JPH05501157A - 付着性タンパク質に対するリガンド／抗リガンドアッセイ法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 付着性タンパク質に対するリガンド／抗リガンドアッセイ法 光」ｌヱどＬＬ 本発明は、親油性の血清及び血漿タンパク質、サイトカイン、球状の血清及び血 漿タンパク質、並びにベントラキシン（ｐｅｎｔｒａｘｉｎ）を含む付着性タン パク質を検出し測定するためのリガンド（配位子）／抗リガンドアッセイに関す る。

本発明のアッセイは特に、血清アミロイドＡ、アポリポタンパク質Ａ１．アポリ ポタンパク質Ｂ、ＣＲＰ、ＩＬ−１ンバク質の検出及び測定に有用である。

血漿及び血清のような生物学的流体は種々のタンパク質を含んでいる。特定タン パク質の存在、不在又は濃度は、例えばこれらのデータが生物学的流体の由来源 である個体の臨床的状態に関する情報を提供するという理由で、重要であり得る 。そのため、この種のタンパク質の存在を検出し且つその濃度を測定する比較的 簡単で低コストのアッセイ方法がめられている。

例えば、血漿及び血清は、脂質に非共有的に結合する数種類のタンパク質を含ん でいる。これらの親油性タンパク質は、脂質の運搬、細胞間の連絡及び宿主の防 御を含む様々な機能を果たす。医学的研究の結果、親油性の血清及び血漿タンパ ク質は多くの疾患状態で非疾患状態の時とは異なる濃度を示すことが判明した。

このような濃度差の有意性は能動的臨床研究の対象となっている。

親油性の血清又は血漿タンパク質の多くは、体の物理的状態の変化に伴って濃度 が変化する１例えば、血清アミロイドＡの濃度は炎症中に激増する。アポリポタ ンパク質Ａ１の濃度は心臓病（ｅｏｒｏｎａｒｙ　ｄｉｓｅａｓｅ）の場合に減 少し、アポリポタンパク質Ｂは心臓病の場合に増加する。従って、これらのタン パク質の臨床的測定は、種々の疾患状態のメカニズムが解明されるにつれて益々 重要なものとなるであろう。

親油性の血清又は血漿タンパク質の正確で再現性のある測定は歴史的に困難なも のであった。この問題には、例えば親油性タンパク質の複数の構造の存在及び親 油性タンパク質が生来有する「粘着性（５ｔｉｃｋｎｅｓｓ）　Ｊといった要因 が関与している。

生体はしばしば、特定の親油性タンパク質を幾つかの分子構造で含む、これらの 構造は、アミノ酸配列が僅かに異なっているに過ぎない、これらの分子構造はイ ソタイプとして知られており、各々が複数の立体配座（コンフォーメーション） 状態で存在し得る。免疫学的反応性はイソタイプの間及び特定イソタイプの立体 配座状態の間で異なり得る。

アポリポタンパク質では、アポリポタンパク質による脂質の結合に伴う立体配座 変化がしばしば観察される（Ｂａｕ−ｓｓｅｒｍａｎら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ ｓ、２５８．　１０６８１（１９８３）　：　Ｓｅｇｒｅｓｔら、Ｂｉｏｃｈｅ ＋５ｉｓｔｒｙ　１５．３１８７（１９７６）　；　Ｓｅｇｒｅｓｔら、ＦＥＢ Ｓ　Ｌｅｔｔｅｒｓ３８、２４７（１９７４）　ＨＭｏｒｒｉｓｅｔｔら、Ｂｉ ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１２．　１２９０（１９７３））、これらの立体配座変 化は、血清又は血漿中のタンパク質を免疫拡散又はチャージシフト（ｃｈａｒｇ ｅ　５ｈｉｆｔ）免疫電気泳動によって分析した時に観察することができる（Ｌ ｉｎｋｅ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、＾ｅｔａ　６６８．３８８（１ ９８１））、加熱、酸、アルカリ、塩酸グアニジンでの処理及び有機溶媒での抽 出もアポリポタンパク質の立体配座変化を誘起し得る（Ｓｉｐｅら、ＢｒＪ、Ｅ ｘｐ、Ｐａｔｈ、　５７，５８２（１９７６）　；　Ｐｅｐｙｓ及びＢａ　Ｉ　 ｔｚ　。

＾ｄｖ、Ｉｍｍｕｎｏ１．３４．１４１（１９８３）　；　Ｅｒ１ｋｓｅｎ及び Ｂｅｎｄｉｔｔ、　Ｍｅｔｈ。

Ｅｎｚｙｍｏｌ、ＩＺ８．３１１（１９８６）　；　Ｍａｅｉｅｊｋｏ、　Ｃｌ １ｎ、Ｃｈｅｍ、２８．１９９（１９８２））。

更に、親油性タンパク質は「粘着性がある」、即ち同じ構造の別の分子と非特異 的疎水性相互作用を起こす（自己会合（ｓｅｌｆ　ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）と も称する）、この粘着性は、親油性タンパク質、関連性のない（無関係な）血清 タンパク質及び実験容器の間の非特異的疎水性相互作用も引き起こす（Ｆｒａｎ ｋｌｉｎ、　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１４土、　１６７９（１９７６）　；　Ｍａ ｒｈａｕｇ　ａｎｄＨｕｓｂｙ、Ｃｌ１ｎ、Ｅｘｐ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、４５．　 ９７（１９８１）；　Ｂａｕｓｓｅｒｍａｎら　。

前出の文献（１９８３））、親油性タンパク質の生来の粘着性はイムノアッセイ でタンパク質の測定を不正確なものにする。

血清中及び血漿中に存在する３つの代表的な親油性タンパク質は、アポリポタン パク質Ａ１、アポリポタンパク質Ｂ及び血清アミロイドＡである。アポリポタン パク質Ａ１（以後ａｐｏＡ１と称する）は、高密度リポタンパク質（以後ＨＤＬ と称する）中に存在する主要タンパク質の１つである。ａｐｏＡｌはＨＤＬの必 要な構造成分であり得（Ｈ，に、Ｎａ１ｔｏ、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、ｆｍｕｎｏａｓ ｓａｙ　９．１１（１９８６））、レシチンコレステロールアセチルトランスフ ェラーゼ、即ち末梢血液からコレステロールを除去する経路内の酵素の活性化因 子である。低密度リポタンパク質（以後ＬＤＬと称する）の主要タンパク質成分 であるアポリポタンパク質Ｂ（以後ａｐｏＢと称する）は、ＬＤＬの異化作用に 関する細胞レセプターの認識で活性を示す。血清アミロイドＡ（以後ＳＡＡと称 する）もＨＤＬに会合（ａｓｓｏｃｉａｔｅ）　しているが、このリポタンパク 質は脂質の運搬において既知の役割を果たすことはない、ＳＡＡは急性期反応体 （ａｃｕｔｅ　ｐｈａｓｅｒｅａｃｔａｎｔ　）の１つである。即ち、急性炎症 状態の時に高濃度で存在する。　ａ　ｐ　ｏ　Ａ　１は、シスチン、システィン 又はロイシンを含まないアミノ酸残基数２４３〜２４５の単一の非グリコジル化 鎖からなる。ａｐｏＡｌのイソタイプは幾つか存在し、このタンパク質の無脂質 状態ではアルファらせん含量が５５％であるが、このアポリポタンパク質にリン 脂質が結合゛すると前記らせん含量が７５％に上昇する。

ａｐｏＡｌは肝臓及び腸で合成される。

ａ　ｐ　ｏ　Ａ　１測定の臨床的重要性は、冠動脈疾患を診断する上で有用なこ とにある。前述のように、ａ　ｐ　ｏ　Ａ　１濃度は心臓病にかかつている個体 において減少し、従って臨床的に有意である。これに対し、ａρＯＢ濃度は心臓 病の時に増加するため、ａｐｏＡ１濃度及びａｐｏＢ濃度の測定値を比較すれば 感度の高い臨床プロフィールが得られる。

血漿及び他の生物学的試料におけるＳＡＡ濃度も臨床的に有意である（　Ｒｏｓ ｅｎｔｈａｌ及びＦｒａｎｋｌｉｎ、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ。

５５、　７４６（１９７５）；　Ｃｏｒｅｖｉｅら　、Ｃｌ１ｎ、Ｉｍｍｕｎｏ １．ｌｍ５ｕｎｏｐａｔｈｏｌ。

６、８３（１９７６）　；　Ｐｅｐｙｓ及びＢａ　Ｉ　ｔｚ　、前出の文献（１ ９８３）　；Ｉｈ」」」仁旺■二担力」上虻但肛ｅｓ　ｉｎ　ｔｌ咀ユｈ」追出 ＬＤｉｓｅａｓｅｓ、＾、Ｓ、Ｃｏｈｅｎ編、　Ｇｒｕｎｅ　ａｎｄ　５ｔｒａ ｔｔｏｎ、　０ｒｌａｎｄ。

（１９８５）、　ｐ、７７に記載の５ｉｐｅの論文；Ｋｕｓｂｎｅｒ及びＭａｃ ｋｉｅｗｉｃｚ。

Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｍａｒｋｅｒｓ　５．１（１９８６））　、　ＳＡＡ合或は恒 常性（ホメオスタシス）の間は最小限であるが、損傷が起こると数時間のうちに ＳＡＡの２つの主要イソフオーム（ｍａｊｏｒｉｓｏｆｏｒｍ）と幾つかの副イ ソフオーム（ｍｉｎｏｒ　ｉｓｏｆｏｒｍ）とが゛血漿高密度リポタンパク質（ 以後ＨＤＬと称する）中に検出できるようになる（　Ｂｅｎｄｉｔｔ及びＥｒ１ ｋｓｅｎ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ　。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７４．　４９２５（１９７７）：　Ｂａｕｓｓｅｒｍａｎら、 Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１５２゜６４１（１９８０）ｒ　Ｂｅｎｄｉｔｔら　、　 Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、１６３．　５１０（１９８Ｂ）：５ｔｒａｅｈａｎ ら、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６４　：　１８３６８（１９８９））、組織 損傷及び細胞壊死に対する急性期反応時のＳＡＡ産生の量及び持続時間は損傷の 種類と大きさとに依存する（　ＭｃＡｄａＩら、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、 ６１．３９０（１９７８）；　Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏ− ＬＱＪＬＬ、＾、Ｓ、Ｃｏｈｅｎ及びＪ、Ｃ，Ｂｅｎｎｅｔｔｉｉ、　Ｃｒｕｎ ｅ　ａｎｄ　５ｔｒａｔｔｏｎ。

