DE69226548T3 - Verfahren zum Nachweis des Abbaus von Typ-I-Kollagen - Google Patents

Verfahren zum Nachweis des Abbaus von Typ-I-Kollagen Download PDF

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Description

  • Diese Erfindung betrifft einen Test zum Messen des Abbaus von Kollagen Typ I und somit zur Beurteilung der Geschwindigkeit der Knochenresorption sowie ein Kit, welches zur Durchführung dieses Tests geeignet ist.
  • Kollagen Typ I ist der häufigste Kollagentyp im menschlichen Körper. Es tritt zusammen mit anderen Kollagentypen in weichen Bindegeweben auf, es bildet aber ebenfalls das Gerüst von mineralisierten Knochen, wo es praktisch der einzige vorhandene Kollagentyp ist und wo es ungefähr 90% des gesamten organischen Materials ausmacht. Kollagen Typ I wird ebenfalls in den Knochen nicht-humaner Vertebraten gefunden.
  • Während des ganzen Lebens sind Knochen ein metabolisch aktives Gewebe. Die Prozesse der Synthese von neuer Matrix und des Umwandelns von bestehender Matrix sind normalerweise, was sowohl Raum als auch Zeit betrifft, eng miteinander verbunden. Bei Krankheitszuständen kann dieses Verhältnis gestört sein; bei Osteoporose z. B. überschreitet die Knochenresorption auf lange Sicht die Synthese, was zu einer verminderten Knochenmasse führt. In ähnlicher Weise induzieren rheumatoide Arthritis und verschiedene Karzinome mit Knochenmetastasen eine lokale Zerstörung der Knochen.
  • Die WO 88/08980 beschreibt die Präparation des aminoterminalen Telopeptids von Kollagen Typ III.
  • Die EP-A-171176 beschreibt eine Zusammensetzung zur Behebung von Knochendefekten durch Verwendung von Suspensionen, welche gereinigtes Telopeptid, rekonstituiertes fibrilläres Hautkollagen oder Knochenkollagenpulver oder eine Mischung daraus enthalten. Das Knochenkollagenpulver kann durch Reinigen, Einfrieren, Pulverisieren und Entmine ralisieren von Knochen; Abtrennen des restlichen organischen Materials und Verdauen von diesem unter Verwendung von proteolytischen Enzymen wie z. B. Trypsin hergestellt werden. Das resultierende Knochenkollagenpulver behält anscheinend die ursprüngliche molekulare Architektur des Knochenkollagens bei und ist frei von den Telopeptiden.
  • Die Menge an synthetisiertem Kollagen Typ I kann auf der Basis eines Testverfahrens für das carboxyterminale Propeptid von Prokollagen Typ I abgeschätzt werden, welches mit Blutproben durchgeführt wird. Der Abbau von Kollagen wurde lange durch eine Bestimmung der Hydroxyprolinausscheidung im Urin beurteilt. Dieses Verfahren ist jedoch langwierig, benötigt eine 24-stündige Urinsammlung und ist nicht für einen bestimmten Kollagentyp spezifisch.
  • Die WO 89/04491 offenbart ein Verfahren zum Testen der Knochenresorptionsgeschwindigkeiten, das aus einem Quantifizieren der Konzentration von spezifischen Peptidfragmenten mit 3-Hydroxypyridinium-Querverknüpfungen, die aus Knochenkollagen stammen, welche in einer Körperflüssigkeit gefunden werden, besteht. Das Verfahren verwendet Antikörper, die gegen Peptidfragmente erzeugt wurden, welche aus dem Urin von Patienten mit Paget Syndrom isoliert wurden. Von dem Peptidfragment, von dem anfangs angenommen wurde, daß es das carboxyterminale Telopeptid von Kollagen Typ I sei, wurde anschließend gefunden, daß es in vivo keine kovalente Struktur ist. Das Verfahren beurteilt aus Kollagen stammende Pyridinolin-Querverknüpfungen im Harn. Trotz einiger Vorteile über den Hydroxyprolintest teilt dieses Verfahren dessen Hauptnachteile. Es besteht ein Bedarf für ein spezifisches Verfahren zur Bestimmung des Abbaus von Kollagen Typ I auf der Grundlage von Serumproben.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein solches Verfahren zur Verfügung, welches schnell und einfach zu praktizieren ist.
