JPH01160493A - モノクローナル抗体及びその使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はオステオカルシン（以下ＯＣと略称する）に対
して特異性を有するモノクローナル抗体及びその使用方
法に関する。

〔従来の技術〕 ＯＣは骨で生産されるビタミンに依存性カルシウム結合
蛋白でるる００Ｃの生理作用は遺骨過程においてＸ要な
役割を担っている。ＯＣの生合成は骨組織、符に骨芽細
胞で行われ、骨代鮒の良好な指標として骨の石灰化、真
新石灰化、骨転移、ベージェット病、原発性副甲状腺機
能先進症、オステオベ：の臨床診断上重要な測定意義を
有する。

この目的のため、　　Ｐ、Ａ、プライスらＣＰ、Ａ。

Ｐｒ１ｃｅらグロシーデイング　オプ　ナショナルアカ
デミ−オプ　サイエンス　オプ　ザＵＳＡ（Ｐｒｏｃ、
　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　）第７７
巻、第２２３４頁（１９８０））によってポリクローナ
ル抗体を用いたラジオイムノアッセイ法が開発され、ヒ
ト血中のＯＣ級度ｔ−測定することが可能となった。ま
た、ポリクローナル抗体を用いるエンザイムイムノアツ
セイ汰も報告されている（　Ｈ，タナ力（Ｈ，Ｔａｎａ
ｋａ　）　　ら、ジャーナルオブ　イムノロジカル　メ
ンツズ（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｔ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　）第９４巻、第１９頁（１９８６））
。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながらこれらの方法はポリクローナル抗体を用い
ているため、感度、精度の面で満足なものでなく改良が
望まれている。

本発明の目的は、ポリクローナル抗体の問題点のない抗
ＯＣモノクローナル抗体及びその使用方ｆｉｔ提供する
ことにるる。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明の第１の発明はＩｇＧクラ
スに属する抗ＯＣモノクローナル抗体に関し、また第２
発Ｅ！ＡはＯＣの測定方法に関する発明でろって、生体
試料中のＯＣの免疫学的測定に際して、上記第１の発明
のＩｇＧクラスに属する抗ＯＣモノクローナル抗体を使
用することを特徴とする。

本発明者らは、前述した問題点を克服するため鋭意研兄
を重ねた結果、細胞融合によりＯＣに対して特異性を有
するＩｇＧクラスに属するモノクローナル抗体を暇得す
ることに成功し、このモノクローナル抗体を用いれは、
ＯＣを高感度で精度よく測定可能であることを見出し、
本発明を完成するに至った。

本発明のモノクローナル抗体は、いわゆる細胞融合法に
よって製造される。すなわち、抗体産生細胞と骨髄腫細
胞との間に、融合ハイプリドーマを形成させ、該ハイプ
リドーマをクローン化し、ＯＣに対し特異性を示す抗体
を産生ずるクローンを選択することによって製造される
。

抗体産生細胞Ｆ′ｉ例えばＯＣによって免疫てれた動物
からの肺細胞、リンパ節細胞３９７７球が使用できる。

免疫させる動物としては、マウス、ラット、馬、ヤギ、
ウサギなどが例示される。

抗原としては動物の骨由来のＯＣが利用可能でるり、例
えば次のようにして製造され、免疫に使用される。ウシ
骨粉末をＥＤＴＡ溶液で抽出し、ＯＤ８カラムを用いた
ＨＰＬＣによりウシＯＣをｆｉｌｎする。かくして得ら
れたウシＯＣは例えばＫ　Ｌ　Ｈ（Ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌ
ｉｍｐｅｔ　Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ　）に代表されるキ
ャリア蛋白と結合後、又はｐｖｐ（ポリビニルピロリド
ン）と混合後、フロイントのアジュバントと混合し、動
物の免疫用として使用する。又はウシｏＣｔ″直接フロ
イントのアジュバントと混合し、動物の免疫用として使
用する。

免疫は動物の皮下、筋肉内あるいは腹腔内に１回に２０
Ｓ２００μ？、　　２〜３週間に１回、６〜７週間投与
することによって行われる。最終免疫エクＦ７３〜５日
後、免疫動物から抗体産生細胞を分散する。

