JPH06148183A - ３−デオキシピリジノリン若しくはその置換体又はその残基を有するコラーゲン断片を測定する方法 - Google Patents
３−デオキシピリジノリン若しくはその置換体又はその残基を有するコラーゲン断片を測定する方法Info
- Publication number
- JPH06148183A JPH06148183A JP32884692A JP32884692A JPH06148183A JP H06148183 A JPH06148183 A JP H06148183A JP 32884692 A JP32884692 A JP 32884692A JP 32884692 A JP32884692 A JP 32884692A JP H06148183 A JPH06148183 A JP H06148183A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- deoxypyridinoline
- substance
- measured
- solution
- collagen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 ３ＤＰ若しくはその置換体又はその残基を含
むコラーゲン断片を簡便な操作で、かつ、感度良く測定
する方法を提供することである。 【構成】 抗３−デオキシピリジノリン抗体又はその抗
原結合性断片と、３−デオキシピリジノリン若しくはそ
の置換体又はその残基を有するコラ−ゲン断片との特異
的結合を利用した免疫測定により、生体試料中に含まれ
る３−デオキシピリジノリン若しくはその置換体又はそ
の残基を有するコラ−ゲン断片を測定する方法を提供し
た。
むコラーゲン断片を簡便な操作で、かつ、感度良く測定
する方法を提供することである。 【構成】 抗３−デオキシピリジノリン抗体又はその抗
原結合性断片と、３−デオキシピリジノリン若しくはそ
の置換体又はその残基を有するコラ−ゲン断片との特異
的結合を利用した免疫測定により、生体試料中に含まれ
る３−デオキシピリジノリン若しくはその置換体又はそ
の残基を有するコラ−ゲン断片を測定する方法を提供し
た。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、生体試料中の３−デオ
キシピリジノリン若しくはその置換体又はその残基を有
するコラ−ゲン断片を測定する方法に関する。本発明の
方法は、骨粗鬆症の診断に有用である。
キシピリジノリン若しくはその置換体又はその残基を有
するコラ−ゲン断片を測定する方法に関する。本発明の
方法は、骨粗鬆症の診断に有用である。
【０００２】
【従来の技術】骨粗鬆症とは骨密度が低下し、骨内部が
スカスカになり、もろくなる病気のことである。人体は
常に、骨を作ったり、壊したりしており、そのバランス
が保たれている間は強い骨が維持されているが老化など
により、そのバランスが崩れたりした時には、骨粗鬆症
になる恐れがある。病因としては主に加齢という生理現
象、女性ホルモンの欠乏、その他ホルモンの変化、ビタ
ミンD 、カルシウム、蛋白質の摂取不足、運動不足など
の多因子が挙げられる。この症状の特徴は、加齢という
生理現象を背景に発症するケ−スが主であり生化学的及
び内分泌学的検査所見もほとんどが生理的変動範囲内の
変化である事が多いため、異常が認められず、早期発見
が遅れる。骨粗鬆症は、最近、社会の高齢化、食生活の
変化などにより若年層にも発生するケ−スが増加してお
り日本での現在の推定患者数は800〜900 万人と言われ
ており、今後、増加するのは確実である。
スカスカになり、もろくなる病気のことである。人体は
常に、骨を作ったり、壊したりしており、そのバランス
が保たれている間は強い骨が維持されているが老化など
により、そのバランスが崩れたりした時には、骨粗鬆症
になる恐れがある。病因としては主に加齢という生理現
象、女性ホルモンの欠乏、その他ホルモンの変化、ビタ
ミンD 、カルシウム、蛋白質の摂取不足、運動不足など
の多因子が挙げられる。この症状の特徴は、加齢という
生理現象を背景に発症するケ−スが主であり生化学的及
び内分泌学的検査所見もほとんどが生理的変動範囲内の
変化である事が多いため、異常が認められず、早期発見
が遅れる。骨粗鬆症は、最近、社会の高齢化、食生活の
変化などにより若年層にも発生するケ−スが増加してお
り日本での現在の推定患者数は800〜900 万人と言われ
ており、今後、増加するのは確実である。
【０００３】骨粗鬆症の診断は生化学. 内分泌検査、骨
萎縮度測定法、骨密度定量法、組織学的検査などがある
が確定診断には骨密度測定法だけが使われている。この
骨密度測定法とは、光子吸収法（DEXA：２種の異なるエ
ネルギ−のX 線を用いる方法）であり、正確な診断が可
能であるが装置が特殊設備を要しかつ、高額であるため
普及には限界がある。
萎縮度測定法、骨密度定量法、組織学的検査などがある
が確定診断には骨密度測定法だけが使われている。この
骨密度測定法とは、光子吸収法（DEXA：２種の異なるエ
ネルギ−のX 線を用いる方法）であり、正確な診断が可
能であるが装置が特殊設備を要しかつ、高額であるため
普及には限界がある。
【０００４】そこで最近、骨粗鬆症のマ−カ−として尿
中ピリジノリン及びその誘導体が注目されている。この
