JPH0445520B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、体液中の基底膜物質
（Basalmembranmaterial）を免疫学的に測定す
るために好適な基底膜フラグメント及びその製法
に関する。 多くの疾病（糖尿病、腎臓病、硬皮症、肝臓繊
維症、血管炎）で、特に血管壁中に基底膜が増加
することは公知である。この血管変化は、従つて
屡々致死要因となつている。これらの疾病におけ
る免疫学的螢光検査によれば、これら基底膜変動
は、特にラミニンと称せられる新規の基底膜成分
及び基底膜コラーゲンの高い生成に基づくことが
判明した。組織学的検査ではこの変動の特異検査
を行なつているが、バイオプシー物質でのみ実施
でき、定量的には評価できない。 従つて、本発明は、この問題を血中及び他の体
液（尿、腹水）中の基底膜抗原を測定するために
定量的かつ特異的方法を得るための特定の基底膜
抗原を得ることである。 この測定法は、体液中の基底膜物質の免疫学的
測定法であり、これは、測定すべき試料の存在化
に抗原としての標識ラミニン、標識ラミニンフラ
グメントP1又は標識基底膜フラグメント Col1
（）をその特異抗体と共にインキユベートし、
生じた抗原−抗体−結合体を分離し、結合体中又
は分離した液体中に含有される標識抗原の量を測
定することよりなる。 前記方法は、３種の基底膜の新規構造蛋白質即
ちラミニン、ラミニンフラグメントP1及びコラ
ーゲンペプチドcol1（）の特性付けに基づく。
これらの３種の新規物質殊に２種のフラグメント
ラミニンP1及びCol1（）は、蛋白質分解及び変
性作用に対して高い安定性を示し、従つて体液殊
に血液中に良好に立証しうる量でも現われるか
ら、その定量によつて基底膜の増加が測定でき
る。 ラミニンは、高分子量の糖蛋白質である。これ
は、炭水化物12〜15重量％を含有し、分子量800
〜1000000を有する糖蛋白質であり、２種の分子
量約220000及び440000のジスルフイド結合したポ
リペプチド鎖より成り、プロテアーゼ阻害剤の存
在で基底膜含有組織を濃い塩溶液で抽出し、引続
きこの組織を0.4〜0.6M NaClで抽出し、後者抽
出液を3.3〜3.5M NaClで沈殿させ、再溶解させ
た沈殿をクロマトグラフイにかけることにより得
られる。 プロテアーゼ例えばペプシンを用いるか又は化
学的方法で例えば臭化シアンを用いるラミニンの
分解により、これからラミニンP1と称される多
大のフラグメントを得ることができる。このフラ
グメントは、直接、組織から得ることもできる。 ラミニンP1は、分子量200〜300000を有し、シ
ステイン12〜14モル％を含有し、レクチンに対す
る高い親和性及びコラゲナーゼに対する安定性を
有し、 (1)プロテアーゼ又は臭化シアンを用いてラミニ
ンを分解するか又は(2)プロテアーゼ阻害剤存在下
で基底膜含有組織を濃い塩溶液で、かつ引続き
0.4〜0.6M NaClで抽出し、残留分をプロテアー
ゼと共にインキユベートレ、得られる溶液を透析
し、得られた溶液を2M及び4M NaClの間で分別
沈殿させ、弱塩基性カチオン交換体を通すクロマ
トグラフイにかけ、レクチンを通すクロマトグラ
