JPH0720126A - コラーゲン分解時に放出されるペプチドを基準にした骨吸収分析 - Google Patents
コラーゲン分解時に放出されるペプチドを基準にした骨吸収分析Info
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- JPH0720126A JPH0720126A JP4092420A JP9242092A JPH0720126A JP H0720126 A JPH0720126 A JP H0720126A JP 4092420 A JP4092420 A JP 4092420A JP 9242092 A JP9242092 A JP 9242092A JP H0720126 A JPH0720126 A JP H0720126A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ヒト又は脊椎動物の骨からのＩ型コラーゲン
カルボキシル末端テロペプチドの単離方法、該テロペプ
チドに特異的な抗体、それを利用するＩ型コラーゲン分
解産物の分析方法、及び分析方法を実施する際の使用に
好適なキット。 【効果】 迅速で簡単に、血清サンプルを用いてＩ型コ
ラーゲンの分解を測定することができ、骨粗鬆症、リウ
マチ様関節炎及び骨の転移を伴う種々の癌などの疾病の
診断及び監視に利用できる。
カルボキシル末端テロペプチドの単離方法、該テロペプ
チドに特異的な抗体、それを利用するＩ型コラーゲン分
解産物の分析方法、及び分析方法を実施する際の使用に
好適なキット。 【効果】 迅速で簡単に、血清サンプルを用いてＩ型コ
ラーゲンの分解を測定することができ、骨粗鬆症、リウ
マチ様関節炎及び骨の転移を伴う種々の癌などの疾病の
診断及び監視に利用できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はＩ型コラーゲンの分解を
測定する方法すなわち骨吸収の度合を測定する方法、及
びその方法を実施するのに好適なキットに関する。
測定する方法すなわち骨吸収の度合を測定する方法、及
びその方法を実施するのに好適なキットに関する。
【０００２】Ｉ型コラーゲンは、人体中に最も豊富に存
在するコラーゲンのタイプである。これは他のコラーゲ
ンと共に軟結合組織中に見出されるが、また、石灰化し
た骨の土台をも形成しており、その場合にはこれが実際
には存在する唯一のコラーゲンのタイプであって、総有
機物質の約９０％を占める。Ｉ型コラーゲンはまた、ヒ
ト以外の脊椎動物の骨の中にも見出だされる。
在するコラーゲンのタイプである。これは他のコラーゲ
ンと共に軟結合組織中に見出されるが、また、石灰化し
た骨の土台をも形成しており、その場合にはこれが実際
には存在する唯一のコラーゲンのタイプであって、総有
機物質の約９０％を占める。Ｉ型コラーゲンはまた、ヒ
ト以外の脊椎動物の骨の中にも見出だされる。
【０００３】一生を通じて、骨は代謝的に活性な組織で
ある。新しいマトリックスの合成及び存在するマトリッ
クスの入れ替わりは、通常、空間および時間の両方に互
いに関係している。疾病時にはこのバランスが乱れるこ
とがあり、例えば骨粗鬆症の場合には骨吸収が骨合成を
長期にわたって上まわってしまい、結果として骨量の減
少をきたす。同様に、リウマチ様関節炎及び骨の転移を
伴う種々の癌も、局所的な骨の破壊をもたらす。
ある。新しいマトリックスの合成及び存在するマトリッ
クスの入れ替わりは、通常、空間および時間の両方に互
いに関係している。疾病時にはこのバランスが乱れるこ
とがあり、例えば骨粗鬆症の場合には骨吸収が骨合成を
長期にわたって上まわってしまい、結果として骨量の減
少をきたす。同様に、リウマチ様関節炎及び骨の転移を
伴う種々の癌も、局所的な骨の破壊をもたらす。
【０００４】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】合成さ
れたＩ型コラーゲンの量は、Ｉ型プロコラーゲンのカル
ボキシル末端プロペプチドの分析方法を基本として測定
することができ、血液サンプルを用いて実施される。コ
ラーゲンの分解は、長い間、尿中のヒドロキシプロリン
の排泄物を測定することにより分析されてきた。しか
し、この方法は長時間（２４時間）を通して尿を採取し
なければならず、しかも特定の型のコラーゲンに限定さ
れる方法ではない。より新しい方法は、尿中のコラーゲ
ン由来のピリジノリン架橋の測定方法である。ヒドロキ
シプロリン分析に対するいくつかの長所にもかかわら
ず、この方法は重大な欠点をも有している。血清サンプ
ルを基にしたＩ型コラーゲンの分解を測定する特定の方
法に対する要望がある。
れたＩ型コラーゲンの量は、Ｉ型プロコラーゲンのカル
ボキシル末端プロペプチドの分析方法を基本として測定
することができ、血液サンプルを用いて実施される。コ
ラーゲンの分解は、長い間、尿中のヒドロキシプロリン
の排泄物を測定することにより分析されてきた。しか
し、この方法は長時間（２４時間）を通して尿を採取し
なければならず、しかも特定の型のコラーゲンに限定さ
れる方法ではない。より新しい方法は、尿中のコラーゲ
ン由来のピリジノリン架橋の測定方法である。ヒドロキ
シプロリン分析に対するいくつかの長所にもかかわら
ず、この方法は重大な欠点をも有している。血清サンプ
ルを基にしたＩ型コラーゲンの分解を測定する特定の方
法に対する要望がある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明はそのような方法
であって、迅速で簡単に実施できる方法を提供するもの
である。
であって、迅速で簡単に実施できる方法を提供するもの
である。
【０００６】我々は、骨のコラーゲンの分解時に多くの
様々な断片が形成される場合に、ある種の架橋された断
片が放出され、この断片はそれ以上の分解に耐えてその
免疫学的構造を完全なまま保つことを見出した。それゆ
えこれはイムノアッセイを用いて容易に定量的に測定で
きる形で循環中に現れる。このＩ型コラーゲン分子のカ
ルボキシル末端の非らせん状端、いわゆるテロペプチド
部は不溶性コラーゲンマトリックス中の分子間多価架橋
に関わっており、たとえばラジオイムノアッセイのよう
な免疫学的方法によって分析することができ、Ｉ型コラ
ーゲンの分解に関する重要な情報を提供する。
