JPH11502622A

JPH11502622A - 体液中のタンパク質断片の検定方法

Info

Publication number: JPH11502622A
Application number: JP8528893A
Authority: JP
Inventors: フレデリウス、クリスチャン; ボンデ・マーチン; クビスト・ペル
Original assignee: オステオメーター・ビオテク・エー／エス
Priority date: 1995-03-24
Filing date: 1996-03-21
Publication date: 1999-03-02
Also published as: EP0820598B1; WO1996030765A1; DE69636749D1; EP0820598A1; DE69636749T2; ES2278383T3; GB9506050D0; CN100430727C; US6210902B1; BR9607854A; AU712375B2; AU5146896A; CN1185209A; ATE347697T1

Abstract

(57)【要約】骨コラーゲンなどの身体タンパク質の分解を、アスパラギン酸またはアスパラギンのαカルボン酸基に結合しているペプチドが異性化されてアスパラギン酸の側鎖のカルボン酸基に結合してアミド結合になった前記タンパク質の異性化ペプチド断片を体液中に検出することによって検討する。上記異性化ペプチド配列に特異的な抗体を検定に使用する。

Description

【発明の詳細な説明】体液中のタンパク質断片の検定方法本発明は、コラーゲンなどのタンパク質の分解生成物の検定方法およびその方法を実施するのに有用な物質に関する。コラーゲンとコラーゲン代謝の障害骨粗鬆症はヒトの最も普通の骨の疾患である。原発性骨粗鬆症は、骨折を起こし易くなるが、骨格の骨重量が徐々に減少することが原因である。米国だけで15 00万〜2000万人の個体がかかっていると推定されている。その原因は、骨の再造形すなわち骨組織の形成と吸収の速度の年齢に関連する平衡異常である。米国では、約538,000件の脊椎の圧迫骨折、約227,000件の股関節骨折およびかなりの数の周辺骨の早期骨折を含む約120万件の骨粗鬆症関連の骨折が毎年、高齢者に起こっている。股関節の骨折は重篤な外傷と出血を起こすので、股関節骨折の12〜20％は致命的であり、存在している患者の半数は養護施設での看護が必要である。骨粗鬆症関連の損傷による全経費は現在、米国で年間少なくとも100 億ドルに達している（Riggs、New England Journal of Medecine、327巻、620〜 627頁、1992年）。骨粗鬆症は閉経後の女性にとって最も普通の疾患であり、これら女性は閉経後 10年間で、平均してその骨重量の15％を失う。またこの疾患は、高齢になった男性と若い無月経女性のスポーツ選手にも起こる。骨粗鬆症が増大している重大な社会的経済的な問題であるにも関わらず、患者または健常者の骨吸収率（resorp tion rate）を測定する信頼性の高い検定法の利用が非常に限られている。コラーゲン代謝の異常を伴う（および該異常に関連する）他の疾患としては、パジェット病、マルファン症候群、骨形成不全症、膠原組織における新生物増殖、こびと症、リウマチ様関節炎、骨関節症および脈管炎症候群がある。公知の3クラスのヒトコラーゲンが現在までに報告されている。クラスＩのコラーゲン（Ｉ、II、III、ＶおよびXI型に小区分されている）は再線維を生成することが知られている。Ｉ〜III型のアミノ酸配列（すでに解明された結果）は、国際特許願公開第WO75/08115号の付録Aに示されている。コラーゲンＩ型は骨の有機マトリックスの90％以上を占めている。したがって、原則的に、コラーゲンＩ型の分解を監視することによって骨吸収率を推定することが可能である。同様に、結合組織を含むいくつかの他の疾患の状態はコラーゲンの分解を測定することによって監視することができる。その例は、リウマチ様関節炎と骨関節症に関連するコラーゲンII型の分解と脈管炎症候群のコラーゲンIII型の分解である。ヒトIII型コラーゲン、ヒトプロα1（II）コラーゲンおよびヒトIII型コラーゲンの全プレプロα１（III）連鎖のアミノ酸配列ならびに対応するCDNAクローンはいくつもの研究者グループによって研究・測定されている（Loilら、Nuclei c Acid Research、12巻、9383〜9394頁、1984年；Sangiorgiら、Nucleic Acids Research、13巻、2207〜2225頁、1985年；Baldwinら、Biochem．J.、262巻、521 〜528頁、1989年；およびAla-KOKKOら、Biochem．J.、260巻、509〜516頁、1989 年参照）。Ｉ、IIおよびIII型のコラーゲンはすべて、プロコラーゲン分子として生物内で形成され、この分子はコアコラーゲン分子に結合したN末端とC末端のプロペプチド配列で構成されている。コラーゲン合成中、生体内で自然に起こる上記プロペプチドの消失の後、コラーゲン分子の残っているコアは、大部分が、非三重らせんである末端テロペプチド配列を有する三重らせん領域で構成されている。これらのテロペプチド配列は、コラーゲン細線維を細胞外で分子間架橋する部位として重要な機能をもっている。αらせん領域も架橋可能な部位をもっている。分子間架橋を行うと、生化学的に安定なコラーゲン細線維が得られる。これら架橋の生成は、リシン(lysine)およびヒドロキシリシンの残基を修飾して対応するアルデヒドにすることによって開始される。コラーゲンの隣接する連鎖上に配列されているこれら残基のいくつかは、自発的に、異なる分子間架橋を生成する。コラーゲンテロペプチド上およびそのらせん領域から架橋する部位の正確な位置は、すでに報告されている（例えば、Kuhn、K.、"Immunochemistry of the ex tracellular matrix"、1巻、1〜29頁、1982年、米国フロリダ州ボカラトン所在のCRC Press Inc.社；Eyre、D．R.、Ann．Ret．Biochem.、53巻、717〜748頁、1 984年；または米国特許第5140103号および同第5455179号を参照）。さらに、Ｉ、IIおよびIII型のコラーゲン中の架橋する可能性があるいくつかの部位のアミノ酸配列を以下の表Ｉに示す。繊維状タンパク質であるコラーゲンとエラスチンはリシンまたはヒドロキシリシンの側鎖からアルデヒドが生成することに基づいた独特の秩序によって架橋する。架橋の4種の遺伝子座は、Ｉ、IIおよびIII型のコラーゲンの分子の中に明らかに存在している（総説については、K hn、K．"Immunochemistry of the extra cellular matrix"、1巻、1〜29頁、1982年参照）。二つがアルデヒド部位であり、各テロペプチド領域に一つづつある。他の二つの部位は、その分子の各末端から約90個の残基の位置に対称的に配置されているヒドロキシリシンである。コラーゲン分子がかたまって原線維になるとき、らせん領域中のこれら後者の部位は一列に並んで隣接する分子中のテロペプチドアルデヒドと反応する。3-ヒドロキシピリジニウム残基が、ヒドロキシリシン由来アルデヒドから生じる成熟架橋であることは現在強力な証拠がある。しかし、他の経路の成熟架橋残基すなわちリシン残基のアデヒド生成由来の成熟架橋残基はまだ不明である。以下に考察するヨーロッパ特許第0394296号の式で示されているように、2種の 3-ヒドロキシピリジウムの架橋は、ヒドロキシリシルピリジノリン（単に「ピリジノリン」として知られている）およびリシルピリジノリン（「デオキシピリジノリン」として知られている）であることが分かっている。