JPH0415240B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、体液中の基底膜物質（Basalmemb
−ranmaterial）を免疫学的に測定する方法のた
めに好適なペプチドラミニンP1及びその製法に
関する。 多くの疾病（糖尿病、腎臓病、硬皮症、肝臓繊
維症、血管炎）で、特に血管壁中に基底膜が増加
することは公知である。この血管変化は、従つて
屡々致死要因となつている。これらの疾病におけ
る免疫学的螢光検査によれば、これら基底膜変動
は、特にラミニンと称せられる新規の基底膜成分
及び基底膜コラーゲンの高い生成に基づくことが
判明した。組織学的検査ではこの変動の特異検査
を行なつているが、バイオプシー物質でのみ実施
でき、定量的には評価できない。 従つて、本発明は、この問題を血中及び他の体
液（尿、腹水）中の基底膜抗原を測定するための
定量的かつ特異的方法を得るための特定の基底膜
抗原を得ることである。 この方法は、体液中の基底膜物質の免疫学的測
定法よりなり、これは、測定すべき試料の存在下
に抗原としての標識ラミニン、標識ラミニンP1
又は標識基底膜フラグメントCol1（）をその特
異抗体と共にインキユベートし、生じた抗原−抗
体−結合体を分離し、結合体中又は分離した液体
中に含有される標識抗原の量を測定することより
なる。 前記方法は、３種の基底膜の新規構造蛋白質即
ちラミニン、ラミニンフラグメントラミニンP1
及びコラーゲンペプチドCol1（）の特性付けに
基づく。これらの３種の新規物質殊に２種のフラ
グメントラミニンP1及びCol1（）は、蛋白質分
解及び変性作用に対して高い安定性を示し、従つ
て体液殊に血液中に良好に立証しうる量でも現わ
れるから、その定量によつて基底膜の増加が測定
できる。 ラミニンは、高分子量の糖蛋白質である。これ
は、炭水化物12〜15重量％を含有し、分子量800
〜1000kを有する糖蛋白質であり、２種の分子量
約220k及び440kのジスルフイド結合したポリペ
プチド鎖より成り、プロテアーゼ阻害剤の存在で
基底膜含有組織を濃塩酸溶液で抽出し、引続きこ
の組織を0.4〜0.6M NaClで抽出し、後者抽出液
を3.3〜3.5M NaClで沈澱させ、再溶解させた沈
澱をクロマトグラフイにかけることにより得られ
る。 プロテアーゼ例えばペプシンを用いるか又は化
学的方法で例えば臭化シアンを用いるラミニンの
分解により、これからラミニンP1と称される多
大のフラグメントを得ることができる。このフラ
グメントは、直接、組織から得ることもできる。 ラミニンP1は、分子量200〜300kを有し、シス
テイン12〜14モル％を含有し、レクチンに対する
高い親和性及びコラゲナーゼに対する安定性を有
し、 (1)プロテアーゼ又は臭化シアンを用いてラミニ
ンを分解するか又は(2)プロテアーゼ阻害剤の存在
下で基底膜含有組織を濃塩酸溶液で、かつ引続き
0.4〜0.6M NaClで抽出し、残留分をプロテアー
ゼと共にインキユベートし、得られる溶液を透析
し、得られた溶液を2M及び4M NaClの間で分別
沈澱させ、弱塩基性カチオン交換体を通すクロマ
トグラフイにかけ、レクチンを通すクロマトグラ
