链抗体(scFv)、双特异性抗体、融合蛋白、Fab抗体等。

本发明的一个实施例提供一种核酸序列，该核酸序列按照密码子表编码本发明的抗Dig的抗体的重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列。

需要说明的是，由于密码子的简并性，编码本发明的抗体重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的核酸序列并不唯一，任何能够编码本发明的抗体的核酸序列，均是本发明要求保护的核酸序列。

在一个优选的实施例中，本发明的核酸序列包括重链可变区编码序列和轻链可变区编码序列，它们选自如下(a)至(d)中的一项：

本发明的一个实施例提供一种重组载体质粒，该重组载体质粒上连接有本发明的核酸序列，该核酸序列能够在细胞内表达出本发明的抗Dig的抗体的重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列，形成功能性抗体。本发明对重组载体质粒除了限定具有本发明的核酸序列以外，没有其他限定，例如，载体质粒骨架可以是各种适合在真核细胞或原核细胞内表达的载体。

本发明的一个实施例提供一种表达抗Dig的抗体的细胞，该细胞内包含本发明的核酸序列，或本发明的重组载体质粒。本发明的细胞内由于含有能够表达抗Dig的抗体的重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的核酸序列，能够在宿主细胞内表达出功能抗体。本发明对宿主细胞种类没有特别限定，只要适合本发明的核酸序列或重组载体质粒在其内表达即可。

本发明的一个实施例提供一种融合蛋白，该融合蛋白包含本发明的抗Dig的抗体，以及与其化学偶联的功能蛋白。其中，功能蛋白可以按照具体需要选择，例如具有酶促功能的蛋白，特别是荧光催化酶，即能够催化荧光底物发光的酶。在本发明的一个实施例中，荧光催化酶是荧光素酶Nluc，即本发明的融合蛋白是本发明的抗Dig的抗体与荧光素酶Nluc进行化学偶联制备的Nluc-Ab-Dig。

本发明的一个实施例提供一种本发明的融合蛋白在测序中的应用，特别是，荧光素酶Nluc与本发明的抗Dig的抗体通过化学偶联形成Nluc-Ab-Dig，用于测序仪上。具体而言，在测序中使用Dig标记的dNTP，当其加入新合成的核酸链中，同时加入Nluc-Ab-Dig，抗Dig的抗体(Ab-Dig)特异性识别Dig分子，加入发光底物在荧光素酶Nluc的催化下发出荧光信号，捕捉荧光信号即可完成测序。

以下通过实施例详细说明本发明的技术方案和效果，应当理解，实施例仅是示例性的，不能理解为对本发明的限制。

实施例1杂交瘤亚克隆筛选

将Dig抗原进行小鼠免疫后取出效价高的小鼠脾细胞，与骨髓瘤细胞进行细胞融合，得到杂交瘤母克隆。然后将杂交瘤母克隆细胞培养后，收取细胞上清。细胞上清进行ELISA鉴定，得到上清中抗体的阳性值。经筛选获得阳性细胞株，继续进行第二轮有限稀释法亚克隆。最后再进行ELISA鉴定筛选阳性细胞株，结果如图2所示。

ELISA筛选步骤如下：

(1)将抗原100μL BSA-Dig浓度1μg/ml过夜包被于酶条上。加200μL PBST震荡洗涤10min 3次，PBS震荡洗涤3次。

(2)加入1％BSA-PBS 200μL，37℃封闭2h。加PBST 200μL震荡洗涤3×10min，PBS200μL震荡洗涤3×10min。

(3)加入稀释后上清100μL，37℃孵育2h。加PBST 200μL震荡洗涤3×10min，PBS200μL震荡洗涤3×10min。

(4)加入稀释的商品辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠抗体100μL，37℃孵育1h。加PBST 200μL震荡洗涤3×10min，PBS 200μL震荡洗涤3×10min。

(5)使用四甲基联苯胺微孔过氧化物酶底物(TMB)作为底物进行显色10min。

(6)加入50μL浓度为0.1mol/L的硫酸终止反应后，测量其在450nm的吸光度。

实施例2单克隆抗体的制备及其纯度和效价鉴定

将第二轮亚克隆后得到的杂交瘤细胞扩大培养，经10000rpm×5min离心，收集其细胞上清。将收集的细胞上清经0.22μm滤膜过滤后用Protein A柱进行纯化，使用洗脱液进行洗脱后获得纯化的单克隆抗体。对纯化得到的单克隆抗体进行ELISA鉴定其效价值。筛选获得四株阳性细胞株A4、E5、H8和H10。

