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Diese
Erfindung betrifft einen Test zum Messen des Abbaus von Kollagen
Typ I und somit zur Beurteilung der Geschwindigkeit der Knochenresorption
sowie ein Kit, welches zur Durchführung dieses Tests geeignet
ist.
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Kollagen
Typ I ist der häufigste
Kollagentyp im menschlichen Körper.
Es tritt zusammen mit anderen Kollagentypen in weichen Bindegeweben
auf, es bildet aber ebenfalls das Gerüst von mineralisierten Knochen, wo
es praktisch der einzige vorhandene Kollagentyp ist und wo es ungefähr 90% des
gesamten organischen Materials ausmacht. Kollagen Typ I wird ebenfalls
in den Knochen nicht-humaner Vertebraten gefunden.
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Während des
ganzen Lebens sind Knochen ein metabolisch aktives Gewebe. Die Prozesse
der Synthese von neuer Matrix und des Umwandelns von bestehender
Matrix sind normalerweise, was sowohl Raum als auch Zeit betrifft,
eng miteinander verbunden. Bei Krankheitszuständen kann dieses Verhältnis gestört sein; bei
Osteoporose z. B. überschreitet
die Knochenresorption auf lange Sicht die Synthese, was zu einer
verminderten Knochenmasse führt.
In ähnlicher
Weise induzieren rheumatoide Arthritis und verschiedene Karzinome mit
Knochenmetastasen eine lokale Zerstörung der Knochen.
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Die
WO 88/08980 beschreibt die Präparation
des aminoterminalen Telopeptids von Kollagen Typ III.
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Die
EP-A-171176 beschreibt eine Zusammensetzung zur Behebung von Knochendefekten
durch Verwendung von Suspensionen, welche gereinigtes Telopeptid,
rekonstituiertes fibrilläres
Hautkollagen oder Knochenkollagenpulver oder eine Mischung daraus
enthalten. Das Knochenkollagenpulver kann durch Reinigen, Einfrieren,
Pulverisieren und Entmine ralisieren von Knochen; Abtrennen des restlichen
organischen Materials und Verdauen von diesem unter Verwendung von
proteolytischen Enzymen wie z. B. Trypsin hergestellt werden. Das
resultierende Knochenkollagenpulver behält anscheinend die ursprüngliche
molekulare Architektur des Knochenkollagens bei und ist frei von
den Telopeptiden.
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Die
Menge an synthetisiertem Kollagen Typ I kann auf der Basis eines
Testverfahrens für
das carboxyterminale Propeptid von Prokollagen Typ I abgeschätzt werden,
welches mit Blutproben durchgeführt
wird. Der Abbau von Kollagen wurde lange durch eine Bestimmung der
Hydroxyprolinausscheidung im Urin beurteilt. Dieses Verfahren ist
jedoch langwierig, benötigt
eine 24-stündige
Urinsammlung und ist nicht für
einen bestimmten Kollagentyp spezifisch.
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Die
WO 89/04491 offenbart ein Verfahren zum Testen der Knochenresorptionsgeschwindigkeiten,
das aus einem Quantifizieren der Konzentration von spezifischen
Peptidfragmenten mit 3-Hydroxypyridinium-Querverknüpfungen,
die aus Knochenkollagen stammen, welche in einer Körperflüssigkeit
gefunden werden, besteht. Das Verfahren verwendet Antikörper, die
gegen Peptidfragmente erzeugt wurden, welche aus dem Urin von Patienten
mit Paget Syndrom isoliert wurden. Von dem Peptidfragment, von dem
anfangs angenommen wurde, daß es
das carboxyterminale Telopeptid von Kollagen Typ I sei, wurde anschließend gefunden,
daß es
in vivo keine kovalente Struktur ist. Das Verfahren beurteilt aus
Kollagen stammende Pyridinolin-Querverknüpfungen im Harn. Trotz einiger
Vorteile über
den Hydroxyprolintest teilt dieses Verfahren dessen Hauptnachteile.
Es besteht ein Bedarf für
ein spezifisches Verfahren zur Bestimmung des Abbaus von Kollagen
Typ I auf der Grundlage von Serumproben.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein solches Verfahren zur Verfügung, welches
schnell und einfach zu praktizieren ist.
