KR20210068067A - 인간 심장 트로포닌 i에 대한 재조합 항체 - Google Patents

인간 심장 트로포닌 i에 대한 재조합 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 cTnI 항원 결합 도메인을 포함하는 단리된 결합 단백질을 제공한다. 상기 항원 결합 도메인은 본원에 정의된 아미노산 서열로부터 선택된 적어도 하나의 상보성 결정 영역을 포함하거나, 상기 아미노산 서열의 상보성 결정 영역에 대해 적어도 80%의 서열 동일성 및 cTnI에 대해 KD≤1.41 Х 10-9mol/L의 친화도를 갖는다. 상기 결합 단백질은 cTnI 단백질의 검출에 사용될 수 있다.

Description

인간 심장 트로포닌 I에 대한 재조합 항체
관련 출원에 대한 상호 참조
본 개시는 "인간 심장 트로포닌 I에 대한 재조합 항체"라는 제목으로, 2018년 10월 10일에 출원된, 중국 특허 출원 번호 제201811179512.3호의 우선권을 주장하며, 그 내용이 본원에 전체적으로 참조로 포함된다.
기술 분야
본 개시는 면역학적 기술 분야, 특히 항-인간 심장 트로포닌 I 재조합 항체에 관한 것이다.
배경
1980년대 이전, 심장 효소 프로파일의 활성은 세계 보건 기구 (WHO)에 의해 급성심근경색 (AMI)에 대한 진단 기준 중 하나로 늘 간주되었다. 1980년대 말, 연구자들은 트로포닌 (Tn)이 포스포크레아틴 키나제 (CK), 포스포크레아틴 키나제-MB (CK-MB), 젖산 탈수소효소, 아스파르트산 아미노전이효소 등과 같은 바이오마커보다 높은 민감도 및 특이도를 가진다는 것을 발견했다. 심근에만 존재하는, 심장 트로포닌 I (cTnI)은, 심근 세포의 마커이고, 이의 비정상적인 변화는 심장의 이완 및 수축 기능에 영향을 미칠 수 있다. cTnI는 심근 괴사의 진단, 심근 손상의 결정 등에 사용될 수 있고, 심근세포 손상에 대한 가장 민감하고 특이적인 마커 중 하나가 되었다. cTnI는 AMI 및 급성관상동맥증후군 (ACS)의 신속한 진단용 및 ACS의 위험 계층화 지원 및 그 예후 반영용 주요 생화학 마커로 인식된다.
일반적으로, 정상인의 혈액 내 cTnI는 0.3μg/L 미만의 함량을 가진다. 허혈 또는 저산소증으로 인한 심근 세포막의 완전성이 손상될 때, 유리 cTnI가 세포막을 통해 빠르게 침투하여 혈류로 들어갈 수 있다. 따라서, cTnI의 신속, 민감 및 정확한 결정과 발병 초기의 인간 혈액에서의 이의 변화 경향이 급성심근경색의 진단, 급성관상동맥증후군의 위험 계층화, 다양한 요인으로 인한 심근 손상의 모니터링 등에 임상적 의의가 있다. 임상적으로 cTnI 수준을 검출하는 데 사용되는 방법은 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA), 화학 발광, 콜로이드 금 등을 포함한다. 다양한 방법은 각각 장점 및 단점을 가지지만, 모두 cTnI에 대한 특이적 단일클론 항체가 필요하다.
기존의 cTnI 항체는 이의 낮은 활성 및 낮은 친화도로 인해 cTnI 단백질의 검출에 잘 적용될 수 없다. 따라서, cTnI에 효과적이고 특이적으로 결합하고 검출하는 항체에 대한 본 기술분야의 강력한 요구가 있다.
요약
본 개시는 심장 트로포닌 I (cTnI) 항원-결합 도메인을 포함하는 신규한 단리된 결합 단백질에 관한 것이고, 상기 결합 단백질의 제조 및 적용이 연구되었다.
상기 항원-결합 도메인은 다음과 같은 아미노산 서열을 갖거나; 또는 다음과 같은 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖고, 1.41Х10-9 mol/L 이하의 KD 값에서 심장 트로포닌 I에 대한 친화도를 갖는, 적어도 하나의 상보성 결정 영역을 포함한다:
X1은 L 또는 I, X2는 D 또는 E, 및 X3은 F 또는 Y인, G-F-N-X1-K-X2-Y-X3-M-H의 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-VH1;
X1은 E 또는 D, X2는 A 또는 G, 및 X3은 R 또는 K인, R-I-X1-P-E-D-X2-E-T-X3-Y-A-P-E의 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-VH2;
X1은 T 또는 S, 및 X2는 I, L 또는 V인, Y-Y-X1-S-Y-X2-P-F-V-Y의 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-VH3;
X1은 I 또는 L, X2는 I 또는 L, 및 X3은 R 또는 K인, Q-S-X1-X2-Y-S-N-X3-H-T-Y의 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-VL1;
X1은 I, L 또는 V, 및 X2는 N 또는 Q인, Q-X1-S-X2-R-F-S의 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-VL2;
X1은 Q 또는 N, X2는 L 또는 I, 및 X3은 F 또는 Y인, S-X1-S-T-H-X2-P-X3-T의 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-VL3.
중요한 이점은 상기 결합 단백질이 인간 cTnI 단백질에 대해 강한 활성 및 높은 친화도를 갖는다는 것이다.
하나 이상의 구현예에서,
상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서, X2는 D이다;
상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서, X1는 D이다;
상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서, X1는 S이다;
상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서, X3은 R이다;
상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서, X2는 N이다.
상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서, X1은 Q이다;
하나 이상의 구현예에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서, X1은 L이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서, X1은 I이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서, X3은 F이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서, X3은 Y이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서, X2는 A이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서, X2는 G이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서, X3은 R이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서, X3은 K이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서, X2는 I이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서, X2는 L이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서, X2는 V이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서, X1은 I이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서, X1은 L이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서, X2는 I이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서, X2는 L이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서, X1은 I이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서, X1은 L이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서, X1은 V이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서, X2는 L이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서, X2는 I이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서, X3은 F이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서, X3은 Y이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 상보성 결정 영역 각각의 돌연변이 부위는 다음 돌연변이 조합으로부터 선택된 어느 하나이다.
Figure pct00001
Figure pct00002
.
하나 이상의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 적어도 3개의 CDR을 포함하거나; 또는 상기 결합 단백질은 적어도 6개의 CDR을 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 가변 영역 및 불변 영역을 포함하는 온전한 항체이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 결합 단백질은, 나노바디, F(ab')2, Fab', Fab, Fv, scFv, 이중 특이적 항체, 및 항체 최소 인식 단위와 같은 항체의 "기능적 단편"이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 각각 서열번호 1 내지 4에 제시된 서열을 갖는 경쇄 프레임워크 영역 FR-L1, FR-L2, FR-L3 및 FR-L4, 및/또는 각각 서열번호 5 내지 8에 제시된 서열을 갖는 중쇄 프레임워크 영역 FR-H1, FR-H2, FR-H3 및 FR-H4를 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 항체의 불변 영역 서열을 추가로 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 불변 영역 서열은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, 및 IgD로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 불변 영역의 서열이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 불변 영역은 다음의 종으로부터 유래된다: 소, 말, 젖소, 돼지, 양, 염소, 랫, 마우스, 개, 고양이, 토끼, 낙타, 당나귀, 사슴, 밍크, 닭, 오리, 거위, 칠면조, 투계, 또는 인간.