将对四株杂交瘤细胞上清纯化得到的抗体各取5μg做蛋白电泳纯度鉴定，结果如图3所示。

ELISA实验鉴定优选的4株单克隆抗体的效价，步骤如下：

(3)将抗体按不同浓度进行稀释后，加入100μL，37℃孵育2h。加PBST200μL震荡洗涤3×10min，PBS 200μL震荡洗涤3×10min。

ELISA实验鉴定优选的4株单克隆抗体的效价结果如图4所示。

实施例3单克隆抗体序列的获得

对筛选到具有较好亲和活性的四株单克隆抗体杂交瘤细胞提取RNA，通过逆转录得到杂交瘤细胞的cDNA库。接着根据已知的鼠源抗体重轻链恒定区设计兼并引物，利用设计的引物对cDNA进行PCR得到单克隆抗体重链及轻链可变区序列。然后将可变区序列通过克隆进入T载体，导入大肠杆菌DH5α中进行扩增，挑选单克隆。最后对挑选的单克隆扩大培养，提取重组载体质粒并对其进行测序，进而获得抗体重轻链可变区序列。

四株单克隆抗体Anti-Dig-A4、Anti-Dig-E5、Anti-Dig-H8和Anti-Dig-H10的重链可变区氨基酸序列分别是SEQ ID NO:1-4，它们的核酸序列分别是SEQ ID NO:5-8，轻链可变区氨基酸序列分别是SEQ ID NO:9-12，它们的核酸序列分别是SEQ ID NO:13-16。

SEQ ID NO:1

LQQSGTVLPRPGASVKMSCKASDYTFTTYWMHWIKQRPGQGLEWIGAIYPGNSDTTYNQKFKDKAKLTAVTSASTAYMELSTLTNEDSAVYYCTRSLLGQDYAMDYWGQGTSVTVS

SEQ ID NO:2

LQQSGTVLPRPGASVKMSCKASDYTFTTYWMHWIKQRPGQGLEWIGAIYPGNSDTTYNQKFKGKAKLTAVTSASTAYMELSSLTNEDSAVYYCTRSLLGQDYAMDYWGQGTSVTVS

SEQ ID NO:3

GVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDDKRYNPALKSRLTISKETSSNQVFLKIASVDTADTATYYCARSYYGNYGAMDYWGQGT

SEQ ID NO:4

YLVLNPVTDDDSAGDYCTRSLLRQNSAMNYWLQGTALTVS

SEQ ID NO:5

gctgcagcagtctgggactgtactgccaaggcctggggcttcagtgaagatgtcctgcaaggcttctgactacacctttaccacctactggatgcactggataaaacagaggcctggacagggtctggaatggattggcgctatttatcctggaaatagtgatactacctacaaccagaagttcaagggcaaggccaaactgactgcagtcacatctgccagcactgcctacatggagctcagcagcctgacaaatgaggactctgcggtctattactgtacaagatccctactgggacaggactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcct

SEQ ID NO:6

gaggagacggtgactgaggttccttgaccccagtagtccatagcatagtcctgtcccagtagggatcttgtacagtaatagaccgcagagtcctcatttgtcaggctgctgagctccatgtaggcagtgctggcagatgtgactgcagtcagtttggccttgcccttgaacttctggttgtaggtagtatcactatttccaggataaatagcgccaatccattccagaccctgtccaggcctctgttttatccagtgcatccagtaggtggtaaaggtgtagtcagaagccttgcaggacatcttcactgaagccccaggccttggcagtacagtcccagactgctgcagc

SEQ ID NO:7

GGGTGTAGGGTGGATTCGTCAGCCTTCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTGGTGGGATGATGACAAGCGCTATAACCCAGCCCTGAAGAGCCGACTGACAATCTCCAAGGAAACCTCCAGCAACCAGGTATTCCTCAAGATCGCCAGTGTGGACACTGCAGATACTGCCACATACTACTGTGCTCGAAGCTACTATGGTAACTACGGGGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCT

