CN117567636A - 抗乙基葡萄糖醛酸单克隆抗体及其应用和产品 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种抗乙基葡萄糖醛酸单克隆抗体及其应用和产品，涉及生物技术领域。本发明提供的抗乙基葡萄糖醛酸单克隆抗体，其可变区包括：具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的互补决定区CDR1‑VH、具有如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的互补决定区CDR2‑VH、具有如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的互补决定区CDR3‑VH、具有如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的互补决定区CDR1‑VL、具有如SEQ ID NO.10所示氨基酸序列的互补决定区CDR2‑VL和具有如SEQ ID NO.5所示氨基酸序列的互补决定区CDR3‑VL。该抗体对乙基葡萄糖醛酸具有良好的特异性结合能力。

Description

抗乙基葡萄糖醛酸单克隆抗体及其应用和产品
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种抗乙基葡萄糖醛酸单克隆抗体及其应用和产品。
背景技术
乙基葡萄糖醛酸(Ethylβ-D-Glucuronide，ETG)是乙醇的一种代谢产物，在接触乙醇(例如饮用酒精饮料)后通过乙醇与肝脏中葡萄糖醛酸的酶促结合形成的乙醇的直接代谢物。该II期反应由线粒体膜结合的UDP-葡萄糖醛酸基转移酶催化，是近期酒精摄入量的最新生物标志物之一。可以收集在几种体液，组织和头发中。ETG最常在尿液中作为酒精摄入的标志物进行测量，但也可以在全血和血清中测量。它的尿液分泌约占摄入乙醇剂量的0.02-0.06％。它比所有其他已知的乙醇标志物具有更高的特异性和敏感性，并且仅在酒精摄入后检测到，在血液中长达36小时，在尿液中长达5天。被用作生物标志物来测试乙醇使用情况并在饮酒的情况下监测酒精戒断禁止，例如在专业监测项目、学校、肝移植或正在康复的酒精患者。ETG分子式是C8H14O7，分子量为222.19，外观为白色至灰白色结晶性固体，熔点160-161℃。
ETG已被证明是一种稳定的标志物。研究表明，在4℃下储存五周的尿液样本发现ETG浓度没有变化。当在室温下储存在通风小瓶中时，由于水蒸发，ETG浓度增加。尽管ETG在尿液中表现出稳定性，但有研究报道，尿液的细菌污染都可能引起假阳性和假阴性结果，细菌污染后葡糖苷酸和硫酸盐偶联物分别被β-葡糖醛酸酶和硫酸酶裂解。当样品感染大肠杆菌和梭状芽胞杆菌时，ETG对细菌水解敏感。由于大肠杆菌是尿路感染中最常见的病原体，因此存在ETG结果假阳性的风险。
目前，ETG可以通过传统的实验室方法在尿液中测量(GC/MS或LC/MS)。ETG的LC-MS检测可以使用对母离子(m/z 221)和主子离子(m/z75)进行选定的离子监测。五倍代氘代ETG(ETG-D5，m/z 226)用作内标，使用了过渡m/z 221→85。大多数LC-MS方法对ETG的定量限为50–100μg/L，用水和内标离心和稀释后，无需提取即可直接进样尿液。血清样品可在用甲醇或乙腈脱蛋白、离心并将上清液加入流动相等分试样后进行分析。但该方法仪器昂贵，检测费时，需要将样品送至实验室由专业技术人员操作仪器进行检测，单个仪器的成本超过250000美元。其他方法包括带脉冲电化学检测的反相液相色谱，微波辅助萃取后气相色谱-质谱联用(GC-MS)，用于汗液样品的固相萃取的GC-MS45和硅烷化衍生物的GC-MS，毛细管电泳，毛细管区带电泳-质谱，毛细管等速电泳和区带电泳以及基于多克隆抗体的酶联免疫吸附测定。这些技术灵敏度和准确率高，但不能达到现代检测对快速、准确的要求。因此建立快速、灵敏、准确的检测技术是很有必要的。
为了解决现场大规模应用的问题，免疫学法由于其检测速度快，成本低，通量高，部分免疫学检测方法(胶体金纸层析法)还具有操作简单，不需要额外设备等优点，倍受重视。因此，开发出优良的ETG诊断用的抗体成为了决定免疫学法应用前景的关键。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种抗乙基葡萄糖醛酸单克隆抗体，以解决上述问题中的至少一种。
本发明的第二目的在于提供生物材料。
本发明的第三目的在于提供上述抗乙基葡萄糖醛酸单克隆抗体在非诊断和治疗目的的乙基葡萄糖醛酸检测中的应用。