０ｒｌａｎｄｏ（１９８６）、　ｐ、９７に記載の５ｉｐｅの論文）。

ＳＡＡの合成は、インターロイキン−１、腫瘍壊死因子及びインターロイキン− ６といったマクロファージの分泌産生物によって調節される（Ｖｏｇｅ　ｌ及び ５ｉｐｅ、５ｕｒｖ、Ｉｍａ＋ｕｎｏｌ　。

Ｒｅｓ、１．　２３５（１９８２）；　Ｇａｎａｐｔｈｉら　、Ｂｉｏｅｈｅｍ 、Ｂｉｏｃｐｈｙｓ、Ｒｅｓ。

Ｃｏ−５ｕｎ、１５７．２７１（１９８８））、　ＳＡＡは、大部分のグリコジ ル化急性期タンパク質よりも速やかに血漿から除去及び／又は消費される（〜リ ュｏｉｃｌｏｓｉｓ、　Ｊ、Ｍａｒｒｉｎｋ及びＮ、Ｈ，ｖａｎ−Ｒｉｊｓｗｉ ｊｋ編、Ｍａｒｔｉｎｕｓ　Ｎ１ｊｈｏｆｆ、＾−５ｔｅｒｄａｓ（１９８６） 、ｐ、３３７に記載のり、Ｌ、Ｂａｕｓｓｅｒ＋ｓａｎの論文）、従って、ＳＡ Ａ濃度はＩＬ−１及び関連サイトカインの新しい産生及び作用を示すものとして 有用である。

過去２０年の間、ＳＡＡはアミロイドフィブリルの前駆体として、ＨＤＬのアポ タンパク質成分として、そして特に急性期タンパク質として研究されきた。循環 ＳＡＡの濃度は新しい組織損傷及び細胞壊死の敏感で特異的で定量的なマーカー であるため、ＳＡＡ値をモニターすることは実・際に臨床上有用なことである。

しかしながら、その潜在的有用性にも拘わらず、ＳＡＡ及び他の多くの親油性タ ンパク質の信頼できる臨床的測定はこれまで不可能であった。

その主な理由は、これらのタンパク質の物理化学的特性にある。

ＳＡＡには２つの両親媒性らせん領域が存在する。１つは残基１から２４に及ぶ 該分子のアミノ末端部分にあり、もう１つは残基５０から７４に及ぶ部分にある （　Ｐａｒｍｅｌｅｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２１　、３２９８（１９ ８２））、Ｓ　Ａ　Ａ分子の一部のイソフオーム（ｉｓｏｆｏｒｓｓ）のカルボ キシル部分がタンパク質加水分解開裂により除去されてアミロイドＡ　（ＡＡ） が形成されると、立体配座及び溶解度が激変する。ＡＡタンパク質は、クロス６ プリーツシート構造を有し且つ組織の細胞外スペースに蓄積される不溶性フィブ リルを形成する（Ｂｅｎｄｉｔｔ及びＥｒ１ｋｓｅｎ−Ｊ、Ｐａｔｈｏｌ、６５ ．２３１（１９７１）　；　Ｃ１ｅｎｎｅｒ。

Ｎ、Ｅｎｇ、Ｊ、Ｍｅｄ、３０２．１２８３（１９８０））、単離されたフィブ リルは最小限の抗原性及び免疫原性を示すと報告されている（Ｒａｍら、Ｉｎｋ 、＾ｒｃｈ　、＾ｌｌｅｒｇｙ　３４．２６９（１９６８））。

血漿中のＳＡＡの大部分は高濃度の塩の存在下で数時間遠心した後にＨＤＬタン パク質と共に単離され得るが、血漿ＳＡＡの一部分は血漿の非すポタンパク質フ ラクション中に存在することが報告された（　ＭａｒｈａＢら、Ｃｌ１ｎ、Ｅｘ ｐ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、５０．３８２（１９８２）、　Ｂａｕｓｓｅｒｍａｎ、私信） 、非すポタンパク質血漿フラクション中のＳＡＡは脂質には結合しないため、Ｈ ＤＬタンパク質と共に単離されたＳＡＡとは異なる立体配座を有すると予想され る。従って、血漿試料はおそらく両方のＳＡＡ立体立体配座体性体ち遊離ＳＡＡ 及びＨＤＬ会合ＳＡＡを含み得る。立体配座異性体の立体配座の相違は免疫学的 アッセイの精度に影響し得る。なぜなら、特定の抗体又は抗血清が種々の立体配 座異性体中に露出されたエピトープを総て認識するとは限らないからである。

同じ個体中に存在するＳＡＡの１つ以上のイソタイプの存在によっても類似の現 象が起こり得る。

血漿及び他の生物学的流体のＳＡＡ濃度の正確で再現性のある定量を取り巻く技 術的問題はこれまでにも広く指摘されたきた（Ｍｉｒｂａｕｇ、５ｃａｎｄ、Ｊ 、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１８，３２９（１９８３）　；Ｐｅｐｙｓ及びＢａ１ｔｚ、 前出の文献（１９８３）　；　にｏｄｅｎｉｒら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　８３．２１７（１９８５）　；　Ｂｅｎｄｉｔｔら、前出の文 献（１９８８））。

最適な免疫化学的測定には脂質及びアポリポタンパク質からのＳＡＡの変性及び 解離が必要であることがこれまでしばしば報告されてきた。ある研究所は、熱、 酸又はアルカリによる変性がＳＡＡ測定の免疫反応性及び再現性を増加させるこ とを発見した（Ｓｉｐｅら、前出の文献（１９７６、）　；　ｖａｎＲｉｊｓｗ ｉｊｋ、＾ｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ、オランダＧｒｏｎｉｎｇｅｎ大学の博士論文 （１９８１）　；　Ｅｒ１ｋｓｅｎ及びＢｅｎｄｉｔｔ、前出の文献（１９８６ ））、一方、他の研究者達は、変性処理を使用すると定量に悪影響が及ぼされる と報告している（Ｂｅｎｓｏｎ及びＣｏｈｅｎ　、＾ｒｔｈｒｉｔｉｓＲｈｅｕ ｍ、２２．３６（１９７９）　；　Ｃｈａｍｂｅｒｓ及び−ｂｉｔｃｈｅｒ、　 Ｊ、ＩｓｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ　５９，９５（１９８３）　；　Ｎａｒｈａｕ ｇ、前出の文献（１９８３））、これらの異なる観察の原因は、使用した抗体の エピトープ特異性及び使用したイムノアッセイの特定のタイプ（直接もしくは競 合結合ラジオイムノアッセイ（Ｒ１＾）又は酵素結合イムノソーペントアッセイ （ＥＬＩＳ＾）又はラジカル免疫拡散法）にあると考えられる。

精製ａｐｏＳＡＡは任意の一般的なタンパク質測定方法で測定し得る。しかしな がら、ゲル走査（ｇｅｔ　ｓｃｎｎｉｎｇ）、アミノ酸分析又は高性能液体クロ マトグラフィーはコストが高く労働集約的であるため臨床的使用には適していな い。

また、血清及び血漿は一般的なタンパク質アッセイを妨害し得る物質を含んでい るため、これらの方法を用いる場合には精製が必要である。更に、精製ＳＡＡの 測定は生来のりボタンバク質の濃度を正確に反映するとは限らない。

ＳＡＡを生来の状態で測定するイムノアッセイは極めて望ましいものである。な ぜなら、臨床実験室はこの種の手法を日常的に使用しており、且つこのようなア ッセイは多くの生物学的リガンドに間する一般的臨床文献の多くの基礎をなすか らである。ＳＡＡのイムノアッセイは幾つが開示されている（　ＤｅＢｅｅｒら 、１９８２．　ＢａｕｓｓｅｒｍｉＬｎら、　１９８８゜Ｂｅｎ５ｏｎ及びＣｏ ｈｅｎ、　１９７９）、　Ｌかしながら、公知のＳＡＡアッセイは他の血漿成分 による妨害を受け、臨床的有用性は立証されていない。

また、公知の臨床的に使用できるイムノアッセイは半定量的でしかなく、その感 度は、肺炎又は外傷のような急性状態で観察される高ＳＡＡ濃度には適していて も慢性患者のＳＡＡのモニターには不適当である。慢性リウマチ患者のＳＡＡ濃 度は５〜１００μｇ／ｍ＋のように低くなり得、慢性リウマチ患者の１０〜２０ μｇ／ｍ！程度の小さいＳＡＡ濃度変化は臨床的に重要な意味を有し得る。従っ て。

慢性患者のモニターには従来のものより感度の高いアッセイが必要とされる。

また、炎症性刺激は循環ＳＡＡ′ｄＡ度を数百倍〜千倍増加させる。従って、臨 床的に有用であるためには、ＳＡＡアッセイが数桁に及ぶ濃度範囲にわたって正 確であることが望ましい。

Ｎａｒｈａｕｇ（前出の文献、１９８３）は、ポリクローナルウサギ抗ＡＡ及び ＳＡＡ並びにモノクローナルマウス抗ＳＡＡ抗体を使用するサンドイッチＥＬＩ ＳＡと、プレートをａｐｏＳＡＡでコーティングし、試験試料をウェルに加える 前にモノクローナル抗ＳＡＡ抗体と共にインキュベートする阻害ＥＬＩＳＡとを 比較した。これらの方法は２つともＳＡＡでの自己コーティングの影響を受けた 。変性は不要であり、脂質除去（ｄｅｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）は免疫反応性を少 し低下させた。どちらのアッセイもＳＡＡの臨床的に意味のある測定に必要な感 度は示さながった。　Ｍａｒｈａｕｇはラジオイムノアッセイについて６記述し ており、どちらのＥＬＩＳＡよりも正確であったとしている。しかしながら、ラ ジオイムノアッセイには放射能の使用に固有の多くの問題があるため、ＳＡＡの 臨床的測定のための優れた方法とはいえない。

