DE3842498A1 - Verfahren zur erkennung von krankheiten und hierfuer verwendbare monoklonale antikoerper - Google Patents

Description

Vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erkennung von Krankheiten, die mit einer Stoffwechselstörung von Osteocalcin (im folgenden mit "OC" abgekürzt) wie Human-Cerebralarteriosklerose und Human-Herzinsuffizienz, einhergehen, und sie betrifft monoklonale Antikörper, die für diese Krankheitserkennung verwendbar sind.

OC ist ein Vitamin K-abhängiges, Calcium-bindendes Protein, das in Knochen erzeugt wird, und seine physiologische Funktion spielt eine wichtige Rolle in der Osteogenese. Die Biosynthese von OC erfolgt in Knochengeweben, insbesondere in Osteoblasten, und sie bietet daher eine wichtige Markiermöglichkeit in der klinischen Diagnose von Calcifikation von Knochen, Knochenmetastase und ähnlichen Krankheiten. Es ist bekannt, daß die Menge an OC im Blut in an diesen Krankheiten leidenden Patienten einen hohen Wert zeigt.

Ein Radioimmunoassay unter Verwendung polyklonaler Antikörper wurde von P. A. Price et al. [Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 77, 2234 (1980)] entwickelt zur Messung der OC-Konzentration in menschlichem Blut. Über einen Enzym-Immunoassay unter Verwendung polyklonaler Antikörper für den gleichen Zweck wurde ebenfalls berichtet [H. Tanaka et al.: J. Immunol. Methods, 94, (1986)].

Diese Methoden, bei denen polyklonale Antikörper zur Anwendung gelangen, erweisen sich jedoch als nicht befriedigend im Bezug auf Empfindlichkeit und Genauigkeit und es besteht daher ein Bedürfnis nach einem neuen Verfahren, das sich durch verbesserte Empfindlichkeit und Genauigkeit auszeichnet.

Es gibt keinen Bericht über den Einfluß des OC-Spiegels im Blut auf spezifische Erkrankungen in Patienten, die an anderen Krankheiten leiden als an den oben genannten, die mit dem Knochenstoffwechsel zu tun haben.

Ausgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Erkennung von spezifischen Krankheiten, die mit OC-Stoffwechselstörungen einhergehen, anzugeben unter Verwendung der Menge an OC als Markierungsmittel, sowie anti-OC-monoklonale Antikörper zu schaffen, die frei von den mit polyklonalen Antikörpern einhergehenden Problemen sind, und ein Verfahren zu deren Anwendung anzugeben.

Vorliegende Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Erkennung von Krankheiten, die mit einer OC-Stoffwechselstörung einhergehen, bei dem die Menge an OC in einer einem lebenden Körper entnommenen Probe gemessen und der gemessene Wert mit dem Normalwert verglichen wird.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum Messen der Menge an OC in einer einem lebenden Körper entnommenen Probe mit Hilfe eines Immunoassays, bei dem anti-OC-monoklonale Antikörper der IgG-Klasse zur Anwendung gelangen, und sie betrifft diese anti-OC-monoklonale Antikörper der IgG-Klasse.

Als Ergebnis intensiver Studien ist es gelungen, nach der Zellfusionstechnik anti-OC-monoklonale Antikörper der IgG-Klasse, die auf OC spezifisch sind, zu erzeugen, und es wurde gefunden, daß die Menge an OC mit hoher Empfindlichkeit und Genauigkeit durch Verwendung der auf diese Weise erhaltenen monoklonalen anti-OC-Antikörper gemessen werden kann.

Ferner haben Untersuchungen über die Abhängigkeit zwischen Erkrankungen und der Menge an unter Verwendung solcher monoklonaler Antikörper gemessenen OC ergeben, daß ein beträchtlicher Anstieg der Menge an OC in speziellen Krankheiten festzustellen ist. Vorliegende Erfindung wurde auf der Basis dieser Befunde geschaffen.

Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper werden nach der sogenannten Zellfusionstechnik hergestellt durch Bildung von Hybridomen aus Antikörper-erzeugenden Zellen und Myelomzellen, durch Klonen dieser Hybridome und durch Auswahl klonierter Zellen, die zur Erzeugung von gegen OC spezifischen Antikörpern befähigt sind. Als Antikörper-erzeugende Zellen können z. B. Milzzellen und B-Lymphocyten verwendet werden, die Tieren, die durch OC immunisiert sind, entnommen wurden. Maus, Ratte, Pferd, Ziege und Kaninchen können als Beispiele für zu immunisierende Tiere genannt werden. Als das Antigen zur Immunisierung ist aus Tierknochen stammendes OC verwendbar, das z. B. erhalten wird durch Extraktion von Rinderknochenpulver mit einer wäßrigen Lösung von EDTA und Reinigung des Extrakts durch HPLC unter Verwendung einer ODS-Säule. Das auf diese Weise erhaltene Rinder-OC wird mit einem Trägerprotein, z. B. KLH (Keyhole limpet Hemocyanin) kombiniert oder mit PVP (Polyvinylpyrrolidon) vermischt, danach mit Freund′s-Adjuvans gemischt und zur Immunisierung verwendet. Wahlweise wird das Rinder-OC direkt mit Freund′s-Adjuvans gemischt und zur Tierimmunisierung verwendet.

Die Immunisierung wird durch subkutane, intramuskuläre oder intraperetoneale Verabreichung von 20 bis 200 µg OC einmal alle zwei bis drei Wochen über einen Zeitraum von drei bis sieben Wochen bewirkt. Antikörper-produzierende Zellen werden aus dem immunisierten Tier etwa drei bis fünf Tage nach der letzten Immunisierung fraktioniert.

Bei den verwendeten Myelomzellen handelt es sich um solche, die aus der Maus, der Ratte oder von Menschen stammen. Zellfusion wird z. B. nach der Methode von G. Köhler [Nature, 256, 495 (1975)] bewirkt oder nach einer dieser sehr ähnlichen Methode, bei der die Reaktion bei 30 bis 40°C während etwa 1 bis 3 Minuten in Gegenwart von 30 bis 50% Polyethylenglykol (Molekulargewicht 1000 bis 4000) durchgeführt wird.

Die erhaltenen Hydridome werden einem Screening nach der Enzym-Antikörpermethode oder dergleichen unterworfen, und die auf diese Weise selektierten Antikörper-produzierenden Hydridome werden sodann geklont, z. B. nach der limitierenden Verdünnungsmethode. Die auf diese Weise erhaltenen geklonten Zellen werden erneut einem Screening nach dem zur Erzeugung des angestrebten monoklonalen Antikörpern befähigten Klon unterworfen, z. B. nach der Enzym-Antikörpermethode. Der auf diese Weise selektierte Klon wird intraperetoneal einer BALB/C-Maus, der zuvor Pristan (2,6,10,14-Tetramethylpentadecan) verabreicht worden war, transplantiert, und der Ascites der die monoklonalen Antikörper in einer hohen Konzentration enthält, wird nach 10 bis 14 Tagen entnommen. Die monoklonalen Antikörper können aus diesem Ascites leicht isoliert werden durch Reinigungstechniken, die für Immunoglobuline üblicher Weise angewandt werden (z. B. Ammoniumsulfat-Fraktionierung, Polyethlenglykol- Fraktionierung, Ionenaustausch-Chromatographie und Gel- Chromatographie).

Die auf diese Weise erhaltenen anti-OC-monoklonalen Antikörper sind hochgradig geeignet zur spezifischen Messung der Menge an OC in Serum, Plasma oder Urin bei hoher Empfindlichkeit und Genauigkeit. Für diesen Zweck können monoklonale Antikörper als solche oder Fragmente derselben, welche die entsprechenden immunologischen Charakteristika aufweisen (z. B. Fab-Fragmente) eingesetzt werden.

Mit Krankheiten, die von OC-Stoffwechselstörungen begleitet werden, sind hier solche gemeint, die mit Störungen von Calcium-Stoffwechsel und Calciumausfällung in Organen oder Geweben lebender Körper einhergehen. Als Beispiele können genannt werden Cerebralarteriosklerose, Cerebralinfarkt, Cerebralhämorrhagie, Herzinsuffizienz, Myocardinfarkt, Angina pectoris, Lebercirrhose, chronische Hepatitis, Rheumatismus, Parkinson'sche Krankheit, Magengeschwür, Diabetes mellitus, Niereninsuffizienz und Katarakt.

