JPS61229900A - 免疫測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヘパラン硫酸プロテオグリカンは基礎膜内に存在してお
りイオン選択フィルターとして作用する。基礎膜内のプ
ロテオグリカンの減少は例えば糖尿病のような病気時に
見られることは各種文献に記載されている。この減少は
それが原因となって例えば腎障害のような糖尿病の遅延
合併症をひき起こすと考えられている。細胞を採取し且
つそれを利、用することは、この減少を検出する際に用
いる方法にとって不可欠である。

そこで、かかる変化を血清を分析することＫよって検出
できることが望まれている。

本発明の方法の使用によって、低密度ヘパラン硫酸プロ
テオグリカンが基礎膜を含有する組織より純粋に単離し
得ろことが発見されたのは驚くべきことである。この抗
原及びそれに対応する高度に特異的な抗体の使用によっ
て高度に敏感な免疫測定法を構築することが可能となる
。

また本発明による測定方法の使用により特に血液又は血
清のような体液中の低密度へパラン硫酸プロテオグリカ
ンを極小ｆｋ　（ｎｔ／ｍｚ）でも検出することが可能
である。

このことは病気の診断方法への有用な応用ができること
を意味している。通常の成人の血清中に普通見られる低
密度へバラン硫酸プロテオグリカンの濃度は１００　ｍ
ｙ／−から１５０ｎｐ／−の範囲である。しかし、例え
ば実験的に誘発された糖尿病などにおいて基礎膜に変化
が生じた時に統計的にこの濃度のかなり増大がある。今
や本発明の方法の使用によってこのような変化を迅速且
つ確実に検出することができるのである。

本発明は、 ａ）プロテアーゼ阻害剤の存在下で基礎膜組織をホモジ
ナイズし、組織残留物よりヘパラン硫酸プロテオグリカ
ンを採取し、イオン交換クロマトグラフィに続いて分子
篩クロマトグラフィによって精製し、そして密度勾配分
別を行なうことからなる低密度（ρ＝１．３５から１．
５９）ヘパラン硫酸プロテオグリカンの製造法及びその
方法により得られた生成物、 ｂ）低密度のヘパラン硫酸プロテオグリカンによって実
験動物を免疫化し、その血清を得ることからなるヘパラ
ン硫酸プロテオグリカンに対して高度に特異な抗体を含
有する血清の製造方法、及びこのようにして得られた生
成物、並びに Ｃ）体液中の抗原低密度ヘパラン硫酸プロテオグリカン
及び／又は抗原決定基の測定よりなるヘノラン硫酸プロ
テオグリカンの先便的測定方法 に関する。

上記の事項を以下に詳細に説明し、特許請求の範囲内で
限定することにする。

原則として低密度ヘパラン硫酸プロテオグリカンは本発
明による方法を使用すると基礎膜を含有する全細胞より
得ることができる。基礎膜の純粋な調製は本発明におい
ては全（不要である。抗原の単離は、組織の特性に応じ
て高濃度のカオトロピック塩溶液を使用して直接行なう
か、又はアルカリ金属塩によって抽出され得る阻害タン
パク質を取り除いた後に行なわれる。

適当なカオトロピック塩の例としてはチオシアン酸カリ
ウム、チオシアン酸グアニジニウム及び塩化グアニジニ
ウムがあげられる。塩化グアニジニウムが好適に使用さ
れる。これらの塩は１〜８モル好適には４〜７モルの範
囲の！１度で使用される。

阻害タンパク質を除去するための前抽出においては不純
物質に応じていくつかの可能な操作が存在する。すなわ
ち、 ｔ　組織を細かく砕き、組織成分が溶解していない程度
までの濃度のアルカリ金属塩を含有する水性緩衝液中で
ホモジナイズする。ＮａＣｔ又はＫＣｌが３．４〜４モ
ルの濃度で好適に使用される。

２、　低濃度の塩の存在下好ましくはＮ＋ａＣＬ又はＸ
ＣＺを０．１から１モルの濃度で含有する緩衝液を用い
てこの方法を実施する。

３．１及び２を組合せて行なう。

この前抽出の後に、低密度のヘノラン硫酸プロテオグリ
カンを上述のように単離する。抗原の実質的抽出及び予
備精製をプロテアーゼ阻害剤の存在下及び州中性におい
て好適に実施する。