様々な断片が形成される場合に、ある種の架橋された断
片が放出され、この断片はそれ以上の分解に耐えてその
免疫学的構造を完全なまま保つことを見出した。それゆ
えこれはイムノアッセイを用いて容易に定量的に測定で
きる形で循環中に現れる。このＩ型コラーゲン分子のカ
ルボキシル末端の非らせん状端、いわゆるテロペプチド
部は不溶性コラーゲンマトリックス中の分子間多価架橋
に関わっており、たとえばラジオイムノアッセイのよう
な免疫学的方法によって分析することができ、Ｉ型コラ
ーゲンの分解に関する重要な情報を提供する。
【０００７】この発見は、Ｉ型コラーゲンのカルボキシ
ル末端テロペプチドに特異的な抗体を用いた、いかなる
公知のイムノアッセイにおいても用いることができる。
それゆえ本発明はＩ型コラーゲン分解産物の分析方法を
提供し、この方法は、(i) そのような産物を含有してい
ることがわかっているか予想される試料；(ii)Ｉ型コラ
ーゲンカルボキシル末端テロペプチドに特異的な抗体、
及び(iii) 標識を、該標識が該試料中のＩ型コラーゲン
分解産物の量に依存する量で結合するような条件で、い
ずれかの順序で接触させ、次いで、結合した及び／又は
結合していない標識を、該試料中に存在するＩ型コラー
ゲン分解産物の存在又は量の指標として分析することを
含む。
ル末端テロペプチドに特異的な抗体を用いた、いかなる
公知のイムノアッセイにおいても用いることができる。
それゆえ本発明はＩ型コラーゲン分解産物の分析方法を
提供し、この方法は、(i) そのような産物を含有してい
ることがわかっているか予想される試料；(ii)Ｉ型コラ
ーゲンカルボキシル末端テロペプチドに特異的な抗体、
及び(iii) 標識を、該標識が該試料中のＩ型コラーゲン
分解産物の量に依存する量で結合するような条件で、い
ずれかの順序で接触させ、次いで、結合した及び／又は
結合していない標識を、該試料中に存在するＩ型コラー
ゲン分解産物の存在又は量の指標として分析することを
含む。
【０００８】このような方法は、ヒト又はヒト以外のど
ちらの脊椎動物のコラーゲン分解の分析にも役立つであ
ろう。例えば、ヒトにおいては、骨マトリックスの合成
又は入れ替わりの乱れに関連した疾病状態を診断又は監
視しうる。たとえば囓歯類、イヌ科、ウシ科及びネコ科
などのヒト以外の脊椎動物において同様の分析をなすこ
とができ、これは獣医学又は薬学の分析において用いる
ことができる。
ちらの脊椎動物のコラーゲン分解の分析にも役立つであ
ろう。例えば、ヒトにおいては、骨マトリックスの合成
又は入れ替わりの乱れに関連した疾病状態を診断又は監
視しうる。たとえば囓歯類、イヌ科、ウシ科及びネコ科
などのヒト以外の脊椎動物において同様の分析をなすこ
とができ、これは獣医学又は薬学の分析において用いる
ことができる。
【０００９】本イムノアッセイはＩ型コラーゲンカルボ
キシル末端テロペプチドに特異的な抗体を用いる必要が
ある。好適な抗体はＩ型コラーゲンカルボキシル末端架
橋テロペプチドに対して作られたものであり、本発明に
より提供される。抗体の産生に用いられるテロペプチド
は、ヒト又はヒト以外の脊椎動物の骨から得られる。下
記のより詳細な説明において引用されているコラーゲン
はヒトコラーゲンであるが、いかなる脊椎動物のコラー
ゲンに対しても適当に応用できるであろうことは評価さ
れる。
キシル末端テロペプチドに特異的な抗体を用いる必要が
ある。好適な抗体はＩ型コラーゲンカルボキシル末端架
橋テロペプチドに対して作られたものであり、本発明に
より提供される。抗体の産生に用いられるテロペプチド
は、ヒト又はヒト以外の脊椎動物の骨から得られる。下
記のより詳細な説明において引用されているコラーゲン
はヒトコラーゲンであるが、いかなる脊椎動物のコラー
ゲンに対しても適当に応用できるであろうことは評価さ
れる。
【００１０】抗体産生のための抗原として用いられる架
橋テロペプチドは骨コラーゲンから単離される。上述し
たように、テロペプチドの架橋断片はさらなる分解に抵
抗し、それ故、抗体産生用抗原として好適な選択であ
る。
橋テロペプチドは骨コラーゲンから単離される。上述し
たように、テロペプチドの架橋断片はさらなる分解に抵
抗し、それ故、抗体産生用抗原として好適な選択であ
る。
【００１１】本発明は又、Ｉ型コラーゲンカルボキシル
末端架橋テロペプチドの単離方法をも提供し、それは、
脱灰した不溶性の骨組織を変性させること及び、少なく
とも２つの分離ステップを異なるpHで行う高速液体クロ
マトグラフィー（ＨＰＬＣ）による複数の逆相分離ステ
ップを用いるクロマトグラフィーを含む。
末端架橋テロペプチドの単離方法をも提供し、それは、
脱灰した不溶性の骨組織を変性させること及び、少なく
とも２つの分離ステップを異なるpHで行う高速液体クロ
マトグラフィー（ＨＰＬＣ）による複数の逆相分離ステ
ップを用いるクロマトグラフィーを含む。
【００１２】Ｉ型コラーゲン分子がコラーゲン繊維に組
み込まれる時に、分子間架橋が、１分子のカルボキシル
末端テロペプチド部位及び他の分子の三重らせん状部分
のアミノ末端側の半分の中の特定の部位との間に形成さ
れる。これらの若い架橋はゆっくり成熟して多価の架橋
となり、これは骨コラーゲン中で、ピリジノリン又はジ
ヒドロピリジノリンの化学構造を有し、カルボキシル末
端のテロペプチド中の２つのヒドロキジリジンもしくは
リジン、又はそれらのアルデヒド類、及びらせん部分中
の１つのヒドロキシリジン残基（末端アミノ基から数え
て８７番目のアミノ酸）から誘導される。このようなピ
リジノリン構造は、特有の蛍光を有し、これに基いてピ
リジノリンを含有するペプチドは容易に識別することが
できる。これらの多価架橋はコラーゲンを、中性又は酸
性溶液のどちらの通常の抽出過程でも不溶性にしてい
る。そのような架橋によってなおも結合しているペプチ
ド類は、架橋Ｉ型コラーゲンを主として含有する脱灰し
た不溶性の骨組織を、変性後に、トリプシン又は細菌性
コラーゲナーゼのような蛋白質分解酵素によって完全に
消化した後に単離される。遊離された架橋ペプチドは次
いでクロマトグラフィーにより、好ましくは高速液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いた数次の逆相分離
により精製される。
み込まれる時に、分子間架橋が、１分子のカルボキシル
末端テロペプチド部位及び他の分子の三重らせん状部分