하나 이상의 구현예에서, 상기 불변 영역은 쥐과(murine)로부터 유래된다.
경쇄의 상기 불변 영역 서열은 서열번호 9에 제시된 바와 같다.
중쇄의 상기 불변 영역 서열은 서열번호 10에 제시된 바와 같다.
본 개시의 일 측면에 따르면, 본 개시는 또한 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 상기 핵산 분자는 상기한 바와 같은 상기 결합 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA이다.
본 개시의 일 측면에 따르면, 본 개시는 또한 상기한 바와 같은 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 개시의 일 측면에 따르면, 본 개시는 상기한 바와 같은 상기 벡터로 형질 전환된 숙주 세포에 관한 것이다.
본 개시의 일 측면에 따르면, 본 개시는 또한 상기한 바와 같은 상기 결합 단백질을 생산하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
상기한 바와 같은 상기 숙주 세포를 적절한 배양 조건 하에서 배양 배지에서 배양하는 단계, 및 이로서 생성된 상기 결합 단백질을 상기 배양 배지에서 또는 배양된 숙주 세포로부터 회수하는 단계.
본 개시의 일 측면에 따르면, 본 개시는 또한 상기한 바와 같은 상기 결합 단백질의 급성심근경색, 급성관상동맥증후군, 폐경색, 불안정 협심증, 및 심근 손상을 진단하기 위한 진단제 또는 키트의 제조에서의 용도에 관한 것이다.
본 개시의 일 측면에 따르면, 본 개시는 또한
a) 항체/항원 결합 반응의 발생에 충분한 조건 하에서 시험 샘플의 트로포닌 I을 상기한 바와 같은 상기 결합 단백질과 접촉시켜 면역 복합체를 형성하는 단계; 및
b) 상기 시험 샘플의 트로포닌 I 항원의 존재를 나타내는 상기 복합체의 존재인, 상기 면역 복합체의 존재를 검출하는 단계:를 포함하는 시험 샘플에서 트로포닌 I 항원을 검출하는 방법에 관한 것이다.
하나 이상의 구현예에서, 단계 a)에서, 상기 면역 복합체는 상기 결합 단백질에 결합하는 2차 항체를 추가로 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 단계 a)에서, 상기 면역 복합체는 상기 심장 트로포닌 I 항원에 결합하는 2차 항체를 추가로 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 효소는 겨자무 과산화효소, 알칼리 포스파타제 및 글루코스 산화효소 중 어느 하나를 포함한다.
본 개시의 일 측면에 따르면, 본 개시는 또한 상기한 바와 같은 상기 결합 단백질을 포함하는 키트에 관한 것이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 트로포닌 I 항원은 심장 트로포닌 I 항원이다.
본 개시는 또한 본원에서 기재된 상기 결합 단백질의 심장 트로포닌 I 관련 질환의 진단에서의 용도에 관한 것이다.
본 개시는 또한
A) 결합 반응을 위해 상기 결합 반응의 발생에 충분한 조건 하에서 피험자로부터의 샘플을 본 개시의 상기 결합 단백질과 접촉시키는 단계, 및
B) 상기 결합 반응에 의해 생성된 면역 복합체를 검출하는 단계:를 포함하고,
상기 면역 복합체의 존재는 심장 트로포닌 I 관련 질환의 존재를 나타내는, 심장 트로포닌 I 관련 질환을 진단하는 방법에 관한 것이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 방법은 형광 면역분석법, 화학발광 면역분석법, 콜로이드 금 면역분석법, 방사성 면역분석법 및/또는 효소-결합 면역분석법을 기초로 한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 샘플은 전혈, 말초 혈, 혈청, 혈장 또는 심근 조직으로부터 선택된 적어도 하나이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 피험자는 영장류, 예를 들어, 인간과 같은, 포유 동물이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 심장 트로포닌 I 관련 질환은 심혈관 질환이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 심장 트로포닌 I 관련 질환은 급성심근경색, 급성관상동맥증후군, 폐경색, 불안정 협심증, 심근 손상 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
도면의 간단한 설명
본 개시의 특정 구현예 또는 종래 기술의 기술적 해결책을 보다 명확하게 설명하기 위해, 특정 구현예 또는 종래기술에서 사용된 도면에 대해 하기에서 간략하게 설명한다. 당연히, 후술하는 도면은 본 개시의 일부 구현예이다. 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자를 위해, 창의적인 작업 없이 다른 도면이 이들 도면으로부터 도출될 수 있다.
도 1은 본 개시에 따른 항-인간 심장 트로포닌 I 재조합 항체의 전기영동 이미지이다.
구현예의 상세한 설명
본 개시는 본 개시의 일부 구현예에 대한 다음의 설명 및 본원에 포함된 실시예의 상세한 내용을 통해 보다 쉽게 이해될 수 있다.
본 개시를 더 설명하기 전에, 이들 구현예는 반드시 다양하기 때문에, 본 개시는 특정 구현예에 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 또한 본 개시의 범위는 첨부된 청구범위에서만 정의될 것이기 때문에, 본 명세서에서 사용된 용어는 제한을 위한 것이 아니라, 특정 구현예를 설명하기 위한 것일 뿐임을 이해해야 한다.
용어 정의
"항원-결합 도메인을 포함하는 단리된 결합 단백질"은 CDR 영역을 포함하는 모든 단백질/단백질 단편을 의미한다. 용어 "항체"는, Fab, F(ab')2, Fd, Fv, scFv, 이중 특이적 항체, 및 항체 최소 인식 단위를 포함하는, 다클론 항체, 단일클론 항체, 및 이들 항체의 항원-화합물-결합 단편뿐만 아니라, 이들 항체 및 단편의 단일 사슬 유도체를 포함한다. 상기 항체의 유형은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, 및 IgD로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 또한, 용어 "항체"는 자연 발생 항체뿐만 아니라, 예를 들어, 키메라, 이작용성 및 인간화 항체, 및 관련 합성 이소형을 포함하는, 비-자연 발생 항체를 포함한다. 용어 "항체"는 "면역글로불린"과 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노 말단 도메인을 의미한다. 중쇄의 가변 도메인은 "VH"로 지칭될 수 있다. 경쇄의 가변 도메인은 "VL"로 지칭될 수 있다. 이러한 도메인은 일반적으로 항체의 가장 가변적인 부분이고 항원-결합 부위를 포함한다. 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역 (VL 또는 VH)은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"이라고 하는 3개의 초가변 영역 및 3개의 CDR을 분리하는 프레임워크 영역으로 구성된다. 프레임워크 영역 및 CDR의 범위는, 예를 들어 Kabat (E.Kabat, et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services (1983) 참조), 및 Chothial에서 정확하게 정의되었다. 항체의 프레임워크 영역, 즉, 경쇄 및 중쇄의 조합을 구성하는 프레임워크 영역은, CDR의 위치를 찾아내고 CDR을 정렬시키는 기능을 하며, CDR은 주로 항원에 결합하는 역할을 담당한다.
본원에서 사용된, "프레임워크 영역" 또는 "FR"은 CDR로 정의된 것을 제외한 항체의 가변 영역 내의 영역을 의미한다. 각각의 항체 가변 도메인 프레임워크 영역은 CDR에 의해 분리된 인접 영역 (FR1, FR2, FR3, 및 FR4)로 더 세분화될 수 있다.
일반적으로, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 VL/VH는 다음의 조합에서 다음의 번호가 매겨진 CDR 및 FR을 배열하고 연결하여 얻어질 수 있다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.
