JPH0256500A - 基底膜物質の免疫学的測定法のために好適なラミニン及びその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、体液中の基底膜物質（Ｂａｓａｌｍｅｍｂ−
ｒａｎｍａｔｅｒｉａｌ）を免疫学的に測定するために
好適な基底膜７ラグメント及びその製法に関する。

多くの疾病（糖尿病、腎臓病、硬皮症、肝臓繊維症、血
管炎）で、特に血管壁中に基底膜が増加することは公知
である。この血管変化は、従って屡々致死要因となって
いる。これらの疾病における免疫学的螢光検査によれば
、これら基底膜変動は、特にラミニンと称せられる新規
の基底膜成分及び基底膜コラーゲンの高い生成に基づく
ことが判明した。組織学的検査ではこの変動の特異検査
を行なっているが、／−イオブシー物質でのみ実施でき
、定量的には評価できない。

従って、本発明は、この問題を血中及び他の体液（尿、
腹水）中の基底膜抗原を測定するだめの定量的かつ特異
的方法を得るための特定の基底膜抗原を得ることである
。

この測定法は、体液中の基底膜物質の免疫学的測定法で
あり、これは、測定すべき試料の存在下に抗原としての
標識ラミニン、標識ラミニンフラグメントＰ１又は標識
基底膜フラグメントＣｏ１１（■）をその特異抗体と共
にインキュベートし、生じた抗原−抗体−結合体を分離
し、結合体中又は分離した液体中に含有される標識抗原
の量を測定することよりなる。

前記方法は、３種の基底膜の新規構造蛋白質即ちラミニ
ン、ラミニンフラグメントＰｉ及びコラーゲンペプチド
Ｃｏ１ｔ　　（ＩＶ）の特性付けに基づく。これらの３
種の新規物質殊に２種の７ラグメントラミニンＰ１及び
Ｃａ１ｌ（ＩＶ）は、蛋白質分解及び変性作用に対して
高い安定性を示し、従って体液殊に血液中に良好に立証
しうる量でも現われるから、その定量によって基底膜の
増加か測定できる。

ラミニンは、高分子量の糖蛋白質である。これは、炭水
化物１２〜１５重量％を含有し、分子量８００〜１００
０ｋを有する糖蛋白質であり、２種の分子量約２２０ｋ
及び４４０にのジスルフィド結合したポリペプチド鎖よ
り成り、プロテアーゼ阻害剤の存在で基底膜含有組織を
濃塩酸溶液で抽出し、引続きこの組織を０．４〜０　、
６　Ｍ　ＮａＣＱで抽出し、後者抽出液を３．３〜３　
、５　Ｍ　ＮａＣ＋２で沈殿させ、再溶解させた沈殿を
クロマトグラフィにかけることにより得られる。

プロテアーゼ例えばペプシンを用いるか又は化学的方法
で例えば臭化シアンを用いるラミニンの分解により、こ
れからラミニンＰ１と称される多大の７ラグメントを得
ることができる。

このフラグメントは、直接、組織から得ることもできる
。

ラミニンＰ１は、分子量２００〜３００ｋを有し、ンス
テイン１２〜１４モル％を含有し、レクチンに対する高
い親和性及びコラゲナーゼに対する安定性を有し、 ｌ）プロテアーゼ又は臭化シアンを用いてラミニンを分
解するか又は２）プロテアーゼ阻害剤の存在下で基底膜
含有組織を濃塩酸溶液で、かつ引続き０．４−０．６　
Ｍ　ＮａＣｌ２で抽出し、残留分をプロテアーゼと共に
インキュベートし、得られる溶液を透析し、得られた溶
液を２Ｍ及び４ＭＮａＣθの間で分別沈殿させ、弱塩基
性カチオン交換体を通すクロマトグラフィにかけ、レク
チンを通すクロマトグラフィにかけることによって得ら
れる。

ラミニンＰＬに対して高い親和性を有するレクチンの典
型的な例はコンカナバリン（Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ
）　Ａ及び麦芽レクチンである。