物質を同定、定量するには尿中からまず大きなタンパク
質を除きその後、高速液体クロマトグラフィ−で分離、
同定するなどの非常に煩雑な分析方法があるが、これは
一般検査では非常に測定時間の無駄であり、同じ装置で
同時に何十検体も測定が不可能であり、精度にも問題が
ある。
中ピリジノリン及びその誘導体が注目されている。この
物質を同定、定量するには尿中からまず大きなタンパク
質を除きその後、高速液体クロマトグラフィ−で分離、
同定するなどの非常に煩雑な分析方法があるが、これは
一般検査では非常に測定時間の無駄であり、同じ装置で
同時に何十検体も測定が不可能であり、精度にも問題が
ある。
【０００５】ピリジノリンと総称されるものにはリジル
ピリジノリン（LP）、2 ’- ヒドロキシリジルピリジノ
リン（HP）、3-デオキシピリジノリン（3DP)の３種類、
これらの置換体及びこれらの残基を含むコラーゲン断
片）が尿中には存在する。前記２種類は自然蛍光を持っ
ているが3-デオキシピリジノリンは蛍光特性を持ってい
ない。そこでこの物質を紫外線吸収スペクトルで測定し
なければならないが蛍光感度に比べ、紫外吸収スペクト
ルは一般的に感度が低いこと、そして微量なことから高
速液体クロマトグラフィ−では測定にかなり技術を要す
る。
ピリジノリン（LP）、2 ’- ヒドロキシリジルピリジノ
リン（HP）、3-デオキシピリジノリン（3DP)の３種類、
これらの置換体及びこれらの残基を含むコラーゲン断
片）が尿中には存在する。前記２種類は自然蛍光を持っ
ているが3-デオキシピリジノリンは蛍光特性を持ってい
ない。そこでこの物質を紫外線吸収スペクトルで測定し
なければならないが蛍光感度に比べ、紫外吸収スペクト
ルは一般的に感度が低いこと、そして微量なことから高
速液体クロマトグラフィ−では測定にかなり技術を要す
る。
【０００６】従って、本発明の目的は、３ＤＰ若しくは
その置換体又はその残基を含むコラーゲン断片を簡便な
操作で、かつ、感度良く測定する方法を提供することで
ある。
その置換体又はその残基を含むコラーゲン断片を簡便な
操作で、かつ、感度良く測定する方法を提供することで
ある。
【０００７】本願発明者らは、鋭意研究の結果、これら
の物質を免疫学的に測定することに成功し、本発明を完
成した。
の物質を免疫学的に測定することに成功し、本発明を完
成した。
【０００８】すなわち、本発明は、抗３−デオキシピリ
ジノリン抗体又はその抗原結合性断片と、３−デオキシ
ピリジノリン若しくはその置換体又はその残基を有する
コラ−ゲン断片との特異的結合を利用した免疫測定によ
り、生体試料中に含まれる３−デオキシピリジノリン若
しくはその置換体又はその残基を有するコラ−ゲン断片
を測定する方法を提供する。
ジノリン抗体又はその抗原結合性断片と、３−デオキシ
ピリジノリン若しくはその置換体又はその残基を有する
コラ−ゲン断片との特異的結合を利用した免疫測定によ
り、生体試料中に含まれる３−デオキシピリジノリン若
しくはその置換体又はその残基を有するコラ−ゲン断片
を測定する方法を提供する。
【０００９】以下、本発明をさらに詳細に説明する。
【００１０】本発明の方法により測定されるものは、３
ＤＰ、グリコシル化誘導体のようなその置換体、及び３
ＤＰ残基を含むコラーゲン断片である。尿中に含まれ
る、３ＤＰ残基含有コラーゲン断片は、下記式［Ｉ］又
は［II］に示されるものに代表される、３ＤＰがアミノ
酸鎖の一部で置換されたものである。
ＤＰ、グリコシル化誘導体のようなその置換体、及び３
ＤＰ残基を含むコラーゲン断片である。尿中に含まれ
る、３ＤＰ残基含有コラーゲン断片は、下記式［Ｉ］又
は［II］に示されるものに代表される、３ＤＰがアミノ
酸鎖の一部で置換されたものである。
【００１１】
【化１】
【００１２】
【化２】 ただし、式［Ｉ］及び［II］において、PYN は３ＤＰ残
基を示し、Gln はグルタミン又は完全に環化したピロリ
ドンカルボン酸を示す。
基を示し、Gln はグルタミン又は完全に環化したピロリ
ドンカルボン酸を示す。
【００１３】また、尿中に含まれる３ＤＰのグリコシル
化置換体は、下記式［III]又は［IV］で示されるものに
代表される、リジル基のＯＨ部分がグリコシル化された
ものを包含する。
化置換体は、下記式［III]又は［IV］で示されるものに
代表される、リジル基のＯＨ部分がグリコシル化された
ものを包含する。
【００１４】
【化３】
【００１５】
【化４】
【００１６】以下、本発明の方法を実施するための手順
を順を追って説明するが、下記に示すものは好ましい態
様であり、本発明は下記に示す態様に限定されるもので
はない。
を順を追って説明するが、下記に示すものは好ましい態
様であり、本発明は下記に示す態様に限定されるもので
はない。
【００１７】尿中３ＤＰの単離方法 高濃度のピリジノリン架橋物質を含む尿試料をペ−ジェ
ト病患者、副甲状線機能亢進症患者の尿より採取する。
早朝尿1000ml程度を元の量の1/10程度に濃縮し、0.2M酢
酸を溶離液としてセファデックスＧ25（3 ｘ100 ｃｍ）
（ファルマシア社製）を用いて蛍光、紫外線の両方のス
ペクトルを測定し、ピリジノリン架橋断片（蛍光部分）
の前後の紫外吸収部分を画分し、凍結乾燥する。上記画
分をＤＥＡＥ−５ＤＷカラム（7.5 mm x 7.5 cm)（東ソ