これらの架橋化合物は自然に蛍光を発する。いくつかのヒドロキシリシルピリジノリンの架橋は、例えばヨーロッパ特許願公開第A-0424428号で考察されているようにグリコシル化されていることが分かっている。しかし、Lastら、Int．J．Biochem.、22巻、6号、559〜564頁、1990年に記載されているように、コラーゲン中には他の架橋が天然に存在している。コラーゲン分解の従来技術の検定法従来、生体内でのコラーゲンの分解を監視する検定法は、各種の生化学的マーカー（そのいくかはコラーゲンの分解生成物であった）を測定することによって開発されてきた。例えば、ヒドロキシプロリンすなわちほとんどコラーゲンに限定されているアミノ酸、および骨の主要な構造タンパク質と他のすべての結合組織が尿中に分泌されている。その分泌率（excretion rate）は、特定の症状、特にパジェット病すなわち以下にさらに考察するように骨の代謝回転が著しく増大する代謝性骨疾患の場合に増大することが知られている。このため、尿のヒドロキシプロリンが、コラーゲン分解のアミノ酸マーカーとして広く使用されてきた（Avioli、L．V.およびKane、S．M.編集、"Metabolic B one Disease " VOl II、489〜575頁、1978年、米国ニューヨークのAcademic Pre ss社のSinger、F．R.らの報告）。米国特許第3600132号は、コラーゲン代謝の逸脱を監視するため、血清、尿、腰椎液および他の細胞間液などの体液中のヒドロキシプロリンを測定する方法を開示している。この特許は、ヒドロキシプロリンが、パジェット病、マルファン症候群、骨形成不全症、膠原組織における新生物増殖および各種形態のこびと症などの症状に関連するコラーゲンの同化または異化の増大と相関関係があると述べている。パジェット病と関連する骨吸収も、骨コラーゲンの分解に続いて尿中に分泌される、ヒドロキシプロリン含有の小ペプチドを測定することによって監視されている（Russellら、Metab．Bone Dis．and Rel．Res.、4および5、2250262、1981 年；およびSinger、F．R.らの前掲報文）。パジェット病の場合、尿のヒドロキシプロリンが増大するのは恐らく、大部分が骨の分解が原因であるが、ビドロキシプロリンは一般に、骨分解の特別の指標として使用できない。尿中のヒドロキシプロリンの多くは、新しいコラーゲンの合成（かなりの量の新しく製造されたタンパク質が分解して組織の構造に組み込まれることなしに分泌される）ならびに特定の血液タンパク質およびヒドロキシプロリンを含有する他のタンパク質の代謝回転が原因で生じる。さらにタンパク質の分解由来の遊離ヒドロキシプロリンの約80％が肝臓で代謝され、尿中には消して現れない（Kiviriko,、K．I.、Int．Rev．Connect．Tissu e Res.、5巻、93頁、1970年およびWeiss、P．H.およびKlein、L.、J．Clin、Inv est.、48巻、1頁、1969年）。ヒドロキシプロリンは、骨吸収に対してたとえ特異的でなくても骨のコラーゲンに対して特異的なので、骨粗鬆症に対して優れたマーカーであるが、取扱いが面倒である。ヒドロキシリシンとそのグリコシド誘導体は、ともに膠原タンパク質に固有のものであるが、コラーゲン分解のマーカーとしてヒドロキシプロリンより正確であると考えられている。しかし、ヒドロキシプロリンについて先に記載したのと同じ理由で、ヒドロキシリシンとそのグリコシド類は恐らく、同様に骨吸収の非特異的マーカーである（Krane、S．M.およびSimon、L．S.、Develop．Biochem.、22巻、185頁、1981年）。他の研究者らは、関節疾患におけるコラーゲン分解の指標として尿中の架橋化合物3-ヒドロキシピリジニウムを測定している（背景および実例として、WuおよびEyre、Biochemistry、23巻、1850頁、1984年；Blackら、Annals of the Rheum atic Diseases、45巻、969〜973頁、1986年；およびSeibelら、The Journal of Dermatology、16巻、964頁、1989年参照）。本発明とは対照的に、これらの従来の研究者達は、体液由来のタンパク質を加水分解し次いで遊離の3-ヒドロキシピリジニウム残基の存在を探究している。Ｉ、IIおよびIII型のコラーゲンの分解を測定する検定法は、ヨーロッパ特許第0394296号および米国特許第4973666号と同第5140103号に開示されている。しかし、これらの特許は、架橋物質3-ヒドロキシピリジニウムを含有するコラーゲン断片に限定されている。さらに、上記検定法は、この検定法で抗体の産生および抗原に利用するため、3-ヒドロキシピリジニウムを含有するコラーゲン断片を尿から得るのに、面倒で複雑な精製を行う必要がある。現在、米国特許第4973666号および同第5140103号に記載されている方法を用いる非常に少ない臨床データが利用できる。特に、Ｉ型コラーゲンの3-ヒドロキシピリジニウム含有テロペプチドの尿中濃度（上記諸特許に記載の方法で測定される）と実際の骨の損失（骨の密度測定法で繰返し測定することによって求める）との間の相関関係に関するデータは全く発表されていない。尿中に3-ヒドロキシピリジウム含有テロペプチドが存在している場合、骨吸収プロセスの前の色々の時点で、この特別の架橋構造が骨組織中に適正に生成している必要がある。これらのプロセスについてはごくわずかの情報しか利用できないので、上記架橋構造の正しい生成にこのように依存することは避けることが望ましい。英国特許願第 2205643号は、身体内でのIII型コラーゲンの分解は、III型コラーゲン由来のN末端テロペプチドの体液内濃度を測定することによって定量的に測定できると報告している。この方法は、III型コラーゲンを細菌コラゲナーゼで分解することによって放出されるN末端テロペプチドに対して生成する抗体を使用する。なおこのテロペプチドはこの検定法では標識化して用いる。 Schroter-Kermariら、Immunol．Invest.、19巻、475〜491頁、1990年には、Ｉ型とII型のコラーゲンのCNBr断片に基づいた免疫学的測定システムが記載されている。組織中のテロペプチドから発生するペプシン可溶化コラーゲンが利用されている（上記英国特許願第2205643号参照）。したがって上記断片とこれに対する抗体との間の類似性はない。その上、この文献には、抽出した組織の試料について測定した記載されていない。ペプシン可溶化Ｉ型コラーゲンに対するモノクローナル抗体の発生は、Werkme isterら、Eur．J．Biochem.、1987巻、439〜443頁、1990年に記載されている。この抗体は、組織セグメントの免疫組織化学的染色および細胞培養中のコラーゲン含量の測定に用いられている。体液についての測定は行われていない。ヨーロッパ特許願第0505210号は、Ｉ型コラーゲン由来の架橋C末端テロペプチドの精製物で免疫化することによる抗体試薬（antibody reagent）の発生を記載している。その免疫原は、ヒトの骨コラーゲンを細菌コラゲナーゼで可溶化することによって調製している。このようにして調製した抗体は、架橋したテロペプチドと架橋していないテロペプチドの両者およびピリジノリン以外の架橋物質と反応することができる。国際特許願公開第WO91/09114号には、固体基質に対する細胞接着を促進するのに使用される特定の合成ペプチドが開示されている。その合成ペプチドを免疫学的試薬として使用することは記載されていない。