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Wir
haben gefunden, daß während des
Knochenkollagenabbaus, wenn eine Anzahl verschiedener Fragmente
gebildet wird, ein gewisses querverknüpftes Fragment freigesetzt
wird, welches gegenüber
einem weiteren Abbau beständig
ist und seine immunchemische Struktur intakt beibehält. Es erscheint
daher im Blutkreislauf in einer Form, welche leicht quantitativ
gemessen werden kann, indem ein Immunoassay verwendet wird. Dieses
carboxyterminale nicht helikale Ende des Kollagen Typ I-Moleküls, der
sogenannte Telopeptidbereich, welcher an intermolekularen mehrwertigen
Querverknüpfungen
in einer unlöslichen
kollagenen Matrix teilnimmt, kann durch immunologische Verfahren,
z. B. durch ein Radioimmunassay, getestet werden und liefert wichtige
Informationen über
den Abbau von Kollagen Typ I.
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Dieser
Fund kann in jedem bekannten Immunoassayverfahren verwendet werden,
welches einen Antikörper
verwendet, der für
das carboxyterminale Telopeptid von Kollagen Typ I spezifisch ist,
das aus Knochen von einem humanen oder tierischen Vertebraten erhältlich ist.
Die Erfindung stellt demgemäß ein Verfahren zum
Testen auf ein Abbauprodukt von Kollagen Typ I zur Verfügung, welches
umfaßt:
In-Kontakt-Bringen
in beliebiger Reihenfolge von (i) einer Probe, von welcher bekannt
ist oder vermutet wird, daß sie
ein solches Produkt enthält;
(ii) einem Antikörper,
der für
das carboxyterminale Telopeptid von Kollagen Typ I spezifisch ist, welches
aus Knochen aus einem humanen oder tierischen Wirbeltier erhältlich ist;
und (iii) einem Marker; unter solchen Bedingungen, daß der Marker
in einer Menge gebunden wird, die von der Menge des Abbauproduktes von
Kollagen Typ I, welche in der Probe vorhanden ist, abhängt, und
dann Testen auf den gebundenen und/oder nicht gebundenen Marker
als einem Maß für das Vorliegen
oder den Gehalt des Abbauproduktes von Kollagen Typ I, welches in
der Probe vorhanden ist.
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Ein
solches Verfahren wäre
beim Beurteilen des Kollagenabbaus in entweder humanen oder nicht-humanen
Vertebraten nützlich.
Beispielsweise können
Krankheitszustände
des Menschen, die mit einer Störung der
Synthese oder der Umwandlung der Knochenmatrix zusammenhängen, diagnostiziert
oder überwacht werden.
Bei nicht-humanen Vertebraten, wie z. B. Nagetieren, Hunden, Rindern
und Katzen, können ähnliche Beurteilungen
vorgenommen werden, welche einen Nutzen in der Veterinärwissenschaft
oder in der Beurteilung von Pharmazeutika haben können.
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Der
Immunoassay macht die Verwendung eines Antikörpers notwendig, welcher für das carboxyterminale
Telopeptid von Kollagen Typ I spezifisch ist. Ein geeigneter Antikörper ist
einer, der gegen das carboxyterminale querverknüpfte Telopeptid von Kollagen
Typ I erzeugt wurde, das aus Knochen von einem humanen oder tierischen
Vertebraten erhältlich
ist, und ein solcher wird durch die vorliegende Erfindung zur Verfügung gestellt.
Das Telopeptid, welches bei der Erzeugung des Antikörpers verwendet
wurde, kann aus Knochen von einem humanen oder nicht-humanen Vertebraten
erhalten werden. In der detaillierteren Diskussion, welche folgt,
ist das betreffende Kollagen humanes Kollagen; man wird aber einsehen,
daß die
Tatsachen gegebenenfalls auf das Kollagen jedes Vertebraten angewendet
werden können.
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Das
querverknüpfte
Telopeptid, welches als das Antigen zur Erzeugung des Antikörpers verwendet wird,
kann aus Knochenkollagen isoliert werden. Wie oben angegeben, ist
das querverknüpfte
Fragment des Telopeptids gegenüber
einem weiteren Abbau beständig
und ist daher eine geeignete Wahl als ein Antigen zur Erzeugung
des Antikörpers.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Isolierung
des carboxyterminalen querverknüpften
Telopeptids von Kollagen Typ I zur Verfügung, welches ein Unterwerfen
von entkalktem, unlöslichem Knochengewebe
unter eine Denaturierung sowie eine Chromatographie unter Verwendung
einer Mehrzahl von Schritten einer Umkehrphasentrennung mit Hochleistungsflüssigchromatographie
(HPLC) umfaßt,
wobei wenigstens zwei der Trennungsschritte bei einem unterschiedlichen
pH stattfinden.