본원에서 사용된, 폴리펩티드 또는 핵산과 관련하여 용어 "정제된" 또는 "단리된"은 폴리펩티드 또는 핵산이 이의 천연 배지에 있거나 이의 천연 형태가 아님을 의미한다. 따라서, 용어 "단리된"은 이의 원래의 환경, 예를 들어, 만일 그것이 자연적으로 발생한 것이라면 자연 환경으로부터 추출된 폴리펩티드 또는 핵산을 포함한다. 예를 들어, 단리된 폴리펩티드는 일반적으로 폴리펩티드가 일반적으로 결합하거나, 일반적으로 폴리펩티드와 혼합되거나, 또는 용액 내에 있는 적어도 일부 단백질 또는 다른 세포 성분을 포함하지 않는다. 단리된 폴리펩티드는 세포 용해물에 포함된 자연적으로-생성된 폴리펩티드, 정제된 또는 부분적으로 정제된 형태의 폴리펩티드, 재조합 폴리펩티드, 세포에 의해 발현되거나 분리된 폴리펩티드, 및 이종 숙주 세포 또는 배양물의 폴리펩티드를 포함한다. 핵산과 관련된 용어 단리된 또는 정제된은 핵산이, 예를 들어, 벡터에서, 발현 카세트로서, 프로모터에 연결되거나, 이종 숙주 세포에 인위적으로 도입된 것과 같은, 예를 들어, 천연 게놈 배경이 아닌 것을 나타낸다.
본원에서 사용된, 용어 "이중 특이적 항체" 또는 "이기능성 항체"는 2개의 상이한 중쇄/단쇄 쌍 및 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공 하이브리드 결합 단백질을 의미한다. 이중 특이적 결합 항체는, 하이브리도마 융합 또는 Fab' 단편 연결을 포함하는 다양한 방법에 의해 생산될 수 있다.
본원에서 사용된, 용어 "서열 동일성"은 적어도 2개의 상이한 서열 간의 유사성을 의미한다. 이 백분율 동일성은, 예를 들어, Basic Local Alignment Search Tool (BLAST); Needleman et al.에 의해 확립된 알고리즘; 또는 Meyers et al.에 의해 확립된 알고리즘과 같은, 표준 알고리즘에 의해 결정될 수 있다. 하나 이상의 구현예에서, 파라미터 세트는 12의 갭 페널티, 4의 갭 확장 페널티, 및 5의 프레임쉬프트 갭 페널티가 있는 Blosum 62 점수화 매트릭스일 수 있다. 하나 이상의 구현예에서, 2개의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열 간의 백분율 동일성은 또한 PAM120 중량 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티, 및 4의 갭 페널티를 사용하여, ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 통합된, Meyers 및 Miller ((1989)CABIOS 4: 11-17)에서 설명된 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 백분율 동일성은 일반적으로 유사한 길이의 서열을 비교하여 계산된다.
본원에서 사용된, 용어 "친화도"는 결합 단백질 또는 항체의 항원-결합 도메인의 항원 또는 항원의 에피토프에 대한 결합 강도를 의미한다. 친화도는 KD 값으로 측정될 수 있다. 작은 KD 값은 더 큰 친화도를 의미한다.
본 개시의 예시적인 구현예
본 개시는 항원-결합 도메인을 포함하는 단리된 결합 단백질을 제공하며, 상기 항원-결합 도메인은 다음과 같은 아미노산 서열을 갖거나; 또는 다음과 같은 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖고 1.41Х10-9 mol/L 이하의 KD 값에서 심장 트로포닌 I에 대한 친화도를 갖는 적어도 하나의 상보성 결정 영역을 포함한다:
X1은 L 또는 I, X2는 D 또는 E, 및 X3은 F 또는 Y인, G-F-N-X1-K-X2-Y-X3-M-H의 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-VH1;
X1은 E 또는 D, X2는 A 또는 G, 및 X3은 R 또는 K인, R-I-X1-P-E-D-X2-E-T-X3-Y-A-P-E의 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-VH2;
X1은 T 또는 S, 및 X2는 I, L 또는 V인, Y-Y-X1-S-Y-X2-P-F-V-Y의 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-VH3;
X1은 I 또는 L, X2는 I 또는 L, 및 X3은 R 또는 K인, Q-S-X1-X2-Y-S-N-X3-H-T-Y의 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-VL1;
X1은 I, L 또는 V, 및 X2는 N 또는 Q인, Q-X1-S-X2-R-F-S의 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-VL2;
X1은 Q 또는 N, X2는 L 또는 I, 및 X3은 F 또는 Y인, S-X1-S-T-H-X2-P-X3-T의 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-VL3.
하나 이상의 구현예에서, 상기 항원-결합 도메인은 다음과 같은 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역에 대해 적어도 50%, 또는 적어도 55%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 65%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 75%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖고 1.41Х10-9 mol/L 이하, 예를 들어, 1Х10-10 mol/L, 2Х10-10 mol/L, 3Х10-10 mol/L, 4Х10-10 mol/L, 4.5Х10-10 mol/L, 5Х10-10 mol/L, 6Х10-10 mol/L, 7Х10-10 mol/L, 8Х10-10 mol/L, 9Х10-10 mol/L, 1Х10-11 mol/L, 3Х10-11 mol/L, 5Х10-11 mol/L、5Х10-11 mol/L, 7Х10-11 mol/L, 9Х10-11 mol/L 또는 1Х10-9 mol/L의 KD 값에서,
또는 1.68Х10-10 mol/L 이상 및 1.41Х10-9 mol/L 이하의 KD 값에서,
또는 1Х10-10 mol/L, 2Х10-10 mol/L, 3Х10-10 mol/L, 4Х10-10 mol/L, 4.5Х10-10 mol/L, 5Х10-10mol /L, 6Х10-10 mol/L, 7Х10-10 mol/L, 8Х10-10 mol/L, 9Х10-10 mol/L, 1Х10-11 mol/L, 3Х10-11 mol/L, 5Х10-11 mol/L, 5Х10-11 mol/L, 7Х10-11 mol/L, 또는 9Х10-11 mol/L 이하의 KD 값에서 심장 트로포닌 I에 대한 친화도를 가진다.
상기 친화도는 본 개시의 방법에 따라 측정된다.
하나 이상의 구현예에서,
상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서, X2는 D이다;
상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서, X1는 D이다;
상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서, X1는 S이다;
상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서, X3은 R이다;
상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서, X2는 N이다.
상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서, X1은 Q이다;
하나 이상의 구현예에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서, X1은 L이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서, X1은 I이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서, X3은 F이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서, X3은 Y이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서, X2는 A이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서, X2는 G이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서, X3은 R이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서, X3은 K이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서, X2는 I이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서, X2는 L이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서, X2는 V이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서, X1은 I이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서, X1은 L이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서, X2는 I이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서, X2는 L이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서, X1은 I이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서, X1은 L이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서, X1은 V이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서, X2는 L이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서, X2는 I이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서, X3은 F이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서, X3은 Y이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 상보성 결정 영역 각각의 돌연변이 부위는 다음 돌연변이 조합 중 어느 하나로부터 선택된다:
Figure pct00003
Figure pct00004
하나 이상의 구현예에서, 본 개시에 기재된 상기 결합 단백질의 6개의 CDR 영역에 나타나는 X1은 각각 독립적으로 본 개시에 정의된 아미노산을 나타내고; 본 개시에 기재된 상기 결합 단백질의 6개의 CDR 영역에 나타나는 X2는 각각 독립적으로 본 개시에 정의된 아미노산을 나타내고; 및 본 개시에 기재된 상기 결합 단백질의 6개의 CDR 영역에 나타나는 X3은 각각 독립적으로 본 개시에 정의된 아미노산을 나타낸다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 적어도 3개의 CDR을 포함하거나; 상기 결합 단백질은 적어도 6개의 CDR을 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 가변 영역 및 불변 영역을 포함하는 온전한 항체이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 나노바디, F(ab')2, Fab', Fab, Fv, scFv, 이중 특이적 항체, 및 항체 최소 인식 단위 중 하나와 같은, 항체의 "기능적 단편"이다.
scFv (sc=단일 사슬), 이중 특이적 항체 (디아바디).