特定のプロコラーゲンペプチドを定量することによってコラーゲンの分解を測定できることを示す報告がいくつかある。プロペプチドは、プロコラーゲン分子中のタイミングによって、コラーゲンコアのテロペプチドとα-らせん領域から識別されている（米国特許第4504587号；同第4312853号；Pierardら、Analytica l Biochemistry、141巻、127〜136頁、1984年；Niemela、Clin．Chem.、31/8、 1301〜1304頁、1985年；およびRohdeら、European Journal of Clinical Invest igation、9巻、451〜459頁、1979年参照）。ヨーロッパ特許願第0298210号および同第0339443号の両者には、III型プロコラーゲンペプチドおよびその断片の免疫学的測定法が記載されている。さらに、プロコラーゲンの測定に基づいた方法がヨーロッパ特許願第0465104号に開示されている。免疫学的試薬を発生させるためにIX型コラーゲン由来の配列を有する合成ペプチドを使用することがPCT特許願公開第WO90/08195号に開示されている。さらに、この特許願には、そのようにして製造した抗体を、体液のIX型コラーゲン断片を測定するのに使用することが記載されている。米国特許第4778768号は、滑液試料中のプロテオグリカンモノマーまたはその抗原断片を定量して行う、関節軟骨に起こる変化の測定法に関するものである。 Dodge、J．Clin．Invest.、83巻、647〜661頁、1981年には、ヒトとウシのII 型コラーゲンの無傷のα連鎖と臭化シアン誘導ペプチドと特異的に反応するポリクローナル抗血清を利用するII型コラーゲン分解の分析法が開示されている。コラーゲンの分解生成物は体液中に検出されなかったが、細胞培養物を染色することによって組織化学的にすなわち「その場で（in situ）」検出された。国際特許願公開第WO94/03813号には、試料中のコラーゲンまたはコラーゲン断片を検出する競合免疫検定法が記載されている。この方法では、コラーゲンの非らせん形のC末端またはN末端のドメインに対応する合成線状ペプチドを含有する結合パートナーを、その線状合成ペプチドに対する抗体および試料とともにインキュベートし次いでその抗体の結合パートナーに対する結合を測定している。国際特許願公開第WO95/08115号は、体液中のコラーゲン断片を、合成ペプチドと反応性の抗体と反応させることによって測定する検定法に関する特許である。この検定法は、試料とこのようなペプチドが、抗体、おそらくコラーゲンのコラゲナーゼによる分解で得られるコラーゲンの断片に対して生成するポリクローナル抗体に対して競合する競合検定法である。あるいは、この検定法は、抗体、おそらくかような合成ペプチドに対して生成したモノクローナル抗体を使用する検定法である。体液中、特に尿中に我々が発見した一つの特定のペプチド断片は下記式1で表されるフラグナントである。上記式において、K-K-Kは、例えばホドロキシピリジウム架橋であってもより架橋を表すが天然に存在する架橋でもよく、具体的に述べれば、Lastらの上記引用文献で考察されているいずれの架橋でもよい。上記の小さい断片を含めて大きいペプチド断片がヨーロッパ特許第0394296号に報告されている。我々はいまや、体液中の「ペプチド」断片の比率が、式1中のアスパラギン酸が異性化しイソアスパラギン酸になった同等のアミノ酸配列のペプチド例えば式 1で表されるペプチドに関連していることを発見したのである。我々は本明細書で「ペプチド」をいう用語を用いるが、この異性化が起これば、これらの種はもはや正確にはペプチドとはみなされないことを意味する。アスパラギン酸を含有するタンパク質の異性化は、生理的条件下で起こる自然反応であることがすでに報告されている（例えば、Brennanら、Protein Science 、2巻、331〜338頁、1993年；Gallettiら、Biochem．J.、306巻、313〜325頁、1 995年；Lowensonら、Blood Cells、14巻、103〜117頁、1988年；およびOliyaら、Pharmaceutical Research、11巻、5号、751頁、1994年参照）。異性化は、以下の図に示すようにアスパラギン酸残基のカルボキシ末端方向の下流に位置するペプチド連鎖の部分が、正常タンパク質内でペプチド結合で結合しているアスパラギン酸のαカルボン酸から、非ペプチドアミド結合の側鎖カルボン酸に移行する作用である。その非ペプチド結合のアスパラギン酸残基は「イソアスパラギン酸」と呼ばれている。類似の異性化は、アスパラギン残基を含有するタンパク質（すなわち上記反応式中の出発タンパク質の-OHの代わりに-NH2を有するタンパク質）にも起こる。上記発見は、この異性化は骨組織にも起こるのでその異性化の程度は関連する骨組織の年齢の指標になると期待されることを示している。さらに、このような骨ペプチド断片中に上記異性化ペプチドが存在していることは、これら断片が実際に骨の分解に由来するものであり、新しく生成して骨に組み込まれなかったコラーゲンが分解して生じたような他の何らかの原因によるものではないことを確証している。したがって、本発明は、第一の態様で、体液中の一種以上のイソアスパラギン酸を含有する種の量を測定することからなる、コラーゲンのような身体タンパク質（body protein）の、例えば骨からの分解率を測定する方法を提供するものである。問題の異性化ペプチドはＩ型、II型またはIII型のコラーゲンに特徴的なものであるが、Ｉ型コラーゲンに特徴的な異性化ペプチドが好ましい。かような方法は、さらに好ましくは、前記体液中に存在する、一種以上の特別のイソアスパラギン酸を含有する異性化ペプチドの量を測定する。この方法は、好ましくは、前記体液中に存在する下記式2：（式中、*はその一方または両者はイソアスパラギン酸である）で表される異性化ペプチドの量、またはイソアスパラギン酸を含有する式2で表される異性化ペプチド中に存在するとエピトープを含有する一種以上の異性化ペプチドの量を測定する。上記式中、K-K-Kは、ピリジノリン（グリコシル化されていてもグリコシル化されていなくてもよい）またはデオキシピリジノリンでもよいヒドロキシピリジニウム架橋などの架橋である。好ましくは、前記測定は、測定中試料内に存在する、イソアスパラギン酸含有の種、すなわち好ましくは、式2で表される前記異性化ペプチド、またはイソアスパラギン酸を含有する式2の異性化ペプチド中に存在するエピトープを含有する異性化ペプチドに対して特異的な免疫学的結合パートナーを用いて実施する。その免疫学的結合パートナーはモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体でよい。免疫学的結合パートナーがイソアスパラギン酸含有種に対して特異的であるという必要条件は、その免疫学的結合パートナーが、前記種および類似のアスパラギン酸含有種（ペプチド）を検定法にとって有用な経度に識別することを意味する。また適切な免疫学的結合パートナーとしては、同じ抗原決定基に結合できる、 Fab、Fab′およびF(ab′)2の断片を含む抗体の断片も含まれる。好ましくは、免疫学的結合パートナーは、前記アミノ酸配列中に前記コラーゲンタンパク質配列中のアスパラギン酸の代わりにイソアスパラギン酸を有するコラーゲン内の配列に対応する、線状異性化ペプチド、好ましくは合成の異性化ペプチドに対する抗体である。この検定法にはELISA、RIAまたIRMAを含めて多くの形態のものがある。これらの方法は非常によく知られているので本明細書では説明しない。