のアミノ末端側の半分の中の特定の部位との間に形成さ
れる。これらの若い架橋はゆっくり成熟して多価の架橋
となり、これは骨コラーゲン中で、ピリジノリン又はジ
ヒドロピリジノリンの化学構造を有し、カルボキシル末
端のテロペプチド中の２つのヒドロキジリジンもしくは
リジン、又はそれらのアルデヒド類、及びらせん部分中
の１つのヒドロキシリジン残基（末端アミノ基から数え
て８７番目のアミノ酸）から誘導される。このようなピ
リジノリン構造は、特有の蛍光を有し、これに基いてピ
リジノリンを含有するペプチドは容易に識別することが
できる。これらの多価架橋はコラーゲンを、中性又は酸
性溶液のどちらの通常の抽出過程でも不溶性にしてい
る。そのような架橋によってなおも結合しているペプチ
ド類は、架橋Ｉ型コラーゲンを主として含有する脱灰し
た不溶性の骨組織を、変性後に、トリプシン又は細菌性
コラーゲナーゼのような蛋白質分解酵素によって完全に
消化した後に単離される。遊離された架橋ペプチドは次
いでクロマトグラフィーにより、好ましくは高速液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いた数次の逆相分離
により精製される。
【００１３】アルブミン、又は完全な形のＩ型コラーゲ
ン分子のような関係のない蛋白質と結合している、組織
の塩又は酸性抽出物から可溶性の形で単離された架橋テ
ロペプチド部分は、次いで、公知の、たとえば "Immuno
chemistry of the Extracellular Matrix" ed. H Furth
mayr CRC Press社、Boca Rator, U.S.A.1982、特にFurt
hmayr による１４３〜１７８頁、Linsenmayer 他による
１７９〜１９８頁及びTimpl 他により１９９〜２３５頁
などに記載の技術を用いて好適な動物を免疫化すること
などにより、特異的抗体を産生するのに用いられる。高
度に特異的なＩ型コラーゲンテロペプチドの抗体は、Ｉ
型コラーゲンを、実験用動物、例えば、ポリクローナル
抗体の場合はウザギ、モノクローナル抗体の場合はマウ
スに、好適なアジュバントの存在下で皮下注射すること
により最も良く産生される。抗体はモノクローナル又は
ポリクローナルであってIgG 型又はIgM であってよい。
ン分子のような関係のない蛋白質と結合している、組織
の塩又は酸性抽出物から可溶性の形で単離された架橋テ
ロペプチド部分は、次いで、公知の、たとえば "Immuno
chemistry of the Extracellular Matrix" ed. H Furth
mayr CRC Press社、Boca Rator, U.S.A.1982、特にFurt
hmayr による１４３〜１７８頁、Linsenmayer 他による
１７９〜１９８頁及びTimpl 他により１９９〜２３５頁
などに記載の技術を用いて好適な動物を免疫化すること
などにより、特異的抗体を産生するのに用いられる。高
度に特異的なＩ型コラーゲンテロペプチドの抗体は、Ｉ
型コラーゲンを、実験用動物、例えば、ポリクローナル
抗体の場合はウザギ、モノクローナル抗体の場合はマウ
スに、好適なアジュバントの存在下で皮下注射すること
により最も良く産生される。抗体はモノクローナル又は
ポリクローナルであってIgG 型又はIgM であってよい。
【００１４】上述の方法により産生された抗体はカルボ
キシル基末端テロペプチド部に、それが架橋していても
いなくても、特異的である。血清サンプルを分析したと
きに測定されるテロペプチドは架橋したものである。と
いうのは、架橋していないテロペプチドはＩ型コラーゲ
ンの入れ替わり時にさらなる分解に耐えることができな
いので、血清中には見出せないからである。しかし、架
橋の性質は重要な問題ではない、というのは、他のタイ
プの架橋（リジン／ヒドロキシリジンから誘導されたも
の、及びヒスチジンから誘導されたもの）を含有する軟
組織Ｉ型コラーゲンから単離されたペプチドは上述した
方法によって産生された抗体によって検知できるからで
ある。同じ抗体はまた、テロペプチド部分を含有するが
架橋していない可溶性Ｉ型コラーゲン分子を（たとえば
細胞培養実験期間中などに）測定するのに用い得る。血
清サンプルの場合にはそのような状況に遭遇することは
ないが、他の病理学的液体又は組織液（腹水液、傷口液
等）を分析する際にはおこりうる。
キシル基末端テロペプチド部に、それが架橋していても
いなくても、特異的である。血清サンプルを分析したと
きに測定されるテロペプチドは架橋したものである。と
いうのは、架橋していないテロペプチドはＩ型コラーゲ
ンの入れ替わり時にさらなる分解に耐えることができな
いので、血清中には見出せないからである。しかし、架
橋の性質は重要な問題ではない、というのは、他のタイ
プの架橋（リジン／ヒドロキシリジンから誘導されたも
の、及びヒスチジンから誘導されたもの）を含有する軟
組織Ｉ型コラーゲンから単離されたペプチドは上述した
方法によって産生された抗体によって検知できるからで
ある。同じ抗体はまた、テロペプチド部分を含有するが
架橋していない可溶性Ｉ型コラーゲン分子を（たとえば
細胞培養実験期間中などに）測定するのに用い得る。血
清サンプルの場合にはそのような状況に遭遇することは
ないが、他の病理学的液体又は組織液（腹水液、傷口液
等）を分析する際にはおこりうる。
【００１５】イムノアッセイはそれ自身、いかなる方法
を用いて実施されてもよいが、相分離過程を含んでい
る、たとえばその頭文字によってＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、
ＦＩＡ、ＴＲ−ＦＩＡ、ＥＩＡ及びＩＲＭＡとして知ら
れている不均一系方法が好ましい。
を用いて実施されてもよいが、相分離過程を含んでい
る、たとえばその頭文字によってＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、
ＦＩＡ、ＴＲ−ＦＩＡ、ＥＩＡ及びＩＲＭＡとして知ら
れている不均一系方法が好ましい。
【００１６】好ましくは本方法は、単離したヒト架橋カ
ルボキシル末端Ｉ型コラーゲンテロペプチド及びそれに
特異的な抗体を用いたラジオイムノアッセイとして実施
される。テロペプチドは、放射性核種、好ましくはヨー
