DE69636749T2

DE69636749T2 - Methode zur bestimmung von proteinfragmenten in körperflüssigkeiten

Info

Publication number: DE69636749T2
Application number: DE69636749T
Authority: DE
Inventors: Christian Fledelius; Martin Bonde; Per Qvist
Original assignee: Osteometer Biotech AS
Current assignee: Immunodiagnostic Systems Nordic AS
Priority date: 1995-03-24
Filing date: 1996-03-21
Publication date: 2007-04-05
Anticipated expiration: 2016-03-22
Also published as: AU5146896A; WO1996030765A1; AU712375B2; ES2278383T3; EP0820598A1; ATE347697T1; DE69636749D1; GB9506050D0; US6210902B1; BR9607854A; JPH11502622A; EP0820598B1; CN1185209A; CN100430727C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Bestimmung von Kollagen oder sonstigen Proteinabbauprodukten und hierfür nützliche Materialien.
Kollagene und Störungen des Kollagen-Stoffwechsels
Osteoporose ist die verbreitetste Knochenkrankheit beim Menschen. Primäre Osteoporose, begleitet von erhöhter Anfälligkeit für Knochenbrüche, ist das Ergebnis einer fortschreitenden Reduktion der Knochenskelettmasse. Es wird geschätzt, dass diese allein in den USA 15-20 Millionen Menschen betrifft. Ihre Basis ist ein altersbedingtes Ungleichgewicht bei der Knochenerneuerung, d.h., bei den Bildungs- und Resorptionsraten von Knochengewebe.
In den USA kommt es jedes Jahr zu ca. 1,2 Millionen osteoporosebedingten Knochenbrüchen bei älteren Menschen, wobei diese jedes Jahr ca. 538 000 Kompressionsfrakturen der Wirbelsäule, ca. 227 000 Hüftfrakturen und eine wesentliche Anzahl von vorzeitig gebrochenen Gliederknochen beinhalten. Zwischen 12 und 20% der Hüftfrakturen sind tödlich, da sie schwere Traumata und Blutungen verursachen, und die Hälfte der überlebenden Patienten benötigt Versorgung in einem Pflegeheim. Die Gesamtkosten aus osteoporosebedingten Verletzungen betragen inzwischen mindestens 10 Milliarden USD jährlich in den USA (Riggs, New England Journal of Medicine, 127; 620-627 (1992).
Osteoporose ist am verbreitetsten bei Frauen nach der Menopause, die in den 10 Jahren nach der Menopause im Durchschnitt 15% ihrer Knochenmasse verlieren. Diese Krankheit tritt auch bei Männern auf, wenn sie älter werden, sowie bei jungen weiblichen Sportlerinnen mit Amenorrhoe. Trotz der beträchtlichen – und steigenden – sozialen und wirtschaftlichen Folgen von Osteoporose ist die Verfügbarkeit von verlässlichen Untersuchungen zur Messung von Knochenresorptionsraten bei Patienten oder bei gesunden Menschen sehr begrenzt. Sonstige Störungen, die Anomalien des Kollagenstoffwechsels mit sich bringen (und mit diesen korreliert sind), beinhalten die Paget-Krankheit, das Marfan-Syndrom, Osteogenesis imperfecta, neoplastisches Wachstum in kollagenhaltigem Gewebe, Nanismus, rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis und das Vasculitis-Syndrom.
Drei bekannte Klassen menschlichen Kollagens sind bis heute beschrieben worden: Es ist bekannt, dass die Kollagene der Klasse I, unterteilt in Typ I, II, III, V und XI, Fibrillen bilden. Die Aminosäuresequenz von Typ I-III (soweit diese erforscht worden ist) ist in Anhang A von WO95/08115 angegeben.
Kollagen vom Typ I macht mehr als 90% der organischen Matrix des Knochens aus. Es ist daher im Prinzip möglich, die Knochenresorptionsrate abzuschätzen, indem der Abbau von Kollagen vom Typ I beobachtet wird. Ebenso kann eine Anzahl von weiteren Krankheitszuständen, die das Bindegewebe betreffen, überwacht werden, indem der Kollagenabbau bestimmt wird. Beispiele hierfür sind der mit rheumatoider Arthritis und Osteoarthritis verbundene Abbau von Kollagen vom Typ II und der Abbau von Kollagen vom Typ III im Vasculitis-Syndrom.
Aminosäuresequenzen des menschlichen Typ III-Kollagens, des menschlichen Pro-α1(II)-Kollagens und die gesamte Prepro-α1-(III)-Kette des menschlichen Typ III-Kollagens, sowie entsprechende cDNA-Klone sind von mehreren Forschungsgruppen erforscht und bestimmt worden; siehe Loil et al., Nucleic Acid Research 12:9383-9394 (1984); Sangiovgi et al., Nucleic Acids Research, 13; 2207-2225 (1985); Baldwin et al., Biochem J., 262; 521-528 (1989); und Ala-Kokko et al., Biohem J., 26o; 509-516 (1989).
Alle Kollagene des Typs I, II und III werden im Organismus als Prokollagen-moleküle mit N-terminalen und C-terminalen Propeptidsequenzen gebildet, welche an die Kern-Kollagenmoleküle gebunden sind. Nach Entfernung der Propeptide, die auf natürliche Weise in vivo während der Kollagensynthese erfolgt, besteht der verbleibende Kern der Kollagenmoleküle weitgehend aus einem Tripel-Helix-Bereich mit terminalen Telopeptidsequenzen, die keine Tripel-Helix aufweisen. Diese Telopeptidsequenzen haben eine wichtige Aufgabe als Orte für intermolekulare Quervernetzung von Kollagen-Fibrillen in extrazellularer Weise. Der Alpha-Helix-Bereich umfasst ebenfalls quervernetzbare Orte.
Intermolekulare Quervernetzungen gewährleisten Kollagen-Fibrillen mit biomechanischer Stabilität. Die Bildung dieser Quervernetzungen wird durch Modifizierung von Lysin- und Hydroxylysinresiduen zu den entsprechenden Aldehyden ausgelöst. Mehrere dieser an benachbarten Kollagenketten befindlichen Residuen werden spontan verschiedene intermolekulare Quervernetzungen bilden. Die genaue Position der Orte für Quervernetzung an Kollagen-Telopeptiden und aus dem helikalen Bereich ist bereits beschrieben worden. Siehe zum Beispiel Kühn, K., in Immunochemistry of the extracellular matrix, 1:1-29, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida (1982), Eyre, D.R., Ann. Rev. Biochem., 53:717-48 (1984) oder US-Patent Nr. 5140103 und 5455179. Zudem sind die Aminosäuresequenzen einiger potenzieller Orte für Quervernetzung in Kollagen des Typs I, II und III nachstehend in Tabelle 1 angegeben. Die Faserproteine, Kollagen und Elastin, werden durch einen einzigartigen Mechanismus quervernetzt, der auf Aldehydbildung aus Lysin- oder Hydroxylysin-Seitenketten basiert. Vier homologe Quervernetzungsorte sind in Molekülen von Typ I, II und III-Kollagenen nachgewiesen (für eine Übersicht siehe Kühn, K., in Immunochemistry of the extracellular matrix, 1:1-29 (1982). Zwei von diesen sind Aldehydorte, einer in jeder Telopeptidregion. Die anderen zwei Orte sind Hydroxylysin, symmetrisch bei etwa 90 Residuen von jedem Molekülende plaziert. Wenn Kollagenmoleküle in Fibrillen eindringen, richten sich diese letzteren Orte in der helikalen Region miteinander aus und reagieren mit Telopeptid-Aldehyden in benachbarten Molekülen. Es gibt jetzt überzeugende Beweise dafür, dass 3-Hydroxypyridinium-Residuen die ausgereifte Quervernetzung sind, die von hydroxylysinabgeleiteten Aldehyden herrührt. Die ausgereiften Quervernetzungs-Residuen des anderen Pfades, d.h. aus Aldehydbildung von Lysinresiduen, sind jedoch immer noch unbekannt.
Wie durch die nachstehend erörterte Formel in EP-0394296 veranschaulicht, wurde herausgefunden, dass die beiden 3-Hydroxypyridinium-Quervernetzungen Hydroxylysyl-Pyridinolin (auch einfach als „Pyridinolin" bekannt) und Lysyl-Pyridinolin (auch als „Deoxypyridinolin" bekannt) sind. Diese Quervernetzungskomponenten sind auf natürliche Weise fluoreszierend. Es hat sich herausgestellt, dass manche Hydroxylysyl-Pyridinolin-Quervernetzungen glykosyliert sind, wie zum Beispiel in EP-A-04244428 erörtert. Es treten jedoch, wie in Last et al., Int. J. Biochem., Vol. 22, No. 6, pp 559-564 beschrieben, auf natürliche Weise andere Quervernetzungen in Kollagen auf.
Bestimmung des Kollagenabbaus nach dem bisherigen Stand der Technik
In der Vergangenheit wurden Untersuchungen zur Beobachtung des Kollagenabbaus in vivo entwickelt, indem verschiedene biochemische Marker gemessen wurden, von denen einige Kollagenabbauprodukte waren.
Zum Beispiel wird Hydroxyprolin, eine Aminosäure, die weitgehend auf Kollagen beschränkt und das Haupt-Strukturprotein in Knochen und allen anderen Bindegeweben ist, im Harn ausgeschieden. Es ist bekannt, dass sich die Ausscheidungsrate in bestimmten Krankheitszuständen erhöht, namentlich bei der Paget-Krankheit, einer Knochen-Stoffwechselstörung, bei der der Knochenumsatz wesentlich erhöht ist, wie weiter unten erörtert.
Aus diesem Grund wurde aus Harn gewonnenes Hydroxyprolin verbreitet als ein Aminosäure-Marker für Kollagenabbau genutzt; Singer, F.R. et al., Metabolic Bone Disease, Vol. II (Ed. Violi, L.V. und Kane, S.M.), 489-575 (1978), Academic Press, New York.