第二の態様で、本発明は、前記アミノ酸配列中に、前記コラーゲンタンパク質配列中のアスパラギン酸の代わりにイソアスパラギン酸を有するコラーゲン内の配列に対応するアミノ酸配列を有する、コラーゲン由来の異性化ペプチドまたは合成の異性化ペプチドの検定法での使用に関する。競合検定法で、前記合成の異性化ペプチドを用いて、免疫学的結合パートナーに対して、試料中の一種以上の異性化ペプチドと競合させることができる。この種のELISA法では、上記合成ペプチドは固体支持体に固定化する。試料を、固定支持体と接触しているペプチドの合成異性体に対するポリクローナル抗体とともにインキュベートし、次に洗浄した後、ペルオキシダーゼ接合（暴露）抗体を添加する。さらにインキュベートした後、ペルオキシダーゼ基質溶液を添加する。競合によって、上記抗体と反応性の、試料中のペプチド異性体は、上記ペルオキシダーゼの反応を阻害する。あるいは、上記合成ペプチド異性体を用いてモノクローナル免疫学的結合パートナーを生成させることができる。したがって、上記合成異性化ペプチドは検定時に競合試薬を必要としない。例えば、コラゲナーゼで処理したコラーゲンを精製し、固体支持体に固定化し、次いでモノクローナル抗体を用いてELISA法を実施することができる。したがって、第三の態様で、本発明には、前記アミノ酸配列中例えばコラーゲン配列中に、前記タンパク質中のアスパラギン酸の代わりにイソアスパラギン酸を有するタンパク質、例えばコラーゲン内の配列に対応するアミノ酸配列に特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体が含まれる。本発明のこの態様の好ましい実施態様で、抗体は、配列：EKAHiDGGRを含有しているかまたは前記配列中に存在するiD（イソアスパラギン酸を示す）の存在に対して特異的なエピトープを含有する異性化ペプチド配列に対し特異的な抗体である。したがって、本発明のこの態様には、ペプチド異性体の配列EKAHiDGGR（式中i Dはイソアスパラギン酸である）を含有するか、該配列に含まれているか、または該配列で構成されているエピトープと反応性の抗体、好ましくはモノクローナル抗体が含まれる。第四の実施態様で、本発明には、前記アミノ酸配列中に前記コラーゲンタンパク質配列中のアスパラギン酸の代わりにイソアスパラギン酸を有するタンパク質、例えばコラーゲン内の配列に対応するアミノ酸配列を有するペプチド異性体に対する抗体好ましくはモノクローナル抗体が含まれる。本発明には、本発明の第三または第四の態様のモノクローナル抗体を産生する細胞系が含まれる。また本発明には、検出可能なマーカーを結合させた、本発明の第三または第四の実施態様の抗体が含まれる。適切な検出可能なマーカーとしては、限定されないが、酵素類、発色団類、発蛍光団類、補酵素類、酵素阻害剤類、化学発光物質類、常磁性物質類、スピン標識類、放射性同位元素類、核酸配列類または核酸類似体の配列類がある。第五の態様で、本発明には、前記アミノ酸の配列中に前記タンパク質（例えばコラーゲン）の配列中のアスパラギン酸の代わりにイソアスパラギン酸を有するタンパク質（例えばコラーゲン）内の配列に対応するアミノ酸配列に対して特異的な抗体の、イソアスパラギン酸含有の一種もしくは複数のペプチド異性体の、前記体液中の量に関する情報を得るためのコラーゲンまたは他のタンパク質由来の異性化ペプチドの検定法への使用が含まれる。第六の態様で、本発明には、前記アミノ酸配列中に前記コラーゲンタンパク質配列中のアスパラギン酸の代わりにイソアスパラギン酸を有するコラーゲン内の配列に対応するアミノ酸配列を有し、好ましくは、対応するペプチドが少なくとも実質的に存在しない合成ペプチド異性体が含まれる。隣接するグリシンによってアスパラギン酸の異性化が容易になるので、不変性ペプチド形のアミノ酸配列中のアスパラギン酸残基に隣接してグリシンを配置することが好ましい。一つ以上のアスパラギン酸を含有するペプチドおよびイソアスパラギン酸を含有する上記ペプチドの類似体それぞれに対して選択性を有する抗体を製造することができる。したがって、単一のペプチドまたは複数のペプチドの両者の変異体の検定を行うことができる。イソアスパラギン酸の相対量は、検定法が一種のコラーゲン断片に対する検定法の場合、タンパク質を分解するタンパク質の年齢と骨の年齢の指標を提供する。したがって、第六の態様で、本発明は、体液中における、コラーゲン由来で少なくとも一種のアスパラギン酸含有ペプチドおよび対応するイソアスパラギン酸含有ペプチド類似体の相対量を測定することからなる、患者のコラーゲン吸収に関する情報を得る方法を提供するものである。また本発明には、上記の方法に有用な試験キットが含まれる。このようなキットには、本発明の第三もしくは第四の態様の抗体または同様に特異的な抗体断片が、好ましくは、上記抗体と反応性のイソアスパラギン酸を含有する合成のペプチド類似体；抗体酵素接合体および／またはこの接合体に対する基質；酵素接合体と基質の反応を停止させる組成物；または洗浄溶液；のうちのいずれかの一種以上と組み合わせて入っている。本発明はヒトと動物の両者に適用できる。適切な体液としては、ヒトもしくは動物の尿、血液、血清、血漿および滑液がある。本発明の方法は例えば唾液および汗にも利用できると考えられる。体液はそのままで使用してもよく、または接触ステップの前に精製してもよい。この精製ステップは、限定されないが、カートリッジ吸着と溶離、分子ふるい、クロマトグラフィー、透析、イオン交換、アルミナクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびこれらの組合わせを含むいくつかの標準法を用いて達成できる。本発明を、添付図面を参照して以下に一層詳細に説明する。図面の簡単な説明図1は、実施例3aに説明されているように、配列EKAH*GGRで表され、その*の部分が異なりイソアスパラギン酸（ピーク2）またはノルマルアスパラギン酸（ピーク3）である合成のペプチドとペプチド類似体をHPLCで分離された結果を示す。図2は、図1に示す分離されたペプチドとペプチド類似体を実施例3aで述べているように、二つの形態のELISA法で測定した異なる反応性を示す。図3（a）と3（b）は、実施例3（b）に記載されているように、HPLCで分離した尿由来の架橋されたペプチドおよびペプチド類似体の蛍光強度（a）および吸光度（b）を示す。図4と5は、骨吸収に対するビスホスホネート処理の影響を監視するため、異なる抗体を用いて血清を検定した結果を示す。本発明の方法の好ましい実施態様で、尿などの体液中のＩ型、II型またはIII 型のコラーゲンの断片の検定は、インヒビションELISA法（酸素結合イムノソルベント検定法）を用いて行い、尿素体液の試料を秤取し、その試料を、コラーゲン由来の配列を有する合成ペプチド類似体および該合成ペプチド類似体の免疫反応性の抗体と接触させることによって実施する。その合成ペプチド類似体は固体支持体に固定化する。上記抗体は、合成ペプチド類似体に対して生成させるかまたはコラーゲンの分解生成物に対して生成させ、次に上記の合成ペプチド類似体を用いて選別する。合成ペプチド類似体の製造合成のペプチドおよびペプチド類似体は、当該技術分野で公知の方法、例えば通常「メリフィールド合成法」と呼ばれている固相ペプチド合成法で製造される。またクラシカル溶液相法（classical solution phase technique）も利用できる。対象の配列は、コラーゲンを架橋する強力な部位を有する（例えばK hn、K. 、Immunochemistry of the extracelular matrix、1巻、1〜29頁、1982年；Eyre 、D．R.、Ann．Rev．Biochem.、53巻、717〜748頁、1984年；または米国特許第5 140103号参照）。