前記方法で使用できる第３の新規抗原は、基底膜コラー
ゲンのジスルフィドの多い変形体よりなるフラグメント
であり、慣用のプロテアーゼ例えばペプシン及びトリプ
シンに対しても、細菌性コラゲナーゼ（ＣＱ−ヒストリ
ティクム）に対しても抵抗する。これは、Ｃｏｌ　　ｌ
　（ＩＶ）と称され、分子量２００〜３００ｋを有し、
システィン２〜５モル％を含有し、軸比ｌ：０、融点範
囲６０〜７０°Ｃの安定なトリペルらせんを有し、コラ
ゲナーゼに対して抵抗し、プロテアーゼ阻害剤の存在で
基底膜含有組織を濃塩酸溶液で、かつ引続き０．４−０
．６　Ｍ　ＮａＣＱで抽出し、抽出残分を７０テアーゼ
と共にインキュベートし、得られた溶液を透析し、２Ｍ
ＮａＣＱで沈殿させ、再溶解した沈殿をコラゲナーゼと
共にインキュベートし、透析しかつクロマトグラフィで
精製することにより得られる。

比較すると、コラーゲンにおける軸比はｌ：２００であ
る。

次表に新規の３種の抗原のアミノ酸組成を挙げろ。

ｙｐ Ａｓｐ ｈｒ ｅｒ １ｕ Ｐｒ。

ｌｙ ｌａ ｙｓ ａ１ ｅｔ ｌｅ ｅｕ ｙｒ ｈｅ ｉｓ ｙｌ ｙｓ ｒｇ ラミニン ラミニンＰｌ これらの新規基底膜成分（以後これらを本発明の抗原と
称する）は、前記のように、体液中殊に血液中の基底膜
物質を公知の免疫学的検査法を用いる本発明による測定
を可能にし、これは、共同の抗体に関する周知量の標識
抗原と被検試料中の未知量の抗原との競争に基づく。こ
の場合、公知ラジオイムノアッセイ−（ＲＩＡ）−変法
も、酵素イムノアッセイ−変法及び他の方式の標識付は
例えば螢光標識付け、染料標識性は等を用いる類似測定
法も使用できる。この種の方法は、当業者にとっては公
知である。

すべてのこれらの方法は、できるだけ高純度の抗原を用
いて適当な実験動物中に抗血清を作りこれをそのもの自
体として又はこれから単離した特異抗体を得、場合によ
り抗体もしくは抗血清を固体担体に結合した後、慣用の
抗ぷ一抗体一緒合体形成反応を反応成分相互のインキュ
ベートにより進行させることに基づく。体液の被検試料
中に存在する標識されていない抗原の量に応じて、この
結合体中では標識抗原の１部分のみが結合しており、結
合体の単離によるか又は上澄み中で測定されうる。結合
体中で結合した標識抗原の量は、結合しなかった抗原の
量に関係するから、こうして、体液中の抗原作用をする
・基底膜物質の含分を測定することができる。

抗血清の製造は、常法で実験動物特に家兎に腹腔内注射
することにより行なうことができるこの場合完全な７０
インドのアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄｓｃｈｅｎ　Ａｄ
ｊｕｖａｎｓ）の存在で操作するのが有利である。この
種の場合に慣用の抗原量は更に加工できる。家兎使用の
際の特に好適な投与量としては、０．５〜１ｍｇ／動物
が効を奏する。次いで生じた抗血清は当業者に公知の方
法で回収され、そのもの自体として使用される。血清中
に存在する特異抗体を、予め、例えば親和クロマトグラ
フィの方法でなお精製することもできる。

抗原の標識付けは、蛋白質の標識付けに公知の方法で実
施できる。放射線核での放射性標識付けの場合は、放射
線核としてヨード１２５を使用する。この放射線核を用
いる標識付けは、公知のクロラミンＴ−法で行なうこと
ができる（　Ｉｎｔ、　Ａｒｃｈ、　Ａｌｌｅｒｇｙ　
２９巻１８５頁参照）。

前記方法の有利な実施形は、特異抗血清で形成された抗
原−抗体一緒合体を第２の抗体の使用により、結合しな
かった抗原から分離することよりなる。この場合、第２
の抗体として、抗血清を得るためＩこ使用した動物の免
疫グロブリンＧに対する抗体を使用するのが有利である
。

これにより不溶の形に変えられた抗原−抗体一緒合体を
溶液から分離することは、このために慣用の方法例えば
遠心分離、濾過及び類似方法で行なうことができる。抗
血清もしくは抗体を固体担体例えば試験管の内壁に結合
させるのも有利である。

