JPH04261199A - Ｉ型プロコラーゲンのｃ末端プロペプチドの免疫学的定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はヒトにおけるＩ型プロコ
ラーゲン合成の測定法に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】Ｉ型
コラーゲンは、ヒトの体全体を通して様々な異なる型の
結合組織の中に見られるが、そのほとんどは骨に存在す
る。骨ではＩ型コラーゲンは組織マトリックスの９５％
以上を形成している。多くの病気がコラーゲン合成量の
増加、すなわち骨基質（ｂｏｎｅ　ｍａｔｒｉｘ）　形
成および代謝の割合の増加と関連している。とくに骨粗
鬆症や他の代謝性の骨の病気は一般の健康問題なので、
Ｉ型コラーゲンの割合を評価することができれば望まし
いであろう。この評価ができればこれらの病気の治療法
を考案するうえでの手引きを提供することができるであ
ろう。

【０００３】Ｉ型コラーゲンは分子の両末端にプロペプ
チドの延長を含むプロコラーゲンとして合成される。し
たがって、Ｉ型コラーゲン合成の割合はプロコラーゲン
からコラーゲンへの変換の際に遊離するプロペプチドの
量を測定することによって測定することができる。Ｉ型
プロコラーゲンのプロペプチドの定量法は開示されてい
る（トーブマンら、サイエンス１８６　巻、１１１５〜
１１１７頁、１９７４年（Ｔａｕｂｍａｎ　ｅｔａｌ．
，Ｓｃｉｅｎｃｅ　１８６，１１１５−１１１７，１９
７４）参照）。そして、その定量法はＩ型プロコラーゲ
ンのＮ末端のプロペプチドであると信じられていた抗原
に関連している。しかしながらのちに、その測定された
抗原はおそらくＣ末端部分に由来しているらしいことが
示された。

【０００４】さらに、この定量法で用いられたプロペプ
チド抗原は、培養線維芽細胞によって生産されるプロコ
ラーゲンから精製されていて、ＩＩＩ　型プロコラーゲ
ンに対応するプロペプチドとも反応することが示されて
いる。（シモンら、ジャーナルオブ　　クリニカル　　
エンドクリノロジー　　アンド　　メタボリズム５８巻
，１１０　〜１２０　頁，１９８４年　（Ｓｉｍｏｎ　
ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．
Ｍｅｔａｂ．５８，１１０−１２０，１９８４））プロ
ペプチド抗原を分解し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動で分析すると、３から４本の異なるバンドが
えられる（ゴールドバーグら、コラーゲン　　アンドリ
レイテッド　　リサーチ　　５巻３９３　〜４０４　頁
１９８５年（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｏｌ
ｌａｇｅｎＲｅｌ．Ｒｅｓ．５，３９３−４０４，１９
８５，３９８　頁第３図））。これは、ＩＩＩ　型プロ
コラーゲンのＣ末端プロペプチド由来の余分に存在する
鎖と一致している。このように以前に開示されている測
定法はＩ型プロコラーゲンに特異的なものではない。

【０００５】培養ヒト皮フ線維芽細胞は常にプロコラー
ゲンのＩ型およびＩＩＩ　型の両方を生産する。しかし
ながら、この２つの型をそれぞれに完璧に分けることは
技術的に困難である。最も一般的に用いられる分離方法
である塩による分画では、完全な分離はできない。ＩＩ
Ｉ　型プロコラーゲンの濃度は、しばしばＩＩＩ　型プ
ロコラーゲンのＮ末端プロペプチドの定量を用いて測定
（ｍｏｎｉｔｏｒ）　される。しかし、この測定は、Ｃ
末端プロペプチドを含むがＮ末端プロペプチドを失った
分子（そのような分子はＩＩＩ　型ｐＣ−コラーゲンと
して知られている）を認識しないので、充分に感度が高
いものではない。

【０００６】それゆえに、本発明は、ヒト血清中のＩ型
プロコラーゲンのＣ末端プロペプチドの定量をするため
に、ＩＩＩ　型プロコラーゲンのＣ末端プロペプチド（
ＰＩＩＩ　ＣＰと略す）を含まないＩ型プロコラーゲン
のＣ末端プロペプチド（ＰＩＣＰと略す）を製造する方
法を開発し、速く簡単に行なえる定量法をつくり出そう
とするものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、ＩＩＩ　型プ
ロコラーゲンのプロペプチドを含まないＩ型プロコラー
ゲンのＣ末端プロペプチドを提供する。