ー社製）を用いて陰イオン交換クロマトグラフィ−で１
０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを含む０．０２Ｍトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中ＮａＣｌ（０→０．２Ｍ）の
勾配で溶離し、精製する。さらにそれをセファデックス
Ｇ10（ファルマシア社製）のカラムで脱塩し、凍結乾燥
し、最終精製はTSK ODS-120T（4.6 ｘ25ｃｍ）（東ソ
ー社製）による逆相HPLCで行い0.1 ％ヘプタフルオロ酪
酸および15〜30％の直線勾配濃度のアセトニトリルで30
分間溶出させる。下記実施例では、このピリジノリン架
橋断片（蛍光部分）前後の３つの紫外吸収ピ−クを分離
し、1H-NMR,13C-NMRで構造を同定し、3-デオキシピリジ
ノリンを単離した。架橋断片を有しない遊離型の3DHPを
単離するためには６M HCl と混合し105 〜110 ℃で24時
間加水分解した後エバポレ−タで脱塩、濃縮した後、遠
心分離し、上清を上記同様の操作（セファデックスＧ−
２５の代わりにセファデックスＧ−１０、陰イオン交換
カラムの代わりに陽イオン交換カラムを使用）により得
られる。
ト病患者、副甲状線機能亢進症患者の尿より採取する。
早朝尿1000ml程度を元の量の1/10程度に濃縮し、0.2M酢
酸を溶離液としてセファデックスＧ25（3 ｘ100 ｃｍ）
（ファルマシア社製）を用いて蛍光、紫外線の両方のス
ペクトルを測定し、ピリジノリン架橋断片（蛍光部分）
の前後の紫外吸収部分を画分し、凍結乾燥する。上記画
分をＤＥＡＥ−５ＤＷカラム（7.5 mm x 7.5 cm)（東ソ
ー社製）を用いて陰イオン交換クロマトグラフィ−で１
０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを含む０．０２Ｍトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中ＮａＣｌ（０→０．２Ｍ）の
勾配で溶離し、精製する。さらにそれをセファデックス
Ｇ10（ファルマシア社製）のカラムで脱塩し、凍結乾燥
し、最終精製はTSK ODS-120T（4.6 ｘ25ｃｍ）（東ソ
ー社製）による逆相HPLCで行い0.1 ％ヘプタフルオロ酪
酸および15〜30％の直線勾配濃度のアセトニトリルで30
分間溶出させる。下記実施例では、このピリジノリン架
橋断片（蛍光部分）前後の３つの紫外吸収ピ−クを分離
し、1H-NMR,13C-NMRで構造を同定し、3-デオキシピリジ
ノリンを単離した。架橋断片を有しない遊離型の3DHPを
単離するためには６M HCl と混合し105 〜110 ℃で24時
間加水分解した後エバポレ−タで脱塩、濃縮した後、遠
心分離し、上清を上記同様の操作（セファデックスＧ−
２５の代わりにセファデックスＧ−１０、陰イオン交換
カラムの代わりに陽イオン交換カラムを使用）により得
られる。
【００１８】免疫学的測定法 ３ＤＰに対して特異的なモノクローナル抗体及びポリク
ローナル抗体は公知の方法によって作られる。例えばキ
ャンベル（Campbell,A,M）著、（1986）”生物学および
分子生物学における実験技術（Laboratory Techniques
in Biochemistry and Molecular Biology ）”13巻、を
参照。上記架橋断片に対する抗体をつくることは可能で
あるがこれらの架橋断片の分子量はせいぜい5000以下で
あるから、３ＤＰ、その置換体またはその残基を含むコ
ラーゲン断片を担体分子に結合させることが好ましい。
適した担体分子としてはウシ血清アルブミン、卵アルブ
ミンなどがあげられるがこれに限られるわけではない。
また、これらの抗体の抗原結合性断片（Ｆａｂ断片及び
Ｆ（ａｂ’）2 断片）も用いることができる。なお、上
記架橋コラーゲン断片を担体に結合したものを免疫原と
して抗血清を調製した場合、３ＤＰに特異的に結合する
抗体を選択することは、これらを固定したカラムに抗血
清を通過させ、吸着したものを採取することにより行う
ことができる。この操作の詳細は下記実施例に記載され
ている。
ローナル抗体は公知の方法によって作られる。例えばキ
ャンベル（Campbell,A,M）著、（1986）”生物学および
分子生物学における実験技術（Laboratory Techniques
in Biochemistry and Molecular Biology ）”13巻、を
参照。上記架橋断片に対する抗体をつくることは可能で
あるがこれらの架橋断片の分子量はせいぜい5000以下で
あるから、３ＤＰ、その置換体またはその残基を含むコ
ラーゲン断片を担体分子に結合させることが好ましい。
適した担体分子としてはウシ血清アルブミン、卵アルブ
ミンなどがあげられるがこれに限られるわけではない。
また、これらの抗体の抗原結合性断片（Ｆａｂ断片及び
Ｆ（ａｂ’）2 断片）も用いることができる。なお、上
記架橋コラーゲン断片を担体に結合したものを免疫原と
して抗血清を調製した場合、３ＤＰに特異的に結合する
抗体を選択することは、これらを固定したカラムに抗血
清を通過させ、吸着したものを採取することにより行う
ことができる。この操作の詳細は下記実施例に記載され
ている。
【００１９】標識は放射性ラベル例えば125Iまたは蛍光