ド１２５で例えば、クロラミン−Ｔ法を用い、遊離のヨ
ードを廃棄可能な逆相カートリッジで分離して、標識さ
れる。酵素的標識又は、例えばユウロピウムのような蛍
光標識を用いるその他の標識方法を用いてもよい。イム
ノアッセイで用いてもよい公知の技術は、例えば上述
の"Immunochemistry of the Extracellular Matrix" 等
の文献に記載がある。例えば、ある方法においては、標
識した架橋Ｉ型コラーゲンカルボキシル末端プロペプチ
ド及び試料を、共に抗体と接触させ、そのようにして形
成された抗原抗体複合体を、複合体形成していない出発
物質から分離し、複合体形成した標識又は複合体形成し
ない標識を分析する。抗原抗体複合体の分離は、抗原抗
体複合体を、１次抗体に特異的な２次抗体に接触させ、
抗原−抗体−抗体複合体を複合体形成していない出発材
料から分離することにより容易に実施できる。
ルボキシル末端Ｉ型コラーゲンテロペプチド及びそれに
特異的な抗体を用いたラジオイムノアッセイとして実施
される。テロペプチドは、放射性核種、好ましくはヨー
ド１２５で例えば、クロラミン−Ｔ法を用い、遊離のヨ
ードを廃棄可能な逆相カートリッジで分離して、標識さ
れる。酵素的標識又は、例えばユウロピウムのような蛍
光標識を用いるその他の標識方法を用いてもよい。イム
ノアッセイで用いてもよい公知の技術は、例えば上述
の"Immunochemistry of the Extracellular Matrix" 等
の文献に記載がある。例えば、ある方法においては、標
識した架橋Ｉ型コラーゲンカルボキシル末端プロペプチ
ド及び試料を、共に抗体と接触させ、そのようにして形
成された抗原抗体複合体を、複合体形成していない出発
物質から分離し、複合体形成した標識又は複合体形成し
ない標識を分析する。抗原抗体複合体の分離は、抗原抗
体複合体を、１次抗体に特異的な２次抗体に接触させ、
抗原−抗体−抗体複合体を複合体形成していない出発材
料から分離することにより容易に実施できる。
【００１７】本発明のイムノアッセイは、ヒトの血清又
は他の体液中のＩ型コラーゲン分解産物の測定を可能に
する。正常の血清中の架橋テロペプチドの濃度は約１．
５〜４．２マイクログラム／リットルであって、例えば
骨転移を伴う前立腺癌又は胸郭癌などの患者においては
この濃度が上昇し、Ｉ型コラーゲン分解産物の濃度は通
常の２０倍にも増加する。本分析方法は、０．５マイク
ログラム／リットルの架橋テロペプチドをも検出するこ
とが可能である。
は他の体液中のＩ型コラーゲン分解産物の測定を可能に
する。正常の血清中の架橋テロペプチドの濃度は約１．
５〜４．２マイクログラム／リットルであって、例えば
骨転移を伴う前立腺癌又は胸郭癌などの患者においては
この濃度が上昇し、Ｉ型コラーゲン分解産物の濃度は通
常の２０倍にも増加する。本分析方法は、０．５マイク
ログラム／リットルの架橋テロペプチドをも検出するこ
とが可能である。
【００１８】
【実施例】次の実施例により本発明を説明する。 実施例１ ヒトの骨又は実験動物の骨からのＩ型コラーゲンの架橋
したカルボキシル末端テロペプチドの調製及びそれに特
異的な抗体の製造。
したカルボキシル末端テロペプチドの調製及びそれに特
異的な抗体の製造。
【００１９】まず、ヒト又は実験動物（たとえばラッ
ト、モルモット、犬、牛）の骨から不溶性Ｉ型コラーゲ
ンを単離した。ヒトの骨の場合、選択的股関節置換手術
時に取り除かれた大腿骨先端から大腿骨の１cm薄片を得
た。実験動物の場合、断頭後に大腿骨を得た。骨をアセ
トンを用いて抽出して骨髄中に存在する脂肪を除去し
た。空気中で乾燥した後、この薄片を細片に切り分け、
最終的に液体窒素下で鉱物破砕機（Raetsch AG、 German
y ）で破砕した。非コラーゲン性プロテインを、＋４℃
で２４時間、プロテアーゼインヒビター（０．１M アミ
ノカプロン酸、５mMベンズアミジン／ＨＣｌ及び１mMフ
ェニルメチルスルホニルフルオリド）を含有する５０mM
トリス／ＨＣｌ緩衝液、pH７．４中の４M グアニジン／
ＨＣｌにより抽出した。抽出後、骨粉を蒸留水で数回洗
浄して抽出緩衝液の痕跡を除去した。次いで、まだ無機
化合物が残っている粉末を、＋４℃で２４時間、ｐＨ
７．４に調整し、６M 尿素を含有する０．５M ＥＤＴＡ
で抽出することにより脱灰した。この抽出を２度繰り返
した。不溶性残渣を遠心分離により（１５，０００×ｇ
で３０分間）収集し、数回蒸留水で洗い、抽出緩衝液の
痕跡を除去した。その後残渣を凍結乾燥した。１cmのヒ
ト大腿骨薄片より、約１ｇの不溶性コラーゲンが得られ
た。
ト、モルモット、犬、牛）の骨から不溶性Ｉ型コラーゲ
ンを単離した。ヒトの骨の場合、選択的股関節置換手術
時に取り除かれた大腿骨先端から大腿骨の１cm薄片を得
た。実験動物の場合、断頭後に大腿骨を得た。骨をアセ
トンを用いて抽出して骨髄中に存在する脂肪を除去し
た。空気中で乾燥した後、この薄片を細片に切り分け、
最終的に液体窒素下で鉱物破砕機（Raetsch AG、 German
y ）で破砕した。非コラーゲン性プロテインを、＋４℃
で２４時間、プロテアーゼインヒビター（０．１M アミ
ノカプロン酸、５mMベンズアミジン／ＨＣｌ及び１mMフ
ェニルメチルスルホニルフルオリド）を含有する５０mM
トリス／ＨＣｌ緩衝液、pH７．４中の４M グアニジン／
ＨＣｌにより抽出した。抽出後、骨粉を蒸留水で数回洗
浄して抽出緩衝液の痕跡を除去した。次いで、まだ無機
化合物が残っている粉末を、＋４℃で２４時間、ｐＨ
７．４に調整し、６M 尿素を含有する０．５M ＥＤＴＡ
で抽出することにより脱灰した。この抽出を２度繰り返
した。不溶性残渣を遠心分離により（１５，０００×ｇ
で３０分間）収集し、数回蒸留水で洗い、抽出緩衝液の
痕跡を除去した。その後残渣を凍結乾燥した。１cmのヒ
ト大腿骨薄片より、約１ｇの不溶性コラーゲンが得られ
た。
【００２０】分解ペプチドの製造のために、不溶性骨コ
ラーゲン２ｇを０．２M 炭酸水素アンモニウム１００ml
中に懸濁し、＋７０℃で３０分間変性させた。溶液の温
度を＋３７℃まで下げた後、この材料を＋３７℃で８時
間、細菌性コラーゲナーゼ（CLSPA 級、Worthington,
U.S.A.)１０mgを用いて消化した。もう一度変性させた
（＋７０℃で３０分）後、さらに１０mgの酵素を加えて