Ｄｕｂｏｉｓ及び−ａｌｓｅｎｄｉｅｒ（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｎｅｔｈｏｄｓ 　１１２．７１＜１９８８ン）は、アフィニティ精製した抗ａ　ｐ　ｏ　ＳＡＡ でコーティングしたウェルに結合したａｐｏＳ′ｆｆ定量するのにペルオキシダ ーゼ複合抗ＳＡＡ抗体を使用する、ヒトアポリポタンパク質Ｓ　（ＳＡＡと同じ と思われる）を測定するためのダブルサンドイッチＥＬＩＳＡについて記述して いる。

このアッセイの感度は適当なものであった。しかしながら、このアッセイは抗体 及び複合体のアフイニテイ精製を必要とするため極めて労働集約的である。また 、試薬の費用も、日常的な臨床使用にとって望ましい値より高い。

Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ及び５ｕｒｐｒｅｎａｎｔ（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、ＭｅＬｈ ｏｄｓ　９２，３７（１９８６））は、ＳＡＡをｐＨ９，６の重炭酸塩バッファ 中４℃でマウス血清から直接コーティングするアッセイ方法を開示している。従 来の大部分のアッセイと同様に、このアッセイはＳＡＡ濃度を絶対量ではなく相 対単位で表す、前述のように、ＳＡＡ濃度を相対単位で表すと、取得し且つある 時間にわたってアッセイした試料に由来する値の比較が制限され、研究所間の結 果の比較も制限される。これらの比較データがなければ、いかなるＳＡＡアッセ イも臨床的有用性が大幅に限定される。

Ｚｕｅｋｅｒｍａｎ及び５ｕｒｐｒｅｎａｎｔの方法は、試料を同じ希釈度でア ッセイした場合、マウスＳＡＡについては比較的定量的である。この方法は、血 漿を用いた場合に得られる曲線より安定な標準的曲線を作成するためにＳＡＡ濃 度の高いリポタンパク質フラクションを用いることによって、ヒト試料中のＳＡ Ａの測定に使用できるように改変し得る０次いで、同一グループの試料を同じ希 釈度でアッセイし、ＳＡＡ濃度をＳＡＡ濃度の高いＨＤＬの相対量で表わせばよ い。

しかしながら、Ｚｕｃｋｅｒ＋＊ａｎ及び５ｕｒｐｒｅｎａｎｔの方法はヒト血 漿試料中のＳＡＡの臨床的測定に適しているとは立証されていない。有意な比較 を行うためには、臨床試料を数桁におよぶＳＡＡ濃度範囲にわたってアッセイし なければならない、そのためには、様々なタンパク質濃度を有する複数の試料希 釈物のアッセイが必要である。ヒト血漿試料は、種々の試料希釈度で種々の形で 結合に作用する妨害タンパク質を含んでいる。ヒトＳＡＡはマウスＳＡＡよりも 強く他の血漿成分に作用し得ると想定されている。　Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ及び５ ｕｒｐｒｅｎａｎｔの方法は、ヒト血漿試料中に存在する種々の妨害を補正する ための対策を全く含んでいない。

更に、ヒト血漿ＳＡＡは、Ｚｕｃｋｅｒ＋＊ａｎ及び５ｕｒｐｒｅｎａｎｔの条 件では、マウスの血漿又は血清に由来するＳＡＡはと効果的にマイクロタイター （マイクロ滴定、ｍ１ｅｒｏｔｉｔｅｒ）７．レートに結合しないことが判明し た。また、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ及び５ｕｒｐｒｅｎａｎｔが測定した試料が実験 的炎症刺激を体験したマウスに由来するものであったことがら、別の問題も生じ ている。そのため、マウスのＳＡＡ濃度は、ヒトの病気に伴う比較的低いＳＡＡ 濃度とにへ゛て南かった。（是って、’　＝　’　Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ及び ５ｕｒｐｒｅｎａｎｔのアッセイを改変したアッセイの感度は、ヒト臨床試料の ＳＡＡ濃度の測定には十分ではないと考えられる。

ポリクローナルウサギ抗ヒトＳＡＡ抗血清を検出抗体として使用するダブルサン ドイッチ固相ＥＬＩＳＡを用いる抗原捕捉システムも、血清及び血漿試料中のＳ ＡＡの測定には有効でないことが判明した。このダブルサンドイッチ固相ＥＬＩ ＳＡは大きな成果をもたらしたが、これらの成果は変動的であった。これについ ては、例えばＭａｒｈａｎｇ（前出の文献（１９８３））を参照されたい、この 方法では、カゼインでブロックした（ｃａｓｅｉｎ−ｂｌｏｅｋｅｄ）マイクロ タイタープレート上に抗体を固定し、分析物（ａｎａｌｙｔｅ）を溶液状態で加 える。また、抗体がプレート上に固定されたが否かにががわらず、同量のＳＡＡ がカゼインでブロックしたプレートに結合した。同一試料の一部を精製し、改変 したＺｕｃｋｅｒｍａｎ／　５ｕｒｐｒｅｎａｎｔの方法でアッセイしたところ 、ＳＡＡ濃度はダブルサンドイッチ固相ＥＬＩＳＡで得られた値を遥かに下回っ ていた。これらの結果は、試料中のＳＡＡとブロック剤との相互作用、試料中の ＳＡＡ分子間の相互作用、又はＳＡＡ分子と他の血清成分例えばアルブミン、フ ィブロネクチンもしくはＳＡＰとの相互作用に起因して、ＳＡＡのダブルサンド イッチ固相ＥＬＩＳＡが正確ではながったことを示唆している。

Ｃｏ−Ｂｉｎｄプレート（Ｍｉｃｒｏ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ＋Ｎｅｗａｒｋ、９５ ０ｒａｎｇｅＳｔｒｅｅｔ、　Ｎｅｗａｒｋ、Ｎ、Ｊ、０１７２０）へのＳＡＡ の共有結合も有効ではなかった。精製ＳＡＡはＣｏ−Ｂｉｎｄプレートに効果的 に結合し、結合度はｐＨ９，６での方がｐＨ７，２の時より高い、これは、ＰＨ の増加によって、プレートに結合した遊離アミノ基を露出する立体配座変化が起 こることを示唆するものである。プレートへの精製ＳＡＡの結合は妨害し得るが 、非特異的結合は血漿試料中で急増した。決定基を最大限に露出するためには、 捕捉の前に試料を熱又はグアニジン処理によって変性させる必要があった。

血漿由来のＳＡＡをポリ塩化ビニルプレートに直接結合させ、次いで有機溶媒で 脂質除去する方法は、十分な感度を示さない、ＳＡＡが大幅に過剰な量の非関連 （無関係、１ｒｒｅｌｅｖｅｎｔ）タンパク質の存在下でプラスチック面に優先 的に結合するという５ｅｒｂａｎの観察（米国特許第４，７８２，０１４号）は 、ＳＡＡのイムノアッセイの改良には余り役に立たない。

プラスチック面へのＳＡＡの結合は、再現性をもって、且つ試験試料中のＳＡＡ 濃度に正比例する量が結合するように制御しなければならない、このような制御 された再現性のある結合は５ｅｒｂａｎの文書にはみられない。

Ｂｅｎｄｉｔｔら（前出の文献、１９８８）は、プレートを精製ＡＡタンパク質 で予めコーティングし、熱変性した試料をアフィニテイ精製したａｐｏＡＡ抗体 と共にインキュベートする競合阻ｇＥＬＩＳＡ法を開示している。プレートにコ ーティングしたＳＡＡ抗体への結合に関して抗体と競合するという血漿試料の能 力を測定する消去式競合アッセイは、臨床試料中に存在する低濃度ＳＡＡを検出 するのに十分な感度を示さなかった。このアッセイは更に、大量の抗原及び抗体 を必要とする。

生物学的流体中に存在する他のタンパク質も同様にアッセイが困難であった。Ｉ Ｌ−１ベータ及びＣＲＰはこの種のタンパク質の一例である。

培養上清中のＩＬ−１ベータをイムノアッセイによって測定することは比較的容 易であったが、血漿中のものは測定が困難であった。血漿脂質及び／又はリポタ ンパク質による妨害はＤｕｆｆの研究所によって指摘されている（Ｅａｓｔ−ｇ ａｔｅ、Ｊ、＾、ら、　Ｌａｎｃｅｔ、ｐ、７０６．１９８８年９月２４日）、 この研究所では、関節リューマチ患者の血漿中のＩＬ−１ベータをＥＬＩＳＡで 測定する前にクロロホルム抽出を行っている。

そこで本発明は、ＩＬ−１ベータのより良いアッセイ法を提供する。

ＣＲＰに使用されている最も一般的な２つの臨床的方法は比濁法及び放射免疫拡 散法である。どちらの方法もしきい値は５〜８μｇ／ｍｌである０本発明の方法 では、関節リューマチ患者に関して臨床的に有用であり得る１〜１０μｇ／ｍｌ の範囲でＣＲＰを測定する。

定量的臨床測定にとって有用であるためには、いずれのタンパク質のアッセイも 下記の特徴を有することが極めて望ましい： １、リガンドを、本質的に、相対単位ではなく絶対量で測定できる。

２、リガンドの臨床的に重要な濃度範囲にわたってリガンドを正確に測定できる 。

３．アッセイを自動化できる。

４、簡単であり、信頼性があり、価格が低く、危険がない。

絶対単位を測定することができれば、取得し及び／又はある時間にわたって測定 した試料に由来する結果の比較、並びに種々の研究所からの結果の比較を行うこ とができる。

また、検査は熟練度の比較的低い複数の研究所員によって実施できることが望ま しい。

このように、既存の方法には種々の欠点があるため、特に測定が技術的に難しい タンパク質の濃度を測定するためのより良い方法がめられている。

免ｉへ１１ 疎水性領域を有するタンパク質の正確で再現性のある測定は本発明の実施を通し て達成し得る。理論に結び付けるつもりはないが、この種のタンパク質の疎水性 領域は本発明の方法の条件で種々の支持媒体との間に非特異的疎水性相互作用を 起こすと考えられる。

従って、本発明でアッセイできるタンパク質は、所望の支持媒体との間に非特異 的疎水性相互作用を起こすことができるタンパク質、特にこのような非特異的疎 水性相互作用が塩の存在下で且つ高いｐＨ及び高い温度で促進されるようなタン パク質を含む、この種のタンパク質は以後［付着性タンパク質（ａｄｈｅｒｅｎ ｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ）」と称する。従って、本発明の方法は生物学的試料中に存 在する付着性タンパク質の測定に使用することができる。