フイにかけることによつて得られる。 ラミニンP1に対して高い親和性を有するレク
チンの典型的な例はコンカナバリン
（Concanavalin）Ａ及び麦芽レクチンである。 前記方法で使用できる第３の新規抗原は、基底
膜コラーゲンのジスルフイドの多い変形体よりな
るフラグメントであり、慣用のプロテアーゼ例え
ばペプシン及びトリプシンに対しても、細菌性コ
ラゲナーゼ（Cl−ヒストリテイクム）に対しても
抵抗する。これは、Col1（）と称され、分子量
200〜300000を有し、システイン２〜５モル％を
含有し、軸比１：０、融点範囲60〜70℃の安定な
トリぺルらせんを有し、コラゲナーゼに対して抵
抗し、プロテアーゼ阻害剤の存在で基底膜含有組
織を濃い塩溶液で、かつ引続き0.4〜0.6M NaCl
で抽出し、抽出残分をプロテアーゼと共にインキ
ユベートし、得られた溶液を透析し、2M NaCl
で沈殿させ、再溶解した沈殿をコラゲナーゼと共
にインキユベートし、透析しかつクロマトグラフ
イで精製することにより得られる。 比較すると、コラーゲンにおける軸比は１：
200である。 次表に新規の３種の抗原のアミト酸組成を挙げ
る。

【表】

【表】 これらの新規基底膜成分（以後これらを本発明
の抗原と称する）は、前記のように、体液中殊に
血液中の基底膜物質を公知の免疫学的検査法を用
いる本発明による測定を可能にし、これは、共同
の抗体に関する周知量の標識抗原と被検試料中の
未知量の抗原との競争に基づく。この場合、公知
ラジオイムノアツセイ−（RIA）−変法も、酵素イ
ムノアツセイ−変法及び他の方式の標識付け例え
ば螢光標識付け、染料標識付け等を用いる類似測
定法も使用できる。この種の方法は、当業者にと
つては公知である。すべてのこれらの方法は、で
きるだけ高純度の抗原を用いて適当な実験動物中
に抗血清を作り、これをそのもの自体として又は
これから単離した特異抗体を得、場合により抗体
もしくは抗血清を固体担体に結合した後、慣用の
抗原−抗体−結合体形成反応を反応成分相互のイ
ンキユベートにより進行させることに基づく。体
液の被検試料中に存在する標識されていない抗原
の量に応じて、この結合体中では標識抗原の１部
分のみが結合しており、結合体の単離によるか又
は上澄み中で測定されうる。結合体中で結合した
標識抗原の量は、結合しなかつた抗原の量に関係
するから、こうして、体液中の抗原作用をする基
底膜物質の含分を測定することができる。 抗血清の製造は、常法で実験動物特に家兎に腹
腔内注射することにより行なうことができる。こ
の場合完全なフロインドのアジユバンド
（Freundschen Adjuvans）の存在で操作するの
が有利である。この種の場合に慣用の抗原量は更
に加工できる。家兎使用の際の特に好適な投与量
としては、0.5〜１mg／動物が効を奏する。次い
で生じた抗血清は当業者に公知の方法で回収さ
れ、そのもの自体として使用される。血清中に存
在する特異抗体を、予め、例えば親和クロマトグ
ラフイの方法でなお精製することもできる。 抗原の標識付けは、蛋白質の標識付けに公知の
方法で実施できる。放射線核での放射性標識付け
の場合は、放射線核としてヨード125を使用する。
この放射線核を用いる標識付けは、公知のクロラ
ミンＴ−法で行なうことができる（Int.Arch.
