JP2016141649A - ペプチド及びそれを用いて作製した抗心筋トロポニンｉ抗体 - Google Patents

Abstract

【課題】新規なペプチドを作製し、それを用いて簡便な方法で抗心筋トロポニンＩ抗体を製造する方法及びそのようにして得られた抗体。【解決手段】心筋トロポニンＩの３９−５１位又は３５−５５位に相当するアミノ酸配列からなるペプチドを用いて、ペプチド免疫法によりマウスに免疫して、遊離型心筋トロポニンＩに特異的な抗体を作製する方法。又同様にラットに免疫して、遊離型及び複合体型心筋トロポニンＩに反応性を有する抗体を作製する方法。【選択図】図２

Description

本発明は、ペプチド及びそれを用いて作製した抗心筋トロポニンＩ抗体に関するものである。

トロポニン（Ｔｎ）は、Ｉ（分子量約２３，５００）、Ｔ（分子量約３７，０００）及びＣ（分子量約１８，０００）の３つのサブユニットからなる複合体タンパク質で、トロポミオシンやアクチンとともに横紋筋筋原繊維の細い繊維を構成し、骨格筋や心筋において筋肉の収縮を制御している（非特許文献１）。

トロポニンＩ（ＴｎＩ）は心筋、骨格筋でそのアミノ酸配列が異なり、心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）は高い心筋特異性を有しているため、アミノ酸配列の相違に基づいてｃＴｎＩを特異的に測定することは、心筋梗塞の診断等に有用である。ｃＴｎＩは他の心筋マーカーと異なり、通常は血中に殆ど存在せず、運動や筋疾患等による疑陽性も示さないことから、微小梗塞や軽度の心筋障害を鋭敏に検出するなどへの応用が進められている（非特許文献２）。急性心筋梗塞などで心筋が障害を受けると、トロポニンは血中に逸脱し、３〜４時間後には異常高値を示す。またこの場合、血中でのｃＴｎＩの異常高値は１週間程度持続することから、発症後時間が経過しても診断が可能である（非特許文献３）。

ｃＴｎＩの測定方法として抗ｃＴｎＩ抗体を利用した免疫測定が知られている。これまでに多数の抗ｃＴｎＩ抗体が単離されており、市販もされている。一般に、モノクローナル抗体を作製する際、多数の抗体サンプルから目的の性能を有する抗体をＥＬＩＳＡ等のスクリーニング方法によって選択する必要がある。例えば、複合体を形成していないｃＴｎＩ（以下、遊離型ｃＴｎＩと略す）に反応性を示すが、複合体を形成しているｃＴｎＩ（以下、複合体型ｃＴｎＩと略す）に反応性を示さない抗体、すなわち遊離型ｃＴｎＩ特異モノクローナル抗体を作製する際、遊離型ｃＴｎＩに対する反応性及び複合体型ｃＴｎＩに対する反応性の両項目に関してスクリーニングを実施する必要があり、操作が煩雑となり非効率的である。

Ｇａｎｏｎｇ，Ｗ．， Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｍｅｄｉｃａｌ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ， １６ｔｈ ｅｄ．， Ａｐｐｌｅｔｏｎ−Ｌａｎｇｅ， Ｅａｓｔ Ｎｏｒｗａｌｋ， ＣＴ； ５６−６０（１９９３） Ｆ． Ｓ． Ａｐｐｌｅ， Ｒ． Ｈ． Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｏｎ， Ａ． Ｓ． Ｊａｆｆｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｉｏｎａｌ ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ＩＦＣＣ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｃａｒｄｉａｃ ｄａｍａｇｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ： Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｉｓｓｕｅｓ ｆｏｒ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ， Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５３：４； ５４７−５５１（２００７） Ｌａｒｕｅ Ｃ， Ｃａｌｚｏｌａｒｉ Ｃ， Ｂｅｒｔｉｎｃｈａｒｄ ＪＰ， Ｌｅｃｌｅｒｑ Ｆ， Ｇｒｏｌｌｅａｕ Ｒ， Ｐａｕ Ｂ． Ｃａｒｄｉａｃ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｏｅｎｚｙｍｏｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ ｏｆ ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｉ ｉｎ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｐｈａｓｅ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ３９：９７２−９７９（１９９３）