ラベル例えばフルオレセインイソチオシアネ−トもしく
はロ−ダミンでもよい。磁性物質、または、常磁性元素
Fe,Cu,Mn,Gd または造形物質例えば、131In のごとき放
射性核種を標識として使用してもよい。また、西洋ワサ
ビペルオキシダ−ゼのような酵素でもよいがこれに限ら
れるわけではない。コンジュゲ−トとは標識物質と抗体
又は、標識物質と抗原および抗原類似物質の結合物質こ
とであり、アビジン- ビオチン等を介して標識化するこ
とも可能である。またこれらの物質の結合にはグルタル
アルデヒド法、過ヨ−ソ酸法、マレイミド法、ピリジル
ジスルフィド法（酵素免疫測定法：石川栄治ら、医学書
院）などが挙げられる。測定法としては抗原様物質を固
定化して標識抗体を用いたインヒビションアッセイ、抗
体を固定化して標識抗原と試料を競合させる競合法、２
抗体法などいずれの公知の方法でもよい。
ラベル例えばフルオレセインイソチオシアネ−トもしく
はロ−ダミンでもよい。磁性物質、または、常磁性元素
Fe,Cu,Mn,Gd または造形物質例えば、131In のごとき放
射性核種を標識として使用してもよい。また、西洋ワサ
ビペルオキシダ−ゼのような酵素でもよいがこれに限ら
れるわけではない。コンジュゲ−トとは標識物質と抗体
又は、標識物質と抗原および抗原類似物質の結合物質こ
とであり、アビジン- ビオチン等を介して標識化するこ
とも可能である。またこれらの物質の結合にはグルタル
アルデヒド法、過ヨ−ソ酸法、マレイミド法、ピリジル
ジスルフィド法（酵素免疫測定法：石川栄治ら、医学書
院）などが挙げられる。測定法としては抗原様物質を固
定化して標識抗体を用いたインヒビションアッセイ、抗
体を固定化して標識抗原と試料を競合させる競合法、２
抗体法などいずれの公知の方法でもよい。
【００２０】
【実施例】実施例１ 抗血清（ウサギ）の作成、精製法 上記尿中３ＤＰ架橋断片の単離法で単離した後、N-エチ
ル-N'-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハ
イドロクロライドを用いて卵白アルブミンに結合させフ
ロイント完全アジュバントによりエマルジョン化した。
上記免疫原（３ＤＰ）を四肢指の皮内16ケ所および背部
皮内数ケ所に注射した。3 週後に補助注射として上記免
疫原を1/5 〜1/10程度に希釈したものを2ml 静脈に注
射、10日後に試験採取して、免疫電気泳動法で検討し
た。IgG,IgM,IgA および補体のβ1CAの沈降線が明瞭に
認められた。つぎにIgG の精製として硫酸ソ−ダによる
塩析でIgG 画分を沈殿させ混在する他のタンパクを除く
ためにDEAEセルロ−スカラムに通すことによって素通り
画分に高純度なIgG が得られた。さらに抗体の精製をお
こなうためにアフィニテイ−クロマトグラフィ−をおこ
なった。それぞれ精製した抗原30mgを2ml のcoupling b
uffer(NaHCO3 4.2g, NaCl 29g を水で1000mlにする。
PH=8.3) に溶解して洗浄したCNBr−セファロース（ファ
ルマシア社製） 2g を18mlのcoupling buffer に加え室
温で2 時間振とうした。これを遠心管に移し2000rpm で
遠心し、上清を捨て、グリシン-HCl 緩衝液で2 回洗
い、最後にグリシン-HCl緩衝液に懸濁して、一晩氷室に
おき、残存する活性基をブッロックした。次にcoupling
buffer で洗い、0.1M酢酸緩衝液（PH=4.0）で洗った。
この操作を２回繰り返した。こうして作成した不溶性抗
原をカラムにつめcoupling buffer 約30mlを流し洗浄し
たあと、IgG 画分をカラムに吸着させた。coupling buf
fer 約70mlを流してカラムを洗浄した。グリシン-HCl
緩衝液を流し溶出させすべて試験管にとった（2 〜3ml
ずつ）。各試験管ごとに0.1 Ｎ NaOH を注意深く加え
て、PHを中性にし吸光度（280nm ）を測定し、タンパク
質陽性の画分をすべてプ−ルして濃縮した。PBS 透析
後、遠心して、不溶性のものを除き、所定の濃度にし
た。こうして３ＤＰの抗体を作成した。
ル-N'-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハ
イドロクロライドを用いて卵白アルブミンに結合させフ
ロイント完全アジュバントによりエマルジョン化した。
上記免疫原（３ＤＰ）を四肢指の皮内16ケ所および背部
皮内数ケ所に注射した。3 週後に補助注射として上記免
疫原を1/5 〜1/10程度に希釈したものを2ml 静脈に注
射、10日後に試験採取して、免疫電気泳動法で検討し
た。IgG,IgM,IgA および補体のβ1CAの沈降線が明瞭に
認められた。つぎにIgG の精製として硫酸ソ−ダによる
塩析でIgG 画分を沈殿させ混在する他のタンパクを除く
ためにDEAEセルロ−スカラムに通すことによって素通り
画分に高純度なIgG が得られた。さらに抗体の精製をお
こなうためにアフィニテイ−クロマトグラフィ−をおこ
なった。それぞれ精製した抗原30mgを2ml のcoupling b
uffer(NaHCO3 4.2g, NaCl 29g を水で1000mlにする。
PH=8.3) に溶解して洗浄したCNBr−セファロース（ファ