フイにかけることによつて得られる。 ラミニンP1に対して高い親和性を有するレク
チンの典型的な例はコンカナバリン（Conca−
navalin）Ａ及び麦芽レクチンである。 前記方法で使用できる第３の新規抗原は、基底
膜コラーゲンのジスルフイドの多い変形体よりな
るフラグメントであり、慣用のプロテアーゼ例え
ばペプシン及びトリプシンに対しても、細菌性コ
ラゲナーゼ（Cl−ヒストリテイクム）に対しても
抵抗する。これは、Col １（）と称され、分子
量200〜300kを有し、システイン２〜５モル％を
含有し、軸比１：０、融点範囲60〜70℃の安定な
トリペルらせんを有し、コラゲナーゼに対して抵
抗し、プロテアーゼ阻害剤の存在で基底膜含有組
織を濃塩酸溶液で、かつ引続き0.4〜0.6M NaCl
で抽出し、抽出残分をプロテアーゼと共にインキ
ユベートし、得られた溶液を透析し、2M NaCl
で沈澱させ、再溶解した沈澱をコラゲナーゼと共
にインキユベートし、透析しかつクロマトグラフ
イで精製することにより得られる。 比較すると、コラーゲンにおける軸比は１：
200である。 次表に新規の３種の抗原のアミノ酸組成を挙げ
る。

【表】

【表】 これらの新規基底膜成分は、前記のように、体
液中殊に血液中の基底膜物質を公知の免疫学的検
査法を用いる前記測定を可能にし、これは、共同
の抗体に関する周知量の標識抗原と被検試料中の
未知量の抗原との競争に基づく。この場合、公知
ラジオイムノアツセイ−（RIA）−変法も、酸素イ
ムノアツセイ−変法及び他の方式の標識付け例え
ば螢光標識付け、染料標識付け等を用いる類似測
定法も使用できる。この種の方法は、当業者にと
つては公知である。すべてのこれらの方法は、で
きるだけ高純度の抗原を用いて適当な実験動物中
に抗血清を作り、これをそのもの自体として又は
これから単離した特異抗体を得、場合により抗体
もしくは抗血清を固定担体に結合した後、慣用の
抗原−抗体−結合体形成反応を反応成分相互のイ
ンキユベートにより進行させることに基づく。体
液の被検試料中に存在する標識されていない抗原
の量に応じて、この結合体中では標識抗原の１部
分のみが結合しており、結合体の単離によるか又
は上澄み中で測定されうる。結合体中で結合した
標識抗原の量は、結合しなかつた抗原の量に関係
するから、こうして、体液中の抗原作用をする基
底膜物質の含分を測定することができる。 抗血清の製造は、常法で実験動物特に家兎に腹
腔内注射することにより行なうことができる。こ
の場合完全なフロインドのアジユバント
（Freundschen Adjuvans）の存在で操作するの
が有利である。この種の場合に慣用の抗原量は更
に加工できる。家兎使用の際の特に好適な投与量
としては、0.5〜１mg／動物が効を奏する。次い
で生じた抗血清は当業者に公知の方法で回収さ
れ、そのもの自体として使用される。血清中に存
在する特異抗体を、予め、例えば親和クロマトグ
ラフイの方法でなお精製することもできる。 抗原の標識付けは、蛋白質の標識付けに公知の
方法で実施できる。放射線核での放射性標識付け
の場合は、放射線核としてヨード125を使用する。
この放射線核を用いる標識付けは、公知のクロラ
ミンＴ−法で行なうことができる（Int.Arch.