本発明の目的は、新規なペプチドを作製し、それを用いて簡便な方法で抗ｃＴｎＩ抗体を製造する方法及びそのようにして得られた抗体を提供することにある。

本発明者は上記の課題に関し鋭意研究を行なった結果、本発明を完成するに至った。即ち本発明は、以下のとおりである。
（１）心筋トロポニンＩの一部のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列からなることを特徴とするペプチド。
（２）配列番号１に記載の心筋トロポニンＩの３９−５１位に相当するアミノ酸配列を含む、（１）に記載のペプチド。
（３）配列番号２に記載の心筋トロポニンＩの３５−５５位に相当するアミノ酸配列からなる、（１）又は（２）に記載のペプチド。
（４）（１）−（３）いずれかに記載のペプチドを用いて、ペプチド免疫法を行い、抗心筋トロポニンＩ抗体を作製することを特徴とする、抗心筋トロポニンＩ抗体の製造方法。
（５）マウスに免疫して遊離型心筋トロポニンＩ特異抗体を作製する、（４）に記載の製造方法。
（６）ラットに免疫して、遊離型及び複合体型心筋トロポニンＩに反応性を有する抗体を作製する、（４）に記載の製造方法。
（７）（４）に記載の製造方法により得られる抗心筋トロポニンＩ抗体。
（８）（５）に記載の製造方法により得られる遊離型心筋トロポニンＩ特異抗体。
（９）（６）に記載の製造方法により得られる、遊離型及び複合体型心筋トロポニンＩに反応性を有する抗体。

以下に本発明を詳細に説明する。本発明は、ｃＴｎＩの一部のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するペプチドである。このようなペプチドとしては特に限定されるものではないが、例えば配列番号１に記載のｃＴｎＩの３９−５１位に相当するアミノ酸配列を含むペプチドを例示することができ、好ましくは配列番号１に記載のｃＴｎＩの３９−５１位に相当するアミノ酸配列からなるペプチド（以下、ｃＴｎＩ（３９−５１）と略す）を例示することができ、より好ましくは配列番号２に記載のｃＴｎＩの３５−５５位に相当するアミノ酸配列からなるペプチド（以下、ｃＴｎＩ（３５−５５）と略す）を例示することができる。

このようなアミノ酸配列からなるペプチドを、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）やキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等のキャリアタンパク質にコンジュゲートさせ、これを免疫原としてヒト以外の動物に免疫するといういわゆるペプチド免疫法を行い、抗ｃＴｎＩ抗体を作製することができる。この抗ｃＴｎＩ抗体として、例えば抗血清やモノクローナル抗体があげられる。抗血清は、例えば免疫した動物から適宜回収すればよい。またモノクローナル抗体は、免疫した動物から抗体産生細胞を回収し、ミエローマ細胞等と融合させ、得られたハイブリドーマを適宜スクリーニングして得ることができ、また遺伝子工学的手法で作製することもできる。

興味深いことに、上述の免疫原をラットに免疫した場合、その抗血清は遊離型ｃＴｎＩに対しても複合体型ｃＴｎＩに対しても反応性を示したが、該免疫原をマウスに免疫した場合、その抗血清は遊離型ｃＴｎＩに対して反応性を示したが複合体型ｃＴｎＩに対して反応性を示さなかった。また同様の現象が、該免疫原を免疫したラット及びマウスから抗ｃＴｎＩモノクローナル抗体を作製した場合にもみられた。即ち、ラット由来の抗体産生細胞を用いて作製した抗ｃＴｎＩモノクローナル抗体は、遊離型ｃＴｎＩに対しても複合体型ｃＴｎＩに対しても反応するものが圧倒的に多かった。これに対し、マウス由来の抗体産生細胞を用いて作製した抗ｃＴｎＩモノクローナル抗体は、遊離型ｃＴｎＩに対して反応したが複合体型ｃＴｎＩに対しては反応しなかった。