Es wurde gefunden, daß Proben, die Patienten, welche an diesen Krankheiten leiden, entnommen wurden, eine größere Menge an OC enthalten als die normalen Personen entnommenen Proben, und es wurde gezeigt, daß die Menge an OC als Markierungsmittel für die Erkennung von Krankheiten, die von OC-Stoffwechselstörungen begleitet sind, dienen kann.

Als Beispiele für Testproben, die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendbar sind, können verschiedene Gewebe, verschiedene Typen von Körperflüssigkeit, Urin und Fäzes genannt werden.

Jede bekannte Methode kann zur OC-Messung herangezogen werden, doch ist der Immunoassay am besten geeignet im Hinblick auf Genauigkeit und Einfachheit.

Der zur OC-Messung verwendete Immunoassay kann in zwei Typen unterteilt werden: derjeinge, bei dem polyklonale OC-Antikörper und derjenige, bei dem monoklonale OC-Antikörper zum Einsatz gelangen.

Der erstgenannte Typ umfaßt den Radioimmunoassay, über den von P. A. Price et al. [Proc. Nat. Acad. Sci, USA, 77, 2234 (1980)] berichtet wird, und den Enzym-Immunoassay, der von H. Tanaka et al. [J. Immunol. Methods, 94, 19 (1986)] beschrieben wird, während der letztgenannte Typ die in Beispiel 1 vorliegende Erfindung beschriebene Sandwich-Methode einschließt, bei der ein durch ein Hybridom (FERM BP-2077) erzeugter monoklonaler Antikörper OC-G2 oder ein durch ein Hybridom (FERM BP-2078) erzeugter monoklonaler Antikörper OC-G3 zum Einsatz gelangt.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

In der beigefügten Zeichnung zeigt

Fig. 1 die Empfindlichkeit und Genauigkeit der OC-Messung nach der Sandwich-Immunoassaymethode unter Verwendung erfindungsgemäßer monoklonaler Antikörper und

Fig. 2 eine graphische Darstellung, in der die nach dem erfindungs­ gemäßen Verfahren gemessene Menge an OC im Serum für verschiedene Typen von Erkrankungen aufgetragen ist.

Beispiel 1 (Herstellung von monoklonalen Antikörpern) (1) Reinigung von Antigen

Ein Stück Rinderfemur wurde fein pulverisiert, das erhaltene Pulver wurde mit 0,5M wäßriger Lösung von EDTA (pH 8) behandelt zur Extraktion des vorhandenen Knochenproteins, die Extraktsuspension wurde zentrifugiert, der Überstand wurde lyophilisiert, und das auf diese Weise erhaltene Pulver wurde einer HPLC unterworfen unter Verwendung einer ODS-Säule unter Erzielung von gereinigtem Rinder-OC.

(2) Immunisierung von Mäusen

Zu 3 ml einer 50-mM-Phosphatpufferlösung, die 20 mg darin gelöstes 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethyl-carbodiimid enthielt (pH 7,4), wurden 2 mg Rinder-OC und 2 mg KLH zugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und gegen 10-mM-Phosphatpufferlösung, die 0,15M Natriumchlorid enthielt (pH 7,4) dialysier. Die Dialysatlösung wurde gut mit Freund′s kompletten Adjuvans im Verhältnis von 1 : 1 (V/V) vermischt und das Gemisch wurde intraperetoneal Mäusen verabreicht in einer Menge von 80 µg Rinder-OC pro Kopf. 14 Tage nach dieser ersten Immunisierung wurde das obige Gemisch erneut in einer Menge von 40 µg Rinder-OC intraperetoneal verabreicht und Rinder-OC/KLH-Konjugat (das kein Adjuvans enthielt) wurde schließlich 18 Tage später als die letzte Immunisierung intraperetoneal verabreicht.