本発明は、試料中の所期の付着性タンパク質の存在又は量を調べるための方法で あって、 ａ、固体支持体への付着性タンパク質の結合を促進する条件下で、付着性タンパ ク質に対してｉ相性を示す支持媒体に、高濃度の塩の存在下で加温下に試料を接 触させ、ｂ、ステップ（ａ）で得た支持媒体を、付着性タンパク質への抗リガン ドの結合を促進する条件下で、付着性タンパク質に対する少なくとも１つの抗リ ガンドと接触させ、Ｃ３付着性タンパク質に結合した抗リガンドを検出してその 量を測定し、 ｄ、（ｉ）ステップ（ｃ）で測定した抗リガンドの量を、ステップ（ａ）〜（ｃ ）に従って調製した、付着性タンパク質を含んでいないことがわかっている１つ 以上の非関連タンパク質を含んでいる少なくとも１つの対照試料についテップ（ ｃ）で測定した抗リガンド量を、既知量の付着性タンパク質を含んでおり且つ精 製付着性タンパク質を１つ以上の非関連タンパク質の溶液中に含んでいるステッ プ（ａ）〜（ｃ）に従って調製した試料について測定した抗リガンド量に関連付 ける ステップを含む方法を提供する。

本発明では、所期の付着性タンパク質を支持媒体に結合させるための塩濃度を、 約０．１５Ｍから特定の選択した塩のほぼ飽和状態に至るまでの範囲で変化させ 得る。ｐＨは約８から約１１までの範囲で変化させ得る。温度は約４０℃〜６５ ℃の範囲で変化させ得る。支持媒体は固体又は液体であってよい、抗リガンドは 所期の付着性タンパク質に特異的に結合する任意の分子であってよく、結合の検 出には任意の適当な方法を使用し得る。

非関連タンパク質は、所期の付着性タンパク質と免疫学的に交差反応しないもの が好ましい、これらの非関連タンパク質はまた、付着性タンパク質を含んでいる 生物学的流体を支持媒体と接触させた場合にこの支持媒体に付着性タンパク質が 結合するのと同様の方法で支持媒体に付着性タンパク質が結合するのを促進し得 る。

ここで、血清アミロイドＡ、アポリポタンパク質Ａ１、アポリポタンパク質Ｂ、 ＣＲＰ、ＩＦＮ−１ベータ、ＴＮＦアルファ及びアルブミンの測定に関して本発 明の方法を詳述する。本発明の方法は他の付着性タンパク質、特に測定が同様に 難しいタンパク質にも適用できる。

本発明の方法は、疎水性領域を１つ以上含む大部分のタンパク質のアッセイに有 用であると予想される。特定タンパク質のアッセイに対する本発明の方法の適性 は、例えば本明細書の教示に従って所期のタンパク質を含む対照試料を調製し、 次いで本明細書の教示に従って対照試料中のタンパク質が所望の支持媒体に結合 しているか否かを検査することにより調べることができる。

゛　の　ｔ・ 図１は「発明の詳細な説明するように精製したＳＡＡの５ＤＳ−ポリアクリルア ミド（ＳＤＳ＝ドデシル硫酸ナトリウム）ゲルのデンシトメーター分析を示して いる。

図２はマイクロタイタープレートへのＳＡＡ結合に対する温度の影響を示してい る。

図３は、マイクロタイタープレートのウェルへのＳＡＡ結合に対するアルブミン の阻害作用と、塩の存在下での加熱による逆の現象とを示している。

図４は「発明の詳細」で述べるように作成したＳＡＡ標準曲線を示している。

図５は本発明のＳＡＡ　ＥＬＩＳＡとダブル抗体ＲＩＡとの比較を示している。

図６は「発明の詳細」で述べるうに作成した本発明のａｐｏＡＩ　ＥＬＩＳＡの 代表的な標準曲線を示している。

図７は本発明のａｐｏＡＩ　ＥＬＩＳＡと一般的な免疫比濁アッセイとの比較を 示している。

図８は本発明のａｐｏＢ　ＥＬＩＳＡの標準曲線を示している。

図９はＩｇＧ／アルブミンの存在下及び不在下でＩＬ−１ベータに関して本発明 で作成した標準曲線を示している。

図１０はＴＮＦ／アルファに間して本発明で作成した標準曲線を示している。

１！１１１＠は精製ヒトＩｇＧ及びアルブミンの存在下（１本発明で作成した標 準曲線を示している。

図１２は精製しトＩｇＧの存在下（第１２図Ａ）及び不在下（図１２Ｂ）で精製 血清アルブミンに関して本発明で作成した標準曲線を示している。

Ｌｉへ１１ 本発明の方法は、親油性の血清及び血漿タンパク質、サイトカイン、球状の血清 及び血漿タンパク質、並びにベントラキシンな含む付着性タンパク質の生物学的 流体中での存在及び濃度の検査に極めて有用である。このようなタンパク質とし ては、ＳＡＡ、ＡｐｏＡｌ、ＡｐｏＢ、ＣＲＰ、ＩＬ−１ベータ、ＴＮＦアルフ ァ、アルブミン及び他の類似の付着性を有するタンパク質が挙げられる。

本発明の方法は特に、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ中に存在し且つ他の血漿タンパ ク質と会合している親油性付着性タンパク質の測定に有用である。

親油性タンパク質の正確な測定はこれまで技術的に困難であったため、本発明の 方法の幅広い有用性を示すために、ここでは本発明の方法をこれらの親油性タン パク質及び他のタイプのタンパク質に関して説明する。

本発明の方法で測定する親油性タンパク質は、立体配座変化及びインタイブ縮重 に起因して正確な測定が困難であるものが好ましい０本発明の方法は、ＳＡＡ、 ＡｐｏＡｌ、ＡｐｏＢ、腫瘍壊死因子、インターロイキン−６、インク−ロイキ ン−１ベータ並びにＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及び他の血漿タンパク質に付随し て見いだされる類似のタンパク質のような親油性タンパク質であって、病気、外 傷又は遺伝的病理状態の時に測定可能なほど変化するタンパク質の測定に使用す るのが最も好ましい０本発明によって有利に測定できる他の付着性タン１１り質 としてはＣＲＰ及びアルブミンが挙げられる。

本発明の方法は、様々な時点で様々な人々から収集した多くの臨床試料中の付着 性タンパク質の測定に使用するのが好ましい０本発明は、大々的な臨床的研究で １つ以上の研究所から得られた比較可能なデータを供給するのに使用するのが最 も好ましい。

本発明の方法は、好ましい実施態様の１つでは、測定すべき試料を、支持媒体へ の付着性タンパク質の結合を促進する条件で、所期の付着性タンパク質が支持媒 体に結合するのに十分な時間にわたって、高濃度の塩の存在下で高いｐ）（で支 持媒体と接触させることからなる。支持媒体は、マイクロタイタープレートの１ つもしくは複数のウェル、プラスチックビーズ、クロマトグラフィー樹脂、磁化 ビーズ、又は測定タンパク質に対して親和性を示す他の適当な支持体が好ましい 、支持媒体はまた、１つ以上の相が存在する液体媒質、又はミセル構造を含む液 体媒質であってもよい。本発明で使用する高い塩濃度は生理的食塩水濃度より大 きい任意の塩濃度、即ち約０．１５Ｍより大きい濃度である。本発明の高い塩濃 度には、使用する特定の塩の飽和に近い濃度も含まれる０本発明の高いｐＨは約 ８より大きい任意のＰＨである。本発明の高いｐＨは約１１のｐＨを含む、付着 性タンパク質と支持媒体との結合を促進する条件は、温度を変化させること、付 着性タンパク質濃度を変化させること、他の溶質を加えること、又は特定の付着 性タンパク質に特異的な他のパラメータを変えることを含み得る。

付着性タンパク質が支持媒体に結合したら、その付着性タンパク質に特異的な抗 リガンドを、支持媒体に結合した付着性タンパク質と接触させる。付着性タンパ ク質に対する抗リガンドは、付着性タンパク質に対して特異的なものである限り 任意のものを使用し得る。抗リガンド（抗配位子）は好ましくは、イムノグロブ リン、付着性タンパク質に特異的に結合するレセプタータンパク質、付着性タン パク質に特異的に結合する輸送体膜タンパク質又は類似の分子である。イムノグ ロブリンは、適当に接種した動物に由来するポリクローナル抗血清、又は付着性 タンパク質に特異的なモノクローナル抗体が好ましい。付着性タンパク質に特異 的に結合する単純又は複合炭水化物も抗リガンドとして使用できる。＃！油性タ ンパク質の場合は、その親油性タンパク質に特異的に結合する単純又は複合脂質 を使用し得る。

次いで、支持媒体に固定された付着性タンパク質に結合した抗リガンドの量を、 任意の適当な検出方法によって測定する。検出手段としては、抗リガンドに対す る抗体の複合体、抗リガンド特異的抗体フラグメントの複合体、ビオチン−アビ ジン複合体等のような任意の手段を使用し得る。

好ましくは、抗リガンド特異的抗体、抗体フラグメント又はビオチン−アビジン をフルオレセイン又はローダミンのような蛍光マーカーに結合させるか、又は可 視範囲の色もしくは吸光度によって定量できる物質の生成を触媒する酵素、例え ばβ−ガラクトシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ又はホースラデイッンユペ ルオキシダーゼに複合させる。

本発明では次いで、未知の試料中に存在する付着性タンパク質の絶対量を測定す べく、付着性タンパク質に結合した抗リガンドの量を１つの又は一連の対照試料 と比較する。

対照試料は、所期の付着性タンパク質に実験的に関連付けることができる物質を 既知量含んでいる限り、任意のものを使用し得る。対照試料は、より好ましくは 、精製状態又は実質的精製状態の前記付着性タンパク質を既知量含む。

対照試料は最も好ましくは、既知量の精製付着性タンパク質を、対照試料の総タ ンパク質濃度を未知の試料の総タンパク質濃度とほぼ同じにするのに十分な量の 非関連タンパク質と共に含む。