本发明的第四目的在于提供一种乙基葡萄糖醛酸标记物。
本发明的第五目的在于提供一种用于乙基葡萄糖醛酸检测的试剂盒。
第一方面，本发明提供了一种抗乙基葡萄糖醛酸单克隆抗体，所述抗乙基葡萄糖醛酸单克隆抗体的可变区包括：具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的互补决定区CDR1-VH、具有如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的互补决定区CDR2-VH、具有如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的互补决定区CDR3-VH、具有如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的互补决定区CDR1-VL、具有如SEQ ID NO.10所示氨基酸序列的互补决定区CDR2-VL和具有如SEQ ID NO.5所示氨基酸序列的互补决定区CDR3-VL。
作为进一步技术方案，所述可变区包括具有如SEQ ID NO.6所示氨基酸序列的重链可变区VH。
作为进一步技术方案，所述可变区包括具有如SEQ ID NO.7所示氨基酸序列的轻链可变区VL。
作为进一步技术方案，所述抗乙基葡萄糖醛酸单克隆抗体为IgG抗体。
第二方面，本发明提供了生物材料，所述生物材料选自a-c中的任一项：
a.核苷酸，所述核苷酸包括所述抗乙基葡萄糖醛酸单克隆抗体的核苷酸序列；
b.载体，所述载体携带所述a中的核苷酸；
c.细胞，所述细胞携带所述a中核苷酸，或者含有所述b中载体，或者表达所述抗乙基葡萄糖醛酸单克隆抗体。
第三方面，本发明提供了上述抗乙基葡萄糖醛酸单克隆抗体在非诊断和治疗目的的乙基葡萄糖醛酸检测中的应用。
第四方面，本发明提供了一种乙基葡萄糖醛酸标记物，包括所述的抗乙基葡萄糖醛酸单克隆抗体和标记物；
所述抗乙基葡萄糖醛酸单克隆抗体和标记物偶联。
作为进一步技术方案，所述标记物包括酶、荧光分子标记、荧光微球、彩色微球、胶体金、生物素或链霉亲和素。
第五方面，本发明提供了一种用于乙基葡萄糖醛酸检测的试剂盒，所述试剂盒包括所述的抗乙基葡萄糖醛酸单克隆抗体或者所述的乙基葡萄糖醛酸标记物。
作为进一步技术方案，所述试剂盒包括免疫层析检测试剂盒、ELISA检测试剂盒、免疫磁微粒检测试剂盒、免疫荧光检测试剂盒或免疫印记检测试剂盒。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明运用ETG免疫新西兰大白兔，取兔外周血分离PBMC(外周血单个核细胞)，再分选获得B细胞，通过特异性的高通量筛选得到具有高度特异性的B细胞株。再通过mRNA提取、反转录以及PCR获得抗体的重轻链序列，重组至表达载体并进行转染表达，经多步筛选获得高纯度、高灵敏度和高特异性的抗ETG的单克隆抗体anti-ETG-mab1，为开发检测乙基葡萄糖醛酸的免疫试纸条或试剂盒提供了所需的原料。本发明的抗乙基葡萄糖醛酸的单克隆抗体anti-ETG-mab1可用于免疫印迹、免疫荧光等免疫学检测，所获抗体经验证具有良好的特异性结合能力。
具体实施方式
下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
抗体的“可变区(variable region)”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基端识别并结合抗原的结构域，该区段氨基酸的组成和排列决定了抗体识别抗原的特异性。重链可变区可以被称为“VH”。轻链可变区可以被称为“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变的部分，并含有抗原结合位点。重链和轻链的可变区各自由通过4个框架(frameworkregion，FR)连接的3个互补性决定区(complementarity-determining region，CDR)(也被称作高变区)组成。每个链中的CDR通过FR保持紧密靠在一起构成可变区，通常情况下，重链和轻链的可变区VL/VH可由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
术语“载体”是指，可将核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。