US-Patent Nr. 3600132 offenbart ein Verfahren zur Bestimmung von Hydroxyprolin in Körperflüssigkeiten wie Serum, Harn, Rückenmarksflüssigkeit und sonstige interzellulare Flüssigkeiten, um Abweichungen im Kollagenstoffwechsel zu beobachten. Das Patent legt dar, dass Hydroxyprolin mit erhöhtem Kollagen-Aufbaustoffwechsel oder Abbaustoffwechsel korreliert ist, welcher mit pathologischen Zuständen, wie etwa Paget-Krankheit, Marfan-Syndrom, Osteogenesis imperfecta, neoplastisches Wachstum in Kollagengeweben und verschiedenen Formen von Nanismus verbunden ist.
Knochenresorption, die mit der Paget-Krankheit verbunden ist, wurde auch beobachtet, indem kleine, hydroxyprolinenthaltende Peptide gemessen wurden, die nach Abbau von Knochenkollagen im Harn ausgeschieden werden; Russell et al., Metab. Bone Dis. and Rel. Res. 4 und 5, 2250262 (1981), und Singer, F.R., et al., supra.
Im Falle der Paget-Krankheit stammt das erhöhte Harn-Hydroxyprolin wahrscheinlich weitgehend aus Knochenabbau; im Allgemeinen kann Hydroxyprolin jedoch nicht als ein spezifischer Hinweis auf Knochenabbau verwendet werden. Ein großer Teil des Hydroxyprolins im Harn kann aus der Synthese von neuem Kollagen stammen (beträchtliche Mengen des neu hergestellten Proteins werden abgebaut und ausgeschieden ohne jemals in Gewebestoffe eingefügt zu werden), sowie aus dem Umsatz bestimmter Blutproteine ebenso wie sonstiger Proteine, die Hydroxyprolin enthalten.
Weiterhin werden etwa 80% des freien Hydroxyprolins, das aus Proteinabbau abgeleitet ist, in der Leber abgebaut und erscheinen nie im Harn. Kiviriko, K.I., Int. Rev. Connect. Tissue Res. 5:93 (1970), sowie Weiss, P.H. und Klein, L., J. Clin. Invest. 48:1 (1969). Hydroxyprolin ist ein guter Marker für Osteoporose, da es spezifisch für Kollagen in Knochen ist, selbst wenn es nicht spezifisch für Knochenresorption ist, aber es ist schwierig zu handhaben.
Hydroxylysin und seine Glykosid-Derivative, beide spezifisch für Kollagen-Proteine, wurden als Marker für Kollagenabbau angesehen, die präziser sind als Hydroxyprolin. Aus denselben Gründen, wie vorstehend für Hydroxyprolin beschrieben sind, jedoch Hydroxylysin und seine Glykoside wahrscheinlich ebenfalls nichtspezifische Marker für Knochenresorption; Krane, S.M. und Simon, L.S., Develop. Biochem. 22:185 (1981).
Andere Forscher haben die Quervernetzungskomponenten 3-Hydroxypyridinium im Harn gemessen als ein Anzeichen von Kollagenabbau bei Gelenkkrankheiten. Siehe als Hintergrund und für Beispiele Wu und Eyre, Biochemistry, 23:1850 (1984); Black et al., Annals of the Rheumatic Diseases, 45:969-973 (1986); und Seibel et al., The Journal of Dermatology, 16:964 (1989). Im Gegensatz zu der vorliegenden Erfindung haben diese früheren Forscher Peptide aus Körperflüssigkeiten hydrolysiert und dann nach dem Vorhandensein von freien 3-Hydroxypyridinium-Residuen gesucht.
Untersuchungen zur Bestimmung des Abbaus von Typ I, II und III-Kollagen werden in EP-0394296 und US-Patent Nr. 4973666 und US-Patent 5140103, offenbart. Jedoch sind diese Patente auf Kollagenfragmente beschränkt, die den Quervernetzer 3-Hydroxypyridinium enthalten. Zudem erfordern die vorstehend erwähnten Untersuchungen mühsame und komplizierte Reinigungen von Urin des Kollagenfragmente enthaltenden 3-Hydroxypyridiniums, das in den Untersuchungen für die Herstellung von Antikörpern und für Antigene verwendet werden soll.
Gegenwärtig sind nur sehr wenige klinische Daten verfügbar, die den in US-Patent Nr. 4973666 und US-Patent Nr. 5140103 beschriebenen Ansatz verwenden. Insbesondere wurden keine Daten in Bezug auf die Korrelation zwischen der Harnkonzentration (wie durch die in den vorstehend erwähnten Patenten beschriebenen Verfahren bestimmt) von 3-Hydroxypyridinium enthaltenden Telopeptiden von Typ I-Kollagen und dem tatsächlichen Knochenverlust (wie durch wiederholte Messungen durch Knochen-Densiometrie festgestellt) veröffentlicht. Das Vorhandensein von 3-Hydroxypyridinium enthaltenden Telopeptiden im Harn erfordert die einwandfreie Ausbildung im Knochengewebe dieser spezifischen Vernetzungsstruktur zu verschiedenen Zeitpunkten vor dem Knochenresorptionsprozess. Über diese Prozesse ist nur sehr wenig Information verfügbar, und es wäre wünschenswert, diese Abhängigkeit von der korrekten Ausbildung der Vernetzungsstruktur zu vermeiden.
GB-Patentanmeldung Nr. 2205643 berichtet, dass der Abbau von Typ-III-Kollagen im Körper quantitativ bestimmt werden kann, indem die Konzentration eines N-terminalen Telopeptids von Typ-III-Kollagen in einer Körperflüssigkeit gemessen wird. Dieses Verfahren verwendet Antikörper, die gegen N-terminate Telopeptide erzeugt wurden, welche durch bakteriellen Kollagenaseabbau von Typ-III-Kollagen freigegeben wurden, wobei die Telopeptide markiert und in der Untersuchung verwendet werden.
Schröter-Kermani et al., Immunol. Invest. 19:475-491 (1990) beschreiben immunologische Messsysteme, die auf CNBr-Fragmenten von Kollagen Typ I und II basieren. Es wird durch pepsinlöslich gemachtes Kollagen zur Verwendung gebracht, wobei die Telopeptide in dem Gewebe belassen werden (vgl. die vorstehend erwähnte GB-Patentanmeldung Nr. 2205643). Es besteht daher keine Übereinstimmung zwischen den Fragmenten und den aus diesen gewonnenen Antikörpern. Zudem beschreibt diese Referenz nur Messungen an extrahierten Gewebeproben.
Die Entwicklung eines monoklonalen Antikörpers, der gegen pepsinlöslich gemachtes Typ-I-Kollagen gerichtet ist, wird in Werkmeister et al., Eur. J. Biochem. 1987:439-443 (1990), beschrieben. Der Antikörper wird für immunohistochemisches Färben von Gewebesegmenten und für das Messen des Kollagengehalts in Zellkulturen verwendet. Die Messungen werden nicht an Körperflüssigkeiten durchgeführt.
EP-Patentanmeldung Nr. 050210 beschreibt die Entwicklung von Antikörperreagenzien durch Immunisierung mit gereinigten, quervernetzten, C-terminalen Telopeptiden von Typ I-Kollagen. Das Immunogen wird hergestellt, indem menschliches Knochenkollagen mit bakterieller Kollagenase löslich gemacht wird. Die so bereitgestellten Antikörper sind in der Lage, sowohl mit quervernetzten als auch mit nicht vernetzten Telopeptiden zu reagieren, und mit anderen Vernetzern als Pyridinolin.
Die internationale Patentanmeldung Nr. WO 91/09114 offenbart bestimmte synthetische Peptide, die verwendet werden, um Zellhaftung an einem festen Substrat zu fördern. Die Verwendung der synthetischen Peptide als immunologische Reagenzien wird nicht erwähnt.
Es gibt eine Anzahl von Dokumenten, die darauf hinweisen, dass der Kollagenabbau durch quantitative Bestimmung gewisser Prokollagen-Peptide gemessen werden kann. Propeptide werden von Telopeptiden und dem alpha-helikalen Bereich des Kollagenkerns durch ihre Lage in dem Prokollagenmolekül und die Zeit ihrer Spaltung in vivo unterschieden; siehe US-Patent Nr. 4504587; US-Patent Nr. 4312853; Pierard et al., Analytical Biochemistry 141:127-136 (1984); Niemela, Clin. Chem. 31/8:1301-1304 (1985); und Rohde et al., European Journal of Clinical Investigation, 9:451-459 (1979).
Die EP-Patentanmeldung Nr. 0298210 und Nr. 0339443 beschreiben beide die immunologische Bestimmung von Prokollagenpeptid Typ III und Fragmenten desselben. Zudem wird ein auf der Messung von Prokollagen basierendes Verfahren in der EP-Patentanmeldung Nr. 0465104 offenbart.
Die Verwendung von synthetischen Peptiden mit vom Typ-IX-Kollagen abgeleiteten Sequenzen für die Entwicklung von immunologischen Reagenzien wird in der PCT-Patentanmeldung Nr. WO90/08195 offenbart. Die Anmeldung beschreibt gleichermaßen die Verwendung von so hergestellten Antikörpern zur Bestimmung von Typ-IX-Kollagenfragmenten in Körperflüssigkeiten.
US-Patent Nr. 4778768 bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestimmung von Veränderungen, die in Gelenkknorpeln auftreten, welches die quantitative Bestimmung von Protoglykan-Monomeren oder antigenischen Fragmenten derselben in einer synovialen Flüssigkeitsprobe beinhaltet.
Dodge, J. Clin Invest 83:647-661 (1981) offenbart Verfahren zur Analyse vom Typ II-Kollagenabbau unter Verwendung eines polyklonalen Antiserums, das spezifisch mit abgewickelten Alpha-Ketten und von Cyanbromid abgeleiteten Peptiden von humanen und bovinen Typ-II-Kollagenen reagiert. Die Abbauprodukte von Kollagen wurden nicht in einer Körperflüssigkeit nachgewiesen, sondern histochemisch durch Färben von Zellkulturen, d.h., durch „In situ"-Detektion.