非関連タンパク質は、所期の付着性タンパク質と免疫学的に交差反応しないタン パク質が好ましい、また、非関連タンパク質は、付着性タンパク質が所期の生物 学的流体から支持媒体に結合するのと類似の方法で付着性タンパク質が支持媒体 に結合するのを促進するのが好ましい０本発明の実施に使用する非関連タンパク 質としては、生物学的流体中に存在するタンパク質、並びに感染及び他の病態生 理学的状態時に存在する細菌及びウィルスタンパク質が挙げられる。

球状の血清又は血漿タンパク質を本発明の方法でアッセイする場合は、１つ又は 複数の異なる眸゛状又は血清タンパク質を非関連タンパク質として使用する。非 関連タンパク質はより好ましくはアルブミン（測定すべき付着性タンパク質がア ルブミンの場合は例外）及びイムノグロブリンＧである。非関連タンパク質は最 も好ましくは、所期の付着性タンパク質と同じ分類学上の種のアルブミン（やは り測定すべき付着性タンパク質がアルブミンである場合は例外）及びイムノグロ ブリンＧである。例えば付着性タンパク質がヒト由来のものであれば、非関連タ ンパク質もヒト由来のものが最も好ましい。

本発明の方法では、特に親油性タンパク質に関しては、前述のアッセイと異なっ て、親油性タンパク質と他の血漿成分との間の非共有結合的相互作用が阻止され るため、マイクロタイターウェルを濃度に比例した親油性タンパク質フラクショ ンで直接コーティングすることができる６本発明では、親油性タンパク質リガン ドを高濃度の塩の存在下で加温下にマイクロタイタープレートに結合させる０本 発明の別の特徴は、所期のリガンドを高濃度で含み且つ試料の総タンパク質濃度 に合わせて漂準化した精製リポタンパク質標準を使用することにある。この方法 を用いれば、臨床試料中の親油性血清又は血漿タンパク質の簡単で正確で再現性 のある検出及び測定を大規模に行うことができる。

本発明は付着性タンパク質全般のアッセイに有用であるが、親油性タンパク質の アッセイには特に有用である。なぜなら本発明の方法は、先行技術のアッセイを 親油性タンパク質の臨床的測定に使用できなくしている従来のアッセイに伴う問 題を解決するからである。本発明の実施態様の１つは、幅広い臨床的実験で患者 を逐次モニターするのに適用し得るＳＡＡ及びａｐｏＡｌのイムノアッセイ手法 を含む、これらのアッセイの特徴は、（１）精製ＳＡＡ濃度又はａ　ｐ　ｏ　Ａ 　１濃度の高いリポタンパク質をヒトＩｇＧ及びアルブミンの溶液に試験試料に 対応する濃度で加えることによって標準的基準曲線を作成し、（２）ＳＡＡ又は ａｐｏＡ１リガンドを高い塩濃度及び高温でマイクロタイターウェルにコーティ ングし、且つ（３）ＳＡＡ又はａｐｏＡ１濃度の値が標準曲線の直線範囲内の希 釈度から得られるように一連の希釈物を同時にアッセイすることにある。

本発明のアッセイは脂質除去を必要としない、これは、所期の親油性タンパク質 が例えばマイクロタイターウェルのような支持媒体に高温及び高塩濃度でコーテ ィングされるからである、脂質除去の省略は有利なことである。なぜなら、試料 の脂質除去は労働集約的であり、時間もかかる。

更に、脂質除去は実際に測定している親油性タンパク質の濃度の誤りの原因とな り得る。なぜなら、このプロセスはタンパク質を劣化させるか又は抗原部位の立 体配座を変化させ得るからである。

本発明は更に、感度に関しても、親油性血清タンパク質の公知のアッセイに比べ て重要な利点を有する０例えば、関節リュウマチのような慢性症状の患者のＳＡ Ａ濃度は急性炎症にかかつている実験動物より低い（例えばＺｕｅｋｅｒ輪ａｎ 及び５ｕｐｒｅｎａｎｔの前出の文献参照）０本発明は、これらの患者の低濃度 のＳＡＡを正確に且つ再現性をもって測定することができると共に、ある時間を かけて採取した試料の比較及び結果の対比を可能にする。

本発明のアッセイはまた、抗ＳＡＡ抗血清の使用量が例えばＤｕｂｏｉｓ及びＭ ａｌｍｅｎｄｉｅｒの方法（前出の文献１９８８参照）のような公知の方法より 遥かに少ない。これは、抗体のアフイニティ精製が不要だからである。また、本 発明で使用する抗体の量も、５ａｉｌｅらの方法（ＣＩｉｎ、Ｃｈｅｌ、３４． １９８８）より少なでなく、ヒトＳＡＡの捕捉及び検出のためにアフィニティ精 製した抗体を使用する。

以下の実施例１及び２は、本発明の方法をＳＡＡに関連して説明するものである 。実施例３ではａｐｏＡ及びａｐｏＢの測定を説明する。実施例４〜６ては、対 照試料を用いて作成した標準曲線によって、付着性タンパク質のアッセイにおけ る本発明の方法の有用性を明確に立証する。

特異的抗リガンド及び適当な標準を使用することによって、所期の付着性タンパ ク質の幾つかは複数のウェルに分配された単一試料の希釈物中で定量し得、個々 のウェル中の試料は分離可能な検出システムを用いて分析し得る。

本発明を以下の実施例によってさらに説明する。ただし、これらの実施例は単に 例示のために示されるものであり、本発明を一切限定するものではない。

ＳＡＡ及びＡｐｏＡｌ　（ａｐｏＡｌ）を、超遠心分離により、ＨＤＬ複合体と して痛風及び急性肺炎患者から採取したＳＡＡに富む血清のプールから単離した （Ｒｏｓｅｆｆ　ｅｔａ＋、、１９８７）。４℃で１５分間、２０００ｘｇで遠 心分離後、固体ＫＢｒ（試薬等級、ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍｅｄ ｆｏｒｄ、ＭＡ）を添加して、血漿を１．２１ｇｍ／ｃｃの密度に調整した。水 性ＫＢｒ溶液（密度１．２１ｇ／ｃｃ）を５ｍｌまでの調整血漿上に上張りした 。試験管をＳＷ４１０−ター中で、１５℃で３６時間遠心分離した。吸引により 試験管から７つの等分画を、連続的に取り出した。燐酸塩緩衝食塩水（Ｐ　Ｂ　 Ｓ）に対して分画を透析し、４℃又は−７０℃で保存した。凍結−解氷を繰り返 さないようにした。

標準として結晶ラン血清アルブミン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて、ＢｉｏＲａｄ（Ｒｉ　ｃｈｍｏｎｄ、Ｃ Ａ）蛋白質測定キットで分画の蛋白質含量を測定した。このようにして得られた ＳＡＡの純度及び物理的特性を、下記のようにポリアクリルアミドゲルよって分 析した（図１参照）。総血漿ＳＡＡの８０％以上がＫＢｒでの１回超遠心分離後 にＨＤＬで回収されることが、−貫して見い出されている（図１）。

図１（ａ）は、１５℃で４０時間、ＫＢｒに溶解した５ｍｌの血漿（密度１．２ １ｇｍ／ｃｃ）を超速１ｃＩ分離後のＳ　Ａ　Ａ　ｉコ富む血漿（１０００μｇ 　／　ｍ　１　）のＳＤＳ−ポ啄ノアクＩＪ　）レアミドゲル電気泳動分析であ る。レーン１〜７番よ各々１００μｇの蛋白質を含有する。これらの結果は、超 遠心分離後の上部３分画において、総血漿ＳＡＡの８０〜９０％が回収されたこ とを示す。

図１（ｂ）は、１０名の健康な被験者から採取した血漿（ＳＡＡ，４μｇ／ｍｌ ）の上部３分画と、ＳＡＡに富む血漿の上部３分画のＳＤＳ−ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動分析の比較である。レーン１〜３は正常血漿からの各３０μｇの 上部３分画を含有する；レーン４はＳ　Ａ　Ａに富む血漿の３０Ｍｇの上部分画 を含有する。このゲルは、本明細書に記載の超遠心分離手順によって健康な被験 者から採取した血漿を分別した場合に、ＳＡＡと同じ大きさの蛋白質は検出され なかったことを示す。

ＨＤＬ標準分画のＡｐｏＡ１含量を、同様の方法で測定した。濃度計測走査は（ ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｉｃｓｃａｎｎｎｇ）　、ＨＤＬ標準が９％ＡｐｏＡｌ を含有することを示した。

ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法１ｍｌのグリセロール、２．３ｍｌの １０％ＳＤＳ。

１．２５ｍ１の０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ６，８、及び４．９５ｍ１の水を混合 して、プレサンプル緩衝液を調製した。

９３０μｌのプレサンプル緩衝液、５０μｌのベーターメルカプトエタノール、 及び５２μｌの０，１％ブロムフェノールブルーを混合して、負荷緩衝液を調製 した。

負荷緩衝液中で５分間沸騰させてＨＤＬ及び血漿分画を変性させ、その成分を、 ５％積層ゲルを用い、６．４Ｍ尿素を含有する１１，４％ポリアクリルアミドゲ ル上でサイズ分別した。

２種類の大きさのゲルを用いた；大きい方は１６ｘ１８ｃｍ。

厚さ１．５ｍｍでレーン当たり１００μｇの蛋白質を有し、小さい方は７．３ｘ ｌＯ１２ｃｍ、厚さ、７５ミリでレーン当たり３０ｍｇの蛋白質を有した。大型 ゲルは水道水で冷却しながら３〜６時間、２５０ボルトで処理し、小型ゲルは空 気冷却しながら１．５〜２時間、７５ボルトで処理した。

ＳＡＡのゲルバンドを切り取り、５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒａｎｄ　５ｃｈｕｅ１］ 　（ＶＷＲ，Ｍｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）電気溶離装置中でゲルから蛋白質を溶離し た。使用した緩衝液は、０．０２５Ｍ　Ｔｒｉｓベース、０．１９Ｍ　グリシン 、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ　Ｄ　Ｓ）であった。

Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　Ｄａｔａ　Ｃｅｎｔｅｒ（Ｈｅｌｅｎａ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

Ｂｅａｕｍｏｎｔ、ＴＸ）を用いてＣｏｏｍａ　ｓ　ｓ　ｉ　ｅ染色ゲルの個々 のレーンを走査することにより、ＳＡＡ／ＨＤＬ分画中のＳＡＡの百分率を濃度 計で測定した０相対ＳＡＡ濃度は・ＥＬＩＳＡ分析で確証した。

