JPH06201695A - リジルピリジノリン、２’−ヒドロキシリジルピリジノリン若しくはこれらの置換体又はこれらの残基を有するコラーゲン断片の測定方法 - Google Patents
リジルピリジノリン、２’−ヒドロキシリジルピリジノリン若しくはこれらの置換体又はこれらの残基を有するコラーゲン断片の測定方法Info
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- JPH06201695A JPH06201695A JP5307398A JP30739893A JPH06201695A JP H06201695 A JPH06201695 A JP H06201695A JP 5307398 A JP5307398 A JP 5307398A JP 30739893 A JP30739893 A JP 30739893A JP H06201695 A JPH06201695 A JP H06201695A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 リジルピリジノリン若しくは２’−ヒドロキ
シリジルピリジノリン又はこれらの残基を有するコラ−
ゲン断片を簡便な操作で、かつ、感度良く測定する方法
を提供すること。 【構成】 抗リジルピリジノリン抗体若しくは抗２’-
ヒドロキシリジルピリジノリン抗体又はこれらの抗原結
合性断片と、リジルピリジノリン、２’- ヒドロキシリ
ジルピリジノリン若しくはこれらの置換体又はこれらの
残基を有するコラ−ゲン断片との特異的結合を利用した
免疫学的方法により、生体試料中に含まれるリジルピリ
ジノリン、２’- ヒドロキシリジルピリジノリン若しく
はこれらの置換体又はこれらの残基を有するコラ−ゲン
断片を測定する方法を提供した。
シリジルピリジノリン又はこれらの残基を有するコラ−
ゲン断片を簡便な操作で、かつ、感度良く測定する方法
を提供すること。 【構成】 抗リジルピリジノリン抗体若しくは抗２’-
ヒドロキシリジルピリジノリン抗体又はこれらの抗原結
合性断片と、リジルピリジノリン、２’- ヒドロキシリ
ジルピリジノリン若しくはこれらの置換体又はこれらの
残基を有するコラ−ゲン断片との特異的結合を利用した
免疫学的方法により、生体試料中に含まれるリジルピリ
ジノリン、２’- ヒドロキシリジルピリジノリン若しく
はこれらの置換体又はこれらの残基を有するコラ−ゲン
断片を測定する方法を提供した。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、生体試料中のリジルピ
リジノリン若しくは２’- ヒドロキシリジルピリジノリ
ン又はこれらの置換体を有するコラ−ゲン断片の測定方
法に関する。本発明の方法は、骨粗鬆症の診断に有用で
ある。
リジノリン若しくは２’- ヒドロキシリジルピリジノリ
ン又はこれらの置換体を有するコラ−ゲン断片の測定方
法に関する。本発明の方法は、骨粗鬆症の診断に有用で
ある。
【０００２】
【従来の技術】骨粗鬆症とは骨密度が低下し、骨内部が
スカスカになり、もろくなる病気のことである。人体は
常に、骨を作ったり、壊したりしており、そのバランス
が保たれている間は強い骨が維持されているが老化など
により、そのバランスが崩れたりした時には、骨粗鬆症
になる恐れがある。病因としては主に加齢という生理現
象、女性ホルモンの欠乏、その他ホルモンの変化、ビタ
ミンD 、カルシウム、蛋白質の摂取不足、運動不足など
の多因子が挙げられる。この症状の特徴は、加齢という
生理現象を背景に発症するケ−スが主であり生化学的及
び内分泌学的検査所見もほとんどが生理的変動範囲内の
変化である事が多いため、異常が認められず、早期発見
が遅れる。骨粗鬆症は、最近、社会の高齢化、食生活の
変化などにより若年層にも発生するケ−スが増加してお
り日本での現在の推定患者数は800〜900 万人と言われ
ており、今後、増加するのは確実である。
スカスカになり、もろくなる病気のことである。人体は
常に、骨を作ったり、壊したりしており、そのバランス
が保たれている間は強い骨が維持されているが老化など
により、そのバランスが崩れたりした時には、骨粗鬆症
になる恐れがある。病因としては主に加齢という生理現
象、女性ホルモンの欠乏、その他ホルモンの変化、ビタ
ミンD 、カルシウム、蛋白質の摂取不足、運動不足など
の多因子が挙げられる。この症状の特徴は、加齢という
生理現象を背景に発症するケ−スが主であり生化学的及
び内分泌学的検査所見もほとんどが生理的変動範囲内の
変化である事が多いため、異常が認められず、早期発見
が遅れる。骨粗鬆症は、最近、社会の高齢化、食生活の
変化などにより若年層にも発生するケ−スが増加してお
り日本での現在の推定患者数は800〜900 万人と言われ
ており、今後、増加するのは確実である。
【０００３】骨粗鬆症の診断は生化学. 内分泌検査、骨
萎縮度測定法、骨密度定量法、組織学的検査などがある
が確定診断には骨密度測定法だけが使われている。この
骨密度測定法とは、光子吸収法（DEXA：２種の異なるエ
ネルギ−のX 線を用いる方法）であり、正確な診断が可
能であるが装置が特殊設備を要しかつ、高額であるため
普及には限界がある。
萎縮度測定法、骨密度定量法、組織学的検査などがある
が確定診断には骨密度測定法だけが使われている。この
骨密度測定法とは、光子吸収法（DEXA：２種の異なるエ
ネルギ−のX 線を用いる方法）であり、正確な診断が可
能であるが装置が特殊設備を要しかつ、高額であるため
普及には限界がある。
【０００４】そこで最近、骨粗鬆症のマ−カ−として尿
中ピリジノリン及びその誘導体が注目されている。この
物質を同定、定量するには尿中からまず大きなタンパク
質を除きその後、高速液体クロマトグラフィ−で分離、
同定するなどの非常に煩雑な分析方法があるが、これは
一般検査では非常に測定時間の無駄であり、同じ装置で
同時に何十検体も測定が不可能であり、精度にも問題が
ある。このため本発明ではこれらの問題点を克服するた