WO94/03813 beschreibt eine kompetitive Immununtersuchung zum Nachweis von Kollagen oder von Kollagenfragmenten in einer Probe, wobei ein Bindungspartner, der ein synthetisches lineares Peptid enthält, welches dem nicht-helikalen, C-terminalen oder N-terminalen Bereich von Kollagen entspricht, mit einem Antikörper gegen das lineare synthetische Peptid und der Probe inkubiert wird, und wobei die Bindung des Antikörpers an den Bindungspartner bestimmt wird.
WO95/08115 bezieht sich auf Untersuchungsverfahren, bei denen Kollagenfragmente in einer Körperflüssigkeit durch Reaktion mit einem Antikörper bestimmt werden, der mit einem synthetischen Peptid reaktiv ist. Die Untersuchung kann eine kompetitive Untersuchung sein, bei der die Probe und ein solches Peptid um einen Antikörper konkurrieren, möglicherweise einen Antikörper, der gegen Kollagenfragmente erzeugt wurde, die durch Kollagenase-Kollagenabbau erhalten wurden. Alternativ kann dies eine Untersuchung sein, bei der ein Antikörper, möglicherweise ein monoklonaler Antikörper, verwendet wird, der gegen ein solches synthetisches Peptid erzeugt wurde.
Ein besonderes Peptidfragment, das wir in Körperflüssigkeit, insbesondere Harn, gefunden haben, ist von folgender Formel:
In der obigen Formel stellt K-K-K eine Vernetzung dar, die zum Beispiel eine Hydroxypyridinium-Vernetzung sein kann, aber jede beliebige natürlich vorkommende Vernetzung sein kann, und spezifischerweise jede derjenigen, die in der vorstehend zitierten Veröffentlichung von Last et al. erörtert werden.
Von einem größeren Peptidfragment, das das obige kleinere Fragment einschließt, wird in EP 0394296 berichtet.
Wir haben nun entdeckt, dass ein Teil der „Peptid"-Fragmente in Körperflüssigkeit mit Peptiden von äquivalenter Aminosäuresequenz in Beziehung stehen, z.B. mit Peptiden nach Formel 1, durch die Isomerisierung von Asparaginsäure in der Formel zu Isoasparaginsäure. Wir haben „Peptide" hier in Anführungszeichen gesetzt, da die Isomerisierung natürlich bedeutet, dass diese Spezies richtigerweise nicht mehr als Peptide angesehen werden können.
Es wurde zuvor bereits berichtet, dass die Isomerisierung von Proteinen, die Asparaginsäure enthalten, eine spontane Reaktion ist, die unter physiologischen Bedingungen vorkommt.
Siehe zum Beispiel Brennan et al. Protein Science 1993, 2, 331-338, Galletti et al., Biochem. J. 1995, 306, 313-325, Lowenson et al., Blood Cells 1988, 14, 103-117 und Oliya et al., Pharmaceutical Research, Vol. 11, Nr. 5, 1994, S. 751.
Die Isomerisierung hat zur Auswirkung das Transferieren desjenigen Teils der Peptidkette, der der Asparaginsäureresidue nachgeordnet in der Carboxy-Terminus-Richtung verläuft, von der Alpha-Carboxylsäure der Asparaginsäure, mit der dieser über eine Peptidbindung in dem normalen Protein gebunden ist, zu der Seitenketten-Carboxylsäure in einer nicht-peptidischen Amidbindung, wie nachstehend dargestellt:
Die nicht-peptidisch gebundene Asparaginsäure-Residue wird als „Isoasparaginsäure" bezeichnet.
Eine ähnliche Isomerisierung kann in Proteinen auftreten, die Asparaginresiduen enthalten (d.h. mit -NH₂ an Stelle von -OH in dem anfänglichen Protein in dem obigen Reaktionsschema).
Die obige Entdeckung weist darauf hin, dass diese Isomerisierung auch in Knochengewebe vorkommt, und es ist zu erwarten, dass das Ausmaß der Isomerisierung ein Marker für das Alter des betroffenen Knochengewebes ist.
Weiterhin verschafft das Vorhandensein der isomerisierten Peptide unter solchen Knochenpeptidfragmenten eine Bestätigung dafür, dass die Fragmente tatsächlich vom Knochenabbau stammen, und nicht aus irgendeiner anderen Quelle, wie etwa dem Abbau von neu gebildetem Kollagen, das nie in den Knochen eingefügt war.
Dementsprechend ist die vorliegende Erfindung in den angehängten Ansprüchen definiert und stellt in einem ersten Aspekt ein Verfahren zur Messung der Abbaurate eines Körperproteins wie Kollagen, beispielsweise aus dem Knochen, bereit, welches das Bestimmen der Menge von einer oder mehreren Isoasparaginsäure enthaltenden Spezies in einer Körperflüssigkeit umfasst, wobei die Spezies eine Aminosäuresequenz haben, die diese Spezies charakteristisch für das Körperprotein in einer Körperflüssigkeit macht.
Die in Frage stehenden isomerisierten Peptide können charakteristisch für Typ I, Typ II oder Typ III-Kollagen sein, sind aber vorzugsweise charakteristisch für Typ I-Kollagen.
Noch besser bestimmt ein solches Verfahren die Menge eines oder mehrerer spezifischer, Isoasparaginsäure enthaltender, isomerisierter Peptide, die in der Körperflüssigkeit vorhanden sind.
Vorzugsweise bestimmt das Verfahren die Menge des isomerisierten Peptids von der Formel 2 (nachstehend), das in der Körperflüssigkeit vorhanden ist:
wobei eines oder beide von * Isoasparaginsäure ist, oder die Menge eines oder mehrerer isomerisierter Peptide, die ein Epitop beinhalten, das in dem isomerisierten Peptid von Formel 2 vorhandenen ist, welches Isoasparaginsäure enthält.
In der obigen Formel ist K-K-K eine Vernetzung, wie etwa eine Hydroxypyridinium-Vernetzung, die Pyridinolin (das glykosiliert oder nicht glykosiliert sein kann) oder Deoxypyridinolin sein kann.
Vorzugsweise wird die Bestimmung unter Verwendung eines immunologischen Bindungspartners durchgeführt, der spezifisch für eine Isoasparaginsäure enthaltende Spezies, wie oben definiert, ist, welche in der Probe während des Verfahrens vorhanden ist, vorzugsweise das isomerisierte Peptid nach Formel 2 oder ein isomerisiertes Peptid, das ein Epitop beinhaltet, das in dem isomerisierten Peptid nach Formel 2 vorhanden ist, welches Isoasparaginsäure enthält.
Der immunologische Bindungspartner kann ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper sein. Mit dem Erfordernis, dass der immunologische Bindungspartner für die vorstehend definierte, Isoasparaginsäure enthaltende Spezies spezifisch sein muss, ist gemeint, dass der immunologische Bindungspartner zwischen dieser Spezies und der analogen, Asparaginsäure enthaltenden Spezies (Peptid) in einem Ausmaß unterscheidet, das in der Untersuchung nützlich ist.
Geeignete immunologische Bindungspartner umfassen auch Fragmente von Antikörpern, die in der Lage sind, denselben antigenischen Bestimmungsfaktor, einschließlich Fragmente von Fab, Fab' und F(ab')₂, zu binden.
Vorzugsweise ist der immunologische Bindepartner ein gegen ein linear isomerisiertes Peptid gerichteter Antikörper, vorzugsweise ein synthetisches isomerisiertes Peptid, das einer Sequenz innerhalb von Kollagen entspricht, wobei Isoasparaginsäure in dieser Aminosäuresequenz Asparaginsäure in der Kollagen-Proteinsequenz ersetzt.
Die Bestimmung kann viele Formen annehmen, einschließlich ELISA, RIA oder IRMA-Verfahren, die so bekannt sind, dass sie hier keine Beschreibung rechtfertigen.
In einem zweiten Aspekt beinhaltet die Erfindung die Verwendung, in einer Untersuchung für von Kollagen abgeleitete isomerisierte Peptide eines synthetischen isomerisierten Peptids mit einer Aminosäuresequenz, die einer Sequenz innerhalb von Kollagen entspricht, wobei Isoasparaginsäure in der Aminosäuresequenz Asparaginsäure in der Kollagen-Proteinsequenz ersetzt. In einer kompetitiven Untersuchung kann das synthetische isomerisierte Peptid dazu verwendet werden, mit einem oder mehreren isomerisierten Peptiden in der Probe um einen immunologischen Bindungspartner zu konkurrieren.
In einem ELISA-Verfahren dieses Typs kann das synthetische Peptid auf einem festen Träger immobilisiert werden. Eine Probe kann mit einem polyklonalen Antikörper gegen das synthetische Isomer eines mit dem festen Träger in Kontakt stehenden Peptids inkubiert werden, und nach Waschen kann ein an Peroxidase konjugierter (aufdeckender) Antikörper beigefügt werden. Nach weiterer Inkubation wird eine Peroxidasesubstratlösung beigefügt. Durch Kompetition hemmt das Peptidisomer in der Probe, das mit dem Antikörper reaktiv ist, die Peroxidasereaktion.
Alternativ kann das synthetische Peptidisomer verwendet werden, um einen monoklonalen immunologischen Bindungspartner zu erzeugen. Das synthetische isomerisierte Peptid muss dann kein Kompetitionsmittel in der Untersuchung sein. Zum Beispiel kann mit Kollagenase behandeltes Kollagen gereinigt und auf dem festen Träger immobilisiert werden, und ein ELISA-Verfahren kann unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers durchgeführt werden.
Demgemäß beinhaltet die Erfindung in einem dritten Aspekt einen Antikörper, wie in Anspruch 8 definiert, vorzugsweise einen monoklonalen Antikörper.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung ist der Antikörper spezifisch für eine isomerisierte Peptidsequenz, die die Sequenz EKAHiDGGR beinhaltet oder ein Epitop enthält, das spezifisch ist für das Vorhandensein von in dieser Sequenz vorhandenem iD, wobei iD Isoasparaginsäure ist.
Demgemäß beinhaltet dieser Aspekt der Erfindung einen Antikörper, vorzugsweise einen monoklonalen Antikörper, der reaktiv ist mit einem Epitop, das die Peptidisomersequenz EKAHiDGGR enthält, in dieser enthalten ist oder sich aus dieser zusammensetzt, wobei iD Isoasparaginsäure ist.
