JP3137676B2 - Ｉ型プロコラーゲンのｃ末端プロペプチドの免疫学的定量法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はヒトにおけるＩ型プロコ
ラーゲン合成の測定法に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】Ｉ型
コラーゲンは、ヒトの体全体を通して様々な異なる型の
結合組織の中に見られるが、そのほとんどは骨に存在す
る。骨ではＩ型コラーゲンは組織マトリックスの95％以
上を形成している。多くの病気がコラーゲン合成量の増
加、すなわち骨基質(bone matrix) 形成および代謝の割
合の増加と関連している。とくに骨粗鬆症や他の代謝性
の骨の病気は一般の健康問題なので、Ｉ型コラーゲンの
割合を評価することができれば望ましいであろう。この
評価ができればこれらの病気の治療法を考案するうえで
の手引きを提供することができるであろう。

【０００３】Ｉ型コラーゲンは分子の両末端にプロペプ
チドの延長を含むプロコラーゲンとして合成される。し
たがって、Ｉ型コラーゲン合成の割合はプロコラーゲン
からコラーゲンへの変換の際に遊離するプロペプチドの
量を測定することによって測定することができる。Ｉ型
プロコラーゲンのプロペプチドの定量法は開示されてい
る（トーブマンら、サイエンス186 巻、1115〜1117頁、
1974年(Taubman etal.,Science 186,1115-1117,1974）
参照）。そして、その定量法はＩ型プロコラーゲンのＮ
末端のプロペプチドであると信じられていた抗原に関連
している。しかしながらのちに、その測定された抗原は
おそらくＣ末端部分に由来しているらしいことが示され
た。

【０００４】さらに、この定量法で用いられたプロペプ
チド抗原は、培養線維芽細胞によって生産されるプロコ
ラーゲンから精製されていて、III 型プロコラーゲンに
対応するプロペプチドとも反応することが示されてい
る。（シモンら、ジャーナルオブ クリニカル エンド
クリノロジー アンド メタボリズム58巻，110 〜120
頁，1984年 (Simon et al.,J.Clin.Endocrinol.Metab.5
8,110-120,1984))プロペプチド抗原を分解し、SDS-ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動で分析すると、３から４本
の異なるバンドがえられる（ゴールドバーグら、コラー
ゲン アンドリレイテッド リサーチ ５巻393 〜404
頁1985年（Goldberg et al.,CollagenRel.Res.5,393-40
4,1985,398 頁第３図））。これは、III 型プロコラー
ゲンのＣ末端プロペプチド由来の余分に存在する鎖と一
致している。このように以前に開示されている測定法は
Ｉ型プロコラーゲンに特異的なものではない。

【０００５】培養ヒト皮フ線維芽細胞は常にプロコラー
ゲンのＩ型およびIII 型の両方を生産する。しかしなが
ら、この２つの型をそれぞれに完璧に分けることは技術
的に困難である。最も一般的に用いられる分離方法であ
る塩による分画では、完全な分離はできない。III 型プ
ロコラーゲンの濃度は、しばしばIII 型プロコラーゲン
のＮ末端プロペプチドの定量を用いて測定(monitor) さ
れる。しかし、この測定は、Ｃ末端プロペプチドを含む
がＮ末端プロペプチドを失った分子（そのような分子は
III 型pC−コラーゲンとして知られている）を認識しな
いので、充分に感度が高いものではない。

【０００６】それゆえに、本発明は、ヒト血清中のＩ型
プロコラーゲンのＣ末端プロペプチドの定量をするため
に、III 型プロコラーゲンのＣ末端プロペプチド（ＰII
I ＣＰと略す）を含まないＩ型プロコラーゲンのＣ末端
プロペプチド（ＰＩＣＰと略す）を製造する方法を開発
し、速く簡単に行なえる定量法をつくり出そうとするも
のである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、Ｉ型プロコラ
ーゲンのＣ末端プロペプチドを定量することによるＩ型
コラーゲンの評価法を提供する。