ルマシア社製） 2g を18mlのcoupling buffer に加え室
温で2 時間振とうした。これを遠心管に移し2000rpm で
遠心し、上清を捨て、グリシン-HCl 緩衝液で2 回洗
い、最後にグリシン-HCl緩衝液に懸濁して、一晩氷室に
おき、残存する活性基をブッロックした。次にcoupling
buffer で洗い、0.1M酢酸緩衝液（PH=4.0）で洗った。
この操作を２回繰り返した。こうして作成した不溶性抗
原をカラムにつめcoupling buffer 約30mlを流し洗浄し
たあと、IgG 画分をカラムに吸着させた。coupling buf
fer 約70mlを流してカラムを洗浄した。グリシン-HCl
緩衝液を流し溶出させすべて試験管にとった（2 〜3ml
ずつ）。各試験管ごとに0.1 Ｎ NaOH を注意深く加え
て、PHを中性にし吸光度（280nm ）を測定し、タンパク
質陽性の画分をすべてプ−ルして濃縮した。PBS 透析
後、遠心して、不溶性のものを除き、所定の濃度にし
た。こうして３ＤＰの抗体を作成した。
【００２１】実施例２ 抗体の標識化 過ヨウ素酸法によるIgG のペルオキシダ−ゼ標識 ”酵素免疫測定法”作製法に準じて標識抗体を作成し
た。
た。
【００２２】実施例３ 抗原の標識化 過ヨウ素酸酸化法によるペルオキシダ−ゼのペプチド分
子への標識法 ”酵素免疫測定法”の作製法に準じて標識抗原を作成し
た。
子への標識法 ”酵素免疫測定法”の作製法に準じて標識抗原を作成し
た。
【００２３】実施例４ インヒビションアッセイを行うためにマイクロタイタ−
プレ−ト（96穴）のウエルに免疫原として使用した3DHP
- アルブミンを被覆させた（4 ℃、一晩）。次にこの液
をウエルから除き、洗浄液（0.14M NaCl/10mM-リン酸バ
ッファ−（PH=7.5）+0.1％Tween20 ）で1 回洗浄した。
3%BSA （ウシ血清アルブミン）を含むPBS 溶液でウエル
を満たし37℃１時間放置した。BSA 溶液を除去したあと
上記洗浄液でウエルを洗浄した。あらかじめHPLCで濃度
を測定してあるサンプルと3DHPに対するペルオキシダ−
ゼ標識抗体を含む液（50μl 、BSA を1%含む液で希釈）
は別の試験管で37℃１時間反応させてある。この混合溶
液をウエルに加えてさらに37℃１時間反応させた。ペル
オキシダ−ゼ標識抗体を含む液を除去し上記洗浄液で十
分にウエルを洗浄し、ペルオキシダ−ゼ基質溶液（ウエ
ル1 個当たり100 μl ；0.14M NaCl/10mM-リン酸バッフ
ァ−（PH=7.5）中0.25mMのオルトフェニレンジアミンと
0.01% 過酸化水素水）を加え、発色させた。410nm での
光学密度を、MR580 マイクロエリザ、オ−ト、リ−ダ−
（ダイナテック製）を用いて測定した。結果を下記表１
に示す。
プレ−ト（96穴）のウエルに免疫原として使用した3DHP
- アルブミンを被覆させた（4 ℃、一晩）。次にこの液
をウエルから除き、洗浄液（0.14M NaCl/10mM-リン酸バ
ッファ−（PH=7.5）+0.1％Tween20 ）で1 回洗浄した。
3%BSA （ウシ血清アルブミン）を含むPBS 溶液でウエル
を満たし37℃１時間放置した。BSA 溶液を除去したあと
上記洗浄液でウエルを洗浄した。あらかじめHPLCで濃度
を測定してあるサンプルと3DHPに対するペルオキシダ−
ゼ標識抗体を含む液（50μl 、BSA を1%含む液で希釈）
は別の試験管で37℃１時間反応させてある。この混合溶
液をウエルに加えてさらに37℃１時間反応させた。ペル
オキシダ−ゼ標識抗体を含む液を除去し上記洗浄液で十
分にウエルを洗浄し、ペルオキシダ−ゼ基質溶液（ウエ
ル1 個当たり100 μl ；0.14M NaCl/10mM-リン酸バッフ
ァ−（PH=7.5）中0.25mMのオルトフェニレンジアミンと
0.01% 過酸化水素水）を加え、発色させた。410nm での
光学密度を、MR580 マイクロエリザ、オ−ト、リ−ダ−
（ダイナテック製）を用いて測定した。結果を下記表１
に示す。
【００２４】実施例５ 競合法を行うためにマイクロタイタ−プレ−ト（96穴）
のウエルに3DHPに対する抗体を被覆させた（4 ℃、一
晩）。次にこの液を ウエルから除き、洗浄液（0.14M
NaCl/10mM-リン酸バッファ−（PH=7.5）+0.1％Tween20
）で1 回洗浄した。3%BSA （ウシ血清アルブミン）を
含むPBS 溶液でウエルを満たし37℃１時間放置した。BS
A 溶液を除去したあと上記洗浄液でウエルを洗浄した。
あらかじめ混合してプレインキュベ−トしてあるサンプ
ルとペルオキシダ−ゼ標識抗原（3DHP）+0.14M NaCl/10
mM−リン酸バッファ−（PH=7.5）をウエルに添加し37℃
１時間反応させた。標識抗原溶液を除去し上記洗浄液で
十分にウエルを洗浄し、ペルオキシダ−ゼ基質溶液（ウ
エル１個当たり100 μl ；0.14M NaCl/10mM-リン酸バッ
ファ−（PH=7.5）中0.25mMのオルトフェニレンジアミン
と0.01% 過酸化水素水）を加え、発色させた。410nm で
の光学密度を、MR580 マイクロエリザ、オ−ト、リ−ダ
−（ダイナテック製）を用いて測定した。結果を下記表
２に示す。
のウエルに3DHPに対する抗体を被覆させた（4 ℃、一
晩）。次にこの液を ウエルから除き、洗浄液（0.14M