【０００８】

【実施例】精製プロペプチドの製造は充分な濃度のフリ
ー（ｆｒｅｅ）のプロペプチドもしくはＩ型プロコラー
ゲンを含む原料から始められる。前者の例にはたとえば
、腹水、治癒しつつある傷からの間質液および血清が含
まれる。ヒト線維芽細胞の細胞培養培地（ｍｅｄｉｕｍ
）は、後者の例である。しかし、培養ヒト線維芽細胞は
、プロコラーゲン製造出発原料としてのふさわしさの点
で異なる。かなり高濃度の（１０％より高い）仔ウシ血
清存在下に保たれている初期培養は最も多量のプロコラ
ーゲンを生産する。これらはもちろん１つの例で、他の
ソース（ｓｏｕｒｃｅ）も同様に用いることができる。

【０００９】プロコラーゲンソースから始めれば、プロ
コラーゲンの段階で、Ｉ型プロコラーゲンからほとんど
のＩＩＩ　型プロコラーゲンを分離するのに便利である
。

【００１０】この分離は、たとえば、硫酸アンモニウム
や塩化ナトリウムを用いた一連の沈殿によって行ないう
る。これに続いて、ゲルろ過およびイオン交換クロマト
グラフィーを行なう。

【００１１】ＰＩＩＩ　ＣＰからのＰＩＣＰの最終分離
はプロペプチド段階で達成される。細菌由来のコラーゲ
ナーゼによるプロコラーゲンの消化によってプロペプチ
ドを製造し、そしてそれをレクチン結合（ｌｅｃｔｉｎ
　ｂｉｎｄｉｎｇ）、ゲルろ過およびクロマトグラフィ
ーによって精製する。

【００１２】ＰＩＣＰおよびＰＩＩＩ　ＣＰの両者はマ
ンノースが豊富なオリゴサッカライド側鎖を有し、その
ためコンカナバリンＡレクチンに結合する。ＰＩＩＩ　
ＣＰは培養ヒト線維芽細胞から生産されるとリン酸化さ
れ、したがってより多く負電荷を帯びるため、クロマト
グラフィーではＰＩＣＰよりも遅く溶出されるというこ
とにもとづき、ＰＩＣＰは混入しているＰＩＩＩ　ＣＰ
から効率よく分離される。クロマトグラフィーは、イオ
ン交換クロマトグラフィーや逆相クロマトグラフィーを
用いて４．０　より高いｐＨで行なうのが好ましい。た
とえば、ＤＥＡＥ−　セファセル（Ｓｅｐｈａｃｅｌ）
イオン交換クロマトグラフィーカラムの塩化ナトリウム
勾配ではＰＩＩＩ　ＣＰとＰＩＣＰとは別々に溶出され
る。

【００１３】調製物（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）　の脱
塩とＰＩＣＰの最終精製は逆相クロマトグラフィーにて
行ないうる。クロマトグラフィーは、プロペプチドが変
性されない条件で行なわれなければならない。前記のク
ロマトグラフィーは、調製物のｐＨが４．０　から８．
５　の間となる条件で行なうことが好ましい。実際にプ
ロコラーゲンやプロペプチドの取り扱いは難しく、低収
率となることが知られている。本質的にＰＩＩＩ　ＣＰ
を含まないＰＩＣＰを単離することのできる典型的な精
製手順の詳しい条件は後の実施例において示す。

【００１４】Ｉ型とＩＩＩ　型のプロペプチドの混合物
から始めるばあい、４．０　より高いｐＨで、たとえば
セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ−３００などで
のゲルろ過、たとえばコンカナバリンＡレクチンなどを
用いたレクチン親和結合、たとえばＤＥＡＥセルロース
などでのイオン交換クロマトグラフィーおよび逆相クロ
マトグラフィーによってＩ型プロペプチドがえられる。

【００１５】分離されたプロペプチドはＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動で均質となる。還元を行なう
と前記の調製物とは対照的に、電気泳動では２つのバン
ドのみを生ずる。それはおよそ分子量３０，０００付近
のもので、およそ２：１の割合となっている。このこと
は、ＩＩＩ　型プロコラーゲンのプロペプチドが存在し
ないことを示す。Ｎ末端配列の分析によっても、ＩＩＩ
　型プロコラーゲンのＣ末端プロペプチド由来の鎖は存
在しないことが確認される。