본 개시에서 기재된 "기능적 단편"은 구체적으로 모 항체와 동일한 cTnI에 대한 특이도를 갖는 항체 단편을 의미한다. 상기 기능적 단편 이외에, 증가된 반감기를 갖는 임의의 단편이 또한 포함된다.
일반적으로, 이러한 기능적 단편은 이들이 유래된 항체와 동일한 결합 특이도를 갖는다. 본 개시에서 언급된 내용으로부터, 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 상기한 바와 같은 기능적 단편이 (펩신 또는 파파인을 포함하는) 효소적 소화와 같은 방법을 통해 및/또는 이황화 결합을 분해하는 화학 환원 방법을 통해 본 개시의 항체 단편을 사용하여 얻어질 수 있다.
항체 단편은 또한 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 또한 잘 알려진 재조합 유전 기술에 의해 또는 펩티드 합성에 의해, 예를 들어, Applied BioSystems에서 판매되는 것과 같은, 자동 펩티드 합성기를 통해 얻어질 수 있다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 각각 서열번호 1 내지 4에 제시된 서열을 갖는 경쇄 프레임워크 영역 FR-L1, FR-L2, FR-L3 및 FR-L4, 및/또는 각각 서열번호 5 내지 8에 제시된 서열을 갖는 중쇄 프레임워크 영역 FR-H1, FR-H2, FR-H3 및 FR-H4를 포함한다.
인간화 항체를 형성하기 위해, 프레임워크 영역은 본 개시에서 상기 기재된 아미노산 서열에 추가하여, 인간으로부터 유래될 수 있음을, 유의해야 한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 결합 단백질은 항체의 불변 영역 서열을 추가로 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 불변 영역 서열은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, 및 IgD로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 불변 영역의 서열이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 불변 영역은 다음의 종으로부터 유래된다: 소, 말, 젖소, 돼지, 양, 염소, 랫, 마우스, 개, 고양이, 토끼, 낙타, 당나귀, 사슴, 밍크, 닭, 오리, 거위, 칠면조, 투계, 또는 인간.
하나 이상의 구현예에서, 상기 불변 영역은 쥐과(murine)로부터 유래된다.
경쇄의 상기 불변 영역 서열은 서열번호 9에 제시된 바와 같다.
중쇄의 상기 불변 영역 서열은 서열번호 10에 제시된 바와 같다.
본 개시의 일 측면에 따르면, 본 개시는 또한 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 상기 핵산 분자는 상기한 바와 같은 상기 결합 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA이다.
본 개시의 일 측면에 따르면, 본 개시는 또한 상기한 바와 같은 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 개시는, 플라스미드, 추가로 발현 플라스미드와 같은, 상기한 바와 같은 상기 핵산 분자를 코딩하는 하나 이상의 핵산 작재물을 추가로 포함한다. 상기 벡터를 구축하는 방법은 본 출원의 일 구현예에서 설명될 것이다.
본 개시의 일 측면에 따르면, 본 개시는 또한 상기한 바와 같은 상기 벡터로 형질 전환된 숙주 세포에 관한 것이다.
상기 숙주 세포는, 포유 동물 세포와 같은 진핵 세포일 수 있다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 숙주 세포는 CHO 세포이다.
본 개시의 일 측면에 따르면, 본 개시는 또한 상기한 바와 같은 상기 결합 단백질을 생산하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
상기한 바와 같은 숙주 세포를 적절한 배양 조건 하에서 배양 배지에서 배양하는 단계, 및 이로서 생성된 상기 결합 단백질을 상기 배양 배지에서 또는 배양된 숙주 세포로부터 회수하는 단계.
본 개시의 일 측면에 따르면, 본 개시는 또한 상기한 바와 같은 상기 결합 단백질의 급성심근경색, 급성관상동맥증후군, 폐경색, 불안정 협심증, 및 심근 손상을 진단하기 위한 진단제 또는 키트의 제조에서의 용도에 관한 것이다.
본 개시의 일 측면에 따르면, 본 개시는 또한
a) 항체/항원 결합 반응의 발생에 충분한 조건 하에서 시험 샘플의 트로포닌 I을 상기한 바와 같은 상기 결합 단백질과 접촉시켜 면역 복합체를 형성하는 단계; 및
b) 상기 시험 샘플의 트로포닌 I 항원의 존재를 나타내는 상기 복합체의 존재인 상기 면역 복합체의 존재를 검출하는 단계:를 포함하는, 시험 샘플에서 트로포닌 I 항원을 검출하는 방법에 관한 것이다.
이 구현예에서, 상기 결합 단백질은 신호 강도를 나타내는 지표로 표지될 수 있으므로, 상기 복합체는 쉽게 검출될 수 있다.
하나 이상의 구현예에서, 단계 a)에서, 상기 면역 복합체는 상기 결합 단백질에 결합하는 2차 항체를 추가로 포함한다.
이 구현예에서, 1차 항체의 형태로, 상기 결합 단백질은, cTnI의 상이한 에피토프에 결합하기 위해 2차 항체와 쌍을 이루는 항체를 형성한다.
상기 2차 항체는 신호 강도를 나타내는 지표로 표지될 수 있으므로, 상기 복합체는 쉽게 검출될 수 있다.
하나 이상의 구현예에서, 단계 a)에서, 상기 면역 복합체는 트로포닌 I 항원에 결합하는 2차 항체를 추가로 포함한다.
이 구현예에서, 상기 결합 단백질은 상기 2차 항체의 항원으로서 작용한다. 상기 2차 항체는 신호 강도를 나타내는 지표로 표지될 수 있으므로, 상기 복합체는 쉽게 검출될 수 있다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 신호 강도를 나타내는 지표는 형광 물질, 양자점, 디곡시제닌-표지된 프로브, 비오틴, 방사성 동위원소, 방사선 조영제, 상자성 이온 형광 마이크로스피어, 전자-밀도 물질, 화학 발광 마커, 초음파 조영제, 감광제, 콜로이드 금 또는 효소 중 어느 하나를 포함한다.
심장 트로포닌 I 항원에 결합하는 2차 항체를 추가로 포함하는, 시험 샘플에서 트로포닌 I 항원을 검출하는 방법.