(3) Zellfusion und Klonen

Die Milz wurde jeder Maus 3 Tage nach der letzten Immunisierung entnommen, die auf diese Weise erhaltenen Milzzellen wurdem mit Maus-Myelom P3U1-Zellen in einem Verhältnis von 10 : 1 vermischt, und die Zellfusion wurde nach der oben genannten Methode von Köhler et al., über die in Nature berichtet wird, durchgeführt. Die auf diese Weise erhaltenen Hybridome wurden auf eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen eingeimpft, in DMEM-10% FCS-Medium mit einem Gehalt an HAT (1×10^-4 M-Hypoxanthein, 4×10^-7 M-Aminopterin und 1,6×10^-5 M-Thymidin) - HAT-Medium - 10 bis 17 Tage lang inkubiert, und in ein DMEM-10% FCS-Medium mit einem Gehalt an HT (1×10^-4 M-Hypoxanthin und 1,6×10⁵ M-Thymidin) - HT-Medium - überführt und inkubiert, bis eine Kultivierung in einer Flasche (25 ml) möglich war. Die Kultivierung wurde sodann in DMEM-10% FCS-Medium fortgesetzt, die Vertiefungen, in denen Zellwachstum festgestellt wurde, wurden selektiert, der Antikörpergehalt an Kulturüberstand wurde für die selektierten Vertiefungen nach der Enzym-Anti­ körpermethode gemessen zur Auswahl erwünschter Vertiefungen, und das Klonen entsprechender Hybridome wurde nach der Limitierungs-Verdünnungsmethode wie unten beschrieben, durchgeführt. Mausthymozyten wurden auf einer Mikrotiterplatte eingeimpft (etwa 2,5×10⁴ Zellen/Vertiefung), Hybridome wurden in DMEM-Medium auf Konzentrationen von 5, 1 und 0,5 Zellen pro 0,1 ml verdünnt und jede dieser Verdünnungen wurde auf die obige Mikrotiterplatte (0,1 ml/Vertiefung) eingeimpft und inkubiert. Visuell feststellbare Kolonien wurden 10 bis 14 Tage später gebildet und ergaben geklonte Stämme.

(4) Screening

Der Kulturüberstand wurde aus den Vertiefungen, in denen Wachstum von Hybridomen und Klonen zu beobachten war, gesammelt und auf Klone und Hybridome getestet, die zur Erzeugung von Rinder-OC nach dem Enzym-gekoppelten Immuno­ sorbentassay (ELISA) befähigt sind, wie dies unten beschrieben wird. Rinder-OC wurde auf einer Mikrotiterplatte verteilt (0,5 µg/50µl/Vertiefung), an der Feststoffphase adsorbiert durch Stehenlassen bei 4°C während 18 Stunden, und dreimal mit 200 µl einer 10mM-Phosphat-gepufferten Salzlösung (PBS; pH 7,4) gewaschen: PBS, das 1% Rinderserumalbumin (BSA) enthielt, wurde sodann zugegeben (100 µl/Vertiefung), das Gemisch wurde bei 37°C 1 Stunde lang stehengelassen zur Blockierung des nicht-adsorbierten Anteils, eine Kulturlösung (Testprobe) wurde zugegeben (50 µl/Vertiefung), und die Reaktion wurde bei 37°C 1 Stunde lang durchgeführt. Nach dreimaligem Waschen mit PBS, das 0,05% Tween-20 enthielt, wurde Peroxidase-markiertes Antimaus- IgG (ICN Inc.) zugegeben (50 µl/Vertiefung), und die Reaktion wurde bei 37°C 1 Stunde lang fortgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde dreimal mit PBS, das Tween-20 enthielt, gewaschen, 0,1M-Citratpuffer (pH 4,0), der 0,001% Wasserstoffperoxid enthielt, und 0,55 mg/ml ABTS [2,2′- Azino-di-(3-ethylbenzthiazolinsulfonat)] (Handelsprodukt der Behringer Mannheim Co.) wurde zugesetzt und das Absorptionsvermögen bei 410 nm wurde gemessen. Farbentwicklung wurde nur mit den Vertiefungen beobachtet, die einen Antikörper gegen Rinder-OC enthielten.

Geklonte Stämme mit hoher Antikörperproduktivität, OC-G2 und OC-G3, wurden auf diese Weise erhalten.

Diese geklonten Stämme wurden beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology unter den Hinterlegungsnummern FERM BP-2077 (Hybridom OC-G2) bzw. FERM BP-2078 (Hybridom OC-G3) hinterlegt.

(5) Herstellung von monoklonalen Antikörpern

Pristan (Handelsprodukt der Aldrich Co.) wurde intraperetoneal an BALB/C-Mäuse eines Alters von 7 Wochen oder mehr verabreicht (0,5 ml/Kopf), ein separat gezüchteter geklonter Stamm wurde sodann intraperetoneal nach mehr als einer Woche eingeimpft (1 bis 9×10⁸ Zellen/Kopf), und die Mäuse wurden 10 bis 14 Tage später getötet zur Ascites-Entnahme. Zentrifugation bei 3000 Upm während 10 Minuten ergab Ascites mit einem Gehalt an dem entsprechenden monoklonalen Antikörper (5 bis 15 ml/Kopf).