このようなペプチド配列の例は下記表1に示す。従来のペプチド合成法によれば、ペプチド（正常なペプチド結合で結合されたアスパラギン酸を含有）とアスパラギン酸に対する結合が異性化されているペプチド類似体の混合物が産生される。一般にこのような混合物は、そのペプチドを検定法にかける場合、満足すべきものである。しかし、このような混合物を加熱すると、通常、ペプチド内容物のイソ型への異性化が起こる。合成ペプチド類似体については、（a）対応する不変性コラーゲン断片のイソアスパラギン酸類似体を認識する抗体を生成するか、または（b）上記抗体が不変性断片の前記類似体に結合するのを阻害する性能を実質的に失うことなく、一つ以上のアミノ酸残基を、架橋部位の配列から除くかまたは該架橋部位に加えることが可能である。長いコラーゲン断片および／またはキメラペプチド類似体を用いて上記抗体を生成させることができるので、原則として、競合検定法に置いて、免疫原および競合体として同じペプチド類似体を使用する必要はない。抗体の製造モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両者の製造方法は当該技術分野で公知である（例えば、Campbell、A．M．、Laboratory Techmingues in Bioc hemistry and Molecular Biology、Vol 12、1986年参照）。免疫化によって、合成異性化ペプチドに対する抗体を産生させることができる。しかしこれらの化合物の分子量は比較的小さいので、担体分子にハプテンを接合する方が好ましい。適切な担体分子としては、限定されないが、ウシ血清アルブミン、チログトブリン、オバルブミン、破傷風トキソイドおよびキーホールリンペット・ヘモシアニンがある。好ましい担体はウシ血清アルブミンである。免疫化動物の抗体産生細胞に、免疫原性が最も高い形態でハプテンを加えるために、いくつかの別のカップリングプロトコルを使用できる。適切なプロトコルとしては、限定されないが、グルタルアルデヒド、カルボジイミドおよび過ヨウ素酸塩がある。好ましい結合剤はグルタルアルデヒドとカルボジイミドである。抗体は、自然異性化がなされているコラーゲン断片または担体に接合された合成の異性化ペプチドで免疫化することによって製造される。免疫原性を改善するため免疫原は注入する前にアジェバントと混合することが好ましい。アジェバントの例としては限定されないが、水酸化アルミニウム、フロイントのアジュバントおよび免疫刺激複合体（ISCOM）がある。ISCOMは、Morein、B.ら、Nature、30 8巻、457〜460頁、1984年に記載されている方法によって製造することができる。ハプテン担体分子に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を製造することができる。モノクローナル抗体を製造するにはマウスを免疫化することが好ましい。免疫化マウス由来の脾臓細胞を採取し、ホモジナイズし、次いでポリエチレングリコールの存在下、癌細胞と融合させて、コラーゲン由来の異性化ペプチドに対して特異的なモノクローナル抗体を産生する細胞ハイブリッドを製造する。適切な癌細胞としては、限定されないが、骨髄種、肝細胞癌、癌腫および肉腫の細胞がある。モノクローナル抗体の製造についての詳細な説明は、Go ding、J．W.、"Monoclonal Antibodies：Principles and Practice"、1986年になされている。好ましい予備的な選別法としては、担体に接合され次に微量滴定用プレートの固体面にコートされた合成の異性化ペプチドを使う方法がある。コラーゲン由来の異性化ペプチド断片と反応性のポリクローナル抗体を製造するのに、異なる動物の種を免疫化することができる。適切な種としては、限定されないが、ニワトリ、ウサギおよびヤギがある。ニワトリとヤギが好ましい。このようにして産生された抗体は、適当な配列を有するイソアスパラギン酸含有合成ペプチド類似体との反応性を試験することによって、本発明で使用する場合の適性について選別する。抗体断片は当該技術分野で公知の方法で製造される（E．Ishikawa、Journal o f Immunoassay、3巻、209〜327頁、1983年参照）。免疫検査の実施したがって、上記のようにして製造した抗体を用いる免疫検定法を利用することによって、予め分画または加水分解を行うことなしに、生物学的液体の試料を検定することができる。生物学的液体中の所望のコラーゲン断片に対する特異性は、検定法を組み立てる際に、合成の異性化ペプチドを組合わせて使用する抗体によって供給される。なおその抗体は、上記合成の異性化ペプチドに対する抗体であるか、またはいずれにしろ該ペプチドに対し免疫学的に反応性である。あるいは、この免疫検定はモノクローナル抗体を用いて実施することができる。この検定法の設計の基本的概念は、検定法の特異性を、抗原（コラーゲンに対する合成ペプチド異性体）から抗体（モノクローナル抗体に対するウサギの抗血清）へ変えることである。このような組立てを用いると、その検定法は合成ペプチド異性体をその上に使用する必要がない。免疫検定法のこのバージョンは、患者の試料または標準溶液を、精製コラゲナーゼで処理したコラーゲンで予めコートした微量滴定プレート中で、ペルオキシダーゼ接合抗体溶液とともに培養することによって適切に実施される。洗浄後、該プレートのウェルに、基質溶液を加えて暗所でインキュベートする。呈色反応を停止溶液を添加して停止させ、最後に吸光度を測定する。免疫検定自体は、当該技術分野で一般に公知の各種の標準検定プロトコルから選択した方法を用いて実施することができる。広く理解されているように、この検定法は、特異性については、特異的な免疫学的結合パートナーと所望の被検体の間の相互作用に依存し、そして被検体と免疫学的パートナーによって形成された複合体を検出するため何らかの手段を利用するよう組み立てられる。免疫学的結合パートナーは固体支持体に複合させて、被検体を捕獲する免疫学的結合パートナーとして使用できる。このプロトコルは、被検体免疫学的結合パートナー複合体の生成を、例えば蛍光、放射能または酵素の標識によって検出する直接方式；または標識化した基準物を、免疫学的結合パートナーに対して、被検体と競合させる競合方式で実施することができる。またこの方式は擬集検定法として組み立てることもでき、すなわち上記複合体は、適切な沈澱剤を反応混合物に添加することによって沈澱させることができる。その免疫検定法の設計上の選択範囲は非常に広いので、当該技術分野で利用可能な臨床検定装置とそのプロトコルの数は非常に多い（このような各種のプロトコルについては米国特許第5001225号参照）。直接方式または競合方式で、標準の検出プロトコル例えば放射同位元素による標識化、蛍光標識化またはELISA法を用いて免疫検定を行うのに用いる抗体類および顕示試薬類は、必要な要素と検定法の説明書が入っているキットとして便利に供給される。本発明の一実施態様で、かようなキットには、関連する合成の異性化ペプチドでコートした微量滴定プレート、標準曲線を作成するのに用いる標準溶液、分析実験の特性試験のための対照の体液（例えば尿）、上記合成ペプチド異性体と反応のウサギ抗体、ペルオキシダーゼに接合した抗ウサギ免疫グロブリン、基質の溶液、停止溶液、洗浄用緩衝液および説明書が入っている。免疫検定法は、抗体および特異的な合成異性化ペプチドで組み立てることができるので、適当な生物学的液体中の、対応する各種コラーゲン断片の配列の比率は、これら配列の個々のレベルおよびその合計として測定できる。