図１（ｃ）は、（：００ｍａｓｓｉｅブルー染色ゲルの走査によるＳ　Ａ　Ａ／ ＨＤ　Ｌ標準の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析である。レーン１ ：３７ＭｇｓＡＡを含有するＬ　ＯＯμｇＳＡＡ／ＨＤＬ　Ｈレーン２　：　Ｅ Ｌ　Ｉ　ＳＡＩ：よ６３２μｇＳＡＡを含有する１００μｇｓＡＡ／ＨＤＬ；レ ーン３：ＥＬＩＳＡＩ＝よる４１ＭｇｓＡＡを含有する１００μｇＳＡＡ／ＨＤ Ｌ　；　レ−：／４　：　ＥＬ　Ｉ　ＳＡＩ：よる９μｇＳＡＡを含有する１０ ０μｇＳＡＡ／ＨＤＬ、分画３（図ＩＣ，レ−：／４）　は、その後のＥＬ　ｒ 　ＳＡ実験における標準として用いるために選択した；それは９％ＳＡＡ蛋白質 を含有した（表Ｉ）。

図１（ｄ）は、Ｃｏｏｍａ　ｓ　ｓ　ｉ　ｅブルー染色ゲルから電気溶離した（ ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｅｄ）ＳＡＡの５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳 動分析である。レーン１：各々５μｇの分子量マーカー：降順に、卵アルブミン （４３，０００）、アルファーキモトリプシノーゲン（２５゜７００）、ベータ ラクトグロビン（１８，４００）、リゾチーム（１４，３００）、ウシトリプシ ン阻害剤（６，２００）、及びインシュリン。レーン２９図１（ａ）に示されて いるようなＳＡＡバンドから電気溶離した約１０μｇのＳＡＡ蛋白質。

電気溶離によってゲル切片からＳＡＡを回収した場合、残留Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ブルーはＳ　ＡＡモノマートしフカリ結合シ、１４ｋｄ分子量マーカーのわずか に先に予測通りに移動した。

２００Ｍｇ　／　ｍ　ｌの濃度の電気溶離ＳＡＡを完全フロインドアジュバント を用いて乳化し、ラットの多数の部位に注入した（Ｗｏｏｄ　ｅ　ｔ　ａ　１． ．１９８２）ｏ　３週問おきにラットを追加免疫し、ＥＬ　Ｉ　ＳＡにより前免 疫血清に対する抗体活性の増大に関して血清を調べた。ＳＡＡ特異性抗体の存在 は、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎと５ｕｒｐｒｅｎａｎｔ　（１９８６）の直接結合ＥＬ 　ｒ　ＳＡ法により測定した。

電気溶離ＳＡＡは、免疫から３週間以内に１　：　１００〜１：１０．０００の 範囲の力価の抗体を誘導した。残存力価は、少なくとも１２週間上昇した。正常 ヒト血清又は血漿を用いて免疫化レジメンで後に得られた血清を吸収する必要が あった。検出可能なＳＡＡを欠いた血漿で吸収後（ＤｅＢｅｅｒｅｔａｌ、、１ ９８２）、抗体はＳ　Ａ　Ａ　１．ｍ富むＨＤ　Ｌ　トｙｍ的に反応し、正常血 漿からのＨＤＬとは反応しなかった。

以前に記載されているように（Ｌｉｎｋｅ　ｅｔ　ａｔ、。

１９７５）、ヒトＡＡ蛋白質に対してウサギ抗体を生じさせた。

ヒトＳＡＡに対するウサギ抗体はＣａ　ｌｂ　ｔ　ｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ　Ｄｉｅ ｇｏ、ＣＡ）から購入し、参考試料はＡ、５ｔｒａｃｈａｎ博士及びＦ、ＤｅＢ ｅｅｒ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　５ｔｅｌｌｅｎｂｏｓｃｈ。

Ｔｙｇｅｒｂｅｒｇ、５ｏｕｔｈ　Ａｆｒｉｃａ）の好意で提供されたものであ った。

ＳＡＡのＥＬＩＳＡ 抗凝固化血漿は、分析まで一８５℃で凍結保存した。代表的な検定（アッセイ） は、三通りのウェル中に各々同じ９種類の濃度のＳＡＡ／ＨＤＬを含有する４つ のマイクロ滴定プレートで構成された。１０μｌの血漿を軟質塩化ポリビニルマ イクロ滴定プレート中の９０μ）の燐酸塩緩衝食塩水（０，１０Ｍ燐酸ナトリウ ム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７，２（ＰＢＳ））に添加して、血漿試料 を１：１０に希釈した。

１５μｍアリコートを、Ｏ，１Ｍ重炭酸ナトリウム、ｐＨ９，６に溶解した３Ｍ 　ＫＢｒ　（１：　１００）希釈液１３５μＩを含有するウェルに移した。混合 後直ちに、５０μｌアリコートを、１００μｌの３ＭＫＢｒ溶液（１：３００） を含有する別のプレートに移した。さらに３種類の３倍希釈液（１：９００．１ ：２７００、及び１：８１００）は、１０００μｇ／ｍｌまでのＳＡＡ濃度に関 する線状範囲を包含する。最終プレートから５０μｌを捨てた。

標準ＳＡＡ／ＨＤＬ標本を、ヒトＩｇＧ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ　Ｄｉ ｅｇｏ、ＣＡ）　１３ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｉ及びアルブミ：ｚ（Ｃａｌｂｉｏｃｈ ｅｍ、５ａｎＤ　ｉ　ｅ　ｇ　ｏ、ＣＡ）４５ｍｇ／ｍ　１ストツク濃縮液の該 当する希釈液（１：１００．１＋３００等）に順次希釈した。６μｌのＳＡＡ　 １．４ｍｇ／ｍｌ、９％ＳＡＡを２００μｌの希釈ＩｇＧ／アルブミン溶液に添 加し、混合後、１００μｍを８連続希釈液中に溶解した溶液１００μｌに移した 。

６０℃で一晩インキユベートして、マイクロ滴定プレートのウェルをＳＡＡで覆 った。翌日、ウェルを空にして、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する０、 ０２Ｍ燐酸緩衝液に溶解した乾燥乳の５％溶液（ｐＨ７，４）を添加することに よって、非特異的部位をブロックし、室温で１時間インキュベートした。

次に、プレートを洗浄緩衝液（０，０２Ｍ燐酸塩、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０ ，１）Ｈ７，４）で３回洗浄した。

洗浄緩衝液に溶解したラット又はウサギポリクローン性抗血清の希釈液（１：３ ００又はそれ以上の希釈液）１００μｌを用いて、３７℃で９０分間、ウェルを インキュベートした。洗浄緩衝液でプレートを３回洗浄し、ベルオキシダーゼ複 合ヤギ抗ラット又は抗ウサギＩｇＧ　（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の１＝１０００ 希釈液１００μｌを各ウェルに添加した。３７℃で９０分間インキュベーション を実施した。

次に、洗浄緩衝液で９回、プレートを洗浄した。ｌＱｍｌのクエン酸緩衝液（０ ，１Ｍクエン酸ナトリウム、０，１Ｍ燐酸−水素二ナトリウム　ｐＨ５）に５． ５ｍｇのＯ−フエニレンジアミンニ塩酸塩（ＰＤＡ）を溶解して、基質を調製し た。マイクロ滴定プレートに添加する直前に、３３μｍの３％過酸化水素をＰＤ Ａ溶液に添加した。１００μｍの基質溶液のアリコートを各ウェルに添加し、４ ５０ｎｍでＶＭａｘ自動ＥＬ　Ｉ　ＳＡ読み取り器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅ ｖｉｃｅｓ。

Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で発色をモニターした。約５分後、１００μｌのＩ Ｍ　硫酸を添加し、４９０ｎｍでプレートを読み取った。ｎｇ／ウェルＳＡＡ対 ４９０ｎｍでの吸収の対数をプロブトして得られた標準”曲線の線状回帰分析に よってデータを分析した。曲線の線状範囲の点の相関係数は、通常は＞０．９９ であった。変動係数のプレート内平均は５％未満であった；変動係数のプレート 間平均は２０％未満であった。

７つの対照試料及び１６の試料を１回処理し、値を確証するためにこれを繰り返 した。これは、対照値とともに濃度値が最も適切な希釈液から測定されたという 保証を提供した（表１１１）。値は常に、プレート１の１　：　１００希釈液か ら得られた。ＳＡＡ値（ｎ、　ｇ　／ウェル）がプレートｂに関するブランク値 の２倍又はそれ以上であるか、あるいはプレートＣ及びｄに関する値の３倍であ る場合、合計値（ｎ　ｇ／ウェル）からブランク値を引き、正味値に希釈因子を 掛けてそのプレートに関する最終ＳＡＡ濃度（μｇ　／　ｍ　Ｉ　）を出す。

相対濃度値よりむしろ絶対濃度値が必要な場合には、標準曲線の蛋白質濃度は試 験中の試料とできるだけ同じであるのが望ましい。ＳＡＡ検定に関する標準曲線 は、約２０倍の範囲に亘って直線であった（図４）。図４においては、指示され た量のＳＡＡ／ＨＤＬを、ａ−１：　１００．ｂ−１：　３００．ｃ−１：９０ ０、ｄ−１：２７００希釈ヒトＩ　ｇＧ　（１３ｍｇ／ｍ　ｌ）及びアルブミン （４５ｍｇ／ｍｌ）を含有するプレートａ−ｄの三通りのウェルに添加した。

検定の感度は、拮抗する血漿蛋白質の量が減少すると（１：２７０ｏ希釈で＜　 Ｌ　Ｏｎ　ｇ／ウェルに）、増大した。慣用的に分析された血漿の最高濃度は１ 　：　１００希釈であって、本発明の方法により検出し得た血漿ＳＡＡの最低濃 度は約１μｇ／ｍ＋であった。

ブランク値は、ヤギ抗ウサギ複合体とヒトＩｇＧとの交叉反応性により、正常ヒ ト血漿及並びにＩｇＧ及びアルブミンを用いた複合体血清の吸収効率にしたがっ て、５〜２５ｎｇ／＋７エルの間で変化した。一般に１０μｇ　／　ｍ　１のオ ーダーのこの値を各試料濃度値から差し引いた（表ｒ　Ｉ　ｆ）。標準曲線の相 関係数は、通常は≧０．９９である。