【０００８】

【実施例】精製プロペプチドの製造は充分な濃度のフリ
ー(free)のプロペプチドもしくはＩ型プロコラーゲンを
含む原料から始められる。前者の例にはたとえば、腹
水、治癒しつつある傷からの間質液および血清が含まれ
る。ヒト線維芽細胞の細胞培養培地(medium)は、後者の
例である。しかし、培養ヒト線維芽細胞は、プロコラー
ゲン製造出発原料としてのふさわしさの点で異なる。か
なり高濃度の（10％より高い）仔ウシ血清存在下に保た
れている初期培養は最も多量のプロコラーゲンを生産す
る。これらはもちろん１つの例で、他のソース(source)
も同様に用いることができる。

【０００９】プロコラーゲンソースから始めれば、プロ
コラーゲンの段階で、Ｉ型プロコラーゲンからほとんど
のIII 型プロコラーゲンを分離するのに便利である。

【００１０】この分離は、たとえば、硫酸アンモニウム
や塩化ナトリウムを用いた一連の沈殿によって行ないう
る。これに続いて、ゲルろ過およびイオン交換クロマト
グラフィーを行なう。

【００１１】ＰIII ＣＰからのＰＩＣＰの最終分離はプ
ロペプチド段階で達成される。細菌由来のコラーゲナー
ゼによるプロコラーゲンの消化によってプロペプチドを
製造し、そしてそれをレクチン結合(lectin binding)、
ゲルろ過およびクロマトグラフィーによって精製する。

【００１２】ＰＩＣＰおよびＰIII ＣＰの両者はマンノ
ースが豊富なオリゴサッカライド側鎖を有し、そのため
コンカナバリンＡレクチンに結合する。ＰIII ＣＰは培
養ヒト線維芽細胞から生産されるとリン酸化され、した
がってより多く負電荷を帯びるため、クロマトグラフィ
ーではＰＩＣＰよりも遅く溶出されるということにもと
づき、ＰＩＣＰは混入しているＰIII ＣＰから効率よく
分離される。クロマトグラフィーは、イオン交換クロマ
トグラフィーや逆相クロマトグラフィーを用いて4.0 よ
り高いpHで行なうのが好ましい。たとえば、DEAE- セフ
ァセル(Sephacel)イオン交換クロマトグラフィーカラム
の塩化ナトリウム勾配ではＰIII ＣＰとＰＩＣＰとは別
々に溶出される。

【００１３】調製物(preparation) の脱塩とＰＩＣＰの
最終精製は逆相クロマトグラフィーにて行ないうる。ク
ロマトグラフィーは、プロペプチドが変性されない条件
で行なわれなければならない。前記のクロマトグラフィ
ーは、調製物のpHが4.0 から8.5 の間となる条件で行な
うことが好ましい。実際にプロコラーゲンやプロぺプチ
ドの取り扱いは難しく、低収率となることが知られてい
る。本質的にＰIII ＣＰを含まないＰＩＣＰを単離する
ことのできる典型的な精製手順の詳しい条件は後の実施
例において示す。

【００１４】Ｉ型とIII 型のプロペプチドの混合物から
始めるばあい、4.0 より高いpHで、たとえばセファクリ
ル(Sephacryl)S-300などでのゲルろ過、たとえばコンカ
ナバリンＡレクチンなどを用いたレクチン親和結合、た
とえばDEAEセルロースなどでのイオン交換クロマトグラ
フィーおよび逆相クロマトグラフィーによってＩ型プロ
ペプチドがえられる。

【００１５】分離されたプロペプチドはSDS-ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動で均質となる。還元を行なうと前
記の調製物とは対照的に、電気泳動では２つのバンドの
みを生ずる。それはおよそ分子量30,000付近のもので、
およそ２：１の割合となっている。このことは、III 型
プロコラーゲンのプロペプチドが存在しないことを示
す。Ｎ末端配列の分析によっても、III 型プロコラーゲ
ンのＣ末端プロペプチド由来の鎖は存在しないことが確
認される。