骨髄腫細胞としてはマウス、ラット、ヒト等由来のもの
が使用される。細胞融合は例えばＧ。

ケラ−（Ｇ、　Ｋ６ｈｌｅｒ　）ネーチャー（Ｎａｔｕ
ｒｅ　）第２５６巻、第４９５頁（１９７５）に記載の
方法又はこれに準する方法によって行われる。

この際３０〜５０％ポリエチレングリコール（分子址１
０００〜４０００）を用い、３０〜４０℃の＠度下？Ｆ
Ｊ１〜３分間程度反応させることによって行われる。

細胞融合によって得られたノ１イプリドーマはスクリー
ニングに付される。すなわち、スクリーニングは酵素抗
体法等によって行われる。得られた抗体産生ノ１イブリ
ドーマはクローニングに付される。すなわち、当該ノー
イブリドーマをｆｌＪえば限界希釈法によってクローニ
ングを行ってクローンを得る。得られたクローンは、次
いで目的とするモノクローナル抗体を産生ずるクローン
のスクリーニングに付され、例えば酵素抗体法等によっ
て行われる。選ばれたクローンは、例えばめらかしめプ
リスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデ
カン）を投与したＢＡＬＪ３／Ｃマウスの腹腔内へ移植
し、１０〜１４日後にモノクローナル抗体を高濃度に含
む腹水を採取する。この腹水からのモノクローナル抗体
の回収はＩｇの＃Ｉ製法として従来既昶の硫安分画法、
ポリエチレングリコール分画法、イオン交換クロマトグ
ラフ法、ゲルクロマトグラフ法等を厄用することで容易
に達成される。

かくして得られた抗ｏＣモノクローナル抗体は、生体由
来の試料、例えば血清、血しよう又は尿中のＯＣを特異
的に高感度で精度良く測定するために極めて好適である
。この測定のために、モノクローナル抗体そのもの又は
それからの相応する免疫学的特性を有するフラグメント
、例えばＦａｂフラグメントを使用することができる。

〔実施例〕

以下に実施例を示し、本発明をより具体的にｉ５を明す
るが、本発明はこれら実施例に限定されない。

実施例１　モノクローナル抗体の作製 （１１抗原の精製 ウシ大腿骨を細砕し、０．５　Ｍ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８
ンで骨蛋白を抽出した。抽出懸濁液を遠心分離し、上溝
を凍結乾燥後ＯＤ８カラムを用いたＨＰＬＣでウシＯＣ
を精製した。

（２）　　マウスの免疫 ウシＯＣ’２■とＫＬＨ２■を１−（３−ジメチルアミ
ノプロビル）−３−エチルカルボジイミド２０ｍ９を溶
解させた５　０　ｍＭ　ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７，４）
３づに加え、室温で１晩かくはん佐、１１５ＭＮａＣ４
を含むｌ０ｍＭ　リン酸緩衝＊　（ｐＨ７，４）　　に
対して透析した。透析内ｆｉｋフロイントの完全アジュ
バントト１　：　１　（Ｖ／’Ｖ）の割合でよく混合し
、マウス１匹当りウシＯＣが８０μりとなるように腹腔
内に免疫したＱ初回免疫から１４日後に４０μりのウシ
ＯＣを含む上記混合ｗｆｔ腹腔内投与し、更にその１８
日後、ｒ７シ０ｃ−ＫＬＨコンジュゲート金アジュ／＜
ントと混合せずに腹腔内に最終免疫した。

（３）　　細胞融合及びクローニング 最終免疫の３日後にマウスの肺臓を取出し、その牌細胞
とマウスミエローマＰ５Ｕ１とを１０＝１の割合で混合
し前記ネーチャー記載のケラ−らの方法を用いて細胞融
合を行った。次に、９６ウエルマイクロプレートに植え
込み、ＨＡＴ（ヒボキサンチン＋ｘｌＯ−’Ｍ、アミノ
プテリン４ｘ＋Ｏ−’Ｍ、チミジン１．６　Ｘ　１０−
５　Ｍ　）を含んだＤＭＥＭ−１０％ＦＣ８培地（ＨＡ
’Ｉ’培地ンで培地へ１７日間培養後、ＨＴ（ヒボキサ
ンチン１ｘ＋０−’Ｍ、チミジン１．６　Ｘ　１０″″
Ｓ　Ｍ　）を含んだＤＭＥＭ−１０％ＦＣ８培地（ＨＴ
培地）に移行し、更にフラスコ（２５ｔＩＬｔ）に培養
できるようになってからＤＭＥＭ−１０％ＦＣ８培地で
培養した。増殖の見られたウェルの培養上清中の抗体価
を酵素抗体法により測足し、適切なウェルから限界希釈
法により、求めるノ−イブリドーマのクローニングを行
った。すなわち、マイクロプレートにウェル当り約２．
５ｘｌＯ’個のマウス胸腺細胞ｔＭ見込み、次にＤＭＥ
Ｍ培地で５．１、α５個／（ＬｌｄＫなるようにハイプ
リドーマを希釈し、これを上記マイクロプレートにαｔ
　ｗｔ　／ウェルずり植え込み培養した。培養開始後１
０〜１４日で肉眼で認められるコロニーが形成され、ク
ローン株を得た。