In einem vierten Aspekt stellt die Erfindung einen Antikörper, vorzugsweise einen monoklonalen Antikörper, bereit, der spezifisch ein Peptidisomer erkennt, das eine Aminosäuresequenz hat, die einer Sequenz innerhalb eines Proteins entspricht, z.B. Kollagen, wobei Isoasparaginsäure in der Aminosäuresequenz die Asparaginsäure in der Kollagenproteinsequenz ersetzt.
Die Erfindung beinhaltet Zelllinien, die monoklonale Antikörper gemäß des dritten oder vierten Aspekts der Erfindung erzeugen.
Die Erfindung beinhaltet auch Antikörper gemäß des dritten oder vierten Aspekts der Erfindung, die an einen detektierbaren Marker gekoppelt sind. Geeignete detektierbare Marker umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Enzyme, Chromophoren, Fluorophoren, Coenzyme, Enzymhemmer, chemilumineszente Materialien, paramagnetische Materialien, Spin-Markierungen, Radio-Isotopen, Nukleinsäure oder Nukleinsäure-Analogsequenzen.
In einem fünften Aspekt beinhaltet die Erfindung die Verwendung, in einer Untersuchung für Kollagen oder sonstige, von Protein abgeleitete isomerisierte Peptide, eines Antikörpers, der spezifisch ist für eine Aminosäuresequenz, die einer charakteristischen Sequenz innerhalb des Proteins (z.B. Kollagen) entspricht, welche dazu dient, das Protein zu identifizieren, wobei Isoasparaginsäure in der Aminosäuresequenz die Asparaginsäure in der Protein(z.B. Kollagen)sequenz ersetzt, um Information bezüglich der Menge an Isoasparaginsäure enthaltendem Peptidisomer oder Peptidisomeren in der Körperflüssigkeit zu erhalten.
In einem sechsten Aspekt beinhaltet die Erfindung ein synthetisches Peptidisomer mit einer Aminosäuresequenz, die einer Sequenz in Kollagen entspricht, wobei Isoasparaginsäure in der Aminosäuresequenz die Asparaginsäure in der Kollagen-Proteinsequenz ersetzt, vorzugsweise in zu mindestens der wesentlichen Abwesenheit des entsprechenden Peptids.
Vorzugsweise besteht eine der Asparaginsäureresidue benachbarte Glycinresidue, in der ursprünglichen Peptidform der Aminosäuresequenz, da ein benachbartes Glycin die Isomerisierung der Asparaginsäure erleichtert.
Antikörper können hergestellt werden, die jeweils in Bezug auf eines oder mehrere Asparaginsäure enthaltende Peptide und in Bezug auf deren Isoasparaginsäure enthaltende Analoge selektiv sind. Es ist dann möglich, einen Untersuchung für beide Varianten des Peptids oder der Peptide durchzuführen. Die relative Menge an Isoasparaginsäure gibt einen Hinweis auf das Alter des Proteins, das abgebaut wird, sowie des Knochens, wenn die Untersuchung für einen Typ von Kollagenfragment ist. Demgemäß stellt die Erfindung in einem sechsten Aspekt ein Verfahren bereit zum Erhalten von Information über Kollagenresorption bei einem Patienten, welches das Messen der relativen Mengen mindestens eines Asparaginsäure enthaltenden Peptids, das von Kollagen abgeleitet ist, und eines entsprechenden Isoasparaginsäure enthaltenden Peptidanalogs in einer Körperflüssigkeit aufweist.
Die Erfindung beinhaltet auch Testkits, die bei den vorstehend beschriebenen Verfahren nützlich sind. Solche Kits können einen Antikörper gemäß des dritten oder des vierten Aspekts der Erfindung oder ein Fragment desselben mit derselben spezifischen Wirksamkeit aufweisen, in Kombination mit irgendeinem oder mehreren der folgenden:
ein synthetisches Peptidanalog, das gegen den Antikörper reaktive Isoasparaginsäure enthält,
ein Antikörper-Enzym-Konjugat undoder ein Substrat hierfür,
eine Zusammensetzung, die die Reaktion des Enzym-Konjugat-Substrats stoppt, oder
eine Waschlösung.
Die Erfindung kann sowohl bei Menschen als auch bei Tieren angewendet werden.
Geeignete Körperflüssigkeiten umfassen menschlichen oder tierischen Harn, Blut, Serum, Plasma und Gelenkflüssigkeit. Es wird in Betracht gezogen, dass das Verfahren beispielsweise auch auf Speichel und Schweiß angewendet werden kann. Die Körperflüssigkeit kann so wie sie ist verwendet werden, oder sie kann vor dem Kontaktschritt gereinigt werden. Dieser Reinigungsschritt kann unter Verwendung einer Anzahl von Standardverfahren durchgeführt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Kartuschen-Adsorption und Elution, molekulare Siebchromatographie, Dialyse, Ionenaustausch, Alumina-Chromatographie, Hydroxyapatit-Chromatographie und Kombinationen derselben.
Die Erfindung wird in weiteren Details nachstehend beschrieben. Es wird auf die angehängten Zeichnungen Bezug genommen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die HPLC-Separation eines synthetischen Peptids und eines Peptidanalogs der Sequenz EKAH*GGR, welche sich bei * zwischen Isoasparaginsäure (Peak 2) und normaler Asparaginsäure (Peak 3), wie in Beispiel 3a beschrieben, unterscheiden.
2 stellt die unterschiedliche Reaktivität des getrennten Peptids und Peptidanalogs von 1 in zwei Ausgestaltungen des ELISA-Verfahrens dar, wie in Beispiel 3a beschrieben; und
3(a) und 3(b) zeigen die Fluoreszenz (a) und das Absorptionsvermögen (b) von vernetzten Peptiden und Peptidanalogen aus Harn, die durch HPLC getrennt wurden, wie in Beispiel 3(b) beschrieben.
4 und 5 stellen die Ergebnisse von Untersuchungen an Serum dar, unter Verwendung verschiedener Antikörper, um die Wirkung von Biphosphonatbehandlung auf Knochenresorption zu beobachten.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung wird das Bestimmen von Typ I, II oder III-Kollagenfragmenten in Harn oder sonstiger Körperflüssigkeit durch ein Hemmungs-ELISA-Verfahren (Enzym-Immunsorptionsmittel-Bestimmung) mittels Messen einer Probe von Harnkörperflüssigkeit durchgeführt, wobei die Probe mit einem synthetischen Peptidanalog, das eine von Kollagen abgeleitete Sequenz aufweist, und mit einem Antikörper, der immunoreaktiv gegen das synthetischen Peptidanalog ist, in Kontakt gebracht wird. Das synthetische Peptidanalog ist auf einem festen Träger immobilisiert. Der Antikörper kann gegen das synthetische Peptidanalog gerichtet sein, oder kann gegen Kollagenabbauprodukte gerichtet sein und durch Verwendung eines solchen Peptidanalogs nachgewiesen werden.
Herstellung von synthetischen Peptidanalogen
Die Herstellung von synthetischen Peptiden und Peptidanalogen kann nach auf dem Fachgebiet wohl bekannten Verfahren durchgeführt werden, z.B. durch Festphasen-Peptidsynthese-Techniken, gemeinhin als „Merrifield-Synthese" beschrieben. Auch können klassische Lösungsphasen-Techniken eingesetzt werden. Beteiligte Sequenzen beinhalten potenzielle Orte für Kollagen-Quervernetzung (siehe zum Beispiel Kühn, K., in Immunochemistry of the extracellular matrix, 1:1-29 (1982), Eyre, D.R., Ann. Rev. Biochem. 53:717-48 (1984), oder US-Patent Nr. 5140103). Beispiele von solchen Peptidsequenzen sind nachstehend in Tabelle 1 angegeben. Das herkömmliche Verfahren zur Peptidsynthese kann eine Mischung aus Peptid (mit normaler peptidgebundener Asparaginsäure) und Peptidanalog mit Isomerisierung der Bindung an die Asparaginsäure erzeugen. Generell wird eine solche Mischung zufriedenstellend sein, da das Peptid in die Untersuchung eingeführt sein wird. Jedoch wird das Erhitzen einer solchen Mischung normalerweise Isomerisierung des Peptidgehalts zu der Iso-Form erzeugen.
In Bezug auf die synthetischen Peptidanaloge ist es möglich, eine oder mehrere Aminosäureresiduen aus (oder zu) den Sequenzen mit quervernetzbaren Orten auszulassen, ohne wesentlichen Verlust der Fähigkeit, (a) Antikörper zu erzeugen, die das Isoasparaginsäreanalog des entsprechenden nativen Kollagenfragments erkennen, oder (b) die Bindung solcher Antikörper an das Analog des nativen Fragments zu hemmen. Es ist möglich, längere Kollagenfragmente undoder chimäre Peptidanaloge zu verwenden, um die Antikörper zu erzeugen, und im Prinzip ist es nicht notwendig, dasselbe Peptidanalog als das Immunogen und den Konkurrenten in einer Kompetitionsuntersuchung zu verwenden.
TABELLE 1
Beispiele von Aminosäuresequenzen mit potenziellen Orten für Quervernetzung in verschiedenen Typen von Kollagen, die als eine Basis für Isoasparaginsäure enthaltende synthetische Peptidanaloge gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden sollen
Kollagen Typ I
Kollagen Typ II
Kollagen Typ III
Herstellung von Antikörpern
Die Verfahren zur Herstellung sowohl von monoklonalen als auch von polyklonalen Antikörpern sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Siehe zum Beispiel Campbell, A.M., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 12 (1986). Es ist möglich, Antikörper gegen synthetische isomerisierte Peptide durch Immunisierung herzustellen. Jedoch wird es aufgrund des relativ geringen Molekulargewichts dieser Komponenten bevorzugt, dass das Hapten an ein Trägermolekül konjugiert wird. Geeignete Trägermoleküle umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, bovines Serum-Albumin, Thyroglobulin, Oval-Bumin, Tetanustoxoid und Keyhole-Limpet-Hämocyanin. Der bevorzugte Träger ist bovines Serum-Albumin. Um das Hapten in seiner immunogensten Form den Antikörper erzeugenden Zellen des immunisierten Tiers zu präsentieren, können eine Anzahl von zur Wahl stehenden Kopplungsprotokollen verwendet werden. Geeignete Verfahren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Glutaraldehyd, Carbodiimid und Periodat. Bevorzugte Bindemittel sind Glutaraldehyd und Carbodiimid.