次いで低密度へパラン硫酸プロテオグリカンを高濃度の
尿素又はその誘導体の存在下に、好ましくはＤＥＡＥ−
セルロース又はＤＥＡＥ−交差結合デキストラン（例え
ばＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ
Ｉｎｃ、製５ｅｐｈａｄｅｘ■）のような弱塩基性陽イ
オン交換体上のイオン交換クロマトグラフィによって、
その抽出物より精製する。

はじめの精製は分子篩クロマトグラフィで行なう。それ
Ｋよって抗体の生成にとって充分の純度を持つ生成物が
得られる。

次の密度勾配遠心分１ｉ１ｉ　（ｄｅｎｓｉｔｙ　ｇｒ
ａｄｉｅｎｔｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ　）によっ
て、タンパク質及び核酸を含有しない低密度（ρ＝１３
３〜１３９９／ｍＺ）のヘパラン硫酸プロテオグリカン
が得られる。

低密度へパラン硫酸プロテオグリカンに対する適当な抗
血清の入手可能性は、本発明による測定方法にとって決
定的に重要である。抗血清はモルモット、ヤギ、ヒツジ
、ロバ及び好適にはウサギのような実験動物内に皮下又
は筋肉注射することによる慣用法によって生成すること
ができる。完全フロインドアジュバントの存在は、この
目的達成のためには有利である。ウサギに対する好適投
与量は１匹肖り０．５から１ｍｇである。生成された抗
血清はその後当業者には周知の方法で得られ、同様に使
用され得る。またその後の使用前に、血清内に存在する
抗体を追加的に精製することができる。精製のための好
適な方法としては、親和性クロマトグラフィーがあり例
えば臭化シアンで活性化した５ｅｐｈａｒｏｓｅ■のよ
うに、抗原が共有結合している親和性マトリックス上で
行なわれる。

以下説明する免疫測定に対して必要な抗原の標識は、タ
ンパク質の標識にとって周知の方法で行なうことができ
る。放射性同位元素、酵素又は蛍光による標識が好適で
ある。放射性同位元素標識において、好適に用いられる
放射性核種はヨク累−１２５である。その後周知のクロ
ラミンＴ法（［Ｉｎｔ、　Ａｒｃｈ、　Ａｌｌｅｒｇｙ
　Ｊ　２９　、１８５　、１．９６６）による標識を行
なうこともできる。

本発明による上記説明の方法によって単離された低密度
ヘパラン硫酸プロテオグリカンと抗血清とＫよってそれ
自体周知の免疫測定方法を使用して特に血清内の抗原決
定基だゆでなく、上記説明のように本発明による体液中
の低密度ヘパラン硫酸プロテオグリカンの測定を行なう
ことができる。

この目的のためには、周知のラジオイムノアッセイ（Ｒ
工Ａ）変法並びにエンザイムイムノアツセイ変法及び例
えば蛍光標識、色素標識のような他の標識を用いる類似
の決定法の両方法を用いることによって可能となる。

この種の方法は当業者には周知であるので、これ以上の
説明を省略する。

これらの検出反応において、標識低密度ヘパラン硫酸プ
ロテオグリカンと測定対象の試料中に存在する未標識抗
原との間の抗体に対する周知の方法による拮抗作用が起
こるので、生成され九抗原−抗体複合体の量は測定対象
の試料中の未標識抗原量の増加に応じて減少する。例え
ば放射性同位元素活性又は酵素活性のような複合体を標
識又は抗原抗体複合体除去後の上澄みを標識することに
より、既知の低密度ヘパラン硫酸プロテオグリカン含量
の試料の使用によって書き上げられた目盛曲線に基づい
て、測定対象の試料中に含まれる抗原量を決定すること
ができる。好ましくは複合体を標識したものが決定され
る。

本発明による免疫方法の好適実施例は特異抗血清により
生成された抗原抗体複合体を第２抗体の使用により除去
することを含む。特異抗血清を得るために用いられる動
物種のＩｇＧに対する抗体が好適に用いられる。溶液か
らの抗原−抗体複合体の除去は沈殿、遠心分離又は濾過
のＬつなこの目的にとって習慣的に用いられる方法によ
って行うことができる。

別法として、抗血清又は第２抗体は固体キャリヤーに結
合される。抗原抗体複合体を除去した後に複合体内に含
有されるか又は溶液中に残存する放射性同位元素活性又
は他の標識量が測定される。

他の変法として例えばウサギのような適当な動物種のＩ
ｇＧに対する抗体を標識して低密度ヘパラン硫酸プロテ
オグリカンの測定のために実施することもでき、この場
合に既に詳しく説明した標識法が同様に適当であるが、
酵素標識が好適に用いられる。