めに、これらの物質を免疫学的に測定する測定方法に関
するものである。
中ピリジノリン及びその誘導体が注目されている。この
物質を同定、定量するには尿中からまず大きなタンパク
質を除きその後、高速液体クロマトグラフィ−で分離、
同定するなどの非常に煩雑な分析方法があるが、これは
一般検査では非常に測定時間の無駄であり、同じ装置で
同時に何十検体も測定が不可能であり、精度にも問題が
ある。このため本発明ではこれらの問題点を克服するた
めに、これらの物質を免疫学的に測定する測定方法に関
するものである。
【０００５】ピリジノリンと総称されるものにはリジル
ピリジノリン（LP）、2 ’- ヒドロキシリジルピリジノ
リン（HP）及び3-デオキシピリジノリン（DP）の３種類
並びにこれらを含むコラ−ゲン断片が尿中には存在す
る。前記２種類は自然蛍光を持っているため蛍光検出器
を備えたHPLCで測定すれば測定は可能であるが高速液体
クロマトグラフィ−では測定にかなり技術を要する。
ピリジノリン（LP）、2 ’- ヒドロキシリジルピリジノ
リン（HP）及び3-デオキシピリジノリン（DP）の３種類
並びにこれらを含むコラ−ゲン断片が尿中には存在す
る。前記２種類は自然蛍光を持っているため蛍光検出器
を備えたHPLCで測定すれば測定は可能であるが高速液体
クロマトグラフィ−では測定にかなり技術を要する。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、リジルピリジノリン若しくは２’−ヒドロキシリジ
ルピリジノリン又はこれらの残基を有するコラ−ゲン断
片を簡便な操作で、かつ、感度良く測定する方法を提供
することである。
は、リジルピリジノリン若しくは２’−ヒドロキシリジ
ルピリジノリン又はこれらの残基を有するコラ−ゲン断
片を簡便な操作で、かつ、感度良く測定する方法を提供
することである。
【０００７】本願発明者らは、鋭意研究の結果、これら
の物質を免疫学的に測定することに成功し、本発明を完
成した。
の物質を免疫学的に測定することに成功し、本発明を完
成した。
【０００８】すなわち、本発明は、抗リジルピリジノリ
ン抗体若しくは抗２’- ヒドロキシリジルピリジノリン
抗体又はこれらの抗原結合性断片と、リジルピリジノリ
ン、２’- ヒドロキシリジルピリジノリン若しくはこれ
らの置換体又はこれらの残基を有するコラ−ゲン断片と
の特異的結合を利用した免疫学的方法により、生体試料
中に含まれるリジルピリジノリン、２’- ヒドロキシリ
ジルピリジノリン若しくはこれらの置換体又はこれらの
残基を有するコラ−ゲン断片を測定する方法を提供す
る。
ン抗体若しくは抗２’- ヒドロキシリジルピリジノリン
抗体又はこれらの抗原結合性断片と、リジルピリジノリ
ン、２’- ヒドロキシリジルピリジノリン若しくはこれ
らの置換体又はこれらの残基を有するコラ−ゲン断片と
の特異的結合を利用した免疫学的方法により、生体試料
中に含まれるリジルピリジノリン、２’- ヒドロキシリ
ジルピリジノリン若しくはこれらの置換体又はこれらの
残基を有するコラ−ゲン断片を測定する方法を提供す
る。
【０００９】以下、本発明をさらに詳細に説明する。
【００１０】本発明の方法により測定されるものは、リ
ジルピリジノリン（ＬＰ）、ヒドロキシリジルピリジノ
リン（ＨＰ）、グリコシル化誘導体のようなこれらの置
換体、及びこれらの残基を含むコラーゲン断片である。
尿中に含まれる、リジルピリジノリン残基含有コラーゲ
ン断片は、下記式［Ｉ］又は［II］で示されるものに代
表される、ＬＰ又はＨＰがアミノ酸鎖の一部で置換され
たものである。
ジルピリジノリン（ＬＰ）、ヒドロキシリジルピリジノ
リン（ＨＰ）、グリコシル化誘導体のようなこれらの置
換体、及びこれらの残基を含むコラーゲン断片である。
尿中に含まれる、リジルピリジノリン残基含有コラーゲ
ン断片は、下記式［Ｉ］又は［II］で示されるものに代
表される、ＬＰ又はＨＰがアミノ酸鎖の一部で置換され
たものである。
【００１１】
【化１】
【００１２】
【化２】 ただし、式［Ｉ］及び［II］において、PYN はリジルピ
リジノン又はヒドロキシリジルピリジノン残基を示し、
Gln はグルタミン又は完全に環化したピロリドンカルボ
ン酸を示す。
リジノン又はヒドロキシリジルピリジノン残基を示し、
Gln はグルタミン又は完全に環化したピロリドンカルボ
ン酸を示す。
【００１３】また、尿中に含まれるＬＰ又はＨＰのグリ
コシル化置換体は、下記式［III]又は［IV］で示される
ものに代表される、リジル基のＯＨ部分がグリコシル化
されたものを包含する。
コシル化置換体は、下記式［III]又は［IV］で示される
ものに代表される、リジル基のＯＨ部分がグリコシル化
されたものを包含する。
【００１４】
【化３】
【００１５】
【化４】
【００１６】以下、本発明の方法を実施するための手順
を順を追って説明するが、下記に示すものは好ましい態
様であり、本発明は下記に示す態様に限定されるもので
はない。
を順を追って説明するが、下記に示すものは好ましい態
様であり、本発明は下記に示す態様に限定されるもので
はない。
【００１７】尿中ピリジノリン架橋断片の単離方法 高濃度のピリジノリン架橋物質を含む尿試料をペ−ジェ
ト病患者、副甲状線機能亢進症患者の尿より採取する。
早朝尿1000ml程度を元の量の1/10程度に濃縮し、0.2M酢
酸を溶離液としてセファデックスＧ25（ファルマシア社
製）（3 ｘ100ｃｍ）を用いて蛍光スペクトルを測定
し、ピリジノリン架橋断片部分を画分し、凍結乾燥す
る。上記画分をＤＥＡＥ−５ＤＷカラム（東ソー社製）
（7.5 mm x 7.5 cm)を用いて陰イオン交換クロマトグラ
フィ−で１０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを含む０．０
２Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中ＮａＣｌ（０→
０．２Ｍ）の勾配で溶離し、精製する。さらにそれをセ