【００１６】本発明はまた、Ｉ型プロコラーゲンのＣ末
端プロペプチドに対して作製される抗体、とくにIII 型
プロコラーゲンのＣ末端プロペプチドに対しては親和性
を有していない抗体も提供する。この抗体はこの分野で
知られている技術を用いて作製されうる。たとえば、プ
ロペプチドを用いる免疫処置は他のプロコラーゲンのプ
ロペプチド抗原についてニーメラ オー、リステリ エ
ル、パークキーネンジェイおよびリステリ ジェイ(Nie
mela O, Risteli L, Parkkinen J＆RisteliJ,）がバイ
オケミカル ジャーナル 232巻(Biochem. J. 232,)145
〜150 頁、1985年(145-150、1985）において述べている
ようにして行なうことができる。

【００１７】本発明は、Ｉ型コラーゲンのＣ末端プロペ
プチドの定量法をも提供するものである。その定量法
は、形成されるプロペプチド−抗体複合体と結合される
ような標識の存在下で、本発明の抗体と定量されるサン
プルとを接触させること、ならびにその結合および（ま
たは）非結合の標識量を定量することからなるものであ
る。

【００１８】この新しい定量により、プロペプチド濃度
の速く正確な定量が保証される。これは、連続的な定量
のあいだの、実際の濃度変化があまり大きくない臨床的
な条件においてはとくに有用である。この定量の検出限
界は約1.2 μg ／リットルである。

【００１９】臨床的な条件の例としては、骨粗鬆症患者
におけるエストロゲン治療や、成長ホルモン欠乏の子供
における成長ホルモン治療の効果があげられる。

【００２０】この定量は、標識の存在下で一次抗体とＩ
型プロコラーゲンのＣ末端プロペプチドと定量すべきサ
ンプルとを接触させること、そうして形成された標識化
されたプロペプチド−抗体複合体を非複合化物から分離
することならびに複合化された標識および（または）非
複合化標識を定量することにより行ないうる。このプロ
ペプチド−抗体複合体を、一次抗体に特異的である二次
抗体と接触させてもよい。そしてその二次抗体は支持体
に結合していてもよい。つぎにこのプロペプチド−抗体
−抗体複合体を非複合化原料から分離してもよい。

【００２１】この定量で用いられる標識されたプロペプ
チドにもまた、III型プロコラーゲンのＣ末端プロペプ
チド（ＰIII ＣＰ）が含まれてはならない。

【００２２】このように述べてきた方法で調製された試
薬を用いる、このプロペプチドの免疫学的定量は、指標
となる抗原もしくは抗体のどちらかに、たとえば放射
性、螢光、発光、もしくは酵素標識を用いて行ないう
る。指標となる抗原、精製されたＩ型コラーゲンのＣ末
端プロペプチドに便利なように標識を付ける。ポリクロ
ーナルまたはモノクローナル抗体どちらをも用いること
ができる。成人では、血清中のプロペプチド濃度は通常
約40〜200 μg ／リットルである。幼児や子供の場合の
濃度はかなり高い。

【００２３】つぎに示す実施例にもとづいて本発明を説
明するが、本発明はもとよりかかる実施例のみに限定さ
れるものではない。実施例１ではヒト線維芽細胞の培養
培地を用いる。しかしヒトＰＩＣＰと充分な交差反応を
示す抗体をえるためにウシ、ヒツジ、ブタのような他種
の細胞や体液を用いることもまた可能である。