【００１６】本発明はまた、Ｉ型プロコラーゲンのＣ末
端プロペプチドに対して作製される抗体、とくにＩＩＩ
　型プロコラーゲンのＣ末端プロペプチドに対しては親
和性を有していない抗体も提供する。この抗体はこの分
野で知られている技術を用いて作製されうる。たとえば
、プロペプチドを用いる免疫処置は他のプロコラーゲン
のプロペプチド抗原についてニーメラ　　オー、リステ
リ　　エル、パークキーネンジェイおよびリステリ　　
ジェイ（Ｎｉｅｍｅｌａ　Ｏ，　Ｒｉｓｔｅｌｉ　Ｌ，
　Ｐａｒｋｋｉｎｅｎ　Ｊ＆ＲｉｓｔｅｌｉＪ，）がバ
イオケミカル　　ジャーナル　２３２巻（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．　Ｊ．　２３２，）１４５　〜１５０　頁、１９８
５年（１４５−１５０、１９８５）において述べている
ようにして行なうことができる。

【００１７】本発明は、Ｉ型コラーゲンのＣ末端プロペ
プチドの定量法をも提供するものである。その定量法は
、形成されるプロペプチド−抗体複合体と結合されるよ
うな標識の存在下で、本発明の抗体と定量されるサンプ
ルとを接触させること、ならびにその結合および（また
は）非結合の標識量を定量することからなるものである
。

【００１８】この新しい定量により、プロペプチド濃度
の速く正確な定量が保証される。これは、連続的な定量
のあいだの、実際の濃度変化があまり大きくない臨床的
な条件においてはとくに有用である。この定量の検出限
界は約１．２　μｇ　／リットルである。

【００１９】臨床的な条件の例としては、骨粗鬆症患者
におけるエストロゲン治療や、成長ホルモン欠乏の子供
における成長ホルモン治療の効果があげられる。

【００２０】この定量は、標識の存在下で一次抗体とＩ
型プロコラーゲンのＣ末端プロペプチドと定量すべきサ
ンプルとを接触させること、そうして形成された標識化
されたプロペプチド−抗体複合体を非複合化物から分離
することならびに複合化された標識および（または）非
複合化標識を定量することにより行ないうる。このプロ
ペプチド−抗体複合体を、一次抗体に特異的である二次
抗体と接触させてもよい。そしてその二次抗体は支持体
に結合していてもよい。つぎにこのプロペプチド−抗体
−抗体複合体を非複合化原料から分離してもよい。

【００２１】この定量で用いられる標識されたプロペプ
チドにもまた、ＩＩＩ型プロコラーゲンのＣ末端プロペ
プチド（ＰＩＩＩ　ＣＰ）が含まれてはならない。

【００２２】このように述べてきた方法で調製された試
薬を用いる、このプロペプチドの免疫学的定量は、指標
となる抗原もしくは抗体のどちらかに、たとえば放射性
、螢光、発光、もしくは酵素標識を用いて行ないうる。 指標となる抗原、精製されたＩ型コラーゲンのＣ末端プ
ロペプチドに便利なように標識を付ける。ポリクローナ
ルまたはモノクローナル抗体どちらをも用いることがで
きる。成人では、血清中のプロペプチド濃度は通常約４
０〜２００　μｇ　／リットルである。幼児や子供の場
合の濃度はかなり高い。

【００２３】つぎに示す実施例にもとづいて本発明を説
明するが、本発明はもとよりかかる実施例のみに限定さ
れるものではない。実施例１ではヒト線維芽細胞の培養
培地を用いる。しかしヒトＰＩＣＰと充分な交差反応を
示す抗体をえるためにウシ、ヒツジ、ブタのような他種
の細胞や体液を用いることもまた可能である。