ファデックスＧ10のカラムで脱塩し、凍結乾燥し、最終
精製はTSK ODS-120T（東ソー社製）（4.6 ｘ25ｃｍ）
による逆相HPLCで行い0.1 ％ヘプタフルオロ酪酸および
15〜30％の直線勾配濃度のアセトニトリルで30分間溶出
させ、リジルピリジノリン、2 ’- デオキシピリジノリ
ン架橋断片を単離する。このピリジノリン架橋断片を6M
HClで加水分解し再度、同様の操作を行いピリジノリン
部分を1H-NMR,13C-NMRで構造を同定し、アミノ酸部分に
ついてはアミノ酸分析計で構造決定をおこなった。HP,L
P を単離するためには尿を６M HCl と混合し105 〜110
℃で24時間加水分解した後エバポレ−タで脱塩、濃縮し
た後、遠心分離し、上清を上記同様の操作（セファデッ
クスＧ−２５のかわりにセファデックスＧ−１０、陰イ
オン交換カラムの代わりに陽イオン交換カラムを使用）
により得られる。また、尿のかわりに牛アキレス腱コラ
ーゲンを用いても、同様の方法でＨＰ、ＬＰが単離でき
る。
ト病患者、副甲状線機能亢進症患者の尿より採取する。
早朝尿1000ml程度を元の量の1/10程度に濃縮し、0.2M酢
酸を溶離液としてセファデックスＧ25（ファルマシア社
製）（3 ｘ100ｃｍ）を用いて蛍光スペクトルを測定
し、ピリジノリン架橋断片部分を画分し、凍結乾燥す
る。上記画分をＤＥＡＥ−５ＤＷカラム（東ソー社製）
（7.5 mm x 7.5 cm)を用いて陰イオン交換クロマトグラ
フィ−で１０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを含む０．０
２Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中ＮａＣｌ（０→
０．２Ｍ）の勾配で溶離し、精製する。さらにそれをセ
ファデックスＧ10のカラムで脱塩し、凍結乾燥し、最終
精製はTSK ODS-120T（東ソー社製）（4.6 ｘ25ｃｍ）
による逆相HPLCで行い0.1 ％ヘプタフルオロ酪酸および
15〜30％の直線勾配濃度のアセトニトリルで30分間溶出
させ、リジルピリジノリン、2 ’- デオキシピリジノリ
ン架橋断片を単離する。このピリジノリン架橋断片を6M
HClで加水分解し再度、同様の操作を行いピリジノリン
部分を1H-NMR,13C-NMRで構造を同定し、アミノ酸部分に
ついてはアミノ酸分析計で構造決定をおこなった。HP,L
P を単離するためには尿を６M HCl と混合し105 〜110
℃で24時間加水分解した後エバポレ−タで脱塩、濃縮し
た後、遠心分離し、上清を上記同様の操作（セファデッ
クスＧ−２５のかわりにセファデックスＧ−１０、陰イ
オン交換カラムの代わりに陽イオン交換カラムを使用）
により得られる。また、尿のかわりに牛アキレス腱コラ
ーゲンを用いても、同様の方法でＨＰ、ＬＰが単離でき
る。
【００１８】免疫学的測定法 ＬＰ又はＨＰに対して特異的なモノクロ−ナル抗体およ
びポリクロ−ナル抗体は公知の方法によって作られる。
例えばキャンベル（Campbell,A,M）著、（1986）”生物
学および分子生物学における実験技術（Laboratory Tec
hniques in Biochemistry and Molecular Biology ）”
13巻、を参照。上記ＨＰ又はＬＰ残基を有する架橋コラ
ーゲン断片に対する抗体をつくることは可能であるがこ
れらの架橋断片の分子量はせいぜい5000以下であるか
ら、これらを担体分子に結合させることが好ましい。適
した担体分子としてはウシ血清アルブミン、卵アルブミ
ンなどがあげられるがこれに限られるわけではない。ま
た、これらの抗体の抗原結合性断片（Ｆａｂ断片及びＦ
（ａｂ’）2 断片）も用いることができる。なお、上記
架橋コラーゲン断片を担体に結合したものを免疫原とし
て抗血清を調製した場合、ＬＰ又はＨＰに特異的に結合
する抗体を選択することは、これらを固定したカラムに
抗血清を通過させ、吸着したものを採取することにより
行うことができる。この操作の詳細は下記実施例に記載
されている。
びポリクロ−ナル抗体は公知の方法によって作られる。
例えばキャンベル（Campbell,A,M）著、（1986）”生物
学および分子生物学における実験技術（Laboratory Tec
hniques in Biochemistry and Molecular Biology ）”
13巻、を参照。上記ＨＰ又はＬＰ残基を有する架橋コラ
ーゲン断片に対する抗体をつくることは可能であるがこ
れらの架橋断片の分子量はせいぜい5000以下であるか
ら、これらを担体分子に結合させることが好ましい。適
した担体分子としてはウシ血清アルブミン、卵アルブミ
ンなどがあげられるがこれに限られるわけではない。ま
た、これらの抗体の抗原結合性断片（Ｆａｂ断片及びＦ
（ａｂ’）2 断片）も用いることができる。なお、上記
架橋コラーゲン断片を担体に結合したものを免疫原とし
て抗血清を調製した場合、ＬＰ又はＨＰに特異的に結合
する抗体を選択することは、これらを固定したカラムに
抗血清を通過させ、吸着したものを採取することにより
行うことができる。この操作の詳細は下記実施例に記載
されている。
【００１９】標識は放射性ラベル例えば125Iまたは蛍光
ラベル例えばフルオレセインイソチオシアネ−トもしく
はロ−ダミンでもよい。磁性物質、または、常磁性元素
Fe,Cu,Mn,Gd または造形物質例えば、131In のごとき放
射性核種を標識として使用してもよい。また、西洋ワサ
ビペルオキシダ−ゼのような酵素でもよいがこれに限ら
れるわけではない。コンジュゲ−トとは標識物質と抗体
又は、標識物質と抗原および抗原類似物質の結合物質こ
とであり、アビジン- ビオチン等を介して標識化するこ
とも可能である。またこれらの物質の結合にはグルタル
アルデヒド法、過ヨ−ソ酸法、マレイミド法、ピリジル
ジスルフィド法（酵素免疫測定法：石川栄治ら、医学書
院）などが挙げられる。測定法としては抗原様物質を固
定化して標識抗体を用いたインヒビションアッセイ、抗