하나 이상의 구현예에서, 상기 형광 물질은 Alexa 350, Alexa 405, Alexa 430, Alexa 488, Alexa 555, Alexa 647, AMCA, 아미노아크리딘, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, 5-카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레세인, 5-카르복시-2',4',5',7'-테트라클로로플루오레세인, 5-카르복시플루오레세인, 5-카르복시로다민, 6-카르복시로다민, 6-카르복시테트라메틸로다민, Cascade Blue, Cy2, Cy3, Cy5, Cy7, 6-FAM, 단실 클로라이드, 플루오레세인, HEX, 6-JOE, NBD (7-니트로벤조-2-옥사-1,3-디아졸), Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Pacific Blue, o-프탈산, p-프탈산, m-프탈산, 크레솔 솔리드 바이올렛, 크레솔 블루 바이올렛, 브릴리언트 크레솔 블루, p-아미노벤조산, 에리트로신, 프탈로시아닌, 아조메틴, 시아닌, 잔틴, 숙시닐플루오레세인, 희토류 금속 크립테이트, 유로퓸 트리스-비피리딘 디아민, 유로퓸 크립테이트 또는 킬레이트, 디아민, 비스시아닌, La Jolla 블루 염료, 알로피코시아닌, B-알로코시아닌, C-피코시아닌, R-피코시아닌, 티아민, 피코에리트린 , R-피코에리트린, REG, 로다민 그린, 로다민 이소티오시아네이트, 로다민 레드, ROX, TAMRA, TET, TRIT (테트라메틸로다민 이소티올), 테트라메틸로다민 및 Texas Red 중 임의의 것을 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 방사성 동위원소는 110In, 111In, 177Lu, 18F, 52Fe, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 86Y, 90Y, 89Zr, 94mTc, 94Tc, 99mTc, 120I, 123I, 124I, 125I, 131I, 154-158Gd, 32P, 11C, 13N, 15O, 186Re, 188Re, 51Mn, 52mMn, 55Co, 72As, 75Br, 76Br, 82mRb 및 83Sr 중 임의의 것을 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 효소는 겨자무 과산화효소, 알칼리 포스파타제 및 글루코스 산화효소 중 임의의 것을 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 형광 마이크로스피어는, 희토류인, 형광 유로퓸이, 내부에 패키징된 폴리스티렌 형광 마이크로스피어이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 트로포닌 I 항원은 심장 트로포닌 I 항원이다.
본 개시는 또한 본원에서 기재된 상기 결합 단백질의 심장 트로포닌 I 관련 질환의 진단에서의 용도에 관한 것이다.
본원에서 사용된, 용어 "심장 트로포닌 I 관련 질환"은, 단백질 자체 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는, 심장 트로포닌 I이 마커로 작용하는 질환을 의미한다. 특히, 본 개시의 하나 이상의 구현예에서, 상기 심장 트로포닌 I 관련 질환은 혈중 심장 트로포닌 I의 증가된 수준을 특징으로 하는 질환을 의미할 수 있다. 본 개시의 하나 이상의 구현예에서, 상기 심장 트로포닌 I 관련 질환은 심근 조직 및 심근 세포에서 심장 트로포닌 I의 감소된 수준을 특징으로 하는 질환을 의미할 수 있다.
본 개시는 또한
A) 결합 반응을 위해 상기 결합 반응의 발생에 충분한 조건 하에서 피험자로부터의 샘플을 본 개시의 상기 결합 단백질과 접촉시키는 단계, 및
B) 상기 결합 반응에 의해 생성된 면역 복합체를 검출하는 단계:를 포함하고,
상기 면역 복합체의 존재는 심장 트로포닌 I 관련 질환의 존재를 나타내는, 심장 트로포닌 I 관련 질환을 진단하는 방법에 관한 것이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 방법은 형광 면역분석법, 화학발광 면역분석법, 콜로이드 금 면역분석법, 방사성 면역분석법 및/또는 효소-결합 면역분석법을 기초로 한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 샘플은 전혈, 말초 혈, 혈청, 혈장 또는 심근 조직으로부터 선택된 적어도 하나이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 피험자는 영장류, 예를 들어, 인간과 같은, 포유 동물이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 심장 트로포닌 I 관련 질환은 심혈관 질환이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 심장 트로포닌 I 관련 질환은 급성심근경색, 급성관상동맥증후군, 폐경색, 불안정 협심증, 심근 손상, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 개시의 구현예는 실시예와 관련하여 이하에서 상세히 설명될 것이지만, 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 다음의 실시예가 본 개시를 설명하기 위해서만 사용되며, 본 개시의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다는 것을 이해할 것이다. 특정 조건이 실시예에서 표시되는 않은 경우 제조업체에 의해 권장된 기존 조건 또는 조건에 따라 실시예가 수행되어야 한다. 제조업체를 표시하지 않고 사용된 시약 또는 기기는 모두 기존의 상용 제품이다.
실시예 1
이 실시예는 인간 심장 트로포닌 I에 대한 항-재조합 항체를 제조하는 예시적 방법을 제공한다.
S10. 발현 플라스미드의 구축:
이 실시예에서, 제한 엔도뉴클레아제 및 Prime Star DNA Polymerase를 Takara에서 구입했다;
MagExtractor-RNA 추출 키트를 TOYOBO에서 구입했다. SMARTER?? RACE cDNA 증폭 키트를 Takara에서 구입했다.
pMD-18T 벡터를 Takara에서 구입했다.
플라스미드 추출 키트를 Tiangen에서 구입했다.
프라이머 합성 및 유전자 시퀀싱은 Invitrogen에 의해 수행되었다.
항-cTnI 5G8 단일클론 항체를 분비하는 세포주는 기존 하이브리도마 세포주였으며 사용을 위해 부활시켰다.
S11. 프라이머의 설계 및 합성.
중쇄 및 경쇄 증폭을 위한 5'RACE 전방향 프라이머
SMARTER II A 올리고뉴클레오티드:
5'>AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACXXXXX<3';
5'-RACE CDS 프라이머（5'-CDS)：5'>(T)25VN<3'(N=A, C, G, or T;V=A, G, 또는 C);
범용 프라이머 A 믹스 (UPM)
5'>CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT<3';
중첩-범용 프라이머 A (NUP):
5'>AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT<3'；
mIg-kR: 5'> CTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAAT <3'；
mIg-HR: 5'> TCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGGC <3'.
S12. 항체 가변 영역의 유전자 클로닝 및 시퀀싱
cTnI 5G8 단일클론 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주로부터 RNA를 추출하고, SMARTERTM RACE cDNA 증폭 키트 및 SMARTER II A 올리고뉴클레오티드 및 키트에서 5'-CDS 프라이머를 이용하여 1차-가닥 cDNA의 합성에 사용했다. 수득된 생성물, 즉 1차-가닥 cDNA는, PCR 증폭을 위해 주형으로 사용되었다. 경쇄 유전자는 범용 프라이머 A 믹스 (UPM), 중첩-범용 프라이머 A (NUP) 및 mIg-kR 프라이머로 증폭되고, 중쇄 유전자는 범용 A 믹스 (UPM), 중첩-범용 프라이머 A (NUP) 및 mIg-HR 프라이머로 증폭되었다. 약 1.4 KB 크기의 표적 밴드는 경쇄용 프라이머 쌍으로 증폭되는 동안에, 약 0.72 KB 크기의 표적 밴드는 경쇄용 프라이머 쌍으로 증폭되었다.
아가로스 겔 전기영동에 의한 정제 및 회수 후, 생성물을 폴리-A 꼬리 첨가 반응을 실시하고 DH5α 컴피턴트 세포로 형질 전환 하기 전에 pMD-18T 벡터에 삽입하였다. 콜로니가 성장한 후, 중쇄 및 경쇄 유전자 각각에 대해, 4개의 클론을 고른 다음, 시퀀싱을 위해 Invitrogen에 보냈다.