所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒。在一些实施方式中，本发明所述载体中包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和其他表达控制元件(例如转录终止信号，或者多腺苷酸化信号和多聚U序列等)。
第一方面，本发明提供了一种抗乙基葡萄糖醛酸单克隆抗体，所述抗乙基葡萄糖醛酸单克隆抗体的可变区包括：具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的互补决定区CDR1-VH、具有如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的互补决定区CDR2-VH、具有如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的互补决定区CDR3-VH、具有如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的互补决定区CDR1-VL、具有如SEQ ID NO.10所示氨基酸序列的互补决定区CDR2-VL和具有如SEQ ID NO.5所示氨基酸序列的互补决定区CDR3-VL。
SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.10的氨基酸序列如表1所示。
表1
高变区 序列 编号
CDR1-VH GFTFSSYN SEQ ID NO.1
CDR2-VH IDGSGVA SEQ ID NO.2
CDR3-VH ARLLYAVSGAYFNL SEQ ID NO.3
CDR1-VL QNVWDNNY SEQ ID NO.4
CDR2-VL SAS SEQ ID NO.10
CDR3-VL QAYFSGDVWD SEQ ID NO.5
在一些可选的实施方式中，所述可变区包括具有如SEQ ID NO.6所示氨基酸序列的重链可变区VH。
QSMEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFTFSSYNMCWVRQAPGKGLEY IGFIDGSGVANYANWAKGRFTISKTSSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARLL YAVSGAYFNLWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO.6)。
在一些可选的实施方式中，所述可变区包括具有如SEQ ID NO.7所示氨基酸序列的轻链可变区VL。
AQVLTQTPSSTSAAVGGTVTINCQASQNVWDNNYLAWYQQKPGQP PKLLIYSASTLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYFCQAYFSG DVWDFGGGTEVVVK(SEQ ID NO.7)。
在一些可选的实施方式中，所述抗乙基葡萄糖醛酸单克隆抗体为IgG抗体。
第二方面，本发明提供了生物材料，所述生物材料选自a-c中的任一项：
a.核苷酸，所述核苷酸包括所述抗乙基葡萄糖醛酸单克隆抗体的核苷酸序列；
b.载体，所述载体携带所述a中的核苷酸；
c.细胞，所述细胞携带所述a中核苷酸，或者含有所述b中载体，或者表达所述抗乙基葡萄糖醛酸单克隆抗体。
第三方面，本发明提供了上述抗乙基葡萄糖醛酸单克隆抗体在非诊断和治疗目的的乙基葡萄糖醛酸检测中的应用。
本发明提供的抗乙基葡萄糖醛酸单克隆抗体能够特异性识别乙基葡萄糖醛酸，因此能够用于乙基葡萄糖醛酸的检测。
第四方面，本发明提供了一种乙基葡萄糖醛酸标记物，包括所述的抗乙基葡萄糖醛酸单克隆抗体和标记物；
所述抗乙基葡萄糖醛酸单克隆抗体和标记物偶联。
该标记物能够用于乙基葡萄糖醛酸的特异性标记。
在一些可选的实施方式中，所述标记物包括但不限于酶、荧光分子标记、荧光微球、彩色微球、胶体金、生物素或链霉亲和素。
第五方面，本发明提供了一种用于乙基葡萄糖醛酸检测的试剂盒，所述试剂盒包括所述的抗乙基葡萄糖醛酸单克隆抗体或者所述的乙基葡萄糖醛酸标记物。
在一些可选的实施方式中，所述试剂盒包括但不限于免疫层析检测试剂盒、ELISA检测试剂盒、免疫磁微粒检测试剂盒、免疫荧光检测试剂盒或免疫印记检测试剂盒。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1、单克隆抗体anti-ETG-mab1的获取