(6) Reinigung der monoklonalen Antikörper

Der wie angegeben erhaltene Ascites wurde durch absorbierendes Leinen filtriert zur Entfernung von darin enthaltenen Fettsubstanzen, das Filtrat wurde mit 50-mM-Phosphatpuffer (pH 7,3) 1 : 1 verdünnt, die gleiche Menge gesättigte Lösung an Ammoniumsulfat wurde zugegeben, und der ausgefällte Niederschlag wurde gesammelt. Er wurde gelöst im gleichen Typ Phosphatpuffer wie oben verwendet (in der kleinst-möglichen Menge), die erhaltene Lösung wurde gegen den gleichen Typ Phosphatpuffer dialysiert und das Dialysat wurde in einer DEAE-Zellulosesäule behandelt unter Erzielung von reinem monoklonalem Antikörper gegen Rinder-OC (Antikörper OC-G2 aus Hybridom OC-G2 und Antikörper OC-G3 aus Hybridom OC-G3).

(7) Physicochemische Eigenschaften von monoklonalen Anti­ körpern (a) Ig-Unterklasse OC-G2: IgG1/OC-G3: IgG3

Agarose (1%ig) wurde zu Phosphat (1/15M)-gepufferter Salzlösung (pH 7,2) zugegeben, das Gemisch wurde zum Sieden erhitzt und 5 ml der erhaltenen Lösung auf einem Objektträger aufgestrichen und verfestigt. Löcher von 2,5 mm Durchmesser wurden in dem verfestigten Überzug in 5 mm-Abständen erzeugt und mit den wie oben beschrieben gewonnenen gereinigten monoklonalen Antikörpern und Antiserum für verschiedene Typen von Maus-Ig-Unterklassen (jeweils 5 µl) gefüllt. Die Objektträger wurden in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur 18 Stunden lang stehengelassen und die zwischen zwei benachbarten Löchern, die monoklonalen Antikörper bzw. Antiserum enthielten, gebildeten Präzipitationsbanden wurden bestimmt.

(b) Molekulargewicht OC-G2: 145 000/OC-G3: 146 000

Das Molekulargewicht jedes monoklonalen Antikörpers wurde durch Elektrophorese an SDS-Polyacrylamidgel (12,5%) bestimmt. Da die beiden Antikörper zur IgG-Unterklasse gehören, wurde die doppelte Menge des gesamten H-Ketten- und L-Ketten-Molekulargewichts als das Antikörper-Molekulargewicht angenommen. Als Molekulargewichtsmarkierungsmittel wurde Bio-rad′s SDS-PAGE Molecular Weight Standard Low [Lysozym (14,4 K), Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor (21,5 K), Carbonanhydrase (31 K), Ovalbumin (45 K), Rinderserum­ albumin (66,2 K) und Phosphorylase B (92,5 K)] verwendet.

(c) Isoelektrischer Punkt OC-G2: 7,2 bis 6,9/OC-G3: 8,9 bis 8,7

Die Elektrofokussierung der gereinigten monoklonalen Antikörper zeigte Banden, die den obigen isoelektrischen Punkten entsprachen.

(d) Bindungsstellen am Antigen

Rinder-OC wurde in Fragmente abgebaut durch Trypsin und durch Staphylococcus aureus V8-Protease (beides Handelsprodukte der Sigma Co.), jede der erhaltenen Abbaumedien wurde fraktioniert durch C18-Reversphasen-HPLC, und jedes Fragment wurde durch Hydrolyse in 6N-HCl bei 130°C während 3 Stunden identifiziert, gefolgt von einer Aminosäureanalyse. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 wiedergegeben.

Tabelle 1

Wie ersichtlich, wurden Fragmente T1 (1 bis 19), T2 (21 bis 43) und T3 (45 bis 49) aus dem Trypsinabbau erhalten, während Fragmente V1 (8 bis 31), V2 (32 bis 40), V3 (41 bis 45) und V4 (46 bis 49) aus dem Abbau mit St. aureus V8-Protease erhalten wurden. Diese Fragmente wurden zur Bestimmung der Bindungsstellen der monoklonalen Antikörper an dem Ansteigen wie unten beschrieben verwendet.