NaCl/10mM-リン酸バッファ−（PH=7.5）+0.1％Tween20
）で1 回洗浄した。3%BSA （ウシ血清アルブミン）を
含むPBS 溶液でウエルを満たし37℃１時間放置した。BS
A 溶液を除去したあと上記洗浄液でウエルを洗浄した。
あらかじめ混合してプレインキュベ−トしてあるサンプ
ルとペルオキシダ−ゼ標識抗原（3DHP）+0.14M NaCl/10
mM−リン酸バッファ−（PH=7.5）をウエルに添加し37℃
１時間反応させた。標識抗原溶液を除去し上記洗浄液で
十分にウエルを洗浄し、ペルオキシダ−ゼ基質溶液（ウ
エル１個当たり100 μl ；0.14M NaCl/10mM-リン酸バッ
ファ−（PH=7.5）中0.25mMのオルトフェニレンジアミン
と0.01% 過酸化水素水）を加え、発色させた。410nm で
の光学密度を、MR580 マイクロエリザ、オ−ト、リ−ダ
−（ダイナテック製）を用いて測定した。結果を下記表
２に示す。
【００２５】実施例６ ２抗体法を行うためにマイクロタイタ−プレ−ト（96
穴）のウエルに免疫原として使用した3DHP- アルブミン
を被覆させた（4 ℃、一晩）。次にこの液をウエルから
除き、洗浄液（0.14M NaCl/10mM-リン酸バッファ−（PH
=7.5）+0.1％Tween20 ）で1 回洗浄した。3%BSA （ウシ
血清アルブミン）を含むPBS 溶液でウエルを満たし37℃
１時間放置する。BSA 溶液を除去したあと上記洗浄液で
ウエルを洗浄した。あらかじめHPLCで濃度を測定してあ
るサンプルと3DHPに対する抗体を含む液（50μl 、BSA
を1%含む液で希釈）は別の試験管で37℃１時間反応させ
てある。この混合溶液をウエルに加えてさらに37℃１時
間反応させた。抗体を含む液を除去し上記洗浄液で十分
にウエルを洗浄し、カッペル社の抗ウサギIgG(H+L)に実
施例２と同様の操作によりペルオキシダ−ゼを標識した
ものをバッファ−で希釈して各ウエルに加え37℃1 時間
反応させた。ペルオキシダ−ゼ標識抗ウサギIgG を含む
液を除去し上記洗浄液で十分にウエルを洗浄し、ペルオ
キシダ−ゼ基質溶液（ウエル1 個当たり100 μl ；0.14
M NaCl/10mM-リン酸バッファ−（PH=7.5）中0.25mMのオ
ルトフェニレンジアミンと0.01% 過酸化水素水）を加
え、発色させる。410nm での光学密度を、MR580 マイク
ロエリザ、オ−ト、リ−ダ−（ダイナテック製）を用い
て測定した。結果を下記表３に示す。
穴）のウエルに免疫原として使用した3DHP- アルブミン
を被覆させた（4 ℃、一晩）。次にこの液をウエルから
除き、洗浄液（0.14M NaCl/10mM-リン酸バッファ−（PH
=7.5）+0.1％Tween20 ）で1 回洗浄した。3%BSA （ウシ
血清アルブミン）を含むPBS 溶液でウエルを満たし37℃
１時間放置する。BSA 溶液を除去したあと上記洗浄液で
ウエルを洗浄した。あらかじめHPLCで濃度を測定してあ
るサンプルと3DHPに対する抗体を含む液（50μl 、BSA
を1%含む液で希釈）は別の試験管で37℃１時間反応させ
てある。この混合溶液をウエルに加えてさらに37℃１時
間反応させた。抗体を含む液を除去し上記洗浄液で十分
にウエルを洗浄し、カッペル社の抗ウサギIgG(H+L)に実
施例２と同様の操作によりペルオキシダ−ゼを標識した
ものをバッファ−で希釈して各ウエルに加え37℃1 時間
反応させた。ペルオキシダ−ゼ標識抗ウサギIgG を含む
液を除去し上記洗浄液で十分にウエルを洗浄し、ペルオ
キシダ−ゼ基質溶液（ウエル1 個当たり100 μl ；0.14
M NaCl/10mM-リン酸バッファ−（PH=7.5）中0.25mMのオ
ルトフェニレンジアミンと0.01% 過酸化水素水）を加
え、発色させる。410nm での光学密度を、MR580 マイク
ロエリザ、オ−ト、リ−ダ−（ダイナテック製）を用い
て測定した。結果を下記表３に示す。
【００２６】実施例７ 競合法を行うためにマイクロタイタ−プレ−ト（96穴）
のウエルに3DHP-pep（上記式［Ｉ］で示されるもの、以
下同じ）に対する抗体を被覆させた（4 ℃、一晩）。次
にこの液を ウエルから除き、洗浄液（0.14M NaCl/10m
M-リン酸バッファ−（PH=7.5）+0.1％Tween20 ）で1 回
洗浄した。3%BSA （ウシ血清アルブミン）を含むPBS 溶
液でウエルを満たし37℃１時間放置した。BSA 溶液を除
去したあと上記洗浄液でウエルを洗浄した。あらかじめ
混合してプレインキュベ−トしてあるサンプルとペルオ
キシダ−ゼ標識抗原（3DHP-pep）+0.14M NaCl/10mM- リ
ン酸バッファ−（PH=7.5）をウエルに添加し37℃1 時間
反応させた。標識抗原溶液を除去し上記洗浄液で十分に
ウエルを洗浄し、ペルオキシダ−ゼ基質溶液（ウエル1
個当たり100 μl ；0.14M NaCl/10mM-リン酸バッファ−
（PH=7.5）中0.25mMのオルトフェニレンジアミンと0.01
% 過酸化水素水）を加え、発色させた。410nm での光学
密度を、MR580 マイクロエリザ、オ−ト、リ−ダ−（ダ
イナテック製）を用いて測定した。結果を下記表４に示
す。
のウエルに3DHP-pep（上記式［Ｉ］で示されるもの、以
下同じ）に対する抗体を被覆させた（4 ℃、一晩）。次