Allergy29巻185頁参照）。 前記方法の有利な実施形は、特異抗血清で形成
された抗原−抗体−結合体を第２の抗体の使用に
より、結合しなかつた抗原から分離することより
なる。この場合、第２の抗体として、抗血清を得
るために使用した動物の免疫グロブリンＧに対す
る抗体を使用するのが有利である。これにより不
溶の形に変えられた抗原−抗体−結合体を溶液か
ら分離することは、このために慣用の方法例えば
遠心分離、濾過及び類似方法で行なうことができ
る。抗血清もしくは抗体を固体担体例えば試験管
の内壁に結合させるのも有利である。 抗原−抗体−結合体の分離の後に、前記のよう
に、標識、例えば抗原−抗体−結合体に結合して
いる又は選択的に上澄み中に残留している放射能
又は酵素活性を測定する。公知の抗原含量の試料
を用いて製造した較正曲線を用いて、被検体中に
含有される抗原量を測定することができる。この
場合、原則的に、標識抗原の量（これは、生じた
抗原−抗体−結合体中に結合している）が少ない
と、被検体中に存在する非標識抗原は多くなる。 前記免疫学的測定法によれば、1nｇ／mlの範
囲までの濃度の測定が可能である。従つて、この
方法を動物及びヒトの体液殊に血液もしくは血清
中の基底膜物質の測定法に使用することができ
る。正常の固体の場合に、血清中のこの抗原の濃
度は、20〜50nｇ／mlｌの範囲内にあり、基底膜
変化の際には例えば実験的糖尿病の際には著るし
く高まる。前記方法を用いると、この種の変化は
比較的迅速かつ確実に測定できる。 前記方法で使用される新規抗原は、原則的に基
底膜を含有するすべての組織から得られる。得る
べき物質の含分が明らかに多いので、ヒトの胎盤
が有利である。同様に、多量の基底膜を形成する
特定の腫瘍組織例えばマウスのEHS−内腫も有
利である。 本発明により新規抗原を得る場合に、この組織
からの基底膜の純粋製造は省略されれ。組織を差
当り、プロテアーゼ阻害剤の存在で高い塩濃度で
抽出すると、この際付随蛋白質が除かれる。この
場合3.4〜4M NaClが有利である。この抽出のた
めに、組織の差当り常法で粉砕もしくはホモゲナ
イズする。場合により高い塩濃度で数回抽出の後
に、低い塩濃度での、有利に0.4〜0.6M NaClで
の第２の抽出工程を数回実施することができる。
この場合実際に基底膜コラーゲンは溶解しない
が、ラミニンの１部分は溶解する。こうして得た
溶液は、ラミニン及びラミニンフラグメントラミ
ニンP1を得るために使用でき、二重塩抽出時に
残留する不溶を組織残分は、フラグメント
Col1（）を得るために出発物質として使用され
るが、ラミニンP1を得るためにも好適である。 プロテアーゼ阻害剤として例えばフエニルメチ
ルスルホニルフルオリド、ｐ−クロルメルクリ安
息香酸又はエチレンジアミンテトラ酢酸が使用さ
れる。しかしながら他のプロテアーゼ阻害剤も好
適である。阻害剤は、個々に又は混合して使用で
きる。好適な濃度は、通例約１〜50mg／であ
る。 ラミニン含有抽出物から天然のラミニンが、付
随蛋白質の塩沈殿により分離できる。沈殿は3.3
〜3.5M NaClで行なうのが有利である。 こうして得た沈殿を再び緩衝液中に入れ、例え
ばアガロースＡ 1.5ｍのクロマトグラフイにか
ける。こうして、前記のように、本発明方法に使
用できる前記ラミニンが得られる。 こうして得られたラミニンから、フラグメント
P1は、蛋白質分解酵素を用いる分解によるか又
は化学的方法で例えば臭化シアンを用いて得るこ
とができる。約PH1.5〜2.5の強酸性溶液中でのペ
プシンを用いる分解を行なうのが有利である。こ
うして得た溶液から、分別塩沈殿によりフラグメ
ントP1を得ることができる。沈殿は有利に、差
当たり2M NaClを用い、かつ引続き4M NaClを
用いて行なうのが有利であり、この際最後の工程
でラミニンP1が沈殿する。 フラグメントP1は、直接、単離する必要のな
い基定膜物質から得ることもできる。この有利な
取得法では、２工程塩抽出の不溶組織成分から出
発される。残分を懸濁させ、蛋白分解酵素と共