市販のウサギ抗ＳＡＡ、ウサギ抗ＡＡ抗血清、及びウサギ抗ＡＡを用いて、比較 可能な結果が得られた。

ＳＡＡ結合に及ぼす温度の影響 熱は、比例的且つ再現可能なウェルへのＳＡＡのコーティングを促すことが判明 した（図２及び３）。ＳＡＡ／ＨＤＬを重炭酸塩溶液、ｐ）（ｉ　６に順次希釈 して、図２に示すＳＡＡ／ウェルの量にした。プレートを密封し、４℃　−〇− 又は６０℃　−０−でインキュベートした。ウェルに結合するＳＡＡの量は４９ ０ｎｍでの吸収に比例した。三重ウェルの平均変動係数は、５％未満であった。

図２は、重炭酸塩溶液　ｐＨ９，６中で６０’Ｃで一晩ＳＡＡ／ＨＤＬ＠＄蛋白 質でウェルをコーティングした場合、抗原性決定因子の結合及び／又は暴露は、 ４℃で一晩結合した場合と比較して増強されたことを示す。血清及び血漿試料か らのＳＡＡの直接結合も、温度を上げると増大した（表ＩＩ）。しかしながら、 多量のＳＡＡを含有する血清又は血漿からのウェルと結合するＳＡＡの量は、Ｈ ＤＬ分画からよりも非常に少なかったが、これは結合に及ぼす血清成分の実質的 減衰作用を示す。

ＳＡＡ結合に及ぼす塩の作用 塩も、比例的且つ再現可能的なウェルのＳＡＡコーティングを促進することが判 明した。図３は、マイクロ滴定プレートのウェルに結合するＳＡＡに及ぼすアル ブミンの阻害作用、及び塩の存在下での熱によるその逆の場合を示す。図３（ａ ）では、ＳＡＡ／ＨＤＬ標準（１２００ｎ　ｇ／ｍ　Ｉ）　トフルフミン（１０ μｇ／ｍｌ）の混合物を重炭酸塩溶液、ｐＨ９，６に順次希釈し、ウェルを４℃ 　−〇−で一晩インキユベートしてコーティングした。ＳＡＡ／ＨＤＬ標準のみ を、４℃　−〇−で一晩インキユベートした。ｌｆｆ１３　（ｂ）では、アルブ ミンを用いて及び用いずにＳＡＡ／ＨＤＬを図３（ａ）に関して記載されている のと同様に希釈したが、しかしコーティングは３ＭＫＢ　ｒ中で６０℃で一晩イ ンキユベートすることにより実施した。

ＳＡＡのウェルとの結合は、アルブミンの存在下で、特に４℃で阻害された（ｖ ｌＪ３ａ）。血漿３ＭをＫＢｒ中に希釈し、結合を６０℃で実施した場合に、Ｈ ＤＬ分画及び血漿からのＳＡＡのより多量の結合が観察された。塩及び温度上昇 は、ＳＡＡ結合に及ぼすアルブミンの阻害作用を減少させることが観察された（ 図３Ｂ）。

冥施例３ ＡｐｏＡＩ及びＡｐｏＢの測定 Ａ、ＡｐｏＡｌ 抗凝固化血漿を、分析まで一８５℃で凍結保存した。代表的な検定は、三重ウェ ル中に各々同じ試料濃度を含有する４つのマイクロ滴定プレートで構成された。

１０μｌの血漿をマイクロ滴定プレートのウェル中の１９０μＩのＰＢＳに添加 して、血漿試料を１：２０に希釈した。−次希釈液１０μｌをさらに１９０μｌ のＰＢＳ中に希釈して、原試料の１　：　４００希釈液を作った。１：４００希 釈液の１０μ！アリコートをＯ，１Ｍ重炭酸ナトリウム、ｐＨ９，６に溶解した ３Ｍ　ＫＢｒ　（１：８０００）希釈液１９０μｌを含有する三重ウェルに移し た。

混合後直ちに、１００μｍアリコートを、１００μｍの３ＭＫＢｒ溶液（１：１ ６．０００）を含有する別のプレートに移した。さらに２種類の２倍希釈液（１ ：３２．ｏｏｏ及び１：６４．０００）は、７ｍｇ／ｍｌまでのＡｐｏＡｌ濃度 に関する線状範囲を包含する。最終プレートから１００μｍを捨てた。

標準Ａ　ｐ　ｏ　Ａ　１　／　ＨＤ　Ｌ標本を、ヒトＩｇＧ（Ｃａｌｂｉｏｃｈ ｅｍ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）１３ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌ及びアルブミン（Ｃ ａｌｂｉｏｃｈｅｍ、５ａｎＤ　ｉ　ｅ　ｇｏ、ＣＡ）４５ｍｇ／ｍ　１ストツ ク濃縮液の該当する希釈！　（１：　８０００，１　：　１６，０００等）に順 次希釈した。

ＡｐｏＡｌ　１．５ｍｇ／ｍ１．９％ＡｐｏＡＩを含有する５、２μｌのＨＤＬ を２００μｌの希釈１ｇＧ／アルブミン溶液に添加し、混合後、１００μｌを１ １連続希釈液中に溶解した溶液１００μｍに移した。

６０℃で一晩インキユベートして、マイクロ滴定プレートのウェルをＡｐｏＡｌ でコーティングした。翌日、ウェルを空にして、室温で１時間インキュベートし て、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する０、０２Ｍ燐酸緩衝液に溶解した乾 燥乳の５％溶液（ｐ　Ｈ７，４）で非特異的部位をブロックした。プレートを、 乾燥乳を含まない洗浄緩衝液で３回洗浄した。

洗浄緩衝液に溶解したウサギポリクローン性抗ＡｐｏＡ１抗血清（Ｃａｌｂｉｏ ｃｈｅｍ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）の希釈液（１：３０００希釈液）１００μｌ を用いて、３７℃で９０分間、ウェルをインキュベートした。洗浄緩衝液でプレ ートを３回洗浄し、ペルオキシダーゼ複合ヤギ抗ウサギＩｇＧの１゜１０００希 釈液１００μｍを各ウェルに添加した。３７℃で９０分間インキュベーションを 実施した。

次に、洗浄緩衝液で９回、プレートを洗浄した。１０ｍ１のクエン酸緩衝液（０ ，１Ｍクエン酸ナトリウム、Ｏ，１Ｍ燐酸−水素二ナトリウム　ｐＨ５）に５． ５ｍｇの０−フエニレンジアミンニ塩酸塩（Ｐ　Ｄ　Ａ）を溶解して、基質を調 製した。マイクロ滴定ウェルに添加する直前に、３３μｌの３％過酸化水素をＰ ＤＡ溶液に添加した。１００μｌの基質溶液のアリコートを各ウェルに添加し、 ４５０ｎｍでＶＭａｘ自動ＥＬ　Ｉ　ＳＡ読み取り器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄ ｅｖｉｃｅｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）で発色をモニターした。約５分後、１ ００μｍのＩＭ　硫酸を添加し、４９０ｎｍでプレートを読み取った。ｎｇ／ウ ェルＳＡＡの対数対４９０１ｍでの吸収をプロットして得られた標準曲線の線状 回帰分析によってデータを分析した。曲線の線状範囲の点の相関係数は、通常は ＞０．９９であった。変動係数のプレート内平均は５％未満であった；変動係数 のプレート間平均は２０％未満であった。

ＡｐｏＡ１検定の結果を表ＴＶに示す。図６は、本発明のＡｐｏＡＩＥＬＩｓＡ に関する標準曲線である。

図７は、本発明のＥＬ　Ｉ　ＳＡとＡｐｏＡｌに関する慣用的免疫比濁法検定と の比較を示す。免疫比濁法検定は、ＳｉｇｍａＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　（Ｓｔ 、Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入したキットを用いて実施した。

Ｂ、ＡｐｏＢ ＡｐｏＢ検定においは、手順は、標準Ａ　ｐ　ｏ　Ａ　Ｉ　／　ＨＤ　Ｌ標本に 関して上記した実施例３．Ａ、と同様であったが、但し、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ から購入したＬＤＬ標本を標準として用いた。−次及び二次抗体濃度は、１　： 　１０００及び１：５０００であった。

図８は、本発明のＡｐｏＢ　ＥＬＩＳＡに関する標準曲線をサイトカイン・ＩＬ −１ベータ及びＴＮＦアルファの測定サイトカイン、ＩＬ−１ベータ及びＴＮＦ アルファの測定においては、手順は、上記の実施例３の標準ＡｐｏＡＩ／ＨＤＬ 標本に関して記載されたものと同様であったが、但し、１：１００のストック濃 度で用いたＩ　Ｌ−１に関して指示された場合を除いて、コーティング緩衝液中 には精製組換え体生成すイト力インを用い、ＩｇＧ／アルブミンは用いなかった 。−次及び二次抗体に対する希釈は１　：　１０００であった。

図９は、ＩｇＧ／アルブミンの存在下及び非存在下でのＩＬ−１ベータを含有す る対照試料に関する標準曲線を示す。

図１０は、ＴＮＦ−アルファに関する標準曲線を示す。

以下の検定において、−次及び二次抗体濃度は１　：　１０００〜１：５０００ であった。

精製ＣＲＰはＳ　ｉ　ｇｍａから、精製ＣＲＰに対するウサギ抗体はＣａ　ｌｂ 　ｉｏｃｈｅｍから購入した。

図１１は、精製ヒトＩｇＧ及びアルブミンの存在下（図１１人）及び非存在下（ 図１１Ｂ）での精製ヒトＣＲＰを含有する対照試料に関して得られた標準曲線を 示す。アルブミン及びＩｇＧに関する標準曲線を用いて、臨床的に合理的な値を 得た。