混合物を＋３７℃でさらに１２時間インキュベートし
た。消化後、混合物を遠心分離し（１５，０００×ｇで
３０分間）て、消化されていない不溶性物質を取り除い
た。上清を濃塩酸でpH２．５に調整し、イソプロパノー
ルを、最終的に２０％濃度になるまで加えた。この混合
物（約１００ml）を、次いで，５mlづつ、分取用Sep-Pa
k （商品名）Ｃ18カートリッジに通過させた。Ｉ型コラ
ーゲンの架橋カルボキシル基末端テロペプチドはカート
リッジに結合しており、このカートリッジから、０．１
M 酢酸中５０％のイソプロパノール３mlを用いて取り除
いた。溶出液を次いで凍結して乾燥した。約４０mgのペ
プチド類を含む混合物が２ｇの不溶性コラーゲンより得
られた。
ラーゲン２ｇを０．２M 炭酸水素アンモニウム１００ml
中に懸濁し、＋７０℃で３０分間変性させた。溶液の温
度を＋３７℃まで下げた後、この材料を＋３７℃で８時
間、細菌性コラーゲナーゼ（CLSPA 級、Worthington,
U.S.A.)１０mgを用いて消化した。もう一度変性させた
（＋７０℃で３０分）後、さらに１０mgの酵素を加えて
混合物を＋３７℃でさらに１２時間インキュベートし
た。消化後、混合物を遠心分離し（１５，０００×ｇで
３０分間）て、消化されていない不溶性物質を取り除い
た。上清を濃塩酸でpH２．５に調整し、イソプロパノー
ルを、最終的に２０％濃度になるまで加えた。この混合
物（約１００ml）を、次いで，５mlづつ、分取用Sep-Pa
k （商品名）Ｃ18カートリッジに通過させた。Ｉ型コラ
ーゲンの架橋カルボキシル基末端テロペプチドはカート
リッジに結合しており、このカートリッジから、０．１
M 酢酸中５０％のイソプロパノール３mlを用いて取り除
いた。溶出液を次いで凍結して乾燥した。約４０mgのペ
プチド類を含む混合物が２ｇの不溶性コラーゲンより得
られた。
【００２１】Ｉ型コラーゲンの架橋カルボキシル末端テ
ロペプチドの精製を、高速液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）で２つの異なる逆相工程を用いて実施した。凍
結乾燥したペプチド混合物を、まず０．１％トリフルオ
ロ酢酸に溶解し、Ｃ18逆相カラム（Ｖｙｄａｃ２１８Ｔ
Ｐ１０１０（商品名））にかけた。結合したペプチドを
イソプロパノールの濃度を上げつつ（１０〜７０％、０
〜４５分）溶出した。溶出液はピリジノリン架橋に特有
な蛍光（励起：２９５nm、蛍光：３９５nm）に関して監
視した。Ｉ型コラーゲンの架橋カルボキシル基末端テロ
ペプチドを含有する、蛍光ペプチドピーク部を集めて凍
結乾燥した。次いでペプチド（まだ少量の他の夾雑ペプ
チドを含んでいる）を、pH７．４の５０mM酢酸アンモニ
ウム中に溶解して、Ｃ18pH安定性逆相カラム（Ｖｙｄａ
ｃ２２８ＴＰ１０４（商品名））にかけた。結合したペ
プチドを、アセニトリルの濃度を上げつつ（０〜９０
％、０〜４５分）溶出した。溶出液を、上記の蛍光に関
して監視し、今回は、均一なＩ型コラーゲンの架橋カル
ボキシ末端テロペプチドを収集し凍結乾燥した。Ｎ末端
アミノ酸配列決定により、ペプチドの由来及び識別を行
った。下記の配列が、２つのＩ型コラーゲンのα１−鎖
のカルボキシル基末端テロペプチド及びＩ型コラーゲン
のα１−鎖又はα２−鎖のらせん部からの領域から誘導
された架橋ヒトペプチドとして得られた。
ロペプチドの精製を、高速液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）で２つの異なる逆相工程を用いて実施した。凍
結乾燥したペプチド混合物を、まず０．１％トリフルオ
ロ酢酸に溶解し、Ｃ18逆相カラム（Ｖｙｄａｃ２１８Ｔ
Ｐ１０１０（商品名））にかけた。結合したペプチドを
イソプロパノールの濃度を上げつつ（１０〜７０％、０
〜４５分）溶出した。溶出液はピリジノリン架橋に特有
な蛍光（励起：２９５nm、蛍光：３９５nm）に関して監
視した。Ｉ型コラーゲンの架橋カルボキシル基末端テロ
ペプチドを含有する、蛍光ペプチドピーク部を集めて凍
結乾燥した。次いでペプチド（まだ少量の他の夾雑ペプ
チドを含んでいる）を、pH７．４の５０mM酢酸アンモニ
ウム中に溶解して、Ｃ18pH安定性逆相カラム（Ｖｙｄａ
ｃ２２８ＴＰ１０４（商品名））にかけた。結合したペ
プチドを、アセニトリルの濃度を上げつつ（０〜９０
％、０〜４５分）溶出した。溶出液を、上記の蛍光に関
して監視し、今回は、均一なＩ型コラーゲンの架橋カル
ボキシ末端テロペプチドを収集し凍結乾燥した。Ｎ末端
アミノ酸配列決定により、ペプチドの由来及び識別を行
った。下記の配列が、２つのＩ型コラーゲンのα１−鎖
のカルボキシル基末端テロペプチド及びＩ型コラーゲン
のα１−鎖又はα２−鎖のらせん部からの領域から誘導
された架橋ヒトペプチドとして得られた。
【００２２】
【化１】
【００２３】（式中、Ｈｙｐはヒドロキシプロリン、Ｈ
ｙｌｙｓはヒドロキシリジン、そして網かけ部は架橋部
を示している）
ｙｌｙｓはヒドロキシリジン、そして網かけ部は架橋部
を示している）
【００２４】ペプチドを分離するのに用いる酵素に依存
したり、さまざまな調製によって異なったりするが、出
発配列は結局のところは数個のアミノ酸が長いか短いか
である。しかし測定される免疫学的測定対象物がα１−
鎖テロペプチド部分の架橋部（網かけで示した）付近で
あるために、このことは本発明の分析には影響しない。
したり、さまざまな調製によって異なったりするが、出
発配列は結局のところは数個のアミノ酸が長いか短いか
である。しかし測定される免疫学的測定対象物がα１−
鎖テロペプチド部分の架橋部（網かけで示した）付近で
あるために、このことは本発明の分析には影響しない。
【００２５】カルボキシル末端テロペプチドに特異的な
抗血清は、１mlの０．２M ＮＨ4 ＨＣＯ3 に可溶化し、
１mlのFreund完全アジュバントと混合した精製架橋テロ
ペプチド０．１mgでウサギを免疫化することにより得ら
れる。懸濁液の２mlをウサギの背部５０ケ所に皮内注入
した。同様の追加注入を、３週間後にも行ない、放射性
標識した抗原の結合に関して抗血清を試験した後、必要
であれば繰り返した。マウスを免疫化する時は、同じ懸
濁液０．１mlをマウスの背部に注入した。同様の追加注
入を３週間後に行い、また、ハイブリドーマを製造する
ために脾臓を摘出する数日前にも、腹腔内注入を行なっ