S13. 항- cTnI 5G8 항체의 가변 영역 유전자의 서열 분석
상기 시퀀싱에 의해 얻어진 유전자 서열을 IMGT 항체 데이터베이스에 넣고 VNTI11.5 소프트웨어를 사용하여 분석하여, 중쇄 및 경쇄에 대한 프라이머 쌍으로 증폭된 유전자가 정확함을 확인했다. 경쇄에 대한 프라이머 쌍으로 증폭된 유전자 단편에서, VkII 유전자 패밀리에 속하는, VL 유전자는, 57 bp 리더 펩티드 서열 위쪽을 가진 321 bp 서열을 가지고; 및 종쇄에 대한 프라이머 쌍으로 증폭된 유전자 단편에서, VH1 유전자 패밀리에 속하는, VL 유전자는, 57 bp 리더 펩티드 서열 위쪽을 가진 357 bp 서열을 갖는다.
S14. 재조합 항체 발현 플라스미드의 구축
pcDNATM 3.4 TOPO® 벡터는, HindIII, BamHI, EcoRI 등과 같은, 다중 클로닝 부위가 도입된, 재조합 항체에 대한 구축된 진핵 발현 벡터이며, pcDNA 3.4A 발현 벡터로 명명되었다 (이하 줄여서 3.4A 발현 벡터라고 함). pMD-18T의 앞서 언급된 항체 가변 영역의 시퀀싱 결과에 따르면, 양 끝에 HindIII 및 EcoRI 제한 부위와 보호 염기가 있는, 항-cTnI 5G8 항체의 VL 및 VH 유전자에 특이적인 프라이머가 설계되었다. 프라이머는 다음과 같다:
cTnI-5G8-HF: 5'> CCCAAGCTTATGGAATGCAGCTGTGTCATGCTCTTCTTC <3'；
cTnI-5G8-HR: 5'> CCCGAATTCTCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGGC <3'；
cTnI-5G8-LF: 5'> CCCAAGCTTATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGG <3'；
cTnI-5G8-LR: 5'> CCCGAATTCCTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAA <3'；
0.72 KB 크기의 경쇄 유전자 단편 및 1.4 KB 크기의 중쇄 유전자 단편을 PCR 증폭에 의해 증폭시켰다. 중쇄 및 경쇄 유전자 단편을 HindIII/EcoRI로 각각 이중 분해되었다. 3.4 벡터도 또한 HindIII/EcoRI로 이중 분해되었다. 분해된 단편 및 벡터를 정제하여 회수한후, 중쇄 유전자 및 경쇄 유전자 각각을 3.4A 발현 벡터에 연결하여, 각 중쇄용 및 경쇄용 재조합 발현 플라스미드를 얻었다.
실시예 2
재조합 항체 발현 플라스미드의 CHO 세포로의 일시적 형질 감염 및 발현된 상층액에서의 항체의 활성 평가
플라스미드를 초순수로 400 ng/ml로 희석했다. CHO 세포는 원심 분리 튜브에서 1.43Х107 세포/mL로 조정되었다. 100 μL의 플라스미드를 700 μL의 세포와 혼합한 후, 혼합물을 전기 형질전환을 위해 전기천공 큐벳으로 옮긴 다음 10 mL CD CHO AGT 배지로 옮겨, 37℃ (8% CO2, 진폭 150)에서 쉐이커에서 배양했다. 배지는 세포 활성을 시험하기 위해 매일 샘플링되었다. 세포 활성이 50% 미만이 되면, 세포 배양물을 원심분리하고, 항체 (각각 서열번호 11 및 12에 제시된 서열을 갖는 경쇄 및 중쇄를 가짐)를 상층액으로부터 수득하였다.
분석에서, 중쇄의 상보성 결정 영역은 다음과 같다:
G-F-N-L(X1)-K-E(X2)-Y-F(X3)-M-H의 서열을 갖는 CDR-VH1;
R-I-E(X1)-P-E-D-A(X2)-E-T-R(X3)-Y-A-P-E의 서열을 갖는 CDR-VH2;
Y-Y-T(X1)-S-Y-I(X2)-P-F-V-Y의 서열을 갖는 CDR-VH3;
경쇄의 상보성 결정 영역은 다음과 같다:
Q-S-I(X1)-I(X2)-Y-S-N-K(X3)-H-T-Y의 서열을 갖는 CDR-VL1;
Q-I(X1)-S-Q(X2)-R-F-S의 서열을 갖는 CDR-VL2;
S-N(X1)-S-T-H-L(X2)-P-F(X3)-T의 서열을 갖는 CDR-VL2;
여기서, X1, X2, 및 X3은 모두 돌연변이가 될 부위이다.
표 1 항체 활성 관련 돌연변이 부위
Figure pct00005
본 발명자들은 더 나은 활성을 갖는 항체를 얻기 위해 전술한 바와 같이 WT에서 CDR 부위를 돌연변이시켰다.
코팅 용액으로 1 μg/ml로 희석한 후 cTnI 품질 대조군을 웰 당 100uL의 마이크로플레이트 코팅에 사용하고 4℃에 하룻밤동안 두었다. 다음 날, 마이크로플레이트를 세척액으로 2회 세척하고 두드려 건조시켰다. 블로킹 용액 (20% BSA+80% PBS)을 웰 당 120 μL로 첨가하고 37℃에서 30분 동안 두었고, 마이크로플레이트를 두드려 건조시켰다. 희석된 cTn 단일클론 항체를 웰 당 100 μL로 첨가하고 37℃에서 30분 동안 두었다; 그런 다음 마이크로플레이트를 세척액으로 5회 세척하고 두드려 건조시켰다. 염소 항-마우스 IgG-HRP를 웰 당 100μL로 첨가하고 37℃에서 30분 동안 두었다; 그 다음 마이크로 플레이트를 세척액으로 5회 세척하고 두드려 건조시켰다. 현색 용액 A를 웰 당 50μL로 첨가한 다음, 현색 용액 B를 웰 당 50μL로 첨가하였다; 혼합 용액을 10분간 방치하였다; 그리고 정지 용액을 웰 당 50μL로 첨가하였다. OD 값은 마이크로플레이트 판독기에서 450 nm (630 nm 기준)에서 판독되었다.
표 2 항체 활성 분석 데이터
Figure pct00006
특이적 항체 서열의 친화도 데이터는 다음과 같은 방법으로 상기 표에서 추가로 결정되었다: AMC를 사용하여, 정제된 항체를 PBST로 10 μg/ml로 희석하고, CTNI 품질 대조군 재조합 단백질 (PK2-CTNI-1, 170120, 출원인에 의해 제조됨)을 PBST로 400 nmol/ml, 200 nmol/ml, 100 nmol/ml, 50 nmol/ml, 25 nmol/ml, 12.5 nmol/ml, 6.25 nmol/ml, 및 0 nmol/ml로 연속 희석하였다.
실행 과정은 다음과 같다: 60s 동안 완충액 1 (PBST)에서 평형화, 300s 동안 항체 용액에서 항체를 고정, 180s 동안 완충액 2 (PBST)에서 배양, 420s 동안 항원 용액에서 결합, 1200s 동안 완충액 2에서 해리, pH 1.69의 10mM GLY 용액 및 완충액 3으로 센서를 재생하고, 데이터를 출력하였다.
분석에서, 상기 표의 돌연변이 1은 가장 우수한 활성 효과를 보였으므로, 돌연변이 1이 더 나은 효능을 가진 돌연변이 부위에 대한 스크리닝을 위한 백본 서열로 사용되었다 (스크리닝에 의해 얻어진 항체는 돌연변이 1과 유사한 활성, 즉 항체 활성 ±10%을 가지는지 확인함). 결과 중 일부는 다음과 같다.