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Wenn
Kollagen Typ I-Moleküle
zu Kollagenfasern zusammengesetzt werden, werden zwischen dem carboxyterminalen
Telopeptidbereich von einem Molekül und einer bestimmten Stelle
innerhalb der aminoterminalen Hälfte
des tripelhelikalen Bereichs eines anderen Moleküls intermolekulare Querverknüpfungen
gebildet. Diese jungen Querverknüpfungen
reifen langsam zu mehrwertigen Querverknüpfungen, welche in Knochenkollagen
die chemische Struktur von Pyridinolin oder Dehydropyridinolin aufweisen
und welche von zwei Hydroxylysinen oder Lysin oder deren Aldehyden
in den carboxyterminalen Telopeptiden und einem Hydroxylysinrest
(Aminosäure
Nummer 87, vom Aminoterminus aus gezählt) in dem helikalen Bereich
abgeleitet sind. Solche Pyridinolinstrukturen weisen eine charakteristische
Fluoreszenz auf, auf deren Grundlage Peptide, welche Pyridinolin
enthalten, leicht identifiziert werden können. Diese mehrwertigen Querverknüpfungen
machen das Kollagen bei gewöhnlichen
Extraktionsverfahren mit entweder neutralen oder sauren Lösungen unlöslich. Peptide,
die noch durch solche Querverknüpfungen
verknüpft
sind, können
nach einem Unterwerfen von entkalktem unlöslichem Knochengewebe, welches
hauptsächlich
querverknüpftes
Kollagen Typ I enthält,
nach einer Denaturierung unter einen gründlichen Verdau mit einem proteolytischen
Enzym wie z. B. Trypsin oder bakterielle Kollagenase isoliert werden.
Die freigesetzten querverknüpften
Peptide werden dann durch chromatographische Verfahren gereinigt,
indem vorzugsweise eine Mehrzahl von Schritten einer Umkehrphasentrennung
mit Hochleistungsflüssigchromatographie
(HPLC) verwendet wird.
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Der
isolierte querverknüpfte
Telopeptidbereich, welcher mit einem nicht verwandten Protein, z.
B. Albumin, verbunden ist, oder intakte Kollagen Typ I-Moleküle, die
in löslicher
Form aus Salz- oder Säureextrakten
von Geweben isoliert wurden, können
dann verwendet werden, um einen spezifischen Antikörper, z.
B. durch Immunisierung eines geeigneten Tieres unter Verwendung
von Techniken, die im Stand der Technik wohl bekannt sind, zu produzieren;
siehe beispielsweise "Immunochemistry
of the Extracellular Matrix",
Herausg. H. Furthmayr, CRC Press, Boca Raton, U.S.A., 1982 und insbesondere
die Artikel von Furthmayr, Seiten 143–178, Linsenmayer et al., Seiten
179–198
und Timpl et al., Seiten 199– 235.
Ein in hohem Maße
spezifischer Kollagen Typ I-Telopeptid-Antikörper wird am besten durch die
subkutane Injektion von Kollagen Typ I in Testtiere, z. B. Kaninchen
im Fall von polyklonalen Antikörpern
und Mäuse
im Fall von monoklonalen Antikörpern,
in der Gegenwart eines geeigneten Hilfsmittels produziert. Der Antikörper kann
monoklonal oder polyklonal und vom IgG- oder IgM-Typ sein.
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Der
Antikörper,
welcher durch das obige Verfahren produziert wurde, ist für den carboxyterminalen Telopeptidbereich,
entweder querverknüpft
oder nicht, spezifisch. Das Telopeptid, welches beim Testen einer Serumprobe
gemessen wird, ist querverknüpft,
da nicht querverknüpftes
Telopeptid nicht gegen einen weiteren Abbau während der Umwandlung von Kollagen
Typ I resistent ist und somit nicht im Serum gefunden wird. Die Natur
der Querverknüpfung
ist jedoch nicht kritisch, da ein Peptid, das aus Kollagen Typ I
aus weichem Gewebe isoliert wurde, welches einen anderen Typ an
Querverknüpfung
enthält
(der von Lysin/Hydroxylysin und auch von Histidin abgeleitet ist),
durch einen Antikörper
nachgewiesen werden kann, der durch das oben beschriebene Verfahren
erzeugt wurde. Auch kann derselbe Antikörper verwendet werden, um lösliche Kollagen Typ
I-Moleküle
zu messen (z. B. während
Zellkulturexperimenten usw.), welche den Telopeptidbereich enthalten,
aber nicht querverknüpft
sind. Solche Situationen werden mit Serumproben nicht angetroffen,
können aber
auftreten, wenn andere physiologische oder Gewebeflüssigkeiten
(Ascitesflüssigkeit,
Wundflüssigkeit, usw.)
getestet werden.