  • Wir haben gefunden, daß während des Knochenkollagenabbaus, wenn eine Anzahl verschiedener Fragmente gebildet wird, ein gewisses querverknüpftes Fragment freigesetzt wird, welches gegenüber einem weiteren Abbau beständig ist und seine immunchemische Struktur intakt beibehält. Es erscheint daher im Blutkreislauf in einer Form, welche leicht quantitativ gemessen werden kann, indem ein Immunoassay verwendet wird. Dieses carboxyterminale nicht helikale Ende des Kollagen Typ I-Moleküls, der sogenannte Telopeptidbereich, welcher an intermolekularen mehrwertigen Querverknüpfungen in einer unlöslichen kollagenen Matrix teilnimmt, kann durch immunologische Verfahren, z. B. durch ein Radioimmunassay, getestet werden und liefert wichtige Informationen über den Abbau von Kollagen Typ I.
  • Dieser Fund kann in jedem bekannten Immunoassayverfahren verwendet werden, welches einen Antikörper verwendet, der für das carboxyterminale Telopeptid von Kollagen Typ I spezifisch ist, das aus Knochen von einem humanen oder tierischen Vertebraten erhältlich ist. Die Erfindung stellt demgemäß ein Verfahren zum Testen auf ein Abbauprodukt von Kollagen Typ I zur Verfügung, welches umfaßt: In-Kontakt-Bringen in beliebiger Reihenfolge von (i) einer Probe, von welcher bekannt ist oder vermutet wird, daß sie ein solches Produkt enthält; (ii) einem Antikörper, der für das carboxyterminale Telopeptid von Kollagen Typ I spezifisch ist, welches aus Knochen aus einem humanen oder tierischen Wirbeltier erhältlich ist; und (iii) einem Marker; unter solchen Bedingungen, daß der Marker in einer Menge gebunden wird, die von der Menge des Abbauproduktes von Kollagen Typ I, welche in der Probe vorhanden ist, abhängt, und dann Testen auf den gebundenen und/oder nicht gebundenen Marker als einem Maß für das Vorliegen oder den Gehalt des Abbauproduktes von Kollagen Typ I, welches in der Probe vorhanden ist.
  • Ein solches Verfahren wäre beim Beurteilen des Kollagenabbaus in entweder humanen oder nicht-humanen Vertebraten nützlich. Beispielsweise können Krankheitszustände des Menschen, die mit einer Störung der Synthese oder der Umwandlung der Knochenmatrix zusammenhängen, diagnostiziert oder überwacht werden. Bei nicht-humanen Vertebraten, wie z. B. Nagetieren, Hunden, Rindern und Katzen, können ähnliche Beurteilungen vorgenommen werden, welche einen Nutzen in der Veterinärwissenschaft oder in der Beurteilung von Pharmazeutika haben können.
  • Der Immunoassay macht die Verwendung eines Antikörpers notwendig, welcher für das carboxyterminale Telopeptid von Kollagen Typ I spezifisch ist. Ein geeigneter Antikörper ist einer, der gegen das carboxyterminale querverknüpfte Telopeptid von Kollagen Typ I erzeugt wurde, das aus Knochen von einem humanen oder tierischen Vertebraten erhältlich ist, und ein solcher wird durch die vorliegende Erfindung zur Verfügung gestellt. Das Telopeptid, welches bei der Erzeugung des Antikörpers verwendet wurde, kann aus Knochen von einem humanen oder nicht-humanen Vertebraten erhalten werden. In der detaillierteren Diskussion, welche folgt, ist das betreffende Kollagen humanes Kollagen; man wird aber einsehen, daß die Tatsachen gegebenenfalls auf das Kollagen jedes Vertebraten angewendet werden können.
  • Das querverknüpfte Telopeptid, welches als das Antigen zur Erzeugung des Antikörpers verwendet wird, kann aus Knochenkollagen isoliert werden. Wie oben angegeben, ist das querverknüpfte Fragment des Telopeptids gegenüber einem weiteren Abbau beständig und ist daher eine geeignete Wahl als ein Antigen zur Erzeugung des Antikörpers.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Isolierung des carboxyterminalen querverknüpften Telopeptids von Kollagen Typ I zur Verfügung, welches ein Unterwerfen von entkalktem, unlöslichem Knochengewebe unter eine Denaturierung sowie eine Chromatographie unter Verwendung einer Mehrzahl von Schritten einer Umkehrphasentrennung mit Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) umfaßt, wobei wenigstens zwei der Trennungsschritte bei einem unterschiedlichen pH stattfinden.