た。
抗血清は、１mlの０．２M ＮＨ4 ＨＣＯ3 に可溶化し、
１mlのFreund完全アジュバントと混合した精製架橋テロ
ペプチド０．１mgでウサギを免疫化することにより得ら
れる。懸濁液の２mlをウサギの背部５０ケ所に皮内注入
した。同様の追加注入を、３週間後にも行ない、放射性
標識した抗原の結合に関して抗血清を試験した後、必要
であれば繰り返した。マウスを免疫化する時は、同じ懸
濁液０．１mlをマウスの背部に注入した。同様の追加注
入を３週間後に行い、また、ハイブリドーマを製造する
ために脾臓を摘出する数日前にも、腹腔内注入を行なっ
た。
【００２６】実施例２ 平衡型ラジオイムノアッセイの実施 実施例１に記載したようにして製造した、Ｉ型コラーゲ
ンの架橋カルボキシル末端テロペプチド５マイクログラ
ムを、クロラミンＴ（５マイクログラム）を用いて、１
ミリキュリーの125 Ｉで標識した。溶液を０．１Ｍ酢酸
で酸性化した後、分取用Sep-Pak Ｃ18（商品名）カート
リッジによって遊離のヨードを除去した。標識されたペ
プチドは、０．１M 酢酸中５０％のイソプロパノールに
よりカートリッジから溶出させた。
ンの架橋カルボキシル末端テロペプチド５マイクログラ
ムを、クロラミンＴ（５マイクログラム）を用いて、１
ミリキュリーの125 Ｉで標識した。溶液を０．１Ｍ酢酸
で酸性化した後、分取用Sep-Pak Ｃ18（商品名）カート
リッジによって遊離のヨードを除去した。標識されたペ
プチドは、０．１M 酢酸中５０％のイソプロパノールに
よりカートリッジから溶出させた。
【００２７】標識架橋テロペプチドの放射性カウント数
５０，０００／分で抗体結合カーブを描いた。未知の血
清又は体液サンプル中のテロペプチド濃度を、下のよう
な阻害ラジオイムノアッセイ法により測定した。予備テ
ストした量の抗血清を、未知のサンプル及び５０，００
０カウント／分のトレーサーと共に３７℃で２時間イン
キュベートした。次いで、１．２M （ＮＨ4 )2ＳＯ4 中
のウサギγ−グロブリンに対する２次抗体を加え、＋４
℃、３０分間のインキュベーションの後に免疫複合体に
結合した抗原を遠心分離により溶液から分離した。未知
のサンプルの阻害活性を、未標識のＩ型コラーゲン架橋
カルボキシル基末端テロペプチドの標準濃度のものの活
性と比較した。
５０，０００／分で抗体結合カーブを描いた。未知の血
清又は体液サンプル中のテロペプチド濃度を、下のよう
な阻害ラジオイムノアッセイ法により測定した。予備テ
ストした量の抗血清を、未知のサンプル及び５０，００
０カウント／分のトレーサーと共に３７℃で２時間イン
キュベートした。次いで、１．２M （ＮＨ4 )2ＳＯ4 中
のウサギγ−グロブリンに対する２次抗体を加え、＋４
℃、３０分間のインキュベーションの後に免疫複合体に
結合した抗原を遠心分離により溶液から分離した。未知
のサンプルの阻害活性を、未標識のＩ型コラーゲン架橋
カルボキシル基末端テロペプチドの標準濃度のものの活
性と比較した。
Claims (16)
- 【請求項１】 Ｉ型コラーゲン分解産物を含有している
ことがわかっているか又は予想される試料中で、該分解
産物の存在又は量を試験する際の、Ｉ型コラーゲンカル
ボキシル末端テロペプチドに特異的な抗体の使用。 - 【請求項２】 Ｉ型コラーゲン分解産物の分析方法であ
って、（ｉ）そのような産物を含有することがわかって
いるか又は予想される試料；（ii）Ｉ型コラーゲンカル
ボキシル末端テロペプチドに特異的な抗体；及び(iii)
標識を、標識が該試料中のＩ型コラーゲン分解産物の量
に依存する量で結合するような条件下でいずれかの順序
で接触させ、結合した及び／又は結合していない標識を
分析して該試料中のＩ型コラーゲン分解産物の存在又は
量を測定する方法。 - 【請求項３】 抗体がＩ型コラーゲンカルボキシル末端
架橋テロペプチドに対して産生された抗体である、請求
項２記載の方法。 - 【請求項４】 抗体を産生するために用いられるテロペ
プチドが、ヒト又は脊椎動物の骨から得られたものであ
る、請求項３記載の方法。 - 【請求項５】 抗体がモノクローナル抗体である、請求
項２ないし４のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項６】 標識されたＩ型コラーゲンカルボキシル
末端テロペプチド及び試料の両方を該抗体と接触させ、
そのようにして形成された抗原−抗体複合体を複合体形
成していない出発材料から分離し、複合体形成した標識
又は複合体形成していない標識を分析する、請求項２な
いし５のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項７】 抗原−抗体複合体を、１次抗体に対する
抗体である２次抗体と接触させ、そのようにして形成さ
れた抗原−抗体−抗体複合体を、複合体形成していない
出発材料から分離する、請求項６記載の方法。 - 【請求項８】 標識が放射性標識、酵素標識又は蛍光標
識である、請求項２ないし７のいずれか１項記載の方
法。 - 【請求項９】 １次抗体又は、もし存在するならば２次
抗体を固体の担体に結合させておき、そして、固体担体
との結合体を分離することにより、形成された抗原−抗
体複合体又は抗原−抗体−抗体複合体を接触の起こった
媒体から分離する、請求項２ないし８のいずれか１項記
載の方法。 - 【請求項１０】 実質的に実施例２に記載した、Ｉ型コ
ラーゲン分解産物の分析方法。 - 【請求項１１】 Ｉ型コラーゲンカルボキシル末端テロ
ペプチドに特異的な抗体及び標識を含む、請求項２ない
し１０のいずれか１項記載の分析方法を実施する際の使
用に好適なキット。 - 【請求項１２】 Ｉ型コラーゲンカルボキシル末端テロ
ペプチドに特異的な１次抗体、１次抗体に対する抗体で
ある２次抗体、標識及び、１次又は２次抗体が結合して
いる固体担体を含む、請求項９記載の分析法を実施する
際の使用に好適なキット。 - 【請求項１３】 Ｉ型コラーゲンカルボキシル末端架橋
テロペプチドに対して産生された抗体。 - 【請求項１４】 該テロペプチドが、ヒト又はヒト以外
の脊椎動物の骨から得られるものである、請求項１３記
載の抗体。 - 【請求項１５】 Ｉ型コラーゲンカルボキシル末端テロ
ペプチドに特異的なモノクローナル抗体である、請求項
１３又は１４に記載の抗体。 - 【請求項１６】 脱灰した不溶性骨組織を変性させ、次