体を固定化して標識抗原と試料を競合させる競合法、２
抗体法などいずれの公知の方法でもよい。
ラベル例えばフルオレセインイソチオシアネ−トもしく
はロ−ダミンでもよい。磁性物質、または、常磁性元素
Fe,Cu,Mn,Gd または造形物質例えば、131In のごとき放
射性核種を標識として使用してもよい。また、西洋ワサ
ビペルオキシダ−ゼのような酵素でもよいがこれに限ら
れるわけではない。コンジュゲ−トとは標識物質と抗体
又は、標識物質と抗原および抗原類似物質の結合物質こ
とであり、アビジン- ビオチン等を介して標識化するこ
とも可能である。またこれらの物質の結合にはグルタル
アルデヒド法、過ヨ−ソ酸法、マレイミド法、ピリジル
ジスルフィド法（酵素免疫測定法：石川栄治ら、医学書
院）などが挙げられる。測定法としては抗原様物質を固
定化して標識抗体を用いたインヒビションアッセイ、抗
体を固定化して標識抗原と試料を競合させる競合法、２
抗体法などいずれの公知の方法でもよい。
【００２０】
【実施例】実施例１ 抗血清（ウサギ）の作成、精製法 ＨＰ、ＬＰを前述の単離法に従い単離した後、N-エチル
-N'-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイ
ドロクロライドを用いて卵白アルブミンに結合させフロ
イント完全アジュバントによりエマルジョン化した。上
記免疫原（HP,LP ）を四肢指の皮内16ケ所および背部皮
内数ケ所に注射した。３週後に補助注射として上記免疫
原を1/5 〜1/10程度に希釈したものを2ml 静脈に注射、
10日後に試験採取して、免疫電気泳動法で検討した。Ig
G,IgM,IgA および補体のβ1CA の沈降線が明瞭に認めら
れた。つぎにIgG の精製として硫酸ソ−ダによる塩析で
IgG 画分を沈殿させ混在する他のタンパクを除くために
DEAEセルロ−スカラムに通すことによって素通り画分に
高純度なIgG が得られた。さらに抗体の精製をおこなう
ためにアフィニテイ−クロマトグラフィ−をおこなっ
た。HP,LP 両者に特異的に結合する抗体を得るために
は、HPで免疫をかけて得られたIgG をLPを結合させたア
フィニテイ−クロマトグラフィ−にかけて回収した。HP
のみに特異的に結合する抗体を得るためには、上記のア
フィニテイ−クロマトグラフィ−を素通りしてきた液を
HPを結合させたアフィニテイ−クロマトグラフィ−にか
け、結合したIgG を回収した。LPのみに特異的に結合す
る抗体を得るにも同様の操作を行ない、手順は以下のよ
うに行った。それぞれ精製した抗原30mgを2ml のcoupli
ng buffer(NaHCO3 4.2g, NaCl 29g を水で1000mlにす
る。PH=8.3) に溶解して洗浄したCNBr-Sepharose 2g を
18mlのcoupling buffer に加え室温で2 時間振とうす
る。これを遠心管に移し2000rpm で遠心し、上清を捨
て、グリシン-HCl 緩衝液で2 回洗い、最後にグリシン
-HCl緩衝液に懸濁して、一晩氷室におき、残存する活性
基をブッロックする。次にcoupling buffer で洗い、0.
1M酢酸緩衝液（PH=4.0）で洗う。この操作を2 回繰り返
す。こうして作成した不溶性抗原をカラムにつめcoupli
ng buffer 約30mlを流し洗浄したあと、IgG 画分をカラ
ムに吸着させる。coupling buffer 約70mlを流してカラ
ムを洗浄する。グリシン-HCl 緩衝液を流し溶出させす
べて試験管にとる。（2 〜3ml ずつ）各試験管ごとに0.
1 ＮNaOH を注意深く加えて、PHを中性にし吸光度（28
0nm ）を測定し、タンパク質陽性の画分をすべてプ−ル
して濃縮する。PBS 透析後、遠心して、不溶性のものを
除き、所定の濃度にする。こうしてHP+LP,HPのみ、LPの
みの抗体を作成した。同様にしてHP-pep、LP-pep（前記
式［Ｉ］で示される構造を有するもの）に特異的に結合
する抗体を得た。
-N'-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイ
ドロクロライドを用いて卵白アルブミンに結合させフロ
イント完全アジュバントによりエマルジョン化した。上
記免疫原（HP,LP ）を四肢指の皮内16ケ所および背部皮
内数ケ所に注射した。３週後に補助注射として上記免疫
原を1/5 〜1/10程度に希釈したものを2ml 静脈に注射、
10日後に試験採取して、免疫電気泳動法で検討した。Ig
G,IgM,IgA および補体のβ1CA の沈降線が明瞭に認めら
れた。つぎにIgG の精製として硫酸ソ−ダによる塩析で
IgG 画分を沈殿させ混在する他のタンパクを除くために
DEAEセルロ−スカラムに通すことによって素通り画分に
高純度なIgG が得られた。さらに抗体の精製をおこなう
ためにアフィニテイ−クロマトグラフィ−をおこなっ
た。HP,LP 両者に特異的に結合する抗体を得るために
は、HPで免疫をかけて得られたIgG をLPを結合させたア
フィニテイ−クロマトグラフィ−にかけて回収した。HP
のみに特異的に結合する抗体を得るためには、上記のア
フィニテイ−クロマトグラフィ−を素通りしてきた液を
HPを結合させたアフィニテイ−クロマトグラフィ−にか
け、結合したIgG を回収した。LPのみに特異的に結合す
る抗体を得るにも同様の操作を行ない、手順は以下のよ
うに行った。それぞれ精製した抗原30mgを2ml のcoupli
ng buffer(NaHCO3 4.2g, NaCl 29g を水で1000mlにす
る。PH=8.3) に溶解して洗浄したCNBr-Sepharose 2g を
18mlのcoupling buffer に加え室温で2 時間振とうす
る。これを遠心管に移し2000rpm で遠心し、上清を捨
て、グリシン-HCl 緩衝液で2 回洗い、最後にグリシン
-HCl緩衝液に懸濁して、一晩氷室におき、残存する活性
基をブッロックする。次にcoupling buffer で洗い、0.