  • Wenn Kollagen Typ I-Moleküle zu Kollagenfasern zusammengesetzt werden, werden zwischen dem carboxyterminalen Telopeptidbereich von einem Molekül und einer bestimmten Stelle innerhalb der aminoterminalen Hälfte des tripelhelikalen Bereichs eines anderen Moleküls intermolekulare Querverknüpfungen gebildet. Diese jungen Querverknüpfungen reifen langsam zu mehrwertigen Querverknüpfungen, welche in Knochenkollagen die chemische Struktur von Pyridinolin oder Dehydropyridinolin aufweisen und welche von zwei Hydroxylysinen oder Lysin oder deren Aldehyden in den carboxyterminalen Telopeptiden und einem Hydroxylysinrest (Aminosäure Nummer 87, vom Aminoterminus aus gezählt) in dem helikalen Bereich abgeleitet sind. Solche Pyridinolinstrukturen weisen eine charakteristische Fluoreszenz auf, auf deren Grundlage Peptide, welche Pyridinolin enthalten, leicht identifiziert werden können. Diese mehrwertigen Querverknüpfungen machen das Kollagen bei gewöhnlichen Extraktionsverfahren mit entweder neutralen oder sauren Lösungen unlöslich. Peptide, die noch durch solche Querverknüpfungen verknüpft sind, können nach einem Unterwerfen von entkalktem unlöslichem Knochengewebe, welches hauptsächlich querverknüpftes Kollagen Typ I enthält, nach einer Denaturierung unter einen gründlichen Verdau mit einem proteolytischen Enzym wie z. B. Trypsin oder bakterielle Kollagenase isoliert werden. Die freigesetzten querverknüpften Peptide werden dann durch chromatographische Verfahren gereinigt, indem vorzugsweise eine Mehrzahl von Schritten einer Umkehrphasentrennung mit Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) verwendet wird.
  • Der isolierte querverknüpfte Telopeptidbereich, welcher mit einem nicht verwandten Protein, z. B. Albumin, verbunden ist, oder intakte Kollagen Typ I-Moleküle, die in löslicher Form aus Salz- oder Säureextrakten von Geweben isoliert wurden, können dann verwendet werden, um einen spezifischen Antikörper, z. B. durch Immunisierung eines geeigneten Tieres unter Verwendung von Techniken, die im Stand der Technik wohl bekannt sind, zu produzieren; siehe beispielsweise "Immunochemistry of the Extracellular Matrix", Herausg. H. Furthmayr, CRC Press, Boca Raton, U.S.A., 1982 und insbesondere die Artikel von Furthmayr, Seiten 143–178, Linsenmayer et al., Seiten 179–198 und Timpl et al., Seiten 199– 235. Ein in hohem Maße spezifischer Kollagen Typ I-Telopeptid-Antikörper wird am besten durch die subkutane Injektion von Kollagen Typ I in Testtiere, z. B. Kaninchen im Fall von polyklonalen Antikörpern und Mäuse im Fall von monoklonalen Antikörpern, in der Gegenwart eines geeigneten Hilfsmittels produziert. Der Antikörper kann monoklonal oder polyklonal und vom IgG- oder IgM-Typ sein.
  • Der Antikörper, welcher durch das obige Verfahren produziert wurde, ist für den carboxyterminalen Telopeptidbereich, entweder querverknüpft oder nicht, spezifisch. Das Telopeptid, welches beim Testen einer Serumprobe gemessen wird, ist querverknüpft, da nicht querverknüpftes Telopeptid nicht gegen einen weiteren Abbau während der Umwandlung von Kollagen Typ I resistent ist und somit nicht im Serum gefunden wird. Die Natur der Querverknüpfung ist jedoch nicht kritisch, da ein Peptid, das aus Kollagen Typ I aus weichem Gewebe isoliert wurde, welches einen anderen Typ an Querverknüpfung enthält (der von Lysin/Hydroxylysin und auch von Histidin abgeleitet ist), durch einen Antikörper nachgewiesen werden kann, der durch das oben beschriebene Verfahren erzeugt wurde. Auch kann derselbe Antikörper verwendet werden, um lösliche Kollagen Typ I-Moleküle zu messen (z. B. während Zellkulturexperimenten usw.), welche den Telopeptidbereich enthalten, aber nicht querverknüpft sind. Solche Situationen werden mit Serumproben nicht angetroffen, können aber auftreten, wenn andere physiologische oder Gewebeflüssigkeiten (Ascitesflüssigkeit, Wundflüssigkeit, usw.) getestet werden.
  • Der Immunoassay selbst kann durchgeführt werden, indem irgendein Verfahren verwendet wird; vorzugsweise wird aber ein heterogenes Verfahren, welches einen Phasentrennungsschritt beinhaltet, wie z. B. ein unter den Abkürzungen RIA, ELISA, FIA, TR-FIA, EIA und IRMA bekanntes, verwendet.