いで少なくとも２つのステップを異なるpHで行う高速液
体クロマトグラフィーを用いる、数ステップの逆相分離
を用いてクロマトグラフィー処理することよりなる、Ｉ
型コラーゲンカルボキシル末端架橋テロペプチドの単離
方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9105893.3 | 1991-03-20 | ||
| GB919105893A GB9105893D0 (en) | 1991-03-20 | 1991-03-20 | Bone resorption assay based on a peptide liberated during collagen degradation |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0720126A true JPH0720126A (ja) | 1995-01-24 |
| JP2886728B2 JP2886728B2 (ja) | 1999-04-26 |
Family
ID=10691878
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4092420A Expired - Lifetime JP2886728B2 (ja) | 1991-03-20 | 1992-03-19 | コラーゲン分解時に放出されるペプチドを基準にした骨吸収分析 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5538853A (ja) |
| EP (1) | EP0505210B2 (ja) |
| JP (1) | JP2886728B2 (ja) |
| AT (1) | ATE169739T1 (ja) |
| DE (1) | DE69226548T3 (ja) |
| DK (1) | DK0505210T4 (ja) |
| ES (1) | ES2120431T5 (ja) |
| FI (1) | FI103152B1 (ja) |
| GB (1) | GB9105893D0 (ja) |
Families Citing this family (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4973666A (en) † | 1987-11-06 | 1990-11-27 | Washington Research Foundation | Peptide fragments containing HP and LP cross-links |
| US6027903A (en) * | 1987-11-06 | 2000-02-22 | Washington Research Foundation | Kit for detecting analyte indicative of type I collagen resorption in vivo |
| US5300434A (en) * | 1987-11-06 | 1994-04-05 | Washington Research Foundation | Hybridoma cell line producing an antibody to type-I collagen amino-terminal telopeptide |
| US5320970A (en) * | 1987-11-06 | 1994-06-14 | Washington Research Foundation | Detection of collagen degradation in vivo |
| US5962639A (en) * | 1987-11-06 | 1999-10-05 | Washington Research Foundation | Synthetic peptides corresponding to telopeptide sequences of cross-linked type I collagen metabolites |
| US6153732A (en) * | 1987-11-06 | 2000-11-28 | Washington Research Foundation | Kit for detecting analyte indicative of type II collagen resorption in vivo |
| DE4225038C2 (de) * | 1992-07-29 | 1995-11-30 | Boehringer Mannheim Gmbh | Herstellung und Verwendung von Antikörpern gegen Kollagen |
| US6132976A (en) * | 1992-12-04 | 2000-10-17 | Shriners Hospitals For Children | Immunoassays for the measurement of collagen denaturation and cleavage in cartilage |
| CA2148132A1 (en) * | 1992-12-04 | 1994-06-23 | Anthony Robin Poole | Immunoassay for the measurement of collagen cleavage in cartilage |
| CA2152667C (en) * | 1992-12-28 | 2003-02-11 | David J. Baylink | Bone resorption assay |
| CA2167496A1 (en) * | 1993-07-28 | 1995-02-09 | Werner Naser | Immunoassay for the detection of collagen or collagen fragments |