选用6周大小健康雄性新西兰大白兔，按照预先指定的免疫方案进行免疫注射。ETG半抗原(Creative Biolabs Vaccine，VAng-Cr3685)作为免疫原，免疫新西兰大白兔。采集免疫成功的兔外周血，通过PBMC分离技术从兔外周血分离获得PBMC细胞，再使用分选技术获得抗原特异性的兔B细胞。经过B细胞体外培养后筛选获得可分泌抗原特异性抗体的细胞株，提取mRNA并获得抗体序列，重组表达进行第二轮筛选。保留阳性克隆进行测序验证，确保为单克隆抗体。具体实验步骤如下：
一、单克隆抗体anti-ETG-mab1的制备。
将ETG半抗原对实验兔子进行阶段性免疫。
动物免疫实验具体步骤包括：
挑选健康的6周大小的新西兰大白兔两只(约2.5Kg)，使其适应新的生活环境，稳定几天再进行首次耳静脉取血。将收集的血液置于37℃灭活30min，再置于4℃过夜使其凝结释放血清。将凝结好的血液在3000rpm/min离心15min，收集上层血清，作为阴性对照。
每次注射两只兔子各1mL乳化好的抗原，抗原缓冲溶液必须不含对兔子有害的化学试剂。每只兔子初次免疫400ug抗原，使用弗氏完全佐剂乳化。后续免疫每次为200ug抗原，使用弗氏不完全佐剂。
每只兔子免疫4个部位(背部和大腿根部均可)，每个部位250ul，针头呈45度角插入皮下1-2cm，注射完后停留数秒以防止抗原外流。每两周免疫一次，免疫后7-10天采血，总共免疫3-5次。
检测血清效价。
免疫了2只新西兰大白兔，兔子编号依次为R1、R2。2-3次免疫结束后，分别检测血清效价变化。检测数据如下表2所示。
表2：血清效价检测数据
分别用ETG半抗原和ETG小分子做抗原竞争检测，用ETG半抗原作包被抗原进行间接ELISA和竞争ELISA检测免疫兔子血清效价(以下实验中，间接ELISA和竞争ELISA检测参照此处)，间接ELISA法酶标板每孔加1μg/ml的用包被液稀释的包被抗原50μl，4℃包被过夜后，用洗涤液(PBST)洗板3次(下同)，每孔加入封闭液200μl(1％BSA)，于37℃温箱中放置2h，取出洗涤后，每孔再加入稀释的血清50μl，再在37℃温箱中反应30min，洗涤后，加入羊抗兔IgG-HRP溶液50μl，37℃温箱中反应30min。洗涤后加入底物液100μl，37℃温箱中避光显色10min，最后加2mol/L H2SO4,50μL终止反应，于酶标仪读取A450值。2只兔子的三免后耳静脉血清效价均>125000。
竞争ELISA的过程与间接ELISA过程大部分相同，不同之处在于用封闭液封闭，洗酶标板之后，加入稀释的200ng/mL小分子ETG标准液50μl，再加入稀释的血清抗体50μl，使小分子的最终浓度达到100ng/mL，其余的步骤相同。100ng/ml小分子ETG竞争检测，在1:125000时均能达到40％以上，进行采血细胞分选。
筛选获得培养上清阳性的细胞株，并对细胞株进行抗体序列提取和构建质粒，在293细胞中进行高通量重组表达，对表达上清进行ELISA阳性筛选。筛选出的阳性单克隆，扩增质粒转染293细胞进行小样生产，用Protein A抗体纯化柱纯化抗体，纯化后的抗体ELISA效价>1:25,000，纯度>90％。
二、酶联反应ELISA检测识别ETG的结合活性。
1、IgG抗体滴度检测方式
(1)底板包被：将所用抗原用包被稀释液稀释到0.5μg/ml，每孔各加入配好的包被液100μl，置4℃冰箱，放置24h。
(2)24h后，从冰箱取出后置于37℃平衡30min，之后弃去孔中液体；用洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3min。
(3)封闭酶标反应孔：每孔加入封闭液200μl(1％BSA)后置37℃封闭120min，封闭结束后用洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3min。
(4)加入待检测样品：将样本按照需要的比例进行稀释，将稀释好的样品加入酶标反应孔中，每孔100μl，置于37℃，30min；用洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3min。
(5)加入酶标抗体：按照说明书加入适宜浓度的二抗；37℃，30min，每孔加100μl洗涤同前。
(6)加入底物液：底物加入量每孔100μl，置37℃避光放置15～30min。
(7)终止反应：每孔加入终止液50μl终止反应，于20min内测定实验结果。
三、检测单克隆抗体识别ETG的结合活性。
(1)、细胞上清和重组克隆筛选数据
兔子编号依次为R1、R2，共完成了三轮筛选。