  • Vorzugsweise wird der Test als ein Radioimmunassay durchgeführt, indem isoliertes humanes querverknüpftes carboxyterminales Telopeptid von Kollagen Typ I und ein Antikörper, welcher dafür spezifisch ist, verwendet werden. Das Telopeptid ist mit einem Radionuklid markiert, vorzugsweise Iod 125, indem beispielsweise das Chloramin-T-Verfahren verwendet wird, wobei das freie Iod durch eine Umkehrphasen-Einwegkartusche abgetrennt wird. Andere Verfahren der Markierung unter Verwendung von enzymatischen oder Fluoreszenz-Markern, z. B. Europium, können ebenfalls verwendet werden. Bekannte Techniken, welche in dem Immunoassay verwendet werden können, sind in der Literatur beschrieben worden, z. B. in dem Buch "Immunochemistry of the Extracellular Matrix", welches oben erwähnt wurde. In einem Verfahren werden beispielsweise markiertes querverknüpftes carboxyterminales Propeptid von Kollagen Typ I und die Probe beide mit dem Antikörper in Kontakt gebracht, der so gebildete Antigen-Antikörper-Komplex wird von dem nicht komplexierten Ausgangsmaterial abgetrennt und es wird auf den komplexierten oder nicht komplexierten Marker getestet. Die Abtrennung des Antigen-Antikörper-Komplexes kann erleichtert werden, indem der Antigen-Antikörper-Komplex mit einem zweiten Antikörper in Kontakt gebracht wird, welcher für den ersten Antikörper spezifisch ist, und der Antigen-Antikörper-Antikörper-Komplex von den nicht komplexierten Ausgangsmaterialien abgetrennt wird.
  • Das Immunoassayverfahren der Erfindung erlaubt die Bestimmung von Abbauprodukten von Kollagen Typ I in humanem Serum oder anderen Körperflüssigkeiten. Die Konzentration des querverknüpften Telopeptids in normalem Serum liegt bei ca. 1,5 bis 4,2 Mikrogramm/Liter und ist z. B. in Prostata- oder Brustkrebspatienten mit osteolytischen Metastasen erhöht, die eine bis zu zwanzigfache Erhöhung der Konzentration der Abbauprodukte von Kollagen Typ I aufweisen können. Das Testverfahren ist in der Lage, 0,5 Mikrogramm/Liter des querverknüpften Telopeptids nachzuweisen.
  • Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
  • BEISPIEL I
  • Präparation von querverknüpftem carboxyterminalem Telopeptid von Kollagen Typ I aus menschlichem Knochen oder aus Knochen eines Versuchstieres und Produktion eines spezifischen Antikörpers gegen dieses
  • Zuerst wird nicht gelöstes Kollagen Typ I aus Knochen von Menschen oder von einem Versuchstier (z. B. Ratte, Meerschweinchen, Hund, Rind) isoliert. Im Fall von menschlichem Knochen werden einen cm dicke Scheiben des Femurs aus dem Femurkopf erhalten, die während einer elektiven Hüftgelenksprothesenoperation entfernt wurden. Im Fall von Versuchstieren wird der Femur nach einer Enthauptung des Tieres präpariert. Die Knochen werden mit Aceton extrahiert, um das Fett zu entfernen, welches im Knochenmark vorhanden ist. Nach einem Trocknen an der Luft werden die Scheiben in kleinere Stücke geschnitten und schließlich unter flüssigem Stickstoff pulverisiert, indem eine Mineralmühle (Raetsch AG, Deutschland) verwendet wird. Nicht kollagene Proteine werden bei +4°C für 24 Stunden durch 4 M Guanidin/HCl in 50 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7,4, welcher Proteaseinhibitoren (0,1 M Aminocapronsäure, 5 mM Benzamidin/HCl und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid) enthält, extrahiert. Nach der Extraktion wird das Knochenpulver mehrere Male mit destilliertem Wasser gewaschen, um die Spuren des Extraktionspuffers zu entfernen. Dann wird das immer noch mineralisierte Knochenpulver durch Extraktion bei +4°C für 24 Stunden mit 0,5 M EDTA, das auf pH 7,4 eingestellt ist und 6 M Harnstoff enthält, entmineralisiert. Die Extraktion wird zweimal wiederholt. Der unlösliche Rückstand wird durch Zentrifugation (15 000 × g für 30 min.) gesammelt und mehrere Male mit destilliertem Wasser gewaschen, um die Spuren des Extraktionspuffers zu entfernen. Danach wird der Rückstand lyophilisiert. Ungefähr ein g unlösliches Kollagen kann aus einer ein cm-Scheibe des menschlichen Femurs erhalten werden.