표 3 항체 친화도 관련 돌연변이 부위
Figure pct00007
Figure pct00008
친화도 분석
AMC 센서를 사용하여, 정제된 항체를 PBST로 10 μg/ml로 희석하고, CTNI 품질 대조군 재조합 단백질 (PK2-CTNI-1, 170120, 출원인에 의해 제조됨)을 PBST로 400 nmol/ml, 200 nmol/ml, 100 nmol/ml, 50 nmol/ml, 25 nmol/ml, 12.5 nmol/ml, 6.25 nmol/ml, 및 0 nmol/ml로 연속 희석했다.
실행 과정은 다음과 같다: 60s 동안 완충액 1 (PBST)에서 평형화, 300s 동안 항체 용액에서 항체를 고정, 180s 동안 완충액 2 (PBST)에서 배양, 420s 동안 항원 용액에서 결합, 1200s 동안 완충액 2에서 해리, pH 1.69의 10mM GLY 용액 및 완충액 3으로 센서를 재생하고, 데이터를 출력하였다 (KD는 평형 해리 상수, 즉, 친화도를 나타낸다; kon은 결합 속도를 나타낸다; 및 koff는 해리 속도를 나타낸다).
표 4 친화도 분석 데이터
Figure pct00009
Figure pct00010
표 3에 열거된 돌연변이 부위는 항체의 친화도에 거의 영향을 미치지 않음을 표 4로부터 알 수 있다.
상기 결과를 확인하기 위해, WT를 백본 서열로 하는 상기 실험을 반복하여 돌연변이 부위의 친화도를 확인하였다. 결과 중 일부는 다음과 같다.
표 5 WT를 백본으로 사용한 돌연변이
Figure pct00011
표 6 친화도 분석 데이터
Figure pct00012
표 5 및 표 6에서, 상기 언급된 돌연변이 부위는, 항체 활성이 보장되는 한 다른 부위와 거의 상관 관계가 없다.
마지막으로, 상기 실시예들은 예시를 위해서만 사용되며, 본 개시의 기술적 해결책을, 제한하는 것은 아님에 유의해야 한다. 본 개시는 전술한 구현예를 참조하여 상세하게 기술되었지만, 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 전술한 구현예에서 기재된 기술적 해결책을 변형하거나 기술적 특징의 일부 또는 전부를 동등하게 대체하는 것이 여전히 가능함을 이해해야 한다; 그러나, 이러한 변형 또는 대체는 대응하는 기술적 해결책의 본질이 본 개시의 구현예의 기술적 해결책의 범위를 벗어나게 하지 않는다.
산업상 이용 가능성
본 개시에서 제공되는 심장 트로포닌 I에 결합하는 항원-결합 도메인을 포함하는 단리된 결합 단백질은 특이적 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR을 포함한다. 상기 결합 단백질은 심장 트로포닌 I를 특이적으로 인식하고 결합할 수 있으며 높은 민감도 및 특이도를 갖는다. 특히, 상기 결합 단백질은 인간 cTnI 단백질에 대한 높은 친화도를 가져, 따라서, 심장 트로포닌 I 관련 질환의 검출 및 진단이 가능하다.
SEQUENCE LISTING <110> GUANGDONG FEIPENG BIOLOGICAL CO., LTD. <120> RECOMBINANT ANTIBODY AGAINST HUMAN CARDIAC TROPONIN I <130> PI19035801 <150> CN2018111795123 <151> 2018-10-10 <160> 12 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 26 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser 20 25 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 1 5 10 15 Phe <210> 3 <211> 32 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Lys Ile Asn Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys 20 25 30 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 5 <211> 25 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser 20 25 <210> 6 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Trp Met Lys Gln Arg Thr Glu Gln Gly Leu Asp Trp Ile Gly 1 5 10 <210> 7 <211> 35 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala 1 5 10 15 Tyr Leu Gln Leu Ser Thr Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 20 25 30 Cys Ala Arg 35 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Ala Ser Ala 1 5 10 <210> 9 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15 Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg 35 40 45 Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu 65 70 75 80 Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 100 105 <210> 10 <211> 323 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10 Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala 1 5 10 15 Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu 50 55 60 Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val 65 70 75 80 Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys 85 90 95 Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro 100 105 110 Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu 115 120 125 Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser 130 135 140 Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu 145 150 155 160 Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Ile Asn Ser Thr 165 170 175 Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn 180 185 190 Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro 195 200 205 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln 210 215 220 Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val 225 230 235 240 Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asn Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val 245 250 255 Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln 260 265 270 Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn 275 280 285 Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val 290 295 300 Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His 305 310 315 320 Ser Pro Gly <210> 11 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain <400> 11 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Ile Tyr Ser 20 25 30 Asn Lys His Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Phe Gln Ile Ser Gln Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Asn Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Asn Ser 85 90 95 Thr His Leu Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu 115 120 125 Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg 145 150 155 160 Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu 180 185 190 Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser 195 200 205 Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 215 <210> 12 <211> 442 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain <400> 12 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Leu Lys Glu Tyr 20 25 30 Phe Met His Trp Met Lys Gln Arg Thr Glu Gln Gly Leu Asp Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Glu Pro Glu Asp Ala Glu Thr Arg Tyr Ala Pro Glu Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Thr Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Thr Ser Tyr Ile Pro Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Ala Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser 195 200 205 Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys 210 215 220 Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro 225 230 235 240 Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr 245 250 255 Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser 260 265 270 Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro Arg 275 280 285 Glu Glu Gln Ile Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile 290 295 300 Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn 305 310 315 320 Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys 325 330 335 Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu 340 345 350 Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asn Phe 355 360 365 Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala 370 375 380 Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr 385 390 395 400 Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly 405 410 415 Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His 420 425 430 Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly 435 440

Claims (18)

  1. 항원-결합 도메인을 포함하는 단리된 결합 단백질로서,
    상기 항원-결합 도메인은 다음과 같은 아미노산 서열을 갖거나; 또는 다음과 같은 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖고 1.41Х10-9 mol/L 이하의 KD 값에서 심장 트로포닌 I에 대한 친화도를 갖는 적어도 하나의 상보성 결정 영역을 포함하고:
    X1은 L 또는 I, X2는 D 또는 E, 및 X3은 F 또는 Y인, G-F-N-X1-K-X2-Y-X3-M-H의 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-VH1;
    X1은 E 또는 D, X2는 A 또는 G, 및 X3은 R 또는 K인, R-I-X1-P-E-D-X2-E-T-X3-Y-A-P-E의 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-VH2;
    X1은 T 또는 S, 및 X2는 I, L 또는 V인, Y-Y-X1-S-Y-X2-P-F-V-Y의 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-VH3;
    X1은 I 또는 L, X2는 I 또는 L, 및 X3은 R 또는 K인, Q-S-X1-X2-Y-S-N-X3-H-T-Y의 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-VL1;
    X1은 I, L 또는 V, 및 X2는 N 또는 Q인, Q-X1-S-X2-R-F-S의 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-VL2;
    X1은 Q 또는 N, X2는 L 또는 I, 및 X3은 F 또는 Y인, S-X1-S-T-H-X2-P-X3-T의 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-VL3;
    바람직하게,
    상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서, X2는 D;
    상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서, X1는 D;
    상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서, X1는 S;
    상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서, X3은 R;
    상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서, X2는 N.