（４）　　スクリーニング法 ハイプリドーマ及びクローンが増殖したウェルの培養上
清を分取し、エンザイム　リンクドイムノフルベント　
アッセイ（Ｅｎｚｙｍｅ　ＬｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏｓ
ｏｒｂｅｎｔ　Ａｓ５ａｙ　）　（ＫＬ　Ｉ　ＳＡ　）
法によりウシＯＣに対する抗体産生ハイプリドーマ及び
クローンを調べた。マイクロタイタープレートにウシＯ
Ｃをα５μ２１５０μｔ／ウエルとなるように分注し、
４Ｃで１８時間静置してウシＯＣを面相に吸着させた。

１０　ｍＭ　ＩＪン＃ｌ緩衝食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ　）　
（ｐＨ７，４）　　２００μｔで３回洗浄したｖ！に１
１％ウシ血清アルブミン（ＢＡＡ）を含むＰＢＳ　Ｉ　
ＯＯμｔ／ウェルを加え、３７℃で１・時間静置し、谷
ウェルの未吸着部分をブロックした。次いで、検体であ
る培養欣ｔ１″５０μｔ／ウェル加え３７℃で１時間反
応させた。

ｌ１０５％ツイーン（Ｔｗａｅｎ　）　−２０を含むＰ
ＢＳで３回洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識抗マウス
ＩｇＧ　（Ｉ　ＣＮ社製）を５０μｔ／ウエル添加し、
３７℃で１時間反応させた。ツイーン−２０含有ＰＢ８
で洗浄し、１１００１％過酸化水素、（Ｌ　５５１ｎ９
／　ｄ　ＡＢＴＳ　Ｃ２，２’−アジノージ（３−エチ
ルベンゾチアゾリン−スルホネート）］ペーリンガーマ
ンハイム社製〕を含むαＩＭクエン酸−水醒化ナトリウ
ム暖＠液（ｐＨ４，０）を加え、波長４１０　ｎｍでの
吸元度全−１１足した。

検体中、ウシＯＣに対する抗体が存在したウェルのみ発
色がみられた。

この結果、抗体産生能の高いクローン株ＯＣ−Ｇ１％Ｏ
Ｃ−Ｇ２及びＯＣ−Ｇ３が得られた。

前記クローン株は、谷々ＨｙｂｒｉｄＯｍａ　ＯＣ−Ｇ
　＋と表示し微工研菌寄第９６９６号（ＦＥＢＭ　Ｐ−
９６９６）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　ＯＣ−Ｇ　２と表示
し微工研菌寄第９７３２号（ＦＥＢＭ　Ｐ−９７５２）
、ＨｙｂｒｉｄＯｍａ　ＯＣ−Ｇ　５と表示し微工研菌
寄第９６９７号（ＦＥＢＭ　Ｐ−９６９７）として、工
業技術院微生物工業技術研究所にＷ託されている。

（５）　　モノクローナル抗体の作製 ７週令以上のＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　Ｃ糸マウスに１リス
タン（アルドリッチ社製）α５−を腹腔内に投与し、１
週間以上経過した後、培養、増殖させたクローン株１〜
９ｘｌＯ”個／マウスを腹腔内接柚した。１０〜１４日
後にマウスを殺し、腹水を採取した。これｆ　５．００
０　ｒｐｍ　１０分間遠心分離し、５〜１５−７匹のモ
ノクローナル抗体含有腹水を得た。