SEQ ID NO:8

TACTTGGTTCTCAACCCTGTGACGGACGATGACTCTGCCGGCGATTACTGTACGAGATCCCTACTGAGACAGAACTCTGCTATGAACTACTGGCTGCAAGGAACCGCCTTGACCGTCTCCT

SEQ ID NO:9

IVLTHSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSEGG

SEQ ID NO:10

IVMTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSEGG

SEQ ID NO:11

IQLTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSEGG

SEQ ID NO:12

IVLTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVNTAVAWCQQKPGQSPKPLIYWASTRHTGVPDRLTGSGSGTDYTLTISSVQAEDVALYYCQQNYGTP

SEQ ID NO:13

ggtcccccctccgaacgtgtaagctccctaatgtgctgacagtaataggttgcagcatcctcctcctccacaggatggatgttgagggtgaagtctgtcccagacccactgccactgaacctggcagggaccccagattctaggttggatacaagatagatgaggagtctgggtggctgtcctggtttctgttggttccagtgcatataactatagccagatgtactgacacttttgctggccctgtatgagatggtggccctctgccccagagatacagctaaggaagcaggagagtgggtcagcacaatgt

SEQ ID NO:14

attgtgatgacccagtctcctgcttccttagctgtatctctggggcagagggccaccatctcatacagggccagcaaaagtgtcagtacatctggctatagctatatgcactggaaccaacagaaaccaggacagccacccagactcctcatctatcttgtatccaacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcagcacattagggagcttacacgttcggaggggggacc

SEQ ID NO:15

atccagctgactcagtctcctgcttccttagctgtatctctggggcagagggccaccatctcatacagggccagcaaaagtgtcagtacatctggctatagttatatgcactggaaccaacagaaaccaggacagccacccagactcctcatctatcttgtatccaacctagaatctagggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcagcacattagggagcttacacgttcggaggggggacc

SEQ ID NO:16

tgaggagtgccataattttgctgacagtaataaagtgccacgtcttcagcctgcacgctgctgatggtgagagtataatctgtcccagatccactgcctgtgaggcgatcagggactccagtgtgccgggtggatgcccagtaaatcagaggtttaggagattgccctggtttttgttgacaccaggctacagcagtattcacatcctgactggccttgcaggtgatgctgaccctgtctcctactgatgtggacatgaatttgtgagattgggtcagcacaatgt

实施例4单克隆抗体在制备Nluc-Ab-Dig中的应用

(1)化学偶联制备Nluc-Ab-Dig：

(a)首先将Nluc和sulfo-SMCC孵育，利用Nluc的游离氨基与sulfo-SMCC反应形成稳定的酰胺键，制备Nluc-SMCC；

(b)同时将Ab-Dig经TCEP还原，暴露出抗体的SH-；

(c)然后将步骤(a)和(b)的产物混合孵育，通过抗体暴露的SH-和SMCC的马来酰亚胺基团共价交联，形成Nluc-Ab-Dig；

(d)最后经Ni柱纯化，除去未反应的Ab-Dig，得到纯化的Nluc-Ab-Dig。

(2)Nluc-Ab-Dig偶联过程的鉴定：

(a)将偶联过程中的各步产物各取5μg做蛋白电泳鉴定，结果如图5所示。

(b)将偶联过程中的各步产物做活性鉴定。

分别测定反应过程中Nluc、Nluc-SMCC、Nluc-Ab-Dig的浓度，将其稀释至1μg/ml分别测其酶活性。检测条件为10μL酶稀释液(浓度1μg/ml)+90μL底物，酶活鉴定结果如图6所示。

实施例5Nluc-Ab-Dig在小型测序仪上的测序应用

将偶联制备的Nluc-Ab-Dig作为小型测序仪的一个测序酶在PC机上进行上机测试，并与商品化的Dig抗体和Nluc进行偶联制备的Nluc-Ab-Dig进行比较，结果如图7所示，效果无明显差异。

以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳华大生命科学研究院

<120> 19I29369

<130> 一种抗Dig的抗体及其在测序中的应用

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 116

<212> PRT

<213> 抗体序列

<400> 1

Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Pro Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys

1 5 10 15

Met Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Trp Met His

20 25 30

Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile

35 40 45

Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys

50 55 60

Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu

65 70 75 80

Ser Thr Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Ser

85 90 95

Leu Leu Gly Gln Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

100 105 110

Val Thr Val Ser

115

<210> 2

<211> 116

<212> PRT

<213> 抗体序列

<400> 2

Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Pro Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys

1 5 10 15

Met Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Trp Met His

20 25 30

Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile

35 40 45

Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys

50 55 60

Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu

65 70 75 80

Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Ser

85 90 95

Leu Leu Gly Gln Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

100 105 110

Val Thr Val Ser

115

<210> 3

<211> 81

<212> PRT

<213> 抗体序列

<400> 3

Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

1 5 10 15

Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ala Leu Lys

20 25 30

Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Glu Thr Ser Ser Asn Gln Val Phe Leu

35 40 45

Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala

50 55 60

Arg Ser Tyr Tyr Gly Asn Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

65 70 75 80

Thr

<210> 4

<211> 40

<212> PRT

<213> 抗体序列

<400> 4

Tyr Leu Val Leu Asn Pro Val Thr Asp Asp Asp Ser Ala Gly Asp Tyr

1 5 10 15

Cys Thr Arg Ser Leu Leu Arg Gln Asn Ser Ala Met Asn Tyr Trp Leu

20 25 30

Gln Gly Thr Ala Leu Thr Val Ser

35 40

<210> 5

<211> 350

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gctgcagcag tctgggactg tactgccaag gcctggggct tcagtgaaga tgtcctgcaa 60

ggcttctgac tacaccttta ccacctactg gatgcactgg ataaaacaga ggcctggaca 120

gggtctggaa tggattggcg ctatttatcc tggaaatagt gatactacct acaaccagaa 180

gttcaagggc aaggccaaac tgactgcagt cacatctgcc agcactgcct acatggagct 240

cagcagcctg acaaatgagg actctgcggt ctattactgt acaagatccc tactgggaca 300

ggactatgct atggactact ggggtcaagg aacctcagtc accgtctcct 350

<210> 6

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gaggagacgg tgactgaggt tccttgaccc cagtagtcca tagcatagtc ctgtcccagt 60

agggatcttg tacagtaata gaccgcagag tcctcatttg tcaggctgct gagctccatg 120

taggcagtgc tggcagatgt gactgcagtc agtttggcct tgcccttgaa cttctggttg 180

taggtagtat cactatttcc aggataaata gcgccaatcc attccagacc ctgtccaggc 240

ctctgtttta tccagtgcat ccagtaggtg gtaaaggtgt agtcagaagc cttgcaggac 300

atcttcactg aagccccagg ccttggcagt acagtcccag actgctgcag c 351

<210> 7

<211> 245

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gggtgtaggg tggattcgtc agccttcagg gaagggtctg gagtggctgg cacacatttg 60

gtgggatgat gacaagcgct ataacccagc cctgaagagc cgactgacaa tctccaagga 120

aacctccagc aaccaggtat tcctcaagat cgccagtgtg gacactgcag atactgccac 180

atactactgt gctcgaagct actatggtaa ctacggggct atggactact ggggtcaagg 240

aacct 245

<210> 8

<211> 121

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tacttggttc tcaaccctgt gacggacgat gactctgccg gcgattactg tacgagatcc 60

ctactgagac agaactctgc tatgaactac tggctgcaag gaaccgcctt gaccgtctcc 120

t 121

<210> 9

<211> 103

<212> PRT

<213> 抗体序列

<400> 9

Ile Val Leu Thr His Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln

1 5 10 15

Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly

20 25 30

Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg

35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg

50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro

65 70 75 80

Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg Glu

85 90 95

Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly

100

<210> 10

<211> 103

<212> PRT

<213> 抗体序列

<400> 10

Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln

1 5 10 15

Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly

20 25 30

Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg

35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg

50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro

65 70 75 80

Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg Glu

85 90 95

Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly

100

<210> 11

<211> 103

<212> PRT

<213> 抗体序列

<400> 11

Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln

1 5 10 15

Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly

20 25 30

Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg

35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg

50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro

65 70 75 80

Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg Glu

85 90 95

Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly

100

<210> 12

<211> 94

<212> PRT

<213> 抗体序列

<400> 12

Ile Val Leu Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp

1 5 10 15

Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val

20 25 30

Ala Trp Cys Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr

35 40 45

Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Leu Thr Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu

65 70 75 80

Asp Val Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr Gly Thr Pro

85 90

<210> 13

<211> 313

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ggtcccccct ccgaacgtgt aagctcccta atgtgctgac agtaataggt tgcagcatcc 60

tcctcctcca caggatggat gttgagggtg aagtctgtcc cagacccact gccactgaac 120

ctggcaggga ccccagattc taggttggat acaagataga tgaggagtct gggtggctgt 180

cctggtttct gttggttcca gtgcatataa ctatagccag atgtactgac acttttgctg 240

gccctgtatg agatggtggc cctctgcccc agagatacag ctaaggaagc aggagagtgg 300

gtcagcacaa tgt 313

<210> 14

<211> 311

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

attgtgatga cccagtctcc tgcttcctta gctgtatctc tggggcagag ggccaccatc 60

tcatacaggg ccagcaaaag tgtcagtaca tctggctata gctatatgca ctggaaccaa 120

cagaaaccag gacagccacc cagactcctc atctatcttg tatccaacct agaatctggg 180

gtccctgcca ggttcagtgg cagtgggtct gggacagact tcaccctcaa catccatcct 240

gtggaggagg aggatgctgc aacctattac tgtcagcaca ttagggagct tacacgttcg 300

gaggggggac c 311

<210> 15

<211> 311

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

atccagctga ctcagtctcc tgcttcctta gctgtatctc tggggcagag ggccaccatc 60

tcatacaggg ccagcaaaag tgtcagtaca tctggctata gttatatgca ctggaaccaa 120

cagaaaccag gacagccacc cagactcctc atctatcttg tatccaacct agaatctagg 180

gtccctgcca ggttcagtgg cagtgggtct gggacagact tcaccctcaa catccatcct 240

gtggaggagg aggatgctgc aacctattac tgtcagcaca ttagggagct tacacgttcg 300

gaggggggac c 311

<210> 16

<211> 286

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tgaggagtgc cataattttg ctgacagtaa taaagtgcca cgtcttcagc ctgcacgctg 60

ctgatggtga gagtataatc tgtcccagat ccactgcctg tgaggcgatc agggactcca 120

gtgtgccggg tggatgccca gtaaatcaga ggtttaggag attgccctgg tttttgttga 180

caccaggcta cagcagtatt cacatcctga ctggccttgc aggtgatgct gaccctgtct 240

cctactgatg tggacatgaa tttgtgagat tgggtcagca caatgt 286

Claims

1.一种抗Dig的抗体，其特征在于，所述抗体包括重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列，它们选自如下（a）至（d）中的一项：

（a）重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；

（b）重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；

（c）重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；

（d）重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。

2.一种核酸，其特征在于，所述核酸按照密码子表编码权利要求1中抗Dig的抗体的重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列。

3.根据权利要求2所述的核酸，其特征在于，所述核酸包括重链可变区编码序列和轻链可变区编码序列，它们选自如下（a）至（d）中的一项：

（a）重链可变区编码序列如SEQ ID NO:5所示，轻链可变区编码序列如SEQ ID NO:13所示；

（b）重链可变区编码序列如SEQ ID NO:6所示，轻链可变区编码序列如SEQ ID NO:14所示；

（c）重链可变区编码序列如SEQ ID NO:7所示，轻链可变区编码序列如SEQ ID NO:15所示；

（d）重链可变区编码序列如SEQ ID NO:8所示，轻链可变区编码序列如SEQ ID NO:16所示。

4.一种重组载体质粒，其特征在于，所述重组载体质粒上连接有权利要求2或3所述的核酸。

5.一种表达抗Dig的抗体的细胞，其特征在于，所述细胞内包含权利要求2或3所述的核酸，或权利要求4所述的重组载体质粒。

6.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含权利要求1所述的抗Dig的抗体，以及与其化学偶联的功能蛋白。

7.根据权利要求6所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由所述抗Dig的抗体与荧光催化酶通过化学偶联形成。

8.根据权利要求7所述的融合蛋白，其特征在于，所述荧光催化酶是荧光素酶Nluc。

9.根据权利要求6-8任一项所述的融合蛋白在测序中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述融合蛋白是荧光素酶Nluc与所述抗Dig的抗体通过化学偶联形成的Nluc-Ab-Dig。