| DK104093D0 (da) * | 1993-09-17 | 1993-09-17 | Osteometer A S | Fremgangsmaade til bestemmelse af collagen-fragmenter i legemsvaesker, test-kit og midler til udoevelse af fremgangsmaaden og anvendelse af fremgangsmaaden til diagnosticering af lidelser associeret til collagen-metabolismen |
| US6110689A (en) * | 1994-01-21 | 2000-08-29 | Osteometer A/S | Method of assaying collagen fragments in body fluids, a test kit and means for carrying out the method and use of the method to diagnose the presence of disorders associated with the metabolism of collagen |
| GB9506050D0 (en) | 1995-03-24 | 1995-05-10 | Osteometer A S | Assaying collagen fragments in body fluids |
| EP0787301B1 (en) | 1994-10-17 | 2001-02-14 | Osteometer Biotech AS | Estimation of the fragmentation pattern of collagen in body fluids and the diagnosis of disorders associated with the metabolism of collagen |
| GB9507985D0 (en) * | 1995-04-19 | 1995-06-07 | Orion Yhtymae Oy | Antibody to aminoterminal propeptide to type 1 procollagen and assay method using it |
| US6107047A (en) * | 1996-03-21 | 2000-08-22 | Osteometer Biotech A/S | Assaying protein fragments in body fluids |
| GB9617616D0 (en) | 1996-08-22 | 1996-10-02 | Osteometer Biotech As | Assaying protein fragments in body fluids |
| EP0829724A1 (en) * | 1996-09-17 | 1998-03-18 | Nederlandse Organisatie Voor Toegepast-Natuurwetenschappelijk Onderzoek Tno | Assay for detecting collagen degradation |
| WO1998026286A2 (en) | 1996-12-09 | 1998-06-18 | Osteometer Biotech A/S | Sandwich assays for collagen type i fragments |
| EP1010007B1 (en) * | 1997-07-31 | 2004-01-21 | Metra Biosystems, Inc. | Collagen-peptide assay method |
| US6117646A (en) * | 1997-09-22 | 2000-09-12 | Osteometer Biotech A/S | Assaying protein fragments in body fluids |
| DE19980834T1 (de) | 1998-06-19 | 2001-06-13 | Washington Res Found | Knorpel-Resorptionstests |
| US6348320B1 (en) | 1998-06-19 | 2002-02-19 | Washington Research Foundation | Cartilage resorption assays measuring type II collagen fragments |
| US6916903B2 (en) | 1998-06-19 | 2005-07-12 | Washington Research Foundation | Collagen type III synthetic peptides for collagen resorption assays |
| US6602980B1 (en) | 1998-06-19 | 2003-08-05 | Washington Research Foundation | Collagen type III synthetic peptides for collagen resorption assays |
| GB9907234D0 (en) * | 1999-03-29 | 1999-05-26 | Isis Innovation | Drug assay |
| EP2266628A3 (en) | 2003-05-13 | 2012-01-18 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Method of determining the susceptibility to bone meatastases by EPhA2 expression |
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| TWI395593B (zh) | 2008-03-06 | 2013-05-11 | Halozyme Inc | 可活化的基質降解酵素之活體內暫時性控制 |
| WO2009153783A1 (en) * | 2008-06-16 | 2009-12-23 | Mor Research Applications Ltd. | Monitoring skin metabolism products for evaluating burn injury |
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