エンザイムイムノアツセイにおいて、例えば抗原抗体複
合体の生成後に残存する抗ヘパラン硫酸プロテオグリカ
ン（低密度）血清の一部は前者をキャリアー結合低密度
ヘパラン硫敵プロテオグリカンに結合させ、その後それ
をウサギのＩｇＧに対する酵素−標識抗体と反応させる
ことによって測定することかできる。その後結合された
酵素標識量を酵素反応の測定によって定量するが、その
量は試料中の未知量の低密度ヘパラン硫酸プロテオグリ
カンに非直接的に比例する。

以下、実施例により本発明の詳細な説明する。

実施例　１ 低密度ヘパラン硫酸プロテオグリカンの調製ａ）ヒトの
胎盤を出発物質として用いた。プロテアーゼ阻害剤であ
るフェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）
　（２，５ｍＭ）、１）−クロル安息香酸の水銀塩（ｂ
ｙ／ｍ）、ｇＤＴＡ　（１０ｍＭ　）及びＮ−エチルマ
レイマイド（Ｎ腹）（２，５ｍＭ）の存在下において、
２０倍過剰量の０．１５　Ｍ　ＮａＣ１及びＣ１０５Ｍ
　）すｘｎｃｚ（ｐｆ１７．４）内で２又は３回組罎を
均質化し、抽出可能なタンパク質を遠心分離によって除
去した。

その後残留物を２回、６Ｍの塩化グアニジウム、０．０
５Ｍ）リスＨＣ２（ｐＨ７，４）によってプロテアーゼ
阻害剤の存在下、温度４℃において抽出した。抽出物は
へパラン硫酸プロテオグリカンを含有する。ヘパラン硫
酸プロテオグリカンを４℃の温度において７Ｍ尿１　０
．０５ＭトＩＪスＨＣ２（ｐＨ８，６）　、０５ｍＭの
ｇＤＴＡ　、　０．５　ｍＭのＮＥＭ。

０、５　ｍＭのＰＭＳＦにより平衡状態に達したＤｇＡ
Ｅセルロース上で０からα６Ｍの密度勾配を有するＮａ
ＣＬによって溶出するイオン交換クロマトグラフィによ
って精製し、生成物は密度勾配の半分以上によって溶出
された。

６Ｍの塩化グアニジニウムとα０５Ｍトリス／ＨＣ１，
ｐＨ７，４Ｋよって平衡に達したＮ、Ｎ’−メチレンビ
スアクリルアミド（例えばファーマシアファインケミカ
ルズインコーボレーテツド製５ｅｐｈａｃｒｙｌ　８４
００Ｏ）と交差結合したアリルデΦストラン上でＤＥＩ
−セルロースクロマトグラフィに使用する抑制剤を使用
して分子篩クロマトグラフィを行ない、続いて初期密度
ｔ　３４　ｒ鷹とする６Ｍ塩化グアニジニウム緩衝液中
でＣｓＣ２密度勾配遠心沈殿（＞ｉｏｏ、０ＯＯｘｆ、
８時間、１８℃）を行なった後に密度勾配の中心部で得
られる低密度ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ρ＝　１
．３３〜１、３９９７ｍ　）は、高密度ヘパラン硫酸プ
ロテオグリカン、グリコプロティン及び核酸を含有して
いなかった。

ｂ）ネズミの腫瘍（０ｒｋｉｎ等による［Ｊ、　Ｅ：ｃ
ｐ、　Ｍｅｄ、Ｊ１４５．２０４〜２２０（１９７７）
に記載のＥＭＳ肉腫〕を出発物質として用いること以外
は実施例１ａ）と同様の操作を行なった。ただし阻害タ
ンパク質を抽出するための予備′Ｎ展は不要である。

実施例　２ 標識抗原の調製 低密度ヘパラン硫酸プロテオグリカン２５ｎ？をクロラ
ミンＴ法によってヨウ素−１２５０，５ｍＣ１により標
識し、未結合のヨウ素を透析又はポリアクリルアミドゲ
ル（例えばファーマシアファインケミカルズインコーボ
レーテツド製ＢｉｏｇｅｌＰ２＠）上のケ゛ル濾過によ
り除去した。

実施例　３ 免疫測定のための操作（ＲＩＡ） 免疫測定のために必要な全ての操作を、例えばＴｗｅｅ
ｎ　２０　、即ちポリエトキシル化されたソルビトール
モノラウレートのような非イオン化界面活性剤の存在下
で行なった。