即ちＣＲＰは正常血漿中には検出されず、慢性関節リウマチ患者の血漿中では１ １．８μｇ　／　ｍ　ｌであった。血漿試料は１：１００に希釈した。

以下の検定において、−次及び二次抗体濃度は１　：　１０００及び１　：　５ ０００であった。

精製ヒトアルブミン、及びアルブミンに対するウサギ抗体はＣａｌｂｉｏｃｈｅ ｍから購入した。

図１２は、精製ヒ）ＩｇＧの存在下（図１２Ａ）及び非存在下（図１２Ｂ）での 精製血清アルブミンを含有する対照試料各；関して得られた標準曲線を示す。

表Ｖは、健常個体（ＮＨＰ）及び慢性関節リウマチ患者（ＲＡ）から採取した血 漿中のアルブミン濃度に関する予備ＥＬ　Ｔ　ＳＡによって得られた値を示す。

このＥＬＩ　ＳＡを最適化するためには、ＩｇＧの存在下で得られた値がＩｇＧ の非存在下で得られた値より低いので、アルブミンに関する絶対値を得るために 、ＩｇＧのほかに、リポ蛋白質のようなその他の無関係な蛋白質を標準曲線に加 えることが望ましい。血漿試料は１：４０．０００に希釈した。

表■ ＳＡＡ／ＨＤＬ　（分析ｎｇ値）　ＳＡＡ　（％）ＥＬ　Ｉ　５Ａ ７００　８、１２．９ ３５０　６、１４．８．１０ １７５　５、１３．８．９ ８８　４、１４．１２．７ 平均ＳＡＡ含量　９．３土３．１％ ゲル走査 １００　９．３ レーン４のＳＡＡ含量（図２Ｂ）を、ＥＬＩＳＡによってＳ　Ａ　Ａ／ＨＤ　Ｌ 標準、３７％ＳＡＡと比較した。ウェルのコーティングは、ＫＢｒを含有しない 重炭酸塩緩衝液、ｐＨ９，３中で、４℃で実施した。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色ゲ ルのゲル走査は、方法の項に記載されている通りに実施した。

表ＩＩ 血漿試料からのＳＡＡ結合に及ぼす温度の影響ＳＡＡ濃度　４℃　６０℃ ４　ｕ　ｇ／ｍ　１　０．１８　０．２４３２　０．１５　０．２８ １１２　０．２７　０．３６ ５８５　・　０．５５　０．４２ １０００　０．５９　０．６８ 血漿試料は、ＰＢＳ中で１＝１０に、次いでＫＢｒ重炭酸塩緩衝液、ｐＨ９，６ 中で１：１０に希釈した。インキュベーションは指示温度で一晩実施し、結合し たＳＡＡの量は、方法の項に記載されているのと同様にして、抗体を用いたブロ ック及びインキュベーション後の４９０ｎｍでの吸収の測定によって定量した。

表ｌｌｌ ５ＡＡ直接結合ＥＬ　ｒ　ＳＡデータ及び計算値ＳＡＡ　（ｎｇ／？エル） １　１７１０８４１９　９６３　６．９２　１７　８　６　３　１６　８　５　 ３　６．６３　１６　８　６　３　１６　８　５　３　５．６４　１５　８　６ 　３　１５　８　５　３　４．５５　１５　８　６　３　１４　８　５　３　３ 、に６　１６　７　６　３　ｍＡ　８　５　３　５．４７　１６　８　６　３　 １４　１１　６　３　５．４８　２８１４　９　４　２８　１３　７　４　１７ ．２＆、Ｉ８，２１９　３１１５　１０　４　ｋ２　１７　９　４２０，２７， ３２．３３１０　２０１０　９　４　２５　１１　７　４　９．１５１１　１４ 　７　６　３　１４８　５　３　３．４１２　１４　８　６　３　１６　８　６ 　３　３．６１３　１！＋８２９　１５　６　８５　３５　１６　７　３７．６ ９，９９，１０４７５．８７．１０８ ＩＡ　１４　９　７　４　１６　９　６　３　３．６１５　１５　８　７　４　 １５　９　６　３　ｋ、５１６　１Ｚｔ　８　６　３　１６　８　６　３　３． ６１７　４４１７　１０　４　４１　１６　７　ｋ　３３，３３，３１，３０１ ９　１１２３２　１７　６　５７　２０　９　５　１０１．７８，１１７４７． ４２．４５ ２０　９９５８　３７　２０　］ＩＡ　６８　３５　２０２９４．４８６２７９ ．４５９ ２１　１４５１２３６１　３１　１９Ｚｔ　１３１　５３　３１　５１３．７８ ３４４ｔ、７５６ 表■ｖ 試料　キット　（ｍｇ／ｍｌ）　ＥＬＩＳＡ　（ｍｇ／ｍ１）１、　ＮＩＰ　１ ．７４　２．５０ ２、　ＭＥＤ　Ｏ，７６０，７５ ３、＾ＰＰ　１．０８　０．６４ ４、Ｐｌ　１．００　０．９７ ５、　Ｐ２　１．３６　１．５０ ６、キット　対照１　０．９７　１．０４７、キット　対照Ｉ＋　１．５０　１ ．５６表Ｖ ｖｌｏ　［ｇＧ凸曲線　８．６５　１０．６４ｖ／ＩｇＧ曲線　５．７３　７． ２２　Ｇ、［１５本明細書に記載の実施例及び態様は、本発明を説明するためだ けのものであって、当業者には明らかな種々の修正又は変更は、本出願の精神及 び範囲内に、並びに承認された請求の範囲に含まれる。

＋２３４５６７ 図ＩＢ ＭＷ（ｋｄｌ 図ＩＤ ＳＡＡ（ｎｇ　／つＬ）し】 Ｕ　３Ａ　ＳＡＡ　（ｎｑ／つｐＬｌ ＳＡＡ（ｎｇ／ウェル） 図３Ｂ ＳＡＡ　（’ｎｇ　／　ウェル） 図４ ＥＬＩＳＡ灯　ＲＩＡ ＳＡＡ（ｕｑ／ｍ１ｌＲＩＡ 図５ 図　７　４ｐｏ　−ＡＩ　ｔｍｇ　／　ｍｌ　ｌ　Ｗ−ｔトｎｇ　Ａｐｏ　Ａ− １／つ勾し 図６ ｉｎｓ’１′タンパ７ｊｉｒ４ａ下ｚ”ｎｌし一＋ｔシ”！”’ＥＬＩＳＡ−Ｉ Ｌ−１　−−一工Ｌ−１，Ｉｇ、Ａｌｂ図９ ＴＮＦ−アルファ　ｎｇ／ウェル ｎ３／ウエルＣＲＰ（月４欠スケール）門／ウェル　ＣＲＰ　（打ン（スケール ）０．５　＋、０　２．０　４．Ｏａ、ｏ　１６．０　３１．０図＋２Ａ Ｏ・５１・０　２０　４．□　Ｂ、０　、１６．０　Ｂ１．０　６２．０アルブ ミン　、ｎ９／ウエル 補正書の写しく翻沢力提出書（特許法第１８４条の８）平成４年４月１３日 圀

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．試料中の付着性蛋白質の存在又は量の測定方法であって、以下の： ａ．付着性蛋白質の支持媒質との結合を促進する条件下で、高塩濃度で且つ温度 を上げた試料を付着性蛋白質に対して親和性を有する支持媒質と接触させ； ｂ．抗リガンドの付着性蛋白質との特異的結合を促進する条件下で、工程（ａ） で得られた支持媒質を付着性蛋白質に対する少なくとも一つの抗リガンドと接触 させ；ｃ．付着性蛋白質と結合した抗リガンドの量を検出及び測定し；そして ｄ．（ｉ）工程（ｃ）で測定された抗リガンドの量と、工程（ａ）〜（ｃ）にし たがって調製された少なくとも一つの対照試料（付着性蛋白質を含有しないこと が公知の一つ又はそれ以上の無関係な蛋白質を包含する）に関して測定された抗 リガンドの量とを関連付けるか、又は（ｉｉ）工程（ｃ）で測定された抗リガン ドの量と、既知量の付着性蛋白質を含有し、工程（ａ）〜（ｃ）にしたがって調 製された試料（一つ又はそれ以上の無関係な蛋白質の溶液に溶解した精製付着性 蛋白質を包含する）に関して測定された抗リガンドの量とを関連づけることを包 含する方法。
2. ２．付着性蛋白質が親油性血清蛋白質、即ちサイトカイン、あるいは球状の血清 もしくは血漿蛋白質、又はペントラキシンである請求項１記載の方法。
3. ３．親油性血清蛋白質がＨＤＬ、ＬＤＬ、又はＶＬＤＬと会合したものである請 求項２記載の方法。
4. ４．親油性血清蛋白質がＨＤＬと会合したものである請求項３記載の方法。
5. ５．親油性血清蛋白質が血清アミロイドＡ、アポ蛋白質Ａ１、アポ蛋白質Ｂ、腫 瘍壊死因子、又はインターロイキン−６である請求項２記載の方法。
6. ６．塩濃度が約０．１５〜飽和濃度である請求項１記載の方法。
7. ７．温度が約４０℃〜約６５℃である請求項６記載の方法。
8. ８．工程（ａ）のｐＨが約ｐＨ８〜約ｐＨ１１である請求項７記載の方法。
9. ９．無関係な蛋白質が球状血清蛋白質である請求項１記載の方法。
10. １０．無関係な蛋白質がイムノグロブリンＧ及び血清アルブミンである請求項１ 記載の方法。
11. １１．無関係な蛋白量が血清アルブミンである請求項１記載の方法。
12. １２．支持媒質が固体媒質を包含する請求項１記載の方法。
13. １３．固体媒質がマイクロ滴定プレート、プラスチックビーズ、樹脂、又は磁気 ビーズを包含する請求項１２記載の方法。
14. １４．支持媒質が液体媒質を包含する請求項１記載の方法。
15. １５．抗リガンドがポリクローン性抗血清、モノクローン性イムノグロブリン、 受容体分子、又は液体運搬体分子である請求項１記載の方法。
16. １６．検出系が複合抗リガンド特異性抗体、複合抗リガンド特異性抗体断片、又 は複合ビオチン−アビジンを包含する請求項１記載の方法。
17. １７．複合体が蛍光マーカーである請求項１６記載の方法。
18. １８．複合体がフルオレセイン又はローダミンである請求項１７記載の方法。
19. １９．複合体が酵素である請求項１６記載の方法。
20. ２０．複合体がβ−カラクトシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、又はホース ラディッシュペルオキシダーゼである請求項１９記載の方法。