1M酢酸緩衝液（PH=4.0）で洗う。この操作を2 回繰り返
す。こうして作成した不溶性抗原をカラムにつめcoupli
ng buffer 約30mlを流し洗浄したあと、IgG 画分をカラ
ムに吸着させる。coupling buffer 約70mlを流してカラ
ムを洗浄する。グリシン-HCl 緩衝液を流し溶出させす
べて試験管にとる。（2 〜3ml ずつ）各試験管ごとに0.
1 ＮNaOH を注意深く加えて、PHを中性にし吸光度（28
0nm ）を測定し、タンパク質陽性の画分をすべてプ−ル
して濃縮する。PBS 透析後、遠心して、不溶性のものを
除き、所定の濃度にする。こうしてHP+LP,HPのみ、LPの
みの抗体を作成した。同様にしてHP-pep、LP-pep（前記
式［Ｉ］で示される構造を有するもの）に特異的に結合
する抗体を得た。
【００２１】実施例２ 抗体の標識化 過ヨウ素酸法によるIgG のペルオキシダ−ゼ標識”酵素
免疫測定法”作製法に準じて標識抗体を作成した。
免疫測定法”作製法に準じて標識抗体を作成した。
【００２２】実施例３ 抗原の標識化 過ヨウ素酸酸化法によるペルオキシダ−ゼのペプチド分
子への標識法”酵素免疫測定法”の作製法に準じて標識
抗原を作成した。
子への標識法”酵素免疫測定法”の作製法に準じて標識
抗原を作成した。
【００２３】実施例４ インヒビションアッセイを行うためにマイクロタイタ−
プレ−ト（96穴）のウエルに実施例１の中にある方法と
同様にして作成したHP−牛血清アルブミン、LP−牛血清
アルブミンを１：１の比で混合させたものを被覆させた
（4 ℃、一晩）。次にこの液をウエルから除き、洗浄液
（0.14M NaCl/10mM-リン酸バッファ−（PH=7.5）+0.1％
Tween20 ）で１回洗浄する。3%BSA （ウシ血清アルブミ
ン）を含むPBS 溶液でウエルを満たし37℃１時間放置す
る。BSA 溶液を除去したあと上記洗浄液でウエルを洗浄
した。ＨＰ及びＬＰが既知濃度の尿とHP+LP に対するペ
ルオキシダ−ゼ標識抗体を含む液（50μl 、BSA を1%含
む液で希釈）は別の試験管で37℃１時間反応させてあ
る。この混合溶液をウエルに加えてさらに37℃１時間反
応させた。ペルオキシダ−ゼ標識抗体を含む液を除去し
上記洗浄液で十分にウエルを洗浄し、ペルオキシダ−ゼ
基質溶液（ウエル1 個当たり100 μl ；0.14MNaCl/10mM
-リン酸バッファ−（PH=7.5）中0.25mMのオルトフェニ
レンジアミンと0.01% 過酸化水素水）を加え、発色させ
た。410nm での光学密度を、MR580 マイクロエリザ、オ
−ト、リ−ダ−（ダイナテック製）を用いて測定した。
結果を下記表１に示す。
プレ−ト（96穴）のウエルに実施例１の中にある方法と
同様にして作成したHP−牛血清アルブミン、LP−牛血清
アルブミンを１：１の比で混合させたものを被覆させた
（4 ℃、一晩）。次にこの液をウエルから除き、洗浄液
（0.14M NaCl/10mM-リン酸バッファ−（PH=7.5）+0.1％
Tween20 ）で１回洗浄する。3%BSA （ウシ血清アルブミ
ン）を含むPBS 溶液でウエルを満たし37℃１時間放置す
る。BSA 溶液を除去したあと上記洗浄液でウエルを洗浄
した。ＨＰ及びＬＰが既知濃度の尿とHP+LP に対するペ
ルオキシダ−ゼ標識抗体を含む液（50μl 、BSA を1%含
む液で希釈）は別の試験管で37℃１時間反応させてあ
る。この混合溶液をウエルに加えてさらに37℃１時間反
応させた。ペルオキシダ−ゼ標識抗体を含む液を除去し
上記洗浄液で十分にウエルを洗浄し、ペルオキシダ−ゼ
基質溶液（ウエル1 個当たり100 μl ；0.14MNaCl/10mM
-リン酸バッファ−（PH=7.5）中0.25mMのオルトフェニ
レンジアミンと0.01% 過酸化水素水）を加え、発色させ
た。410nm での光学密度を、MR580 マイクロエリザ、オ
−ト、リ−ダ−（ダイナテック製）を用いて測定した。
結果を下記表１に示す。
【００２４】実施例５ 競合法を行うためにマイクロタイタ−プレ−ト（96穴）
のウエルにHP+LP に対する抗体を被覆させた（4 ℃、一
晩）。次にこの液をウエルから除き、洗浄液（0.14M Na
Cl/10mM-リン酸バッファ−（PH=7.5）+0.1％Tween20 ）
で１回洗浄した。3%BSA （ウシ血清アルブミン）を含む
PBS 溶液でウエルを満たし37℃１時間放置した。BSA 溶
液を除去したあと上記洗浄液でウエルを洗浄した。あら
かじめ混合してプレインキュベ−トしてあるＨＰ及びＬ
Ｐが既知濃度の尿とペルオキシダ−ゼ標識抗原（HP:LP=
3.5:1 ）+0.14M NaCl/10mM- リン酸バッファ−（PH=7.
5）をウエルに添加し37℃1 時間反応させた。標識抗原
溶液を除去し上記洗浄液で十分にウエルを洗浄し、ペル
オキシダ−ゼ基質溶液（ウエル1 個当たり100 μl ；0.