したがって、その検定法は、いくつものイソアスパラギン酸含有ペプチド類似体および任意に不変性のペプチド配列を測定できるようになるか、または単一のイソアスパラギン酸含有ペプチド類似対の配列もしくはその所望の混合物を測定できるようになる抗体を含めるよう設計することができる。本明細書で詳述している異性化ペプチドは、骨吸収の指標として使用することに加えて、同じ個体の同じかまたは他の適当な生物学的液体中の骨形成のマーカーを実質的に同時に測定して骨の代謝平衡を有利に測定するのに使用できる。「実質的に同時の」という用語は、同じ日、好ましくは4時間以内を意味する。例えば、上記マーカーとしては、オステオカルシン（BGPの骨GLAタンパク質としても知られている）、プロコラーゲンＩ型のプロペプチド類、骨アルカリホスファターゼ、および全アルカリホスファターゼがある。これらマーカーの適切な測定法は、例えばDelmas、P．D.ら、J．Bone Min．Res.、1巻、333〜337頁、1986年に見られる。分解が起こるとコラーゲン由来のペプチドと異性化ペプチドを生成する組織の代謝状況を決定する指標を提供する本発明の検定法は、各種の状況下で有用である。第一に、Ｉ型のコラーゲンの分解を検討する場合、その検定法は、例えば過剰な骨吸収を示すことによって、被検者の異常な状態を評定する方法である。この状態は、骨粗鬆症の症状があることと悪性腫瘍の転移が進行していることを示している。過剰な骨吸収が特徴の他の症状としては、パジェット病と上皮小体機亢進症がある。その上に、結合組織を含むいくつもの他の疾患を、コラーゲンの分解を測定することによって監視することができる。実施例は、リウマチ様関節炎と骨関節症に関連するコラーゲンII型の分解および脈管炎症候群の場合のコラーゲンIII型の分解についての実施例である。被検者の症状は連続して監視することができるので、これらのまたは他の症状を治療するために行われる治療の進行を監視するのに使用することもできる。さらに本発明の検定法は、毒性物質が投与されると組織の分解が起こることが多いので、毒性の尺度として使用することもできる。したがって本発明の検定法は、コラーゲン組織の代謝状態が被検者に直接与えられたかまたは被検者が環境内でさらされた物質の症状、治療または作用の指標として利用できるいずれの場合にも適用できる。以下の実施例は例示を目的とするものであり本発明を限定するものではない。実施例1：尿中の特定のペプチド配列の免疫検定固相法で製造した3種の異性化ペプチド（α1(I)C1、α1(I)N1およびα2(I)N1 ）（表1参照）を使用して免疫原を製造した。免疫化に用いるため、これらペプチド異性体は、カルボジイミドまたはグルタルアルデヒドの試薬を用い当該技術分野で公知の方法にしたがってウシ血清アルブミニンに共有結合させた。これらペプチド異性体に対するモノクローナル抗体とポリクローナル抗体の両者を生成させる。モノクローナル抗体を製造するため、Balblcマウスをペプチド異性体-B SA接合体で免疫化し、そしてハイブリドーマ細胞率は、脾臓またはリンパ節由来の細胞をAg8骨髄腫細胞と融合させた後、標準の方法を用いて製造する。ポリクローナル抗体はウサギとニワトリに生成させる。抗血清とハイブリドーマ細胞の培地の両者の選別は、カルボジイミド試薬と当該技術分野で公知の方法を用いて製造した適当なペプチド異性体-タンパク質担体接合体でコートした微量滴定プレートを用い、ELISA法で実施した。尿中の3種のペプチド異性体配列（α1(I)C1、α1(I)N1、およびα2(I)N1）の検定を以下のようにインヒビションELISA法で実施する。コラーゲン断片を含有している可能性がある尿の試料（10〜25μl）、または標準物としての0.015〜15μgペプチド異性体1mlを含有する溶液をそれぞれ、0.1 ％のトゥィーン-20界面活性剤含有のリン酸緩衝食塩水（PSB-T）に0.1％（w/v）のBSAを加えた液で1:5,000〜1:20,000の比率で希釈した、ペプチド異性体に対する免疫学的結合パートナー75μlに添加する。適当なペプチド異性体を含有するペプチド異性体-タンパク質担体接合体で予めコートした平底96ウェルの微量滴定プレート中に、各試料を二つづつ調製する。60分後、そのプレートをPBS-Tで3 回洗浄し、次に、結合している抗体を、一次抗体の種に対して調製した、西洋カラシペルオキシダーゼで標識化した抗体を用いる標準法で検出する。ペルオキシダーゼの基質を添加し、次に、1MH₃PO₄を用いて酵素反応を停止させた後、発色現象と、微量滴定プレートの自動読取り器で450mmの波長の光で測定する。被検体を含有する試料はプレート上に固定化されたペプチド異性体に対する一次抗体の結合量を減少させるので、色濃度が低下する。試料中の被検体の量は、各プレート上に含まれている標準物から、ログリンプロット（loglin plot）を使って計算して予め作成した曲線を参照して定量する。実施例2：Ｉ型コラーゲンの分解生成物を検出するのにモノクローナル抗体を使用する検定法モノクローナル抗体を、適当な担体タンパク質に接合したイソアスパラギン酸含有α1(I)C1合成ペプチド類似体でマウスを免疫化することによって生成させた。細胞融合、クローン化およびハイブリドーマの増殖を標準の手順にしたがって実施した。選別法として、微量滴定プレートに固定化されたα1(I)C1合成ペプチド類似体に対する反応性を試験する方法を用いた。これら抗体の特異性は、ペプチド類似体形のすなわちアスパラギン酸として異性化された結合を有する、Ｉ型コラーゲンのC-テロペプチド由来の異なるオーバーラップ配列を用いる阻害試験で試験した。一種のかような抗体MAbA-ISOを用いる検定法を開発する。要約すると、イソアスパラギン酸含有合成ペプチド類似体α1(I)C1を、カルボジイミドまたはグルタルアルデヒドを用いてウシ血清アルブミンに接合させ、次にこの接合体を、微量滴定プレートをコートするのに用いる。別の物質も使用できるが、必須の特徴は配列EKAHiDGGRが露出していることである。コーティングを行った後、微量滴定プレートのウェルを、尿15μlおよび西洋カラシペルオキシダーゼに接合させたMAbA-ISO 100μlとともにインキュベートする。 1時間後、プレートを洗浄し、基質（例えばTMB）を添加する。実施例3：イソアスパラギン酸ペプチド類似体に対するELISA検定法および他のペプチド断片と抗体に対するELISA検定法の相関関係（a）合成のペプチドの種および（b）尿から単離したペプチドの種をHPLCで分離したものに対して行った、本発明のポリクローナルELISA法と国際特許願第WO9 5/08115号に記載されているMAbA7 ELISA法の間の相関関係を評価した。MAbA7 EL ISA法は競合検定法である。すなわち8AAペプチド（EKAHDGGR、式中のDはノルマルアスパラギン酸である）に対するMAbA7モノクローナルを用いて、微量滴定トレイに固定化した分解コラーゲンを、上記モノクローナル抗体（MAbA7）に結合させるため、試料中のコラーゲン断片と競合させる方法である。この実施例で使用するELISA法は次のようにして実施する。（a）ポリクローナルISO-ELISA法ポリクローナルELISA法は、Ｉ型コラーゲンのα1連鎖のCテロペプチドの異性化部分に対して特異的な8個のアミノ酸（8AA）からなるアミノ酸配列（Glu-Lys- Ala-His-(ISO)Asp-Gly-Arg）を有する固定化合成ペプチド類似体に基づいている。この配列と反応性の抗体とともにインキュベートする間に、固定化ペプチドIS O形類似体と、試料中のＩ型コラーゲンα1連鎖の分解生成物との間に競合が起こる。要約すると、25μlの試料または標準物を、式1で表される抗原をコートした微量滴定プレートの各ウェルに加え、次にコラゲナーゼで処理したＩ型コラーゲンに対する抗血清75μlを添加する。