にこの液を ウエルから除き、洗浄液（0.14M NaCl/10m
M-リン酸バッファ−（PH=7.5）+0.1％Tween20 ）で1 回
洗浄した。3%BSA （ウシ血清アルブミン）を含むPBS 溶
液でウエルを満たし37℃１時間放置した。BSA 溶液を除
去したあと上記洗浄液でウエルを洗浄した。あらかじめ
混合してプレインキュベ−トしてあるサンプルとペルオ
キシダ−ゼ標識抗原（3DHP-pep）+0.14M NaCl/10mM- リ
ン酸バッファ−（PH=7.5）をウエルに添加し37℃1 時間
反応させた。標識抗原溶液を除去し上記洗浄液で十分に
ウエルを洗浄し、ペルオキシダ−ゼ基質溶液（ウエル1
個当たり100 μl ；0.14M NaCl/10mM-リン酸バッファ−
（PH=7.5）中0.25mMのオルトフェニレンジアミンと0.01
% 過酸化水素水）を加え、発色させた。410nm での光学
密度を、MR580 マイクロエリザ、オ−ト、リ−ダ−（ダ
イナテック製）を用いて測定した。結果を下記表４に示
す。
【００２７】
【表１】
【００２８】
【表２】
【００２９】
【表３】
【００３０】
【表４】
【００３１】これらの結果から競合法、インヒビション
アッセイともに3DHP,3DHP-pep の値が測定可能であるこ
とが示された。
アッセイともに3DHP,3DHP-pep の値が測定可能であるこ
とが示された。
【００３２】
【発明の効果】本発明により、生体試料中の３ＤＰ若し
くはその置換体又はその残基を有するコラ−ゲン断片を
簡便な操作で感度良く測定する方法が提供された。本発
明により、骨粗鬆症を簡便、正確、迅速に行うことが可
能になる。
くはその置換体又はその残基を有するコラ−ゲン断片を
簡便な操作で感度良く測定する方法が提供された。本発
明により、骨粗鬆症を簡便、正確、迅速に行うことが可
能になる。
Claims (8)
- 【請求項１】 抗３−デオキシピリジノリン抗体又はそ
の抗原結合性断片と、３−デオキシピリジノリン若しく
はその置換体又はその残基を有するコラ−ゲン断片との
特異的結合を利用した免疫測定により、生体試料中に含
まれる３−デオキシピリジノリン若しくはその置換体又
はその残基を有するコラ−ゲン断片を測定する方法。 - 【請求項２】 生体試料が尿である請求項１記載の方
法。 - 【請求項３】 被測定物質と標識物質を結合させたコン
ジュゲ−トを用いる請求項１又は２記載の方法。 - 【請求項４】 請求項３記載のコンジュゲ−トと生体試
料中の被測定物質との両者に結合しうる特異的な抗体と
を用いる請求項１又は２記載の方法。 - 【請求項５】 被測定物質に特異的に結合する抗体と標
識物質が結合したコンジュゲ−トを用いる請求項１又は
２記載の方法。 - 【請求項６】 上記請求項５記載のコンジュゲ−トと生
体試料中の被測定物質とを特異的に結合させ過剰のコン
ジュゲ−トを分離するために固定化してある被測定物質
に特異的に結合させる工程を含む請求項１又は２記載の
方法。 - 【請求項７】 標識物質が酵素である請求項３ないし６
のいずれか１項に記載の試験方法。 - 【請求項８】 請求項１ないし７のいずれか１項に記載
の方法を行うためのキット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32884692A JPH06148183A (ja) | 1992-11-12 | 1992-11-12 | ３−デオキシピリジノリン若しくはその置換体又はその残基を有するコラーゲン断片を測定する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32884692A JPH06148183A (ja) | 1992-11-12 | 1992-11-12 | ３−デオキシピリジノリン若しくはその置換体又はその残基を有するコラーゲン断片を測定する方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06148183A true JPH06148183A (ja) | 1994-05-27 |
Family
ID=18214746
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP32884692A Pending JPH06148183A (ja) | 1992-11-12 | 1992-11-12 | ３−デオキシピリジノリン若しくはその置換体又はその残基を有するコラーゲン断片を測定する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06148183A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0915339A3 (en) * | 1997-11-09 | 2001-03-28 | Bayer Corporation | Method and device for the detection of analyte in a fluid sample |
-
1992