14M NaCl/10mM-リン酸バッファ−（PH=7.5）中0.25mMの
オルトフェニレンジアミンと0.01% 過酸化水素水）を加
え、発色させた。410nm での光学密度を、MR580 マイク
ロエリザ、オ−ト、リ−ダ−（ダイナテック製）を用い
て測定した。結果を下記表２に示す。
のウエルにHP+LP に対する抗体を被覆させた（4 ℃、一
晩）。次にこの液をウエルから除き、洗浄液（0.14M Na
Cl/10mM-リン酸バッファ−（PH=7.5）+0.1％Tween20 ）
で１回洗浄した。3%BSA （ウシ血清アルブミン）を含む
PBS 溶液でウエルを満たし37℃１時間放置した。BSA 溶
液を除去したあと上記洗浄液でウエルを洗浄した。あら
かじめ混合してプレインキュベ−トしてあるＨＰ及びＬ
Ｐが既知濃度の尿とペルオキシダ−ゼ標識抗原（HP:LP=
3.5:1 ）+0.14M NaCl/10mM- リン酸バッファ−（PH=7.
5）をウエルに添加し37℃1 時間反応させた。標識抗原
溶液を除去し上記洗浄液で十分にウエルを洗浄し、ペル
オキシダ−ゼ基質溶液（ウエル1 個当たり100 μl ；0.
14M NaCl/10mM-リン酸バッファ−（PH=7.5）中0.25mMの
オルトフェニレンジアミンと0.01% 過酸化水素水）を加
え、発色させた。410nm での光学密度を、MR580 マイク
ロエリザ、オ−ト、リ−ダ−（ダイナテック製）を用い
て測定した。結果を下記表２に示す。
【００２５】実施例６ 競合法を行うためにマイクロタイタ−プレ−ト（96穴）
のウエルにHPに対する抗体を被覆させた（4 ℃、一
晩）。次にこの液を ウエルから除き、洗浄液（0.14M
NaCl/10mM-リン酸バッファ−（PH=7.5）+0.1％Tween20
）で1 回洗浄した。3%BSA （ウシ血清アルブミン）を
含むPBS 溶液でウエルを満たし37℃１時間放置した。BS
A 溶液を除去したあと上記洗浄液でウエルを洗浄した。
あらかじめ混合してプレインキュベ−トしてあるＨＰ及
びＬＰが既知の濃度の尿とペルオキシダ−ゼ標識抗原
（HP）+0.14M NaCl/10mM- リン酸バッファ−（PH=7.5）
をウエルに添加し37℃1 時間反応させた。標識抗原溶液
を除去し上記洗浄液で十分にウエルを洗浄し、ペルオキ
シダ−ゼ基質溶液（ウエル1 個当たり100 μl ；0.14M
NaCl/10mM-リン酸バッファ−（PH=7.5）中0.25mMのオル
トフェニレンジアミンと0.01% 過酸化水素水）を加え、
発色させた。410nm での光学密度を、MR580 マイクロエ
リザ、オ−ト、リ−ダ−（ダイナテック製）を用いて測
定した。結果を下記表３に示す。
のウエルにHPに対する抗体を被覆させた（4 ℃、一
晩）。次にこの液を ウエルから除き、洗浄液（0.14M
NaCl/10mM-リン酸バッファ−（PH=7.5）+0.1％Tween20
）で1 回洗浄した。3%BSA （ウシ血清アルブミン）を
含むPBS 溶液でウエルを満たし37℃１時間放置した。BS
A 溶液を除去したあと上記洗浄液でウエルを洗浄した。
あらかじめ混合してプレインキュベ−トしてあるＨＰ及
びＬＰが既知の濃度の尿とペルオキシダ−ゼ標識抗原
（HP）+0.14M NaCl/10mM- リン酸バッファ−（PH=7.5）
をウエルに添加し37℃1 時間反応させた。標識抗原溶液
を除去し上記洗浄液で十分にウエルを洗浄し、ペルオキ
シダ−ゼ基質溶液（ウエル1 個当たり100 μl ；0.14M
NaCl/10mM-リン酸バッファ−（PH=7.5）中0.25mMのオル
トフェニレンジアミンと0.01% 過酸化水素水）を加え、
発色させた。410nm での光学密度を、MR580 マイクロエ
リザ、オ−ト、リ−ダ−（ダイナテック製）を用いて測
定した。結果を下記表３に示す。
【００２６】実施例７ 競合法を行うためにマイクロタイタ−プレ−ト（96穴）
のウエルにLPに対する抗体を被覆させた（4 ℃、一
晩）。あとはペルオキシダ−ゼ標識抗原（HP）をペルオ
キシダ−ゼ標識抗原（LP）に代えた以外は同様の操作を
行った。結果を下記表４に示す。
のウエルにLPに対する抗体を被覆させた（4 ℃、一
晩）。あとはペルオキシダ−ゼ標識抗原（HP）をペルオ
キシダ−ゼ標識抗原（LP）に代えた以外は同様の操作を
行った。結果を下記表４に示す。
【００２７】実施例８ ２抗体法を行うためにマイクロタイタ−プレ−ト（96
穴）のウエルにHP- アルブミン、LP- アルブミンを1 ：
1 の比で混合させたものを被覆させた（4 ℃、一晩）。
次にこの液を ウエルから除き、洗浄液（0.14M NaCl/1
0mM-リン酸バッファ−（PH=7.5）+0.1％Tween20 ）で1
回洗浄した。3%BSA （ウシ血清アルブミン）を含むPBS
溶液でウエルを満たし37℃１時間放置した。BSA 溶液を
除去したあと上記洗浄液でウエルを洗浄した。ＨＰ及び
ＬＰが既知濃度の尿とHP+LP に対する抗体を含む液（50
μl 、BSA を1%含む液で希釈）は別の試験管で37℃１時
間反応させてある。この混合溶液をウエルに加えてさら
に37℃１時間反応させた。抗体を含む液を除去し上記洗
浄液で十分にウエルを洗浄し、カッペル社の抗ウサギIg
G(H+L)に実施例２と同様の操作によりペルオキシダ−ゼ
を標識したものをバッファ−で希釈して各ウエルに加え
37℃1 時間反応させた。ペルオキシダ−ゼ標識抗ウサギ
IgG を含む液を除去し上記洗浄液で十分にウエルを洗浄
し、ペルオキシダ−ゼ基質溶液（ウエル1 個当たり100
μl ；0.14M NaCl/10mM-リン酸バッファ−（PH=7.5）中
0.25mMのオルトフェニレンジアミンと0.01% 過酸化水素
水）を加え、発色させた。410nm での光学密度を、MR58
0 マイクロエリザ、オ−ト、リ−ダ−（ダイナテック
製）を用いて測定した。結果を下記表５に示す。