  • Für die Präparation der Abbaupeptide werden 2 g unlösliches Knochenkollagen in 100 ml 0,2 M Ammoniumbicarbonat suspendiert und 30 min. lang bei +70°C denaturiert. Nach einem Absenken der Temperatur der Lösung auf +37°C wird das Material 8 Stunden lang bei +37°C mit bakterieller Kollagenase (CLSPA-Grad, Worthington, USA) verdaut, indem 10 mg des Enzyms verwendet werden. Nach einer erneuten Denaturierung (30 min. bei +70°C) wird mehr Enzym (10 mg) zugegeben, und die Mischung wird weitere 12 Stunden bei +37°C inkubiert. Nach dem Verdau wird die Mischung zentrifugiert (15000 × g für 30 min.), um unverdautes unlösliches Material zu entfernen. Dann wird der Überstand mit konzentrierter HCl auf einen pH von 2,5 eingestellt, und Isopropanol wird bis zu der Endkonzentration von 20% zugegeben. Diese Mischung (ca. 100 ml) wird dann in 5 ml-Portionen über eine präparative Sep-Pak®-C18-Kartusche geleitet. Das querverknüpfte carboxyterminale Telopeptid von Kollagen Typ I wird an die Kartusche gebunden, aus welcher es mit 3 ml 50% Isopropanol in 0,1 M Essigsäure abgelöst wird. Das Eluat wird dann bis zur Trockenheit lyophilisiert. Eine Mischung, welche ca. 40 mg an Peptiden enthält, wird aus 2 g unlöslichem Kollagen erhalten.
  • Die Reinigung des querverknüpften carboxyterminalen Telopeptids von Kollagen Typ I wird durchgeführt, indem zwei verschiedene Umkehrphasenschritte mit Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) verwendet werden. Die lyophilisierte Peptidmischung wird zuerst in 0,1% Trifluoressigsäure gelöst und auf eine C18-Umkehrphasensäule (Vydac® 218TP1010) aufgetragen. Die gebundenen Peptide werden mit ansteigenden Konzentrationen von Isopropanol (10–70%, 0–45 min.) eluiert. Das Eluat wird auf die Fluoreszenzcharakteristik von Pyridinolin-Querverknüpfungen hin überwacht (Anregung 295 nm, Emission 395 nm). Der fluoreszierende Peptidpeak, welcher das querverknüpfte carboxyterminale Telopeptid von Kollagen Typ I enthält, wird gesammelt und lyophilisiert. Dann wird das Peptid (welches immer noch eine kleinere Menge an anderen verunreinigenden Peptiden enthält) in 50 mM Ammoniumacetat, pH 7,4, gelöst und auf eine pH-stabile C18-Umkehrphasensäule (Vydac® 228TP104) aufgetragen.
  • Das gebundene Peptid wird mit steigenden Konzentrationen von Acetonitril (0–90%, 0–45 min.) eluiert. Das Eluat wird wie oben auf Fluoreszenz hin überwacht, und das jetzt homogene querverknüpfte carboxyterminale Telopeptid von Kollagen Typ I wird gesammelt und lyophilisiert. Der Ursprung und die Identität des Peptides werden durch N-terminale Aminosäuresequenzierung verifiziert. Die folgenden Sequenzen können für das querverknüpfte humane Peptid erhalten werden, das von zwei carboxyterminalen Telopeptiden der α1-Ketten von Kollagen Typ I und einem Bereich aus dem helikalen Teil von entweder der α1-Kette oder der α2-Kette von Kollagen Typ I abgeleitet ist:
    Figure 00110001
    wobei Hyp Hydroxyprolin ist, Hylys Hydroxylysin ist und
    Figure 00110002
    die Position der Querverknüpfung anzeigt.
  • Abhängig von dem Enzym, welches zur Freisetzung des Peptids verwendet wird, und auch zwischen den verschiedenen Präparationen variierend, können die Ausgangssequenzen wenige Aminosäuren länger oder kürzer sein. Dieses beeinträchtigt jedoch nicht den Test, da die immunologischen Determinanten, die gemessen werden, um die Querverknüpfung (mit
    Figure 00110003
    markiert) herum in dem α1-Kettenbereich des Telopeptids liegen.
  • Das Antiserum, welches für das carboxyterminale Telopeptid spezifisch ist, kann erhalten werden, indem Kaninchen mit 0,1 mg des gereinigten querverknüpften Telopeptids, das in 1 ml 0,2 M NH4HCO3 solubilisiert und mit 1 ml Freund's vollständigem Adjuvans zusammengemischt ist, immunisiert werden. Ein zwei ml-Aliquot der Suspension wird intradermal an 50 verschiedenen Stellen in den Rücken eines Kaninchens verabreicht. Eine ähnliche Auffrischungsinjektion wird nach drei Wochen verabreicht und nach einem Testen des Antiserums auf eine Bindung des radioaktiv markierten Antigens wenn nötig wiederholt. Wenn Mäuse immunisiert werden, werden nur 0,1 ml einer ähnlichen Suspension in den Rücken einer Maus verabreicht. Eine ähnliche Auffrischungsinjektion wird nach drei Wochen verabreicht und eine weitere wird intraperitoneal wenige Tage vor dem Entfernen der Milz zur Produktion von Hybridomen verabreicht.