に、この酵素に好適な温度及びPH値条件下に、イ
ンキユベートする。有利にペプシンを使用し、約
1.5〜2.5のPH−値で常温又は僅かに低い温度で操
作するのが有利である。約10〜20℃が好適であ
る。その後不溶分を分離し、低分子量物質を透析
により除去し、得られた溶液から塩分別により前
記のように、ラミニンP1が得られる。沈殿は有
利に差当たり2M NaClで、引続き4M NaClを用
いて行なう。 沈殿したフラクシヨン２〜4M NaClから、ラ
ミニンP1は、クロマトグラフイにより更に精製
できる。有利に、差当り弱塩基性のカチオン交換
体例えばDEAE−セルロース又はDEAE−セフア
デツクスでのクロマトグラフイを実施する。精製
は、例えば担体結合又は網状化により不溶性形で
存在するレクチンへの結合により、かつ引続き適
当な炭水化物での溶離により行なうことができ
る。例えば網状化されたデキストラン例えばアガ
ロースA1.5ｍでのゲル濾過も精製のために使用
できる。 フラグメント Coll（）を得るために、同様
に、２工程で塩溶液で抽出した組織の溶解溶液か
ら出発する。プロテアーゼ処理の後に得られる
2M NaClまでの沈殿物を新たに溶解の後に、こ
の酵素に好適な温度及びPH値条件でコラゲナーゼ
と共にインキユベートすると、Col1（）を除き
すべての余分のコラーゲンが分解され、透析によ
り除去することができる。精製は、例えば網状化
されたデキストラン及び／又はカルボキシメチル
セルロースでのモレキユラーシーブクロマトグラ
フイにより行なうことができる。 前記の蛋白質分解法にとつてペプシンが有利で
あるが、他のプロテアーゼ例えばトリプシンもこ
のために好適である。化学的分解法も使用でき
る。これは臭化シアンを用いて行なうのが有利で
ある。 次に実施例につき本発明を説明する。 例 １（参考例） 標識抗原の製造 ラミニンP1又はペプチドCol1（）25μｇをク
ロラミン−Ｔ−法によりヨード1250.5ミリキユリ
ーで標識し、結合しなかつたヨードを透析又はビ
オーゲルＰ−２でのゲルい濾過により除く。引続
く工程を有利に非イオン性界面活性剤例えばツイ
ーン（Tween）200.04％の存在で実施する。抗体
との結合曲線を、標識ペプチド1nｇを用いて測
定する。 免疫学的測定（RIA）の実施 血清又は他の体液中の未知試料中のラミニン
P1又はCol1（）の濃度を、次の阻害試験で測定
する。特異抗体又は抗血清の特定量を未知試料と
共に４℃で16時間予備インキユベートし、標識抗
原1nｇの添加の後に更に４℃で８時間インキユ
ベートする。その後家兎免疫グロブリンＧに対す
る抗体を過剰に加え、更に４℃で16時間後に免疫
結合体中に結合した抗原を遠心分離する。未知の
試料の阻害活性を非標識抗原の標準濃度の活性と
比較する。 例 ２ ラミニンの製造 出発物質としてヒトの胎盤又は移植可能なマウ
ス腫瘍〔EHS−肉腫；オーキン（orkin）等によ
るJ.Exp.Med.145巻（1977年）204〜220頁参照〕
を使用する。組織を、まずプロテアーゼ阻害剤フ
エニルメチルスルホニルフルオリド（３mg／ｌ）、
ｐ−クロルメルクリ安息香酸（３mg／）及び
EDTA（0.01M）の存在で20倍過剰の3.4M
NaCl、0.05MトリスHCl（PH7.4）中で２〜３回ホ
モゲナイズし、抽出可能な蛋白質を遠心により除
去する。次いで残分をプロエアーゼ阻害剤の存在
下に４℃で0.5M NaCl、0.05トリス HCl（PH
7.4）で２回１夜にわたり抽出する。抽出物は天
然ラミニンを含有し、これを3.4M NaClを用い
て沈殿させ、かつ再溶解した沈殿をアガロース
A1.5ｍ（1M CaCl₂）でのクロマトグラフイにか
ける（0.05Mトリス・HClPH7.4）ことにより付随
蛋白質を分離させる。 例 ３（参考例） ペプチドラミニンP1の製造 例２に記載の塩抽出物中に残留している不溶の
組織残分を0.5M酢酸中でホモゲナイズさせ（50
mg／乾燥重量ｇ）、HClの添加によりPHを２に調
節し、懸濁液をペプシン（50mg／乾燥重量ｇ）の