Rinder-OC wurde auf einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen in einer Menge von 5 µg/50 µl/Vertiefung verteilt und an der Feststoffphase durch Stehenlassen bei 4°C während 18 Stunden adsorbiert. Nach dreimaligem Waschen mit 250 µl PBS wurde PBS, das 1% BSA enthielt, in einer Menge von 100 µl/Vertiefung zugegeben, das Gemisch wurde bei 4°C 18 Stunden lang stehengelassen zur Blockierung des nicht-adsorbierten Anteils, und danach dreimal gewaschen mit 250 µl PBS, und jeweils 50 µl der Proben wurde zugegeben. Als die Proben wurden Produkte verwendet, die durch Reaktion eines monoklonalen Antikörpers, der mit Meer­ rettichperoxidase (HRP) markiert war, mit T1-T3- und V1-V4-Fragmenten bei jeweils 4°C während 20 Stunden erhalten worden waren. Die Umsetzung wurde bei 37°C 2 Stunden lang durchgeführt, jede Vertiefung wurde viermal mit 250 µl PBS gewaschen, 0,1M-Citratpuffer (pH 4,0), der 0,001% Wasserstoffperoxid enthielt, und 0,55 mg/ml ABTS wurden zugegeben, und die Adsorption bei 410 nm wurde gemessen. Es wurde gezeigt, wie aus Tabelle 2 ersichtlich, daß es Fragmente mit geringem Grad an Farbentwicklung aufgrund seiner Bindung mit HRP-markierten monoklonalem Antikörper gab -T3 (45 bis 49) mit OC-G2, und T2 (21 bis 43) und V1 (8 bis 31) mit OC-G3. Es wurde somit festgestellt, daß die Bindungsstelle von OC-G2 an 45 bis 49 und daß diejenige von OC-G3 an 21 bis 31 erfolgt.

Tabelle 2

Beispiel 2 (quantitative Analyse von OC durch EIA (Sandwich- Methode) unter Verwendung von monoklonalen Anti­ körpern)

Das Reagens zur OC-Messung wurde hergestellt durch Verwendung der gemäß Beispiel 1 erhaltenen monoklonalen Antikörper OC-G2 und OC-G3.

(1) Herstellung von HRP-markiertem monoklonalem Antikörper

HRP-markierter monoklonaler Antikörper wurde hergestellt nach der auf Seite 81 von "Immunoassays in the Clinical Laboratory" von P. K. Nakane (verlegt 1979 von Alan R Liss Inc., New York City) beschriebenen Methode. Zu einer Lösung von 4 mg HRP (Handelsprodukt von Behringer Mannheim) in 1 ml destilliertem Wasser wurden 0,2 ml 0,1-M-Natriumperjodatlösung zugesetzt, das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 20 Minuten lang stehengelassen, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht gegen 1-mM-Acetatpuffer (pH 4) dialysiert. Das Dialysat wurde durch Zugabe von 0,02 ml 0,2-M-Carbonatpuffer (pH 9,5) auf pH 9 bis 9,5 eingestellt, monoklonaler Antikörper OC-G3 (8 mg/ml) der durch Dialyse gegen 0,01-M-Carbonatpuffer (pH 9,5) erhalten worden war, wurde unmittelbar danach zugesetzt, und die Umsetzung wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden lang fortgesetzt. Nach Zugabe von 0,1 ml einer 4-mg/ml-Natriumborhydridlösung wurde das Gemisch bei 4°C 2 Stunden lang gehalten, das Reaktionsgemisch wurde einer Gelfiltration durch eine Sephadex G-100-Säule unterworfen, und HRP-markiertes OC-G3 wurde durch Elution mit 0,1-M-Phosphatpuffer (pH 7,5), der 0,1-M-NaCl enthielt, erhalten.