  • BEISPIEL II
  • Durchführung des Gleichgewichts-Radioimmunassays
  • Fünf Mikrogramm des querverknüpften carboxyterminalen Telopeptids von Kollagen Typ I, welches wie in Beispiel I beschrieben hergestellt wurde, werden mit 1 Millicurie Iod-125 unter Verwendung von Chloramin-T (5 Mikrogramm) markiert. Das freie Iod wird mit einer präparativen Sep-Pak®-C18-Kartusche entfernt, nachdem die Lösung mit 0,1 M Essigsäure angesäuert wurde. Das markierte Peptid wird aus der Kartusche mit 50% Isopropanol in 0,1 M Essigsäure eluiert.
  • Antikörper-Bindungskurven werden mit 50 000 Radioaktivitäts-Zählimpulsen pro Minute von dem markierten querverknüpften Telopeptid angefertigt. Die Telopeptidkonzentration in einer unbekannten Probe des Serums oder einer anderen Körperflüssigkeit wird in dem folgenden Radioimmun-Inhibitionsassay bestimmt. Eine vorher getestete Menge des Antiserums wird mit der unbekannten Probe und 50 000 Zählimpulsen pro Minute der Markierungssubstanz für 2 Stunden bei +37°C inkubiert. Dann wird ein zweiter Antikörper gegen gamma-Globulin aus Kaninchen in 1,2 M (NH4)2SO4 zugegeben, und nach 30 min. Inkubation bei +4°C wird das Antigen, welches in dem Immunkomplex gebunden ist, durch Zentrifugation aus der Lösung abgetrennt. Die Inhibitionsaktivität der unbekannten Probe wird mit der Aktivität der Standardkonzentrationen von nicht markiertem querverknüpftem carboxyterminalem Telopeptid von Kollagen Typ I verglichen.

Claims (15)

  1. Verwendung eines Antikörpers, der für das carboxyterminale Telopeptid von Kollagen Typ I spezifisch ist, welches aus Knochen aus einem humanen oder tierischen Wirbeltier erhältlich ist, beim Testen auf das Vorliegen oder den Gehalt eines Abbauproduktes von Kollagen Typ I in einer Probe, von welcher bekannt ist oder vermutet wird, daß sie das Abbauprodukt enthält.
  2. Verfahren zum Testen auf ein Abbauprodukt von Kollagen Typ I, welches umfaßt: In-Kontakt-Bringen in beliebiger Reihenfolge von (i) einer Probe, von welcher bekannt ist oder vermutet wird, daß sie ein solches Produkt enthält; (ii) einem Antikörper, der für das carboxyterminale Telopeptid von Kollagen Typ I spezifisch ist, welches aus Knochen aus einem humanen oder tierischen Wirbeltier erhältlich ist; und (iii) einem Marker; unter solchen Bedingungen, daß der Marker in einer Menge gebunden wird, die von der Menge des Abbauproduktes von Kollagen Typ I in der Probe abhängt, und dann Testen auf den gebundenen und/oder nicht gebundenen Marker, um das Vorliegen oder den Gehalt des Abbauproduktes von Kollagen Typ I in der Probe zu bestimmen.
  3. Ein Verfahren gemäß Anspruch 2, bei welchem der Antikörper gegen das carboxyterminale quervernetzte Telopeptid von Kollagen Typ I hervorgerufen wird.
  4. Ein Verfahren gemäß Anspruch 2 oder 3, bei welchem der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
  5. Ein Verfahren gemäß Anspruch 4, bei welchem der monoklonale Antikörper spezifisch an ein Peptid bindet, welches die folgende Sequenz aufweist
    Figure 00140001
    wobei Hyp Hydroxyprolin ist, Hylys Hydroxylysin ist und
    Figure 00140002
    die Position der Querverknüpfung anzeigt.
  6. Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 5, in welchem markiertes carboxylterminales Telopeptid von Kollagen Typ I und die Probe beide mit dem genannten Antikörper in Kontakt gebracht werden, der so gebildete Antigen-Antikörper-Komplex von dem nicht komplexierten Ausgangsmaterial abgetrennt wird und auf den komplexierten oder den nicht komplexierten Marker getestet wird.
  7. Ein Verfahren gemäß Anspruch 6, bei welchem der Antigen-Antikörper-Komplex mit einem zweiten Antikörper in Kontakt gebracht wird, welcher ein Antikörper gegen den ersten Antikörper ist, und der so gebildete Antigen-Antikörper-Antikörper-Komplex von dem nicht komplexierten Ausgangsmaterial abgetrennt wird.