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Der
Immunoassay selbst kann durchgeführt
werden, indem irgendein Verfahren verwendet wird; vorzugsweise wird
aber ein heterogenes Verfahren, welches einen Phasentrennungsschritt
beinhaltet, wie z. B. ein unter den Abkürzungen RIA, ELISA, FIA, TR-FIA,
EIA und IRMA bekanntes, verwendet.
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Vorzugsweise
wird der Test als ein Radioimmunassay durchgeführt, indem isoliertes humanes
querverknüpftes
carboxyterminales Telopeptid von Kollagen Typ I und ein Antikörper, welcher
dafür spezifisch
ist, verwendet werden. Das Telopeptid ist mit einem Radionuklid
markiert, vorzugsweise Iod 125, indem beispielsweise das Chloramin-T-Verfahren
verwendet wird, wobei das freie Iod durch eine Umkehrphasen-Einwegkartusche
abgetrennt wird. Andere Verfahren der Markierung unter Verwendung
von enzymatischen oder Fluoreszenz-Markern, z. B. Europium, können ebenfalls
verwendet werden. Bekannte Techniken, welche in dem Immunoassay
verwendet werden können,
sind in der Literatur beschrieben worden, z. B. in dem Buch "Immunochemistry of
the Extracellular Matrix",
welches oben erwähnt
wurde. In einem Verfahren werden beispielsweise markiertes querverknüpftes carboxyterminales
Propeptid von Kollagen Typ I und die Probe beide mit dem Antikörper in
Kontakt gebracht, der so gebildete Antigen-Antikörper-Komplex wird von dem nicht
komplexierten Ausgangsmaterial abgetrennt und es wird auf den komplexierten
oder nicht komplexierten Marker getestet. Die Abtrennung des Antigen-Antikörper-Komplexes
kann erleichtert werden, indem der Antigen-Antikörper-Komplex mit einem zweiten
Antikörper
in Kontakt gebracht wird, welcher für den ersten Antikörper spezifisch
ist, und der Antigen-Antikörper-Antikörper-Komplex
von den nicht komplexierten Ausgangsmaterialien abgetrennt wird.
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Das
Immunoassayverfahren der Erfindung erlaubt die Bestimmung von Abbauprodukten
von Kollagen Typ I in humanem Serum oder anderen Körperflüssigkeiten.
Die Konzentration des querverknüpften
Telopeptids in normalem Serum liegt bei ca. 1,5 bis 4,2 Mikrogramm/Liter
und ist z. B. in Prostata- oder
Brustkrebspatienten mit osteolytischen Metastasen erhöht, die
eine bis zu zwanzigfache Erhöhung
der Konzentration der Abbauprodukte von Kollagen Typ I aufweisen
können.
Das Testverfahren ist in der Lage, 0,5 Mikrogramm/Liter des querverknüpften Telopeptids
nachzuweisen.