Die Herstellung der Antikörper kann mittels herkömmlicher Techniken durchgeführt werden, einschließlich Immunisierung mit Kollagenfragmenten, die natürlich oder synthetisch isomerisierte Peptide enthalten, welche an einen Träger konjugiert sind. Um die Immunogenität zu verbessern, wird das Immunogen bevorzugt vor der Injektion mit einem Zusatz gemischt. Beispiele von Zusätzen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Aluminiumhydroxid, Freund's Zusatz und immunstimulierende Komplexe (ISCOMs). ISCOMs können gemäß dem von Morein, B. et al., Nature 308:457-460 (1984) beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
Es können entweder monoklonale oder polyklonale Antikörper gegen das Hapten-Trägermolekül hergestellt werden. Für die Herstellung von monoklonalen Antikörpern wird die Immunisierung von Mäusen bevorzugt. Milzzellen der immunisierten Maus werden entnommen, homogenisiert und danach mit Krebszellen in Gegenwart von Polyethylen-Glykol vereinigt, um ein Zellhybrid zu erzeugen, das monoklonale Antikörper produziert, die spezifisch für isomerisierte, von Kollagen abgeleitete Peptidfragmente sind. Geeignete Krebszellen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Myelom-, Hepatom-, Karzinom- und Sarkomzellen. Detaillierte Beschreibungen der Herstellung von monoklonalen Antikörpern finden sich in Goding, J.W., in Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (1986). Ein bevorzugtes vorausgehendes Prüfungsprotokoll beinhaltet die Verwendung von synthetischen isomerisierten Peptiden, die an einen Träger konjugiert sind und auf die feste Oberfläche einer Microtiterplatte aufgetragen werden.
Für die Herstellung von polyklonalen Antikörpern, die reaktiv gegen isomerisierte Peptidfragmente sind, die von Kollagen abgeleitet sind, können verschiedene Tierarten immunisiert werden. Geeignete Arten umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Hühner, Kaninchen und Ziegen. Hühner und Kaninchen werden bevorzugt.
Auf diese Weise hergestellte Antikörper können auf ihre Eignung zur Verwendung gemäß der Erfindung geprüft werden, durch Testen der Reaktivität mit einem Isoasparaginsäure enthaltenden synthetischen Peptidanalog von geeigneter Sequenz.
Antikörperfragmente werden durch Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, hergestellt (siehe E. Ishikawa, Journal of Immunoassay 3:209-327 (1983)).
Durchführung von Immunountersuchungen
Dementsprechend ist es möglich, durch Verwendung einer Immunountersuchung mit den wie oben hergestellten Antikörpern, eine Untersuchung an einer biologischen Flüssigkeitsprobe durchzuführen, ohne vorherige Fraktionierung oder Hydrolyse. Die Spezifität für die erwünschten Kollagenfragmente in der biologischen Flüssigkeit kann von dem Antikörper geliefert werden, in Kombination mit der Verwendung eines synthetischen isomerisierten Peptids (gegen welches der Antikörper gerichtet war oder jedenfalls mit welchem der Antikörper immunchemisch reaktiv ist) bei der Ausführung der Untersuchung.
Als Alternative kann die Immunountersuchung unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers durchgeführt werden. Die Grundidee dieses Untersuchungsaufbaus ist es, die Spezifität der Untersuchung von dem Antigen (synthetisches Peptidisomer bis Kollagen) auf den Antikörper (von Kaninchen-Antiserum bis monoklonalen Antikörper) zu verschieben. Da dieser Aufbau verwendet wird, benötigt die Untersuchung keinen weiteren Einsatz eines synthetischen Peptidisomers. Diese Version der Immunountersuchung wird in geeigneter Weise durch Inkubieren der Patientenprobe oder einer Standardlösung mit einer zu Peroxidase konjugierten Antikörperlösung in einer Mikrotiterplatte durchgeführt, die mit gereinigtem, kollagenasebehandeltem Kollagen vorbeschichtet ist. Nach dem Waschen werden die Kavitäten der Platte im Dunkeln mit einer Substratlösung inkubiert. Die Farbreaktion wird durch das Beifügen einer Stoppungslösung gestoppt, und schließlich wird das Absorptionsvermögen gemessen.
Die Immunountersuchungen selbst können unter Verwendung jedes beliebigen Verfahrens, das aus der Vielfalt von generell auf dem Fachgebiet bekannten Standard-Assayprotokollen ausgewählt ist, durchgeführt werden. So wie er allgemein verstanden wird, ist die Untersuchung so konstruiert, dass er sich für die Spezifität auf die Interaktion zwischen dem spezifischen immunologischen Bindepartner und dem erwünschten Analyt stützt und dass er irgendwelche Mittel verwendet, um den Komplex nachzuweisen, der von dem Analyt und dem immunologischen Bindepartner gebildet wird. Der immunologische Bindepartner kann mit einem festen Träger verbunden sein und als ein einnehmender immunologischer Bindepartner für den Analyt verwendet werden. Dieses Protokoll kann in einer direkten Form durchgeführt werden, wobei die Bildung des Komplexes aus Analyt und immunologischem Bindepartner nachgewiesen wird, z.B. durch eine fluoreszente, radioaktive oder enzymatische Markierung, oder es kann in einem kompetitiven Format durchgeführt werden, wobei ein markierter Standard mit dem Analyten um den immunologischen Bindepartner konkurriert. Das Format kann auch als eine Agglutinationsuntersuchung aufgebaut sein, oder der Komplex kann ausgefällt werden durch Zusatz eines geeigneten Fällungsmittels zu der Reaktionsmischung. Der spezifische Aufbau des Immunountersuchungsprotokolls ist offen für eine große Vielfalt an Wahlmöglichkeiten, und die Anzahl von auf dem Fachgebiet verfügbaren Vorrichtungen und Protokollen für klinische Untersuchungen ist groß. Für eine Auswahl an solchen Protokollen, siehe US-Patent Nr. 5001225.
Die Antikörper und sichtbar machenden Reagenzien für die Durchführung einer Immunountersuchung, welche Standard-Nachweisprotokolle, zum Beispiel Radioisotop-Markierung, Fluoreszenz-Markierung oder das ELISA-Verfahren, entweder in einem direkten oder in einem kompetitiven Format, verwendet, können in geeigneter Weise als Kits geliefert werden, die die notwendigen Komponenten und Anweisungen für die Untersuchung beinhalten. In einer Ausführung der Erfindung beinhaltet ein solcher Kit eine Mikrotiteplatte, die mit einem geeigneten synthetischen isomerisierten Peptid beschichtet ist, Standardlösungen zur Herstellung einer Standardkurve, eine Kontroll-Körperflüssigkeit (z.B. Harn) zum Testen der Qualität des Analyseablaufs, Kaninchen-Antikörper, die reaktiv gegen das vorstehend erwähnte synthetische Peptidisomer sind, Anti-Kaninchenimmunoglobuline, die an Peroxidase konjugiert sind, eine Substratlösung, eine Stoppungslösung, einen Wasch-Puffer und ein Anleitungshandbuch.
Da Immunountersuchungen unter Verwendung von Antikörpern und spezifischen synthetischen isomerisierten Peptiden konstruiert werden können, können die Anteile der entsprechenden Kollagenfragment-Sequenzen in einer geeigneten biologischen Flüssigkeit bestimmt werden, ebenso wie ihr individueller Level und ihre Gesamtmenge. Daher kann die Untersuchung so angelegt werden, dass er Antikörper umfasst, was in der Bestimmung von mehreren Isoasparaginsäure enthaltenden Peptidanalogen, und optimal auch der nativen Peptidsequenzen resultieren wird, oder in der Bestimmung einer einzelnen, Isoasparaginsäure enthaltenden Peptidanalog-Sequenz, oder in jeder beliebigen erwünschten Kombination derselben.
Zusätzlich zu der Verwendung der hierin beschriebenen isomerisierten Peptide als Indikatoren von Knochenresorption kann das Gleichgewicht des Knochenstoffwechsels in vorteilhafter Weise durch die im Wesetlichen simultane Bestimmung eines Knochenbildungs-Markers in derselben oder einer anderen geeigneten biologischen Flüssigkeit von derselben Person bestimmt werden. „Im Wesentlichen simultan" bedeutet am selben Tag, vorzugsweise innerhalb von 4 Stunden. Solche Marker umfassen zum Beispiel Osteocalcin (auch als Knochen-GIA-Protein von BGP bekannt), Propeptide von Typ I-Prokollagen, Knochen-Alkaliphosphatase und Gesamt-Alkaliphosphatase. Geeignete Verfahren für die Bestimmung dieser Marker finden sich zum Beispiel in Delmas, P.D., et al., J. Bone Min. Res. (1986) 1:333-337.
Die Untersuchung der vorliegenden Erfindung, die einen Index für die Bestimmung des Stoffwechselzustands von Geweben, die, wenn es zum Abbau kommt, von Kollagen abgeleitete Peptide und isomerisierte Peptide erzeugen, bereitstellt, ist in einer Vielfalt von Umständen nützlich. Erstens sind, wenn der Abbau von Typ I-Kollagen in Betracht gezogen wird, die Untersuchungen Verfahren, um einen abnormalen Zustand eines Subjekts zu untersuchen, indem zum Beispiel exzessive Knochenresorption angezeigt wird. Dies kann die Gegenwart einer Osteoporose-Krankheit oder das metastatische Fortschreiten eines bösartigen Tumors anzeigen. Sonstige Krankheitszustände, die durch exzessive Knochenresorption gekennzeichnet sind, umfassen die Paget-Krankheit und Hyperparathyroidismus. Gleicherweise können eine Anzahl von anderen Krankheitszuständen, die das Bindegewebe betreffen, durch Bestimmung des Kollagenabbaus beobachtet werden. Beispiele sind Typ II-Kollagen-Abbau, der mit rheumatoider Arthritis und Osteoarthritis verbunden ist, und Typ-III-Kollagen-Abbau beim Vaskulitissyndrom. Da der Zustand des Subjekts fortlaufend überwacht werden kann, kann die Anwendung dieser Untersuchungen auch eingesetzt werden, um den Fortschritt einer Therapie, die zur Behandlung dieser oder anderer Krankheiten angewandt wird, zu beobachten. Weiterhin können die Untersuchungen als eine Toxizitätsmessung eingesetzt werden, da die Anwendung von toxischen Substanzen oft zu Gewebeabbau führt.