  8. Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 7, in welchem der Marker ein radioaktiver, ein Enzym- oder ein fluoreszierender Marker ist.
  9. Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 8, in welchem der erste Äntikörper oder, wenn vorhanden, der zweite Antikörper an einen festen Träger gebunden ist, und der gebildete Antigen-Antikörper- oder Antigen- Antikörper-Antikörper-Komplex von dem Medium abgetrennt wird, in welchem der Kontakt stattfindet, indem der feste Träger abgetrennt wird.
  10. Ein Kit, welches zur Verwendung bei der Durchführung eines Testverfahrens gemäß einem der Ansprüche 2 bis 9 geeignet ist, das einen Antikörper, der für das carboxyterminale Telopeptid von Kollagen Typ I spezifisch ist, und einen Marker umfaßt.
  11. Ein Kit, welches zur Verwendung bei der Durchführung eines Testverfahrens gemäß Anspruch 9 geeignet ist, das einen ersten Antikörper, welcher für das carboxyterminale Telopeptid von Kollagen Typ I spezifisch ist, einen zweiten Antikörper, welcher ein Antikörper gegen den ersten Antikörper ist, einen Marker und einen festen Träger umfaßt, an welchen der erste oder zweite Antikörper gebunden ist.
  12. Ein Antikörper, der gegen das carboxyterminale quervernetzte Telopeptid von Kollagen Typ I hervorgerufen wurde, welches aus Knochen aus einem humanen oder nicht-humanen Wirbeltier erhältlich ist.
  13. Ein Antikörper wie in Anspruch 12 beansprucht, welcher ein monoklonaler Antikörper ist, der für das carboxyterminale Telopeptid von Kollagen Typ I spezifisch ist.
  14. Ein Antikörper wie in Anspruch 12 beansprucht, welcher ein monoklonaler Antikörper ist, der spezifisch an ein Peptid mit der Sequenz
    Figure 00150001
    Figure 00160001
    bindet, wobei Hyp Hydroxyprolin ist, Hylys Hydroxylysin ist und
    Figure 00160002
    die Position der Querverknüpfung anzeigt.
  15. Ein Verfahren zum Isolieren von carboxyterminalem quervernetztem Telopeptid von Kollagen Typ I, welches ein Unterwerfen von entkalktem, unlöslichem Knochengewebe unter eine Denaturierung und eine Chromatographie unter Verwendung einer Mehrzahl von Schritten einer Umkehrphasentrennung mit einer Hochleistungsflüssigchromatographie umfaßt, wobei wenigstens zwei der Chromatographieschritte bei einem unterschiedlichen pH stattfinden.
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Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4973666A (en) * 1987-11-06 1990-11-27 Washington Research Foundation Peptide fragments containing HP and LP cross-links
US5962639A (en) 1987-11-06 1999-10-05 Washington Research Foundation Synthetic peptides corresponding to telopeptide sequences of cross-linked type I collagen metabolites
US6027903A (en) * 1987-11-06 2000-02-22 Washington Research Foundation Kit for detecting analyte indicative of type I collagen resorption in vivo
US5320970A (en) * 1987-11-06 1994-06-14 Washington Research Foundation Detection of collagen degradation in vivo
US6153732A (en) * 1987-11-06 2000-11-28 Washington Research Foundation Kit for detecting analyte indicative of type II collagen resorption in vivo
US5300434A (en) * 1987-11-06 1994-04-05 Washington Research Foundation Hybridoma cell line producing an antibody to type-I collagen amino-terminal telopeptide
DE4225038C2 (de) * 1992-07-29 1995-11-30 Boehringer Mannheim Gmbh Herstellung und Verwendung von Antikörpern gegen Kollagen
US6132976A (en) * 1992-12-04 2000-10-17 Shriners Hospitals For Children Immunoassays for the measurement of collagen denaturation and cleavage in cartilage
CA2148132A1 (en) * 1992-12-04 1994-06-23 Anthony Robin Poole Immunoassay for the measurement of collagen cleavage in cartilage
WO1994014844A1 (en) * 1992-12-28 1994-07-07 Baylink David J Bone resorption assay
CA2167496A1 (en) * 1993-07-28 1995-02-09 Werner Naser Immunoassay for the detection of collagen or collagen fragments
DK104093D0 (da) * 1993-09-17 1993-09-17 Osteometer A S Fremgangsmaade til bestemmelse af collagen-fragmenter i legemsvaesker, test-kit og midler til udoevelse af fremgangsmaaden og anvendelse af fremgangsmaaden til diagnosticering af lidelser associeret til collagen-metabolismen