(2) EIA-Meßsystem (Sandwich-Methode)

Auf eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen wurde eine Lösung von monoklonalem Antikörper OC-G2 in PBS (50 µl/Vertiefung) verteilt, die bei 4°C über Nacht inkubiert wurde. Die Lösungen wurden verworfen und eine PBS-Lösung, die 1% BSA enthielt, wurde zugegeben (100 µl/Vertiefung) und bei 37°C 1 Stunde lang gehalten zur Bewirkung der Blockierung. Nach gründlichem Waschen mit PBS wurden 50 µl einer Probe zugegeben und die Reaktion wurde bei 37°C 1 Stunde lang fortgesetzt. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurde eine Lösung von HRP-markiertem monoklonalem Antikörper OC-G3, verdünnt mit 1% BSA enthaltendem PBS, zugegeben (50 µl/Vertiefung) und die Reaktion wurde bei 37°C 1 Stunde lang fortgesetzt. Waschen mit PBS wurde dreimal wiederholt, 0,1-M-Citratpuffer (pH 4,0), der 0,001% Wasserstoffperoxid enthielt, und 0,5 mg/ml ABTS wurden zugegeben und die Adsorption bei 410 nm wurde gemessen.

(3) Empfindlichkeit des Meßsystems

Fig. 1 zeigt eine Standardkurve, die unter Verwendung von Rinder-OC unterschiedlicher Konzentration (0,05 bis 10 ng/ml) gewonnen wurde, in der die Absorption bei 410 nm (Ordinatenachse) gegen Rinder-OC (ng/ml, Abszissenachse) aufgetragen ist, um die Empfindlichkeit und Genauigkeit der OC-Messung nach der EIA (Sandwich-Methode) unter Verwendung der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper zu zeigen.

Aus dieser Figur ist ersichtlich, daß die Menge an OC mit hoher Genauigkeit bis zu einer Konzentration von 0,1 ng/ml nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gemessen werden kann.

Beispiel 3 (Erkennung von mit einer OC-Stoffwechselstörung einhergehenden Erkrankungen durch Verwendung von monoklonalen Antikörpern)

Es wurde die im Serum vorliegende OC-Menge gemessen von normalen Personen (19), Patienten mit Cerebralarteriosklerose (36), Patienten mit Cerebralinfarkt (25), Patienten mit Cerebralhämorrhagie (10), Patienten mit Herzinsuffizienz (30), Patienten mit Myocardinfarkt (13), Patienten mit Angina pectoris (6), Patienten mit Lebercirrhose (23), Patienten mit chronischer Hepatitis (20), Patienten mit Rheumatismus (3), Patienten mit Parkinson′scher Krankheit (10), Patienten mit Magenulcus (10), Patienten mit Diabetes mellitus (21), Patienten mit Niereninsuffizienz (12), Patienten mit Knochenbruch (18) und Patienten mit Katarakt (5).

Die OC-Messung erfolgte nach dem in der JP-Patentanmeldung 3 18 564 (1987) beschriebenen Verfahren unter Verwendung des EIA (Sandwich-Methode)-Reagens, das aus anti-OC-monoklonalen Antikörpern, OC-G2 und OC-G3 gewonnen war. Auf einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen wurde eine 50 µg/ml-Lösung von monoklonalem Antikörper OC-G2 in PBS (50 µl/Vertiefung) verteilt, die bei 4°C über Nacht inkubiert wurde. Die Lösungen wurden verworfen und eine PBS-Lösung mit einem Gehalt an 1% BSA wurde sodann zugegeben (100 µl/Vertiefung) und bei 37°C 1 Stunde lang gehalten zur Bewirkung der Blockierung. Nach gründlichem Waschen mit PBS wurden 50 µl einer Probe zugesetzt und die Reaktion wurde bei 37°C 1 Stunde lang fortgesetzt. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurde eine Lösung von HRP-markiertem OC-G3, verdünnt mit 1% BSA enthaltenden PBS, zugegeben (50 µl/Vertiefung), und die Reaktion wurde bei 37°C 1 Stunde lang fortgesetzt. Das Waschen mit PBS wurde dreimal wiederholt, worauf 0,1-M-Citratpuffer (pH 4,0) mit einem Gehalt an 0,001% Wasser­ stoffperoxid und 0,55 mg/ml ABTS zugegeben wurde, und die Absorption bei 410 nm wurde gemessen.

Die aus der Standardkurve erhaltenen OC-Mengen in den getesteten Proben sind in Fig. 2 gezeigt, in der die Konzentration an OC im Serum (ng/ml) gegen den Krankheitstyp aufgetragen ist.