よって、必要とする抗体の特異性に応じて、本発明のペプチドを用いて免疫する動物を選択すればよく、具体的には、遊離型ｃＴｎＩに特異的な抗体を作製する場合には本発明のペプチドを用いてマウスを免疫すればよく、また遊離型ｃＴｎＩ及び複合体型ｃＴｎＩの両方に反応性を有する抗体を作製する場合には本発明のペプチドを用いてラットを免疫することにより、目的に合った特異性を有する抗体を効率よく作製できる。

本発明はｃＴｎＩの一部のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列からなるペプチド及びそれを用いて作製した抗心筋トロポニンＩ抗体である。本発明により、目的に応じて、遊離型ｃＴｎＩ特異抗体又は遊離型ｃＴｎＩ及び複合体型ｃＴｎＩの両方に反応性を有する抗体を、簡便に効率よく製造することができる。

実施例２におけるマウス抗血清の評価結果を示したグラフである。 実施例２におけるマウスモノクローナル抗体の評価結果を示したグラフである。 実施例２におけるラット抗血清の評価結果を示したグラフである。 実施例２におけるラットモノクローナル抗体の評価結果を示したグラフである。 実施例４におけるマウス抗血清の評価結果を示したグラフである。 実施例４におけるマウスモノクローナル抗体の評価結果を示したグラフである。

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は本実施例により限定されるものではない。

［実施例１］ｃＴｎＩ（３５−５５）を用いたペプチド免疫法による抗ｃＴｎＩ抗体の作製
（１）免疫用コンジュゲ−ト液の作製
ｃＴｎＩ（３５−５５）のＮ末端に更にシステイン残基を付加したペプチドは、業者にペプチド合成を依頼して得た。該ペプチド溶液（１０ｍｇ／ｍｌ、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で溶解したもの）と、マレイミド活性化ＫＬＨ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ、ＰＢＳで溶解したもの）を、体積比１：１で混和し、室温で２時間撹拌して反応させた。その後、反応液をＰＢＳに対して２日間４℃で透析することにより、免疫用コンジュゲート液を得た。

（２）マウスへの免疫
（１）で得た免疫用コンジュゲート液（１ｍｇ／ｍｌ）とフロイントの完全アジュバントを等量ずつ混合して乳濁液とし、これをマウス（雌、６週令）の腹腔内に０．１ｍｌずつ１週間間隔で計４回注射した。最終免疫の１週間後に、ブ−スタ−として免疫用コンジュゲート液をＰＢＳで０．５ｍｇ／ｍｌに希釈したもの（０．１ｍｌ）を腹腔内に投与した。

（３）ラットへの免疫
（１）で得た免疫用コンジュゲート液（４ｍｇ／ｍｌ）とフロイントの完全アジュバントを等量ずつ混合して乳濁液とし、これをラット（雌、６週令）の肉球に０．１ｍｌ注射した。４週間後に、ブ−スタ−として免疫用コンジュゲート液をＰＢＳで２ｍｇ／ｍｌに希釈したもの（０．１ｍｌ）を肉球に投与した。

（４）細胞融合
マウスに対しては、ブ−スタ−免疫から３日後に脾臓を摘出し、その細胞を赤血球溶解バッファーにて赤血球を破壊した。残った細胞をＥ−ＲＤＦ培地に懸濁して細胞融合に用いるリンパ球とした。ラットに対しては、ブ−スタ−免疫から３日後に鼠径部リンパ節を摘出し、その細胞をＥ−ＲＤＦ培地に懸濁して細胞融合に用いるリンパ球とした。