US6110689A (en) * 1994-01-21 2000-08-29 Osteometer A/S Method of assaying collagen fragments in body fluids, a test kit and means for carrying out the method and use of the method to diagnose the presence of disorders associated with the metabolism of collagen
GB9506050D0 (en) 1995-03-24 1995-05-10 Osteometer A S Assaying collagen fragments in body fluids
WO1996012193A1 (en) * 1994-10-17 1996-04-25 Osteometer Bio Tech A/S Estimation of the fragmentation pattern of collagen in body fluids and the diagnosis of disorders associated with the metabolism of collagen
GB9507985D0 (en) * 1995-04-19 1995-06-07 Orion Yhtymae Oy Antibody to aminoterminal propeptide to type 1 procollagen and assay method using it
US6107047A (en) * 1996-03-21 2000-08-22 Osteometer Biotech A/S Assaying protein fragments in body fluids
GB9617616D0 (en) 1996-08-22 1996-10-02 Osteometer Biotech As Assaying protein fragments in body fluids
EP0829724A1 (de) * 1996-09-17 1998-03-18 Nederlandse Organisatie Voor Toegepast-Natuurwetenschappelijk Onderzoek Tno Verfahren zum Nachweis von Kollagenabbau
ATE202632T1 (de) 1996-12-09 2001-07-15 Osteometer Biotech As Sandwichtest zum nachweis von kollagenfragmenten
ATE258310T1 (de) * 1997-07-31 2004-02-15 Metra Biosystems Inc Testverfahren für collagenpeptid
US6117646A (en) * 1997-09-22 2000-09-12 Osteometer Biotech A/S Assaying protein fragments in body fluids
US6348320B1 (en) 1998-06-19 2002-02-19 Washington Research Foundation Cartilage resorption assays measuring type II collagen fragments
ATE302949T1 (de) 1998-06-19 2005-09-15 Washington Res Found Knorpelresorptionsassays
US6602980B1 (en) 1998-06-19 2003-08-05 Washington Research Foundation Collagen type III synthetic peptides for collagen resorption assays
US6916903B2 (en) 1998-06-19 2005-07-12 Washington Research Foundation Collagen type III synthetic peptides for collagen resorption assays
GB9907234D0 (en) * 1999-03-29 1999-05-26 Isis Innovation Drug assay
US8012681B2 (en) 2003-05-13 2011-09-06 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Methods of modulating metastasis and skeletal related events resulting from metastases
US7405037B2 (en) * 2004-05-07 2008-07-29 Lonza Walkersville, Inc. Methods and tools for detecting collagen degradation
JP2010506147A (ja) * 2006-09-29 2010-02-25 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 関節リウマチを有する患者のための疾患進行のリスク評価
TWI395593B (zh) 2008-03-06 2013-05-11 Halozyme Inc 可活化的基質降解酵素之活體內暫時性控制
US9012160B2 (en) * 2008-06-16 2015-04-21 Abraham Amir Monitoring skin metabolism products for evaluating burn injury
WO2010102262A1 (en) 2009-03-06 2010-09-10 Halozyme, Inc. Temperature sensitive mutants of matrix metalloprotease 1 und uses thereof
WO2014107745A1 (en) 2013-01-07 2014-07-10 Halozyme, Inc. Metal sensitive mutants of matrix metalloproteases and uses thereof
CN106248970A (zh) * 2016-08-12 2016-12-21 江苏泽成生物技术有限公司 一种测定i型胶原c末端肽含量的试剂盒及其测试方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1259914A (en) * 1984-07-06 1989-09-26 Donald G. Wallace Methods of bone repair using collagen
GB2205643B (en) * 1987-05-08 1991-03-13 Farmos Group Limited Type iii collagen degradation assay
US4973666A (en) * 1987-11-06 1990-11-27 Washington Research Foundation Peptide fragments containing HP and LP cross-links
US5300434A (en) * 1987-11-06 1994-04-05 Washington Research Foundation Hybridoma cell line producing an antibody to type-I collagen amino-terminal telopeptide
US4969912A (en) * 1988-02-18 1990-11-13 Kelman Charles D Human collagen processing and autoimplant use
GB8815174D0 (en) * 1988-06-25 1988-08-03 Rowett Research Inst Method of monitoring collagen degradation

Also Published As

Publication number Publication date
US5538853A (en) 1996-07-23
DK0505210T3 (da) 1999-02-08
DE69226548D1 (de) 1998-09-17
JP2886728B2 (ja) 1999-04-26
ES2120431T3 (es) 1998-11-01
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ATE169739T1 (de) 1998-08-15
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EP0505210B1 (de) 1998-08-12

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