Allergy29巻185頁参照）。 前記方法の有利な実施形は、特異抗血清で形成
された抗原−抗体−結合体を第２の抗体の使用に
より、結合しなかつた抗原から分離することより
なる。この場合、第２の抗体として、抗血清を得
るために使用した動物の免疫グロブリンＧに対す
る抗体を使用するのが有利である。これにより不
溶の形に変えられた抗原−抗体−結合体を溶液か
ら分離することは、このために慣用の方法例えば
遠心分離、濾過及び類似方法で行なうことができ
る。抗血清もしくは抗体を固体担体例えば試験管
の内壁に結合させるのも有利である。 抗原−抗体−結合体の分離の後に、前記のよう
に、標識、例えば抗原−抗体−結合体に結合して
いる又は選択的に上澄み中に残留している放射能
又は酵素活性を測定する。公知の抗原含量の試料
を用いて製造した較正曲線を用いて、被検体中に
含有される抗原量を測定することができる。この
場合、原則的に、標識抗原の量（これは、生じた
抗原−抗体−結合体中に結合している）が少ない
と、被検体中に存在する非標識抗原は多くなる。 前記免疫学的測定法によれば、1ng／mlの範囲
までの濃度の測定が可能である。従つて、この方
法を動物及びヒトの体液殊に血液もしくは血清中
の基底膜物質の測定法に使用することができる。
正常の固体の場合に、血清中のこの抗原の濃度
は、20〜50ng／mlの範囲内にあり、基底膜変化
の際には例えば実験的糖尿病の際には著るしく高
まる。前記方法を用いると、この種の変化は比較
的迅速にかつ確実に測定できる。 前記方法で使用される新規抗原は、原則的に基
底膜を含有するすべての組織から得られる。得る
べき物質の含分が明らかに多いので、ヒトの胎盤
が有利である。同様に、多量の基底膜を形成する
特定の腫瘍組織例えばマウスのEHS−肉腫も有
利である。 本発明により新規抗原を得る場合に、この組織
からの基底膜の純粋製造は省略される。組織を差
当り、プロテアーゼ阻害剤の存在で高い塩濃度で
抽出すると、この際付随蛋白質が除かれる。この
場合3.4〜4M NaClが有利である。この抽出のた
めに、組織を差当り常法で粉砕もしくはホモゲナ
イズする。場合により高い塩濃度で数回抽出の後
に、低い塩濃度での、有利に0.4〜0.6M NaClで
の第２の抽出工程を数回実施することができる。
この場合実際に基底膜コラーゲンは溶解しない
が、ラミニンの１部分は溶解する。こうして得た
溶液は、ラミニン及びラミニンフラグメントラミ
ニンP1を得るために使用でき、二重塩抽出時に
残留する不溶の組織残分は、フラグメントCol1
（）を得るための出発物質として使用されるが、
ラミニンP1を得るためにも好適である。 プロテアーゼ阻害剤として例えばフエニルメチ
ルスルホニルフルオリド、ｐ−クロルメルクリ安
息香酸又はエチレンジアミンテトラ酢酸が使用さ
れる。しかしながら他のプロテアーゼ阻害剤も好
適である。阻害剤は、個々に又は混合して使用で
きる。好適な濃度は、通例約１〜50mg／であ
る。 ラミニン含有抽出物から天然のラミニンが、付
随蛋白質の塩沈澱により分離できる。沈澱は3.3
〜3.5M NaClで行なうのが有利である。 こうして得た沈澱を再び緩衝液中に入れ、例え
ばアガロースA1.5ｍのクロマトグラフイにかけ
る。こうして、前記のように、本発明方法に使用
できる前記ラミニンが得られる。 こうして得たラミニンから、フラグメントラミ
ニンP1は、蛋白質分解酵素を用いる分解による
か又は化学的方法で例えば臭化シアンを用いて得
ることができる。約PH1.5〜2.5の強酸性溶液中で
のペプシンを用いる分解を行なうのが有利であ
る。こうして得た溶液から、分別塩沈澱によりフ
ラグメントラミニンP1を得ることができる。沈
澱は有利に、差当たり2M NaClを用い、かつ引
続き4M NaClを用いて行なうのが有利であり、
この際最後の工程でラミニンP1が沈澱する。 フラグメントラミニンP1は、直接、単離する