抗原−抗体一緒合体の分離の後に、前記のように、標識
、例えば抗原−抗体一緒合体に結合している又は選択的
に上澄み中に残留している放射能又は酵素活性を測定す
る。公知の抗原含量の試料を用いて製造した較正曲線を
用いて、被検体中に含有される抗原量を一定することが
できる。この場合、原則的に、標識抗原の量（これは、
生じた抗原−抗体−結合体中に結合している）が少ない
と、被検体中に存在する非標識抗原は多くなる。

前記免疫学的測定法によれば、ｌｎｇ／ｍｆｆの範囲ま
での濃度の測定が可能である。従って、この方法を動物
及びヒトの体液殊に血液もしくは血清中の基底膜物質の
測定法に使用することができる。正常の個体の場合に、
血清中のこの抗原の濃度は、２０〜５０　ｎｇ／　ｍＱ
の範囲内にあり、基底膜変化の際には例えば実験的糖尿
病の際には著るしく高まる。前記方法を用いると、この
種の変化は比較的迅速にかつ確実に測定できる。

前記方法で使用される新規抗原は、原則的に基底膜を含
有するすべての組織から得られる。

得るべき物質の含分が明らかに多いので、ヒトの胎盤が
有利である。同様に、多量の基底膜を形成する特定の腫
瘍組織例えばマウスのＥＨＳ　−肉腫も有利である。

本発明により新規抗原を得る場合に、この組織からの基
底膜の純粋製造は省略される。組織を差当り、プロテア
ーゼ阻害剤の存在で高い塩濃度で抽出すると、この際付
随蛋白質が除かれる。この場合３．４〜４　Ｍ　ＮａＣ
（ｌが有利である。

この抽出のために、組織を差当り常法で粉砕もしくはホ
モゲナイズする。場合により高い塩濃度で数回抽出の後
に、低い塩濃度での、有利に０．４〜０．６　Ｍ　Ｎａ
ＣＱでの第２の抽出工程を数回実施することができる。

この場合実際に基底膜コラーゲンは溶解しないが、ラミ
ニンの１ｍ分は溶解する。こうして得た溶液は、ラミニ
ン及びラミニンフラグメントラミニンＰＩを得るために
使用でき、二重塩抽出時に残留する不溶の組織残分は、
７ラグメント　Ｃｏ１１（■）ヲ得るための出発物質と
して使用されるが、ラミニンＰｌを得るためにも好適で
ある。

プロテアーゼ阻害剤として例えばフェニルメチルスルホ
ニルフルオリド、ｐ−クロルメルクリ安息香酸又はエチ
レンジアミンテトラ酢酸が使用される。しかしながら他
のプロテアーゼ阻害剤も好適である。阻害剤は、個々に
又は混合して使用できる。好適な濃度は、通例的１〜５
０ｒｎｇ／Ｑである。

ラミニン含有抽出物から天然のラミニンが、付随蛋白質
の塩沈殿により分離できる。沈殿は３．３〜３　、５　
Ｍ　ＮａＣｌ２で行なうのが有利であるこうして得た沈
殿を再び緩衝液中に入れ、例えばアガロースＡ１．５ｍ
のクロマトグラフィにかける。こうして、前記のように
、本発明方法に使用できる前記ラミニンが得られる。

こうして得たラミニンから、フラグメントＰｌは、蛋白
質分解酵素を用いる分解によるか又は化学的方法で例え
ば臭化シアンを用いて得ることができる。約ｐＨ１，５
〜２．５の強酸性溶液中でのペプシンを用いる分解を行
なうのが有利である。こうして得た溶液から、分別塩沈
殿によりフラグメントＰＩを得ることができる。沈殿は
有利に、差当たり２ＭＮａＣＱを用い、かつ引続き４Ｍ
ＮａＣρを用いて行なうのが有利であり、この際最後の
工程でラミニンｐｔが沈殿スる。

フラグメントＰ１は、直接、単離する必要のない基底膜
物質から得ることもできる。この有利な取得法では、２
工程塩抽出の不溶組織成分から出発される。残分を懸濁
させ、蛋白分解酵素と共に、この酵素に好適な温度及び
ｐＨ値条件下に、インキュベートする。有利にペプシン
を使用し、約１．５〜２．５のｐＨ−値で常温又は僅か
に低い温度で操作するのが有利である。約ｌＯ〜２０℃
が好適である。その後不溶分を分離し、低分子量物質を
透析により除去し、得られた溶液から塩分別により前記
のように、ラミニンＰＩが得られる。沈殿は有利に差当
たり２ＭＮａＣｌ２で、引続き４　Ｍ　ＮａＣＱを用い
て行なう。