【００２４】実施例１ III 型プロコラーゲンのＣ末端プロペプチドを含まない
ヒトＩ型プロコラーゲンのＣ末端プロペプチドの単離 ヒト皮フ線維芽細胞の培養培地30リットルを固体硫酸ア
ンモニウム（20％飽和）で沈殿させる。沈殿したタンパ
ク質を15,000g ×30分間の遠心分離で集め、３mg／リッ
トルのフェニルメタンスルホニルフルオリド、N-エチル
マレイミドおよびp-ヒドロキシメルクリベンゾエイトな
らびに10mM EDTA といったプロテアーゼ阻害剤を含む１
M 塩化ナトリウム、50mMトリス／塩酸pH7.4 に溶解し、
同じ溶液にて透析したのちに固体塩化ナトリウム（最終
濃度1.7M）にて沈殿させた。大部分のＩ型プロコラーゲ
ンを含む上清をセファクリル(Sephacryl)S-500（2.5 ×
120cm)カラムで分離しプロコラーゲンに相当する分画を
集め、以下に示したDEAE開始緩衝液に対して透析した。
そしてサンプルを、前記のプロテアーゼ阻害剤を含む6M
尿素、50mMトリス／塩酸pH8.0 で等張化したDEAE−セフ
ァセルカラム（５×30cm）にて分離した。一次勾配の塩
化ナトリウム（3000＋3000ml）で溶出を行なった。Ｉ型
プロコラーゲンを含む分画を集め、0.5M塩化ナトリウム
および前記のプロテアーゼ阻害剤を含む50mMトリス／塩
酸緩衝液に対して透析した。つぎにそのプロコラーゲン
調製物をCon-A セファロースカラム（ファルマシア(Pha
rmacia) 製、ウップサラ(Uppsala) 、スウェーデン(Swe
den)）（２×20cm）に通し、カラムに結合させたのち0.
5M α−メチルマンノシドで溶出した。その調製物を0.
2M炭酸アンモニウムにて透析したあと凍結乾燥を行なっ
た。単離されたプロコラーゲンは、III 型プロコラーゲ
ンのＮ末端プロペプチド用の定量によりまだ微量のIII
型プロコラーゲンを含んでいると判断されたが、これを
高度に精製された細菌のコラーゲナーゼ（ワーシングト
ン(Worthington) 製、グレードCLSPA(grade CLSPA)）を
初期培地体積(original medium volume)30リットルに対
して９mg用いて、30℃にて15時間消化した。そのプロペ
プチドの調製物をセファクリル(Sephacryl)S-300（2.5
×120cm 、0.2M炭酸アンモニウム中）でゲルろ過し、凍
結乾燥したあと、50mMトリス／酢酸緩衝液pH8.6 にて透
析し、プロテインパックDEAE５PVカラム（ウォーターズ
(waters)製、ミルフォード(Milford) 、マサチューセッ
ツ(Massachusetts) 、アメリカ合衆国）の高速液体クロ
マトグラフィーを使って分離した。カラムに結合してい
るプロペプチドを一次勾配の塩化ナトリウム（０〜60分
間、０〜0.5M）で溶出した。最終精製をpHの安定した逆
相カラム（500mM 酢酸アンモニウムpH8.0；カラム：ヴ
ィダック(Vydac)228TP、ザセパレイションズ グループ
(The Separations group) 製、ヘスペリア(Hesperia)、
カリホルニア(California)、アメリカ合衆国）の高速液
体クロマトグラフィーで行なった。２〜４mgのＰＩＣＰ
がえられた。

【００２５】図１に示すように、精製されたＰＩＣＰは
SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動ではただ１つのバ
ンドが、還元したばあいでは約２：１のモル比で２つの
みのバンドがえられる。これより生成物にはIII 型Ｃ末
端プロペプチドが含まれないことがわかる。