必要のない基底膜物質から得ることもできる。こ
の有利な取得法では、２工程塩抽出の不溶組織成
分から出発される。残分を懸濁させ、蛋白分解酵
素と共に、この酵素に好適な温度及びPH値条件下
に、インキユベートする。有利にペプシンを使用
し、約1.5〜2.5のPH−値で常温又は僅かに低い温
度で操作するのが有利である。約10〜20℃が好適
である。その後不溶分を分離し、低分子量物質を
透析により除去し、得られた溶液から塩分別によ
り前記のように、ラミニンP1が得られる。沈澱
は有利に差当たり2M NaClで、引続き4M NaCl
を用いて行なう。 沈澱したフラクシヨン２〜4M NaClから、ラ
ミニンP1は、クロマトグラフイにより更に精製
できる。有利に、差当り弱塩基性のカチオン交換
体例えばDEAE−セルロース又はDEAE−セフア
デツクスでのクロマトグラフイを実施する。精製
は、例えば担体結合又は網状化により不溶性形で
存在するレクチンへの結合により、かつ引続き適
当な炭水化物での溶離により行なうことができ
る。例えば網状化されたデキストラン例えばアガ
ロースA1.5ｍでのゲル濾過も精製のために使用
できる。 フラグメントCol1（）を得るために、同様
に、２工程で塩溶液で抽出した組織の溶解溶液か
ら出発する。プロテアーゼ処理の後に得られる
2M NaClまでの沈澱物を新たに溶解の後に、こ
の酵素に好適な温度及びPH値条件でコラゲナーゼ
と共にインキユベートすると、Col1（）を除き
すべての余分のコラーゲンが分解され、透析によ
り除去することができる。精製は、例えば網状化
されたデキストラン及び／又はカルボキシメチル
セルロースでのモレキユラーシーブクロマトグラ
フイにより行なうことができる。 前記の蛋白質分解法にとつてペプシンが有利で
あるが、他のプロテアーゼ例えばトリプシンもこ
のために好適である。化学的分解法も使用でき
る。これは臭化シアンを用いて行なうのが有利で
ある。 次に実施例につき本発明を説明する。 例 １（参考例） 標識抗原の製造 ラミニンP1又はペプチドCol1（）25μｇをク
ロラミン−Ｔ−法によりヨード125 0.5ミリキユ
リーで標識し、結合しなかつたヨードを透析又は
ビオーゲルＰ−２でのゲル濾過により除く。引続
く工程を有利に非イオン性界面活性剤例えばツイ
ーン（Tween）20 0.04％の存在で実施する。抗
体との結合曲線を、標識ペプチド1ngを用いて測
定する。 免疫学的測定（RIA）の実施 血清又は他の体液中の未知試料中のラミニン
P1又はCol1（）の濃度を、次の阻害試験で測定
する。特異抗体又は抗血清の特定量を未知試料と
共に４℃で16時間予備インキユベートし、標識抗
原1ngの添加の後に更に４℃で８時間インキユベ
ートする。その後家兎免疫グロブリンＧに対する
抗体を過剰に加え、更に４℃で16時間後に免疫結
合体中に結合した抗原を遠心分離する。未知の試
料の阻害活性を非標識抗原の標準濃度の活性と比
較する。 例 ２ (A) ラミニンの製造 出発物質としてヒトの胎盤又は移植可能なマ
ウス腫瘍〔EHS−肉腫；オーキン（orkin）等
によるJ.Exp.Med.145巻（1977年）204〜220頁
参照〕を使用する。組織を、まずプロテアーゼ
阻害剤フエニルメチルスルホニルフルオリド
（３mg／）、ｐ−クロルメルクリ安息香酸（３
mg／）及びEDTA（0.01M）の存在で20倍過
剰の3.4M NaCl、0.05MトリスHCl（PH7.4）中
で２〜３回ホモゲナイズし、抽出可能な蛋白質
を遠心により除去する。次いで残分をプロテア
ーゼ阻害剤の存在下に４℃で0.5M NaCl、0.05
トリスHCl（PH7.4）で２回１夜にわたり抽出す
る。抽出物は天然ラミニンを含有し、これを
3.4M NaClを用いて沈澱させ、かつ再溶解し
た沈澱をアガロースA1.5ｍ（1M CaCl₂）での