結合部位（Ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｌｏｔ　）を標識ヘパラ
ン硫酸プロテオグリカン１　ｍｇによって測定した。未
知の血清試料又は他の体液内のヘパラン硫酸プロテオグ
リカン濃度を下記の抑制定量分析によって測定した。

限定量の特異的抗体又は血清を４℃において１６時間、
未知の試料とともに前インキュ−ニー、さらにＷ識抗原
１ｎｐを追加した後に４℃において８時間インキュベー
トを続けた。その後ウサギのＩｇＧに対する過剰量の抗
体を追加しさらに１６時間４℃においてインキューニー
）　した後、免疫複合体内の抗原結合体を遠心分ｌｌ１
ａＫより除去した。未知の試料の抑制活性を未標識抗原
の標準濃度活性と比較した。

実施例　４ 抗血清の調製 同量の完全フロインドアジュバントと混合シた抗原溶液
を皮下又は筋肉注射することによって、ウサギを１匹当
り０．５から１■の低密度ヘパラン硫酸プロテオグリカ
ンによって免疫化した。最初の注射から４週間後に完全
フロインドアジュバントと混合した同量・の抗原溶液を
皮下又は筋肉注射した。２゜回目の注射後４乃至８週間
後に血液を採取し、凝固後にその血液より抗血清を得た
。

特許出願人　　ヘキスト・アクチェンゲゼルシャフト外
２名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）（ａ）プロテアーゼ阻害剤の存在下で基礎膜組織細
   胞をホモジナイズし、 （ｂ）その組織残留物よりヘパラン硫酸プロテオグリカ
   ンを抽出し、そして （ｃ）イオン交換クロマトグラフイとそれに続いて分子
   篩クロマトグラフイで精製し、そして密度勾配分別する ことからなる低密度（ρ＝１．３３から１．３９）のヘ
   パラン硫酸プロテオグリカンの調製方法。 ２）実験動物を低密度のヘパラン硫酸プロテオグリカン
   によつて免疫化し、次いでその血清を得ることからなる
   ヘパラン硫酸プロテオグリカンに対する抗体を含有する
   高特異的血清の調製方法。 ３）体液中の抗原である低密度ヘパラン硫酸プロテオグ
   リカン及び／又は抗原決定基を測定することよりなるヘ
   パラン硫酸プロテオグリカンの免疫測定方法。 ４）（ａ）体液中の抗原又は抗原決定基を測定対象の試
   料に対して過剰の限定量の抗体と反応させて、抗原抗体
   複合体を生成させ、そして （ｂ）抗原抗体複合体内の抗体を定量化することからな
   ることを特徴とする特許請求の範囲第３項に記載の方法
   。 ５）（ａ）試料に対して過剰量の抗体を測定対象の試料
   中に存在する抗原の他に過剰量の標識抗原と反応させ、 （ｂ）その反応生成物を抗原抗体複合体及び上澄みとに
   分離し、 （ｃ）標識抗原の量を複合体内又は複合体を除去した後
   の上澄み中で測定する ことよりなる定量化のための特許請求の範囲第４項に記
   載の方法。 ６）標識抗原が放射性同位元素、酵素又は蛍光色素によ
   つて標識されたものであることを特徴とする特許請求の
   範囲第５項に記載の方法。 ７）抗原抗体複合体を第２の抗体との反応によつて除去
   することを特徴とする特許請求の範囲第５項に記載の方
   法。 ８）（ａ）試料に対して過剰量の抗体をキャリアーに結
   合する過剰量の抗原と反応させ、 （ｂ）（ａ）より得られた抗原抗体複合体と過剰量の第
   ２標識抗体とを反応させ、そして （ｃ）（ｂ）から得られた生成物を抗原抗体複合体と遊
   離標識第２抗体を含有する上澄みとに分離し、 （ｄ）第２の標識抗体の量を複合体又は上澄みのどちら
   かにおいて測定する ことよりなる定量のための特許請求の範囲第４項に記載
   の方法。 ９）第２標識抗体が放射性同位元素、酵素又は蛍光色素
   により標識されたものであることを特徴とする特許請求
   の範囲第８項に記載の方法。 １０）タンパク質及び核酸を含有せず、且つ特許請求の
   範囲第１項に記載の方法によつて得られることを特徴と
   する低密度ヘパラン硫酸プロテオグリカン。 １１）特許請求の範囲第２項に記載の方法によつて得ら
   れる低密度ヘパラン硫酸プロテオグリカンに対する抗体
   を含有する高特異的血清。