【００２４】実施例１ ＩＩＩ　型プロコラーゲンのＣ末端プロペプチドを含ま
ないヒトＩ型プロコラーゲンのＣ末端プロペプチドの単
離ヒト皮フ線維芽細胞の培養培地３０リットルを固体硫
酸アンモニウム（２０％飽和）で沈殿させる。沈殿した
タンパク質を１５，０００ｇ　×３０分間の遠心分離で
集め、３ｍｇ／リットルのフェニルメタンスルホニルフ
ルオリド、Ｎ−エチルマレイミドおよびｐ−ヒドロキシ
メルクリベンゾエイトならびに１０ｍＭ　ＥＤＴＡ　と
いったプロテアーゼ阻害剤を含む１Ｍ　塩化ナトリウム
、５０ｍＭトリス／塩酸ｐＨ７．４　に溶解し、同じ溶
液にて透析したのちに固体塩化ナトリウム（最終濃度１
．７Ｍ）にて沈殿させた。大部分のＩ型プロコラーゲン
を含む上清をセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ−
５００（２．５　×１２０ｃｍ）カラムで分離しプロコ
ラーゲンに相当する分画を集め、以下に示したＤＥＡＥ
開始緩衝液に対して透析した。 そしてサンプルを、前記のプロテアーゼ阻害剤を含む６
Ｍ尿素、５０ｍＭトリス／塩酸ｐＨ８．０　で等張化し
たＤＥＡＥ−セファセルカラム（５×３０ｃｍ）にて分
離した。一次勾配の塩化ナトリウム（３０００＋３００
０ｍｌ）で溶出を行なった。Ｉ型プロコラーゲンを含む
分画を集め、０．５Ｍ塩化ナトリウムおよび前記のプロ
テアーゼ阻害剤を含む５０ｍＭトリス／塩酸緩衝液に対
して透析した。つぎにそのプロコラーゲン調製物をＣｏ
ｎ−Ａ　セファロースカラム（ファルマシア（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ）　製、ウップサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）　、
スウェーデン（Ｓｗｅｄｅｎ））（２×２０ｃｍ）に通
し、カラムに結合させたのち０．５Ｍ　　α−メチルマ
ンノシドで溶出した。その調製物を０．２Ｍ炭酸アンモ
ニウムにて透析したあと凍結乾燥を行なった。単離され
たプロコラーゲンは、ＩＩＩ　型プロコラーゲンのＮ末
端プロペプチド用の定量によりまだ微量のＩＩＩ　型プ
ロコラーゲンを含んでいると判断されたが、これを高度
に精製された細菌のコラーゲナーゼ（ワーシングトン（
Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）　製、グレードＣＬＳＰＡ（
ｇｒａｄｅ　ＣＬＳＰＡ））を初期培地体積（ｏｒｉｇ
ｉｎａｌ　ｍｅｄｉｕｍ　ｖｏｌｕｍｅ）３０リットル
に対して９ｍｇ用いて、３０℃にて１５時間消化した。 そのプロペプチドの調製物をセファクリル（Ｓｅｐｈａ
ｃｒｙｌ）Ｓ−３００（２．５　×１２０ｃｍ　、０．
２Ｍ炭酸アンモニウム中）でゲルろ過し、凍結乾燥した
あと、５０ｍＭトリス／酢酸緩衝液ｐＨ８．６　にて透
析し、プロテインパックＤＥＡＥ５ＰＶカラム（ウォー
ターズ（ｗａｔｅｒｓ）製、ミルフォード（Ｍｉｌｆｏ
ｒｄ）　、マサチューセッツ（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔ
ｔｓ）　、アメリカ合衆国）の高速液体クロマトグラフ
ィーを使って分離した。カラムに結合しているプロペプ
チドを一次勾配の塩化ナトリウム（０〜６０分間、０〜
０．５Ｍ）で溶出した。最終精製をｐＨの安定した逆相
カラム（５００ｍＭ　酢酸アンモニウムｐＨ８．０；カ
ラム：ヴィダック（Ｖｙｄａｃ）２２８ＴＰ、ザセパレ
イションズ　　グループ（Ｔｈｅ　Ｓｅｐａｒａｔｉｏ
ｎｓ　ｇｒｏｕｐ）　製、ヘスペリア（Ｈｅｓｐｅｒｉ
ａ）、カリホルニア（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、アメリ
カ合衆国）の高速液体クロマトグラフィーで行なった。 ２〜４ｍｇのＰＩＣＰがえられた。

【００２５】図１に示すように、精製されたＰＩＣＰは
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動ではただ１つ
のバンドが、還元したばあいでは約２：１のモル比で２
つのみのバンドがえられる。これより生成物にはＩＩＩ
　型Ｃ末端プロペプチドが含まれないことがわかる。