穴）のウエルにHP- アルブミン、LP- アルブミンを1 ：
1 の比で混合させたものを被覆させた（4 ℃、一晩）。
次にこの液を ウエルから除き、洗浄液（0.14M NaCl/1
0mM-リン酸バッファ−（PH=7.5）+0.1％Tween20 ）で1
回洗浄した。3%BSA （ウシ血清アルブミン）を含むPBS
溶液でウエルを満たし37℃１時間放置した。BSA 溶液を
除去したあと上記洗浄液でウエルを洗浄した。ＨＰ及び
ＬＰが既知濃度の尿とHP+LP に対する抗体を含む液（50
μl 、BSA を1%含む液で希釈）は別の試験管で37℃１時
間反応させてある。この混合溶液をウエルに加えてさら
に37℃１時間反応させた。抗体を含む液を除去し上記洗
浄液で十分にウエルを洗浄し、カッペル社の抗ウサギIg
G(H+L)に実施例２と同様の操作によりペルオキシダ−ゼ
を標識したものをバッファ−で希釈して各ウエルに加え
37℃1 時間反応させた。ペルオキシダ−ゼ標識抗ウサギ
IgG を含む液を除去し上記洗浄液で十分にウエルを洗浄
し、ペルオキシダ−ゼ基質溶液（ウエル1 個当たり100
μl ；0.14M NaCl/10mM-リン酸バッファ−（PH=7.5）中
0.25mMのオルトフェニレンジアミンと0.01% 過酸化水素
水）を加え、発色させた。410nm での光学密度を、MR58
0 マイクロエリザ、オ−ト、リ−ダ−（ダイナテック
製）を用いて測定した。結果を下記表５に示す。
【００２８】実施例９ 競合法を行うためにマイクロタイタ−プレ−ト（96穴）
のウエルにHP-pep（上記式［Ｉ］で示される構造を有す
るもの、以下同じ）に対する抗体を被覆させた（4 ℃、
一晩）。次にこの液を ウエルから除き、洗浄液（0.14
M NaCl/10mM-リン酸バッファ−（PH=7.5）+0.1％Tween2
0 ）で1 回洗浄する。3%BSA （ウシ血清アルブミン）を
含むPBS 溶液でウエルを満たし37℃１時間放置した。BS
A 溶液を除去したあと上記洗浄液でウエルを洗浄した。
あらかじめ混合してプレインキュベ−トしてあるＨＰ及
びＬＰが既知濃度の尿とペルオキシダ−ゼ標識抗原（HP
-pep）+0.14M NaCl/10mM- リン酸バッファ−（PH=7.5）
をウエルに添加し37℃1 時間反応させる。標識抗原溶液
を除去し上記洗浄液で十分にウエルを洗浄し、ペルオキ
シダ−ゼ基質溶液（ウエル1 個当たり100 μl ；0.14M
NaCl/10mM-リン酸バッファ−（PH=7.5）中0.25mMのオル
トフェニレンジアミンと0.01% 過酸化水素水）を加え、
発色させる。410nm での光学密度を、MR580 マイクロエ
リザ、オ−ト、リ−ダ−（ダイナテック製）を用いて測
定した。結果を下記表６に示す。
のウエルにHP-pep（上記式［Ｉ］で示される構造を有す
るもの、以下同じ）に対する抗体を被覆させた（4 ℃、
一晩）。次にこの液を ウエルから除き、洗浄液（0.14
M NaCl/10mM-リン酸バッファ−（PH=7.5）+0.1％Tween2
0 ）で1 回洗浄する。3%BSA （ウシ血清アルブミン）を
含むPBS 溶液でウエルを満たし37℃１時間放置した。BS
A 溶液を除去したあと上記洗浄液でウエルを洗浄した。
あらかじめ混合してプレインキュベ−トしてあるＨＰ及
びＬＰが既知濃度の尿とペルオキシダ−ゼ標識抗原（HP
-pep）+0.14M NaCl/10mM- リン酸バッファ−（PH=7.5）
をウエルに添加し37℃1 時間反応させる。標識抗原溶液
を除去し上記洗浄液で十分にウエルを洗浄し、ペルオキ
シダ−ゼ基質溶液（ウエル1 個当たり100 μl ；0.14M
NaCl/10mM-リン酸バッファ−（PH=7.5）中0.25mMのオル
トフェニレンジアミンと0.01% 過酸化水素水）を加え、
発色させる。410nm での光学密度を、MR580 マイクロエ
リザ、オ−ト、リ−ダ−（ダイナテック製）を用いて測
定した。結果を下記表６に示す。
【００２９】実施例10 競合法を行うためにマイクロタイタ−プレ−ト（96穴）
のウエルにLP-pepに対する抗体を被覆させた（4 ℃、一
晩）。あとはペルオキシダ−ゼ標識抗原（HP-pep）をペ
ルオキシダ−ゼ標識抗原（LP-pep）に代えた以外は実施
例９と同様の操作を行った。結果を下記表７に示す。
のウエルにLP-pepに対する抗体を被覆させた（4 ℃、一
晩）。あとはペルオキシダ−ゼ標識抗原（HP-pep）をペ
ルオキシダ−ゼ標識抗原（LP-pep）に代えた以外は実施
例９と同様の操作を行った。結果を下記表７に示す。
【００３０】実施例１１ インヒビションアッセイを行うためにアミノプレート
（９６穴：住友ベークライト社製）各ウェルに１００μ
ｌの２％グルタルアルデヒド（ＰＢＳ溶液希釈）を分注
し、室温で２時間静置後、洗浄液でウェルを洗浄した。
その後、ＨＰを各ウェルに１μg/mlを５０μｌ分注し、
室温で２時間インキュベートし、洗浄後ブロッキングを
３７℃、１時間鳥血清（ＰＢＳで希釈したもの）で行っ
た。溶液を除去した後、上記洗浄液でウェルを洗浄し
た。ＨＰの濃度が既知の尿とＨＰに対するペルオキシダ
ーゼ標識抗体を含む液（５０μｌ、鳥血清希釈）は別の
試験管で３７℃、１時間反応させてある。この混合溶液
をウェルに加えてさらに３７℃、１時間反応させた。ペ
ルオキシダーゼ標識抗体を含む液を除去し、上記洗浄液
で十分にウェルを洗浄し、ペルオキシダーゼ基質溶液
（ウェル１個当たり１００μｌ；0.14 M NaCl/10 mM-リ
ン酸バッファー（ｐＨ＝7.5)中0.25 mM のオルトフェニ
レンジアミンと０．０１％過酸化水素水）を加え、発色
させた。４１０ｎｍでの光学密度を、ＭＲ５８０マイク
ロエリザ、オートリーダー（ダイナテック製）を用いて
測定した。結果を下記表８に示す。
（９６穴：住友ベークライト社製）各ウェルに１００μ
ｌの２％グルタルアルデヒド（ＰＢＳ溶液希釈）を分注
し、室温で２時間静置後、洗浄液でウェルを洗浄した。