添加の後に15℃で24時間インキユベートする。酵
素で溶解させた物質を遠心により単離し、４℃で
0.5M NaCl、0.05Mトリス（PH7.4）で透析する。
こと溶液から2M NaClを用いてコラーゲン性蛋
白質の混合物を沈殿させ、引続き上澄みを4M
NaClで沈殿させることにより、フラグメントラ
ミニンP1の濃度を高める。2M NaClまでの沈殿
はCol1（）を得るために使用できる。 ラミニンP1を、0.05Mトリス・HCl（PH8.6）、
2M尿素中で均衡化し、線状勾配濃度のNaCl（０
〜0.4M）で溶離させ、更に精製する。最終精製
は、コンカナバリンＡ−カラムに結合させ、
0.1Mα−メチルマンノシドを用いて溶離させるこ
とにより行なう。必要な場合には、アガロース
A1.5ｍでのゲル濾過によりなお、更に精製する
ことができる。組織残分の代りに例２で得られる
ラミニンも使用できる。 例 ４（参考例） Col1（）の製造 ペプチドCol1（）の単離のために、例３で得
たコラーゲン蛋白質の混合物（沈殿、0.5〜２
NaCl）を0.05Mトリス・HCl（PH7.4）、0.2M
NaCl、0.002M NaCl₂（10mg／ml）中に溶かし、
細菌コラゲナーゼ（0.1mg／ml）の添加の後に20
℃又は37℃で16時間インキユベートする。この場
合、ペプチドCol1（）を除いて全ての他のコラ
ーゲンは分解されて低分子量ペプチドになるか
ら、これらを透析により除去する。更にアガロー
スA5M（1M CaCl₂、0.05トリス・HCl、PH7.4）
で、かつ引続き、ペプチドを、0.01M酢酸ナトリ
ウム（PH4.0）、4M尿素中で均衡化したCM−セル
ロースのカラムに結合させることにより精製す
る。線状勾配濃度のNaCl（０〜0.2M NaCl）に
よる純粋なCol1（）をカラムから溶離させる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 炭水化物12〜15重量％を含有し、Asp109、
   Thr58、Ser77、Glu122、Pro53、Gly93、
   Ala76、Cys30、Val48、Met14、Ile42、Leu92、
   Tyr27、Phe31、His24、Hyl2、Lys52、Arg50の
   アミノ酸組成を有し、分子量800〜1000000を有す
   る糖蛋白質であり、分子量220000〜440000のジス
   ルフイド結合ポリペプチド鎖２種より成り、プロ
   テアーゼ阻害剤の存在で基底膜含有組織を3.4〜
   4Mの塩溶液で抽出し、引続きこの組織を0.4〜
   0.6M NaClで抽出し、後者抽出液から3.3〜3.5M
   NaClで沈殿させ、再溶解させた沈殿物のクロマ
   トグラフイにより得られたものであることを特徴
   とする、体液中の基底膜物質を免疫学的に測定す
   るために好適なラミニン。 ２ 基底膜含有組織物質をプロテアーゼ阻害剤の
   存在で差当り3.4〜4Mの塩溶液で、次いで0.4〜
   0.6M NaClで少なくとも１回抽出し、0.4〜0.6M
   NaClで得た抽出液から塩沈殿によりラミニンを
   分離させ、得られた沈殿物を再溶解させてクロマ
   トグラフイにかけることを特徴とする、炭水化物
   12〜15重量％を含有し、Asp109、Thr58、
   Ser77、Glu122、Pro53、Gly93、Ala76、Cys30、
   Val48、Met14、I1e42、Leu92、Tyr27、Phe31、
   His24、Hyl2、Lys52、Arg50のアミノ酸組成を
   有し、分子量800〜1000000を有する糖蛋白質であ
   り、分子量220000〜440000のジスルフイド結合ポ
   リペプチド鎖２種より成る、体液中の基底膜物質
   を免疫学的に測定するために好適なラミニンの製
   法。 ３ 基底膜含有出発物質として、ヒト胎盤又はマ
   ウスのEHS−肉腫を使用する、特許請求の範囲
   第２項に記載の方法。