【００２６】実施例２ 平衡型のラジオイムノアッセイの実行 Ｉ型プロコラーゲンのＣ末端プロペプチド１０μｇ　を
クロラミン−Ｔ（５μｇ）により、１ミリキューリーの
　１２５Ｉで標識し、その標識されたプロペプチドを、
１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ　緩衝液
で等張化したセファクリルＳ−３００　カラム（１×２
００ｃｍ）でゲルろ過することによりフリーのヨウ素と
分離した。標識されたプロペプチド（すなわちトレーサ
ー）はフリー（ｆｒｅｅ）のヨウ素よりもかなり前に鋭
いピークとしてカラムから溶出した。検量は５０，００
０放射活性カウント数／分（ｃｐｍ）に標識されたプロ
ペプチドで調製された抗血清結合曲線にもとづいて行な
った。プロペプチドの濃度は血清中の未知のサンプルの
もので、他の体液のものは次に述べるラジオイムノイン
ヒビションアッセイ（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏ　ｉｎｈ
ｉｂｉｔｉｏｎａｓｓａｙ）によって定量された：予め
量を調べた抗血清を、未知のサンプルおよび５０，００
０カウント数／分（ｃｐｍ）　のトレーサーと３７℃に
て、２時間インキュベーションし、そののち抗ウサギγ
−　グロブリンの固体相の二次抗体に加えた。 ２０℃にて、１５分間インキュベートしたのちに、遠心
分離し、溶液から免疫複合体中に結合した抗原を分離し
た。 未知のサンプルの阻害活性を、標識されていないＩ型プ
ロコラーゲンのＣ末端プロペプチドの基準濃度の活性と
比較を行なった。

【００２７】一方、このＰＩＣＰ定量法の特異性をヒト
ＩＩＩ　型プロコラーゲンのＣ末端プロペプチド（ＰＩ
ＩＩ　ＣＰ）を用いて検査したところ、交差反応は見ら
れなかった。ここで用いたＰＩＩＩ　ＣＰは多量のＩＩ
Ｉ型プロコラーゲンを生産する（総コラーゲンタンパク
質の約４０％）ヒト骨肉腫ＭＧ６３細胞の培養培地から
部分精製された（とくにヒトＰＩＣＰを含まない）もの
である。

【００２８】

【発明の効果】本発明の方法によれば、ＩＩＩ　型プロ
コラーゲンのＣ末端プロペプチドを含まないＩ型プロコ
ラーゲンのＣ末端プロペプチドをえることができる。さ
らにこれに対して作製される抗体をえることができる。 この抗体を用いることにより、Ｉ型プロコラーゲンのＣ
末端プロペプチドの免疫的定量を感度よく、速く、簡単
に行なうことができる。そしてこの定量法は骨粗鬆症や
他の代謝性の骨の疾患などの診察に有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１において精製されたＰＩＣＰのＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す図であ
る。

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　ＩＩＩ　型プロコラーゲンのＣ末端プ
   ロペプチドを含まないＩ型プロコラーゲンのＣ末端プロ
   ペプチド。
2. 【請求項２】　　変性しない条件でプロペプチドのクロ
   マトグラフィーを行なうことよりなる請求項１記載のプ
   ロペプチドを製造する方法。
3. 【請求項３】　　４．０　より高いｐＨで、逆相分離を
   適用したプロペプチドのクロマトグラフィーを行なうこ
   とよりなる、請求項２記載の製造方法。
4. 【請求項４】　　ＩＩＩ　型プロコラーゲンからＩ型プ
   ロコラーゲンを分離し、Ｉ型プロコラーゲンを対応する
   Ｃ末端プロペプチドへ変換し、さらに請求項２または３
   の方法を行なうことよりなる請求項１記載のペプチドを
   製造する方法。
5. 【請求項５】　　請求項１記載のプロペプチドまたは請
   求項２、３もしくは４記載の方法により製造するペプチ
   ドに対して作製される抗体。
6. 【請求項６】　　ＩＩＩ　型プロコラーゲンのＣ末端プ
   ロペプチドに親和性のない請求項５記載の抗体。
7. 【請求項７】　　形成されるプロペプチド−抗体複合体
   に結合されるような標識の存在下で、請求項５または６
   記載の抗体と定量されるサンプルとを接触させ、結合お
   よび（または）非結合標識の量を定量することよりなる
   Ｉ型プロコラーゲンのＣ末端プロペプチドの定量法。
8. 【請求項８】　　標識されたＩ型プロコラーゲンのＣ末
   端プロペプチドおよび定量されるサンプルを抗体と接触
   させ、そうして形成されたプロペプチド−抗体複合体を
   非複合化物から分離し、複合化または非複合化標識の定
   量を行なう請求項７記載の方法。
9. 【請求項９】　　プロペプチド−抗体複合体を一次抗体
   に特異的な二次抗体と接触させ、プロペプチド−抗体−
   抗体複合体を非複合化物から分離する請求項７または８
   記載の方法。
10. 【請求項１０】　　二次抗体が固体支持体に結合されて
    いる請求項９記載の方法。
11. 【請求項１１】　　標識が放射性、酵素、発光または螢
    光標識である請求項７、８、９または１０記載の方法。