【００２６】実施例２ 平衡型のラジオイムノアッセイの実行 Ｉ型プロコラーゲンのＣ末端プロペプチド10μg をクロ
ラミン-T（５μg)により、１ミリキューリーの ¹²⁵Ｉで
標識し、その標識されたプロペプチドを、１mg／mlウシ
血清アルブミンを含むPBS 緩衝液で等張化したセファク
リルS-300 カラム（１×200cm)でゲルろ過することによ
りフリーのヨウ素と分離した。標識されたプロペプチド
（すなわちトレーサー）はフリー(free)のヨウ素よりも
かなり前に鋭いピークとしてカラムから溶出した。検量
は50,000放射活性カウント数／分（cpm)に標識されたプ
ロペプチドで調製された抗血清結合曲線にもとづいて行
なった。プロペプチドの濃度は血清中の未知のサンプル
のもので、他の体液のものは次に述べるラジオイムノイ
ンヒビションアッセイ(radioimmuno inhibitionassay)
によって定量された：予め量を調べた抗血清を、未知の
サンプルおよび50,000カウント数／分(cpm) のトレーサ
ーと37℃にて、２時間インキュベーションし、そののち
抗ウサギγ- グロブリンの固体相の二次抗体に加えた。
20℃にて、15分間インキュベートしたのちに、遠心分離
し、溶液から免疫複合体中に結合した抗原を分離した。
未知のサンプルの阻害活性を、標識されていないＩ型プ
ロコラーゲンのＣ末端プロペプチドの基準濃度の活性と
比較を行なった。

【００２７】一方、このＰＩＣＰ定量法の特異性をヒト
III 型プロコラーゲンのＣ末端プロペプチド（ＰIII Ｃ
Ｐ）を用いて検査したところ、交差反応は見られなかっ
た。ここで用いたＰIII ＣＰは多量のIII型プロコラー
ゲンを生産する（総コラーゲンタンパク質の約40％）ヒ
ト骨肉腫ＭＧ63細胞の培養培地から部分精製された（と
くにヒトＰＩＣＰを含まない）ものである。

【００２８】

【発明の効果】本発明の方法によれば、III 型プロコラ
ーゲンのＣ末端プロペプチドを含まないＩ型プロコラー
ゲンのＣ末端プロペプチドをえることができる。さらに
これに対して作製される抗体をえることができる。この
抗体を用いることにより、Ｉ型プロコラーゲンのＣ末端
プロペプチドの免疫的定量を感度よく、速く、簡単に行
なうことができる。そしてこの定量法は骨粗鬆症や他の
代謝性の骨の疾患などの診察に有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１において精製されたＰＩＣＰのSDS-ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ユッカ メルッコ フィンランド共和国、エス エフ− 90250 オウル、スオハウカンチエ １ エイチ (56)参考文献 Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，（1987) 126（１）ｐ．137−147 癌と化学療法，（1988）15（４ ｐａ ｒｔ ▲ＩＩ▼）ｐ．1229−1235 Ｍａｔｒｉｘ，（1990）10（３）ｐ. 186−199 Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．, （1986）78（５）ｐ．1237−1244 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（1977) 16（13）ｐ．3030−3036 Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，（1990）36 （７）ｐ．1328−1332 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 16/18 C07K 1/16 G01N 33/53 ＣＡ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 形成されるプロペプチド−抗体複合体に
   結合されるような標識の存在下で、III型プロコラーゲ
   ンのＣ末端プロペプチドを含まないＩ型プロコラーゲン
   のＣ末端プロペプチドに対して作製される抗体と定量さ
   れるサンプルとを接触させ、結合および（または）非結
   合標識の量を定量することよりなるＩ型プロコラーゲン
   のＣ末端プロペプチドの定量法。
2. 【請求項２】 標識されたＩ型プロコラーゲンのＣ末端
   プロペプチドおよび定量されるサンプルを抗体と接触さ
   せ、そうして形成されたプロペプチド−抗体複合体を非
   複合化物から分離し、複合化または非複合化標識の定量
   を行なう請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 プロペプチド−抗体複合体を一次抗体に
   特異的な二次抗体と接触させ、プロペプチド−抗体−抗
   体複合体を非複合化物から分離する請求項１または２記
   載の方法。
4. 【請求項４】 二次抗体が固体支持体に結合されている
   請求項３記載の方法。
5. 【請求項５】 標識が放射性、酵素、発光または螢光標
   識である請求項１、２、３または４記載の方法。
6. 【請求項６】 Ｉ型プロコラーゲンのＣ末端プロペプチ
   ドに特異的な抗体および標識からなる請求項１記載の定
   量法を行う際に使用するのに適するキット。