    상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서, X1은 Q;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서, X1은 L;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서, X1은 I;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서, X3은 F;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서, X3은 Y;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서, X2는 A;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서, X2는 G;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서, X3은 R;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서, X3은 K;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서, X2는 I;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서, X2는 L;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서, X2는 V;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서, X1은 I;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서, X1은 L;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서, X2는 I;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서, X2는 L;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서, X1은 I;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서, X1은 L;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서, X1은 V;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서, X2는 L;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서, X2는 I;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서, X3은 F;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서, X3은 Y;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 각각의 돌연변이 부위는 다음 돌연변이 조합 중 어느 하나로부터 선택되는, 단리된 결합 단백질:
    Figure pct00013

    Figure pct00014

    Figure pct00015

    .
  2. 제1항에 따른 항원-결합 도메인을 포함하는 단리된 결합 단백질로서, 상기 결합 단백질은 적어도 3개의 CDR을 포함하거나; 또는 상기 결합 단백질은 적어도 6개의 CDR을 포함하며;
    바람직하게, 상기 결합 단백질은 나노바디, F(ab')2, Fab', Fab, Fv, scFv, 이중 특이적 항체, 및 항체 최소 인식 단위 중 하나이고;
    바람직하게, 상기 결합 단백질은 각각 서열번호 1 내지 4에 제시된 서열을 갖는 경쇄 프레임워크 영역 FR-L1, FR-L2, FR-L3 및 FR-L4, 및/또는 각각 서열번호 5 내지 8에 제시된 서열을 갖는 중쇄 프레임워크 영역 FR-H1, FR-H2, FR-H3 및 FR-H4를 포함하는, 단리된 결합 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 따른 항원-결합 도메인을 포함하는 단리된 결합 단백질로서, 상기 결합 단백질은 항체의 불변 영역 서열을 추가로 포함하고;
    바람직하게, 상기 불변 영역 서열은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, 및 IgD로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 불변 영역의 서열이고;
    바람직하게, 상기 불변 영역은 다음의 종으로부터 유래되고: 소, 말, 젖소, 돼지, 양, 염소, 랫, 마우스, 개, 고양이, 토끼, 낙타, 당나귀, 사슴, 밍크, 닭, 오리, 거위, 칠면조, 투계, 또는 인간;
    바람직하게, 상기 불변 영역은 마우스로부터 유래되고;
    경쇄의 상기 불변 영역 서열은 서열번호 9에 제시된 바와 같고;
    중쇄의 상기 불변 영역 서열은 서열번호 10에 제시된 바와 같은, 단리된 결합 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 상기 결합 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자로서, 상기 핵산 분자는 DNA 또는 RNA인, 단리된 핵산 분자.
  5. 제4항에 따른 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  6. 제5항에 따른 상기 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
  7. 제6항에 따른 숙주 세포를 적절한 배양 조건 하에서 배양 배지에서 배양하는 단계, 및 이로서 생성된 상기 결합 단백질을 상기 배양 배지에서 또는 배양된 숙주 세포로부터 회수하는 단계
    :의 단계를 포함하는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 상기 결합 단백질의 생산방법.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 상기 결합 단백질의 급성심근경색, 급성관상동맥증후군, 폐경색, 불안정 협심증, 및 심근 손상을 진단하기 위한 진단제 또는 키트의 제조에서의 용도.
  9. a) 항체/항원 결합 반응의 발생에 충분한 조건 하에서 시험 샘플의 트로포닌 I을 제3항에 따른 상기 결합 단백질과 접촉시켜 면역 복합체를 형성하는 단계; 및
    b) 상기 시험 샘플의 트로포닌 I 항원의 존재를 나타내는 상기 복합체의 존재인, 상기 면역 복합체의 존재를 검출하는 단계
    :를 포함하고;
    바람직하게, 상기 면역 복합체는 상기 결합 단백질에 결합하는 2차 항체를 추가로 포함하고;
    바람직하게, 단계 a)에서, 상기 면역 복합체는 심장 트로포닌 I 항원에 결합하는 2차 항체를 추가로 포함하는, 시험 샘플에서 트로포닌 I 항원을 검출하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 트로포닌 I 항원은 심장 트로포닌 I 항원인, 방법.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 상기 결합 단백질을 포함하는 키트.
  12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 상기 결합 단백질의 심장 트로포닌 I 관련 질환 진단에서의 용도.
  13. A) 결합 반응을 위해 상기 결합 반응의 발생에 충분한 조건 하에서 피험자로부터의 샘플을 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 상기 단백질과 접촉시키는 단계, 및
    B) 상기 결합 반응에 의해 생성된 면역 복합체를 검출하는 단계
    :를 포함하고,
    상기 면역 복합체의 존재는 심장 트로포닌 I 관련 질환의 존재를 나타내는, 심장 트로포닌 I 관련 질환 진단 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 방법은 형광 면역분석법, 화학발광 면역분석법, 콜로이드 금 면역분석법, 방사성 면역분석법 및/또는 효소-결합 면역분석법을 기초로 하는, 방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 샘플은 전혈, 말초 혈, 혈청, 혈장 또는 심근 조직으로부터 선택된 적어도 하나인, 방법.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피험자는 포유 동물, 바람직하게 영장류, 및 보다 바람직하게 인간인, 방법.
  17. 제12항 또는 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 심장 트로포닌 I 관련 질환은 심혈관 질환인, 용도 또는 방법.
  18. 제12항 또는 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 심장 트로포닌 I 관련 질환은 급성심근경색, 급성관상동맥증후군, 폐경색, 불안정 협심증, 심근 손상, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 용도 또는 방법.
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CN113929777A (zh) * 2020-07-13 2022-01-14 东莞市朋志生物科技有限公司 抗肌红蛋白的抗体、检测肌红蛋白的试剂盒和方法
US20240117024A1 (en) * 2022-09-30 2024-04-11 Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd. Cardiac troponin i specific antibody, kit and uses thereof

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1247615C (zh) * 2000-03-21 2006-03-29 上海润东生物科技有限公司 人体心肌肌钙蛋白ⅰ的纯化和其单克隆抗体的制备方法
FI20030652A0 (fi) * 2003-04-30 2003-04-30 Susann Eriksson Parannettu immunomääritys
CN101105497B (zh) * 2006-07-13 2011-10-19 上海凯创生物技术有限公司 一种检测心肌肌钙蛋白i的试剂盒及其制备方法
US8652788B2 (en) * 2009-12-02 2014-02-18 Abbott Laboratories Assay for diagnosis of cardiac myocyte damage
CN101942416B (zh) * 2010-07-23 2012-03-28 中国医学科学院放射医学研究所 抗人心肌肌钙蛋白i特异性单克隆抗体及其制备方法
WO2013175678A1 (ja) * 2012-05-24 2013-11-28 パナソニック株式会社 ヒト心筋由来トロポニンｉに特異的にかつ速やかに結合できる変異体タンパク質
CN103173420B (zh) * 2013-04-08 2015-07-15 菲鹏生物股份有限公司 可分泌抗心肌肌钙蛋白i单抗的杂交瘤细胞及应用
CN103694355B (zh) * 2013-12-11 2016-08-17 菲鹏生物股份有限公司 抗人心肌肌钙蛋白i的重组抗体及其构建方法和应用
JP2016141649A (ja) 2015-02-02 2016-08-08 東ソー株式会社 ペプチド及びそれを用いて作製した抗心筋トロポニンｉ抗体
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