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Die
folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
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BEISPIEL I
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Präparation von querverknüpftem carboxyterminalem
Telopeptid von Kollagen Typ I aus menschlichem Knochen oder aus
Knochen eines Versuchstieres und Produktion eines spezifischen Antikörpers gegen
dieses
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Zuerst
wird nicht gelöstes
Kollagen Typ I aus Knochen von Menschen oder von einem Versuchstier
(z. B. Ratte, Meerschweinchen, Hund, Rind) isoliert. Im Fall von
menschlichem Knochen werden einen cm dicke Scheiben des Femurs aus
dem Femurkopf erhalten, die während
einer elektiven Hüftgelenksprothesenoperation
entfernt wurden. Im Fall von Versuchstieren wird der Femur nach
einer Enthauptung des Tieres präpariert. Die
Knochen werden mit Aceton extrahiert, um das Fett zu entfernen,
welches im Knochenmark vorhanden ist. Nach einem Trocknen an der
Luft werden die Scheiben in kleinere Stücke geschnitten und schließlich unter flüssigem Stickstoff
pulverisiert, indem eine Mineralmühle (Raetsch AG, Deutschland)
verwendet wird. Nicht kollagene Proteine werden bei +4°C für 24 Stunden
durch 4 M Guanidin/HCl in 50 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7,4, welcher
Proteaseinhibitoren (0,1 M Aminocapronsäure, 5 mM Benzamidin/HCl und
1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid) enthält, extrahiert. Nach der Extraktion
wird das Knochenpulver mehrere Male mit destilliertem Wasser gewaschen,
um die Spuren des Extraktionspuffers zu entfernen. Dann wird das
immer noch mineralisierte Knochenpulver durch Extraktion bei +4°C für 24 Stunden
mit 0,5 M EDTA, das auf pH 7,4 eingestellt ist und 6 M Harnstoff
enthält,
entmineralisiert. Die Extraktion wird zweimal wiederholt. Der unlösliche Rückstand
wird durch Zentrifugation (15 000 × g für 30 min.) gesammelt und mehrere
Male mit destilliertem Wasser gewaschen, um die Spuren des Extraktionspuffers
zu entfernen. Danach wird der Rückstand
lyophilisiert. Ungefähr ein
g unlösliches
Kollagen kann aus einer ein cm-Scheibe des menschlichen Femurs erhalten
werden.
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Für die Präparation
der Abbaupeptide werden 2 g unlösliches
Knochenkollagen in 100 ml 0,2 M Ammoniumbicarbonat suspendiert und
30 min. lang bei +70°C
denaturiert. Nach einem Absenken der Temperatur der Lösung auf
+37°C wird
das Material 8 Stunden lang bei +37°C mit bakterieller Kollagenase
(CLSPA-Grad, Worthington, USA) verdaut, indem 10 mg des Enzyms verwendet
werden. Nach einer erneuten Denaturierung (30 min. bei +70°C) wird mehr
Enzym (10 mg) zugegeben, und die Mischung wird weitere 12 Stunden
bei +37°C
inkubiert. Nach dem Verdau wird die Mischung zentrifugiert (15000 × g für 30 min.),
um unverdautes unlösliches
Material zu entfernen. Dann wird der Überstand mit konzentrierter
HCl auf einen pH von 2,5 eingestellt, und Isopropanol wird bis zu
der Endkonzentration von 20% zugegeben. Diese Mischung (ca. 100
ml) wird dann in 5 ml-Portionen über
eine präparative
Sep-Pak®-C18-Kartusche geleitet. Das querverknüpfte carboxyterminale
Telopeptid von Kollagen Typ I wird an die Kartusche gebunden, aus
welcher es mit 3 ml 50% Isopropanol in 0,1 M Essigsäure abgelöst wird.
Das Eluat wird dann bis zur Trockenheit lyophilisiert. Eine Mischung,
welche ca. 40 mg an Peptiden enthält, wird aus 2 g unlöslichem
Kollagen erhalten.
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Die
Reinigung des querverknüpften
carboxyterminalen Telopeptids von Kollagen Typ I wird durchgeführt, indem
zwei verschiedene Umkehrphasenschritte mit Hochleistungsflüssigchromatographie
(HPLC) verwendet werden. Die lyophilisierte Peptidmischung wird
zuerst in 0,1% Trifluoressigsäure
gelöst
und auf eine C18-Umkehrphasensäule (Vydac® 218TP1010)
aufgetragen. Die gebundenen Peptide werden mit ansteigenden Konzentrationen
von Isopropanol (10–70%,
0–45 min.)
eluiert. Das Eluat wird auf die Fluoreszenzcharakteristik von Pyridinolin-Querverknüpfungen
hin überwacht
(Anregung 295 nm, Emission 395 nm). Der fluoreszierende Peptidpeak,
welcher das querverknüpfte
carboxyterminale Telopeptid von Kollagen Typ I enthält, wird gesammelt
und lyophilisiert. Dann wird das Peptid (welches immer noch eine
kleinere Menge an anderen verunreinigenden Peptiden enthält) in 50
mM Ammoniumacetat, pH 7,4, gelöst
und auf eine pH-stabile C18-Umkehrphasensäule (Vydac® 228TP104)
aufgetragen.