R1兔子细胞分选共筛选出100个阳性细胞株，R2兔子细胞分选共筛选出96个阳性细胞株。进行重组与亚克隆，最终筛选到了27个结合与竞争效果最好的重组克隆。筛选标准为表达上清原液与稀释100倍检测的OD450值有显著梯度变化，且稀释100倍后结合值＞1，竞争大于50％，或稀释100倍后结合值＞2，竞争大于40％。
部分重组克隆表达上清检测效价数据如表3：
表3：重组克隆表达上清效价检测数据
备注：横纵坐标仅表示酶标板孔位，每个数值代表1个克隆，上述表格展示了48个克隆培养上清的不同稀释度Elisa结合及竞争OD值。
(2)、抗体纯化条件摸索和检测数据
通过上述筛选获得的27个重组克隆重轻链质粒扩增后，转染293细胞进行抗体生产，经ProteinA亲和层析纯化，共得到26个抗体，3#抗体表达量过低，未纯化。部分抗体的效价检测数据见表4：
表4：纯化抗体效价检测数据
经抗体效价检测显示26个单克隆抗体对ETG抗原具有良好的特异性结合能力，用小分子ETG做竞争实验，结果均有良好竞争，其中表4中的5个抗体结合效价与竞争相对较佳。因此，将26个抗体用于ETG胶体金产品的测试。
四、单克隆抗体anti-ETG-mab1在产品上的应用。
通过免疫胶体金平台对26个单克隆抗体进行胶体金标记，然后制备胶体金层析试纸，所述免疫层析试纸包括样品垫、结合垫和检测垫，检测垫设置检测线和质控线。结合垫包被胶体金标记的筛选出的单克隆抗体，检测线包被ETG抗原，质控线包被羊抗兔IgG抗体。平行检测阴性对照样本和不同浓度的ETG标准品。检测阴性样本时，无ETG小分子跟ETG抗原竞争结合标金的单克隆抗体，因此检测线处包被的ETG抗原结合标金的单克隆抗体，T线显色。
具体的，实验组为使用上述实验得到的ETG抗体1#至27#共26个抗体，对杭州安旭生物科技有限公司的乙基葡萄糖醛酸标准品ETG进行检测。阴性对照为尿液样本。将上述试剂进行加样，之后使用杭州安旭生物科技有限公司的POCT检测仪器ACG1000(ID-A003)对结果进行检测，筛选出13#、21#、22#、23#、26#号抗体阴性和梯度较好，实验数据结果见表5：
表5：抗体初评结果
注：G3-G9表示试纸条的条带颜色深浅的级别，数值越高，表示颜色越深，+/-表示比该级别的颜色稍深或稍浅。加入乙基葡萄糖醛酸标准品ETG数值变低说明小分子有竞争作用，抗体可以和乙基葡萄糖醛酸标准品ETG结合。
结果显示，13#号抗体梯度最好，可用于ETG产品中，cut-off值做到1000ng/ml，之后做13#号抗体的稳定性评估，制备3个批次的抗体小样，评估结果如表6：
表6：13#抗体3批稳定性评估结果
抗体批号 阴性 ETG 500ng/ml ETG 1500ng/ml
13#-1 G9+/9+ G6 G4+
13#-2 G9/9+ G6 G4
13#-3 G9/9+ G5 G4/4-
根据产品的评估结果将13号抗体命名为anti-ETG-mab1，该抗体可以用于乙基葡萄糖醛酸抗原检测试剂盒的检测。
五、单克隆抗体anti-ETG-mab1重链V区(VH)及轻链V区(VL)序列分析。
重组阶段设计扩增重链V区(VH)及轻链V区(VL)基因的引物。
取培养上清Elisa检测阳性的B细胞株，使用磁珠法抽提细胞的mRNA，以mRNA为模板反转录合成cDNA第一链，以上述扩增产物为模板PCR扩增抗体的VH/VL基因。
回收取anti-ETG-mab1的重链VH(约360bp)、轻链VL(约330bp)片段，克隆连接至载体后，质粒送公司测序。
然后分析VH/VL基因序列，所得序列如下：
重链的可变区序列：
anti-ETG-mab1-VH:354bp。
CAGTCAATGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTACAACATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATACATCGGATTCATTGATGGTAGTGGTGTTGCGAACTACGCGAACTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGACCAGTCTGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTTTGTGCCAGACTACTATATGCTGTTAGTGGTGCTTATTTTAACTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO.8)。
anti-ETG-mab1 protein：118aa。
QSMEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFTFSSYNMCWVRQAPGKGLEY IGFIDGSGVANYANWAKGRFTISKTSSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARLL YAVSGAYFNLWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO.6)。
轻链的可变区序列：
anti-ETG-mab1 LVκ：330bp。
GCGCAAGTGCTGACCCAGACTCCCTCTTCCACGTCTGCGGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAATGTTTGGGATAACAACTACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATTCTGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTTCTGTCAAGCCTATTTTAGTGGTGATGTTTGGGATTTCGGCGGCGGGACCGAGGTGGTGGTCAAA(SEQ ID NO.9)。
anti-ETG-mab1 LVκprotein:110aa。
AQVLTQTPSSTSAAVGGTVTINCQASQNVWDNNYLAWYQQKPGQP PKLLIYSASTLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYFCQAYFSG DVWDFGGGTEVVVK(SEQ ID NO.7)。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种抗乙基葡萄糖醛酸单克隆抗体，其特征在于，所述抗乙基葡萄糖醛酸单克隆抗体的可变区包括：具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的互补决定区CDR1-VH、具有如SEQID NO.2所示氨基酸序列的互补决定区CDR2-VH、具有如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的互补决定区CDR3-VH、具有如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的互补决定区CDR1-VL、具有如SEQID NO.10所示氨基酸序列的互补决定区CDR2-VL和具有如SEQ ID NO.5所示氨基酸序列的互补决定区CDR3-VL。
2.根据权利要求1所述的抗乙基葡萄糖醛酸单克隆抗体，其特征在于，所述可变区包括具有如SEQ ID NO.6所示氨基酸序列的重链可变区VH。
3.根据权利要求1所述的抗乙基葡萄糖醛酸单克隆抗体，其特征在于，所述可变区包括具有如SEQ ID NO.7所示氨基酸序列的轻链可变区VL。
4.根据权利要求1所述的抗乙基葡萄糖醛酸单克隆抗体，其特征在于，所述抗乙基葡萄糖醛酸单克隆抗体为IgG抗体。
5.生物材料，其特征在于，所述生物材料选自a-c中的任一项：
a.核苷酸，所述核苷酸包括编码权利要求1-4任一项所述抗乙基葡萄糖醛酸单克隆抗体的核苷酸序列；
b.载体，所述载体携带所述a中的核苷酸；
c.细胞，所述细胞携带所述a中核苷酸，或者含有所述b中载体，或者表达权利要求1-4任一项所述抗乙基葡萄糖醛酸单克隆抗体。
6.权利要求1-4任一项所述的抗乙基葡萄糖醛酸单克隆抗体在非诊断和治疗目的的乙基葡萄糖醛酸检测中的应用。
7.一种乙基葡萄糖醛酸标记物，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的抗乙基葡萄糖醛酸单克隆抗体和标记物；
所述抗乙基葡萄糖醛酸单克隆抗体和标记物偶联。
8.根据权利要求7所述的乙基葡萄糖醛酸标记物，其特征在于，所述标记物包括酶、荧光分子标记、荧光微球、彩色微球、胶体金、生物素或链霉亲和素。
9.一种用于乙基葡萄糖醛酸检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-4任一项所述的抗乙基葡萄糖醛酸单克隆抗体或者权利要求7或8所述的乙基葡萄糖醛酸标记物。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括免疫层析检测试剂盒、ELISA检测试剂盒、免疫磁微粒检测试剂盒、免疫荧光检测试剂盒或免疫印记检测试剂盒。
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