また、いずれの動物に対してもリンパ球を得る直前には全採血を行ない、定法により抗血清を得た。

次にＥ−ＲＤＦ培地に懸濁したミエローマ細胞０．４×１０^７個をマウスまたはラットのリンパ球１．６×１０^７個と混合し、遠心後、上清を除去した。細胞沈殿物をマンニトール緩衝液（２５０ｍＭ マンニトール、１００ｍＭ 塩化カルシウム、１００ｍＭ 塩化マグネシウム）に懸濁し、電気的細胞融合を行なった。電気的細胞融合を行なった細胞懸濁液をＨＡＴ培地（１００μＭ ヒポキサンチン、０．４μＭ アミノプテリン、１６
μＭ チミジンを含むＧＩＴ培地）２００ｍｌに懸濁し、３８４ウエル細胞培養プレ−ト１０枚の各ウエルに０．０５ｍｌずつ分注した。約７日後にはハイブリド−マの増殖が認められた。

（５）スクリーニング
ハイブリド−マが増殖してきたウエルについて、培養上清を用いて抗ｃＴｎＩ抗体産生の有無をＥＬＩＳＡ法で検定した。まず、市販の抗ｃＴｎＩ抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社、Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｉ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ｃａｒｄｉａｃ））を、ＥＬＩＳＡプレートに０．１μｇ／ウェルで固定化し、１重量％スキムミルクでブロッキングした。ウェルを洗浄後、遊離型ｃＴｎＩ（Ａｂｃａｍ社、Ｃａｒｄｉａｃ Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｉ ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ）をＰＢＳで１００ｎｇ／ｍｌの濃度に調製したものをウェルに添加して反応させた。

さらにウェルを洗浄後、ハイブリドーマの培養上清をウェルに添加して反応させた。このとき、マウス由来のハイブリドーマの培養上清に対しては、抗マウスＩｇＧ抗体のアルカリ性フォスファターゼ標識体（ミリポア社、Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ Ａｎｔｉｂｏｄｙ， Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）をハイブリドーマの培養上清と同時に添加して反応させ、ラット由来のハイブリドーマの培養上清に対しては、抗ラットＩｇＧ抗体のアルカリ性フォスファターゼ標識体（ＢＥＴＨＹＬ社、Ｓｈｅｅｐ ａｎｔｉ−Ｒａｔ ＩｇＧ−ｈｅａｖｙ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）をハイブリドーマの培養上清と同時に添加して反応させた。

反応後、定法に従いアルカリ性フォスファターゼ活性を測定することでハイブリドーマの培養上清中の抗体と遊離型ｃＴｎＩとの反応性を観察した。反応性を有する抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法により単クローン化し、その培養上清から抗ｃＴｎＩモノクローナル抗体を定法により得た。マウス由来のハイブリドーマから５種類、ラット由来のハイブリドーマから５種類の抗ｃＴｎＩモノクローナル抗体を得た。

［実施例２］実施例１で得られた各抗体の遊離型ｃＴｎＩ及び複合体型ｃＴｎＩとの反応性の評価
実施例１（４）、（５）で得られた抗血清及び抗ｃＴｎＩモノクローナル抗体の、遊離型ｃＴｎＩ及び複合体型ｃＴｎＩに対する反応性をＥＬＩＳＡ法で検定した。遊離型ｃＴｎＩに対する反応性の評価は実施例１（５）のＥＬＩＳＡ法におけるハイブリドーマの培養上清の代わりに抗血清または抗ｃＴｎＩモノクローナル抗体を使用することで実施した。複合体型ｃＴｎＩに対する反応性の評価は、遊離型ｃＴｎＩの代わりに複合体型ｃＴｎＩ（ＬＥＥ社、Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ（Ｉ−Ｔ−Ｃ））を使用することで実施した。また、陰性対照として、遊離型ｃＴｎＩも複合体型ｃＴｎＩも添加せずに同様のＥＬＩＳＡを実施した。