（６）　モノクローナル抗体の精製 上記（５１によって得られた腹水を脱脂綿でｒ過して脂
肪を除き、５０ｍＭ　リン酸緩衝ｇ（ｐＨ７，３）で２
倍希釈した後、等量の飽和硫酸アンモニウムを加え、沈
殿画分を分取した。この両分をなるべく少鼠の上記リン
ば緩衝液に溶解させ、同じ緩衝液に対して透析した。こ
のサンプル’１ＤＥＡＥ−セルロースカラムにかけ、り
ｏ−ン株０Ｃ−（）ｊ、０Ｃ−０２及び０Ｃ−０５から
各々抗つシＯＣモノクローナル抗体０Ｃ−０１％０Ｃ−
０２及び０Ｃ−０５を得た。

（７）　　モノクローナル抗体の物理化学的性質■　工
ｇ　サブクラス　　０Ｃ−Ｇｌ　：　Ｉｇ’ＧＩＯＣ−
（）２　：　ＩｇＧ２ ＯＣ−（）３　：　ＩｇＧ３ １／１５　Ｍ　ＩＪ　／［！衝食塩水（ｐＨ７，２）Ｉ
ｃアガロースを１％加え、煮沸後スライドグラスに５ゴ
のせ、固化した。直径２−５ｍの穴を５−間隔で開け、
容入に腹水より精製したモノクローナル抗体又はウサギ
で作成した谷柚マウスエｇサブクラスに対する抗血清を
５μを入れた。スライドグラスを湿潤箱に入れ、室温で
１８時間静置し、七ツクローナル抗体と抗マウスＩｇサ
ブクラス血清を入れた２穴間に生じた抗原抗体反応によ
る沈降線の形成を観察した。

■　分子量　　ＯＣ−Ｃ）ｌ　：　１４５，０００ＯＣ
−Ｇ２　　：　　１４５，０００ ＯＣ−Ｇ５　　：　　１４＜Ｓ、０００ＳＤ８−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（１２，５％）でモノクロー
ナル抗体の分子量を推定した。両抗体はＩｇＧであるこ
とから、Ｈ鎖とし鎖の分子量の合計の２倍をモノクロー
ナル抗体の分子量とした。分子量マーカーはバイオ−ラ
ド（Ｂｉｏ　−Ｒａａ　）社の８ＤＳ−ＰＡＧＥ分子量
スタンダード−Ｌｏｗ　（リゾチーム１４．４に、ダイ
ズトリブシンインヒビター２１．５に、カルボニックア
ンバイトラーゼ３１に１オボアルブミン４５に％ウシ血
清アルブミン６＆２に、ホスホリラーゼＢ９２．５ｋ）
を用いた。

■　等電点　　ＯＣ−Ｇｌ　：　７．７〜１５ＯＣ−Ｇ
２　：　７．２〜＆９ ＯＣ−Ｇ５　：　ａ９〜ａ７ 精製モノクローナル抗体の等′亀点蒐気泳勧を行ったと
ころ、上記のｐ工に相当するノ（ンドが認められた。

■　抗原との結合部位 ウシ０ｃｔ−トリジン／（シグマ社製〕とスタフィロコ
ッカス　アウレウス（８ｔａｐｈｙｌｏ−ｃｏｃｃｕａ
　ａｕｒｅｕｓ　）　Ｖ　８グロテアーゼ（シグマ社製
）で消化し、フラグメントに断片化した。

各消化物はＣＩ８逆相ＨＰＬＣによ部分画し、ｂ　Ｎ　
ＨＣ１中１３０℃で３時間喰加水分％Ｓを行った後、ア
ミノ酸組成分析を実施し、フラグメントの同定を行った
。その結果を表１に示す。トリプシン消化物からは、Ｔ
１（１−１９）、Ｔ２（２１−ａｓ）、’ｒ、５（４５
−４９）、スタフィロコッカス　アウレウス　ｖ８プロ
テアーゼ消化物からはＶ＋（８−３１）、Ｖ２（３２，
−４０）、Ｖ３（４１−４５）、Ｖ４（４６−４９）が
得られた。