クロマトグラフイにかける（0.05Mトリス・
HCl PH7.4）ことにより付随蛋白質を分離さ
せる。 (B) ペプチドラミニンP1の製造 (A)に記載の塩抽出物中に残留している不溶の
組織残分を0.5M酢酸中でホモゲナイズさせ
（50mg／乾燥重量ｇ）、HClの添加によりPHを２
に調節し、懸濁液をペプシン（50mg／乾燥重量
ｇ）の添加の後に15℃で24時間インキユベート
する。酵素で溶解させた物質を遠心により単離
し、４℃で0.5M NaCl、0.05Mトリス（PH7.4）
で透析する。この溶液から2M NaClを用いて
コラーゲン性蛋白質の混合物を沈澱させ、引続
き上澄みを4M NaClで沈澱させることにより、
フラグメントラミニンP1の濃度を高める。2M
NaClまでの沈澱はCol1（）を得るために使用
できる。 ラミニンP1を、0.05Mトリス・HCl（PH8.6）、
2M尿素中で均衝化し、線状勾配濃度のNaCl
（０〜0.4M）で溶離させ、更に精製する。最終
精製は、コンカナバリンＡ−カラムに結合さ
せ、0.1Mα−メチルマンノシドを用いて溶離さ
せることにより行なう。必要な場合には、アガ
ロースA1.5ｍでのゲル濾過によりなお、更に
精製することができる。組織残分の代りに(A)で
得られるラミニンも使用できる。 (C) Col1（）の製造（参考） ペプチドCol1（）の単離のために、(B)で得
たコラーゲン蛋白質の混合物（沈澱、0.5〜
2NaCl）を0.05Mトリス・HCl（PH7.4）、0.2M
NaCl、0.002M NaCl₂（10mg／ml）中に溶か
し、細菌コラゲナーゼ（0.1mg／ml）の添加の
後に20℃又は37℃で16時間インキユベートす
る。この場合、ペプチドCol1（）を除いて全
ての他のコラーゲンは分解されて低分子量ペプ
チドになるから、これらを透析により除去す
る。更にアガロースA5M（1M CaCl₂、0.05ト
リス・HCl、PH7.4）で、かつ引続き、ペプチ
ドを、0.01M酢酸ナトリウム（PH4.0）、4M尿
素中で均衝化したCM−セルロースのカラムに
結合させることにより精製する。線状勾配濃度
のNaCl（０〜0.2M NaCl）により純粋なCol1
（）をカラムから溶離させる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 分子量200〜300kを有し、システイン12〜14
   モル％を含有し、レクチンに対する高い親和性及
   びコラゲナーゼに対する安定性を有し、プロテア
   ーゼ又は臭化シアンを用いてラミニンを分解する
   か又はプロテアーゼ阻害剤の存在で、基底膜含有
   組織を濃塩溶液で、引続き0.4〜0.6M NaClで抽
   出し、残留分をプロテアーゼと共にインキユベー
   トし、得られた溶液を透析し、得られた溶液を
   2M及び4M NaClで分別沈澱させ、沈澱物を、弱
   塩基性カチオン交換体を通すクロマトグラフイに
   かけ、かつレクチンを通すクロマトグラフイにか
   けることにより得られたものであることを特徴と
   する、体液中の基底膜物質を免疫学的に測定する
   ために好適なペプチドラミニンP1。 ２ プロテアーゼ阻害剤の存在で、基底膜含有組
   織を濃塩溶液で、かつ引続き0.4〜0.6M NaClで
   抽出することにより得られた不溶性組織残分又は
   ラミニンを、プロテアーゼと共にインキユベート
   し、得られた溶液を透析し、この透析した溶液か
   ら2M及び4M NaClで沈澱するフラクシヨンを
   得、この沈澱物を弱塩基性カチオン交換体を通し
   かつレクチンを通すクロマトグラフイにかけるこ
   とを特徴とする、ペプチドラミニンP1の製法。 ３ 基底膜含有出発物質として、ヒト胎盤又はマ
   ウスのEHS−内腫を使用する、特許請求の範囲
   第２項に記載の方法。