結果を図１−４に示す。５匹のマウスそれぞれの抗血清はいずれも遊離型ｃＴｎＩには反応したが、複合体型ｃＴｎＩには反応しなかった（図１）。また、マウス由来の抗ｃＴｎＩモノクローナル抗体のいずれも、遊離型ｃＴｎＩには反応したが複合体型ｃＴｎＩには反応しなかった（図２）。一方、２匹のラットそれぞれの抗血清は遊離型ｃＴｎＩにも複合体型ｃＴｎＩにも反応した（図３）。また、ラット由来の抗ｃＴｎＩモノクローナル抗体のうち１種類（図４のラットモノクローナル抗体５）は遊離型ｃＴｎＩには反応したが複合体型ｃＴｎＩには反応せず、残りの４種類（図４のラットモノクローナル抗体１−４）は遊離型ｃＴｎＩにも複合体型ｃＴｎＩにも反応した（図４）。すなわち、本発明のペプチドを免疫原としてラットに免疫すると遊離型ｃＴｎＩのみならず複合体型ｃＴｎＩに対しても反応する抗体が単離されうるが、マウスに免疫すると遊離型ｃＴｎＩに特異的な抗体を効率よく単離できることが明らかとなった。

［実施例３］ｃＴｎＩ（３９−５１）を用いたペプチド免疫法による抗ｃＴｎＩ抗体の作製
ｃＴｎＩ（３５−５５）の代わりにｃＴｎＩ（３９−５１）を用いて、実施例１と同様にして、マウス抗血清と、マウス由来のハイブリドーマから２種類の抗ｃＴｎＩモノクローナル抗体を得た。

［実施例４］実施例３で得られた各抗体の遊離型ｃＴｎＩ及び複合体型ｃＴｎＩとの反応性の評価
実施例３で得られた抗血清及び抗ｃＴｎＩモノクローナル抗体の、遊離型ｃＴｎＩ及び複合体型ｃＴｎＩに対する反応性を実施例２と同様にしてＥＬＩＳＡ法で検定した。結果を図５及び図６に示す。５匹のマウスそれぞれの抗血清はいずれも遊離型ｃＴｎＩには反応したが、複合体型ｃＴｎＩには反応しなかった（図５）。また、マウス由来の抗ｃＴｎＩモノクローナル抗体のいずれも、遊離型ｃＴｎＩには反応したが複合体型ｃＴｎＩには反応しなかった（図６）。すなわち、ｃＴｎＩ（３９−５１）をマウスに免疫すると、ｃＴｎＩ（３５−５５）をマウスに免疫したときと同様に、遊離型ｃＴｎＩに特異的な抗体を効率よく単離できることが明らかとなった。よって、本発明のペプチドの一例としてはｃＴｎＩ（３９−５１）のアミノ酸配列を含むペプチドであればよいことが明らかとなった。

Claims (9)

1. 心筋トロポニンＩの一部のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列からなることを特徴とするペプチド。
2. 配列番号１に記載の心筋トロポニンＩの３９−５１位に相当するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のペプチド。
3. 配列番号２に記載の心筋トロポニンＩの３５−５５位に相当するアミノ酸配列からなる、請求項１又は請求項２に記載のペプチド。
4. 請求項１−３いずれかに記載のペプチドを用いて、ペプチド免疫法を行い、抗心筋トロポニンＩ抗体を作製することを特徴とする、抗心筋トロポニンＩ抗体の製造方法。
5. マウスに免疫して遊離型心筋トロポニンＩ特異抗体を作製する、請求項４に記載の製造方法。
6. ラットに免疫して、遊離型及び複合体型心筋トロポニンＩに反応性を有する抗体を作製する、請求項４に記載の製造方法。
7. 請求項４に記載の製造方法により得られる抗心筋トロポニンＩ抗体。
8. 請求項５に記載の製造方法により得られる遊離型心筋トロポニンＩ特異抗体。
9. 請求項６に記載の製造方法により得られる、遊離型及び複合体型心筋トロポニンＩに反応性を有する抗体。

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