Daher können die Untersuchungen in jeder beliebigen Situation angewandt werden, in der der Stoffwechselzustand von Kollagengeweben als ein Index des Krankheitszustands, der Behandlung oder des Effekts von Substanzen, die dem Subjekt direkt eingegeben wurden oder denen das Subjekt in seiner Umwelt ausgesetzt ist, verwendet werden kann.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen, diese aber nicht beschränken.
BEISPIEL 1: IMMUNOUNTERSUCHUNGEN FÜR SPEZIFISCHE PEPTIDSEQUENZEN IM HARN
Drei isomerisierte Peptide (α1(I)C1, α1(I)N1 und α2(I)N1) (siehe Tabelle 1), die mittels Festphasentechniken hergestellt wurden, werden zur Herstellung von Immunogenen verwendet. Zur Immunisierung werden die Peptidisomere kovalent an bovines Serumalbumin angebunden, unter Verwendung von Carbodiimid- oder Glutaraldehydreagenzien und von auf dem Fachgebiet wohlbekannten Verfahren. Sowohl monoklonale als auch polyklonale Antikörper sind gegen die Peptidisomere aufgestellt. Zur Erzeugung von monoklonalen Antikörpern werden Balb/c-Mäuse mit Peptidisomer-BSA-Konjugaten immunisiert und Hybridom-Zelllinien werden unter Verwendung von Standardtechniken hergestellt, nach Verschmelzung von Zellen aus der Milz oder aus Lymphknoten mit Ag8-Myelomzellen. Polyklonale Antikörper werden in Kaninchen und Hühnern erzeugt. Der Nachweis sowohl von Antisera als auch von Hybridomzellmedien wird durch ELISA unter Verwendung von Microtiterplatten durchgeführt, die mit dem geeigneten Peptidisomer-Proteinträger-Konjugat beschichtet sind, welches unter Verwendung von Carbodiimidreagenzien und auf dem Fachgebiet wohlbekannten Verfahren hergestellt wurde.
Untersuchungen für drei der Peptidisomersequenzen (α1(I)C1, α1(I)N1 und α2(I)N1) in Harn werden mittels eines Hemmungs-ELISA-Verfahrens wie folgt durchgeführt:
Harnproben (10 bis 25 μl), die möglicherweise Kollagenfragmente enthalten, bzw. Lösungen, die 0,015-15 μg Peptidisomer/ml als Bezugsstandards enthalten, werden zu 75 μl von immunologischen Bindepartnern für die Peptidisomere beigefügt, welche im Verhältnis von 1:5 000-1:20 000 in phosphatgepufferter saliner Lösung verdünnt sind, die 0,1% Tween-20-Detergens (PSB-T) enthält und 0,1% (w/v) an BSA beinhaltet. Jede Probe wird im Doppel in flachbodigen, 96-Well-Microtiterplatten aufbereitet, die zuvor mit einem Peptidisomer-Proteinträger-Konjugat, welches das geeignete Peptidisomer enthält, beschichtet wurden. Nach 60 Minuten werden die Platten mit PBS-T gewaschen (dreimal), und die gebundenen Antikörper werden durch Standardtechniken mit einem mit Meerrettich-Peroxidase markierten Antikörper, der gegen die Spezies des primären Antikörpers erzeugt wurde, detektiert. Peroxidasesubstrat wird beigefügt, und die Farbentwicklung wird bei 450 nm in einem automatisierten Microtiter-Lesegerät gemessen, nachdem die Enzymreaktion unter Verwendung von 1 M H₃ PO₄ gestoppt wurde. Proben, die den Analyt enthalten, vermindern die Bindung von einem primären Antikörper an das immobilisierte Peptidisomer auf der Platte und haben daher eine verminderte Farbkonzentration. Die Menge an Analyt in der Probe wird unter Bezugnahme auf zuvor festgelegte Kurven quantifiziert, die aus auf jeder Platte enthaltenen Standards unter Verwendung von LogLin-Plots berechnet wurden.
BEISPIEL 2: UNTERSUCHUNGEN UNTER VERWENDUNG EINES MONOKLONALEN ANTIKÖRPERS ZUM NACHWEIS VON ABBAUPRODUKTEN VON TYP I-KOLLAGEN
Monoklonale Antikörper wurden durch Immunisierung von Mäusen mit Isoasparaginsäure enthaltendem synthetischem α1(I)C1-Peptidanalog, konjugiert an ein geeignetes Trägerprotein, entwickelt. Zellverschmelzung, Clonen und Vermehrung von Hybridomen wurden nach Standardverfahren durchgeführt. Kontrollverfahren beinhalteten das Testen der Reaktivität auf synthetisches α1(I)C1-Peptidanalog, das auf Microtiterplatten immobilisiert war.
Die Spezifität der Antikörper wurde durch Hemmungsuntersuchungen getestet, indem verschiedene sich überlagernde Sequenzen aus dem C-Telopeptid von Typ I-Kollagen in Peptidanalogform verwendet wurden, d.h. einschließlich der isomerisierten Bindung als Asparaginsäure.
Eine Untersuchung, die einen solchen Antikörper MabA-ISO verwendet, wird entwickelt. Kurz gesagt, das Isoasparaginsäure enthaltende synthetische α1(I)C1-Peptidanalog wird unter Verwendung von Carbodiimid oder Glutaraldehyd an bovines Serumalbumin konjugiert und das Konjugat wird zum Beschichten von Microtiterplatten verwendet. Alternatives Material kann ebenfalls verwendet werden, wobei das wesentliche Merkmal die Freilegung der Sequenz EKAHiDGGR ist.
Nach dem Beschichten werden die Kammern der Microtiterplatten mit 15 μl Harn und 100 μl MabA-ISO, an Meerrettich-Peroxidase konjugiert, inkubiert.
Nach einer Stunde werden die Platten gewaschen und Substrat (z.B. TMB) wird beigefügt.
BEISPIEL 3: KORRELATION DES ELISA-VERFAHRENS FÜR EIN ISOASPARAGINSÄURE-PEPTIDANALOG ZU ELISA-UNTERSUCHUNGEN, DIE AUF ANDEREN PEPTIDFRAGMENTEN UND ANTIKÖRPERN BASIEREN
Die Korrelation zwischen einem polyklonalen ELISA-Verfahren gemäß dieser Erfindung und einem MabA7-ELISA-Verfahren wie in WO95/08115 beschrieben, an HPLC-getrennter Peptidspezies (a) synthetisch und (b) aus Harn wurde ausgewertet. Das MAbA7-ELISA-Verfahren ist eine kompetitive Untersuchung, in der der MAbA7 monoklonale Antikörper, der gegen das 8AA-Peptid (EKAHDGGR, in welchem D normale Asparaginsäure ist) gerichtet ist, verwendet wird und abgebautes Kollagen, das auf einem Microtiter-Tablett immobilisiert ist, mit Kollagenfragmenten in der Probe um Bindung an den monoklonalen Antikörper (MabA7) konkurriert.
Die in diesem Beispiel verwendeten ELISA-Verfahren werden wie folgt durchgeführt:
(a) DAS POLYKLONALE ISO-ELISA-Verfahren
Das polyklonale ELISA-Verfahren basiert auf einem immobilisierten synthetischen Peptidanalog mit einer Aminosäuresequenz von acht Aminosäuren (8AA), die spezifisch für einen isomerisierten Teil des C-Telopeptids der α1-Kette von Typ I-Kollagen (Glu-Lys-Ala-His-(Iso)Asp-Gly-Gly-Arg) ist. Während der Inkubation mit einem Antikörper, der mit dieser Sequenz reaktiv ist, findet eine Kompetition zwischen dem immobilisierten Peptidanalog in Iso-Form und den Zersetzungsprodukten der α1-Kette von Typ I-Kollagen in der Probe statt.
Kurz gesagt, eine 25 μL – Probe oder ein Standard wird jeder Kammer einer mit Formel 1 – Antigen beschichteten Microtiterplatte beigefügt, gefolgt von 75 μL Antiserum, das gegen mit Kollagenase behandeltes Typ I-Kollagen gerichtet ist. Die Platten werden eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert und fünf Mal mit einem Waschpuffer gewaschen. Ein Ziegen-Anti-Kaninchen-Immunoglobulin G-Meerrettichperoxidase-Konjugat (100 μL) wird jeder Kammer beigefügt. Nach Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur werden die Platten fünf Mal wie zuvor gewaschen. Das Enzymsubstrat (100 μL/Kammer) wird hinzugefügt, und nach 15 Minuten Inkubation im Dunkeln wird die Reaktion durch Zufügen von 100 μL Phosphorsäure (1 mol/L) gestoppt. Die optische Dichte von 450 nm wird mit einem Microplatten-Lesegerät gemessen. Doppelte Messungen werden für jede Probe durchgeführt, und die Daten werden als Nanogramm pro Mol an Creatinin (Cr) ausgedrückt, gemessen mittels einer colorimetrischen Standardtechnik. Diese Untersuchung wird hierin als ISO-ELISA-Verfahren bezeichnet.
Das MabA7 ELISA-Verfahren
MabA7 ist ein monoklonaler Antikörper, der wie oben beschrieben in Mäusen gegen das Peptid der Sequenz EKAHDGGR erzeugt wird, d.h. mit normaler Asparaginsäure.