沈殿した７ラクシａン２〜４　Ｍ　ＮａＣ４から、ラミ
ニンＰＩは、クロマトグラフィにより更に精製できる。

有利に、差当り弱塩基性のカチオン交換体例えばＤＥＡ
Ｅ−セルロース又はＤＥＡＥ　−セファデックスでのク
ロマトグラフィを実施する。精製は、例えば担体結合又
は網状化により不溶性形で存在するレクチンへの結合に
より、かつ引続き適当な炭水化物での溶離により行なう
ことができる。例えば網状化されたデキストラン例えば
アガロースＡ１．５ｍでのゲル濾過も精製のために使用
できる。

フラグメント　Ｃｏ１１（ＩＶ）を得るために、同様に
、２工程で塩溶液で抽出した組織の溶解溶液から出発す
る。プロテアーゼ処理の後に得られる２ＭＮａＣＱまで
の沈殿物を新たに溶解の後に、この酵素に好適な温度及
びｐＨ値条件でコラゲ九−ゼと共にインキュベートする
と、Ｃ０１１（ＩＶ）を除きすべての余分のコラーゲン
が分解され、透析により除去することができる。精製は
、例えば網状化されたデキストラン及び／又はカルボキ
シメチルセルロースでのモレキュラーシーブタロマドグ
ラフィにより行なうことができる。

前記の蛋白質分解法にとってペプシンが有利であるが、
他のプロテアーゼ例えばトリプシンもこのために好適で
ある。化学的分解法も使用できる。これは臭化シアンを
用いて行なうのが有利である。

次に実施例につき本発明を説明する。

例１（参考例） 標識抗原の製造 ラミニンＰ１又はペプチドＣｏ１１　（ＩＶ）　２５μ
９をクロラミン−Ｔ−法によりヨード１２５０．５ミリ
キユリーで標識し、結合しなかったヨードを透析又はビ
オ−ゲルＰ−２でのゲル濾過により除く。引続く工程を
有利に非イオン性界面活性剤例えばツイーン（Ｔｗｅｅ
ｎ）　２０　０．０４％の存在で実施する。抗体との結
合曲線を、標識ペプチドｌｎｇを用いて測定する。

免疫学的測定（ＲＩ　Ａ）の実施 血清又は他の体液中の未知試料中のラミニンＰｉ又はｃ
ｏ＋１（ＩＶ）の濃度を、次の阻害試験で測定する。特
異抗体又は抗血清の特定量を未知試料と共に４°Ｃで１
６時間予備インキュベー１−　Ｌ、標識抗！１ｎ９の添
加の後に更に４°Ｃで８時間インキュベート・する。そ
の後家兎免疫グロブリンＧに対する抗体を過剰に加え、
更に４°Ｃで１６時間後に免疫結合体中に結合した抗原
を遠心分離する。未知の試料の阻害活性を非標識。

抗原の標準濃度の活性と比較する。

例２ ラミニンの製造 出発物質としてヒトの胎盤又は移植可能なマウス腫瘍（
ＥＨ５−肉腫；オーキン（ｏｒｋｉｎ）等によるＪ　、
　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　　１４５巻（１９７７年）２０
４〜２２０頁参照〕を使用する。組織を、まスフロチア
ーゼ阻害剤フェニルメチルスルホニルフルオリド（３ｍ
ｇ／＋２　）　、ｐ−クロルメルクリ安息香酸（３ｍｇ
／（２）及びＥＤＴＡ　（０，０１Ｍ）の存在で２０倍
過剰の３．４　Ｍ　ＮａＣＱ、　０．０５ＭトリスＨＣ
Ｑ（ｐＨ７、４）中で２〜３回ホモゲナイズし、抽出可
能な蛋白質を遠心により途去する。次いで残分をプロテ
アーゼ阻害剤の存在下に４℃で０．５　Ｍ　ＮａＣＱ、
　　０．０５　トリス　ＨＣｆｆ（ｐＨ７，４）で２回
１夜にわたり抽出する。抽出物は天然ラミニンを含有し
、これ−を３．４ＭＮａＣＱを用いて沈殿させ、かつ再
溶解した沈殿を・アガロースＡ　Ｉ　−５ｍ　（ｌ　Ｍ
　ＣａＣＱ２）でのりｃ＋７トグラフイにかける（０．
０５Ｍトリス・ＨＣＱｐＨ７，４）ことにより付随蛋白
質を分離させる例３（参考例） ペプチドラミニンＰＩの製造 例２に記載の塩抽出物中に残留している不溶の組織残分
を０．５Ｍ酢酸中でホモゲナイズさせ（５０ｍｙ／乾燥
重量９）　、ＨＣＯの添加によりｐＨを２に調節し、懸
濁液をペプシン（５０ｍｇ／乾燥重量ｇ）の添加の後に
１５°Ｃで２４時間インキュベートする。酵素で溶解さ
せた物質を遠心により単離し、４°Ｃで０．５　Ｍ　Ｎ
ａＣ（２，０，０５Ｍトリス（ｐＨ７，４）で透析する
。この溶液から２ＭＮａＣＱを用いてコラーゲン性蛋白
質の混合物を沈殿させ、引続き上澄みを４　Ｍ　ＮａＣ
（２で沈殿させることにより、７ラグメントラミニンＰ
ｌの濃度を高める。２ＭＮａＣ（２までの沈殿はＣｏ１
１　　（ＩＶ）を得るために使用できる。