これらのプレートを振盪しながら室温で1時間インキュベートし次いで洗浄緩衝液で5回洗浄する。ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンG-西洋ワサビペルオキシダーゼ接合体（100μl）を各ウェルに添加する。室温で1時間インキュベートした後、プレートを先に述べたのと同様にして5回洗浄する。酵素基質（100μl/ウェル）を加え、暗所で15分間インキュベートした後、100μlのリン酸溶液（1mol/L）を添加して反応を停止させる。450nmの光学濃度を微量滴定プレート読取り器で測定する。各試料に対して2回づつ測定し、そのデータは、標準の比色法で測定した＋1グラム／molクレアチニン（Cr）で示す。この検定法は本明細書ではISO-ELISA法と呼ぶ。 MAbA7 ELISA法 MAbA7は、ノルマルアスパラギン酸を有する配列EKAHDGGRのペプチドに対して、マウスに上記のようにして生成させたモノクローナル抗体である。この検定法バージョンは以下のように3ステップで実施する。第一ステップで、精製したコラゲナーゼ処理コラーゲン（CTC）で予めコートした微量滴定プレートのウェルを、15μlの標準溶液または試料および100μlのペルオキシダーゼ接合モノクローナル抗体溶液とともに室温で1時間インキュベートする。洗浄した後、第二ステップで、これらウェルを、100μlの基質溶液とともに室温で15分間、暗所でインキュベートする。最後に、第三ステップで、100μlの停止溶液を添加して呈色反応を停止させる。450nmの吸光度を2時間以内に測定する。実施例3（a）この実施例は、合成のEKAHDGGRまたはEKAHiDGGRに対し特異的な抗体を生成させることができることを示す。合成のEKAHDGGRとEKAHiDGGRの混合物をHPLCで分離した（それぞれ図1のピーク 3とピーク2）。配列を分析してピーク2が異性化アスパルテートを含有していることを確認した。このことは、配列決定の操作がヒスチジン残基の後で停止されたことによって示された。ピーク3はレギュラーのアスパルテートを含有しているので、配列決定は正常に進めることができた。HPLCのプロフィルからの画分を集めて、MAbA7 ELISA法とポリクローナルISO-ELISA法の両方で免疫反応性について試験した。上記二つの検定法が別個のピークを検出することが確認された。すなわちピーク2はISO-ELISA法で検出され、ピーク3はMAbA7-ELISA法で検出された。試験結果を図2に示す。実施例3（b）この実施例は、ISO-ELISA法関連の分子が尿から精製できることおよびこれら分子が異性化アスパルテートまたはレギュラーアスパルテートを含有するジペプチド関連の種に分離できることを示す。最初に、MAbA7を使用して尿を免疫精製した。MAbA7は、メーカーの指示にしたがってCNBr活性化Sepharose（登録商標）に結合させた。尿をPBS緩衝液で1：3（ V/V）の比率で希釈し、1M NaOHを用いてpHを8.0に調節した。希釈した尿800mlを、流量0.8ml/minで4℃にて24時間、カラム（14cm³）中を再循環させた。200mlの PBS緩衝液（pH8.0）でカラムを洗浄後、結合している抗原を、1％TFA（V/V）を含有する50％飽和(NH₄)₂SO₄溶液20mlを用いて溶離し、-20℃で貯蔵した。溶離された抗原を、1mlのC18Sep-Pak（登録商標）カラムを用いて脱塩した。そのSep-P akカラムは、抗原を添加する前に、80％メタノール（V/V）20mlでコンディショニングを行い続けて1％TFA（V/V）を含有する水20mlで平衡化した。結合している抗原を、1％TFA（V/V）を含有する水20mlで洗浄し、次に0.1％TFA（V/V）を含有する40％アセトニトリル（V/V）で溶離し、凍結乾燥を行い-20℃で貯蔵した。上記の方法で得た選択されたピークの分子は、イオン対としてトリフルオロ酢酸（TFA）を使用するHPLCでさらに分離した。画分を、アミノ酸組成、アミノ酸の配列決定、質量分析法およびMAbA7 ELISA法とISO-ELISA法による免疫反応性で分析した。 HFBAのHPLCプロフィルの蛍光度（3-ヒドロキシピリジニウム架橋）と吸光度を図3に示す。さらに分離することによって、純品の製剤が得られ、質量分析法と免疫反応性で試験し（表2）アミノ酸の配列決定を行い（表3）およびアミノ酸組成を測定した（表4）。三つの別個の分子がすべて約2036キロダルトンの分子量を有し、固定できたことをデータは示している（表2）。アミノ酸の配列決定は、ピークF-24-17-10の場合ヒスチジンの後で阻止されたが、2種の他のピーク（F -26-18-09およびF-29-19-24、表3）の場合は完全な配列EKAHDGGRが得られた。アミノ酸組成の分析（異性化アスパルテートとレギュラーアスパルラートは分離されない）によって、これら三つのピークは同じアミノ酸を有することが確認された。これらのデータは、3種の異なる架橋ジペプチド関連の種が尿中に確認されたことを示唆している。これらの分子は、配列EKAHDGGR中に異性化アスパルテートまたはレギュラーアスパルテートを有する点が異なっていた。ピークF-24-17-10 は配列EKAHiDGGRの二つのペプチド類似体を含有していることが示唆され、ピークF-26-18-09は一つのEKAHiDGGRと一つのEKAHDGGRを含有していることが示唆され、そしてピークF-29-19-24は配列EKAHDGGRの二つの架橋ペプチドを含有していることが示唆される。さらに、分子量が約2039の分子について類似の観察を行った。これらの分子は 3-ヒドロキシピリジニウム架橋を含有していなかった（蛍光がなかったから）のでクロスリンカーの性質は測定されなかった。ポリクローナル検定法はイソアスパラギン酸残基を含有するペプチド類似体に対して特異的であることを示し、MAbA7検定法はノルマルアスパラギン酸残基を含有するペプチドに対して特異的であることを示している。異性化アスパラギン酸と非異性化アスパラギン酸の両者を含有するジペプチド類似体は上記両者の検定法で検出される。それ故、これら二つの検定法を尿の試料に適用すると、イソアスパラギン酸含有異性化ペプチドのレベルとノルマル形のレベルを比較して、樹立されてから長年月が経過している骨組織が分解されている程度の指標を提供することができる。実施例4 ビスホスネート（bisphosphonate）であるイバンドロネート（Ibandoronate）（Boehringer Mannheim社）で治療する前後に、閉経後の女性から採取した血清試料を、上記のISOELISAポリクローナル検定法の血清バーションおよびMabA7に基づいたELISAモノクローナル検定法で分析することによって、血清中に異性化ペプチド類似体が存在することの臨床上の意義を検討した。血清中の、Ｉ型コラーゲンの分解生成物を測定するために開発した検定法は、アミノ酸配列EKAHDGGRがペプチド形およびペプチド異性体形で存在している、固定化された合成ペプチド／ペプチド異性体の混合物に基づいている。2ステップのカルボジイミド法で、BSAに接合させた異性化ペプチドを用いて、ウサギを免疫化した。異性化ペプチドが、採用されたウサギ内で、ペプチド形のアミノ酸配列より著しく抗原性が高ければ、BSAに接合されたペプチド／ペプチド異性体混合物で免疫化することができる。微量滴定プレートをコートするため、そのペプチドを、グルタルアルデヒドを使用して、チログロプリンに接合させた。この抗体とともにインキュベートしている間に、固定化されたペプチド異性体（固定化されたペプチドは検定中、小活性である）と血清中のＩ型コラーゲンの分解生成物との間に競合が起こる。