Diese Untersuchungsversion wird in drei Schritten wie folgt ausgeführt:
Im ersten Schritt werden die Kammern einer Microtiterplatte, vorbeschichtet mit gereinigtem, mit Kollagenase behandeltem Kollagen (CTC), für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 15 μl Standardlösung oder -probe und 100 μl einer Lösung von an Peroxidase konjugiertem monoklonalm Antikörper inkubiert.
Nach Waschen im zweiten Schritt werden die Kammern im Dunkeln für 15 Minuten bei Raumtemperatur mit 100 μl Substratlösung inkubiert. Schließlich wird im dritten Schritt die Farbreaktion durch den Zusatz von 100 μl Stoppungslösung gestoppt. Das Absorptionsvermögen bei 450 nm wird innerhalb von 2 Stunden gemessen.
Beispiel 3(a)
Dieses Beispiel zeigt, dass Antikörper, die spezifisch entweder für synthetisches EKAHDGGR oder für EKAHiDGGR sind, entwickelt werden können.
Eine Mischung aus synthetischem EKAHDGGR und EKAHiDGGR wurde durch HPLC getrennt (1, Peak 3 bzw. Peak 2). Eine Sequenzanalyse bestätigte, dass Peak 2 isomerisiertes Aspartat enthielt. Dies wurde dadurch angezeigt, dass die Sequenzierung nach der Histidin-Residue angehalten war. Peak 3 enthielt reguläres Aspartat und das Entschlüsseln konnte normal fortschreiten. Fraktionen aus dem NPLC-Profil wurden gesammelt und sowohl in MabA7-ELISA als auch in polyklonalem ISO-ELISA-Verfahren auf Immunoreaktivität getestet. Es wurde gezeigt, dass die beiden Untersuchungen separate Peaks nachwiesen, d.h. Peak 2 wurde durch ein ISO-ELISA-Verfahren und Peak 3 durch ein MabA7-ELISA-Verfahren detektiert.
Die Resultate sind in 2 dargestellt.
BEISPIEL 3(b)
Dieses Beispiel zeigt, dass mit ISO-ELISA verbundene Moleküle aus Harn gereinigt werden können, und dass diese Moleküle in mit Dipeptid verwandte Spezies, die isomerisiertes oder reguläres Aspartat enthalten, aufgeteilt werden können.
Zuerst wurde Harn immunopurifiziert, wobei MAbA7 verwendet wurde. MAbA7 wurde an CNBr-aktiviertes Sepharose^TM gemäß der Anweisungen des Herstellers gekoppelt. Harn wurde 1:3 (v/v) in PBS-Puffer verdünnt und der pH auf 8,0 geregelt, wobei 1 M NaOH verwendet wurde. Achthundert ml verdünnter Harn wurden für 24 Stunden bei 4 °C bei einer Fließrate von 0,8 ml/Min. auf eine Säule (14 cm°) neu zugeführt. Nachdem die Säule mit 200 ml PBS-Puffer, pH 8,0, gewaschen worden war, wurden gebundene Antigene eluiert, wobei 20 ml von zu 50% gesättigtem (NH₄)₂ SO₄, das 1% TFA (v/v) enthielt, verwendet wurden, und bei –20 °C aufbewahrt. Die eluierten Antigene wurden entsalzt, wobei eine 1 ml-C18-Sep-PakTM-Säule verwendet wurde. Die Sep-Pak^TM-Säule wurde mit 20 ml 80-prozentigem Methanol (v/v) versetzt und mit 20 ml Wasser, das 1% TFA (v/v) enthielt, ausgeglichen, bevor das Antigen zugesetzt wurde. Gebundene Antigene wurden mit 20 ml Wasser, das 1% TFA enthielt, gewaschen und mit 40-prozentigem Acetonitril (v/v), das 0,1 TFA (v/v) enthielt, eluiert, gefriergetrocknet und bei –20 °C aufbewahrt.
Moleküle aus ausgewählten Spitzen, die durch das obige Verfahren erhalten worden waren, wurden weiter durch HPLC getrennt, wobei Trifluoroacetalsäure (TFA) als Ionenpaar verwendet wurde. Fraktionen wurden mittels Aminosäuren- Zusammensetzung, Aminosäuren-Sequenzierung, Massenspektrometrie und Immunoreaktivität in MabA7 und ISO-ELISA analysiert.
Die Fluoreszenz (3-Hydroxypyridinium-Querverbindungen) und das Absorptionsvermögen des HFBA-HPLC-Profils wird in 3 gezeigt. Durch weitere Trennung wurden reine Präparate erhalten und durch Massenspektrometrie und Immunoreaktivität (Tabelle 2), sowie durch Aminosäure-Sequenzierung (Tabelle 3) und Aminosäure-Zusammensetzung (Tabelle 4) getestet. Die Daten zeigen, dass drei getrennte Moleküle, alle mit einem Molekulargewicht um 2036 kDalton, identifiziert werden konnten (Tabelle 2). Aminosäuresequenzierung war nach Histidin in Peak F-24-17-10 blockiert, während die komplette Sequenz EKAHDGGR für die beiden anderen Peaks (F-26-18-09 und F-29-19-24, Tabelle 3) erhalten wurde. Aminosäuren-Zusammensetzungsanalyse (die isomerisiertes und reguläres Aspartat nicht trennt) bestätigte die drei in derselben Aminosäure enthaltenen Peaks.
Diese Daten führen zu der Annahme, dass drei unterschiedliche, quervernetzte, dipeptid-verwandte Spezies in dem Harn identifiziert wurden. Die Moleküle unterschieden sich dadurch, dass sie entweder isomerisiertes oder reguläres Aspartat in der Sequenz EKAHDGGR aufwiesen. Es wird angenommen, dass Peak F-24-17-10 zwei Peptidanaloge der Sequenz EKAHiDGGR enthält, Peak F-26-18-09 ein EKAHiDGGR und ein EKAHDGGR, und Peak F-29-19-24 zwei quervernetzte Peptide der Sequenz EKAHDGGR.
Zusätzlich wurde eine ähnliche Beobachtung an Molekülen mit einem Molekulargewicht um 2039 durchgeführt. Diese enthielten keine 3-Hydroxypyridinium-Querverbindungen (da Fluoreszenz abwesend war), und die Natur des Quervernetzers wurde nicht bestimmt. TABELLE 2 Nachweis durch MabA7 und ISO-ELISA-Verfahren von peptidverwandter durch HPLC von Harn getrennten Spezies
TABELLE 3 Sequenzdaten für peptidbezogene Moleküle in F-24-17-10, F-26-18-09 und F-29-19-24
TABELLE 4 Aminosäurezusammensetzung der Peptide F-24-17-10, F-26-18-09 und F-29-19-24 (Residue/Peptid)
Es wird gezeigt, dass die polyklonale Untersuchung spezifisch für das Isoasparaginsäure-Residuen enthaltende Peptidanalog ist, und dass die MabA7-Untersuchung spezifisch für das normale Asparaginsureresiduen enthaltende Peptid ist. Dipeptidanaloge, die sowohl die isomerisierte als auch die nicht isomerisierte Asparaginsäure enthalten, werden von beiden Untersuchungen nachgewiesen.
Die Anwendung dieser zwei Untersuchungen auf eine Harnprobe erlaubt daher einen Vergleich des Niveaus des Isoasparaginsäure enthaltenden isomerisierten Peptids und des Niveaus der normalen Form, wobei ein Hinweis auf das Ausmaß gegeben wird, in dem altes, bestehendes Knochengewebe abgebaut wird.
BEISPIEL 4
Die klinische Bedeutung des Vorhandenseins von isomerisiertem Peptidanalog in Serum wurde erforscht, indem Serumproben von postmenopausalen Frauen, entnommen vor und nach Behandlung mit einem Biphosphonat, Ibandronat (Boehringer, Mannheim), einer Analyse sowohl in einer Serumversion der vorstehend beschriebenen ISOELISA polyklonalen Untersuchung als auch in der auf MabA7 basierenden ELISA monoklonalen Untersuchung unterworfen wurden.
Die für die Messung von Typ I-Abbauprodukten in Serum entwickelte Untersuchung basiert auf einer immobilisierten synthetischen Peptid/Peptidisomer-Mischung, wobei die Aminosäuresequenz EKAHDGGR in Peptid- und in Peptidisomerform vorhanden ist. Kaninchen wurden immunisiert mit dem isomerisierten Peptid, konjugiert an BSA, unter Verwendung eines Carbodiimid-Verfahrens in zwei Schritten. Wenn das isomerisierte Peptid in den eingesetzten Kaninchen wesentlich mehr antigenisch ist als die Peptidform der Aminosäuresequenz, so kann man mit der an BSA konjugierten Peptid/Peptidisomermischung immunisieren. Zum Beschichten von Microtiterplatten wurde das Peptid unter Verwendung von Glutaraldehyd an Thyroglobulin konjugiert. Während der Inkubation mit diesem Antikörper findet eine Kompetition zwischen dem immobilisierten Peptidisomer (wobei das immobilisierte Peptid in der Untersuchung inaktiv ist) und den Abbauprodukten von Typ I-Kollagen in Serum statt. Wenn sich der Peptidgehalt in der Lösung erhöht, werden sich weniger Antikörper an das immobilisierte Peptidisomer binden, was zu einer abnehmenden optischen Dichte führt.
Kurz gesagt, 50 μl Standard (Mischung aus synthetischem 8AA-Peptidisomer/Peptid) oder unbekannte Probe in einem Teströhrchen wird 100 μl Assay-Puffer (500 mM TRIS, o,0% Tween 20, 1,0% BSA; pH = 6,5) beigefügt. Von diesen 150 μl werden 50 μl in die geeigneten Wells in der vorbeschichteten ELISA-Platte pipettiert. Dann werden 50 μl Antikörper-Lösung (Kaninchen-Antiserum gegen EKAHiDGGR, verdünnt 1 + 20 000 in Assay-Puffer) jeder Kammer zugefügt, die Platte wird mit Dichtungsband bedeckt und bei Raumtemperatur 60 Minuten lang auf einer Schüttelvorrichtung inkubiert. Alle die nachfolgenden Verfahren wurden ebenfalls bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach Inkubation wurden die Platten dreimal mit verdünntem Wasch-Puffer (25 mmol/l TRIS und 50 mmol/l NaCl, pH = 7,2) gewaschen.