谷分画は、次に示す方法によって、モノクローナル抗体
の抗原への結合部位の検索に使用した。

まず、゛９６ウエルマイクロタイタープレートの各ウェ
ルにウシＯＣ’ｉ５μｆ１５０μｔ／ウェルとなるよう
に分注し、４℃で１８時間静置して、固相に吸着させた
。次にリン鍍緩衝食塩水（ＰＢＳ）２５０　μｔで３回
洗浄した後、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む
ＰＢＳ　Ｉ　ＯＯμｔ／ウェルを加え、４℃で１８時間
静置し、谷ウェルの未吸着部分をブロックした。ＰＢＳ
２５０７Ｊｔで３回洗浄した後、サンプル５０μｔを添
加した。サンプルは、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｈ
ＲＰ）標識モノクローナル抗体と、Ｔｌ〜Ｔ３．Ｖ１〜
ｖ４をそれぞれ４℃で２００時間反応せたものを用いた
。３７℃で２時間反応させたｉ、ＰＢＳ２５０ａｔで４
回洗浄し、１００１％過酸化水素、α５５ダ／ｍＡＢＴ
ｓを含むα１Ｍクエンば一水酸化ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ４，０）を加え、波長４１０　ｎｍでの吸ｆｔ、度を
測定した。その結果、表２に示すように。

ＨＲＰ＠識モノクローナル抗体とフラグメントが結合し
ているために発色の低くなるフラグメントが存在するこ
とが示された。すなわちＯＣ−ＧｌはＴ３（４５−４９
）、Ｖ４（４６−４９）と結合し、ＯＣ−Ｇ２はＴ５（
４５−４９）と結合し、ＯＣ−０３は’ｌ’２（２１−
４５）、Ｍｌ（８−３１）と結合することより、ＯＣ−
Ｇｌの結合部位は４６−４９、ＯＣ−０２の結合部位は
４５−４９、ＯＣ−Ｇ！ｌの結合部位ｔｉ２１−５１で
あると決定した。

表　２ ＯＣ−ＧＩ　　ＣＬ４２５１．０７０１．０４２　［１
５４４ｃＬ５３２　［Ｌ５３７　（１３９６［Ｌ２２８
ＯＣ−Ｇ２　　［Ｌ４２４　ＣＬ３５０α４２１　［１
０９１ＯＣ−Ｇ３　　α３７５α２７５α１４８　ＣＬ
３６４　（Ｌｉ２Ｏ１１２５１（Ｌ３９６　［Ｌ４４２
実施例２モノクローナル抗体を用いたサンドイッチｆＥ
、Ｅｒ−ＡによるＯＣの定量 実施例１で得たモノクローナル抗体ＯＣ−Ｇ２、ＯＣ−
０３を用いてＯＣ測足試薬を調装した。

（１１西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識モノ
クローナル抗体の作製 ニューヨーク市、アラン　Ｒリス　インコーホレーテッ
ド（Ａｌａｎ　ＲＬｉ５ｅ　Ｉｎｃ、　）　＋　９７９
年発行、Ｐ、に、ナカネ（Ｐ、に、　Ｎａｋａｎｅ　）
著［イムノアツセイス　イン　ザ　クリニカル　ラボラ
ド　リ　−　Ｊ　　（Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ　　ｉ
ｎ　　ｔｈｅ　　Ｃ１１ｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ　）　　第８１頁に記載の方法に準じて行った。ＨＲ
Ｐ（ペーリンガーマンノ・イム社製）４■′ｊ＆：１−
の蒸留水に溶かし、１１Ｍ過ヨウ素咳ンーダα２ｍを加
えて室温で２０分間反応させた後、１　ｍＭ　＃酸ンー
ダｌｉｍｂ（ｐＨ４）に対して１晩透析する。１２Ｍ炭
酸ソーダ緩衝液（ｐＨ９，５）　　α０２ｗｔ’ｉ加え
てｐＨ９〜９．５にすると同時にモノクローナル抗体Ｏ
Ｃ−０５８〜／−〔１０１Ｍ炭酸ソーダ緩衝液（ｐＨ９
，５）に対して透析したもの〕を加える。室温で２時間
反応させた後、水素化ホウ素ノーダ４ｒｎ９／−１ｌｌ
−加えて４℃で２時間反応させる。これをセファデック
ス（８ｅｐｈａｄｅｚ　）　Ｇ、−１００カラムでゲル
ｆ過し、［１１Ｍ　ＮａＣ１を含む（Ｌ　Ｉ　Ｍ　ＩＪ
ン葭ナトリウム緩＠ｇｐＨ７，５で溶出させ、ＨＲＰ標
識ＯＣ−Ｇ５モノクローナル抗体を分覗した。