溶液中のペプチドの含量が増大するにつれて、固定化ペプチド異性体に結合する抗体が少なくなり、光学濃度が低下する。要約すると、試験管中の50μlの標準液（合成の8AA-ペプチド異性体／ペプチド混合物）または未知試料に100μlの検定緩衝液（500mMのTRIS、0.0％のトゥィーン20、1.0％のBSA；pH＝6.5）を添加する。これら150μlの液から、50μlをピペットで採取し、予めコートしたELISAプレートの適当なウェル中に入れる。次に50μlの抗体溶液（上記検定緩衝液で1t20,000に希釈した、EKAHiDGGRに対するウサギ抗血清）を各ウェルに添加し、そのプレートを密封テープでカバーし、次に振盪装置上で室温にて60分間インキュベートする。この後に続く手順はすべて室温で実施した。インキュベートを行った後、プレートを希釈した洗浄緩衝液（ 25mmol/l TRISおよび50mmol/l Nacl、pH＝7.2）で3回洗浄した。ペルオキシダーゼを接合させた抗体［HRPを接合させた、ウサギIgGに対するヤギ抗体（JacKson Immunochemicals、PA）上記検定緩衝液で1t 4000に希釈］を1 ウェル当り100μlづつ加え、ウェルを密閉して振盪装置上で60分間インキュベートした。さらに洗浄した後、100μlのTMB気質溶液を、密閉したウェル全部に添加し15分間インキュベートした。15分後に100μlの停止溶液を加えて酵素反応を停止させた。光学濃度を450nmにて、ELISA読取器で読み取った。五つの標準物（25ng/ml〜500ng/ml）の平均吸光度を、対数線形グラフにプロットして較正曲線を作成した。各患者の検体と等価のEKAHiDGGRの濃度を、上記較正曲線に内挿することによって求めた。試験結果を図4と5に示す。4図に示すように、骨吸収率を低下させると予想される治療剤で治療する前と15ケ月間治療した後の、反応性の抗体に対してペプチド配列EKAHDGGRと競合する分子に対してなされたモノクローナル検定での反応性の分子の血清中レベルには、有意な変化は全く見られなかった。図5に示すように、ポリクローナル血清中の抗体に対して非ペプチドEKAHiDGGRと競合する分子に対しなされたポリクローナル検定での反応性分子のレベルは、2.5mg/日のイバンドロネートを用いて6ケ月間治療を行ったところ60％以上低下した。これは薬剤治療の予想した結果を反映している。この実施例は、配列EKAHDGGRを含有する血清中ペプチドの全体が（米国特許第 5455179号に記載されている種類の架橋ペプチドおよび他の架橋に基づいた類似の分子または全く架橋されたいない分子が含まれている）、骨吸収率の指標ではなく、アミノ酸配列中のアスパラギン酸の結合の異性化によって産生された類縁の非ペプチド分子が骨吸収率の指標であることを示している。オクタペプチドの異性化類似体に対する特異性によって、ISOELISA法は、血清中に存在する。MabA7 ELISA法で反応性の分子に対し非感受性になることが示唆される。異性化のレベルは、骨の年齢に関連すると考えられたので、成熟骨の代謝回転の定量可能なマーカーになるが、モノクローナル検定法で妨害する分子は骨吸収に関連がなく、「若い」コラーゲン分子の代謝回転、例えば骨のマトリックスにまだ組み込まれていない細胞外コラーゲンのタンパク質分解または非骨格部位における短命のＩ型コラーゲンの代謝回転が原因で生成したものであろう。さらに、身体は、アスパルテートの異性化によるタンパク質に対する損傷を修復する機構をもっていると考えられるが、骨のコラーゲンはこのような修復機構から遮蔽されて、骨の場合、異性化は、「古い」コラーゲンの吸収の非常に優れた指標になる。本発明は、特定の実施例を参照して説明してきたが、本発明の範囲内の多くの変形が可能である。例えば、本発明は、コラーゲンのみならずアスパラギン酸またはアスパラギン含有のタンパク質に適用できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/577 33/577 Ｂ // Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者クビスト・ペルデンマーク国、ディーケー−2930、クランペンボルク、タールベク・ストランドベイ、103番ジー

Claims

【特許請求の範囲】１．体液中の、一種以上のイソアスパラギン酸を含有する種の量を測定することからなる身体タンパク質の分解率の測定方法。２．前期体液中の、少なくとも一種のイソアスパラギン酸含有異性化ペプチドの量を測定する請求項1記載の方法。３．上記の一種または複数種の異性化ペプチドがコラーゲンに特徴的なペプチドである請求項2記載の方法。４．前期体液中に存在する、下記式2：（式中、K-K-Kは天然に存在する架橋でありそして＊はイソアスパラギン酸である）で表されるペプチド類似体、またはイソアスパラギン酸を含有する式2で表されるペプチド類似体中に存在するエピトープを含有する一種以上のペプチド類似体の量を測定することからなる請求項3記載の方法。５．測定が、測定手順中、試料中に存在するイソアスパラギン酸含有の種に対して特異的な免疫学的結合パートナーを用いて実施される請求項1〜4のいずれか一つに記載の方法。６．免疫学的結合パートナーが、アミノ酸配列中、コラーゲン配列中のアスパラギン酸の代わりにイソアスパラギン酸を有するコラーゲン内の配列に対応する線状ペプチド類似体に対応する抗体である請求項5記載の方法。７．アミノ酸配列中、タンパク質配列中のアスパラギン酸の代わりにイソアスパラギン酸を有するタンパク質内の配列に対応するアミノ酸配列を有するペプチドの合成異性体の、ペプチド由来の異性化ペプチド検定への使用。８．アミノ酸配列中、タンパク質配列内のアスパラギン酸の代わりにイソアスパラギン酸を有するタンパク質内の配列に対応するアミノ酸配列に特異的な抗体。９．アミノ酸配列DKAHiDGGRを含有するペプチド異性体の配列、または前記配列に含まれかつイソアスパラギン酸であるiDを含有するエピトープに対して特異的な請求項8記載の抗体。 10．アミノ酸配列中、コラーゲン配列内のアスパラギン酸の代わりにイソアスパラギン酸を有するコラーゲン内の配列に対応するアミノ酸配列を有するペプチド異性体に対する抗体。 11．請求項8〜10のいずれか一つに記載の抗体であるモノクローナル抗体を産生する細胞系。 12．検出可能なマーカーが結合されている請求項8〜10のいずれか一つに記載の抗体。 13．一種または複数種の、イソアスパラギン酸含有ペプチド類似体の量に関する情報を得るため、アミノ酸配列中、タンパク質配列内のアスパラギン酸の代わりにイソアスパラギン酸を有するタンパク質内の配列に対応するアミノ酸配列に特異的な抗体の、タンパク質由来異性化ペプチドの検定への使用。 14．アミノ酸配列中、コラーゲン配列内のアスパラギン酸の代わりにイソアスパラギン酸を有するコラーゲン内の配列に対応するアミノ酸配列を有する合成ペプチド類似体。 15．イソアスパラギン酸残基に隣接してグリシン残基が存在する請求項14記載の合成ペプチド類似体。 16．タンパク質由来の少なくとも1種のアスパラギン酸含有ペプチドおよび対応するイソアスパラギン酸含有ペプチド類似体の、体液中の相対量を測定することからなる、患者のタンパク質分解に関する情報を得る方法。 17．請求項8〜10のいずれか一つに記載の抗体または同様に特異的な抗体断片；ならびに、下記の上記の抗体または抗体断片と反応性のイソアスパラギン酸含有合成ペプチド類似体；抗体−酵素接合体および／またはその基質；酵素接合体と基質の反応を停止させる組成物；または洗浄溶液；の一種以上を組み合わせて備えてなる、請求項1〜6のいずれか一つに記載の検定法に使用する試験キット。