- 1992-11-12 JP JP32884692A patent/JPH06148183A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0915339A3 (en) * | 1997-11-09 | 2001-03-28 | Bayer Corporation | Method and device for the detection of analyte in a fluid sample |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2802751B2 (ja) | 骨吸収速度測定方法 | |
| Ohkaru et al. | Development of a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of human heart type fatty acid-binding protein in plasma and urine by using two different monoclonal antibodies specific for human heart fatty acid-binding protein | |
| RU2139541C1 (ru) | Способы определения разрушения коллагена in vivo и наборы для осуществления способов, гибридома, моноклональное антитело и его фрагмент, пептиды, происходящие из коллагена, и способ анализа | |
| AU594651B2 (en) | Immunoassays for protein analytes, particularly HB A1c, involving sample denaturation | |
| US6689566B1 (en) | Methods, kits, and antibodies for detecting parathyroid hormone | |
| JPH0588421B2 (ja) | ||
| JPH09509736A (ja) | 体液中のコラーゲン断片を測定する方法、該方法を実施するためのテストキット及び手段、並びにコラーゲンの代謝に関連する疾患の存在を診断するために該方法を使用する方法・用途 | |
| JP2789306B2 (ja) | インスリン様成長因子の免疫学的測定方法ならびにインスリン様成長因子測定用キット | |
| Lowey et al. | An immunochemical approach to the structure of myosin and the thick filament | |
| US6210902B1 (en) | Estimation of the fragmentation pattern of collagen in body fluids and the diagnosis of disorders associated with the metabolism of collagen | |
| JP3137676B2 (ja) | Ｉ型プロコラーゲンのｃ末端プロペプチドの免疫学的定量法 | |
| PL177771B1 (pl) | Linie komórek hybrydoma i preparaty przeciwciał | |
| JPH01503331A (ja) | モノカインの検査法 | |
| JP3224356B2 (ja) | ヒトおよび動物における骨および結合組織の疾患を検出する方法 | |
| SK374392A3 (en) | Method of determination of concentration of different matters | |
| CA2274776C (en) | Method for analyzing annexin v in urine and use thereof | |
| JPH05501157A (ja) | 付着性タンパク質に対するリガンド／抗リガンドアッセイ法 | |
| AU653536B2 (en) | Measuring non-dystrophin proteins and diagnosing muscular dystrophy | |
| JP3053503B2 (ja) | 骨ぜい弱性と骨粗しょう症骨折の危険性の検査方法 | |
| NO175639B (ja) | ||
| JPH10507266A (ja) | 体液中のコラーゲンの断片化パターンの評価とコラーゲンの代謝に関連する疾患の診断 | |
| JP3245052B2 (ja) | Ｉ型プロコラーゲンのアミノ末端プロペプチドに対する抗体およびそれを用いるアッセイ法 | |
| Livaniou et al. | A thymosin β4 ELISA using an antibody against the N terminal fragment thymosin β4 [1–14] | |
| JPH06148183A (ja) | ３−デオキシピリジノリン若しくはその置換体又はその残基を有するコラーゲン断片を測定する方法 | |
| JPH06201695A (ja) | リジルピリジノリン、２’−ヒドロキシリジルピリジノリン若しくはこれらの置換体又はこれらの残基を有するコラーゲン断片の測定方法 |