ラミニンＰｉを、０．０５Ｍトリス・ＨＣＱ（ｐＨ８，
６）、２Ｍ尿素中で均衡化し、線状勾配濃度のＮａＣＱ
　（０−０，４Ｍ）で溶離させ、更に精製する。最終精
製は、コンカナバリン八−カラムに結合させ、Ｏ，１Ｍ
α−メチルマンノシドを用いて溶離させるこ、１こより
行なう。必要な場合には、アガロースＡ１．５ｍでのゲ
ル濾過によりなお、更に精製することができる。組織残
分の代りに例２で得られるラミニンも使用できる。

例４（参考例） Ｃｏｌｌ（ＩＶ）の製造 ペプチドＣａ１ｌ（ＩＶ）の単離のために、例３で得た
コラーゲン蛋白質の混合物（沈殿、０．５〜２　　　Ｎ
ａＣＱ）　　を　０．０５Ｍ１−　　　リ　　ス　　・
　　ＨＣ４（ｐＨ７，４）　、０．２Ｍ　ＮａＣ＋２．
０．００２Ｍ　ＮａＣＱ２（ｌ　Ｏｍｇ／ｍＱ）中に溶
かし、細菌コラゲナーゼ（０，１ｍｇ／ｍ１２）の添加
の後に２０℃又は３７°０で１６時間インキュベートす
る。この場合、ペプチドＣ０１１（■）を陳いて全ての
他のコラーゲンは分解されて低分子量ペプチドになるか
ら、これらを透析により除去する。更にアガロースＡ５
Ｍ（ｌ　　Ｍ　　　ＣａＣＱ２、　０．０５　　ト　リ
　コζ　・　ＨＣ（２，ｐＨ７，４）で、かつ引続き、
ペプチドを、０．０１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，０）
　、４Ｍ尿素中で均衡化したＣＭ−セルロースのカラム
に結合させることにより精製する。線状勾配濃度のＮａ
ＣＱ　（０−０、２Ｍ　’　ＮａＣ４）により純粋なＣ
ｏ１１（ｒＶ）をカラムから溶離させる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、炭水化物１２〜１５重量％を含有し、分子量８００
   〜１０００ｋを有する糖蛋白質であり、分子量約２２０
   ｋ〜４４０ｋのジスルフィド結合ポリペプチド鎖２種よ
   り成り、プロテアーゼ阻害剤の存在で基底膜含有組織を
   濃塩酸で抽出し、引続きこの組織を０．４〜０．６ＭＮ
   ａＣｌで抽出し、後者抽出液から３．３〜３．５ＭＮａ
   Ｃｌで沈殿させ、再溶解させた沈殿物のクロマトグラフ
   ィにより得られたものであることを特徴とする、体液中
   の基底膜物質を免疫学的に測定するために好適なラミニ
   ン２、基底膜含有組織物質をプロテアーゼ阻害剤の存在
   で差当り高濃度塩酸で、次いで０．４〜０．６ＭＮａＣ
   ｌで少なくとも１回抽出し、０．４〜０．６ＭＮａＣｌ
   で得た抽出液から塩沈殿によりラミニンを分離させ、得
   られた沈殿物を場合により再溶解させてクロマトグラフ
   ィにかけることを特徴とするラミニンの製法３、基底膜
   含有出発物質として、ヒト胎盤又はマウスのＥＨＳ−肉
   腫を使用する、特許請求の範囲第２項に記載の方法