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Das
gebundene Peptid wird mit steigenden Konzentrationen von Acetonitril
(0–90%,
0–45 min.)
eluiert. Das Eluat wird wie oben auf Fluoreszenz hin überwacht,
und das jetzt homogene querverknüpfte
carboxyterminale Telopeptid von Kollagen Typ I wird gesammelt und
lyophilisiert. Der Ursprung und die Identität des Peptides werden durch
N-terminale Aminosäuresequenzierung
verifiziert. Die folgenden Sequenzen können für das querverknüpfte humane
Peptid erhalten werden, das von zwei carboxyterminalen Telopeptiden
der α1-Ketten
von Kollagen Typ I und einem Bereich aus dem helikalen Teil von
entweder der α1-Kette
oder der α2-Kette von Kollagen
Typ I abgeleitet ist:
wobei
Hyp Hydroxyprolin ist, Hylys Hydroxylysin ist und
die
Position der Querverknüpfung
anzeigt.
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Abhängig von
dem Enzym, welches zur Freisetzung des Peptids verwendet wird, und
auch zwischen den verschiedenen Präparationen variierend, können die
Ausgangssequenzen wenige Aminosäuren
länger oder
kürzer
sein. Dieses beeinträchtigt
jedoch nicht den Test, da die immunologischen Determinanten, die
gemessen werden, um die Querverknüpfung (mit
markiert)
herum in dem α1-Kettenbereich
des Telopeptids liegen.
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Das
Antiserum, welches für
das carboxyterminale Telopeptid spezifisch ist, kann erhalten werden,
indem Kaninchen mit 0,1 mg des gereinigten querverknüpften Telopeptids,
das in 1 ml 0,2 M NH4HCO3 solubilisiert
und mit 1 ml Freund's
vollständigem
Adjuvans zusammengemischt ist, immunisiert werden. Ein zwei ml-Aliquot
der Suspension wird intradermal an 50 verschiedenen Stellen in den
Rücken
eines Kaninchens verabreicht. Eine ähnliche Auffrischungsinjektion
wird nach drei Wochen verabreicht und nach einem Testen des Antiserums
auf eine Bindung des radioaktiv markierten Antigens wenn nötig wiederholt.
Wenn Mäuse
immunisiert werden, werden nur 0,1 ml einer ähnlichen Suspension in den
Rücken
einer Maus verabreicht. Eine ähnliche
Auffrischungsinjektion wird nach drei Wochen verabreicht und eine
weitere wird intraperitoneal wenige Tage vor dem Entfernen der Milz
zur Produktion von Hybridomen verabreicht.
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BEISPIEL II
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Durchführung des Gleichgewichts-Radioimmunassays
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Fünf Mikrogramm
des querverknüpften
carboxyterminalen Telopeptids von Kollagen Typ I, welches wie in
Beispiel I beschrieben hergestellt wurde, werden mit 1 Millicurie
Iod-125 unter Verwendung
von Chloramin-T (5 Mikrogramm) markiert. Das freie Iod wird mit
einer präparativen
Sep-Pak®-C18-Kartusche
entfernt, nachdem die Lösung
mit 0,1 M Essigsäure
angesäuert
wurde. Das markierte Peptid wird aus der Kartusche mit 50% Isopropanol
in 0,1 M Essigsäure
eluiert.
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Antikörper-Bindungskurven
werden mit 50 000 Radioaktivitäts-Zählimpulsen
pro Minute von dem markierten querverknüpften Telopeptid angefertigt.
Die Telopeptidkonzentration in einer unbekannten Probe des Serums
oder einer anderen Körperflüssigkeit
wird in dem folgenden Radioimmun-Inhibitionsassay
bestimmt. Eine vorher getestete Menge des Antiserums wird mit der
unbekannten Probe und 50 000 Zählimpulsen
pro Minute der Markierungssubstanz für 2 Stunden bei +37°C inkubiert.
Dann wird ein zweiter Antikörper
gegen gamma-Globulin aus Kaninchen in 1,2 M (NH4)2SO4 zugegeben, und
nach 30 min. Inkubation bei +4°C
wird das Antigen, welches in dem Immunkomplex gebunden ist, durch
Zentrifugation aus der Lösung
abgetrennt. Die Inhibitionsaktivität der unbekannten Probe wird
mit der Aktivität
der Standardkonzentrationen von nicht markiertem querverknüpftem carboxyterminalem
Telopeptid von Kollagen Typ I verglichen.