（２）　サンドイッチ法ＥＩＡ測定系 ９６ウエル　マイクロタイタープレートの各ウェルにＰ
Ｂ８４Ｃ溶解したモノクローナル抗体ＯＣ−０２（５０
μｆ／−）を５０　μｔ　ずつ添刀口し、４℃で１晩イ
ンキユベートし、浴液を捨てた後、１％ＢＡＡを含むＰ
ＢＳ浴准を１００μｔずつ谷ウェルに添加し、３７℃で
１時間ブロッキングを行った。ＰＢＳでよく洗浄したの
ち、サンプル５０μｔを添加して３７℃で１時間反応で
せ、ＰＢＳで３回洗浄し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで希
釈したＨＲＰ標識ＯＣ−（）３モノクロ一ナル抗体液５
０μｔを添加して３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳで
３回洗浄したのち、（ＬＯ（Ｍ％過酸化水素、α５５　
■／ｄＡＢＴｓ　ｉ含むαＩＭクエン酸−水酸化ナトリ
ウム援衝孜（ｐＨ４，０）　　をカロえ、波長４１０　
　ｎｍでの吸光度を測定した。

（３）　　測定系の感度 谷橿＠度のウシＯＣ（α０５〜１０　ｎｌＦ／＋＋＋／
）を用いて作製した検量線ｔ−第１図に示す。すなわち
第１図は、本発明のモノクローナル抗体を用いたサンド
イッチ２　Ｅ　Ｉ　Ａ　ＶＣよるＯＣ測定の感度と精度
を、ウシＯＣ濃度（ｎｆ／ｄ、横軸〕と４１　’ｄｎｍ
における吸光度（縦軸）との関係で示す図でめる。

第１図に示す結果から、本発明の測定方法を用いれば、
　　［１１ｎ９／−まで精度良く測定可能であることが
明らかである。

〔発明の効果〕

以上詳細に説明した通り、本発明にエフＯＣに対するモ
ノクローナル抗体が提供された。本発明のモノクローナ
ル抗体を利用することにより、精度及び感度の高いＯＣ
Ｏ彼址定斂が可能となり、ＯＣの生理作用の研究、骨代
謝におけるＯＣの役割の解明などに非常に有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のモノクローナル抗体ｔ−用いたサンド
インチ法ＥＩＡによるＯＣ測定の感度と精度を示す図で
める０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ＩｇＧクラスに属する抗オステオカルシンモノクロ
   ーナル抗体。 ２、該抗オステオカルシンモノクローナル抗体が、下記
   の性質を有するＯＣ−Ｇ１である特許請求の範囲第１項
   記載のモノクローナル抗体。 （ａ）分子量：１４５，０００ （ｂ）Ｉｇクラス：ＩｇＧ１ （ｃ）等電点：７．７〜７．３ （ｄ）反応性：少なくともウシ・オステオカルシンに対
   して反応性を示す （ｅ）抗原との結合部位：オステオカルシンのＣ末端ア
   ミノ酸配列【遺伝子配列があります。】の少なくとも１
   アミノ酸以上を含むペプチドを 認識する ３、該抗オステオカルシンモノクローナル抗体が、下記
   の性質を有するＯＣ−Ｇ２である特許請求の範囲第１項
   記載のモノクローナル抗体。 （ａ）分子量：１４５，０００ （ｂ）Ｉｇクラス：ＩｇＧ２ （ｃ）等電点：７．２〜６．９ （ｄ）反応性：少なくともウシ・オステオカルシンに対
   して反応性を示す （ｅ）抗原との結合部位：オステオカルシンのＣ末端ア
   ミノ酸配列【遺伝子配列があります。】の少なくとも１
   アミノ酸以上を含むペプチ ドを認識する ４、該抗オステオカルシンモノクローナル抗体が、下記
   の性質を有するＯＣ−Ｇ３である特許請求の範囲第１項
   記載のモノクローナル抗体。 （ａ）分子量：１４６，０００ （ｂ）Ｉｇクラス：ＩｇＧ３ （ｃ）等電点：８．９〜８．７ （ｄ）反応性：少なくともウシ・オステオカルシンに対
   して反応性を示す （ｅ）抗原との結合部位：オステオカルシンのＣ末端ア
   ミノ酸配列 【遺伝子配列があります。】 （式中Ｇｌａはγ−カルボキシグルタミン酸を示す）の
   少なくとも１アミノ酸以上を含むペプチドを認識する ５、生体試料中のオステオカルシンの免疫学的測定に際
   して、ＩｇＧクラスに属する抗オステオカルシンモノク
   ローナル抗体を使用することを特徴とするオステオカル
   シンの測定方法。