Fig. 2 zeigt eindeutig den Unterschied in der Verteilung der OC-Konzentration im Serum zwischen normalen Personen und Patienten, die an Cerebralarteriosklerose, Cerebralinfarkt, Cerebralhämorrhagie, Herzinsuffizienz, Myocardinfarkt, Angina pectoris, Lebercirrhose, chronische Hepatitis, Rheumatismus, Parkinson′scher Krankheit, Magengeschwür, Diabetes mellitus, Niereninsuffizienz, Knochenfraktur und Katarakt leiden. Es konnte somit gezeigt werden, daß die Menge an OC als ein Markierungshinweis für die Erkennung dieser Krankheiten dient.

Beispiel 4 (Erkennung von mit OC-Stoffwechselstörung einhergehenden Krankheiten durch Verwendung von polyklonalen Antikörpern)

Die Menge an im Serum vorliegendem OC wurde nach der Doppel- Antikörpertechnik unter Verwendung von 125 J-OC gemessen, wobei Anti-OC-Kaninchenserum als der erste Antikörper und Anti-Kaninchen-Globulin-Schafserum (Handelsprodukt der Miles Laboratories Inc.) als der zweite Antikörper eingesetzt wurde.

Es wurde gezeigt, daß die Menge an OC auch in diesem Falle als ein Markierungshinweis für die Krankheitserkennung sein kann.

Es ergibt sich somit, daß vorliegende Erfindung monoklonale Antikörper gegen OC bereitstellt, die eine quantitative Analyse von OC mit hoher Genauigkeit und Empfindlichkeit ermöglichen und demzufolge sehr nützlich für die Untersuchung der physiologischen Funktionen von OC und der Rolle, die OC im Knochenstoffwechsel spielt, sind. Es konnte ferner gezeigt werden, daß die Menge an OC als ein Markierungshinweis für die Erkennung von Krankheiten dienen kann, die mit OC-Stoffwechselstörungen einhergehen, z. B. von Cerebralarteriosklerose, Cerebralinfarkt, Cerebralhämorrhagie, Herzinsuffizienz, Myocardinfarkt, Angina pectoris, Lebercirrhose, chronische Hepatitis, Rheumatismus, Parkinson'sche Krankheit, Magengeschwür, Diabetes mellitus, Niereninsuffizienz und Katarakt, so daß eine neue Methode zur Erkennung dieser Krankheit geschaffen wurde. Diese Methode verspricht weit verbreitete Anwendung, insbesondere als erstes Screening zur Verhütung von Cerebralerkrankung und Herzkrankheiten.

Claims (6)

1. Verfahren zur Erkennung von Krankheiten, die mit Osteocalcin-Stoffwechselstörungen einhergehen, bei dem die Mengen an Osteocalcin in einer einem lebenden Körper entnommenen Probe gemessen und der gemessene Wert mit demjenigen normaler Personen verglichen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem eine Immunoassay-Methode zur Messung der Menge an Osteocalcin verwendet wird.

3. Immunoassay zur Messung der Menge an Osteocalcin in einer einem lebenden Körper entnommenen Probe, bei dem anti-Osteocalcin-monoklonale Antikörper der IgG-Klasse angewandt werden.

4. Anti-Osteocalcin-monoklonale Antikörper der IgG-Klasse.

5. Monoklonaler Anitkörper nach Anspruch 4, bei dem es sich um Osteocalcin-G2 (OC-G2) mit folgenden Eigenschaften handelt:

• (a) Molekulargewicht: 145 000
• (b) Ig-Klasse: IgG1
• (c) Isoelektrischer Punkt: 7,2 bis 6,9
• (d) Reaktivität: reaktiv mit zumindest Rinder-Osteocalcin
• (e) Bindungsstellen am Antigen: spricht an auf ein Peptid, das mindestens eine Aminosäure in der Sequenz von an der C-Endgruppe von Osteocalcin enthält.

6. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 4, bei dem es sich um Osteocalcin-G3 (OC-G3) mit den folgenden Eigenschaften handelt:

• (a) Molekulargewicht: 146 000
• (b) Ig-Klasse: IgG3
• (c) Isoelektrischer Punkt: 8,9 bis 8,7
• (d) Reaktivität: reaktiv mit zumindest Rinder-Osteocalcin
• (e) Bindungsstelle am Antigen: spricht an auf ein Peptid, das mindestens eine Aminosäure in der Sequenz von (worin Gla für γ-Carboxyglutaminsäure steht) in Osteocalcin enthält.