Ein an Peroxidase konjugierter Antikörper (an HRP konjugierte Ziegen-Antikörper gegen Kaninchen-IgG (Jackson Immunochemicals, PA), verdünnt 1 + 4000 im Untersuchungspuffer, 100 μl/Kammer) wurde hinzugefügt und die abgedichteten Kammern wurden 60 Minuten lang auf einer Schüttelvorrichtung inkubiert. Nach einem weiteren Waschverfahren wurden 100 μl an TMB-Substrat-Lösung allen Kammern beigefügt, welche abgedichtet und 15 Minuten lang inkubiert wurden. Die Enzymreaktion wurde nach 15 Minuten gestoppt mittels Zusatz von 100 μl Stoppungslösung. Die optische Dichte wurde in einem ELISA-Lesegerät bei 450 nm abgelesen.
Eine Eichkurve wurde auf einem log-linearem Diagrammpapier konstruiert, indem das durchschnittliche Absorptionsvermögen der fünf Standards (25 ng/ml-500 ng/ml) graphisch dargestellt wurde. Die Konzentration des EKAHiDGGR-Äquivalents in jeder Patientenprobe wurde durch Interpolation auf der Eichkurve bestimmt.
Die Ergebnisse sind in 4 und 5 dargestellt. In 4 ist keine wesentliche Veränderung zu sehen im Serumlevel von Molekülen, die in der monoklonalen Untersuchung reaktiv sind, welche auf Moleküle gerichtet ist, die mit der Peptidsequenz EKAHDGGR um reaktive Antikörper konkurrieren, vor und nach einer fünfzehnmonatigen Behandlung mit einem Therapeutikum, von dem erwartet wird, dass es die Knochenresorptionsrate reduziert. In 5 sieht man eine Abnahme von mehr als 60%, in der Folge einer sechsmonatigen Behandlung mit 2,5 mg/Tag Ibandronat, im Level von Molekülen, die in der polyklonalen Untersuchung aktiv sind, welche auf Moleküle gerichtet ist, die mit dem nicht-peptidischen EKAHiDGGR um Antikörper in dem polyklonalen Serum konkurrieren, was das erwartete Resultat der therapeutischen Behandlung reflektiert.
Dieses Beispiel weist darauf hin, dass die Summe an Peptiden in Serum, die die Sequenz EKAHDGGR beinhalten, was quervernetzte Peptide von der in US 5455179 beschriebenen Art und ähnliche, auf sonstigen Quervernetzungen basierende Moleküle oder überhaupt nicht quervernetzte Moleküle umfassen kann, keine Indikatoren der Knochenresorptionsrate sind, sondern dass die verwandten nichtpeptidischen Moleküle, erzeugt durch Isomerisierung der Bindung der Asparaginsäure in der Aminosäuresequenz, solche Indikatoren sind.
Es wird angenommen, dass die Spezifität für das isomerisierte Analog des Octapeptids den ISOELISA unempfindlich für in dem Serum vorhandene Moleküle lässt, die in dem MabA-ELISA reaktiv sind. Das Maß an Isomerisierung steht vermutlich mit dem Alter des Knochens in Zusammenhang und ist daher ein quantifizierbarer Marker für den Umsatz an vollentwickeltem Knochen, während die in der monoklonalen Untersuchung eingreifenden Moleküle in keiner Beziehung zu Knochenresorption stehen und aus dem Umsatz von „jungen" Kollagenmolekülen stammen könnten, z.B: aus proteolytischem Abbau von extrazellularem Kollagen, das noch nicht in die Knochenmatrix inkorporiert ist, oder erzeugt während des Umsatzes von kurzlebigem Typ I-Kollagen an nichtskelettalen Orten.
Zudem kann es sein, obwohl angenommen wird, dass der Körper über Mechanismen zur Reparatur von Schäden an Proteinen durch Isomerisierung an Aspartat verfügt, dass im Knochen Kollagen von diesen Reparaturmechanismen abgeschirmt ist, was Isomerisierung zu einem ungewöhnlich guten Indikator für die Resorption von „altem" Kollagen im Falle von Knochen macht.
Während die Erfindung unter Bezugnahme auf spezifische Beispiele beschrieben wurde, sind viele Variationen derselben innerhalb des Anwendungsbereichs der Erfindung, der durch die angehängten Ansprüche definiert ist, möglich. Zum Beispiel kann die Erfindung generell auf die Asparaginsäure oder Asparagin enthaltenden Proteine angewandt werden, und nicht nur auf Kollagene.

Claims

Verfahren zur Messung der Abbaurate eines spezifischen Körperproteins, umfassend: Bestimmen der Menge eines oder mehrerer Isoasparaginsäure enthaltender, isomerisierter Peptide mit einer Aminosäuresequenz, die diese Spezies charakteristisch für das Körperprotein in einer Körperflüssigkeit macht.
Verfahren nach Anspruch 1, das die Menge mindestens eines Isoasparaginsäure enthaltenden, isomerisierten Peptides in der Körperflüssigkeit bestimmt.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das isomerisierte Peptid oder die isomerisierten Peptide charakteristisch für Kollagene sind.
Verfahren nach Anspruch 3, umfassend das Bestimmen der Menge des Peptidanalogs von Formel 2 (nachstehend), das in der Körperflüssgkeit vorhanden ist:
wobei K-K-K jede beliebige natürlich vorkommende Quervernetzung ist und Isoasparaginsäure, oder eines oder mehrerer Peptidanaloge, welche ein Epitop beinhalten, das in dem Isoasparaginsäure enthaltenden Peptidanalog von Formel 2 vorhanden ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Bestimmung unter Verwendung eines immunologischen Bindepartners durchgeführt wird, der spezifisch für eine Isoasparaginsäure enthaltende Spezies ist, die in der Probe während des Verfahrens vorhanden ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der immunologische Bindepartner ein gegen ein lineares Peptidanalog gerichteter Antikörper ist, der einer Sequenz in Kollagenen entspricht, wobei die Isoasparaginsäure in der Aminosäuresequenz die Asparaginsäure in der Kollagensequenz ersetzt.
Die Verwendung zur Bestimmung von von einem Protein abgeleiteten isomerisierten Peptiden eines synthetischen Isomers eines Peptids, das Asparaginsäure enthält und eine Aminosäuresequenz aufweist, die einer charakteristischen Sequenz in dem Protein entspricht, welche dazu dient, dieses Protein zu identifizieren, wobei Isoasparaginsäure in der Aminosäuresequenz die Asparaginsäure in der Proteinsequenz ersetzt.
Antikörper, der spezifisch ist für eine Aminosäuresequenz, die in isomerisierten Peptiden in einer menschlichen Körperflüssigkeit vorkommt, welche Fragmente sind, die durch den Abbau eines menschlichen Körperproteins erzeugt werden, wobei diese Aminosäuresequenz Asparaginsäure enthält und einer charakteristischen Sequenz in dem Protein entspricht, die dazu dient, das Protein zu identifizieren, wobei Isoasparaginsäure in der Aminosäuresequenz die Asparaginsäure in der Proteinsequenz ersetzt.
Antikörper nach Anspruch 8, der spezifisch ist für eine Peptidisomersequenz, die die Aminosäuresequenz EKAHiDGGR beinhaltet, oder für ein Epitop, das in dieser Sequenz eingebunden ist und iD enthält, wobei iD Isoasparaginsäure ist.
Antikörper, der spezifisch ein Peptidisomer mit einer Aminosäuresequenz erkennt, die Asparaginsäure enthält und einer charakteristischen Sequenz in Kollagenen entspricht, wobei Isoasparaginsäure in der Aminosäuresequenz die Asparaginsäure in der Kollagensequenz ersetzt.
Eine Zelllinie erzeugender monoklonaler Antikörper, der ein Antikörper nach einem der Ansprüche 8 bis 10 ist.
Antikörper nach einem der Ansprüche 8 bis 10, der mit einem nachweisbaren Marker gekoppelt ist.
Die Verwendung zur Untersuchung einer Körperflüssigkeit auf von einem Protein abgeleitete isomerisierte Peptide eines Antikörpers, der spezifisch ist für eine Aminosäuresequenz, welche einer charakteristischen Sequenz in einem Protein entspricht, die dazu dient, das Protein zu identifizieren, wobei Isoasparaginsäure in der Aminosäuresequenz die Asparaginsäure in der Proteinsequenz ersetzt, um Informationen bezüglich der Menge von Isoasparaginsäure enthaltendem Peptidanalogs oder Peptidanalogen in der Körperflüssigkeit zu erhalten.
Synthetisches Peptidanalog mit einer Aminosäuresequenz, die einer charakteristischen Sequenz in Kollagenen entspricht, wobei Isoasparaginsäure in der Aminosäuresequenz die Asparaginsäure in der Kollagensequenz ersetzt.
Synthetisches Peptidanalog nach Anspruch 14, wobei ein Glycinrückstand neben dem Isoasparaginsäurerückstand besteht.
Verfahren zum Erhalten von Information über Proteinabbau in einem Patienten, umfassend: Messen der relativen Mengen mindestens eines Asparaginsäure enthaltenden Peptides, das von einer Aminosäuresequenz abgeleitet ist und diese enthält, welche das Peptid in einer Körperflüssigkeit charakteristisch für ein Protein macht, sowie eines entsprechenden Isoasparaginsäure enthaltenden Peptidanalogs.
Testkit zur Verwendung in einem Untersuchungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, umfassend: einen Antikörper nach einem der Ansprüche 8 bis 10 oder ein Fragment desselben, das dieselbe spezifische Wirksamkeit aufweist, in Kombination mit irgendeinem oder mehreren der folgenden: ein synthetisches Peptidanalog, das Isoasparaginsäure enthält, die gegen den Antikörper oder das Antikörperfragment reaktiv ist, ein Antikörper-Enzym-Konjugat undoder ein Substrat für dieses, eine die Reaktion des Enzymkonjugat-Substrats stoppende Zusammensetzung, oder eine Waschlösung.