その後、ＨＰを各ウェルに１μg/mlを５０μｌ分注し、
室温で２時間インキュベートし、洗浄後ブロッキングを
３７℃、１時間鳥血清（ＰＢＳで希釈したもの）で行っ
た。溶液を除去した後、上記洗浄液でウェルを洗浄し
た。ＨＰの濃度が既知の尿とＨＰに対するペルオキシダ
ーゼ標識抗体を含む液（５０μｌ、鳥血清希釈）は別の
試験管で３７℃、１時間反応させてある。この混合溶液
をウェルに加えてさらに３７℃、１時間反応させた。ペ
ルオキシダーゼ標識抗体を含む液を除去し、上記洗浄液
で十分にウェルを洗浄し、ペルオキシダーゼ基質溶液
（ウェル１個当たり１００μｌ；0.14 M NaCl/10 mM-リ
ン酸バッファー（ｐＨ＝7.5)中0.25 mM のオルトフェニ
レンジアミンと０．０１％過酸化水素水）を加え、発色
させた。４１０ｎｍでの光学密度を、ＭＲ５８０マイク
ロエリザ、オートリーダー（ダイナテック製）を用いて
測定した。結果を下記表８に示す。
【００３１】
【表１】
【００３２】
【表２】
【００３３】
【表３】
【００３４】
【表４】
【００３５】
【表５】
【００３６】
【表６】
【００３７】
【表７】
【００３８】
【表８】
【００３９】これらの結果から競合法、インヒビション
アッセイ、２抗体法ともにHP+LP,HP,LP,HP-pep,LP-pep
の値がそれぞれ測定可能であることが示された。
アッセイ、２抗体法ともにHP+LP,HP,LP,HP-pep,LP-pep
の値がそれぞれ測定可能であることが示された。
【００４０】
【発明の効果】本発明により、生体試料中のリジルピリ
ジノリン、２’−ヒドロキシリジルピリジノリン若しく
はこれらの置換体又はこれらの残基を有するコラ−ゲン
断片を簡便な操作で感度良く測定する方法が提供され
た。本発明により、骨粗鬆症を簡便、正確、迅速に行う
ことが可能になる。
ジノリン、２’−ヒドロキシリジルピリジノリン若しく
はこれらの置換体又はこれらの残基を有するコラ−ゲン
断片を簡便な操作で感度良く測定する方法が提供され
た。本発明により、骨粗鬆症を簡便、正確、迅速に行う
ことが可能になる。
Claims (8)
- 【請求項１】 抗リジルピリジノリン抗体若しくは抗
２’- ヒドロキシリジルピリジノリン抗体又はこれらの
抗原結合性断片と、リジルピリジノリン、２’- ヒドロ
キシリジルピリジノリン若しくはこれらの置換体又はこ
れらの残基を有するコラ−ゲン断片との特異的結合を利
用した免疫学的方法により、生体試料中に含まれるリジ
ルピリジノリン、２’- ヒドロキシリジルピリジノリン
若しくはこれらの置換体又はこれらの残基を有するコラ
−ゲン断片を測定する方法。 - 【請求項２】 生体試料が尿である請求項１記載の方
法。 - 【請求項３】 被測定物質と標識物質とが結合したコン
ジュゲ−トを用いる請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 請求項３記載のコンジュゲ−トと生体試
料中の被測定物質との両者に結合しうる特異的な抗体を
用いる請求項１記載の方法。 - 【請求項５】 被測定物質に特異的に結合する物質と標
識物質とが結合したコンジュゲ−トを用いる請求項１記
載の方法。 - 【請求項６】 請求項５記載のコンジュゲ−トと生体試
料中の被測定物質とを特異的に結合させ、過剰のコンジ
ュゲ−トを分離するために固定化してある被測定物質に
特異的に結合させる工程を含んでなる請求項１記載の方
法。 - 【請求項７】 標識物質が酵素である請求項２ないし６
のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項８】 請求項１ないし７のいずれか１項に記載
の方法を行うためのキット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5307398A JPH06201695A (ja) | 1992-11-12 | 1993-11-12 | リジルピリジノリン、２’−ヒドロキシリジルピリジノリン若しくはこれらの置換体又はこれらの残基を有するコラーゲン断片の測定方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4-328619 | 1992-11-12 | ||
| JP32861992 | 1992-11-12 | ||
| JP5307398A JPH06201695A (ja) | 1992-11-12 | 1993-11-12 | リジルピリジノリン、２’−ヒドロキシリジルピリジノリン若しくはこれらの置換体又はこれらの残基を有するコラーゲン断片の測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06201695A true JPH06201695A (ja) | 1994-07-22 |
Family
ID=26565089
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5307398A Pending JPH06201695A (ja) | 1992-11-12 | 1993-11-12 | リジルピリジノリン、２’−ヒドロキシリジルピリジノリン若しくはこれらの置換体又はこれらの残基を有するコラーゲン断片の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06201695A (ja) |
-
1993
- 1993-11-12 JP JP5307398A patent/JPH06201695A/ja active Pending
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Effective date: 20070226 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20070625 |